ES2526425T3

ES2526425T3 - Péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101 y composiciones farmacéuticas que contienen al mismo

Info

Publication number: ES2526425T3
Application number: ES10191234.3T
Authority: ES
Inventors: Haruo Sugiyama
Original assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2015-01-12
Anticipated expiration: 2027-12-14
Also published as: CN101573448A; MY161664A; EP2098595A4; AU2007340679A1; TW201345544A; DK2479275T3; CA2886622A1; US8653038B2; IL215334A0; DK2479276T3; RU2009128979A; EP2341142A2; NZ592510A; AU2007340679B2; CN102302788B; ES2556831T3; PH12014500902A1; US9272026B2; EP2479275B1; EP3026115A1

Abstract

Un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos (1) o (2): (1) una secuencia de aminoácidos de Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7), (2) una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, en la que un aminoácido está sustituido por otro aminoácido, donde el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de (2) tiene una capacidad para unirse a una molécula HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un LTC.

Description

Péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101 y composiciones farmacéuticas que contienen al mismo

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a péptidos específicos de WT1 restringidos a HLA-A*1101 que consisten en 9 aminoácidos contiguos de una proteína WT1, que tienen la capacidad de unirse a una molécula de HLA-A*1101 e inducir un LTC.

Antecedentes

El gen WT1 (gen 1 del tumor de Wilms) se identificó como un gen responsable del tumor de Wilms, que es un cáncer renal en niños (Documentos no de patente 1 y 2). WT1 es un factor de transcripción que tiene una estructura de

15 dedo de cinc. Inicialmente, el gen WT1 se consideró un gen supresor de tumores. Sin embargo, estudios posteriores (Documentos no de patente 3, 4, 4 y 6) demostraron que el gen WT1 sin embargo funciona como un oncogén en tumores hematopoyéticos y cánceres sólidos.

El gen WT1 se expresa a altos niveles en muchos tipos de tumores malignos. Por tanto, se ha examinado si el producto génico de WT1 libre de mutaciones, que es una proteína autóloga, tiene inmunogenicidad en un organismo vivo o no. Los resultados revelaron que la proteína derivada del gen WT1 que se expresa a altos niveles en células tumorales se fragmenta a lo largo del procesamiento intracelular, los péptidos resultantes forman complejos con moléculas de clase 1 del CMH, y los complejos se presentan sobre la superficie de células, y que los LTC que reconocen dichos complejos pueden inducirse mediante vacunación con péptido (Documentos no de patente 7, 8 y 25 9). También se demostró que en un ratón inmunizado con un péptido de WT1 o un ADNc de WT1, las células tumorales trasplantadas que expresan un gen WT1 se rechazan con una elevada probabilidad (Documentos no de patente 7 y 10), mientras que los tejidos normales que expresan fisiológicamente el gen WT1 no se dañan por los LTC inducidos (Documento no patente 7). Se demostró en experimentos in vitro usando células humanas que cuando se usa péptido Db126 o péptido WH187 (aminoácidos 187-195 de SEC ID Nº: 1, SLGEQQYSV) que tienen una gran capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*0201, que es una de las moléculas de clase I de CMH humano, para estimular células mononucleadas de sangre periférica que tienen HLA-A*0201, se inducen LTC específicos de WT1, los LTC tienen una actividad citotóxica específica para células tumorales que expresan un gen WT1 de manera endógena a elevados niveles, y la actividad citotóxica de dichos LTC está restringida a HLA-A2 (Documento no de patente 11). Se demostró en experimentos in vitro en células humanas usando péptido de WT1

35 que se empareja con HLA-A*2402 (que se encuentra con más frecuencia en japoneses entre los alelos de HLA-A) (WT1235; aminoácidos 235-243 de SEC ID Nº: 1, CMTWNQMNL) que se inducen LTC específicos de WT1 (TAK-1) (Documento no de patente 12), y que los LTC inducidos no suprimen la actividad formadora de colonias de células madre hematopoyéticas normales que expresan fisiológicamente de manera parcial un gen WT1 (Documentos no de Patente 12 y 13). Estos informes sugieren con fuerza que no solo en ratones, sino también en seres humanos, pueden inducirse LTC específicos de WT1, que dichos LTC tienen una actividad citotóxica contra células tumorales que expresan un gen WT1 a altos niveles, pero que no tienen una actividad citotóxica contra células normales que expresan de manera fisiológica un gen WT1 (Documentos no de patente 7, 10, 11, 12 y 13).

El producto génico de WT1 está presente como una proteína nuclear, y se procesa por proteasomas en el

45 citoplasma para fragmentarse en péptidos. Los péptidos fragmentados se transportan al lumen del retículo endoplásmico mediante moléculas TAP (transportador asociado con procesamiento de antígenos), forman complejos con moléculas de clase I del CMH, y se presentan sobre la superficie de las células. Los LTC específicos de WT1 se inducen como resultado del reconocimiento de los complejos péptido de WT1-molécula de clase I de CMH mediante células precursoras de LTC a través de TCR, por tanto ejerciendo un efecto citotóxico en células tumorales que presentan un producto génico de WT1 a través de moléculas de clase I de CMH (Documentos no de patente 7, 8 y 9). Por tanto, se necesita que al menos que un péptido de WT1 usado en inmunoterapia contra el cáncer que se dirija a un producto génico de WT1 esté en la forma que se une a una molécula de clase I de CMH en un organismo vivo. Sin embargo, las moléculas de clase I de CMH son diversas y las secuencias de los péptidos de WT1 que se unen a las moléculas de clase I de CMH respectivas son diferentes entre sí. Por lo tanto, se necesita proporcionar un

55 péptido que se empareje a cada subtipo de la clase I de CMH. Sin embargo, solo se conocen péptidos restringidos a la molécula de HLA-A*2402, la molécula de HLA-A*0201, la molécula de HLA-A*2601 y a la molécula de HLAA*3303 como péptidos de WT1 restringidos a molécula de HLA hasta la fecha (Documento de Patente 1, Documento no de patente 11, Documento de Patente 2 y Documento de Patente 3, respectivamente). Por consiguiente, hay una necesidad de encontrar un péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101.

Documento de Patente 1: WO 2003/106682 Documento de Patente 2: WO 2005/095598 Documento de Patente 3: Solicitud de Patente Japonesa Nº 2006-45287, Documento no de patente 1: Daniel A. Haber et al., Cell. 29 de junio de 1990; 61(7): 1257-69).

65 Documento no de patente 2: Call KM et al., Cell. 9 de febrero de 1990; 60(3): 509-20). Documento no de patente 3: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181:151-212. Review.

Documento no de patente 4: Yamagami T et al., Blood. 1 de abril de 1996; 87(7): 2878-84). Documento no de patente 5: Inoue K et al., Blood. 15 de abril de 1998; 91(8): 2969-76). Documento no de patente 6: Tsuboi A et al., Leuk Res. mayo de 1999; 23(5): 499-505). Documento no de patente 7: Oka Y et al., J Immunol. 15 de febrero de 2000; 164(4): 1873-80).

5 Documento no de patente 8: Melief CJ et al., Immunol Rev. junio de 1995; 145:167-77. Documento no de patente 9: Ritz J, J Clin Oncol. febrero de 1994; 12(2): 237-8). Documento no de patente 10: Tsuboi A et al., J Clin Immunol. mayo de 2000; 20(3): 195-202). Documento no de patente 11: Oka Y et al., Immunogenetics. febrero de 2000; 51(2): 99-107). Documento no de patente 12: Ohminami H et al., Blood. 1 de enero de 2000; 95(1): 286-93). Documento no de patente 13: Gao L et al., Blood. 1 de abril de 2000; 95(7): 2198-203).

Divulgación de la invención

Problemas a resolver por la invención

15 Los problemas a resolver por la presente invención son proporcionar un péptido que está restringido a una molécula de HLA-A*1101 y comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína de WT1, y un polinucleótido que codifica al mismo, así como una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, que comprenda al mismo.

Medios para resolver los problemas

Como resultado de estudios intensivos a la vista de la situación descrita anteriormente, el presente inventor ha descubierto que entre péptidos que comprenden cada uno una secuencia de aminoácidos que consiste en 9

25 aminoácidos contiguos de una proteína de WT1, los péptidos, teniendo cada uno una capacidad de unirse a una molécula de HLA-A*1101 pueden inducir un LTC específico de WT1 con un alto rendimiento. Por consiguiente, se ha completado la presente invención.

La presente invención proporciona:

(1) un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos (1) o (2):

(1): una secuencia de aminoácidos de Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7),

(2): una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, en la que un aminoácido está sustituido por otro

35 aminoácido, donde el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de (2) tiene una capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un LTC

(2) un dímero peptídico que consiste en monómeros peptídicos de (1) y (2) que se unen mediante un enlace disulfuro:

(1)

(i) un monómero peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos: Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7), o

45 (ii) un monómero peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, en la que un aminoácido está sustituido por otro aminoácido,

(2)

(i) un monómero peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7), Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEC ID Nº: 3), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEC ID Nº: 8) e

55 Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEC ID Nº: 9), o

(ii) un monómero peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 7 SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9, en la que un aminoácido está sustituido por otro aminoácido, donde el dímero peptídico tiene la capacidad de unirse a una molécula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un LTC;

(3) una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende al péptido de acuerdo con (1) y/o al dímero peptídico de acuerdo con (2);

(4) el uso del péptido de acuerdo con (1) y/o el dímero peptídico de acuerdo con (2) para preparar un 65 medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*1101;

(5) un polinucleótido que codifica al péptido de acuerdo con (1);

(6): un vector de expresión que comprende al polinucleótido de acuerdo con (5);

(7): una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende al polinucleótido de acuerdo con (1) o un vector que comprende a dicho polinucleótido;

(8) el uso del polinucleótido de acuerdo con (1) o el vector que comprende a dicho polinucleótido, para preparar 5 un medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*1101;

(9): un LTC específico de WT1, que se induce mediante un péptido de acuerdo con (1) y/o el dímero peptídico de acuerdo con (2);

(10): un método para la inducción de un LTC específico de WT1, que comprende cultivar una célula mononuclear de sangre periférica en presencia del péptido de acuerdo con (1) y/o el dímero peptídico de acuerdo con (2) para inducir al LTC específico de WT1 a partir de la célula mononuclear de sangre periférica;

(11): un kit para la inducción de un LTC específico de WT1, que comprende al péptido de acuerdo con (1) y/o al dímero peptídico de acuerdo con (2) como un componente esencial;

(12): una célula presentadora de antígenos que presenta un péptido de WT1, que se induce mediante un péptido de acuerdo con (1) y/o el dímero peptídico de acuerdo con (2);

15 (13) un método para la inducción de una célula presentadora de antígenos que presenta a un péptido de WT1, que comprende cultivar una célula presentadora de antígenos inmadura en presencia del péptido de acuerdo con

(1): y/o el dímero peptídico de acuerdo con (2) para inducir a la célula presentadora de antígenos a presentar a un péptido de WT1 a partir de la célula presentadora de antígenos inmadura;

(14): un kit para la inducción de una célula presentadora de antígenos que presenta a un péptido de WT1, que comprende al péptido de acuerdo con (1) y/o al dímero peptídico de acuerdo con (2) como un componente esencial; y

(15): un método para el diagnóstico de un cáncer, que comprende usar el LTC de acuerdo con (9) o la célula presentadora de antígenos de acuerdo con (12) con una muestra de un sujeto positivo a HLA-A*1101, y determinar la cantidad del mismo.

Efectos de la invención

La presente invención proporciona un péptido que está restringido a HLA-A*1101 y comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en 9 aminoácidos contiguos de una proteína de WT1, y un polinucleótido que codifica al mismo, así como una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, que comprenda al mismo. Por lo tanto, es posible inducir in vivo e in vitro LTC específicos de WT1 en sujetos que tienen HLA-A*1101. Debido a que la frecuencia de HLA-A*1101 positivos en japoneses es elevada (aproximadamente un 17,9 %), los LTC específicos de WT1 pueden inducirse en una amplia variedad de sujetos.

35 Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1251. La Fig. 2 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1279. La Fig. 3 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1312. La Fig. 4 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1313. La Fig. 5 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1338. La Fig. 6 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1378. La Fig. 7 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1386. La Fig. 8 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1415.

45 La Fig. 9 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con WT1436. La Fig. 10 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con péptido WT1378 (a, b y c representan las actividades citotóxicas observadas usando CMSP de los donantes sanos 1, 2 y 3 positivos a HLA-A*1101, respectivamente). La Fig. 11 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con dímero peptídico WT1378 (a, b y c representan las actividades citotóxicas observadas usando CMSP de los donantes sanos 1 y 2 positivos a HLA-A*1101, respectivamente). La Fig. 12 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con péptido WT1378 modificado (G → I) (a, b y c representan las actividades citotóxicas observadas usando CMSP de los donantes sanos 1, 2 y 3 positivos a HLA-A*1101, respectivamente).

55 La Fig. 13 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con péptido WT1378 modificado (G → V) (a, b y c representan las actividades citotóxicas observadas usando CMSP de los donantes sanos 1, 2 y 3 positivos a HLA-A*1101, respectivamente). La Fig. 14 representa la actividad citotóxica del LTC inducido con péptido WT1379 (a, b y c representan las actividades citotóxicas observadas usando CMSP de los donantes sanos 1, 2 y 3 positivos a HLA-A*1101, respectivamente).

Mejor modo de realización de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que

65 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, donde un aminoácido puede sustituirse con otro aminoácido y en donde el péptido tiene una capacidad de unirse a una molécula de HLA-A*1101, y tiene una

capacidad de inducir un LTC (también citado en el presente documento como "el péptido de la invención" y "péptido de WT1"). El péptido de SEC ID Nº: 7 de la presente invención consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende cisteína (o cisteínas), la estabilidad puede aumentarse sustituyendo la cisteína (o las cisteínas) en la secuencia de aminoácidos con otra sustancia, tal como otro aminoácido (por ejemplo, serina, alanina y ácido α

5 aminobutírico) o modificando el grupo SH de la cisteína (o cisteínas) con un grupo protector conocido en la técnica (por ejemplo, grupo carboximetilo o grupo piridiletilo). El péptido de la presente invención es un péptido de antígeno de cáncer que puede inducir a un LTC como resultado de la presentación, por medio de una célula presentadora de antígenos, de un péptido generado mediante el procesamiento del péptido de la presente invención en una célula.

Como se ha descrito anteriormente, es un objeto de la presente invención obtener un péptido restringido a HLAA*1101. Por consiguiente, el péptido de la presente invención tiene una capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*1101. La capacidad de unión puede determinarse mediante un método conocido en la materia. Los ejemplos de dichos métodos incluyen un método basado en ordenador, tal como Rankpep, BIMAS o SYFPEITHI, y un ensayo de unión competitiva con un péptido conocido que tiene una capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*1101.

15 Por ejemplo, la capacidad para unirse determinada puede compararse con aquella de un péptido restringido a HLAA*1101 conocido para juzgar si el péptido de la presente invención tiene una capacidad para unirse, o no. Los ejemplos de péptidos que tienen una capacidad para unirse de acuerdo con la presente invención incluyen un péptido cuya puntuación de afinidad para una molécula de HLA-A*1101, determinada mediante el método descrito en el ejemplo 1, es 4 o más, preferentemente 5 o más, más preferentemente 6 o más.

El péptido de la presente invención además tiene la capacidad para inducir a un LTC. El gen WT1 se expresa en su forma nativa a altos niveles, por ejemplo, en tumores hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno y cánceres sólidos, tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga,

25 cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer de cuello de útero o cáncer de ovarios. Por lo tanto, el péptido de la presente invención puede inducir a un LTC con un alto rendimiento en un sujeto que padezca una de dichas enfermedades. La capacidad para inducir a un LTC se refiere a una capacidad para inducir a un LTC in vivo o in vitro. Dicha capacidad puede determinarse usando un método general, tal como un método en el que se determina una actividad citotóxica de un LTC usando un ensayo de liberación de Cr.

El péptido de la presente invención puede tener Lys o Arg en la posición 9 de la secuencia de aminoácidos. Se considera que teniendo dicho aminoácido, la capacidad del péptido para unirse a una molécula de HLA-A*1101 se hace mayor.

35 El péptido de la presente invención es Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7). Además, puede tener una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido o el aminoácido sustituido puede modificarse de manera adecuada. En cualquier caso, el péptido de la presente invención mantiene una capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*1101.

Como se ha descrito anteriormente, el péptido de la presente invención consiste en 9 aminoácidos contiguos y, por ejemplo, es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 7.

El péptido de la presente invención puede sintetizarse mediante métodos usados generalmente en la técnica o modificaciones de los mismos. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Peptide Synthesis, Interscience,

45 Nueva York, 1966 ; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., Nueva York, 1976 ; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; e Iyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide-Gosei, Hirokawa -Book store, 1991.

El péptido de la presente invención también puede prepararse usando técnicas de ingeniería genética basándose en la información referente la secuencia de nucleótidos que codifica al péptido de la presente invención. Dichas técnicas de ingeniería genética son bien conocidas para un experto en la materia.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un dímero peptídico tal como se ha descrito anteriormente que tiene una capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*101 y que tiene una capacidad para

55 inducir a un LTC, en el que dos monómeros peptídicos comprendiendo cada uno una secuencia de aminoácidos que consiste en 9 aminoácidos contiguos de una proteína de WT1 y comprendiendo al menos un resto de cisteína se unen entre sí mediante un enlace disulfuro (en lo sucesivo citado como "dímero peptídico de WT1"). La estabilidad del dímero peptídico de la presente invención aumenta en comparación con la del monómero peptídico formando un dímero. El dímero peptídico de la presente invención es un dímero peptídico antígeno tumoral que puede inducir a un LTC como resultado de la presentación por medio de una célula presentadora de antígenos, de un péptido generado mediante el procesamiento del péptido de la presente invención en una célula.

EL dímero peptídico de la presente invención se forma uniendo dos monómeros peptídicos mediante un enlace disulfuro entre restos de cisteína presentes en los monómeros. Por consiguiente, cada uno de los monómeros 65 peptídicos comprendidos en el dímero peptídico de WT1 de la presente invención es el péptido de WT1 tal como se describe anteriormente y comprende al menos un resto de cisteína. El dímero peptídico de WT1 de la presente

invención puede ser un homodímero o un heterodímero.

En el dímero peptídico de WT1 de la presente invención, el primer monómero peptídico consiste en Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7), donde una secuencia de aminoácidos puede sustituirse por otra secuencia de

5 aminoácidos (más preferentemente, el primer monómero peptídico es Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7), y el segundo monómero peptídico consiste en Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7), Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEC ID Nº: 3), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEC ID Nº: 8) o Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEC ID Nº: 9), donde una secuencia de aminoácidos puede sustituirse por otra secuencia de aminoácidos.

El dímero peptídico de WT1 de la presente invención puede prepararse usando un método conocido en la técnica. Por ejemplo, si los monómeros peptídicos comprenden un par de restos de cisteína, el dímero peptídico de WT1 de la presente invención puede prepararse, por ejemplo, eliminando todos los grupos protectores, incluyendo aquellos en las cadenas laterales de cisteína, y después sometiendo a la solución de monómero resultante a oxidación al aire

15 en condiciones alcalinas, o añadiendo un oxidante en condiciones alcalinas o ácidas para formar un enlace disulfuro. Los ejemplos de oxidantes incluyen yodo, dimetilsulfóxido (DMSO) y ferrocianato de potasio.

Cuando cada uno de los monómeros peptídicos comprende dos o más restos de cisteína, el dímero peptídico de WT1 de la presente invención también puede prepararse mediante el método descrito anteriormente. En este caso, se obtienen isómeros debido a los diferentes tipos de enlaces disulfuro. Como alternativa, el dímero peptídico de WT1 de la presente invención puede prepararse seleccionando una combinación de grupos protectores para las cadenas laterales de cisteína. Los ejemplos de las combinaciones de grupos protectores incluyen combinaciones de grupo MeBzl (metilbencilo) y grupo Acm (acetamidometilo), grupo Trt (tritilo) y grupo Acm, grupo Npys (3-nitro-2piridiltio) y grupo Acm, y grupo S-Bu-t (S-terc-butilo) y grupo Acm. Por ejemplo, en el caso de la combinación de

25 grupo MeBzl y grupo Acm, el dímero peptídico puede prepararse eliminando los grupos protectores distintos del grupo MeBzl y el grupo protector en la cadena lateral de cisteína, sometiendo a la solución de monómero resultante a oxidación al aire para formar un enlace disulfuro entre los restos de cisteína protegidos, y después desproteger y oxidar usando yodo para formar un enlace disulfuro entre los restos de cisteína previamente protegidos mediante Acm.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer que comprende al péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o al dímero peptídico de WT1. El gen WT1 se expresa a altos niveles en varios cánceres y tumores incluyendo tumores hematopoyéticos, tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno y cánceres sólidos, tales como cáncer

35 gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical o cáncer de ovarios. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para el tratamiento o prevención de un cáncer. Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se administra a un sujeto positivo a HLA-A*1101, se inducen LTC específicos de WT1 mediante el péptido de WT1 o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLAA*1101 comprendido en la composición farmacéutica, y las células cancerosas en el sujeto se dañan mediante dichos LTC.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además del péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101 como principio activo, por ejemplo, un vehículo o un excipiente. El

45 péptido de WT1 o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101 comprendido en la composición farmacéutica de la presente invención induce a un LTC específico de WT1. Por consiguiente, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender un adyuvante adecuado, o puede administrarse junto con un adyuvante adecuado para potenciar la eficacia de la inducción. Los ejemplos de adyuvantes preferentes incluyen adyuvante de Freund completo o incompleto e hidróxido de aluminio.

El método de administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede seleccionarse de manera adecuada dependiendo de condiciones, tales como el tipo de enfermedad, el estado del sujeto o el sitio diana. Los ejemplos de dichos métodos incluyen administración intradérmica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intravenosa, administración nasal y administración oral. La cantidad del

55 péptido o dímero peptídico comprendida en la composición farmacéutica de la presente invención, así como la forma de dosificación y el número de veces de la administración de la composición farmacéutica de la presente invención pueden seleccionarse de manera adecuada dependiendo de condiciones tales como el tipo de enfermedad, el estado del sujeto o el sitio diana. La dosis sencilla del péptido es normalmente de 0,0001 mg a 1000 mg, preferentemente, de 0,001 mg a 1000 mg.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 para preparar un medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*1101. El cáncer a tratar o prevenir puede ser cualquiera, y los ejemplos del mismo incluyen tumores hematopoyéticos, tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno y cánceres sólidos, tales como cáncer

65 gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical o cáncer de ovarios.

En un aspecto adicional, La presente invención se refiere a un método para la determinación de la presencia o cantidad de un LTC específico de WT1 en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende:

(a) hacer reaccionar un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*1101 con una muestra del 5 sujeto; y

(b) determinar la presencia o cantidad de un LTC que reconozca al complejo contenido en la muestra. La muestra de un sujeto puede ser cualquiera siempre que exista la posibilidad de que contenga un linfocito. Los ejemplos de muestras incluyen fluidos corporales, tales como sangre o linfa y un tejido. El complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*1101 puede prepararse, por ejemplo, como un tetrámero o pentámero usando un método conocido para un experto en la materia, tal como el método de biotina-estreptavidina. La presencia o cantidad del LTC que reconozca a dicho complejo puede medirse mediante cualquier método conocido para un experto en la materia. En este aspecto de la presente invención, puede marcarse el complejo. Puede usarse como marcador un marcador conocido, tal como un marcador fluorescente o un marcador radiactivo. La marcación hace que la determinación de la presencia o cantidad de un LTC sea fácil y rápida.

15 Por consiguiente, la presente invención también proporciona una composición para la determinación de la presencia

o cantidad de un LTC específico de WT1 en un sujeto positivo a HLA-A*1101 que comprende un péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101.

Además, la presente invención proporciona un kit para la determinación de la presencia o cantidad de un LTC específico de WT1 en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un péptido de WT1 restringido a HLAA*1101.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la producción de un LTC específico de 25 WT1 usando un complejo de WT1 y una molécula de HLA-A*1101, que comprende:

(a): hacer reaccionar al complejo con una muestra; y

(b): obtener un LTC que reconozca al complejo contenido en la muestra. El complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*1101 se describe anteriormente. La muestra puede ser cualquiera siempre que exista la posibilidad de que contenga un linfocito. Los ejemplos de muestras incluyen una muestra de un sujeto, tal como sangre, y un cultivo celular. Los LTC que reconocen al complejo pueden obtenerse usando un método conocido para un experto en la técnica, tal como FACS o MACS. La presente invención permite cultivar al LTC específico de WT1 y usarlo para el tratamiento o prevención de varios cánceres.

35 Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un LTC específico de WT1 que puede obtenerse mediante un método para la producción de un LTC específico de WT1 usando un complejo de WT1 y una molécula de HLA-A*1101.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica al péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101. El polinucleótido de la presente invención puede ser ADN o ARN. La secuencia de bases del polinucleótido de la presente invención puede determinarse basándose en la secuencia de aminoácidos del péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101. El polinucleótido puede prepararse mediante cualquier método conocido para la síntesis de ADN o ARN (por ejemplo, un método sintético químico) o un método de PCR.

45 En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende al polinucleótido. El tipo de vector de expresión, la secuencia comprendida distinta de la secuencia del polinucleótido puede seleccionarse de manera adecuada dependiendo del tipo de hospedador en el que se introduce el vector de expresión de la presente invención o el propósito de uso. Es posible tratar o prevenir tumores hematopoyéticos o cánceres sólidos administrando el vector de expresión de la presente invención a un sujeto positivo a HLA-A*1101 para producir un péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101 en un organismo vivo e inducir un LTC específico de WT1, y dañar células de tumor hematopoyético o células de cáncer sólido en el sujeto.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende al polinucleótido o al vector de expresión. La composición y la composición

55 farmacéutica de la presente invención en este aspecto se describen anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del polinucleótido o del vector de expresión para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*1101. Los ejemplos de cánceres a tratar o prevenir incluyen tumores hematopoyéticos, tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno y cánceres sólidos, tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical o cáncer de ovarios.

Además se divulga una célula que comprende al vector de expresión. La célula puede prepararse, por ejemplo,

65 transformando una célula hospedadora, tal como E. coli, levaduras, células de insecto o células animales con el vector de expresión. El método para la introducción del vector de expresión en una célula hospedadora puede

seleccionarse de manera adecuada a partir de varios métodos. El péptido de la presente invención puede prepararse cultivando la célula transformada y recuperando y purificando el péptido de WT1 producido.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un LTC específico de WT1, que está inducido por el

5 péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101. El LTC de la presente invención reconoce a un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*1101. Por consiguiente, el LTC de la presente invención puede usarse para dañar específicamente una célula tumoral positiva a HLA-A*1101 y que expresa WT1 a un alto nivel.

10 En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la introducción de un LTC específico de WT1, que comprende cultivar una célula mononuclear de sangre periférica en presencia del péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101 para inducir al LTC específico de WT1 a partir de la célula mononuclear de sangre periférica. El sujeto del que se deriva la célula mononuclear de sangre periférica puede ser cualquiera, siempre que sea positivo para HLA-A*1101. Mediante el cultivo de las células mononucleares de sangre periférica en

15 presencia del péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101, se inducen LTC específicos de WT1 a partir de células precursoras de LTC contenidas en las células mononucleares de sangre periférica. Es posible tratar o prevenir tumores hematopoyéticos o cánceres sólidos en un sujeto positivo a HLA-A*1101 administrando el LTC específico de WT1 obtenido de acuerdo con la presente invención al sujeto.

20 En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la introducción de un LTC específico de WT1, que comprende un péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101 como un componente esencial. Preferentemente, el kit se usa en el método para la inducción de un LTC específico de WT1. El kit de la presente invención puede comprender además del péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101, por ejemplo, un medio para obtener una célula mononuclear de sangre periférica, un adyuvante, un

25 vaso de reacción o similares. En general, se adjunta con el kit un manual de instrucciones. Mediante el uso del kit de la presente invención, pueden inducirse LTC específicos de WT1 de manera eficiente.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula presentadora de antígenos (tal como una célula dendrítica) que presenta a un péptido de WT1 mediante una molécula de HLA-A*1101, que está inducido por

30 el péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101. Mediante el uso de la célula presentadora de antígenos de la presente invención, se inducen LTC específicos de WT1 de una manera eficiente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la inducción de una célula presentadora de antígenos que presenta a un péptido de WT1 mediante una molécula de HLA-A*1101, que comprende cultivar una 35 célula presentadora de antígenos inmadura en presencia del péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101 para inducir a la célula presentadora de antígenos que presenta un péptido de WT1 mediante una molécula de HLA-A*1101 a partir de la célula presentadora de antígenos inmadura. La célula presentadora de antígenos inmadura se refiere a una célula, tal como una célula dendrítica inmadura, que puede madurarse hasta una célula presentadora de antígenos. Un sujeto a partir del cual se deriva la célula presentadora

40 de antígenos inmadura puede ser cualquiera siempre que sea positivo a HLA-A-1101. Debido a que las células presentadoras de antígeno están contenidas, por ejemplo, en células mononucleares de sangre periférica, dichas células pueden cultivarse en presencia del péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la inducción de una célula presentadora de antígenos

45 que presenta a un péptido de WT1 mediante una molécula de HLA-A*1101, que comprende al péptido de WT1 y/o el dímero peptídico de WT1 restringido a HLA-A*1101 como un componente esencial. Preferentemente, el kit se usa en el método para la inducción de una célula presentadora de antígenos. Otros componentes que comprenderá el kit de la presente invención y similares se describen anteriormente. El kit de la presente invención puede usarse para inducir de manera eficiente una célula presentadora de antígenos que presenta un péptido de WT1 mediante una

50 molécula de HLA-A*1101.

Además se adjunta un anticuerpo contra un péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101 o un polinucleótido que codifique al péptido. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.

55 En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de un cáncer, que comprende al LTC específico de WT1, a la célula presentadora de antígenos que presenta un péptido de WT1 mediante una molécula de HLA-A*1101, o al anticuerpo contra un péptido de WT1 restringido a HLA-A o a un polinucleótido que codifica al péptido. Preferentemente, el LTC específico de WT1 se usa en el método para el diagnóstico de la presente invención. Por ejemplo, incubando al LTC anterior, o a la célula presentadora de

60 antígenos anterior con una muestra de un sujeto positivo a HLA-A*1101, y determinando la cantidad del mismo. El LTC, l la célula presentadora de antígenos, pueden estar marcados. Uniendo un marcador, el método para el diagnóstico de la presente invención puede ponerse en práctica de un modo eficiente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención en más detalle. Los ejemplos no cubiertos por el ámbito de las reivindicaciones son con fines ilustrativos. 5 Ejemplo 1: Selección de péptido de WT1

Se usó RANKPEP (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) para seleccionar WT1251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 y WT1436 que tienen una gran capacidad para unirse a una molécula de HLA

10 A*1101 derivados de péptidos de una proteína de WT1 (SEC ID Nº: 1). Las secuencias de aminoácidos, números de aminoácidos en SEC ID Nº: 1 y las puntuaciones de afinidad a una molécula de HLA-A*1101 de estos péptidos se muestran en la Tabla 1.

[Tabla 1] Péptido Número de Secuencia de Puntuación de aminoácidos aminoácidos afinidad WT1251 (SEC ID Nº: 2) 251-259). AAGSSSSVK 15,18 WT1279 (SEC ID Nº: 3) 279-287). PILCGAQYR 11,47 WT1312 (SEC ID Nº: 4) 312-320). RSASETSEK 14,96 WT1313 (SEC ID Nº: 5) 313-321). SASETSEKR 6,87 WT1338 (SEC ID Nº: 6) 338-346). SHLQMHSRK 13,72 WT1378 (SEC ID Nº: 7) 378-386). TGVKPFQCK 11,33 WT1386 (SEC ID Nº: 8) 386-394). KTCQRKFSR 13,82 WT1415 (SEC ID Nº: 9) 415-423). SCRWPSCQK 10,29 WT1436 (SEC ID Nº: 10) 436-444). NMHQRNMTK 14,19

15 Preparación de células B-LCL

Se separaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) mediante el método de centrifugación de densidad de gradiente Ficoll-Hypaque a partir de sangre periférica que se ha recogido a partir de un donante sano 20 positivo a HLA-A*1101. Las CMSP se sembraron a continuación en una placa de cultivo de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 1 x 107 en medio RPMI 1640 que contiene FCS al 10 %, y se añadió un sobrenadante de cultivo de células B95-8 (células que producen virus EB). Se cultivaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante aproximadamente 1 mes. Se obtuvieron células B-LCL transformadas con virus EB, que son células B tumorales. Se confirmó que las células B-LCL resultantes no expresaban el gen WT1. Las células B-LCL se

25 sometieron a impulsos incubándolas con 20 mg/ml de WT1251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 o WT1436 durante 2 horas, y se las irradió con 80 Gy de radiación. Las células B-LCL resultantes (en lo sucesivo citadas como células B-LCL sometidas a impulsos con un péptido de WT1) se usaron como células presentadoras de antígenos para los experimentos posteriores.

30 Inducción de LTC específicos de WT1

Se cultivaron 3 x 106 CMSP en una placa de cultivo de 24 pocillos en medio completo (RPMI al 45 %, medio AMI-V al 45 % y suero AB humano al 10 %) que contenía 20 mg/ml de WT1251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 o WT1436 a 37 °C con CO2 al 5 % durante 1 semana para obtener células respondedoras. Se 35 cocultivaron 2 x 106 de las células respondedoras con 1 x 106 células B-LCL sometidas a impulsos con el mismo péptido de WT1 en medio completo durante 1 semana (primera estimulación). Las CMSP se cocultivaron con las células B-LCL sometidas a impulsos con el péptido de WT1 tres veces más (segunda a cuarta estimulación) en las condiciones en las que se añadieron 20 UI/ml (concentración final) de IL2 del modo siguiente: segunda estimulación: dos veces en días alternos a partir de los tres días después del inicio de la estimulación; tercera y cuarta

40 estimulación: tres veces a intervalos de un día a partir del día después del inicio de la estimulación. Las células resultantes se concentraron usando kit de columnas de selección negativa alimentadas por gravedad (StemSp) de tal modo que la proporción de linfocitos T CD8 positivos alcanzó el 80 %, y se cocultivaron con las células B-LCL sometidas a impulsos con el péptido de WT1 (quinta estimulación). Los linfocitos T CD8 (LTC) obtenidos cinco días después de la estimulación final se usaron para la medida de la citotoxicidad.

45 Actividad citotóxica de LTC

La actividad citotóxica de los LTC se midió usando ensayo de liberación de 51Cr. Las células LTC (en lo sucesivo células efectoras) se mezclaron a una proporción (proporción E/T) de 1:1 a 30:1 en 200 ml de medio con células 50 diana a las que se había incorporado 51Cr, y se cultivaron en una placa de cultivo de 96 pocillos a 37 °C con CO2 al 5 % durante 4 horas. Las células B-LCL sometidas a impulsos con el mismo péptido de WT1 usado para la inducción de LTC (BLCL-P), y las células B-LCL sin someterse a impulsos usando un péptido de WT1 (BLCL-NP) se usaron

como células diana. Después del cultivo, se recogieron los sobrenadantes mediante centrifugación. Las cantidades de 51Cr liberadas en los sobrenadantes se midieron usando con contador de centelleo líquido. La actividad citotóxica (%) se determinó usando la siguiente fórmula:

5 (Liberación de 51Cr en sobrenadante de muestra -liberación espontánea de 51Cr) / (Liberación máxima de 51Cr -liberación espontánea de 51Cr) x 100

donde Liberación Espontánea de 51Cr es la liberación de 51Cr observada cuando las células diana a las que se había incorporado 51Cr se cultivaron solas en las mismas condiciones, y Liberación Máxima de 51Cr es la liberación de 51Cr

10 observada cuando las células diana a las que se había incorporado 51Cr se lisaron por completo usando Triton X-100 al 1 %. Los resultados se muestran en las Figuras 1-9. En las figuras, los ejes longitudinales representan la lisis específica (%), y los ejes horizontales representan proporciones E/T. Las BLCL-P se representan usando líneas continuas, y las BLCL-NP se representan usando líneas de puntos. Se confirmó que los LTC inducidos con WT1251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 o WT1436 dañan específicamente a las BLCL-P que

15 presentan al péptido de WT1 como complejo con una molécula de HLA-A*1101 en comparación con las BLCL-NP. Los LTC inducidos con WT1251, WT1279, WT1313, WT1338 o WT1386 se usaron para los siguientes experimentos adicionales.

Actividad citotóxica de LTC contra células que expresan WT1 de manera endógena

20 La actividad citotóxica de LTC inducida por WT1251, WT1279, WT1313, WT1338 o WT1386 contra B-LCL que expresan WT1 se determinó usando el método descrito anteriormente. Una célula que expresa WT1 se refiere a una B-LCL en la que se ha introducido un gen WT1 humano, y que expresa una proteína de WT1 en la célula, y presenta a un péptido que consiste en aproximadamente 9 aminoácidos resultantes del procesamiento con una molécula de HLA

25 A*1101. Los resultados se muestran en las Figuras 1, 2, 4, 5 y 7. En las figuras, Las B-LCL que expresan WT1 se representan usando líneas discontinuas. Se confirmó que los LTC inducidos con WT1251, WT1279, WT1313, WT1338 o WT1386 tienen una actividad citotóxica contra células que expresan un gen de WT1 de manera endógena.

Preparación de dímero peptídico de WT1

30 Se oxidó al aire una mezcla de 227,5 mg de monómero peptídico WT1378, 227,5 mg de N-metilglucamina (NMG) y 23 ml de agua mediante agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 días. A la mezcla resultante, se le añadió una solución de 2 g de acetato de sodio en 5 ml ml de agua y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. A la solución resultante, se le añadieron 200 ml de agua y aproximadamente

35 200 ml de acetonitrilo, y la mezcla se filtró a través de un embudo Kiriyama (papel de filtro del Nº 5C) y se lavó con agua (aproximadamente 50 ml x 3). Al residuo se le añadieron aproximadamente 200 ml de agua y el resto se liofilizó para obtener 158 mg de dímero peptídico de WT1378 en bruto.

Purificación de dímero peptídico de WT1 en bruto

40 Se disolvieron 158 mg de dímero peptídico de WT1378 en 9 ml de DMSO y se inyectó en una columna C18 ODS (5 cm φ x 50 cm L, YMC Co., LTD.) acoplada a HPLC (Shimadzu, tipo LC8AD) y se equilibró con solución 1 (H2O/AcOH al 1 %) usando una bomba de HPLC. Se dejó reposar la columna durante aproximadamente 30 minutos, y se eluyó con un gradiente de concentración del 0 % al 40 % de solución 2 (CH3CN/AcOH al 1 %) durante 360 minutos. Se

45 recogieron las fracciones que contenían dímero peptídico de WT1 usando un colector automático de fracciones a la vez que se controlaba la absorbancia UV a 220 nm. Las fracciones recogidas se combinaron, se inyectaron en una columna C18 ODS (4,6 mm φ x 25 cm L, YMC Co., LTD.) acoplada a HPLC (Hitachi, tipo L-4000) y se equilibró con solución 2 al 17 %, y se eluyó con gradiente de concentración del 0 % al 47 % de solución 2 durante 30 minutos para obtener 46,6 mg del dímero peptídico de WT1378 purificado a un tiempo de retención de 20,51 minutos. FAB.EM

50 2365,0 (valor teórico: 2342,70) Na+ F = 0,25 %

Inducción de LTC mediante dímero peptídico de WT1

Las capacidades de los dímeros peptídicos de WT1378, péptido de WT1378, péptido de WT1378 modificado (G → I)

55 (SEC ID Nº: 11) y péptido de WT1378 modificado (G → V) (SEC ID Nº: 12) así como péptido de WT1379 (SEC ID Nº: 13, tal como se divulga en el documento WO 2002/28414) resultantes para inducir un LTC se examinaron usando CMSP procedentes de los donantes 1-3 sanos positivos a HLA-A*1101 de acuerdo con el método descrito anteriormente. Los resultados se muestran en las Figuras 10-14. En las figuras, los ejes longitudinales representan la lisis específica (%), y los ejes horizontales representan proporciones E/T. Las BLCL-P se representan usando

60 líneas continuas, y las BLCL-NP se representan usando líneas de puntos. Se confirmó que el dímero peptídico WT1378 tiene capacidad de inducir un LTC. Además, se ha descubierto que la capacidad de cada péptido de WT1379 cuya secuencia de aminoácidos es diferente de la del péptido WT1378 en un aminoácido en la secuencia de la proteína de WT1 para inducir un LTC es mucho menor que la del péptido de WT1378 y, por lo tanto, el péptido de WT1 de la presente invención tiene un efecto excelente e inesperado en comparación con el péptido conocido.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101, un polinucleótido que codifica al péptido, una composición farmacéutica que comprende al mismo, y similares. Por lo tanto, la presente invención

5 puede usarse en el campo de la medicina y similares, por ejemplo, en los campos del desarrollo y la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de varios tumores hematopoyéticos y cánceres sólidos que expresan el gen WT1 a altos niveles.

Texto libre del listado de secuencias

10 SEC ID Nº: 11: Péptido de WT1 modificado SEC ID Nº: 12: Péptido de WT1 modificado

LISTADO DE SECUENCIAS 15

<110> International Institute of Cancer Immunology, Inc.

<120> Péptido de WT1 restringido a HLA-A*1101 y composiciones farmacéuticas que contienen al mismo 20 <130> 102677ep

<150> EP 07850650.8

<151> 14/12/2007 25 <150> JP 2006-355356

<151> 28/12/2006

<160> 13 30 <170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 449

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5

<400> 3

10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 4

20 <210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 5 30 <210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 6 40 <210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

45 <400> 7

<210> 8 50 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8 55

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10 15

<210> 11

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido de WT1 modificado 25

<400> 11

30 <210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Péptido de WT1 modificado

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT 45 <213> Homo sapiens

<400> 13

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos (1) o (2):

5 (1) una secuencia de aminoácidos de Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7),

(2) una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, en la que un aminoácido está sustituido por otro aminoácido, donde el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de (2) tiene una capacidad para unirse a una molécula HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un LTC.
2. Un dímero peptídico que consiste en monómeros peptídicos de (1) y (2) que se unen mediante un enlace disulfuro:

(1) 15

(i) un monómero peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos:

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7), o

20 (ii) un monómero peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, en la que un aminoácido está sustituido por otro aminoácido,

(2)

25 (i) un monómero peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEC ID Nº: 7), Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEC ID Nº: 3), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEC ID Nº: 8) e

30 Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEC ID Nº: 9), o

(ii) un monómero peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 7 SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9, en la que un aminoácido está sustituido por otro aminoácido,

35 donde el dímero peptídico tiene una capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*1101 y tiene una capacidad para inducir a un LTC.
3. Una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende a un péptido de

acuerdo con la reivindicación 1 y/o al dímero peptídico de acuerdo con la reivindicación 2. 40
4. Uso de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y/o el dímero peptídico de acuerdo con la reivindicación 2 para preparar un medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*1101.
5. Un polinucleótido que codifica al péptido de acuerdo con la reivindicación 1. 45
6.

Un vector de expresión que comprende al polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5.
7.

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo a

HLA-A*1101, que comprende un polinucleótido que codifica a un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, o un 50 vector que comprende a dicho polinucleótido.
8. Uso de un polinucleótido que codifica a un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, o un vector que comprende a dicho polinucleótido, para preparar un medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*1101.
9.

Un LTC específico de WT1, que se induce mediante un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y/o un dímero peptídico de acuerdo con la reivindicación 2.
10.

Un método para la inducción de un LTC específico de WT1, que comprende cultivar una célula mononuclear de

60 sangre periférica en presencia del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y/o el dímero peptídico de acuerdo con la reivindicación 2 para inducir al LTC específico de WT1 a partir de la célula mononuclear de sangre periférica.
11. Una célula presentadora de antígenos que presenta un péptido de WT1, que se induce in vitro mediante un

péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y/o un dímero peptídico de acuerdo con la reivindicación 2. 65
12. Un método para la inducción de una célula presentadora de antígenos que presenta a un péptido de WT1, que comprende cultivar una célula presentadora de antígenos inmadura obtenida de un sujeto positivo a HLA-A*1101 en presencia de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y/o un dímero peptídico de acuerdo con la reivindicación 2 para inducir la célula presentadora de antígenos que presenta un péptido de WT1 a partir de la célula presentadora

5 de antígenos inmadura.
13. Un kit para la inducción de un LTC específico de WT1 o para la inducción de una célula presentadora de antígenos que presenta a un péptido de WT1, que comprende al péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y/o al dímero peptídico de acuerdo con la reivindicación 2 como un componente esencial.
14. Un método para el diagnóstico de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende incubar el LTC de acuerdo con la reivindicación 9 o la célula presentadora de antígenos de acuerdo con la reivindicación 11 con una muestra de un sujeto positivo a HLA-A*1101, y determinar la cantidad del mismo.