JPWO2008081701A1 - Ｈｌａ−ａ＊１１０１拘束性ｗｔ１ペプチド、およびそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチド、詳細には、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子と結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有するペプチド、および少なくとも１個のシステイン残基を含むＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む２個のペプチド単量体が、ジスルフィド結合により互いに結合しているペプチド二量体であって、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子と結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有する、ペプチド二量体に関する。さらに本発明は、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらを含む癌治療および／または予防用医薬組成物などに関するものである。

Description

本発明は、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチド、詳細には、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子と結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有するペプチド、および少なくとも１個のシステイン残基を含むＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む２個のペプチド単量体が、ジスルフィド結合により互いに結合しているペプチド二量体であって、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子と結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有する、ペプチド二量体に関する。さらに本発明は、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらを含む癌治療および／または予防用医薬組成物などに関するものである。

ＷＴ１遺伝子（Wilms' tumor 1 gene）は、小児の腎癌であるウイルムス腫瘍の責任遺伝子として同定された遺伝子であり（非特許文献１および２）、ジンクフィンガー構造を有する転写因子である。当初、ＷＴ１遺伝子は癌抑制遺伝子であるとされたが、その後の研究（非特許文献３、４、５および６）により、造血器腫瘍や固形癌においてはむしろ癌遺伝子として働くことが示された。

ＷＴ１遺伝子が多くの悪性腫瘍において高発現していることから、変異のない自己タンパク質であるＷＴ１遺伝子産物の生体内における免疫原性の有無が検証されてきた。その結果、腫瘍細胞で高発現しているＷＴ１遺伝子由来のタンパク質は細胞内プロセッシングにより断片化され、生じたペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して細胞表面に提示されること、およびかかる複合体を認識するＣＴＬがＷＴ１ペプチドワクチネーションにより誘導され得ることが明らかとなった（非特許文献７、８および９）。さらに、ＷＴ１ペプチドまたはＷＴ１ ｃＤＮＡで免疫されたマウスは、移植されたＷＴ１遺伝子発現腫瘍細胞を高い確率で拒絶するが（非特許文献７および１０）、ＷＴ１遺伝子を生理的に発現している正常組織は誘導されたＣＴＬによって傷害されないことも示された（非特許文献７）。ヒト細胞を用いたインビトロの実験において、ヒトＭＨＣクラスＩ分子の１つであるＨＬＡ−Ａ^＊０２０１分子高結合性Ｄｂ１２６ペプチドおよびＷＨ１８７ペプチド（配列番号：１におけるアミノ酸１８７−１９５、ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ）を用いてＨＬＡ−Ａ^＊０２０１を持つヒト末梢血単核球を刺激すると、ＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導され、誘導されたＣＴＬは内因性にＷＴ１遺伝子を高発現している腫瘍細胞に対し特異的な傷害活性を有すること、およびかかるＣＴＬの傷害活性はＨＬＡ−Ａ２拘束性であることが示された（非特許文献１１）。ＨＬＡ−Ａアリールのうち、日本人に最も多いＨＬＡ−Ａ^＊２４０２に適合するＷＴ１ペプチド（ＷＴ１２３５；配列番号：１におけるアミノ酸２３５−２４３、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ）を用いたヒト細胞でのインビトロの実験において、ＷＴ１特異的ＣＴＬ（ＴＡＫ−１）が誘導され（非特許文献１２）、誘導されたＣＴＬは、一部ＷＴ１遺伝子を生理的に発現している正常造血幹細胞のコロニー形成能を抑制しないことが示された（非特許文献１２および１３）。これらの報告から、マウスだけでなくヒトにおいてもＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導が可能であり、かかるＣＴＬがＷＴ１遺伝子を高発現する腫瘍細胞に対しては傷害活性を有するが、ＷＴ１遺伝子を生理的に発現する正常細胞には傷害活性を有さない可能性が強く示唆された（非特許文献７、１０、１１、１２および１３）。

ＷＴ１遺伝子産物は核内タンパク質として存在し、細胞質内でプロテアソームによってプロセッシングを受け、ペプチドに断片化される。断片化されたペプチドは、ＴＡＰ（transporter associated with antigen processing）分子によって小胞体内腔へと導かれ、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成し、細胞表面に提示される。ＣＴＬ前駆細胞がＴＣＲを介してＷＴ１ペプチド−ＭＨＣクラスＩ分子複合体を認識することによって、ＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導され、ＭＨＣクラスＩ分子を介してＷＴ１遺伝子産物を提示する腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を発揮する（非特許文献７、８および９）。そうすると、ＷＴ１遺伝子産物を標的とした癌免疫療法において用いられるＷＴ１ペプチドは、少なくとも生体内でＭＨＣクラスＩ分子に結合する形態となる必要がある。しかし、ＭＨＣクラスＩ分子には多様性があり、それぞれのＭＨＣクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列は異なるため、ＭＨＣクラスＩの型別に適合するペプチドを用意する必要がある。しかしながら、現在分かっているＨＬＡ分子に拘束性のＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０２分子、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１分子、ＨＬＡ−Ａ^＊２６０１分子、ＨＬＡ−Ａ^＊３３０３分子拘束性のもののみである（それぞれ、特許文献１、非特許文献１１、特許文献２、および特許文献３）。従って、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドを見出す必要があった。
国際公開２００３／１０６６８２号公報 国際公開２００５／０９５５９８号公報 特願２００６−４５２８７ Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29;61(7):1257-69. Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9;60(3):509-20. Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998;181:151-212. Review. Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84. Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969-76. Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499-505. Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15;164(4):1873-80. Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995 Jun;145:167-77. Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb;12(2):237-8. Tsuboi A et al., J Clin Immunol. 2000 May;20(3):195-202. Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107. Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1;95(1):286-93. Gao L et al., Blood. 2000 Apr 1;95(7):2198-203.

本発明の解決課題は、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子拘束性であって、ＷＴ１タンパク質由来のアミノ酸配列を含むペプチド、およびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらを含む癌の治療および／または予防用医薬組成物などを提供することにある。

本発明者は、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドのうちＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子と結合能を有するペプチドが、高い確率でＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子と結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有する、ペプチド、
（２）アミノ酸配列の第９位のアミノ酸がＬｙｓまたはＡｒｇである、（１）記載のペプチド、
（３）アミノ酸配列が以下の群：
Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ（配列番号：２）、
Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ（配列番号：３）、
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ（配列番号：４）、
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ（配列番号：５）、
Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ（配列番号：６）、
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ（配列番号：７）、
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ（配列番号：８）、
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ（配列番号：９）、
Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｙｓ（配列番号：１０）、
からなる群より選択される、（１）記載のペプチド、
（４）アミノ酸配列がＡｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ（配列番号：２）である、（３）記載のペプチド、
（５）少なくとも１個のシステイン残基を含むＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む２個のペプチド単量体が、ジスルフィド結合により互いに結合しているペプチド二量体であって、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子と結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有する、ペプチド二量体、
（６）ペプチド単量体のアミノ酸配列が、以下の群：
Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ（配列番号：３）、
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ（配列番号：７）、
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ（配列番号：８）、
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ（配列番号：９）、
からなる群より選択される、（５）記載のペプチド二量体、
（７）（１）記載のペプチドおよび／または（５）記載のペプチド二量体を含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
（８）有効量の（１）記載のペプチドおよび／または（５）記載のペプチド二量体をＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（９）（１）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（１０）（９）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（１１）（９）記載のポリヌクレオチドまたは（１０）記載のベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
（１２）有効量の（９）記載のポリヌクレオチドまたは（１０）記載のベクターをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（１３）（１）記載のペプチドおよび／または（５）記載のペプチド二量体により誘導される、ＷＴ１特異的ＣＴＬ、
（１４）末梢血単核球を（１）記載のペプチドおよび／または（５）記載のペプチド二量体の存在下で培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導方法、
（１５）（１）記載のペプチドおよび／または（５）記載のペプチド二量体を必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導するためのキット、
（１６）（１）記載のペプチドおよび／または（５）記載のペプチド二量体により誘導される、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞、
（１７）未熟抗原提示細胞を（１）記載のペプチドおよび／または（５）記載のペプチド二量体の存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞からＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞の誘導方法、
（１８）（１）記載のペプチドおよび／または（５）記載のペプチド二量体を必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞を誘導するためのキット、
（１９）（１３）記載のＣＴＬまたは（１６）記載の抗原提示細胞を用いることを特徴とする、癌の診断方法、
を提供するものである。

本発明により、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性であって、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチド、およびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらを含む癌の治療および／または予防用医薬組成物などが得られるので、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１を有する対象におけるインビボおよびインビトロでのＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導が可能となる。日本人におけるＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性率は、約１７．９％と高いことから、広範囲の対象においてＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導できる。

図１は、ＷＴ１_２５１を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図２は、ＷＴ１_２７９を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図３は、ＷＴ１_３１２を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図４は、ＷＴ１_３１３を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図５は、ＷＴ１_３３８を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図６は、ＷＴ１_３７８を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図７は、ＷＴ１_３８６を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図８は、ＷＴ１_４１５を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図９は、ＷＴ１_４３６を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。 図１０は、ＷＴ１_３７８ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す（ａ、ｂ、ｃは、それぞれＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性健常人ドナー１、２、３由来ＰＢＭＣを用いたときの細胞傷害活性を示す）。 図１１は、ＷＴ１_３７８ペプチド二量体を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す（ａおよびｂは、それぞれＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性健常人ドナー１および２由来ＰＢＭＣを用いたときの細胞傷害活性を示す）。 図１２は、改変ＷＴ１_３７８ペプチド（Ｇ→Ｉ）を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す（ａ、ｂ、ｃは、それぞれＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性健常人ドナー１、２、３由来ＰＢＭＣを用いたときの細胞傷害活性を示す）。 図１３は、改変ＷＴ１_３７８ペプチド（Ｇ→Ｖ）を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す（ａ、ｂ、ｃは、それぞれＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性健常人ドナー１、２、３由来ＰＢＭＣを用いたときの細胞傷害活性を示す）。 図１４は、ＷＴ１_３７９ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す（ａ、ｂ、ｃは、それぞれＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性健常人ドナー１、２、３由来ＰＢＭＣを用いたときの細胞傷害活性を示す）。

本発明は、１の態様において、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子と結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有するペプチド（本明細書において、「ＷＴ１ペプチド」ともいう）に関するものである。ヒトＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。本発明のペプチドは、かかる配列番号：１に示されるアミノ酸配列中の連続する９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むものである。本発明のペプチドが、後述の配列番号３、７、８および９のアミノ酸配列などのシステインを含むアミノ酸配列を含む場合、かかるアミノ酸配列中のシステインを他のアミノ酸などの別の物質（例えば、セリン、アラニン、α−アミノ酪酸）に置換して、あるいはシステインのＳＨ基を当該技術分野で既知の保護基（例えば、カルボキシメチル基、ピリジルエチル基）で修飾することにより、安定性を上昇させてもよい。本発明のペプチドは、細胞内でプロセッシングされて、プロセッシングされたペプチドが抗原提示細胞により提示されることにより、ＣＴＬを誘導することができる癌抗原ペプチドである。

本発明は、上述の通りＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性を有するペプチドを得ることを目的とする。従って、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子と結合能を有するものである。結合能は、当該技術分野において既知の方法により調べることができる。かかる方法として、例えば、Ｒａｎｋｐｅｐ、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩなどのコンピューターベースの方法、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子結合能を有する既知のペプチドとの競合的結合試験などがある。例えば、調べた結合能を既知のＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ペプチドの結合能と比較し、本発明のペプチドが結合能を有するかどうかを判断することができる。本発明における結合能を有するペプチドの例は、本願明細書の実施例１に記載した方法により得られるＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子に対する親和性スコアが４以上のもの、好ましくは、５以上のもの、より好ましくは、６以上のものである。

本発明のペプチドは、さらに、ＣＴＬ誘導能を有するものである。ＷＴ１遺伝子は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において天然型で高発現しているので、本発明のペプチドは、かかる疾患に罹患した対象において、高い確率でＣＴＬを誘導することなどが可能である。ＣＴＬ誘導能は、インビボまたはインビトロにおいてＣＴＬを誘導することができる能力をいう。かかる誘導能は、一般的な方法、例えば、Ｃｒ遊離アッセイを用いてＣＴＬの細胞傷害活性を調べることなどにより調べることができる。

本発明のペプチドは、アミノ酸配列の第９位のアミノ酸がＬｙｓまたはＡｒｇのものであってもよい。かかるアミノ酸を有することで、ペプチドのＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との結合能が高くなると考えられる。

本発明のペプチドが含む該９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列のうち好ましいものは、Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ（配列番号：２）、Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ（配列番号：３）、Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ（配列番号：４）、Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ（配列番号：５）、Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ（配列番号：６）、Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ（配列番号：７）、Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ（配列番号：８）、Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ（配列番号：９）、またはＡｓｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｙｓ（配列番号：１０）であり、最も好ましいものは、Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ（配列番号：７）である。さらに、配列番号：２〜１０のいずれかにおいて、該９個のアミノ酸のうち１個ないし数個、好ましくは１個ないし５個のアミノ酸が別のアミノ酸に置換されたものであってもよい。また、該９個のアミノ酸および置換された別のアミノ酸のいずれかが、適宜修飾されたものであってもよい。但し、いずれの場合においても、本発明のペプチドがＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との結合能を保持していることが条件となる。

上述の通り、本発明のペプチドは、ＷＴ１タンパク質由来であって、上記９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含んでいればよい。従って、本発明のペプチドは、例えば、配列番号：２〜１０に示すアミノ酸配列からなるペプチドそのものであってもよく、あるいは配列番号：２〜１０に示すアミノ酸配列を含む、ＷＴ１タンパク質またはその一部であってもよい。本発明のペプチドに含まれるアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、９〜５００個、９〜３００個、９〜２００個、９〜１００個、９〜５０個、９〜３０個、９〜１２個などである。本発明のペプチドはまた、上記９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、種々の物質を結合させることができる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。本発明のペプチドにこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に上記９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を生じ、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との複合体として細胞表面に提示されることにより、ＣＴＬ誘導効果を得ることができる。これらの物質は、本発明のペプチドの溶解性を調節するものであってもよく、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるものであってもよく、また例えば、所定の組織・器官に特異的に本発明のペプチドをデリバリーするようなものであってもよく、あるいはまた抗原提示細胞の取込み効率を増強させる作用などを有するものであってもよい。これらの物質はまた、ＣＴＬ誘導能を増大させるもの、例えば、ヘルパーペプチドなどであってもよい。

本発明のペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991などに記載されている。

本発明のペプチドはまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は、当業者に周知のものである。

本発明は、さらなる態様において、少なくとも１個のシステイン残基を含むＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む２個のペプチド単量体が、ジスルフィド結合により互いに結合している、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有する、ペプチド二量体（本明細書において、「ＷＴ１ペプチド二量体」ともいう）に関するものである。本発明のペプチド二量体の安定性は、二量体形態をとることによりペプチド単量体と比較して増大する。本発明のペプチド二量体は、細胞内でプロセッシングされて、プロセッシングされたペプチドが抗原提示細胞により提示されることにより、ＣＴＬを誘導することができる癌抗原ペプチド二量体である。

本発明のＷＴ１ペプチド二量体は、２個のペプチド単量体が、単量体に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合を介して結合することにより、形成される。従って、本発明のＷＴ１ペプチド二量体に含まれるペプチド単量体は、上述のＷＴ１ペプチドであって、かつ少なくとも１個のシステイン残基を含むものである。本発明のＷＴ１ペプチド二量体は、ホモ二量体であっても、ヘテロ二量体であってもよい。

本発明のＷＴ１ペプチド二量体において、ペプチド単量体が含むアミノ酸配列のうち好ましいものは、 Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ（配列番号：３）、Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ（配列番号：７）、Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ（配列番号：８）、またはＳｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ（配列番号：９）であり、最も好ましいものは、Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ（配列番号：７）である。

本発明のＷＴ１ペプチド二量体は、当該技術分野において既知の方法を用いて製造することができる。例えば、ペプチド単量体が１対のシステイン残基を含むとき、本発明のＷＴ１ペプチド二量体は、例えば、システイン側鎖上の保護基を含む全ての保護基を除去し、次に、得られた単量体溶液をアルカリ条件下で空気酸化の対象とするか、あるいはアルカリまたは酸性条件下で酸化剤を添加することによりジスルフィド結合を形成することにより、製造され得る。酸化剤としては、例えば、ヨウ素、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、フェリシアン化カリウムなどが挙げられる。

ペプチド単量体が２個以上のシステイン残基を含むときも、本発明のＷＴ１ペプチド二量体は前記方法により合成される。この場合、異なるタイプのジスルフィド結合に起因して、異性体が得られる。あるいは、本発明のＷＴ１ペプチド二量体は、システイン側鎖の保護基の組み合わせを選択することにより、製造され得る。保護基の組み合わせとしては、例えば、ＭｅＢｚｌ（メチルベンジル）基とＡｃｍ（アセトアミドメチル）基、Ｔｒｔ（トリチル）基とＡｃｍ基、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジルチオ）基とＡｃｍ基、Ｓ−Ｂｕ−ｔ（Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチル）基とＡｃｍ基の組み合わせなどが挙げられる。例えば、ＭｅＢｚｌ基とＡｃｍ基との組み合わせの場合、ＷＴ１ペプチド二量体は、ＭｅＢｚｌ基以外の保護基およびシステイン側鎖上の保護基以外の保護基を除去し、得られた単量体溶液を空気酸化の対象とし、保護されたシステイン残基間でジスルフィド結合を形成し、次に、ヨウ素により脱保護および酸化して、Ａｃｍで保護されていたしシステイン残基間でジスルフィド結合を形成することにより、製造され得る。

本発明は、もう１つの態様において、上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体を含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。ＷＴ１遺伝子は、各種の癌や腫瘍、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において高発現しているため、本発明の医薬組成物を癌の治療または予防のために用いることができる。本発明の医薬組成物がＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与されると、該医薬組成物に含まれるＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドまたはＷＴ１ペプチド二量体により、ＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導され、かかるＣＴＬにより対象中の癌細胞が傷害される。

本発明の医薬組成物は、有効成分としての上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物に含まれるＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドまたはＷＴ１ペプチド二量体は、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することから、その誘導効率を増強させるために、本発明の医薬組成物は適当なアジュバントを含むか、あるいは適当なアジュバントと共に投与されてもよい。好ましいアジュバントとしては、例えば、完全または不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどが挙げられるがこれらに制限されない。

本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。本発明の医薬組成物に含まれるペプチドまたはペプチド二量体の量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択できるが、１回あたりのペプチド投与量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇである。

本発明は、別の態様において、有効量の上記ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体をＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、いずれのものであってもよく、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌を含む。

本発明は、さらなる態様において、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象におけるＷＴ１特異的ＣＴＬの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との複合体を該対象由来試料と反応させ；次に、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するＣＴＬの存在または量を調べる、
工程を含む方法に関するものである。対象由来試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液、リンパ液などの体液、組織などが挙げられる。ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との複合体は、例えば、ビオチンストレプトアビジン法などの当業者に既知の方法を用いて、例えば、テトラマー、ペンタマーなどの形態にされていてもよい。かかる複合体を認識するＣＴＬの存在または量は、当業者に既知の方法により測定することができる。本発明のこの態様において、上記複合体は標識されたものであってもよい。標識としては、蛍光標識、放射性標識などの公知のものを使用することができる。標識することで、ＣＴＬの存在または量の決定が容易かつ迅速になる。

従って、本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象におけるＷＴ１特異的ＣＴＬの存在または量を決定するための、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドを含む組成物を提供する。

さらに、本発明は、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドを含む、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象におけるＷＴ１特異的ＣＴＬの存在または量を決定するためのキットを提供する。

本発明は、さらなる態様において、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との複合体を用いて、ＷＴ１特異的ＣＴＬを生成する方法であって、
（ａ）試料と該複合体を反応させ、
（ｂ）該試料中に含まれる該複合体を認識するＣＴＬを得る、
工程を含む方法に関するものである。ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との複合体については上述の通りである。試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液などの対象由来試料、細胞培養液などが挙げられる。複合体を認識するＣＴＬの取得は、例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳなど当業者に既知の方法を用いて行うことができる。得られたＷＴ１特異的ＣＴＬを培養し、種々の癌の治療または予防に用いることも可能になる。

従って、本発明はまた、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との複合体を用いて、ＷＴ１特異的ＣＴＬを生成する方法により得ることのできる、ＷＴ１特異的ＣＴＬに関するものである。

本発明は、さらにもう１つの態様において上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドに関するものである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列に基づき決定できる。該ポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法などの公知のＤＮＡまたはＲＮＡ合成方法、ＰＣＲ法などにより製造することができる。

本発明は、別の態様において上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関するものである。発現ベクターの種類、上記ポリヌクレオチド配列以外で含まれる配列等は、当該発現ベクターを導入する宿主の種類、目的等に応じて適宜選択できる。本発明の発現ベクターをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与し、生体内においてＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドを産生させ、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導し、これにより対象中の造血器腫瘍細胞、固形癌細胞などを傷害することで、該造血器腫瘍、固形癌の治療または予防を行うことができる。

本発明は、さらに別の態様において上記ポリヌクレオチドまたは上記発現ベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。本発明のこの態様の医薬組成物の組成、投与方法等は、上述の通りである。

本発明は、別の態様において、有効量の上記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌を含む。

本発明は、別の態様において、上記発現ベクターを含有する細胞に関するものである。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記発現ベクターを用いて形質転換することにより製造することができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、種々の方法を適宜選択して用いることができる。形質転換した細胞を培養し、産生されたＷＴ１ペプチドを回収・精製することにより、本発明のペプチドを製造することもできる。

本発明は、さらなる態様において、上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体により誘導される、ＷＴ１特異的ＣＴＬに関するものである。本発明のＣＴＬは、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との複合体を認識する。従って、本発明のＣＴＬを用いて、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性、かつＷＴ１高発現腫瘍細胞を特異的に傷害することができる。

本発明は、別の態様において、ＷＴ１特異的ＣＴＬをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。ＷＴ１特異的ＣＴＬの投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。

本発明は、別の態様において、末梢血単核球を上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体の存在下で培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導方法に関するものである。末梢血単核球が由来する対象は、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性であればいずれであってもよい。末梢血単核球をＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体の存在下で培養することで、末梢血単核球中のＣＴＬ前駆細胞からＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導される。本発明により得られたＷＴ１特異的ＣＴＬをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することで、対象の造血器腫瘍、固形癌を治療または予防することができる。

本発明は、さらに別の態様において、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体を必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導するためのキットに関するものである。好ましくは、該キットは上記ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導方法に用いられる。本発明のキットは、上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体のほかに、例えば、末梢血単核球の取得手段、アジュバント、反応容器等を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、ＷＴ１特異的ＣＴＬを効率よく誘導できる。

本発明は、さらなる態様において、上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体により誘導される、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子を介して提示する抗原提示細胞（樹状細胞など）に関するものである。本発明の抗原提示細胞を用いることで、上記ＷＴ１特異的ＣＴＬが効率よく誘導される。

本発明は、別の態様において、上記ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子を介して提示する抗原提示細胞をＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。抗原提示細胞の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。

本発明は、別の態様において、未熟抗原提示細胞を上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体の存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞からＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子を介して提示する抗原提示細胞の誘導方法に関するものである。未熟抗原提示細胞は、未熟樹状細胞などの成熟して抗原提示細胞となり得る細胞をいう。未熟抗原提示細胞が由来する対象は、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性であればいずれのものであってもよい。未熟抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球などに含まれているため、かかる細胞を上記ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体の存在下で培養してもよい。

本発明は、さらに別の態様において、上記ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドおよび／またはＷＴ１ペプチド二量体を必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導するためのキットに関するものである。好ましくは、該キットは上記抗原提示細胞の誘導方法に用いられる。本発明のキットに含まれるその他の構成成分等は上述の通りである。本発明のキットを用いて、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子を介して提示する抗原提示細胞を効率よく誘導できる。

本発明は、別の態様において、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体に関するものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。

本発明は、さらなる態様において、上記ＷＴ１特異的ＣＴＬ、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子を介して提示する抗原提示細胞、またはＨＬＡ−Ａ拘束性ＷＴ１ペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体を用いることを特徴とする、癌の診断方法に関するものである。好ましくは、ＷＴ１特異的ＣＴＬが本発明の診断方法に用いられる。例えば、上記ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体をＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象由来の試料とインキュベーションする、あるいはＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与し、次に該ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体の例えば、位置、部位、量等を決定することで、癌の診断が可能となる。上記ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体は、標識されたものであってもよい。かかる標識を付すことで、本発明の診断方法を効率よく行うことができる。

以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

ＷＴ１ペプチドの選択
ＲＡＮＫＰＥＰ（http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html）を用いて、ＷＴ１タンパク質（配列番号：１）由来のペプチドから、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との結合能の高いＷＴ１_２５１、ＷＴ１_２７９、ＷＴ１_３１２、ＷＴ１_３１３、ＷＴ１_３３８、ＷＴ１_３７８、ＷＴ１_３８６、ＷＴ１_４１５、およびＷＴ１_４３６を選択した。これらのペプチドのアミノ酸配列、配列番号：１におけるアミノ酸番号、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子に対する親和性スコアを表１に示す。

Ｂ−ＬＣＬ細胞の調製
ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性健常人ドナーより採取した末梢血からFicoll-Hypaque gradient density centrifugation法により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。次に、ＰＢＭＣを２４ウェル細胞培養用プレートに１０％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地中約１×１０^７個の密度で播種し、Ｂ９５−８細胞（ＥＢウイルス産生細胞）の培養上清を添加して、３７℃、５％ ＣＯ_２で約１ヶ月間培養した。ＥＢウイルスにより形質転換された、Ｂ細胞系腫瘍細胞であるＢ−ＬＣＬ細胞を得た。得られたＢ−ＬＣＬ細胞がＷＴ１遺伝子を発現していないことを確認した。Ｂ−ＬＣＬ細胞を２０μｇ／ｍｌ ＷＴ１_２５１、ＷＴ１_２７９、ＷＴ１_３１２、ＷＴ１_３１３、ＷＴ１_３３８、ＷＴ１_３７８、ＷＴ１_３８６、ＷＴ１_４１５、またはＷＴ１_４３６と共に２時間インキュベーションすることでパルスし、次に、放射線８０Ｇｙを照射させた。得られたＢ−ＬＣＬ細胞（以下、ＷＴ１ペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞という）を抗原提示細胞として以下の実験に用いた。

ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導
自己のＰＢＭＣ３×１０^６個を、２４ウェル細胞培養用プレートにて２０μｇ／ｍｌ ＷＴ１_２５１、ＷＴ１_２７９、ＷＴ１_３１２、ＷＴ１_３１３、ＷＴ１_３３８、ＷＴ１_３７８、ＷＴ１_３８６、ＷＴ１_４１５、またはＷＴ１_４３６を含む完全培地（４５％ ＲＰＭＩ、４５％ ＡＭＩ−Ｖ培地、および１０％ ヒトＡＢ血清）中、３７℃、５％ ＣＯ_２で１週間培養し、応答細胞を得た。得られた応答細胞 ２×１０^６個を、同じＷＴ１ペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞 １×１０^６個と完全培地中で１週間共培養した（１回目刺激）。ＰＢＭＣをＷＴ１ペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞とさらに３回共培養し（２〜４回目刺激）、その際２０ＩＵ／ｍｌ（最終濃度）ＩＬ２を、次の条件；２回目刺激：刺激開始の３日後から１日置き計２回；３回目および４回目刺激：刺激開始の翌日から１日置き計３回添加した。得られた細胞を、Negative Selection Columns Gravity Feed Kit（StemSp）を用いてＣＤ８陽性Ｔ細胞が約８０％となるよう濃縮し、次に、ＷＴ１ペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞と共培養した（５回目刺激）。最終刺激の５日後のＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を細胞傷害活性の測定のために用いた。

ＣＴＬの細胞傷害活性
ＣＴＬの細胞傷害活性を^５１Ｃｒ遊離試験を用いて測定した。ＣＴＬ細胞（以下、エフェクター細胞ともいう）を、あらかじめ^５１Ｃｒを取り込ませた標的細胞と１：１ないし３０：１の比率（Ｅ／Ｔ比）となるよう培地 ２００μｌに調製し、９６ウェル細胞培養用プレート中、３７℃、５％ ＣＯ_２で４時間培養した。標的細胞として、ＣＴＬ誘導に用いたＷＴ１ペプチドと同じペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞（ＢＬＣＬ−Ｐ）、およびＷＴ１ペプチドをパルスしていないＢ−ＬＣＬ細胞（ＢＬＣＬ−ＮＰ）を用いた。培養後、遠心して上清を回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて、上清中に遊離した^５１Ｃｒ量を測定した。細胞傷害活性（％）を次の式：
（試料上清中の^５１Ｃｒ遊離量−自然発生^５１Ｃｒ遊離量）／（最大^５１Ｃｒ遊離量−自然発生^５１Ｃｒ遊離量）×１００
（自然発生^５１Ｃｒ遊離量は、^５１Ｃｒを取り込ませた標的細胞のみを同様の条件で培養したときの^５１Ｃｒ遊離量であり、最大^５１Ｃｒ遊離量は、^５１Ｃｒを取り込ませた標的細胞を１％ トリトンＸ−１００を用いて全細胞を溶解させたときの^５１Ｃｒ遊離量である）
を用いて決定した。結果を図１〜９に示す。図中、縦軸は特異的溶解（％）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また、ＢＬＣＬ−Ｐを実線、ＢＬＣＬ−ＮＰを点線で示す。ＷＴ１_２５１、ＷＴ１_２７９、ＷＴ１_３１２、ＷＴ１_３１３、ＷＴ１_３３８、ＷＴ１_３７８、ＷＴ１_３８６、ＷＴ１_４１５、およびＷＴ１_４３６を用いて誘導されたＣＴＬは、ＢＬＣＬ−ＮＰ細胞と比較して、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との複合体として提示しているＢＬＣＬ−Ｐ細胞を特異的に傷害することが確認できた。以下で、ＷＴ１_２５１、ＷＴ１_２７９、ＷＴ１_３１３、ＷＴ１_３３８、およびＷＴ１_３８６を用いて誘導されたＣＴＬについてさらなる実験を行った。

ＣＴＬの内因性ＷＴ１遺伝子発現細胞に対する細胞傷害活性
ＷＴ１_２５１、ＷＴ１_２７９、ＷＴ１_３１３、ＷＴ１_３３８、およびＷＴ１_３８６を用いて誘導されたＣＴＬのＷＴ１発現Ｂ−ＬＣＬに対する細胞傷害活性を上述の方法を用いて決定した。ＷＴ１発現細胞は、ヒトＷＴ１遺伝子を導入したＢ−ＬＣＬ細胞であって、細胞内でＷＴ１タンパク質を発現し、プロセスされて約９個のアミノ酸からなるペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子上に発現する細胞をいう。結果を図１、２、４、５、および７に示す。図中、ＷＴ１発現Ｂ−ＬＣＬを破線で示す。ＷＴ１_２５１、ＷＴ１_２７９、ＷＴ１_３１３、ＷＴ１_３３８、およびＷＴ１_３８６を用いて誘導されたＣＴＬが、ＷＴ１遺伝子を内因性に発現している細胞に対しても傷害活性を有することが確認できた。

ＷＴ１ペプチド二量体の製造
ＷＴ１_３７８ペプチド単量体２２７．５ｍｇ、Ｎ−メチルグルカミン（ＮＭＧ）２２７．５ｍｇおよび水２３ｍｌの混合物を室温で約２日間攪拌することにより、空気酸化した。得られた混合液に酢酸ナトリウム２ｇを水５ｍｌに溶解した水溶液を加え約２０分間、室温にて攪拌した。水２００ｍｌとアセトニトリル約２００ｍｌを添加し、桐山ロート（ろ紙 Ｎｏ．５Ｃ）でろ過し、水（約５０ｍｌ×３回）で洗浄した。残渣に水約２００ｍｌを添加し、凍結乾燥を行い、粗ペプチドＷＴ１_３７８二量体１５８ｍｇを得た。

粗ＷＴ１ペプチド二量体の精製
粗ＷＴ１ペプチド_３７８二量体１５８ｍｇをＤＭＳＯ ９ｍｌに溶解し、ＨＰＬＣ（島津製作所製 ＬＣ８ＡＤ型）にセットした、１液（Ｈ_２Ｏ／１％ ＡｃＯＨ）で平衡化したＯＤＳ Ｃ_１８カラム（５ｃｍ Φ×５０ｃｍ Ｌ，ＹＭＣ社製）にＨＰＬＣポンプを用いて注入した。カラムを約３０分間そのままにし、０％〜４０％の濃度勾配の２液（ＣＨ_３ＣＮ／１％ ＡｃＯＨ）で３６０分間かけて溶出した。２２０ｎｍでのＵＶ吸収をモニターしながら、自動分画装置を用いて、ＷＴ１ペプチド二量体を含む分画を回収した。回収した分画を合わせ、ＨＰＬＣ（日立製 Ｌ−４０００型）にセットした、１７％の２液で平衡化したＯＤＳ Ｃ_１８カラム（４．６ｍｍ Φ×２５ｃｍ Ｌ，ＹＭＣ社製）に注入し、０％〜４７％の濃度勾配の２液で３０分かけて溶出し、保持時間２０．５１分の精製ＷＴ１_３７８ペプチド二量体４６．６ｍｇを得た。
ＦＡＢ．ＭＳ ２３６５．０（理論値 ２３４２．７０）Ｎａ^＋ Ｆ＝０．２５％

ＷＴ１ペプチド二量体によるＣＴＬ誘導
得られたＷＴ１_３７８ペプチド二量体、ＷＴ１_３７８ペプチド、改変ＷＴ１_３７８ペプチド（Ｇ→Ｉ）（配列番号：１１）および改変ＷＴ１_３７８ペプチド（Ｇ→Ｖ）（配列番号：１２）、ＷＴ１_３７９ペプチド（配列番号：１３，国際公開第２００２／２８４１４号において開示）のＣＴＬ誘導能を、上述の方法により、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性健常人ドナー１〜３由来のＰＢＭＣを用いて調べた。結果を図１０〜１４に示す。図中、縦軸は特異的溶解（％）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また、ＢＬＣＬ−Ｐを実線、ＢＬＣＬ−ＮＰを点線で示す。ＷＴ１_３７８ペプチド二量体がＣＴＬ誘導能を有することが確認できた。また、ＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列において、ＷＴ１_３７８ペプチドと１アミノ酸ずつ異なるＷＴ１_３７９ペプチドのＣＴＬ誘導能は、ＷＴ１_３７８ペプチドと比較して極めて低く、本発明のＷＴ１ペプチドが既知のＷＴ１ペプチドと比較して格別顕著なＣＴＬ誘導能を有することがわかった。

本発明により、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１拘束性ＷＴ１ペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれらを含む医薬組成物等が提供されるので、医薬品等の分野、例えば、ＷＴ１遺伝子を高発現している種々の造血器腫瘍、固形癌の予防薬、または治療薬の開発、製造分野において利用可能である。

SEQ ID NO: 11: Modified WT1 peptide
SEQ ID NO: 12: Modified WT1 peptide

Claims (19)

1. ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有する、ペプチド。
2. アミノ酸配列の第９位のアミノ酸がＬｙｓまたはＡｒｇである、請求項１記載のペプチド。
3. アミノ酸配列が以下の群：
   Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ（配列番号：２）、
   Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ（配列番号：３）、
   Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ（配列番号：４）、
   Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ（配列番号：５）、
   Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ（配列番号：６）、
   Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ（配列番号：７）、
   Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ（配列番号：８）、
   Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ（配列番号：９）、
   Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｙｓ（配列番号：１０）、からなる群より選択される、請求項１記載のペプチド。
4. アミノ酸配列がＡｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ（配列番号：２）である、請求項３記載のペプチド。
5. 少なくとも１個のシステイン残基を含むＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む２個のペプチド単量体が、ジスルフィド結合により互いに結合しているペプチド二量体であって、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１分子との結合能を有し、かつＣＴＬ誘導能を有する、ペプチド二量体。
6. ペプチド単量体のアミノ酸配列が、以下の群：
   Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ（配列番号：３）、
   Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ（配列番号：７）、
   Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ（配列番号：８）、
   Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ（配列番号：９）、
   からなる群より選択される、請求項５記載のペプチド二量体。
7. 請求項１記載のペプチドおよび／または請求項５記載のペプチド二量体を含む、癌を治療または予防するための医薬組成物。
8. 有効量の請求項１記載のペプチドおよび／または請求項５記載のペプチド二量体をＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
9. 請求項１記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
10. 請求項９記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
11. 請求項９記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０記載のベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物。
12. 有効量の請求項９記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０記載のベクターをＨＬＡ−Ａ^＊１１０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
13. 請求項１記載のペプチドおよび／または請求項５記載のペプチド二量体により誘導される、ＷＴ１特異的ＣＴＬ。
14. 末梢血単核球を請求項１記載のペプチドおよび／または請求項５記載のペプチド二量体の存在下で培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導方法。
15. 請求項１記載のペプチドおよび／または請求項５記載のペプチド二量体を必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導するためのキット。
16. 請求項１記載のペプチドおよび／または請求項５記載のペプチド二量体により誘導される、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞。
17. 未熟抗原提示細胞を請求項１記載のペプチドおよび／または請求項５記載のペプチド二量体の存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞からＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞の誘導方法。
18. 請求項１記載のペプチドおよび／または請求項５記載のペプチド二量体を必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞を誘導するためのキット。
19. 請求項１３記載のＣＴＬまたは請求項１６記載の抗原提示細胞を用いることを特徴とする、癌の診断方法。

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