ES2629578T3

ES2629578T3 - Péptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y una composición farmacéutica que comprenden el mismo

Info

Publication number: ES2629578T3
Application number: ES15201329.8T
Authority: ES
Inventors: Haruo Sugiyama
Original assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2017-08-11
Anticipated expiration: 2027-12-14
Also published as: PH12014500902A1; DK2479276T3; MY161664A; WO2008081701A1; CN102295682A; HK1221252A1; EP2980219A1; JP5484734B2; EP3026115A1; TW200835513A; EP2098595A1; HK1173187A1; CA2886621A1; EP2341142A2; EP2479276A1; CN102659924B; CN102302788B; EP3026115B1; US20110098233A1; TWI417103B

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos (1) o (2): (1) una secuencia de aminoácidos de Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5), (2) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, en la que se sustituye un aminoácido con otro aminoácido, donde el péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos (2) tiene la capacidad de unirse a una molécula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL.

Description

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DESCRIPCION

Peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y una composicion farmaceutica que comprenden el mismo Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o preven cion del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un peptido WT1 restringido a HLA-A*1101, espedficamente un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste en SEQ ID NO: 5 que tiene 9 aminoacidos contiguos de una protema WT1 o una mutante de la misma, donde un aminoacido se ha sustituido con otro aminoacido, donde el peptido tiene capacidad para unirse a una moleculas HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL. Ademas, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o prevencion del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un polinucleotido que codifica el peptido.

Antecedentes

El gen WT1 (gen 1 del tumor de Wilms) se identifico como un gen responsable del tumor de Wilms que es un cancer renal en ninos (Documentos no patente 1 y 2). El WT1 es un factor de transcripcion que tiene una estructura en dedo de zinc. Al principio, se considero que el gen WT1

El gen WT1 se expresa con altos niveles en muchos tipos de tumores malignos. Entonces, se examino si el producto genetico WT1 libre de mutaciones, que es una protema autologa, tiene o no inmunogenicidad en un ser vivo. Los resultados revelaron que la protema derivada del gen WT1 que se expresa con altos niveles en celulas tumorales se fragmenta por medio de un proceso intracelular, los peptidos resultantes forman complejos con moleculas del MHC clase I, y los complejos se presentan en las superficies de las celulas, y que los CTL que reconocen tales complejos pueden inducirse por vacunacion peptfdica (Documentos no patentes 7, 8 y 9). Tambien se demostro que un raton inmunizado con un peptido WT1 o un ADNc WT1, rechaza las celulas tumorales trasplantadas que expresan un gen WT1 con una alta probabilidad (Documentos no patentes 7 y 10), mientras que los tejidos normales que expresan fisiologicamente el gen WT1 no son danados por los CTL que se inducen (Documento de patente 7). Se ha demostrado en experimentos in vitro, utilizando celulas humanas, que cuando se utiliza el peptido Db126 o el peptido WH187 (aminoacidos 187-195 de la SEQ ID NO: 1, SGLEQQYSV) que tienen una gran capacidad para unirse a una molecula HLA-A*0201, que es una de las moleculas del MHC clase I humano, para estimular las celulas mononucleares de sangre periferica humanas que tienen HLA-A*0201, se inducen CTL espedficos de WT1, los CTL inducidos tienen una actividad citotoxica espedfica para las celulas tumorales que expresan endogenamente un gen WT1 a altos niveles, y la actividad citotoxica de tales CTL esta restringida a HLA-A2 (Documento de patente 11). Se ha demostrado en experimentos in vitro en celulas humanas utilizando el peptido WT1 que coincidfa con HLA- A*2402 (que se encuentra mas frecuentemente en la poblacion japonesa entre los alelos HLA-A) (WT1235; aminoacidos 235-243 de la SEQ ID NO: 1, CMTWNQmNl) que se inducen CTL espedficos de WT1 (TAK-1) (Documento no patente 12), y los CTL inducidos no suprimen la actividad formadora de colonias de las celulas madre hematopoyeticas normales que expresan fisiologicamente un gen WT1 parcialmente (Documentos no patentes 12 y 13). Estos informes sugieren fuertemente que no solamente en los ratones sino tambien en los seres humanos, se pueden inducir CTL espedficos de WT1, tales CTL tienen una actividad citotoxica contra las celulas tumorales que expresan un gen WT1 con altos niveles, pero no tienen una actividad citotoxica contra las celulas normales que expresan fisiologicamente un gen WT1 (Documentos de patentes 7, 10, 11, 12 y 13).

El producto del gen WT1 esta presente como una protema nuclear, y se procesa en los proteosomas del citoplasma para fragmentarse en peptidos. Los peptidos fragmentados se transportan al lumen del retmulo endoplasmico por las moleculas TAP (transportadoras asociadas con el procesamiento antigenico), forman complejos con moleculas del MHC clase I, y se presentan en la superficie de las celulas. Los CTL espedficos de WT1 se inducen como resultado del reconocimiento de los complejos peptido WT1- molecula MHC clase I por las celulas precursoras de CTL por medio del TCR, ejerciendo de esta manera un efecto citotoxico sobre las celulas tumorales que presentan un producto del gen WT1 por medio de moleculas del MHC clase I (Documentos de patentes 7, 8 y 9). Entonces, se necesita al menos que un peptido WT1 que se utilice en inmunoterapia dirigida del cancer contra un producto del gen WT1 este en la forma en que se une a una molecula del MHC clase I en un organismo vivo. Sin embargo, las moleculas del MHC clase I son diferentes y las secuencias de aminoacidos de los peptidos WT1 que se unen a cada subtipo del MHC clase I respectivas son diferentes entre ellos. Por lo tanto, se necesita proporcionar un peptido que se una con cada subtipo de MHC clase I. Sin embargo, solo se conocen hasta la fecha los peptidos restringidos a la molecula HLA-A*2402, molecula HLA-A*0201, molecula HLA-A*2601 y molecula HLA-A*3303 como peptidos WT1 restringidos a moleculas HLA (Documento patente 1, Documento no patente 11, Documento patente 2 y Documento patente 3, respectivamente). Por lo tanto, existe la necesidad de encontrar un peptido WT1 restringido a HLA- A*1101.

Documento Patente 1: WO 2003/106682

Documento Patente 2: WO 2005/095598

Documento Patente 3: Solicitud de Patente Japonesa N° 2006-45287

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Documento no Patente 1: Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29; 61(7):1257-69.

Documento no Patente 2: Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9; 60 (3): 509-20.

Documento no Patente 3: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181:151-212. Review.

Documento no Patente 4: Yamagami T et al., Blood. 1996 Abr 1; 87(7):2878-84.

Documento no Patente 5: Inoue K et al., Blood. 1998 Abr 15; 91 (8):2969-76.

Documento no Patente 6: Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May; 23(5):499-505.

Documento no Patente 7: Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15; 164(4):1873-80.

Documento no Patente 8: Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995 Jun; 145:167-77.

Documento no Patente 9: Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb; 12 (2):237-8.

Documento no Patente 10: Tsuboi A et al., J Clin Immunol. 2000 May; 20(3):195-202.

Documento no Patente 11: Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb; 51 (2):99-107.

Documento no Patente 12: Ohminami H et al., Blood. 2000 Ene 1; 95(1):286-93.

Documento no Patente 13: Gao L et al., Blood. 2000 Abr 1; 95(7):2198-203.

Divulgacion de la invencion

Problemas a resolver por la invencion

Los problemas a resolver por la presente invencion son proporcionar un peptido que este restringido a la molecula HLA-A*1101 y comprenda una secuencia de aminoacidos de una protema WT1, y un polinucleotido que codifica el mismo, asf como una composicion farmaceutica para el tratamiento y/o prevencion de un cancer, que comprende el mismo, y similares.

Medios de resolver los problemas

Como resultado de estudios intensos en vista de la situacion que se describe anteriormente, el presente inventor ha descubierto que entre los peptidos que comprenden cada uno una secuencia de aminoacidos que consiste en 9 aminoacidos contiguos de una protema WT1, teniendo cada peptido la capacidad de unirse a una molecula HLA- A*1101 puede inducir un CTL espedfico de WT1 con una alta tasa. Por lo tanto, la presente invencion ha sido completada.

La presente invencion proporciona:

(I) una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o prevencion de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un peptido que consiste en (1) o (2):

(1) Una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, en la que un aminoacido esta sustituido con otro aminoacido, donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL;

(II) el uso de un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, en la que un aminoacido esta sustituido con otro aminoacido, donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*110, y tiene la capacidad de inducir un CTL, para preparar un medicamento para el tratamiento o prevencion de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101;

(III) una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o prevencion de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un polinucleotido que codifica un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, en la que un aminoacido esta sustituido con otro aminoacido, donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL, o un vector que comprende dicho polinucleotido;

(IV) el uso de un polinucleotido que codifica un peptido que consisten en la secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5)

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(2) una secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 5, en la cual un aminoacido esta sustituido con otro aminoacido, donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de (2) tiene la capacidad para unirse a una molecula de HLA-A*1101 y tiene la capacidad de inducir un CTL, un vector de expresion que comprende dicho polinucleotido para preparar un medicamento para el tratamiento o prevencion de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101;

(V) un metodo para la induccion de un CTL espedfico de WT1, que sea adecuado para el tratamiento del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, donde el metodo comprende el cultivo de una celula mononuclear de sangre periferica obtenida del sujeto positivo a HLA-A*1101 en presencia de un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO:5),

(2) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, en la que un aminoacido esta sustituido con otro aminoacido, donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL, para inducir CTL espedficos de WT1 a partir de la celula mononuclear de sangre periferica;

(VI) un CTL espedfico de WT1, para su uso en el tratamiento del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que se obtiene por el metodo de acuerdo con (V);

(VII) un metodo para la induccion de una celula presentadora de antigeno que presenta un peptido WT1, y que sea adecuado para el tratamiento del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, donde el metodo comprende el cultivo de una celula presentadora de antigeno inmadura que se obtiene del sujeto positivo a HLA-A*1101 en presencia de un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, en la que un aminoacido esta sustituido con otro aminoacido, donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL, para inducir una celula presentadora de antigeno que presenta un peptido WT1 a partir de una celula presentadora de antigeno inmadura;

(VIII) una celula presentadora de antigeno que presenta un peptido WT1, para su uso en el tratamiento del cancer de un sujeto positivo a HLA-A*1101, que se obtiene in vitro por el metodo de acuerdo con (VII); y

(IX) un metodo para el diagnostico de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende la utilizacion del CTL de acuerdo con (VI) o la celula presentadora de antfgeno de acuerdo con (VIII).

Efectos de la invencion

La presente invencion proporciona un peptido que esta restringido a HLA-A*1101 y comprende una secuencia de aminoacidos que consiste en 9 aminoacidos contiguos de una protema WT1, y un polinucleotido que codifica el mismo, asf como una composicion farmaceutica para el tratamiento y/o prevencion de un cancer, que comprende el mismo. Por lo tanto es posible inducir CTL espedficos de WT1 in vivo e in vitro en sujetos que tienen HLA-A*1101. Debido a que la tasa de positivos a HLA-A*1101 entre la poblacion japonesa es alta (aproximadamente un 17,9%), los CTL espedficos de WT1 se pueden inducir en un amplio intervalo de sujetos.

Breve descripcion de los dibujos

La: Fig. 1 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 251.

La: Fig. 2 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 279.

La: Fig. 3 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 312.

La: Fig. 4 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 313.

La: Fig. 5 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 338.

La: Fig. 6 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 378.

La: Fig. 7 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 386.

La: Fig. 8 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 415.

La: Fig. 9 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con WT1 436.

La Fig. 10 representa la actividad citotoxica del CTL inducido por el peptido WT1378 (a, b y c representan las actividades citotoxicas que se observaron utilizando PBMC de los donantes sanos positivos a HLA-A*1101 1, 2 y 3, respectivamente).

La Fig. 11 representa la actividad citotoxica del CTL inducido por el dfmero peptfdico WT1378 (a y b representan las actividades citotoxicas que se observaron utilizando PBMC de los donantes sanos positivos a HLA-A*1101 1 y 2, respectivamente).

La Fig. 12 representa la actividad citotoxica del CTL inducido con el peptido WT1378 modificado (G^I) (a, b y c representan las actividades citotoxicas que se observaron utilizando PBMC de los donantes sanos positivos a

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HLA-A*1101 1,2 y 3, respectivamente).

La Fig. 13 representa la actividad citotoxica del CTL inducida con el peptido modificado WTI378 (G^V) (a, b, y c representan las actividades citotoxicas que se observaron utilizando PBMC de los donantes sanos positivos a hLa-A*1101 1, 2 y 3, respectivamente).

La Fig. 14 representa la actividad citotoxica del CTL inducido por el peptido WTI379 (a, b y c representan las actividades citotoxicas que se observaron utilizando PBMC de los donantes sanos positivos a HLA-A*1101 1, 2 y 3, respectivamente).

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

En un aspecto, la presente invencion se refiere a un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste en 9 aminoacidos contiguos de una protema WT1, donde el peptido tiene la capacidad de unirse a una molecula HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL (tambien denominado en el presente documento un “peptido WT1”). La secuencia de aminoacidos de la protema WT1 humana se muestra en la SEQ ID NO: 1. El peptido de la presente invencion que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende cistema(s) tal como las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 3, 7, 8 o 9 como se describe posteriormente, se puede aumentar la estabilidad sustituyendo las cistema(s) de la secuencia de aminoacidos con otra sustancia tal como otro aminoacido (por ejemplo, serina, alanina y acido a-aminobutmco) o modificando el grupo SH de la cistema(s) con un grupo protector conocido en la tecnica (por ejemplo, un grupo carboximetilo o un grupo piridiletilo). El peptido de la presente invencion es un peptido antigenico de cancer que puede inducir un CTL como resultado de la presentacion, por una celula presentadora de antigeno, de un peptido que se genera procesando el peptido de la presente invencion en una celula.

Como se ha descrito anteriormente, es un objetivo de la presente invencion obtener un peptido restringido a HLA- A*1101. Por lo tanto, el peptido de la presente invencion tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA- A*1101. La capacidad para unirse se puede determinar por un metodo conocido en la tecnica. Ejemplos de estos metodos incluyen un metodo basado en computadora tal como BIMAS o SYFPEITHI, y un ensayo de union competitiva con un peptido conocido que tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101. Por ejemplo, se puede comparar una determinada capacidad de unirse con la de un peptido restringido a HLA-A*1101 conocido para juzgar si el peptido de la presente invencion tiene la capacidad de unirse o no. Ejemplos de peptidos que tienen la capacidad de unirse de acuerdo con la presente invencion incluyen un peptido del que se ha determinado un valor de afinidad con una molecula de HLA-A*1101 como se determina por el metodo que se describe en el ejemplo 1 es 4 o mas, preferentemente 5 o mas, mas preferentemente 6 o mas.

El peptido de la presente invencion tiene la capacidad ademas para inducir un CTL. El gen WT1 se expresa en su forma nativa a altos niveles, por ejemplo, en tumores hematopoyeticos tales como leucemia, smdrome mielodisplasico, mieloma multiple o linfoma maligno y en canceres solidos tales como cancer gastrico, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de celulas germinales, cancer hepatico, cancer de piel, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer uterino, cancer de cuello uterino o cancer ovarico. Por lo tanto, el peptido de la presente invencion puede inducir un CTL con una alta tasa en un sujeto que padece tal enfermedad. La capacidad para inducir un cTl se refiere a la capacidad para inducir un CTL in vivo o in vitro. Tal capacidad puede determinarse utilizando un metodo general tal como un metodo en el que se determina la actividad citotoxica de un CTL utilizando un ensayo de liberacion de Cr.

El peptido de la presente invencion puede tener una Lys o Arg en la posicion 9 de la secuencia de aminoacidos. Se considera que teniendo tal aminoacidos, la capacidad del peptido para unirse a una molecula HLA-A*1101 se vuelve mayor.

La secuencia de aminoacidos que consiste en 9 aminoacidos contenida en el peptido de la presente invencion es preferentemente, Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID No: 2), Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No: 3), Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys (SEQ ID No: 4), Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID No: 5), Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys (SEQ ID No: 6), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SeQ iD No: 8), Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No: 9) o Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys (SeQ ID No: 10). Mas preferentemente, es Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7). Ademas, puede tener una sustitucion de uno o varios, preferentemente de uno a cinco aminoacidos con otros aminoacidos en cualquiera de los nueve aminoacidos de la SEQ ID NO: 5. Cualquiera de los 9 aminoacidos u otros aminoacidos sustituidos se pueden modificar apropiadamente. En cualquiera de los casos, el peptido de la presente invencion mantiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101.

Como se ha descrito anteriormente, el peptido de la presente invencion puede ser cualquiera, siempre que contenga una secuencia de aminoacidos que se deriva de una protema WT1 y consiste en 9 aminoacidos contiguos. Por lo tanto, el peptido de la presente invencion puede ser, por ejemplo, un peptido que consiste solamente en la secuencia de aminoacidos mostrada en cualquiera de sEq ID NO: 2-10, o una protema WT1 o una parte de la misma que comprende cualquier secuencia de aminoacidos que se muestra en SEQ ID NO: 2-10. El numero de aminoacidos comprendidos en el peptido de la presente invencion no esta limitado espedficamente, y el numero es, por ejemplo, de 9-500, 9-300, 9-200, 9-100, 9-50, 9-30 y 9-12 aminoacidos. Se pueden unir varias sustancias al

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extremo N y/o el extremo C de la secuencia de aminoacidos que consiste en 9 aminoacidos contiguos en el peptido de la presente invencion. Por ejemplo, se puede unir un aminoacido, un peptido o un analogo del mismo. Si tal sustancia se une al peptido de la presente invencion, la sustancia se puede procesar, por ejemplo, por una enzima en un organismo vivo o por medio de un proceso tal como un proceso intracelular, y finalmente, se puede producir la secuencia de aminoacidos que consiste en 9 aminoacidos contiguos y presentarse como un complejo con una molecula de HLA-A*1101 en la superficie de una celula, resultando de esta manera en el efecto de induccion de un CTL. La sustancia puede ser una sustancia que modula la solubilidad del peptido de la presente invencion, o aumentar su estabilidad (resistencia a proteasas, etc.). De manera alternativa puede ser una sustancia que suministre el peptido de la presente invencion espedficamente, por ejemplo, a un tejido u organo determinado, o puede tener la accion de aumentar la eficacia de la captacion por una celula presentadora de antigeno o similar. La sustancia puede ser una sustancia que aumenta la capacidad para inducir un CTL, tal como un peptido auxiliar o similar.

El peptido de la presente invencion se puede sintetizar por metodos que se utilizan en general en la tecnica o modificaciones de los mismos. Tales metodos se describen, por ejemplo, en Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976 ; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; e lyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide-Gosei, Hirokawa - Book store, 1991.

El peptido de la presente invencion se puede preparar tambien utilizando tecnicas de modificacion genetica que se basan en la informacion sobre la secuencia de nucleotidos que codifica el peptido de la presente invencion. Tales tecnicas de modificacion genetica son bien conocidas por un experto en la tecnica.

En un aspecto mas, la presente invencion se refiere a un dfmero peptfdico que tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101 y que tiene la capacidad de inducir un CTL, en el que dos monomeros peptfdicos comprenden cada uno una secuencia de aminoacidos que consiste en 9 aminoacidos contiguos de una protema WT1 y que comprenden al menos un resto de cistema, se unen entre ellos a traves de un enlace disulfuro (de aqrn en adelante tambien denominado un “dfmero peptfdico WT1”). La estabilidad del dfmero peptfdico de la presente invencion esta aumentada en comparacion con la del monomero peptfdico al formar un dfmero. El dfmero peptfdico de la presente invencion es un dfmero peptfdico antigenico tumoral que puede inducir un CTL como resultado de la presentacion, por una celula presentadora de antfgeno, de un peptido generado por procesamiento del peptido de la presente invencion en una celula.

El dfmero peptfdico de la presente invencion se forma uniendo dos monomeros peptfdicos por medio de un enlace disulfuro entre los restos de cistema presentes en los monomeros. Por lo tanto, cada uno de los monomeros peptfdicos contenidos en el dfmero peptfdico WT1 de la presente invencion es el peptido WT1 que se ha descrito anteriormente y comprende al menos un resto de cistema. El dfmero peptfdico WT1 de la presente invencion puede ser un homodfmero o un heterodfmero.

En el dfmero peptfdico de la presente invencion, la secuencia de aminoacidos comprendida en el monomero peptfdico es preferentemente, Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID NO: 3), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO: 7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID NO: 8) o Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SeQ ID NO: 9). Mas preferentemente, es Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO: 7).

El dfmero peptfdico WT1 de la presente invencion se puede preparar utilizando un metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, si los monomeros peptfdicos comprenden un par de restos de cistema, el dfmero peptfdico WT1 de la presente invencion se puede preparar, por ejemplo, retirando todos los grupos protectores incluyendo los de la cistema de las cadenas laterales, y luego sometiendo la solucion de monomeros resultante a la oxidacion al aire bajo condiciones alcalinas, o anadiendo un oxidante bajo condiciones acidas o alcalinas para formar un enlace disulfuro. Ejemplos de los oxidantes incluyen yodo, dimetilsulfoxido (DMSO) y ferricianida potasica.

Cuando cada uno de los monomeros peptfdicos comprende dos o mas restos de cistema, el dfmero peptfdico WT1 de la presente invencion se puede preparar tambien por el metodo que se ha descrito anteriormente. En este caso, se obtienen isomeros debido a los diferentes tipos de enlaces disulfuro. De manera alternativa, el dfmero peptfdico WT1 de la presente invencion se puede preparar seleccionando una combinacion de grupos protectores para la cistema de las cadenas laterales. Ejemplos de las combinaciones de los grupos protectores incluyen combinaciones del grupo MeBzl (metilbenzilo) y el grupo Acm (acetamidemetilo), el grupo Trt (tritilo) y el grupo Acm, el grupo Npys (3-nitro-2-piridiltio) y el grupo Acm, y el grupo S-Bu-t (S-terc-butilo) y el grupo Acm. Por ejemplo, en el caso de la combinacion del grupo MeBzl y el grupo Acm, el dfmero peptfdico WT1 se puede preparar retirando los grupos protectores distintos del grupo MeBzl y el grupo protector en la cadena lateral de cistema, sometiendo la solucion de monomero resultante a la oxidacion al aire para formar un enlace disulfuro entre los restos de cistema protegidos, y luego desprotegiendo y oxidando utilizando yodo para formar un enlace disulfuro entre los restos de cistema que estaban protegidos anteriormente por Acm.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion para el tratamiento o prevencion de un cancer que comprende el peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1. El gen WT1 se expresa a

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altos niveles en varios canceres y tumores que incluyen tumores hematopoyeticos tales como leucemia, smdrome mielodisplasico, mieloma multiple o linfoma maligno y en canceres solidos tales como cancer gastrico, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de celulas germinales, cancer hepatico, cancer de piel, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer uterino, cancer de cuello uterino o cancer ovarico. Por lo tanto, la composicion de la presente invencion se puede utilizar para el tratamiento o prevencion de un cancer. Cuando la composicion farmaceutica de la presente invencion se administra a un sujeto positivo a HLA-A*1101, se inducen CTL espedficos de WT1 por el peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 o el dfmero peptfdico WT1 contenido en la composicion farmaceutica, y se danan las celulas cancerosas en el sujeto por tales CTL.

La composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener ademas del peptido WT1 restringido a HLA- A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1 como ingrediente activo, por ejemplo, un veldculo, un excipiente o similares. El peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptidico WT1 contenido en la composicion farmaceutica de la presente invencion induce un CTL espedfico de WT1. Por lo tanto la composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener un adyuvante adecuado, o se puede administrar con un adyuvante adecuado con el fin de aumentar la eficacia de induccion. Ejemplos de adyuvantes preferibles incluyen, pero no se limitan a, adyuvante completo o incompleto de Freund e hidroxido de aluminio.

El metodo de administracion de la composicion de la presente invencion se puede seleccionar apropiadamente dependiendo de las condiciones tales como el tipo de enfermedad, el estado del sujeto o el sitio diana. Ejemplos de tales metodos incluyen, pero no se limitan a, administracion intradermica, administracion subcutanea, administracion intramuscular, administracion intravenosa, administracion nasal y administracion oral. La cantidad del peptido o dfmero peptfdico contenido en la composicion farmaceutica de la presente invencion, asf como la forma de dosificacion, el numero de veces de administracion y similares de la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede seleccionar adecuadamente dependiendo de las condiciones tales como el tipo de enfermedad, el estado del sujeto o el sitio diana. La dosis unica del peptido es habitualmente, 0,0001 mg - 1000 mg, preferentemente, 0,001 - 1000 mg.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para el tratamiento o prevencion de un cancer, que comprende la administracion de una cantidad eficaz del peptido WT1 y/o dfmero peptfdico WT1 a un sujeto positivo a HLA-A*1101. El cancer que se va a tratar o prevenir puede ser uno cualquiera, y ejemplos de los mismos incluyen tumores hematopoyeticos tales como leucemia, smdrome mielodisplasico, mieloma multiple o linfoma maligno y en canceres solidos tales como cancer gastrico, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de celulas germinales, cancer hepatico, cancer de piel, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer uterino, cancer de cuello uterino o cancer ovarico.

En un aspecto mas, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion de la presencia o cantidad de un CTL espedfico de WT1 en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende:

(a) hacer reaccionar un complejo de un peptido WT1 y una molecula de HLA-A*1101 con una muestra del sujeto; y

(b) determinar la presencia o cantidad de un CTL que reconoce el complejo contenido en la muestra. La muestra de un sujeto puede ser uno cualquiera siempre que haya la posibilidad de que contenga un linfocito. Ejemplos de las muestras incluyen fluidos corporales tales como la sangre o linfa y un tejido. El complejo de un peptido WT1 y una molecula de HLA-A*1101 se puede preparar, por ejemplo, como un tetramero o pentamero utilizando un metodo conocido por un experto en la tecnica tal como un metodo de biotina-estreptavidina. La presencia o cantidad del CTL que reconoce tal complejo se puede medir por un metodo conocido por un experto en la tecnica. En este aspecto de la presente invencion, el complejo se puede marcar. Se puede utilizar como marcador un marcador conocido tal como un marcador fluorescente o un marcador radioactivo. El marcado hace que la determinacion de la presencia o cantidad de un CTL sea facil y rapida.

Por lo tanto, la presente invencion tambien proporciona una composicion para la determinacion de la presencia o cantidad de un CTL espedfico de WT1 en un sujeto positivo a HLA-A*1101 que comprende un peptido WT1 restringido a HLA-A*1101.

Ademas, la presente invencion proporciona un kit para la determinacion de la presencia o cantidad de un CTL espedfico de WT1 en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un peptido WT1 restringido a HLA-A*1101.

En un aspecto mas, la presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de un CTL espedfico de WT1 utilizando un complejo de un peptido WT1 y una molecula de HLA-A*1101, que comprende:

(a) hacer reaccionar el complejo con una muestra; y

(b) obtener un CTL que reconoce el complejo contenido en la muestra. El complejo de un peptido WT1 y una molecula de HLA-A*1101 se ha descrito anteriormente. La muestra puede ser una cualquiera siempre que haya la posibilidad de que contenga un linfocito. Ejemplos de las muestras incluyen una muestra de un sujeto tal como sangre, y un cultivo celular. El CTL que reconoce el complejo se puede obtener utilizando un metodo que conoce un experto en la tecnica tal como FACS o MACS. La presente invencion permite cultivar el CTL espedfico de

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WT1 y su uso para el tratamiento y prevencion de varios canceres.

Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a un CTL espedfico de WT1 que se puede obtener por un metodo para la produccion de un CTL espedfico de WT1 utilizando un complejo de un peptido WT1 y una molecula de HLA-A*1101.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un polinucleotido que codifica el peptido WT1 restringido a HLA- A*1101. El polinucleotido de la presente invencion puede ser ADN o ARN. La secuencia de bases del polinucleotido de la presente invencion se puede determinar en base a la secuencia de aminoacidos del peptido WT1 restringido a HLA-A*1101. El polinucleotido se puede preparar por un metodo conocido para la smtesis de ADN o ARN (por ejemplo, un metodo de smtesis qmmica), un metodo PCR o similares.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un vector de expresion que comprende el polinucleotido. El tipo de vector de expresion, la secuencia que comprende distinta de la secuencia del polinucleotido y similar se puede seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo del huesped en el que se va a introducir el vector de expresion de la presente invencion, el proposito para que se utiliza, o similares. Es posible tratar o prevenir tumores hematopoyeticos o canceres solidos por la administracion del vector de expresion de la presente invencion en un sujeto positivo a HLA-A*1101 para producir un peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 en un organismo vivo e inducir un CTL espedfico de WT1, y producir un dano en las celulas del tumor hematopoyetico o las celulas del cancer solido en el sujeto.

En un aspecto mas, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica para el tratamiento o prevencion de un cancer, que comprende el polinucleotido o el vector de expresion. La composicion, metodo de administracion y similares de la composicion de la presente invencion en esta aspecto se ha descrito anteriormente.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para el tratamiento o prevencion de un cancer que comprende la administracion de una cantidad eficaz del polinucleotido o el vector de expresion a un sujeto positivo a HLA-A*1101. Ejemplos de canceres que se van a tratar o prevenir incluyen tumores hematopoyeticos tales como leucemia, smdrome mielodisplasico, mieloma multiple o linfoma maligno y en canceres solidos tales como cancer gastrico, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de celulas germinales, cancer hepatico, cancer de piel, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer uterino, cancer de cuello uterino o cancer ovarico.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una celula que comprende el vector de expresion. La celula de la presente invencion se puede preparar, por ejemplo, transformando una celula huesped tal como E. coli, levaduras, celulas de insecto, o celulas animales con el vector de expresion. El metodo para la introduccion del vector de expresion en una celula huesped se puede seleccionar adecuadamente de entre varios metodos. Cultivando la celula transformada, y recuperando y purificando el peptido WT1 producido, se puede preparar el peptido de la presente invencion.

En un aspecto mas, la presente invencion se refiere a un CTL espedfico de WT1, que se induce por el peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1. El CTL de la presente invencion reconoce un complejo de un peptido WT1 y una molecula de HLA-A*1101. Por lo tanto, el CTL de la presente invencion se puede utilizar para danar espedficamente una celula tumoral positiva a HLA-A*1101 y que expresa WT1 a un alto nivel.

En otro aspecto la presente invencion se refiere a un metodo para el tratamiento o prevencion de un cancer, que comprende la administracion de un CTL espedfico de WT1 a un sujeto positivo a HLA-A*1101. El metodo de administracion del CTL espedfico de WT1 se puede seleccionar adecuadamente dependiendo de condiciones tales como el tipo de enfermedad, el estado del sujeto o el sitio diana. Ejemplos de tales metodos incluyen, pero no se limitan a, administracion intravenosa, administracion intradermica, administracion subcutanea, administracion intramuscular, administracion nasal y administracion oral.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para la induccion de un CTL espedfico de WT1, que comprende el cultivo de una celula mononuclear de sangre periferica en presencia del peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1 para inducir el CTL espedfico de WT1 a partir de la celula mononuclear de la sangre periferica. El sujeto a partir del que se deriva la celula mononuclear de sangre periferica puede ser uno cualquiera siempre que sea positivo a HLA-A*1101. Cultivando las celulas mononucleares de sangre periferica en presencia del peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1, se inducen los CTL espedficos de WT1 a partir de celulas precursoras de CTL contenidas en las celulas mononucleares de sangre periferica. Es posible tratar o prevenir tumores hematopoyeticos o canceres solidos en un sujeto positivo a HLA-A*1101 administrando el CTL espedfico de WT1 obtenido de acuerdo con la presente invencion al sujeto.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un kit para la induccion de un CTL espedfico de WT1, que comprende un peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1 como un componente esencial. Preferentemente, el kit se utiliza en el metodo para la induccion de un CTL espedfico de WT1. El kit de la presente invencion puede comprender ademas del peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1, por ejemplo, un medio para obtener una celula mononuclear de sangre periferica, un adyuvante, un matraz de reaccion

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o similares. En general se adjunta un manual de instrucciones al kit. Utilizando el kit de la presente invencion, se pueden inducir eficazmente CTL espedficos de WT1.

En un aspecto mas la presente invencion se refiere a una celula presentadora de antigeno (tal como una celula dendntica) que presenta un peptido WT1 por medio de una molecula HLA-A*1101, que es inducida por el peptido restringido a hLA-A*1101 y/o el dfmero peptidico. Utilizando la celula presentadora de antigeno de la presente invencion, se inducen CTL espedficos de WT1 eficazmente.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para el tratamiento o prevencion de un cancer, que comprende la administracion de celulas presentadoras de antigeno que presentan un peptido WT1 por medio de una molecula de HLA-A*1101 a un sujeto positivo a HLA-A*1101. El metodo de administracion de la celula presentadora de antigeno se puede seleccionar adecuadamente de condiciones tal como el tipo de enfermedad, el estado del sujeto o el sitio diana. Ejemplos de tales metodos incluyen, pero no se limitan, la administracion intravenosa, administracion intradermica, administracion intradermica, administracion subcutanea, administracion intramuscular, administracion nasal y administracion oral.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para la induccion de una celula presentadora de antigeno que presenta un peptido WT1 por medio de una molecula de HLA-A*1101, que comprende el cultivo de una celula presentadora de antigeno inmadura en presencia del peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1 para inducir la celula presentadora de antfgeno que presenta un peptido WT1 por medio de una molecula de hLA-A*1101 a partir de la celula presentadora de antigeno inmadura. La celula presentadora de antigeno inmadura se refiere a una celula tal como una celula dendntica inmadura que puede madurar en una celula presentadora de antigeno. Un sujeto del que se deriva la celula presentadora de antigeno inmadura puede ser uno cualquiera siempre que sea positivo a HLA-A*1101. Debido a que las celulas presentadoras de antfgeno inmaduras estan contenidas, por ejemplo, en celulas mononucleares de sangre periferica, tales celulas se pueden cultivar en presencia del peptido WT1 y/o el dfmero peptfdico WT1.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un kit para la induccion de una celula presentadora de antigeno que presenta un peptido WT1 por medio de una molecula de HLA-A*1101, que comprende el peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y/o el dfmero peptfdico WT1 como componente esencial. Preferentemente, el kit se utiliza en el metodo para la induccion de una celula presentadora de antfgeno. Otro componente que va a estar contenido en el kit de la presente invencion y similares se han descrito anteriormente. El kit de la presente invencion se puede utilizar para inducir eficazmente una celula presentadora de antigeno que presenta un peptido WT1 por medio de una molecula de HLA-A*1101.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un anticuerpo contra un peptido restringido a HLA-A*1101 o un polinucleotido que codifica el peptido. El anticuerpo de la presente invencion puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.

En un aspecto mas, la presente invencion se refiere a un metodo para el diagnostico de un cancer, que comprende el uso de CTL espedficos de WT1, la celula presentadora de antigeno que presenta un peptido WT1 por medio de una molecula de HLA-A*1101, o el anticuerpo contra el peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 o un polinucleotido que codifica el peptido. Preferentemente ese utiliza el CTL espedfico de WT1 en el metodo para el diagnostico de la presente invencion. Por ejemplo, es posible diagnosticar un cancer incubando el CTL, la celula presentadora de antfgeno o el anticuerpo con una muestra de un sujeto positivo a HLA-A*1101 o administrandolo a un sujeto positivo a HLA-A*1101, y determinando, por ejemplo, la posicion, sitio o cantidad del mismo. El CTL, la celula presentadora de antfgeno o el anticuerpo pueden estar marcados. Uniendo un marcador, el metodo para el diagnostico de la presente invencion se puede practicar eficazmente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invencion en mas detalle, pero no se conciben para limitar el ambito de la misma.

Ejemplo 1: Seleccion del peptido WT1

Se utilizo el RANKPEP (
http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) para seleccionar los WTI251, WTI279, WTI312, WT1 313, WT1 338, WT1 378, WT1 386, WT1 415 y WT1 436 que tienen una alta capacidad para unirse a una molecula de HLA-A*1101 derivados de los peptidos de una protema WT1 (SEQ ID NO: 1). Las secuencias de aminoacidos, el numero de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 y los valores de la afinidad con una molecula de HLA-A*1101 de estos peptidos se muestran en la Tabla 1.

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[Tabla 1]

Peptido: Numero de Secuencia de Valor de la

: aminoacidos aminoacidos afinidad

WT1251 (SEQ ID NO: : 2) 251-259 AAGSSSSVK 15,18

WT1279 (SEQ ID NO: : 3) 279-287 PILCGAQYR 11,47

WT1312(SEQ ID NO: : 4) 312-320 RSASETSEK 14,96

MT1313 (SEQ ID NO: 5) 313-321 SASETSEKR 6,87

WT1338 (SEQ ID NO: : 6) 338-346 SHLQMHSRK 13,72

WT1378 (SEQ ID NO: : 7) 378-386 TGVKPFQCK 11,33

WT1386 (SEQ id no: : 8) 386-394 KTCQRKFSR 13,82

WT1415(SEQ id no: : 9) 415-423 SCRWPSCQK 10,29

WT1436 (SEQ ID NO: 10): 436-444 NMHQRNMTK 14,19

Preparacion de celulas B-LCL

Se separaron las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) por el metodo de centrifugacion en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque de la sangre periferica que se hadan recolectados de donantes sanos positivos a HLA- A*1101. Las PBMC se sembraron entonces en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 1 x 107 en medio RPMI 1640 que contema un 10% de FCS, y se anadieron los sobrenadantes del cultivo de celulas B95-8 (celulas que producen el virus EB). Se cultivaron a 37 °C con un 5% de CO2 durante aproximadamente un mes. Se obtuvieron celulas B-LCL transformadas con el virus EB, que son celulas B de celulas tumorales. Se confirmo que las celulas B-LCL resultantes no expresaban el gen WT1. Se pulsaron las celulas B-LCL incubandolas con 20 |ig/ml de WT1251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 o WT1436 durante 2 horas, y se radiaron con 80 Gy de radiacion. Las celulas B-LCL resultantes (de aqrn en adelante denominadas celulas B-LCL pulsadas con un peptido WT1) se utilizaron como celulas presentadoras de antfgeno para los experimentos siguientes.

Induccion de CTL espedficos de WT1

Se cultivaron 3 x 106 PBMC autologas en una placa de cultivo celular de 24 pocillos en un medio completo (un 45% de RPMI, un 45% de medio AMI-V y un 10% de suero AB humano) que contema 20 |ig/ml de WT1251, WT1279, WT1 312, WT1 313, WT1 338, WT1 378, WT1 386, WT1 415 o WT1 436 a 37 °C con un 5% de CO2 durante una semana para obtener celulas de respuesta. Se co-cultivaron 2 x 106 de las celulas de respuesta resultantes con 1 x 106 de las celulas B-LCL pulsadas con el mismo peptido WT1 en medio completo durante 1 semana (primera estimulacion). Las PBMC se co-cultivaron con las celulas B-LCL pulsadas con el peptido WT1 tres veces mas (segunda a cuarta estimulaciones) bajo condiciones en las que se anadfan 20 Ul/ml (concentracion final) de IL2 de la siguiente manera: segunda estimulacion: dos veces dfa si dfa no a partir de 3 dfas tras el inicio de la estimulacion; tercera y cuarta estimulaciones: tres veces a intervalos de un dfa desde el dfa despues del inicio de la estimulacion. Las celulas resultantes se concentraron utilizando el kit de alimentacion en gravedad de columnas de seleccion negativa (StemSp) de manea que la proporcion de celulas T positivas a CD8 llegaba aproximadamente al 80%, y se cultivaron con las celulas B-LCl pulsadas con el peptido WT1 (quinta estimulacion). Las celulas T positivas a CD8 (CTL) que se obteman 5 dfas despues de la estimulacion final se utilizaron para la medicion de la actividad citotoxica.

Actividad citotoxica de CTL

Se midio la actividad citotoxica de los CTL utilizando el ensayo de liberacion de 51Cr. Las celulas CTL (de aqrn en adelante denominadas celulas efectoras) se mezclaron en la proporcion (relacion E/T) de 1:1 a 30:1 en 200 |il de medio con celulas diana en las que se hada incorporado 51Cr, y se cultivaron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos a 37 °C con un 5% de CO2 durante 4 horas. Se utilizaron las celulas B-LCL pulsadas con el mismo peptido WT1 que el que se utilizo para la induccion de los CTL (BLCL-P), las celulas B-LCL sin pulsar con un peptido WT1 (BLCL-NP) se utilizaron como celulas diana. Tras el cultivo, se recolectaron los sobrenadantes por centrifugacion. Se midieron las cantidades de 51Cr liberado en los sobrenadantes utilizando un contador de centelleo lfquido. La actividad citotoxica (%) se determino utilizando la siguiente formula:

(liberacion de 51Cr en el sobrenadante de la muestra - liberacion de 51Cr espontanea) / (liberacion de 51Cr maxima - liberacion de 51Cr espontanea) x 100

donde la liberacion de 51Cr espontanea es la liberacion de 51Cr que se observa cuando las celulas diana en las que se hada incorporado el 51Cr se cultivaban solas bajo la misma condicion, y la liberacion de 51Cr maxima es la liberacion de 51Cr que se observa cuando las celulas diana en las que se hada incorporado el 51Cr estaban completamente lisadas utilizando un 1% de Triton X-100. Los resultados se muestran en las Fig. 1-9. En las figuras, los ejes longitudinales representan la lisis espedfica (%), y los ejes horizontales representan las relaciones E/T. Las

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BLCL-P se representan utilizando lmeas continuas, y las BLCL-NP se representan utilizando lmeas interrumpidas. Se confirmo que los CTL inducidos con WTI251, WTI279, WTI312, WTI313, WTI338, WTI378, WTI386, WTI415 o WTI436 danaban espedficamente las BLCL-P que presentaban el peptido WT1 como un complejo con una molecula de HLA-A*1101 en comparacion con las BLCL-NP. Los CTL inducidos con WTI251, WTI279, WTI313, WTI338, o WTI386 se utilizaron para los experimentos adicionales posteriores.

Actividad citotoxica de CTL contra la celula que expresa el WT1 endogenamente

Se determino la actividad citotoxica de los CTL inducidos con WT1251, WT1279, WT1313, WT1338, o WT1386 contra B- LCL que expresaban WT1 utilizando el metodo que se ha descrito anteriormente. Una celula que expresa WT1 se refiere a una B-LCL en la que se ha introducido el gen WT1 humano, y que expresa una protema WT1 en la celula, y presenta un peptido que consiste en 9 aminoacidos que resultan de su procesamiento con una molecula de HLA- A*1101. Los resultados se muestran en las Figs. 1, 2, 4, 5, y 7. En las figuras, las B-LCL que expresan WT1 se representan utilizando lmeas discontinuas. Se confirmo que los CTL inducidos con WT1251, WT1279, WT1313, WT1338, o WT1 386 tienen actividad citotoxica contra celulas que expresan el gen WT1 endogenamente.

Preparacion de un dfmero peptfdico WT1

Se oxido al aire una mezcla de 227,5 mg del monomero peptfdico WT1378, 227,5 mg de N-metilglucamina (NMG) y 23 ml de agua agitando a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 dfas. A la mezcla resultante, se anadio una solucion acuosa de 2 g de acetato sodico en 5 ml de agua y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. A la solucion resultante, se anadieron 200 ml de agua y aproximadamente 200 ml de acetonitrilo, y la mezcla se filtro a traves de un embudo Kiriyama (papel de filtro N° 5C) y se lavo con agua (aproximadamente 50 ml x 3). Al residuo, se anadieron aproximadamente 200 ml de agua y el residuo se liofilizo para obtener 158 mg del dfmero peptfdico WT1378 en bruto.

Purificacion del dfmero peptfdico WT1 en bruto

Se disolvieron 158 mg de dfmero peptfdico WT1378 en bruto en 9 ml de DMSO y se inyecto en una columna ODS C18 (5 cm O x 50 cm L, YMC Co., LTD) unida a una HLPC (Shimadzu, tipo LC8AD) y se equilibro con la solucion 1 (H2O/1% AcOH) utilizando una bomba HPLC. La columna se dejo en reposo durante aproximadamente 30 minutos, y se eluyo con un gradiente de concentracion del 0% al 40% de la solucion 2 (CH3CN/1% AcOH) durante 360 minutos. Las fracciones que conteman el dfmero peptfdico WT1 se recolectaron utilizando un recolector de fraccion automatico mientras se controlaba la absorbancia UV a 220 nm. Las fracciones recolectadas se combinaron, se inyectaron en una columna ODS C18 (4,6 mm O x 25 cm L, YMC Co., LTD.) unida a una HPLC (Hitachi, tipo L-4000) y se equilibro con un 17% de solucion 2 y se eluyo con una concentracion de gradiente del 0% al 47% de solucion 2 durante 30 minutos para obtener 46,6 mg del dfmero peptfdico WT1378 purificado a un tiempo de retencion de 20,51 minutos. FAB.MS 2365.0 (valor teorico: 2342.70) Na+ F = 0,25%.

Induccion de CTL por el dfmero WT1

Se examinaron las capacidades del dfmero peptfdico WT1378, el peptido WT1378, el peptido WT1378 modificado (G^I) (SEQ ID NO: 11) y el peptido WT1378 modificado (G^V) (SEQ ID NO: 12) asf como el peptido WT1379 (SEQ ID NO: 13, como se desvela en el documento WO 2002/28414) para inducir un CTL utilizando PBMC de los donantes sanos positivos a HLA-A*1101 1-3 de acuerdo con el metodo que se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en las Figs. 10-14. En las figuras, los ejes longitudinales representan la lisis espedficas (%), y los ejes horizontales representan las relaciones E/T. Las BLCL-P estan representadas por lmeas continuas y las BCLC-NP se representan utilizando lmeas discontinuas. Se confirmo que el dfmero peptfdico WT1378 tiene una capacidad para inducir un CTL. Ademas, se descubrio que la capacidad para cada peptido WT1379 cuya secuencia de aminoacidos es diferente del peptido WT1378 por un aminoacido de la secuencia de aminoacidos de la protema WT1 para inducir un CTL es mucho menor que la del peptido WT1378 y por lo tanto, el peptido WT1 de la presente tiene un efecto excelente e inesperado en comparacion con el peptido conocido.

Aplicabilidad industrial

La presente invencion proporciona un peptido WT1 restringido a HLA-A*1101, un polinucleotido que codifica el peptido, una composicion farmaceutica que comprende el mismo y similares. Por lo tanto, la presente invencion se puede utilizar en los campos de la medicina y similares, por ejemplo en los campos del desarrollo y preparacion de una composicion farmaceutica para la prevencion o el tratamiento de varios tumores hematopoyeticos y canceres solidos que expresan el gen WT1 a altos niveles.

Listado de secuencias del texto libre

SEQ ID NO: 11: Peptido WT1 modificado SEQ ID NO: 12: Peptido WT1 modificado

5

10

15

20

25

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> International Institute of Cancer Immunology, Inc.

<120> Peptido WT1 restringido a HLA-A*1101 y composiciones farmaceuticas que comprenden el mismo

<130> 120745ep_46ep

<150> EP 10191234.3 <151>

<150> EP 07850650.8 <151>

<150> JP 2006-355356 <151>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1 <211>449 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Met 1: Gly Ser Asp Val 5 Arg Asp Leu Asn Ala 10 Leu Leu Pro Ala Val 15 Pro

Ser: Leu Gly Gly 20 Gly Gly Gly Cys Ala 25 Leu Pro Val Ser Gly 30 Ala Ala

Gin: Trp Ala Pro 35 Val Leu Asp Phe 40 Ala Pro Pro Gly Ala 45 Ser Ala Tyr

Gly: Ser Leu Gly 50 Gly Pro Ala 55 Pro Pro Pro Ala Pro Pro 60 Pro Pro Pro

Pro 65: Pro Pro Pro His Ser 70 Phe lie Lys Gin Glu 75 Pro Ser Trp Gly Gly 80

Ala: Glu Pro His Glu 85 Glu Gin Cys Leu Ser 90 Ala Phe Thr Val His 95 Phe

Ser: Gly Gin Phe 100 Thr Gly Thr Ala Gly 105 Ala Cys Arg Tyr Gly 110 Pro Phe

Gly: Pro Pro Pro 115 Pro Ser Gin Ala 120 Ser Ser Gly Gin Ala 125 Arg Met Phe

Pro: Asn Ala Pro 130 Tyr Leu Pro 135 Ser Cys Leu Glu Ser Gin 140 Pro Ala lie

Arg 145: Asn Gin Gly Tyr Ser 150 Thr Val Thr Phe Asp 155 Gly Thr Pro Ser Tyr 160

Gly: His Thr pro Ser 165 His His Ala Ala Gin 170 Phe Pro Asn His Ser 175 Phe

Lys: Kis Glu Asp 180 Pro Met Gly Gin Gin 185 Gly Ser Leu Gly Glu 190 Gin Gin

5

10

15

Tyc: Ser Val 195 Pro Pro Pro Val Tyr 200 Gly Cys His Thr Pro 205 Thr ASp Ser

Cys: Thr 210 Gly Ser Gin Ala Leu 215 Leu Leu Arg Thr Pro 220 Tyr Ser Ser Asp

Asn 225: Leu Tyr Gin Met Thr 230 Ser Gin Leu Glu Cys 235 Met Thr Trp Asn Gin 240

Met: Asn Leu Gly Ala 245 Thr Leu Lys Gly val 250 Ala Ala Gly Ser Ser 255 Ser

Ser: Val Lys Trp 260 Thr Glu Gly Gin Ser 265 Asn His Ser Thr Gly 270 Tyr Glu

Ser: Asp Asn 275 His Thr Thr Pro He 280 Leu Cys Gly Ala Gin 285 Tyr Arg lie

His: Thr 290 His Gly Val Phe Arg 295 Gly lie Gin Asp Val 300 Arg Arg Val Pro

Gly 305: Val Ala Pro Thr Leu 310 Val Arg Ser Ala Ser 315 Glu Thr Ser Glu Lys 320

Arg: Pro Phe Met Cys 325 Ala Tyr Pro Gly Cys 330 Asn Lys Arg Tyr Phe 335 Lys

l<eu: Ser His Leu 340 Gin Met His Ser Arg 345 Lys His Thr Gly Glu 350 Lys Pro

Tyr: Gin Cys 355 Asp Phe Lys Asp Cys 360 Glu Arg Arg Phe Ser 365 Arg Ser Asp

Gin: Leu 370 Lys Arg His Gin Arg 375 Arg His Thr Gly Val 380 Lys Pro Phe
Gin

Cys 365: Lys Thr Cys Gin Arg 390 Lys Phe Ser Arg Ser 395 Asp Bis Leu Lys Thr 400

His: Thr Arg Thr His 405 Thr Gly Lys Thr Ser 410 Glu Lys Pro Phe Ser 415 Cys

Arg: Trp Pro Ser 420 Cys Gin Lys Lys Phe 425 Ala Arg Ser Asp Glu 430 Leu Val

Arg Leu: His His 435 Asn Met His Gin Arg 440 Asn Met Thr Lys Leu 445 Gin Leu Ala

<210>2 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>2

Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 1 5

<210>3 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Pro lie Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg 1 5

<210>4 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>4

Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 1 5

<210> 5 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg 1 5

<210>6 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>6

Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys 1 5

<210>7 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>7

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys 1 5

<210>8 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>8

Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg 1 5

<210>9 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>9

5

10

15

20

25

30

35

40

Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys 1 5

<210> 10 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 10

Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys 1 S

<210> 11 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido WT1 modificado <400> 11

Thr lie Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys 1 5

<210> 12 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido WT1 modificado <400> 12

Thr Val Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys 1 5

<210> 13 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 13

Gly Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys Thr 1 5

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o prevencion de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, en la que se sustituye un aminoacido con otro aminoacido,

donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL.
2. El uso de un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, en la que se sustituye un aminoacido con otro aminoacido,

donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL,

para preparar un medicamento para el tratamiento o la prevencion de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101.
3. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o prevencion de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende un polinucleotido que codifica un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, en la que se sustituye un aminoacido con otro aminoacido,

donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL, o un vector que comprende dicho polinucleotido.
4. El uso de un polinucleotido que codifica un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, en la que se sustituye un aminoacido con otro aminoacido,

donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL, o un vector que comprende dicho polinucleotido, para preparar un medicamento para el tratamiento o prevencion de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101.
5. Un metodo para la induccion de un CTL espedfico de WT1 que es adecuado para el tratamiento del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, donde el metodo comprende el cultivo de una celula mononuclear de sangre periferica que se obtiene de un sujeto positivo a HLA-A*1101 en presencia de un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos (1) o (2):

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, en la que se sustituye un aminoacido con otro aminoacido,

donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL,

para inducir un CTL espedfico de WT1 a partir de la celula mononuclear de sangre periferica.
6. Un CTL espedfico de WT1 para su uso en el tratamiento del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que se puede obtener por el metodo de la reivindicacion 5.
7. Un metodo para la induccion de una celula presentadora de antigeno que presenta un peptido WT1 y que es adecuado para el tratamiento del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, donde el metodo comprende el cultivo de una celula presentadora de antfgeno inmadura que se obtiene de un sujeto positivo a HLA-A*1101 en presencia de un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos (1) o (2):

5

(1) una secuencia de aminoacidos de

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO: 5),

(2) una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, en la que se sustituye un aminoacido con otro aminoacido,

10

donde el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos (2) tiene la capacidad de unirse a una molecula de HLA-A*1101, y tiene la capacidad de inducir un CTL,

para inducir la celula presentadora de antfgeno que presenta un peptido WT1 a partir de la celula presentadora de antfgeno inmadura.

15
8. Una celula presentadora de antfgeno que presenta un peptido WT1 para su uso en el tratamiento del cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que se puede obtener in vitro por el metodo de la reivindicacion 7.
9. Un metodo para el diagnostico de un cancer en un sujeto positivo a HLA-A*1101, que comprende la utilizacion del 20 CTL de acuerdo con la reivindicacion 6 o la celula presentadora de antfgeno de acuerdo con la reivindicacion 8.