BRPI0720988A2

BRPI0720988A2 - Peptídeo wt1 hla-a*1101 restrito e composição farmacêutica compreendendo o mesmo

Info

Publication number: BRPI0720988A2
Application number: BRPI0720988-6A
Authority: BR
Inventors: Haruo Sugiyama
Original assignee: Int Inst Cancer Immunology Inc
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2014-03-18
Also published as: PH12014500902A1; DK2479276T3; MY161664A; WO2008081701A1; CN102295682A; HK1221252A1; EP2980219A1; JP5484734B2; EP3026115A1; TW200835513A; EP2098595A1; HK1173187A1; CA2886621A1; EP2341142A2; EP2479276A1; CN102659924B; CN102302788B; EP3026115B1; US20110098233A1; TWI417103B

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEO WT1 HLA-A*1101 RESTRITO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COM- PREENDENDO O MESMO".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito, especificamente, a um peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1, em que o peptídeo tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA- A*1101, e tem a capacidade de induzir um CTL. A presente invenção tam- bém se refere a um dímero peptídico com a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101, e com a capacidade de induzir um CTL, em que dois monômeros peptídicos, cada um compreendendo uma seqüência de amino- ácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1 e compreendendo pelo menos um resíduo de cisteína são ligados um ao outro através de uma ligação dissulfeto. Além disso, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo codificando o peptídeo, a uma composição farmacêuti- ca para o tratamento e/ou prevenção de um câncer compreendendo o mes- mo e semelhantes.

Antecedentes

O gene WT1 (gene do tumor de Wilms 1) foi identificado como um gene responsável pelo tumor de Wilms o qual é um câncer renal em cri- anças (Documentos não-patente 1 e 2). WT1 é um fator de transcrição com uma estrutura de dedo de zinco. No início, o gene WT1 foi considerado co- mo sendo um gene supressor tumoral. Entretanto, estudos subsequentes (documentos não-patente 3, 4, 5 e 6) mostraram que o gene WT1 antes fun- ciona como um oncogene nos tumores hematopoiéticos e cânceres sólidos.

O gene WT1 é expresso em altos níveis em muitos tipos de tu- mores malignos. A seguir, foi examinado se o produto do gene WT1 livre de mutações, o qual é uma proteína autóloga, tinha imunogenicidade ou não em um corpo vivo. Os resultados revelaram que a proteína derivada do gene WT1, o qual é expresso em altos níveis em células tumorais, é fragmentado através do processamento intracelular, os peptídeos resultantes formam complexos com as moléculas de MHC de classe I e os complexos são apre- sentados nas superfícies das células, e que os CTLs reconhecendo tais complexos podem ser induzidos por vacinação com peptídeo (Documentos não-patente 7, 8 e 9). Também foi demonstrado que em um camundongo imunizado com um peptídeo WT1 ou um DNAc WT1, células tumorais trans- plantadas expressando um gene WT1 são rejeitadas com alta probabilidade (Documentos não-patente 7 e 10), enquanto tecidos normais expressando fisiologicamente o gene WT1 não são danificados pelos CTLs induzidos (Documento não-patente 7). Foi demonstrado em experimentos in vitro u- sando células humanas que, quando o peptídeo Db126 ou o peptídeo WH187 (aminoácidos 187-195 da SEQ ID NO: 1, SLGEQQYSV) com alta capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*0201, a qual é uma das mo- léculas de MHC classe I, é usada para estimular as células mononucleares do sangue periférico humano com HLA-A 0201, CTLs WT1 -específicos são induzidos, os CTLs induzidos têm uma atividade citotóxica específica para células tumorais expressando endogenamente um gene WT1 em altos ní- veis, e a atividade citotóxica de tais CTLs é HLA-A2-restrita (documento não- patente 11). Foi demonstrado em experimentos in vitro em células humanas usando o peptídeo WT1 que emparelha HLA-A 2402 (o qual é encontrado mais frequentemente em japoneses dentre os alelos HLA-A) (WT1235; ami- noácidos 235-243 da SEQ ID NO: 1, CMTWNQMNL) que CTLs WT1- específicos (TAK-1) são induzidos (Documento não-patente 12), e os CTLs induzidos no suprimem a atividade formadora de colônia das células tronco hematopoiéticas normais as quais expressam parcialmente fisiologicamente um gene WT1 (documentos não-patente 12 e 13). Esses relatórios sugerem fortemente que não somente em camundongos, mas também em indivíduos humanos os CTLs WT1-específicos podem ser induzidos, tais CTLs têm uma atividade citotóxica contra células tumorais expressando um gene WT1 em altos níveis, porém não têm atividade citotóxica contra células normais expressando fisiologicamente um gene WT1 (Documentos não-patente 7,

10, 11, 12 e 13).

O produto gênico WT1 está presente como uma proteína nucle- ar, e é processado por proteassomas no citoplasma a ser fragmentado nos peptídeos. Os peptídeos fragmentados são transportados no lúmen do retí- culo endoplasmático por moléculas TAP (transportadoras associadas com processamento de antígeno), a partir de complexos com moléculas de MHC 5 de classe I, e estão presentes nas superfícies das células. CTLs WT1- específicos são induzidos como resultado do reconhecimento dos complexos peptídeo WT1-MHC de classe I por células precursoras CTL via TCR1 exer- cendo deste modo um efeito citotóxico nas células tumorais apresentando um produto gênico WT1 através das moléculas de MHC classe I (Documen- 10 tos Não-patente 7, 8 e 9). Deste modo, é necessário pelo menos que um peptídeo WT1 usado na imunoterapia do câncer alvejando um produto gêni- co WT1 esteja na forma que se liga a uma molécula MHC de classe I em um corpo vivo. Entretanto, as moléculas de MHC de classe I são diversas e se- qüências de aminoácidos dos peptídeos WT1 se ligando às respectivas mo- 15 léculas MHC classe I são diferentes umas das outras. Consequentemente, é necessário fornecer um peptídeo emparelhando a cada subtipo de MHC classe I. Entretanto, somente os peptídeos restritos à molécula HLA-A2402, a molécula HLA-A 0201, a molécula HLA-A 2601 e a molécula HLA-A 3303 são conhecidas como peptídeos WT1 restritos à molécula HLA até a presen- 20 te data (Documento Patente 1, Documento não-patente 11, Documento Pa- tente 2 e Documento Patente 3, respectivamente). Deste modo, existe uma necessidade em descobrir um peptídeo WT1 restrito ao HLA-A*1101.

Documento Patente 1: WO 2003/106682

Documento Patente 2: WO 2005/095598 Documento Patente 3: Pedido de Patente Japonesa N0 2006-

45287

Documento Não-Patente 1: Daniel A. Haber et al., Ceil. 29 de junho de 1990; 61 (7): 1257-69.

Documento Não-Patente 2: Call KM et al., Ceil. 9 de fevereiro de 1990; 60(3):509-20.

Documento Não-Patente 3: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181:151-212. Review. Documento Não-Patente 4: Yamagami T et al., Blood. 1o de abril de 1996; 87(7):2878-84.

Documento Não-Patente 5: Inoue K et al., Blood. 15 de abril de 1998; 91(8):2969-76.

Documento Não-Patente 6: Tsuboi A et al., Leuk Res. Maio de

1999; 23(5):499-505.

Documento Não-Patente 7: Oka Y et al., J Immunol. 15 de feve- reiro de 2000; 164(4):1873-80.

Documento Não-Patente 8: Melief CJ et al., Immunol Rev. junho de 1995; 145:167-77.

Documento Não-Patente 9: Ritz J, J Clin Oncol. fevereiro de 1994; 12(2):237-8.

Documento Não-Patente 10: Tsuboi A et al., J Clin Immunol. maio de 2000; 20(3): 195-202.

Documento Não-Patente 11: Oka Y et al., Immunogenetics. Fe-

vereiro de 2000; 51(2):99-107.

Documento Não-Patente 12: Ohminami H et al., Blood. 1o de janeiro de 2000; 95(1):286-93.

Documento Não-Patente 13: Gao L et al., Blood. 1o de abril de 2000; 95(7):2198-203.

Descrição da Invenção

Problemas a serem Solucionados pela Invenção

Os problemas a serem solucionados pela presente invenção são para fornecer um peptídeo que é uma molécula HLA-A*1101 restrita e com- 25 preende uma seqüência de aminoácidos de uma proteína WT1, e um polinu- cleotídeo codificando a mesma, assim como uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de um câncer, compreendendo a mesma, e semelhantes.

Formas para Solucionar os Problemas Como resultado de estudos intensivos em vista da situação, con-

forme descrito acima, o presente inventor descobriu que dentre os peptí- deos, cada um compreendendo uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1, peptídeos, cada um com a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101 podem induzir um CTL WT1-específico com uma alta taxa. Deste modo, a presente invenção foi completa.

A presente invenção fornece:

(1) um peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1, em que o peptídeo tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101, e tem a capacidade de induzir uma CTL;

(2) o peptídeo, de acordo com (1), em que o aminoácido na po-

sição 9 da seqüência de aminoácidos é Lys ou Arg,

(3) o peptídeo, de acordo com (1), em que a seqüência de ami- noácidos é selecionada do grupo consistindo em:

Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID No: 2),

Pro Ile Leu Cys GIyAIa Gln TyrArg (SEQ ID No: 3),

Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys (SEQ ID No: 4),

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID No: 5),

Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys (SEQ ID No: 6),

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7),

Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID No: 8),

Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No: 9), e Asn Met His Gln Arg Asn MetThr Lys (SEQ ID No: 10);

(4) o peptídeo, de acordo com (3), em que a seqüência de ami- noácidos é Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID No: 2);

(5) um dímero peptídico com a capacidade de se ligar a uma

molécula HLA-A*1101 e com a capacidade de induzir um CTL, no qual dois monômeros peptídicos, cada um compreendendo uma seqüência de amino- ácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1, e compreendendo pelo menos um resíduo de cisteína são ligados uns aos ou- tros através de uma ligação dissulfeto;

(6) o dímero peptídico, de acordo com (5), em que a seqüência de aminoácidos do monômero peptídico é selecionada do grupo consistindo em:

Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No: 3),

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7),

Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID No: 8), e Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No: 9);

(7) uma composição farmacêutica para o tratamento ou preven- ção de um câncer, compreendendo o peptídeo de acordo com (1) e/ou o dí- mero peptídico de acordo com (5);

(8) um método para o tratamento ou prevenção de câncer, com-

preendendo a administração de uma quantidade eficaz do peptídeo de acor- do com (1) e/ou o dímero peptídico de acordo com (5) a um indivíduo HLA- A*1101-positivo;

(9) um polinucleotídeo codificando o peptídeo, de acordo com

(1);

(10) um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo

de acordo com (9);

(11) uma composição farmacêutica para o tratamento ou pre- venção de um câncer, compreendendo o polinucleotídeo de acordo com (9) ou o vetor de acordo com (10);

(12) um método para o tratamento ou prevenção de um câncer,

compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do polinucleotí- deo de acordo com (9) ou o vetor de acordo com (10) a um indivíduo HLA- A*1101 positivo;

(13) um CTL WT1 -específico, o qual é induzido pelo peptídeo de

acordo com (10 e/ou o dímero peptídico de acordo com (5);

(14) um método para a indução de um CTL WT1 específico, compreendendo o cultivo de uma célula mononuclear sanguínea periférica na presença do peptídeo de acordo com (1) e/ou o dímero peptídico de a- cordo com (5) para induzir o CTL WT1-específico a partir da célula mononu-

clear sanguínea periférica;

(15) um kit para a indução de um CTL WT1-específico, compre- endendo o peptídeo de acordo com (1) e/ou o dímero peptídico de acordo com (5) como um componente essencial;

(16) uma célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1, o qual é induzido pelo peptídeo de acordo com (1) e/ou o dí- mero peptídico de acordo com (5);

(17) um método para a indução de uma célula apresentadora de

antígeno apresentando um peptídeo WT1, compreendendo o cultivo de uma célula apresentadora de antígeno imatura na presença do peptídeo de acor- do com (1) e/ou o dímero peptídico de acordo com (5) para induzir a célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1 a partir da célu- Ia apresentadora de antígeno imatura;

(18) um kit para a indução de uma célula apresentadora de antí- geno apresentando um peptídeo WT1, compreendendo o peptídeo de acor- do com (1) e/ou o dímero peptídico de acordo com (5) como um componente essencial; e

(19) um método para o diagnóstico de um câncer, compreen-

dendo o uso de CTL de acordo com (13) ou a célula apresentadora de antí- geno de acordo com (16).

Efeitos da Invenção

A presente invenção fornece um peptídeo que é HLA-A*1101 20 restrito e compreende uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 a- minoácidos contíguos a partir de uma proteína WT1, e um polinucleotídeo codificando a mesma, assim como uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer, compreendendo o mesmo, e semelhantes. Consequentemente, é possível induzir CTLs WT1-específicos 25 in vivo e in vitro em indivíduos com HLA-A*1101. Devido à taxa de HLA- A*1101 positivo em japoneses ser alta (cerca de 17,9%), CTLs WT1- específicos podem ser induzidos em uma ampla faixa de indivíduos.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

WTI25I-

A figura 2 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

VVT1279. A figura 3 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

WTI312·

A figura 4 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

WTI313.

A figura 5 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

WT1 338-

A figura 6 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

WTI378·

A figura 7 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

WTI386·

A figura 8 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

WTI415.

A figura 9 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com

WTI436-

A figura 10 representa a atividade citotóxica de CTL induzida

com o peptídeo WTI378 (,a b e c representam as atividades citotóxicas ob- servadas usando PBMCs de doadores HLA-A*1101-positivos saudáveis 1, 2 e 3, respectivamente).

A figura 11 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com o dímero peptídico WTI378 (a e b representam as atividades citotóxicas observadas usando PBMCs a partir de doadores HLA-A*1101-positivos sau- dáveis 1 e 2, respectivamente).

A figura 12 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com o peptídeo WTI378 modificado (G -> I) (a, b e c representam as ativida- des citotóxicas observadas usando PBMCs a partir dos doadores HLA- A*1101 positivos saudáveis 1, 2 e 3, respectivamente).

A figura 13 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com o peptídeo WTI378 modificado (G -» V) (a, b e c representam as ativi- dades citotóxicas observadas usando PBMCs a partir dos doadores HLA- A*1101 positivos saudáveis 1, 2 e 3, respectivamente).

A figura 14 representa a atividade citotóxica de CTL induzida com o peptídeo WTI379 (a, b e c representam as atividades citotóxicas ob- servadas usando PBMCs a partir dos doadores HLA-A*1101 positivos sau- dáveis 1, 2 e 3, respectivamente).

Melhor Forma de Executar a Invenção

Em um aspecto, a presente invenção se refere a um peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoáci- dos contíguos a partir de uma proteína WT1, em que o peptídeo tem a capa- cidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101, e tem a capacidade de in- duzir um CTL (aqui também referido como um "peptídeo WT1"). A seqüência de aminoácidos da proteína WT1 humana é mostrada na SEQ ID NO: 1. O peptídeo da presente invenção compreende uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos na seqüência de aminoácidos mos- trada na SEQ ID NO: 1. Quando o peptídeo da presente invenção compre- ende uma seqüência de aminoácidos compreendendo cisteína(s) tal como a seqüência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 3, 7, 8 ou 9, conforme descrito abaixo, a estabilidade pode ser aumentada pela substituição da(s) cisteí- na(s) na seqüência de aminoácidos com outra substância, tal como outro aminoácido (por exemplo, serina, alanina e ácido α-aminobutírico) ou pela modificação do grupo SH da(s) cisteína(s) com um grupo protetor conhecido na técnica (por exemplo, grupo carboximetila ou grupo piridiletila). O peptí- deo da presente invenção é um peptídeo antígeno de câncer que pode indu- zir um CTL como resultado da apresentação, por uma célula apresentadora de antígeno, de um peptídeo gerado pelo processamento do peptídeo da presente invenção em uma célula.

Conforme descrito acima, é um objetivo da presente invenção 25 obter um peptídeo HLA-A*1101 restrito. Deste modo, o peptídeo da presente invenção tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101. A ca- pacidade de se ligar pode ser determinada por um método conhecido na técnica. Exemplos de tais métodos incluem um método computadorizado tal como Rankpep, BIMAS ou SYFPEITHI, e um teste de ligação competitivo 30 com um peptídeo conhecido com a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101. Por exemplo, a capacidade determinada de se ligar pode ser comparada com aquela de um peptídeo HLA-A*1101 restrito conhecido para julgar se o peptídeo da presente invenção tem ou não a capacidade de se ligar. Exemplos dos peptídeos com a capacidade de se ligar de acordo com a presente invenção incluem um peptídeo do qual a pontuação de afinidade a uma molécula HLA-A*1101 conforme determinado pelo método descrito no 5 exemplo 1 é de 4 ou mais, preferivelmente de 5 ou mais, mais preferivelmen- te de 6 ou mais.

O peptídeo da presente invenção ainda tem a capacidade de induzir um CTL. O gene WT1 é expresso na sua forma natural em altos ní- veis, por exemplo, em tumores hematopoiéticos tais como leucemia, síndro- 10 me mielodisplástica, mieloma múltiplo ou Iinfoma maligno e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de células germinativas, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical ou câncer de ovário. Consequentemente, o peptídeo da presente invenção po- 15 de induzir um CTL com alta taxa em um indivíduo sofrendo de tal doença. A capacidade de induzir CTL se refere a uma capacidade de induzir CTL in vivo ou in vitro. Tal capacidade pode ser determinada usando um método geral tal como um método no qual uma atividade citotóxica de CTL é deter- minada usando um ensaio de liberação de Cr-.

O peptídeo da presente invenção pode ter Lys ou Arg na posição

9 da seqüência de aminoácidos. É considerado que por ter tal aminoácido, a capacidade do peptídeo de se ligar a uma molécula HLA-A*1101 se torna mais alta.

A seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos 25 compreendida no peptídeo da presente invenção é, preferivelmente Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID No: 2), Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No: 3), Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys (SEQ ID No: 4), Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID No: 5), Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys (SEQ ID No: 6), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ 30 ID No: 7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID No: 8), Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No: 9) ou Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys (SEQ ID No: 10). Mais preferivelmente, ela é Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7). Além disso, ela pode ter de uma a várias substituições, preferivelmente de um até cinco aminoácidos com outros ami- noácidos nos nove aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2-10. Qualquer um dos 9 aminoácidos ou outros aminoácidos substituídos pode 5 ser aproximadamente modificado. Em todos os casos, o peptídeo da presen- te invenção retém a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101.

Conforme descrito acima, o peptídeo da presente invenção pode ter qualquer um, contanto que ele compreenda uma seqüência de aminoáci- dos que seja derivada de uma proteína WT1 e consista em 9 aminoácidos 10 contíguos. Deste modo, o peptídeo da presente invenção pode ser, por e- xemplo, um peptídeo consistindo somente na seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 2 - 10, ou uma proteína WT1 ou uma parte sua compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 2 - 10. A quantidade de aminoácidos 15 compreendida no peptídeo da presente invenção não está especificamente limitada, e a quantidade é, por exemplo, de 9-500, 9-300, 9-200, 9-100, 9-50, 9-30 e 9-12 aminoácidos. Várias substâncias podem ser ligadas no N- terminal e/ou no C-terminal da seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos no peptídeo da presente invenção. Por exemplo, um 20 aminoácido, um peptídeo ou um análogo seu pode ser ligado. Se tal subs- tância for ligada ao peptídeo da presente invenção, a substância pode ser processada, por exemplo, por uma enzima em um corpo vivo ou através de um processo tal como um processo intracelular, e finalmente a seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos pode ser produzida e 25 apresentada como um complexo com uma molécula HLA-A*1101 na superfí- cie de uma célula, resultando dessa forma no efeito de indução da CTL. A substância pode ser uma substância que modula a solubilidade do peptídeo da presente invenção, ou aumenta a sua estabilidade (resistência à protea- se, etc.). Alternativamente, ela pode ser uma substância que distribui o pep- 30 tídeo da presente invenção especificamente, por exemplo, a um dado tecido ou órgão, ou ela pode ter uma ação para aumentar a eficiência ou absorção por uma célula apresentadora de antígeno ou semelhante. A substância po- de ser uma substância que aumente a capacidade de induzir CTL, tal como um peptídeo auxiliador ou semelhante.

O peptídeo da presente invenção pode ser sintetizado por méto- dos geralmente usados na técnica ou suas modificações. Tais métodos são 5 descritos, por exemplo, em Peptide Synthesis, lnterscience, Nova Iorque, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., Nova Iorque, 1976; Peptide- Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; e em Iyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide-Gosei, Hirokawa - Livraria, 1991.

O peptídeo da presente invenção pode também ser preparado

usando técnicas de engenharia genética baseadas na informação acerca da seqüência de nucleotídeos que codifica o peptídeo da presente invenção. Tais técnicas de engenharia genética são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um díme-

ro peptídico com a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101 e com a capacidade de induzir CTL, na qual dois monômeros peptídicos, cada um compreendendo uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 ami- noácidos contíguos de uma proteína WT1 e compreendendo pelo menos um 20 resíduo de cisteína são ligados um ao outro através de uma ligação dissulfe- to (de agora em diante também chamado de dímero peptídico WT1"). A es- tabilidade do dímero peptídico da presente invenção é aumentada em com- paração com aquela do monômero peptídico pela formação de um dímero. O dímero peptídico da presente invenção é um dímero peptídico antigênico 25 tumoral que pode induzir um CTL como resultado da apresentação, por uma célula apresentadora de antígenos, de um peptídeo gerado pelo processa- mento do peptídeo da presente invenção em uma célula.

O dímero peptídico da presente invenção é formado pela ligação de dois monômeros peptídicos através de uma ligação dissulfeto entre os resíduos de cisteína presentes nos monômeros. Deste modo, cada um dos monômeros peptídicos compreendidos no dímero peptídico WT1 da presen- te invenção é o peptídeo WT1 conforme descrito acima e compreende pelo menos um resíduo de cisteína. O dímero peptídico WT1 da presente inven- ção pode ser um homodímero ou um heterodímero.

No dímero peptídico WT1 da presente invenção, a seqüência de aminoácidos compreendida pelo monômero peptídico compreende preferi- 5 velmente Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No: 3), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID No: 8) ou Ser CysArg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No: 9). Mais preferivelmente, ela é Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7).

O dímero peptídico WT1 da presente invenção pode ser prepa-

rado usando um método conhecido na técnica. Por exemplo, se os monôme- ros peptídicos compreenderem um par de resíduos de cisteína, o dímero peptídico WT1 da presente invenção pode ser preparado, por exemplo, pela remoção de todos os grupos protetores incluindo aqueles das cadeias Iate-

rais de cisteína, e a seguir submetendo a solução monomérica resultante à oxidação pelo ar sob condições alcalinas, ou adicionando um oxidante sob condições alcalinas ou ácidas para formar uma ligação dissulfeto. Exemplos dos oxidantes incluem iodo, dimetilsulfóxido (DMSO) e ferricianeto de potás- sio.

Quando cada um dos monômeros peptídicos compreende dois

ou mais resíduos de cisteína, o dímero peptídico WT1 da presente invenção também pode ser preparado pelo método conforme descrito acima. Nesse caso, são obtidos isômeros devido aos tipos diferentes das ligações dissulfe- to. Alternativamente, o dímero peptídico WT1 da presente invenção pode ser

preparado pela seleção de uma combinação de grupos protetores para as cadeias laterais de cisteína. Exemplos das combinações dos grupos proteto- res incluem combinações do grupo MeBzI (metilbenzil) e do grupo Acm (ace- tamidometil), do grupo Trt (tritil) e do grupo Acm, do grupo Npys (3-nitro-2- piridiltio) e do grupo Acm, e do grupo S-Bu-t (S-terc-butil) e do grupo Acm.

Por exemplo, no caso da combinação do grupo MeBzI e do grupo Acm, o dímero peptídico WT1 pode ser preparado pela remoção dos grupos proteto- res diferentes do grupo MeBzI e do grupo protetor da cadeia lateral de ciste- ína, submetendo a solução monomérica resultante à oxidação pelo ar para formar uma ligação dissulfeto entre os resíduos de cisteína protegidos, e a seguir a desproteção e oxidação usando iodo para formar uma ligação dis- sulfeto entre os resíduos de cisteína anteriormente protegidos por Acm.

5 Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma compo-

sição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer compre- endendo o peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito e/ou o dímero peptídico WT1. O gene WT1 é expresso em altos níveis em vários cânceres e tumores inclu- indo tumores hematopoiéticos tais como leucemia, síndrome mielodisplásti- ca, mieloma múltiplo ou Iinfoma maligno e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de células germinativas, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical ou câncer de ovário. Consequentemente, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada para o tratamento ou prevenção de um câncer. Quando a compo- sição farmacêutica da presente invenção é administrada a um indivíduo HLA-A*1101-positivo, CTLs WT1-específicos são induzidos pelo peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito ou o dímero peptídico WT1 compreendendo na composição farmacêutica, e células cancerígenas no indivíduo são danifica- das por tais CTLs.

A composição farmacêutica da presente invenção pode compre- ender, além do peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito e/ou o dímero peptídico WT1 como um ingrediente ativo, por exemplo, um veículo, um excipiente ou semelhantes. O peptídeo WT1 HLA-A*1101-restrito ou o dímero peptídico 25 WT1 compreendido na composição farmacêutica da presente invenção induz um CTL WT1 -específico. Deste modo, a composição farmacêutica da pre- sente invenção pode compreender um adjuvante apropriado, ou pode ser administrado juntamente com um adjuvante apropriado para intensificar a eficiência da indução. Exemplos de adjuvantes preferíveis incluem, porém 30 não estão limitados, ao adjuvante de Freund completo ou incompleto e hi- dróxido de alumínio.

O método de administração da composição farmacêutica da pre- sente invenção pode ser apropriadamente selecionado dependendo das condições, tais como o tipo de doença, a condição do indivíduo ou o sítio- alvo. Exemplos de tais métodos incluem, porém não estão limitados, à admi- nistração intradérmica, à administração subcutânea, à administração intra- 5 muscular, à administração intravenosa, à administração nasal e à adminis- tração oral. A quantidade do peptídeo ou o dímero peptídico compreendido na composição farmacêutica da presente invenção, assim como a forma de dosagem, a quantidade de vezes da administração e semelhantes da com- posição farmacêutica da presente invenção podem ser apropriadamente se- 10 lecionados dependendo das condições tais como do tipo de doença, da con- dição do indivíduo ou do sítio-alvo. A dose única do peptídeo é geralmente de 0,0001 mg a 1000 mg, preferivelmente, de 0,001 mg a 1000 mg.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo a adminis- 15 tração de uma quantidade eficaz do peptídeo WT1 e/ou do dímero peptídico WT1 a um indivíduo HLA-A*1101 positivo. O câncer a ser tratado ou preve- nido pode ser qualquer um, e seus exemplos incluem tumores hematopoiéti- cos tais como leucemia, síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo ou Iin- foma maligno e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, 20 câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de células germinativas, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uteri- no, câncer cervical ou câncer de ovário.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um méto- do para a determinação da presença ou quantidade de um CTL WT1 especí- fico em um indivíduo HLA-A*1101 positivo, compreendendo:

(a) a reação de um complexo de um peptídeo WT1 e uma molé- cula HLA-A*1101 com uma amostra do indivíduo; e

(b) a determinação da presença ou quantidade de CTL reconhe- cendo o complexo contido na amostra. A amostra de um indivíduo pode ser

qualquer uma, contanto que exista a possibilidade de que contenha um linfó- cito. Exemplos de amostras incluem fluidos corporais tais como sangue ou Iinfa e um tecido. O complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLA- Α*1101 pode ser preparado, por exemplo, como um tetrâmero ou pentâmero usando um método conhecido por uma pessoa versada na técnica, tal como o método de biotina-estreptavidina. A presença ou quantidade do CTL reco- nhecendo tal complexo pode ser medida por um método conhecido por uma 5 pessoa versada na técnica. Nesse aspecto da presente invenção, o comple- xo pode ser marcado. Um marcador conhecido tal como um marcador fluo- rescente ou um marcador radioativo pode ser usado como um marcador. A marcação torna a determinação da presença ou quantidade de um CTL fácil e rápida.

Deste modo, a presente invenção também fornece uma compo-

sição para a determinação da presença ou quantidade de um CTL WT1- específico em um indivíduo HLA-A*1101 compreendendo um peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito.

Além disso, a presente invenção fornece um kit para a determinação da pre- sença ou quantidade de um CTL WT1-específico em um indivíduo HLA- A*1101 positivo, compreendendo um peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um méto- do para a produção de um CTL WT1-específico usando um complexo do peptídeo WT1 e uma molécula HLA-A*1101, compreendendo:

(a) a reação do complexo com uma amostra; e

(b) a obtenção de um CTL reconhecendo o complexo contido na amostra. O complexo de um peptídeo WT1 e de uma molécula HLA-A*1101 é descrito acima. A amostra pode ser qualquer uma, contanto que exista a possibilidade de conter um linfócito. Exemplos das amostras incluem uma 25 amostra de um indivíduo tal como sangue, e uma cultura celular. O CTL re- conhecendo o complexo pode ser obtido usando um método conhecido por uma pessoa versada na técnica, tal como FACS ou MACS. A presente in- venção permite a cultura do CTL WT1 específico e o seu uso para o trata- mento ou prevenção de vários cânceres.

Deste modo, a presente invenção também se refere a um CTL

WT1-específico obtenível por um método para a produção de um CTL WT1- específico usando um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLA- Α*1101.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um polinucle- otídeo codificando o peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito. O polinucleotídeo da presente invenção pode ser DNA ou RNA. A seqüência base do polinu- 5 cleotídeo da presente invenção pode ser determinada baseando-se na se- qüência de aminoácidos do peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito. O polinucle- otídeo pode ser preparado por um método conhecido para a síntese de DNA ou RNA (por exemplo, método de síntese química), método de PCR ou se- melhante.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um vetor de

expressão compreendendo o polinucleotídeo. O tipo do vetor de expressão, a seqüência compreendida diferente da seqüência do polinucleotídeo e se- melhante pode ser apropriadamente selecionado dependendo do tipo de hospedeiro no qual o vetor de expressão da presente invenção está introdu- 15 zido, do propósito de uso ou semelhante. É possível tratar ou prevenir tumo- res hematopoiéticos ou cânceres sólidos pela administração do vetor de ex- pressão da presente invenção a um indivíduo HLA-A*1101 positivo para pro- duzir um peptídeo HLA-A*1101 restrito em um corpo vivo e induzir um CTL WT1 específico, e danificando as células tumorais hematopoiéticas ou as 20 células cancerígenas sólidas no indivíduo.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo o polinucleotídeo ou o vetor de expressão. A composição, método de administração e semelhante da composição farmacêutica da pre- sente invenção nesse aspecto estão descritos acima.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo a adminis- tração de uma quantidade eficaz do polinucleotídeo ou do vetor de expres- são em um indivíduo HLA-A*1101 positivo. Exemplos de cânceres a serem tratados ou prevenidos incluem tumores hematopoiéticos tais como Ieucemi-

a, síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo ou Iinfoma maligno e cânce- res sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de células germinativas, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervi- cal ou câncer de ovário.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma célula 5 compreendendo o vetor de expressão. A célula da presente invenção pode ser preparada, por exemplo, pela transformação de uma célula hospedeira, tal como de E. coli, levedura, célula de inseto ou célula animal com o vetor de expressão. O método para a introdução do vetor de expressão em uma célula hospedeira pode ser apropriadamente selecionado a partir de vários 10 métodos. Pelo cultivo da célula transformada, e pela recuperação e purifica- ção do peptídeo WT1 produzido, o peptídeo da presente invenção pode ser preparado.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um CTL WT-1 específico, o qual é induzido pelo peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito 15 e/ou pelo dímero peptídico WT1. O CTL da presente invenção reconhece um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLA-A*1101. Deste modo, o CTL da presente invenção pode ser usado para danificar especificamente uma célula tumoral positiva para HLA-A*1101 expressando WT1 em altos níveis.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método

para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo a adminis- tração de uma CTL WT1 específica a um indivíduo HLA-A*1101 positivo. O método de administração do CLT WT1-específico pode ser apropriadamente selecionado dependendo das condições, tais como o tipo de doença, a con- 25 dição do indivíduo ou o sítio-alvo. Exemplos de tais métodos incluem, porém não estão limitados, à administração intravenosa, administração intradérmi- ca, administração subcutânea, administração intramuscular, administração nasal e administração oral.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para a indução de um CTL WT1-específico, compreendendo o cultivo de uma célula mononuclear sanguínea periférica na presença do peptídeo HLA- A*1101 restrito e/ou do dímero WT1 peptídico para induzir o CTL WT1- específico da célula mononuclear sanguínea periférica. O indivíduo a partir do qual a célula mononuclear sanguínea periférica é derivada pode ser qual- quer um, contanto que ele seja positivo para HLA-A*-1101. Pelo cultivo das células mononucleares sanguíneas periféricas na presença do peptídeo 5 WT1 HLA-A*1101 restrito e/ou do dímero peptídico WT1, CTLS WT1- específicos são induzidos a partir das células precursoras de CTL contidas nas células mononucleares sanguíneas periféricas. É possível tratar ou pre- venir tumores hematopoiéticos ou cânceres sólidos em um indivíduo HLA- A*1101 positivo pela administração de CTL WT1-específico obtido de acordo 10 com a presente invenção ao indivíduo.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para a indução de um CTL WT1-específico, compreendendo um peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito e/ou o dímero peptídico WT1 como um componente essencial. Preferivelmente, o kit é usado no método para a indução de um 15 CTL WT1-específico. O kit da presente invenção pode compreender, além do peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito e/ou do dímero peptídico WT1, por exemplo, um meio de obter uma célula mononuclear sanguínea periférica, um adjuvante, um frasco reacional ou semelhante. Em geral, um manual de instrução estão associado ao kit. Através do uso do kit da presente invenção, 20 CTs WT1-específicos podem ser eficientemente induzidos.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a uma célu- la apresentadora de antígeno (tal como uma célula dendrítica) apresentando um peptídeo WT1 através de uma molécula HLA-A*1101, a qual é induzida pelo peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito e/ou pelo dímero peptídico WT1. 25 Pelo uso da célula apresentadora de antígeno da presente invenção, CTLs WT1 específicos são eficientemente induzidos.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo a adminis- tração da célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1 30 através da molécula HLA-A*1101 a um indivíduo HLA-A*1101 positivo. O método da administração da célula apresentadora de antígeno pode ser a- propriadamente selecionado dependendo das condições, tais como do tipo de doença, da condição do indivíduo ou do sítio-alvo. Exemplos de tais mé- todos incluem, porém não estão limitados, à administração intravenosa, à administração intradérmica, à administração subcutânea, à administração intramuscular, à administração nasal e à administração oral.

5 Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método

para a indução de uma célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1 através de uma molécula HLA-A*1101, compreendendo o cul- tivo de uma célula apresentadora de antígeno imatura na presença do peptí- deo WT1 HLA-A*1101 restrito e/ou do dímero peptídico WT1 para induzir a 10 célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1 através da molécula HLA-A*1101 a partir da célula apresentadora de antígeno imatu- ra. A célula apresentadora de antígeno imatura se refere a uma célula tal como a uma célula dendrítica imatura que pode ser amadurecida em uma célula apresentadora de antígeno. Um indivíduo a partir do qual a célula a- 15 presentadora de antígeno imatura é derivada pode ser qualquer uma, con- tanto que ela seja positiva pára HLA-A*1101. Devido ao fato das células a- presentadoras de antígeno imaturas estarem contidas, por exemplo, nas cé- lulas mononucleares sanguíneas periféricas, tais células podem ser cultiva- das na presença do peptídeo WT1 e/ou do dímero peptídico WT1.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para a

indução de uma célula apresentadora de antígeno apresentando um peptí- deo WT1 através de uma molécula HLA-A*1101, compreendendo o peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito e/ou o dímero peptídico WT1 como um componen- te essencial. Preferivelmente, o kit é usado no método para a indução de 25 uma célula apresentadora de antígeno. Outro componente a ser compreen- dido no kit da presente invenção e semelhantes são descritos acima. O kit da presente invenção pode ser usado para induzir eficientemente uma célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1 através de uma molécula HLA-A*1101.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um anticorpo

contra um peptídeo WT1 HLA-A*1101 restrito ou um polinucleotídeo codifi- cando o peptídeo. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um méto-

do para o diagnóstico de um câncer, compreendendo o uso de CTL WT1 específico, a célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1 através de uma molécula HLA-A*1101, ou o anticorpo contra um peptí- deo WT1 HLA-A*1101 restrito ou um polinucleotídeo codificando o peptídeo. Preferivelmente, o CTL WT1 específico é usado no método para o diagnósti- co da presente invenção. Por exemplo, é possível diagnosticar um câncer pela incubação de CTL, da célula apresentadora de antígeno ou o anticorpo com uma amostra de um indivíduo HLA-A*1101, ou a administração desta em um indivíduo HLA-A*1101 positivo, e a determinação, por exemplo, da posição, sítio ou quantidade sua. O CTL, a célula apresentadora de antígeno ou o anticorpo pode ser marcado. Pela ligação de um marcador, o método para o diagnóstico da presente invenção pode ser praticado eficientemente. Exemplos

mais detalhada, porém não são para serem construídos para limitar o seu escopo.

Exemplo 1: Seleção do peptídeo WT1 RANKPEP

(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) foi usado para selecionar

com alta capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101 derivada dos peptídeos de uma proteína WT1 (SEQ ID NO: 1). Seqüências de aminoáci- dos, números de aminoácidos na SEQ ID NO: 1 e pontuações de afinidade a uma molécula HLA-A*1101 desses peptídeos são mostradas na tabela 1.

Os seguintes exemplos ilustram a presente invenção de forma

Tabela 1

Peptídeo

Número do ami- Seqüência do ami- Pontuação de

noácido

afinidade

251-259

AAGSSSSVK

15.18

(SEQ ID No: 2) WTI279

(SEQ ID No: 3)

279-287

PILCGAQYR

11.47 Peptídeo Número do ami- Seqüência do ami- Pontuação noácido noácido afinidade WT1 312 312-320 RSASETSEK 14.96 (SEQ ID No: 4) WT1 313 313-321 SASETSEKR 6.87 (SEQ ID No: 5) WT1 338 338-346 SHLQMHSRK 13.72 (SEQ ID No: 6) WT1 378 378-386 TGVKPFQCK 11.33 (SEQ ID No: 7) WT1 386 386-394 KTCQRKFSR 13.82 (SEQ ID No: 8) WTI415 415-423 SCRWPSCQK 10.29 (SEQ ID No: 9) WTI436 436-444 NMHQRNMTK 14.19 (SEQ ID No: 10) Preparação da célula B-LCL

Células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) foram separadas pelo método de centrifugação de densidade de gradiente Ficoll- Hypaque a partir do sangue periférico que foi coletado a partir de um doador 5 saudável HLA-A*1101-positivo. Os PBMCs foram a seguir semeados em uma placa de cultura de células com 24 poços na densidade de cerca de 1 x 107 em meio RPMI 1640 contendo FCS 10%, e um sobrenadante de cultura de células B95-8 (células produtoras do vírus EB) foi adicionado. Elas foram cultivadas a 37 0C com CO2 5% por cerca de 1 mês. As células B-LCL trans- 10 formadas com o vírus EB, as quais são células B tumorais, foram obtidas. Foi confirmado que as células B-LCL resultantes não expressam o gene WT1. As células B-LCL foram pulsadas pela incubação delas com 20 μg/mL de WTI251, WTI279, WTI312, WTI313, WTI338, WTI378, WTI386, WTI415 ou WTI436 por 2 horas, e irradiadas com 80 Gy de radiação. As células B-LCL 15 resultantes (de agora em diante chamadas de células B-LCL pulsadas com um peptídeo WT1) foram usadas como células apresentadoras de antígeno para os seguintes experimentos.

Indução de CTL WT1-específico

3 x 106 dos PBMCs autólogos foram cultivados em uma placa de cultura de células com 24 poços em meio completo (RPMI 45%, meio AMI-V 45% e soro AB humano 10%) contendo 20 μςΛηΙ. de WTI251, WTI279, WTI312, WTI313, WTI338, WTI378, WTI386, WTI415 ou WTI436 37 0C com CO2 5% por 1 semana para obter as células responsivas. 2 x 106 das células 5 responsivas resultantes foram cocultivadas com 1 x 106 das células B-LCL pulsadas com 0 mesmo peptídeo WT1 em meio completo por 1 semana (primeira estimulação). Os PBMCs foram co-cultivados com as células B- LCL pulsadas com 0 peptídeo WT1 mais três vezes (segunda a quarta esti- mulações) sob as condições sob as quais 20 lU/mL (concentração final) de 10 IL2 foi adicionada como a seguir: segunda estimulação: duas vezes dia sim dia não a partir de três dias depois da iniciação da estimulação; terceira e quarta estimulações: três vezes em intervalos de um dia a partir do dia de- pois do início da estimulação. As células resultantes foram concentradas usando um Kit de Alimentação por Gravidade de Colunas de Seleção Nega- 15 tivas (StemSp) de modo que a proporção de células T-CD8 positivas tenha se tornado aproximadamente 80%, e cocultivadas com as células B-LCL pulsadas com o peptídeo WT1 (quinta estimulação). As células T-CD8 posi- tivas (CTLs) obtidas 5 dias depois da estimulação final foram usadas para medições da atividade citotóxica.

Atividade citotóxica de CTL

A atividade citotóxica das CTLs foi medida usando o ensaio de liberação de 51Cr. As células CTL (de agora e mediante referidas como célu- las efetoras) foram misturadas na proporção (proporção E/T) de 1:1 a 30:1 em 200 μί de meio com células-alvo nas quais 51Cr foi incorporado, e culti- 25 vadas em uma placa de cultura de 96 poços a 37 0C com CO2 5% por 4 ho- ras. As células B-LCL pulsadas com o mesmo peptídeo WT1 que aqueles usados para indução de CTLs (BLCL-Os) e as células B-LCL sem pulsar com um peptídeo WT1 (BLCL-NPs) foram usadas como células-alvos. De- pois do cultivo, os sobrenadantes foram coletados por centrifugação. A 30 quantidade de 51Cr liberado no sobrenadante foi medida usando um conta- dor de cintilação líquido. A atividade citotóxica (%) foi determinada usando a fórmula a seguir: (liberação de 51Cr no sobrenadante da amostra - liberação de 51Cr espontânea) / (liberação de 51Cr máxima - liberação de 51Cr espontâ- nea) x 100

em que a liberação de 51Cr espontânea é a liberação de 51Cr observada quando as células-alvos nas quais 51Cr foi incorporado foram cul- tivadas sozinhas sob as mesmas condições, e a liberação de 51Cr máxima é a liberação de 51Cr observada quando as células-alvos nas quais 51Cr foi incorporado foram completamente Iisadas usando Triton X-100 1%. Os re- sultados estão mostrados nas figuras 1 a 9. Nas figuras, os eixos Iongitudi- nais representam a Iise específica (%) e os eixos horizontais representam as proporções E/T. BLCL-Os são representados usando linhas contínuas, e BLCL-NPs são representados usando linhas pontilhadas. Foi confirmado que CTLs induzidos com WTI251, WTI279, WT13i2, WTI3-13, WTI338, WTI378, WTI386, WTI415 ou WT1436 danificam especificamente BLCL-Os apresentan- do o peptídeo WT1 como um complexo com uma molécula HLA-A*1101 em comparação com BLCL-NPs. CTLs induzidos com WTI251, WTI279, WTI313, WTI338 ou WTI386 foram usados para os experimentos adicionais abaixo.

Atividade citotóxica de CTL contra células expressando WT12 endogenamente.

A atividade citootóxica dos CTLs induzido por WTI251, WTI279,

WTI313, WTI338 ou WTI386 contra células B-LCLs expressando WT1 foi de- terminada usando o método descrito acima. Uma célula expressando WT1 se refere a uma B-LCL na qual um gene WT1 humano é introduzido, e este expressa uma proteína WT1 na célula, e apresenta um peptídeo consistindo 25 em cerca de 9 aminoácidos resultando do processamento em uma molécula HLA-A*1101. Os resultados estão mostrados nas figuras 1, 2, 4, 5 e 7. Nas figuras, B-LCLs expressando WT1 são representados usando linhas traceja- das. Foi confirmado que CTLs induzidos com WTI251, WTI279, WT13i3, WTI338 ou WTI386 têm uma atividade citotóxica contra células expressando 30 o gene WT1 endogenamente.

Preparação do Dímero Peptídico WT1

Uma mistura de 227,5 mg do monômero peptídico WTI378, 227,5 mg de N-metilglucamina (NMG) e 23 ml_ de água foi oxidada pelo ar por agi- tação em temperatura ambiente por cerca de 2 dias. À mistura resultante, uma solução aquosa de 2 g de acetato de sódio em 5 ml_ de água foi adicio- nada e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por cerca de 20 minu- 5 tos. À solução resultante, 200 mL de água e cerca de 200 mL de acetonitrila foram adicionados, e a mistura foi filtrada através de um funil Kiriyama (papel de filtro N0 5C) e lavada com água (cerca de 50 mL x 3). Ao resíduo, cerca de 200 mL de água foram adicionados e o resíduo foi Iiofilizado para obter 158 mg do dímero peptídico WTI37S bruto.

Purificação do dímero peptídico WT1 bruto

158 mg do dímero peptídico WTI378 bruto foram dissolvidos em

9 mL de DMSO e injetados em uma coluna ODS Ci8 (5 cm Φ x 50 cm L, YMC Co., LTD.) ligada a um HPLC (Shimadzu, tipo LC8AD) e equilibrada com solução 1 (H20/Ac0H 1%) usando uma bomba de HPLC. A coluna foi 15 deixada por cerca de 30 minutos, e eluída com gradiente de concentração de 0% a 40% da solução 2 (CH3CN/1% AcOH) durante 360 minutos. As fra- ções contendo o dímero peptídico WT1 foram coletadas usando um coletor de frações automático durante o monitoramento da absorvância UV a 220 nm. As frações coletadas foram combinadas, injetadas em coluna ODS Ci8 20 (4,6 mm Φ x 25 cm L, YMC Co., LTD.), ligadas ao HPLC (Hitachi, tipo L- 4000) e equilibradas com 17% de solução 2, e eluídas com o gradiente de concentração de 0% a 47% da solução 2 durante 30 minutos para obter 46,6 mg do dímero peptídico WTI378 purificado no tempo de retenção de 20,51 minutos.

FAB.MS 2365,0 (valor teórico: 2342,70) Na+ F = 0,25%

Indução de CTL pelo dímero peptídico WT1 As capacidades do dímero peptídico WTI378 resultante, do pep- tídeo WTI378, do peptídeo WTI378 modificado (G -» I) SEQ ID NO: 11) e do peptídeo WTI378 modificado (G -» V) (SEQ ID NO: 12), assim como do pep- 30 tídeo WTI379 (SEQ ID NO: 13, conforme revelado no WO 2002/28414) para induzir CTL foram examinadas usando PBMCs a partir de doadores saudá- veis HLA-A*1101 positivos 1 - 3 de acordo com o método conforme descrito acima. Os resultados estão mostrados nas figuras 10-14. Nas figuras, os eixos longitudinais representa a Iise específica (%), e os eixos horizontais representam as proporções E/T. BLCL-Os são representados usando linhas contínuas, e BLCL-NPs são representados usando linhas pontilhadas. Foi 5 confirmado que o dímero peptídico WTI378 tem a capacidade de induzir um CTL. Além disso, foi descoberto que a capacidade de cada peptídeo WTI379 do qual a seqüência de aminoácidos é diferente daquela da WTI378 por um aminoácido na seqüência de aminoácidos da proteína WT1 para induzir um CTL é muito menor do que aquela do peptídeo WTI378 e, deste modo, o pep- 10 tídeo WT1 da presente invenção tem um efeito excelente e inesperado em comparação com o peptídeo conhecido.

Aplicabilidade Industrial

A presente invenção fornece um peptídeo HLA-A*1101 restrito, um polinucleotídeo codificando o peptídeo, uma composição farmacêutica 15 compreendendo o mesmo e semelhantes. Consequentemente, a presente invenção pode ser usada nos campos da medicina e semelhante, por exem- plo, nos campos do desenvolvimento e preparação de uma composição far- macêutica para a prevenção ou tratamento de vários tumores hematopoiéti- cos e cânceres sólidos que expressam o gene WT1 em altos níveis.

Texto livre da listagem de seqüências

SEQ ID NO: 11: Peptídeo WT1 modificado SEQ ID NO: 12: Peptídeo WT1 modificado Listagem de Seqüência

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<110> International Institute i Df Cancer Immunology, , Inc. <120> "PEPTÍDEO WTl HLA-A*1101 RESTRITO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DENDO C I MESMO" <130> 667 985 <150> JP 2006-355356 <151> 2006-12-28 < 160> 13 <17 0> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211 > 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe

85 90 95

Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 HO

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser GIy Gln Ala Arg Met Phe

115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser

145 150 155

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser

165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln

180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp 195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser

210 215 220

Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn 225 230 235

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser 245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr 260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro He Leu Cys Gly Aia Gln Tyr Arg 275 280 285

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val 290 295 300

Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu 305 310 315

Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe 325 330 335

Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys 340 345 350

Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser 355 360 365

Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe 370 375 380

Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys 385 390 395

Tyr

160

Phe

Gln

Ser

Asp

Gln

240

Ser

Glu

Ile

Pro

Lys

320

Lys

Pro

Asp

Gln

Thr

400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415

Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430

Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala 435 440 445

Leu <210> 2 <211> 9 <212> PRT

<213> Homo sapiens <4 00> 2

Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 1 5

<210> 3

<211> 9 < 212 > PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 3

Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg 1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys

1 5

<210> 5

< 211 > 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <4 00> 5 Ser Ala Ser I

<210> 6 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo

<4 00> 6 Ser His Leu 1

<210> 7

<2 11> 9

<212> PRT

<213> Homo

<4 00> 7

Thr Gly Val 1

<210> 8 <211> 9 20 <212> PRT <213> Homo <4 0 0> 8 Lys Thr Cys 1

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo

<4 00> 9 Ser Cys Arg 1

<210> 10

Glu Thr Ser Glu Lys Arg 5

sapiens

Gln Met His Ser Arg Lys 5

sapiens

Lys Pro Phe Gln Cys Lys b

sapiens

Gln Arg Lys Phe Ser Arg 5

sapiens

Trp Pro Ser Cys Gln Lys 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 10 Asn Met His Gln Arg Asn Met 1 5 <210> 11 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified WTl peptide <400> 11 Thr Ile Val Lys Pro Phe Gln 1 5 <2 10> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified WTl peptide <4 00> 12 Thr Val Val Lys Pro Phe Gln 1 5 <210> 13 <211> 9 < 212 > PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 13 Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys 1 5

Claims

1. Peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1, em que o peptídeo tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-A*1101, e tem a capacidade de induzir CTL.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, em que o aminoá- cido na posição 9 da seqüência de aminoácidos é Lys ou Arg.

3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên- cia de aminoácidos é selecionada do grupo consistindo em: Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID No: 2), Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No: 3), Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys (SEQ ID No: 4), Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID No: 5), Ser His Leu Gln Met His SerArg Lys (SEQ ID No: 6), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID No: 8), Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No: 9), e Asn Met His Gln Arg Asn MetThr Lys (SEQ ID No: 10).

4. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 3, em que a sequên- cia de aminoácidos é Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID No: 2).

5. Dímero de peptídeo com a capacidade de se ligar a uma mo- lécula HLA-A*1101 e com a capacidade de induzir CTL, no qual dois monô- meros peptídicos, cada um compreendendo uma seqüência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1 e compreen- dendo pelo menos um resíduo de cisteína estão ligados um ao outro através de uma ligação dissulfeto.

6. Dímero peptídico, de acordo com a reivindicação 5, em que a seqüência de aminoácidos do monômero peptídico é selecionada do grupo consistindo em: Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No: 3), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No: 7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe SerArg (SEQ ID No: 8), e Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No: 9).

7. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo o peptídeo como definido na reivindicação 1, e/ou o dímero peptídico como definido na reivindicação 5.

8. Método para o tratamento ou prevenção de um câncer, com- preendendo a administração de uma quantidade eficaz do peptídeo como definido na reivindicação 1, e/ou o dímero peptídico como definido na reivin- dicação 5, a um indivíduo HLA-A*1101 positivo.

9. Polinucleotídeo codificando o peptídeo como definido na rei- vindicaçãol.

10. Vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 9.

11. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindi- cação 9 ou o vetor como definido na reivindicação 10.

12. Método para o tratamento ou prevenção de um câncer, com- preendendo a administração de uma quantidade eficaz do polinucleotídeo como definido na reivindicação 9 ou o vetor como definido na reivindicação 10, a um indivíduo HLA-A*1101 positivo.

13. CTL WT1-específico, o qual é induzido pelo peptídeo como definido na reivindicação 1 e/ou o dímero peptídico como definido na reivin- dicação 5.

14. Método para a indução de um CTL WT1-específico, compre- endendo o cultivo de uma célula mononuclear sanguínea periférica na pre- sença do peptídeo como definido na reivindicação 1 e/ou o dímero peptídico como definido na reivindicação 5, para induzir o CTL WT1-específico a partir da célula mononuclear sanguínea periférica.

15. Kit para a indução de um CTL WT1-específico, compreen- dendo o peptídeo de acordo com a reivindicação 1 e/ou o dímero peptídico de acordo com a reivindicação 5 como um componente essencial.

16. Célula apresentadora de antígeno apresentando um peptí- deo WT1, o qual é induzido pelo peptídeo como definido na reivindicação 1 e/ou o dímero peptídico como definido na reivindicação 5.

17. Método para a indução de uma célula apresentadora de an- tígeno apresentando um peptídeo WT1, compreendendo o cultivo de uma célula apresentadora de antígeno imatura na presença do peptídeo como definido na reivindicação 1 e/ou o dímero peptídico como definido na reivin- dicação 5, para induzir a célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1 a partir da célula apresentadora de antígeno imatura.

18. Kit para a indução de uma célula apresentadora de antígeno apresentando um peptídeo WT1, compreendendo o peptídeo como definido na reivindicação 1 e/ou o dímero peptídico como definido na reivindicação 5, como um componente essencial.

19. Método para o diagnóstico de câncer, compreendendo o uso de CTL de acordo com a reivindicação 13 ou a célula apresentadora de antí- geno como definido na reivindicação 16.