CN116096405A - 多聚体t细胞调节多肽及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供T细胞调节多聚体多肽，其包含免疫调节多肽且包含表位递呈的威尔姆氏瘤肽。T细胞调节多聚体多肽适用于调节T细胞的活性且适用于调节个体中的免疫反应。
Description
交叉引用
本申请要求2020年5月12日提交的美国临时专利申请号63/023,834和2020年6月19日提交的美国临时专利申请号63/041,451的优先权，这些申请的公开内容以引用方式整体并入本文。
通过引用以文本文件形式提供的序列表并入
序列表作为文本文件提供，“CUEB-133WO_SEQ_LIST2_ST25.txt”创建于2021年5月7日，大小为800KB。文本文件的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
适应性免疫反应涉及存在于T细胞表面上的T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞(APC)表面上非共价递呈的小肽抗原通过主要组织相容性复合物(MHC；在人中也称为人白细胞抗原(HLA)复合物)进行的接合。此接合表示免疫系统的靶向机制且为T细胞调节(活化或抑制)及效应物功能的必需分子相互作用。在表位特异性细胞靶向之后，通过使APC上所见的共刺激蛋白与T细胞上的对应物共刺激蛋白接合来激活所靶向的T细胞。驱动T细胞特异性及活化或抑制需要两种信号，即表位/TCR结合及APC共刺激蛋白与T细胞共刺激蛋白的接合。TCR对于给定表位具有特异性；然而，共刺激蛋白并非表位特异性的且相反通常在全部T细胞上或大T细胞子集上表达。
发明内容
本公开提供T细胞调节多聚体多肽(TMMP)，其包含免疫调节多肽且包含表位递呈的威尔姆氏瘤(Wilms tumor)肽。所述T细胞调节多聚体多肽适用于调节T细胞的活性且适用于调节个体中的免疫反应。
附图说明
图1A-1F为本公开的各种TMMP的示意性描绘。
图2A-2F为本公开的各种二硫键连接的TMMP的示意性描绘。
图3A-3E提供WT-1多肽的氨基酸序列。图3A-3E的序列分别列于SEQ ID NO:399-403中。
图4A-4E提供本公开的TMMP的示例性多肽链的氨基酸序列。图4A-4E的示例性多肽链的序列分别列于SEQ ID NO:405-409中。表位序列如下列出：图4D：CMTWNQMNL(SEQ IDNO:266)；图4E：CYTWNQMNL(SEQ ID NO:267)。
图5A-5H提供免疫球蛋白Fc多肽的氨基酸序列。图5A-5G的序列分别列于SEQ IDNO:410-421中。图5H中描述的序列列于SEQ ID NO:487中。
图6提供来自以下各项的β-2微球蛋白(β2M)前体(即，包括前导序列)的多重氨基酸序列比对：智人(Homo sapiens)(NP_004039.1；SEQ ID NO:19)、黑猩猩(Pantroglodytes)(NP_001009066.1；SEQ ID NO:19)、恒河猕猴(Macaca mulatta)(NP_001040602.1；SEQ ID NO:20)、欧洲牛(Bos taurus)(NP_776318.1；SEQ ID NO:21)及小家鼠(Mus musculus)(NP_033865.2；SEQ ID NO:22)。氨基酸1-20是信号肽。
图7A-7C提供等位基因A*0101(SEQ ID NO:23)、A*1101(SEQ ID NO:24)、A*2402(SEQ ID NO:25)及A*3303(SEQ ID NO:26)(图7A)的全长人HLA重链的氨基酸序列；等位基因B*0702(SEQ ID NO:27)(图7B)的全长人HLA重链的氨基酸序列；以及全长人HLA-C重链(SEQ ID NO:28)(图7C)的氨基酸序列。
图8提供十一种无前导序列、跨膜结构域及细胞内结构域的成熟I类MHC重链氨基酸序列的比对。从上到下：SEQ ID NO:41-51。
图9A-9B提供HLA-A重链氨基酸序列(图9A)和共有序列(图9B；SEQ ID NO:29)的比对。
图10A-10B提供HLA-B重链氨基酸序列(图10A；分别为SEQ ID NO:207-213)和共有序列(图10B；SEQ ID NO:30)的比对。
图11A-11B提供HLA-C重链氨基酸序列(图11A；分别为SEQ ID NO:214-222)和共有序列(图11B；SEQ ID NO:31)的比对。
图12提供HLA-E、HLA-F及HLA-G重链(分别为SEQ ID NO:32-34)中各者的共有氨基酸序列。各种氨基酸(aa)位置指示为依次编号的“X”残基；氨基酸84、139及236的位置加双下划线。
图13提供HLA-A(SEQ ID NO:29)、-B(SEQ ID NO:30)、-C(SEQ ID NO:31)、-E(SEQID NO:32)、-F(SEQ ID NO:33)及-G(SEQ ID NO:34)的共有氨基酸序列的比对。
图14A-14J提供本公开的双二硫键连接的TMMP的多肽链的氨基酸序列。图14A-14I的多肽链的序列分别列于SEQ ID NO:422-430中。表位序列如下列出：图14B：VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)；图14C：RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)；图14F：VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)；图14G：RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)；图14H：YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)；图14I：YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)及14J(SEQ ID NO:486)。
图15描绘本公开的含有WT1(37-45)表位的TMMP的表达和稳定性数据。
图16描绘本公开的含有WT1(126-134)表位的TMMP的表达和稳定性数据。
图17A-17D提供本公开的双二硫键连接的TMMP的示意性描绘。
图18A-18C提供本公开的二硫键连接的TMMP的构型的实例的示意性描绘。
图19提供免疫调节多肽于本公开的TMMP中的位置的实例的示意性描绘。
图20A-20R提供本公开的TMMP的示例性多肽链的氨基酸序列。图20A-20R的示例性多肽链的序列分别列于SEQ ID NO:431-448中。表位序列如下列出：图20H：CYTWNQMNL(SEQID NO:262)；图20I：CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)；图20J：CYTW NQMNL(SEQ ID NO:262)；图20K：CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)；图20L：CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)；图20M：NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)；图20N：NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)；图20O：NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)；图20P：NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)；图20Q：NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)；图20R：NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)。
图21描绘含有WT1肽表位及HLA-A*02重链的TMMP对抗原特异性CD8+ T细胞扩增的作用。
图22描绘在10天促发培养后的8天再刺激培养过程中含有WT1肽表位的TMMP对来自总PBMC的WT1-特异性CD8+ T细胞的扩增的作用。
图23描绘由以具有G2C或R12C/G2C构架的含有WT1 37-45的TMMP扩增的WT1-特异性CD8+ T细胞进行的TNF-α和IFN-γ产生。
图24描绘由以具有R12C/G2C构架的含有WT1 126-134的TMMP扩增的WT1-特异性CD8+ T细胞进行的TNF-α和IFN-γ产生。
图25描绘二硫键对IL-2驱动的免疫细胞活化的作用。
图26描绘与阿地白介素(proleukine)相比，含有变体IL-2作为免疫调节多肽的TMMP对CGLL-2增殖的作用。
图27描绘“1715+2380”TMPP与各种Fc受体的结合。
图28描绘含有WT1肽表位235-243(M236Y)和HLA-A*24重链的TMMP对抗原特异性CD8+T细胞扩增的作用。
图29描绘含有WT1肽表位239-247(Q240Y)和HLA-A*24重链的TMMP对抗原特异性CD8+T细胞扩增的作用。
图30描绘具有在位置1或3处工程化的IL-2多肽、肽表位WT1235-243(M236Y)、HLA-A24重链和G2C或R12C/G2C二硫键框架的TMMP诱导CD69表达。
图31描绘与阿地白介素和重组人IL-2(rhIL-2)相比，TMMP(具有在位置1或3处工程化的IL-2多肽、肽表位WT1 239-247(Q240Y)、HLA-A24重链和G2C或R12C/G2C二硫键框架)对CD69表达的作用。
图32描绘与阿地白介素相比，TMMP(具有在位置1或3处工程化的IL-2多肽、肽表位WT1 235-243(M236Y)、HLA-A24重链和G2C或R12C/G2C二硫键框架)对CTLL-2增殖的作用。
图33描绘与阿地白介素相比，TMMP(具有在位置1或3处工程化的IL-2多肽、肽表位WT1 239-247(Q240Y)、HLA-A24重链和G2C或R12C/G2C二硫键框架)对CTLL-2增殖的作用。
图34描绘“3425+3529”TMPP与各种Fc受体的结合。
图35A-35F提供本公开的TMMP的示例性多肽链的氨基酸序列，其中多肽链包含WT-1肽SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)。
图36A-36F提供本公开的TMMP的示例性多肽链的氨基酸序列，其中多肽链包含WT-1肽GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)。
图37A-37F提供本公开的TMMP的示例性多肽链的氨基酸序列，其中多肽链包含WT-1肽SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)。
图38A-38F提供本公开的TMMP的示例性多肽链的氨基酸序列，其中多肽链包含WT-1肽GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)。
图39描绘WT137-45特异性CD8+T细胞从未促发的PBMC的扩增，其中扩增由本公开的TMMP(“CUE-102/A02WT137-45IST”)诱导。
图40A-40B描绘WT137-45特异性CD8+T细胞从WT137-45肽促发的PBMC的扩增，其中扩增由本公开的TMMP(“CUE-102/A02WT137-45IST”)诱导。
图41A-41B描绘由本公开的TMMP(“CUE-102/A02WT137-45IST”)或由野生型IL-2诱导的TNF-α、IL-6和IFN-γ的产生以及CD69的上调。
图42A-42B描绘在本公开的TMMP(“CUE-102/A02WT137-45IST”)的存在下从肽促发的PBMC扩增的WT137-45肽特异性CD8+T细胞针对肽递呈靶细胞的CTL活性。
图43描绘含有WT1肽表位WT1 235-243(C235S；M236Y)和HLA-A*24重链的TMMP对抗原特异性CD8+T细胞扩增的作用。
图44描绘含有WT1肽表位WT1 239-247(Q240Y)和HLA-A*24重链的TMMP对抗原特异性CD8+T细胞扩增的作用。
图45描绘含有WT1肽表位37-45的TMMP对幼稚HLA-A2(AAD)转基因小鼠中抗原特异性CD8+T细胞扩增的作用。
图46A-46D提供HLA-E重链的氨基酸序列。
图47A-47D提供HLA-G重链的氨基酸序列。
定义
如本文中可互换使用的术语“多核苷酸”与“核酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物形式，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生化核苷酸碱基的聚合物。
术语“肽”、“多肽”及“蛋白质”在本文中可互换使用，且是指具有任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可包括编码及非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸、及具有修饰肽主链的多肽。此外，如本文所用，“多肽”是指包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(通常本质上是本领域技术人员已知的保守的)，只要蛋白质保持所需的活性。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是偶然的，诸如通过产生蛋白质的宿主的突变，或由于聚合酶链式反应(PCR)扩增或其他重组DNA方法引起的错误。本文提及已知多肽中的特定残基或残基编号应理解为是指野生型多肽中该位置的氨基酸。就野生型多肽的序列通过一个或多个氨基酸的添加或缺失而改变的程度而言，普通技术人员将理解对特定残基或残基编号的提及将相应地改变，以便指代改变的多肽中相同的特定氨基酸，其应理解为位于改变的位置编号处。例如，如果通过在N末端添加一个氨基酸来改变I类MHC多肽，那么对位置84或位置84处的特定残基的提及将被理解为指示在改变的多肽上的位置85处的氨基酸。同样，本文提及特定位置处特定氨基酸例如Y84的取代应理解为指代氨基酸取代野生型多肽中位置84处的氨基酸。Y84C取代因此应理解为Cys残基取代存在于野生型序列中的Tyr残基。如果例如野生型多肽被改变以将位置84处的氨基酸从其野生型氨基酸改变为替代氨基酸，则对位置84处的氨基酸的取代应理解为是对替代氨基酸的取代。如果在这种情况下，多肽也因一个或多个氨基酸的添加或缺失而改变，那么对取代的提及应理解为指代在改变的位置编号处对替代氨基酸的取代。对多肽例如I类MHC多肽中的“非天然存在的Cys残基”的提及意指该多肽在相应的野生型多肽中不存在Cys的位置处包含Cys残基。这可以通过常规蛋白质工程来实现，其中半胱氨酸取代野生型序列中出现的氨基酸。
多核苷酸或多肽与另一个多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”意指在比对时在比较两个序列时碱基或氨基酸的百分比相同且处于相同相对位置中。序列同一性可以许多不同方式测定。为了测定序列同一性，可使用各种便利方法及在万维网之网址上可获得的计算机程序(例如BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)来比对序列，这些网址包括ncbi.nlm.nili.gov/BLAST、ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/、mafft.cbrc.jp/alignment/software/。参见，例如Altschul等人(1990),J.Mol.Bioi.215:403-10。除非另有说明，否则使用BLAST计算机程序测定序列同一性。
术语“保守氨基酸取代”是指在蛋白质中具有类似侧链的氨基酸残基的可互换性。例如，具有脂族侧链的氨基酸组由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸组成；具有脂族羟基侧链的氨基酸组由丝氨酸和苏氨酸组成；具有含酰胺侧链的氨基酸组由天冬酰胺和谷氨酰胺组成；具有芳族侧链的氨基酸组由苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸组成；具有碱性侧链的氨基酸组由赖氨酸、精氨酸及组氨酸组成；具有酸性侧链的氨基酸组由谷氨酸和天冬氨酸组成；且具有含硫侧链的氨基酸组由半胱氨酸和甲硫氨酸组成。示例性保守氨基酸取代基为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所用，术语“免疫学突触”或“免疫突触”通常是指适应性免疫反应的两个相互作用免疫细胞之间的自然界面，包括例如抗原递呈细胞(APC)或靶细胞与效应细胞例如淋巴细胞、效应T细胞、自然杀手细胞等之间的界面。APC与T细胞之间的免疫学突触通常通过T细胞抗原受体与主要组织相容性复合物分子之间的相互作用来起始，例如，如Bromley等人,Annu Rev Immunol.2001；19:375-96中所述，该文献的公开内容以引用方式整体并入本文。
“T细胞”包括所有类型的表达CD3的免疫细胞，包括T-辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T-细胞(CD8+细胞)、T-调节性细胞(Treg)及NK-T细胞。
如本文所用，术语“免疫调节多肽”也称为“共刺激多肽”)包括在抗原递呈细胞(APC)(例如，树突状细胞、B细胞等)上的多肽，其特异性结合T细胞上的同源共免疫调节多肽，从而提供一个信号，除了通过例如TCR/CD3复合物与以肽装载的主要组织相容性复合物(MHC)多肽的结合提供的主要信号之外，该信号还介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等反应。免疫调节多肽可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、Fas配体(FasL)、诱导性共刺激配体(ICOS-L)、细胞内粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、以及与B7-H3特异性结合的配体。
如上文所述，“免疫调节多肽”(在本文中也称为“MOD”)特异性结合T细胞上的同源共免疫调节多肽。
本公开的TMMP的“免疫调节结构域”(“MOD”)结合可存在于靶T细胞上的同源共免疫调节多肽。
如本文所用，术语“体内”是指在体内发生的任何过程或程序。
如本文所用，“体外”是指在体外发生的任何过程或程序。
如本文所用，“异源”意指核苷酸或多肽分别不可见于天然核酸或蛋白质中。
如本文所用，“重组”意指特定核酸(DNA或RNA)为克隆、限制、聚合酶链反应(PCR)和/或连接步骤的各种组合的产物，这些组合产生具有与见于自然系统中的内源性核酸可区分的结构性编码或非编码序列的构建体。编码多肽的DNA序列可由cDNA片段或一系列合成寡核苷酸组装以提供合成核酸，该合成核酸能够从细胞或无细胞转录及转译系统中所含的重组转录单元表达。
术语“重组表达载体”或“DNA构建体”在本文中可互换使用以指代包含载体和至少一个插入物的DNA分子。重组表达载体通常出于表达和/或繁殖插入物的目的或出于构建其他重组核苷酸序列的目的而生成。插入物可以可操作地连接或不连接至启动子序列且可以可操作地连接或不连接至DNA调节序列。
如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂(例如抗体与抗原)的可逆结合的平衡常数且表示为解离常数(KD)。如本文所用，术语“亲合力”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对解离的抵抗。术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中关于抗体和/或抗原结合片段可互换使用。
如本文所用，术语“结合”(例如关于TMMP与T细胞上的多肽(例如T细胞受体)的结合)是指两个分子之间的非共价相互作用。非共价结合是指两个分子之间由于例如静电、疏水性、离子和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥和水桥的相互作用)而直接缔合。“亲和力”是指非共价结合强度，结合亲和力的增加与较低的KD相关联。“特异性结合”通常是指配体与作为其指定结合位点或受体的部分的结合。“非特异性结合”通常是指配体与其指定的结合位点或受体以外的部分的结合。如本文所用，“共价结合”或“共价键”是指两个不同分子之间的一个或多个共价化学结合的形成。
术语“治疗(treatment/treating)”等在本文中用于通常意指获得所要药理学和/或生理学作用。该作用可在完全或部分预防疾病或其症状方面为预防性的，且/或可在疾病和/或因疾病引起的不良效应的部分或完全治愈方面为治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物中的疾病或症状的任何治疗，且包括：(a)预防疾病或症状出现于可能倾向于获得该疾病或症状但尚未诊断为患有该疾病的受试者中；(b)抑制疾病或症状，即阻止其发展；和/或(c)缓解疾病，即引起疾病消退。治疗剂可在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。尤其关注正在发展的疾病的治疗，其中所述治疗使患者的不希望有的临床症状稳定或减轻。此类治疗理想地在患病组织中的功能完全丧失之前进行。目标疗法将理想地在疾病之有症状阶段期间且在一些情况下在疾病的有症状阶段之后施用。
术语“个体(individual)”、“受试者(subject)”、“宿主(host)”及“患者(patient)”在本文中可互换使用且是指需要诊断、处理或治疗的任何哺乳动物受试者。哺乳动物包括例如人、非人灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠；小鼠)、兔类动物(例如兔)、有蹄类动物(例如奶牛、绵羊、猪、马、山羊等)等。
除非另有说明，否则术语“大体上”旨在涵盖“完全”和“大部分但不完全”。例如，“大体上不诱导细胞溶解”的Ig Fc意指完全不诱导细胞溶解或很大程度上不诱导细胞溶解的Ig Fc。
如本文所用，与量结合使用的术语“约”表示该量可以在规定量的10％范围内变化。例如，“约100”意指90-110的量。当在范围的上下文中使用约时，“约”关于范围的下限使用时意指下限包括比范围的下限低10％的量，并且“约”关于范围的上限使用时意指上限包括比范围的上限高10％的量。举例来说，从约100至约1000意指范围从90延伸至1100。
在进一步描述本公开之前，应了解本发明不限于所述特定实施方案，因此所述实施方案当然可变化。还应理解，本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案，并不旨在限制，因为本公开的范围仅受所附申请专利范围的限制。
当提供数值范围时，应了解在那个范围的上限与下限之间的直至下限的十分之一单位的各间插值(除非上下文另外明确规定)以及在那个所述范围内的任何其他陈述值或间插值皆涵盖在本发明内。这些较小范围的上限及下限可独立地包括在较小范围中，且也涵盖在本公开内，属于陈述的范围内的任何明确排除的界限。在所陈述范围包括界限的一个或两个时，排除那些包括的界限的任一个或两个的范围也可包括在本公开内。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有熟习本发明所属技术者通常理解的相同含义。虽然类似于或等效于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或测试本公开，但现在描述优选方法和材料。本文提及的所有出版物均以引用的方式并入本文中以公开及描述与出版物引用的内容关联的方法和/或材料。
必须注意的是，除非上下文另外明确规定，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”和“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，提及“T细胞调节多聚体多肽”包括多个此类多肽且提及“免疫调节多肽”包括提及一种或多种免疫调节多肽及其为本领域技术人员所知的等效物等。应进一步注意可起草权利要求书的范围以排除任何任选的要素。因此，此陈述旨在充当与叙述申请专利范围要素关联使用诸如“唯一”、“仅”等的排除性术语或使用“否定性”限制的前提基础。
应了解，为明确起见在单独实施方案的情形下描述的本公开的某些特征也可于单一实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单一实施方案的情形下描述的本发明的各种特征也可单独或以任何适合子组合提供。本发明所涉及的实施方案的全部组合明确由本发明包括，且就如同各个及每个组合个别地及明确地在本文中公开一般来公开于本文中。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也由本公开明确包括，且就如同各个及每个此子组合个别地及明确地在本文中公开一般来公开于本文中。
本文论述之出版物仅因其公开内容在本申请的申请日期之前而加以提供。本文中没有内容应解释为承认本公开由于先前发明而无权先于此出版物。此外，提供的公开日期可不同于可能需要独立确认的实际公开日期。
具体实施方式
本公开提供T细胞调节多聚体多肽，其包含免疫调节多肽(“MOD”)且包含表位递呈的威尔姆氏瘤-1(WT-1)肽。TMMP适用于调节T细胞的活性且适用于调节个体中的免疫反应。
T细胞调节多聚体多肽
本公开提供一种T细胞调节多聚体多肽(TMMP)，其包含：a)第一多肽；和b)第二多肽，其中所述TMMP包含表位；第一主要组织相容性复合物(MHC)多肽；第二MHC多肽；一种或多种MOD；以及任选的免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架。本公开提供一种TMMP，其中所述TMMP为异二聚体，其包含：a)包含第一MHC多肽的第一多肽；和b)包含第二MHC多肽的第二多肽，其中第一多肽或第二多肽包含表位(例如，递呈表位的肽)；其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含一种或多种可以相同或不同的MOD；及任选的Ig F c多肽或非Ig支架。本公开的TMMP在本文中也称为“本公开的多聚体多肽”或“synTac”。在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的肽表位是WT-1肽。
本公开提供一种TMMP，其包含异二聚体多肽，所述多肽包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)肽表位；和ii)第一MHC多肽；b)第二多肽，所述第二多肽包含第二MHC多肽；以及c)至少一种MOD，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含至少一种(即一种或多种)MOD。任选地，第一多肽或第二多肽包含Ig Fc多肽或非Ig支架。所述一种或多种MOD中的至少一个为呈现出对同源共免疫调节多肽(“co-MOD”)的亲和力与相应野生型MOD对co-MOD的亲和力相比有所减小的变体MOD。存在于TMMP中的表位以如下亲和力结合至T细胞上的T细胞受体(TCR)：至少100μM(例如至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)。TMMP结合至第一T细胞的亲和力比TMMP结合第二T细胞的亲和力高至少25％，其中第一T细胞在其表面上表达同源co-MOD及以至少100μM的亲和力结合表位的TCR，且其中第二T细胞在其表面上表达同源co-MOD但在其表面上不表达以至少100μM(例如，至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)的亲和力结合表位的TCR。在一些情况下，存在于TMMP中的肽表位是WT-1肽。
本公开提供一种TMMP，其中所述TMMP为：
A)异二聚体，其包含：a)包含第一MHC多肽的第一多肽；及b)包含第二MHC多肽的第二多肽，其中所述第一多肽或所述第二多肽包含表位(例如，将表位递呈至T细胞的肽)；其中第一多肽和/或第二多肽包含一种或多种可以相同或不同的MOD，且其中所述一种或多种MOD中的至少一个可为野生型MOD或野生型MOD的变体，其中所述变体MOD与相应野生型MOD的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代；且其中所述第一多肽或所述第二多肽任选包含Ig Fc多肽或非Ig支架；或
B)异二聚体，其包含：a)包含第一MHC多肽的第一多肽；及b)包含第二MHC多肽的第二多肽，其中第一多肽或第二多肽包含表位；其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含一种或多种可以相同或不同的MOD，
其中所述一种或多种MOD中的至少一个为野生型MOD的变体，其中所述变体MOD与相应野生型MOD的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代，
其中所述一个或多个MOD中的至少一个为变体MOD，其呈现出对同源co-MOD的亲和力与相应野生型MOD对同源co-MOD的亲和力相比有所减小，且其中表位以至少10-7M的亲和力结合至T细胞上的TCR，使得：i)所述TMMP多肽结合至第一T细胞的亲和力比TMMP结合第二T细胞的亲和力高至少25％，其中第一T细胞在其表面上表达同源co-MOD及以至少10-7M的亲和力结合表位的TCR，且其中第二T细胞在其表面上表达同源co-MOD，但在其表面上不表达以至少10-7M的亲和力结合表位的TCR；且/或ii)当通过生物层干涉术测量时，对照TMMP与同源co-MOD的结合亲和力与包含野生型MOD变体的TMMP与同源co-MOD的结合亲和力的比率范围为1.5:1至106:1，其中所述对照包含野生型MOD；且其中所述变体MOD与相应野生型MOD的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代；且
其中所述第一多肽或所述第二多肽任选包含Ig Fc多肽或非Ig支架；或
C)异二聚体，其包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)表位；ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)任选的Ig Fc多肽或非Ig支架，其中所述TMMP包含一个或多个可以相同或不同的MOD，其中所述一个或多个MOD中的至少一个：A)在第一多肽的C端；B)在第二多肽的N端；C)在第二多肽的C端；或D)在第一多肽的C端且在第二多肽的N端，且其中所述一个或多个MOD中的至少一个可为野生型MOD或野生型MOD的变体，其中所述变体MOD与相应野生型MOD的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代；且
任选地其中所述一个或多个MOD中的至少一个为变体MOD，其呈现出对同源co-MOD的亲和力与相应野生型MOD对同源co-MOD的亲和力相比有所减小，且其中表位以至少10-7M的亲和力结合至T细胞上的TCR，使得：i)所述TMMP结合至第一T细胞的亲和力比TMMP结合第二T细胞的亲和力高至少25％，其中第一T细胞在其表面上表达同源co-MOD及以至少10-7M的亲和力结合表位的TCR，且其中第二T细胞在其表面上表达同源co-MOD，但在其表面上不表达以至少10-7M的亲和力结合表位的TCR；且/或ii)当通过生物层干涉术测量时，对照TMMP与同源co-MOD的结合亲和力与包含野生型MOD变体的TMMP与同源co-MOD的结合亲和力的比率范围为1.5:1至106:1，其中所述对照包含野生型MOD；且其中所述变体MOD与相应野生型MOD的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些情况下，存在于TMMP中的肽表位是WT-1肽。
本公开提供一种TMMP，其包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)表位；ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)任选的Ig Fc多肽或非Ig支架。TMMP包含一种或多种MOD，其中所述一种或多种MOD中的至少一个：A)在第一多肽的C端；B)在第二多肽的N端；C)在第二多肽的C端；或D)在第一多肽的C端且在第二多肽的N端。所述一种或多种MOD中的至少一个为呈现出对同源co-MOD的亲和力与相应野生型MOD对同源co-MOD的亲和力相比有所减小的变体MOD。存在于TMMP中的表位以如下亲和力结合至T细胞上的T细胞受体(TCR)：至少100μM(例如至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)。TMMP结合至第一T细胞的亲和力比TMMP结合第二T细胞的亲和力高至少25％，其中第一T细胞在其表面上表达同源co-MOD及以至少100μM的亲和力结合表位的TCR，且其中第二T细胞在其表面上表达同源co-MOD但在其表面上不表达以至少100μM(例如，至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)的亲和力结合表位的TCR。
存在于TMMP中的MOD结合至其同源co-MOD的亲和力比相应野生型MOD对同源co-MOD的亲和力小至少10％、小至少15％、小至少20％、小至少25％、小至少30％、小至少35％、小至少40％、小至少45％、小至少50％、小至少55％、小至少60％、小至少65％、小至少70％、小至少75％、小至少80％、小至少85％、小至少90％、小至少95％或小大于95％。
MOD对其同源co-MOD的减小的亲和力与表位对TCR的亲和力的组合提供了TMMP的提高的选择性。举例来说，本公开的TMMP与结合至第二T细胞相比选择性地结合至第一T细胞，所述第一T细胞呈现出：i)对存在于TMMP中的表位具有特异性的TCR；及ii)结合至存在于TMMP中的MOD的co-MOD，所述第二T细胞呈现出：i)对除了存在于TMMP中的表位以外的表位具有特异性的TCR；及ii)结合至存在于TMMP中的MOD的co-MOD。举例来说，本公开的TMMP结合至第一T细胞的亲和力比其结合第二T细胞的亲和力高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或大于100倍。
在一些情况下，TMMP当向有需要的个体施用时诱导表位特异性T细胞反应及表位非特异性T细胞反应。换句话说，在一些情况下，TMMP当向有需要的个体施用时通过调节第一T细胞的活性来诱导表位特异性T细胞反应，所述第一T细胞呈现出：i)对存在于TMMP中的表位有特异性的TCR；ii)结合至存在于TMMP中的MOD的co-MOD；且通过调节第二T细胞的活性来诱导表位非特异性T细胞反应，所述第二T细胞呈现出：i)对除了存在于TMMP中的表位以外的表位有特异性的TCR；及ii)结合至存在于TMMP中的MOD的co-MOD。表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、或至少100:1。表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为约2:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约15:1、约15:1至约20:1、约20:1至约25:1、约25:1至约50:1、或约50:1至约100:1、或大于100:1。“调节T细胞的活性”可包括以下各项中的一个或多个：i)激活细胞毒性(例如CD8+)T细胞；ii)诱导细胞毒性(例如CD8+)T细胞的细胞毒性活性；iii)诱导细胞毒性(例如CD8+)T细胞对细胞毒素(例如穿孔蛋白；颗粒酶；粒溶蛋白)的产生及释放；iv)抑制自身反应性T细胞的活性；等等。
MOD对其同源co-MOD的减小的亲和力与表位对TCR的亲和力的组合提供了TMMP的提高的选择性。因此，举例来说，TMMP与其结合至第二T细胞的亲合力相比以更高亲合力结合至第一T细胞，所述第一T细胞呈现出：i)对存在于TMMP中的表位具有特异性的TCR；及ii)结合至存在于TMMP中的MOD的co-MOD，所述第二T细胞呈现出：i)对除了存在于TMMP中的表位以外的表位具有特异性的TCR；及ii)结合至存在于TMMP中的MOD的co-MOD。
MOC与其同源co-MOD之间的结合亲和力可通过生物层干涉术(BLI)，使用纯化的MOD及纯化的同源co-MOD来确定。TMMP与其同源co-MOD之间的结合亲和力可通过BLI，使用纯化的TMMP及同源co-MOD来确定。BLI方法为本领域技术人员所公知。参见，例如Lad等人(2015)J.Biomol.Screen.20(4):498-507；以及Shah和Duncan(2014)J.Vis.Exp.18:e51383。
BLI测定可使用Octet RED 96(Pal FortéBio)仪器或如下类似仪器进行。TMMP(例如，本公开的TMMP；对照TMMP(其中对照TMMP包含野生型免疫调节多肽))固定于不溶性支撑物(“生物传感器”)。固定的TMMP为“靶标”。固定可通过将捕获抗体固定至不溶性支撑物上来实现，其中捕获抗体固定TMMP。例如，固定可通过将抗Fc(例如，抗人IgG Fc)抗体固定至不溶性支撑物上来实现，其中固定的抗Fc抗体结合至且固定TMMP(其中TMMP包含IgFc多肽)。共免疫调节多肽以若干种不同浓度施加于固定的TMMP，且记录仪器的反应。测定在包含25mM HEPES pH 6.8、5％聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1％牛血清白蛋白及0.02％Tween20非离子清洁剂的液体介质中进行。共免疫调节多肽与固定的TMMP的结合在30℃下进行。作为结合亲和力的阳性对照，可使用抗I类MHC单克隆抗体。例如，可使用抗HLA I类单克隆抗体W6/32(美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)编号HB-95；Parham等人(1979)J.Immunol.123:342)，其具有7nM的KD。标准曲线可使用抗I类MHC单克隆抗体的连续稀释液来生成。共免疫调节多肽或抗I类MHC mAb为“分析物”。BLI分析从以下两个表面反射的白光的干涉图型：i)固定的多肽(“靶标”)；及ii)内部参考层。结合至生物传感器尖端的分子(“分析物”；例如，共免疫调节多肽；抗HLA抗体)的数目的变化引起干涉图型的偏移；干涉图型中的此偏移可即时测量。描述靶标/分析物相互作用的亲和力的两个动力学术语为缔合常数(ka)和解离常数(kd)。这两个术语的比率(kd/a)产生亲和力常数KD。
BLI测定在多孔板中进行。为了操作该测定，限定板布局，限定测定步骤，且在Octet Data Acquisition软件中指派生物传感器。使生物传感器组件水合。将水合的生物传感器组件和测定板在Octet仪器上平衡10分钟。一旦采集数据，便将所采集数据加载至Octet Data Analysis软件中。在处理窗口中通过指定参考减法、y轴对准、步间校正及Savitzky-Golay滤波的方法来处理数据。在分析窗口中通过指定分析(缔合和解离)、选择曲线拟合模型(1:1)、拟合方法(全域)及目标窗口(以秒计)的步骤来分析数据。评价拟合品质。如果在3倍范围内，则对各数据追踪(分析物浓度)的KD值取平均值。KD误差值应处于亲和力常数值的约一个数量级之内；R2值应高于0.95。参见，例如Abdiche等人(2008)J.Anal.Biochem.377:209。
除非本文另外说明，本公开的TMMP对同源共免疫调节多肽的亲和力或对照TMMP(其中对照TMMP包含野生型免疫调节多肽)对同源共免疫调节多肽的亲和力使用如上文所述的BLI测定。
在一些情况下，i)对照TMMP(其中对照包含野生型免疫调节多肽)与同源共免疫调节多肽的结合亲和力同ii)本公开的包含野生型免疫调节多肽变体的TMMP与同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率当通过BLI(如上文所述)测量时为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1、或至少106:1。在一些情况下，i)对照TMMP(其中对照包含野生型免疫调节多肽)与同源共免疫调节多肽的结合亲和力同ii)本公开的包含野生型免疫调节多肽变体的TMMP与同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率当通过BLI测量时范围在1.5:1至106:1内，例如1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102:1、102:1至103:1、103:1至104:1、104:1至105:1、或105:1至106:1。
作为一个实例，在对照TMMP包含野生型IL-2多肽时，且在本公开的TMMP包含变体IL-2多肽(相对于野生型IL-2多肽的氨基酸序列包含1至10个氨基酸取代)作为免疫调节多肽时，i)对照TMMP与IL-2受体(即，同源共免疫调节多肽)的结合亲和力同ii)本公开的TMMP与IL-2受体的结合亲和力的比率当通过BLI测量时为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1、或至少106:1。在一些情况下，在对照TMMP包含野生型IL-2多肽时，且在本公开的TMMP包含变体IL-2多肽(相对于野生型IL-2多肽的氨基酸序列包含1至10个氨基酸取代)作为免疫调节多肽时，i)对照TMMP与IL-2受体(即，同源共免疫调节多肽)的结合亲和力同ii)本公开的TMMP与IL-2受体的结合亲和力的比率当通过BLI测量时范围在1.5:1至106:1内，例如1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102:1、102:1至103:1、103:1至104:1、104:1至105:1、或105:1至106:1。
本公开的TMMP与靶T细胞的结合亲和力可以根据2019年3月14日公布的已公布的PCT申请WO 2019/051091中所述的程序测量。参见[0063]。
在一些情况下，当如前述段落中所述进行测量时，与TMMP文库成员与包含以下各物的对照T细胞的结合相比，本公开的TMMP呈现出与靶T细胞的选择性结合：i)结合亲本野生型免疫调节多肽的同源共免疫调节多肽；及ii)结合至除了TMMP文库成员中存在的表位以外的表位的T细胞受体。
二聚化TMMP
本公开的TMMP可被二聚化；即，本公开提供包含本公开的TMMP的二聚体的多聚体多肽。因此，本公开提供一种TMMP，其包含：A)第一异二聚体，所述第一异二聚体包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)肽表位；及ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含：i)第二MHC多肽，其中所述第一异二聚体包含一种或多种MOD；及B)第二异二聚体，所述第二异二聚体包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)肽表位；及ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含：i)第二MHC多肽，其中所述第二异二聚体包含一种或多种MOD，且其中所述第一异二聚体与所述第二异二聚体彼此共价连接。在一些情况下，两个TMMP的氨基酸序列彼此相同。在一些情况下，第一异二聚体与第二异二聚体经由第一异二聚体的第二多肽的C端区域及第二异二聚体的第二多肽的C端区域彼此共价连接。在一些情况下，第一异二聚体与第二异二聚体经由第一异二聚体的第二多肽的C端氨基酸及第二异二聚体的第二多肽的C端区域彼此共价连接；例如，在一些情况下，第一异二聚体的第二多肽的C端氨基酸与第二异二聚体的第二多肽的C端区域直接或经由接头彼此连接。接头可为肽接头。肽接头可具有的长度为1个氨基酸至200个氨基酸(例如，1个氨基酸(aa)至5aa、5aa至10aa、10aa至25aa、25aa至50aa、50aa至100aa、100aa至150aa、或150aa至200aa)。在一些情况下，第一异二聚体的肽表位与第二异二聚体的肽表位包含相同氨基酸序列。在一些情况下，第一异二聚体和第二异二聚体的第一MHC多肽为I类MHCβ2-微球蛋白，且其中第一异二聚体及第二异二聚体的第二MHC多肽为I类MHC重链。在一些情况下，第一异二聚体的MOD与第二异二聚体的MOD包含相同氨基酸序列。在一些情况下，第一异二聚体的MOD和第二异二聚体的MOD为与相应亲本野生型MOD相比包含1至10个氨基酸取代的变体MOD，且其中这1至10个氨基酸取代导致变体免疫调节多肽与同源共免疫调节多肽的亲和力结合减小。在一些情况下，第一异二聚体的免疫调节多肽和第二异二聚体的免疫调节多肽各自独立地选自由以下组成的组：IL-2、4-1BBL、PD-L1、CD80、CD86、ICOS-L、OX-40L、FasL、JAG1(CD339)、TGFβ、CD70及ICAM。下文描述适合的MHC多肽、MOD及肽表位的实例。
MHC多肽
如上文所述，本公开的TMMP包括MHC多肽。出于本公开的目的，术语“主要组织相容性复合物(MHC)多肽”旨在包括不同物种的MHC多肽，包括人MHC(也称为人白细胞抗原(HLA))多肽、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)MHC多肽、及其他哺乳动物物种的MHC多肽(例如，兔类动物、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、山羊等)等。术语“MHC多肽”旨在包括I类MHC多肽(例如，β-2微球蛋白和I类MHC重链)。
在一些情况下，第一MHC多肽为I类MHCβ2M(β2M)多肽，且第二MHC多肽为I类MHC重链(H链)(“MHC-H”))。在其他情况下，第一MHC多肽为I类MHC重链多肽；且第二MHC多肽为β2M多肽。在一些情况下，β2M和MHC-H链均为人来源；即，MHC-H链为HLA重链或其变体。除非另外明确说明，本公开的TMMP不包括I类MHC重链的膜锚定结构域(跨膜结构域)或足以将所得TMMP锚定至表达其的细胞(例如，真核细胞，诸如哺乳动物细胞)的I类MHC重链的一部分。在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的I类MHC重链不包括与天然I类MHC重链缔合的信号肽、跨膜结构域或细胞内结构域(细胞质尾部)。因此，例如，在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的I类MHC重链仅包括I类MHC重链的α1、α2及α3结构域。在一些情况下，存在于TMMP中的I类MHC重链具有的长度为约270个氨基酸(aa)至约290aa。在一些情况下，存在于TMMP中的I类MHC重链具有的长度为270aa、271aa、272aa、273aa、274aa、275aa、276aa、277aa、278aa、279aa、280aa、281aa、282aa、283aa、284aa、285aa、286aa、287aa、288aa、289aa或290aa。
在一些情况下，TMMP之MHC多肽为人MHC多肽，其中人MHC多肽也称为“人白细胞抗原”(“HLA”)多肽。在一些情况下，TMMP的MHC多肽为I类HLA多肽，例如，β2-微球蛋白多肽或I类HLA重链多肽。I类HLA重链多肽包括HLA-A重链多肽、HLA-B重链多肽、HLA-C重链多肽、HLA-E重链多肽、HLA-F重链多肽及HLA-G重链多肽。
I类MHC重链
在一些情况下，存在于TMMP中的I类MHC重链多肽包含与图7-13中描绘的任何人HLA重链多肽的全部或部分氨基酸序列(例如，50、75、100、150、200、或250个连续氨基酸)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，I类MHC重链具有的长度为270aa、271aa、272aa、273aa、274aa、275aa、276aa、277aa、278aa、279aa、280aa、281aa、282aa、283aa、284aa、285aa、286aa、287aa、288aa、289aa或290aa。在一些情况下，存在于TMMP中的I类MHC重链多肽包含图7-13中描绘的任一氨基酸序列的1-30、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代(除了指示为在重链共有序列中可变之那些位置)。在一些情况下，I类MHC重链不包括跨膜结构域或细胞质域。作为一个实例，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与图7A、7B及7C中任一个描绘的人HLA-A重链多肽的氨基酸25-300(缺乏全部或大体上全部前导序列、跨膜序列及细胞质序列)或氨基酸25-365(缺乏前导序列)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
图7A、7B和7C提供人白细胞抗原(HLA)I类重链多肽的氨基酸序列。将信号序列氨基酸1-24加粗且加下划线。图7A条目：3A.1为HLA-A重链(HLA-A*01:01:01:01或A*0101)(NCBI登录NP_001229687.1)SEQ ID NO:23；条目3A.2来自HLA-A*1101SEQ ID NO:24；条目3A.3来自HLA-A*2402SEQ ID NO:25且条目3A.4来自HLA-A*3303SEQ ID NO:26。图7B提供序列HLA-B*07:02:01(H LA-B*0702)NCBI GenBank登录NP_005505.2(也参见GenBank登录AUV50118.1.)。图7C提供序列HLA-C*0701(GenBank登录NP_001229971.1)(HLA-C*07:01:01:01或HLA-Cw*070101，HLA-Cw*07参见GenBank登录CAO78194.1)。
图8提供十一种无前导序列或跨膜结构域或细胞内结构域的成熟I类MHC重链氨基酸序列的比对。所比对序列为人HLA-A、HLA-B及HLA-C、小鼠H2K蛋白序列、三种HLA-A变体(var.1、var.2C及var.2CP)、以及3种人HLA-A变体(HLA-A*1101；HLA-A*2402；及HLA-A*3303)。在比对中指出位置(成熟蛋白的84和139)，其中半胱氨酸残基可被引入(例如，通过取代)以用于形成二硫键以使MHC H链-β2M复合物稳定。比对中还展示位置236(成熟多肽的位置)，其可由半胱氨酸残基取代，从而可与β2M形成链间二硫键(例如，在aa12处)。箭头出现于那些位置各自的上方且将残基加粗。比对(var.2c)中所示的第七HLA-A序列展示以C残基在位置84、139及236处取代的变体2的序列。框侧翼残基84、139及236展示在五个残基的那些六组之任一侧上的五个氨基酸的群，该六组表示为aac1(对于“氨基酸簇1”)、aac2(对于“氨基酸簇2”)、aac3(对于“氨基酸簇3”)、aac4(对于“氨基酸簇4”)、aac5(对于“氨基酸簇5”)及aac6(对于“氨基酸簇6”)，这些残基可独立地选自以下的1至5个氨基酸置换：(i)任何天然存在的氨基酸或(ii)或除脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。
关于图9A，在一些情况下：i)aac1(氨基酸簇1)可为氨基酸序列GTLRG(SEQ ID NO:287)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，L被I、V、A或F置换)的序列；ii)aac2(氨基酸簇2)可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:288)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，N被Q置换，Q被N置换，且/或E被D置换)的序列；iii)aac3(氨基酸簇3)可为氨基酸序列TAADM(SEQ ID NO:289)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，T被S置换，A被G置换，D被E置换，且/或M被L、V或I置换)的序列；iv)aac4(氨基酸簇4)可为氨基酸序列AQTTK(SEQ ID NO:290)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，A被G置换，Q被N置换，或T被S置换，且/或K被R或Q置换)的序列；v)aac5(氨基酸簇5)可为氨基酸序列VETRP(SEQ ID NO:291)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，V被I或L置换，E被D置换，T被S置换，且/或R被K置换)的序列；且/或vi)aac6(氨基酸簇6)可为氨基酸序列GDGTF(SEQ ID NO:292)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，D被E置换，T被S置换，或F被L、W或Y置换)的序列。
图9-11提供成熟HLA I类重链氨基酸序列(无前导序列或跨膜结构域或细胞内结构域)的比对。图9A中比对的氨基酸序列是以下等位基因的HLA-A I类重链：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101、A*2301、A*2402、A*2407、A*3303及A*3401。图10A中比对的氨基酸序列为以下等位基因的HLA-B I类重链：B*0702、B*0801、B*1502、B*3802、B*4001、B*4601及B*5301。图11A中比对的氨基酸序列为以下等位基因的HLA-C I类重链：C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*0801及C*1502。在比对中指出位置(成熟蛋白的84和139)，其中半胱氨酸残基可被引入(例如，通过取代)以用于形成二硫键以使HLA H链-β2M复合物稳定。比对中还展示位置236(成熟多肽的位置)，其可由半胱氨酸残基取代，从而可与β2M形成链间二硫键(例如，在aa 12处)。框侧翼残基84、139及236展示在五个残基的那些六组之任一侧上的五个氨基酸的群，该六组表示为aac1(对于“氨基酸簇1”)、aac2(对于“氨基酸簇2”)、aac3(对于“氨基酸簇3”)、aac4(对于“氨基酸簇4”)、aac5(对于“氨基酸簇5”)及aac6(对于“氨基酸簇6”)，这些残基可独立地选自以下的1至5个氨基酸置换：(i)任何天然存在的氨基酸或(ii)或除脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。
图9A、10A及11A分别提供成熟HLA-A、HLA-B及HLA-C I类重链的氨基酸序列的比对。提供成熟蛋白的细胞外部分(无前导序列或跨膜结构域或细胞内结构域)的序列。如图8所述，还展示aa残基84、139及236以及其侧翼残基(aac1至aac6)的位置，这些残基可独立地选自以下的1至5个氨基酸置换：(i)任何天然存在的氨基酸或(ii)除了脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。图9B、10B及11B提供分别在图9A、10A及11A中所提供的HLA-A、HLA-B及HLA-C序列的共有氨基酸序列。共有序列将可变氨基酸位置展示为依次编号的“X”残基且将氨基酸84、139及236的位置加双下划线。
关于图9A，在一些情况下：i)aac1(氨基酸簇1)可为氨基酸序列GTLRG(SEQ ID NO:287)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，L被I、V、A或F置换)的序列；ii)aac2(氨基酸簇2)可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:288)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，N被Q置换，Q被N置换，且/或E被D置换)的序列；iii)aac3(氨基酸簇3)可为氨基酸序列TAADM(SEQ ID NO:289)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，T被S置换，A被G置换，D被E置换，且/或M被L、V或I置换)的序列；iv)aac4(氨基酸簇4)可为氨基酸序列AQTTK(SEQ ID NO:290)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，A被G置换，Q被N置换，或T被S置换，且/或K被R或Q置换)的序列；v)aac5(氨基酸簇5)可为氨基酸序列VETRP(SEQ ID NO:291)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，V被I或L置换，E被D置换，T被S置换，且/或R被K置换)的序列；且/或vi)aac6(氨基酸簇6)可为氨基酸序列GDGTF(SEQ ID NO:292)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，D被E置换，T被S置换，或F被L、W或Y置换)的序列。
关于图10A，在一些情况下：i)aac1(氨基酸簇1)可为氨基酸序列RNLRG(SEQ IDNO:293)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，N被T或I置换；且/或L被A置换；且/或第二R被L置换；且/或G被R置换)的序列；ii)aac2(氨基酸簇2)可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:288)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，N被Q置换，Q被N置换，且/或E被D置换)的序列；iii)aac3(氨基酸簇3)可为氨基酸序列TAADT(SEQ ID NO:294)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，第一T被S置换；且/或A被G置换；且/或D被E置换；且/或第二T被S置换)的序列；iv)aac4(氨基酸簇4)可为氨基酸序列AQITQ(SEQ ID NO:295)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，A被G置换；且/或第一Q被N置换；且/或I被L或V置换；且/或T被S置换；且/或第二Q被N置换)的序列；v)aac5(氨基酸簇5)可为氨基酸序列VETRP(SEQ ID NO:291)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，V被I或L置换，E被D置换，T被S置换，且/或R被K置换)的序列；且/或vi)aac6(氨基酸簇6)可为氨基酸序列GDRTF(SEQ ID NO:296)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，D被E置换；且/或T被S置换；且/或R被K或H置换；且/或F被L、W或Y置换)的序列。
关于图11A，在一些情况下：i)aac1(氨基酸簇1)可为氨基酸序列RNLRG(SEQ IDNO:293)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，N被K置换；且/或L被A或I置换；且/或第二R被H置换；且/或G被T或S置换)的序列；ii)aac2(氨基酸簇2)可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:288)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，N被Q置换，Q被N置换，且/或E被D置换)的序列；iii)aac3(氨基酸簇3)可为氨基酸序列TAADT(SEQ ID NO:294)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，第一T被S置换；且/或A被G置换；且/或D被E置换；且/或第二T被S置换)的序列；iv)aac4(氨基酸簇4)可为氨基酸序列AQITQ(SEQ ID NO:295)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，A被G置换；且/或第一Q被N置换；且/或I被L置换；且/或第二Q被N或K置换)的序列；v)aac5(氨基酸簇5)可为氨基酸序列VETRP(SEQ ID NO:291)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，V被I或L置换，E被D置换，T被S置换，且/或R被K或H置换)的序列；且/或vi)aac6(氨基酸簇6)可为氨基酸序列GDGTF(SEQID NO:292)或有一或两个氨基酸缺失或被其他天然存在的氨基酸取代(例如，D被E置换；且/或T被S置换；且/或F被L、W或Y置换)的序列。
HLA-A
在一些情况下，TMMP包含HLA-A重链多肽。可并入本公开的TMMP中的HLA-A重链肽序列或其部分包括但不限于以下等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101、A*2301、A*2402、A*2407、A*3303及A*3401，其在无全部或大体上全部图9A中的前导序列、跨膜序列及细胞质序列的情况下比对。那些等位基因中的任一个可包含在位置84、139和/或236(如图9A所示)的一个或多个处的选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；及在位置236处丙氨酸至半胱氨酸的取代(A236C)。另外，也可采用与那些HLA-A等位基因的序列的全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250个连续氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的HLA-A序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。
在一些情况下，TMMP包含HLA-A重链多肽，其包含以下HLA-A共有氨基酸序列：
作为一个实例，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQID NO:44)。
在一些情况下，适于包含在TMMP中的HLA-A重链多肽包含以下氨基酸序列：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ ID NO:44)。此HLA-A重链多肽也称为“HLA-A*0201”或简称为“HLA-A02”。在一些情况下，C端Pro不包括在TMMP中。举例来说，在一些情况下，适于包含在TMMP中的HLA-A02多肽包含以下氨基酸序列：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:449)。
HLA-A(Y84C；A236C)
在一些情况下，适于包含在TMMP中的HLA-A重链多肽包含与以下人HLA-A重链(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:488)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A(Y84A；A236C)
在一些情况下，I类MHC重链多肽包含Y84A和A236C取代。举例来说，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与以下人HLA-A重链(Y84A；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为Ala且氨基酸236为Cys。在一些情况下，Cys-236与包含R12C取代的变体β2M多肽的Cys-12形成链间二硫键。
在一些情况下，适于包含在TMMP中的HLA-A重链多肽为包含以下氨基酸序列的HLA-A02(Y84A；A236C)多肽：
在一些情况下，适于包含在TMMP中的HLA-A重链多肽为包含以下氨基酸序列的HLA-A02(Y84A；A236C)多肽：
HLA-A(Y84C；A139C)
在一些情况下，I类MHC重链多肽包含Y84C和A139C取代。举例来说，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与以下人HLA-A重链(Y84C；A139C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为Cys且氨基酸139为Cys。在一些情况下，Cys-84与Cys-139形成链内二硫键。
HLA-A11(HLA-A*1101)
作为一个非限制性实例，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A11重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:300)。此类I类MHC重链在亚洲人群中可为突出的，该亚洲人群包括亚洲人种的个体群体。
HLA-A11(Y84A；A236C)
作为一个非限制性实例，在一些情况下，I类MHC重链多肽为包含Y84A和A236C取代的HLA-A11等位基因。举例来说，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与以下人HLA-A A11重链(Y84A；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为Ala且氨基酸236为Cys。在一些情况下，Cys-236与包含R12C取代的变体β2M多肽的Cys-12形成链间二硫键。
HLA-A11(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于TMMP中的I类MHC重链多肽包含与以下人HLA-A A11重链(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A24(HLA-A*2402)
作为一个非限制性实例，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRYYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTVPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRNSSDRKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTACKV(SEQ ID NO:302)。此类I类MHC重链在亚洲人群中可为突出的，该亚洲人群包括亚洲人种的个体群体。在一些情况下，氨基酸84为Ala。在一些情况下，氨基酸84为Cys。在一些情况下，氨基酸236为Cys。在一些情况下，氨基酸84为Ala且氨基酸236为Cys。在一些情况下，氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
在一些情况下，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为Tyr且氨基酸236为Ala(氨基酸84和236呈粗体并加下划线)；且其中I类MHC重链具有约275个氨基酸的长度。
在一些情况下，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为Ala且氨基酸236为Ala(氨基酸84和236呈粗体并加下划线)；且其中I类MHC重链具有约275个氨基酸的长度。
在一些情况下，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为Tyr且氨基酸236为Cys(氨基酸84和236呈粗体并加下划线)；且其中I类MHC重链具有约275个氨基酸的长度。
在一些情况下，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为ALA且氨基酸236为CYS(氨基酸84和236呈粗体并加下划线)；且其中I类MHC重链具有约275个氨基酸的长度。
在一些情况下，I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为CYS且氨基酸236为ALA(氨基酸84和236呈粗体并加下划线)；且其中I类MHC重链具有约275个氨基酸的长度。
在一些情况下，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中氨基酸84为CYS且氨基酸236为CYS(氨基酸84和236呈粗体并加下划线)；且其中I类MHC重链具有约275个氨基酸的长度。
HLA-A33(HLA-A*3303)
作为一个非限制性实例，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-A33重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFTTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDRNTRNVKAHSQIDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQMMYGCDVGSDGRFLRGYQQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWASVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIVGIIAGLVLFGAVFAGAVVAAVRWRRKSSDRKGGSYSQAASSDSAQGSDMSLTACKV(SEQID NO:303)。此类I类MHC重链在亚洲人群中可为突出的，该亚洲人群包括亚洲人种的个体群体。在一些情况下，氨基酸84为Ala。在一些情况下，氨基酸84为Cys。在一些情况下，氨基酸236为Cys。在一些情况下，氨基酸84为Ala且氨基酸236为Cys。在一些情况下，氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-B
在一些情况下，TMMP包含HLA-B重链多肽。可并入TMMP中的HLA-B重链肽序列或其部分包括但不限于以下等位基因：B*0702、B*0801、B*1502、B*3802、B*4001、B*4601及B*5301，其在无全部或大体上全部图10A中的前导序列、跨膜序列及细胞质序列的情况下比对。那些等位基因中的任一个可包含在位置84、139和/或236(如图10A所示)的一个或多个处的选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；及在位置236处丙氨酸至半胱氨酸的取代(A236C)。另外，也可采用包含与那些HLA-B等位基因的全部或一部分序列(例如，50、75、100、150、200或250个连续氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的HLA-B多肽(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。
在一些情况下，TMMP包含HLA-B重链多肽，其包含以下HLA-B共有氨基酸序列：
作为一个实例，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-B重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGYYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQID NO:207)。
HLA-B(Y84A；A236C)
作为一个非限制性实例，在一些情况下，I类MHC重链多肽为包含Y84A和A236C取代的HLA-B多肽。举例来说，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与以下人HLA-B重链(Y84A；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGAYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ ID NO:305)，其中氨基酸84为Ala且氨基酸236为Cys。在一些情况下，Cys-236与包含R12C取代的变体β2M多肽的Cys-12形成链间二硫键。
HLA-B(Y84C；A139C)
在一些情况下，I类MHC重链多肽包含Y84C和A139C取代。举例来说，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与以下人HLA-B重链(Y84C；A139C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTCAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ ID NO:306)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸139为Cys。在一些情况下，Cys-84与Cys-139形成链内二硫键。
HLA-B*0702
作为一个实例，在一些情况下，存在于TMMP中的I类MHC重链多肽包含图10A中的HLA-B*0702(SEQ ID NO:207)的氨基酸序列或与该序列的全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250个连续氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些情况下，在本公开的TMMP的HLA-B重链多肽与图8中的序列标记的HLA-B或图10A中的标记的“B*0702具有小于100％同一性时，其可包含在位置84、139和/或236中的一个或多个处的选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸的取代(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸的取代(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；及在位置236处丙氨酸至半胱氨酸的取代(A236C)。在一些情况下，本公开的TMMP的HLA-B重链多肽包含Y84A和A236C取代。在一些情况下，本公开的TMMP的HLA-B*0702重链多肽包含Y84C和A139C取代。在一些情况下，本公开的TMMP的HLA-B重链多肽包含Y84C、A139C及A236C取代。
HLA-C
在一些情况下，TMMP包含HLA-C重链多肽。可并入本公开的TMMP中的HLA-C重链多肽或其部分包括但不限于以下等位基因：C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*0801及C*1502，其在无全部或大体上全部图11A中的前导序列、跨膜序列及细胞质序列的情况下比对。那些等位基因中的任一个可包含在位置84、139和/或236(如图11A所示)中的一个或多个处的选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸的取代(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸的取代(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸的取代(A139C)；及在位置236处丙氨酸至半胱氨酸的取代(A236C)。另外，也可采用包含与那些HLA-C等位基因的全部或一部分序列(例如，50、75、100、150、200或250个连续氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的HLA-C多肽(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。
在一些情况下，TMMP包含HLA-C重链多肽，其包含以下HLA-C共有氨基酸序列：
作为一个实例，TMMP的I类MHC重链多肽可包含与以下人HLA-C重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGYYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP(SEQID NO:219)。
HLA-C(Y84A；A236C)
作为一个非限制性实例，在一些情况下，I类MHC重链多肽为包含Y84A和A236C取代的HLA-C多肽。举例来说，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与以下人HLA-C重链(Y84A；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGAYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP(SEQ ID NO:308)，其中氨基酸84为Ala且氨基酸236为Cys。在一些情况下，Cys-236与包含R12C取代的变体β2M多肽的Cys-12形成链间二硫键。
HLA-C(Y84C；A139C)
在一些情况下，I类MHC重链多肽包含Y84C和A139C取代。举例来说，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与以下人HLA-C重链(Y84C；A139C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTCAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP(SEQ ID NO:397)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸139为Cys。在一些情况下，Cys-84与Cys-139形成链内二硫键。
HLA-C*0701
在一些情况下，TMMP的I类MHC重链多肽包含图11A中的HLA-C*0701的氨基酸序列(图8中的标记的HLA-C)或与该序列的全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250个连续氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些情况下，在TMMP的HLA-C重链多肽与图11A中的序列标记的HLA-C*0701具有小于100％同一性时，其可包含在位置84、139和/或236中的一个或多个处的选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸的取代(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸的取代(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；及在位置236处丙氨酸至半胱氨酸的取代(A236C)。在一些情况下，TMMP的HLA-C重链多肽包含Y84A和A236C取代。在一些情况下，T-细胞-MMP或其表位缀合物之HLA-C*0701重链多肽包含Y84C和A139C取代。在一些情况下，本公开的TMMP的HLA-C重链多肽包含Y84C、A139C及A236C取代。
非经典HLA-E、HLA-F及HLA-G
I类MHC重链
在一些情况下，TMMP包含非经典I类MHC重链多肽。可并入本公开的TMMP中的非经典HLA重链多肽或其部分包括但不限于HLA-E、HLA-F及HLA-G等位基因的那些。HLA-E、HLA-F及HLA-G重链多肽的氨基酸序列(以及HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因)可见于万维网hla.alleles.org/nomenclature/index.html、欧洲生物信息研究所(www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk，该研究所为欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分)及美国国家生物技术信息中心(www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov)。
适合的HLA-E等位基因的非限制性实例包括但不限于HLA-E*0101(HLA-E*01:01:01:01)、HLA-E*01:03(HLA-E*01:03:01:01)、HLA-E*01:04、HLA-E*01:05、HLA-E*01:06、HLA-E*01:07、HLA-E*01:09及HLA-E*01:10。适合的HLA-F等位基因的非限制性实例包括但不限于HLA-F*0101(HLA-F*01:01:01:01)、HLA-F*01:02、HLA-F*01:03(HLA-F*01:03:01:01)、HLA-F*01:04、HLA-F*01:05及HLA-F*01:06。适合的HLA-G等位基因的非限制性实例包括但不限于HLA-G*0101(HLA-G*01:01:01:01)、HLA-G*01:02、HLA-G*01:03(HLA-G*01:03:01:01)、HLA-G*01:04(HLA-G*01:04:01:01)、HLA-G*01:06、HLA-G*01:07、HLA-G*01:08、HLA-G*01:09:HLA-G*01:10、HLA-G*01:10、HLA-G*01:11、HLA-G*01:12、HLA-G*01:14、HLA-G*01:15、HLA-G*01:16、HLA-G*01:17、HLA-G*01:18:HLA-G*01:19、HLA-G*01:20及HLA-G*01:22。无前导序列、跨膜序列及细胞质序列中的全部或大体上全部的那些HLA E、HLA-F及HLA-G等位基因的共有序列提供于图12中，且将其与图13中的上文提及的HLA-A、HLA-B及HLA-C等位基因的共有序列进行比对。
图46A-46D中提供了合适的HLA-E重链多肽的氨基酸序列，其中图46A提供了HLA-E*01:01(野生型)的氨基酸序列；图46B提供了具有Y84C和A2346C取代的HLA-E*01:01的氨基酸序列；图46C提供了HLA-E*01:03(野生型)的氨基酸序列；且图46D提供了具有Y84C和A2346C取代的HLA-E*01:03的氨基酸序列。
图47A-7D中提供了合适的HLA-G重链多肽的氨基酸序列，其中图47A提供了HLA-G*01:01(野生型)的氨基酸序列；图47B提供了具有Y84C和A2346C取代的HLA-G*01:01的氨基酸序列；图47C提供了HLA-G*01:04(野生型)的氨基酸序列；且图47D提供了具有Y84C和A2346C取代的HLA-G*01:04的氨基酸序列。
图12提供HLA-E、HLA-F及HLA-G中各者的共有序列，其中可变aa位置指示为依次编号的“X”残基且aa 84、139及236的位置加双下划线。
图13提供在图9-13中给出的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F及HLA-G的共有氨基酸序列的比对。各序列中的可变残基列出为“X”，其中序列编号已被除去。如图8所示，指示aa 84、139及236及其侧翼的五氨基酸簇的位置，该五氨基酸簇可独立地选自以下的1至5个氨基酸置换：(i)任何天然存在的氨基酸或(ii)除了脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。
上文提及的HLA-E、HLA-F和/或HLA-G等位基因中的任一个可包含如图13所示的共有序列在位置84、139和/或236中的一个或多个处的取代。在一些情况下，这些取代可选自：位置84酪氨酸至丙氨酸(Y84A)或半胱氨酸(Y84C)，或在HLA-F情况下，为R84A或R84C取代；位置139丙氨酸至半胱氨酸(A139C)，或在HLA-F情况下，为V139C；及在位置236处丙氨酸至半胱氨酸的取代(A236C)。另外，也可采用与图13所列的共有序列中任一个的全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250个连续氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的HLA-E、HLA-F和/或HLA-G序列(例如，除了其中列出的可变残基的变化以外，这些序列还可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。
小鼠H2K
在一些情况下，存在于TMMP中的I类MHC重链多肽包含小鼠H2K(SEQ ID NO:45)(图8中的小鼠H2K)的氨基酸序列或与该序列的全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250个连续氨基酸)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些情况下，在TMMP的小鼠H2K重链多肽与图8中的序列标记的小鼠H2K具有小于100％同一性时，其可包含在位置84、139和/或236中的一个或多个处的选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；及在位置236处丙氨酸至半胱氨酸的取代(A236C)。在一些情况下，TMMP的小鼠H2K重链多肽包含Y84A和A236C取代。在一些情况下，本公开的TMMP的小鼠H2K重链多肽包含Y84C和A139C取代。在一些情况下，本公开的TMMP的小鼠H2K重链多肽包含Y84C、A139C及A236C取代。
示例性组合
以下表1呈现可并入本公开的TMMP中的I类MHC重链序列修饰的各种组合。
表1
β-2微球蛋白
本公开的TMMP的β2-微球蛋白(β2M)多肽可为人β2M多肽、非人灵长类动物β2M多肽、鼠类β2M多肽等。在一些情况下，β2M多肽包含与图6中描绘的β2M多肽氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，β2M多肽包含与图6中描绘的β2M氨基酸序列的氨基酸21至119具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，适合的β2M多肽包含以下氨基酸序列：
IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLK NGERIEKVE HSDLSFSKDWSFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVN HVTLSQP KIVKWDRDM(SEQ ID NO:311)；且HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDL(aa1){C}(aa2)AGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSW(aa3){C}(aa4))HKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL(aa5)(C)(aa6)QKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ ID NO:309)，其中指示为{C}的半胱氨酸残基在α1与α2-1螺旋之间形成二硫键且(C)残基与位置12处的β2M多肽半胱氨酸形成二硫键。在以上序列中，“aa1”为“氨基酸簇1”；“aa2”为“氨基酸簇2”；“aa3”为“氨基酸簇3”；“aa4”为“氨基酸簇4”；“aa5”为“氨基酸簇5”；且“aa6”为“氨基酸簇6”；参见，例如图10。aa1、aa2、aa3、aa4、aa5及aa6在每次出现时被选出且独立地选择为1-5个氨基酸残基，其中氨基酸残基i)独立地选自任何天然存在(例如编码)的氨基酸或ii)除了脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。
在一些情况下，MHC多肽相对于参考MHC多肽(其中参考MHC多肽可为野生型MHC多肽)包含单一氨基酸取代，其中单一氨基酸取代以半胱氨酸(Cys)残基取代一氨基酸。此类半胱氨酸残基当存在于本公开的TMMP的第一多肽的MHC多肽中时，可以与存在于TMMP的第二多肽链中的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一些情况下，TMMP的第一多肽中的第一MHC多肽和/或TMMP的第二多肽中的第二MHC多肽包括氨基酸取代以用半胱氨酸取代氨基酸，其中第一MHC多肽中的取代的半胱氨酸与第二MHC多肽中的半胱氨酸形成二硫键，其中第一MHC多肽中的半胱氨酸与第二MHC多肽中的取代的半胱氨酸形成二硫键，或其中第一MHC多肽中的取代的半胱氨酸与第二MHC多肽中的取代的半胱氨酸形成二硫键。
举例来说，在一些情况下，HLAβ2-微球蛋白和HLA I类重链中的以下残基对之一被半胱氨酸取代(其中残基编号为成熟多肽的那些)：1)β2M残基12，HLA I类重链残基236；2)β2M残基12，HLA I类重链残基237；3)β2M残基8，HLA I类重链残基234；4)β2M残基10，HLA I类重链残基235；5)β2M残基24，HLA I类重链残基236；6)β2M残基28，HLA I类重链残基232；7)β2M残基98，HLA I类重链残基192；8)β2M残基99，HLA I类重链残基234；9)β2M残基3，HLA I类重链残基120；10)β2M残基31，HLA I类重链残基96；11)β2M残基53，HLA I类重链残基35；12)β2M残基60，HLA I类重链残基96；13)β2M残基60，HLA I类重链残基122；14)β2M残基63，HLAI类重链残基27；15)β2M残基Arg3，HLA I类重链残基Gly120；16)β2M残基His31，HLA I类重链残基Gln96；17)β2M残基Asp53，HLA I类重链残基Arg35；18)β2M残基Trp60，HLA I类重链残基Gln96；19)β2M残基Trp60，HLA I类重链残基Asp122；20)β2M残基Tyr63，HLA I类重链残基Tyr27；21)β2M残基Lys6，HLA I类重链残基Glu232；22)β2M残基Gln8，HLA I类重链残基Arg234；23)β2M残基Tyr10，HLA I类重链残基Pro235；24)β2M残基Ser11，HLA I类重链残基Gln242；25)β2M残基Asn24，HLA I类重链残基Ala236；26)β2M残基Ser28，HLA I类重链残基Glu232；27)β2M残基Asp98，HLA I类重链残基His192；及28)β2M残基Met99，HLA I类重链残基Arg234。MHC/HLA I类重链的氨基酸编号是参考成熟MHC/HLA I类重链，无信号肽。举例来说，在一些情况下，成熟HLA-A氨基酸序列之残基236被Cys取代。在一些情况下，成熟HLA-B氨基酸序列之残基236被Cys取代。在一些情况下，成熟HLA-C氨基酸序列之残基236被Cys取代。在一些情况下，图6中描绘的氨基酸序列的残基32(对应于成熟β2M之Arg-12)被Cys取代。
在一些情况下，β2M多肽包含以下氨基酸序列：IQRTPKIQVY SRHPAENGKSNFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSD LSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQPKIVKW DRDM(SEQ ID NO:310)。在一些情况下，β2M多肽包含以下氨基酸序列：IQRTPKIQVYSCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVD LLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYACRVNHVTLSQP KIVKWDRDM(SEQ ID NO:311)。
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含HLA-A*2402氨基酸序列：
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含HLA-A*2402氨基酸序列：
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，β2M多肽包含以下氨基酸序列：
IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLK NGERIEKVE HSDLSFSKDWSFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVN HVTLSQP KIVKWDRDM(SEQ ID NO:311)；且TMMP的HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，β2M多肽包含以下氨基酸序列：
IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLK NGERIEKVE HSDLSFSKDWSFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVN HVTLSQP KIVKWDRDM(SEQ ID NO:311)；且TMMP的HLA I类重链多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，β2M多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，TMMP的第一多肽与第二多肽通过以下各物彼此经由二硫键连接：i)存在于连接第一多肽链中的肽表位与β2M多肽的接头中的Cys残基；和ii)存在于第二多肽链中的I类MHC重链中的Cys残基。在一些情况下，存在于I类MHC重链中的Cys残基为作为Y84C取代引入的Cys。在一些情况下，连接第一多肽链中的肽表位与β2M多肽的接头为GCGGS(G4S)n(SEQ ID NO:315)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9。举例来说，在一些情况下，接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:316)。作为另一实例，接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)。TMMP的二硫键连接的第一多肽与第二多肽的实例示意性描绘于图2A-2F中。
多二硫键键合的TMMP
在一些情况下，本公开的TMMP的第一多肽与第二多肽通过至少两个二硫键(即，两个链间二硫键)彼此连接。此类多二硫键连接的TMMP的实例示意性描绘于图17A和17B及图18A-18C中。另外，在TMMP包含IgFc多肽时，异二聚体TMMP可被二聚化，使得二硫键连接两个异二聚体TMMP中的IgFc多肽。此种排列示意性描绘于图17C和17D中，其中二硫键由虚线表示。除非另外说明，在此部分中的多二硫键连接的TMMPP中所述的至少两个二硫键并非指代连接二聚化TMMP中的IgFc多肽的二硫键。
如上文所述，在一些情况下，TMMP的第一多肽与第二多肽通过至少两个二硫键(即，两个链间二硫键)彼此连接。举例来说，在一些情况下，TMMP的第一多肽与第二多肽通过2个链间二硫键彼此连接。作为另一实例，在一些情况下，TMMP的第一多肽与第二多肽通过3个链间二硫键彼此连接。作为另一实例，在一些情况下，本公开的TMMP的第一多肽与第二多肽通过4个链间二硫键彼此连接。
在一些情况下，在TMMP的第一多肽中的肽表位通过包含Cys的接头连接至β2M多肽时，至少两个二硫键中的至少一个连接所述接头中的Cys与第二多肽的I类MHC重链中的Cys。在一些情况下，在TMMP的第一多肽中的肽表位通过接头连接至I类MHC重链多肽时，至少两个二硫键中的至少一个连接所述接头中的Cys与存在于第二多肽的β2M多肽中的Cys。
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)与包括该至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP相比呈现出增加的稳定性。在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)与包括该至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP相比呈现出增加的体外稳定性。举例来说，在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)与包括该至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP相比呈现出至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍更大的体外稳定性。
多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)与包括所述至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP相比是否呈现出增加的体外稳定性，可通过随时间且/或在指定条件下且/或在TMMP纯化期间测量存在于样品中的二硫键连接的异二聚体TMMP的量来确定。
举例来说，在一些情况下，当TMMP在37℃下保存一段时间(例如，约1周至约2周、约2周至约4周、或约4周至约2个月的时间段)时，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)与包括该至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP相比呈现出至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍、或至少10倍更大的体外稳定性。例如，在一些情况下，在37℃下在体外保存多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)达28天之后剩余的二硫键连接的异二聚体TMMP的量与在37℃下在体外保存对照TMMP(包括存在于多二硫键连接的TMMP中的至少两个二硫键中仅一个的TMMP)达28天之后剩余的二硫键连接的异二聚体TMMP的量相比是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍、或至少10倍更多。
作为一个实例，包含如图14A和14B中所描绘的多肽1715和2380的双二硫键连接的TMMP与包含多肽2405和2380的TMMP相比呈现出更大的体外稳定性，其中多肽2405描绘于图14D中，其中此类TMMP包含仅一个二硫键联，其中单一二硫键在以下两者之间形成：i)在表位与β2M之间的G2C接头的Cys；与ii)通过I类MHC重链中的Y84C取代提供的Cys。作为另一实例，包含如图14A及14B中所描绘的多肽1715及2380的双二硫键连接的TMMP与包含多肽1380及2380的TMMP相比呈现出更大的体外稳定性，其中多肽1380描绘于图14E中，其中此类TMMP包含仅一个二硫键联，其中单一二硫键在以下两者之间形成：i)通过β2M多肽中的R12C取代提供的Cys；与ii)通过I类MHC重链中的A236C取代提供的Cys。
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP与包括该至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP相比呈现出增加的体内稳定性。举例来说，在一些情况下，多二硫键连接的TMMP与包括该至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP相比呈现出至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍、或至少10倍更大的体内稳定性。
在一些情况下，在多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中存在两个二硫键使得二硫键连接的异二聚体TMMP的产生与在TMMP为包括所述至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP时产生的二硫键连接的异二聚体TMMP的量相比有所增加。举例来说，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)可在体外细胞培养的哺乳动物细胞中产生，其中哺乳动物细胞在液体细胞培养基中培养。TMMP可分泌至细胞培养基中。细胞可裂解，从而生成细胞裂解物，且TMMP可存在于细胞裂解物中。TMMP可自细胞培养基和/或细胞裂解物中纯化。举例来说，在TMMP包含IgG1Fc多肽时，细胞培养基和/或细胞裂解物可与固定的蛋白A接触(例如，细胞培养基和/或细胞裂解物可施用于蛋白A柱，其中蛋白A固定于珠粒上)。存在于细胞培养基和/或细胞裂解物中的TMMP结合至固定的蛋白A。在洗涤柱以除去未结合的材料后，使结合的TMMP洗脱，从而生成蛋白A洗脱物。存在于蛋白A洗脱物中的二硫键连接的异二聚体TMMP的量与在TMMP为包括存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的至少两个二硫键中仅一个的对照TMMP时存在于蛋白A洗脱物中的二硫键连接的异二聚体TMMP的量相比至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％更多。在一些情况下，洗脱物中为非聚集的二硫键连接的异二聚体TMMP的总TMMP蛋白的百分比为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。蛋白A洗脱物可经受尺寸排阻色谱(SEC)和/或一个或多个其他额外纯化步骤。
在一些情况下，TMMP包含至少一种异二聚体，其包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT1肽表位，其中所述WT1肽的长度为至少4个氨基酸(例如，4个氨基酸至25个氨基酸；例如WT1肽具有的长度为4、5、6、7、8、9、10-15、15-20、或20-25个氨基酸)；及ii)第一MHC多肽；b)第二多肽，所述第二多肽包含第二MHC多肽，及c)至少一种MOD，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含MOD，且其中所述异二聚体在第一多肽与第二多肽之间包含2个二硫键(即，所述异二聚体包含：i)连接第一多肽与第二多肽的第一二硫键；及ii)连接第一多肽与第二多肽的第二二硫键)。换句话说，第一多肽包含的第一Cys残基与第二多肽中的第一Cys残基形成二硫键(第一二硫键)；且第一多肽包含的第二Cys残基与第二多肽中的第二Cys残基形成二硫键(第二二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)肽表位；ii)肽接头；及iii)β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含I类MHC重链多肽，其中所述第一多肽及所述第二多肽中的一个或两个包含至少一种MOD，其中所述TMMP包含：a)以下两者之间的第一二硫键联：i)存在于肽表位与β2M多肽之间的接头中的Cys；与ii)引入至I类MHC重链多肽中的第一Cys；及b)第一多肽与第二多肽之间的至少一个第二二硫键联，其中该至少一个第二二硫键联是在以下两者之间：i)第一多肽中在存在于接头中的Cys的C端的Cys；与ii)第二多肽中在引入I类MHC重链多肽中的第一Cys的C端的Cys。
在一些情况下，在TMMP的第一多肽或第二多肽中的第一二硫键形成Cys残基与第二二硫键形成Cys残基彼此间隔约10个氨基酸至约200个氨基酸。例如，在一些情况下，在TMMP的第一多肽或第二多肽中的第一二硫键形成Cys残基与第二二硫键形成Cys残基间隔约10个氨基酸(aa)至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约40aa、约40aa至约50aa、约50aa至约60aa、约60aa至约70aa、约70aa至约80aa、约80aa至约90aa、约90aa至约100aa、约100aa至约110aa、约110aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa、约150aa至约160aa、约160aa至约170aa、约170aa至约180aa、约180aa至约190aa、或约190aa至约200aa。
作为一个实例，在一些情况下，在TMMP的第一多肽中的第一二硫键形成Cys残基与第二二硫键形成Cys残基彼此间隔约10个氨基酸至约80个氨基酸残基。举例来说，在一些情况下，第一多肽中的第二二硫键形成Cys残基在第一多肽中的第一二硫键形成Cys残基的C端的约10个氨基酸至约80个氨基酸(例如，约10个氨基酸(aa)至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约40aa、约40aa至约50aa、约50aa至约60aa、约60aa至约70aa、或约70aa至约80aa)处。在一些情况下，第一多肽中的第二二硫键形成Cys残基在第一多肽中的第一二硫键形成Cys残基的C端的10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa或25aa处。在一些情况下，第一多肽中的第二二硫键形成Cys残基在第一多肽中的第一二硫键形成Cys残基的C端的15aa处。在一些情况下，第一多肽中的第二二硫键形成Cys残基在第一多肽中的第一二硫键形成Cys残基的C端的20aa处。在一些情况下，第一多肽中的第二二硫键形成Cys残基在第一多肽中的第一二硫键形成Cys残基的C端的25aa处。
在一些情况下，在本公开的TMMP的第二多肽中的第一二硫键形成Cys残基与第二二硫键形成Cys残基彼此间隔约140个氨基酸至约160个氨基酸。举例来说，在一些情况下，第二多肽中的第二二硫键形成Cys残基在第二多肽中的第一二硫键形成Cys残基的C端的约140个氨基酸至约160个氨基酸处。在一些情况下，第二多肽中的第二二硫键形成Cys残基在第二多肽中的第一二硫键形成Cys残基的C端的140个氨基酸(aa)、141aa、142aa、143aa、144aa、145aa、146aa、147aa、148aa、149aa、150aa、151aa、152aa、153aa、154aa、155aa、156aa、157aa、158aa、159aa或160aa处。
多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)可包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT1肽(例如，具有4个氨基酸至约25个氨基酸的WT1肽)；和ii)第一MHC多肽，其中所述第一多肽包含介于WT1肽与第一MHC多肽之间的肽接头，其中所述肽接头包含Cys残基，且其中所述第一MHC多肽为包含引入Cys残基的氨基酸取代的β2M多肽；b)及第二多肽，所述第二多肽包含第二MHC多肽，其中所述第二MHC多肽为I类重链，其包含基于HLA-A*0201(图9A中描绘)的氨基酸编号或在另一种I类重链等位基因中的相应位置处的Y84C取代和A236C取代，其中所述TMMP包含介于肽接头中的Cys残基与I类重链的氨基酸位置84或另一种I类重链等位基因的相应位置处的Cys残基之间的二硫键，且其中所述TMMP包含介于β2M多肽中引入的Cys残基与I类重链的氨基酸位置236或另一种I类重链等位基因的相应位置处的Cys之间的二硫键；及c)至少一种MOD，其中所述第一多肽和/或第二多肽包含所述至少一种MOD。实例示意性地描绘于图17A和图17B中。
在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:318)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至10的整数。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:398)，其中n为1。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:320)，其中n为2。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:321)，其中n为3。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:322)，其中n为4。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:323)，其中n为5。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:324)，其中n为6。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:325)，其中n为7。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:326)，其中n为8。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:327)，其中n为9。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:328)，其中n为10。
在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(SEQ ID NO:329)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:330)，其中n为1至10的整数。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:331)，其中n为1。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:332)，其中n为2。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:333)，其中n为3。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:334)，其中n为4。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:335)，其中n为5。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:336)，其中n为6。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:337)，其中n为7。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:338)，其中n为8。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:339)，其中n为9。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:340)，其中n为10。
以下为包含基于HLA-A*0201(图9A中描绘)的氨基酸编号或在另一种I类重链等位基因的相应位置处的Y84C取代和A236C取代的I类MHC重链的非限制性实例。
HLA-A
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT1肽(例如，具有4个氨基酸至约25个氨基酸的WT1肽)；及ii)第一MHC多肽，其中所述第一多肽包含介于WT1肽与第一MHC多肽之间的肽接头，其中所述肽接头包含Cys残基，且其中所述第一MHC多肽为包含引入Cys残基的氨基酸取代的β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含HLA-A I类MHC重链，所述重链包含与以下氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ IDNO:342)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys；及c)至少一种MOD，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含所述至少一种MOD。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQID NO:318)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至10的整数。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。举例来说，β2M多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID NO:311)，其中氨基酸12为Cys。所述至少一种MOD可为对靶T细胞发挥活化/刺激作用或对靶T细胞发挥抑制/抑制性(suppressing/inhibitory)作用的多肽。举例来说，所述至少一种MOD可为细胞因子(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽等；且包括全部家族成员，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80和CD86也分别称为B7-1和B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受体多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽或CX3CL1多肽。这些MOD可为野生型多肽或野生型多肽的变体。在一些情况下，MOD为活化(“刺激”)免疫调节多肽；例如，MOD可对T细胞产生活化/刺激效应。活化MOD的实例包括例如CD80、CD86、4-1BBL、OX40L、CD70、ICOS-L、CD40、ICAM(CD54)、IL2、IL7、IL12、IL15、IL17、IL21、IL27、IL23、GITRL、TGFβ及淋巴毒素β受体。在一些情况下，MOD为抑制(“抑制性”)MOD；例如，MOD可对T细胞产生抑制/抑制性效应。抑制性MOD的实例包括例如PD-1H、PD-L1、PD-L2、TGFβ、FasL、HVEM、半乳糖凝集素-9、ILT3及ILT4。视情形而定，TGFβ多肽可产生活化/刺激效应或抑制/抑制性效应。
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT1肽(例如，具有4个氨基酸至约25个氨基酸的WT1肽)；及ii)第一MHC多肽，其中所述第一多肽包含介于WT1肽与第一MHC多肽之间的肽接头，其中所述肽接头包含Cys残基，且其中所述第一MHC多肽为包含引入Cys残基的氨基酸取代的β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含HLA-A I类MHC重链，所述重链包含与以下氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
在一些情况下，所述至少一种MOD为亲和力减小的变体，如本文别处所述。在一些情况下，第一多肽或第二多肽包含Ig Fc多肽。
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)包含HLA-A I类重链多肽。在一些情况下，存在于本公开的多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与图9A中描绘的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401氨基酸序列具有至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中HLA-A重链多肽包含Y84C和A236C取代。
HLA-A*0101(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*0101(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQKMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNMKAHSQTDRANLGTLRGCYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAVHAAEQRRVYLEGRCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:343)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A*0201(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*0201(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ ID NO:342)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A*0202(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*0202(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:341)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A*1101(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*1101(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGCYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRAYLEGRCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:344)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A*2301(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*2301(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRCYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:345)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A*2402(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*2402(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRCYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:346)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A*2407(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*2407(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDEETGKVKAQSQTDRENLRIALRCYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:347)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A*3303(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*3303(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFTTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDRNTRNVKAHSQIDRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTIQMMYGCDVGSDGRFLRGYQQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWASVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:348)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-A*3401(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-A重链多肽包含与以下HLA-A*3401(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDRNTRKVKAQSQTDRVDLGTLRGCYNQSEDGSHTIQRMYGCDVGPDGRFLRGYQQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWETAHEAEQWRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWASVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:349)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-B
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT1肽(例如，具有4个氨基酸至约25个氨基酸的WT1肽)；及ii)第一MHC多肽，其中所述第一多肽包含介于WT1肽与第一MHC多肽之间的肽接头，其中所述肽接头包含Cys残基，且其中所述第一MHC多肽为包含引入Cys残基的氨基酸取代的β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含HLA-B I类MHC重链，所述重链包含与以下氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ IDNO:350)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys；及c)至少一种MOD，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含所述至少一种MOD。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQID NO:318)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至10的整数。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。举例来说，β2M多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID NO:311)，其中氨基酸12为Cys。所述至少一种MOD可为对靶T细胞发挥活化/刺激效应或对靶T细胞发挥抑制/抑制性效应的多肽。举例来说，所述至少一种MOD可为细胞因子(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽等；且包括全部家族成员，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80和CD86也分别称为B7-1和B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受体多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽或CX3CL1多肽。这些MOD可为野生型多肽或野生型多肽的变体。在一些情况下，MOD为活化(“刺激”)免疫调节多肽；例如，MOD可对T细胞产生活化/刺激效应。活化MOD的实例包括例如CD80、CD86、4-1BBL、OX40L、CD70、ICOS-L、CD40、ICAM(CD54)、IL2、IL7、IL12、IL15、IL17、IL21、IL27、IL23、GITRL、TGFβ及淋巴毒素β受体。在一些情况下，免疫调节多肽为抑制(“抑制性”)MOD；例如，MOD可对T细胞产生抑制/抑制性效应。抑制性MOD的实例包括例如PD-1H、PD-L1、PD-L2、TGFβ、FasL、HVEM、半乳糖凝集素-9、ILT3及ILT4。视情形而定，TGFβ多肽可产生活化/刺激效应或抑制/抑制性效应。
.在一些情况下，所述至少一种MOD为亲和力减小的变体，如本文别处所述。在一些情况下，第一多肽或第二多肽包含Ig Fc多肽。
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)包含HLA-B I类重链多肽。在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-B重链多肽包含与图10A中描绘的HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301氨基酸序列具有至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中HLA-B重链多肽包含Y84C和A236C取代。
HLA-B*0702(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-B重链多肽包含与以下HLA-B*0702(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:350)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-B*0801(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-B重链多肽包含与以下HLA-B*0801(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFDTAMSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIFKTNTQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHNQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQDRAYLEGTCVEWLRRYLENGKDTLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:351)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-B*1502(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-B重链多肽包含与以下HLA-B*1502(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQEGPEYWDRNTQISKTNTQTYRESLRNLRGCYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:352)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-B*3802(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-B重链多肽包含与以下HLA-B*3802(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQICKTNTQTYRENLRTALRCYNQSEAGSHTLQRMYGCDVGPDGRLLRGHNQFAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRTYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:353)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-B*4001(Y84C；A2346C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-B重链多肽包含与以下HLA-B*4001(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFHTAMSRPGRGEPRFITVGYVDDTLFVRFDSDATSPRKEPRAPWIEQEGPEYWDRETQISKTNTQTYRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQRMYGCDVGPDGRLLRGHNQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQISQRKLEAARVAEQLRAYLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:354)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-B*4601(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-B重链多肽包含与以下HLA-B*4601(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEAGSHTLQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQWRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:355)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-B*5301(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-B重链多肽包含与以下HLA-B*5301(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIFKTNTQTYRENLRIALRCYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE(SEQ ID NO:356)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT-1肽(例如，具有4个氨基酸至约25个氨基酸的1WT-1肽)；及ii)第一MHC多肽，其中所述第一多肽包含介于WT-1肽与第一MHC多肽之间的肽接头，其中所述肽接头包含Cys残基，且其中所述第一MHC多肽为包含引入Cys残基的氨基酸取代的β2M多肽；和b)第二多肽，其包含HLA-C I类MHC重链，所述重链包含与以下氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP(SEQID NO:357)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys；及c)至少一种MOD，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含所述至少一种MOD。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ IDNO:318)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至10的整数。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。举例来说，β2M多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID NO:311)，其中氨基酸12为Cys。所述至少一种MOD可为对靶T细胞发挥活化/刺激效应或对靶T细胞发挥抑制/抑制性效应的多肽。举例来说，所述至少一种MOD可为细胞因子(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽等；且包括全部家族成员，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80和CD86也分别称为B7-1和B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受体多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽或CX3CL1多肽。这些MOD可为野生型多肽或野生型多肽的变体。在一些情况下，免疫调节多肽为活化(“刺激”)MOD；例如，MOD可对T细胞产生活化/刺激效应。活化免疫调节多肽的实例包括例如CD80、CD86、4-1BBL、OX40L、CD70、ICOS-L、CD40、ICAM(CD54)、IL2、IL7、IL12、IL15、IL17、IL21、IL27、IL23、GITRL、TGFβ及淋巴毒素β受体。在一些情况下，MOD为抑制(“抑制性”)MOD；例如，MOD可对T细胞产生抑制/抑制性效应。抑制性MOD的实例包括例如PD-1H、PD-L1、PD-L2、TGFβ、FasL、HVEM、半乳糖凝集素-9、ILT3及ILT4。视情形而定，TGFβ多肽可产生活化/刺激效应或抑制/抑制性效应。
在一些情况下，所述至少一种MOD为亲和力减小的变体，如本文别处所述。在一些情况下，第一多肽或第二多肽包含Ig Fc多肽。
在一些情况下，多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)包含HLA-C I类重链多肽。在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与图11A中描绘的HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502氨基酸序列具有至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中HLA-C重链多肽包含Y84C和A236C取代。
HLA-C*01:02(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*01:02(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
CSHSMKYFFTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEAGSHTLQWMCGCDLGPDGRLLRGYDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVMVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP(SEQ ID NO:358)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C*0303(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*03:03(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFYTAVSRPGRGEPHFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEARSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGYDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLKNGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP(SEQ ID NO:359)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C*0304(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*03:04(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFYTAVSRPGRGEPHFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGYDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLKNGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP(SEQ ID NO:360)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C*0401(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*04:01(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
GSHSMRYFSTSVSWPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPREPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQADRVNLRKLRGCYNQSEDGSHTLQRMFGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWKP(SEQ ID NO:361)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C*0602(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*06:02(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQADRVNLRKLRGCYNQSEDGSHTLQWMYGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQWRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP(SEQ ID NO:362)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C*0701(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*07:01(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP(SEQ ID NO:357)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C*0702(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*07:02(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMSGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP(SEQ ID NO:404)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C*0801(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*08:01(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEAGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAARTAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGP(SEQ ID NO:363)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
HLA-C*1502(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于多二硫键连接的TMMP(例如，双二硫键连接的TMMP)中的HLA-C重链多肽包含与以下HLA-C*15:02(Y84C；A236C)氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPHFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQNYKRQAQTDRVNLRKLRGCYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQLAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP(SEQ ID NO:364)，其中氨基酸84为Cys且氨基酸236为Cys。
支架多肽
TMMP可包含Fc多肽或可包含另一种适合的支架多肽。
适合的支架多肽包括基于抗体之支架多肽及非基于抗体的支架。非基于抗体的支架包括例如白蛋白、XTEN(延长重组)多肽、运铁蛋白、Fc受体多肽、弹性蛋白样多肽(参见，例如Hassouneh等人(2012)Methods Enzymol.502:215；例如，包含五肽重复单元(Val-Pro-Gly-X-Gly；SEQ ID NO:59)的多肽，其中X为除了脯氨酸以外的任何氨基酸)、白蛋白结合多肽、丝样多肽(参见，例如Valluzzi等人(2002)Phi los Trans R Soc Lond B BiolSci.357:165)，丝-弹性蛋白-样多肽(SELP；参见，例如Megeed等人(2002)Adv Drug DelivRev.54:1075)等。适合的XTEN多肽包括例如WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO 2007/103515、US 2010/0189682及US 2009/0092582中公开的那些；还参见Schellenberger等人(2009)Nat Biotechnol.27:1186)。适合的白蛋白多肽包括例如人血清白蛋白。
适合的支架多肽在一些情况下将为半衰期延长的多肽。因此，在一些情况下，与缺乏支架多肽的对照TMMP相比，适合的支架多肽增加TMMP的体内半衰期(例如，血清半衰期)。举例来说，在一些情况下，与缺乏支架多肽的对照TMMP相比，支架多肽使TMMP的体内半衰期(例如，血清半衰期)增加了至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或大于100倍。作为一个实例，在一些情况下，与缺乏Fc多肽的对照TMMP相比，Fc多肽使TMMP的体内半衰期(例如，血清半衰期)增加了至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或大于100倍。
Fc多肽
在一些情况下，本公开的TMMP的第一多肽链和/或第二多肽链包含Fc多肽。TMMP的Fc多肽可为人IgG1Fc、人IgG2Fc、人IgG3Fc、人IgG4Fc等。在一些情况下，Fc多肽包含与图5A-5G或5H中描绘的Fc区的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图5A-5G或5H中描绘的Fc区的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc区包含与图5A中描绘的人IgG1Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc区包含与图5A中描绘的人IgG1Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；且包含N77取代；例如，Fc多肽包含N77A取代。在一些情况下，Fc多肽包含与图5A中描绘的人IgG2Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与图5A中描绘的人IgG2Fc多肽的氨基酸99-325具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图5A中描绘的人IgG3Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与图5A中描绘的人IgG3Fc多肽的氨基酸19-246具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图5B中描绘的人IgM Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与图5B中描绘的人IgM Fc多肽的氨基酸1-276具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图5C中描绘的人IgA Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与图5C中描绘的人IgA Fc多肽的氨基酸1-234具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，Fc多肽包含与图5C中描绘的人IgG4Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图5C中描绘的人IgG4Fc多肽的氨基酸100至327具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，IgG4Fc多肽包含以下氨基酸序列：PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:365)。
在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5A中描绘的氨基酸序列(人IgG1Fc)。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5A中描绘的氨基酸序列(人IgG1Fc)，例外之处为以除天冬酰胺以外的氨基酸进行的N297取代(图5A中描绘的氨基酸序列的N77)。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5C中描绘的氨基酸序列(包含N297A取代的人IgG1Fc，所述取代为图5A中描绘的氨基酸序列的N77)。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5A中描绘的氨基酸序列(人IgG1Fc)，例外之处为以除亮氨酸以外的氨基酸进行的L234取代(图5A中描绘的氨基酸序列的L14)。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5A中描绘的氨基酸序列(人IgG1Fc)，例外之处为以除亮氨酸以外的氨基酸进行的L235取代(图5A中描绘的氨基酸序列的L15)。在一些情况下，IgG1Fc多肽包含图5A中描绘的C端Lys。在其他情况下，IgG1Fc多肽不包括图5A中描绘的C端Lys。
在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5E中描绘的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含图5E中描绘的氨基酸序列，但没有C端Lys。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5F中描绘的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含图5F中描绘的氨基酸序列，但没有C端Lys。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5G中描绘的氨基酸序列(包含L234A取代和L235A取代的人IgG1Fc，这些取代对应于图5G中描绘的氨基酸序列的位置14和15)。在一些情况下，Fc多肽包含图5G中描绘的氨基酸序列，但没有C端Lys。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5A中描绘的氨基酸序列(人IgG1Fc)，例外之处为以除脯氨酸以外的氨基酸进行的P331取代(图5A中描绘的氨基酸序列的P111)；在一些情况下，所述取代为P331S取代。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5A中描绘的氨基酸序列(人IgG1Fc)，例外之处为以除亮氨酸以外的氨基酸进行的L234和L235取代(图5A中描绘的氨基酸序列的L14和L15)。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5A中描绘的氨基酸序列(人IgG1Fc)，例外之处为以除亮氨酸以外的氨基酸进行的L234和L235取代(图5A中描绘的氨基酸序列的L14和L15)及以除脯氨酸以外的氨基酸进行的P331取代(图5A中描绘的氨基酸序列的P111)。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽包含图5E中描绘的氨基酸序列(包含L234F、L235E及P331S取代(对应于图5E中描绘的氨基酸序列的氨基酸位置14、15及111)的人IgG1Fc)。在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽为包含L234A和L235A取代(以Ala对图5A中描绘的氨基酸序列的L14和L15进行的取代)的IgG1Fc多肽，如图5G所描绘。
在一些情况下，存在于TMMP中的Fc多肽具有以下氨基酸序列：
接头
本公开的TMMP可包括一个或多个接头，其中所述一个或多个接头介于以下一个或多个之间：i)I类MHC多肽和Ig Fc多肽，其中此接头在本文中称为“L1”；ii)MOD和I类MHC多肽，其中此接头在本文中称为“L2”；iii)第一MOD和第二MOD，其中此接头在本文中称为“L3”；iv)肽抗原(“表位”)和I类MHC多肽；v)I类MHC多肽和二聚化多肽(例如，二聚化对的第一成员或第二成员)；以及vi)二聚化多肽(例如，二聚化对的第一成员或第二成员)和IgFc多肽。
如本文所用，短语“TMMP的任何两个组分之间的肽接头”是指TMMP内任何两个相邻多肽之间的肽接头。例如，如本文所用，短语“TMMP的任何两个组分之间的肽接头”是指以下一个或多个之间的肽接头：i)肽与β2M多肽；ii)β2M多肽与I类MHC重链多肽；iii)I类MHC重链多肽与Ig Fc多肽；iv)I类MHC重链多肽与MOD；v)Ig Fc多肽与MOD；及vi)第一MOD与第二MOD。
适合的接头(也称为“间隔子”)可容易选择且可具有许多适合长度中的任一个，诸如1个氨基酸至25个氨基酸、3个氨基酸至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸。适合的接头长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些情况下，接头具有的长度为25个氨基酸至50个氨基酸，例如长度为25至30、30至35、35至40、40至45、或45至50个氨基酸。
示例性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:366)及(GGGS)n(SEQ ID NO:367)，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物及本领域中已知的其他柔性接头。可使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser皆相对未结构化，且因此可充当组分之间的中性系链。可使用甘氨酸聚合物；甘氨酸甚至比丙氨酸显著更易进入phi-psi空间，且比具有更长侧链的残基受限少得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性接头可包含氨基酸序列，包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:368)、GGSGG(SEQ ID NO:369)、GSGSG(SEQID NO:370)、GSGGG(SEQ ID NO:371)、GGGSG(SEQ ID NO:372)、GSSSG(SEQ ID NO:373)等。示例性接头可包括例如Gly(Ser4)n(SEQ ID NO:374)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GSSSS)n(SEQ ID NO:375)，其中n为4。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GSSSS)n(SEQ ID NO:376)，其中n为5。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:377)，其中n为1。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:378)，其中n为2。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:379)，其中n为3。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:380)，其中n为4。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:381)，其中n为5。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:382)，其中n为6。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:383)，其中n为7，在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:384)，其中n为8，在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQID NO:385)，其中n为9，在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:386)，其中n为10。在一些情况下，接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:283)。
在一些情况下，存在于TMMP的第一多肽中的接头多肽所包括的半胱氨酸残基可与存在于TMMP的第二多肽中的半胱氨酸残基形成二硫键。在一些情况下，举例来说，适合的接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)。作为另一实例，适合的接头可包含氨基酸序列GCGGS(G4S)n(SEQ ID NO:315)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9。举例来说，在一些情况下，接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:316)。作为另一实例，接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)。
表位
在一些情况下，存在于TMMP中的表位(递呈一个或多个表位的肽)为WT-1肽，例如，连同MHC一起向TCR递呈表位的WT-1肽。WT-1同种型的氨基酸序列呈现于图3A-3E中。递呈一个或多个表位的WT-1肽在本文中称为“WT-1肽”或“WT-1表位”。在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的WT-1表位可为与图3A-3E中任一个描绘的WT-1氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的4至25个连续氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10-15aa、15-20aa、或20-25aa)的肽。在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的WT-1表位可为与图3A中描绘的WT-1氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的4至25个连续氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10-15aa、15-20aa、或20-25aa)的肽。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位可为与图3A中描绘的WT-1氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的4至25个连续氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10-15aa、15-20aa、或20-25aa)的肽。在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的WT-1表位可为与图3C中描绘的WT-1氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的4至25个连续氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10-15aa、15-20aa、或20-25aa)的肽。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位可为与图3A中描绘的WT-1氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的4至25个连续氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10-15aa、15-20aa、或20-25aa)的肽。在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的WT-1表位可为与图3E中描绘的WT-1氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的4至25个连续氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10-15aa、15-20aa、或20-25aa)的肽。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为6个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为7个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为8个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为9个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为10个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为11个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为6个氨基酸至25个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为6个氨基酸至20个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为7个氨基酸至25个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为7个氨基酸至20个氨基酸。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1表位的长度为至少4个氨基酸，长度为至少6个氨基酸，或长度为至少7个氨基酸。
存在于TMMP中的表位可具有的长度为约4个氨基酸至约25个氨基酸，例如，表位可具有的长度为4个氨基酸(aa)至10aa、10aa至15aa、15aa至20aa、或20aa至25aa。举例来说，存在于TMMP中的表位可具有的长度为4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7、aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa或25aa。在一些情况下，存在于TMMP中的表位具有的长度为5个氨基酸至10个氨基酸，例如5aa、6aa、7aa、8aa、9aa或10aa。
存在于TMMP中的WT-1表位为T细胞特异性结合的肽，即，表位由WT-1表位特异性T细胞特异性结合。表位特异性T细胞结合具有参考氨基酸序列的表位，但大体上不结合与参考氨基酸序列不同的表位。举例来说，表位特异性T细胞结合具有参考氨基酸序列的表位，且结合与参考氨基酸序列不同的表位，如果有的话，则其亲和力小于10-6M、小于10-5M或小于10-4M。表位特异性T细胞可结合对其具有特异性的表位，其亲和力为至少10-7M、至少10- 8M、至少10-9M或至少10-10M。
适于包含在TMMP中的WT-1肽的实例包括但不限于CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO:225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO:227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO:229)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO:230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:232)、MNLGATLK(SEQ ID NO:233)、MTWNYMNLGATLKGV(SEQ ID NO:234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:238)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO:239)、GALRNPTAL(SEQ IDNO:240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO:241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO:242)、RYRPHPGAL(SEQ IDNO:243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO:244)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO:245)、RIRPHPGAL(SEQ IDNO:246)、QFPNHSFKH EDPMGQ(SEQ ID NO:247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO:248)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO:249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ ID NO:250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQID NO:251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO:252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO:253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO:254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO:255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO:257)、NLMNLGATL(SEQ ID NO:258)、VLDFAPPGA(SEQ IDNO:259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)、CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO:265)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO:266)及NQMNLGATL(SEQ ID NO:267)。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1肽为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1肽为CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)。
在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1肽递呈HLA-A*2402限制性表位。递呈HLA-A*2402限制性表位的WT-1肽包括例如CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)；NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)(WT-1 239-247；Q240Y)；CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)(WT-1235-243)；CMTWNQMNL(SEQID NO:266)(WT-1 235-243)；NQMNLGATL(SEQ ID NO:267)(WT-1 239-247)；及NLMNLGATL(SEQ ID NO:258)(WT-1 239-247；Q240L)。
在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1肽递呈HLA-A*0201限制性表位。递呈HLA-A*0201限制性表位的WT-1肽包括例如VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)(WT-1 37-45)；RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)(WT-1 126-134)；YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)(WT-1126-134；R126Y)；SLGEQQYSV(SEQ ID NO:265)(WT-1 187-195)；及NLMNLGATL(SEQ ID NO:258)(WT-1 239-247；Q240L)。
在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1肽递呈HLA-A*2402限制性表位并且不具有N端Cys。例如，当WT-1肽包含N端Cys时，N端Cys可被Ser替代。作为另一实例，当WT-1肽包含N端Cys时，可以将Gly添加到N端。例如，存在于TMMP中的WT-1肽可包含氨基酸序列X1X2X3TWNQMNL(SEQ ID NO:460)或X2X3TWNQMNL(SEQ ID NO:461)，其中X1、X2和X3各自独立地为任何氨基酸，条件是N端氨基酸不是Cys，并且其中WT-1肽表位具有9至25个氨基酸的长度。在这些实施方案的一些中，WT-1肽具有9个氨基酸或10个氨基酸的长度。适于包含在TMMP中的WT-1肽的实例包括但不限于SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)、GCMTWNQMNL(SEQ IDNO:452)、SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)或GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)。在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的WT-1肽具有氨基酸序列SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)；并具有9个氨基酸的长度。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1肽具有氨基酸序列GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)；并具有10个氨基酸的长度。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1肽具有氨基酸序列SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)；并具有9个氨基酸的长度。在一些情况下，存在于TMMP中的WT-1肽具有氨基酸序列GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)；并具有10个氨基酸的长度。
HLA/肽结合测定
给定肽(例如，WT-1肽)是否结合I类HLA(包含HLA重链和β2M多肽)及在结合至HLA复合物时是否可有效递呈表位至TCR可使用许多公知方法中的任一种来确定。测定包括结合测定和T细胞活化测定。
基于细胞的结合测定
作为一个实例，基于细胞的肽诱导稳定性测定可用于确定肽-HLA I类结合。在此测定中，允许目标肽结合至TAP缺陷型细胞，即具有与抗原加工(TAP)机构相关的缺陷型转运蛋白且因此具有更少表面I类分子的细胞。此类细胞包括例如人T2细胞系(T2(174xCEM.T2；美国模式培养物保藏中心(ATCC)编号CRL-1992)。Henderson等人(1992)Science255:1264。在未将胞质肽缺陷型TAP介导转运至内质网中的情况下，组装的I类复合物是结构上不稳定的，且在细胞表面上仅瞬时保留。然而，当T2细胞与能够结合I类的外源肽一起培育时，表面肽-HLA I类复合物为稳定的且可通过流动式细胞测量术，使用例如泛抗I类单克隆抗体来检测。通过添加肽使细胞表面上的肽-HLA复合物具有稳定性及随之而来的延长的寿命，由此验证了其身份。分析可使用流动式细胞测量术进行，例如其中pan-HLA I类抗体包含荧光标记。肽与HLA H链的各种等位基因形式的结合可通过基因修饰T2细胞以表达目标等位基因HLA H链来进行测试。
以下为T2测定评定肽与HLA A*0201的结合的用途的非限制性实例。将T2细胞在细胞培养基中洗涤，且浓缩至106个细胞/ml。将目标肽在细胞培养基中制备且连续稀释，从而提供浓度200μM、100μM、20μM及2μM。将细胞与各肽稀释液1:1混合以得到200μL最终体积及100μM、50μM、10μM及1μM最终肽浓度。A HLA A*0201结合肽、GILGFVFTL(SEQ ID NO:395)及非-HLA A*0201-限制性肽、HPVGEADYF(SEQ ID NO:396)(HLA-B*3501)分别作为阳性对照和阴性对照包括在内。将细胞/肽混合物保持在37℃5％CO2下十分钟；接着在室温下培育过夜。随后将细胞在37℃下培育2小时且用荧光标记的抗人HLA抗体染色。接着将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次且使用流动式细胞测量术分析。使用抗-HLA抗体染色的平均荧光强度(MFI)测量结合强度。
生物化学结合测定
可在无细胞的体外测定系统中对HLA多肽(HLA重链多肽与β2M多肽的复合物)与目标肽的结合进行测试。举例来说，使标记的参考肽(例如，荧光标记)结合至HLA多肽(HLA重链多肽与β2M多肽之复合物)，以形成HLA-参考肽复合物。对目标测试肽置换来自HLA-参考肽复合物的标记的参考肽的能力进行测试。相对结合亲和力被计算为置换所结合的参考肽所需的测试肽的量。参见，例如van der Burg等人(1995)Human Immunol.44:189。
作为另一实例，目标肽可与HLA分子(HLA重链与β2M多肽的复合物)一起培育，且可以免疫测定形式测量HLA/肽复合物的稳定性。将目标肽稳定化HLA分子的能力与递呈已知T细胞表位的对照肽的能力相比较。稳定性的检测是基于使用抗HLA抗体所检测的HLA/肽复合物的天然构象的存在或不存在。参见，例如Westrop等人(2009)J.Immunol.Methods 341:76；Steinitz等人(2012)Blood 119:4073；及美国专利号9,205,144。
T细胞活化测定
给定肽是否结合I类HLA(包含HLA重链和β2M多肽)及在结合至HLA复合物时是否可有效递呈表位至TCR可通过评定T细胞对肽-HLA复合物的反应来确定。可测量的T细胞反应包括例如干扰素-γ(IFNγ)产生、细胞毒性活性等。
ELISPOT测定
适合的测定包括例如酶联免疫斑点(ELISPOT)测定。在此测定中，在递呈目标肽与HLA I类的复合物的抗原递呈细胞(APC)之后测量CD8+T细胞的IFNγ产生。将IFNγ的抗体固定在多孔板的孔上。将APC添加至孔中，且将其与目标肽一起培育一段时间，使得该肽结合APC表面上的HLA I类。将对该肽具有特异性的CD8+T细胞添加至孔中，且将该板培育约24小时。接着洗涤这些孔，且使用可检测标记的抗IFNγ抗体检测结合至固定的抗IFNγ抗体的任何IFNγ。可使用比色测定。举例来说，可检测标记的抗IFNγ抗体可为生物素标记的抗IFNγ抗体，其可使用例如缀合至碱性磷酸酶的链亲和素来检测。添加BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑鎓)溶液，以使测定显色。IFNγ分泌T细胞的存在通过色斑来鉴定。阴性对照包括未与该肽接触的APC。可使用表达各种HLA H链等位基因的APC来确定目标肽是否有效结合至包含特定HLA H链的HLA I类分子。
细胞毒性测定
给定肽是否结合至特定HLA I类H链及在结合至包含H链的HLA I类复合物时是否可有效递呈表位至TCR也可使用细胞毒性测定来确定。细胞毒性测定涉及将靶细胞与细胞毒性CD8+T细胞一起培育。靶细胞在其表面上展示出包含目标肽的肽/HLA I类复合物及包含有待测试的HLA H链的HLA I类分子。靶细胞可被放射性标记，例如51Cr放射性标记。靶细胞是否有效递呈表位至细胞毒性CD8+T细胞上的TCR，从而由CD8+T细胞诱导针对靶细胞的细胞毒性活性，是通过测量51Cr从裂解的靶细胞的释放来确定。特异性细胞毒性可被计算为肽存在下细胞毒性活性的量减去肽不存在下细胞毒性活性的量。
用肽-HLA四聚体检测抗原特异性T细胞
作为另一实例，使用荧光或重金属标签生成肽-HLA复合物的多聚体(例如，四聚体)。接着可使用多聚体经由流动式细胞测量术(FACS)或质量细胞计数(CyTOF)鉴别及定量特异性T细胞。表位特异性T细胞之检测提供肽结合的HLA分子能够结合至抗原特异性T细胞子集上的特异性TCR的直接证据。参见，例如Klenerman等人(2002)Nature ReviewsImmunol.2:263。
免疫调节多肽(“MOD”)
在一些情况下，存在于TMMP中的MOD是野生型(“wt”)MOD。如上所述，在其他情况下，存在于TMMP中的MOD是wt MOD的变体，与对应的野生型MOD对co-MOD的亲和力相比，其对co-MOD的亲和力降低。呈现出对co-MOD的减小亲和力的适合的MOD与野生型MOD相比可具有1个氨基酸(aa)至20aa的差异。举例来说，在一些情况下，存在于TMMP中的变体MOD的氨基酸序列与相应野生型MOD相差1aa、2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa或10aa。作为另一实例，在一些情况下，存在于TMMP中的变体MOD的氨基酸序列与相应野生型MOD相差11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa或20aa。
如上所述，MOD可以包含wt免疫调节多肽的变体，其可以呈现出与其co-MOD的结合减少，包括例如与co-MOD的一个或多个链或结构域的结合减少。例如，存在于TMMP中的变体MOD可以比相应野生型MOD对co-MOD的亲和力小至少10％、小至少15％、小至少20％、小至少25％、小至少30％、小至少35％、小至少40％、小至少45％、小至少50％、小至少55％、小至少60％、小至少65％、小至少70％、小至少75％、小至少80％、小至少85％、小至少90％、小至少95％或小大于95％的亲和力结合其co-MOD。免疫调节多肽与同源共免疫调节多肽的示例性对包括但不限于：
a)4-1BBL(免疫调节多肽)与4-1BB(同源共免疫调节多肽)；
b)PD-L1(免疫调节多肽)与PD1(同源共免疫调节多肽)；
c)IL-2(免疫调节多肽)与IL-2受体(同源共免疫调节多肽)；
d)CD80(免疫调节多肽)与CD86(同源共免疫调节多肽)；
e)CD86(免疫调节多肽)与CD28(同源共免疫调节多肽)；
f)OX40L(CD252)(免疫调节多肽)与OX40(CD134)(同源共免疫调节多肽)；
g)Fas配体(免疫调节多肽)与Fas(同源共免疫调节多肽)；
h)ICOS-L(免疫调节多肽)与ICOS(同源共免疫调节多肽)；
i)ICAM(免疫调节多肽)与LFA-1(同源共免疫调节多肽)；
j)CD30L(免疫调节多肽)与CD30(同源共免疫调节多肽)；
k)CD40(免疫调节多肽)与CD40L(同源共免疫调节多肽)；
l)CD83(免疫调节多肽)与CD83L(同源共免疫调节多肽)；
m)HVEM(CD270)(免疫调节多肽)与CD160(同源共免疫调节多肽)；
n)JAG1(CD339)(免疫调节多肽)与Notch(同源共免疫调节多肽)；
o)JAG1(免疫调节多肽)与CD46(同源共免疫调节多肽)；
p)CD80(免疫调节多肽)与CTLA4(同源共免疫调节多肽)；
q)CD86(免疫调节多肽)与CTLA4(同源共免疫调节多肽)；及
r)CD70(免疫调节多肽)与CD27(同源共免疫调节多肽)。
如图19示意性示出，MOD(即，一种或多种MOD)可存在于TMMP的多个位置中的任一个处。图19描绘变体IL-2多肽的两个副本的位置；然而，MOD可为如本文所述的多种MOD中的任一种。如图19所描绘，MOD可：1)在I类MHC重链的N端；2)在I类MHC重链的C端和Ig Fc多肽的N端；换句话说，介于I类MHC重链与Ig Fc多肽之间；3)在Ig Fc多肽的C端；4)在肽表位的N端；或5)在β2M多肽的C端。
PD-L1–野生型和变体
存在于TMMP中的MOD可以是野生型PD-L1多肽或变体PD-L1多肽。
在一些情况下，存在于TMMP中的MOD是PD-L1多肽。在一些情况下，TMP的PD-L1多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中列出的PD-L1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。2019年3月14日公布的PCT申请WO 2019/051091中描述了PD-L1变体MOD。参见[00157]-[00169]。
在一些情况下，变体PD-L1多肽呈现出与PD-1(例如，包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的PD-1多肽)的结合亲和力与包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的PD-L1多肽的结合亲和力相比有所减小。举例来说，在一些情况下，本公开的变体PD-L1多肽结合PD-1(例如，包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的PD-1多肽)的结合亲和力比包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的PD-L1多肽的结合亲和力小至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、小至少50％、小至少55％、小至少60％、小至少65％、小至少70％、小至少75％、小至少80％、小至少85％、小至少90％、小至少95％或小大于95％。
CD80–野生型和变体
存在于TMMP中的MOD可以是野生型CD80多肽或变体CD80多肽。CD80变体MOD在2019年3月14日公布的已公布PCT申请WO 2019/051091中有所描述。参见[00170]-[00196]。
在一些情况下，存在于TMMP中的MOD是CD80多肽。在一些情况下，TMMP的CD80多肽包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，变体CD80多肽表现出对CD28的结合亲和力与包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的CD80多肽对CD28的结合亲和力相比有所减小。举例来说，在一些情况下，变体CD80多肽结合CD28的结合亲和力比包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的CD80多肽对CD28(例如，包含SEQ ID NO:5、6或7中的一个列出的氨基酸序列的CD28多肽)的结合亲和力小至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、小至少50％、小至少55％、小至少60％、小至少65％、小至少70％、小至少75％、小至少80％、小至少85％、小至少90％、小至少95％或小大于95％。
CD86–野生型和变体
存在于TMMP中的MOD可以是野生型CD86多肽或变体CD86多肽。CD80变体MOD在2019年3月14日公布的已公布PCT申请WO 2019/051091中有所描述。参见[00197]-[00228]。
在一些情况下，存在于TMMP中的MOD是CD86多肽。在一些情况下，TMMP的CD86多肽包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中列出的CD86氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
4-1BBL–野生型和变体
存在于TMMP中的MOD可以是野生型4-1BBL多肽或变体4-1BBL多肽。4-1BBL变体MOD在2019年3月14日公布的已公布PCT申请WO 2019/051091中有所描述。参见[00229]-[00324]。
在一些情况下，存在于TMMP中的MOD是4-1BBL多肽。在一些情况下，TMMP的4-1BBL多肽包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的4-1BBL氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，变体4-1BBL多肽呈现出对4-1BB的结合亲和力与包含SEQ ID NO:10-13中的一个列出的氨基酸序列的4-1BBL多肽的结合亲和力相比有所减小。举例来说，在一些情况下，当在相同条件下测定时，本公开的变体4-1BBL多肽结合4-1BB的结合亲和力比包含SEQ ID NO:10-13中的一个列出的氨基酸序列的4-1BBL多肽对4-1BB多肽(例如，包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列的4-1BB多肽)的结合亲和力小至少10％、小至少15％、小至少20％、小至少25％、小至少30％、小至少35％、小至少40％、小至少45％、小至少50％、小至少55％、小至少60％、小至少65％、小至少70％、小至少75％、小至少80％、小至少85％、小至少90％、小至少95％或小大于95％。
IL-2变体
在一些情况下，存在于本公开的TMMP中的变体MOD为变体IL-2多肽。野生型IL-2结合至IL-2受体(IL-2R)，即包含IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2Rγ的异三聚体多肽。
野生型IL-2氨基酸序列可为如下：
野生型IL2结合至细胞表面上的IL2受体(IL2R)。在一些情况下，IL2受体为包含α链(IL-2Rα；也称为CD25)、β链(IL-2Rβ；也称为CD122:及γ链(IL-2Rγ；也称为CD132)的异三聚体多肽。人IL-2Rα、IL2Rβ及IL-2Rγ的氨基酸序列可为如下。
人IL-2Rα：ELCDDDPPE IPHATFKAMA YKEGTMLNCE CKRGFRRIKS GSLYMLCTGNSSHSSWDNQC QCTSSATRNT TKQVTPQPEE QKERKTTEMQ SPMQPVDQAS LPGHCREPPP WENEATERIYHFVVGQMVYY QCVQGYRALH RGPAESVCKM THGKTRWTQP QLICTGEMET SQFPGEEKPQ ASPEGRPESETSCLVTTTDF QIQTEMAATM ETSIFTTEYQ VAVAGCVFLL ISVLLLSGLT WQRRQRKSRR TI(SEQ IDNO:16)。
人IL-2Rβ：VNG TSQFTCFYNS RANISCVWSQ DGALQDTSC Q VHAWPDRRRW NQTCELLPVSQASWACNLIL GAPDSQKLTT VDIVTLRVLC REGVRWRVMA IQDFKPFENL RLMAPISLQV VHVETHRCNISWEISQASHY FERHLEFEAR TLSPGHTWEE APLLTLKQKQ EWICLETLTP DTQYEFQVRV KPLQGEFTTWSPWSQPLAFR TKPAALGKDT IPWLGHLLVG LSGAFGFIIL VYLLINCRNT GPWLKKVLKC NTPDPSKFFSQLSSEHGGDV QKWLSSPFPS SSFSPGGLAP EISPLEVLER DKVTQLLLQQ DKVPEPASLS SNHSLTSCFTNQGYFFFHLP DALEIEACQV YFTYDPYSEE DPDEGVAGAP TGSSPQPLQP LSGEDDAYCT FPSRDDLLLFSPSLLGGPSP PSTAPGGSGA GEERMPPSLQ ERVPRDWDPQ PLGPPTPGVP DLVDFQPPPE LVLREAGEEVPDAGPREGVS FPWSRPPGQG EFRALNARLP LNTDAYLSLQ ELQGQDPTHL V(SEQ ID NO:17)。
人IL-2Rγ：LNTTILTP NGNEDTTADF FLTTMPTDSL SVSTLPLPEV QCFVFNVEYMNCTWNSSSEP QPTNLTLHYW YKNSDNDKVQ KCSHYLFSEE ITSGCQLQKK EIHLYQTFVV QLQDPREPRRQATQMLKLQN LVIPWAPENL TLHKLSESQL ELNWNNRFLN HCLEHLVQYR TDWDHSWTEQ SVDYRHKFSLPSVDGQKRYT FRVRSRFNPL CGSAQHWSEW SHPIHWGSNT SKENPFLFAL EAVVISVGSM GLIISLLCVYFWLERTMPRI PTLKNLEDLV TEYHGNFSAW SGVSKGLAES LQPDYSERLC LVSEIPPKGG ALGEGPGASPCNQHSPYWAP PCYTLKPET(SEQ ID NO:18)。
在一些情况下，在TMMP包含变体IL-2多肽时，“同源co-MOD”为包含有包含氨基酸序列SEQ ID NO:16、17及18的多肽的IL-2R。
在一些情况下，变体IL-2多肽呈现出对IL-2R的结合亲和力与包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的IL-2多肽的结合亲和力相比有所减小。举例来说，在一些情况下，当在相同条件下测定时，变体IL-2多肽结合IL-2R的结合亲和力比包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的IL-2多肽对IL-2R多肽(例如，包含有包含SEQ ID NO:16-18中列出的氨基酸序列的多肽的IL-2R)的结合亲和力小至少10％、小至少15％、小至少20％、小至少25％、小至少30％、小至少35％、小至少40％、小至少45％、小至少50％、小至少55％、小至少60％、小至少65％、小至少70％、小至少75％、小至少80％、小至少85％、小至少90％、小至少95％或小大于95％。
在一些情况下，变体IL-2多肽对IL-2R具有的结合亲和力为100nM至100μM。作为另一实例，在一些情况下，变体IL-2多肽对IL-2R(例如，包含有包含SEQ ID NO:16-18中列出的氨基酸序列的多肽的IL-2R)具有的结合亲和力为约100nM至150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、约250nM至约300nM、约300nM至约350nM、约350nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM至约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约15μM、约15μM至约20μM、约20μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有单一氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有2至10个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有2个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有3个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有4个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ IDNO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有5个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有6个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有7个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有8个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有9个氨基酸取代。在一些情况下，变体IL-2多肽与SEQ ID NO:15中列出的IL-2氨基酸序列相比具有10个氨基酸取代。
适合的IL-2变体包括一种多肽，其包含与以下氨基酸序列中的任一个具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
在一些情况下，合适的变体IL-2多肽包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
即变体IL-2多肽具有野生型IL-2的氨基酸序列，但具有H16A和F42A取代(以粗体显示)。或者，可采用前述序列，但在H16和/或F42处具有除Ala以外的取代，例如，可采用H16T代替H16A。在一些情况下，存在于TMP中的变体IL-2多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，存在于TMMP中的变体IL-2多肽包含以下氨基酸序列：
在一些情况下，M包含两个拷贝的这种变体IL-2多肽。
额外多肽
除了上文所述的那些多肽之外，本公开的TMMP的多肽还可包括一种或多种多肽。适合的额外多肽包括表位标签和亲和力结构域。所述一种或多种额外多肽可包括在TMMP的多肽链的N端、在TMMP的多肽链的C端、或在TMMP的多肽链内部。
表位标签
适合的表位标签包括但不限于血球凝集素(HA；例如，YPYDVPDYA(SEQ ID NO:271)；FLAG(例如，DYKDDDDK(SEQ ID NO:272)；c-myc(例如，EQKLISEEDL；SEQ ID NO:273)等。
亲和力结构域
亲和力结构域包括可与结合配偶体，诸如固定在固体支撑物上可用于鉴别或纯化的结合配偶体相互作用的肽序列。编码多个连续单一氨基酸诸如组氨酸的DNA序列当融合至所表达的蛋白时可用于通过与树脂柱诸如镍琼脂糖的高亲和力结合来一步纯化重组蛋白。示例性亲和结构域在2019年3月14日公布的已公布的PCT申请WO 2019/051091中提供。参见[00355]。
药物缀合物
本公开的TMMP的多肽链可包含连接(例如，共价附接)至多肽链的小分子药物。举例来说，在本公开的TMMP包含Fc多肽时，Fc多肽可包含共价连接的小分子药物。在一些情况下，小分子药物为癌症化学治疗剂，例如细胞毒性剂。在2019年3月14日公布的已公布的PCT申请WO 2019/051091中提供了此类药物缀合物和合适的化疗剂的公开内容。参见[00356]-[00363]。
示例性TMMP
本公开的TMMP包含至少一种异二聚体，其包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT-1肽表位；和ii)第一MHC多肽；b)第二多肽，所述第二多肽包含第二MHC多肽；及c)至少一种MOD，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含MOD。因此，在一些情况下，本公开的TMMP包含至少一种异二聚体，其包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT-1肽表位；ii)第一MHC多肽；和iii)至少一种MOD；及b)第二多肽，所述第二多肽包含第二MHC多肽。在其他情况下，TMMP包含至少一种异二聚体，其包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT-1肽表位；及ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)至少一种MOD。在一些情况下，TMMP包含至少一种异二聚体，其包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)WT-1肽表位；ii)第一MHC多肽；及iii)至少一种MOD；及b)第二多肽，所述第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)至少一种MOD。在一些情况下，所述至少一种MOD为野生型免疫调节多肽。在其他情况下，所述至少一种MOD为呈现出与共免疫调节多肽的亲和力与相应野生型MOD对共免疫调节多肽的亲和力相比有所减小的变体MOD。在一些情况下，TMMP包含两种MOD，其中这两种MOD具有相同的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)WT-1肽表位；ii)第一MHC多肽；及iii)至少一种MOD；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)Ig Fc多肽。在一些情况下，第一MHC多肽为β2M多肽；且第二MHC多肽为HLA重链多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和在位置236处的Ala的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，β2M多肽包含位置12处的Arg(R12)。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。在一些情况下，HLA重链多肽为具有A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)WT-1肽表位；ii)第一MHC多肽；及iii)两种MOD，其中这两种MOD具有相同的氨基酸序列。在一些情况下，Ig Fc多肽为人IgG1Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽。在一些情况下，第一多肽与第二多肽两者彼此间以二硫键连接。在一些情况下，MOD为包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，MOD为包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，肽接头介于以下中的一个或多个之间：i)第二MHC多肽与Ig Fc多肽；ii)表位与第一MHC多肽；iii)第一MHC多肽与MOD；及(当TMMP在第一多肽链上包含两种MOD时)iv)介于两种MOD之间。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:283)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ IDNO:284)，其中n为1至10的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至9的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，WT-1肽表位为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，WT-1肽表位为CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)。在一些情况下，WT-1肽表位为SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)。在一些情况下，WT-1肽表位为SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)WT-1肽表位；及ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)至少一种MOD；ii)第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽。在一些情况下，第一MHC多肽为β2M多肽；且第二MHC多肽为HLA重链多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和在位置236处的Ala的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，β2M多肽包含位置12处的Arg(R12)。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。在一些情况下，第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)两种MOD，其中这两种MOD具有相同的氨基酸序列；ii)第二MHC多肽；及iii)IgFc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为人IgG1Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽。在一些情况下，第一多肽与第二多肽两者彼此间以二硫键连接。在一些情况下，MOD为包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，MOD为包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，肽接头介于以下中的一个或多个之间：i)第二MHC多肽与Ig Fc多肽；ii)表位与第一MHC多肽；iii)第一MHC多肽与MOD；及(当TMMP在第二多肽链上包含两种MOD时)iv)介于两种MOD之间。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:283)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:284)，其中n为1至10的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至9的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，WT-1肽表位为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，WT-1肽表位为CYTWNQMNL(SEQID NO:262)。在一些情况下，WT-1肽表位为SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)。在一些情况下，WT-1肽表位为SYTWNQMNL(SEQ IDNO:453)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)WT-1肽表位；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；ii)Ig Fc多肽；及iii)至少一种MOD。在一些情况下，第一MHC多肽为β2M多肽；且第二MHC多肽为HLA重链多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和在位置236处的Ala的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，β2M多肽包含位置12处的Arg(R12)。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。在一些情况下，第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；ii)Ig Fc多肽；及iii)两种MOD，其中这两种MOD具有相同的氨基酸序列。在一些情况下，Ig Fc多肽为人IgG1Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽。在一些情况下，第一多肽与第二多肽两者彼此间以二硫键连接。在一些情况下，MOD为包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，MOD为包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，肽接头介于以下中的一个或多个之间：i)第二MHC多肽与Ig Fc多肽；ii)表位与第一MHC多肽；iii)Ig Fc多肽与MOD；及(当TMMP在第二多肽链上包含两种MOD时)iv)介于这两种MOD之间。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:283)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:284)，其中n为1至10的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至9的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，WT-1肽表位为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，WT-1肽表位为CYTWNQMNL(SEQID NO:262)。在一些情况下，WT-1肽表位为SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)。在一些情况下，WT-1肽表位为SYTWNQMNL(SEQ IDNO:453)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)WT-1肽表位；及ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)至少一种MOD；ii)第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽。在一些情况下，第一MHC多肽为β2M多肽；且第二MHC多肽为HLA重链多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为人IgG1Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽。在一些情况下，第一多肽与第二多肽两者彼此间以二硫键连接。在一些情况下，MOD为包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，MOD为包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，WT-1肽表位为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，WT-1肽表位为CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)至少一种MOD；ii)WT-1肽表位；及iii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)Ig Fc多肽。在一些情况下，第一MHC多肽为β2M多肽；且第二MHC多肽为HLA重链多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)两种MOD，其中这两种MOD具有相同的氨基酸序列；ii)WT-1肽表位；及iii)第一MHC多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为人IgG1Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽。在一些情况下，第一多肽与第二多肽两者彼此间以二硫键连接。在一些情况下，MOD为包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，MOD为包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，肽接头介于以下中的一个或多个之间：i)第二MHC多肽与Ig Fc多肽；ii)表位与第一MHC多肽；iii)MOD与表位；及(当TMMP在第一多肽链上包含两种MOD时)iv)介于两种MOD之间。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:283)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:284)，其中n为1至10的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，WT-1肽表位为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，WT-1肽表位为CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)WT-1肽表位；及ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；ii)至少一种MOD；及iii)Ig Fc多肽。在一些情况下，第一MHC多肽为β2M多肽；且第二MHC多肽为HLA重链多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；ii)两种MOD，其中这两种MOD具有相同的氨基酸序列；及iii)Ig Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为人IgG1Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽。在一些情况下，第一多肽与第二多肽两者彼此间以二硫键连接。在一些情况下，MOD为包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，MOD为包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，肽接头介于以下中的一个或多个之间：i)第二MHC多肽与MOD；ii)MOD与Ig Fc多肽；iii)表位与第一MHC多肽；iii)第一MHC多肽与MOD；及(当TMMP在第二多肽链上包含两种MOD时)iv)介于这两种MOD之间。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:283)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:284)，其中n为1至10的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，WT-1肽表位为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，WT-1肽表位为CYTWNQMNL(SEQ IDNO:262)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)至少一种MOD；ii)WT-1肽表位；及iii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)Ig Fc多肽。在一些情况下，第一MHC多肽为β2M多肽；且第二MHC多肽为HLA重链多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和在位置236处的Ala的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，β2M多肽包含位置12处的Arg(R12)。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。在一些情况下，第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)两种MOD，其中这两种MOD具有相同的氨基酸序列；ii)WT-1肽表位；及iii)第一MHC多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为人IgG1Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽。在一些情况下，第一多肽与第二多肽两者彼此间以二硫键连接。在一些情况下，MOD为包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，MOD为包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，肽接头介于以下中的一个或多个之间：i)第二MHC多肽与Ig Fc多肽；ii)表位与第一MHC多肽；iii)MOD与表位；及(当TMMP在第一多肽链上包含两种免疫调节多肽时)iv)介于两种MOD之间。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:283)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ IDNO:284)，其中n为1至10的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至9的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，WT-1肽表位为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，WT-1肽表位为CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)。在一些情况下，WT-1肽表位为SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)。在一些情况下，WT-1肽表位为SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)WT-1肽表位；及ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；ii)至少一种MOD；及iii)Ig Fc多肽。在一些情况下，第一MHC多肽为β2M多肽；且第二MHC多肽为HLA重链多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和在位置236处的Ala的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84A取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，HLA重链多肽为具有Y84C取代和A236C取代的HLA-A24多肽。在一些情况下，β2M多肽包含位置12处的Arg(R12)。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。在一些情况下，第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)第二MHC多肽；ii)两种MOD，其中这两种MOD具有相同的氨基酸序列；及iii)IgFc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为人IgG1Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽为包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽。在一些情况下，第一多肽与第二多肽两者彼此间以二硫键连接。在一些情况下，MOD为包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，MOD为包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，肽接头介于以下中的一个或多个之间：i)第二MHC多肽与MOD；ii)MOD与Ig Fc多肽；iii)表位与第一MHC多肽；iii)第一MHC多肽与MOD；及(当TMMP在第二多肽链上包含两种MOD时)iv)介于这两种MOD之间。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:283)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:284)，其中n为1至10的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至9的整数(例如，其中n为2、3或4)。在一些情况下，WT-1肽表位为CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)。在一些情况下，WT-1肽表位为CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)。在一些情况下，WT-1肽表位为SMTWNQMNL(SEQ IDNO:451)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)。在一些情况下，WT-1肽表位为SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)。在一些情况下，WT-1肽表位为GCYTWNQMNL(SEQ IDNO:454)。
如上所述且如图19示意性示出，MOD(即，一种或多种MOD)可存在于本公开的TMMP的多个位置中的任一个处。图19描绘变体IL-2多肽的两个拷贝的位置；然而，MOD可为如本文所述的多种MOD中的任一种。如图19所描绘，MOD可：1)在I类MHC重链的N端(位置1)；2)在I类MHC重链的C端及Ig Fc多肽的N端；换句话说，介于I类MHC重链与Ig Fc多肽之间(位置2)；3)在Ig Fc多肽的C端(位置3)；4)在肽表位的N端(位置4)；或5)在β2M多肽的C端(位置5)。“位置1”是指MOD在与I类MHC重链相同的多肽链上且在I类MHC重链的N端的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)肽表位(例如，WT-1肽)；及ii)β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)一种或多种MOD；及ii)I类MHC重链多肽。“位置2”是指MOD在与I类MHC重链相同的多肽链上且在I类MHC重链的C端而非多肽链的C端的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)肽表位(例如，WT-1肽)；及ii)β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)I类MHC重链多肽；ii)一种或多种MOD；及iii)Ig Fc多肽。“位置3”是指MOD在与I类MHC重链相同的多肽链上且在多肽链的C端的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)肽表位(例如，WT-1肽)；及ii)β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)I类MHC重链多肽；ii)IgFc多肽；及iii)一种或多种MOD。“位置4”是指MOD在与β2M多肽相同的多肽链上且在肽表位及β2M多肽的N端的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)一种或多种免疫调节多肽；ii)肽表位(例如，WT-1肽)；及iii)β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含I类MHC重链多肽(例如，第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)I类MHC重链多肽；及ii)Ig Fc多肽。“位置5”是指MOD在与β2M多肽相同的多肽链上且在β2M多肽的C端(例如，多肽链的C端)的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)肽表位(例如，WT-1肽)；及ii)β2M多肽；及iii)一种或多种MOD；和b)第二多肽，所述第二多肽包含I类MHC重链多肽(例如，第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)I类MHC重链多肽；及ii)Ig Fc多肽。
另外，如上文所讨论且如图18A-18C示意性描绘，TMMP的第一多肽链与第二多肽链可由一个或多个二硫键连接。举例来说，TMMP可包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含具有R12C取代的β2M多肽；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含具有A236C取代的I类MHC重链多肽，使得二硫键在第一多肽链中β2M多肽的位置12处的Cys与第二多肽链中I类MHC重链多肽的位置236处的Cys之间形成。作为另一实例，TMMP可包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)肽表位；ii)肽接头，所述肽接头包含GCGGS(G4S)n(SEQ IDNO:315)序列，其中n为1、2或3；及iii)β2M多肽；和b)第二多肽，所述第二多肽包含具有Y84C取代的I类MHC重链多肽，使得二硫键在第一多肽链的肽接头中的Cys与第二多肽链的I类MHC重链多肽的位置84处的Cys之间形成。在其他实例中，TMMP可包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)肽表位；ii)肽接头，所述肽接头包含GCGGS(G4S)n(SEQID NO:315)序列，其中n为1、2或3；及iii)β2M多肽，所述多肽具有R12C取代；和b)第二多肽，所述第二多肽包含具有Y84C取代和A236C取代的I类MHC重链多肽，使得：i)第一二硫键在第一多肽链的肽接头中的Cys与第二多肽链的I类MHC重链多肽的位置84处的Cys之间形成；且ii)第二二硫键在第一多肽链的β2M多肽的位置12处的Cys与第二多肽链的I类MHC重链多肽的位置236处的Cys之间形成。为简明起见，第一二硫键称为“G2C/Y84C”；且第二二硫键称为“R12C/A236C”。TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而无R12C/A236C二硫键；b)R12C/A236C二硫键而无G2C/Y84C二硫键；或c)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键。
TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而无R12C/A236C二硫键；和b)在位置1处的至少一种免疫调节多肽。TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而无R12C/A236C二硫键；和b)在位置2处的至少一种MOD。本公开的TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而无R12C/A236C二硫键；和b)在位置3处的至少一种MOD。TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而无R12C/A236C二硫键；和b)在位置4处的至少一种MOD。TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而无R12C/A236C二硫键；和b)在位置5处的至少一种MOD。
TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫键而无G2C/Y84C二硫键；和在位置1处的至少一种MOD。TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫键而无G2C/Y84C二硫键；和在位置2处的至少一种MOD。TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫键而无G2C/Y84C二硫键；和b)在位置3处的至少一种MOD。本公开的TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫键而无G2C/Y84C二硫键；和在位置4处的至少一种免疫调节多肽。TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫键而无G2C/Y84C二硫键；和在位置5处的至少一种MOD。
TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键；和b)及在位置1处的至少一种MOD。TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键；和b)及在位置2处的至少一种MOD。TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键；和b)及在位置3处的至少一种MOD。本公开的TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键；和b)及在位置4处的至少一种MOD。TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键；和b)及在位置5处的至少一种MOD。
本公开的TMMP的第一多肽链和第二多肽链的氨基酸序列的非限制性实例提供于图4A-4K和图20A-20R中。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4D所描绘的指示为“2752”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4C所描绘的指示为“3159”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4E所描绘的指示为“2753”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4C所描绘的指示为“3159”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4D所描绘的指示为“2752”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4B所描绘的指示为“2750”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4E所描绘的指示为“2753”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4B所描绘的指示为“2750”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4D所描绘的指示为“2752”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4A所描绘的指示为“3158”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4E所描绘的指示为“2753”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4A所描绘的指示为“3158”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14B所描绘的指示为“2380”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14A所描绘的指示为“1715”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，其以从N端至C端的次序包含：i)序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)的WT-1肽；ii)具有氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)的接头；iii)β2M多肽，其在位置12包含Cys(例如，具有SEQ ID NO:311中列出的氨基酸序列的β2M)；和b)第二多肽链，其以从N端至C端的次序包含：i)包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽(即，在位置16和42处包含Ala，例如SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala)；ii)(GGGGS)4接头；iii)包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽(即，在位置16和42处包含Ala，例如SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala)；iv)(GGGGS)4接头；v)在位置84和236处包含Cys的HLA A0202重链(例如，包含SEQID NO:341中列出的氨基酸序列的HLA重链多肽)；vi)AAAGG接头；及vii)Ig Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽包含与图5A-5G或5H中描绘的Fc区的氨基酸序列具有至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Ig Fc多肽是变体Ig Fc多肽，其相对于野生型多肽包含一个或多个序列变异，其中Ig Fc多肽通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导细胞溶解的能力降低或大体消除。在一些情况下，Ig Fc多肽是变体人IgG1Fc多肽，其包含L234A和/或L235A取代(图5H中描绘的氨基酸序列中的L14和L15。在一些情况下，Ig Fc多肽包含图5H中描绘和SEQ IDNO:487中列出的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，其以从N端至C端的次序包含：i)序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)的WT-1肽；ii)具有氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)的接头；及iii)β2M多肽，其在位置12处包含Cys(例如，具有SEQ ID NO:311中列出的氨基酸序列的β2M)；和b)第二多肽链，其以从N端至C端的次序包含：i)包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽(即，在位置16和42处包含Ala，例如SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala)；ii)(GGGGS)4接头；iii)包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽(即，在位置16和42处包含Ala，例如SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala)；iv)(GGGGS)4接头；v)在位置84和236处包含Cys的HLA A0202重链(例如，包含SEQ ID NO:341中列出的氨基酸序列的HLA重链多肽)；vi)AAAGG接头；及vii)在位置14和15处包含Ala并且缺少C端Lys的Ig Fc多肽(例如，包含图5H中描绘和SEQ ID NO:487中列出的氨基酸序列的Ig Fc多肽)。例如，在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14B所描绘的指示为“2380”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14J所描绘的指示为“1715”的氨基酸序列。图14J中描绘的构建体(“没有C端Lys的1715”)在本文中也称为“1715Δ”。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14B所描绘的指示为“2381”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14A所描绘的指示为“1715”或如图14J所描绘的指示为1715Δ且在SEQ ID NO:486中列出的的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14B所描绘的指示为“2380”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14D所描绘的指示为“2405”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14B所描绘的指示为“2381”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14D所描绘的指示为“2405”的氨基酸序列。在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14F所描绘的指示为“2762”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14D所描绘的指示为“2405”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14B所描绘的指示为“2380”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14E所描绘的指示为“1380”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14B所描绘的指示为“2381”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14E所描绘的指示为“1380”的氨基酸序列。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20A所描绘的指示为“3592”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20H所描绘的指示为“3188”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20B所描绘的指示为“3425”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20H所描绘的指示为“3188”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20C所描绘的指示为“3196”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20I所描绘的指示为“3604”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20D所描绘的指示为“2764”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20J所描绘的指示为“3603”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20E所描绘的指示为“3593”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20K所描绘的指示为“3192”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20F所描绘的指示为“3426”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20K所描绘的指示为“3192”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20G所描绘的指示为“3197”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20L所描绘的指示为“3605”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20A所描绘的指示为“3592”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20M所描绘的指示为“3529”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20B所描绘的指示为“3425”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20M所描绘的指示为“3529”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者；且还包含WT1239-247(Q240Y)表位。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20C所描绘的指示为“3196”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20N所描绘的指示为“3709”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4B所描绘的指示为“2750”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20O所描绘的指示为“3528”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4C所描绘的指示为“3159”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20O所描绘的指示为“3528”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20D所描绘的指示为“2764”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20P所描绘的指示为“3708”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20E所描绘的指示为“3593”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20Q所描绘的指示为“3530”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20F所描绘的指示为“3426”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20Q所描绘的指示为“3530”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20G所描绘的指示为“3197”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20R所描绘的指示为“3710”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20F所描绘的指示为“3426”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20M所描绘的指示为“3529”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)；且还包含WT1 239-247(Q240Y)表位。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20B所描绘的指示为“3425”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20O所描绘的指示为“3528”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)；且还包含WT1 239-247(Q240Y)表位。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图20B所描绘的指示为“3425”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20Q所描绘的指示为“3530”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)；且还包含WT1 239-247(Q240Y)表位。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图4C所描绘的指示为“3159”的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20H所描绘的指示为“3188”的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)；且还包含WT1 235-243(M236Y)表位。
具有表位SMTWNQMNL(WT1(235-243；C235S))的示例性TMMP
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35A所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4B所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35A所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4C所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35B所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20A所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35B所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20B所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35C所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20E所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35C所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20F所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35D所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20G所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35E所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20C所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图35F所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20D所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
具有表位GCMTWNQMNL(WT1(235-243；G-1))的示例性TMMP
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36A所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4B所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36A所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4C所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36B所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20A所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36B所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20B所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36C所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20E所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36C所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20F所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36D所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20G所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的免疫调节多肽；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36E所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20C所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图36F所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20D所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
具有表位SYTWNQMNL(WT1(235-243；C235S；M236Y))的示例性TMMP
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37A所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4B所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37A所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4C所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37B所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20A所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37B所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20B所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37C所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20E所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37C所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20F所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37D所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20G所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37E所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20C所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图37F所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20D所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
具有表位GCYTWNQMNL(WT1(235-243；G-1；M236Y))的示例性TMMP
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38A所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4B所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38A所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图4C所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38B所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20A所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38B所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20B所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38C所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20E所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置1处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38C所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20F所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置3处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38D所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20G所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键(而非R12C/A236C二硫键)。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38E所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20C所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键两者。
在一些情况下，TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图38F所描绘的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图20D所描绘的氨基酸序列。此种TMMP包含：a)如图19描绘的在位置5处的MOD；和b)R12C/A236C二硫键(而非G2C/Y84C二硫键)。
生成多聚体T细胞调节多肽的方法
根据2019年3月14日公布的已公布的PCT申请WO 2019/051091提供了获得包含一种或多种变体MOD的TMMP的方法，这些变体MOD与相应的亲本野生型免疫调节多肽对共免疫调节多肽的亲和力相比对同源co-MOD的亲和力较低。参见[00364]-[00387]。
核酸
本公开提供一种核酸，其包含编码本公开的TMMP的核苷酸序列。
在一些情况下，TMMP的个别多肽链在单独的核酸中编码。在一些情况下，TMMP的全部多肽链均在单一核酸中编码。在一些情况下，第一核酸包含编码TMMP的第一多肽的核苷酸序列；且第二核酸包含编码TMMP的第二多肽的核苷酸序列。在一些情况下，单一核酸包含编码TMMP的第一多肽和TMMP的第二多肽的核苷酸序列。
编码多聚体多肽的个别多肽链的单独核酸
本公开提供包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸。如上文所述，在一些情况下，TMMP的个别多肽链在单独的核酸中编码。在一些情况下，编码TMMP的单独多肽链的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件，例如启动子，诸如在真核细胞中起作用的启动子，其中所述启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。
本公开提供第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含编码TMMP的第一多肽的核苷酸序列，其中第一多肽以从N端至C端的次序包含：a)表位(例如，T细胞表位)；b)第一MHC多肽；及c)MOD(例如，如上文所述的野生型MOD或亲和力减小的变体MOD)；且其中第二核酸包含编码TMMP的第二多肽的核苷酸序列，其中第二多肽以从N端至C端的次序包含：a)第二MHC多肽；及b)Ig Fc多肽。适合的T细胞表位、MHC多肽、MOD及Ig Fc多肽如上文所述。在一些情况下，编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件。在一些情况下，转录控制元件为在真核细胞中起作用的启动子。在一些情况下，核酸存在于单独的表达载体中。
本公开提供第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含编码TMMP的第一多肽的核苷酸序列，其中第一多肽以从N端至C端的次序包含：a)表位(例如，T细胞表位)；和b)第一MHC多肽；且其中第二核酸包含编码TMMP的第二多肽的核苷酸序列，其中第二多肽以从N端至C端的次序包含：a)MOD(例如，如上文所述的野生型MOD或亲和力减小的变体MOD)；b)第二MHC多肽；及c)Ig Fc多肽。适合的T细胞表位、MHC多肽、MOD及Ig Fc多肽如上文所述。在一些情况下，编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件。在一些情况下，转录控制元件为在真核细胞中起作用的启动子。在一些情况下，核酸存在于单独的表达载体中。
编码存在于多聚体多肽中的两种或更多种多肽的核酸
本公开提供一种核酸，其包含至少编码TMMP的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列。在一些情况下，在本公开的TMMP包括第一多肽、第二多肽及第三多肽时，核酸包括编码第一多肽、第二多肽及第三多肽的核苷酸序列。在一些情况下，编码TMMP的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列包括插入编码第一多肽的核苷酸序列与编码第二多肽的核苷酸序列之间的蛋白水解可裂解的接头。在一些情况下，编码TMMP的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列包括插入编码第一多肽的核苷酸序列与编码第二多肽的核苷酸序列之间的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些情况下，编码TMMP的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列包括插入编码第一多肽的核苷酸序列与编码第二多肽的核苷酸序列之间的核糖体跳跃信号(或顺式作用水解酶元件，CHYSEL(SEQ ID NO:394))。核酸的实例在下文中描述，在蛋白水解可裂解的接头提供于编码TMMP的第一多肽与第二多肽的核苷酸序列之间；在这些实施方案的任一个中，IRES或核糖体跳跃信号可用于代替编码蛋白水解可裂解的接头的核苷酸序列。
在一些情况下，第一核酸(例如，重组表达载体、mRNA、病毒RNA等)包含编码本公开的TMMP的第一多肽链的核苷酸序列；且第二核酸(例如，重组表达载体、mRNA、病毒RNA等)包含编码本公开的TMMP的第二多肽链的核苷酸序列。在一些情况下，编码第一多肽的核苷酸序列和编码第二多肽的第二核苷酸序列各自可操作地连接至转录控制元件，例如启动子，诸如在真核细胞中起作用的启动子，其中所述启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。
本公开提供一种核酸，所述核酸包含编码重组多肽的核苷酸序列，其中所述重组多肽以从N端至C端的次序包含：a)表位(例如，T细胞表位)；b)第一MHC多肽；c)MOD(例如，如上文所述的野生型MOD或亲和力减小的变体MOD)；d)蛋白水解可裂解的接头；e)第二MHC多肽；及f)Ig Fc多肽。本公开提供一种核酸，所述核酸包含编码重组多肽的核苷酸序列，其中所述重组多肽以从N端至C端的次序包含：a)第一前导肽；b)表位；c)第一MHC多肽；d)MOD(例如，如上文所述的亲和力减小的变体)；e)蛋白水解可裂解的接头；f)第二前导肽；g)第二MHC多肽；及h)Ig Fc多肽。本公开提供一种核酸，所述核酸包含编码重组多肽的核苷酸序列，其中所述重组多肽以从N端至C端的次序包含：a)表位；b)第一MHC多肽；c)蛋白水解可裂解的接头；d)MOD(例如，如上文所述的亲和力减小的变体)；e)第二MHC多肽；及f)Ig Fc多肽。在一些情况下，第一前导肽和第二前导肽为β2-M前导肽。在一些情况下，核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件。在一些情况下，转录控制元件为在真核细胞中起作用的启动子。
适合的MHC多肽在上文中描述。在一些情况下，第一MHC多肽为β2-微球蛋白多肽；且其中第二MHC多肽为I类MHC重链多肽。在一些情况下，β2-微球蛋白多肽包含与图6中描绘的β2M氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，I类MHC重链多肽为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K或HLA-L重链。在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与图3A-3C中任一个所描绘的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
适合的Fc多肽在上文中描述。在一些情况下，Ig Fc多肽为IgG1Fc多肽、IgG2Fc多肽、IgG3Fc多肽、IgG4Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽包含与图5A-5H中描绘的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
合适的MOD如上所述。
适合的蛋白水解可裂解的接头在上文中描述。在一些情况下，蛋白水解可裂解的接头包含选自以下的氨基酸序列：a)LEVLFQGP(SEQ ID NO:388)；b)ENLYTQS(SEQ ID NO:389)；c)DDDDK(SEQ ID NO:390)；d)LVPR(SEQ ID NO:391)；及e)GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:392)。
在一些情况下，介于表位与第一MHC多肽之间的接头包含第一Cys残基，且第二MHC多肽包含提供第二Cys残基的氨基酸取代，使得第一Cys残基及第二Cys残基提供接头与第二MHC多肽之间的二硫键联。在一些情况下，第一MHC多肽包含提供第一Cys残基的氨基酸取代，且第二MHC多肽包含提供第二Cys残基的氨基酸取代，使得第一Cys残基及第二Cys残基提供第一MHC多肽与第二MHC多肽之间的二硫键联。
本公开提供了一种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含：a)第一多肽链，其以从N端至C端的次序包含：i)序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)的WT-1肽；ii)具有氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)的接头；及iii)β2M多肽，其在位置12处包含Cys(例如，具有SEQ ID NO:311中列出的氨基酸序列的β2M)；和b)第二多肽链，其以从N端至C端的次序包含：i)包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽(即，在位置16和42处包含Ala，例如，SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala)；ii)(GGGGS)4接头；iii)包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽(即，在位置16和42处包含Ala，例如，SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala)；iv)(GGGGS)4接头；v)在位置84和236处包含Cys的HLA A0202重链(例如，包含SEQ ID NO:341中列出的氨基酸序列的HLA重链多肽)；vi)AAAGG接头；及vii)Ig Fc多肽。在一些情况下，Ig Fc多肽是变体Ig Fc多肽，其相对于野生型多肽包含一个或多个序列变异，其中Ig Fc多肽通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导细胞溶解的能力降低或大体消除。在一些情况下，IgFc多肽是变体人IgG1Fc多肽，其包含L234A和/或L235A取代(图5H中描绘的氨基酸序列中的L14和L15)。在一些情况下，Ig Fc多肽包含图5H中描绘的氨基酸序列。在一些情况下，第一多肽和第二多肽在单独的核酸上编码；例如，本公开提供了包含编码第一多肽的核苷酸序列的第一核酸和包含编码第二多肽的核苷酸序列的第二核酸。在其他情况下，单个核酸包含编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列；例如，本公开提供了包含编码第一多肽的第一核苷酸序列和编码第二多肽的第二核苷酸序列的核酸。在一些情况下，核酸在表达载体中。
本公开提供了一种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含：a)第一多肽链，其以从N端至C端的次序包含：i)序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)的WT-1肽；ii)具有氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)的接头；及iii)β2M多肽，其在位置12处包含Cys(例如，具有SEQ ID NO:311中列出的氨基酸序列的β2M)；和b)第二多肽链，其以从N端至C端的次序包含：i)包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽(即，在位置16和42处包含Ala，例如SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala)；ii)(GGGGS)4接头；iii)包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽(即，在位置16和42处包含Ala，例如SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala)；iv)(GGGGS)4接头；v)在位置84和236处包含Cys的HLA A0202重链(例如，包含SEQ ID NO:341中列出的氨基酸序列的HLA重链多肽)；vi)AAAGG接头；及vii)在位置14和15处包含Ala并且缺少C端Lys的Ig Fc多肽(例如，包含图5H中描绘和SEQ ID NO:487中列出的氨基酸序列的Ig Fc多肽)。在一些情况下，第一多肽和第二多肽在单独的核酸上编码；例如，本公开提供了包含编码第一多肽的核苷酸序列的第一核酸和包含编码第二多肽的核苷酸序列的第二核酸。在其他情况下，单个核酸包含编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列；例如，本公开提供了包含编码第一多肽的第一核苷酸序列和编码第二多肽的第二核苷酸序列的核酸。在一些情况下，核酸在表达载体中。
本公开提供了一种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含如图14B所描绘指示为“2380”且如SEQ ID NO:423中列出的氨基酸序列；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包含如图14J所描绘且如SEQ ID NO:486中列出的氨基酸序列1715Δ。在一些情况下，本公开提供了：i)第一核酸，其包含编码如图14B所描绘且如SEQ ID NO:423中列出的2380多肽的核苷酸序列；和ii)第二核酸，其包含编码如图14J所描绘且如SEQ ID NO:486中列出的1715Δ多肽的核苷酸序列。在一些情况下，第一核酸在第一表达载体中且第二核酸在第二表达载体中。在一些情况下，本公开提供了一种核酸，其包含：i)第一核苷酸序列，其编码如图14B所描绘且如SEQ ID NO:423中列出的2380多肽；和ii)第二核苷酸序列，其编码如图14J所描绘且如SEQ ID NO:486中列出的1715Δ多肽。在一些情况下，核酸在表达载体中。合适的表达载体如下所述。
重组表达载体
本公开提供包含本公开的核酸的重组表达载体。在一些情况下，重组表达载体为非病毒载体。在一些情况下，重组表达载体为病毒构建体，例如重组腺相关病毒构建体(参见，例如美国专利号7,078,387)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体、非整合病毒载体等。
适合的表达载体包括但不限于病毒载体(例如，基于以下的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:1088 1097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如Ali等人,HumGene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,InvestOpthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人,Hum Mol Genet 5:591 594,1996；Srivastava in WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；以及Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，例如Miyoshi等人,PNAS 94:1031923,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠类白血病病毒、脾坏死病毒及源自逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒的载体)；等等。
大量适合的表达载体为本领域技术人员所知，且许多表达载体为市售的。以下载体作为实例提供；对于真核宿主细胞：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG及pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可使用任何其他载体，只要其与宿主细胞相容。
取决于所利用的宿主/载体系统，在表达载体中可使用许多适合的转录及转译控制元件中的任一个，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见，例如Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
在一些情况下，编码DNA靶向RNA和/或定点修饰多肽的核苷酸序列可操作地连接至控制元件，例如转录控制元件，诸如启动子。转录控制元件可在真核细胞例如哺乳动物细胞；或原核细胞(例如细菌或古细菌细胞)中起作用。在一些情况下，编码DNA靶向RNA和/或定点修饰多肽的核苷酸序列可操作地连接至允许编码DNA靶向RNA和/或定点修饰多肽的核苷酸序列在原核细胞和真核细胞中表达的多个控制元件。
适合的真核细胞启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自以下的那些启动子：巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期及晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)及小鼠金属硫蛋白-I。适当载体及启动子的选择正处于一般本领域技术人员的水平内。表达载体还可含有用于转译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可包括用于扩增表达的适当序列。
基因修饰的宿主细胞
本公开提供一种基因修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞被本公开的核酸基因修饰。
适合的宿主细胞包括真核细胞，诸如酵母细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞。在一些情况下，宿主细胞为哺乳动物细胞系的细胞。适合的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。适合的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国模式培养物保藏中心(ATCC)号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC号CCL10)、PC12细胞(ATCC号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC号CCLI.3)、人胚胎肾(HEK)细胞(ATCC号CRL1573)、HLHepG2细胞等。
在一些情况下，宿主细胞为已被基因修饰使得其并未合成内源性MHCβ2-M的哺乳动物细胞。
在一些情况下，宿主细胞为已被基因修饰使得其并未合成内源性I类MHC重链的哺乳动物细胞。在一些情况下，宿主细胞为已被基因修饰使得其并未合成内源性MHCβ2-M且使得其并未合成内源性I类MHC重链的哺乳动物细胞。
组合物
本公开提供包含本公开的TMMP(synTac)的组合物，包括药物组合物。本公开提供包含TMMP的组合物，包括药物组合物。本公开提供包含本公开的核酸或重组表达载体的组合物，包括药物组合物。
包含多聚体多肽的组合物
除了本公开的TMMP以外，本公开的组合物还可包含以下中的一种或多种：盐，例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；缓冲剂，例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、2-(吗啉代)乙烷磺酸(MES)、2-(吗啉代)乙烷磺酸钠盐(MES)、3-(吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、N-三[羟乙基]甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)等；增溶剂；清洁剂，例如非离子性清洁剂，诸如Tween-20等；蛋白酶抑制剂；甘油；等等。
组合物可包含药学上可接受的赋形剂，多种赋形剂为本领域中已知的且不必在本文中详细论述。药学上可接受的赋形剂已充分描述于多个出版物中，包括例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”，第19版(1995)或最新版本,Mack PublishingCo；A.Gennaro(2000)"Remington:The Science and Practice of Pharmacy"，第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(1999)H.C.Ansel等人编，第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；及Handbook ofPharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编，第3版.Amer.PharmaceuticalAssoc。
药物组合物可包含TMMP及药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，本药物组合物将适用于向受试者施用，例如将为无菌的。例如，在一些情况下，本药物组合物将适用于向人受试者施用，例如其中组合物为无菌的且不含可检测的热原和/或其他毒素。
蛋白质组合物可包含其他组分，诸如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐等。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、盐酸盐、硫酸盐、溶剂合物(例如，混合型离子盐、水、有机物)、水合物(例如，水)等。
举例来说，组合物可包括水溶液、粉末形式、颗粒、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、混悬液、喷雾剂等。组合物可根据下文所述的各种施用途径配制。
在TMMP作为可注射物(例如，皮下、腹膜内、肌肉内和/或静脉内)直接施用于组织中时，制剂可以即用剂型或以非水性形式(例如，可复水的保存稳定的粉末)或水性形式(诸如，由药学上可接受的载剂和赋形剂构成的液体)提供。也可提供含蛋白质的制剂以便在施用后延长TMMP的血清半衰期。举例来说，TMMP可提供于脂质体制剂中，制备为胶体，或使用用于延长血清半衰期的其他常规技术。多种方法可用于制备脂质体，如例如Szoka等人1980Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467，美国专利号4,235,871、4,501,728及4,837,028中所述。制剂也可以受控释放或缓慢释放形式提供。
适用于胃肠外施用的制剂的其他实例包括等张无菌注射溶液、抗氧化剂、抑菌剂、及使制剂与预定接受者的血液等张的溶质、悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂及防腐剂。举例来说，本药物组合物可存在于容器，例如无菌容器，诸如注射器中。制剂可于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿及小瓶)中提供，且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，其仅需要在临使用前添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。临时注射溶液和混悬液可从无菌粉剂、颗粒及片剂制备。
TMMP在制剂中的浓度可广泛变化(例如，自小于约0.1重量％(通常为或至少约2重量％)至多达20重量％至50重量％或更大)且通常将主要基于流体体积、粘度及基于患者的因素，根据所选的特定施用模式及患者需求而选择。
本公开提供包含本公开的组合物(例如液体组合物)的容器。容器可为例如注射器、安瓿等。在一些情况下，容器为无菌的。在一些情况下，容器和组合物二者皆为无菌的。
本公开提供包含TMMP的组合物，包括药物组合物。组合物可包含：a)本公开的TMMP；和b)如上文所述的赋形剂。在一些情况下，赋形剂为药学上可接受的赋形剂。
在一些情况下，TMMP存在于液体组合物中。因此，本公开提供包含TMMP的组合物(例如液体组合物，包括药物组合物)。在一些情况下，本公开的组合物包含：a)本公开的TMMP；和b)盐水(例如，0.9％NaCl)。在一些情况下，组合物为无菌的。在一些情况下，组合物适用于向人受试者施用，例如其中组合物为无菌的且不含可检测的热原和/或其他毒素。因此，本公开提供一种组合物，其包含：a)本公开的TMMP；和b)盐水(例如，0.9％NaCl)，其中所述组合物为无菌的且不含可检测的热原和/或其他毒素。
包含核酸或重组表达载体的组合物
本公开提供包含本公开的核酸或重组表达载体的组合物，例如药物组合物。多种药学上可接受的赋形剂为本领域中已知且不必在本文中详细论述。药学上可接受的赋形剂已充分描述于多个出版物中，包括例如A.Gennaro(2000)"Remington:The Science andPractice of Pharmacy"，第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceut icalDosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人编，第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编，第3版.Amer.Pharmaceutical Assoc。
本公开的组合物可包括：a)一种或多种核酸或一种或多种重组表达载体，其包含编码TMMP的核苷酸序列；和b)以下中的一种或多种：缓冲剂、表面活性剂、抗氧化剂、亲水性聚合物、糊精、螯合剂、悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、抑菌剂、润湿剂及防腐剂。适合的缓冲剂包括但不限于(诸如N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(BIS-Tris)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'3-丙烷磺酸(EPPS或HEPPS)、双甘氨肽、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)、3-(吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N'-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、碳酸氢钠、3-(N-三(羟甲基)-甲基-氨基)-2-羟基-丙烷磺酸)TAPSO、(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES)、N-三(羟甲基)甲基-甘氨酸(Tricine)、三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)等)。适合的盐包括例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等。
本公开的药物制剂可包括约0.001％至约90％(w/w)的量的本公开的核酸或重组表达载体。在制剂的以下描述中，“本核酸或重组表达载体”应理解为包括本公开的核酸或重组表达载体。举例来说，在一些情况下，本制剂包含本公开的核酸或重组表达载体。
本核酸或重组表达载体可与其他化合物或化合物混合物掺合，以其他化合物或化合物混合物包封，与其他化合物或化合物混合物缀合，或以其他方式与其他化合物或化合物混合物缔合；此类化合物可包括例如脂质体或受体靶向分子。本核酸或重组表达载体可与帮助摄取、分布和/或吸收的一种或多种组分一起组合于制剂中。
本核酸或重组表达载体组合物可被配制成许多可能剂型中的任一个，诸如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂及灌肠剂。本核酸或重组表达载体组合物亦可被配制成水性、非水性或混合介质中的混悬液。水性混悬液可进一步含有增加混悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。混悬液还可含有稳定剂。
包含本核酸或重组表达载体的制剂可为脂质体制剂。如本文所用，术语“脂质体”意指由以一个或多个球形双层排列的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体为单层或多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜及含有待递送的组合物的水性内腔。阳性脂质体为带正电脂质体，其可与带负电DNA分子相互作用以形成稳定复合物。据信pH敏感性或带负电之脂质体截留DNA，而非与其复合。阳离子和非阳离子脂质体皆可用于递送本核酸或重组表达载体。
脂质体还包括“空间上稳定的”脂质体，如本文所用，该术语是指包含一种或多种特化脂质的脂质体，所述特化脂质当并入脂质体中时导致其循环寿命相对于缺乏此类特化脂质的脂质体有所增加。空间上稳定的脂质体的实例为如下的那些，其中脂质体之囊泡形成脂质的一部分包含一种或多种醣脂或以一种或多种亲水性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)部分衍生化。脂质体及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中，其以引用方式整体并入本文。
制剂和组合物还可包括表面活性剂。表面活性剂于药物产品、制剂及乳液中的用途为本领域中所公知。表面活性剂及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中。
在一实施方案中，包括各种渗透增强剂以实现核酸的有效递送。除了帮助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜以外，渗透增强剂还增强亲脂性药物的渗透性。渗透增强剂可被分类为属五大类别之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂及非螯合非表面活性剂。渗透增强剂及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中，其以引用方式整体并入本文。
用于经口施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒、微粒、纳米微粒、水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小药囊、片剂或微型片剂。可期望增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。适合的口服制剂包含如下的那些，其中本反义核酸与渗透增强剂表面活性剂及螯合剂中的一种或多种一起施用。适合的表面活性剂包括但不限于脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。适合的胆酸/盐和脂肪酸及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中。渗透增强剂，例如脂肪酸/盐与胆酸/盐组合的组合也为适合的。示例性适合组合为月桂酸、癸酸及UDCA的钠盐。其他渗透增强剂包括但不限于聚氧乙烯-9-月桂基醚及聚氧乙烯-20-十六烷基醚。适合的渗透增强剂还包括丙二醇、二甲亚砜、三乙醇胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、2-吡咯啶酮及其衍生物、四氢糠醇及AZONETM。
调节T细胞活性的方法本公开提供一种选择性调节表位特异性T细胞的活性的方法，所述方法包括使T细胞与本公开的TMMP接触，其中使T细胞与TMMP接触选择性调节表位特异性T细胞的活性。在一些情况下，所述接触在体外发生。在一些情况下，所述接触在体内发生。在一些情况下，所述接触离体发生。
在一些情况下，例如，在靶T细胞为CD8+T细胞时，TMMP包含I类MHC多肽(例如，β2-微球蛋白和I类MHC重链)。
在TMMP包括作为活化多肽的免疫调节多肽时，T细胞与TMMP的接触激活表位特异性T细胞。在一些情况下，表位特异性T细胞为对存在于癌细胞上的表位有特异性的T细胞，且表位特异性T细胞与TMMP的接触提高T细胞对癌细胞的细胞毒性活性。在一些情况下，表位特异性T细胞为对存在于癌细胞上的表位有特异性的T细胞，且表位特异性T细胞与TMMP的接触增加表位特异性T细胞的数目。
在一些情况下，表位特异性T细胞为对存在于病毒感染细胞上的表位有特异性的T细胞，且表位特异性T细胞与TMMP的接触提高T细胞对病毒感染细胞的细胞毒性活性。在一些情况下，表位特异性T细胞为对存在于病毒感染细胞上的表位有特异性的T细胞，且表位特异性T细胞与TMMP的接触增加表位特异性T细胞的数目。
在TMMP包括作为抑制性多肽的免疫调节多肽时，T细胞与TMMP的接触抑制表位特异性T细胞。在一些情况下，表位特异性T细胞为对存在于自体抗原上的表位有特异性的自身反应性T细胞，且所述接触减少自身反应性T细胞的数目。
本公开提供一种调节个体中的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的TMMP。施用TMMP诱导表位特异性T细胞反应(例如，WT-1表位特异性T-细胞反应)和表位非特异性T细胞反应，其中表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少5:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少10:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少25:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少50:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少100:1。在一些情况下，个体为人。在一些情况下，所述调节增加对癌细胞(例如表达WT-1的癌细胞)的细胞毒性T细胞反应。在一些情况下，所述施用为静脉内、皮下、肌肉内、全身性、淋巴管内、治疗部位远端、局部或治疗部位处或附近的施用。
本公开提供一种选择性递送共刺激(即，免疫调节)多肽至靶T细胞的方法，所述方法包括使混合T细胞群与本公开的TMMP接触，其中所述混合T细胞群包含靶T细胞和非靶T细胞，其中靶T细胞对存在于TMMP内的表位有特异性(例如，其中靶T细胞对存在于TMMP内的WT-1表位有特异性)，且其中所述接触步骤递送存在于TMMP内的一种或多种共刺激多肽(免疫调节多肽)至靶T细胞。在一些情况下，所述T细胞群在体外。在一些情况下，所述T细胞群在个体体内。在一些情况下，所述方法包括向个体施用TMMP。在一些情况下，T细胞为细胞毒性T细胞。在一些情况下，混合的T细胞群是从个体获得的体外混合的T细胞群，且接触步骤导致靶T细胞的活化和/或增殖，从而生成活化和/或增殖的靶T细胞群；在这些情况的一些下，所述方法进一步包括向个体施用活化和/或增殖的靶T细胞群。
本公开提供一种检测从个体获得的混合T细胞群中结合目标表位(例如，WT-1表位)的靶T细胞的存在的方法，所述方法包括：a)使混合T细胞群与TMMP在体外接触，其中TMMP包含目标表位(例如，WT-1表位)；及b)检测T细胞响应于所述接触的活化和/或增殖，其中活化和/或增殖的T细胞指示靶T细胞的存在。
治疗方法本公开提供一种治疗个体的方法，所述方法包括向个体施用有效治疗个体的量的本公开的TMMP或一种或多种编码TMMP的核酸。还提供了用于治疗人体或动物体的方法中的TMMP。在一些情况下，本公开的治疗方法包括向有此需要的个体施用包含编码TMMP的核苷酸序列的一种或多种重组表达载体。在一些情况下，本公开的治疗方法包括向有此需要的个体施用包含编码TMMP的核苷酸序列的一种或多种mRNA分子。在一些情况下，本公开的治疗方法包括向有需要的个体施用本公开的TMMP。可治疗的病状包括例如如下文所述的癌症和自身免疫性病症。
在一些情况下，TMMP当向有需要的个体施用时诱导表位特异性T细胞反应及表位非特异性T细胞反应。换句话说，在一些情况下，TMMP当向有需要的个体施用时通过调节第一T细胞的活性来诱导表位特异性T细胞反应，所述第一T细胞呈现出：i)对存在于TMMP中的表位有特异性的TCR；ii)结合至存在于TMMP中的免疫调节多肽的共免疫调节多肽；且通过调节第二T细胞的活性来诱导表位非特异性T细胞反应，所述第二T细胞呈现出：i)对除了存在于TMMP中的表位以外的表位有特异性的TCR；及ii)结合至存在于TMMP中的免疫调节多肽的共免疫调节多肽。表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、或至少100:1。表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为约2:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约15:1、约15:1至约20:1、约20:1至约25:1、约25:1至约50:1、或约50:1至约100:1、或大于100:1。“调节T细胞的活性”可包括以下各项中的一个或多个：i)激活细胞毒性(例如CD8+)T细胞；ii)诱导细胞毒性(例如CD8+)T细胞的细胞毒性活性；iii)诱导细胞毒性(例如CD8+)T细胞对细胞毒素(例如穿孔蛋白；颗粒酶；粒溶蛋白)的产生及释放；iv)抑制自身反应性T细胞的活性；等等。
MOD对其同源co-MOD的减小的亲和力与表位对TCR的亲和力的组合提供了本公开的TMMP的提高的选择性。因此，举例来说，TMMP与其结合至第二T细胞的亲合力相比以更高亲合力结合至第一T细胞，所述第一T细胞呈现出：i)对存在于TMMP中的表位具有特异性的TCR；及ii)结合至存在于TMMP中的免疫调节多肽的共免疫调节多肽，所述第二T细胞呈现出：i)对除了存在于TMMP中的表位以外的表位具有特异性的TCR；及ii)结合至存在于TMMP中的免疫调节多肽的co-MOD。
本公开提供一种选择性调节个体中表位特异性T细胞的活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的TMMP或一种或多种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸(例如，表达载体；mRNA；等)，其中TMMP选择性调节个体中表位特异性T细胞的活性。选择性调节表位特异性T细胞的活性可以治疗个体的疾病或病症。因此，本公开提供一种治疗方法，其包括向此有需要的个体施用有效量的TMMP。
在一些情况下，MOD为活化多肽，且TMMP激活表位特异性T细胞。在一些情况下，表位为癌症相关表位，且TMMP提高对于癌症相关表位有特异性的T细胞的活性。在一些情况下，MOD为活化多肽，且TMMP激活WT-1表位特异性T细胞。在一些情况下，T细胞为T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、或NK-T-细胞。在一些情况下，表位为WT-1表位，且TMMP提高对表达WT-1表位的癌细胞有特异性的T细胞(例如，T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)和/或NK-T-细胞)的活性。CD4+T细胞的活化可包括增加CD4+T细胞的增殖和/或诱导或增加由CD4+T细胞释放的细胞因子。NK-T细胞和/或CD8+细胞的活化可包括：增加NK-T-细胞和/或CD8+细胞的增殖；和/或诱导由NK-T-细胞和/或CD8+细胞释放细胞因子诸如干扰素γ。在一些情况下，本公开的TMMP减少调节性T(Treg)细胞的增殖和/或活性。Treg为FoxP3+、CD4+T细胞。在一些情况下，例如，在本公开的TMMP包含抑制性免疫调节多肽(例如，PD-L1、FasL等)时，TMMP减少Treg的增殖和/或活性。
在一些情况下，MOD为活化多肽，且TMMP激活表位特异性T细胞。在一些情况下，表位为癌症相关表位，且TMMP提高对于癌症相关表位有特异性的T细胞的活性。
在TMMP包含WT-1肽表位时，可向患有表达WT-1的癌症的个体施用TMMP。表达WT1的癌症包括白血病、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞肿瘤、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌、肝癌、肾癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肉瘤、肝细胞癌、威尔姆氏瘤、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常症候群(MDS)、非小细胞肺癌(NSCLC)、骨髓瘤、胰腺癌、结肠直肠癌、间皮瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤及肾母细胞瘤。
在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的急性骨髓性白血病(AML)。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的骨髓瘤。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的卵巢癌。在本公开的TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的胰腺癌。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的非小细胞肺癌(NSCLC)。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的结肠直肠癌(CRC)。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的乳腺癌。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的威尔姆氏瘤。在本公开的TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的间皮瘤。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的软组织肉瘤。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的成神经细胞瘤。在TMMP包含WT-1肽表位时，可向有此需要的个体施用TMMP以治疗个体的肾母细胞瘤。
本公开提供一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本公开的TMMP或一种或多种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸(例如，表达载体；mRNA；等)，其中TMMP包含作为癌症表位的T细胞表位，且其中TMMP包含刺激性MOD。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减少个体中癌细胞的数目至不可检测水平的量。举例来说，在一些情况下，本公开的TMMP的“有效量”为以下的量：当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时，与在施用TMMP之前或在未以TMMP施用时个体中癌细胞的数目相比使个体中癌细胞的数目减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减少个体中癌细胞的数目至不可检测水平的量。
在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减少个体中的肿瘤质量的量。举例来说，在一些情况下，TMMP的“有效量”为以下的量：当以一个或多个剂量向有此需要的个体(患有肿瘤之个体)施用时，与在施用TMMP之前或在未以TMMP施用时个体中的肿瘤质量相比使个体中的肿瘤质量减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体(患有肿瘤的个体)施用时减小个体中的肿瘤体积的量。举例来说，在一些情况下，TMMP的“有效量”为以下的量：当以一个或多个剂量向有需要的个体(患有肿瘤的个体)施用时，与在施用TMMP之前或在未以TMMP施用时个体中的肿瘤体积相比使个体中的肿瘤体积减小至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时增加个体的生存时间的量。举例来说，在一些情况下，TMMP的“有效量”为以下的量：当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，与在未以TMMP施用时个体的预期生存时间相比使个体的生存时间增加至少1个月、至少2个月、至少3个月、3个月至6个月、6个月至1年、1年至2年、2年至5年、5年至10年或大于10年。
在一些情况下，TMMP的“有效量”为以下的量：当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时，作为单一疗法或作为如下所讨论的组合疗法的一部分(例如，作为与免疫检查点抑制剂的组合疗法的一部分)减少个体的整体肿瘤负荷，即体内癌症的量，或者使患者的总肿瘤负荷在足够长的时间内保持相对稳定，以使患者具有由标准RECIST标准所确定的确认的“疾病稳定”参见，例如Aykan和
(2020)World J.Clin.Oncol.11:53。
在一些情况下，TMMP的有效量为以下的量：当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时，作为单一疗法或作为如下所讨论的(例如，与免疫检查点抑制剂的)组合疗法的一部分使肿瘤大小减小了足够的量，并且在足够长的时间内使患者具有由标准RECIST标准所确定的确认的“部分反应”。
在一些情况下，TMMP的有效量为以下的量：当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时，作为单一疗法或作为(例如，与免疫检查点抑制剂的)组合疗法的一部分使肿瘤大小减小了足够的量，并且在足够长的时间内使患者具有由标准RECIST标准所确定的确认的“完全反应”。
在一些情况下，表位特异性T细胞为对存在于病毒感染细胞上的表位有特异性的T细胞，且表位特异性T细胞与TMMP的接触提高T细胞对病毒感染细胞的细胞毒性活性。在一些情况下，表位特异性T细胞为对存在于病毒感染细胞上的表位有特异性的T细胞，且表位特异性T细胞与TMMP的接触增加表位特异性T细胞的数目。
因此，本公开提供一种治疗个体的病毒感染的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的TMMP或一种或多种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含作为病毒表位的T细胞表位，且其中TMMP包含刺激性MOD。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减少个体中病毒感染细胞的数目的量。举例来说，在一些情况下，TMMP的“有效量”为以下的量：当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时，与在施用TMMP之前或在未以TMMP施用时个体中病毒感染细胞的数目相比使个体中病毒感染细胞的数目减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减少个体中病毒感染细胞的数目至不可检测水平的量。
因此，本公开提供一种治疗个体的感染的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的TMMP或一种或多种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含作为病原体相关表位的T细胞表位，且其中TMMP包含刺激性免疫调节多肽。在一些情况下，本公开的TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减少个体中病原体的数目的量。举例来说，在一些情况下，TMMP的“有效量”为以下的量：当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时，与在施用TMMP之前或在未以TMMP施用时个体中病原体的数目相比使个体中病原体的数目减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减少个体中病原体的数目至不可检测水平的量。病原体包括病毒、细菌、原虫等。
在一些情况下，MOD为抑制性多肽，且TMMP抑制表位特异性T细胞的活性。在一些情况下，表位为自身表位，且TMMP选择性抑制对自身表位有特异性的T细胞的活性。
本公开提供一种治疗个体的自身免疫性病症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的TMMP或一种或多种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含作为自身表位的T细胞表位，且其中TMMP包含抑制性MOD。在一些情况下，TMMP的“有效量”为以下的量：当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时，与在施用TMMP之前或在未以TMMP施用时个体中自身反应性T细胞的数目相比使个体中自身反应性T细胞的数目减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减少个体中Th2细胞因子的产生的量。在一些情况下，TMMP的“有效量”为当以一个或多个剂量向有此需要的个体施用时减轻个体中的一种或多种与自体免疫疾病相关的症状的量。
如上文所述，在一些情况下，在进行本治疗方法时，作为TMMP本身向有此需要的个体施用TMMP。在其他情况下，在进行本治疗方法时，向有此需要的个体施用一种或多种包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸。因此，在其他情况下，向有此需要的个体施用本公开的一种或多种核酸，例如，本公开的一种或多种重组表达载体。
制剂
适合的制剂在上文中描述，其中适合的制剂包括药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，适合的制剂包含：a)TMMP；和b)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，适合的制剂包含：a)包含编码TMMP的核苷酸序列的核酸；和b)药学上可接受的赋形剂；在一些情况下，核酸为mRNA。在一些情况下，适合的制剂包含：a)第一核酸，所述第一核酸包含编码TMMP的第一多肽的核苷酸序列；b)第二核酸，所述第二核酸包含编码TMMP的第二多肽的核苷酸序列；及c)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，适合的制剂包含：a)包含编码TMMP的核苷酸序列的重组表达载体；和b)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，适合的制剂包含：a)第一重组表达载体，其包含编码TMMP的第一多肽的核苷酸序列；b)第二重组表达载体，其包含编码TMMP的第二多肽的核苷酸序列；及c)药学上可接受的赋形剂。
适合的药学上可接受的赋形剂在上文中所述。
剂量
适合的剂量可由主治医师或其他合格医务人员基于各种临床因素来确定。如医学技术中所公知，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、身体表面积、年龄、待施用的特定多肽或核酸、患者的性别、施用时间和途径、一般健康状况及同时施用的其他药物。本公开的TMMP可施用的量介于1ng/kg体重与20mg/kg体重/剂量之间，例如在0.1mg/kg体重至10mg/kg体重之间，例如在0.5mg/kg体重至5mg/kg体重之间；然而，设想低于或高于此示例性范围之剂量，特别是考虑到上述因素。如果方案为连续输注，则其也可处于1μg至10mg/kg体重/min的范围内。本公开的TMMP可施用的量为约1mg/kg体重至50mg/kg体重，例如约1mg/kg体重至约5mg/kg体重、约5mg/kg体重至约10mg/kg体重、约10mg/kg体重至约15mg/kg体重、约15mg/kg体重至约20mg/kg体重、约20mg/kg体重至约25mg/kg体重、约25mg/kg体重至约30mg/kg体重、约30mg/kg体重至约35mg/kg体重、约35mg/kg体重至约40mg/kg体重、或约40mg/kg体重至约50mg/kg体重。
在一些情况下，TMMP的适合剂量为0.01μg至100g/kg体重、0.1μg至10g/kg体重、1μg至1g/kg体重、10μg至100mg/kg体重、100μg至10mg/kg体重、或100μg至1mg/kg体重。一般本领域技术人员可容易基于所测量的滞留时间及所施用的剂在体液或组织中的浓度来估计给药的重复率。在成功治疗之后，可能期望使患者经历维持疗法以预防疾病状态的复发，其中TMMP的所施用的维持剂量的范围为0.01μg至100g/kg体重、0.1μg至10g/kg体重、1μg至1g/kg体重、10μg至100mg/kg体重、100μg至10mg/kg体重、或100μg至1mg/kg体重。
本领域技术人员将易于了解，剂量水平可随特定TMMP、症状严重程度和受试者对副作用的易感性而变化。给定化合物的优选剂量可易于由本领域技术人员通过多种方式确定。
在一些情况下，施用多个剂量的TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体。TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体的施用频率可根据多种因素中的任一种而变化，这些因素为例如症状的严重性等。举例来说，在一些情况下，TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周一次(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天一次(qod)、每天一次(qd)、每天两次(qid)、或每天三次(tid)施用。
TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体的施用持续时间，例如施用TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体的时间段，可根据多种因素中的任一种而变化，这些因素为例如患者反应等。举例来说，TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体可施用的时间段的范围为约一天至约一周、约两周至约四周、约一个月至约两个月、约两个月至约四个月、约四个月至约六个月、约六个月至约八个月、约八个月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年、或更长时间。
施用途径
活性剂(本公开的TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体)是使用任何可用的方法及适用于药物递送的途径(包括体内和离体方法以及全身性及局部施用途径)向个体施用。
常规及药学上可接受的施用途径包括肿瘤内、肿瘤周围、肌肉内、淋巴管内、气管内、颅内、皮下、皮内、局部施用、静脉内、动脉内、经直肠、经鼻、经口以及其他经肠及胃肠外施用途径。施用途径在需要时可被组合或根据TMMP和/或所要效果而调整。TMMP或本公开的核酸或重组表达载体可以单一剂量或以多个剂量施用。
在一些情况下，静脉内施用TMMP、核酸、或重组表达载体。在一些情况下，肌肉内施用本公开的TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体。在一些情况下，淋巴管内施用TMMP、核酸、或重组表达载体。在一些情况下，局部施用TMMP、核酸、或重组表达载体。在一些情况下，肿瘤内施用TMMP、核酸、或重组表达载体。在一些情况下，肿瘤周围施用TMMP、核酸、或重组表达载体。在一些情况下，颅内施用TMMP、核酸、或重组表达载体。在一些情况下，皮下施用TMMP、核酸、或重组表达载体。
在一些情况下，静脉内施用TMMP。在一些情况下，肌肉内施用TMMP。在一些情况下，局部施用TMMP。在一些情况下，肿瘤内施用TMMP。在一些情况下，肿瘤周围施用TMMP。在一些情况下，颅内施用TMMP。在一些情况下，皮下施用TMMP。在一些情况下，淋巴管内施用TMMP。
TMMP、核酸、或重组表达载体可使用任何可用的常规方法及适用于递送常规药物的途径(包括全身性或局部途径)向宿主施用。一般而言，预期用于本公开的方法中的施用途径包括但不一定限于经肠、胃肠外及吸入途径。
除了吸入施用以外的胃肠外施用途径包括但不一定限于局部、经皮、皮下、肌肉内、眼眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、肿瘤内、淋巴管内、肿瘤周围及静脉内途径，即除通过消化道以外的任何施用途径。可进行胃肠外施用以实现本公开的TMMP、本公开的核酸、或本公开的重组表达载体的全身性或局部递送。在需要全身性递送时，递送通常涉及药物制剂的侵袭性或全身性吸附性局部或粘膜施用。
组合疗法
在一些情况下，本公开的用于治疗个体的癌症的方法包括：a)施用TMMP；和b)施用至少一种额外治疗剂或治疗性治疗。适合的额外治疗剂包括但不限于小分子癌症化学治疗剂和免疫检查点抑制剂。适合的额外治疗性治疗包括例如辐射、手术(例如，手术切除肿瘤)等。
本公开的治疗方法可包括共施用TMMP和至少一种额外治疗剂。“共施用”意指向个体施用TMMP和至少一种额外治疗剂两者，但不一定在同一时间施用，以便实现治疗作用，该治疗作用为已施用TMMP和至少一种额外治疗剂的结果。TMMP及至少一种额外治疗剂的施用可为大体上同时的，例如，可在施用至少一种额外治疗剂的约1分钟至约24小时内(例如，在约1分钟内、在约5分钟内、在约15分钟内、在约30分钟内、在约1小时内、在约4小时内、在约8小时内、在约12小时内、或在约24小时内)向个体施用TMMP。在一些情况下，向正经历使用至少一种额外治疗剂的治疗或已经历使用至少一种额外治疗剂的治疗的个体施用本公开的TMMP。TMMP的施用可在不同时间和/或以不同频率发生。
作为一个实例，本公开的治疗方法可包含共施用TMMP和免疫检查点抑制剂，诸如对免疫检查点有特异性的抗体。“共施用”意指向个体施用TMMP和免疫检查点抑制剂(例如，对免疫检查点多肽有特异性的抗体)两者，但不一定在同一时间施用，以便实现治疗作用，该治疗作用为已施用TMMP和免疫检查点抑制剂(例如，对免疫检查点多肽有特异性的抗体)的结果。TMMP和免疫检查点抑制剂(例如，对免疫检查点多肽有特异性的抗体)的施用可为大体上同时的，例如，可在施用免疫检查点抑制剂(例如，对免疫检查点多肽有特异性的抗体)的约1分钟至约24小时内(例如，在约1分钟内、在约5分钟内、在约15分钟内、在约30分钟内、在约1小时内、在约4小时内、在约8小时内、在约12小时内、或在约24小时内)向个体施用TMMP。在一些情况下，向正经历使用免疫检查点抑制剂(例如，对免疫检查点多肽有特异性的抗体)的治疗或已经历使用该免疫检查点抑制剂的治疗的个体施用本公开的TMMP。TMMP和免疫检查点抑制剂(例如，对免疫检查点多肽有特异性的抗体)的施用可在不同时间和/或以不同频率发生。
示例性免疫检查点抑制剂包括靶向以下免疫检查点多肽的抑制剂：诸如CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137(也称为4-1BB)、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。在一些情况下，免疫检查点多肽为选自以下的刺激性检查点分子：CD27、CD28、CD40、ICOS、OX40、GITR、CD122及CD137。在一些情况下，免疫检查点多肽为选自以下的抑制性检查点分子：A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM3、CD96、TIGIT及VISTA。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂为对免疫检查点多肽有特异性的抗体。在一些情况下，抗免疫检查点抗体为单克隆抗体。在一些情况下，抗免疫检查点抗体被人源化或去人源化，使得抗体大体上未在人中引发免疫反应。在一些情况下，抗免疫检查点抗体为人源化单克隆抗体。在一些情况下，抗免疫检查点抗体为去人源化单克隆抗体。在一些情况下，抗免疫检查点抗体为全人单克隆抗体。在一些情况下，抗免疫检查点抗体抑制免疫检查点多肽与免疫检查点多肽的配体的结合。在一些情况下，抗免疫检查点抗体抑制免疫检查点多肽与免疫检查点多肽的受体的结合。
适合的抗免疫检查点抗体包括但不限于纳武单抗(nivolumab)(Bristol-MyersSquibb)、派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)、披地单抗(pidilizumab)(Curetech)、AMP-224(GlaxoSmithKline/Amplimmune)、MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Medarex,Inc./Bristol Myer Squibb)、MEDI-4736(Medimmune/AstraZeneca)、阿维鲁单抗(arelumab)(Merck Serono)、伊匹珠单抗(ipilimumab)(YERVOY,(Bristol-Myers Squib b)、曲利木单抗(tremelimumab)(Pfizer)、披地单抗(CureTech,Ltd.)、IMP321(Immutep S.A.)、MGA271(Macrogenics)、BMS-986016(Bristol-Meyers Squibb)、利鲁单抗(lirilumab)(Bristol-Myers Squibb)、乌瑞鲁单抗(urelumab)(Bristol-Meyers Squibb)、PF-05082566(Pfizer)、IPH2101(Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb)、MEDI-6469(MedIm mune/AZ)、CP-870,893(Genentech)、莫木利珠单抗(Mogamulizumab)(Kyowa Hakko Kirin)、瓦利鲁单抗(Varlilumab)(CelIDex Therapeutics)、阿维单抗(Avelumab)(EMD Serono)、加利昔单抗(Galiximab)(Biogen Idec)、AMP-514(Amplimmune/AZ)、AUNP 12(Aurigene及Pierre Fabre)、伊多莫德(Indoximod)(NewLink Genetics)、NLG-919(NewLinkGenetics)、INCB024360(Incyte)；KN035；及其组合。举例来说，在一些情况下，免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。适合的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗、派姆单抗(也称为MK-3475)、披地单抗、SHR-1210、PDR001及AMP-224。在一些情况下，抗PD-1单克隆抗体为纳武单抗、派姆单抗或PDR001。适合的抗PD1抗体描述于美国专利公布第2017/0044259号中。关于披地单抗，参见，例如Rosenblatt等人(2011)J.Immunother.34:409-18。在一些情况下，免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体。在一些情况下，抗CTLA-4抗体为伊匹珠单抗或曲利木单抗。关于曲利木单抗，参见，例如Ribas等人(2013)J.Clin.Oncol.31:616-22。在一些情况下，免疫检查点抑制剂为抗PD-L1抗体。在一些情况下，抗PD-L1单克隆抗体为BMS-935559、MEDI4736、MPDL3280A(也称为RG7446)、KN035或MSB0010718C。在一些实施方案中，抗PD-L1单克隆抗体为MPDL3280A(阿特珠单抗)或MEDI4736(德瓦鲁单抗)。关于德瓦鲁单抗，参见，例如WO2011/066389。关于阿特珠单抗，参见，例如美国专利号8,217,149。
适于治疗的受试者
适于以本公开的方法进行治疗的受试者包括患有癌症的个体，包括已被诊断为患有癌症的个体、已对癌症进行治疗但未能响应于该治疗的个体、及已对癌症进行治疗且最初响应于该治疗但随后变成该治疗难治的个体。适于以本公开的方法进行治疗的受试者包括患有感染(例如，病原体诸如细菌、病毒、原虫等的感染)的个体，包括已被诊断为患有感染的个体和已对感染进行治疗但未能响应于该治疗的个体。适于以本公开的方法进行治疗的受试者包括患有细菌感染的个体，包括已被诊断为患有细菌感染的个体和已对细菌感染进行治疗但未能响应于该治疗的个体。适于以本公开的方法进行治疗的受试者包括患有病毒感染的个体，包括已被诊断为患有病毒感染的个体和已对病毒感染进行治疗但未能响应于该治疗的个体。适于以本公开的方法进行治疗的受试者包括患有自体免疫疾病的个体，包括已被诊断为患有自体免疫疾病的个体和已对自体免疫疾病进行治疗但未能响应于该治疗的个体。
本公开的非限制性方面的实例
方面组A
上文所述的本发明主题的方面(包括实施方案)单独或在与一个或多个其他方面或实施方案组合时可为有益的。不限于以上描述，下文提供本公开的编号1-95的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开的后将显而易知，可使用个别编号的方面中的各者或将其与前述或以下个别编号的方面中的任一个组合。此旨在提供全部此等方面组合的支持且不限于下文明确提供的方面的组合：
方面1.一种T细胞调节多聚体多肽，其包含：至少一种异二聚体，所述异二聚体包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)威尔姆氏瘤-1(WT-1)肽表位；及ii)第一主要组织相容性复合物(MHC)多肽；b)第二多肽，所述第二多肽包含第二MHC多肽；及c)至少一种免疫调节多肽，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含所述免疫调节多肽。
方面2.如方面1的T细胞调节多聚体多肽，其中一个或多个免疫调节结构域中的至少一个为变体免疫调节多肽，其呈现出对同源共免疫调节多肽的亲和力与相应野生型免疫调节多肽对所述同源共免疫调节多肽的亲和力相比有所减小，且其中所述表位以至少10-7M的亲和力结合至T细胞上的T细胞受体(TCR)，使得：i)所述T细胞调节多聚体多肽结合至第一T细胞的亲和力比所述T细胞调节多聚体多肽结合第二T细胞的亲和力高至少25％，其中所述第一T细胞在其表面上表达所述同源共免疫调节多肽及以至少10-7M的亲和力结合所述表位的TCR，且其中所述第二T细胞在其表面上表达所述同源共免疫调节多肽，但在其表面上不表达以至少10-7M的亲和力结合所述表位的TCR；且/或ii)当通过生物层干涉术测量时，对照T细胞调节多聚体多肽与同源共免疫调节多肽的结合亲和力与包含野生型免疫调节多肽变体的所述T细胞调节多聚体多肽与所述同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率范围为1.5:1至106:1，其中所述对照包含所述野生型免疫调节多肽。
方面3.如方面2的T细胞调节多聚体多肽，其中：a)所述T细胞调节多聚体多肽结合至所述第一T细胞的亲和力比其结合所述第二T细胞的亲和力高至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍；且/或b)所述变体免疫调节多肽结合所述共免疫调节多肽的亲和力为约10- 4M至约10-7M、约10-4M至约10-6M、约10-4M至约10-5M；且/或c)其中当通过生物层干涉术测量时，对照T细胞调节多聚体多肽与同源共免疫调节多肽的结合亲和力与包含野生型免疫调节多肽的变体的所述T细胞调节多聚体多肽与所述同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率为至少10:1、至少50:1、至少102:1或至少103:1，其中所述对照包含所述野生型免疫调节多肽。
方面4.如方面1-3中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一多肽或所述第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
方面5.如方面4的T细胞调节多聚体多肽，其中所述Ig Fc多肽为IgG1Fc多肽。
方面6.如方面5的T细胞调节多聚体多肽，其中IgG1Fc多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：N297A、L234A、L235A、L234F、L235E及P331S。
方面7.如方面1-6中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中：a1)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述WT-1肽表位；ii)所述第一MHC多肽；及iii)至少一种免疫调节多肽；且b2)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述第二MHC多肽；及ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或a2)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述WT-1肽表位；及ii)所述第一MHC多肽；且b2)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)至少一种免疫调节多肽；ii)所述第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽；或a3)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述WT-1肽表位；及ii)所述第一MHC多肽；且b3)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述第二MHC多肽；及ii)Ig Fc多肽；及iii)至少一种免疫调节多肽；或a4)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述WT-1肽表位；及ii)所述第一MHC多肽；且b4)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述第二MHC多肽；及ii)至少一种免疫调节多肽；或a5)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述WT-1肽表位；及ii)所述第一MHC多肽；且b5)第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)至少一种免疫调节多肽；及ii)所述第二MHC多肽；或a6)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)所述WT-1肽表位；ii)所述第一MHC多肽；及iii)至少一种免疫调节多肽；且b6)所述第二多肽包含：i)所述第二MHC多肽。
方面8.如方面1-7中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一多肽包含介于所述WT-1表位与所述第一MHC多肽之间的肽接头且/或其中所述第二多肽包含介于所述免疫调节多肽与所述第二MHC多肽之间的肽接头。
方面9.如方面8的T细胞调节多聚体多肽，其中所述肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:284)，其中n为1至10的整数。
方面10.如方面1-9中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2-微球蛋白多肽；且其中所述第二MHC多肽为I类MHC重链多肽。
方面11.如方面1-10中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽选自由以下组成的组：细胞因子(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽等；且包括全部家族成员，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80和CD86也分别称为B7-1和B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受体多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、及其组合。
方面12.如方面1-11中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽为IL-2多肽。
方面13.如方面1-12中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含至少两种免疫调节多肽，且其中这些免疫调节多肽中的至少两个是相同的。
方面14.如方面13的T细胞调节多聚体多肽，其中所述两种或更多种免疫调节多肽是串联的。
方面15.如方面1-14中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一多肽与所述第二多肽彼此共价连接。
方面16.如方面15的T细胞调节多聚体多肽，其中所述共价键是经由二硫键。
方面17.如方面1-16中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽或介于所述表位与所述第一MHC多肽之间的接头包含提供第一Cys残基的氨基酸取代，其中所述第二MHC多肽包含提供第二Cys残基的氨基酸取代，且其中所述二硫键联在所述第一Cys残基与所述第二Cys残基之间。
方面18.如方面1-17中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽表位具有的长度为约4个氨基酸至约25个氨基酸。
方面19.如方面1-18中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽表位包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：NLMNLGATL(SEQ ID NO:258)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO:225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO:227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO:229)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO:230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:232)、MNLGATLK(SEQ ID NO:233)、MTWNYMNLGATLKGV SEQ IDNO:234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:238)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO:239)、GALRNPTAL(SEQ ID NO:240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO:241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO:242)、RYRPHPGAL(SEQ ID NO:243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO:244)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO:245)、RIRPHPGAL(SEQ ID NO:246)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO:247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO:248)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO:249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ IDNO:250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO:252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO:253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO:254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO:255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO:257)、NLMNLGATL(SEQID NO:258)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)、CMTWNQMN(SEQ IDNO:261)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)、YMFPNAPYL(SEQ IDNO:264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO:265)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO:266)及NQMNLGATL(SEQ IDNO:267)。
方面20.如方面1-18中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽包含氨基酸序列CMTWNQMNL(SEQ ID NO:266)或CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)。
方面21.如方面1-20中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽或所述第二MHC多肽包含：a)与图9A中描绘的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或b)与图10A中描绘的HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或c)与图11A中描绘的HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面22.如方面1-20中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A*2402多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面23.如方面1-20中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽为HLA-A*1101多肽。
方面24.如方面1-20中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A*3303多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面25.如方面1-20中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面26.如方面21-25中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述MHC重链多肽包含在位置236处的Cys。
方面27.如方面21-26中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述β2M多肽包含在位置12处的Cys。
方面28.如方面1-27中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述免疫调节多肽为包含以下的变体IL-2多肽：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
方面29.如方面4-28中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含第一异二聚体和第二异二聚体，且其中所述第一异二聚体与所述第二异二聚体通过所述第一异二聚体与所述第二异二聚体的Ig Fc多肽之间的一个或多个二硫键来共价结合。
方面30.一种核酸，其包含编码根据方面1-28中任一项的第一多肽或第二多肽的核苷酸序列，其中所述第一多肽或所述第二多肽包含至少一个免疫调节结构域。
方面31.一种表达载体，其包含如方面30的核酸。
方面32.一种选择性调节对于威尔姆氏瘤-1(WT-1)表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与根据方面1-29中任一项的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述接触选择性调节所述WT-1表位特异性T细胞的活性。
方面33.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含根据方面1-29中任一项的T细胞调节多聚体多肽的药物组合物。
方面34.如方面33的方法，其中所述癌症为肝细胞癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝母细胞瘤或卵巢卵黄囊瘤。
方面35.如方面33或方面34的方法，其中所述施用是肌肉内施用的。
方面36.如方面33或方面34的方法，其中所述施用是静脉内施用的。
方面37.一种调节个体的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如方面1-29中任一项的T细胞调节多聚体多肽(TMMP)，其中所述施用诱导表位特异性T细胞反应(例如，对于存在于所述TMMP中的所述WT-1表位有特异性的T细胞反应)及表位非特异性T细胞反应，其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1。
方面38如方面37的方法，其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少5:1。
方面39.如方面37的方法，其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少10:1。
方面40.如方面37的方法，其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少25:1。
方面41.如方面37的方法，其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少50:1。
方面42.如方面37的方法，其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少100:1。
方面43.如方面37-42中任一项的方法，其中所述个体为人。
方面44.如方面37-43中任一项的方法，其中所述调节包括增强对癌细胞(例如表达WT-1的癌细胞)的细胞毒性T细胞反应。
方面45.如方面37-44中任一项的方法，其中所述施用为静脉内、皮下、肌肉内、全身性、淋巴管内、治疗部位远端、局部、或治疗部位处或附近的施用。
方面46.如方面37-45中任一项的方法，其中所述表位非特异性T细胞反应小于由包含相应野生型免疫调节多肽的对照T细胞调节多聚体多肽诱导的表位非特异性T细胞反应。
方面47.一种选择性递送共刺激(即，免疫调节)多肽至靶T细胞的方法，所述方法包括使混合的T细胞群与如方面1-29中任一项的T细胞调节多聚体多肽(TMMP)接触，其中所述混合的T细胞群包含所述靶T细胞和非靶T细胞，其中所述靶T细胞对存在于所述TMMP内的所述表位有特异性(例如，其中所述靶T细胞对存在于所述TMMP内的所述WT-1表位有特异性)，且其中所述接触递送存在于所述TMMP内的所述一种或多种共刺激多肽至所述靶T细胞。
方面48.如方面47的方法，其中所述T细胞群在体外。
方面49.如方面47的方法，其中所述T细胞群在个体体内。
方面50.如方面49的方法，其包括向所述个体施用所述多聚体多肽。
方面51.如方面47-50中任一项的方法，其中所述靶T细胞为细胞毒性T细胞。
方面52.如方面47的方法，其中所述混合的T细胞群为从个体获得的体外混合的T细胞群，且其中所述接触导致所述靶T细胞的活化和/或增殖，从而生成活化和/或增殖的靶T细胞群。
方面53.如方面52的方法，其进一步包括向所述个体施用所活化和/或增殖的靶T细胞群。
方面54.一种检测从个体获得的混合T细胞群中结合目标WT-1表位的靶T细胞的存在的方法，所述方法包括：a)使所述混合T细胞群与如方面1-29中任一项的T细胞调节多聚体多肽(TMMP)在体外接触，其中所述TMMP包含目标WT-1表位；及b)检测T细胞响应于所述接触的活化和/或增殖，其中活化和/或增殖的T细胞指示靶T细胞的存在。
方面55.一种T细胞调节多聚体多肽，其包含：至少一种异二聚体，所述异二聚体包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)威尔姆氏瘤-1(WT-1)肽表位，其中所述WT-1肽具有的长度为约4个氨基酸至约25个氨基酸；及ii)第一主要组织相容性复合物(MHC)I类多肽；b)第二多肽，所述第二多肽包含第二I类MHC多肽，及c)至少一种免疫调节多肽，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含所述免疫调节多肽，且其中所述第一多肽与所述第二多肽经由至少2个二硫键彼此共价连接。
方面56.如方面55的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽中的至少一个为变体免疫调节多肽，其呈现出对同源共免疫调节多肽的亲和力与相应野生型免疫调节多肽对所述同源共免疫调节多肽的亲和力相比有所减小，且其中所述表位以至少10-7M的亲和力结合至T细胞上的T细胞受体(TCR)，使得：i)所述T细胞调节多聚体多肽结合至第一T细胞的亲和力比所述T细胞调节多聚体多肽结合第二T细胞的亲和力高至少25％，其中所述第一T细胞在其表面上表达所述同源共免疫调节多肽及以至少10-7M的亲和力结合所述表位的TCR，且其中所述第二T细胞在其表面上表达所述同源共免疫调节多肽，但在其表面上不表达以至少10-7M的亲和力结合所述表位的TCR；且/或ii)当通过生物层干涉术测量时，对照T细胞调节多聚体多肽与同源共免疫调节多肽的结合亲和力与包含野生型免疫调节多肽变体的所述T细胞调节多聚体多肽与所述同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率范围为1.5:1至106:1，其中所述对照包含所述野生型免疫调节多肽。
方面57.如方面56的T细胞调节多聚体多肽，其中：a)所述T细胞调节多聚体多肽结合至所述第一T细胞的亲和力比其结合所述第二T细胞的亲和力高至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍；且/或b)所述变体免疫调节多肽结合所述共免疫调节多肽的亲和力为约10-4M至约10-7M、约10-4M至约10-6M、约10-4M至约10-5M；且/或c)其中当通过生物层干涉术测量时，对照T细胞调节多聚体多肽与同源共免疫调节多肽的结合亲和力与包含野生型免疫调节多肽的变体的所述T细胞调节多聚体多肽与所述同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率为至少10:1、至少50:1、至少102:1或至少103:1，其中所述对照包含所述野生型免疫调节多肽。
方面58.如方面55-57中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一多肽或所述第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
方面59.如方面58的T细胞调节多聚体多肽，其中所述Ig Fc多肽为IgG1Fc多肽。
方面60.如方面58的T细胞调节多聚体多肽，其中所述Ig Fc多肽为IgG4Fc多肽。
方面61.如方面59的T细胞调节多聚体多肽，其中IgG1Fc多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：N297A、L234A、L235A、L234F、L235E及P331S。
方面62.如方面55-61中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中
a1)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；
ii)所述第一I类MHC多肽；且
iii)至少一种免疫调节多肽；并且
b1)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二I类MHC多肽；及
ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或
a2)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一I类MHC多肽；且
b2)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)至少一种免疫调节多肽；
ii)所述第二I类MHC多肽；及
iii)Ig Fc多肽；或
a3)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一I类MHC多肽；且
b3)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二I类MHC多肽；及
ii)Ig Fc多肽；和
iii)至少一种免疫调节多肽；或
a4)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一I类MHC多肽；且
b4)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二I类MHC多肽；及
ii)至少一种免疫调节多肽；或
a5)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一I类MHC多肽；且
b5)第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)至少一种免疫调节多肽；和
ii)所述第二I类MHC多肽；或
a6)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；
ii)所述第一I类MHC多肽；且
iii)至少一种免疫调节多肽；并且
b6)所述第二多肽包含：
i)所述第二I类MHC多肽。
方面63.如方面55-62中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2-微球蛋白多肽；且其中所述第二MHC多肽为I类MHC重链多肽。
方面64.如方面55-63中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽选自由以下组成的组：细胞因子(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽等；且包括全部家族成员，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80和CD86也分别称为B7-1和B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受体多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽及CX3CL1多肽、及其组合。
方面65.如方面55-63中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽为IL-2多肽。
方面66.如方面55-65中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含至少两种免疫调节多肽，且其中这些免疫调节多肽中的至少两个是相同的。
方面67.如方面66的T细胞调节多聚体多肽，其中所述两种或更多种免疫调节多肽是串联的。
方面68.如方面55-67中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中：a)第一二硫键在以下两者之间：i)存在于所述WT-1肽表位与所述第一I类MHC多肽之间的接头中的Cys，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由Y84C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽；且b)第二二硫键在以下两者之间：i)经由R12C取代引入所述β2M多肽中的Cys残基；与ii)经由A236C取代引入所述I类MHC重链多肽中的Cys残基。
方面69.如方面68的T细胞调节多聚体多肽，其中所述接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:318)。
方面70.如方面69的T细胞调节多聚体多肽，其中所述接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1至10的整数。
方面71.如方面55-70中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽表位具有的长度为约4个氨基酸至约15个氨基酸。
方面72.如方面55-71中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽表位包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：NLMNLGATL(SEQ ID NO:258)、NYMNLGATL(SEQ IDNO:263)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO:225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO:227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO:229)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO:230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:232)、MNLGATLK(SEQ ID NO:233)、MTWNYMNLGATLKGV SEQ IDNO:234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:238)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO:239)、GALRNPTAL(SEQ ID NO:240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO:241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO:242)、RYRPHPGAL(SEQ ID NO:243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO:244)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO:245)、RIRPHPGAL(SEQ ID NO:246)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO:247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO:248)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO:249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ IDNO:250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO:252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO:253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO:254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO:255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO:257)、NLMNLGATL(SEQID NO:258)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)、CMTWNQMN(SEQ IDNO:261)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)、YMFPNAPYL(SEQ IDNO:264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO:265)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO:266)及NQMNLGATL(SEQ IDNO:267)。
方面73.如方面55-71中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽包含氨基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)或RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)。
方面74.如方面55-73中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一I类MHC多肽或所述第二I类MHC多肽包含：a)与图9A中描绘的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；b)与图10A中描绘的HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或c)与图11A中描绘的HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面75.如方面55-74中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A*2402多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面76.如方面55-74中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽为HLA-A*1101多肽。
方面77.如方面55-74中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A*3303多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面78.如方面55-74中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面79.如方面55-78中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽为包含以下的变体IL-2多肽：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
方面80.如方面55-79中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含第一异二聚体和第二异二聚体。
方面81.一种核酸，其包含编码根据方面55-80中任一项的第一多肽或第二多肽的核苷酸序列，其中所述第一多肽或所述第二多肽包含至少一个免疫调节结构域。
方面82.一种表达载体，其包含如方面81的核酸。
方面83.一种选择性调节对于威尔姆氏瘤-1(WT-1)表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与根据方面55-80中任一项的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述接触选择性调节所述WT-1表位特异性T细胞的活性。
方面84.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含根据方面55-80中任一项的T细胞调节多聚体多肽的药物组合物。
方面85.如方面84的方法，其中所述癌症表达WT-1蛋白。
方面86.如方面84或方面85的方法，其中所述癌症为急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、威尔姆氏瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤或肾母细胞瘤。
方面87.如方面84-86中任一项的方法，其中所述施用是肌肉内施用的。
方面88.如方面84-86中任一项的方法，其中所述施用是静脉内施用的。
方面89.如方面84-88中任一项的方法，其进一步包括向所述个体施用一种或多种检查点抑制剂。
方面90.如方面89的方法，其中所述检查点抑制剂为结合至选自由以下组成的组的多肽的抗体：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
方面91.如方面90的方法，其中所述检查点抑制剂为对PD-1、PD-L1或CTLA4有特异性的抗体。
方面92.如方面89的方法，其中所述一种或多种检查点抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、披地单抗、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿维鲁单抗、伊匹珠单抗、曲利木单抗、披地单抗、IMP321、MGA271、BMS-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠单抗、瓦利鲁单抗、阿维单抗、加利昔单抗、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德、NLG-919、INCB024360、KN035及其组合。
方面93.一种调节个体的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如方面55-80中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述施用诱导表位特异性T细胞反应和表位非特异性T细胞反应，其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1。
方面94.一种选择性递送免疫调节多肽至靶T细胞的方法，所述方法包括使混合T细胞群与如方面55-80中任一项的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述混合T细胞群包含所述靶T细胞和非靶T细胞，其中所述靶T细胞对存在于所述T细胞调节多聚体多肽内的所述WT-1表位具有特异性，且其中所述接触递送存在于所述T细胞调节多聚体多肽内的所述一种或多种免疫调节多肽至所述靶T细胞。
方面95.一种检测从个体获得的混合T细胞群中结合威尔姆氏瘤-1(WT-1)表位的靶T细胞的存在的方法，所述方法包括：a)使所述混合T细胞群与如方面55-80中任一项的T细胞调节多聚体多肽在体外接触，其中所述T细胞调节多聚体多肽包含所述WT-1表位；及b)检测T细胞响应于所述接触的活化和/或增殖，其中活化和/或增殖的T细胞指示所述靶T细胞的存在。
方面组B
上文所述的本发明主题的方面(包括实施方案)单独或在与一个或多个其他方面或实施方案组合时可为有益的。不限于以上描述，下文提供本公开的编号1-36的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开的后将显而易知，可使用个别编号的方面中的各者或将其与前述或以下个别编号的方面中的任一个组合。此旨在提供全部此等方面组合的支持且不限于下文明确提供的方面的组合：
方面1.一种T细胞调节多聚体多肽，其包含：至少一种异二聚体，所述异二聚体包含：a)第一多肽，所述第一多肽包含：i)威尔姆氏瘤-1(WT-1)肽表位，其中所述WT-1肽的长度为至少4个氨基酸；和ii)第一I类主要组织相容性复合物(MHC)多肽；b)第二多肽，所述第二多肽包含第二I类MHC多肽，及c)至少一种活化免疫调节多肽，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含所述免疫调节多肽，且其中所述WT-1肽表位包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：NLMNLGATL(SEQ ID NO:258)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO:225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO:227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO:229)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO:230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:232)、MNLGATLK(SEQ ID NO:233)、MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO:234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:238)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO:239)、GALRNPTAL(SEQID NO:240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO:241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO:242)、RYRPHPGAL(SEQ IDNO:243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO:244)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO:245)、RIRPHPGAL(SEQ IDNO:246)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO:247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO:248)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO:249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ ID NO:250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO:252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO:253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO:254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO:255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO:257)、NLMNLGATL(SEQ ID NO:258)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)、CMTWNQMN(SEQ ID NO:261)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO:265)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO:266)及NQMNLGATL(SEQ ID NO:267)，任选地其中所述第一多肽或所述第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
方面2.如方面1的T细胞调节多聚体多肽，其中所述一个或多个免疫调节结构域中的至少一个为变体免疫调节多肽，其呈现出对同源共免疫调节多肽的亲和力与相应野生型免疫调节多肽对所述同源共免疫调节多肽的亲和力相比有所减小，且其中所述表位以至少10-7M的亲和力结合至T细胞上的T细胞受体(TCR)，使得：
i)所述T细胞调节多聚体多肽结合至第一T细胞的亲和力比所述T细胞调节多聚体多肽结合第二T细胞的亲和力高至少25％，其中所述第一T细胞在其表面上表达所述同源共免疫调节多肽及以至少10-7M的亲和力结合所述表位的TCR，且其中所述第二T细胞在其表面上表达所述同源共免疫调节多肽但在其表面上不表达以至少10-7M的亲和力结合所述表位的TCR；且/或
ii)当通过生物层干涉术测量时，对照T细胞调节多聚体多肽对同源共免疫调节多肽的结合亲和力与包含野生型免疫调节多肽的变体的所述T细胞调节多聚体多肽对所述同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率范围为1.5:1至106:1，其中所述对照包含所述野生型免疫调节多肽。
方面3.如方面2的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述T细胞调节多聚体多肽结合至所述第一T细胞的亲和力比其结合所述第二T细胞的亲和力高至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍；且/或
b)所述变体免疫调节多肽结合所述共免疫调节多肽的亲和力为约10-4M至约10- 7M、约10-4M至约10-6M、约10-4M至约10-5M；且/或
c)其中当通过生物层干涉术测量时，对照T细胞调节多聚体多肽对同源共免疫调节多肽的结合亲和力与包含野生型免疫调节多肽的变体的所述T细胞调节多聚体多肽对所述同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率为至少10:1、至少50:1、至少102:1或至少103:1，其中所述对照包含所述野生型免疫调节多肽。
方面4.如方面1-3中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中
a1)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；
ii)所述第一MHC多肽；和
iii)至少一种免疫调节多肽；并且
b1)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；和
ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或
a2)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b2)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)至少一种免疫调节多肽；
ii)所述第二MHC多肽；和
iii)Ig Fc多肽；或
a3)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b3)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；和
ii)Ig Fc多肽；和
iii)至少一种免疫调节多肽；或
a4)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b4)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；和
ii)至少一种免疫调节多肽；并且
a5)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b5)第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)至少一种免疫调节多肽；和
ii)所述第二MHC多肽；或
a6)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；
ii)所述第一MHC多肽；和
iii)至少一种免疫调节多肽；并且
b6)所述第二多肽包含：
i)所述第二MHC多肽。
方面5.如方面1-4中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一MHC多肽为β2-微球蛋白多肽；且所述第二MHC多肽为I类MHC重链多肽；或
b)所述第一MHC多肽为I类MHC重链多肽；且所述第二MHC多肽为β2-微球蛋白多肽。
方面6.如方面5的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述β2-微球蛋白多肽；并且
b)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)至少一种免疫调节多肽；
ii)所述I类MHC重链多肽；和
iii)Ig Fc多肽。
方面7.如方面5的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述β2-微球蛋白多肽；并且
b)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽；和
iii)至少一种免疫调节多肽
方面8.如方面1-7中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽选自由以下组成的组：细胞因子、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、CD40多肽、CD70多肽及其组合。
方面9.如方面1-8中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽为IL-2多肽。
方面10.如方面1-9中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含至少两种免疫调节多肽，且其中所述免疫调节多肽中的至少两个是相同的，任选地其中所述两种或更多种免疫调节多肽是串联的。
方面11.如方面1-10中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述免疫调节多肽为变体IL-2多肽，其呈现出对IL-2受体的亲和力与野生型IL-2多肽对所述IL-2受体的亲和力相比有所减小。
方面12.如方面11的T细胞调节多聚体多肽，其中所述变体IL-2多肽包含：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
方面13.如方面1-12中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一多肽与所述第二多肽彼此共价连接，任选地其中所述共价键联是经由二硫键。
方面14.如方面1-13中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽或介于所述表位与所述第一MHC多肽之间的接头包含提供第一Cys残基的氨基酸取代，其中所述第二MHC多肽包含提供第二Cys残基的氨基酸取代，且其中所述二硫键联在所述第一Cys残基与所述第二Cys残基之间。
方面15.如方面1-14中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的二硫键：i)存在于所述WT-1肽表位与所述第一I类MHC多肽之间的接头中的Cys，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由Y84C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽。
方面16.如方面1-14中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的二硫键：i)经由R12C取代引入所述第一I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由A236C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽。
方面17.如方面1-14中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的第一二硫键：i)存在于所述WT-1肽表位与所述第一I类MHC多肽之间的接头中的Cys，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由Y84C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽；及在以下两者之间的第二二硫键：i)经由R12C取代引入所述β2M多肽中的Cys残基；与ii)经由A236C取代引入所述I类MHC重链多肽中的Cys残基。
方面18.如方面15或方面17的T细胞调节多聚体多肽，其中介于所述WT-1肽表位与所述第一MHC之间的所述接头为GCGGS(G4S)n(SEQ ID NO:315)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
方面19.如方面1-18中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽表位具有约4个氨基酸至约25个氨基酸的长度。
方面20.如方面1-19中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽包含氨基酸序列CMTWNQMNL(SEQ ID NO:266)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO:265)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)及NLMNLGATL(SEQ ID NO:258)。
方面21.如方面1-20中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽或所述第二MHC多肽包含：
a)与图9A中描绘的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
b)与图10A中描绘的HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
c)与图11A中描绘的HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面22.如方面1-21中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A*2402多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，且其中所述表位选自由以下组成的组：RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)及NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)。
方面23.如方面1-21中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，且其中所述表位选自由以下组成的组：VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)及YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)。
方面24.如方面1-23中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含第一异二聚体和第二异二聚体，且其中所述第一异二聚体与所述第二异二聚体通过所述第一异二聚体与所述第二异二聚体的Ig Fc多肽之间的一个或多个二硫键来共价结合。
方面25.一种核酸，其包含编码如方面1-24中任一项的第一多肽或第二多肽的核苷酸序列。
方面26.一种表达载体，其包含如方面25的核酸。
方面27.一种选择性调节对于威尔姆氏瘤-1(WT-1)表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与根据方面1-24中任一项的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述接触选择性调节所述WT-1表位特异性T细胞的活性。
方面28.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含根据方面1-24中任一项的T细胞调节多聚体多肽的药物组合物。
方面29.如方面28的方法，其中所述癌症为急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、威尔姆氏瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤或肾母细胞瘤。
方面30.如方面28或方面29的方法，其进一步包括向所述个体施用一种或多种检查点抑制剂。
方面31.如方面30的方法，其中所述检查点抑制剂为结合至选自由以下组成的组的多肽的抗体：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
方面32.如方面31的方法，其中所述检查点抑制剂为对PD-1、PD-L1或CTLA4有特异性的抗体。
方面33.如方面30的方法，其中所述一种或多种检查点抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、披地单抗、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿维鲁单抗、伊匹珠单抗、曲利木单抗、披地单抗、IMP321、MGA271、BMS-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠单抗、瓦利鲁单抗、阿维单抗、加利昔单抗、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德、NLG-919、INCB024360、KN035及其组合。
方面34.一种调节个体的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如方面1-24中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述施用诱导表位特异性T细胞反应及表位非特异性T细胞反应，且其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1。
方面35.一种选择性递送免疫调节多肽至靶T细胞的方法，所述方法包括使混合T细胞群与如方面1-24中任一项的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述混合T细胞群包含所述靶T细胞和非靶T细胞，其中所述靶T细胞对存在于所述T细胞调节多聚体多肽内的所述WT-1表位具有特异性，且其中所述接触递送存在于所述T细胞调节多聚体多肽内的所述一种或多种免疫调节多肽至所述靶T细胞。
方面36.一种检测从个体获得的混合T细胞群中结合WT-1表位的靶T细胞的存在的方法，所述方法包括：a)使所述混合T细胞群与如方面1-24中任一项的T细胞调节多聚体多肽在体外接触，其中所述T细胞调节多聚体多肽包含所述WT-1表位；及b)检测T细胞响应于所述接触的活化和/或增殖，其中活化和/或增殖的T细胞指示所述靶T细胞的存在。
方面组C
上文所述的本发明主题的方面(包括实施方案)单独或在与一个或多个其他方面或实施方案组合时可为有益的。不限于以上描述，下文提供本公开的编号1-37的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开的后将显而易知，可使用个别编号的方面中的各者或将其与前述或以下个别编号的方面中的任一个组合。此旨在提供全部此等方面组合的支持且不限于下文明确提供的方面的组合：
方面1.一种T细胞调节多聚体多肽，其包含：
至少一种异二聚体，所述至少一种异二聚体包含：
a)第一多肽，所述第一多肽包含：
i)包含氨基酸序列X1X2X3TWNQMNL(SEQ ID NO:460)或X2X3TWNQMNL(SEQ ID NO:461)的威尔姆氏瘤-1(WT-1)肽表位，其中X1、X2和X3各自独立地为任何氨基酸，条件是N端氨基酸不为Cys，并且其中WT-1肽表位具有9至25个氨基酸的长度；和
ii)第一I类主要组织相容性复合物(MHC)多肽；
b)第二多肽，所述第二多肽包含第二I类MHC多肽，及
c)至少一种活化免疫调节多肽，
其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含至少一种免疫调节多肽，并且任选地其中所述第一多肽或所述第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
方面2.如方面1的T细胞调节多聚体多肽，其中所述一种或多种免疫调节多肽中的至少一个为变体免疫调节多肽，所述变体免疫调节多肽呈现出对同源共免疫调节多肽的亲和力与相应野生型免疫调节多肽对所述同源共免疫调节多肽的亲和力相比有所减小。
方面3.如方面2的T细胞调节多聚体多肽，其中当通过生物层干涉术测量时，所述野生型免疫调节多肽与同源共免疫调节多肽的结合亲和力同所述变体免疫调节多肽与同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率为至少1.5:1。
方面4.如方面2或3的T细胞调节多聚体多肽，其中所述变体免疫调节多肽以选自由以下组成的组的亲和力结合所述共免疫调节多肽：约10-4M至约10-7M、约10-4M至约10-6M和约10-4M至约10-5M。
方面5.如方面1-4中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a1)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b1)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述至少一种免疫调节多肽；
ii)所述第二MHC多肽；和
iii)Ig Fc多肽；或
a2)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b2)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；
ii)所述至少一种免疫调节多肽；和
iii)Ig Fc多肽；或
a3)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b3)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；
ii)Ig Fc多肽；和
iii)所述至少一种免疫调节多肽；或
a4)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述至少一种免疫调节多肽；
ii)所述WT-1肽表位；
ii)所述第一MHC多肽；并且
b4)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；和
ii)所述Ig Fc多肽；或
a5)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；
ii)所述第一MHC多肽；和
iii)所述至少一种免疫调节多肽；并且
b5)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；和
ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
方面6.如方面1-4中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一MHC多肽为β2-微球蛋白多肽；且所述第二MHC多肽为I类MHC重链多肽；或
b)所述第一MHC多肽为I类MHC重链多肽；且所述第二MHC多肽为β2-微球蛋白多肽。
方面7.如方面6的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述β2-微球蛋白多肽；并且
b)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述至少一种免疫调节多肽；
ii)所述I类MHC重链多肽；和
iii)Ig Fc多肽。
方面8.如方面6的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述β2-微球蛋白多肽；并且
b)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽；和
iii)至少一种免疫调节多肽
方面9.如方面1-8中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽选自由以下组成的组：细胞因子、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、CD40多肽、CD70多肽及其组合。
方面10.如方面1-9中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽包括IL-2多肽。
方面11.如方面1-10中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含至少两种免疫调节多肽，且其中所述免疫调节多肽中的至少两个是相同的，任选地其中所述两种或更多种免疫调节多肽是串联的。
方面12.如方面1-11中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽中的一个或多个是变体IL-2多肽，其呈现出对IL-2受体的亲和力与野生型IL-2多肽对所述IL-2受体的亲和力相比有所减小。
方面13.如方面12的T细胞调节多聚体多肽，其中所述一个或多个变体IL-2多肽包含：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
方面14.如方面1-13中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一多肽与所述第二多肽彼此共价连接，任选地其中所述共价键联是经由二硫键。
方面15.如方面1-14中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽或介于所述表位与所述第一MHC多肽之间的接头包含提供第一Cys残基的氨基酸取代，其中所述第二MHC多肽包含提供第二Cys残基的氨基酸取代，且其中所述二硫键联在所述第一Cys残基与所述第二Cys残基之间。
方面16.如方面1-15中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的二硫键：i)存在于所述WT-1肽表位与所述第一I类MHC多肽之间的接头中的Cys，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由Y84C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽。
方面17.如方面1-15中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的二硫键：i)经由R12C取代引入所述第一I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由A236C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽。
方面18.如方面1-15中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的第一二硫键：i)存在于所述WT-1肽表位与所述第一I类MHC多肽之间的接头中的Cys，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由Y84C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽；及在以下两者之间的第二二硫键：i)经由R12C取代引入所述β2M多肽中的Cys残基；与ii)经由A236C取代引入所述I类MHC重链多肽中的Cys残基。
方面19.如方面16或方面18的T细胞调节多聚体多肽，其中介于所述WT-1肽表位与所述第一MHC之间的所述接头为GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
方面20.如方面1-19中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽表位具有9个或10个氨基酸的长度。
方面21.如方面1-20中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述Ig Fc多肽包含图5D、图5E、图5F、图4G及图5H中描绘的氨基酸序列中的一个。
方面22.如方面1-21中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽包含氨基酸序列SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)、GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)、SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)或GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)。
方面23.如方面1-21中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽或所述第二MHC多肽包含与图7A.3中描绘的HLA-A*2402氨基酸序列的氨基酸25-299具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面24.如方面1-23中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A24多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述表位选自由以下组成的组：SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)、GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)、SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)及GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)，且其中所述Ig Fc多肽包含图5G或图5H中描绘的氨基酸序列。
方面25.如方面1的T细胞调节多聚体多肽，其中：a)所述第一多肽包含图37B中描绘的氨基酸序列；并且b)所述第二多肽包含图20B中描绘的氨基酸序列。
方面26.如方面1-25中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含第一异二聚体和第二异二聚体，且其中所述第一异二聚体与所述第二异二聚体通过所述第一异二聚体与所述第二异二聚体的Ig Fc多肽之间的一个或多个二硫键来共价结合。
方面27.一种核酸，其包含编码如方面1-26中任一项的第一多肽或第二多肽的核苷酸序列。
方面28.一种表达载体，其包含如方面27的核酸。
方面29.一种选择性调节对于威尔姆氏瘤-1(WT-1)表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与根据方面1-26中任一项的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述接触选择性调节所述WT-1表位特异性T细胞的活性。
方面30.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含根据方面1-26中任一项的T细胞调节多聚体多肽的药物组合物。
方面31.如方面30的方法，其中所述癌症为急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、威尔姆氏瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤或肾母细胞瘤。
方面32.如方面30或31的方法，其进一步包括向所述个体施用一种或多种检查点抑制剂。
方面33.如方面32的方法，其中所述检查点抑制剂为结合至选自由以下组成的组的多肽的抗体：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
方面34.如方面33的方法，其中所述检查点抑制剂为对PD-1、PD-L1或CTLA4有特异性的抗体。
方面35.如方面33或34的方法，其中所述一种或多种检查点抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、披地单抗、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿维鲁单抗、伊匹珠单抗、曲利木单抗、披地单抗、IMP321、MGA271、BMS-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠单抗、瓦利鲁单抗、阿维单抗、加利昔单抗、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德、NLG-919、INCB024360、KN035及其组合。
方面36.一种调节个体的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如方面1-26中任一项的T细胞调节多聚体多肽，其中所述施用诱导表位特异性T细胞反应及表位非特异性T细胞反应，且其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1。
方面37.一种选择性递送免疫调节多肽至靶T细胞的方法，所述方法包括使混合T细胞群与如方面1-26中任一项的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述混合T细胞群包含所述靶T细胞和非靶T细胞，其中所述靶T细胞对存在于所述T细胞调节多聚体多肽内的所述WT-1表位具有特异性，且其中所述接触递送存在于所述T细胞调节多聚体多肽内的所述一种或多种免疫调节多肽至所述靶T细胞。
方面38.一种检测从个体获得的混合T细胞群中结合WT-1表位的靶T细胞的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述混合T细胞群与如方面1-26中任一项的T细胞调节多聚体多肽在体外接触，其中所述T细胞调节多聚体多肽包含所述WT-1表位；及
b)检测T细胞响应于所述接触的活化和/或增殖，其中活化和/或增殖的T细胞指示所述靶T细胞的存在。
方面39.一种T细胞调节多聚体多肽(TMMP)，其包含：至少一个异二聚体，所述异二聚体包含：a)第一多肽，所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：i)威尔姆氏瘤-1(WT-1)肽，其中WT-1肽具有氨基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)；ii)具有氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)的接头；及iii)β2-微球蛋白多肽，其包含SEQ ID NO:311中列出的氨基酸序列；和b)第二多肽，所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：i)变体IL-2多肽，其包含SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala；ii)(GGGGS)4接头；iii)变体IL-2多肽，其包含SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala；iv)主要组织相容性复合物(MHC)重链多肽，其包含SEQ ID NO:341中列出的氨基酸序列；v)包含氨基酸序列AAAGG的接头；及vi)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
方面40.如方面39的TMMP，其中所述Ig Fc多肽为变体Ig Fc多肽，其相对于所述野生型多肽包含一个或多个序列变异，其中所述Ig Fc多肽通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导细胞溶解的能力降低或大体消除，任选地其中所述Ig Fc多肽包含与图5A-5G或5H中描绘的Fc区的氨基酸序列具有至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面41.如方面40的TMMP，其中所述Ig Fc多肽是变体人IgG1Fc多肽，其包含L234A和/或L235A取代(图5H中描绘的氨基酸序列中的L14和L15)。
方面42.如方面39-41中任一项的TMMP，其中所述第一多肽包含具有图14B和SEQID NO:423中列出的氨基酸序列的构建体2380；并且其中所述第二多肽包含具有图14J和SEQ ID NO:486中列出的氨基酸序列的构建体1715Δ。
方面43.一种TMMP，其包含如方面39-42中任一项的异二聚体的同二聚体。
方面44.一种核酸，其包含编码如方面39-42中任一项的第一多肽或第二多肽的核苷酸序列。
方面45.一种表达载体，其包含如方面44的核酸。
方面46.一种基因修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞用如方面44的核酸或如方面45的表达载体进行基因修饰。
方面47.一种制备T细胞调节多聚体多肽(TMMP)的方法，所述方法包括在培养基中在使得如方面46的基因修饰的宿主细胞合成所述TMMP的条件下体外培养所述宿主细胞。
方面48.一种选择性调节对于威尔姆氏瘤-1(WT-1)表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与根据方面39-43中任一项的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述接触选择性调节所述WT-1表位特异性T细胞的活性。
方面49.一种治疗患有与WT-1相关的癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含如方面39-43中任一项的T细胞调节多聚体多肽的药物组合物。
方面50.如方面49的方法，其中所述癌症为急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、威尔姆氏瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤或肾母细胞瘤。
方面51.如方面49或50的方法，其进一步包括向所述个体施用一种或多种免疫检查点抑制剂。
方面52.如方面51的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为结合至选自由以下组成的组的多肽的抗体：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
方面53.如方面52的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为对PD-1、PD-L1或CTLA4有特异性的抗体。
方面54.如方面52或53的方法，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、披地单抗、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿维鲁单抗、伊匹珠单抗、曲利木单抗、披地单抗、IMP321、MGA271、BMS-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠单抗、瓦利鲁单抗、阿维单抗、加利昔单抗、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德、NLG-919、INCB024360、KN035及其组合。
实施例
提出以下实例以便向一般技艺人士提供如何制备及使用本发明的完全公开和描述，且以下实例不意图限制发明人视为其发明的事物的范围，也不意图表示以下实验为进行的所有或仅有实验。已努力确保关于所用数值(例如，量、温度等)的准确性，但应虑及一些实验误差和偏差。除非另外指示，份为重量份，分子量为重量平均分子量，温度以摄氏度表示，且压力为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
实施例1
测试经由两个二硫键连接TMMP异二聚体的两个多肽链对稳定性和产生的影响。
生成以下TMMP：a)包含1715+2380多肽的TMMP；及b)包含1715多肽和2381多肽的TMMP。多肽链的氨基酸序列提供于图14A-14C中。如图15和图16所示，TMMP包括：i)A02:01等位基因的I类HLA-A重链多肽；和ii)IL2(H16A；F42A)免疫调节(“MOD”)多肽的两个拷贝。2380多肽包含WT1肽WT1(37-45)，而2381多肽包含WT1肽WT1(126-134)。1715-2380TMMP为包含1715多肽及2380多肽的异二聚体的同二聚体。同样，1715-2381TMMP为包含1715多肽和2381多肽的异二聚体的同二聚体。因此，TMMP包括：i)1715+2380异二聚体的2个拷贝，由存在于1715多肽中的IgFc多肽之间的2个二硫键连接；或ii)1715+2381异二聚体的2个拷贝，由存在于1715多肽中的IgFc多肽之间的2个二硫键连接。此排列示意性描绘于图17C中。
TMMP 1715+2380为双二硫键连接的异二聚体：a)第一二硫键联在以下两者之间：i)存在于WT1肽与2380多肽的β2M链之间的接头中的Cys；与ii)通过Y84C取代引入存在于1715多肽中的I类重链中的Cys；且b)第二二硫键联在以下两者之间：i)通过R12C取代引入存在于2380多肽中的β2M多肽中的Cys；与ii)通过A236C取代引入存在于1715多肽中的I类重链中的Cys。
TMMP 1715+2381为双二硫键连接的异二聚体：a)第一二硫键联在以下两者之间：i)存在于WT1肽与2381多肽的β2M链之间的接头中的Cys；与ii)通过Y84C取代引入存在于1715多肽中的I类重链中的Cys；且b)第二二硫键联在以下两者之间：i)通过R12C取代引入存在于2381多肽中的β2M多肽中的Cys；与ii)通过A236C取代引入存在于1715多肽中的I类重链中的Cys。
在ExpiCHO细胞(其改自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；ThermoFisher；参见例如Jain等人(2017)Protein Expr.Purif.134:38)中产生TMMP且将其自这些细胞生长的细胞培养基中纯化。进行两个纯化步骤。在第一步骤中，使细胞培养基变澄清，且使澄清的细胞培养基经历蛋白A柱纯化。在第二纯化步骤中，使来自蛋白A柱的洗脱物经历尺寸排阻色谱。
对纯化的TMMP的稳定性进行测试。在将纯化的TMMP保存于液体溶液(含有365mMNaCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4)中在37℃下达28天或在42℃下达28天之后，确定所存在的异二聚体TMMP的量。
另外，使纯化的TMMP经历3次冷冻/解冻循环。
结果描绘于图15和图16中。
如图15所示，1715-2380异二聚体(在图15中也称为“单体”)的同二聚体占来自蛋白A柱的洗脱物的80％。如图16所示，1715-2381异二聚体(在图16中也称为“单体”)的同二聚体占来自蛋白A柱的洗脱物的79％。
发现异二聚体1715-2380和1715-2381的同二聚体对于3次冷冻/解冻循环是稳定的。
各种TMMP的肽/HLA、IL-2及Fc结构域的解折叠温度表示为Tm(℃)，其提供于图15和图16中。另外，发生聚集的温度(Tm℃)提供于图15和图16中。
进行了稳定性测定(在4℃、37℃和42℃下10天的体外稳定性)，比较了双二硫键键合的TMMP与单二硫键键合的TMMP的稳定性。数据如下表2-4中所示。
下表2示出了用含有WT-1肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)的TMMP获得的结果：
表2
NA＝数据不可用
表2的中间数据列显示了与仅具有这两个二硫键之一的单二硫键TMMP(左侧数据列和右侧数据列)相比，包含WT-1肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)的双二硫键键合的TMMP的体外稳定性数据。
仅在β2M多肽(“R12C”)位置12处的Cys与I类MHC重链(“A236C”)的氨基酸236处的Cys之间具有二硫键的单二硫键TMMP非常不稳定，以至于不能以足够的量纯化来进行稳定性测定。这些数据列于表2的左侧数据列中。
可以产生仅在以下之间具有二硫键的单二硫键TMMP：i)WT-1表位与β2M多肽(“G2C”)之间的接头；与ii)I类MHC重链(“Y84C”)的氨基酸84处的Cys；然而，它在体外不如双硫键键合的TMMP稳定。例如，双二硫键TMMP的冷冻/融化值(表示在指定次数的冷冻/融化循环后剩余的单体％，且因此代表TMMP的稳定性)在连续的冷冻/融化循环中保持稳定和不变，而这种单二硫键TMMP的冷冻/融化值在连续的冷冻/融化循环中下降，表明不稳定。此外，第三次冷冻/融化循环的冷冻/融化值明显低于双二硫键键合的TMMP。这些数据列于表2的右侧数据列中。
用含有WT-1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)的TMMP制成的TMMP获得了类似的结果。结果在下表3中提供。
表3
表3的中间数据列显示了与仅具有这两个二硫键之一的单二硫键TMMP(左侧数据列和右侧数据列)相比，包含WT-1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)的双二硫键键合的TMMP的体外稳定性数据。数据显示双二硫键键合的TMMP在体外比单二硫键TMMP中的任一者更稳定。
左侧数据列中的数据是针对单二硫键TMMP而言，其仅在β2M多肽(“R12C”)位置12处的Cys与I类MHC重链(“A236C”)的氨基酸236处的Cys之间具有二硫键。与双二硫键键合的TMMP相比，这种单二硫键TMMP在37℃下表现出不稳定性。
右侧数据列中的数据是针对仅在以下之间具有二硫键的单二硫键TMMP而言：i)WT-1表位与β2M多肽(“G2C”)之间的接头；与ii)I类MHC重链(“Y84C”)的氨基酸84处的Cys。同样，双二硫键TMMP的冷冻/融化值在连续的冷冻/融化循环中保持稳定和不变，而这种单二硫键TMMP的冷冻/融化值在连续的冷冻/融化循环中下降，表明不稳定。此外，第三次冷冻/融化循环的冷冻/融化值明显低于双二硫键键合的TMMP。
用含有WT-1肽YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)的TMMP制成的TMMP获得了类似的结果。结果在下表4中提供。
表4
表4的中间数据列显示了与仅具有这两个二硫键之一的单二硫键TMMP(左侧数据列和右侧数据列)相比，包含WT-1肽YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)的双二硫键键合的TMMP的体外稳定性数据。数据显示双二硫键键合的TMMP在体外比单二硫键TMMP中的任一者更稳定。
左侧数据列中的数据是针对单二硫键TMMP而言，其仅在β2M多肽(“R12C”)位置12处的Cys与I类MHC重链(“A236C”)的氨基酸236处的Cys之间具有二硫键。与双二硫键键合的TMMP相比，这种单二硫键TMMP在37℃下表现出不稳定性。
右侧数据列中的数据是针对仅在以下之间具有二硫键的单二硫键TMMP而言：i)WT-1表位与β2M多肽(“G2C”)之间的接头；与ii)I类MHC重链(“Y84C”)的氨基酸84处的Cys。同样，双二硫键TMMP的冷冻/融化值在连续的冷冻/融化循环中保持稳定和不变，而这种单二硫键TMMP的冷冻/融化值在连续的冷冻/融化循环中下降，表明不稳定。此外，第三次冷冻/融化循环的冷冻/融化值明显低于双二硫键键合的TMMP。
实施例2：包含WT1表位、HLA-A*02重链、异二聚体的2个多肽链之间的一个或两个二硫键、及位置1处的变体IL-2免疫调节多肽的TMMP的生物化学表征
此项研究中所用的构建体汇总于表5中。
表5
所述构建体的多肽链的氨基酸序列提供于图14A-14I中。
“G2C”指示TMMP包括以下两者之间的二硫键：i)在肽表位与β2M多肽之间的肽接头中的Cys；与ii)在I类MHC重链的位置84处的Cys，其中I类MHC重链具有Y84C取代。
“R12C”指示TMMP包括以下两者之间的二硫键：i)在β2M多肽的位置12处的Cys，其中β2M多肽具有R12C取代；与ii)在I类MHC重链的位置236处的Cys，其中I类MHC重链具有A236C取代。
“G2C+R12C”指示TMMP包括“G2C”二硫键和“R12C”二硫键。
WT-1(37-45)为VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)。
WT-1(126-134)为RMFPNAPYL(SEQ ID NO:260)。
WT-1(126-134(R126Y))为YMFPNAPYL(SEQ ID NO:264)且也称为“126-134模拟表位”。
IL-2“位置1”示意性描绘于图19中。
结果
测试TMMP模拟CD8+T细胞的抗原特异性增殖的能力。TMMP包括以下各物作为表位：i)WT1 37-45；ii)WT1 126-134；或iii)WT1126-134(R126Y)。全部TMMP包括A02等位基因I类MHC重链。
将从人供体获得的外周血单核细胞(PBMC)在体外与不同浓度(0nM、10nM、100nM、300nM或1000nM)的TMMP一起培育10天。在10天培育期之后，测定对表位有特异性的细胞的数目。来自两个供体(“Leukopak 7和Leukopak 12”)的PBMC的数据示于图21中。
图21中提供的数据表明，在两个供体中，WT1特异性TMMP可在10天刺激培养期间诱导来自总PBMC的WT1特异性CD8+ T细胞的扩增。此扩增在具有低或不可检测的WT1特异性T细胞前躯体的PBMC中达成，表明TMMP能够在来自未促发或幼稚库的供体中诱导抗原特异性反应。数据表明对3个选择的WT1肽(37-45、126-134及126-134R126Y)中的任一个有特异性且在两个所测试的二硫键构架(G2C和R12C/G2C)的任一个上的TMMP诱导来自总PBMC的WT1特异性CD8+ T细胞的扩增。
在体外在重组人IL-2存在下以所指示的WT1肽刺激来自不同人供体(L7、L10及L12)的PBMC达10天且接着以含有相同肽且含有G2C二硫键或R12C和G2C二硫键两者的TMMP再刺激8天。数据描绘于图22中。
图22中提供的数据表明在来自三个供体的PBMC中，含有WT1的TMMP可在10天促发培养之后的8天再刺激培养期间自总PBMC扩增WT1特异性CD8+ T细胞。此扩增自具有可检测数目的WT1特异性T细胞前躯体的细胞发生，表明TMMP能够在具有促发/预先存在的WT-1特异性T细胞库的供体中扩增抗原特异性T细胞。数据表明对3种WT1肽(37-45、126-134和126-134R126Y)中的任一个有特异性且在两个测试的二硫键构架(G2C和R12C/G2C)的任一个上的TMMP诱导此类扩增。
测试通过与含有WT1 37-45肽且含有G2C二硫键或R12C和G2C二硫键两者的TMMP接触来进行扩增的CD8+T细胞响应于递呈WT1-37-45肽或不相关肽(SL9)的靶细胞(T2细胞)而产生TNF-α和IFN-γ的能力。使用佛波醇12-肉豆蔻酸盐13-乙酸盐(PMA)和离子霉素(ionomycin)(“iono”)作为阳性对照。使用以培养基处理的CD8+T细胞作为阴性对照。将通过TMMP扩增的CD8+T细胞与以WT1肽或不相关肽(来自HIV的SL9肽)装载的‘靶细胞’(T2细胞)一起培育。将CD8+ T细胞对以WT 37-45肽脉冲处理的T2细胞的反应(如通过IFN-γ和TNF-α的产生所指示)与对以SL9肽脉冲处理的T2细胞的反应相比较。数据示于图23中。
图23中提供的数据证明以含有具有G2C或R12C/G2C构架的TMMP的WT1 37-45扩增的WT1 37-45-特异性CD8+ T细胞的选择性多官能性。仅在识别递呈WT1 37-45肽而非SL9肽的靶细胞时观测到所测量的反应(TNF-α及IFN-γ产生)。阳性和阴性对照孔显示在不存在刺激时(如在仅有培养基的孔中所见)CD8+ T细胞不存在基线活性且抗原特异性细胞及非抗原特异性细胞能够在强抗原非特异性刺激(PMA+离子霉素)后显示功能性反应。
使用相同测定，测试通过含有WT1 126-134肽(“WT1 126”)且含有R12C和G2C二硫键的TMMP扩增的CD8T细胞响应于递呈WT1-126-134肽、WT1-126-134R126Y肽或不相关肽(SL9)的靶细胞(T2细胞)而产生TNF-α和IFN-γ的能力。数据示于图24中。
图24中提供的数据证明以R12C/G2C构架上的WT1 126-134特异性Immuno-STAT扩增的WT1 126-134特异性CD8+ T细胞的选择性多官能性。仅在识别递呈WT1 126-134肽或WT1 126-134R126Y肽而非SL9肽的靶细胞时观测到所测量的反应(TNF-α和IFN-γ产生)。阳性和阴性对照孔显示在不存在刺激时(如在仅有培养基的孔中所见)CD8+ T细胞不存在基线活性且抗原特异性细胞及非抗原特异性细胞能够在强抗原非特异性刺激(PMA+离子霉素)后显示功能性反应。
测试二硫键对IL-2驱动的免疫细胞活化的作用。CD69为大部分淋巴细胞及一些其他免疫细胞上的早期活化标记物。在不同类型的刺激条件(包括IL-2刺激)下，细胞上调CD69。评定在NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞上的CD69上调。CD69上调表明存在于TMMP中的IL-2多肽为有活性的且其功能与对照(重组人IL-2)相比有所减弱。将来自不同人供体的PBMC与表中列出的各种TMMP(“IST”)一起培育。包括包含CMV表位或MART-1表位的TMMP作为对照。展示来自一人供体(Leukopak 6)的数据。数据示于图25中。图25展示作为容易响应于IL-2而上调CD69的细胞的相关及代表性实例的NK细胞上的CD69上调。在CD8+ T细胞闸(cell gate)和CD4+ T细胞闸上观测到类似数据。
图25中提供的数据表明在位置1上被工程化至在各种二硫键构架(R12C、G2C及R12C/G2C)上建立的HLA-A02特异性Immuno-STAT中的IL-2免疫调节多肽为功能性的(如通过在相关免疫细胞表面上诱导CD69所观测到的)且与野生型重组人IL-2相比有所减弱。
为了评价存在于TMMP中的变体IL-2免疫调节多肽的效力，进行CTLL-2增殖测定。CTLL-2细胞依赖于IL-2进行生长；因此，CTLL-2增殖为存在于培养基中的IL-2的量和/或功效的量度(例如，其中IL-2由与TMMP接触的T细胞产生)。Gillis等人(1978)J.Immunol.120:2027。
数据示于图26中。图26中提供的数据表明在位置1上工程化至在各种二硫键构架(R12C、G2C及R12C/G2C)上建立的HLA-A02特异性Immuno-STAT(TMMP)中的IL-2免疫调节多肽为功能性的(如通过CTLL-2增殖的诱导所观测到的)且与阿地白介素相比有所减弱。
测试这些实验中所用的TMMP结合至FcRn的能力。TMMP包括可结合至FcRn的Ig Fc区。结合至FcRn为体内半衰期延长的指示。Souders等人(2015)MAbs 7:912。“1715+2380”TMPP的数据示于图27中。
测试“1715+2380”TMPP结合至其他Fc受体的能力。“1715+2380”TMPP包括具有LALA取代的Ig Fc区，其减少Ig Fc与FcRI、RIIA、IIB、IIIA-F及IIIB的结合，从而减弱Ig Fc介导的效应物功能。数据示于图27中。
材料和方法
图21
使用分离术仪器获得来自两个健康供体的Leukopak。将Leukopak以等体积的室温磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释。通过如下密度梯度离心从稀释的leukopak分离PBMC：在50mL锥形管中以13mL Ficoll-Paque使30mL稀释的leukopak处于下层，且在400g下在室温下在无制动器的摆动桶式转子中离心30分钟。从血浆-Ficoll界面收集单核细胞层(淋巴细胞、单核细胞及血小板)，将其转移至新的50mL锥形管中且通过在室温下在300g下离心10分钟来以3倍过量PBS洗涤。在小心除去上清液后，使细胞再悬浮且通过在室温下在200g下离心10分钟来以50mL PBS洗涤以除去血小板。在洗涤及血小板除去后，将所获得的PBMC自50mL管中汇集，在PBS中再悬浮，计数，通过在300g下离心10分钟来沉淀，且使其以50x106个细胞/ml的最终浓度再悬浮于细胞冷冻培养基中。
由如上文所述的两个leukopak制备人健康供体PBMC。在实验当天，在37℃水浴中使细胞解冻且在温热的ImmunoCultTM-XF Cell Expansion Media(StemcellTechnologies)中通过在350x g下离心6分钟来洗涤。除去上清液，且使细胞再悬浮于ImmunoCultTM培养基中。使用Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)来评定活细胞计数。调整培养基体积以使细胞浓度为5x106个细胞/ml且在6孔板中每孔接种2mL细胞(等同于10x106个细胞)。在4ml培养基的总体积中，将PBMC以指定量的Immuno-STAT或仅以培养基刺激。将细胞在37℃、5％CO2下刺激10天，其中在第5天和第7天通过从孔中抽吸2mL培养上清液且再添加2mL新鲜培养基来更换培养基。
在培养后，收获细胞且通过在350x g下离心5分钟来沉淀，通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)确定活细胞计数，且通过用以下各物染色来处理细胞以用于流动式细胞测量术：活力染剂、适当的WT1肽特异性HLA-A*0201四聚体(MBL International)及针对CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)的抗体。洗涤染色的细胞且通过流动式细胞测量术进行分析。
使用Attune NxT流动式细胞测量仪(Invitrogen)进行数据采集。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
基于通过流动式细胞测量术分析的抗原特异性T细胞的频率、体积及事件及在培养结束时收获的细胞的总体积和数目，计算每孔抗原特异性T细胞的数目且绘制为所示曲线图。
图22
将来自两个供体的PBMC用10μg/ml指定肽和50U/ml重组人IL-2扩增10天。在6孔板中在每孔4ml Immunocult培养基中以总计1千万个细胞进行扩增。将细胞在37℃、5％CO2下刺激10天，其中在第5天和第7天通过从孔中抽吸2mL培养上清液且再添加具有50U/ml重组人IL-2的2mL新鲜培养基来更换培养基。在培养后，收获细胞且通过在350g下离心5分钟来沉淀，通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)确定活细胞计数。在六孔板的至少3个孔中进行每种刺激条件。使用来自一个孔的PBMC来在用以下各物染色后通过流动式细胞测量术评估培养物中WT1特异性CD8+ T细胞的频率/量：活力染剂、适当的WT1肽特异性HLA-A*0201四聚体(MBL International)及针对CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)的抗体。洗涤染色的细胞且通过流动式细胞测量术进行分析。使用至少两个孔，使用来自Stem Cell Technologies的CD8+ T细胞阴性选择套组富集CD8+ T细胞。在先前用丝裂霉素C以1:2比率处理的自体PBMC存在下，将纯化的CD8+ T细胞用指定TMMP再刺激8天，其中在每孔4ml体积的Immunocult培养基中具有最终5百万-1千万个细胞。以先前确定对于供体与特定TMMP的组合而言最佳的浓度使用TMMP。
在培养时，收获细胞且通过在350g下离心5分钟来沉淀，通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)测定活细胞计数，且通过用以下各物染色来处理以用于流动式细胞测量术：活力染剂、适当的WT1肽特异性HLA-A*0201四聚体(MBL International)及针对CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)的抗体。洗涤染色的细胞且通过流动式细胞测量术进行分析。
使用Attune NxT流动式细胞测量仪(Invitrogen)进行数据采集。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
基于通过流动式细胞测量术分析的抗原特异性T细胞的频率、体积及事件及在培养结束时收获的细胞的总体积和数目，计算每孔抗原特异性T细胞的数目且绘制为所示曲线图。
图23
将来自两个供体的PBMC用10μg/ml WT1 37-45肽和50U/ml重组人IL-2扩增10天。在6孔板中在每孔4ml Immunocult培养基中以总计1千万个细胞进行扩增。将细胞在37℃、5％CO2下刺激10天，其中在第5天和第7天通过从孔中抽吸2mL培养上清液且再添加具有50U/ml重组人IL-2的2mL新鲜培养基来更换培养基。在培养后，收获细胞且通过在350g下离心5分钟来沉淀，通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)确定活细胞计数。在六孔板的至少3个孔中进行该刺激。使用来自一个孔的PBMC来在用以下各物染色后通过流动式细胞测量术评估培养物中WT1 37-45肽特异性CD8+ T细胞的频率/量：活力染剂、适当的WT1 37-45肽特异性HLA-A*0201四聚体(MBL International)及针对CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)的抗体。洗涤染色的细胞且通过流动式细胞测量术进行分析。使用Attune NxT流动式细胞测量仪(Invitrogen)进行数据采集。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
使用至少两个孔，使用来自Stem Cell Technologies的CD8+ T细胞阴性选择套组富集CD8+ T细胞。在先前用丝裂霉素C以1:2比率处理的自体PBMC存在下，将纯化的CD8+ T细胞用G2C或R12C/G2C构架上的指定WT1 37-45特异性Immuno-STAT再刺激8天，其中在每孔4ml体积的Immunocult培养基中具有最终5百万-1千万个细胞。以先前确定对于该供体而言最佳的浓度使用G2C或R12C/G2C构架上的WT1 37-45特异性Immuno-STAT。
在培养后，收获细胞且通过在350g下离心5分钟来沉淀，通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)确定活细胞计数，且使用来自Stem Cell Technologies的CD8+ T细胞阴性选择套组富集CD8+ T细胞。
将靶细胞T2细胞(ATCC)在37℃、5％CO2下用5μg/mL WT137-45肽或人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Gag77-85SL9肽脉冲处理2小时。在肽装载后，将T2细胞洗涤两次且再悬浮于ImmunoCultTM-XF Cell Expansion Media(Stemcell Technologies)中。
将富集的CD8+T细胞和装载有肽的T2细胞以1:1比率(各自1x106个细胞)混合于96孔板中，每孔200μL的总体积。将培养基和佛波醇12-肉豆蔻酸盐13-乙酸盐(PMA)/离子霉素分别作为阴性对照和阳性对照添加至对照孔中。在刺激后0.5至1小时，将针对CD107a的染色抗体直接添加至孔中。将细胞刺激5小时，用PBS洗涤且在冰上使用FVS780针对活力进行染色10分钟。将细胞洗涤，在室温下用WT1 37-45肽特异性四聚体(以APC和PE标记)染色15分钟。随后，将细胞洗涤，且在冰上用针对CD3及CD8的抗体染色30分钟。将染色的细胞洗涤两次且在4℃下再悬浮于细胞内(IC)固定缓冲液中过夜。次日，将细胞洗涤且再悬浮于渗透缓冲液中且在室温下培育5分钟。将渗透的细胞洗涤且用针对干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的抗体染色，在室温下再悬浮于渗透缓冲液中达30分钟。将染色的细胞洗涤，再悬浮于2mL FACS缓冲液中，且将其转移至96孔深板中。使用Attune NxT流动式细胞测量仪(Thermofisher Scientific,MA)进行数据采集。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
图24
将来自两个供体的PBMC用10μg/ml WT1 126-134肽及50U/ml重组人IL-2扩增10天。在6孔板中在每孔4ml Immunocult培养基中以总计1千万个细胞进行扩增。将细胞在37℃、5％CO2下刺激10天，其中在第5天和第7天通过从孔中抽吸2mL培养上清液且再添加具有50U/ml重组人IL-2的2mL新鲜培养基来更换培养基。在培养后，收获细胞且通过在350g下离心5分钟来沉淀，通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)确定活细胞计数。在六孔板的至少3个孔中进行该刺激。使用来自一个孔的PBMC来在用以下各物染色后通过流动式细胞测量术评估培养物中WT1 126-134肽特异性CD8+ T细胞的频率/量：活力染剂、适当的WT1 126-134肽特异性HLA-A*0201四聚体(MBL International)及针对CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)的抗体。洗涤染色的细胞且通过流动式细胞测量术进行分析。使用Attune NxT流动式细胞测量仪(Invitrogen)进行数据采集。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
使用至少两个孔，使用来自Stem Cell Technologies的CD8+ T细胞阴性选择套组富集CD8+ T细胞。在先前用丝裂霉素C以1:2比率处理的自体PBMC存在下，将纯化的CD8+ T细胞用R12C/G2C构架上的WT1 126-134特异性Immuno-STAT再刺激8天，其中在每孔4ml体积的Immunocult培养基中有最终5百万-1千万个细胞。以先前确定对于该供体而言最佳的浓度使用R12C/G2C构架上的WT1 126-134特异性Immuno-STAT。
在培养后，收获细胞且通过在350g下离心5分钟来沉淀，通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)确定活细胞计数，且使用来自Stem Cell Technologies的CD8+ T细胞阴性选择套组富集CD8+ T细胞。
将靶细胞T2细胞(ATCC)在37℃、5％CO2下用5μg/mL WT1126-134肽、WT1 126-134R126Y肽或人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Gag77-85SL9肽脉冲处理2小时。在肽装载后，将T2细胞洗涤两次且再悬浮于ImmunoCultTM-XF Cell Expansion Media(StemcellTechnologies)中。
将富集的CD8+T细胞和装载有肽的T2细胞以1:1比率(各自1x106个细胞)混合于96孔板中，每孔200μL的总体积。将培养基和佛波醇12-肉豆蔻酸盐13-乙酸盐(PMA)/离子霉素分别作为阴性对照和阳性对照添加至对照孔中。在刺激后0.5至1小时，将针对CD107a的染色抗体直接添加至孔中。将细胞刺激5小时，用PBS洗涤且在冰上使用FVS780针对活力进行染色10分钟。将细胞洗涤，在室温下用WT1 126-134肽特异性四聚体(以APC和PE标记)染色15分钟。随后，将细胞洗涤，且在冰上用针对CD3及CD8的抗体染色30分钟。将染色的细胞洗涤两次且在4℃下再悬浮于细胞内(IC)固定缓冲液中过夜。次日，将细胞洗涤且再悬浮于渗透缓冲液中且在室温下培育5分钟。将渗透的细胞洗涤且用针对干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的抗体染色，在室温下再悬浮于渗透缓冲液中达30分钟。将染色的细胞洗涤，再悬浮于2mL FACS缓冲液中，且将其转移至96孔深板中。使用Attune NxT流动式细胞测量仪(Thermofisher Scientific,MA)进行数据采集。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
图25
由从Hemacare(Northridge,CA)获得的leukopak制备人健康供体PBMC且在-150℃下保持低温保存，直至实验当天。
在实验当天在水浴中解冻细胞1分钟，将其用10mL温热的ImmunoCultTM-XF CellExpansion Media(Stemcell Technologies,Vancouver,Canada)洗涤，通过离心(350g，5分钟)沉淀，且使其再悬浮于10mL培养基中。使用Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)计数细胞，调整培养基体积以使细胞浓度达3.8x106个细胞/mL且将237.5uL细胞悬液添加至圆底96孔板中。
于Immunocult培养基中制备指定Immuno-STAT及rh-IL-2之20X稀释液系列。为了刺激PBMC，将12.5μL 20X稀释液系列添加至含有细胞的孔中且混合以获得最终测定药物浓度。将PBMC在37℃、5％CO2下培育20至24小时。
在刺激后，通过在350g下离心5分钟来使细胞沉淀。收集上清液，将其冷冻并保存在-20℃下，直至进一步分析。将沉淀的PBMC用PBS洗涤两次且在4℃下在50μL可固定的活细胞/死细胞FVS780染剂中染色10分钟。用200μL染色缓冲液淬灭染色且通过离心(350x g，5分钟)来使细胞沉淀。将细胞在4℃下用50μL体积中针对CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD56及CD69的抗体染色30分钟。在染色后，将细胞用染色缓冲液洗涤，通过离心(350x g，5分钟)沉淀，使其再悬浮于130μL染色缓冲液中且通过流动式细胞测量术，使用
流动式细胞测量仪进行分析。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
对在IL-2刺激后上调CD69敏感的不同细胞子集评定CD69上调。基于染色中所用的表面标记物的表达水平，形成闸门以鉴别NK细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞。
图26
在测定前一天，将CTLL-2细胞用培养基洗涤且以1x105个细胞/ml在75-T烧瓶中在37C、5％CO2下培养24小时以用于IL-2饥饿。在24小时饥饿培养后，将细胞以5000个细胞/孔接种在100微升/孔的具有盖的96孔细胞培养簇平底板(Costar corning，目录号3599)中。在刺激前使用Vi细胞活力分析仪(Beckman-Coulter)检查细胞活力和计数。
于补充有10％HI FBS的完全RPMI中制备指定的Immuno-STAT(TMMP)或阿地白介素(Prometheus Therapeutics)的稀释液系列(10点；3倍稀释步骤)作为最终测定浓度的2X储备液。将100μL此2X稀释液系列添加至先前接种在96孔板中的细胞中且混合以获得最终测定药物浓度。重复三次测试各浓度。在37C、5％CO2下将细胞培育三天。
在培养三天后，将来自各孔的100μL细胞转移至平底白色用组织培养物处理的96孔板中。根据由制造商提供说明书，使用CellTiter-Glo Luminescent细胞活力测定套组(Promega目录号G7571)来制备100μL
试剂，且将其添加至细胞中。通过将板置于回转式振荡器上2分钟来混合细胞与
试剂以诱导细胞溶解。然后将板在室温下培育10分钟以稳定发光信号。测量发光且在Biotek synergy neo2多模式读取器软件Gen5 3.04上记录。
图27
在Octet HTX系统(ForteBio)上进行所有实验。在测定缓冲液中使Anti-penta-his(HIS1K)动力学级别生物传感器(ForteBio,#18-5122)水合且在pH 1.7甘氨酸中预调节。对除了FcRn以外的全部测定使用测定缓冲液。用于FcRn的缓冲液为PBS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.02％Tween-20pH 7.2。用于FcRn试剂的测定缓冲液为PBS、0.1％BSA、0.02％Tween-20pH 6。
将各带His标签的受体以5μg/mL(FcRI例外：10ug/mL)的浓度固定于HIS1K生物传感器上120秒。接着将装载有抗原的HIS1K生物传感器浸入各个别抗体以300nM开始的7点1:3稀释液系列中。使用仅含有测定缓冲液的孔来测试缓冲液与装载的生物传感器之间的非特异性结合。观测缔合达60秒，随后观测解离60秒。在HIS1K装载后，使用解离缓冲液建立短基线(60秒)。
实施例3：包含WT1表位、HLA-A*24重链、异二聚体的2个多肽链之间的一个或两个二硫键、及位置1、3或5处的变体IL-2免疫调节多肽的TMMP的生物化学表征
此项研究中所用的构建体汇总于表6中。
表6
所述构建体的多肽链的氨基酸序列提供于图10A-10R中。
“G2C”指示TMMP包括以下两者之间的二硫键：i)在肽表位与β2M多肽之间的肽接头中的Cys；与ii)在I类MHC重链的位置84处的Cys，其中I类MHC重链具有Y84C取代。
“R12C”指示TMMP包括以下两者之间的二硫键：i)在β2M多肽的位置12处的Cys，其中β2M多肽具有R12C取代；与ii)在I类MHC重链的位置236处的Cys，其中I类MHC重链具有A236C取代。
“G2C+R12C”指示TMMP包括“G2C”二硫键和“R12C”二硫键。
WT1(235-243(M236Y))为CYTWNQMNL(SEQ ID NO:262)并且也称为“235模拟表位”。
WT1(239-247(Q240Y))为NYMNLGATL(SEQ ID NO:263)。
IL-2“位置1”、“位置3”及“位置5”示意性地描绘于图19中。
材料和方法
TMMP对抗原特异性(AgS)CD8+T细胞数量的影响
使用分离术仪器获得来自健康供体的Leukopak。将Leukopak以等体积的室温磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释。通过如下密度梯度离心从稀释的leukopak分离PBMC：在50mL锥形管中以13mL Ficoll-Paque使30mL稀释的leukopak处于下层，且在400g下在室温下在无制动器的摆动桶式转子中离心30分钟。从血浆-Ficoll界面收集单核细胞层(淋巴细胞、单核细胞及血小板)，将其转移至新的50mL锥形管中且通过在室温下在300g下离心10分钟来以3倍过量PBS洗涤。在小心除去上清液后，使细胞再悬浮且通过在室温下在200g下离心10分钟来以50mL PBS洗涤以除去血小板。在洗涤及血小板除去后，将所获得的PBMC自50mL管中汇集，在PBS中再悬浮，计数，通过在300g下离心10分钟来沉淀，且使其以50x106个细胞/ml的最终浓度再悬浮于细胞冷冻培养基中。
在实验当天，在37℃水浴中使细胞解冻且在温热的ImmunoCultTM-XF CellExpansion Media(Stemcell Technologies)中通过在350x g下离心6分钟来洗涤。除去上清液，且使细胞再悬浮于ImmunoCultTM培养基中。使用Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)来评定活细胞计数。调整培养基体积以使细胞浓度为5x106个细胞/ml且在6孔板中每孔接种2mL细胞(等同于10x106个细胞)。在4ml培养基的总体积中，将PBMC以指定量的Immuno-STAT或仅以培养基刺激。将细胞在37℃、5％CO2下刺激10天，其中在第5天和第7天通过从孔中抽吸2mL培养上清液且再添加2mL新鲜培养基来更换培养基。
在培养后，收获细胞且通过在350x g下离心5分钟来沉淀，通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen,CA)确定活细胞计数，且通过用以下各物染色来处理细胞以用于流动式细胞测量术：活力染剂、适当的WT1肽特异性HLA-A*2402四聚体(MBL International)及针对CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)的抗体。洗涤染色的细胞且通过流动式细胞测量术进行分析。
使用Attune NxT流动式细胞测量仪(Invitrogen)进行数据采集。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
基于通过流动式细胞测量术分析的抗原特异性T细胞的频率、体积及事件及在培养结束时收获的细胞的总体积和数目，计算每孔抗原特异性T细胞的数目且绘制为所示曲线图。
将从人供体获得的外周血单核细胞(PBMC)(标示为“Leukopak 7”、“Leukopak 18”及“Leukopak 6”)在体外与不同浓度(0nM、10nM、100nM、300nM或1000nM)的TMMP一起培育10天。在10天培育期之后，测定对表位有特异性的细胞的数目。
二硫键对IL-2驱动的免疫细胞活化的作用
测试二硫键对IL-2驱动的免疫细胞活化的作用。CD69为大部分淋巴细胞及一些其他免疫细胞上的早期活化标记物。在不同类型的刺激条件(包括IL-2刺激)下，细胞上调CD69。评定在NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞上的CD69上调。CD69上调表明存在于TMMP中的IL-2多肽为有活性的且其功能与对照(重组人IL-2)相比有所减弱。将来自不同人供体的PBMC与图13和图14的表中列出的各种TMMP(“IST”)一起培育。包括包含CMV表位或MART-1表位的TMMP作为对照。
变体IL-2对CTLL-2增殖的影响
为了评价存在于TMMP中的变体IL-2免疫调节多肽的效力，进行CTLL-2增殖测定。CTLL-2细胞依赖于IL-2进行生长；因此，CTLL-2增殖为存在于培养基中的IL-2的量和/或功效的量度(例如，其中IL-2由与TMMP接触的T细胞产生)。Gillis等人(1978)J.Immunol.120:2027。
在测定前一天，将CTLL-2细胞用培养基洗涤且以1x105个细胞/ml在75-T烧瓶中在37C、5％CO2下培养24小时以用于IL-2饥饿。在24小时饥饿培养后，将细胞以5000个细胞/孔接种在100微升/孔的具有盖的96孔细胞培养簇平底板(Costar corning，目录号3599)中。在刺激前使用Vi细胞活力分析仪(Beckman-Coulter)检查细胞活力和计数。
于补充有10％HI FBS的完全RPMI中制备指定的Immuno-STAT(TMMP)或阿地白介素(Prometheus Therapeutics)的稀释液系列(10点；3倍稀释步骤)作为最终测定浓度的2X储备液。将100μL此2X稀释液系列添加至先前接种在96孔板中的细胞中且混合以获得最终测定药物浓度。重复三次测试各浓度。在37C、5％CO2下将细胞培育三天。
在培养三天后，将来自各孔的100μL细胞转移至平底白色用组织培养物处理的96孔板中。根据由制造商提供说明书，使用CellTiter-Glo Luminescent细胞活力测定套组(Promega目录号G7571)来制备100μL
试剂，且将其添加至细胞中。通过将板置于回转式振荡器上2分钟来混合细胞与
试剂以诱导细胞溶解。然后将板在室温下培育10分钟以稳定发光信号。测量发光且在Biotek synergy neo2多模式读取器软件Gen5 3.04上记录。
与Fc受体的结合
在Octet HTX系统(ForteBio)上进行所有实验。在测定缓冲液中使Anti-penta-his(HIS1K)动力学级别生物传感器(ForteBio,#18-5122)水合且在pH 1.7甘氨酸中预调节。对除了FcRn以外的全部测定使用测定缓冲液。用于FcRn的缓冲液为PBS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.02％Tween-20pH 7.2。用于FcRn试剂的测定缓冲液为PBS、0.1％BSA、0.02％Tween-20pH 6。
将各带His标签的受体以5μg/mL(FcRI例外：10ug/mL)的浓度固定于HIS1K生物传感器上120秒。接着将装载有抗原的HIS1K生物传感器浸入各个别抗体以300nM开始的7点1:3稀释液系列中。使用仅含有测定缓冲液的孔来测试缓冲液与装载的生物传感器之间的非特异性结合。观测缔合达60秒，随后观测解离60秒。在HIS1K装载后，使用解离缓冲液建立短基线(60秒)。
结果
结果示于图28-34中。
图28和图29中提供的数据显示，包含WT1 235-243R236Y、在不同位置处具有免疫调节多肽(IL-2)并且具有单个二硫键或具有两个二硫键的TMMP可以在10天的刺激培养过程中从总PBMC扩增WT1特异性CD8+ T细胞。此扩增在具有低或不可检测的WT1特异性T细胞前体的PBMC中达成，表明TMMP能够在来自未促发或幼稚库的供体中诱导抗原特异性反应。
图30中提供的数据显示，在构建于不同二硫键构架(G2C和R12C/G2C)上的WT1235-243M236Y特异性HLA-A24TMMP的位置1或3处被工程化的IL-2多肽与CMV和MART-1特异性HLA-A02TMMP的活性相比为功能性的(如通过在相关免疫细胞表面上诱导CD69所观测到的)且与野生型重组人IL-2相比有所减弱。
图31中提供的数据显示，在构建于不同二硫键构架(R12C、G2C和R12C/G2C)上的WT1 239-247Q240Y特异性HLA-A24TMMP的位置1、3或5处被工程化的IL-2多肽与CMV和MART-1特异性HLA-A02Immuno-STAT的活性相比为功能性的(如通过在相关免疫细胞表面上诱导CD69所观测到的)且与野生型重组人IL-2相比有所减弱。
图32中提供的数据显示，在构建于不同二硫键构架(G2C和R12C/G2C)上的WT1235-243M236Y特异性HLA-A24TMMP的位置1或3处被工程化的IL-2多肽为功能性的(如通过诱导CTLL-2增殖所观测到的)并且与阿地白介素相比有所减弱且与野生型重组人IL-2相比有所减弱。
图33中提供的数据显示，在构建于不同二硫键构架(R12C、G2C和R12C/G2C)上的WT1 239-247Q240Y特异性HLA-A24TMMP的位置1、3或5处被工程化的IL-2多肽为功能性的(如通过诱导CTLL-2增殖所观测到的)且与野生型重组人IL-2相比有所减弱。
图34中提供的数据显示“3425+3529”TMPP能够结合至FcRn。“3425+3529”TMPP包括具有LALA取代的Ig Fc区。如图34所示，“3425+3529”TMPP表现出Ig Fc与FcRI、RIIA、IIB、IIIA-F和IIIB的结合减少。
实施例4
测试了包含1715(没有C端Lys，即具有SEQ ID NO:486中列出的序列的1715Δ)+2380多肽的TMMP。多肽链的氨基酸序列在图14J(没有C端赖氨酸的1715，即1715Δ)和图14B(2380)中提供。1715Δ+2380TMMP包含：i)A02:01等位基因的I类HLA-A重链多肽；和ii)IL2(H16A；F42A)免疫调节(“MOD”)多肽的两个拷贝。2380多肽包含WT1肽WT1(37-45)。1715Δ-2380TMMP为包含1715Δ多肽和2380多肽的异二聚体的同二聚体。因此，TMMP包含：i)1715Δ+2380异二聚体的2个拷贝，通过1715Δ多肽中存在的IgFc多肽之间的2个二硫键连接。
TMMP 1715Δ+2380为双二硫键连接的异二聚体：a)第一二硫键联在以下两者之间：i)存在于WT1肽与2380多肽的β2M链之间的接头中的Cys；与ii)通过Y84C取代引入存在于1715Δ多肽中的I类重链中的Cys；且b)第二二硫键联在以下两者之间：i)通过R12C取代引入存在于2380多肽中的β2M多肽中的Cys；与ii)通过A236C取代引入存在于1715Δ多肽中的I类重链中的Cys。
测试了TMMP 1715Δ+2380对PBMC的作用。数据示于图39-42中。TMMP 1715Δ+2380在下文中也称为“CUE-102/A02WT137-45Immuno-STAT”、“CUE-102/A02WT137-45IST”，或简称为“CUE-102/A02”。
如图39所示，CUE-102/A02WT137-45IST诱导来自未促发的PBMC的WT137-45特异性CD8+T细胞的扩增。将健康供体PBMC在ImmunocultTM培养基中用CUE-102/A02WT137-45Immuno-STAT(IST)刺激10天。在不存在CUE-102/A02的情况下培养的细胞用作阴性对照。在用WT137-45特异性四聚体染色后，通过流动式细胞测量术检测肽特异性CD8+T细胞。
如图40A-40B所示，CUE-102/A02WT137-45IST诱导从促发的PBMC扩增WT137-45特异性CD8+T细胞。在重组人IL-2的存在下，用WT137-45肽对健康供体PBMC进行10天的促发。然后通过磁性分离富集CD8+T细胞，并在存在丝裂霉素C处理的自体PBMC的情况下，在ImmunocultTM培养基中用CUE-102/A02WT137-45IST再刺激8天。在不存在CUE-102/A02的情况下再刺激的细胞用作阴性对照。在用WT137-45特异性四聚体染色后，通过流动式细胞测量术检测肽特异性CD8+T细胞。
如图41A-41B所示，与野生型IL-2相比，亲和力降低的含有IL-2的CUE-102/A02WT137-45IST降低与全身性IL-2活化相关的风险。在ImmunocultTM培养基中用
(IL-2)或CUE-102/A02WT137-45IST刺激五个健康供体PBMC持续18小时。刺激后，收获上清液，并通过免疫测定法评估TNF-α、IL-6和IFN-γ的水平(图41A)。NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的CD69上调通过流动式细胞测量术对来自相同培养孔的细胞进行评估(图41B)。在不存在
(IL-2)或CUE-102/A02WT137-45IST的情况下培养的细胞用作阴性对照。
如图42A-42B所示，CUE-102/A02WT137-45IST扩增的T细胞是识别和杀伤递呈WT137-45肽的靶细胞的多功能性CTL。将健康供体PBMC在重组人IL-2存在下用WT137-45肽促发10天，并在丝裂霉素C处理的自体PBMC存在下，在ImmunocultTM培养基中用WT137-45肽或CUE-102/A02WT137-45IST扩增8天。使用WT137-45特异性PE标记的四聚体，通过基于磁珠的分离富集WT137-45特异性CD8+T细胞。图42A：CUE-102/A02WT137-45IST扩增的WT137-45特异性T细胞表达效应分子IFN-γ和TNF-α；并且在与用同源WT137-45肽而不是与对照无关肽(SL9)脉冲的靶T2细胞相互作用4小时后上调脱粒标记物CD107a。图42B：在以不同T细胞效应物:靶细胞比率进行的过夜培养中，扩增的WT137-45特异性T细胞杀伤同源WT137-45肽脉冲的T2细胞，而不是对照肽脉冲的T2细胞。通过流动式细胞测量术评估特异性杀伤，比较了在过夜培养时用同源肽与用对照肽脉冲的活T2细胞的比率。
实施例5
测试TMMP模拟CD8+T细胞的抗原特异性增殖的能力。TMMP包含以下各物作为表位：i)WT1 235-243(C235S；M236Y)；或ii)WT1 239-247(Q240Y)。全部TMMP包括A24等位基因I类MHC重链。
测试TMMP模拟CD8+ T细胞的抗原特异性增殖的能力。TMM P包含以下各物作为表位：i)WT1 235-243(C235S；M236Y)；或ii)WT1 239-247(Q240Y)。全部TMMP包括A24等位基因I类MHC重链。TMMP包含：a)“重链”多肽，其包含：i)包含Y84C和A236C取代的A24:02等位基因的I类HLA-A重链多肽；ii)IL2(H16A；F42A)免疫调节(“MOD”)多肽的两个拷贝；及iii)包含L234A和L235A取代的IgG1Fc多肽；和b)“轻链”多肽构建体3973(图37B)或3529(图20M)，其包含：i)WT1 235-243(C235S；M236Y)或WT1 239-247(Q240Y))；和ii)包含R12C取代的β-2微球蛋白多肽。重链和轻链多肽通过2个二硫键连接。“重链”包含图20B中描绘的链3425的氨基酸序列。TMMP包含“重”链和“轻”链异二聚体的同二聚体，通过在各自IgG1Fc区之间形成的二硫键连接。
将从人供体获得的外周血单核细胞(PBMC)在体外与不同浓度(0nM、10nM、100nM、300nM或1000nM)的TMMP一起培育10天。在10天培育期之后，测定对表位有特异性的细胞的数目。来自健康人供体的PBMC(Leukopak 22(“L22”)；Leukopak 24(“L24”)；Leukopak 29(“L29”)；及Leukopak 31(“L31”))的数据示于图43中。来自健康人供体的PBMC(Leukopak24(“L24”)；Leukopak 30(“L30”)；及Leukopak 31(“L31”))的数据示于图44中。
图43和图44中提供的数据显示，WT1特异性TMMP可在10天的刺激培养过程中诱导WT1特异性T细胞从总PBMC的扩增。
材料和方法
使用分离术仪器获得来自健康供体的Leukopak。将Leukopak以等体积的室温磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释。通过如下密度梯度离心从稀释的leukopak分离PBMC：在50mL锥形管中以13mL Ficoll-Paque使30mL稀释的leukopak处于下层，且在400g下在室温下在无制动器的摆动桶式转子中离心30分钟。从血浆-Ficoll界面收集单核细胞层(淋巴细胞、单核细胞及血小板)，将其转移至新的50mL锥形管中且通过在室温下在300g下离心10分钟来以3倍过量PBS洗涤。在小心除去上清液后，使细胞再悬浮且通过在室温下在200g下离心10分钟来以50mL PBS洗涤以除去血小板。在洗涤及血小板除去后，将所获得的PBMC自50mL管中汇集，在PBS中再悬浮，计数，通过在300g下离心10分钟来沉淀，且使其以50x106个细胞/ml的最终浓度再悬浮于细胞冷冻培养基中。
由如上文所述的两个leukopak制备人健康供体PBMC。在实验当天，在37℃水浴中使细胞解冻且在温热的ImmunoCultTM-XF Cell Expansion Media(StemcellTechnologies)中通过在350x g下离心6分钟来洗涤。除去上清液，且使细胞再悬浮于ImmunoCultTM培养基中。使用Vi-Cell XR自动细胞计数器(Beckman-Coulter)评估活细胞计数。调整培养基体积以使细胞浓度为5x106个细胞/ml且在6孔板中每孔接种2mL细胞(等同于10x106个细胞)。在总体积4ml的培养基中，将PBMC用指定量的Immuno-STAT、肽(10ug/mL)和IL-2(50IU/mL)或仅用培养基刺激。将细胞在37℃、5％CO2下刺激10天，其中在第5天和第7天通过从孔中抽吸2mL培养上清液且再添加2mL新鲜培养基来更换培养基。
在培养后，收获细胞且通过在350x g下离心5分钟来沉淀，通过Vi-Cell XR自动细胞计数器(Beckman-Coulter)确定活细胞计数，且通过用以下各物染色来处理细胞以用于流动式细胞测量术：活力染剂、适当的WT1肽特异性HLA-A*24:02四聚体(MBLInternational)及针对CD3、CD14、CD19、CD56、CD4(Biolegend)、CD8(BD Biosciences)的抗体。洗涤染色的细胞且通过流动式细胞测量术进行分析。
使用Attune NxT流动式细胞测量仪(Invitrogen)进行数据采集。将所采集的数据输出为fcs文档且使用Flowjo软件(Tree Star,OR)进行分析。
抗原特异性CD8+T细胞的绝对数量绘制在所示的图中，描绘了抗原特异性细胞的扩增作为Immuno-STAT浓度的函数。
实施例6
每周一次向幼稚的HLA-A2(AAD)转基因小鼠静脉内给予30mg/kg的TMMP，总共三个剂量，所述TMMP包含由异二聚体1715-2380(“TMMP 1715-2380”)形成的同二聚体。第一剂由瞬时转染细胞系产生的TMMP 1715-2380组成，而随后的两剂由稳定细胞系产生的TMMP1715-2380组成。然后在最后一剂后7天在外周血单核细胞(PBMC)中测量WT1 37-45特异性CD8+ T细胞的频率。在存在蛋白转运抑制剂和抗CD107a抗体的情况下，用WT1 37-45肽在37℃下再刺激分离的PBMC持续5小时以测量脱粒。接着用WT1 37-45/A02四聚体、活力染料和细胞表面标记物(包括CD3、CD4、CD8、CD45、CD11b、CD19和CD44)对细胞进行表面染色，然后进行针对IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B的细胞内染色。通过分析CD8+ T细胞群(定义为单个、活的、CD11b-、CD19-、CD45+、CD3+、CD4-)中四聚体+细胞的频率来检测抗原特异性细胞。发现治疗小鼠中WT1 37-45特异性(“％AgS”)CD8+ T细胞的频率高于未用TMMP 1715-2380治疗的幼稚小鼠中观察到的频率(参见图45)。
尽管本发明已关于其具体实施方案加以描述，但本领域技术人员应了解的是可在不脱离本发明的实际精神和范围下进行各种变化且可用等效物进行替代。此外，可进行许多修改以使特定情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤适合于本发明的目标、精神和范围。所有这些修改皆意图在随附于此的申请专利范围的范围内。
Claims (54)
1.一种T细胞调节多聚体多肽，其包含：
至少一种异二聚体，所述至少一种异二聚体包含：
a)第一多肽，所述第一多肽包含：
i)包含氨基酸序列X1X2X3TWNQMNL(SEQ ID NO:460)或X2X3TWNQMNL(SEQ ID NO:461)的威尔姆氏瘤-1(WT-1)肽表位，其中X1、X2和X3各自独立地为任何氨基酸，条件是N端氨基酸不为Cys，并且其中所述WT-1肽表位具有9至25个氨基酸的长度；和
ii)第一I类主要组织相容性复合物(MHC)多肽；
b)第二多肽，所述第二多肽包含第二I类MHC多肽，和
c)至少一种活化免疫调节多肽，
其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含所述至少一种免疫调节多肽，并且任选地其中所述第一多肽或所述第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
2.如权利要求1所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述一种或多种免疫调节多肽中的至少一个为变体免疫调节多肽，所述变体免疫调节多肽呈现出对同源共免疫调节多肽的亲和力与相应野生型免疫调节多肽对所述同源共免疫调节多肽的亲和力相比有所减小。
3.如权利要求2所述的T细胞调节多聚体多肽，其中当通过生物层干涉术测量时，所述野生型免疫调节多肽与同源共免疫调节多肽的结合亲和力同所述变体免疫调节多肽与所述同源共免疫调节多肽的结合亲和力的比率为至少1.5:1。
4.如权利要求2或3所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述变体免疫调节多肽以选自由以下组成的组的亲和力结合所述共免疫调节多肽：约10-4M至约10-7M、约10-4M至约10-6M和约10-4M至约10-5M。
5.如权利要求1至4中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a1)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b1)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述至少一种免疫调节多肽；
ii)所述第二MHC多肽；和
iii)Ig Fc多肽；或
a2)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b2)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；
ii)所述至少一种免疫调节多肽；和
iii)Ig Fc多肽；或
a3)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述第一MHC多肽；并且
b3)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；
ii)Ig Fc多肽；和
iii)所述至少一种免疫调节多肽；或
a4)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述至少一种免疫调节多肽；
ii)所述WT-1肽表位；
ii)所述第一MHC多肽；并且
b4)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；和
ii)所述Ig Fc多肽；或
a5)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；
ii)所述第一MHC多肽；和
iii)所述至少一种免疫调节多肽；并且
b5)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述第二MHC多肽；和
ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
6.如权利要求1至4中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一MHC多肽为β2-微球蛋白多肽；且所述第二MHC多肽为I类MHC重链多肽；或
b)所述第一MHC多肽为I类MHC重链多肽；且所述第二MHC多肽为β2-微球蛋白多肽。
7.如权利要求6所述的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述β2-微球蛋白多肽；并且
b)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述至少一种免疫调节多肽；
ii)所述I类MHC重链多肽；和
iii)Ig Fc多肽。
8.如权利要求6所述的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述WT-1肽表位；和
ii)所述β2-微球蛋白多肽；并且
b)所述第二多肽以从N端至C端的次序包含：
i)所述I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽；和
iii)至少一种免疫调节多肽。
9.如权利要求1至8中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽选自由以下组成的组：细胞因子、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、CD40多肽、CD70多肽及其组合。
10.如权利要求1至9中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽包括IL-2多肽。
11.如权利要求1至10中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含至少两种免疫调节多肽，且其中所述免疫调节多肽中的至少两个是相同的，任选地其中所述两种或更多种免疫调节多肽是串联的。
12.如权利要求1至11中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述至少一种免疫调节多肽中的一个或多个是变体IL-2多肽，其呈现出对IL-2受体的亲和力与野生型IL-2多肽对所述IL-2受体的亲和力相比有所减小。
13.如权利要求12所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述一个或多个变体IL-2多肽包含：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
14.如权利要求1至13中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一多肽与所述第二多肽彼此共价连接，任选地其中所述共价键联是经由二硫键。
15.如权利要求1至14中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽或介于所述表位与所述第一MHC多肽之间的接头包含提供第一Cys残基的氨基酸取代，其中所述第二MHC多肽包含提供第二Cys残基的氨基酸取代，且其中所述二硫键联在所述第一Cys残基与所述第二Cys残基之间。
16.如权利要求1至15中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的二硫键：i)存在于所述WT-1肽表位与所述第一I类MHC多肽之间的接头中的Cys，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由Y84C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽。
17.如权利要求1至15中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的二硫键：i)经由R12C取代引入所述第一I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由A236C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽。
18.如权利要求1至15中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多肽包含在以下两者之间的第一二硫键：i)存在于所述WT-1肽表位与所述第一I类MHC多肽之间的接头中的Cys，其中所述第一I类MHC多肽为β2M多肽；与ii)经由Y84C取代引入所述第二I类MHC多肽中的Cys残基，其中所述第二I类MHC多肽为I类MHC重链多肽；和在以下两者之间的第二二硫键：i)经由R12C取代引入所述β2M多肽中的Cys残基；与ii)经由A236C取代引入所述I类MHC重链多肽中的Cys残基。
19.如权利要求16或权利要求18所述的T细胞调节多聚体多肽，其中介于所述WT-1肽表位与所述第一MHC之间的所述接头为GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:319)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
20.如权利要求1至19中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽表位具有9个或10个氨基酸的长度。
21.如权利要求1至20中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述Ig Fc多肽包含图5D、图5E、图5F、图5G及图5H中描绘的氨基酸序列中的一个。
22.如权利要求1至21中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述WT-1肽包含氨基酸序列SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)、GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)、SYTWNQMNL(SEQ IDNO:453)或GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)。
23.如权利要求1至21中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽或所述第二MHC多肽包含与图7A.3中描绘的HLA-A*2402氨基酸序列的氨基酸25-299具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
24.如权利要求1至23中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述第一MHC多肽为β2M多肽，且其中所述第二MHC多肽包含与HLA-A24多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述表位选自由以下组成的组：SMTWNQMNL(SEQ ID NO:451)、GCMTWNQMNL(SEQ ID NO:452)、SYTWNQMNL(SEQ ID NO:453)及GCYTWNQMNL(SEQ ID NO:454)，且其中所述Ig Fc多肽包含图5G或图5H中描绘的氨基酸序列。
25.如权利要求1所述的T细胞调节多聚体多肽，其中：
a)所述第一多肽包含图37B中描绘的氨基酸序列；并且
b)所述第二多肽包含图20B中描绘的氨基酸序列。
26.如权利要求1至25中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，其中所述多聚体多肽包含第一异二聚体和第二异二聚体，且其中所述第一异二聚体与所述第二异二聚体通过所述第一异二聚体与所述第二异二聚体的Ig Fc多肽之间的一个或多个二硫键来共价结合。
27.一种核酸，其包含编码如权利要求1至26中任一项所述的第一多肽或第二多肽的核苷酸序列。
28.一种表达载体，其包含如权利要求27所述的核酸。
29.一种选择性调节对于威尔姆氏瘤-1(WT-1)表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与如权利要求1至26中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述接触选择性调节所述WT-1表位特异性T细胞的活性。
30.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含如权利要求1至26中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽的药物组合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述癌症为急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、威尔姆氏瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤或肾母细胞瘤。
32.如权利要求30或31所述的方法，其进一步包括向所述个体施用一种或多种检查点抑制剂。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述检查点抑制剂为结合至选自由以下组成的组的多肽的抗体：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述检查点抑制剂为对PD-1、PD-L1或CTLA4有特异性的抗体。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述一种或多种检查点抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、披地单抗、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿维鲁单抗、伊匹珠单抗、曲利木单抗、披地单抗、IMP321、MGA271、BMS-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠单抗、瓦利鲁单抗、阿维单抗、加利昔单抗、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德、NLG-919、INCB024360、KN035及其组合。
36.一种调节个体的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至26中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽，
其中所述施用诱导表位特异性T细胞反应和表位非特异性T细胞反应，且
其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1。
37.一种选择性递送免疫调节多肽至靶T细胞的方法，所述方法包括使混合T细胞群与如权利要求1至26中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述混合T细胞群包含所述靶T细胞和非靶T细胞，其中所述靶T细胞对存在于所述T细胞调节多聚体多肽内的所述WT-1表位具有特异性，且其中所述接触递送存在于所述T细胞调节多聚体多肽内的所述一种或多种免疫调节多肽至所述靶T细胞。
38.一种检测从个体获得的混合T细胞群中结合WT-1表位的靶T细胞的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述混合T细胞群与如权利要求1至26中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽在体外接触，其中所述T细胞调节多聚体多肽包含所述WT-1表位；和
b)检测T细胞响应于所述接触的活化和/或增殖，其中活化和/或增殖的T细胞指示所述靶T细胞的存在。
39.一种T细胞调节多聚体多肽(TMMP)，其包含：
至少一种异二聚体，所述至少一种异二聚体包含：
a)第一多肽，其以从N端至C端的次序包含：
i)威尔姆氏瘤-1(WT-1)肽，其中所述WT-1肽具有氨基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:259)；
ii)具有氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:317)的接头；和
iii)β2-微球蛋白多肽，其包含在SEQ ID NO:311中列出的氨基酸序列；和
b)第二多肽，其以从N端至C端的次序包含：
i)变体IL-2多肽，其包含SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala；
ii)(GGGGS)4接头；
iii)变体IL-2多肽，其包含SEQ ID NO:188中列出的氨基酸序列，其中X1为Ala且其中X2为Ala；
iv)主要组织相容性复合物(MHC)重链多肽，其包含SEQ IDNO:341中列出的氨基酸序列；
v)包含氨基酸序列AAAGG的接头；和
vi)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
40.如权利要求39所述的TMMP，其中所述Ig Fc多肽为变体Ig Fc多肽，其相对于所述野生型多肽包含一个或多个序列变异，其中所述Ig Fc多肽通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导细胞溶解的能力降低或大体消除，任选地其中所述Ig Fc多肽包含与图5A-5G或5H中描绘的Fc区的氨基酸序列具有至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
41.如权利要求40所述的TMMP，其中所述Ig Fc多肽是变体人IgG1 Fc多肽，其包含L234A和/或L235A取代(图5H中描绘的氨基酸序列中的L14和L15)。
42.如权利要求39至41中任一项所述的TMMP，其中所述第一多肽包含具有图14B和SEQID NO:423中列出的氨基酸序列的构建体2380；并且其中所述第二多肽包含具有图14J和SEQ ID NO:486中列出的氨基酸序列的构建体1715Δ。
43.一种TMMP，其包含如权利要求39至42中任一项所述的异二聚体的同二聚体。
44.一种核酸，其包含编码如权利要求39至42中任一项所述的第一多肽和/或第二多肽的核苷酸序列。
45.一种表达载体，其包含如权利要求44所述的核酸。
46.一种基因修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞用如权利要求44所述的核酸或如权利要求45所述的表达载体进行基因修饰。
47.一种制备T细胞调节多聚体多肽(TMMP)的方法，所述方法包括在培养基中在使得如权利要求46所述的基因修饰的宿主细胞合成所述TMMP的条件下体外培养所述宿主细胞。
48.一种选择性调节对于威尔姆氏瘤-1(WT-1)表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与如权利要求39至43中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽接触，其中所述接触选择性调节所述WT-1表位特异性T细胞的活性。
49.一种治疗患有与WT-1相关的癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含如权利要求39至43中任一项所述的T细胞调节多聚体多肽的药物组合物。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述癌症为急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、威尔姆氏瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤或肾母细胞瘤。
51.如权利要求49或50的方法，其进一步包括向所述个体施用一种或多种免疫检查点抑制剂。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为结合至选自由以下组成的组的多肽的抗体：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为对PD-1、PD-L1或CTLA4有特异性的抗体。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、披地单抗、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿维鲁单抗、伊匹珠单抗、曲利木单抗、披地单抗、IMP321、MGA271、BMS-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠单抗、瓦利鲁单抗、阿维单抗、加利昔单抗、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德、NLG-919、INCB024360、KN035及其组合。
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