CN1196495C - 突变的人cd80及其制备和应用组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了改良的疫苗及其使用方法。还公开了用于治疗自身免疫病或移植排斥反应的免疫抑制组合物以及这种组合物的使用方法。

Description

突变的人CD80及其制备和应用组合物和方法
发明领域
本发明涉及免疫个体的组合物和方法。本发明涉及免疫抑制组合物、其组分以及其制备和使用方法。
发明背景
本发明涉及美国临时专利申请60/131,764，申请于1999年4月30日，在此文中引入以做参考。
CD28是在大多数成熟T细胞和胸腺细胞中组成性表达的一种细胞表面糖蛋白。CTLA-4受体仅在活化后48-72小时的T细胞中可测得，而在静息T细胞中不存在。CD28/CTLA-4分子的主要配体是表达于专门的抗原呈递细胞(APC)表面的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)。目前对于存在至少两种受体(CD28和CTLA-4)及两种配体(CD86和CD80)的生物学原理尚不清楚。最初认为CD86和CD80抗原在功能上是相似的。但对于这两种共刺激分子不同表达方式的了解暗示了不同功能的存在。CD86在APC上组成性表达。APC活化后，CD86的表达快速上升，接着渐渐降低到基线水平。CD80的表达比CD86延迟，并且在免疫应答启始48-72小时内达到最大。CD86的组成性表达以及正调节早于CD80，这暗示，在免疫的早期应答中，CD86发挥了更大的作用，而CD80在后期更为重要。
具有CD28和CTLA-4的共刺激分子的结合动力学数据进一步揭示了CD86和CD80的功能差异。表面胞质团共振分析表明，这两种配体与CTLA-4的结合亲和力均高于与CD28的结合亲和力。进一步的研究揭示，CD86/CTLA-4复合物的解离速度比CD80/CTLA-4的解离速度快。这种亲和力的差异，以及表达CTLA-4和CD80时同样的延迟暗示，CTLA-4和CD80比CTLA-4和CD86分子间的关系更强。
CD86和CD80在体内、体外实验中表现出功能的多样性。抗CD86而非抗CD80的抗体阻止了自身免疫性糖尿病小鼠的疾病发展，但对实验的过敏性脑脊髓炎小鼠有相反的效果。几个实验系统都证明CD86对于引发T细胞对抗源的反应有重要作用。并且，CD80也可能对这些细胞提供调节信号。还发现，在含有HIV-I包膜蛋白的DNA免疫后人外源CD86的表达产生对小鼠T细胞的重要激活信号，但CD80的表达没有同样的效应。编码HIV-I或流感抗原的基因与编码小鼠CD80和CD86的质粒免疫小鼠，也有同样的现象。因此，认为CD86和CD80的功能差异与小鼠体内表达的人共刺激分子不同的免疫原性无关。可以认为是外源的人或小鼠的CD86，刺激了DNA免疫中的抗病毒T细胞的活化。同样产生的CD80没有这种效果。
疫苗可用于使个体对靶抗原产生免疫，所述靶抗原例如为病原体抗原或与涉及人类疾病的细胞相关联的抗原。参与人类疾病的细胞相关抗原包括与癌症相关的肿瘤抗原和涉及自身免疫病的细胞相关抗原。
在设计这些疫苗时认识到，在接种了疫苗的个体中产生靶抗原的疫苗可有效诱导免疫系统的细胞臂。具体而言，减毒的活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗均导致抗原在接种了疫苗的个体的细胞中产生，由此诱导免疫系统中的细胞免疫。另一方面，只包括蛋白和诱导体液应答的死疫苗或灭活疫苗的亚单位疫苗，不诱导良好的细胞免疫应答。
对于提供抗病原体感染保护，和提供有效用于治疗病原体感染、癌症或自身免疫病的免疫介导疗法，细胞免疫应答常常是必须的。因此，在接种了疫苗的个体中产生靶抗原的疫苗是优选的，例如减毒的活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗。
尽管这些疫苗对于预防性或治疗性地使个体免患病原体感染或人类疾病常常是有效的，但改良的疫苗仍是需要的。产生增强的免疫应答的组合物和方法也是需要的。
基因治疗与免疫不同，采用编码非免疫原性蛋白的核酸分子。这种核酸分子的表达在其给予的个体中有良好的疗效。一种具体类型的基因治疗涉及将编码调控个体免疫应答的非免疫原性蛋白的基因给予个体，发挥疗效。例如，可以设计将对与自身免疫病相关的免疫应答有负调节作用的非免疫原性蛋白的基因导入个体以获得疗效。因此，用于调节免疫应答的基因治疗组合物及其制备和使用方法是需要的。
也可以考虑用其他方式调节免疫应答，治疗诸如自身免疫病和细胞、组织、器官的移植物排斥反应。对于可用于调节免疫应答的组合物及方法，以及设计和发现这种用于调节免疫应答的组合物有需要。
附图简述
图1显示在表明抗原特异性的抗病毒CTL应答实施例中所述实验的数据。
图2A和2B显示在表明各种基因构建体诱导淋巴因子产生的实施例中所述实验结果。
图3显示了在表明在各种基因构建体的给予后的CTL活性的实施例中所述实验的数据。
图4显示了在表明去除细胞群后测量后的在各种基因构建体的给予后的CTL活性的实施例中所述实验的数据。
图5是显示了在表明各种基因构建体免疫的小鼠中产生淋巴细胞对肌肉组织的浸润的实施例中所述实验的照片。
图6为CD80分子的图示。
本发明优选实施方案的说明
申请者发现，人CD80的C区负责在抗原呈递细胞(APC)和T细胞的相互作用中传递负信号。负信号降低了T细胞的活性，并降低了针对APC呈递到T细胞上的抗原的免疫应答。具体而言，T细胞上的T细胞受体(TCR)与APC上由组织相容性复合体与抗原形成的MHC/抗原复合体相互作用，伴随着APC上共刺激分子CD80和CD86与T细胞上的CD28分子的相互作用。这种相互作用导致了T细胞的活化和免疫应答的增强。但是，T细胞活化后表达CTLA-4，CTLA-4与CD80分子相互作用产生主导性的负信号，进而排除了前一阶段由CD80/CD86和CD28作用产生的共刺激。CTLA-4与CD80的相互作用削弱了T细胞参与的免疫应答。
申请者的发现包括本发明的两个方面。本发明的一个方面公布了CD80突变体及其编码核酸。这种CD80突变体拥有CD80的共刺激活性，但不传递CTLA-4与CD80相互作用产生的负信号。这种CD80突变体以蛋白质或其编码核酸的形式与蛋白质免疫原或编码这种蛋白质免疫原的DNA共同给予个体细胞，从而可用于免疫方案。本发明的这个方面，CD80突变体是免疫方案中的分子佐剂。本发明的另一方面，包括含有C区CD80突变体及其编码核酸。这种CD80突变体可以传递CTLA-4与CD80相互作用产生的负信号。这种CD80突变体用于治疗诸如自身免疫病或细胞、组织、器官的移植物排斥反应。这种产生负信号CD80突变体以蛋白质或其编码核酸的形式给予个体细胞。本发明这一方面的CD80突变体是自免疫和免疫抑制治疗物。
人CD80的核酸序列及氨基酸序列已公布，源自：Freeman等(1989)免疫学杂志(J.Immunol.)，143(8)：2714-2722，Selvakumar等(1992)免疫遗传学(Immunogenetics)36(3)：175-181，Freeman等(1991)外科学杂志(J.Ex.Med.)174(3)：625-631，Lanier等(1989)免疫学杂志154(1)：97-105及Genbank接入号P33681，这文献在此收录以做参考。
CD86(B7.2)最早出现于Azuma，M.等，自然杂志(Natare)，1993366：76-79，该文献引入本文作参考。附图2B显示B7.2的核酸序列和可能的氨基酸序列，此序列信息参见Genbank数据库U04343，在此引入以做参考。
人CD80表达产生一个288个氨基酸的蛋白质，加工后成为由35-288个氨基酸组成的成熟蛋白质。CD80分为4个区：可变(V)区、恒定(C)区、跨膜(tm)区、胞质尾区(ct)。35-242的氨基酸都是胞外区。其中43-123为V区，也称类免疫球蛋白V区。其中155-223为C区，也称类免疫球蛋白C2型区。243-263为跨膜区，264-288为胞质尾区。
此处所用术语“CD80突变体”、“C区CD80突变体”、“C区缺失的CD80突变体”、和“CD80ΔC突变体”可以互换使用，是指含功能性的CD80/CD86 V区且至少有一个功能性的CD80非C区，以及不含CD80的功能性C区，从而缺失所有或部分C区获得的分子。这种分子不能传递野生型CD80 C区与CTLA-4作用的相关负调节信号。
此处所用术语“至少有一个功能性CD80的非C区”和“CD80的功能性C区”中的“CD80功能区”是指CD80的完整蛋白质区域或保有完整区域活性的部分区域。如CD80的功能性V区是指43-123氨基酸序列或其片段，包括含有但并不局限于其它CD80序列的蛋白质片段，其为含有CD28结合能力的片段。CD80的功能性C区是指155-223氨基酸序列或其片段，包括含有但并不局限于其它CD80序列的蛋白质片段，其为保有CTLA-4结合能力，并能传递负信号的片段。一个无CD80的功能性C区的蛋白可能也包含155-223氨基酸序列的片段，该片段失去了CTLA-4结合及传递负信号的能力。如果由于邻近序列构象或其它改变使C区非功能化，一个不含CD80的功能性C区的类似蛋白也可包括155-223位氨基酸。CD80的功能性跨膜区是指243-263氨基酸序列或其保有锚定于膜上，防止分泌能力的片段。CD80的功能性胞质尾区是指264-288氨基酸序列或任何当突变CD80表达后存在于细胞质中的氨基酸片段。
此处所用术语“C区+CD80蛋白质”和“C区蛋白”可以互换使用，是指含有功能性CD80 C区并因全部或部分C区的存在可以传递CTLA-4与野生型CD80 C区作用相关性负信号的蛋白质分子。
本发明的一个方面涉及改进的接种疫苗组合物及其方法，尤其是编码靶抗原的DNA疫苗，这种DNA疫苗给予个体后，被摄入并表达，产生针对该靶抗原的免疫应答。根据本发明，CD80ΔC突变蛋白的编码DNA被共传递给个体，该DNA的表达产生CD80ΔC突变蛋白，其增强针对该免疫原的免疫应答。
CD80ΔC突变体在表达靶抗原的免疫个体细胞中可以显著增强针对该靶抗原的免疫应答。CD80ΔC突变体的编码基因在个体细胞中表达，可以增强DNA疫苗、重组载体疫苗和减毒疫苗的作用效果。
CD80ΔC突变蛋白可以显著增强针对该靶抗原的细胞免疫应答。相应的，本发明将CD80ΔC突变体的编码基因可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接，作为DNA疫苗、亚基无毒重组载体疫苗及减毒的活疫苗的辅助部分共免疫动物。这种方法改良的疫苗有良好的效果。CD80ΔC突变蛋白也可以作为蛋白质佐剂与免疫原或编码免疫原的基因构建体共免疫。
在本发明的一些实施方案中，提供了CD80ΔC突变体作为免疫方案中的分子佐剂，所述CD80ΔC突变体或者含有功能性CD80 V区或者含有功能性CD86 V区。CD80ΔC突变体不含功能性CD80 C区。在一些实施方案中，所述C区是缺失的，并且V区直接与跨膜区相连。在一些实施方案中，插入CD86 C区以替代CD80 C区。在一些实施方案中，CD80ΔC突变体中，在V区后包括了非CD80、非CD86序列。一些实施方案包括CD80跨膜区。一些实施方案包括CD86跨膜区。在一些实施方案中，缺失了CD80跨膜区且未被其他任何序列替代。在一些实施方案中，用非CD80、非CD86序列替代CD80跨膜区。在一些实施方案中，包括CD80胞质尾区。一些实施方案中，包括CD86胞质尾区。在一些实施方案中，缺失了CD80胞质尾区且未被其他任何序列替代。在一些实施方案中，用非CD80、非CD86序列替代CD80胞质尾区。已发现，在通过给予编码CD80ΔC突变体的遗传物质而将CD80ΔC突变体传递给细胞的那些实施方案中，那些包括跨膜区和胞质尾区的CD80ΔC突变体特别适用于刺激免疫应答。在一些实施方案中，提供了CD80跨膜区和CD80胞质尾区。在一些实施方案中，提供了CD86跨膜区和CD86胞质尾区。在一些实施方案中，提供了CD80跨膜区和CD86胞质尾区。在一些实施方案中，提供了CD86跨膜区和CD80胞质尾区。在通过给予CD80ΔC突变蛋白而将CD80ΔC突变体传递给细胞的那些实施方案中，可提供CD80ΔC突变蛋白作为可溶蛋白，其跨膜区和胞质尾区是缺失的，在一些情况下，它们被可溶部分所替代。
本发明的一些方面涉及一种包含80V、80tm、80ct并不包含80C的经分离的蛋白质。此处所说的蛋白质包含80V或86V或这二者，并且选择性的包括80tm、86tm、80ct、86ct中的任一或多个成分。其中
80V是指CD80的可变区或其功能片段；
86V是指CD86的可变区或其功能片段；
86C是指CD86的C区或其功能片段；
80tm是指CD80的跨膜区或其功能片段；
86tm是指CD86的跨膜区或其功能片段；
80ct是指CD80的胞质尾区或其功能片段；
86ct是指CD86的胞质尾区或其功能片段。
根据一些实施方案，有如下结构：
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9
其中
R1是指0-50个氨基酸；
R2是指80V或86V；
R3是指0-50个氨基酸；
R4是指86C或0个氨基酸；
R5是指0-50个氨基酸；
R6是指80tm或86tm；
R7是指0-50个氨基酸；
R8是指80ct或86ct；且
R9是指0-50个氨基酸。
一些实施方案中，R1是指0-25个氨基酸；R3是指0-25个氨基酸；R5是指0-25个氨基酸；R7是指0-25个氨基酸；和/或R9是指0-25个氨基酸。
一些实施方案中，R1是指0-10个氨基酸；R3是指0-10个氨基酸；R5是指0-10个氨基酸；R7是指0-10个氨基酸；和/或R9是指0-10个氨基酸。
一些实施方案中，CD80突变蛋白选自如下结构：
80V/缺失区域/80tm/80ct；
80V/缺失区域/80tm/86ct；
80V/缺失区域/86tm/80ct；
86V/缺失区域/80tm/80ct；
86V/缺失区域/80tm/86ct；
86V/缺失区域/86tm/80ct；
80V/缺失区域/86tm/86ct；
80V/86C/80tm/80ct；
80V/86C/80tm/86ct；
80V/86C/86tm/80ct；
86V/86C/80tm/80ct；
86V/86C/80tm/86ct；
86V/86C/86tm/80ct；
80V/86C/86tm/86ct；
80V/缺失区域/80tm/缺失区域；
80V/缺失区域/86tm/缺失区域；
86V/缺失区域/80tm/缺失区域；
80V/86C/80tm/缺失区域；
80V/86C/86tm/缺失区域；
86V/86C/80tm/缺失区域；
86V/86C/80tm/缺失区域；
86V/86C/缺失区域/80ct；
80V/86C/缺失区域/80ct；
80V/缺失区域/缺失区域/80ct；
86V/缺失区域/缺失区域/80ct；
80V/86C/缺失区域/缺失区域；
及80V。
一些实施方案中，CD80突变蛋白选自如下结构：
R-80V-R-缺失区域-R-80tm-R-80ct-R；
R-80V-R-缺失区域-R-80tm-R-86ct-R；
R-80V-R-缺失区域-R-86tm-R-80ct-R；
R-86V-R-缺失区域-R-80tm-R-80ct-R；
R-86V-R-缺失区域-R-80tm-R-86ct-R；
R-86V-R-缺失区域-R-86tm-R-80ct-R；
R-80V-R-缺失区域-R-86tm-R-86ct-R；
R-80V-R-86C-R-80tm-R-80ct-R；
R-80V-R-86C-R-80tm-R-86ct-R；
R-80V-R-86C-R-86tm-R-80ct-R；
R-86V-R-86C-R-80tm-R-80ct-R；
R-86V-R-86C-R-80tm-R-86ct-R；
R-86V-R-86C-R-86tm-R-80ct-R；
R-80V-R-86C-R-86tm-R-86ct-R；
R-86V-R-缺失区域-R-80tm-R-缺失区域-R；
R-80V-R-缺失区域-R-86tm-R-缺失区域-R；
R-86V-R-缺失区域-R-80tm-R-缺失区域-R；
R-80V-R-86C-R-80tm-R-缺失区域-R；
R-80V-R-86C-R-86tm-R-缺失区域-R；
R-86V-R-86C-R-80tm-R-缺失区域-R；
R-86V-R-86C-R-80tm-R-缺失区域-R；
R-86V-R-86C-R-缺失区域-R-80ct-R；
R-80V-R-86C-R-缺失区域-R-80ct-R；
R-80V-R-缺失区域-R-缺失区域-R-80ct-R；
R-86V-R-缺失区域-R-缺失区域-R-80ct-R；
R-80V-R-86C-R-缺失区域-R-缺失区域-R；和
R-80V-R；
其中，
80V是指CD80的可变区或其功能片段；
86V是指CD86的可变区或其功能片段；
86C是指CD86的C区或其功能片段；
80tm是指CD80的跨膜区或其功能片段；
86tm是指CD86的跨膜区或其功能片段；
80ct是指CD80的胞质尾区或其功能片段；
86ct是指CD86的胞质尾区或其功能片段；
缺失区域是指0个氨基酸；且
R是指各自独立的0-100个氨基酸的片段。
一些实施方案中，R是指各自独立的0-50个氨基酸的片段。一些实施方案中，R是指各自独立的0-30个氨基酸的片段。一些实施方案中，R是指各自独立的0-20个氨基酸的片段。
本发明的一些实施方案中，CD80突变体选自：
C区缺失的CD80；
CD86的跨膜区取代了CD80跨膜区并缺失C区的CD80；
CD86的胞质尾区取代了CD80胞质尾区并缺失C区的CD80；
CD86的V区取代了CD80 V区并缺失C区的CD80；
CD86的跨膜区和可变区分别取代了CD80跨膜区和可变区，并缺失C区的CD80；
CD86的胞质尾区和可变区分别取代了CD80胞质尾区和可变区，并缺失C区的CD80；
CD86的跨膜区和胞质尾区分别取代了CD80的跨膜区和胞质尾区，并缺失C区的CD80；
CD86的C区取代了CD80 C区的CD80；
CD86的跨膜区和C区分别取代了CD80跨膜区和C区的CD80；
CD86的胞质尾区和C区分别取代了CD80胞质尾区和C区的CD80；
CD86的C区和可变区分别取代了CD80的C区和可变区的CD80；
CD86的跨膜区、可变区和C区分别取代了CD80跨膜区、可变区和C区的CD80；
CD86的C区、可变区和胞质尾区分别取代了CD80的C区、可变区和胞质尾区的CD80；
CD86的跨膜区、C区和胞质尾区分别取代了CD80跨膜区、C区和胞质尾区的CD80；
C区和胞质尾区缺失的CD80；
CD86的跨膜区取代了CD80跨膜区并缺失C区和胞质尾区的CD80；
CD86的V区取代了CD80的V区并缺失C区和胞质尾区的CD80；
CD86的跨膜区、C区和胞质尾区分别取代了CD80跨膜区、可变区和胞质尾区的CD80；
CD86的C区取代了CD80的C区并缺失胞质尾区的CD80；
CD86的跨膜区和C区分别取代了CD80跨膜区和C区，并缺失胞质尾区的CD80；
CD86的V区和C区分别取代了CD80的V区和C区，并缺失胞质尾区的CD80；
CD86的V区和C区分别取代了CD80 V区和C区，并缺失跨膜区的CD80；
CD86的C区取代了CD80的C区并缺失跨膜区的CD80；
跨膜区和C区缺失的CD80；
CD86的V区取代了CD80的V区并缺失C区和跨膜区的CD80；
CD86的C区取代了CD80的C区并缺失跨膜区和胞质尾区的CD80；
缺失结构区、跨膜区和胞质尾区的CD80；
CD80 V区或其功能片段。
CD80ΔC突变体的蛋白质形式可被用作疫苗的成份，或者，带有CD80ΔC突变体编码序列的基因构建体被用作疫苗的成份，在任何一种情况下，这种疫苗都可以用于预防或治疗的方法。
根据本发明的一些优选方案，DNA疫苗由带有免疫原编码序列的DNA分子和编码CD80ΔC突变体序列的DNA分子组成，本发明的改进之处涉及在含有靶抗原核酸序列的DNA疫苗中，另加入含有编码CD80ΔC突变蛋白的遗传物质。
本发明涉及将遗传物质导入个体细胞中的方法，这种方法可以诱导针对编码该靶抗原或肽的免疫应答，这种方法包含将单个核酸分子或由两种核酸分子组成的组合物给予个体组织，前者包含靶抗原蛋白质和CD80ΔC突变蛋白的编码序列，后者由一个含有靶蛋白质编码序列的核酸分子和一个含有CD80ΔC突变蛋白的编码序列的核酸分子组成，核酸分子可能是质粒DNA，重组载体或减毒疫苗遗传物质的部分。
本发明提供了预防和/或治疗个体以对抗病原或异常疾病相关细胞的组合物及其使用方法。组合物的组成，其一包括带有编码与要靶向的病原体或细胞上的免疫原性蛋白质有至少一个相同表位的蛋白质或肽的遗传物质，其二包括编码CD80ΔC突变蛋白的编码序列，这种遗传物质在个体细胞中表达，作为靶免疫原诱导免疫应答，产生的免疫应答与其靶向的病原或细胞作用，而且是广谱的：除了体液免疫外，也诱导了两种细胞免疫应答。本发明的方法可以用于预防性和治疗性免疫，包括保护个体不受免疫原侵害，防止特殊的细胞增生，也包括对受病原感染个体的超常增殖性疾病或自身免疫病的治疗。
本文使用的术语“免疫原”、“抗原”、“靶抗原”和“靶蛋白”可互换使用，指的是由本发明的基因构建体编码的肽、多肽和蛋白，它们作为针对其诱导免疫应答的目标。靶蛋白是需要针对其诱导免疫的免疫原性蛋白，其与来自病原体或不希望的细胞类型的蛋白具有至少一个相同的表位，所述不希望的细胞类型例如为癌症细胞或参与自身免疫病的细胞。针对靶蛋白的免疫应答，将保护个体抵抗与靶蛋白相关的特定感染或疾病，或者治疗个体的上述感染或疾病。靶蛋白无须与引发免疫应答的蛋白完全相同。相反，靶蛋白诱导的免疫应答必须能对该蛋白产生交叉反应。
本发明可用于引发针对靶蛋白的广谱免疫应答，所述靶蛋白即与病原体或个体自身的“异常”细胞特异性相关的蛋白。本发明可用于使个体具有对抗病原性物质和生物的免疫性，从而针对病原体蛋白的免疫应答提供对抗病原体的保护性免疫。通过诱发针对与超常增殖性细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答，本发明可用于对抗超常增殖性疾病和障碍如癌症。通过诱发针对与参与自身免疫病的细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答，本发明可用于对抗自身免疫性疾病和障碍。
本发明中，编码靶蛋白和CD80ΔC突变蛋白的DNA或RNA分子导入个体组织细胞中，表达产生该靶蛋白和CD80ΔC突变蛋白，这种编码靶蛋白和CD80ΔC突变蛋白的DNA或RNA都与在个体细胞中表达所须的调控元件连接，包括启动子和多腺苷酸化信号。此外这种基因构建体中可能存在其它元件，如Kozak区。优选的实施方案中，编码靶蛋白和CD80ΔC突变蛋白的DNA或RNA分子独立的存在，并分别连有独立的、在个体细胞中表达所必须的调控元件。本发明还涉及另一些实施方案，其中靶蛋白和CD80ΔC突变蛋白的编码序列作为一个基因构建体存在。这种实施方案中，单一可表达形式产生的多蛋白质可以被加工成两个独立的蛋白质，或以嵌合蛋白存在，并分别行使靶蛋白和CD80ΔC突变蛋白的功能。一些实施方案中，一个单一可表达形式的基因构建体含有两个或更多靶蛋白的基因拷贝和/或两个或多个CD80ΔC突变蛋白的基因拷贝，它们存在于一个单一可表达形式的构建体，产生的多蛋白质可以在表达后加工成亚单位，或作为功能性的多蛋白质维持原状。
本文使用的术语“可表达形式”指的是含有必要的调控元件的基因构建体，所述调控元件可操作地与编码靶蛋白和/或CD80ΔC的编码序列相连接，从而当存在于个体细胞中时，所述编码序列将得以表达。
此处所用术语“有相同表位”指蛋白质组成中至少有一个表位与另一个蛋白的表位相同或基本相似。
此处所用术语“基本相似的表位”指在结构上与另一个蛋白质的表位不完全相同，但却因此可以诱发对该蛋白有交叉反应的细胞或免疫应答的表位。
基因构建体带有可操作地连有基因表达必需调控元件的靶蛋白和/或CD80ΔC突变蛋白的编码序列。本发明提供了基因构建体的多种组合，这些基因构建体包括一个编码靶蛋白和一个CD80ΔC突变体的核苷酸序列的可表达形式。不同的基因构建体组合的DNA或RNA分子导入体细胞后，产生靶蛋白和CD80ΔC突变蛋白，并惊人地增强了针对这种靶蛋白的免疫应答。
本发明可用于使个体对所有病原体如病毒、原核生物和病原性真核生物如单细胞病原生物和多细胞寄生虫具有免疫性。本发明特别可用于使个体对那些感染细胞和未被包封的病原体如病毒，和原核生物如淋病菌属(gonorrhea)、李斯特菌属和志贺菌属具有免疫性。此外，本发明也可用于使个体对原生动物病原体具有免疫性，这些原生动物病原体在生命周期中包括一个阶段，在其中它们是细胞内病原体。本文使用的术语“细胞内病原体”指的是病毒或病原生物，它们在至少一部分复制或生命周期中，存在于宿主细胞内，并在其中产生病原体蛋白或使其得以产生。表1提供了一些病毒科和病毒属的列表，可针对它们制备本发明的疫苗。DNA构建体可用于疫苗中，所述构建体包括编码包括至少一个表位的肽的DNA序列，所述表位与在病原体抗原例如表中列出的那些抗原上展示的表位相同或基本上相似。此外，本发明也可用于使个体对其他病原体具有免疫性，这些病原体包括原核和真核原生生物病原体和多细胞寄生虫，例如表2中列出的那些病原体。
为了产生基因疫苗以防止病原体感染，编码免疫原性蛋白的遗传物质必须包括在遗传构建体中作为目标的编码序列，可针对所述免疫原性蛋白诱导保护性免疫应答。无论是本发明特别适用的细胞内病原体感染还是细胞外病原体感染，未必所有的病原体抗原可引发保护性应答。由于DNA和RNA都比较小，较易于产生，因此本发明提供了允许使用多种病原体抗原进行疫苗接种的额外优点。用于基因疫苗的遗传构建体可包括编码许多病原体抗原的遗传物质。例如在单一构建体中可包括若干病毒基因，由此提供多种目标。
表1和2包括一些病原性物质和生物的列表，可针对它们来制备基因疫苗以保护个体不被它们感染。在一些优选的实施方案中，使个体对病原体具有免疫性的方法是针对HIV、HTLV或HBV的。
本发明另一方面提供了产生针对超常增殖性细胞的广谱保护性免疫应答的方法，和治疗患有超常增殖性疾病的个体的方法，所述超常增殖性细胞是超常增殖性疾病的特征。本文使用的术语“超常增殖性疾病”指的是以细胞超常增殖为特征的那些疾病和障碍。超常增殖性疾病的例子包括各种癌症和牛皮癣。
业已发现，将包括编码与“超常增殖性细胞”相关的免疫原性蛋白的核苷酸序列的遗传构建体引入到个体细胞中，导致这些蛋白在接种了疫苗的个体中产生。本文使用的术语“超常增殖性相关蛋白”指的是与超常增殖性疾病相关的蛋白。为了使个体对超常增殖性疾病具有免疫性，将包括编码与“超常增殖性疾病”相关的蛋白的核苷酸序列的遗传构建体给予个体。
为了使超常增殖性相关蛋白成为有效的免疫原性目标，它必须专门在超常增殖性细胞中产生，或与正常细胞相比，在超常增殖性细胞中的水平较高。靶抗原包括这些蛋白、其片段和肽，所述片段和肽至少包括一个在该蛋白中发现的表位。有时，超常增殖性相关蛋白是编码蛋白的基因突变的产物。突变的基因编码的蛋白与正常蛋白几乎相同，除了具有稍微不同的氨基酸序列之外，这种不同产生不同的表位，在正常细胞中未发现该表位的存在。这样的靶蛋白包括由癌基因如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的蛋白。除了以癌基因产物作为靶抗原之外，用于抗癌治疗和保护计划的靶蛋白包括由B细胞淋巴瘤制备的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施方案中，其也作为靶抗原用于自身免疫病。其他肿瘤相关蛋白可用作靶蛋白，例如被发现以较高水平存在于肿瘤细胞中的蛋白，包括有单克隆抗体17-1A识别的蛋白，和叶酸结合性蛋白。
尽管本发明可用于使个体对若干癌症形式中的一种或多种具有免疫性，但本发明特别可用于预防性地对个体进行免疫，所述个体易于发展成特定癌症，或已患癌症并易于复发。遗传学、技术和流行病学的发展使得能够确定个体癌症发展的概率并估计其危险率。利用遗传筛选和/或家庭健康史，有可能预测特定个体发展出若干癌症类型中任一种的概率。
与之类似，已患有癌症的个体和已接受用于消除癌症的治疗或症状缓解的个体特别易于复发。作为治疗计划的一部分，可使这些个体对他们被确诊患有的癌症具有免疫性，以对抗复发。因此，一旦已知个体患有一种癌症和有复发的危险，可对其进行免疫，以使其免疫系统能够对抗未来所述癌症的发作。
本发明提供了治疗患有超常增殖性疾病的个体的方法。在这些方法中，引入遗传构建体，其用作免疫治疗剂，指导并促进个体的免疫系统对抗超常增殖性细胞，由该遗传构建体产生靶蛋白。
本发明提供了通过诱导针对目标的广谱保护性免疫应答，治疗患有自身免疫性疾病和障碍的个体的方法。所述目标与自身免疫相关，自身免疫包括细胞受体和产生“自”定向抗体的细胞。
T细胞介导的自身免疫病包括风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、干燥综合症、结节病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、关节强硬性脊椎炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、牛皮癣、脉管炎、韦格纳肉芽肿病、局限性回肠炎和溃疡性结肠炎。这些疾病的特征均为存在下述T细胞受体，该受体结合内源性抗体并启动与自身免疫病相关的炎性级联。针对T细胞可变区的疫苗接种将引发包括CTL在内的免疫应答，以消除那些T细胞。
对于RA，已表征了若干参与所述疾病的T细胞受体(TCR)的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-3、Vβ-14、Vβ-17和Vα-17。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种，将引发免疫应答，该免疫应答将靶向参与RA的T细胞。参见：Howell，M.D.等人，1991，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88：10921-10925；Paliard，X.等人，1991，科学(Science)，253：325-329；Williams，W.V.等人，1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，90：326-333；各文献均引入本文作参考。
对于MS，已表征了若干参与所述疾病的TCR的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-7和Vα-10。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种，将引发免疫应答，该免疫应答将靶向参与MS的T细胞。参见：Wucherpfennig，K.W.等人，1990，科学(Science)，248：1016-1019；Oksenberg，J.R.等人，1990，自然(Nature)，345：344-346；各文献均引入本文作参考。
对于硬皮病，已表征了若干参与所述疾病的TCR的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-6、Vβ-8、Vβ-14、Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种，将引发免疫应答，该免疫应答将靶向参与硬皮病的T细胞。
为了治疗患有T细胞介导的自身免疫疾病的患者，特别是那些其TCR的可变区尚未被表征的患者，可进行滑液活检。取出所存在的T细胞样品，采用标准技术识别那些TCR的可变区。并可利用这些信息制备基因疫苗。
B细胞介导的自身免疫病包括狼疮(SLE)、毒性弥漫性甲状腺肿、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆硬化和恶性贫血。这些疾病的特征均为存在下述抗体，其结合内源性抗原并启动与自身免疫病相关的炎性级联。针对抗体可变区的疫苗接种将引发包括CTL在内的免疫应答，以消除那些产生抗体的B细胞。
为了治疗患有B细胞介导的自身免疫病的患者，必须鉴定参与自身免疫活性的抗体的可变区。可进行活组织检查，可提取存在于炎症位置上的抗体样品。可使用标准技术鉴定这些抗体的可变区。可使用该信息制备基因疫苗。
在SLE的情况下，一个抗原被认为是DNA。因此，在将接受针对SLE的免疫的患者中，可针对抗DNA的抗体来筛选其抗血清，可制备包括DNA构建体的疫苗，所述构建体编码在血清中发现的抗DNA抗体的可变区。
TCR和抗体的可变区之间的共同的结构特征是众所周知的。通常可使用熟知的方法，来发现编码特定TCR或抗体的DNA序列，方法例如参见Kabat等人，1987，具有免疫学作用的蛋白质的序列(Sequenceof Proteins of Immunological Interest)，U.S.Department of Health andHuman Services，Bethesda MD，该文献引入本文作参考。此外，克隆来自抗体的功能性可变区的通用方法可参见Chaudhary，V.K.等人，1990，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：1066，该文献引入本文作参考。
本发明公布了改进的免疫个体的方法，包括基因构建体作为DNA疫苗组合物的一部分，与DNA疫苗、减毒活疫苗及重组疫苗共同给予个体。基因构建体带有与调控元件可操作连接的编码免疫调节蛋白及引发疫苗表达的序列，这种改良的疫苗可以增强细胞免疫应答。
一些免疫方法中，个体被分别给予编码免疫原和编码CD80ΔC突变蛋白序列的两个基因构建体。一些免疫方法中，个体被分别给予编码免疫原和CD80ΔC突变体的蛋白质序列的一个基因构建体。一些免疫方法中，个体被分别给予免疫原和CD80ΔC突变体蛋白质。另一些免疫方法中，个体被分别给予蛋白免疫原和编码CD80ΔC突变体的蛋白质序列的一个基因构建体。一些免疫方法，个体被分别给予编码免疫原序列的一个基因构建体和CD80ΔC突变体的蛋白质。
本发明的另一方面，公布了可以抑制与自身免疫病和移植排斥有关的免疫应答的CD80 C区蛋白。CD80 C区蛋白质含有功能性的CD80C区，其功能性片段可常规地检出。一些实施方案中，CD80 C区的功能片段少于60个氨基酸。一些实施方案中，CD80 C区的功能片段少于50个氨基酸。一些实施方案中，CD80 C区的功能片段少于40个氨基酸。一些实施方案中，CD80 C区的功能片段少于30个氨基酸。一些实施方案中，CD80 C区的功能片段少于20个氨基酸。一些实施方案中，CD80 C区的功能片段少于15个氨基酸。一些实施方案中，CD80 C区的功能片段少于10个氨基酸。
在一些实施方案中，可变区缺失。在一些实施方案中，含有CD80和CD86的可变区。在一些实施方案中，含有CD80的跨膜区。在一些实施方案中，含有CD86的跨膜区。在一些实施方案中，缺失CD80的跨膜区，且未被任何其他序列取代。在一些实施方案中，含有非CD80和非CD86的序列。在一些实施方案中，CD80的跨膜区被非CD80和非CD86的序列取代。在一些实施方案中，含有CD80的胞质尾区。在一些实施方案中，含有CD86的胞质尾区。在一些实施方案中，CD80胞质尾区缺失，且未被任何其他序列取代。在一些实施方案中，CD80胞质尾区被非CD80和非CD86的序列取代。
根据一些实施方案，非CD80蛋白至少包括CD80的C区或其功能片段。本文使用的术语“非CD80蛋白”是指与野生型CD80蛋白不同，但包括CD80 C区或其功能片段的蛋白质。在一些实施方案中，非CD80蛋白结构如下：
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9
此处，
R1是指0-50个氨基酸；
R2是指80V或86V；
R3是指0-50个氨基酸；
R4是指80C；
R5是指0-50个氨基酸；
R6是指80tm或86tm；
R7是指0-50个氨基酸；
R8是指80ct或86ct；且
R9是指0-50个氨基酸；
此处，
80V是指CD80的可变区或其功能片段；
86V是指CD86的可变区或其功能片段；
80C是指CD80的C区或其功能片段；
80tm是指CD80的跨膜区或其功能片段；
86tm是指CD86的跨膜区或其功能片段；
80ct是指CD80的胞质尾区或其功能片段；
86ct是指CD86的胞质尾区或其功能片段。
根据本发明的一些实施方案，至少包括CD80 C区或其功能片段的非CD80蛋白选自以下结构：
R-缺失区域-R-80C-R-80tm-R-80ct-R；
R-缺失区域-R-80C-R-80tm-R-缺失区域-R；
R-80V-R-80C-R-80tm-R-缺失区域-R；
R-80V-R-80C-R-缺失区域-R-缺失区域-R；
R-86V-R-80C-R-80tm-R-80ct-R；
R-86V-R-80C-R-80tm-R-缺失区域-R；
R-86V-R-80C-R-缺失区域-R-缺失区域-R；
R-80V-R-80C-R-86tm-R-80ct-R；
R-缺失区域-R-80C-R-86tm-R-80ct-R；
R-缺失区域-R-80C-R-86tm-R-缺失区域-R；
R-80V-R-80C-R-86tm-R-缺失区域-R；
R-80V-R-80C-R-80tm-R-86ct-R；
R-缺失区域-R-80C-R-80tm-R-86ct-R；
R-86V-R-80C-R-86tm-R-80ct-R；
R-86V-R-80C-R-80tm-R-86ct-R；
R-86V-R-80C-R-86tm-R-缺失区域-R；
R-缺失区域-R-80C-R-86tm-R-86ct-R；和
R-86V-R-80C-R-86tm-R-86ct；
此处，
80V是指CD80的可变区或其功能片段；
86V是指CD86的可变区或其功能片段；
80C是指CD80的C区或其功能片段；
80tm是指CD80的跨膜区或其功能片段；
86tm是指CD86的跨膜区或其功能片段；
80ct是指CD80的胞质尾区或其功能片段；
86ct是指CD86的胞质尾区或其功能片段；
缺失区域是指0个氨基酸；
R是指各自独立的0-100个氨基酸的片段。
在一些实施方案中，R是指各自独立的0-50个氨基酸的片段。在一些实施方案中，R是指各自独立的0-30个氨基酸的片段。在一些实施方案中，R是指各自独立的0-20个氨基酸的片段。
在本发明的一些实施方案中，非CD80蛋白选自：
可变区缺失的突变CD80；
可变区和胞质尾区缺失的突变CD80；
胞质尾区缺失的突变CD80；
跨膜区和胞质尾区缺失的突变CD80；
CD86的V区取代了CD80 V区的突变CD80；
CD86的V区取代了CD80 V区并缺失胞质尾区的突变CD80；
CD86的V区取代了CD80 V区并缺失跨膜区和胞质尾区的突变CD80；
CD86的跨膜区取代了CD80跨膜区的突变CD80；
CD86的跨膜区取代了CD80跨膜区并缺失可变区的突变CD80；
CD86的跨膜区取代了CD80跨膜区并缺失可变区和胞质尾区的突变CD80；
CD86的跨膜区取代了CD80跨膜区并缺失胞质尾区的突变CD80；
CD86的胞质尾区取代了CD80胞质尾区的突变CD80；
CD86的胞质尾区取代了CD80胞质尾区并缺失可变区的突变CD80；
CD86的跨膜区和可变区分别取代了CD80跨膜区和可变区的突变CD80；
CD86的胞质尾区和可变区分别取代了CD80胞质尾区和可变区的突变CD80；
CD86的跨膜区和可变区分别取代了CD80跨膜区和可变区，并缺失胞质尾区的突变CD80；
CD86的跨膜区和胞质尾区分别取代了CD80跨膜区和胞质尾区，并缺失可变区的突变CD80；
CD86的跨膜区、可变区和胞质尾区分别取代了CD80跨膜区、可变区和胞质尾区的突变CD80。
本发明公布了各种CD80 C区蛋白的蛋白和核酸形式。其中编码野生型CD80、缺失区域/80C/80tm/80ct、缺失区域/80C/80tm/86ct、缺失区域/80C/86tm/80ct或缺失区域/80C/86tm/86ct的基因构建体给予细胞可以产生有效的免疫抑制和对自身免疫病的良好疗效。
本发明这一方面的方法可用于治疗自身免疫病。熟悉本领域的人员可以分辨患有自身免疫病或障碍的个体。自身免疫病和障碍包括T细胞介导的自身免疫病，如：风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、干燥综合症、结节病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、关节强硬性脊椎炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、牛皮癣、脉管炎、韦格纳肉芽肿病、局限性回肠炎和溃疡性结肠炎，以及B细胞介导的自身免疫病，如：狼疮(SLE)、毒性弥漫性甲状腺肿、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆硬化和恶性贫血。
本发明这一方面的方法也适用于治疗经历移植手术个体的免疫排斥反应，所述移植包括细胞移植(如骨髓、脑细胞移植)，组织移植(如角膜、皮肤移植和肌成形术)和器官移植(如肝、肾、肺及心脏移植)。
本发明组合物的制备和给予方法对于免疫和非免疫原性治疗程序是相同的。
此处所用术语“蛋白质”指蛋白类物质，包括肽、多肽及蛋白质。本发明的一些实施方案涉及通过将核酸分子，尤其DNA分子给予个体而传递蛋白，以及其应用方法。例如一些免疫方法中，将编码免疫原和CD80ΔC突变体的蛋白质的核酸给予个体。同样的治疗自身免疫病和移植排斥的免疫抑制涉及给予个体编码CD80 C区蛋白质的核酸分子。此处所用术语“本发明的基因构建体”是指含有免疫原性蛋白、CD80ΔC突变体蛋白和CD80 C区蛋白的编码序列的基因构建体。在本发明中这些基因构建体可以用同样方式制备、配制及给予。
DNA疫苗的例子述于美国专利5,593,972、美国专利5,589,466、PCT/US90/01515、PCT/US93/02338、PCT/US93/048131和PCT/US94/00899，这些文献各自引入本文作参考。除了在这些申请中描述的传递方案，在美国专利4,945,050和5,036,006中描述了另一些传递DNA的方法，这两个文献均引入本文作参考。DNA疫苗方法可用于免疫个体。这些方案可以用在本发明的这一方面，即将带有CD80C区编码序列的基因构建体免疫个体，治疗自身免疫病和移植物排斥反应。在一些实施方案中，没有提供免疫原的编码序列。
本发明的基因构建体在被细胞摄入后，以一种功能性染色体外分子存在，或整合于细胞染色体DNA中。DNA可以一个或多个质粒形式导入细胞。或者可以导入线性的DNA分子，使其更易整合于细胞染色体中。DNA导入细胞中时可以加入促进整合的试剂，也可以在导入的DNA分子中直接加入这种试剂。此外，RNA也可以导入细胞。也可以考虑构建带有端粒、中心粒及复制起点的线性微小染色体的本发明基因构建体。
本发明的基因构建体含有基因表达所必需的调控元件，包括启动子、起始密码子、终止密码子及多腺苷酸化信号。此外，增强子序列也常用来调节本发明蛋白质编码序列的表达。这些元件必须可操作地连接在目标蛋白的编码序列上，并能在给予的个体中发挥作用。
一般认为启始子和终止子是目标蛋白质编码序列的一部分。这些元件必须能在基因构建体给予的个体中发挥作用。起始和终止密码子必须和编码序列位于同一结构中。
启动子和多腺苷酸化信号在个体细胞中必须有功能。
本发明采用的，特别在人类基因疫苗的生产中，常用的启动子包括但不局限于以下：猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼氏病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和来自人类基因如人肌动蛋白、肌球蛋白、血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫因的启动子。
本发明实施方案中使用的尤其适用于人基因疫苗的合成的多腺苷酸化信号，包括但不局限于以下：人和牛生长激素的多腺苷酸化信号，SV40的多腺苷酸化信号，LTR多腺苷酸化信号。优选pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego，CA)中的SV40多腺苷酸化信号，其也称为SV40多聚苷酸化信号。
除了DNA表达所需的调控元件，DNA分子中还需包括其它一些元件，如增强子。增强子可以选自以下但不局限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、肌酸增强子及例如来自CWV、RSV和EBV的病毒增强子。
本发明基因构建体也可能带有使其染色体外形成得以保存、并在细胞中多拷贝复制的哺乳动物的复制起点。质粒pCEP4、pREP4(Invitrogen，San Diego，CA)有EBV的复制起点和核抗原EBNA-1的编码区，在未整合的情况下，可以高拷贝地附加型复制。
一些优选实施方案涉及免疫应用。所给予的基因构建体除了带有靶蛋白和CD80ΔC突变蛋白的编码序列外，还带有可以增强针对该靶蛋白的免疫应答的基因序列。这样的基因包括编码细胞因子和淋巴因子如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、GC-SF、GM-CSF、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12的基因。
可选择在受体细胞中最适表达的调节序列，使蛋白质表达最大化。此外，可选择在细胞中最有效转录的密码子。本领域普通技术人员可以获得大量的在细胞中发挥功能的基因构建体。
本发明采用的免疫或免疫抑制的方法都包含将核酸分子给予个体组织。在一些优选实施方案中，在所述个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子，其中给药途径选自：经肌肉、鼻内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药，或者通过灌洗给至选自阴道、直肠、尿道、口腔和舌下的黏膜组织。
本发明的一个方面涉及可用于本发明中的药物组合物。所述药物组合物包括一核酸分子，优选是DNA分子，其包括可操作地与在个体细胞中表达所必需的调控元件相连接的编码蛋白的核苷酸序列。所述药物组合物进一步包括药用载体或稀释剂。术语“药”是众所周知的，可为本领域技术人员普遍理解。本文使用的术语“药物组合物”和“可注射的药物组合物”指的是如本领域技术人员所理解的一般含义。要求药物组合物满足特定的标准，涉及无菌状态、热原质、颗粒物质、等渗性和pH。例如，可注射的药物组合物是无菌的和无热原质的。
本发明的药物组合物包括约1ng-约10000μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约2000μg、3000μg、4000μg或5000μgDNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约1000μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约10ng-约800μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约0.1-约500μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约1-约350μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约25-约250μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约100μg DNA。
本发明的药物组合物根据将要使用的给药方式进行配制。本领域普通技术人员可容易地配制出包括遗传构建体的疫苗。当选择肌肉注射作为给药方式时，优选使用等渗制剂。通常，用于保持等渗压的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸缓冲盐溶液是优选的。稳定剂包括白明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂加入制剂中。所提供的本发明的药物制剂是无菌且无热原质的。本发明药物组合物除了传递成分和核酸分子外，还由药用载体或赋形剂如盐溶液。可使用其他任何容许核酸成功给予的任何介质。本领域技术人员将很容易了解可用于本发明中的多种药用介质。合适的药用载体在此领域的一本标准参考书(Remington’s Pharmaceutical Sciences，A.Osol)中有详细的描述，此文献引入本文作参考。
本发明的一些实施方案中，在将核酸分子给至细胞的同时，给予一助剂。助剂也被称为多核苷酸功能增强剂或遗传疫苗助剂。助剂的例子述于1998年11月3日公布的美国专利5,830,876、1997年1月14日公布的美国专利5,593,972和于1994年1月26日申请的国际申请PCT/US94/00899(1997年11月29日申请的美国专利申请08/979,385)，这些文献各自引入本文作参考。此外，助剂的例子也述于1998年4月14日公布的美国专利5,739,118、1998年11月17日公布的美国专利5,837,553和于1995年9月28日申请的国际申请PCT/US95/12502，和于1995年3月30日申请的国际申请PCT/US95/04071，这些文献各自引入本文作参考。与核酸分子一起给药的助剂可以作为与核酸分子的混合物给药，或在核酸分子给药的同时、之前或之后分开给药。此外，其它作为转染物和/或复制剂和/或炎症反应物的药剂也可以在有或无助剂的情况下一起给予。这些药物包括生长因子、细胞因子和淋巴因子如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、GC-SF、GM-CSF、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和B7.2，以及成纤维细胞生长因子、表面活性物质如免疫刺激复合体(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、包括单磷酰基脂质A(MPL)等LPS类似物、胞壁酰基肽、醌类似物和囊泡如角鲨烯和角鲨烯，和透明质酸。在一些涉及免疫方法的实施方案中，助剂优选能增强免疫应答。在一些涉及免疫抑制方法的实施方案中，选择不能增强免疫应答的助剂。
一些优选的实施方案中，本发明的基因构建体是与助剂共同制备和给予的。这种助剂选自苯甲酸酯、苯胺、脒、氨基甲酸酯及其盐酸盐如局部麻醉药剂。
在一些优选的实施方案中，助剂可以是以下结构的化合物：
Ar-R1-O-R2-R3
或Ar-N-R1-R2-R3
或R4-O-R5-R6
或R4-O-R1-R7
其中：Ar是苯、对氨基苯、间氨基苯、邻氨基苯、取代的苯、取代的对氨基苯、取代的间氨基苯、取代的邻氨基苯。其中的氨基苯化合物中氨基基团可以是氨基、C1-C5烷基胺、C1-C5、C1-C5二烷基胺，取代的化合物中的取代基为卤素、C1-C5烷基和C1-C5烷氧基。
R1是C＝O；
R2是C1-C10烷基，包括支链烷基；
R3是氢、胺、C1-C5烷基胺、C1-C5、C1-C5二烷基胺；
R2+R3可以形成环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基、环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10杂环，包括C1-C10烷基取代的氮代杂环；
R4-是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基、环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环，包括C1-C10烷基N-取代的杂环；
R5是C＝NH；
R6-是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基、环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环，包括C1-C10烷基N-取代的杂环；
R7-是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基、环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环，包括C1-C10烷基N-取代的杂环；
酯类的例子包括：苯甲酸酯(如piperocaine、meprylcaine、isobucaine)、对氨基苯甲酸酯(如普鲁卡因、丁卡因、莫诺卡因、propoxycaine、氯普鲁卡因)、间氨基苯甲酸酯(如metabuthamine、primacaine)和邻氧化氨基苯甲酸酯(如parethoxycaine)。苯胺的例子包括：利多卡因、衣铁卡因、甲哌卡因、丁呱卡因、pyrrocaine和丙胺卡因。这类化合物的其他例子包括狄布卡因、苯佐卡因、达克罗宁、丙吗卡因、丙氧苯卡因、布特卡因、丁氧普鲁卡因、卡波卡因、甲基丁呱卡因、butasin picrate、芬那卡因、diothan、luccaine、intracaine、纽白卡因、metabutoxycaine、piridocaine、biphenamine及植物学衍生的双环类化合物，如可卡因、肉桂酰可卡因、组丝古柯碱(truxilline)及乙基苯酰爱康因。所有的化合物都以盐酸盐形式存在。
优选的实施方案中，助剂是丁哌卡因。丁哌卡因与甲哌卡因的区别在于，丁哌卡因的N-丁基基团替代了甲哌卡因的N-甲基基团。化合物在N和C1-C10上可能被卤素取代，诸如普鲁卡因和氯普鲁卡因。其中优选苯胺。
助剂的给予可以早于、晚于或与基因构建体的给予同时进行。助剂和基因构建体也可以存在于同一组合物中。
丁哌卡因-HCl在化学上被定为1-丁基-N-(2，6-二甲基苯基)-2-哌啶羧酰胺一盐酸盐一水合物，可广泛地商购自包括Astra PharmaceuticalProducts Inc.(Westboro，Mass.)和Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(NewYork，N.Y.)、Eastman Kodak(Rochester，NY)在内的许多公司用于药物用途。商业上，在存在或不存在对羟基苯甲酸甲酯以及存在或不存在肾上腺素的情况下配制丁哌卡因。可使用任何这样的制剂。它可以以0.25％、0.5％和0.75％的浓度商购用于药物用途，这些浓度可用于本发明中。如果需要，可制备成引发目标作用的其他浓度，特别是0.05％-1.0％的浓度。根据本发明，给予约250μg-约10mg丁哌卡因。在一些实施方案中，给予约250μg-约7.5mg。在一些实施方案中，给予约0.05mg-约5.0mg。在一些实施方案中，给予约0.5mg-约3.0mg。在一些实施方案中，给予约5-50μg。例如，在一些实施方案中，在给予疫苗之前、同时或之后，在与疫苗相同的位置上，给予位于等渗药用载体中的约50μl-约2ml、优选50μl-约1500μl、更优选约1ml的0.25-0.50％丁哌卡因-HCl和0.1％对羟基苯甲酸甲酯。相似地，在一些实施方案中，在给予疫苗之前、同时或之后，在与疫苗相同的位置上，给予位于等渗药用载体中的约50μl-约2ml、优选50μl-约1500μl、更优选约1ml的0.25-0.50％丁哌卡因-HCl。丁哌卡因和任何其他具有相似作用的化合物，特别是相关的局麻药类化合物，可以以提供所希望的对细胞摄取遗传构建体的促进作用的浓度给药。
本发明的一些实施方案中，助剂比基因构建体提前给予个体，如提前至多约1周或10天给予。本发明的一些实施方案中，助剂比基因构建体提前约1-5天给予个体。一些实施方案中，助剂在基因构建体给予前24小时内或后24小时内给予。或者，助剂与基因构建体同时，或只有几分钟之差给予个体。相应的，这种助剂与基因构建体可能形成一个单一药物组合物。
一些实施方案中，基因构建体在无助剂存在下给予。也就是说，以一种不含有助剂的配方给予，且这种给予的方法中基因构建体不与助剂联同给药。
在涉及免疫的实施方案中，本发明的基因构建体可保留减毒活微生物或重组微生物载体中的遗传物质的一部分。除了使用CD80ΔC突变体的可表达形式之外，本发明还涉及改良的减毒活疫苗或利用重组载体传递编码抗原的外源基因的改良疫苗。减毒活疫苗和利用重组载体传递外源抗原的疫苗的例子述于美国专利：4,722,848、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734和5,482,713，这些文献各自引入本文作参考。包括编码CD80ΔC突变蛋白质的核苷酸序列的基因构建体可操作地连有影响疫苗表达的调节序列。根据本发明，减毒活疫苗和重组疫苗中加入基因构建体，可以改进这些疫苗。基因构建体可能作为重组病毒疫苗基因组的部分，其中，遗传物质整合于染色体中，或位于染色体外。一些涉及治疗性非诱导免疫反应的实施方案，编码CD80 C区蛋白质的核酸分子可以用重组病毒表达载体或其它传递工具等给予，从而影响其在相容性宿主细胞中的导入和表达。一般的，病毒载体可能是DNA病毒如重组腺病毒和重组牛痘病毒或RNA病毒(如重组反转毒病毒)。其它重组载体包括可感染细胞并表达重组基因的重组原核生物。除重组载体外，也可以考虑用其它传递成分，如脂质体包埋、转铁蛋白介导的转染及其它受体介导方式给予细胞。本发明旨在包含各种形式的表达载体及有同样功能的其它适宜的传递工具。一些优选实施方案中，DNA通过腺病毒转入感受态宿主细胞。本领域的技术人员很容易理解通过这种方式给予DNA至宿主细胞的技术。尽管本发明优选腺病毒，也可以使用其它有同样功能的病毒。本发明的另一个优选实施方案中，RNA通过反转录病毒转入感受态宿主细胞。本领域的技术人员很容易理解，通过这种方式给予RNA的技术。本发明旨在包含任何可用来表达由RNA编码的蛋白质的反转录病毒。
本发明的一些实施方案涉及蛋白质及其使用方法。例如在一些免疫方法中，免疫原性蛋白和CD80ΔC突变蛋白被给予个体。同样，CD80C区蛋白给予个体，产生免疫抑制，以治疗自身免疫病和防止移植物排斥反应。此处所用术语“本发明蛋白”是指免疫原性蛋白、CD80ΔC突变蛋白及CD80 C区蛋白。三者可以同样方法制备和形成，并在本发明中以同样方法给予。
常规方法可以制备含有本发明蛋白质编码序列的包括重组表达载体在内的载体。此处所用术语“重组表达载体”指质粒、噬菌体、病毒粒子或其它载体，当导入相容性宿主细胞后，其带有表达编码序列所必须的遗传元件。本领域普通技术人员可以利用标准技术及易得的起始材料，分离或合成编码本发明蛋白的核酸分子，并将其插入表达载体。编码序列可操作地连有必需调控序列。表达载体是众所周知并易得的，包括质粒、噬菌体、病毒载体和其它核酸分子，或含有利于宿主细胞转化、协助基因表达的载体的核酸分子。本发明一些实施方案涉及含有编码CD80ΔC突变蛋白或CD80 C区蛋白的核苷酸序列的重组表达载体。本发明的重组表达载体可用于转化宿主。本发明涉及一种重组表达载体。其包括编码CD80ΔC突变蛋白、含有CD80ΔC突变蛋白的嵌合蛋白、或CD80 C区蛋白的核苷酸序列。
本发明涉及包括含CD80Δ突变蛋白编码序列、含有CD80ΔC突变蛋白的嵌合蛋白编码序列、或CD80 C区蛋白编码序列的重组表达载体的宿主细胞。用于制备蛋白的重组表达系统的宿主细胞是众所周知并易得的。例子包括细菌细胞(如大肠肝菌)、酵母细胞(如裂殖酵母(S.cerevisiae))、昆虫细胞(如S.frugiperda)、非人哺乳动物组织培养细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)及人组织培养细胞(如Hela细胞)。
例如一些实施方案中，本领域普通技术人员利用已知技术，可容易地将DNA插入商业化表达系统的载体内。如商业化质粒pSE420(Invitrogen，San Diego，CA)用于在大肠杆菌中制备CD80ΔC突变蛋白。商业化载体pYES2(Invitrogen，San Diego，CA)用于在芽殖酵母中制备蛋白。商业化MAXBACTM是完全杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)，可用于昆虫细胞。商业化质粒pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)可用于如中国仓鼠卵巢细胞的哺乳动物细胞。本领域普通技术人员可利用熟知的技术和易得的材料，用这些或其他商业化载体和系统表达本发明蛋白质，参见Sambrook等，分子克隆实验手册(Molecular Cloning a Laboratory Manual.)，第二版，冷泉港出版社，1989年。此文献引入本文以作参考。因此目标蛋白可以在真核和原核系统中制备，从而产生蛋白质的多种加工形式。
本领域中普通技术人员可利用商业化的表达载体和系统，利用熟知的技术和易得的材料制备载体。用于各种宿主的带有必须调控序列(如启动子、多腺苷酸化信号及优选的增强子)的表达系统是易得并熟知的，参见Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社，1989年。
含有编码本发明蛋白质的DNA的表达载体用于转化相容性培养细胞，这种细胞培养于适宜表达外源基因的环境下。这类蛋白通过裂解细胞或直接从培养基中收获。本领域的普通技术人员利用熟知的技术可以分离在此表达系统中产生的本发明蛋白质。利用特异性结合的抗体分离蛋白质的技术以及制备这种抗体的方法都很常规(参见：Hariow，E和Lane，E.，抗体：实验手册(Antibodies：A LaboratoryManual)，1988，冷泉港出版社，引入此文以做参考)。这种抗体可以用于天然或重组DNA方式制备的蛋白质。
一些基因构建体含有本发明蛋白质的编码序列以及确保其在被转染细胞中有功能的启动子。组成型启动子包括：巨细胞病毒或SV40的组成型启动子。诱导型启动子如鼠乳腺白血病病毒的启动子和金属硫因启动子。本领域普通技术人员利用易得的材料可容易地制备用于转染细胞的基因构建体，这种基因构建体含有本发明蛋白质的编码基因，并用于制备本发明蛋白质。
除了利用重组技术制备本发明蛋白质，自动肽合成仪也可来制备本发明蛋白质，本领域普通技术人员已熟知这项技术，其特别适用于在DNA编码的蛋白质的产生过程中不存在的含有氨基酸替换的蛋白质行生物的制备。
本发明蛋白质可以通过以下已知技术制备。方便的，本发明蛋白质可通过Merrified最初提出的固相合成技术制备(美国化学学报(J.Am.Chem.Soc.)，(1963)，15：2149-2154，在此文中引入以作参考)。其它的蛋白质合成技术可参见以下：M.Bodanszky等，(1976)肽类合成(Peptide Synthesis)，John Wiley&Sons出版社，第二版，在此文中引入以作参考；Kent及Clark-Lewis，生物学和医学合成肽(SyntheticPeptides in Biology and Medicine)，295-358页，Alitalo，K.等编辑，科学出版社，(1985，阿坶斯特丹)，在此文中引入以作参考；及其它本领域专业人士所熟知的参考文献。合成技术的总结在以下文献中，J Stuart和J.D.Young，固相肽合成技术(Solid Phase PeptideSynthelia)，Pierce Chemical Company，Rockford，IL(1984)，引入本文作为参考。可使用溶液合成方法，参见The Proteins，第II卷，第三版，105-237页，Nenrath，H.等编辑，纽约学术出版社(1976)，在此引入以做参考。以上文献中也有合适保护基团的说明，还包括J.F.W.McOmie，有机化学中的保护基(Protective Groups in OrganicChemistry)，白金出版社，纽约(1973)，在此文中引入以做参考。
一般，这类合成方法需要将一个或多个氨基酸残基或保护残基依次加到延伸中的肽链未端。用一个合适的并可被选择性除去的基因保护第一个氨基酸残基的氨基或羧基。含有活性反应侧链的氨基酸，如赖氨酸，也需要被合适的可被选择性除去的氨基酸残基保护基。
以固相合成为例，被保护或衍生了的氨基酸通过其未保护的氨基或羧基结合于惰性固相支持物上，接着保护基团被移去，加入另一个被适当保护的具有补充基团(氨基或羧基)氨基酸并与固相支持物上的氨基酸残基反应。然后，除去新加入的氨基酸残基上的氨基或羧基保护基。同样方法，依次加入合适的氨基酸。在正确接了全部合适氨基酸后，残存的未端和侧链保护基团及固相支持物被依次或同时除去。得到最终的多肽链。本发明多肽最好不含有苄基化或甲基苄基化氨基酸。保护基团在肽合成中起作用，但应在使用肽之前除。本文中其它部分也提到，可能还需要别的反应以形成维持正确构象的分子间连接。
一些实施方案中，蛋白质在转基因动物中表达。本发明涉及含有重组表达载体的非人转基因哺乳动物，重组表达载体含有CD80ΔC突变蛋白或CD80 C区蛋白编码序列的核酸分子。可用于制备重组蛋白的非人转基因哺乳动物、必需的表达载体和制备转基因动物的技术是众所周知的。一般的，这种转基因动物含有的带有CD80ΔC突变蛋白或CD80 C区蛋白编码序列的重组表达载体可操作地连有哺乳动物特异性启动子，由此只在哺乳动物细胞中表达编码序列，并且产生的重组蛋白可以从动物乳汁中制备。本领域普通技术人员据以下文献中提及的技术等标准技术可以获得表达CD80ΔC突变蛋白和CD80 C区蛋白的转基因动物。这些文献被引入本文以作参考，美国专利4,873,191，公布于1989年10月10日授权给Wagner，和美国专利4,736,866，公布于1988年4月12号，授权给Leder优选动物为山羊及啮齿类动物，尤其为大鼠和小鼠。
可以考虑对本发明蛋白质氨基酸序列的保守性替换。此处所用术语“保守性替换”是指带有相同结构和/或电性特点的其它氨基酸残基对于CD80的氨基酸残基的替换。本领域普通技术人员可容易地根据已知的保守基团设计出具有保守性替换的蛋白质。
本发明药物组合物能以任何使活性成分到达哺乳动物体内药物作用位点的方式给予。根据所需要的是局部治疗还是系统性治疗，以及治疗的部位，可选择适宜的方式给予本发明的药物组合物。可以局部(包括眼部、阴道、直肠、鼻内、透皮)给药、口服或肠胃外给药。由于当口服给药时，肽易于被消化，所以，通过用肠衣包裹活性物质来制备口服制剂，以免其在胃里消化(例如预中和)。肠胃外给药包括静脉滴注、皮下、腹膜内或肌肉注射，肺部给药如通过吸入或吹入，或者鞘内或心室内给药。在优选实施方案中，肠胃外给药，即静脉、皮下、透皮、肌肉给药，被常规地用于使药物吸收达到最佳。静脉给药可在输液管的帮助下完成。本发明的药物组合物可配制成乳剂。
本领域技术人员可以理解本发明中使用的药用介质的多样性。合适的药用载体在本领域一本标准参考书中有详述，《Remington药物学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，A.Osol)在此文中引入以作参考。局部用药的制剂包括透皮贴膜、乳液、油膏、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉末。也可以使用传统的药物载体如液体、粉末或油质基料，增稠剂等。口服组合物可以是粉末或粒状、水或非水介质中的悬液或溶液、胶囊、药丸或药片。也可以使用增稠剂、增味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂。肠胃外用药、静脉用药、鞘内用药或心室内用药组合物可包括无菌水溶液，其中也可含有缓冲液、稀释剂和其它适宜的添加剂，其优选是无菌和无致热原的。适宜根据本发明静脉用药的药物组合物应该无菌且无致热原。肠胃外用药时，本发明的肽可配制成与肠胃外药用载体结合的溶液、悬液、乳液或冷冻粉末。载体的实例有水、盐溶液、林格溶液、葡萄糖溶液及5％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和固化油滴等非水载体。这种载体或冷冻粉末可能含有保持等渗性和化学稳定性的添加物(前者如氯化钠、甘露醇，后者如缓冲液和防腐剂)。制剂使用常规方法灭菌。例如，通过将1.5重量％的活性成分溶解在0.9％氯化钠溶液中，获得适用于注射给药的肠胃外组合物。
本发明的药物组合物可以以单一剂量给药，也可以以多剂量给药。本发明的药物组合物可以单独发挥疗效，也可以与其它药剂共同使用。本发明的治疗方法也可以与传统方法依次或同时使用。
许多已知因素影响药物组合物剂量，包括特定成分药物的动力学特点、用药的方式和途径；服药者的年龄、健康状况及体重；病症的性质和程度、同步治疗的类型、治疗频率和期望疗效。本领域的技术人员可容易地控制药物组合物的制备及使用。通常的，肽类药剂量为每50千克体重，给药1到3000毫克。优选的方案为每50千克体重给药10-1000毫克；更优选的，每50千克体重用药25-800毫克。通常个体用药为每天8-800毫克，分1到6次服用或以缓释的形式以获得最大疗效。
根据此蛋白或若干蛋白质的给药方法，本发明药物组合物可以被最有效地制备和给予。参考了本说明书后，各种给药方式对于本领域普通技术人员是显而易见的。
本发明的方法可用于人类和兽类医学领域。相应的，本发明涉及哺乳动物、鸟类和鱼类的遗传免疫。本发明的方法特别适用于哺乳动物类，包括人、牛、羊、猪、马、犬、猫等各类物种。
以下的实施例包括了本发明各方面的代表性实例。这些实施例并不是限制本发明的范围，而是作为典型例证的目的。此外，以下的说明可以总结本发明的各个方面，但并不是限制本发明的范围，而是为了强调本发明的各个方面。本领域普通技术人员可容易地理本发明的其它方面和其它实施例。
实施例
为了确定T细胞应答需要的是CD86而不是CD80，和进一步分析CD86和CD80上参与结合CD28和CTLA-4的、存在于CD80 V区及C区上的关键区域的结构与功能，通过用DNA免疫原和编码CD86/CD80分子的嵌合或截短形式的DNA共免疫小鼠，研究了CD80和CD86分子的不同区域在T细胞活化中的作用。
方法
基因构建体的制备
制备编码HIV-1MN包膜蛋白的DNA疫苗(pcEnv)，方法参见美国专利5,593,972。从B细胞cDNA文库(Clontech，Palo Alto，CA)中克隆人CD80和CD86基因(Kim，等，1997 Nature Biot.，15：641-651，该文献引入本文作参考)。将其插入表达载体pSRαneol+。具体如下：PCR扩增CD80和CD86基因，连接到SRα启动子pSRαneol+下游，构建pCD80和pCD86表达载体。用ExpandTM高保真度多聚酶系统(Boehringer-Mannheim，Germany)进行PCR扩增，得到这两个基因的嵌合和截短的突变体。再以pCD80或pCD86作为PCR模板，构建共刺激分子的所有其它形式。以下为此反应中使用的引物：
A：CTGCTTGCTCAACTCTACGTC-SEQ ID NO：1(正向引物，载体)
B：CTGAAGTTAGCTTTGACTGATAACG-SEQ ID NO：2(反向引物，CD80)
C：GCAATAGCATCACAAATTTCA-SEQ ID NO：3(反向引物，载体)
D：CAGTCAAAGCTAACTTCAGTCAACC-SEQ ID NO：4(正向引物，CD86)
E：GGGAAGTCAGCAAGCACTGACAGTTC-SEQ ID NO：5(反向引物，CD86)
F：TCAGTGCTTGCTGACTTCCCTACACC-SEQ ID NO：6(正向引物，CD80)
G：TCTTGCTTGGCTTTGACTGATAACGTCAC-SEQ ID NO：7(反向引物，CD80)
H：TCAGTCAAAGCCAAGCAAGAGCATTTTCC-SEQ ID NO：8(正向引物，CD80)
I：TCCTCAAGCTCAAGCACTGACAGTTC-SEQ ID NO：9(反向引物，CD86)
J：TCAGTGCTTGAGCTTGAGGACCC-SEQ ID NO：10(正向引物，CD86)
K：TCTGGATCCTCATCTTGGGGCA-SEQ ID NO：11(反向引物，CD80)
L：TCTGGATCCTCATTTCCATAG-SEQ ID NO：12(反向引物，CD86)。
使用引物A和B扩增CD80的V区。使用引物C和D扩增CD86的C区、跨膜区(TM)和胞质尾区(T)。这些片段经纯化、组合后可用做第二步PCR反应的模板(正向引物为：CTGCTTGCTCAACTCTACGTC-SEQ ID NO：1；反向引物为：GCAATAGCATCACAAATTTCA-SEQ ID NO：3)。将PCR产物插入载体pSRαneol+，得到质粒pV80C86T86。该质粒编码嵌合的共刺激分子，表达CD80的V区、CD86的C区、跨膜区和胞质尾区。嵌合的交换点位于CD80上第106位的保守丙氨酸和CD86上第111位的丙氨酸，其与外显子的边界相关联。
引物A和E扩增产生编码CD86的V区的基因片段。引物C和F扩增产生编码CD80的C区、跨膜区和胞质尾区的基因片段。第二步PCR反应和克隆化同上所述，获得编码CD86的V区和CD80的C区、跨膜区和胞质尾区的第二个质粒pV86C80T80。
二步PCR反应也可获得无C区的共刺激分子的截短形式(pV80CΔT80、pV86CΔT86)。这两个分子的V区分别由引物对A/G、A/I扩增。这两个C区截短的分子的跨膜区和胞质尾区分别由引物对C/H、C/J扩增。通过扩增和将PCR扩增产物克隆于表达载体pSRαneol+中，得到了构建体。测序结果证明了所有构建体与野生型模板序列是一致的。得到的CD80缺失突变体缺失了从第107位的天冬氨酸到第200位的苏氨酸的一段氨基酸，和得到的CD86缺失突变体缺失了从第111位的丙氨酸到第211位的异亮氨酸的一段氨基酸。两种分子片段都保有C区的6到7个近膜氨基酸。
T区缺失的pV80C80TΔ和pV86C86TΔ由一步PCR反应获得。二者均以A为正向引物，分别以K和L为反向引物。PCR扩增产物克隆于表达载体pSRαneol+中。其编码的CD80蛋白质在第一个细胞质尾的残基即精氨酸残基处终止，而CD86蛋白质在编码基因的第942个核苷酸分子处终止，保有细胞质尾的第一个赖氨酸残基。
所有嵌合、截短的构建体及野生型的基因片段均克隆于载体SRαneol+中。基因的表达由启动子SRα控制。SRα由SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒I型长末端重复区的R片段、U5序列的一部分构成(R-U5’)。测序结果证实所有基因片段的序列与初始野生型模板CD80和CD86相同。
质粒的表达
用免疫荧光和流式细胞法分析基因片段在转染了实验质粒或对照质粒的人横纹肌肉瘤细胞(RD)中的表达。使用基因脉冲仪(BioRed，Hercules，CA)通过电穿孔法转染细胞(容量500μF，电压0.25V)。
进行免疫荧光分析。转染的细胞孵育两天后，转入FalconR培养玻片(Becton Dickinson，Bedford，MA)。几天后，用甲醇冲洗并固定细胞(室温30分钟)。与抗CD80(Coulter，Miami，FL)或CD86(Pharmingen，San Diego，CA)的单克隆抗体孵育(37℃，1.5小时)。冲洗玻片，用羊抗鼠免疫球蛋白IgG染色(Boehinger Mannheim，Indianapolis，IN)。在Nikon OPTIPHOT(尼康公司，东京，日本)荧光显微镜下观察并照相。
进行FACS分析。用编码CD86或CD80的构建体(2μg)和绿色荧光蛋白表达载体{10μg(pcGFP，Clontech，Palo Alto，CA)}混合转染细胞。后者被用作对照质粒计算转染频率。结合PE的抗CD80或CD86分子V区的单克隆抗体(均来自Pharmingen，San Diego，CA)用来验证实验质粒的表达。简述如下：加入1μg抗B7抗体于转染细胞或对照细胞(10×105)，FACS分析通过CELLQuestTM数据库搜索和软件(Becton Dickinson Immunocytometry System，San Jose，CA)进行。表达不同B7分子的细胞的转染效率(即荧光强度)可以从表达绿色荧光蛋白GFP的细胞群体上得以量化。
免疫动物
以两周为间隔对Balb/c小鼠进行三次肌肉注射处理，使用50μgDNA，其重悬于100μl PBS缓冲液和0.25％的丁哌卡因-HCl(Sigma，St-Louis，MO)中。此剂量可以使因同时使用不同的分子佐剂(如突变、截短或野生型共刺激基因)而产生的抗病毒免疫应答的增强最大化。50μg编码HIV-1 gp160包膜蛋白的质粒(pcEnv)单独、或与50μg不同的CD86/CD80构建体(分子佐剂)共同注射实验动物。以天然小鼠和注射对照载体的小鼠作为对照。在一些实验中，给动物注射三次这两种分子佐剂(共100μg)和pcEnv(50μg)的混合物。两周后，分离实验动物的脾细胞，检测T细胞反应及细胞因子的产生。
肌细胞的免疫组织化学分析
对免疫后的腿部肌肉组织进行免疫化学分析，观察是否存在浸润现象(淋巴细胞在肌肉组织中存在)。用50μg pcEnv和50μg实验质粒或对照质粒的混合物接种于小鼠的四头肌。接种7天后，处死小鼠，取出小鼠四头肌。新鲜的肌肉组织冷冻于O.C.T化合物中(SakuraFinetek USA，Inc.，Torrance，CA)。制备4微米的冷冻切片，进行苏木精和曙红染色(H&E)，以确定炎症反应的程度。
细胞毒性T淋巴细胞分析
进行5小时51Cr释放CTL分析。简述如下：在刺激性细胞和无Con A的10％RAT-T-STIM中放置6天，效应物被激活。在抗原激活中需要使用0.1％戊二醛固定的P-815细胞(NIH AIDS研究及参考试剂项目)。这种细胞感染了带有HIV-1包膜蛋白编码基因的重组牛痘病毒(vMN462)。靶细胞是感染了重组(vMN462，特异性)或野生型(WR，非特异性)牛痘病毒的P-815细胞。靶细胞标记有100Ci/mlNa2 51CrO4，并与效应细胞以100∶1到12.5∶1的比值混合(效应物∶靶比值，E∶T比值)。比溶的确定参见Kim，1997，同上。分别确定靶细胞在10％TritonX-100和培养基中的溶解百分率，从而确定最大和最小释放量。如果“自发释放”超过“最大释放”达20％，则认为该分析是无效的。特异性靶细胞的溶解百分率中减去非特异性靶细胞的溶解百分率，就是该靶细胞的比溶。一些实验中，用抗CD8的单抗(53-6.7，ATCC)处理，然后与无毒兔补体(Sigma)温育，从而从脾细胞培养物中取出CD8+T细胞。
细胞因子的产生
免疫细胞释放各种细胞因子的水平反映了免疫应答的方向与强度。因此，收集用于CTL分析的体外受激效应细胞的上清液，用商购的ELISA试剂盒(Biosource，Camarillo，CA)检测γIFN、IL-4和IL-12的释放。
结果
编码CD80和CD86野生型及突变形式的质粒的表达
首先分析了CD80和CD86构建体的不同形式在用对照质粒或实验质粒瞬时转染的RD肌瘤细胞中的表达。利用免疫荧光技术，观察到野生型及突变共刺激分子的不同形式均在实验质粒中表达，而只转染了载体的对照质粒不表达共刺激分子。对这些分子的转染效率进行FACS分析。在这些实验中，用编码GFP的对照质粒和编码共刺激分子的不同形式的实验质粒混合转染细胞。只在表达GFP的细胞群体中检测出表达B7分子的细胞的荧光强度。这一结果表明，大部分CD80/CD86的嵌合或截短形式与野生型CD80/CD86分子的表达是相似的(表3)。与其他质粒相比，只有编码野生型CD80(pCD80)和缺失细胞质尾的CD86(pV86C86TΔ)的两种构建体在转染细胞表面有相对较高的表达量。
CD80和CD86 V区对病毒特异性CTL应答的活化和细胞因子Th1 的产生均有重要作用
B7分子可以引发抗原特异性T细胞表达出适当的配体，从而在诱导这类细胞的活化中有关键作用。早期实验证明野生型CD86而非CD80的cDNA与DNA免疫原共导入可以增强抗原特异性T细胞应答(Kim等，1997，同上)。为研究CD86的V区在这一活化中的作用，将CD80和CD86的V区互换(附表3)，并用编码这些分子的构建体和编码病毒蛋白的质粒共同免疫小鼠。阳性对照采用编码野生型CD80/CD86的构建体，将其与DNA免疫原共同注射小鼠。阴性对照为注射空载体的小鼠。最后一次免疫后两星期，分析脾细胞培养物的抗病毒CTL应答。
在对照小鼠脾细胞中发现有背景水平的特异性死亡。pcEnv或pcEnv与pCD80共免疫的动物中有低水平的死亡。然而，pcEnv与pCD86共免疫小鼠有高水平的包膜特异性的CTL应答(附表4)。因此，利用插入表达载体pSRαneol+中的CD80和CD86基因，证实CD80和CD86对于DNA接种引发的细胞免疫反应有不同的调节作用。接着分析嵌合分子免疫的小鼠体内的抗病毒CTL应答。pcEnv和pV86C80T80共免疫小鼠不产生病毒特异性的细胞毒性细胞。但pcEnv和pV80C86T86共免疫的小鼠，可诱导超过40％的抗HIV-1的CTL活性，E∶T＝1∶100。pcEnv与pCD86共免疫小鼠的抗病毒CTL应答与之相同(附表4)。因此，当CD80V区与CD86 C区和胞质尾区同时表达时，其也能和CD86的V区一样，在抗原特异性T细胞的活化中发挥作用。但CD86V区在与CD80 C区或细胞质尾同时表达时无作用。细胞因子的产生也支持以上结果。pcEnv或pcEnv与pCD80共免疫的小鼠脾细胞上清液有低水平的IL-12，但无γIFN和IL-4的释放(附表4)。相反，pcEnv+pCD86或pcEnv+pV80C86T86共免疫小鼠，诱导γIFN和IL-12特异性地增强，但无IL-4的释放。
以上结果表明CD86 C区和/或细胞质尾对T细胞有重要的正调节作用。而CD80的同样区域则没有。CD80的C区和/或细胞质尾可能参与向T细胞提供负信号。
CD86细胞质尾区在抗原特异性T细胞的活化中发挥重要作用
已证明，B7的细胞质尾区促使配体在细胞表面集结，其对体外实验的T细胞活化是必要的。因此，构建了缺失细胞质尾区的B7突变体，以研究细胞质尾区对抗原特异性T细胞的活化的具体作用。用pcEnv与pV80C80TΔ或pV86C86TΔ共免疫小鼠。这些编码CD80或CD86分子的截短形式的构建体可以诱导低水平的死亡，而pcEnv与pCD86共免疫小鼠产生强的抗病毒CTL应答(附表4)。对细胞因子Th1产生的分析也支持以上结果。
缺失细胞质尾区的CD80和CD86构建体在与DNA免疫原共免疫小鼠时，对γIFN无特异性地增强作用。IL-12的水平在pV86C86TΔ免疫的小鼠中略高于pcEnv或pcEnv与pV80C80TΔ共免疫的小鼠。重要的是，pcEnv与野生型CD86的编码DNA共免疫小鼠可以显著增大γIFN和IL-12的产量(附表4)。因此，CD86细胞质尾区对T细胞活化有重要作用，pcEnv与pV80C80TΔ共免疫小鼠对T细胞活化无诱导作用。所以，为了了解是否CD80的C区和/或细胞质尾区也参与T细胞的活化，进一步构建CD80和CD86细胞质尾区缺失的突变体。
CD80的C区对T细胞活化有负调控，而细胞质尾区无此效应
pcEnv与只编码CD86/CD80分子V区和细胞质尾区的质粒pV80CΔT80或pV86CΔT86共免疫小鼠。只注射pcEnv或pcEnv与pCD86/pCD80的共免疫小鼠作为对照。附表1显示了这些实验的抗原特异性的抗病毒CTL应答。CD86的辅助效应在CD86 C区缺失的分子中处在极低的水平。而缺失C区的质粒pV80CΔT80能有效激活抗病毒CTL应答(图1)。说明C区的缺失是引起这种功能的原因。CD80野生型以及细胞质尾区缺失型(图1，表4)无此效应。用pcEnv和pV80CΔT80/pV86CΔT86共免疫的小鼠脾细胞研究细胞因子Th1的产量变化，以研究细胞免疫的增强。pcEnv与pCD86/pCD80共免疫的小鼠作为对照，发现pcEnv与野生型的pCD86以及pV80CΔT80和pV86CΔT86嵌合基因共免疫小鼠同样可以诱导淋巴因子Th1的产生(图2A和2B)。
结果表明，CD80细胞质尾区是有功能的，对抗原特异性T细胞的活化有重要作用。而CD80而非CD86的C区对T细胞有负调控作用。接着分析了CD80 C区对T细胞的抑制作用。
CD80 C区抑制CD86对T细胞的活化
DNA免疫原与分子佐剂共同免疫小鼠，分析CD80 C区对抗原特异性T细胞的抑制作用。用DNA免疫原以及野生型的pCD80/pCD86或pCD86/pV80CΔT80共免疫小鼠。对照只注射了pcEnv，或pcEnv与pCD86/pV80CΔT80/pCD80这三者中任一。分析实验及对照小鼠的脾细胞的抗病毒CTL应答。
前人曾观察到DNA免疫原与pCD86或pV86CΔT80共同免疫小鼠可以显著诱导抗病毒CTL反应的增强(附图3)。但pcEnv与野生型pCD80或pCD86共同免疫小鼠，不能诱导抗病毒CTL反应的增强(溶解率与pcEnv免疫的对照组相同)。值得注意的是，pCD86和pV80CΔT80的组合仍然可以在免疫动物诱导辅助效应，这种效应类同DNA免疫原与pCD86共同免疫产生的效应。可以认为，野生型的pCD80与DNA免疫原共免疫，可以抑制抗病毒CTL反应的增强，C区缺失的CD80无此效应。以下实施例对CD8+T细胞对细胞毒性的影响作了分析，在除去这些细胞后分析了CTL活性。用抗CD8+单抗和无毒兔补体处理脾细胞。处理后的细胞去除了CD8+细胞，可以抑制DNA免疫原与pCD86共同免疫小鼠的抗病毒CTL反应。在pcEnv+pCD80+pCD86共同免疫小鼠未观察到抗病毒的CTL活性(图4)。
C区缺失的CD80的表达较之野生型CD80的表达更易诱导淋巴 细胞对免疫动物肌肉组织的浸润
研究表明，与pcEnv+pCD80相比，pcEnv+pCD86共免疫的小鼠有显著增加的浸润现象。这些浸润细胞包括CD8+和CD4+T细胞。以下实验例采用pcEnv和pV80CΔT80共免疫小鼠，以探明T细胞对肌肉组织的浸润现象。对照为用载体或pcEnv+pCD80或pCD86免疫的动物。pcEnv+pCD86共免疫的小鼠有显著增加的浸润现象，而pcEnv+pCD80而无此效果(附图5)。正常动物的细胞几乎没有浸润现象，DNA免疫原与pV80CΔT80共同免疫小鼠有更强的浸润现象。说明，C区的缺失改变了CD80的共刺激特性，使其在这方面类似野生型的CD86。
C区缺失的CD80和野生型CD80对CTLA-4有不同的结合亲和 力
以上实验例说明，DNA免疫原与pCD86或pV80CΔT80共免疫小鼠，可增强CTL活性、增强注射位点的浸润现象、增加细胞因子Th1产量。与之相反，DNA免疫原与pCD80共免疫没有这种效应。因此我们推测，C区缺失造成CD80对CTLA-4亲和力的降低，并产生对T细胞的负调节作用。我们使用表面胞质团共振比较C区缺失的CD80和野生型CD80对CTLA-4的亲和力差异。一般固定受体分子(抗受体分子)于感受器表面，使不同浓度的抗受体分子(受体分子)不间断地通过感受器表面。我们观察到人的可溶性CTLA-4结合可溶性CD80的KD值为0.2-0.4μM。将表达特定配体的细胞固定于感受器表面，细胞的固定化减小了配体可能的构向变化，从而使CD80表面表位与可溶性CTLA-4-Ig最大限度的接触。膜双层的侧向扩散使CD80配体在结合CTLA-4时保持正常生理状态下的寡聚化。结果表明，表达C区缺失的CD80和野生型CD80的RD细胞都可以特异性地结合CTLA-4-Ig。此结合依赖浓度的变化。进一步的实验扣除了单抗结合的非特异性信号，以计算其亲和力。野生型CD80受体与CTLA-4＝Ig结合速度比以缺失C区CD80的快五倍(参数kon)。而复合体CTLA-4/CD80的结合速度比野生型CD80受体慢2.8倍(参数koff)。CTLA-4＝Ig/野生型CD80的相互作用比缺失C区CD80强14倍(参数KD)。Bioacore的计量参数kon和koff与细胞表面的受体数目无关。说明，CD80C区的缺失对于CTLA-4/CD80相互作用有很大的影响。
讨论
目前的证据表明，表达在APC上的CD80和CD86参与了T细胞活化的重要共刺激途径之一。这些分子与T细胞表面受体(CD28或CTLA-4)相互作用并产生影响增殖和细胞因子分泌的重要二级信号。T细胞活化的关键共刺激信号是由CD28结合B7配体后产生的。相反，CTLA-4主要诱导抑制信号。CD80和CD86的功能更加复杂，难以定义。几个主要的体外实验模型表明CD80和CD86都参与T细胞活化。CD86比CD80更早的表达意味着其对于启始T细胞免疫反应有更重要的作用。CD80和CD86的差异也表现在与CD28和CTLA-4不同的亲和力上。CD80和CD86的功能差异在许多在内的模型系统中都有记录，包括DNA免疫。
DNA免疫小鼠后，CD86参与T细胞活化的二级信号，而CD80没有这种效应。然而，CD80和CD86与编码微基因的质粒DNA共表达可以增强CTL应答活性。此结果与其他结果的区别在于，认为在其中单独发挥作用的是表位而非天然抗原。不过，这些不同研究者的结果都有相同之处，即暗示了在启始和扩展体内细胞免疫方面，CD86比CD80更加重要。
为了进一步研究CD80和CD86在T细胞活化中的作用，构建了一些嵌合和截短的CD80和CD86突变体(表3)。这些质粒与HIV-1/EnvDNA免疫原共注射小鼠，测定CTL的活性及淋巴因子Th1的产量。嵌合的pV80C86T86和野生型pCD86同样支持T细胞活化，而pCD80没有这种效应(见表4)。由于CD80和CD86的V区都能激活T细胞，这一结果值得关注。这也说明，CD86的C区和细胞质尾区同样支持T细胞活化。相反的，嵌合体pV86C80T80则不能产生激活T细胞所必须的共刺激信号。推测CD80的C区和/或细胞质尾区可能对T细胞活化有抑制作用。为了进一步研究对T细胞活化有抑制作用的分子区域，构建了B7的C区或细胞质尾区缺失的突变体。可以直接估计这些分子在T细胞激活或抑制中的作用。
体内实验表明，CD86的细胞质尾区对抗病毒CTL应答和细胞因子Th1的产生是绝对必要的(表4)。但由于CD80的细胞质尾区缺失突变体不能诱导T细胞活化，难以确定C区或细胞质尾区的抑制效应区。这一问题的解决涉及编码免疫原和缺失C区的CD80分子的基因对小鼠的共免疫(图1，2A，2B)。观察到，pV80CΔT80和pcEnv共免疫小鼠，显著地增强了T细胞的活化，似乎CD80与CD86的胞质尾区均参与T细胞的活化而无抑制效应。胞质尾区对于CD80分子在专门APC表面的重新分布和寡聚化中起到重要作用。研究表明，通过离子霉素和/或PMA活化CD80转染的细胞，可引起某种30kDa磷蛋白对于CD80胞质尾区的结合。另一些同样分子大小的、可在酪氨酸残基处诱导磷酸化的蛋白质也有这种表现。还有一些报道，CD86分子的引发可以激活B细胞上新免疫球蛋白的表达，从而产生对于APC的可能的直接信号反馈。基于这些结果及本实验中的数据，我们进一步假设，B7对APC提供直接信号，并反过来诱导诸如细胞因子、淋巴因子和趋化因子等分子的分泌与表达。这类由专门APC产生并参与免疫应答的分子包括IL-1α，IL-1β，IL-12，TNF等，可以激活或抑制免疫应答反应。事实上，这些细胞因子在DNA免疫中直接调节抗病毒的体液和细胞免疫应答反应。
一些实验表明，CD80的C区可能有抑制T细胞共激活的作用，而CD86的C区没有这种效应。我们的实验中，至少缺失了C区的突变体显著地增强了T细胞的活化(图1、2A和2B)，而野生型则不能(表4)。目前研究表明T细胞失活是由于CTLA-4与一系列TCR间的相互作用介导的。相应的，我们的实验表明，CD80的C区和V区在与CTLA-4的结合中不可或缺。暗示TCR传递的抑制信号比CD28传递的激活信号更加主导。为了直接证明这一假设，以DNA免疫原和CD80/CD86的分子组合共免疫动物。这种共免疫排除了正常状态下由pCD86共激活产生的强效抗病毒CD8+CTL反应(图3、4)。但C区缺失的CD80分子不能抑制该反应的产生(图3)。因此同时表达C区和V区的CD80，不仅能优先结合CTLA-4，直接抑制T细胞的活化，也能抑制由V区结合CD28配体而产生的正调节信号。事实上，CTLA-4的结合直接抑制了CD28的活化效应，说明前者的作用更加主导。
因为CTLA-4分子和CD28分子都能结合CD80，一定有某种结构上的差异，使平衡更利于CTLA-4的抑制效应，而不利于CD28的激活效应。通过表面脂质球共振分析发现，含有C区的CD80与CTLA-4的亲和力增加了8倍。鉴于CTLA-4和B7间可能存在的多价相互作用，这种差别有可能更大。结合CD80的CTLA-4的单体解离速度与未结合状态CTLA-4的单体解离速度相同，但由于CD80和CTLA-4还有第二步的相互作用，所观察到的解离速度可能比实际要慢，从而形成更加稳定的CTLA-4/CD80复合物。含有C区的膜CD80与膜CTLA-4的亲和力与不含有C区的膜CD80相差14倍。这些数据清楚地表明，CD80的C区不仅抑制了T细胞的活化，也改变了CD80与CTLA-4分子的结构功能关系。
缺失了C区的CD80突变体基因的表达不仅诱导T细胞的活化，也诱导实验动物肌肉组织的浸润。这种浸润远远强于pCD80和pcEnv共免疫动物后产生的浸润(图5)。目前研究表明，体外实验中人肌肉组织有APC活性。经细胞因子活化后，人成肌细胞作为MHC II限制性APC并表达共刺激分子。此外，体内实验也发现了肌细胞在T细胞活化中的效应。CD86分子的表达使小鼠肌细胞转化为MHC I限制性的APC，而CD80分子无同样效应。此结果显示，pcEnv的免疫可以诱导注射部位免疫活性细胞的少量浸润。这些浸润的T细胞可以被转染后表达MHC I、外源肽及CD86分子的肌细胞活化。活化的T细胞又可以产生趋化因子，吸引更多的T细胞到达炎症部位。相应的，pcEnv和pCD86共免疫的可以在肌肉组织中产生强的浸润(图5)。用DNA免疫原和pV80CΔT80共免疫也产生这种现象，但pcEnv和pCD80的共免疫动物肌肉组织只有少量的浸润。因为CD28分子和CTLA-4分子都能结合CD80，一定有某种结构上的差异，使平衡更利于CTLA-4的抑制效应，而不利于CD28的激活效应。野生型CD80的C区在被转染的肌细胞中的表达对激活的淋巴细胞在该组织的浸润和/或增殖可能有早期抑制的作用。这可能可以解释CTLA-4的优先结合和抑制信号的主导地位。免疫位点的T细胞不产生趋化因子，也不诱导免疫区其他细胞的迁移(图5)。对于哪一种共刺激分子优先结合CTLA-4，以及这种优先的结构基础仍不清楚。
早期的定点诱变实验研究了B7与CD28/CTLA-4分子的结构功能关系。总的来说，研究者都认为CD80 V区和C区上超过20个氨基酸残基在与CTLA-4的结合中至关重要，但不清楚具体的结合区域。小鼠的脾细胞和淋巴结中存在缺失C区的经剪接的CD80分子。与CD80相比，这种天然的IgV分子极易结合CD28＝Ig，但与CTLA-4的亲和力降低。至少有一个研究小组认为，CD80缺失C区在同CTLA-4＝Ig的结合中比同CD28＝Ig的结合有更显著的影响。体外实验中CD80的IgV类似区激活了活性T细胞的增殖。体内实验也证明，缺失C区的CD80分子能更有效地发挥共刺激作用。欲解释表达CD80的C区的共刺激分子的抑制能力，须考虑到CD80与CTLA-4的亲和力比与CD28的强。近期的实验表明，CD80与二聚体CTLA-4的亲和力也远强于对二聚体CD28的亲和力。二聚体CTLA-4与CD80的亲和力也远强于对CD86的结合亲和力。这些亲和力差异可能可以解释CTLA-4诱导的抑制信号的主导地位。为了进一步研究CD80/CD86与CTLA-4的结合差异，研究者构建了二者C区的三维模型。
C区的三维模型分析与突变实验结果的相关性使受体结合的研究有了新的突破。CD80和CD86都表现出与免疫球蛋白的序列同源性，暗示存在着相似的构象(表6)。接下来的免疫分析主要集中在改变人和小鼠CD80分子间的保守残基，以及CD80与CD86间的保守残基。实验发现，CD80 C区上的几个保守残基对于结合CTLA-4＝Ig是必须的(表6)。
根据数据建立模型。将Q157、D158、E162和L163在空间上集结于表面易接触的部位，靠近D-E链间环的氨基末端和E链起始区的。其它残基，如F108，P111和I113在空间上定位于A链(表6)。从在突变分析的基础上构建的第二个模型中发现，B-C环的P135和P137，D-E环上的Q157，D158，P159对于结合CTLA-4是必须的。参与受体结合的主要残基标示在IgC区的ABCDE上。
图6显示具有CTLA-4结合区残基的CD80分子的Cα道，其在CPK上标示为B-C环的P135和P137，D-E环上的Q157，D158，P159。相应的，在CD86的模型上，有4个残基(KKMS)插入第144位至第147位，在表6和图6中以斜体标出。这4个残基的插入改变了CD80分子的B-C环构象，使CD80与CTLA-4的结合区域显著缩小。P135和P159的间距由原来CD80分子的16减至CD86分子上的12。P137和Q157的距离由CD80中的13降低为CD86中的10。因此，与CD80相比，这4个残基的插入改变了CD86分子的B-C环构象，使CD86与CTLA-4的结合面积远小于CD80与CTLA-4的结合面积(比较见图6)。CD80和CD86的模型表明二者的B-C环有结构差异。KKMS在CD86中的插入对于降低与CTLA-4的亲和力是关键的，并因此削弱了靶向T细胞的抑制信号。
总而言之，对于CD80 V区和C区结合及功能位点的差异，以及CD86与CTLA-4/CD28配体作用弱，可以利用不同实验室中不同抗原和实验系统进行解释。例如，T细胞共刺激实验的结果可利用抗CD3单克隆抗体(第一信号)和B7分子(第二信号)的可溶形式(CD80＝Ig，CD86＝Ig)获得。利用这一模式系统获得了重要的数据资料。但目前发表的研究结果表明，只有表达寡聚化共刺激分子的细胞能驱动T细胞的活化。另一方面，即使是CD80和CD86转染的细胞对于T细胞共刺激实验也非最优选的模式。在抗CD3和膜结合的CD80分子引发后，CTLA-4可以与TCRζ相互作用。这些研究结果表明，一个适当的模型可能需要包含表达MHC I/II和CD80/CD86的APC与表达TCR和CTLA-4/CD28的T细胞相互作用。相应的，在体内正常生理状态下的APC和T细胞的相互作用更适宜于揭示T细胞的激活机制。也可以利用这种模式系统研究CD80和CD86，以及CD80 V区和C区之间的功能差异。
此项发明提供了开发T细胞免疫应答调控新方法的重要信息。特别的，提供了一种B7配体。这种配体包括V和C区，它们通过优先引发表达在抗原特异性T细胞上的CTLA-4分子，使免疫应答失活。这种基因构建体对于移植物耐受及自身免疫病的治疗有重要的应用价值。另一方面，利用可减弱对于T细胞活化的抑制的CD80 V区进行免疫，可以获得更加有效的肿瘤疫苗。此外，此项发明提供的一些分子佐剂也可用于产生增强细胞免疫应答的疫苗。
表1
小核糖核酸病毒科
属：              鼻病毒属：(医学)引起普通感冒病例中约50％。
                  肠道病毒属：(医学)包括脊髓灰质炎病毒、柯萨
                  奇病毒、人肠道细胞病变孤儿病毒和人肠道病
                  毒如甲型肝炎病毒。
                  Apthovirus：(兽医学)这些是口蹄疫病毒。
靶抗原：          VP1、VP2、VP3、VP4、VPG
Calcovirus科
属：              诺沃克类病毒：(医学)这些病毒是流行性胃肠炎
                  的重要致病物。
披膜病毒科
属：              α病毒属：(医学和兽医学)例子包括Senilis病毒、
                  RossRiver病毒和东方和西方马脑炎病毒。
                  风疹病毒属：(医学)风疹病毒。
黄病毒科          例子包括：(医学)登革热、黄热病、日本脑炎、
                  圣路易型脑炎和蜱传性脑炎病毒。
丙型肝炎病毒：    (医学)这些病毒仍未被置于一个科中，但相信它
                  们是一种披膜病毒或黄病毒。它们与披膜病毒
                  科非常相似。
冠状病毒科：      (医学和兽医学)
                  传染性支气管炎病毒(家禽)
                  猪传播性胃肠道病毒(猪)
                  猪血细胞凝集性脑脊髓炎病毒(猪)
                  猫传染性腹膜炎病毒(猫)
                  猫肠冠状病毒(猫)
                  犬冠状病毒(狗)
                  人呼吸道冠状病毒引起普通感冒中的～40％。EX.
                  224E，0C43
                  注意-冠状病毒可引起除甲型、乙型和丙型以外
                  的肝炎
靶抗原：          E1-也称M或基质蛋白
                  E2-也称S或Spike蛋白
                  E3-也称HE或血细胞凝集-elterose糖蛋白(不
                  存在于所有的冠状病毒中)
                  N-核壳
棒状病毒科
属：              水泡性病毒属
                  狂犬病病毒属：(医学和兽医学)狂犬病
靶抗原：          G蛋白
                  N蛋白
线性病毒科：      (医学)
                  出血热病毒，如马伯格氏病毒和埃博拉病毒
副粘病毒科：
属：              副粘病毒属：(医学和兽医学)腮腺炎病毒、新城
                  疫病毒(重要的鸡体内病原体)
                  麻疹病毒属：(医学和兽医学)麻疹、犬瘟热
                  肺病毒属：(医学和兽医学)呼吸道合胞病毒
正粘病毒科        (医学)
                  流行性感冒病毒
本杨病毒科
属：              本杨病毒属：(医学)加利福尼亚脑炎、拉克罗丝
                  脑炎
                  白岭病毒属：(医学)裂谷热
                  汉滩病毒属：Puremala是一种hemahagin热病
                  毒
                  纳伊罗病毒属(兽医学)内罗毕羊病
                  还包括许多未指定的本杨病毒
嵌沙样病毒科      (医学)
                  LCM、拉沙热病毒
呼肠孤病毒科
属：              呼肠孤病毒：可能的人类病原体
                  轮状病毒：儿童急性胃肠炎
                  环状病毒：(医学和兽医学)
                  科洛拉多蜱传热、Lebombo(人)马变性性脑病、
                  蓝舌病
逆转录酶病毒科
亚科：            肿瘤病毒(Oncorivirinal)亚科：(兽医学)猫白血病
                  病毒、HTL VI和HTL VII
                  慢病毒亚科：(医学和兽医学)HIV、猫免疫缺陷
                  性病毒、马感染、贫血症病毒
                  泡沫病毒亚科
乳多空病毒科
亚科：            Polyomavirus：(医学)BKU和JCU病毒
亚科：            乳头状瘤病毒：(医学)许多与癌症或乳头状瘤的
                  恶性进展相关的病毒类型
腺病毒            (医学)
                  EX AD7、ARD.、O.B.-引起呼吸道疾病-一
                  些腺病毒如275引起肠炎
细小病毒科        (兽医学)
                  猫细小病毒：引起猫肠炎
                  猫panleucopeniavirus
                  犬细小病毒
                  猪细小病毒
疱疹病毒科
亚科：            α疱疹病毒
属：              单纯疱疹病毒属(医学)
                  HSVI、HSVII
                  水痘病毒属：(医学-兽医学)假性狂犬病-水痘带
                  状疱疹
亚科：            β疱疹病毒
属：              巨细胞病毒属(医学)
                  HCMV
                  Muromegalovirus
亚科：            γ疱疹病毒
属：              淋巴潜伏病毒属(医学)
                  EBV-(伯基特淋巴瘤)
                  Rhadinovirus
痘病毒科
亚科：            脊髓动物痘病毒(医学-兽医学)
属：              天花
                  牛痘
                  副痘病毒属-兽医学
                  Auipoxvirus-兽医学
                  山羊痘病毒属
                  兔痘病毒属
                  猪痘病毒属
亚科：            Entemopoxviridue
嗜肝DNA病毒科：   乙型肝炎病毒
未分类的：        丁型肝炎病毒
表2
                     细菌病原体
病原性革兰氏阳性球菌包括：肺炎球菌；葡萄球菌；和链球菌。
病原性革兰氏阴性球菌包括：脑膜炎球菌；和淋球菌。
病原性革兰氏阴性肠道杆菌包括：肠杆菌科；假单胞菌、不动杆菌和埃肯菌属；类鼻疽；沙门氏菌；志贺氏菌病；嗜血杆菌；摩拉克氏菌；软性下疳；布鲁氏杆菌病；土拉菌病；耶尔森氏鼠疫杆菌(巴斯德氏菌)；链杆菌念珠棘虫属和螺旋菌；单核细胞增多性李氏菌；丹毒丝菌属rhusiopathiae；白喉；霍乱；炭疽热；性病肉芽肿(腹股沟肉芽肿)；和巴尔通氏体病。
病原性厌氧菌包括：破伤风；肉毒梭菌中毒；其他梭状芽孢杆菌；肺结核；麻风病；和其他分枝杆菌。病原性螺旋体疾病包括：梅毒；密螺旋体病：雅司病、品他病和地方性梅毒；和钩端螺旋体病。
由较高病原体细菌和病原性真菌引起的其他感染包括：放线菌病；诺卡氏菌病；隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病、曲霉病和白霉菌病；孢子丝菌病；副球孢子菌病、petriellidiosis、球拟酵母病、足分支菌病和着色真菌病；和皮真菌病。
立克次体感染包括立克次体的和立克次体病。
支原体和衣原体感染的例子包括：肺炎支原体，性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和围产期衣原体感染。
病原性真核生物
病原性原生动物和蠕虫及由其引起的感染包括：阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形体病；卡氏肺孢子虫；巴贝西虫病；贾第鞭毛虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫；吸虫或蛭；和绦虫感染。
表3利用FACS分析编码CD80和CD86分子的野生型、嵌合或截短形式的构建体的表达效率
*方框代表CD80(阴影)和CD86(空白)分子的V区、C区和T区(胞质尾区)(跨膜序列没有略去)。
**用编码绿色荧光蛋白(GFP)的构建体与实验或对照质粒共同转染的横纹肌肉瘤细胞。在表达GFP的细胞群中检测表达B7分子(红色意味着通道)的细胞的荧光强度(FI)。
表4用编码病毒抗原和B7分子的不同形式的质粒
共免疫的小鼠中的细胞免疫反应(CTL和细胞因子Th1的产生)
 用以下质粒免疫的小鼠          *不同E/T比值时的抗病毒CTL(％)         *细胞因子Th1(pg/ml)
    100∶1   50∶1   25∶1   γIFN   IL-12
 空载质粒     1.1   2.5   4.3   34.50   16.80
 pcEnv     13.3   12.8   13.7   46.50   31.37
 pcEnv+pcD80     16.6   12.5   11.3   36.32   36.99
 pcEnv+pcD86     47.7   34.8   24.7   334.54   71.86
 pcEnv+pV80C86T86     42.8   36.2   28.5   500.37   90.32
 pcEnv+pV86C80T80     16.4   17.1   13.4   50.93   26.42
 pcEnv+pV80C80TΔ     14.5   8.6   5.1   41.25   21.87
 pcEnv+pV86C86TΔ     11.0   8.7   10.6   38.91   31.86
*最后一次免疫两周后，收集脾细胞，分析CTL和细胞因子Th1，方法见文中“材料与方法”部分。CTL的检测实验重复三次，细胞因子的检测重复两次，结果全部一致。
                表5
CTLA-4/CD80相互作用的结合参数(依据朗缪尔模型)
 CD80种类     kon(l/Ms)     koff(l/s)   KD(M)
 野生型CD80     3.99×105     2.00×10-4   5.02×10-10
 缺失C区的CD80     7.86×104     5.53×10-4   7.04×10-9
           表6
人CD80和CD86 C区的序列对比
*使用CLUSTALW(Thompson，1994)进行序列对比，并经手动调整。各行末尾的残基是从其各自的N末端开始编号的。据文献所述(Ellis，1996；Fargeas，1995；Guo，1995；Guo，1998；Peach，1995)对结合T细胞表面受体CTLA-4有关键作用的CD80残基用黑体标出。CD86中两种可能的4个氨基酸插入以斜体显示，它们很有可能干扰与CTLA-4的结合(参见讨论部分)。CD80和CD86中着重标出的β链是基于sB7-1的晶体结构(Ikemizu，2000)。
序列表
<110>宾夕法尼亚大学理事会
     拉菲克·P·塞卡利
     马克·霍尔特曼
<120>突变的人CD80及其制备和应用组合物和方法
<130>UPAP0377
<140>
<141>
<160>20
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>1
ctgcttgctc aactctacgt c                                          21
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>2
ctgaagttag ctttgactga taacg                                      25
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>3
gcaatagca cacaaatttc a                                           21
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>4
cagtcaaagc taacttcagt caacc                                      25
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>5
gggaagtcag caagcactga cagttc                                     26
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>6
tcagtgcttg ctgacttccc tacacc                                     26
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>7
tcttgcttgg ctttgactga taacgtcac                                  29
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>8
tcagtcaaag ccaagcaaga gcattttcc                                  29
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>9
tcctcaagct caagcactga cagttc                                     26
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>10
tcagtgcttg agcttgagga ccc                                        23
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>11
tctggatcct catcttgggg ca                                         22
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：新序列
<400>12
tctggatcct catttccata g                                          21
<210>13
<211>33
<212>PRT
<213>智人
<400>13
Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr
  1               5                  10                  15
Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu
             20                  25                  30
Pro
<210>14
<211>34
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr
  1               5                  10                  15
Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro
             20                  25                  30
Glu Pro
<210>15
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>15
His Leu Ser Trp Leu Glu
  1               5
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys
  1               5                  10
<210>17
<211>33
<212>PRT
<213>智人
<400>17
Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro
  1               5                  10                  15
Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr
             20                  25                  30
Thr
<210>18
<211>36
<212>PRT
<213>智人
<400>18
Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn
  1               5                  10                  15
Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro
             20                  25                  30
Asp Val Thr Ser
         35
<210>19
<211>24
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
  1               5                  10                  15
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr
             20
<210>20
<211>24
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu
  1               5                  10                  15
Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu  Leu
             20

Claims (22)

1.一种经分离的蛋白质，至少包括80V、80tm和80ct中的一个，且不含有80C；其中所述蛋白包括80V或86V或这两者，并且选择性地包括由86C、80tm、86tm、80ct和86ct中的一个或多个，其中：
80V是指CD80的可变区或其功能片段；
86V是指CD86的可变区或其功能片段；
86C是指CD86的C区或其功能片段；
80tm是指CD80的跨膜区或其功能片段；
86tm是指CD86的跨膜区或其功能片段；
80ct是指CD80的胞质尾区或其功能片段；且
86ct是指CD86的胞质尾区或其功能片段。
2.权利要求1的经分离的蛋白质，其中
80V是指CD80的可变区；
86V是指CD86的可变区；
86C是指CD86的C区；
80tm是指CD80的跨膜区；
86tm是指CD86的跨膜区；
80ct是指CD80的胞质尾区；且
86ct是指CD86的胞质尾区。
3.权利要求1的经分离的蛋白质，结构如下：
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9其中
R1是指0-50个氨基酸；
R2是指80V或86V；
R3是指0-50个氨基酸；
R4是指86C或0个氨基酸；
R5是指0-50个氨基酸；
R6是指80tm或86tm；
R7是指0-50个氨基酸；
R8是指80ct或86ct；且
R9是指0-50个氨基酸。
4.权利要求3的经分离的蛋白质，其中：
R1是指0-25个氨基酸；
R3是指0-25个氨基酸；
R5是指0-25个氨基酸；
R7是指0-25个氨基酸；且
R9是指0-25个氨基酸。
5.权利要求3的经分离的蛋白质，其中：
R1是指0-10个氨基酸；
R3是指0-10个氨基酸；
R5是指0-10个氨基酸；
R7是指0-10个氨基酸；且
R9是指0-10个氨基酸。
6.权利要求1的蛋白质，选自：
80V/缺失区域/80tm/80ct；80V/缺失区域/80tm/86ct；80V/缺失区域/86tm/80ct；86V/缺失区域/80tm/80ct；86V/缺失区域/80tm/86ct；86V/缺失区域/86tm/80ct；80V/缺失区域/86tm/86ct；80V/86C/80tm/80ct；80V/86C/80tm/86ct；80V/86C/86tm/80ct；86V/86C/80tm/80ct；86V/86C/80tm/86ct；86V/86C/86tm/80ct；80V/86C/86tm/86ct；80V/缺失区域/80tm/缺失区域；80V/缺失区域/86tm/缺失区域；86V/缺失区域/80tm/缺失区域；80V/86C/80tm/缺失区域；80V/86C/86tm/缺失区域；86V/86C/80tm/缺失区域；86V/86C/80tm/缺失区域；86V/86C/缺失区域/80ct；80V/86C/缺失区域/80ct；80V/缺失区域/缺失区域/80ct；86V/缺失区域/缺失区域/80ct；80V/86C/缺失区域/缺失区域；和80V。
7.一种嵌合蛋白，包括权利要求1-6中任意一项所述的蛋白质部分和免疫原部分。
8.一种组合物，包括权利要求1-7中任意一项所述的蛋白质和免疫原性蛋白或包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的编码序列的核酸序列。
9.一种核酸分子，包括可操作地与调控元件相连接的编码权利要求1-7中任意一项所述的蛋白质的编码序列。
10.一种质粒，包括权利要求9中的核酸分子。
11.权利要求10中的质粒，包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的编码序列。
12.一种组合物，包括权利要求10或11的质粒，进一步包括免疫原性蛋白或包括核酸序列的质粒，所述核酸序列包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的编码序列。
13.一种重组或减毒的疫苗，包括含有权利要求9中所述核酸分子的组合物。
14.一种重组或减毒的疫苗的组合物，包括权利要求1-13中任意一项所述的主题。
15.一种药物组合物，包括权利要求1-14中任意一项所述的主题。
16.权利要求1-15中任意一项所述的主题在制备用于免疫个体对抗免疫原的药物中的应用。
17.权利要求16的应用，其中所述免疫是预防性的。
18.权利要求16的应用，其中所述免疫是治疗性的。
19.权利要求16的应用，其中所述免疫原是过敏原。
20.权利要求16的应用，其中所述免疫原是病原体抗原。
21.权利要求16的应用，其中所述免疫原是与自身免疫病相关的抗原。
22.权利要求16的应用，其中所述免疫原是与超常增殖性疾病相关的抗原。
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