KR20020047032A

KR20020047032A - 돌연변이체 인간 ｃｄ80, 이를 포함하는 조성물, 및 이를제조하고 이용하는 방법

Info

Publication number: KR20020047032A
Application number: KR1020017013884A
Authority: KR
Inventors: 라픽 피. 세칼리; 마크 홀터맨; 데이비드 비. 웨이너; 마이클 지. 아가자니안
Original assignee: 라픽 피. 세칼리; 멕코나시 에블린 에이치.; 마크 홀터맨; 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-27
Publication date: 2002-06-21
Also published as: BR0010155A; CA2369747A1; EP1173204A4; WO2000066162A1; CN1196495C; WO2000066162A9; AU4494700A; IL145795A0; KR100903710B1; JP2002542800A; AU779395B2; IL145795A; US7446189B1; DE60044247D1; US8202847B2; EP1173204B1; US20110002956A1; ATE464910T1; MXPA01011079A; KR20080052690A

Abstract

본 발명에는 개선된 백신 및 이를 이용하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 자가면역성 질환을 앓고 있거나 이식에 관련된 개체를 치료하기 위한 면역 억제 조성물, 및 이를 이용한 방법이 개시되어 있다.

Description

돌연변이체 인간 ＣＤ80, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 제조하고 이용하는 방법{Mutant Human CD80 and Compositions for and Methods of Making and Using the Same}

본 출원은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는, 1999년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 제60/131,764호에 관한 것이다.

CD28은 대부분의 성숙 T-세포 및 흉선세포에서 구성적으로 발현되는 세포 표면의 당단백질이며, CTLA-4 수용체는 휴지기의 T 세포에서는 나타나지 않고 T 세포가 활성화된 후 48 내지 72 시간 후에야 검출되는 것이다. CD28/CTLA-4 분자에 대한 주요 리간드는 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86)이며, 이들은 전문적인 항원 표출 세포(antigen presenting cell; APC)의 표면에서 발현된다. 2개 이상의 수용체(CD28 및 CTLA-4) 및 2개 이상의 리간드(CD80 및 CD86)의 존재에 대한 생물학적 원리는 분명하지 않다. 연구 초기에 CD80과 CD86의 항원이 기능적으로 유사함이 입증되었다. 그러나, 이들이 상이한 패턴으로 발현된다고 알려지면서, 이 동시에 자극되는 분자들이 상이한 역할을 한다는 것이 최초로 제안되었다. CD86은APC에서 구성적으로 발현되고, APC의 활성화 이후에 그 발현이 빠르게 상향조절된 후, 점차 기본 발현 수준으로 돌아간다. CD80은 CD86에 비해 나중에 발현되고, 그 발현은 면역 반응의 개시 후 48 내지 72 시간에 최대이다. CD86은 구성적으로 발현되고 CD80에 비해 초기에 발현이 상향 조절되기 때문에, CD86의 발현은 면역 반응의 초기에 중요하고 CD80의 발현은 그다음에 중요하다는 것을 알 수 있다.

CD80과 CD86의 기능적 차이는 이 동시 자극성 분자들과 CD28 및 CTLA-4의 결합 속도 데이타에 의해 추가로 제안되었다. 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 분석은 2개의 리간드 모두가 CD28보다 CTLA-4에 더 높은 친화도로 결합함을 입증하였다. 추가로 측정한 결과, CD86/CTLA-4 복합체는 CD80/CTLA-4 복합체보다 더 빠르게 해리됨을 알아냈다. CTLA-4 및 CD80의 발현 지연과 관련된 이러한 결합의 차이는 CTLA-4와 CD80의 기능적 관계가 CTLA-4와 CD86 분자의 기능적 관계보다 더 강력함을 시사한다.

CD80 및 CD86 분자는 시험관내 및 생체내에서 여러가지 기능을 한다고 보고되었다. 항-CD86 항체는 자가면역성 당뇨병의 생쥐 모델에서 발병을 차단했지만 항-CD80은 차단하지 못한 반면, 실험적 알레르기성 뇌척수염의 쥐과 모델에서는 이들 항체간에 반대되는 효과가 나타났다. 여러가지 실험 시스템은 항원에 대한 T-세포 반응의 개시에서 CD86이 중요한 작용을 함을 입증하였고, CD80 분자가 이들 세포에 조절 신호를 제공하는 중요한 기능을 할 것이라 주장하였다. 외생성 인간 CD86의 발현은 HIV-1의 외피(envelope) 단백질과의 DNA 백신접종(vaccination) 이후에 쥐과 T 세포에 중요한 활성화 신호를 제공하지만, CD80은 그렇지 않다. HIV-1 또는 인플루엔자 항원을 코딩하는 DNA, 및 쥐과 CD80 및 CD86을 코딩하는 플라스미드로 생쥐를 백신접종했을 때, 유사한 결과가 관찰되었다. 따라서, CD80과 CD86의 기능적 차이는 생쥐에서 발현된 인간의 동시 자극성 분자들의 면역원성 차이와는 무관하다. 인간 또는 쥐과의 외생성 CD86은 DNA 백신접종시 항-바이러스성 T-세포 활성화를 자극하지만, CD80은 그렇지 않을 것으로 생각된다.

백신은 병원성 항원이나 인간의 질병과 관련된 세포에 결합하는 항원과 같은 표적 항원에 대해 개체를 면역화시키는데 유용하다. 인간의 질병과 관련된 세포에 결합하는 항원으로는 암-결합 종양 항원 및 자가면역성 질환과 관련된 세포에 결합하는 항원이 포함된다.

이러한 백신을 디자인함에 있어서, 백신접종될 개체의 세포에서 표적 항원을 생산하는 백신이 면역계라는 세포의 무기(arm)를 유도하는데 효과적이라고 인식되어 왔다. 구체적으로, 독성약화 생백신, 무독성 벡터를 사용하는 재조합 백신, 및 DNA 백신은 백신접종될 개체의 세포에서 항원을 생성함으로써 면역계라는 세포의 무기를 유도하게 된다. 한편, 오직 단백질만을 포함하는 서브유닛 백신, 및 사백신 또는 불활성화된 백신은 체액성 반응은 유도하지만 양호한 세포성 면역 반응을 유도하지는 못한다.

종종, 세포성 면역 반응은 병원체의 감염으로부터 보호하고, 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 효과적인 면역-매개의 치료법을 제공하는데 필수적이다. 따라서, 독성약화 생백신, 무독성 벡터를 사용하는 재조합 백신 및 DNA 백신이 때로는 바람직하다.

때로는 그러한 백신이 병원체 감염 또는 인간의 질병에 대해 예방 또는 치료 목적으로 개체를 면역화시키는데 효과적이긴 하지만, 개선된 백신에 대한 요구가 존재하는 실정이다. 즉, 면역 반응을 생성하고 증가시키는 조성물 및 방법이 필요하다.

면역화와는 대조적으로, 유전자 치료법은 비-면역원성 단백질을 코딩하는, 발현되어 핵산 분자가 투여된 개체에 치료상 유익한 효과를 부여하는 핵산 분자를 이용한다. 유전자 치료법의 구체적인 유형은 개체에서 면역 반응을 조절하는 비-면역원성 단백질을 코딩하는 유전자 물질을 전달하여 치료상 유익한 효과를 부여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 개체에서 자가면역성 질환과 관련된 면역 반응을 하향 조절하는 비-면역원성 단백질을 코딩하는 유전자 물질을 전달하여 개체에 치료상 유익한 효과를 부여하도록 프로토콜을 디자인할 수 있다. 면역 반응을 조절하는 유전자 치료법 프로토콜에 사용할 수 있는 조성물 및 방법이 필요한 실정이다.

자가면역성 질환 및 세포/조직/기관 이식거부와 같은 질환을 치료하는, 다른 수단에 의한 면역 반응의 조절이 이와 유사하게 요구되고 있다. 면역 반응의 조절에 사용할 수 있고 면역 반응의 조절에 유용한 조성물을 디자인 및 개발하는데 사용될 수 있는 조성물 및 방법이 요구되고 있다.

본 발명은 개체를 면역화시키기 위한 조성물 및 방법, 면역 억제성 조성물, 상기 조성물의 성분, 및 이를 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 항원 특이적 항-바이러스성 CTL 반응을 보여주는 실시예에 기재된 실험에서 얻은 데이타이다.

도 2A 및 2B는 다양한 작제물에 의해 유도된 림포카인(lymphokine) 생산을 보여주는 실시예에 기재된 실험에서 얻은 데이타이다.

도 3은 작제물 투여 이후의 CTL 활성을 보여주는 실시예에 기재된 실험에서 얻은 데이타이다.

도 4는 이들 세포의 개체군을 제거한 후에 측정된, 작제물 투여 이후의 CTL 활성을 보여주는 실시예에 기재된 실험에서 얻은 데이타이다.

도 5는 작제물로 면역화된 생쥐의 근육으로 림프구가 침윤되는 것을 보여주는 실시예에 기재된 실험에서 얻은 사진이다.

도 6은 CD80 분자의 도식이다.

본 출원인은 항원 표출 세포(APC)가 T 세포와 상호작용할 때 인간 CD80의 C 영역이 음성(negative) 신호를 변화시키는 작용을 한다는 것을 알아냈다. 음성 신호는 T 세포의 활성을 감소시킴으로써 APC에 의해 T 세포에 표출되는 항원에 대해 생겨나는 면역 반응을 감소시킨다. 구체적으로는, 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 단백질과 항원의 복합체 형성에 의해 APC 상에 형성된 MHC/항원 복합체에 대한 T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)의 상호작용이, APC에 존재하는 동시 자극성 분자인 CD80 및 CD86과 T 세포 상의 CD28 분자의 상호작용을 수반한다. 이러한 상호작용의 결과 T 세포가 활성화되고 면역 반응이 증가하게 된다. 그러나, T 세포의 활성화 이후에 CTLA4가 T 세포에 의해 발현된다. CTLA4는 CD80과 상호작용하고, 이러한 상호작용의 결과 우성적 음성 신호(dominantnegative signal)를 생성함으로써 CD80 및 CD86의 CD28과의 상호작용에 의한 동시 자극 효과는 없어지게 된다. CTLA4와 CD80의 상호작용 결과, T 세포가 관여하는 면역 반응이 감소하게 된다.

본 출원인의 발견은 본 발명의 2가지 별개의 측면을 형성한다. 본 발명의 한 측면에 따라, CD80의 동시 자극 활성은 유지하되 CD80의 CTLA4와의 상호작용과 관련된 음성 신호는 변화시키지 않는 CD80 돌연변이체 및 이를 코딩하는 핵산이 제공된다. 그러한 CD80 돌연변이체는, 단백질 면역원 또는 면역원을 코딩하는 핵산 분자로서 전달되는 면역원과 함께 단백질이나 그 단백질을 코딩하는 핵산으로서 자신이 전달되는 면역화 프로토콜에 유용하다. 본 발명의 한 측면을 이루는 CD80 돌연변이체는 면역화 프로토콜의 분자 면역보강제이다. 본 발명의 다른 측면에 따라, CD80의 CTLA4와의 상호작용과 관련된 음성 신호를 변화시킬 수 있는 CD80의 C 영역 함유 CD80 돌연변이체 및 이를 코딩하는 핵산이 제공된다. 그러한 CD80 돌연변이체는 자가면역성 질환, 및 세포, 조직 및 기관 이식체와 관련된 면역 억제 프로토콜에 유용하다. 음성 신호를 제공하는 CD80 돌연변이체는 단백질이나 그 단백질을 코딩하는 핵산으로서 전달될 수 있다. 본 발명의 상기 측면을 이루는 CD80 돌연변이체는 자가면역/면역억제 치료제이다.

인간 CD80의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 잘 공지되어 있으며, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143 (8): 2714-2722, Selvakumar et al. (1992) Immunogenetics 36 (3): 175-181, Freeman et al. (1991) J. Ex. Med. 174 (3): 625-631, Lanier et al. (1989) J. Immunol.154 (1): 97-105] 및 진뱅크(Genbank) 고유 코드 P33681(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 기재되어 있다.

CD86(B7.2)에 대해서는 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Azuma, M. et al. 1993 Nature 366: 76-79]에 최초로 기재되었다. 상기 문헌의 도 2B에는 B7.2 단백질의 뉴클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열이 개시되어 있다. 또한, 그 서열 정보는 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 진뱅크 데이타베이스의 U04343으로서 입수할 수 있다.

인간 CD80은 288개 아미노산의 단백질(1-288)로서 발현되어 성숙 단백질(35-288)로 가공된다. CD80은 4개의 영역, 즉 가변(V) 영역, 불변(C) 영역, 막횡단 영역(tm) 및 세포질 꼬리부 영역(ct)으로 나누어진다. 아미노산 35-242는 단백질의 세포외 도메인을 형성한다. 아미노산 43-123은 V 영역을 형성하고, 이는 또한 면역글로불린과 유사한 V-형 도메인이라고도 불리운다. 아미노산 155-223은 C 영역을 형성하고, 이는 또한 면역글로불린과 유사한 C2-형 도메인이라고도 불리운다. 아미노산 243-263은 막횡단 영역을 형성한다. 아미노산 264-288은 세포질 꼬리부를 형성한다.

본원에 사용되는 "CD80 돌연변이체", "CD80의 C 영역 돌연변이체", "C 영역 결핍 CD80 돌연변이체" 및 "CD80ΔC 돌연변이체"는 상호 교환가능하게 사용되며, CD80의 하나 이상의 기능적 비-C 영역이 포함된 기능적 CD80과 CD86V 영역 중 어느 하나를 함유하고, C 영역의 전부 또는 일부가 존재하지 않음으로써 야생형 CD80 C 영역의 CTLA4와의 상호작용과 관련된 음성 신호를 변화시키지 않도록 CD80의 기능적 C 영역이 없는 분자를 의미한다.

본원에 "CD80의 하나 이상의 기능적 비(非)-C 영역" 및 "CD80의 기능적 C 영역"이라는 어구에 사용되는 "CD80의 기능적 영역"이란 CD80의 완전한 단백질 영역들 뿐만 아니라 완전한 영역의 활성을 지닌 부분 영역들도 일컫는 것이다. 예를 들어, CD80의 기능적 V 영역은 CD80의 아미노산 43-123 또는 그의 단편을 지칭하며, 여기에는 CD28에 결합하는 능력을 지닌 다른 CD80 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 서열들을 포함하는 단백질이 포함된다. CD80의 기능적 C 영역은 CD80의 아미노산 155-223 또는 그의 단편을 지칭하며, 여기에는 CTLA-4에 결합하여 음성 신호를 변화시키는 능력을 지닌 CD80의 다른 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 서열들을 포함하는 단백질이 포함된다. 따라서, CD80의 기능적 C 영역이 없는 단백질은 CD80의 아미노산 155-223의 단편을 포함할 수 있지만, 그러한 단편은 CTLA-4에 결합하여 음성 신호를 변화시키는 능력이 없다. 기능적 C 영역이 없는 유사한 단백질은, 인접 서열들이 변하여 구조 변화 또는 기타 변화를 통해 C 영역을 비-기능적인 것이 되도록 한다면 아미노산 155-223을 포함할 수도 있다. CD80의 기능적 tm은 CD80의 아미노산 243-263, 또는 돌연변이체 CD80 단백질을 세포막에 포함되도록 하여 분비를 방지하는 앵커(anchor)를 포함하는 그의 단편을 지칭한다. CD80의 기능적 ct는 CD80의 아미노산 264-288, 또는 돌연변이체 CD80 단백질의 발현시 세포질에 존재하는 임의의 그 단편을 지칭한다.

본원에 사용되는 "C 영역⁺CD80 단백질" 및 "C 영역 단백질"은 상호 교환가능하게 사용되며, CD80의 기능적 C 영역을 포함하고, C 영역의 전부 또는 일부가 존재함으로써 야생형 CD80 C 영역의 CTLA4와의 상호작용과 관련된 음성 신호를 변화시킬 수 있는 단백질을 의미한다.

본 발명의 한 측면은 백신접종을 위한, 구체적으로는 표적 면역원을 코딩하는 DNA가 상기 DNA를 받아들여 발현시킴으로써 상기 면역원에 대한 면역 반응이 생성되는 개체에 투여되는 DNA 백신접종을 위한 개선된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 측면에 따라, CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 DNA를 개체에 동시 투여하면, 상기 DNA의 발현은 상기 면역원에 대해 유도된 면역 반응을 증가시키는 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 생성하게 된다.

표적 항원을 발현하는 백신접종된 개체의 세포에서 CD80ΔC 돌연변이체 단백질의 동시 생산 결과, 놀랍게도 표적 항원에 대한 면역 반응이 증가됨을 발견하였다. CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 발현가능한 형태의 뉴클레오티드를 제공함으로써, DNA 백신, 재조합 벡터 백신 및 독성약화 백신을 비롯하여 백신접종된 개체의 세포에서 표적 항원의 발현에 의해 기능하는 백신들의 기능이 개선되었다.

항원을 생산하는 세포에서 CD80ΔC 돌연변이체 단백질의 동시 생산은 항원에 대한 세포성 면역 반응을 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 DNA 백신, 무독성 서브유닛 재조합 벡터 백신 및 독성약화 생백신과 같이, 백신의 일부로서 백신에서의 발현을 위해 필요한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 CD80ΔC 돌연변이체 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열을 제공함으로써 개선된 백신을 제공한다. 별법으로, CD80ΔC 돌연변이체 단백질은 면역원 또는 면역원을 코딩하는 유전자 작제물과 함께 단백질 면역보강제로서 전달한다.

CD80ΔC 돌연변이체가 면역화 프로토콜에서 분자 면역보강제로서 제공되는 본 발명의 일부 실시양태에 따라, CD80ΔC 돌연변이체는 CD80의 기능적 V 영역 또는 CD86의 기능적 V 영역을 함유한다. CD80ΔC 돌연변이체는 CD80의 기능적 C 영역을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서는 C 영역이 결실되고 V 영역이 막횡단 영역에 직접 연결된다. 일부 실시양태에서는 CD86의 C 영역이 CD80의 C 영역 대신 삽입된다. 일부 실시양태에서, 비-CD80이며 비-CD86인 서열들이 CD80ΔC 돌연변이체에서 V 영역 뒤쪽에 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD80의 막횡단 영역이 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD86의 막횡단 영역이 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD80의 막횡단 영역이 결실되어 어떠한 다른 서열로도 치환되지 않는다. 일부 실시양태에서는 비-CD80이며 비-CD86인 서열들이 CD80의 tm 대신 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD80의 세포질 꼬리부가 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD86의 세포질 꼬리부가 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD80의 세포질 꼬리부가 결실되어 어떠한 다른 서열로도 치환되지 않는다. 일부 실시양태에서는 비-CD80이며 비-CD86인 서열들이 CD80의 ct 대신 포함된다. CD80ΔC 돌연변이체가 CD80ΔC 돌연변이체를 코딩하는 유전자 물질의 투여에 의해 세포에 전달되는 실시양태에서, 막횡단 영역 및 세포질 꼬리부을 포함하는 CD80ΔC 돌연변이체가 면역 반응을 자극하는데 특히 효과적이라는 것을 발견하였다. 일부 실시양태에서는 CD80의 tm 및 CD80의 ct가 제공된다. 일부 실시양태에서는 CD86의 tm 및 CD86의 ct가 제공된다. 일부 실시양태에서는 CD80의 tm 및 CD86의 ct가 제공된다. 일부 실시양태에서는CD86의 tm 및 CD80의 ct가 제공된다. CD80ΔC 돌연변이체가 CD80ΔC 돌연변이체 단백질의 투여에 의해 세포에 전달되는 실시양태에서, CD80ΔC 돌연변이체 단백질은 막횡단 영역 및 세포질 꼬리부가 결실된(어떤 경우에는 가용성 잔기로 대체됨) 가용성 단백질로서 제공될 수 있다.

본 발명의 어떤 측면은 80V, 80tm 및 80ct를 포함하고, 80C가 없는 단리된 단백질에 관한 것이다. 여기서, 상기 단백질은 80V와 86V 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하며, 임의로 하나 이상의 80tm, 86tm, 80ct 및 86ct를 포함할 수 있다. 이때,

80V는 CD80의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

86V는 CD86의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

86C는 CD86의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

80tm은 CD80의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

86tm은 CD86의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

80ct는 CD80의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이며,

86ct는 CD86의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이다.

일부 실시양태에 따라, R¹-R²-R³-R⁴-R⁵-R⁶-R⁷-R⁸-R⁹(상기 식에서, R¹은 0-50개의 아미노산이고, R²는 80V 또는 86V이고, R³는 0-50개의 아미노산이고, R⁴는 86C 또는 0개의 아미노산이고, R⁵는 0-50개의 아미노산이고, R⁶는 80tm 또는 86tm이고, R⁷은0-50개의 아미노산이고, R⁸은 80ct 또는 86ct이며, R⁹은 0-50개의 아미노산임)의 화학식을 갖는 단백질이 제공된다.

일부 실시양태에서, R¹은 0-25개의 아미노산이고, R³는 0-25개의 아미노산이고, R⁵는 0-25개의 아미노산이고, R⁷은 0-25개의 아미노산이며(이거나), R⁹은 0-25개의 아미노산이다.

일부 실시양태에서, R¹은 0-10개의 아미노산이고, R³는 0-10개의 아미노산이고, R⁵는 0-10개의 아미노산이고, R⁷은 0-10개의 아미노산이며(이거나), R⁹은 0-10개의 아미노산이다.

일부 실시양태에서, CD80 돌연변이체는

80V/dele/80tm/80ct,

80V/dele/80tm/86ct,

80V/dele/86tm/80ct,

86V/dele/80tm/80ct,

86V/dele/80tm/86ct,

86V/dele/86tm/80ct,

80V/dele/86tm/86ct,

80V/86C/80tm/80ct,

80V/86C/80tm/86ct,

80V/86C/86tm/80ct,

86V/86C/80tm/80ct,

86V/86C/80tm/86ct,

86V/86C/86tm/80ct,

80V/86C/86tm/86ct,

80V/dele/80tm/dele,

80V/dele/86tm/dele,

86V/dele/80tm/dele,

80V/86C/80tm/dele,

80V/86C/86tm/dele,

86V/86C/80tm/dele,

86V/86C/dele/80ct,

80V/86C/dele/80ct,

80V/dele/dele/80ct,

86V/dele/dele/80ct,

80V/86C/dele/dele, 및

80V로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, CD80 돌연변이체는

R-80V-R-dele-R-80tm-R-80ct-R,

R-80V-R-dele-R-80tm-R-86ct-R,

R-80V-R-dele-R-86tm-R-80ct-R,

R-86V-R-dele-R-80tm-R-80ct-R,

R-86V-R-dele-R-80tm-R-86ct-R,

R-86V-R-dele-R-86tm-R-80ct-R,

R-80V-R-dele-R-86tm-R-86ct-R,

R-80V-R-86C-R-80tm-R-80ct-R,

R-80V-R-86C-R-80tm-R-86ct-R,

R-80V-R-86C-R-86tm-R-80ct-R,

R-86V-R-86C-R-80tm-R-80ct-R,

R-86V-R-86C-R-80tm-R-86ct-R,

R-86V-R-86C-R-86tm-R-80ct-R,

R-80V-R-86C-R-86tm-R-86ct-R,

R-80V-R-dele-R-80tm-R-dele-R,

R-80V-R-dele-R-86tm-R-dele-R,

R-86V-R-dele-R-80tm-R-dele-R,

R-80V-R-86C-R-80tm-R-dele-R,

R-80V-R-86C-R-86tm-R-dele-R,

R-86V-R-86C-R-80tm-R-dele-R,

R-86V-R-86C-R-dele-R-80ct-R,

R-80V-R-86C-R-dele-R-80ct-R,

R-80V-R-dele-R-dele-R-80ct-R,

R-86V-R-dele-R-dele-R-80ct-R,

R-80V-R-86C-R-dele-R-dele-R, 및

R-80V-R로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 가지며, 여기서,

80V는 CD80의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

86V는 CD86의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

86C는 CD86의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

80tm은 CD80의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

86tm은 CD86의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

80ct는 CD80의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이고,

86ct는 CD86의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이고,

dele는 0개의 아미노산이며,

R은 각각 독립적으로 0-100개의 아미노산이다.

일부 실시양태에서, R은 각각 독립적으로 0-50개의 아미노산이다.

일부 실시양태에서, R은 각각 독립적으로 0-30개의 아미노산이다.

일부 실시양태에서, R은 각각 독립적으로 0-20개의 아미노산이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, CD80 돌연변이체는

C 도메인이 결실된 CD80,

C 도메인이 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 CD80,

C 도메인이 결실되고 CD80의 세포질 꼬리부 영역이 CD86의 세포질 꼬리부 영역으로 치환된 CD80,

C 도메인이 결실되고 CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환된 CD80,

C 도메인이 결실되고 CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환되었으며 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 CD80,

C 도메인이 결실되고 CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환되었으며 CD80의 세포질 꼬리부 영역이 CD86의 세포질 꼬리부 영역으로 치환된 CD80,

C 도메인이 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환되었으며 CD80의 세포질 꼬리부 영역이 CD86의 세포질 꼬리부 영역으로 치환된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 CD80의 세포질 꼬리부 영역이 CD86의 세포질 꼬리부 영역으로 치환된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환되었으며 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환되었으며 CD80의 세포질 꼬리부 영역이 CD86의 세포질 꼬리부 영역으로 치환된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환되었으며 CD80의 세포질 꼬리부 영역이 CD86의 세포질 꼬리부 영역으로 치환된 CD80,

C 도메인 및 세포질 꼬리부 영역이 결실된 CD80,

C 도메인 및 세포질 꼬리부 영역이 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 CD80,

C 도메인 및 세포질 꼬리부 영역이 결실되고 CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 세포질 꼬리부 영역이 결실된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 세포질 꼬리부 영역이 결실되었으며 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 CD80,

CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환되고 CD80의 C 도메인이 CD86의C 도메인으로 치환되었으며 세포질 꼬리부 영역이 결실된 CD80,

CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환되고 CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되었으며 막횡단 영역이 결실된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 막횡단 영역이 결실된 CD80,

C 도메인 및 막횡단 영역이 결실된 CD80,

C 도메인이 결실되고 CD80의 V 도메인이 CD86의 V 도메인으로 치환되었으며 막횡단 영역이 결실된 CD80,

CD80의 C 도메인이 CD86의 C 도메인으로 치환되고 막횡단 영역 및 세포질 꼬리부 영역이 결실된 CD80,

C 도메인, 막횡단 영역 및 세포질 꼬리부 영역이 결실된 CD80, 및

CD80의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편

으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

CD80ΔC 돌연변이체의 단백질 형태가 백신의 성분으로서 제형화되거나, 또는 CD80ΔC 돌연변이체를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 유전자 작제물이 백신의 성분으로서 제공될 수 있다. 각각의 경우에 그러한 백신은 예방적 또는 치료적 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 바람직한 실시양태에 따라, 면역원 및 CD80ΔC 돌연변이체를 코딩하는 코딩 서열이 포함된 DNA 분자를 함유하는 DNA 백신이 제공된다. 본 발명은 DNA 백신의 핵산 서열에 의해 코딩되는 항원 표적의 생산 이외에, CD80ΔC 돌연변이체 단백질의 동시 생산을 위한 유전자 물질을 포함한다는 점에서 개선된 것이다.

본 발명은 유전자 물질에 의해 코딩되는 단백질 및 펩티드에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개체의 세포에 상기 유전자 물질을 도입하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 핵산 분자를 포함하거나, 또는 하나는 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자이고 다른 하나는 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자인 2개의 핵산 분자를 포함하는 조성물으로 상기 개체의 조직에 투여하는 단계를 포함한다. 이 핵산 분자(들)은 플라스미드 DNA, 재조합 벡터의 핵산 분자 또는 독성약화 백신에 제공된 유전자 물질의 일부로서 제공될 수 있다.

본 발명에 따라, 예방 및(또는) 치료를 위해 병원성이거나 비정상적인 질병-관련 세포에 대해 개체를 면역화시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 표적 단백질, 즉 병원체 또는 치료될 세포에 존재하는 면역원성 단백질과 공통의 에피토프를 하나 이상 함유한 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 물질과, CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 유전자 물질을 포함한다. 유전자 물질은 개체의 세포에 의해 발현되고, 발현된 물질은 면역 반응을 유도하는 면역원성 표적으로서 작용한다. 결과적으로 병원체 또는 치료될 세포와 면역 반응이 일어나며, 면역 반응을 더 폭넓은 데, 즉 체액성 면역 반응 이외에도 세포성 면역 반응이라는 무기를 이끌어낸다. 본 발명의 방법은 예방적 및 치료적 면역성을 부여하는데 유용하다. 따라서,면역화 방법은 개체를 병원체 감염으로부터 보호하거나 특정 세포의 발생이나 증식을 억제하는 방법 뿐만 아니라, 병원체 감염, 과다증식성 질환 또는 자가면역성 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 포함한다.

본원에 사용되는 "표적 단백질" 및 "면역원"이라는 용어는 상호 교환환가능하게 사용되며, 면역 반응에 대한 단백질 표적으로서 작용하는 유전자 작제물에 의해 코딩되는 펩티드 및 단백질을 의미한다. 표적 단백질은 면역반응을 유도할 수 있는 단백질이다. 표적 단백질은 면역화가 필요한 병원체, 바람직하지 못한 세포형(예를 들어, 암세포) 또는 자가면역성 질환과 관련된 세포로부터의 단백질과 하나 이상의 에피토프를 공유하는 면역원성 단백질이다. 표적 단백질에 대해 유도된 면역 반응은 표적 단백질이 관련된 특정 감염 또는 질병으로부터 개체를 보호하고 치료할 것이다. 표적 단백질이 면역 반응을 필요로 하는 단백질과 동일할 필요는 없다. 오히려, 표적 단백질은 면역 반응을 필요로 하는 단백질과 교차반응하는 면역 반응을 유도할 수 있어야 한다.

본 발명은 표적 단백질, 즉 병원체나 개체 자신의 "비정상" 세포와 특이적으로 관련된 단백질에 대한 넓은 범위의 면역 반응을 유도하는데 유용하다. 본 발명은 병원성 물질에 대해 개체를 면역화시키고, 병원체 단백질에 대한 면역 반응이 병원체에 대한 보호적 면역성을 제공하는 생물체를 면역화시키는데 유용하다. 본 발명은 과다증식성 세포와 특이적으로 관련된 표적 단백질에 대해 면역 반응을 유도함으로써 암과 같은 과다증식성 질환 및 장애를 치료하는데 유용하다. 본 발명은 자가면역성 증상을 수반하는 세포와 특이적으로 관련된 표적 단백질에 대해 면역 반응을 유도함으로써 자가면역성 질환 및 장애를 치료하는데 유용하다.

본 발명에 따라, 표적 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA가 개체 조직의 세포에 도입되고, 여기서 상기 DNA 또는 RNA가 발현되어 표적 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 생산하게 된다. 표적 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열 각각은 개체의 세포에서 발현을 위해 필요한 조절 성분에 연결되어 있다. DNA 발현을 위한 조절 성분에는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 또한, 코작(Kozak) 영역과 같은 다른 성분이 유전자 작제물에 포함될 수 있다. 바람직한 실시양태에는 표적 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질이 개체의 세포에서 발현을 위해 필요한 조절 성분에 연결되어 별도의 발현가능한 형태로 제공되는, 표적 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 그러나, 본 발명은 부가적으로 표적 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질이 단일 유전자 작제물로서 제공되는 실시양태에 관한 것이다. 그러한 일부 실시양태에서, 발현가능한 단일 형태에 의해 생산되는 폴리단백질(polyprotein)은 별개의 단백질 2개로 가공되거나, 또는 표적 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 두가지 모두로 작용하는 키메라 단백질로서 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2 복제본 이상의 표적 단백질 및(또는) 2 복제본 이상의 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 발현가능한 단일 형태의 유전자 작제물로 제공될 수 있다. 여기서 코딩된 폴리단백질은 발현 후에 서브유닛으로 가공되거나 기능적 폴리단백질로서 유지될 수 있다.

본원에 사용되는 "발현가능한 형태"라는 용어는 표적 단백질 및(또는) CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 필수 조절 성분을 함유함으로써, 개체의 세포에 존재하는 경우에 코딩서열이 발현되도록 하는 유전자 작제물을 지칭한다.

본원에 사용되는 "에피토프를 공유하는"이란 용어는 다른 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단백질을 지칭한다.

본원에 사용되는 "실질적으로 유사한 에피트프"라는 용어는 어떤 단백질의 에피토프와 동일하지는 않지만 상기 단백질과 교차반응하는 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도하는 구조를 가진 에피토프를 의미한다.

유전자 작제물은 유전자 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된, 표적 단백질 및(또는) CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에 따라, 하나는 표적 단백질을 코딩하는 발현가능한 형태의 뉴클레오티드 서열이고 다른 하나는 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 발현가능한 형태의 뉴클레오티드 서열인 2가지 유전자 작제물의 조합이 제공된다. 유전자 작제물의 조합을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 살아있는 세포에 혼입시키면, 상기 DNA 또는 RNA가 발현되어 표적 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질이 생산된다. 그 결과, 놀랍게도 표적 단백질에 대한 면역 반응이 증가되었다.

본 발명은 바이러스, 원핵생물 또는 병원성 진핵생물체(예를 들어, 병원성 단세포 생물체 및 다세포 기생충)와 같은 모든 병원체에 대해 개체를 면역화시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 바이러스, 및 임질균, 리스테리아균(listeria) 및이질균과 같이 세포를 감염시키며 외피로 싸여있지 않는 병원체에 대해 개체를 면역화시키는데 특히 유용하다. 또한, 본 발명은 생활사 중에 세포내 병원체인 단계를 포함하는 원생동물성 병원체에 대해 개체를 면역화시키는데 유용하다. 본원에 사용되는 "세포내 병원체"란 용어는 생식 주기 또는 생활사의 적어도 일부분 동안에 숙주 세포 내에 존재하면서 병원성 단백질을 생산하거나 그 생산을 유발하는 바이러스 또는 병원성 생물체를 의미한다. 표 1은 본 발명에 따라 백신을 만들 수 있는 바이러스에 대한 과 및 속의 일부 목록을 기재한 것이다. 표 1에 기재된 항원들과 같은 병원체 항원에 나타나는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 하나 이상의 에피토프가 포함된 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 작제물은 백신으로서 유용하다. 또한, 본 발명은 원핵 및 진핵 원생동물성 병원체 뿐만 아니라 표 2에 기재된 바와 같은 다세포 병원체를 비롯한 다른 병원체에 대해 개체를 면역화시키는데 유용하다.

병원체 감염에 대해 보호하는 유전자 백신을 제조하기 위해, 보호성 면역 반응이 유도되는 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자 물질은 표적에 대한 코딩 서열로서의 유전자 작제물을 포함해야 한다. 병원체가 세포내에서 감염(본 발명이 특히 유용함)되든지 세포외에서 감염되든지, 모든 병원체 항원은 보호성 반응을 유도할 것이다. DNA 및 RNA는 비교적 크기가 작고 비교적 용이하게 제조할 수 있기 때문에, 본 발명은 여러가지 병원체 항원에 대해 백신접종할 수 있는 부가적인 이점을 제공한다. 유전자 백신에 사용되는 유전자 작제물은 많은 병원체 항원을 코딩하는 유전자 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 여러가지 바이러스 유전자가 단일 작제물에 포함되어 여러가지 표적을 제공할 수 있다.

표 1 및 2에는 몇몇 병원체 물질 및 병원성 생물체의 목록이 포함되어 있으며, 유전자 백신은 이들에 의한 감염으로부터 개체를 보호하도록 제조될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 병원체에 대해 개체를 면역화시키는 방법은 HIV, HTLV 또는 HBV에 대항하는 방법이다.

본 발명의 또다른 측면은 과다증식성 질환의 특징인 과다증식성 세포에 대해 넓은 범위의 보호성 면역 반응을 부여하는 방법, 및 과다증식성 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 사용되는 "과다증식성 질환"이란 용어는 세포가 과다증식하는 특징이 있는 질병 및 장애를 의미한다. 과다증식성 질환의 예로는 모든 형태의 암 및 건선이 포함된다.

면역원성 "과다증식 세포"-관련 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 개체의 세포에 도입한 결과, 개체의 백신접종된 세포에서 상기 단백질이 생산됨을 알아냈다. 본원에 사용되는 "과다증식성-관련 단백질"이란 용어는 과다증식성 질환과 관련된 단백질을 의미한다. 과다증식성 질환에 대해 면역화시키기 위해, 과다증식성 질환과 관련된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 개체에 투여한다.

과다증식성-관련 단백질이 면역원성 표적에 효과적이도록 하기 위해서는 단백질이 과다증식성 세포에서만 발현되거나, 또는 정상 세포에 비해 과다증식성 세포에서 높은 수준으로 발현되어야 한다. 표적 항원에는 그러한 단백질, 및 그러한 단백질에서 발견되는 에피토프를 하나 이상 포함하는 그의 단편 및 펩티드가 포함된다. 일부 경우에는 과다증식성-관련 단백질이 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의해 생성된 산물이다. 돌연변이된 유전자는 정상 단백질에서 발견되지 않는 상이한 에피토프가 생성되게 하는 약간 다른 아미노산 서열을 갖는 것을 제외하고, 정상 단백질과 거의 동일한 단백질을 코딩한다. 그러한 표적 단백질에는myb,myc및fyn과 같은 종양유전자(oncogene),bcr/abl,ras,src, P53,neu,trk및 EGRF와 같은 전이(translocation) 유전자에 의해 코딩되는 단백질들이 포함된다. 항암 치료 및 보호성 요법을 위한 표적 단백질에는 표적 항원으로서의 종양유전자 산물 이외에, B 세포 림프종에 의해 만들어진 항체의 가변 영역과 T 세포 림프종에 의해 만들어진 T 세포 수용체의 가변 영역이 포함되며, 일부 실시양태에서는 자가면역성 질환에 대한 표적 항원을 이용한다. 모노클로날 항체 17-1A에 의해 인식되는 단백질 및 폴레이트 결합 단백질을 비롯하여 종양 세포에서 높은 수준으로 발견되는 단백질과 같은 기타 종양-관련 단백질이 표적 단백질로서 사용될 수도 있다.

본 발명은 여러가지 형태의 암 중 하나 이상에 대해 개체를 면역화시키는데 사용되는 한편, 본 발명은 특정 암이 발병하기 쉬운 개체 또는 이미 암에 걸린 경험이 있어서 재발하기 쉬운 개체를 예방 차원에서 면역화시키는데 특히 유용하다. 유전학 및 기술의 발전 뿐만 아니라 전염병학의 발전으로 인해 개체에서 암의 발생에 대한 확률을 측정하고 위험을 평가할 수 있게 되었다. 유전자 스크리닝 및(또는) 가족의 병력(病歷)을 이용하면, 여러가지 유형의 암 중에서 어느 하나가 특정 개체에서 발생할 확률을 예측할 수 있다.

이와 유사하게, 이미 암에 걸린 개체, 암을 제거하는 치료를 받은 개체 및암 치료로 증상이 완화된 개체는 특히 재발할 가능성이 높다. 치료 요법의 일부로서, 암에 걸린 것으로 진단받은 개체는 재발에 대항할 수 있도록 암에 대해 면역화될 수 있다. 따라서, 특정 개체가 어떤 유형의 암에 걸린 경험이 있고 재발할 위험이 있다고 알려지면, 앞으로 발생할 수 있는 어떤 암에도 대항할 수 있도록 면역계를 준비하기 위해 면역화될 수 있다.

본 발명은 과다증식성 질환에 걸린 개체의 치료 방법을 제공한다. 그러한 방법에서, 유전자 작제물의 도입은 면역치료제로서 작용하여 개체의 면역계를 유도 및 증진시킴으로써 표적 단백질을 생산하는 과다증식성 세포에 대항하게 된다.

본 발명은 세포 수용체 및 "자가"-유도 항체를 생산하는 세포를 비롯한 자가면역성과 관련된 표적에 대항하도록 넓은 범위의 보호성 면역 반응을 부여함으로써 자가면역성 질환 및 장애에 걸린 개체의 치료 방법을 제공한다.

T 세포 매개의 자가면역성 질환에는 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌(Sjogren's) 증후군, 사르코이도시스(sarcoidosis), 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 경직성 척추염, 피부경화증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 베게너(Wegener's) 육아종, 크론(Crohn's)병 및 궤양성 대장염이 포함된다. 각각의 이들 질환은 T 세포 수용체가 내생성 항원에 결합하여 자가면역성 질환과 관련된 일련의 염증성 반응을 개시하게 한다는 특징이 있다. T 세포의 가변 영역에 대한 백신접종은, CTL에 의해 상기 T 세포가 제거되는 것을 포함하는 면역 반응을 유도할 것이다.

RA의 경우, 질병과 관련된 T 세포 수용체(TCR)의 여러 가변 영역이 특성화되었다. 이들 TCR에는 Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 및 Vα-17이 포함된다. 따라서, 상기 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 DNA 작제물로 백신접종을 하면 RA와 관련된 T 세포를 표적으로 하는 면역 반응이 유도될 것이다. 이는 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Howell, M. D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253: 325-329; Williams, W. V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90: 326-333]을 참조할 수 있다.

MS의 경우, 질병과 관련된 T 세포 수용체(TCR)의 여러 가변 영역이 특성화되었다. 이들 TCR에는 Vβ-7 및 Vα-10이 포함된다. 따라서, 상기 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 DNA 작제물로 백신접종을 하면 MS와 관련된 T 세포를 표적으로 하는 면역 반응이 유도될 것이다. 이는 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Wucherpfennig, K. W., et al., 1990 Science 248: 1016-1019; Oksenberg, J. R., et al., 1990 Nature 345: 344-346]을 참조할 수 있다.

피부경화증의 경우, 질병과 관련된 T 세포 수용체(TCR)의 여러 가변 영역이 특성화되었다. 이들 TCR에는 Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 및 Vα-12가 포함된다. 따라서, 상기 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 DNA 작제물로 백신접종을 하면 피부경화증과 관련된 T 세포를 표적으로 하는 면역 반응이 유도될 것이다.

T 세포 매개의 자가면역성 질환에 걸린 환자를 치료하기 위해, 특히 TCR의 가변 영역이 아직 특성화되지 않은 환자를 치료하기 위해서는 활액 생체검사법을 수행할 수 있다. 존재하는 T 세포 샘플을 취하여, 표준 기술을 이용하여 상기 TCR의 가변 영역을 확인한다. 이 정보를 이용하여 유전자 백신을 제조할 수 있다.

B 세포 매개의 자가면역성 질환에는 루푸스(Lupus, SLE), 그레이브(Grave's)병, 중증 근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판결핍증, 천식, 한랭글로불린혈증, 원발성 담즙성 경화증 및 악성 빈혈이 포함된다. 각각의 이들 질환은 항체가 내생성 항원에 결합하여 자가면역성 질환과 관련된 일련의 염증성 반응을 개시하게 한다는 특징이 있다. 항체의 가변 영역에 대한 백신접종은, 항체를 생산하는 B 세포가 CTL에 의해 제거되는 것을 포함하는 면역 반응을 유도할 것이다.

B 세포 매개의 자가면역성 질환에 걸린 환자를 치료하기 위해서는 자가면역 활성과 관련된 항체의 가변 영역을 확인해야 한다. 생체검사법을 수행하여 염증 부위에 존재하는 항체의 샘플을 취할 수 있다. 상기 항체의 가변 영역은 표준 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 이 정보를 이용하여 유전자 백신을 제조할 수 있다.

SLE의 경우, 어떤 항원은 DNA일 것으로 생각된다. 따라서, SLE에 대해 면역화될 환자에서는, 환자의 혈청을 항-DNA 항체에 대해 스크리닝하여 혈청에서 발견되는 상기 항-DNA 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 작제물을 포함하는 백신을 제조할 수 있다.

TCR 및 항체 모두의 가변 영역 사이의 공통적인 구조적 특징은 잘 알려져 있다. 특정 TCR 또는 항체를 코딩하는 DNA 서열은, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Kabat, et al. 1987 Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD]에 기재된 바와 같은 잘 공지된 방법에 따라 통상적으로 찾아낸다. 또한, 항체로부터 기능적 가변 영역을 클로닝하는 방법은, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Chaudhary, V. K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명은 개체의 세포에 DNA 백신, 독성약화 생백신 및 재조합 백신을 비롯한 백신 조성물의 일부로서 유전자 작제물을 전달하는 단계를 포함하는, 개체를 면역화시키는 개선된 방법을 제공한다. 유전자 작제물은 백신접종자에서 발현을 담당하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 개선된 백신은 세포성 면역 반응을 증가시킨다.

면역화시키는 일부 방법에서, 면역원을 코딩하는 유전자 작제물과 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 유전자 작제물을 개체에 투여한다. 면역화시키는 일부 방법에서, 면역원과 CD80ΔC 돌연변이체 단백질 모두를 코딩하는 유전자 작제물을 개체에 투여한다. 일부 다른 면역화 방법에서, 면역원과 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 개체에 투여한다. 일부 다른 면역화 방법에서, 면역원 단백질과 CD80ΔC 돌연변이체를 코딩하는 유전자 작제물을 투여한다. 일부 다른 면역화 방법에서, 면역원을 코딩하는 유전자 작제물과 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 투여한다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, 자가면역성 질환 및 이식 거부와 관련된 면역 반응을 억제하기 위한 CD80의 C 영역 단백질이 제공된다. CD80의 C 영역 단백질은 CD80의 기능적 C 영역을 포함한다. CD80 C 영역의 기능적 단편은 통상적으로확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD80 C 영역의 기능적 단편은 60개 미만의 아미노산으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD80 C 영역의 기능적 단편은 50개 미만의 아미노산으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD80 C 영역의 기능적 단편은 40개 미만의 아미노산으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD80 C 영역의 기능적 단편은 30개 미만의 아미노산으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD80 C 영역의 기능적 단편은 20개 미만의 아미노산으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD80 C 영역의 기능적 단편은 15개 미만의 아미노산으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD80 C 영역의 기능적 단편은 10개 미만의 아미노산으로 이루어진다.

일부 실시양태에서는 V 영역이 결실된다. 일부 실시양태에서는 CD80 또는 CD86의 V 영역이 존재한다. 일부 실시양태에서는 CD80의 막횡단 영역이 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD86의 막횡단 영역이 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD80의 막횡단 도메인이 결실되어 어떠한 다른 서열로도 치환되지 않는다. 일부 실시양태에서는 비-CD80이며 비-CD86인 서열이 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD80tm 대신에 비-CD80이며 비-CD86인 서열이 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD80의 세포질 꼬리부가 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD86의 세포질 꼬리부가 포함된다. 일부 실시양태에서는 CD80의 세포질 꼬리부가 결실되어 어떠한 다른 서열로도 치환되지 않는다. 일부 실시양태에서는 CD80ct 대신에 비-CD80이며 비-CD86인 서열이 포함된다.

일부 실시양태에 따라, 비-CD80 단백질은 적어도 CD80의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 본원에 사용되는 "비-CD80 단백질"이란 용어는 야생형CD80과는 다르지만 CD80의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 단백질을 의미한다. 일부 실시양태에서, 비-CD80 단백질은 R¹-R²-R³-R⁴-R⁵-R⁶-R⁷-R⁸-R⁹(상기 식에서, R¹은 0-50개의 아미노산이고, R²는 80V 또는 86V이고, R³는 0-50개의 아미노산이고, R⁴는 80C이고, R⁵는 0-50개의 아미노산이고, R⁶는 80tm 또는 86tm이고, R⁷은 0-50개의 아미노산이고, R⁸은 80ct 또는 86ct이며, R⁹은 0-50개의 아미노산이고, 여기서 80V는 CD80의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고, 86V는 CD86의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고, 80C는 CD80의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편이고, 80tm은 CD80의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고, 86tm은 CD86의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고, 80ct는 CD80의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이며, 86ct는 CD86의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편임)의 화학식을 갖는 단백질이다.

본 발명의 일부 실시양태에 따라, 적어도 CD80의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 단리된 비-CD80 단백질은

R-dele-R-80C-R-80tm-R-80ct-R,

R-dele-R-80C-R-80tm-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-80tm-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-dele-R-dele-R,

R-86V-R-80C-R-80tm-R-80ct-R,

R-86V-R-80C-R-80tm-R-dele-R,

R-86V-R-80C-R-dele-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-86tm-R-80ct-R,

R-dele-R-80C-R-86tm-R-80ct-R,

R-dele-R-80C-R-86tm-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-86tm-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-80tm-R-86ct-R,

R-dele-R-80C-R-80tm-R-86ct-R,

R-86V-R-80C-R-86tm-R-80ct-R,

R-86V-R-80C-R-80tm-R-86ct-R,

R-86V-R-80C-R-86tm-R-dele-R,

R-dele-R-80C-R-86tm-R-86ct-R, 및

R-86V-R-80C-R-86tm-R-86ct로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 가지며, 여기서

80V는 CD80의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

86V는 CD86의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

80C는 CD80의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

80tm은 CD80의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

86tm은 CD86의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

80ct는 CD80의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이고,

86ct는 CD86의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이고,

dele는 0개의 아미노산이며,

R은 각각 독립적으로 0-100개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서는 R이 각각 독립적으로 0-50개의 아미노산이고, 일부 실시양태에서는 R이 각각 독립적으로 0-30개의 아미노산이며, 일부 실시양태에서는 R이 각각 독립적으로 0-20개의 아미노산이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 비-CD80 단백질은

가변 도메인이 결실된 돌연변이체 CD80,

가변 도메인 및 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

막횡단 영역 및 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 막횡단 영역 및 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 영역이 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

가변 영역 및 세포질 꼬리부가 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

세포질 꼬리부가 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80,

가변 영역이 결실되고 CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환되었으며 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

가변 도메인이 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환되었으며 CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80, 및

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환되었으며 CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80

으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

CD80의 C 영역 단백질은 단백질로서 또는 CD80의 C 영역을 코딩하는 유전자 작제물로서 제공된다. 야생형 CD80, dele/80C/80tm/80ct, dele/80C/80tm/86ct, dele/80C/86tm/80ct 또는 dele/80C/86tm/86ct를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 유전자 작제물을 전달하면, 면역 억제 및 자가면역성 질환의 치료에 특히 효과적인 결과를 초래한다.

본 발명에 있어서, 이러한 측면의 방법은 자가면역성 질환 및 장애의 치료에 유용하다. 당업자라면 자가면역성 질환 또는 장애를 가진 개체를 판별할 수 있을 것이다. 자가면역성 질환 및 장애에는 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 사르코이도시스, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 경직성 척추염, 피부경화증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 베게너 육아종, 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 T 세포 매개의 자가면역성 질환, 및 루푸스(SLE), 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판결핍증, 천식, 한랭글로불린혈증, 원발성 담즙성 경화증 및 악성 빈혈과 같은 B 세포 매개의 자가면역성 질환이 포함된다.

또한, 본 발명의 방법은 골수 및 뇌세포 이식과 같은 세포 이식; 각막 및 피부 이식과 근형성술(myoplasty)과 같은 조직 이식; 및 간, 폐, 신장 및 심장 이식과 같은 기관 이식을 비롯한 이식 절차를 수행중인 개체에서 면역 반응을 억제시키는데 유용하다.

본 발명의 조성물을 제조하고 전달하는 방법은 면역화 프로토콜 및 비-면역원성 치료 프로토콜과 통상적으로 동일하다.

본원에 사용되는 "단백질"이란 용어는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 비롯한 단백질성 분자를 포함하는 의미이다. 본 발명의 일부 실시양태는 핵산(특히, DNA)의 투여를 통한 단백질의 전달, 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 면역화시키는 일부 방법에서, 면역원성 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 핵산이 개체에 투여된다. 이와 유사하게, 면역 억제에 의해 자가면역성 질환을 치료하고 이식편/이식체 거부를 방지하는 일부 방법에서는 CD80의 C 영역 단백질을 코딩하는 핵산이 개체에 투여된다. 본원에 사용되는 "본 발명의 유전자 작제물"이란 용어는 면역원성 단백질, CD80ΔC 돌연변이체 단백질 및 CD80의 C 영역 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하며, 유사한 수단에 의해 생산되고 본 발명의 방법에서 유사한 방식으로 제형화 및 투여될 수 있는 유전자 작제물을 의미한다.

DNA 백신에 대해서는 미국 특허 제5,593,972호, 미국 특허 제5,589,466호, PCT/US90/01515호, PCT/US93/02338호, PCT/US93/048131호 및 PCT/US94/00899호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함된다. 상기 출원에 기재된 전달 프로토콜 이외에, DNA를 전달하는 다른 방법이 미국 특허 제4,945,050호 및 동 제5,036,006호에 기재되어 있으며, 이 문헌들도 이 거명을 통해 본 명세서에 포함된다. DNA 백신 프로토콜은 개체를 면역화시키는데 유용하다. 이 교시 내용은 본 발명에서 CD80의 C 영역 단백질을 코딩하는 유전자 작제물을 이용하여 자가면역성 질환 및 이식 거부를 치료하는 측면에도 적용할 수 있다. 그러한 실시양태에서는 면역원을 코딩하는 코딩 서열이 제공되지 않는다.

본 발명의 유전자 작제물은 세포에 투여된 후에 염색체 외의 기능성 분자로서 남아있고(거나) 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. DNA는 플라스미드의 형태로 별도의 유전자 물질로서 남아있게 되는 세포에 도입될 수 있다. 별법으로, 염색체에 통합될 수 있는 선형 DNA가 세포에 도입될 수도 있다. DNA를 세포에 도입할 때, 염색체로의 DNA 통합을 촉진하는 시약을 가할 수 있다. 또한, 도입될 DNA에 통합을 촉진하는데 유용한 DNA 서열이 포함될 수도 있다. 별법으로, RNA를 세포에 도입할 수 있다. 또한, 동원체(centromere), 말단 소립(telomere) 및 복제 개시점을 포함하는 선형의 소형 염색체(minichromosome)로서 본 발명의 유전자 작제물을 제공할 수도 있다.

본 발명의 유전자 작제물은 핵산 분자의 유전자 발현에 필수적인 조절 성분을 포함한다. 이 조절 성분에는 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈, 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 또한, 본 발명의 단백질을 코딩하는 서열의 유전자 발현에 인핸서(enhancer)가 필요한 경우도 있다. 이 조절 성분은 원하는 단백질을 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결되어야 하며, 이들이 투여되는 개체에서 작동할 수 있어야 한다.

개시 코돈 및 정지 코돈은 통상적으로 원하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분일 것으로 생각된다. 그러나, 이들 성분은 유전자 작제물이 투여되는 개체에서 기능할 수 있어야 한다. 개시 및 종결 코돈은 코딩 서열과 프레임이 맞아야 한다.

사용되는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호는 개체의 세포에서 기능할 수 있어야 한다.

본 발명을 수행하는데, 특히 인간을 위한 유전자 백신을 제조하는데 유용한 프로모터의 예로는 원숭이 바이러스 40(Simian Virus 40, SV40)으로부터의 프로모터, 생쥐 유방암 바이러스(Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)의 장쇄 말단 반복서열(Long Terminal Repeat, LTR)프로모터와 같은 HIV의 프로모터, 몰로니 바이러스(Moloney virus) 프로모터, ALV 프로모터, 거대세포 바이러스(Cytomegalovirus, CMV)의 초기 프로모터와 같은 CMV 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV) 프로모터, 라우스 육종바이러스(Rous Sarcoma Virus, RSV) 프로모터 뿐만 아니라, 인간 액틴(Actin), 인간 미오신(Myosin), 인간 헤모글로빈(Hemoglobin), 인간 근육 크레아틴(creatine) 및 인간 메탈로티오네인(metalothionein)과 같은 인간의 유전자로부터의 프로모터가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명을 수행하는데, 특히 인간을 위한 유전자 백신을 제조하는데 유용한 폴리아데닐화 신호의 예로는 인간 및 소의 생장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히, pCEP4 플라스미드(Invitrogen, San Diego, CA)에 존재하는 SV40 폴리아데닐화 신호가 본 발명에 사용된다.

DNA 발현에 필요한 조절 성분 이외에, 다른 성분들도 DNA 분자에 포함될 수 있다. 그러한 부가 성분에는 인핸서가 포함된다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈 및 인간 근육 크레아틴의 인핸서, 및 CMV, RSV 및 EBV의 인핸서와 같은 바이러스 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 유전자 작제물은, 이 작제물을 염색체 외의 상태로 유지하면서 세포에서 다수의 복제본을 생성하도록 하는 포유동물의 복제 개시점을 포함할 수 있다. 인비트로젠사(San Diego, CA)에서 시판하는 플라스미드인 pCEP4 및 pREP4는 엡스타인 바 바이러스의 복제 개시점 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함함으로써, 염색체에 통합되지 않고 다수의 에피좀(episome) 복제본을 생성한다.

면역화의 적용에 관한 일부 바람직한 실시양태에서는, 표적 단백질, CD80ΔC 돌연변이체 단백질 및, 임의로 표적 단백질에 대한 면역 반응을 더 증가시키는 단백질의 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자(들)이 전달된다. 그러한 유전자의 예로는 α-인터페론, γ-인터페론, 혈소판 유래의 생장 인자(PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 상피 생장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12와 같은 싸이토카인(cytokine) 및 림포카인을 코딩하는 것들이 있다.

단백질 생산을 최대로 하기 위해, 작제물이 투여된 세포에서의 유전자 발현에 매우 적합한 조절 서열을 선택할 수 있다. 더욱이, 세포에서 가장 효율적으로 전사되는 코돈을 선택할 수도 있다. 당업자라면 세포에서 기능할 수 있는 DNA 작제물을 제조할 수 있을 것이다.

면역화 방법이든지 면역 억제 방법이든지 무관하게, 본 발명의 방법은 개체의 조직에 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서,핵산 분자는 근육내 투여, 비강내 투여, 복강내 투여, 피하 투여, 경피내 투여, 정맥내 투여, 폐 조직으로의 에어로졸 투여, 및 질, 직장, 요도, 구강 및 설하로 이루어진 군으로부터 선택되는 점막 조직으로의 국소 투여 또는 세척에 의한 투여로 투여될 수 있다.

본 발명의 한 측면은 본 발명의 방법에 유용한 제약 조성물에 관한 것이다. 제약 조성물은 핵산 분자, 바람직하게는 개체의 세포에서 발현을 위해 필수적인 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다. 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 더 포함한다. "제약상"이란 용어는 당업자에게 잘 공지되고 널리 이해되는 것이다. 본원에 사용되는 "제약 조성물" 및 "주사 가능한 제약 조성물"이란 용어는 당업자에 의해 이해되는 통상적인 의미를 갖는다. 제약 조성물은 멸균성, 발열원, 입자 물질 뿐만 아니라 등장성과 pH에 관한 특정 표준을 만족시켜야 한다. 예를 들면, 주사 가능한 제약은 멸균되고 발열원이 없어야 한다.

본 발명의 제약 조성물은 약 1 ng 내지 약 10,000 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 2000 ㎍, 3000 ㎍, 4000 ㎍ 또는 5000 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1000 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 10 ng 내지 약 800 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 0.1 내지 약 500 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1 내지 약 350 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 25 내지 약 250 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 100 ㎍의 DNA를 함유한다.

본 발명의 유전자 작제물을 포함하는 본 발명의 제약 조성물은 사용될 투여 방식에 따라 그에 맞게 제형화될 수 있다. 당업자라면 유전자 작제물을 포함하는 백신 또는 비-면역원성 치료제를 쉽게 제형화할 수 있을 것이다. 투여 방식으로 근육내 주사가 선택된 경우, 등장성 제형을 사용하는 것이 바람직하다. 통상, 등장성을 위한 첨가제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스가 포함된다. 일부의 경우에는 인산염 완충 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제로는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 일부 실시양태에서는 혈관 수축제가 제형에 가해진다. 본 발명의 제약 제형은 멸균되고 발열원이 없어야 한다. 본 발명의 제약 조성물은 핵산 분자와 배합된 전달 성분을 포함하며, 식염수와 같이 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 더 포함한다. 핵산을 성공적으로 전달해 주는 임의의 매체를 사용할 수 있다. 당업자라면 본 발명에 사용될 수 있는 제약상 허용되는 다수의 매체를 쉽게 이해할 것이다. 제약상 허용되는 적합한 담체는, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 당업계의 표준 교과서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 핵산 분자는 촉진제와 함께 세포에 전달된다. 촉진제는 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서 또는 유전자 백신 촉진제라고도 불리운다. 촉진제는 1998년 11월 3일자로 허여된 미국 특허 제5,830,876호, 1997년 1월 14일자로 허여된 미국 특허 제5,593,972호, 및 1994년 1월 26일자로 출원된 국제 특허 출원제PCT/US94/00899호(1997년 11월 29일자로 출원된 미국 출원 제08/979,385호)에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함된다. 또한, 촉진제는 1998년 4월 14일자로 허여된 미국 특허 제5,739,118호, 1998년 11월 17일자로 허여된 미국 특허 제5,837,533호, 1995년 9월 28일자로 출원된 PCT/US95/12502호 및 1995년 3월 30일자로 출원된 PCT/US95/04071호에 기재되어 있으며, 이들 문헌도 이 거명을 통해 본 명세서에 포함된다. 핵산 분자와 함께 투여되는 촉진제는 핵산 분자와의 혼합물로 투여되거나, 또는 핵산 분자의 투여 전 또는 후에 별도로 투여될 수 있다. 또한, 형질감염 보조제 및(또는) 복제 보조제 및(또는) 소염제로서 작용할 수 있으며, 촉진제와 함께 동시 투여되거나 촉진제 없이 투여될 수 있는 다른 면역보강제로는 생장 인자, 그리고 α-인터페론, γ-인터페론, 혈소판 유래의 생장 인자(PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 상피 생장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 및 B7.2와 같은 싸이토카인 및 림포카인 뿐만 아니라, 섬유아세포 생장 인자, 면역 자극 복합체(ISCOMS)와 같은 표면 활성제, 프로인트(Freund) 불완전 면역보강제, 모노포스포릴 리피드 A(monophoshoryl Lipid A, MPL)를 비롯한 LPS 유사체, 뮤라밀 펩티드, 스쿠알렌과 같은 퀴논 유사체 및 소낭(vesicle), 및 히알루론산이 포함된다. 면역화 방법에 관한 실시양태에서는, 면역 반응을 바람직하게 증가시키는 면역보강제를 선택한다. 면역 억제 방법에 관한 실시양태에서, 면역 반응을 증가시키지 않는 면역보강제를 선택할 수 있다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자 작제물은 벤조산 에스테르, 아닐리드, 아미딘, 우레탄 및 이들의 염산염(국소 마취제)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 촉진제와 함께 제형화되거나 투여된다.

일부 바람직한 실시양태에서, 촉진제는 Ar-R¹-O-R²-R³, Ar-N-R¹-R²-R³, R⁴-N-R⁵-R⁶또는 R⁴-O-R¹-R⁷의 화학식을 갖는 화합물일 수 있다.

상기 식에서,

Ar은 벤젠, p-아미노벤젠, m-아미노벤젠, o-아미노벤젠, 치환된 벤젠, 치환된 p-아미노벤젠, 치환된 m-아미노벤젠 또는 치환된 o-아미노벤젠이며, 여기서 아미노 벤젠 화합물의 아미노기는 아미노, C₁-C₅알킬아민 또는 C₁-C₅,C₁-C₅디알킬아민일 수 있으며, 치환된 화합물의 치환체는 할로겐, C₁-C₅알킬 및 C₁-C₅알콕시이고;

R¹은 C=O이고,

R²는 분지쇄 알킬을 비롯한 C₁-C₁₀알킬이고,

R³는 수소, 아민, C₁-C₅알킬아민 또는 C₁-C₅,C₁-C₅디알킬아민이고,

R²+ R³는 시클릭알킬, C₁-C₁₀알킬로 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C₁-C₁₀알킬로 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로고리 또는 C₁-C₁₀알킬로 치환된 헤테로고리(예를 들면, C₁-C₁₀알킬 N-치환된 헤테로고리)를 형성할 수 있고,

R⁴는 Ar, R²또는 C₁-C₅알콕시, 시클릭알킬, C₁-C₁₀알킬로 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C₁-C₁₀알킬로 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로고리, C₁-C₁₀알킬로 치환된 헤테로고리 및 C₁-C₁₀알콕시로 치환된 헤테로고리(예를 들면, C₁-C₁₀알킬 N-치환된 헤테로고리)이고,

R⁵는 C=NH이고,

R⁶는 Ar, R²또는 C₁-C₅알콕시, 시클릭알킬, C₁-C₁₀알킬로 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C₁-C₁₀알킬로 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로고리, C₁-C₁₀알킬로 치환된 헤테로고리 및 C₁-C₁₀알콕시로 치환된 헤테로고리(예를 들면, C₁-C₁₀알킬 N-치환된 헤테로고리)이며,

R⁷은 Ar, R²또는 C₁-C₅알콕시, 시클릭알킬, C₁-C₁₀알킬로 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C₁-C₁₀알킬로 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로고리, C₁-C₁₀알킬로 치환된 헤테로고리 및 C₁-C₁₀알콕시로 치환된 헤테로고리(예를 들면, C₁-C₁₀알킬 N-치환된 헤테로고리)이다.

에스테르의 예로는 피페로카인, 메프릴카인 및 이소부카인과 같은 벤조산 에스테르; 프로카인, 테트라카인, 부테타민, 프로폭시카인 및 클로로프로카인과 같은 파라-아미노벤조산 에스테르; 메타부타민 및 프리마카인을 비롯한 메타-아미노벤조산 에스테르; 및 파레톡시카인과 같은 파라-에톡시벤조산 에스테르가 포함된다.아닐리드의 예로는 리도카인, 에티도카인, 메피바카인, 부피바카인, 피로카인 및 프릴로카인이 포함된다. 그러한 화합물의 다른 예로는 디부카인, 벤조카인, 디클로닌, 프라목신, 프로파라카인, 부타카인, 베녹시네이트, 카르보카인, 메틸 부피바카인, 부타신 피크레이트, 페나카인, 디오탄, 루카인, 인트라카인, 누페르카인, 메타부톡시카인, 피리도카인, 비페나민 및 식물 유래의 이중고리(예를 들어, 코카인, 신나모일코카인, 트룩실린 및 코카에틸렌), 및 염화수소와 결합된 형태의 상기 화합물들이 포함된다.

바람직한 실시양태에서, 촉진제는 부피바카인이다. 부피바카인은 메피바카인의 N-메틸기 대신에 N-부틸기를 가진다는 점에서 메피바카인과 다르다. 화합물들은 상기 N에 C₁-C₁₀을 가질 수 있다. 화합물들은 프로카인 및 클로로프로카인과 같이 할로겐에 의해 치환될 수 있다. 아닐리드가 바람직하다.

촉진제는 유전자 작제물의 투여 이전에, 유전자 작제물과 동시에, 또는 유전자 작제물의 투여 이후에 투여한다. 촉진제 및 유전자 작제물은 동일한 조성물 중에 제형화될 수 있다.

부피바카인-HCl은 화학적으로 2-피페리딘카르복스아미드 1-부틸-N-(2,6-디메틸페닐)-일염산염 일수화물이라 지칭되며, 아스트라 파마슈타칼 프로덕츠 인크(Astra Pharmaceutical Products Inc., Westboro, MA) 및 사노피 윈트롭 파마슈타칼스(Sanofi Winthrop Pharmaceuticals, New York, NY)를 비롯한 많은 회사로부터 제약용으로 시판된다. 부피바카인은 상업적으로 메틸파라벤이 있거나 없는상태로, 및 에피네프린이 있거나 없는 상태로 제형화되어 있다. 임의의 그러한 제형을 사용할 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 부피바카인은 0.25％, 0.5％ 및 0.75％ 농도의 제약용으로 입수할 수 있다. 필요한 경우에는 다른 농도, 구체적으로는 0.05％ 내지 1.0％의 농도로 제조하여 원하는 효과를 도출할 수 있다. 본 발명에 따라, 약 250 ㎍ 내지 약 10 mg의 부피바카인이 투여된다. 일부 실시양태에서는 약 250 ㎍ 내지 약 7.5 mg이 투여된다. 일부 실시양태에서는 약 0.5 mg 내지 약 3.0 mg이 투여된다. 일부 실시양태에서는 약 5 내지 50 ㎍이 투여된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서는 등장성 제약 담체 중에 포함된, 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 보다 바람직하게는 약 1 ml의 0.25-0.50％ 부피바카인-HCl과 0.1％ 메틸파라벤이 백신 투여 전이나 그와 동시에 또는 그 후에, 백신과 동일한 부위에 투여된다. 이와 유사하게, 일부 실시양태에서는 등장성 제약 담체 중에 포함된, 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 보다 바람직하게는 약 1 ml의 0.25-0.50％ 부피바카인-HCl이 백신 투여 전이나 그와 동시에 또는 그 후에, 백신과 동일한 부위에 투여된다. 부피바카인 및 임의의 유사한 다른 작용 화합물, 구체적으로는 국소 마취와 관련된 화합물의 군은 세포에 의한 유전자 작제물의 유입을 바람직하게 촉진시키는 농도로 투여될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 개체는 유전자 작제물의 투여 이전에 먼저 촉진제 주사를 맞는다. 즉, 예를 들어, 유전자 작제물을 투여하기 약 1주일 내지 10일 이전에, 먼저 촉진제를 개체에 주사한다. 일부 실시양태에서는 유전자 작제물을 투여하기 약 1 내지 5일, 일부 실시양태에서는 유전자 작제물을 투여하기 24시간 전 또는 후에 촉진제를 주사한다. 별법으로, 유전자 작제물과 촉진제 모두를 사용하는 경우에는, 촉진제를 유전자 작제물의 투여와 동시에 주사하거나, 유전자 작제물을 투여하기 수분 전 또는 후에 촉진제를 투여한다. 따라서, 촉진제 및 유전자 작제물은 혼합되어 단일 제약 조성물을 형성할 수 있다.

일부 실시양태에서는 유전자 작제물을 촉진제 없이 투여한다. 즉, 유전자 작제물을 촉진제와 함께 투여하지 않는 투여 프로토콜을 이용하여 촉진제가 없는 제형으로 투여한다.

면역화에 관한 일부 실시양태에서, 본 발명의 유전자 작제물은 살아있는 독성약화 생물체 또는 재조합 미생물 벡터 중에 유전자 물질의 일부로 남아있을 수 있다. 유전자 백신을 개선하기 위해 발현가능한 형태의 CD80 또는 CD80ΔC 돌연변이체 단백질의 코딩 서열을 이용하는 것 이외에, 본 발명은 개선된 독성약화 생백신, 및 항원을 코딩하는 외부 유전자를 전달하기 위해 재조합 벡터를 이용하는 개선된 백신에 관한 것이다. 독성약화 생백신, 그리고 외부 항원을 전달하기 위해 재조합 벡터를 이용하는 백신의 예는 미국 특허 제4,722,848호, 제5,017,487호, 제5,077,044호, 제5,110,587호, 제5,112,749호, 제5,174,993호, 제5,223,424호, 제5,225,336호, 제5,240,703호, 제5,242,829호, 제5,294,441호, 제5,294,548호, 제5,310,668호, 제5,387,744호, 제5,389,368호, 제5,424,065호, 제5,451,499호, 제5,453,364호, 제5,462,734호, 제5,470,734호 및 제5,482,713호에 기재되어 있으며, 이들은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함된다. 백신에서의 발현을 유도할 수있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상태로 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물이 본 발명에서 제공된다. 유전자 작제물은 독성약화 생백신 및 재조합 백신에 혼입되어 본 발명에 따른 개선된 백신을 생성한다. 유전자 작제물은 재조합 바이러스 백신 게놈의 일부분일 수 있으며, 여기서 유전 물질은 세포의 염색체에 통합되거나 염색체 외의 상태로 남아있다. 비-면역 반응 유도 치료법에 관한 일부 실시양태에서, CD80의 C 영역 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 재조합 바이러스 발현 벡터 또는 기타 적합한 전달 수단과 같은 임의의 전달 성분을 이용하여 전달됨으로써, 상용성 숙주세포로의 도입 및 숙주세포에서의 발현에 영향을 끼칠 수 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스 및 재조합 백시니아 바이러스와 같은 DNA 바이러스이거나, 또는 재조합 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스일 수 있다. 기타 재조합 벡터로는 세포를 감염시켜 재조합 유전자를 발현하는 재조합 원핵생물 벡터가 포함된다. 재조합 벡터 이외에, 리포좀 내로의 캡슐화, 트랜스페린 매개의 형질감염 및 기타 수용체 매개의 수단과 같은 다른 전달 성분도 생각할 수 있다. 본 발명은 그러한 다른 형태의 발현 벡터, 및 동등한 작용을 하고 당업계에 공지된 다른 적합한 전달 수단을 포함하는 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서는 DNA가 아데노바이러스에 의해 수용성(competent) 숙주세포에 전달된다. 당업자라면 그러한 수단에 의해 숙주세포에 DNA를 전달하는 기술을 쉽게 이해할 것이다. 바람직하게는 본 발명이 아데노바이러스를 포함하지만, 본 발명은 동등한 작용을 하는 임의의 바이러스를 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서는 RNA가 레트로바이러스에 의해수용성 숙주세포에 전달된다. 당업자라면 그러한 수단에 의해 숙주세포에 RNA를 전달하는 기술을 쉽게 이해할 것이다. RNA에 의해 코딩되는 단백질을 발현시킬 수 있는 임의의 레트로바이러스가 본 발명에 포함된다.

본 발명의 일부 실시양태는 단백질 및 이 단백질을 이용하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 일부 면역화 방법에서는 면역원성 단백질 및 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 개체에 투여한다. 이와 유사하게, 면역 억제에 의해 자가면역성 질환을 치료하고 이식편/이식체 거부를 방지하는 일부 방법에서는 CD80의 C 영역 단백질을 개체에 투여한다. 본원에 사용되는 "본 발명의 단백질"이란 용어는 유사한 수단에 의해 생산되며 본 발명의 방법에서 유사한 방식으로 제형화 및 투여될 수 있는 면역원성 단백질, CD80ΔC 돌연변이체 단백질 및 CD80의 C 영역 단백질을 의미한다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 비롯한 벡터들은 통상적으로 제조할 수 있다. 본원에서 사용된 "재조합 발현 벡터"라는 용어는 적합한 숙주에 도입되었을 때 코딩 서열의 발현을 유도하기 위해 필요한 유전자 요소를 함유하고 있는 플라스미드, 파지, 바이러스 입자 또는 다른 벡터를 의미한다. 당업자라면 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 단리 또는 합성하여, 표준 기술과 용이하게 입수한 출발 물질을 이용하여 발현 벡터 내로 삽입할 수 있을 것이다. 코딩 서열은 필수 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있어야 한다. 발현 벡터는 잘 공지되어 있으며, 용이하게 입수할 수 있다. 발현 벡터의 예로는 플라스미드, 파지, 바이러스 벡터 및 다른 핵산 분자, 또는 숙주 세포의 형질전환 및 코딩 서열의 발현 촉진에 유용한 비히클을 함유하는 핵산 분자가 포함된다. 본 발명의 일부 실시양태는 CD80ΔC 돌연변이체 단백질 또는 CD80의 C 영역 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주를 형질전환시키는데 유용하다. 본 발명은 CD80ΔC 돌연변이체 단백질, CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 포함하는 키메라 단백질, 또는 CD80의 C 영역 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 CD80ΔC 돌연변이체 단백질, CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 포함하는 키메라 단백질, 또는 CD80의 C 영역 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터가 포함된 숙주 세포에 관한 것이다. 단백질의 생산을 위해 잘 알려진 재조합 발현 시스템에 사용할 수 있는 숙주 세포는 잘 공지되어 있고 용이하게 입수할 수 있다. 숙주 세포의 예로는 대장균(E. coli)과 같은 세균 세포, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)와 같은 효모 세포, 에스. 프루기페르다(S. frugiperda)와 같은 곤충 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 비-인간 포유동물 조직 배양 세포, 및 HeLa 세포와 같은 인간 조직 배양 세포가 포함된다.

예를 들면, 일부 실시양태에서, 당업자라면 잘 공지된 기술을 이용하여 잘 공지된 발현 시스템에 사용하기 위해 상업적으로 시판되는 발현 벡터에 DNA 분자를 삽입할 수 있을 것이다. 예를 들면, 상업적으로 시판되는 플라스미드인 pSE420(Invitrogen, San Diego, CA)을 사용하여 대장균에서 CD80ΔC 돌연변이체 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 상업적으로 시판되는 플라스미드인pYES2(Invitrogen, San Diego, CA)를 사용하여 효모 균주인 에스. 세레비지애에서 생산할 수도 있다. 상업적으로 시판되는 맥스백(상표명, MAXBAC) 완전 배큘로바이러스 발현 시스템(Invitrogen, San Diego, CA)를 사용하여 곤충 세포에서 생산할 수도 있다. 상업적으로 사판되는 플라스미드인 pcDNAⅠ 또는 pCDNA3(Invitrogen, San Diego, CA)를 사용하여 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유동물 세포에서 생산할 수도 있다. 당업자라면 상업적으로 시판되는 이와 같은 발현 벡터 및 시스템, 또는 다른 벡터를 사용하여 통상적인 기술과 용이하게 입수할 수 있는 출발 물질을 이용하여 본 발명의 단백질을 생산할 수 있을 것이다(이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)] 참조). 따라서, 원하는 단백질은 원핵세포 시스템 및 진핵세포 시스템 모두에서 제조될 수 있으며, 그 결과 특정 범위로 가공된 형태의 단백질을 얻을 수 있다.

당업자라면 상업적으로 입수가능한 다른 발현 벡터 및 시스템을 이용하거나 공지된 방법과 용이하게 입수할 수 있는 출발 물질을 이용하여 벡터를 제조할 수 있을 것이다. 프로모터와 폴리아데닐화 신호 및 바람직하게는 인핸서와 같은 필수 조절 서열을 함유하는 발현 시스템은 용이하게 입수할 수 있고, 다양한 숙주에 대해 당업계에 공지되어 있다[Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)].

본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터는 상용성 숙주의 형질전환에 사용될 수 있고, 이는 외부 DNA가 발현되는 조건하에서 배양 및 유지될수 있다. 이와 같이 생산된 본 발명의 단백질은, 필요에 따라 세포의 용해에 의해 회수하거나 배양용 배지로부터 회수할 수 있으며, 이들 기술은 당업계에 공지된 것이다. 당업자라면 공지된 기술을 이용하여, 그러한 발현 시스템에서 생산된 본 발명의 단백질을 단리할 수 있을 것이다. 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 천연 공급원으로부터 상기 단백질을 정제하는 방법은 상기 항체를 생성하는 방법 만큼이나 통상적인 것이다(이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Harlow, E. and Lane, E., Antibodies : A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조). 그러한 항체는 재조합 DNA 방법 또는 천연 공급원에 의해 생산된 단백질을 정제하는데 이용될 수 있다.

유전자 작제물의 예로는 본 발명의 단백질을 코딩하고 자신이 형질감염될 세포주에서 기능하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열이 포함된다. 구성적 프로모터의 예로는 거대세포 바이러스 또는 SV40으로부터의 프로모터가 포함된다. 유도가능한 프로모터의 예로는 생쥐 유방 백혈병 바이러스 또는 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터가 포함된다. 당업자라면 용이하게 입수가능한 출발 물질로부터 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA로 세포를 형질감염시키는데 유용한 유전자 작제물을 제조할 수 있을 것이다. 이러한 유전자 작제물은 본 발명의 단백질을 생산하는데 유용하다.

재조합 기술에 의한 본 발명의 단백질 생산 이외에, 자동화 펩티드 합성기(automated paptide synthesizer)를 본 발명의 단백질 생산에 이용할 수 있다. 그러한 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, DNA-코딩 단백질 생산시 치환체를 갖는 유도체가 존재하지 않는 경우에 유용하다.

본 발명의 단백질은 임의의 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 용이하게는, 본 발명의 단백질은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 15: 2149-2154 (1963)]에 최초로 기재된 고상 합성 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 다른 단백질 합성 기술은 예를 들어, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [M. Bodanszky et al., (1976) Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed] 및 [Kent and Clark-Lewis, Synthetic Peptides in Biology and Medicine, p. 295-358, eds. Alitalo, K., et al. Science Publishers, (Amsterdam, 1985)] 뿐만 아니라, 당업자들에게 공지된 기타 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 합성 기술에 관한 요약은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [J. Stuart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [The Proteins, Vol. Ⅱ, 3d Ed., p. 105-237; Neurath, H. et al., Eds., Academic Press, New York, NY (1976)]에 기재된 바와 같이 용액에 의한 합성 방법을 사용할 수도 있다. 그러한 합성에 사용할 수 있는 적합한 보호기는 상기 문헌들 뿐만 아니라, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973)]에서도 찾아볼 수 있다.

일반적으로, 합성 방법은 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 적합하게 보호된 아미노산 잔기를 합성중인 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다. 통상적으로는, 제1 아미노산 잔기의 아미노기 또는 카르복실기가 적합한 보호기에 의해 보호되며, 이 보호기는 선택적으로 제거할 수 있다. 또한, 선택적으로 제거할 수 있는 다른 보호기가 리신과 같이 반응성 측쇄기를 함유하는 아미노산에 이용된다.

예를 들어, 고상 합성을 이용하는 경우에는 보호되거나 유도체화된 아미노산이 보호되지 않은 카르복실기 또는 아미노기를 통해 불활성 고형 지지체에 부착된다. 아미노기 또는 카르복실기의 보호기는 이후에 선택적으로 제거되고, 상보적인 기(아미노기 또는 카르복실기)를 갖는 서열에서 적합하게 보호된 그 다음 아미노산이 혼합되어 고형 지지체에 이미 부착된 잔기와 반응한다. 그 후에, 아미노기 또는 카르복실기의 보호기를 새로 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거하고, (적합하게 보호된) 그 다음 아미노산을 첨가한다. 원하는 모든 아미노산을 적합한 서열로 연결한 후, 임의의 잔여 말단기 및 측쇄기 보호기 (및 고형 지지체)를 순차적으로 또는 동시에 제거하여 최종 펩티드를 생성한다. 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 벤질화 또는 메틸벤질화 아미노산이 없다. 그러한 보호기 부분은 합성 과정에 사용될 수 있지만, 펩티드를 사용하기 전에 제거한다. 단백질을 특정한 구조로 속박하는 분자내 결합을 형성하기 위해, 본원의 여타 부분에 기재된 부가 반응이 필요할 수도 있다.

일부 실시양태에서는 단백질을 트랜스제닉(transgenic) 동물에서 생산할 수 있다. 본 발명은 CD80ΔC 돌연변이체 단백질 또는 CD80의 C 영역 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터가 포함된 비-인간 트랜스제닉 포유동물에 관한 것이다. 재조합 단백질을 생산하는데 유용한 비-인간 트랜스제닉 포유동물은 필요한 벡터 및 트랜스제닉 동물의 생성 기술 만큼이나 잘 알려져 있다. 일반적으로, 트랜스제닉 동물은 CD80ΔC 돌연변이체 단백질 또는 CD80의 C 영역 단백질을 유방 세포에 특이적인 프로모터에 작동 가능하게 연결시킴으로써 코딩 서열이 유방 세포에서만 발현되기 때문에 동물의 젖으로부터 발현된 재조합 단백질을 회수할 수 있게 하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 당업자라면, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는, 1989년 10월 10일자로 와그너(Wagner)에게 허여된 미국 특허 제4,873,191호 및 1988년 4월 12일자로 레더(Leder)에게 허여된 미국 특허 제4,736,866호의 교시사항과 같은 당업계의 표준 기술을 이용하여 CD80ΔC 돌연변이체 단백질 또는 CD80의 C 영역 단백질을 생산하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있을 것이다. 바람직한 동물로는 염소 및 설치류(특히, 쥐 및 생쥐)가 있다.

본 발명 단백질의 아미노산 서열에 대한 보존적 치환을 생각할 수 있다. 본원에 사용되는 "보존적 치환"이란 용어는 CD80의 아미노산 잔기를 유사한 구조 및(또는) 전하 특성을 공유하는 다른 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 당업자라면 잘 공지된 보존적 군을 기초로 하여 보존적으로 치환된 본 발명의 단백질을 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

본 발명의 제약 조성물은 활성 약제가 포유동물 체내의 적합한 부위에 도달할 수 있게 하는 임의의 수단으로 투여할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 국소 치료가 필요한지 전신 치료가 필요한지에 따라, 또 치료될 영역에 따라 무수한 방법으로 투여할 수 있다. 투여는 국소 투여(안구 투여, 질 투여, 직장 투여, 비내투여 및 경피 투여 포함), 경구 투여 또는 비경구 투여일 수 있다. 경구 투여시에는 펩티드가 분해되기 때문에, 경구용 조성물은 활성 약제가 장용(enterically) 코팅되거나 위에서의 분해로부터 보호(예를 들면, 예비 중화(preneutralization))되도록 제형화한다. 비경구 투여에는 정맥내 점적, 피하 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 폐 투여(예를 들어, 흡입 또는 취입에 의해), 경막내 투여, 또는 심실내 투여가 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 흡수를 최적화하기 위해 통상적으로 비경구 투여, 즉 정맥내, 피하, 경피 또는 근육내 투여가 사용된다. 정맥내 투여는 주입 펌프의 도움을 받아 수행될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 에멀젼으로 제형화될 수도 있다.

당업자라면 본 발명에 사용될 수 있는 제약상 허용되는 다수의 매체의 쉽게 이해할 것이다. 적합한 제약 담체는 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되며 당업계의 표준 교과서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]에 기재되어 있다. 국소 투여를 위한 제형에는 경피 패취, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적약, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 포함된다. 수성, 분말 또는 오일 기재의 증점제와 같은 통상적인 제약 담체가 필수적이거나 바람직할 수 있다. 경구 투여용 조성물에는 분말이나 과립, 물 또는 비수성 매체 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사세이(sachet) 또는 정제가 포함된다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 비경구, 정맥내, 경막내 또는 심실내 투여를 위한 조성물에는 완충액, 희석제 또는 기타 적합한 첨가제를 함유하며, 바람직하게는 멸균되고 발열원이 없는 멸균 수용액이 포함된다. 본 발명에 따른 정맥내투여에 적합한 제약 조성물은 멸균되고 발열원이 없어야 한다. 비경구 투여에 있어서, 본 발명의 펩티드는 예를 들어, 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조 분말로서 제형화될 수 있다. 그러한 비히클의 예로는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 5％ 인간 혈청 알부민이 있다. 리포좀, 및 고정된 오일과 같은 비수성 비히클도 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조 분말은 등장성을 유지하기 위한 첨가제(예를 들어, 염화나트륨 및 만니톨) 및 화학적 안정성을 위한 첨가제(예를 들어, 완충액 및 방부제)를 함유할 수도 있다. 본 발명의 제형은 통상적으로 사용되는 기술에 의해 멸균된다. 예를 들어, 주사로 투여하기 적합한 비경구용 조성물은 0.9％의 염화나트륨 용액 중에 1.5 중량％의 활성 성분을 용해시켜 제조한다.

본 발명에 따른 제약 조성물은 단일 투여 또는 다중 투여로 투여할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 개별 치료제로서 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있다. 본 발명의 치료제는 순차적으로 또는 동시에 투여되는 종래의 치료제와 병용할 수 있다.

투여량은 특정 약제의 약물동력학적 특성, 및 그의 투여 방식과 경로; 환자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질과 정도; 수반되는 치료의 종류; 치료 빈도; 및 원하는 효과와 같은 공지된 인자에 따라 달라진다. 치료 조성물의 제형 및 그에 따른 투여량은 당업자의 사고범위 내에 있을 것이라 생각된다. 통상, 펩티드의 투여량은 체중 50 kg 당 약 1 내지 3000 mg, 바람직하게는 체중 50 kg 당 약 10 내지 1000 mg, 보다 바람직하게는 체중 50 kg 당 약 25 내지 800 mg일 수 있다. 통상, 일일 8 내지 800 mg을 1 내지 6회로 나누어 투여하며, 서방형이 원하는 결과를 얻는데 효과적일 수 있다.

단백질 또는 단백질들이 투여되는 방법에 따라, 본 발명의 제약 조성물은 가장 효과적으로 제형화되거나 투여될 수 있다. 투여 방식은 본 발명의 개시 내용을 고려하면 당업자에게 분명할 것이다.

본 발명의 방법은 인간 의학 및 수의학 분야에 유용하다. 따라서, 본 발명은 포유동물, 조류 및 어류의 유전자 면역화에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 인간, 소, 양, 돼지, 말, 개 및 고양이를 비롯한 포유동물 종에 특히 유용하다.

하기 기재되는 실시예는 본 발명의 측면에 관한 대표적인 실시예를 포함한다. 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 단지 예시하기 위한 것이다. 또한, 본 발명의 다양한 측면은 하기 설명에 의해 요약될 수 있다. 그러나, 이 설명은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 오히려 본 발명의 다양한 측면을 강조하기 위한 것이다. 당업자라면 본 발명의 부가적인 측면 및 실시양태를 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

CD86은 T-세포 반응의 증가에 필요하지만 CD80은 그렇지 않은 이유를 밝히려는 노력에서, 그리고 CD80의 V- 및 C-도메인에서 발견된 잔기들을 비롯한 CD28 및 CTLA-4에 대한 결합에 관련된 몇몇 중요한 영역이 밝혀진 CD80과 CD86의 구조 기능 분석을 추가로 연구하기 위해, CD80 및 CD86 분자의 키메라 형태나 말단이 잘린 형태를 코딩하는 DNA와 DNA 면역원으로 생쥐를 동시 면역화시켜, T-세포 활성화에서CD80 및 CD86 분자의 상이한 영역의 기능을 조사하였다.

<방법>

<작제물의 제조>

HIV-1_MX외피 단백질을 코딩하는 DNA 백신 작제물(pcEnv)을 미국 특허 제5,593,972호에 기재된 바와 같이 제조하였다. 인간 CD80 및 CD86 유전자를 B 세포 cDNA 라이브러리(Clonthec, Palo Alto, CA)로부터 클로닝하여 발현벡터인 pSRαneo1+에 넣었다. 더욱 구체적으로는, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Kim et al. (1997) Nature Biot. 15:641-645]에 기재된 바와 같이 CD80 및 CD86 유전자를 PCR로 증폭하여 pSRαneo1+의 SRα 프로모터 하류에 라이게이션하여 pCD80 및 pCD86 발현 벡터를 만들었다. 상기 두 유전자의 키메라 변이체 및 말단이 잘린 변이체는 엑스팬드(상표명, Expand) 고충실도 중합효소 시스템(High Fidelity Polymerase system, Boehringer-Mannheim, Germany)를 이용하여 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 이러한 모든 형태의 동시 자극성 분자를 제작하기 위해, pCD80 및 pCD86을 PCR의 주형으로 사용하였다. 이 반응에서 하기의 프라이머들을 사용하였다:

A: CTGCTTGCTCAACTCTACGTC-서열 1 (정방향, 벡터)

B: CTGAAGTTAGCTTTGACTGATAACG-서열 2 (역방향, CD80)

C: GCAATAGCATCACAAATTTCA-서열 3 (역방향, 벡터)

D: CAGTCAAAGCTAACTTCAGTCAACC-서열 4 (정방향, CD86)

E: GGGAAGTCAGCAAGCACTGACAGTTC-서열 5 (역방향, CD86)

F: TCAGTGCTTGCTGACTTCCCTACACC-서열 6 (정방향, CD80)

G: TCTTGCTTGGCTTTGACTGATAACGTCAC-서열 7 (역방향, CD80)

H: TCAGTCAAAGCCAAGCAAGAGCATTTTCC-서열 8 (정방향, CD80)

I: TCCTCAAGCTCAAGCACTGACAGTTC-서열 9 (역방향, CD86)

J: TCAGTGCTTGAGCTTGAGGACCC-서열 10 (정방향, CD86)

K: TCTGGATCCTCATCTTGGGGCA-서열 11 (역방향, CD80)

L: TCTGGATCCTCATTTCCATAG-서열 12 (역방향, CD86)

CD80의 V 도메인은 A 및 B 프라이머를 사용하여 증폭하였고, CD86의 C-도메인, 막횡단(TM) 및 세포질 꼬리부(T)는 C 및 D 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 이어서, 이들 단편을 정제하여 혼합한 후, 이를 정방향(CTGCTTGCTCAACTCTACGTC-서열 1) 및 역방향(GCAATAGCATCACAAATTTCA-서열 3) 프라이머를 사용하는 2단계 PCR 반응에서 주형으로 사용하였다. PCR 생성물을 pSRαneo1+ 벡터로 라이게이션하고, 생성된 플라스미드(pV80C86T86)는 CD80의 V-도메인과 CD86의 C-, TM- 및 T-영역을 발현하는 동시 자극성 키메라 분자를 코딩한다. 키메라의 교차 지점은 보존적인 CD80의 알라닌 106 위치 및 CD86의 알라닌 111 위치이며, 이는 엑손 경계와 관련되어 있다.

CD86의 V-도메인과 CD80의 C-, TM- 및 T-영역을 코딩하는 다음 플라스미드 pV86C80T80은 A 및 B 프라이머를 사용하여 CD86의 V-영역을 증폭시킴으로써 제작하였다. CD80의 C-, TM- 및 T-도메인을 코딩하는 PCR 단편은 C 및 F 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 2단계 PCR 및 클로닝은 상기와 같이 수행하였다.

또한, C-도메인이 포함되지 않도록 말단이 잘린 형태의 동시 자극성 분자(pV80CΔT80, pV86CΔT86)도 2단계 PCR 기술에 의해 제조하였다. pV80CΔT80의 경우에는 A 및 G 프라이머를 사용하여 V-도메인을 증폭하였으며, pV86CΔT86의 경우에는 A 및 I 프라이머를 사용하여 V-도메인을 증폭하였다. 말단이 잘린 C-도메인의 두 가지 분자의 TM/T 단편은, pV80CΔT80의 경우에는 C/H 프라이머를 사용하고 pV86CΔT86의 경우에는 C/J 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 결과의 작제물은 PCR로 증폭하여 이 PCR 생성물을 pSRαneo1+ 발현 벡터에 클로닝함으로써 제조하였다. 모든 작제물은 원래의 야생형 CD80 및 CD86의 주형에 대해 작제물의 서열이 정확한지의 여부로 확인하였다. 생성된 결실 돌연변이체는 CD80의 아스파테이트 107에서 트레오닌 200까지의 아미노산이 결여되어 있었고, CD86의 알라닌 111에서 이소루이신 211까지의 아미노산이 결여되어 있었다. 각각의 분자들이 각각의 C-도메인의 막 인접 아미노산 6 내지 7개를 보유하도록 제작되었음을 알아야 한다.

마지막으로, pCD80(pV80C80TΔ) 및 pCD86(pV86C86TΔ)의 T-영역 결실 돌연변이체는 모든 경우에 A를 정방향 프라이머로 사용하고 각각 K 및 L을 역방향 프라이머로 사용하는 1단계 PCR에 의해 생성하였다. PCR 생성물을 pSRαneo1+ 벡터에 클로닝하였다. 코딩된 CD80 단백질은 세포질 꼬리부의 제1 아미노산 잔기인 아르기닌 이후에 종결된다. 생성된 CD86 분자의 유전자는 세포질 꼬리부의 제1 리신을 포함하는 뉴클레오티드 942 이후에 종결된다.

모든 키메라 작제물 및 말단이 잘린 작제물 뿐만 아니라 야생형 분자들도pSRαneo1+ 벡터에 클로닝하였다. 유전자 발현은 원숭이 바이러스 40(SV40)의 초기 프로모터 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1형의 장쇄 말단 반복서열의 R-단편 및 U5 서열의 일부분(R-5')으로 이루어진 SRα 프로모터의 조절을 받는다. 모든 작제물은 원래의 야생형 CD80 및 CD86의 주형에 대해 작제물의 서열이 정확한지의 여부로 확인하였다.

<플라스미드의 발현>

이들 작제물의 발현은 실험군 및 대조군 플라스미드로 형질감염된 인간 횡문근육종(RD) 세포를 이용하여 면역형광 및 유동 세포계(immunofluorescence and flow cytometry, FACS) 분석법으로 분석하였다. 세포는 500 μF 의 용량 및 0.25 V를 이용하는 전기천공법에 의해 진펄스(Gene Pulse, Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 형질감염시켰다.

면역형광 분석을 위해, 형질감염된 세포를 2일동안 배양한 후, 팔콘(등록상표, Falcon) 배양 슬라이드(Becton Dickinson, Bedford, MA)로 옮겼다. 다음날, 세포를 세척하고, 메탄올(30', 상온)로 고정시킨 후, 항-CD80 모노클로날 항체(Coulter, Miami, FL) 또는 항-CD86 모노클로날 항체(Pharmingen, San Diego, CA)와 함께 인큐베이션하였다(1.5 시간, 37℃). 슬라이드를 세척하고, 염소-항 생쥐 IgG(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)로 37℃에서 1.5 시간 동안 염색하였다. 이 슬라이드를 니콘 옵티포트(Nikon OPTIPHOT) 형광 현미경(Nikon Inc., Tokyo, JAPAN)으로 관찰하고 사진을 찍었다.

FACS 분석을 위해, RD 세포를 CD80 또는 CD86 분자를 코딩하는 작제물(2 ㎍)과 녹색 형광 단백질 발현 벡터{10 ㎍의 pcGFP, 클론테크(Clontech, Palo Alto, CA)}의 혼합물로 형질감염시켰다. 녹색 형광 단백질 발현 벡터를 형질감염 효율을 계산하기 위한 대조군 플라스미드로 사용하였다. 실험군 플라스미드는 PE와 접합된 CD80 또는 CD86 분자의 V-도메인에 대한 모노클로날 항체(Pharmingen, San Diego, CA)를 이용하여 확인하였다. 요컨대, 항-B7 항체 1 ㎍을 형질감염된 세포 또는 대조군 세포(10×10⁵)에 가하였다. 데이타는 셀퀘스트(상표명, CELLQuest) 데이타 획득 및 소프트웨어(data acquisition and software, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)로 팩스스캔(FACScan)에 의해 분석하였다. 상이한 B7 분자를 발현하는 세포의 형질감염 효율(형광 강도)은 GFP를 발현하는 세포의 개체군에서 측정하였다.

<동물의 면역화>

인산염 완충 식염수(PBS) 100 ㎕ 및 0.25％ 부피바카인-HCl(Sigma, St. Louis, MO)에 재현탁된 각 DNA 작제물 50 ㎍을 각 Balb/c 생쥐에 3회 근육내 주사(2주 간격)하였다. 이 투여량은 상이한 분자 면역보강제(즉, 돌연변이, 말단이 잘린, 또는 야생형 동시 자극성 유전자)의 자극성 전달에 의해 제공된 항-바이러스성 면역 반응을 최대로 증가시키기 위해 선택하였다. HIV-1 gp160 외피를 코딩하는 플라스미드(pcEnv) 50 ㎍을 단독으로 주사하거나, 또는 pcEnv와 다양한 CD80/86 작제물(분자 면역보강제) 50 ㎍의 혼합물을 주사하였다. 대조군으로서, 대조군 벡터를 주사한 천연 생쥐 및 동물을 사용하였다. 여러가지 실험에서, 2가지 분자 면역보강제(총 100 ㎍)와 pcEnv(50㎍)의 혼합물을 동물에 3회 주사하였다. 최종 주사한지 2주 후, 모둔 실험 동물과 대조군 동물로부터 비장세포을 단리하여 T-세포 반응 및 싸이토카인 생산의 검출을 위해 사용하였다.

<근육 세포의 면역조직학적 분석>

침윤(근육에 림프구의 존재)을 검출하기 위해, 면역화된 다리 근육을 면역조직학적으로 조사하였다. 요컨대, 실험 플라스미드 또는 대조군 플라스미드 50 ㎍과 혼합된 pcEnv 50 ㎍을 생쥐의 사두근에 접종하였다. 접종 7일 후, 생쥐를 죽여 사두근을 분리하였다. 신선한 근육 조직을 O.C.T. 화합물(Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA) 중에서 동결시키고, 4 ㎛의 동결 단면을 만들었다. 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) (H＆E)으로 염색된 근육 단면을 조사함으로써 염증도를 측정하였다.

<세포독성 T 림프구 분석>

5시간 단위의⁵¹Cr 방출 CTL 분석을 수행하였다. 요컨대, 작용물질을 자극성 세포와 Con A가 없는 10％ RAT-T-STIM(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)의 존재하에 6일 동안 자극하였다. 항원성 자극을 위해, HIV-1 외피 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(vMN462, NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)로 감염된, 0.1％의 글루타르알데히드로 고정된 P-815 세포를 사용하였다. 표적 세포로서, 재조합 백시니아 바이러스(vMN462, 특이적)로 감염된 P-815 세포 및 야생형 백시니아 바이러스(WR, 비특이적)로 감염된 P-815 세포를 사용하였다.두 가지 표적 세포 모두 100 Ci/ml의 Na₂ ⁵¹CrO₄로 표지하였고, 작용 물질:표적(E:T)의 비율이 100:1 내지 12.5:1이 되도록 작용 세포와 혼합하였다. 비용해도는 상기 문헌(Kim, 1997)에 기재된 바와 같이 측정하였다. 최대 및 최소 방출은 각각 10％ 트리톤(Triton)-X 100 및 배지 중에서 용해에 의해 측정하였다. "자발 방출" 계수값이 "최소 방출"의 20％를 초과하는 경우에는 분석을 타당한 것으로 간주하지 않았다. 표적의 비용해성을 계산하기 위해, 비특이적인 표적의 용해도를 특이적인 표적의 용해도에서 감하였다. 일부 실시양태에서는 CD8+ T-세포를 항-CD8 모노클로날 항체(53-6.7, ATCC)로 처리한 후, 무독성 토끼 보체(Sigma)와 인큐베이션하여 비장세포 배양액으로부터 제거하였다.

<싸이토카인 생산>

면역 세포에 의한 다양한 싸이토카인의 방출량은 면역 반응의 방향 및 크기를 반영한다. 따라서, CTL 분석을 위해 시험관내에서 자극된 작용 세포로부터의 상청액을 수집하여 γIFN, IL-4 및 IL-12의 방출에 대해 시판되는 ELISA 키트(Biosource, Camarillo, CA)로 시험하였다.

<결과>

<야생형 및 돌연변이체 형태의 CD80 및 CD86을 코딩하는 플라스미드의 발현>

대조군 및 실험군 플라스미드로 형질감염된 RD 근육 종양 세포에 CD80 또는 CD86 작제물을 상이한 형태로 발현하는지 여부를 우선 분석하였다. 면역형광 기술을 이용하여, 대조군 세포(벡터만으로 형질감염됨)를 제외한 실험군 세포가 야생형및 상이한 형태의 동시 자극성 돌연변이 분자를 생산하는지 관찰하였다. 이들 분자의 형질감염 효율은 FACS 분석에 의해 조사하였다. 이 실험에서, GFP를 코딩하는 대조군 플라스미드 및 상이한 형태의 동시 자극성 분자를 코딩하는 실험군 작제물을 형질감염시켰다. B7 분자를 발현하는 세포의 형광 강도는 GFP를 발현하는 세포의 개체군에서만 검출되었다. 그 결과는 CD86 및 CD80의 키메라 및 말단이 잘린 대부분의 형태, 및 CD86의 야생형 분자가 유사하게 발현되었다는 것을 증명하였다(표 3). CD80의 야생형(pCD80) 및 세포질 꼬리부 결실된 CD86(pV86C86TΔ)을 코딩하는 2개의 작제물만이 형질감염된 세포의 표면에서 다른 플라스미드에 비해 비교적 높은 수준으로 발현되었다.

<CD86과 CD80의 V-도메인은 모두 바이러스-특이적 CTL 반응 및 Th1 싸이토카인 생산에 중요하다>

B7 분자는 세포의 표면에서 발현되는 적합한 리간드를 통해 항원-특이적 T-세포 활성화를 유도하는데 중요한 작용을 한다. 초기에는 DNA 면역원과 함께 야생형 CD86(CD80의 cDNA는 그렇지 않음)을 동시 투여하면 항원 특이적 T-세포 반응이 증가한다(Kim et al. 1997, 상기 문헌)고 보고하였다. 이 활성화에 있어서 CD86의 V-영역의 기능을 조사하기 위해, CD80과 CD86의 3가지 도메인을 상호교환(표 3)하여 이들 분자를 바이러스 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 동시 면역화시켰다. 양성 대조군으로서, 야생형 CD80 및 CD86을 발현하는 작제물을 DNA 면역원과 함께 동시 주사하였고, 음성 대조군 생쥐에는 벡터만을 주사하였다. 최종 면역화 2주 후, 비장세포 배양액에서 항-바이러스성 CTL 반응을 분석하였다.

대조군 동물로부터 얻은 비장 세포에서 배경값 수준의 특이적 사멸이 관찰되었고, pcEnv 또는 pcEnv + pCD80으로 동시 면역화된 동물에서 낮은 수준의 사멸이 관찰되었다. 그러나, pcEnv 및 pCD80으로 동시 면역화된 생쥐에서 높은 수준의 외피-특이적 CTL 반응이 나타났다(표 4). 따라서, 기존에 사용된 pcDNA3 벡터 대신에 pSRαneo1+ 벡터에 삽입된 CD80 및 CD86 유전자를 사용하여, CD80 및 CD86이 DNA 백신접종에 따른 세포성 면역 반응의 조절에 차등적인 역할을 한다는 것을 확인하였다. 그 다음으로, 키메라 분자로 면역화된 생쥐에서 항-바이러스성 CTL 반응을 분석하였다. pV86C80T80 및 pcEnv로 동시 면역화된 생쥐에서는 바이러스-특이적 세포독성 세포가 생성되지 않았지만, pV80C86T86과 pcEnv의 혼합물로 면역화된 경우에는 E:T 비율 1:100에서 40％가 넘는 항-HIV-1 CTL 활성이 유도되었다. 이 반응은 pcEnv + pCD86으로 동시 주사한 생쥐에서도 항-바이러스성 CTL 활성이 유사했다(표 4). 따라서, CD80의 V 영역은 CD86의 C-도메인 및 세포질 꼬리부와 함께 발현된다면 CD86 분자의 V-영역 만큼 항원-특이적 T-세포 활성화에 중요하다. 그러나, CD86의 V-도메인은 CD80의 C-도메인 및 세포질 꼬리부와 함께 발현되었을 때 기능이 없었다. 이들 결과는 싸이토카인 생산 데이타에 의해서도 지지된다. pcEnv 및 pcEnv + pCD80을 주사한 생쥐로부터 얻은 비장 세포의 상청액은 낮은 수준으로 IL12 생산을 유도했지만, γIFN 또는 IL4의 생산을 유도하지는 못하였다(표 4). 반대로, pcEnv + pCD86 및 pcEnv + pV80C86T86으로 동시면역화시키면, γIFN 및 IL12의 항원 특이적 생산이 상당히 증가되었지만, IL4 생산이 증가되지는 않았다.

이들 결과는 CD86의 C-도메인 및(또는) 세포질 꼬리부가 T-세포의 양성 신호전달에 중요한 반면, CD80의 동일한 도메인은 그렇지 않음을 시사한다. 또한, CD80의 C-도메인 및(또는) 세포질 꼬리부는 T-세포에 대한 음성 신호전달을 제공하는 것과 관련되어 있을 수 있다.

<항원-특이적 T-세포 활성화에 중요한 CD86의 세포질 꼬리부>

B7의 세포질 꼬리부가 세포 표면에서 리간드를 클러스터링(clustering)시킴으로써 시험관내에서 T-세포의 동시 자극에 필요하다고 입증된 바 있다. 따라서, T-세포의 동시 자극에 있어서 B7의 세포질 꼬리부의 기능을 입증하기 위해, B7의 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체를 제작하고, 이들 플라스미드(pV80C80TΔ 또는 pV86C86TΔ) 및 pcEnv를 생쥐에 동시 주사하였다. CD80 또는 CD86 분자의 말단이 잘린 형태를 코딩하는 두 가지 모든 작제물이 낮은 수준의 사멸을 유도한 반면, pcEnv와 CD86의 혼합물로 동시 면역화된 동물은 강한 항-바이러스성 CTL 반응을 나타냈다(표 4). Th1 싸이토카인 생산 분석에 의해서도 이를 지지하는 데이타가 생성되었다.

세포질 꼬리부가 없는 CD80 및 CD86 작제물은 DNA 백신을 동시 주사한 후에 γIFN 생산을 증가시키지 못하였다. 생쥐를 pV86C86TΔ로 동시 면역화시킨 경우에는 pcEnv 또는 pcEnv + pV80C80TΔ를 주사한 생쥐에 비해 IL12의 생산이 소량 증가하였다. 중요한 것은 pcEnv + 야생형 CD86을 코딩하는 DNA로 동시 면역화된 대조군 동물은 γIFN 및 IL12 싸이토카인 생산을 상당히 증가시켰다는 것이다(표 4). 따라서, CD86 분자의 세포질 꼬리부는 T-세포의 활성화에 중요하다. 그러나,pcEnv + pV80C80TΔ로 동시 면역화된 생쥐는 T-세포의 활성화를 유도하지 않았다. 따라서, 음성 신호전달에 있어서 CD80의 C-도메인 및(또는) 세포질 꼬리부의 연관성은 결정되지 않은 채로 남아있다. 이 문제점을 해결하기 위해, 하기의 CD80 및 CD86의 C-도메인 결실 돌연변이체를 제작하였다.

<CD80의 세포질 꼬리부가 아니라, C-도메인이 T-세포에 대한 음성 신호전달에 관련되어 있다>

다음 실험세트에서는 생쥐를 면역원 및 플라스미드(CD80 또는 CD86 분자의 V-도메인 및 세포질 꼬리부만을 코딩하는 pV80CΔT80 또는 pV86CΔT86)로 동시 면역화시켰다. 대조군으로서, 생쥐에 pcEnv, pcEnv + pCD80 또는 pcEnv + pCD86만을 주사하였다. 이 실험 결과로 얻은 항원 특이적 항-바이러스성 CTL 반응은 도 1에 나타나 있다. CD86의 면역보강제 효과는 극적으로 변하였으며, CD86의 C-도메인 결실 분자에서 더 낮은 정도로 유지되었다. CD80의 야생형 및 세포질 꼬리부 결실 형태에 의해 유도된 T-세포 활성화에 대한 매우 불량한 효과(도 1, 표 4)와는 아주 대조적으로, pV80CΔT80은 항-Env CTL 반응의 동시 자극에 매우 효과적이었으며(도 1), 이는 C-도메인의 손실에 의한 기능의 획득을 증명하는 것이다. 세포성 면역의 증가에 대해 더 조사하기 위해, pcEnv 및 플라스미드(C-도메인이 결실된 CD80 또는 CD86 분자를 코딩함)로 면역화된 생쥐의 비장 세포를 사용하여 Th1 싸이토카인 생산을 조사하였다. 대조군으로서, 생쥐를 pcEnv + pCD80 또는 pcEnv + pCD86으로 동시 면역화시켰다. pcEnv와 함께 동시 주사한 pV86CΔT86와 pV80CΔT80 키메라 유전자 및 야생형 CD86을 코딩하는 DNA가 동등하게 만족스러운 정도로 Th1 림포카인 생산을 유도하였다(도 2A 및 2B).

이러한 결과는 CD80의 세포질 꼬리부가 기능성이며, 생체내에서 T-세포 활성화에 중요함을 입증하는 것이다. 더욱 중요하게, 이 데이타는 CD80(CD86이 아님)의 C-도메인이 T-세포에 대해 "음성" 신호를 제공할 수 있다는 결론을 지지한다. 그 다음으로, T-세포 활성화에 있어서 CD80의 C-도메인의 억제 작용을 분석하였다.

<CD80의 C-도메인은 CD86 분자에 의해 T-세포 활성화를 억제한다>

항원-특이적 T-세포에 음성 신호를 제공하는 것에 대한 CD80 C-도메인의 연관성을 입증하기 위해, 동물을 DNA 면역원과 분자 면역보강제의 조합으로 면역화시켰다. 실험군 생쥐를 DNA 면역원 및 pCD86과 pCD80의 혼합물 또는 pCD86과 pV80CΔT80의 혼합물로 동시 면역화시켰다. 대조군 동물은 pcEnv만을 주사하거나, pcEnv + pCD86, pcEnv + pCD80 또는 pcEnv + pV80CΔT80을 동시 주사하였다. 실험군 및 대조군의 생쥐로부터 얻은 비장 세포로 항-바이러스성 CTL 분석을 수행하였다.

이전에 관찰된 바와 같이, DNA 면역원 및 pCD86 또는 pV86CΔT80으로 동시 면역화된 생쥐에서 CTL 활성이 상당히 증가하였다(도 3). 그러나, pcEnv 및 야생형 분자 면역보강제(pCD86 + pCD80)의 조합으로 동시 면역화된 생쥐에서는 CTL 반응이 증가하지 않았다(pcEnv를 주사한 대조군보다 용해도가 크지 않음). 중요한 것은 pCD86 및 pV80CΔT80의 조합이 백신화된 동물에서 여전히 면역보강제 효과를 유도한다는 것이며, 이 효과는 pCD86 + DNA 면역원으로 면역화된 동물에서 유도된 효과와 유사하였다. 따라서, 야생형 CD80(C-도메인이 결실된 CD80은 아님)은 DNA면역원과 동시에 전달될 때 항-바이러스성 CTL 반응의 증가를 억제시켰다. 관찰된 세포독성 활성에서 CD8⁺T 세포의 기능을 확인하기 위해, 상기 세포의 개체군을 제거한 후에 CTL 활성을 측정하였다. 비장 세포를 항-CD8 모노클로날 항체 및 무독성 토끼 보체로 처리하였다. CD8⁺T 세포의 제거한 결과, DNA 면역원 및 pCD86을 동시 주사한 생쥐에서 항-바이러스성 CTL 활성이 억제되었다. 또한, pcEnv + pCD80 + pCD86으로 동시 면역화된 생쥐에서는 항-HIV-1 CTL 활성을 전혀 관찰할 수 없었다(도 4).

<C-도메인이 결실된 CD80의 발현은 야생형 CD80의 발현에 비해 면역화된 동물의 근육으로의 림프구 침윤을 더 많이 유도하였다>

pcEnv + pCD86으로 면역화된 생쥐에서는 대조군 또는 pcEnv + pCD80으로 면역화된 동물에 비해 림프구의 침윤이 현저히 증가하였다. 침윤 세포에는 CD4⁺및 CD8⁺T 세포가 포함된다. 따라서, C-도메인이 결실된 CD80 분자가 T 세포와 반응할 수 있는지 추가로 조사하기 위해, 생쥐에 pcEnv + pV80CΔT80을 주사한 후에 근육 조직으로의 세포 침윤을 조사하였다. 대조군으로서, 벡터만을 주사한 동물이나 pcEnv + pCD80 또는 pcEnv + pCD86의 혼합물을 주사한 동물을 사용하였다. 생쥐에 pcEnv + pCD86을 동시 주사하면 근육 조직으로의 림프구 침윤이 극적으로 유도되었지만, pcEnv + pCD80을 주사한 경우에는 그렇지 않았다(도 5). 정상적인 동물은 사실상 침윤되지 않는다. 더욱 중요한 것은 DNA 면역원 및 pV80CΔT80으로 동시면역화된 생쥐의 근육에서 침윤이 훨씬 더 많았다는 것이다. 따라서, C-도메인의 결실은 CD80의 동시 자극적 성질을 야생형 CD86과 유사하게 변화시켰다.

상기 입증된 바와 같이, 생쥐를 DNA 면역원 및 pCD86 또는 pV80CΔT80으로 동시 면역화시키면 CTL 활성, Th1 싸이토카인 생산, 및 주사 부위에서 세포의 침윤이 증가하였다. 반대로, DNA 면역원 및 pCD80으로 면역화시키면 유사한 효과가 나타나지 않았다. 본 발명자들은 CD80의 C-도메인을 결실시키면 CTLA-4에 대한 친화도가 감소할 것이라고 가정하였다. 그 결과, T 세포에 강력한 음성 신호를 제공하게 될 것이다. 본 발명자들은 CD80과 CD80의 C-도메인 결실 돌연변이체 사이의 CTLA-4에 대한 결합 친화도 차이를 비교하기 위해 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용하였다. 통상, 수용체(대응 수용체(counterreceptor)) 분자는 센서 표면에 고정되고, 상이한 농도의 대응 수용체(수용체)는 이 센서를 통해 연속적으로 흐르게 된다. 이 방법을 이용하여, 가용성 CD80에 결합한 인간의 가용성 CTLA-4의 용액 K_D가 0.2 내지 0.4 μM이라는 것을 알아냈다. 목적 리간드를 발현하는 세포를 센서의 표면에 고정시켰다. 세포의 고정으로 인해, 세포 표면의 CD-80 에피토프는 리간드의 구조가 최소한으로 변형된 상태에서 다량의 가용성 CTLA-4-Ig에 최대한 접근할 수 있었다. 막 이중층 내부에서의 측면 확산으로 인해, CD80 리간드는 CTLA-4에 결합시 생리적으로 올리고머를 형성하게 된다. 이 방법을 이용하여, CTLA-4-Ig가 야생형 CD80 및 C-도메인이 결실된 CD80 분자로 형질전환된 RD 세포에 특이적으로 결합함을 입증하였다. 중요한 것은 이 결합이 농도에 따라 달라진다는 것이다. 모노클로날 항체의 결합에서 비특이적 신호를 뺀 후, 친화도를 계산하였다. 야생형 CD80 수용체와 CTLA-4-Ig의 결합은 돌연변이체 CD80보다 5배 빠른(k_on파라미터) 반면, CTLA-4/CD80 복합체의 해리는 야생형 수용체보다 2.8배 느리다(k_off파라미터). 반응속도에 있어서의 이러한 차이점 때문에, CTLA-4-Ig와 CD80 야생형의 상호작용은 K_D에 반영된 바와 같이 CD80 돌연변이체보다 14배 더 강력하다. 비아코어(Biacore)에 의해 측정된 k_off파라미터 및 K_on파라미터는 세포 표면에 발현된 수용체의 수에 의존하지 않는다. 따라서, CD80 수용체의 불변 영역 결실은 CD80과 CTLA-4의 상호작용 자체에 큰 효과를 미친다.

<논의>

지금까지의 증거는 T 세포 활성화에 대한 동시 자극성 경로에서 가장 중요한 것 중 하나가 APC 상에 CD80 및 CD86을 발현시키는 것과 관련되어 있음을 시사한다. 이들 분자는 T 세포 표면 수용체(CD28 또는 CTLA-4)와 상호작용하여 증식 및 싸이토카인 분비에 중요한 2차 신호를 제공한다. T 세포 활성화에 대한 중요한 동시 자극성 신호는 B7 리간드와의 결합 이후에 CD28을 통해 제공된다. 반대로, CTLA-4는 주로 억제 신호를 유도한다. CD80 및 CD86 분자의 기능적 작용을 규정하는 증거는 더 복잡하다. 몇몇 생체내 모델에서, CD80과 CD86 모두가 T 세포 활성화에 중요한 작용을 한다고 입증된 바 있다. 그러나, CD80이 발현되기 전에 CD86이 발현된다는 것은 CD86이 T-세포 면역 반응을 개시하는데 더 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. CD80과 CD86의 차이점은 CD28 및 CTLA-4와의 동시 자극성 분자의 결합 반응속도 데이타에 의해 추론할 수 있다. 최근, CD80과 CD86 분자 사이의 기능적 차이는 DNA 면역화를 비롯한 많은 모델 시스템에서 증명되었다.

CD86 분자는 생쥐의 DNA 백신접종 이후에 T 세포에 2차 신호를 제공하는데 매우 중요하지만, CD80 분자는 그렇지 않다. 그러나, CD80 및 CD86은 소형유전자(minigene)을 코딩하는 플라스미드 DNA와 동시에 발현되었을 때 CTL 반응을 증가시키는 것으로 보고되었다. 이 결과는, 천연 항원보다 유리 에피토프가 독특한 양태를 보인다는 것을 시사하는 다른 결과들과 다르다. 상이한 군으로부터 유사한 결과가 얻어진다는 것은 유익한 것이며, 이는 CD86의 발현이 생체내에서 세포성 면역 반응을 개시하고 진행하는데 있어서 CD80의 발현보다 더 중요할 수 있음을 시사한다.

T-세포 활성화에 있어서 CD80 및 CD86의 기능을 추가로 조사하기 위해, CD80 및 CD86의 여러가지 키메라 및 결실 돌연변이체 형태(표 3)를 제작하였다. 이들 플라스미드를 HIV-1/Env DNA 면역원과 함께 생쥐에 동시 주사하고, CTL 활성 및 Th1 림포카인 생산을 측정하였다. 키메라 pV80C86T86 및 pCD86(pC80은 아님)은 T-세포의 활성화를 뒷받침하였다(표 4). 이는 CD80 및 CD86의 V-도메인이 T-세포를 활성화시킬 수 있기 때문에 중요하다. 또한, 이들 결과는 CD86의 C-도메인 및 세포질 꼬리부가 T-세포의 활성화를 뒷받침한다는 것을 시시한다. 중요한 것은, 이와 반대되는 키메라 작제물(pV86C80T80)은 항원-특이적 T-세포 자극에 필수적인동시 자극성 신호를 제공하지 못한다는 것이다. 이는 CD80의 C-도메인 및(또는) 세포질 꼬리부가 T 세포 활성화에 중요한 억제 작용을 할 가능성을 높여준다. 이어서, 세포질 꼬리부 또는 C-도메인이 결여된 B7 분자의 결실 돌연변이체를 사용하였다. 이는 상기 분자의 영역의 T-세포 활성화 또는 억제에 대한 작용을 직접 평가할 수 있게 해준다.

생체내에서 CD86의 세포질 꼬리부가 항-바이러스성 CTL 반응 및 Th1 싸이토카인 생산에 절대적으로 필요하다고 알려졌다(표 4). 그러나, 세포질 꼬리부가 결실된 CD80 분자(pV80C80TΔ)가 T-세포 활성화를 유도하지 못했기 때문에, CD80의 C-도메인 또는 세포질 꼬리부에 대한 이 분자의 억제 영역을 지도화할 수 없었다. 이 문제점은 면역원을 코딩하는 유전자와 C-도메인이 결실된 CD80 분자를 코딩하는 유전자를 생쥐에 동시 면역화시킴으로써 해결하였다(도 1, 2A 및 2B). pV80CΔT80 및 pcEnv를 동시 주사한 생쥐에서 T-세포 활성화가 극적으로 증가하였다. CD86의 세포질 꼬리부와 유사하게, CD80의 세포질 꼬리부는 T 세포 활성화에 관련된 것으로 보이며, T-세포 활성화의 억제에 관련되지 않은 것으로 보인다. 세포질 꼬리부는 전문적인 APC의 표면에서 상기 분자의 재분배 및 올리고머 형성에 중요한 기능을 한다. 중요한 것은, CD80으로 형질감염된 세포를 이오노마이신(ionomycin) 및(또는) PMA로 활성화시킨 결과 30 kDa의 인단백질이 CD80의 세포질 꼬리부에 결합한다는 사실이 입증된 것이다. CD80의 가교결합 이후에 티로신에서 유도가능하게 인산화되는, 유사한 크기의 단백질이 보고되었다. 마지막으로, CD86 분자를 촉진시키면 B-세포에서 새로운 면역글로불린 유전자의 발현이 활성화된다고 보고되었다.이러한 결과들은 B7 분자가 거꾸로 APC에 직접 신호를 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 결과들 및 상기 기재된 본 발명이 데이타를 기초로, 본 발명자들은 B7이 APC에 직접 신호를 제공하여 세포성 면역 반응의 활성화 또는 억제에 중요한 특정 분자(싸이토카인, 림포카인, 케모카인 등)의 분비/발현을 유도할 수 있다는 가설을 세웠다. 그러한 분자의 예로는 IL-1α, IL-1β, IL-12 및 TNF 싸이토카인이 포함되며, 이들은 전문적인 APC에 의해 생산되고 면역 활성화에 중요한 기능을 한다. 사실상, 최근에 이들 싸이토카인은 DNA 동시 면역화 동안에 체액성 및 세포성의 항-바이러스성 면역 반응을 조절한다고 직접적으로 입증되었다.

다른 중요한 관찰은, CD80의 C-도메인(CD86의 C-도메인은 아님)이 어떠한 방식으로든 T-세포의 동시 자극성을 억제한다는 것이다. 적어도 C-도메인이 결실된 돌연변이체는 본 발명의 실험에서 T-세포 활성화를 상당히 증가(도 1, 2A 및 2B)시킨 반면, 야생형에서는 그렇지 않았다(표 4). 최근 연구에 의하면, T-세포의 불활성화의 메카니즘은 CTLA-4를 통한 TCR 사슬과의 상호작용에 의해 매개된다는 것이 입증되었다. 따라서, 본 발명의 실험은 CD80의 V- 및 C-도메인이 CTLA-4 결합에 필수적이며, TCR을 통해 전해지는 그 이후의 억제 신호는 동시에 전달되는 CD28 활성화 신호를 능가한다는 것을 시사한다. 이 가설을 직접 시험하기 위해, DNA 면역원 및 CD80 및 CD86 분자의 조합으로 동물을 동시 면역화시켰다. DNA 면역원과 함께 pCD80과 pCD86을 동시 주사하면, pCD86의 동시 자극 이후에 정상적으로 나타나는 강력한 항-바이러스성 CD8⁺CTL 반응이 없어졌다(도 3, 4). 중요한 것은 C-도메인이 결실된 형태의 CD80 분자는 이 억제 신호를 생성하지 않는다는 것이다(도 3). 따라서, CD80의 V-와 C-도메인 모두를 발현하는 분자는 T-세포의 활성화를 방지(CTLA-4에 대한 우선적인 결합을 통해 나타나는 것 같음)할 뿐만 아니라, CD80 및 CD86의 V-도메인에 의해 CD28 리간드를 촉진시킴으로써 제공되는 양성 신호를 극복할 수 있다. 사실상, 활성화 경로가 동시성 CTLA-4 가교결합의 결과 직접 억제되는 CD28보다 CTLA-4의 신호전달이 더 우수하다고 입증된 바 있다.

CD80 분자는 CD28과 CTLA-4 모두에 결합할 수 있기 때문에, CD28 활성화 경로보다 CTLA-4 억제 경로를 선호하도록 평형을 이동시키는 중요한 구조적 차이가 있을 것이다. 표면 플라스몬 공명 분석으로 CTLA4와 CD80 사이의 결합이 14배 증가함을 측정하였다. CTLA-4와 B7의 다가 상호작용이 쉽게 일어나기 때문에, 이 차이는 실제로 더 클것 같다. CD80과 결합한 CTLA-4 각 성분의 해리 속도는 모노머 해리 속도와 유사하다. 그러나, CD80은 제2 CTLA-4 상호작용에 의해 결합상태가 유기되기 때문에, 관찰된 해리 속도는 훨씬 더 느릴 것이고, 따라서 더 안정한 CTLA-4/CD80 복합체를 형성할 것이다. 따라서, 막결합 CD80 또는 막결합 CD80의 C-도메인이 결실된 돌연변이체에 대한 막결합 CTLA-4의 결합력의 차이를 계산하면 14배가 될 것이다. 이 데이타는 CD80의 C-도메인이 T-세포 활성화를 방지할 뿐만 아니라, CTLA-4와 CD80의 구조 기능 관계를 변화시킨다는 것을 의미한다.

CD80의 C-도메인이 결실된 돌연변이체를 코딩하는 유전자의 발현은 T-세포의 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 실험 동물 근육으로의 거대한 침윤을 유도한다. 이 침윤은 pCD86과 pcEnv의 동시 발현 이후에 관찰되는 침윤보다 훨씬 더 크다(도 5).최근에 인간 근육 세포의 시험관내 APC 활성이 보고되었다. 싸이토카인으로 활성화된 이후에, 인간 근모세포는 동시 자극성 분자들을 발현할 수 있고, 전문적인 MHC 클래스 Ⅱ로 한정된 APC로서 기능할 수 있다. 또한, T-세포 활성화에 있어서 근육 세포의 생체내 효과가 입증되었다. CD86(CD80 분자는 아님)의 발현에 의해 생쥐 근육 세포를 MHC 클래스 Ⅰ으로 한정된 APC로 전환시켰다. 본원에 기록된 데이타는, pcEnv로의 DNA 면역화가 주사된 부분으로 면역수용성 세포의 침윤을 다소간 유도한다는 것을 보여주는 것으로 해석할 수 있다. 이들 침윤 T 세포는 CD86 분자 뿐만 아니라 MHC 클래스 Ⅰ 분자 및 외부 펩티드를 발현하는 형질감염 근육 세포에 의해 활성화될 수 있다. 활성화된 T-세포는 케모카인을 생산하고, 염증 부위에 더 많은 T-세포를 모이게 한다. 따라서, pcEnv + pCD86으로 동시 면역화시킨 경우에 근육 조직에서 거대한 침윤이 관찰된다(도 5). DNA 면역원과 pV80CΔT80으로 동시 면역화된 후에도 동일한 메카니즘이 적용될 것이다. 그러나, pCD80과 pcEnv의 동시 투여는 실험 동물의 근육 조직에서 다소간의 침윤만을 유도하였다. CD80 분자가 CD28과 CTLA-4 모두에 결합할 수 있다는 것을 고려하면, CD28 활성화 경로보다 CTLA-4 억제 경로를 선호하도록 평형을 이동시키는 힘이 있음에 틀림없다. 야생형 CD80으로 형질감염된 근육 세포에 CD80의 C-도메인이 존재하면, 이 조직에서 활성화된 림프구의 침윤 및(또는) 증식에 대해 매우 이른 시기의 억제 효과가 나타나는 것 같으며, 이는 CTLA-4에 대한 우선적인 결합 및 CTLA-4를 통한 신호전달을 반영하는 것이다. 따라서, 주사 부위에서의 T-세포는 케모카인을 생산하지 않을 것이며, 면역화 부위에서 다른 림프구의 이동을 유도하지 않을 것이다(도 5).중요한 것은, CD28에 대항하여 CTLA-4와 상호작용함으로써 동시 자극성 분자들이 우선적으로 기능하는지의 여부가 평가되지 않았고, 이 상호작용에 대한 구조적 기초가 아직 불명확하다는 것이다.

초기에는 다수의 연구 그룹이 B7과 CD28/CTLA-4 분자의 구조 기능 관계를 조사하는 부위 지정 돌연변이 유발 실험의 결과를 보고하였다. 총괄적으로, 이들 연구 결과는 CD80의 V- 및 C-도메인 상의 20개 이상의 잔기가 CTLA-4 결합에 중요함을 암시하였다. 그러나, CTLA-4 및 CD28에 대한 CD80 분자의 상호작용에 중요한 영역은 정확히 규정되지 않았다. 생쥐의 비장 및 림프절은 C-도메인이 결여된 다른 스플라이스(spliced) 형태의 CD80을 갖는 것으로 나타났다. 자연적으로 합성된 IgV 분자는 CTLA-4에 대한 결합이 현저하게 억제됨에도 불구하고 (CD80에 비해) CD28=Ig에 매우 잘 결합한다. 또한, CD80 분자의 C-도메인을 결실시키면 CD28=Ig보다 CTLA-4=Ig에 대한 결합에 더 큰 영향을 미친다고 하나 이상의 연구 그룹에서 입증하였다. 중요한 것은, CD80의 IgV-유사 영역이 시험관내에서 활성화된 T-세포의 증식을 활성화시킬 수 있다는 것이다. CD80의 C-도메인이 결실된 분자에 의해 제공되는 효과적인 동시 자극을 나타내는 생체내 데이타는 이러한 결과를 지지한다. CD80의 C-도메인을 발현하는 동시 자극성 분자들의 억제성에 대해 어떤 설명을 하려면, CD28보다 CTLA-4에 의한 CD80 결합력이 증가되었다는 사실을 고려해야 한다. 최근 측정 결과, 다이머 CTLA-4에 대한 CT80의 결합력이 다이머 CD28에 대한 결합력보다 훨씬 크다는 것을 알았다. 중요한 것은, 다이머 CTLA-4가 CD86보다 더 높은 결합력으로 CD80에 결합한다는 것이다. 이와 같이 더 큰 결합 강도를 고려하면, CTLA-4에 의해 유도된 억제 신호가 실험 시스템에서 우세한 이유를 설명할 수 있을 것이다. CD80과 CD86의 CTLA-4 결합 영역에 있어서의 중요한 차이점을 더 밝혀내기 위해, 본 발명자들은 두 가지 분자에 대한 3차원 모델을 제작하였다.

CD80 C-도메인의 3차원 모델과 돌연변이 유발 연구의 상호관계는 수용체 결합에 대한 통찰력을 제공한다. CD80과 CD86 모두는 Ig의 폴드부위(fold)와 서열 상동성을 나타내며, 이는 상기 두 분자가 모두 유사한 구조를 하고 있음을 시사한다(표 6). 따라서, 대부분의 돌연변이 유발 분석은 인간과 생쥐의 CD80 사이에 보존된 잔기의 변화 및 CD80과 CD86 사이에 보존된 잔기의 변화에 초점을 맞추고 있다. CD80의 C 도메인에 나타나는 몇몇 보존적 잔기들은 CTLA-4=Ig에 대한 결합에 중요한 것 같다(표 6).

Q157, D158, E162 및 L163이 가닥 D와 E 사이 및 가닥 E의 시작 부위의 루프에서 도메인의 아미노-말단 부근의 표면 접근가능한 위치에서 공간적으로 클러스터링되는 모델을 구축하였다. 다른 잔기들(F108, P111 및 I113)은 가닥 A에 지도화되었다(표 6 참조). 또한, 돌연변이 분석을 기초로 제작된 두 번째 모델은 CTLA-4 결합에 B-C 루프의 P135 및 P137 뿐만 아니라 D-E 루프의 Q157, D158 및 P159가 중요한 작용을 한다는 것을 입증하였다. 총괄적으로, 수용체 결합에 중요한 잔기들은 IgC 도메인의 ABCED 면에 지도화되었다.

도 6은 CTLA-4 결합 영역의 잔기들이 CPK로 표시되는 CD80 분자의 Cα 흔적(trace)을 나타내며, 여기에 B-C 루프 아미노산인 P135와 P136 및 D-E 루프 잔기인 Q157, D158, P159가 표시되어 있다. 이와 상응하는 CD86의 모델에서, 표 6및 도 6에 이탤릭체로 표시된 4개의 잔기(144-147, KKMS)가 삽입되어 있다. 이와 같은 CD86에서의 삽입은 CD80과 비교시 이 분자에서 B-C 루프의 구조를 변화시키고, 그 결과 결합 영역이 현저히 작아진다. 삽입으로 인해, P159와 P135 사이의 거리는 CD80에서의 16Å에서 CD86의 상응하는 잔기에서의 12Å으로 감소한다. 또한, Q157과 P137 사이의 거리는 CD80에서의 13Å에서 CD86의 상응하는 잔기에서의 10Å으로 감소한다. 따라서, 이 삽입은 CD80과 비교시 CD86 분자의 B-C 루프 구조를 변화시키고, 그 결과 CD86 분자에서의 CTLA-4 전체 표면 결합 영역이 CD80의 동일한 영역보다 현저히 작아지게 한다(도 6 비교). 따라서, CD80과 CD86의 모델은 이들 분자의 B-C 루프 구조가 상이함을 시사하고, CTLA-4에 대한 결합력의 감소에 있어서 CD86의 KKMS 삽입체가 중요한 역할을 함으로써 T-세포를 표적으로 하는 억제 신호를 감소시킬 수 있음을 시사한다.

요컨대, CD80의 V- 및 C-도메인의 결합/기능 부위에 관한 불일치 및 CTLA-4 및(또는) CD28 리간드에 대한 CD86 분자의 낮은 결합력은 서로 다른 실험실에서 사용된 상이한 항원 및 실험 시스템에 의해 설명할 수 있다. 예를 들면, T-세포 동시 자극에 관한 다수의 실험 결과는 항-CD3 모노클로날 항체(1차 신호) 및 가용성 형태의 B7(CD80=Ig, CD86=Ig) 분자(2차 신호)를 사용하여 얻었다. 그러나, 최근 공개된 결과는 올리고머 형태의 동시 자극성 분자를 발현하는 세포만이 T-세포 활성화를 유도할 수 있다고 주장하였다. 한편, T 세포의 동시 자극을 위해 CD80 및 CD86이 형질감염된 세포를 사용하는 경우 조차도 최적 모델로서 간주되지 않을 수도 있다. 항-CD3 및 막결합 CD80 분자로 개시한 후에 CTLA-4가 TCRζ와 상호작용한다고 보고되었다. 이들 결과는 적합한 모델이 아마도 MHC 클래스 Ⅰ/Ⅱ를 발현하는 APC와 TRC 및 CD28/CTLA-4를 발현하는 T-세포의 상호작용을 포함해야 한다는 것을 시사한다. 따라서, APC와 T-세포의 상호작용을 위한 생체내의 생리적 조건은 T-세포 동시 자극의 메카니즘(들)을 알아내는데 더 적합할 것이다. 이 모델 시스템을 이용하여, CD80과 CD86 사이의 기능적 차이 및 CD80 분자의 V-도메인과 C-도메인의 기능적 차이를 입증하였다.

현행 연구는 T-세포 면역 반응의 조절에 대한 새로운 접근법의 개발을 위한 중요한 정보를 제공하고 있다. 구체적으로는, 항원 특이적 T-세포에서 발현되는 CTLA-4를 우선적으로 촉진시킴으로써 진행중인 인간 면역 반응을 불활성화시킬 수 있는 V- 및 C-도메인을 포함하는 형태의 B7 리간드가 제공될 수 있다. 그러한 작제물은 이식에 대한 허용 또는 자가면역성 질환의 치료에 중요하게 적용될 수 있다. 반대로, 보다 효과적인 종양 백신접종은 T-세포 활성화 능력이 감소된 CD80의 V-도메인을 통한 동시 면역화로부터 기인할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 분자 면역보강제를 이용하여 개선된 세포성 면역력을 표적으로 하는 백신을 제공할 수 있다.

피코르나바이러스과속: 리노바이러스: (의학) 감기 원인의 ~50%를 차지.엔테로바이러스: (의학) 폴리오바이러스, 콕사키에바이러스, 에코 바이러스, 및 인간 엔테로바이러스(예: A형 간염 바이러스) 포함.압토바이러스: (수의학) 다리 및 구강 질환 바이러스가 있음.표적 항원: VP1, VP2, VP3, VP4, VPG

칼시바이러스과속: 노르워크 군의 바이러스: (의학) 이 바이러스들은 유행성 위장염의 중요한 원인 물질임.

토가바이러스과속: 알파바이러스: (의학 및 수의학) 예로는 세닐리스 바이러스, 로스리버바이러스, 및 이스턴 ＆ 웨스턴 말 뇌염 바이러스가 포함.레오바이러스: (의학) 루벨라 바이러스

플라비바이러스과예로는 (의학) 뎅기, 황열, 일본 뇌염, 세인트루이스 뇌염 및 진드기 매개의 뇌염 바이러스가 포함.C형 간염 바이러스: (의학) 이 바이러스는 아직 특정 바이러스과에 속하지 않지만, 토가바이러스 또는 플라비바이러스 중 하나일 것으로 생각됨. 토가바이러스과와 가장 유사.

코로나바이러스과: (의학 및 수의학)감염성 기관지염 바이러스(가금), 돼지의 전염성 위장염 바이러스(돼지),돼지의 응집성 뇌척수염 바이러스(돼지), 고양이과 감염성 복막염 바이러스(고양이)고양이과 장성 코로나바이러스(고양이), 개과 코로나바이러스(개). 인간의 호흡기코로나바이러스는 감기 원인의 ~40%임. EX. 224E, 0C43.주의-코로나바이러스는 A, B 또는 C형 이외의 간염을 유발할 수 있음.표적 항원: E1 - M 또는 매트릭스 단백질이라고도 불리움.E2 - S 또는 스파이크 단백질이라고도 불리움.E3 - HE 또는 헤마글루틴-엘테로스 당단백질이라구도 불리움(모든 코로나 바이러스에 존재하지는 않음).N - 뉴클레오캡시드

라브도바이러스과속: 베실리오바이러스리사바이러스: (의학 및 수의학) 광견병표적 항원: G 단백질, N 단백질

필로바이러스과: (의학) 마르버그 및 에볼라 바이러스와 같은 출혈열 바이러스

파라믹소바이러스과속: 파라믹소바이러스: (의학 및 수의학) 이하선염 바이러스, 뉴캐슬 질환바이러스(닭에서 중요한 병원체)모르빌리바이러스: (의학 및 수의학) 개과의 급성 홍역뉴민바이러스: (의학 및 수의학) 호흡기 신시티움 바이러스

오르토믹소바이러스과(의학)인플루엔자 바이러스

붕가바이러스과속: 붕가바이러스: (의학) 캘리포니아 뇌염, LA 크로스(Crosse)플레보바이러스: (의학) 리프트계곡열한타바이러스: 푸레말라(Puremala)는 헤마하진열 바이러스이다.나이르바이러스: (수의학) 나이로비 양 질환또한, 분류되지 않은 많은 붕가바이러스가 있다.

아레나바이러스과(의학) LCM, 라사열(Lassa fever) 바이러스

레오바이러스과속: 레오바이러스: 가능한 인간 병원체로타바이러스: 아동에서의 급성 위장염오르비바이러스: (의학 및 수의학) 콜로라도 진드기열,레봄보(Lebombo) (인간) 말 대뇌증, 청설

레트로바이러스과아과: 온코리바이러스아과: (수의학)(의학) 고양이과 백혈병 바이러스,HTLVⅠ 및 HTLVⅡ렌티바이러스아과: (의학 및 수의학) HIV, 고양이과 면역결핍 바이러스,말 감염증, 빈혈증 바이러스스푸마바이러스아과

파포바바이러스과아과: 폴리오마바이러스: (의학) BKU 및 JCU 바이러스아과: 파필로마바이러스: (의학) 많은 바이러스형이 암 또는 유두종의 악성전이와 관련됨.

아데노바이러스 (의학)EX AD7, ARD, O.B. - 호흡기 질환 유발, 275와 같은 일부 아데노바이러스는장염을 유발함.

파르보바이러스과(수의학)고양이과 파르보바이러스: 고양이 장염을 유발고양이과 판류코페니바이러스개과 파르보바이러스돼지의 파르보바이러스

허피스바이러스과아과: 알파허피스바이러스속: 심플렉스바이러스: (의학) HSVⅠ, HSVⅡ바리셀로바이러스: (의학-수의학) 의사광견병(pseudorabies)-수두 대상포진아과: 베타허피스바이러스속: 거대세포바이러스: (의학) HCMV뮤로메갈로바이러스아과: 감마허피스바이러스속: 림포크립토바이러스: (의학) EBV - (버키트 림포)라디노바이러스

폭스바이러스과아과: 코르도폭스바이러스아과 (의학 및 수의학)속: 바리올라(천연두), 백시니아(우두), 파라폭스바이러스(수의학)오이폭스바이러스(수의학), 카프리폭스바이러스, 레포리폭스바이러스,수이폭스바이러스아과: 엔테모폭스바이러스아과

헤파드나바이러스과: B형 간염 바이러스

비분류: 델타 간염 바이러스

세균성 병원체병원성 그람-양성 구균에는 뉴모코커스, 스타필로코커스 및 스트렙토코커스가포함된다. 병원성 그람-음성 구균에는 메닝고코커스 및 고노코커스가 포함된다.병원성 장성 그람-음성 간상균에는 엔테로박테리아세, 슈도모나스, 아시네토박테리라 및 에이케넬라, 멜리오이도시스, 살모넬라, 쉬겔로시스, 헤모필러스, 찬크로이드, 브루셀로시스, 툴라레미아, 예르시니아(파스테우렐라), 스트렙토바실러스모닐리포르미스 및 스피릴룸, 리스테리아 모노사이토제네스, 에리시펠로트릭스 루시오파티애, 디프테리아, 콜레라, 안트락스, 도노바노시스(서혜부 육아종), 및바르토넬로시스가 포함된다.병원성 혐기성 세균에는 테타누스, 보툴리즘, 기타 클로스트리디아, 투베르쿨로시스, 레프로시, 및 기타 미코박테리아가 포함된다. 병원성 파상균 질환에는 매독,트레포네마토시스, 딸기종, 핀타 및 풍토성 매독, 및 렙토스피라병이 포함된다.고등 병원체 세균 및 병원성 진균에 의해 유발되는 기타 감염에는 방선균증, 노카르디아증, 효모균증, 블라스토미세스증, 히스토플라스마증 및 콕시디오이데스진균증, 칸디다증, 아스페르길루스증, 및 모균증, 스포로트리쿰증, 파라콕시디오이드진균증, 페트리엘리디움병, 토룰롭시스증, 진균증 및 색소진균증, 및 피부사상균증이 포함된다.리케티아성 감염에는 리케치아감염 및 리케치아증이 포함된다.미코플라스마 및 클라미디아성 감염의 예로는 미코플라스마 뉴모니애, 림포그래눌로마 베네레움, 시타코시스, 및 출생전후 클라미디아 감염이 포함된다.

병원성 진핵생물병원성 원생생물 및 그에 의한 기생충 및 감염에는 아메바병, 말라리아, 리슈마니아증, 트리파노소마증, 톡소플라스마증, 뉴모시스티스 카리니, 바베시아증, 편모충증, 선모충증, 사상충증, 주혈흡충증, 선충, 디스토마 또는 흡충류, 및 촌충류(촌충) 감염이 포함된다.

랑뮈어(Langmuir) 모델에 대한 적합도로부터 예측된 CTLA-4/CD80 상호작용의 결합 파라미터

CD80 유형	k_on(l/Ms)	k_off(l/s)	K_D(M)
야생형 CD80	3.99×10⁵	2.00×10^-4	5.02×10^-10
C-도메인이 결실된 CD80	7.86×10⁴	5.53×10^-4	7.04×10^-9

Claims

80V와 86V 중 어느 하나를 포함하거나 둘 모두를 포함하고, 임의로 86C, 80tm, 86tm, 80ct 및 86ct 중 하나 이상을 포함할 수 있는,

(여기서, 80V는 CD80의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

86V는 CD86의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

86C는 CD86의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

80tm은 CD80의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

86tm은 CD86의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

80ct는 CD80의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이며,

86ct는 CD86의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편임)

80V, 80tm 및 80ct 중 하나 이상을 포함하고 80C가 없는 단리된 단백질.
제1항에 있어서,

80V가 CD80의 가변 도메인이고,

86V가 CD86의 가변 도메인이고,

86C가 CD86의 C 도메인이고,

80tm이 CD80의 막횡단 영역이고,

86tm이 CD86의 막횡단 영역이고,

80ct가 CD80의 세포질 꼬리부이며,

86ct가 CD86의 세포질 꼬리부인 단리된 단백질.
제1항에 있어서, R¹-R²-R³-R⁴-R⁵-R⁶-R⁷-R⁸-R⁹(상기 식에서, R¹은 0-50개의 아미노산이고, R²는 80V 또는 86V이고, R³는 0-50개의 아미노산이고, R⁴는 86C 또는 0개의 아미노산이고, R⁵는 0-50개의 아미노산이고, R⁶는 80tm 또는 86tm이고, R⁷은 0-50개의 아미노산이고, R⁸은 80ct 또는 86ct이며, R⁹은 0-50개의 아미노산임)의 화학식을 갖는 단리된 단백질.
제3항에 있어서, R¹이 0-25개의 아미노산이고, R³가 0-25개의 아미노산이고, R⁵가 0-25개의 아미노산이고, R⁷이 0-25개의 아미노산이며, R⁹이 0-25개의 아미노산인 단리된 단백질.
제3항에 있어서, R¹이 0-10개의 아미노산이고, R³가 0-10개의 아미노산이고, R⁵가 0-10개의 아미노산이고, R⁷이 0-10개의 아미노산이며, R⁹이 0-10개의 아미노산인 단리된 단백질.
제1항에 있어서, 80V/dele/80tm/80ct, 80V/dele/80tm/86ct,80V/dele/86tm/80ct, 86V/dele/80tm/80ct, 86V/dele/80tm/86ct, 86V/dele/86tm/80ct, 80V/dele/86tm/86ct, 80V/86C/80tm/80ct, 80V/86C/80tm/86ct, 80V/86C/86tm/80ct, 86V/86C/80tm/80ct, 86V/86C/80tm/86ct, 86V/86C/86tm/80ct, 80V/86C/86tm/86ct, 80V/dele/80tm/dele, 80V/dele/86tm/dele, 86V/dele/80tm/dele, 80V/86C/80tm/dele, 80V/86C/86tm/dele, 86V/86C/80tm/dele, 86V/86C/80tm/dele, 86V/86C/dele/80ct, 80V/86C/dele/80ct, 80V/dele/dele/80ct, 86V/dele/dele/80ct, 80V/86C/dele/dele 및 80V로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단백질 부분 및 면역원성 부분을 포함하는 키메라 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질, 및 면역원성 단백질 또는 면역원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하며 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 상태로 포함하는 핵산 분자.
제9항의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드.
제10항에 있어서, 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원 코딩 서열을 더 포함하는 플라스미드.
제10항 또는 제11항의 플라스미드를 포함하며, 면역원성 단백질 또는 면역원을 코딩하며 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열이 포함된 핵산 분자를 포함하는 플라스미드를 더 포함하는 조성물.
제9항의 핵산 분자가 포함된 조성물을 포함하는 재조합 백신 또는 독성약화 백신.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 물질을 포함하는 재조합 백신 조성물 또는 독성약화 백신 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 물질을 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 물질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 면역원에 대해 개체를 면역화시키는 방법.
제16항에 있어서, 상기 면역화가 예방 목적인 방법.
제16항에 있어서, 상기 면역화가 치료 목적인 방법.
제16항에 있어서, 상기 면역원이 알레르겐(allergen)인 방법.
제16항에 있어서, 상기 면역원이 병원성 항원인 방법.
제16항에 있어서, 상기 면역원이 자가면역성 질환과 관련된 항원인 방법.
제16항에 있어서, 상기 면역원이 과다증식성 질환과 관련된 항원인 방법.
적어도 CD80의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 단리된 비-CD80 단백질.
제23항에 있어서, 적어도 CD80의 C 도메인을 포함하는 단리된 비-CD80 단백질.
제23항에 있어서, R¹-R²-R³-R⁴-R⁵-R⁶-R⁷-R⁸-R⁹(상기 식에서, R¹은 0-50개의 아미노산이고, R²는 80V 또는 86V이고, R³는 0-50개의 아미노산이고, R⁴는 80C이고, R⁵는0-50개의 아미노산이고, R⁶는 80tm 또는 86tm이고, R⁷은 0-50개의 아미노산이고, R⁸은 80ct 또는 86ct이며, R⁹은 0-50개의 아미노산이고, 여기서 80V는 CD80의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고, 86V는 CD86의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고, 80C는 CD80의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편이고, 80tm은 CD80의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고, 86tm은 CD86의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고, 80ct는 CD80의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이며, 86ct는 CD86의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편임)의 화학식을 갖는 단리된 비-CD80 단백질.
제25항에 있어서, R¹이 0-25개의 아미노산이고, R³가 0-25개의 아미노산이고, R⁵가 0-25개의 아미노산이고, R⁷이 0-25개의 아미노산이며, R⁹이 0-25개의 아미노산인 단리된 단백질.
제25항에 있어서, R¹이 0-10개의 아미노산이고, R³가 0-10개의 아미노산이고, R⁵가 0-10개의 아미노산이고, R⁷이 0-10개의 아미노산이며, R⁹이 0-10개의 아미노산인 단리된 단백질.
제23항에 있어서,

R-dele-R-80C-R-80tm-R-80ct-R,

R-dele-R-80C-R-80tm-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-80tm-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-dele-R-dele-R,

R-86V-R-80C-R-80tm-R-80ct-R,

R-86V-R-80C-R-80tm-R-dele-R,

R-86V-R-80C-R-dele-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-86tm-R-80ct-R,

R-dele-R-80C-R-86tm-R-80ct-R,

R-dele-R-80C-R-86tm-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-86tm-R-dele-R,

R-80V-R-80C-R-80tm-R-86ct-R,

R-dele-R-80C-R-80tm-R-86ct-R,

R-86V-R-80C-R-86tm-R-80ct-R,

R-86V-R-80C-R-80tm-R-86ct-R,

R-86V-R-80C-R-86tm-R-dele-R,

R-dele-R-80C-R-86tm-R-86ct-R, 및

R-86V-R-80C-R-86tm-R-86ct로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 가지며, 여기서

80V는 CD80의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

86V는 CD86의 가변 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

80C는 CD80의 C 도메인 또는 그의 기능적 단편이고,

80tm은 CD80의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

86tm은 CD86의 막횡단 영역 또는 그의 기능적 단편이고,

80ct는 CD80의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이고,

86ct는 CD86의 세포질 꼬리부 또는 그의 기능적 단편이고,

dele는 0개의 아미노산이며,

R은 각각 독립적으로 0-100개의 아미노산인 단리된 비-CD80 단백질.
제28항에 있어서, R이 각각 독립적으로 0-50개의 아미노산인 단리된 비-CD80 단백질.
제28항에 있어서, R이 각각 독립적으로 0-30개의 아미노산인 단리된 비-CD80 단백질.
제28항에 있어서, R이 각각 독립적으로 0-20개의 아미노산인 단리된 비-CD80 단백질.
제23항에 있어서,

가변 도메인이 결실된 돌연변이체 CD80,

가변 도메인 및 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

막횡단 영역 및 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 막횡단 영역 및 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 영역이 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

가변 영역 및 세포질 꼬리부가 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

세포질 꼬리부가 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80,

가변 영역이 결실되고 CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80,

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환되었으며 세포질 꼬리부가 결실된 돌연변이체 CD80,

가변 도메인이 결실되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환되었으며 CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80, 및

CD80의 가변 도메인이 CD86의 가변 도메인으로 치환되고 CD80의 막횡단 영역이 CD86의 막횡단 영역으로 치환되었으며 CD80의 세포질 꼬리부가 CD86의 세포질 꼬리부로 치환된 돌연변이체 CD80

으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 비-CD80 단백질.
제23항 내지 제32항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 상태로 포함하는 핵산 분자.
제33항의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드.
제34항의 플라스미드 및(또는) 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는 조성물.
제33항의 핵산 분자가 포함된 조성물을 포함하는 재조합 벡터.
제23항 내지 제36항 중 어느 한 항의 물질을 포함하는 제약 조성물.
제23항 내지 제37항 중 어느 한 항의 물질이 포함된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체의 면역 억제 방법.
제38항에 있어서, 상기 개체가 자가면역성 질환을 앓고 있는 개체인 방법.
제38항에 있어서, 상기 개체가 이식을 받은 경험이 있거나, 이식을 받고 있거나, 또는 조만간 이식을 받으려고 하는 개체인 방법.