MXPA01011079A

MXPA01011079A - Cd80 mutante de humano y composiciones y metodos para hacer y usar las mismas.

Info

Publication number: MXPA01011079A
Application number: MXPA01011079A
Authority: MX
Inventors: Mark Holterman
Original assignee: Univ Pennsylvania
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-27
Publication date: 2002-07-22
Also published as: ATE464910T1; US7446189B1; KR20080052690A; US8202847B2; EP1173204B1; KR20020047032A; EP1173204A1; EP1173204A4; CN1384758A; JP2002542800A; BR0010155A; IL145795A0; AU4494700A; KR100903710B1; DE60044247D1; IL145795A; CA2369747A1; WO2000066162A9; US20110002956A1; AU779395B2

Abstract

Se describen vacunas mejoradas y metodos para usar las mismas. Se describen composiciones inmunosupresoras para tratar a individuos que tengan enfermedades autoinmunes o trasplantes, y metodos para usar las mismas.

Description

CD80 MUTANTE DE HUMANO Y COMPOSICIONES Y MÉTODOS PAIRA HACER Y USAR LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para inmunizar individuos, con composiciones inmunosupresoras, con componentes de las mismas, y con métodos para hacer y usar las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud está relacionada con la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 60/131,764, presentada el 30 de abril de 1999, que está incorporada a la presente como referencia. La CD 28 es una glucoproteína superficial de la célula, que se expresa constitutivamente en la mayoría de las células T y los timocitos maduros, aunque el receptor CTLA-4 no está presente en las células T latentes, y únicamente se puede detectar de 48 a 72 horas después de la activación de las células T. Los ligandos principales para las moléculas CD28/CTLA-4 son B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) que se expresan en la superficie de las células que presentan el antígeno (APC) profesional. No está clara la razón biológica fundamental para la existencia de cuando menos dos receptores (CD28 y CTLA-4) y dos ligandos (CD80 y CD86) . Inicialmente se demostró que los antígenos CD80 y CD86 eran funcionalmente similares. Sin embargo, primeramente se sugirieron diferentes papeles para estas moléculas coestimulantes, cuando se determinaron los diferentes patrones de su expresión. El CD86 se expresa constitutivamente en APC, y después de la activación de APC, la expresión de CD86 se regula ascendentemente rápidamente, seguida por un regreso gradual a los niveles de la línea base. La expresión de CD80 es retardada en comparación con CD86, y su expresión es máxima 48 a 72 horas después del inicio de una respuesta inmune. Debido a que CD86 se expresó constitutivamente y se reguló ascendentemente más temprano que CD80, se sugirió que la expresión de CD86 es importante para la fase temprana de una respuesta inmune, mientras que CD80 es importante para la segunda. Adicionalmente se sugieren diferencias funcionales entre CD80 y CD86, por los datos sobre la cinética de fijación de las moléculas coestimulantes con CD28 y CTLA-4. El análisis de resonancia de plasmon superficial (SPR) ha demostrado que ambos ligandos se fijan a CTLA-4 con mayor avidez que a CD28. Otras mediciones revelaron que el complejo CD86/CTLA-4 se disocia más rápido que el complejo CD80/CTLA-4. Estas diferencias de fijación combinadas con el retardo similar en la expresión de CTLA-4 y CD80 sugieren que la relación funcional entre CTLA-4 y CD80 es probablemente más potente que la relación funcional entre las moléculas CTLA-4 y CD86. También se han reportado múltiples funciones para las moléculas CD80 y CD86 in vi tro e in vivo . Los anticuerpos anti-CD86 pero no anti-CD80, bloquean el desarrollo de la enfermedad en un modelo de ratón de diabetes autoinmune, mientras que se ve el efecto opuesto con estos anticuerpos en un modelo murino de encefalomielitis alérgica experimental. Muchos sistemas experimentales demuestran un papel importante para CD86 para iniciar una respuesta de células T al antígeno, y que la molécula CD80 puede jugar un papel importante para proporcionar señales moduladoras a estas células. Se observó que la expresión de CD86, pero no CD80, humano exógeno proporciona señales de activación importantes a las células T de murino, después de vacunación de ADN con proteínas de envoltura del VIH-1. Se observaron resultados similares después de la inmunización de ratones con ADN que codificaba antígeno de VIH-1 o influenza, y plásmidos que codificaban CD80 y CD86 de murino. De esta manera, las diferencias funcionales entre CD80 y CD86 no estuvieron conectadas con la inmunogenicidad diferencial de las moléculas coestimulantes humanas que se expresan en el organismo del ratón. Se cree que CD86, pero no CD80, de humano o murino exógeno estimula la activación de las células T antivirales durante la inmunización por ADN.

Las vacunas son útiles para inmunizar individuos contra antígenos objetivo tales como antígenos patógenos, o antígenos asociados con células envueltas en enfermedades humanas. Los antígenos asociados con las células envueltas en enfermedades humanas incluyen antígenos de tumores asociados con cáncer, y antígenos asociados con las células envueltas en enfermedades autoinmunes. Al diseñar esas vacunas, se ha reconocido que las vacunas que producen el antígeno objetivo en la célula del individuo vacunado, son efectivas para inducir el arma celular del sistema inmune. Específicamente, las vacunas vivas atenuadas, vacunas recombinantes que usan vectores avirulentos, y las vacunas de ADN llevan, todas, ala producción de antígenos en la célula del individuo vacunado, lo que da como resultado la inducción del arma celular del sistema inmune. Por otra parte, las vacunas de subunidad, que comprenden únicamente proteínas, y las vacunas muertas o inactivadas inducen respuestas humorales, pero no inducen buenas respuestas inmunes celulares . Frecuentemente es necesaria una respuesta inmune celular para proporcionar protección contra la infección por patógenos, y para proporcionar terapia inmuno - mediada efectiva para el tratamiento de la infección por patógenos, cáncer, o enfermedades autoinmunes. De conformidad con lo anterior, frecuentemente se prefieren las vacunas que producen el antígeno objetivo en la célula del individuo vacunado, tales como vacunas vivas atenuadas, vacunas recombinantes que usan vectores avirulentos, y vacunas de ADN. Aunque esas vacunas frecuentemente son efectivas para inmunizar individuos profiláctica o terapéuticamente contra la infección por patógenos ? enfermedades humanas, existe la necesidad de vacunas mejoradas. Existe la necesidad de comparaciones y métodos que produzcan una respuesta inmune mejorada. La terapia de genes, en contraste con la inmunización, usa moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas no inmunógenas, cuya expresión confiere un beneficio terapéutico a un individuo a quien se administren las moléculas de ácido nucleico. Un tipo específico de terapia de genes se relaciona con la aplicación de material genético que codifique proteínas no inmunógenas, que modulen las respuestas inmunes en el individuo, y de esta manera confieran un beneficio terapéutico. Por ejemplo, se pueden diseñar protocolos para aplicar material genético que codifique proteínas no inmunógenas, que regulen descendentemente las respuestas inmunes asociadas con una enfermedad autoinmune en un individuo, y así confieran un beneficio terapéutico al individuo. Existe la necesidad de composiciones y métodos que se puedan usar en protocolos de terapia de genes, para modular las respuestas inmunes. La modulación de las respuestas inmunes por medio de medios alternativos es igualmente deseable para tratar enfermedades tales como enfermedad autoinmune y rechazo de células/tejido/órgano. Existe la necesidad de composiciones y métodos que se puedan usar para modular las respuestas inmunes, y para diseñar y descubrir composiciones útiles para modular las respuestas inmunes .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los datos de los experimentos descritos en el Ejemplo, que muestra las respuestas de CTL antivirales específicas al antígeno. Las Figuras 2A y 2B muestran los datos de experimentos descritos en el Ejemplo, que muestran la producción de linfocina inducida por diferentes construcciones . La Figura 3 muestra los datos de los experimentos descritos en el Ejemplo, que muestra la actividad de CTL después de la administración de las construcciones. La Figura 4 muestra los datos de los experimentos descritos en el Ejemplo, que muestra la actividad de CTL después de la administración de las construcciones, medida después de la remoción de esta población de células. La Figura 5 son fotografías de los experimentos descritos en el Ejemplo, que muestran la infiltración de los linfocitos dentro del músculo de ratones inmunizados con construcciones . La Figura 6 es una representación gráfica de la molécula CD80.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN Los solicitantes han descubierto que la región C del CD80 humano es responsable de transmitir una señal negativa cuando un antígeno que presenta la célula (APC) interactúa con una célula T. La señal negativa da como resultado una reducción en la actividad de la célula T, y de esta manera una reducción en la respuesta inmune generada contra el antígeno presentado por la APC a la célula T. Específicamente, la interacción entre un receptor de células T (TCR) en una célula T con un complejo de MHC/antígeno, que se ha formado en una APC mediante la formación de un complejo entre una proteína de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) , y un antígeno, está acompañada por la interacción entre las moléculas coestimulantes CD80 y CD86 presentes en la APC, con las moléculas CD28 en la célula T. Esa interacción da como resultado la activación de las células T, y una respuesta inmune elevada. Sin embargo, después de la activación de las células T, las células T expresan CTLA4. CTLA4 interactúa con CD80, y esa interacción da como resultado una señal negativa dominante que elimina el efecto coestimulante previo provocado por la interacción de CD80 y CD86 con CD28. El resultado de la interacción de CD80 con CTLA4 es una reducción en la respuesta inmune con la cual están envueltas las células T. El descubrimiento de los solicitantes proporciona dos aspectos distintos de la invención. De conformidad con un aspecto de la invención, se proporcionan mutantes de CD80 y los ácidos nucleicos que codifican los mismos, los cuales poseen la actividad coestimulante de CD80, pero que no transmutan la señal negativa asociada con la interacción de CD80 con CTLA4. Esos mutantes de CD80 son útiles en los protocolos de inmunización en los cuales se aplican éstos, como proteínas o ácidos nucleicos que codifican esas proteínas, junto con los inmunógenos que se aplican como inmunógenos de proteínas o moléculas de ácido nucleico que codifican inmunógenos. Los mutantes de CD80 de este aspecto de la invención son auxiliares moleculares en protocolos de inmunización. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporcionan mutantes de CD80 y los ácidos nucleicos que codifican los mismos, los cuales poseen la región C de CD80, de tal manera que éstos transmutan la señal negativa asociada con la interacción de CD80 con CTLA4. Esos mutantes de CD80 son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, y protocolos de inmunosupresión asociados con transplantes de células, tejidos y órganos. Los mutantes de CD80 que proporcionan la señal negativa se pueden aplicar como proteínas o ácidos nucleicos que codifican esas proteínas. Los mutantes de CD80 de este aspecto de la invención son productos terapéuticos autoinmunes/ inmunosupresores . Son bien conocidas las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de CD80 humana, y se establecen en Freeman y colaboradores (1989) J. Immunol . 143 (8) : 2714-2722 , Selvakumar y colaboradores (1992) Immunogenetics 36 (3) : 175-181, Freeman y colaboradores (1991) J. Ex. Med. 174 (3) : 625-631, Lanier y colaboradores (1989) J. Immunol . 154 (1) : 97-105 , y código de acceso del Genbank P33681 (www.ncbi.nlm.nih.gov), que están incorporados a la presente como referencia. La CD86 (B7.2) primero se describió en Azuma, M. y colaboradores 1993 Nature 366:76-79, que está incorporado a la presente como referencia. La Figura 2Bde esa publicación describe la secuencia de nucleótidos y aminoácidos predicha de la proteína B7.2. la información sobre la secuencia también está disponible en la base de datos del Genbank como U04343, que está incorporada a la presente como referencia. La CD80 humana se expresa como una proteína de 288 aminoácidos (1-288) , que se procesa a una proteína madura (35-288). La CD80 se divide en cuatro regiones: la región variable (V) , la región constante (C) , la región de transmembrana (tm) , y la región de cola citoplásmica (CT) . Los aminoácidos 35-242 conforman el dominio extracelular de la proteína, los aminoácidos 43-123 conforman la región V, a la que también se hace referencia como el dominio tipo V parecido a Inmunoglobulina. Los aminoácidos 155-223 conforman la región C, a la que también se hace referencia como el dominio tipo C2 parecido a Inmunoglobulina. Los aminoácidos 243-263 conforman la región de transmembrana. Los aminoácidos 264-288 conforman la cola citoplásmica. Como se usan en la presente, los términos "mutantes de CD80", "mutantes de CD80 de región C" , "mutantes de CD80 deficientes en región C" y mutantes de CD80?" se usan intercambiablemente, y se quiere que se refieran a las moléculas que contienen una región funcional ya sea CD80 ó CD86, cuando menos una región funcional no C de CD80, y que estén libres de una región funcional C de CD80, de tal manera que, a través de la ausencia de toda o parte de la región C, esas moléculas no transmuten la señal negativa asociada con las interacciones de la región C de CD80 de tipo silvestre con CTLA4. Como se usan en la presente, las referencias a una "región funcional de CD80" como se usa en las frases a "cuando menos una región funcional no C de CD80" y "región funcional C de CD80" se quiere que se refieran a las regiones ^^^^-^¡j^egi de proteínas completas de CD80, así como a las regiones parciales que retienen la actividad de la región completa. Por ejemplo, una región funcional V de CD80 se refiere a los aminoácidos 43-123 de CD80 o un fragmento de los mismos, incluyendo las proteínas que incluyen otras secuencias, incluyendo pero no limitándose a otras secuencias de CD80, que retienen la habilidad para fijarse a CD28. Una región funcional C de CD80 se refiere a los aminoácidos 155-223 de CD80 o un fragmento de los mismos, incluyendo proteínas que incluyen otras secuencias que incluyen pero no se limitan a otras secuencias de CD80, que retienen la habilidad para fijarse a CDLA-4 y transmutan una señal negativa. De esta manera, una proteína libre de una región funcional C de CD80 puede contener un fragmento de los aminoácidos 155-223 de CD80, peso ese fragmento no se fija a CDLA-4 y transmuta una señal negativa. Las proteínas similares libres de una región funcional C pueden incluir los aminoácidos 155-223, si se cambian las secuencias adyacentes para producir la región C no funcional a través de cambios de conformación u otros cambios. Una tm funcional de CD80 se refiere a los aminoácidos 243-263 de CD80 o un fragmento de los mismos, que retiene el ancla a una proteína CD80 mutante que comprende a éste dentro de la membrana de la célula, y mediante lo mismo evita la secreción. Una ct funcional de CD80 se refiere a los aminoácidos 264-288 de CD80 o cualquier fragmento de los 1 mismos, que se retiene en el citoplasma cuando se expresa la proteína CD80 mutante. Como se usan en la presente, los términos "proteínas CD80 de región"1" C" y "proteínas de región C" se usan intercambiablemente, y se quiere que se refieran a aquellas proteínas que comprenden una región C de CD80 funcional, y debido a la presencia de toda o parte de la región C, esas moléculas transmutan la señal negativa asociada con las interacciones de la región C de CD80 de tipo silvestre con CTLA4. Un aspecto de la invención se relaciona con métodos mejorados y composiciones para vacunación, particularmente vacunación de ADN, en la que se administra ADN que codifica inmunógenos objetivo, dentro del individual en quien se toma y expresa el ADN, y se genera una respuesta inmune en contra del inmunógeno. De conformidad con los aspectos de la invención, se coaplica al individuo el ADN que codifica una proteína mutante de CD80?C, y la expresión de ese ADN produce la proteína mutante de CD80?C que mejora la respuesta inmune inducida contra el inmunógeno. Se ha descubierto que la coproducción de la proteína mutante de CD80?C en las células de un individuo vacunado, que son antígenos objetivo de expresión, da como resultado una respuesta inmune sorprendentemente mejorada contra el antígeno objetivo. Por medio de proporcionar una forma expresable de la secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas mutantes CD80?C, se mejoran las vacunas que funcionan mediante la expresión del antígeno objetivo en las células del individuo vacunado, tales como las vacunas de ADN, las vacunas de vector recombinante, y las vacunas, atenuadas . La coproducción de las proteínas mutantes CD80?C en las células que producen antígenos da como resultado inmunidad celular mejorada contra el antígeno. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona vacunas mejoradas, mediante la provisión de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína mutante de CD80?C, operablemente enlazada a las secuencias reguladoras necesarias para la expresión en vacunas, como parte de vacunas tales como vacunas de ADN, vacunas de vector recombinante avirulento de subunidad, y vacunas vivas atenuadas. Alternativamente, la proteína mutante de CD80?C se aplica como una proteína auxiliar, junto con un inmunógeno o construcción de gen que codifica un inmunógeno. De conformidad con algunas modalidades de la invención en las cuales se proporcionan los mutantes CD80?C como auxiliares moleculares en protocolos de inmunización, los mutantes CD80?C contienen ya sea una región V de CD80 funcional, o una región V de CD86 funcional. Los mutantes CD80?C no contienen una región C de CD80 funcional. En algunas modalidades, se suprime la región C, y la región V se enlaza directamente a la región de transmembrana. En algunas modalidades se inserta la región C de CD86 en lugar de la región C de CD80. En algunas modalidades, se incluyen secuencias no CD80 y no CD86 en los mutantes CD80?C, después de la región V. Algunas modalidades incluyen la región de transmembrana de CD80. Algunas modalidades incluyen la región de transmembrana de CD86. En algunas modalidades, se suprime la región de transmembrana de CD86 y no se sustituye con ninguna otra secuencia. Algunas modalidades incluyen secuencias no CD80, no CD86 en lugar de la tm de CD80. Algunas modalidades incluyen la cola citoplásmica de CD80. Algunas modalidades incluyen la cola citoplásmica de CD86. En algunas modalidades se suprime la cola citoplásmica de CD80, y no se sustituye por ninguna otra secuencia. Algunas modalidades incluyen secuencias no CD80, no CD86 en lugar de la ct de CD80. Se ha descubierto que en aquellas modalidades en las cuales se aplican los mutantes CD80?C a las células, mediante la administración de material genético que codifica el mutante de CD80?C, aquellos mutantes CD80?C que incluyen una región de transmembrana y cola citoplásmica, son particularmente efectivos para estimular respuestas inmunes. En algunas modalidades, se proporcionan la tm de CD80 y la ct de CD80. En algunas modalidades, se proporcionan la tm de CD86 y la ct de CD86. En algunas modalidades se proporcionan la tm de CD80 y la ct de CD86. En algunas modalidades se proporcionan la tm de CD86 y la ct de CD80. En aquellas modalidades en las cuales se aplican los mutantes CD80?C a las células, mediante la administración de proteínas mutantes CD80?C, las proteínas mutantes CD80?C se pueden proporcionar como una proteína soluble en la cual se suprimen la región de transmembrana y la cola citoplásmica y, en algunos casos, se reemplazan con una fracción soluble . Los aspectos de la presente invención se relacionan con proteínas aisladas que comprenden 80V, 80tm y 80ct, y están libres de 80C; en donde esa proteína comprende ya sea 80V u 86V o ambas, y opcionalmente comprende uno o más de 80tm, 86tm, 80ct, y 86ct, y en donde: 80V es el dominio variable de CD80 o un fragmento funcional del mismo; 86V es el dominio variable de CD86 o un fragmento funcional del mismo; 86C es el dominio C de CD86 o un fragmento funcional del mismo; 80tm es la región de transmembrana de CD80 o un fragmento funcional de la misma; 86tm es la región de transmembrana de CD86 o un fragmento funcional de la misma; 80ct es la cola citoplásmica de CD80 o un fragmento funcional de la misma; y 86ct es la cola citoplásmica de CD86 o un fragmento funcional de la misma. De conformidad con algunas modalidades, éstos tienen la fórmula: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9 en donde R1 es 0-50 aminoácidos; R2 es 80V u 86V; R3 es 0-50 aminoácidos; R4 es 86C ó 0 aminoácidos; R5 es 0-50 aminoácidos; R6 es 80tm u 86tm; R7 es 0-50 aminoácidos; R8 es 80ct u 86ct; y R9 es 0-50 aminoácidos. En algunas modalidades R1 es 0-25 aminoácidos; R3 es 0-25 aminoácidos; R5 es 0-25 aminoácidos; R7 es 0-25 aminoácidos; y/o R9 es 0-25 aminoácidos. En algunas modalidades R1 es 0-10 aminoácidos; R3 es 0-10 aminoácidos; R5 es 0-10 aminoácidos; R7 es 0-10 aminoácidos; y/o R9 es 0-10 aminoácidos. En algunas modalidades, la proteína es un mutante de CD80 seleccionado a partir del grupo que consiste de: 80V/dele/80tm/80ct; 80V/dele/80tm/86ct; 80V/dele/86tm/80ct, 86V/dele/80tm/80ct; 86V/dele/80tm/86ct; 86V/dele/86tm/80ct , 80V/dele/86tm/86ct, 80V/86C/80tm/80ct, 80V/86C/80tm/86ct, 80V/86C/86tm/80ct, 86V/86C/80tm/80ct, 86V/86C/80tm/86ct, 86V/86C/86tm/80ct, 80V/86C/86tm/86ct, 80V/dele/80tm/dele; 86V/dele/80tm/dele; 80V/86C/80tm/dele1 SOV/sec/Sdtm/dele, 86V/86C/80tm/dele, 86V/86C/80tm/dele, 86V/86C/dele/80ct, 80V/86C/dele/80ct 80V/dele/dele/80ct; 86V/dele/dele/80ct ; 80V/86C/dele/dele; y 80V. En algunas modalidades, el mutante de CD80 tiene la fórmula seleccionada a partir del grupo que consiste de R-80V-R -dele-R-80tm-R-80ct-R; R-80V-R -dele-R-80tm-R-86ct-R R-80V-R -dele-R-86tm-R-80ct-R R-86V-R-•dele-R-80tm-R-80ct-R R-86V-R- dele-R-80tm-R-86ct-R R-86V-R-•dele-R-86tm-R-80ct-R R-80V-R- dele-R-86tm-R-86ct-R R-80V-R-•86C-R-80tm-R-80ct-R R-80V-R-•86C-R-80tm-R-86ct-R R-80V-R-•86C-R-86tm-R-80ct-R R-86V-R- 86C-R-80tm-R-80ct-R R-86V-R- 86C-R-80tm-R-86ct-R R-86V-R- 86C-R-86tm-R-80ct-R R-80V-R- 86C-R-86tm-R-86ct-R R-80V-R- dele-R-80tm-R-dele-R R-80V-R- dele-R-86tm-R-dele-R R-86V-R- dele-R-80tm-R-dele-R R-80V-R- 86C-R-80tm-R-dele-R R-80V-R- 86C-R-86tm-R-dele-R R-86V-R- 86C-R-80tm-R-dele-R R-86V-R- 86C-R-80tm-R-dele-R R-86V-R- 86C-R-dele-R-80ct-R R-80V-R- 86C-R-dele-R-80ct-R R-80V-R- dele-R-dele-R-80ct-R; R-86V-R-dele-R-dele-R-80ct-R; R-80V-R-86C-R-dele-R-dele-R; y R-80V-R; en donde 80V es el dominio variable de CD80 o un fragmento funcional del mismo; 86V es el dominio variable de CD86 o un fragmento funcional del mismo; 86C es el dominio C de CD86 o un fragmento funcional del mismo; 80tm es la región de transmembrana de CD80 o un fragmento funcional de la misma; 86tm es la región de transmembrana de CD86 o un fragmento funcional de la misma; 80ct es la cola citoplásmica de CD80 o un fragmento funcional de la misma; 86ct es la cola citoplásmica de CD86 o un fragmento funcional de la misma; dele es 0 aminoácidos; y R son cada una independientemente 0-100 aminoácidos. En algunas modalidades, R son cada una independientemente 0-50 aminoácidos. En algunas modalidades, R son cada una independientemente 0-30 aminoácidos. En algunas modalidades, R son cada una independientemente 0-20 aminoácidos.

En algunas modalidades de la invención el mutante de CD80 se selecciona a partir del grupo que consiste de: CD80 con el dominio C suprimido; CD80 con el dominio C suprimido, y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80; CD80 con el dominio C suprimido, y una región de cola citoplásmica de CD86 sustituyendo la región de cola citoplásmica de CD80; CD80 con el dominio C suprimido, y un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80; CD80 con el dominio C suprimido, y un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80, y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80; CD80 con el dominio C suprimido, y un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80, y una región de cola citoplásmica de CD86 sustituyendo la región de cola citoplásmica de CD80; CD80 con el dominio C suprimido, y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80, y una región de cola citoplásmica de CD86 sustituyendo la región de cola citoplásmica de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80 y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80 y una región de cola citoplásmica de CD86 sustituyendo la región de cola citoplásmica de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80 y un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80, y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80, y una región de cola citoplásmica de CD86 sustituyendo la región de cola citoplásmica de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80 y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80, y una región de cola citoplásmica de CD86 sustituyendo la región de cola citoplásmica de CD80; CD80 con el dominio C suprimido, y la región de cola citoplásmica suprimida; CD80 con el dominio C suprimido, y la región de cola citoplásmica suprimida, y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80; CD80 con el dominio C suprimido, y la región de cola citoplásmica suprimida, y un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80, y una región de cola citoplásmica de CD86 sustituyendo la región de cola citoplásmica de CD80; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y la región de cola citoplásmica suprimida; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y la región de cola citoplásmica suprimida, y una región de transmembrana de CD86 sustituyendo la región de transmembrana de CD80; CD80 con un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80, y un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y la región de cola citoplásmica suprimida; CD80 con un dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80, y un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y la región de transmembrana suprimida; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y la región de transmembrana suprimida; CD80 con el dominio C suprimido, y la región de transmembrana suprimida; CD80 con el dominio C suprimido, y el dominio V de CD86 sustituyendo el dominio V de CD80, y la región de transmembrana suprimida; CD80 con un dominio C de CD86 sustituyendo el dominio C de CD80, y la región de transmembrana suprimida, y la región de cola citoplásmica suprimida; CD80 con el dominio suprimido, la región de transmembrana suprimida, y la región de cola citoplásmica suprimida; y El dominio variable de CD80 o fragmentos funcionales del mismo. Las formas de proteína de los mutantes de CD80?C se pueden formular como componentes en vacunas o construcciones genéticas, que incluyan secuencias de codificación que codifican los mutantes de CD80?C que se pueden proporcionar como componentes de vacunas. En cualquier caso, esas vacunas se pueden usar en métodos profilácticos o terapéuticos. De conformidad con algunas modalidades preferidas de la invención, se proporcionan vacunas de ADN que contienen moléculas de ADN que contienen secuencias codificadoras que codifican un inmunógeno y un mutante de CD80?C. Una mejora de la presente invención se relaciona con la inclusión de material genético para la coproducción de una proteína mutante de CD80?C, en adición a la producción del objetivo antigénico codificado mediante las secuencias de ácidos nucleicos de las vacunas de ADN. La presente invención se relaciona con métodos para introducir material genético dentro de las células de un individuo, con el propósito de inducir respuestas inmunes contra proteínas y péptidos que se codifican por medio del material genético. Los métodos comprenden los pasos de administrar al tejido del individuo, ya sea una sola molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína objetivo, y una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína mutante de CD80?C; o una composición que tenga dos moléculas de ácido nucleico, una que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína objetivo, y una que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína mutante de CD80?C. La(s) molécula (s) de ácido nucleico se pueden proporcionar como ADN de plásmido, las moléculas de ácido nucleico de vectores recombinantes, o como parte del material genético que se proporciona en una vacuna atenuada . De conformidad con la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos que inmunizan profiláctica y/o terapéuticamente a un individuo contra un patógeno o célula anormal, relacionada con enfermedad. El material genético que codifica una proteína objetivo, es decir, un péptido o proteína que comparte cuando menos un epítopo con una proteína inmunogénica que se encuentra en el patógeno o las células objetivo, y material genético que codifica una proteína mutante de CD80?C. El material genético se expresa por medio de las células del individuo, y sirve como un objetivo inmunogénico contra el cual se produce una respuesta inmune. La respuesta inmune resultante reacciona con un patógeno o células objetiyo, y es de base amplia: en adición a una respuesta inmune humoral, se producen ambas armas de la respuesta inmune celular. Los métodos de la presente invención son útiles para conferir inmunidad profiláctica y terapéutica. De esta manera, un método para inmunización incluye tanto métodos para proteger a un individuo de una agresión por patógenos, o de la ocurrencia o proliferación de células específicas, así como métodos para tratar a un individuo que sufra de infección por patógenos, enfermedad hiperproliferativa, o enfermedad autoinmune. Como se usan en la presente, los términos "proteína objetivo" e "inmunógeno" se usan intercambiablemente y se quiere que se refieran a péptidos y proteínas codificados por construcciones de genes que actúan como objetivos de proteína para una respuesta inmune. La proteína objetivo es una proteína contra la cual se puede producir una respuesta inmune. La proteína objetivo es una proteína inmunogénica que comparte cuando menos un epítopo con una proteína del patógeno o del tipo de célula indeseable, tal como una célula cancerosa o una célula envuelta en enfermedad autoinmune, contra la cual se requiere la inmunización. La respuesta inmune dirigida contra la proteína objetivo protegerá al individuo contra, y tratará al individuo para la infección o enfermedad específica con la cual esté asociada la proteína objetivo. La proteína objetivo no necesita ser idéntica a la proteína contra la cual se desea una respuesta inmune. Más bien, la proteína objetivo debe ser capaz de inducir una respuesta inmune que reaccione cruzadamente con la proteína contra la cual se desea la respuesta inmune. La presente invención es útil para producir respuestas inmunes amplias contra una proteína objetivo, es decir, proteínas específicamente asociadas con patógenos o con las células "anormales" del propio individuo. La presente invención es útil para inmunizar individuos contra agentes y organismos patogénicos, de tal manera que una respuesta inmune contra una proteína patógena proporcione inmunidad protectora contra el patógeno. La presente invención es útil para combatir enfermedades y desórdenes hiperproliferativos tales como cáncer, por medio de producir una respuesta inmune contra una proteína objetivo que esté específicamente asociada con las células hiperproliferativas. La presente invención es útil para combatir enfermedades y desórdenes autoinmunes, por medio de producir una respuesta inmune contra una proteína objetivo que esté específicamente asociada con las células envueltas en la condición autoinmune . De conformidad con la presente invención, se introduce ADN o ARN que codifique una proteína objetivo y una proteína mutante de CD80?C, dentro de las células del tejido de un individuo en donde ésta se expresa, produciendo de esta manera la proteína objetivo y la proteína mutante de CD80?C. Las secuencias de ADN o ARN que codifican la proteína objetivo y el mutante de CD80?C están enlazadas, cada una, a elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo. Los elementos reguladores para la expresión de ADN incluyen un promotor y una señal de poliadenilación. En adición, también se pueden incluir otros elementos, tales como una región Kozak, en la construcción genética. Las modalidades preferidas incluyen secuencias de nucleótidos que codifican la proteína objetivo y la proteína mutante de CD80?C, que se proporcionan como formas expresables separadas en las cuales cada una de la proteína objetivo y la proteína mutante de CD80?C se enlaza a su propio conjunto de elementos reguladores necesarios para la expresión en la célula del individuo. Sin embargo, la presente invención se relaciona adicionalmente con modalidades en las cuales se proporcionan la proteína objetivo y la proteína mutante de CD80?C como una sola construcción genética. En algunas de esas modalidades, la poliproteína que se produce por medio de la única forma expresable, se puede procesar en dos proteínas separadas, o ésta puede existir como una proteína quimérica que funcione tanto como la proteína objetivo como el mutante de CD80?C. En algunas modalidades, se pueden proporcionar secuencias de ácidos nucleicos que codifican dos o más copias de la proteína objetivo y/o dos o más copias de la proteína mutante de CD80?C, en una sola forma expresable de una construcción de genes. Las poliproteínas que se codifiquen en la misma se pueden procesar en subunidades después de la expresión, o se pueden mantener como poliproteínas funcionales. Como se usa en la presente, el término "forma expresable" se refiere a construcciones de genes que contienen los elementos reguladores necesarios operables, enlazados a una secuencia de codificación que codifica una proteína objetivo y/o una proteína mutante de CD80?C, de tal manera que cuando están presentes en la célula del individuo, se expresará la secuencia de codificación. Como se usa en la presente, el término "compartir un epítopo" se refiere a proteínas que comprenden cuando menos un epítopo que es idéntico a, o sustancialmente similar a un epítopo de otra proteína. Como se usa en la presente, el término "epítopo sustancialmente similar" se quiere que se refiera a un epítopo que tenga una estructura que no sea idéntica a un epítopo de una proteína, pero que no obstante invoque una respuesta inmune celular o humoral, que reacciona cruzadamente con esa proteína. Las construcciones genéticas comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína objetivo y/o una proteína mutante de CD80?C operablemente enlazada a los elementos reguladores necesarios para la expresión de genes. De conformidad con la invención, se proporcionan combinaciones de construcciones de genes que incluyan uno que comprenda una forma expresable de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína mutante de CD80?C. La incorporación dentro de una célula viva de la(s) molécula (s) de ADN o ARN que incluyen la combinación de construcciones de genes, da como resultado la expresión del ADN o ARN, y la producción de la proteína objetivo y una proteína mutante de CD80?C. El resultado es una respuesta inmune sorprendentemente mejorada contra la proteína objetivo. La presente invención se puede usar para inmunizar a un individuo contra todos los patógenos tales como virus, procariotes y organismos eucarióticos patogénicos tales como organismos patogénicos unicelulares y parásitos multicelulares. La presente invención es particularmente útil para inmunizar a un individuo contra aquellos patógenos que infectan células, y que no están encapsulados tal como los virus, y procariotes tales como gonorrea, listeria y shigella. En adición, la presente invención también es útil para inmunizar a un individuo contra patógenos protozoarios, que incluyen una etapa en el ciclo de vida en donde éstos son patógenos intracelulares. Como se usa en la presente, el término "patógeno intracelular" se quiere que se refiera a un virus u organismo patogénico que, cuando menos parte de su ciclo reproductivo o de vida, existe adentro de una célula anfitriona y en la misma produce u ocasiona que se produzcan proteínas patógenas. La Tabla 1 proporciona un listado de algunas de las familias y géneros virales para los cuales se pueden hacer la vacunas de conformidad con la presente invención. En las vacunas son útiles las construcciones de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican los péptidos, que comprenden cuando menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo desplegado en un antígeno patógeno, tal como aquellos antígenos enlistados en las tablas. Además, la presente invención también es útil para inmunizar a un individuo contra otros patógenos, que incluyen patógenos protozoarios procarióticos y eucarióticos, así como parásitos multicelulares tales como aquellos enlistados en la Tabla 2. Con el propósito de producir una vacuna genética para proteger contra infección por patógenos, en una construcción genética se debe incluir material genético que codifique proteínas inmunogénicas contra las cuales se pueda montar una respuesta inmune protectora, como la secuencia de codificación para el objetivo. Sea que el patógeno infecte intracelularmente, para lo cual la presente invención es particularmente útil, o extracelularmente, no es probable que todos los antígenos patógenos produzcan una respuesta protectora. Debido a que tanto el ADN como el ARN son relativamente pequeños, y se pueden producir relativamente de manera fácil, la presente invención proporciona la ventaja adicional de permitir la vacunación con múltiples antígenos patógenos. La construcción genética que se usa en la vacuna genética puede incluir material genético que codifique muchos antígenos patógenos. Por ejemplo, se pueden incluir muchos genes virales en una sola construcción, proporcionando mediante lo mismo múltiples objetivos. Las Tablas 1 y 2 incluyen listas de algunos de los agentes patogénicos y organismos para los cuales se pueden preparar las vacunas genéticas, para proteger a un individuo de la infección por ellos. En algunas modalidades preferidas, los métodos para inmunizar a un individuo contra un patógeno se dirige contra VIH, HTLV o HBV. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para conferir una respuesta inmune protectora basada en la amplitud, contra las células hiperproliferativas que son características en enfermedades hiperproliferativas, y un método para tratar a individuos que sufran de enfermedades .-. y hiperproliferativas. Como se usa en la presente, el término "enfermedades hiperproliferativas" se quiere que se refiera a aquellas enfermedades y desórdenes caracterizados por la hiperproliferación de células. Los ejemplos de enfermedades hiperproliferativas incluyen todas las formas de cáncer y psoriasis . Se ha descubierto que la introducción de una construcción genética que incluya una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína asociada con "células hiperproliferativas" inmunogénicas, dentro de las células de un individuo, da como resultado la producción de aquellas proteínas en las células vacunadas de un individuo. Como se usa en la presente, el término "proteína asociada con hiperproliferativas" se quiere que se refiera a proteínas que están asociadas con una enfermedad hiperproliferativa. Para inmunizar contra enfermedades hiperproliferativas, se administra a un individuo una construcción genética que incluya una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína que esté asociada con una enfermedad hiperproliferativa. Con el propósito de que la proteína asociada con hiperproliferativas sea un objetivo inmunogénico efectivo, ésta debe ser una proteína que se produzca exclusivamente o a niveles más elevados en las células hiperproliferativas, en comparación con las células normales. Los antígenos objetivo incluyen esas proteínas, fragmentos de las mismas y péptidos que comprenden cuando menos un epítopo que se encuentra en esas proteínas. En algunos casos, una proteína asociada con hiperproliferativas es el producto de una mutación de un gen que codifica una proteína. El gen mutado codifica una proteína que es casi idéntica a la proteína normal, excepto que ésta tiene una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente, lo cual da como resultado un epítopo diferente que no se encuentra en la proteína normal . Esas proteínas objetivo incluyen aquellas que son proteínas codificadas por oncógenos tales como myb, myc, fin, y el gen de translocación bcr/abl , ras, src, P53, neu, trk y EGRF. En adición a los productos de oncogenes como antígenos objetivo, las proteínas objetivo para tratamientos anticáncer, y regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos hechas mediante linfomas de células B, y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T que, en algunas modalidades, también se usan como antígenos objetivo para enfermedad autoinmune. Se pueden usar otras proteínas asociadas con tumores, como proteínas objetivo tales como las proteínas que se encuentran en niveles más altos en las células tumorales, incluyendo la proteína que reconoce el anticuerpo monoclonal 17-ÍA, y las proteínas de fijación de folatos . Aunque la presente invención se puede usar para inmunizar a un individuo contra una o más de muchas formas de cáncer, la presente invención es particularmente útil para inmunizar profilácticamente . a un individuo que esté predispuesto a desarrollar un cáncer particular, o quien haya tenido cáncer y por lo tanto sea susceptible a una recaída. Los desarrollos en genética y tecnología, así como en epidemiología, permiten la determinación de la evaluación de probabilidad y riesgo para el desarrollo de cáncer en el individuo. Usando la clasificación genética y/o la historia médica de la familia, es posible predecir la probabilidad que tiene un individuo particular de desarrollar cualquiera de muchos tipos de cáncer. De manera similar, aquellos individuos que ya hayan desarrollado cáncer, y que se hayan tratado para remover el cáncer, o de otra manera están en remisión, son particularmente susceptibles a la recaída y recurrencia. Como parte de un régimen de tratamiento, se puede inmunizar a esos individuos contra el cáncer que se les haya diagnosticado, como si lo tuvieran, con el propósito de combatir una recurrencia. De esta manera, una vez que se sabe que un individuo ha tenido un tipo de cáncer y está en riesgo de una recaída, éste se puede inmunizar con el propósito de preparar su sistema inmune, para combatir cualquier futura aparición del cáncer. La presente invención proporciona un método para tratar a individuos que sufran de enfermedades hiperproliferativas. En esos métodos, la introducción de construcciones genéticas sirve como un inmunoterapéutico, que dirige y promueve al sistema inmune del individuo para combatir las células hiperproliferativas que producen la proteína objetivo. La presente invención proporciona un método para tratar a individuos que sufran de enfermedades y desórdenes autoinmunes, por medio de conferir una respuesta inmune protectora basada en amplitud contra los objetivos que estén asociados con la autoinmunidad, incluyendo receptores de células y células que producen anticuerpos "auto"- dirigidos. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células T incluyen artritis reumatoide (RA) , esclerosis múltiple (MS) , síndrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) , tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de egener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por receptores de células T que se fijan a antígenos endógenos, e inician la cascada inflamatoria asociada con las enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de las células T produciría una respuesta inmune, que incluye CTLs, para eliminar esas células T.

En la RA, se han caracterizado muchas regiones variables específicas de receptores de células T (TCRs) , las cuales están envueltas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen Vß-3, Vß-14, Vß-17 y Va-17. De esta manera, la vacunación con una construcción de ADN que codifique cuando menos una de estas proteínas, producirá una respuesta inmune que se dirigirá a las células T envueltas en la RA. Ver: Howell, M. D., y colaboradores, 1991 Proc . Natl . Acad. Sci . USA 88:10921-10925; Paliard, X., y colaboradores, 1991 Science 253:325-329; Williams, W. V., y colaboradores, 1992 ". Clin . Invest . 90:326-333; cada uno de los cuales está incorporado a la presente como referencia. En la MS, se han caracterizado muchas regiones variables específicas de TCRs, las cuales están envueltas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen Vß-7, y Va-10. De esta manera, la vacunación con una construcción de ADN que codifique cuando menos una de estas proteínas, producirá una respuesta inmune que se dirigirá a las células T envueltas en la MS. Ver: Wucherpfennig, K. W. , y colaboradores, 1990 Science 248:1016-1019; Oksenberg, J. R. , y colaboradores, 1990 Nature 345:344-346; cada uno de los cuales está incorporado a la presente como referencia. En el escleroderma, se han caracterizado muchas regiones variables específicas de TCRs, las cuales están envueltas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen Vß-6, Vß-8, ___ Vß-14 y Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va-15, Va-16, Va-28 y Va-12. De esta manera, la vacunación con una construcción de ADN que codifique cuando menos una de estas proteínas, producirá una respuesta inmune que se dirigirá a las células T envueltas en el escleroderma. Con el propósito de tratar pacientes que sufran de una enfermedad autoinmune mediada por células T, particularmente aquellos para los cuales la región variable de la TCR todavía se va a caracterizar, se puede realizar una biopsia sinovial. Se pueden tomar muestras de las células T presentes, y se puede identificar la región variable de esas TCRs usando técnicas estándares . Se pueden preparar vacunas genéticas usando esta información. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células B incluyen Lupus (SLE) , enfermedad de Grave, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune, asma, crioglobulinemia, esclerosis biliar primaria, y anemia perniciosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por anticuerpos que se fijan a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con las enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de anticuerpos produciría una respuesta inmune que incluye CTLs, para eliminar aquellas células B que producen el anticuerpo. Con el propósito de tratar a pacientes que sufran de una enfermedad autoinmune mediada por células B, se debe identificar la región variable de los anticuerpos envueltos en la actividad autoinmune. Se puede realizar una biopsia, y se pueden tomar muestras de los anticuerpos presentes en un sitio de inflamación. Se puede identificar la región variable de esos anticuerpos usando técnicas estándares. Se pueden preparar vacunas genéticas usando esta información. En el caso del SLE, se cree que un antígeno es el ADN. De esta manera, en los pacientes que se van a inmunizar contra SLE, se puede clasificar su suero para buscar anticuerpos anti-ADN, y se puede preparar una vacuna que incluya las construcciones de ADN que codifiquen la región variable de esos anticuerpos anti-ADN que se encontraron en el suero. Son bien conocidas las características estructurales comunes entre las regiones variables tanto de las TCRs como de los anticuerpos. La secuencia de ADN que codifica una TCR o anticuerpo particular generalmente se puede hallar siguiendo métodos bien conocidos, tales como aquellos descritos en Kabat, y colaboradores 1987 Se?ruence oí Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD, que está incorporado a la presente como referencia. En adición, se puede encontrar un método general para clonar regiones variables funcionales de anticuerpos, en Chaudhary, V. K. , y colaboradores, 1990 Proc. Natl . Acad. Sci . USA 87:1066, que está incorporado a la presente como referencia. La presente invención proporciona un método mejorado para inmunizar a individuos, que comprende el paso de aplicar construcciones de genes a las células de los individuos, como parte de composiciones de vacuna que incluyen vacunas de ADN, vacunas vivas atenuadas, y vacunas recombinantes. Las construcciones de genes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína inmunomoduladora, y que está operablemente enlazada a secuencias reguladoras que pueden funcionar en la vacuna para efectuar la expresión. Las vacunas mejoradas dan como resultado una respuesta inmune celular mejorada. En algunos métodos de inmunización, al individuos se le administra una construcción de genes que codifica un inmunógeno, y una construcción genética que codifica una proteína mutante de CD80?C. En algunos métodos de inmunización, al individuo se le administra una construcción de genes que codifica tanto un inmunógeno como una proteína mutante de CD80?C. En algunos métodos alternativos de inmunización, al individuo se le administra un inmunógeno y una proteína mutante de CD80?C. En algunos métodos alternativos de inmunización, al individuo se le administra un inmunógeno de proteína y una construcción genética que codifica una proteína mutante de CD80?C. En algunos métodos alternativos de inmunización, al individuo se le administra una construcción de genes que codifica un inmunógeno y una proteína mutante de CD80?C. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporcionan proteínas de la región C de CD80, para suprimir las respuestas inmunes asociadas con enfermedades autoinmunes y rechazos de trasplantes. Las proteínas de la región C de CD80 contienen una región C de CD80 funcional. Los fragmentos funcionales de la región C de CD80 se pueden identificar rutinariamente. En algunas modalidades, los fragmentos funcionales de la región C de CD80 son menos de 60 aminoácidos . En algunas modalidades, los fragmentos funcionales de la región C de CD80 son menos de 50 aminoácidos . En algunas modalidades, los fragmentos funcionales de la región C de CD80 son menos de 40 aminoácidos . En algunas modalidades, los fragmentos funcionales de la región C de CD80 son menos de 30 aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos funcionales de la región C de CD80 son menos de 20 aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos funcionales de la región C de CD80 son menos de 15 aminoácidos . En algunas modalidades, los fragmentos funcionales de la región C de CD80 son menos de 10 aminoácidos . En algunas modalidades se suprime la región V. En algunas modalidades, está presente la región V de CD80 ó CD86. Algunas modalidades incluyen la región de transmembrana de CD80. Algunas modalidades incluyen la región de transmembrana de CD86. En algunas modalidades se suprime la región de transmembrana de CD80 y no se sustituye por ninguna otra secuencia. Algunas modalidades incluyen secuencias no CD80, no CD86. Algunas modalidades incluyen secuencias no CD80, no CD86 en lugar de la tm de CD80. Algunas modalidades incluyen la cola citoplásmica de CD80. Algunas modalidades incluyen la cola citoplásmica de CD86. En algunas modalidades se suprime la cola citoplásmica de CD80, y no se sustituye por ninguna otra secuencia. Algunas modalidades incluyen secuencias no CD80, no CD86 en lugar de la ct de CD80. De conformidad con algunas modalidades, la proteína no CD80 comprende cuando menos el dominio C de CD80, o un fragmento funcional del mismo. Como se usa en la presente, el término proteína no CD80 se quiere que se refiera a una proteína que difiere de CD80 de tipo silvestre, pero que comprenda un dominio C de CD80 o un fragmento funcional del mismo. En algunas modalidades, la proteína no CD80 tiene la fórmula: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9 en donde R1 es 0-50 aminoácidos; R2 es 80V u 86V; R3 es 0-50 aminoácidos; R4 es 80C; R5 es 0-50 aminoácidos; R6 es 80tm u 86tm; R7 es 0-50 aminoácidos; R8 es 80ct u 86ct; y R9 es 0-50 aminoácidos, en donde 80V es el dominio variable de CD80 o un fragmento funcional del mismo; 86V es el dominio variable de CD86 o un fragmento funcional del mismo; 80C es el dominio C de CD80 o un fragmento funcional del mismo; 80tm es la región de transmembrana de CD80 o un fragmento funcional de la misma; 86tm es la región de transmembrana de CD86 o un fragmento funcional de la misma; 80ct es la cola citoplásmica de CD80 o un fragmento funcional de la misma; y 86ct es la cola citoplásmica de CD86 o un fragmento funcional de la misma. De conformidad con algunas modalidades de la invención, la proteína no CD80 aislada que comprende cuando menos el dominio C de CD80, o un fragmento funcional del mismo, tiene la fórmula seleccionada a partir del grupo que consiste de: R-dele-R-80C-R-80tm-R-80ct-R; R-dele-R-80C-R-80tm-R-dele-R; R-80V-R-80C-R-80tm-R-dele-Rj R-80V-R-80C-R-dele-R-dele-Rj R-86V-R-80C-R-80tm-R-80ct-R; R-86V-R-80C-R-80tm-R-dele-R; R-86V-R-80C-R-dele-R-dele-R¡ R-80V-R-80C-R-86tm-R-80ct-R; R-dele-R-80C-R-86tm-R-80ct-R; R-dele-R-80C-R-86tm-R-dele-R; R-80V-R-80C-R-86tm-R-dele-R; R-80V-R-80C-R-80tm-R-86ct-R; R-dele-R-80C-R-80tm-R-86ct-R; R-86V-R-80C-R-86tm-R-80ct-R; R-86V-R-80C-R-80tm-R-86ct-Rj R-86V-R-80C-R-86tm-R-dele-R; R-dele-R-80C-R-86tm-R-86ct-R; y R-86V-R-80C-R-86tm-R-86ct-R; en donde 80V es el dominio variable de CD80 o un fragmento funcional del mismo; 86V es el dominio variable de CD86 o un fragmento funcional del mismo; 80C es el dominio C de CD80 o un fragmento funcional del mismo; 80tm es la región de transmembrana de CD80 o un fragmento funcional de la misma; 86tm es la región de transmembrana de CD86 o un fragmento funcional de la misma; 80ct es la cola citoplásmica de CD80 o un fragmento funcional de la misma; 86ct es la cola citoplásmica de CD86 o un fragmento funcional de la misma; dele es 0 aminoácidos; y cada R es independientemente cada una 0-100 aminoácidos . En algunas modalidades, cada R es independientemente 0-50 aminoácidos; en algunas modalidades cada R es independientemente 0-30 aminoácidos; en algunas modalidades, cada R es independientemente 0-20 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención la proteína no CD80 se selecciona a partir del grupo que consiste de: un CD80 mutante con el dominio variable suprimido; un CD80 mutante con el dominio variable suprimido y la cola citoplásmica suprimida; un CD80 mutante con la cola citoplásmica suprimida; un CD80 mutante con la región de transmembrana suprimida y la cola citoplásmica suprimida; un CD80 mutante con un dominio variable de CD86 sustituido en lugar del dominio variable de CD80; un CD80 mutante con un dominio variable de CD86 sustituido en lugar del dominio variable de CD80, y la cola citoplásmica suprimida; un CD80 mutante con un dominio variable de CD86 sustituido en lugar del dominio variable de CD80, y la región de transmembrana suprimida, y la cola citoplásmica suprimida; un CD80 mutante con una región de transmembrana sustituida en lugar de la región de transmembrana de CD80; un CD80 mutante con la región variable suprimida y una región de transmembrana de CD86 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CD80; un CD80 mutante con la región variable suprimida, la cola citoplásmica suprimida, y una región de transmembrana de CD86 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CD80; un CD80 mutante con la cola citoplásmica suprimida, y una región de transmembrana de CD86 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CD80; un CD80 mutante con una cola citoplásmica de CD86 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CD80; un CD80 mutante con la región variable suprimida, y una cola citoplásmica de CD86 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CD80; un CD80 mutante con un dominio variable de CD86 sustituido en lugar del dominio variable de CD80, y una región de transmembrana de CD86 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CD80; un CD80 mutante con un dominio variable de CD86 sustituido en lugar del dominio variable de CD80, y una cola citoplásmica de CD86 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CD80; un CD80 mutante con un dominio variable de CD86 sustituido en lugar del dominio variable de CD80, y una región de transmembrana de CD86 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CD80, y la cola citoplásmica suprimida; un CD80 mutante con el dominio variable suprimido, y una región de transmembrana de CD86 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CD80, y una cola citoplásmica de CD86 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CD80; y un CD80 mutante con un dominio variable de CD86 sustituido en lugar del dominio variable de CD80, y una región de transmembrana de CD86 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CD80, y la cola citoplásmica de CD86 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CD80. Las proteínas de la región C de CD80 se proporcionan ya sea como proteínas o como construcciones genéticas que codifican la región C de CD80. La aplicación de construcciones genéticas que comprenden las secuencias codificadoras que codifican el CD80 de tipo silvestre, dele/80C/80tm/80ct, dele/80C/80tm/86ct , dele/80C/86tm/80ct , o dele/80C/86tm/86ct proporcionan resultados particularmente efectivos en la inmunosupresión y el tratamiento de enfermedades autoinmunes . Los métodos de este aspecto de la invención son útiles para tratar enfermedades y desórdenes autoinmunes. Aquellos expertos en la técnica pueden identificar a individuos que tengan enfermedades o desórdenes autoinmunes . Los ejemplos de enfermedades y desórdenes autoinmunes incluyen enfermedades autoinmunes mediadas por células T tales como artritis reumatoide (RA) , esclerosis múltiple (MS) , síndrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) , tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, y enfermedades autoinmunes mediadas por células B tales como Lupus (SLE) , enfermedad de Grave, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune, asma, crioglobulinemia, esclerosis biliar primaria, y anemia perniciosa. Los métodos de este aspecto de la invención también son útiles para suprimir las respuestas inmunes en individuos que estén pasando por procedimientos de trasplantes, incluyendo trasplantes de células tales como injertos de médula ósea y de células cerebrales, trasplantes de tejido tales como injertos de córnea y piel, y procedimientos de mioplastia, y trasplantes de órgano tales como hígado, pulmón, riñon y corazón. Los métodos para hacer y aplicar las composiciones de la presente invención generalmente son los mismos para los protocolos de inmunización, así como los protocolos terapéuticos no inmunogénicos. Como se usa en la presente, el término "proteína" se quiere que incluya moléculas proteináceas, incluyendo péptidos, polipéptidos y proteínas. Algunas modalidades la invención se relacionan con la aplicación de proteínas a través de la administración de ácidos nucleicos, particularmente ADN, y con métodos para usar los mismos. Por ejemplo, en algunos métodos de inmunización, se administran a los individuos ácidos nucleicos que codifican proteínas inmunogénicas y proteínas mutantes de CD80?C. De la misma manera, en algunos métodos para tratar enfermedades autoinmunes, y evitar rechazos de injertos/trasplantes mediante la inmunosupresión, se administran a los individuos ácidos nucleicos que codifican las proteínas de la región C de CD80. Como se usa en la presente, el término "construcciones de genes de la invención" se pretende que signifique construcciones de genes que incluyan secuencias codificadoras que codifiquen proteínas inmunogénicas, proteínas mutantes de CD80?C, y proteínas de la región C de CD80, las cuales se pueden producir cada una mediante medios similares, y que se pueden formular y administrar de una manera similar, para usarse en los métodos de la invención. En la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,593,972, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,569,466, la PCT/US90/01515, la PCT/US93/0233d, la PCT/US93/04dl31 , y la PCT/US94/00699 , las cuales están incorporadas a la presente como referencia, se describen vacunas de ADN. En adición a los protocolos de aplicación que se describen en esas solicitudes, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,945,050 y 5,036,006, ambas incorporadas a la presente como referencia, se describen métodos alternativos para aplicar ADN. Los protocolos de vacuna de ADN son útiles para inmunizar individuos. Las enseñanzas se pueden aplicar en la presente invención, a aspectos en los cuales se tratan individuos con enfermedad autoinmune y rechazos de trasplantes, usando construcciones de genes que codifiquen las proteínas de la región C de CDdO. En esas modalidades, no se proporciona ninguna secuencia codificadora que codifique inmunógenos . Cuando las capta una célula, las construcciones genéticas de la invención pueden permanecer presentes en la ... célula como una molécula extracromosomal en funcionamiento y/o integrarse dentro del ADN cromosomal de la célula. El ADN se puede introducir dentro de las células, en donde éste permanece como material genético separado en la forma de un plásmido o plásmidos. Alternativamente, se puede introducir dentro de la célula ADN lineal que se pueda integrar dentro del cromosoma. Cuando se introduce ADN dentro de la célula, se pueden añadir reactivos que promuevan la integración del ADN dentro de los cromosomas. También pueden estar incluidas en la molécula de ADN, las secuencias de ADN que sean útiles para promover la integración. Alternativamente, se puede administrar ARN a la célula. También se contempla proporcionar las construcciones genéticas de la invención como un minicromosoma lineal que incluya un centromero, telómeros y un origen de réplica. Las construcciones genéticas de la invención incluyen los elementos reguladores necesarios para la expresión de genes de una molécula de ácido nucleico. Los elementos incluyen: un promotor, un codón de inicio, un codón de detención, y una señal de poliadenilación. En adición, frecuentemente se requieren mejoradores para la expresión de genes de la secuencia que codifica la proteína de la invención. Es necesario que estos elementos estén operablemente enlazados a la secuencia que codifica las proteínas deseadas, y que los elementos reguladores estén operablemente en el individuo a quien se administran éstos . Los codones de inicio y el codón de detención generalmente se consideran que son parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo a quien se administre la construcción de genes. Los codones de inicio y terminación deben estar en marco con la secuencia codificadora. Los promotores y las señales de poliadenilación que se usan deben ser funcionales adentro de las células del individuo . Los ejemplos de promotores útiles para practicar la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen pero no están limitados a promotores del Virus de Simio 40 (SV40) , promotor del Virus de Tumor Mamario de Ratón (MMTV) , Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) tal como el promotor de Repetición de Terminal Larga de VIH (LTR) , virus de Moloney, ALV, Citomegalovirus (CMV) tal como el promotor temprano inmediato de CMV, Virus de Epstein Barr (EBV) , Virus de Sarcoma de Rous (RSV) , así como promotores de genes humanos tales como Actina humana, Miosina humana, Hemoglobina humana, creatina de músculo humana, y metalotioneína humana. Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para practicar la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen pero no están limitados a las señales de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana y bovina, señales de poliadenilación de SV40, y señales de poliadenilación de LTR. En particular, se usa la señal de poliadenilación de SV40 que es un plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego CA) , al que se hace referencia como la señal de poliadenilación de SV40. En adición a los elementos reguladores que se requieren para la expresión de ADN, también se pueden incluir otros elementos en la molécula de ADN. Esos elementos adicionales incluyen mejoradores. El mejorador se puede seleccionar a partir del grupo que incluye, pero no se limita a: Actina humana, Miosina humana, Hemoglobina humana, creatina de músculo humana, y mejoradores virales tales como aquellos de CMV, RSV, y EBV. Las construcciones genéticas de la invención se pueden proporcionar con el origen mamífero de réplica, con el propósito de mantener la construcción extracromosomalmente y producir múltiples copias de la construcción en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de réplica del virus de Epstein Barr, y el antígeno nuclear EBNA-1 que codifica la región que produce réplica episomal de copia alta, sin integración. En algunas modalidades preferidas relacionadas con aplicaciones de inmunización, se aplica (n) molécula (s) de ácido nucleico, que incluye (n) secuencias de nucleótidos que codifican una proteína objetivo, una proteína mutante de CD80?C y, adicionalmente, genes para proteínas que mejoran adicionalmente la respuesta inmune contra esas proteínas objetivo. Los ejemplos de esos genes son aquellos que codifican citocinas y linfocinas tales como a - interferón, gama - interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12. Con el propósito de maximizar la producción de proteínas, se pueden seleccionar secuencias reguladoras que sean bien adecuadas para expresión genética en las células adentro de las cuales se administra la construcción. Por otra parte, se pueden seleccionar codones que se transcriban más eficientemente en la célula. Uno que tenga experiencia ordinaria en la técnica puede producir construcciones de ADN que sean funcionales en las células. Los métodos de la presente invención, sean métodos de inmunización o métodos de inmunosupresión, comprenden el paso de administrar moléculas de ácido nucleico al tejido del individuo. En algunas modalidades preferidas, las moléculas de ácido nucleico se administran intramuscularmente, intranasalmente, intraperitonealmente, subcutáneamente, intradérmicamente, intravenosamente, mediante administración por aerosol al tejido pulmonar, o tópicamente, o mediante lavado al tejido mucosal seleccionado a partir del grupo que consiste de vaginal, rectal, uretral, bucal, y sublingual. Un aspecto de la presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas útiles en los métodos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas comprenden una molécula de ácido nucleico, de preferencia una molécula de ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique una o más proteínas operablemente enlazadas a los elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo. Las composiciones farmacéuticas comprenden adicionalmente un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéutica" es bien conocido y lo entienden ampliamente aquellos expertos en la técnica. Como se usan en la presente, los términos "composiciones farmacéuticas" y "composiciones farmacéuticas inyectables" se quiere que tengan su significado ordinario, según lo entienden aquellos expertos en la técnica. Se requiere que las composiciones farmacéuticas satisfagan los estándares específicos respecto a esterilidad, pirógenos, materia en partículas, así como isotonicidad y pH. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas inyectables son estériles y libres de pirógenos. Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención pueden comprender aproximadamente de 1 ng a aproximadamente 10,000 µg de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 2000 µg, 3000 µg, 4000 µg, ó 5000 µg de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéu-ticas contienen aproximadamente 1000 µg de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 800 µg de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 500 µg de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 350 µg de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 µg de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 100 µg de ADN. Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención, que comprenden las construcciones genéticas de la invención, se formulan de conformidad con el modo de administración que se vaya a usar. Uno que tenga experiencia ordinaria en la técnica puede formular fácilmente una vacuna o producto terapéutico no inmunogénico, que comprenda una construcción genética. En casos en donde la inyección intramuscular es el modo elegido de administración, se usa de preferencia una formulación isotónica.

Generalmente, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren las soluciones isotónicas tales como solución salina regulada en su pH con fosfato. Los 5 estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. En algunas modalidades, se añade un agente de vasoconstricción a la formulación. Las preparaciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención se proporcionan estériles y libres de pirógenos. Las composiciones farmacéuticas de conformidad 10 con la invención incluyen componentes de aplicación en combinación con moléculas de ácido nucleico, que también comprenden portadores o vehículos farmacéuticamente aceptables tales como, por ejemplo, solución salina. Se puede usar cualquier medio que permita la aplicación exitosa del 15 ácido nucleico. Uno experto en la técnica comprendería fácilmente la multitud de medios farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en la presente invención. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia 20 estándar en este campo, que está incorporado a la presente como referencia . En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico se aplica a las células en conjunción con la administración de un agente facilitador. También se hace referencia a los 25 agentes facilitadores como mejoradores de la función de ?J»JWW< <. .-,»> I . .. ....... dz polinucleótidos o agentes facilitadores de vacuna genética. Los agentes facilitadores se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5, 630, 676 emitida el 3 de noviembre de 199d, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,593,972 emitida el 14 de enero de 1997, y la Solicitud Internacional con Número de Serie PCT/US94/00699 presentada el 26 de enero de 1994 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 0d/979,3d5 presentada el 29 de noviembre de 1997), que están incorporadas a la presente como referencia. En adición, los agentes facilitadores se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,739,118 emitida el 14 de abril de 1998, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,837,533 emitida el 17 de noviembre de 1996, la PCT/US95/12502 presentada el 28 de septiembre de 1995, y la PCT/US95/04071 presentada el 30 de marzo de 1995, que están cada una incorporadas a la presente como referencia. Los agentes facilitadores que se administran en conjunción con moléculas de ácido nucleico se pueden administrar como una mezcla con la molécula de ácido nucleico, o administrarse simultáneamente por separado, antes o después de la administración de las moléculas de ácido nucleico. En adición, otros agentes que pueden funcionar como agentes de transfección y/o agentes de réplica y/o agentes inflamatorios, y que se pueden coadministrar con o sin un agente facilitador, incluyen factores de crecimiento, citocinas y linfocinas tales como a - interferón, gama -interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 y B7.2, así como factor de crecimiento de fibroblastos, agentes activos superficiales, tales como complejos inmuno estimulantes (ISCOMS) , auxiliar incompleto de Freund, análogo de LPS que incluye el Lípido A de monofosforilo (MPL) , péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno, y ácido hialurónico. En las modalidades que se relacionan con métodos de inmunización, se seleccionan coagentes que de preferencia mejoren las respuestas inmunes. En las modalidades que se relacionan con los métodos de inmunosupresión, se seleccionan coagentes que no mejoren las respuestas inmunes. En algunas modalidades preferidas, las construcciones genéticas de la invención se formulan con, o se administran en conjunción con un facilitador seleccionado a partir del grupo que consiste de esteres de ácido benzoico, anuidas, amidinas, uretanos, y las sales de clorhidrato de los mismos, tales como aquellas de la familia de anestésicos locales. En algunas modalidades preferidas los facilitadores pueden ser un compuesto que tenga una de las siguientes fórmulas: Ar - R1 - O - R2 - R3 Ar - N - R1 - R2 - R3 o R4 - N - R5 - R6 o R4 - 0 - R1 - R7 en donde : Ar es benceno, p-aminobenceno, m-aminobenceno, o-aminobenceno, benceno sustituido, p-aminobenceno sustituido, 177-aminobenceno sustituido, o-aminobenceno sustituido, en donde el grupo amino en los compuestos de aminobenceno puede ser amino, alquilamina de 1 a 5 átomos de carbono, 1 a 5 átomos de carbono, dialquilamina de 1 a 5 átomos de carbono, y las sustituciones en los compuestos sustituidos son halógeno, alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, y alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono; R1 es C=0; R2 es alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, incluyendo alquilos ramificados; R3 es hidrógeno, amina, alquilamina de 1 a 5 átomos de carbono, 1 a 5 átomos de carbono, dialquilamina de 1 a 5 átomos de carbono; R2 + R3 pueden formar un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, un heterociclo, un heterociclo sustituido por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, incluyendo un heterociclo sustituido en N por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono; R4 es Ar, R2 o alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, un heterociclo, un heterociclo sustituido por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, y un heterociclo sustituido por alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, incluyendo un heterociclo sustituido en N por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono; R5 es C=NH; R6 es Ar, R2 o alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, un heterociclo, un heterociclo sustituido por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, y un heterociclo sustituido por alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, incluyendo un heterociclo sustituido en N por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono; y R7 es Ar, R2 o alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, un heterociclo, un heterociclo sustituido por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, y un heterociclo sustituido por alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, incluyendo un heterociclo sustituido en N por alquilo de 1 a 10 átomos de carbono . Los ejemplos de esteres incluyen: esteres de ácido benzoico tales como piperocaína, meprilcaína, e isobucaína; esteres de ácido para-aminobenzoico tales como procaína, tetracaína, butetamina, propoxicaína, y cloroprocaína; esteres de ácido meta-aminobenzoico incluyendo metabutamina y primacaína; y esteres de ácido para-etoxibenzoico tales como paretoxicaína. Los ejemplos de anuidas incluyen lidocaína, etidocaína, mepivacaína, bupivacaína, pirrocaína y prilocaína. Otros ejemplos de esos compuestos incluyen dibucaína, benzocaína, diclonina, pramoxina, proparacaína, butacaína, benoxinato, carbocaína, bupivacaína de metilo, picrato de butasina, fenacaína, diotan, lucaína, intracaína, nupercaína, metabutoxicaína, piridocaína, bifenamina y bicíclicos botánicamente derivados tales como cocaína, cinamoilcocaína, truxilina y cocaetileno, y todos aquellos compuestos complejados con clorhidrato. En las modalidades preferidas, el facilitador es bupivacaína. La diferencia entre bupivacaína y mepivacaína es que la bupivacaína tiene un grupo N-butilo en lugar de un grupo N-metilo de mepivacaína. Los compuestos pueden tener en N, de 1 a 10 átomos de carbono. Los compuestos se pueden sustituir con halógeno tal como procaína y cloroprocaína. Se prefieren las anuidas. El agente facilitador se administra antes de, simultáneamente con, o subsecuente a la construcción genética. El agente facilitador y la construcción genética se pueden formular en la misma composición. La Bupivacaína - HCl se designa químicamente como 2-piperidincarboxamida, 1-butil-N- (2 , 6-dimetilfenil) -monoclorhidrato, monohidrato, y está ampliamente disponible comercialmente para usos farmacéuticos, con cualquier fuente incluyendo Astra Pharmaceutical Productos Inc. (Westboro, MA) y Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (Nueva York, NY) , Eastman Kodak (Rochester, NY) . La bupivacaína está comercialmente formulada con y sin metilparabeno, y con o sin epinefrina. Se puede usar cualquiera de esas formulaciones. Estas están comercialmente disponibles para uso farmacéutico en una concentración de 0.25 por ciento, 0.5 por ciento, y 0.75 por ciento, las cuales se pueden usar en la invención. Si se desea se pueden preparar concentraciones alternativas, particularmente aquellas entre 0.05 por ciento - 1.0 por ciento, las cuales producen efectos deseables. De conformidad con la presente invención, se administran de aproximadamente 250 µg a aproximadamente 10 miligramos de bupivacaína. En algunas modalidades, se administran de aproximadamente 0.5 miligramos a aproximadamente 3.0 miligramos. En algunas modalidades, se administran de aproximadamente 5 a 50 µg. Por ejemplo, en algunas modalidades se administran de aproximadamente 50 µl a aproximadamente 2 mililitros, de preferencia de 50 µl a aproximadamente 1500 µl, y de más preferencia aproximadamente 1 mililitro de bupivacaína al 0.25-0.50 por ciento - HCl y metilparabeno al 0.1 por ciento, en un portador farmacéutico isotónico, en el mismo sitio que la vacuna anterior, simultáneamente con, o después de que se administra la vacuna. De manera similar, en algunas modalidades, se administran de aproximadamente 50 µl a aproximadamente 2 mililitros, de preferencia de 50 µl a aproximadamente 1500 µl, y de más preferencia aproximadamente 1 mililitro de bupivacaína al 0.25-0.50 por ciento - HCl, en un portador farmacéutico isotónico, en el mismo sitio que la vacuna anterior, simultáneamente con, o después de que se administra la vacuna. Se pueden administrar bupivacaína y otros compuestos que actúen de manera similar, particularmente aquellos de la familia relacionada de anestésicos locales, en concentraciones que proporcionen la facilitación de captación deseada de las construcciones genéticas por parte de las células.

. En algunas modalidades de la invención, primero se somete al individuo a la inyección del facilitador, antes de la administración de la construcción genética. Esto es, hasta, por ejemplo, aproximadamente de una semana a diez días antes de la administración de la construcción genética, primero se le inyecta al individuo con el facilitador. En algunas modalidades, al individuo se le inyecta el facilitador aproximadamente de 1 a 5 días, en algunas modalidades 24 horas, antes o después de la administración de la construcción genética. De conformidad con lo anterior, el facilitador y la construcción genética se pueden combinar para formar una sola composición farmacéutica. En algunas modalidades, las construcciones genéticas se administran libres de agentes facilitadores, esto es, las formulaciones libres de agent4s facilitadores usando los protocolos de administración en las cuales las construcciones genéticas no se administran en conjunción con la administración de los agentes facilitadores. En algunas modalidades que se relacionan con la inmunización, las construcciones de gen de la invención pueden permanecer como parte del material genético en microorganismos vivos atenuados o vectores microbianos recombinantes. Además de usar las formas expresables de las secuencias de codificación de las proteínas mutantes CD80, CD80?C, la presente invención se relaciona con vacunas vivas atenuadas mejoradas y vacunas mejoradas que usan vectores recombinantes para administrar genes extranjeros que codifican los antígenos. En las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,722,848 5,017,487 5,077,044; 5,110,567; 5,112,749; 5,174,993 5,223,424 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441 5,294,548 5,310,668; 5,387,744; 5,389,366; 5,424,065 5,451,499 5,453,364; 5,462,734; 5,470,734; y 5,482,713, las cuales se incorporan a la presente como referencia, se describen los ejemplos de vacunas vivas atenuadas y aquellas que usan vectores recombinantes para administrar antígenos extranjeros. Se proporcionan las construcciones de gen, las cuales incluyen la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína mutante CD80?C se enlaza de manera operable con las secuencias reguladoras que pueden funcionar en la vacuna para efectuar la expresión. Las construcciones de gen se incorporan en las vacunas vivas atenuadas y las vacunas recombinantes para producir vacunas mejoradas de conformidad con la invención. Las construcciones de gen pueden ser parte de genomas de vacunas virales recombinantes, en donde el material genético o se integra dentro del cromosoma de la célula, o permanece extracromosomal . En algunas modalidades que se relacionan con la respuesta no inmune que induce la terapia, las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína de la región CD80 C se pueden administrar usando cualquiera de una variedad de componentes de administración, tales como vectores de expresión viral recombinantes u otros elementos de administración adecuados, a modo de afectar su introducción y expresión en las células anfitrionas compatibles. En general, los vectores virales pueden ser virus de ADN tales como adenovirus recombinantes y virus de vaccinia recombinantes o virus de ARN, tales como los retrovirus recombinantes . Otros vectores recombinantes incluyen procariotes recombinantes que puedan infectar células y expresar los genes recombinantes. Además de los vectores recombinantes, también se contemplan otros componentes de administración tales como encapsulación en liposomas, transfección mediada con transferina y otros elementos mediados con receptor. Se pretende que la invención incluya estas otras formas de vectores de expresión y otros medios de administración adecuados, los cuales sirven funciones equivalentes y los cuales se harán conocidas en la técnica subsecuentemente a la presente. En una modalidad preferida de la presente invención, el ADN se administra a las células anfitrionas del componente por medio de un adenovirus. Alguien de experiencia en la técnica entenderá fácilmente esta técnica para administrar el ADN a una célula anfitriona a través de estos medios. Aunque la invención incluye de preferencia adenovirus, se pretende que la invención incluya cualquier virus que presta funciones equivalentes. En otra modalidad preferida de la presente invención, el ARN se administra a las células anfitrionas del componente por medio de un retrovirus . Alguien experto en la técnica entenderá fácilmente esta técnica de administración de ARN a una célula anfitriona por medio de estos medios. Se pretende que se incluya en la presente cualquier retrovirus que sirva para expresar la proteína que codificó el ARN. Algunas modalidades de la invención se relacionan con las proteínas y métodos para usar las mismas. Por ejemplo, en algunos métodos de inmunización, se administran proteínas inmunogénicas y proteínas mutantes CDßO?C a los individuos. De igual manera, el algunos métodos para tratar enfermedades autoinmunes y evitar rechazos por injertos/transplantes mediante la inmunosupresión. Las proteínas de región CD80 C se administran a los individuos. Como se usa en la presente, se pretende que el término "proteínas de la invención" signifique proteína inmunogénicas, proteínas mutantes CD80?C y proteínas de región CD80 C, las cuales se pueden producir a través de medios similares y las cuales se pueden formular y administrar de una manera similar para usarse en los métodos de la invención. Los vectores que incluyen vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas de la invención, se pueden producir de manera rutinaria. Como se usa en la presente, el término "vector de expresión recombinante" quiere decir un plásmido, fago, partícula viral u otro vector el cual, cuando se introduce dentro de un anfitrión apropiado, contiene los elementos genéticos necesarios para dirigir la expresión de una secuencia de codificación. Alguien que tenga experiencia ordinaria en la técnica, puede aislar o sintetizar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención e insertarla dentro de un vector de expresión, usando las técnicas estándares y materiales de inicio que están fácilmente disponibles. La secuencia de codificación se enlaza de manera operable con las secuencias reguladoras necesarias. Los vectores de expresión son bien conocidos y están disponibles fácilmente. Los ejemplos de vectores de expresión incluyen plásmidos, fagos, vectores virales y otras moléculas de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que contienen vehículos útiles para transformar las células anfitrionas y facilitan la expresión de las secuencias de codificación. Algunas modalidades de la invención se relacionan con los vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína mutante CD80?C o una proteína de región CD80 C. Los vectores de expresión recombinantes de la invención son útiles para transformar anfitriones. La presente invención se relaciona con vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una , A .*«-, .A.ÍA proteína mutante CD80?C, una proteína quimérica que comprende una proteína mutante CD80?C, o una proteína de región CD80 C. La presente invención se relaciona con una célula anfitriona que comprende el vector de expresión recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína mutante CD80?C, una proteína quimérica que comprende una proteína mutante CD80?C o una proteína de región CD80 C. Las células anfitrionas para usarse en los sistemas de expresión recombinantes bien conocidos para la producción de proteínas, son bien conocidas y están disponibles fácilmente. Los ejemplos de células anfitrionas incluyen células de bacterias tales como E. coli , células de levadura tal como S. cerevisiae, células de insectos tal como S . frugiperda, células de cultivo de tejido de mamífero no humano, células de ovario de hámster chino (CHO) y células de cultivo de tejido humano, tal como células HeLa. En algunas modalidades, por ejemplo, alguien de experiencia ordinaria en la técnica puede, usando las técnicas bien conocidas, insertar las moléculas de ADN dentro de un vector de expresión disponible comercialmente para su uso en sistemas de expresión bien conocidos. Por ejemplo, el plásmido pSE420 disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, CA) se puede usar para la producción de una proteína mutante CD80?C en E. coli . El plásmido pYES2 disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse, por ejemplo, para la producción en cepas de S. cerevisiae de levadura. El sistema de expresión de baculovirus completo MAXBAC" disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse, por ejemplo, para la producción en células de insectos. El plásmido pcADNI o pcADN3 disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse, por ejemplo, para la producción en células de mamíferos tales como células de Ovario de Hámster Chino. Alguien que tenga experiencia en la técnica puede usar estos vectores y sistemas de expresión comerciales u otros, para producir las proteínas de la invención usando las técnicas de rutina y materiales de inicio disponibles fácilmente (Vea, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning a Laboratory Manual , segunda edición, Cold Spring Harbor Press (1989) , el cual se incorpora a la presente como referencia) . De esta manera, se pueden preparar las proteínas deseadas tanto en sistemas procarióticos como eucarióticos, dando como resultado un espectro de formas procesadas de la proteína. Alguien que tenga experiencia ordinaria en la técnica, puede usar cualesquier otros vectores y sistemas de expresión disponibles comercialmente, o producir los vectores usando métodos bien conocidos y materiales de inicio disponibles fácilmente. Los sistemas de expresión que contienen las secuencias de control de requisito, tales como promotores y señales de poliadenilación, y de preferencia intensificadores, están disponibles fácilmente y se conocen en la técnica para una variedad de anfitriones. Vea, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning a Laboratory Manual , segunda edición, Cold Spring Harbor Press (1989) . El vector de expresión que incluye el ADN que codifica una proteína de la invención, se usa para transformar el anfitrión compatible, el cual se cultiva entonces y se mantiene bajo condiciones en donde tiene lugar la expresión del ADN extranjero. La proteína de la invención que se produce de esta manera, se recupera del cultivo, ya sea mediante la disolución de las células por acción de las lisinas o a partir del medio de cultivo, según sea apropiado y conocido para aquellos en la técnica. Alguien con experiencia ordinaria en la técnica puede, usando técnicas bien conocidas, aislar la proteína de la invención que se produjo usando estos sistemas de expresión. Los métodos para purificar las proteínas de la invención a partir de fuentes naturales, usando anticuerpos que se fijan de manera específica a esa proteína son rutina, tal como lo son los métodos para generart esps anticuerpos (Vea: harlow, E. y Lañe, E., AntiJbodies: A Laboratory manual , 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, la cual se incorpora a la presente como referencia) . Estos anticuerpos se pueden usar para purificar las proteínas que se producen mediante la metodología de ADN recombinante o fuentes naturales . Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen los promotores a partir de citomegalovirus o SV40. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen virus de leucemia mamaria de ratón o promotores de metalotioneína. Aquellos que tengan experiencia ordinaria en la técnica, pueden producir fácilmente construcciones genéticas útiles para transfectarlas con células con ADN que codifica las proteínas de la invención a partir de materiales de inicio disponibles fácilmente. Estas construcciones de gen son útiles para la producción de las proteínas de la invención. Además de producir las proteínas de la invención mediante técnicas recombinantes, también se pueden emplear sintetizadores de péptido automáticos, para producir las proteínas de la invención. Estas técnicas son bien conocidas para aquellos que tengan experiencia ordinaria en la técnica y son útiles si son derivados que tienen sustituciones para las que no se ha provisto en la producción de proteínas codificadas por ADN. Las proteínas de la invención se pueden preparar mediante cualesquiera de las siguientes técnicas conocidas. De manera conveniente, las proteínas de la invención se pueden preparar usando la técnica sintética de fase sólida que describe Merrifield, en J. Am . Chem. Soc . , 15:2149-2154 (1963), la cual se incorpora a la presente como referencia.

Otras técnicas de síntesis de proteínas se pueden encontrar, por ejemplo, en M. Bodansky y colaboradores, (1976) Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2a edición, la cual se incorpora a la presente como referencia; Kent y Clark-Lewis en Synthetic Peptides in Biology and Medicine, páginas 295-358, eds. Alitalo, K. Y colaboradores, Science Publishers, (Amsterdam, 1985) , la cual se incorpora a la presente como referencia, así como otros trabajos de referencia bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Se puede encontrar un resumen de las técnicas de síntesis en J. Stuart y J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984) , la cual se incorpora a la presente como referencia. También se puede usar la síntesis mediante métodos de solución, como se describe en The Proteins, volumen II, 3a edición, páginas 105-237, Neurath, H. y colaboradores, Eds., Academic Press, Nueva York, NY (1976) , las cuales se incorporan a la presente como referencia. Los grupos protectores apropiados para usarse en estas síntesis se encontrarán en los textos anteriores, así como en J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Nueva York, NY (1973), los cuales se incorporan a la presente como referencia. En general, estos métodos sintéticos incluyen la adición secuencial de uno o más residuos de aminoácidos o residuos de aminoácidos protegidos adecuados a una cadena de péptidos en crecimiento. Normalmente, ya sea el grupo amino o el carboxilo del primer residuo aminoácido se protege mediante un grupo protector removible de manera selectiva, adecuado. Un grupo de protección removible de manera selectiva, diferente, se utiliza para los aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, tal como la lisina. Usando una síntesis de fase sólida como un ejemplo, el aminoácido protegido o derivado se une a un soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino desprotegido. El grupo de protección del grupo amino o carboxilo se remueve entonces de manera selectiva y el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) protegido de manera adecuada, se mezcla y se hace reaccionar con el residuo que ya está unido al soporte sólido. El grupo de protección del grupo amino o carboxilo e remueve entonces de este residuo de aminoácido que se agregó recientemente, y después se agrega el siguiente aminoácido (protegido de manera adecuada), y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se hayan enlazado en la secuencia apropiada, se remueve cualesquier grupos de protección de grupo terminales y laterales (y el soporte sólido) de manera secuencial o concurrente, para proporcionar el péptido final. El péptido de la invención está * de preferencia desprovisto de aminoácidos benzilatados o metilbenzilatado. Estas fracciones de los grupos de protección se pueden usar en el curso de la síntesis, pero se remueven antes de que se usen los péptidos. Pudieran ser necesarias reacciones adicionales, como se describe en algún otro lugar, para formar enlaces intramoleculares para 5 restringir la conformación. En algunas modalidades, las proteínas se pueden producir en animales transgénicos. La presente invención se relaciona con un mamífero no humano transgénico que comprende el vector de expresión recombinante que comprende una 10 secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína mutante CD80?C o la proteína de región CD80 C. Los mamíferos no humanos transgénicos útiles para producir proteínas recombinantes, son bien conocidas así como los vectores de expresión necesarios y las técnicas para generar los animales 15 transgénicos. En general, el animal transgénico comprende un vector de expresión recombinante en el cual la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína mutante CD80?C o la proteína de región CD80 C, se enlaza de manera operable a un promotor específico de célula mamaria mediante lo cual la 20 secuencia decodificación se expresa solamente en las células mamarias y la proteína recombinante que se expresa de esa manera, se recupera a partir de la leche del animal. Alguien que tenga experiencia ordinaria en la técnica que use técnicas estándares, tales como aquellas que se enseñan en la 25 Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número ^g^g§^g** 4,873,191, emitida el 10 de octubre de 1989 a Wagner, y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,736,866, emitida el 12 de abril de 1998 a Leder, las cuales se incorporan a la presente como referencia, pueden producir una proteína mutante CD80?C o la proteína de región CD80 C. Los animales preferidos son cabras y roedores, particularmente ratas y ratones. Se contemplan las sustituciones conservativas de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la invención. Como se usa en la presente, el término "sustituciones conservativas" quiere hacer referencia a las sustituciones de aminoácido de los residuos CD80 con otros residuos que comparten características estructurales y/o de carga similares . Aquellos con experiencia ordinaria en la técnica pueden diseñar fácilmente las proteínas de la invención con sustituciones conservativas de aminoácidos, basados en los grupos conservativos bien conocidos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar mediante cualesquier medios que habiliten el agente activo para alcanzar el sitio acción del agente en el cuerpo de un mamífero. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en un número de maneras, dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistémico y sobre el área que se va a tratar. La administración puede ser tópica (que incluye la oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, transdérmica) , oral o parenteral. Debido a que los péptidos son sujetos a ser digeridos cuando se administran de manera oral, las formulaciones orales se formulan para recubrir de manera entérica el agente activo o para protegerlo de cualquier otra manera de la degradación en el estómago (tal como la neutralización previa) . La administración parenteral incluye el goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, administración pulmonar, por ejemplo, por medio de inhalación o insuflación, o la administración intratecal o intraventricular. En las modalidades preferidas, la administración parenteral, es decir, intravenosa, subcutánea, transdérmica, intramuscular, se usa ordinariamente para optimizar la absorción. La administración intravenosa se puede conseguir con la ayuda de una bomba de infusión. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se pueden formular como una emulsión. Alguien experto en la técnica comprenderá fácilmente la multitud de medios farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en la presente invención. En Remington ' s Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo, el cual se incorpora a la presente como referencia, se describen los portadores farmacéuticos adecuados. Las formulaciones para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, rocíos, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, acuosos, polvo o bases aceitosas, espesantes y similares, podrían ser necesarios o deseables. Las composiciones para la administración oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sacos o tabletas. Los espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionadores, ayudas de dispersión o aglutinantes, podrían ser deseables. Las composiciones para la administración parenteral, intravenosa, intratecal, o intraventricular, pueden incluir soluciones acuosas estériles las cuales pueden contener también reguladores del pH, diluyentes y otros aditivos adecuados y son de preferencia estériles y libres de pirógenos. Las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración intravenosa de conformidad con la invención, son estériles y libres de pirógenos. Para la administración parenteral, los péptidos de la invención pueden formularse, por ejemplo, como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de estos vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y albúmina de suero humano al 5 por ciento. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos, tales como aceites fijados. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo, reguladores del pH y conservadores) . La formulación se esteriliza mediante las técnicas que se usan comúnmente. Por ejemplo, una composición parenteral adecuada para la administración mediante inyección, se preparar por medio de disolver 1.5 por ciento en peso del ingrediente activo en solución de cloruro de sodio al 0.9 por ciento. Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención, se pueden administrar como una sola dosis o en múltiples dosis. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar ya sea como agentes terapéuticos individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los tratamientos de la presente invención se pueden combinar con terapias convencionales, las cuales se pueden administrar de manera secuencial o simultánea. La dosis varía dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular, y su modo y ruta de administración; edad, salud, y peso del receptor; naturaleza y extensión de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Se cree que la formulación de las composiciones terapéuticas y su administración subsecuente, está dentro de la experiencia de aquellos en la técnica. Usualmente, la dosis del péptido puede ser de aproximadamente ,.z 1 a 3000 miligramos por 50 kilogramos de peso corporal; de preferencia de 10 a 1000 miligramos por 50 kilogramos de peso corporal; de más preferencia de 25 a 800 miligramos por 50 kilogramos de peso corporal. Ordinariamente, se administran de 8 a 800 miligramos a un individuo por día en dosis divididas, de 1 a 6 veces por día o en forma de liberación sostenida es efectiva para obtener los resultados deseados. Dependiendo del método para el cual se están administrando la proteína o proteínas, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular y administrar de la manera más eficiente. Los modos de administración serán aparentes para alguien experto en la técnica, en vista de la presente descripción. Los métodos de la presente invención son útiles en los campos de la medicina tanto humana como veterinaria. De conformidad con lo anterior, la presente invención se relaciona con la inmunización genética de mamíferos, aves y peces. Los métodos de la presente invención pueden ser particularmente útiles para las especies de mamíferos que incluyen las especies humana, bovina, ovina, porcina, equina, canina y felina. Los Ejemplos que se muestran más adelante, incluyen ejemplos representativos de aspectos de la presente invención. No se desea que los ejemplos limiten el alcance de la invención, sino más bien, que sirvan propósitos ejemplares. Además, se pueden resumir diferentes aspectos de la invención mediante la siguiente descripción. Sin embargo, no se pretende que esta descripción limite el alcance de la invención, sino que más bien destaque diferentes aspectos de la invención. Alguien de experiencia ordinaria en la técnica puede apreciar fácilmente los aspectos adicionales y modalidades de la invención.

EJEMPLO En un esfuerzo para determinar porqué se requiere la CD86, pero no la CD80, para el aumento de las respuestas de la célula T, y para estudiar adicionalmente el análisis de función de la estructura de CD80 y CD86, el cual ha revelado varias áreas críticas incluidas en la fijación a la CD28 y la CTLA-4, incluyendo los residuos que se encuentran tanto en los dominios V- y C- de CD80, se examinó el papel de las diferentes regiones de las moléculas CD80 y CD86 en la activación de la célula T usando la coinmunización de ratones con inmunógeno de ADN y formas quiméricas o truncadas de codificación de ADN de las moléculas CD80 y CD86. Métodos Preparación de las construcciones: Se preparó una construcción de vacuna de ADN que codifica para la proteína de envoltura HIV-IMN (pcEnv) , como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,593,972. Se clonaron genes de CD80 y CD86 humanos a partir de la genoteca de ADNc de célula B (Clontech, Palo Alto, CA) y se colocó dentro de pSRaneol+, un vector de expresión. De manera más específica, los genes CD80 y CD86 se amplificaron por reacción de cadena de la polimerasa, como se describe en Kim y colaboradores (1997) Nature Biot . 15:641-645, la cual se incorpora a la presente como referencia, y se ligan dentro del pSRaneol+ corriente abajo del promotor SRa para fabricar los vectores de expresión pCD80 y pCD86. Las variantes quimérica y truncada de estos dos genes, se generaron mediante amplificación por reacción de cadena de polimerasa usando el sistema de Polimerasa de Alta Fidelidad Expand" (Boehringer-Mannheim. Alemania) . Para la construcción de todas estas formas de moléculas coestimuladoras, se usaron el pCD80 o el pCD86 como las plantillas de la reacción de cadena de polimerasa. Se han usado los siguientes cebadores en estas reacciones: A: CTGCTTGCTCAACTCTACGTC - SEQ ID NO : 1 (adelante, vector) B: CTGAAGTTAGCTTTGACTGATAACG - SEQ ID NO : 2 (reversa, CD80) C: GCAATAGCATCACAAATTTCA - SEQ ID NO : 3 (reversa, vector) D: CAGTCAAAGCTAACTTCAGTCAACC - SEQ ID NO : 4 (adelante, CD86) E: GGGAAGTCAGCAAGCACTGACAGTTC - SEQ ID NO : 5 (reversa, CD86) F: TCAGTGCTTGCTGACTTCCCTACACC - SEQ ID NO : 6 (adelante, CD80) G: TCTTGCTTGGCTTTGACTGATAACGTCAC- SEQ ID NO : 7 (reversa, CD80) H: TCAGTCAAAGCCAAGCAAGAGCATTTTCC-SEQ ID NO : 8 (adelante, CD80) ....

I: TCCTCAAGCTCAAGCACTGACAGTTC - SEQ ID NO : 9 (reversa, CD86) J: TCAGTGCTTGAGCTTGAGGACCC - SEQ ID O:10 (adelante, CDd6) K: TCTGGATCCTCATCTTGGGGCA - SEQ ID NO: 11 (reversa, CDdO) L: TCTGGATCCTCATTTCCATAG - SEQ ID NO: 12 (reversa, CD86) Se amplificó el dominio V de CD80 usando los cebadores A y B, el dominio C, la transmembrana (TM) y la cola citoplásmica (T) de CDd6 se amplificaron usando los cebadores C y D. Después se purificaron estos fragmentos, se combinaron y se usaron como plantillas en la reacción de cadena de polimerasa del segundo paso, usando los cebadores hacia delante (CTGCTTGCTCAACTCTACGTC - SEQ ID NO:l) y de reversa (GCAATAGCATCACAAATTTCA - SEQ ID NO: 3) . El producto de la reacción de cadena de polimerasa se ligó dentro del vector pSRaneol+ y el plásmido resultante (pV80C86T86) codifica una molécula coestimuladora quimérica que expresa el dominio V de CD80 y las regiones C- , TM- y T- de CD66. El punto de cruzamiento quimérico es en la alanina conservada 106 en la CDdO y la alanina 111 en la posición CD86 y respeta los límites del exón. El siguiente plásmido pV86C80T80, el cual codificó el dominio V día CD86 y las regiones C-, TM- y T- día CDdO, se construyo mediante la amplificación de la región V día CD86, usando los cebadores A y E. El fragmento de la reacción de cadena de polimerasa que codifica os dominios C-, TM- y* T día CDdO, se amplificó usando los cebadores C y F. La reacción de cadena de polimerasa de la segunda etapa y la clonación, se realizaron como se mencionó anteriormente. También se prepararon las formas truncadas de las moléculas coestimuladoras sin el dominio C (pV80C?T80, pV86 C?T86) mediante la técnica de reacción de cadena de polimerasa de dos pasos. En el caso del pV80 C?T8 , se amplificó el dominio V usando los cebadores A y G, mientras que en el caso del pV86C(T86, el dominio V se amplificó usando los cebadores A e I . Los fragmentos TM/T de las moléculas truncadas del dominio C se amplificaron usando los cebadores C/H en el caso del pV80C(T80 y C/J en el caso del pV86CDT86. Las construcciones resultantes se prepararon mediante amplificación y clonación de los productos de la reacción de cadena de polimerasa dentro del vector de expresión pSRaneol+. Se verificaron todas las construcciones mediante la secuencia para ser leales a las plantillas de tipo silvestre originales CDdO y CDd6. Los mutantes de anulación resultantes carecieron del aspartato 107 hasta la treonina 200 del aminoácido en la CDdO y de la alanina 111 hasta la isoleucina 211 en la CDd6. De notarse, las dos moléculas se construyeron para retener de 6 a 7 aminoácidos proximales del dominio C respectivo. Finalmente, la supresión de la región T del pCDdO (pVdOCdOTO y el pCD86 (pV86Cd6T?) se generaron mediante la reacción de cadena de polimerasa de un solo paso, usando en ambos casos A como el cebador hacia delante y K y L como los cebadores de reversa, respectivamente. Los productos de la reacción de cadena de polimerasa se clonaron dentro del vector pSR(neol+. La proteína CD80 codificada termina después 5 del residuo del aminoácido de cola citoplásmica, la arginina. El gen resultante para la molécula CD66 terminó después del nucleótido 942 que preserva la primera lisina en la cola citoplásmica. Todas las construcciones quiméricas y truncadas, así 10 como las moléculas de tipo silvestre se clonaron dentro del vector SRaneol+. La expresión del gen esta bajo el control del promotor SRa, el cual se compone del promotor temprano del virus de simio 40 (SV40) y el segmento R y parte de la secuencia U5 (R-U5') de la repetición de terminal larga del 15 virus de leucemia de la célula T de tipo 1. Se verificaron todas las construcciones mediante secuenciamiento para ser fieles a las plantillas día CD60 y CDd6 de tipo silvestre originales . Expresión de los plásmidos: 20 Se analizó la expresión de estas construcciones mediante los ensayos de inmunofluorescencia y citometría de flujo (FACS) , usando células de rabdomiosarcoma (RD) humano que se transfectaron con plásmidos experimentales o de control. Las células se transfectaron mediante 25 electroporación usando 500µF de capacitancia y 0.25 de -**---***->- - -»" voltaje, usando Gene Pulse (Bio-Rad, Hercules, CA) . Para el ensayo de inmunofluorescencia, las células transfectadas se incubaron durante 2 días y después se transfirieron a portaobjetos de cultivo FalconR (Becton Dickinson, Bedford, MA) . Las células se lavaron al día siguiente, se fijaron con metanol (30', RT) , y se incubaron con anti-CDdO (Coulter, Miami, FL) o anticuerpos monoclonales CD86 (Pharmingen, San Diego, CA) (1.5 horas, 37°C) . Se lavaron los portaobjetos y se mancharon con IgG de cabra-anti ratón (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN) durante 1.5 horas a 37°C. Se observaron los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia OPTIPHOT de Nikon (Nikon Inc., Tokio, JAPÓN) y se obtuvieron las fotografías. Para el análisis de FACS, se transfectaron células RD con la mezcla de construcciones que codifican moléculas CD80 o CD66 (2µg) y el vector de expresión de la proteína fluorescente verde {10 µg (pcGFP de Clontech, Palo Alto, CA) } . Este último se uso como un plásmido de control para el cálculo de la eficacia de la transfección. La expresión de los plásmidos experimentales se confirmó usando anticuerpos monoclonales para el dominio V de las moléculas CDdO o CD66 (las dos de Pharmingen, San Diego, CA) que se conjugaron con PE. Brevemente, se agregó 1 µg de cualesquiera de los anticuerpos anti-B7 a las células transfectadas o de control (lOxlO5) . Se analizaron los datos mediante FACScan con la adquisición de datos de CELLQuest" y software (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José, CA) . Se midió la eficacia de la transfección (intensidad de fluorescencia) de las células que expresan diferentes moléculas B7 en la población de las células que expresan GFP. Inmunización de Animales: Cada ratón Balb/c recibió tres inyecciones intramusculares (con dos semanas de separación) con 50 µg de cada construcción de ADN vuelta a suspender en 100 µl de suero regulado con fosfato (PBS) y bupivacaína-HCl al 0.25 por ciento (Sigma, St . Louis, MO) . Esta dosis se seleccionó para maximizar el mejoramiento de las respuestas inmunes antivirales que proporciona la administración simultánea de diferentes adyuvantes moleculares (es decir, genes coestimuladores mutados, truncados, o de tipo silvestre) . Se inyectaron 50 µg de plásmido, que codifica la cobertura de HIV-1 gpl60 (pcEnv) solo o como una mezcla de pcEnv y 50µg de las diferentes construcciones de CD80/66 (adyuvantes moleculares) . Como un control, se usaron ratones y animales naturales que se inyectaron con vectores de control. En varios experimentos, se inyectaron los animales tres veces con la mezcla de dos adyuvantes moleculares (total de lOOµg) más pcEnv (50µg) . Dos semanas después de la última inyección, se aislaron los esplenocitos a partir de todos los animales experimentales y de control y se usaron para la detección de las respuestas de las células T y la producción de citocina. Ensayos inmunohistoquímicos sobre células musculares: Se examinó de manera inmunohistoquímica el músculo de pierna inmunizado para la detección de infiltración (presencia de linfocitos en el músculo) . Brevemente, se inoculó el músculo cuadríceps de ratón con 5Oµg de pcEnv mezclado con 50µg de plásmidos experimentales o de control. Siete días después de la inoculación, se sacrificaron los ratones y se removieron los músculos cuadríceps. Después se congeló el tejido del músculo fresco en compuesto de O.C.T.

(Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA) y se hicieron secciones congeladas de cuatro micrones. Se determinó el grado de inflamación por medio de examinar las secciones de músculo manchadas con hematoxilina y eosina (HyE) . Ensayo de linfocito T citotóxico: Se realizó un ensayo CTL de liberación de 51Cr de cinco horas. Brevemente, se estimularon los efectores seis días en la presencia de células estimuladoras y RAT-T-STIM al 10 por ciento, sin Con A (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) . Para la estimulación antigénica, se usaron células P-615 fijadas con glutaraldehído infectadas con el virus vaccinia recombinante, el cual expresa la proteína de envoltura HIV-1 (vMN462) (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) . Como células objetivo, se usaron células P-815 infectadas con el virus vaccinia recombinante (vMN462, específico) o de tipo silvestre (WR, no específico) . Las dos células objetivo se etiquetaron con 100 (Ci/mililitro Na251Cr04 y se mezcló con células efectoras en proporciones efector : objetivo (E:0) que fluctuaba de 100:1 a 125:1. Se determinó el porcentaje de disolución de células por acción de las lisinas específica, como se describió en Kim, 1997 supra. Se determinó la liberación máxima y mínima mediante la disolución de células por acción de las lisinas de las células objetivo en Tritón X-100 al 10 por ciento y medio, respectivamente. No se consideró válido un ensayo si el valor para los conteos de 'liberación espontánea' fueron en exceso del 20por ciento de la 'liberación máxima' . Para calcular la disolución de células por acción de las lisinas específica de los objetivos, se sustrajo el porcentaje de disolución de células por acción de las lisinas de los objetivos no específicos, del porcentaje de disolución de células por acción de las lisinas de los objetivos específicos. En algunos experimentos, se removieron las células T de CD8+ del cultivo de esplenocitos mediante el tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-CDd (53-6.7, ATCC), seguido por la incubación con complemento de conejo no tóxico (Sigma) Producción de Citocina: El nivel de diferentes citocinas liberadas mediante las células inmunes refleja la dirección y magnitud de la respuesta inmune. Por lo tanto, se recolectó y se probó el sobrenadante a partir de las células efectoras que se estimuló in vi tro para el ensayo CTL, por la liberación de ?lFN, IL-4, e IL-2, usando los equipos de ELISA disponibles (Biosource, Camarillo, CA) . Resultados Expresión de Plásmidos, que Codifican Formas de Tipo Silvestre y Mutadas de CDdO y CDd6: Primero se analizó la expresión de diferentes formas de las construcciones CDdO o CDd6 dentro de células de tumor de músculo RD que se transfectaron de manera temporal con los plásmidos de control o experimentales . Usando una técnica de inmunofluorescencia, se observó que las células experimentales, pero no las de control (que se transfectaron con el vector solo) , produjeron el tipo silvestre así como todas las formas diferentes de moléculas coestimuladoras mutadas. Las eficiencias de la transfección de estas moléculas se estudiaron mediante el ensayo FACS. En estos experimentos, se transfectó una mezcla de plásmido de control, GFP de codificación y construcciones experimentales, que codifican diferentes formas de moléculas coestimuladoras. Se detectó la intensidad de fluorescencia de las células que expresan las moléculas B7, solamente en la población de células que expresan GFP. Los resultados demostraron que la mayoría de las formas quiméricas y truncadas de CDd6 y de las moléculas de tipo silvestre CD86 y CD86 se habían expresado de manera similar (Tabla 3) . Solamente dos construcciones, que codifican el tipo silvestre CDdO (pCD80) y la CDd6 borrado de la cola citoplásmica (pV86Cd6T?) , se expresaron en la superficie de las células transfectadas relativamente más elevado que otros plásmidos. Los dos dominios V de CD86 y CDdO son importantes para la activación de la respuesta CTL específica del virus y la producción de la citocina Thl Las moléculas B7 desempeñan un papel crítico en la inducción de la activación de las células T específicas del antígeno por medio de disparar los ligandos apropiados que se expresan en estas células. Anteriormente, se reportó que la administración conjunta día CDd6 de tipo silvestre, pero no el ADNc de CDdO junto con el inmunógeno de ADN, mejoró las respuestas de las células T específicas del antígeno (Kim y colaboradores, 1997 supra) . Para determinar el papel de la región V día CDd6 en esta activación, se intercambiaron estos dominios de CDdO y CD66 (Tabla 3) y se coinmunizaron ratones con construcciones que codificaban estas moléculas, junto con el plásmido que codifica las proteínas virales. Como un control positivo, las construcciones que expresaban la CDdO y CD66 de tipo silvestre se inyectaron conjuntamente junto con el inmunógeno de ADN, y los ratones de control negativo recibieron solamente el vector. Dos semanas después de la última inmunización, se analizaron las respuestas de CTL antivirus en los cultivos de esplenocitos. Se observó un nivel de fondo de eliminación específica en los esplenocitos que se obtuvieron a partir de los animales de control y se observó un nivel bajo de eliminación en los animales que se coinmunizaron con pcEnv o pcEnv más pCDdO. Sin embargo, los ratones que se coinmunizaron con pcEnv y pCDd6 dio como resultado un nivel elevado de CTL específico de envoltura (Tabla 4) . Por lo tanto, usando los genes CDdO y CD66 que se insertaron en el vector pSRaneol+, en lugar del vector pCDNA3 que se usó previamente, se confirmó que la CDdO y la CD66 desempeñan papeles diferenciales en la modulación de las respuestas inmunes celulares después de la vacuna con ADN. Después se analizaron las respuestas de CTL antivirales en los ratones que se inmunizaron con las moléculas quiméricas. La coinmunización de los ratones con pV86C60TdO y pcEnv no generaron células citotóxicas específicas del virus, pero la inmunización de los ratones con la mezcla de pV80Cd6T86 y pcEnv indujo más del 40 por ciento de actividad de CTL anti-HIV-1 a una proporción E:T de 1:100. Esta respuesta fue similar a la actividad de CTL antiviral en los ratones que se coinyectaron con pcEnv más pCD86 (Tabla 4) . De esta manera, la región V día CD80 fue tan importante para la activación de las células T específicas del antígeno, que la región V de la molécula CD66, si se expresó con el dominio C y la cola citoplásmica de la molécula CDd6. Sin embargo, el dominio V de CD86 fue funcionalmente silencioso cuando se expresó con el dominio C y la cola citoplásmica de CDdO. Estos resultados se apoyaron mediante los datos de producción de la citocina. 5 El sobrenadante a partir de los esplenocitos que se obtuvieron de los ratones que se inyectaron con pcEnv y pcEnv más pCDdO que indujo el nivel bajo de IL12, pero no producción de ?lFN o IL4 (Tabla 4) . En contraste, la coinmunización con pCEnv + pCD66 y pcEnv + pV80C86T86 indujo 10 el mejoramiento específico del antígeno significativo tanto de ?lFN como de IL12 (Tabla 4), pero no la producción de IL4. Estos resultados sugerirían que el dominio C y/o la cola citoplásmica de CD86 son importante en la señalización positiva para las células T, mientras que los mismos dominios 15 de CDdO no lo son. De manera alternativa, el dominio C y/o la cola citoplásmica de CDdO podrían estar incluidos para proporcionar las señales negativas para las células T. La cola citoplásmica de CD66 es crucial para la activación de la célula T específica del antígeno. 20 Se ha demostrado que se requiere la cola citoplásmica de B7 para la coestimulación de la célula T in vi tro por medio de permitir el agrupamiento del ligando sobre la superficie de la célula. De esta manera, para demostrar el papel de las colas citoplásmicas de la B7 en la 25 coestimulación de la célula T, los mutantes suprimidos de cola citoplásmica de B7 se construyeron y se coinyectaron ratones con estos plásmidos (pVdOCdOT? o pV66C66T?) y pcEnv. Las dos construcciones codificaron formas truncadas de moléculas CDdO o CD66 que indujeron la eliminación de niveles más bajos, mientras que los animales que se coinmunizaron con una mezcla de pcEnv y pCD86 demostraron respuestas de CTL antivirales fuertes (Tabla 4) . Los datos de soporte se generaron por medio de analizar la producción de la citocina Thl. Las construcciones CD80 y CDd6 sin colas citoplásmicas no mejoraron la producción de ?lFN después de la coinyección con la vacuna de ADN. La coinmunización de los ratones con pV66Cd6T? indujo un incremento similar de producción de IL12 en comparación con los ratones que se inyectaron con pcEnv o pcEnv más pVdOCdOT?. De manera importante, los animales de control que se inmunizaron con pcEnv más el ADN que codifica el tipo silvestre de CD66, indujo un mejoramiento significativo en la producción tanto de ?lFN, como de la citocina IL12 (Tabla 4) . De esta manera, la cola citoplásmica de la molécula CD66 fue importante para la activación de la célula T. Sin embargo, los ratones que se coinmunizaron con pcEnv más pVdOCdOT? no indujeron la activación de la célula T. Por lo tanto, la inclusión del dominio C y/o la cola citoplásmica de CDdO en la señalización negativa, permaneció sin determinar. Para resolver esta cuestión, a continuación se construyeron mutantes de supresión del dominio C de CDdO y CDd6. El dominio C, pero no la cola citoplásmica de CDdO, está incluido en la provisión de una señal negativa para las células T En el siguiente conjunto de experimentos, se coinmunizaron ratones con el inmunógeno pcEnv y plásmidos, que codifican solamente el dominio V y la cola citoplásmica de las moléculas CDdO (pVdOC?TdO) o CD66 (pV66C?Td6) . Como controles, los ratones se inyectaron solamente con pcEnv o con pcEnv más ya sea pCDdO o pCDd6. En la Figura 1 se presentan las respuestas de CTL antivirales específicas del antígeno a partir de estos experimentos. El efecto adyuvante de CD86 fue dramático y se retuvo a un grado menor en la molécula de supresión del dominio C de CD86. En contraste agudo con el muy pobre efecto en la activación de la célula T que indujo el tipo silvestre y las formas suprimidas de la cola citoplásmica de CDdO (Figura 1, Tabla 4) , el pVdOC?TdO fue muy efectivo en la coestimulación de la respuesta de CTL anti-Env (Figura 1) , lo que demuestra la ganancia de función a través de la pérdida del dominio C. Para investigar adicionalmente el mejoramiento de la inmunidad celular, se investigó la producción de las citocinas Thl, usando los esplenocitos de los ratones que se inmunizaron con pcEnv y plásmidos, que codifican las moléculas CDdO o CDd6 suprimidas del dominio C. Como controles, los ratones se coinmunizaron con pcEnv más ya sea CDdO o CD66. Los dos genes quiméricos pVd6C?T66 y pVdOC?TdO, así como la CD66 de tipo silvestre codificado con ADN, se coinyectaron junto con el pcEnv indujeron la producción de linfocina Thl igualmente bien (Figuras 2A y 2B) . Estos resultados demuestran que la cola citoplásmica de CDdO es funcional y es importante para la activación de la célula T in vivo. De manera más importante, los datos apoyan la conclusión de que el dominio C de CDdO, pero no de CDd6, puede proporcionar una señal "negativa" a las células T. Después, se analizó el papel inhibidor del dominio C de CDdO en la activación de la célula T. El dominio C de CDdO inhibe la activación de la célula T por parte de las moléculas CD66 Para demostrar la inclusión del dominio C de CDdO en la provisión de una señal negativa para las células T específicas del antígeno, se inmunizaron animales con el inmunógeno de ADN y una combinación de adyuvantes moleculares. Los ratones experimentales se coinmunizaron con el inmunógeno de ADN y una mezcla de pCDd6 con pCDdO o pCDd6 con pVdOCDTdO. Los animales de control se inyectaron solamente con pcEnv o se coinyectaron con pcEnv más pCD86, pCD80 o pVdOC(TdO. Los ensayos antivirales se realizaron con esplenocitos que se obtuvieron a partir de ratones experimentales o de control . Como se observó antes, la coinmunización de los ratones con el inmunógeno de ADN y el pCD66 o pVdOC(T60 indujo un mejoramiento significativo de la actividad de CTL (Figura 3) . Sin embargo, los ratones coinmunizados con pcEnv y la combinación de adyuvantes moleculares de tipo silvestre (pCD86 + pCD80) , no mejoraron la respuesta de CTL (la disolución de células por acción de las lisinas no fue mayor que en el grupo de control con pcEnv) . De manera importante, la combinación de pCDd6 y pVdOCDTdO todavía indujo un efecto adyuvante en los animales que se vacunaron y este efecto fue similar al efecto que se indujo en los animales que se inmunizaron con pCDd6 más el inmunógeno de ADN. Por lo tanto, la CDdO de tipo silvestre, pero no la CDdO mutante suprimido del dominio C, inhibió el mejoramiento de las respuestas CTL antivirales cuando se administró conjuntamente con el inmunógeno de ADN. Para verificar el papel de las células T de CD6" en la actividad citotóxica que se observó, se midió la actividad de CTL después de la remoción de esta población de células. Los esplenocitos se trataron con anticuerpos monoclonales anti-CD8 y complemento de conejo no tóxico. La remoción de las células T de CD8" dio como resultado la supresión de la actividad de CTL antiviral en los ratones que se coinyectaron con el inmunógeno de ADN y pCDd6. Nuevamente, no se observó ninguna actividad de CTL anti-HIV-1 en los ratones que se coinmunizaron con pcEnv+pCDdO+pCDd6 (Figura 4) . La expresión de CDdO suprimido del dominio C indujo una infiltración mayor de los linfocitos dentro del músculo de los animales inmunizados que la expresión día CDdO de tipo silvestre. Se ha reportado una infiltración marcadamente mayor de linfocitos dentro del músculo de ratones inmunizados con pCEnv+pCDd6 que en los animales de control o inmunizados con pCEnv+pCDdO. Las células de infiltración incluyeron las dos células CD4" y CDd". De esta manera, para determinar adicionalmente la capacidad de las moléculas CDdO suprimidas del dominio C para interactuar con las células T, se investigó la infiltración de las células dentro del tejido muscular, después de la coinyección de los ratones con pcEnv más pVdOC?TdO. Como un control, se usaron los animales que se inyectaron con el vector solo o con una mezcla de pcEnv más pCDdO o pCDd6. La coinyección de ratones con pCEnv+pCDd6, pero no con pcEnv+pCDdO, indujo una infiltración dramática de linfocitos dentro del tejido muscular (Figura 5) . Los animales normales no desarrollaron virtualmente ninguna infiltración. De manera más importante, la infiltración fue mucho mayor en el músculo de ratones que se inmunizaron con el inmunógeno de ADN y pVdOC?TdO. Por lo tanto, la supresión del dominio C cambió las propiedades coestimuladoras día CDdO para volver a ensamblar aquellas de un tipo silvestre de CD86. Los mutantes suprimidos del dominio C, CD80 y CDd6, tuvieron diferente afinidad de fijación al CTLA-4 5 Como se demostró anteriormente, la coinmunización de ratones con el inmunógeno de ADN y pCDd6 o pVdOC?T80, mejoraron la actividad de CTL, la producción de la citocina Thl, y la infiltración de células dentro del sitio de la inyección. En contraste, la inmunización con el inmunógeno de 10 ADN y pCD80, no tuvo un efecto similar. Nosotros presuponemos que la supresión del dominio C día CDdO, da como resultado una molécula con afinidad disminuida para CTLA-4. Esto da como resultado la capacidad para proporcionar una señal negativa potente a las células T. Usamos la resonancia de 15 plasmón superficial para comparar las diferencias en la afinidad de fijación de CTLA-4 entre CDdO y el mutante de supresión del dominio C de CDdO. Típicamente, las moléculas receptoras (contrarreceptoras) se inmovilizan en la superficie del detector y diferentes concentraciones del 20 contrarreceptor (receptor) fluyen de manera continua a través de este detector. Usando esta metodología, se mostró que la CTLA-4 soluble humano se fijó al CDdO soluble con la solución KD de 0.2-0.4 µM. Las células que expresaron el ligando de interés, se inmovilizaron sobre la superficie. La 25 inmovilización celular permite el acceso máximo de los epítopes de CD-dO de la superficie celular al volumen día CTLA-4-Ig soluble con la mínima distorsión de conformación de los ligandos. La difusión lateral dentro de la doble capa de la membrana permite la oligomerización fisiológica de los ligandos de CDdO después de la fijación al CTLA-4. Usando este planteamiento, se demostró que la CTLA-4-Ig se fija de manera específica a las células RD, que se transfectaron tanto con el tipo silvestre de CD80, como con las moléculas de supresión del dominio C de CD80. De manera importante, esta fijación fue dependiente de la concentración. Después de la sustracción de la señal no específica de la fijación de los anticuerpos monoclonales, se calcularon las afinidades. La asociación de CTLA-4-Ig con el receptor de CDdO de tipo silvestre, es 5 veces más rápida que con la CD80 mutante (parámetro de kencendido) , mientras que la disociación del complejo CTLA-4/CDd0 es 2.6 más lenta para el receptor de tipo silvestre (parámetro kapagado) • Debido a estas diferencias en la cinética, la interacción del tipo silvestre de CTLA-4-Ig/CD80, es 14 veces más fuerte que con el mutante de CDdO, como se refleja en KD. Por definición, los parámetros encendido y kapagado que se midieron mediante Biacore, no dependen del número de receptores, que se expresan en la superficie de la célula. De esta manera, la supresión de la región constante del receptor de CDdO tiene un efecto profundo en la interacción de CDdO-CTLa-4 misma.

Discusión La evidencia actual indica que una de las rutas coestimuladoras más importantes para la activación de la célula T, incluye la expresión de CDdO y CDd6 sobre APC. Estas moléculas interactúan con los receptores de la superficie de la célula T (CD28 o CTLA-4) y proporcionan señales secundarias importantes para la proliferación y la secreción de citocina. La señal coestimuladora crítica para la activación de la célula T, se proporciona a través de CD28, después de la fijación a los ligandos de B7. En contraste, la CTLA-4 induce principalmente una señal inhibitoria. La evidencia que define los papeles funcionales de las moléculas CDdO y CDd6 es más complicada. Se demostró en diferentes modelos principalmente in vi tro, que tanto la CDdO como la CD66, tiene papeles críticos en la activación de las células T. Sin embargo, la expresión de la CD86 más temprano que la CD80 sugiere fuertemente que la CD66 desempeña un papel más significativo en la iniciación de las respuestas inmunes de la célula T. Las diferencias entre la CDdO y la CD66 se pueden inferir por los datos de la cinética de fijación de las moléculas coestimuladoras con CD28 y CTLa-4. Recientemente, también se han documentado las diferencias funcionales entre las moléculas CDdO y CDd6 en muchos sistemas modelo que incluyen la inmunización con ADN. La molécula CD86, pero no la CDdO, es más importante L en la provisión de señales digitales a las células T después de la vacunación con ADN en ratones. Sin embargo, se ha reportado que la CD80 así como la CDd6, mejoran las respuestas de CTL cuando esta se expresa conjuntamente con el ADN del plásmido que codifica un minigen. Este resultado es diferente de los otros resultados reportados que sugieren que los epítopes libres más bien que los antígenos naturales, se pueden comportar de manera única. La similitud de los resultados a partir de diferentes grupos es instructiva, lo que sugiere que la expresión de la CD86 pudiera ser más importante que la de CD86 en la iniciación y expansión de las respuestas inmunes celulares in vivo. Para investigar adicionalmente el papel de las moléculas CDdO y Cdd6 en la activación de la célula T, se construyeron varias formas mutantes quiméricas y de supresión de la CDdO y la CD66 (Tabla 3) . Estos plásmidos se coinyectaron en ratones con un inmunógeno de Adn HIV-l/Env y se determinaron la actividad de CTL, así como la producción de la linfocina Thl. El pVdOCd6Td6 quimérico, así como el pCD66, pero no el pCDd6, soportaron la activación de las células T (Tabla 4) . Esto es significativo debido a que los dominios C de CDdO y CD66 pueden activar las células T. Estos resultados también sugieren que el dominio C y la cola citoplásmica de CDd6 pueden soportar la activación de la célula T. De notarse, la construcción quimérica opuesta (pVd6CdOT60) no habilitó la señal coestimuladora necesaria para la estimulación de la célula T específica. Esto hizo surgir la posibilidad de que el dominio C y/o la cola citoplásmica de CDdO, puede desempeñar un papel inhibitorio importante en la activación de la célula T. Después, se usaron los mutantes de supresión de las moléculas B7 que carecían de la cola citoplásmica o los dominios C. Esto permitió la valoración directa del papel de estas regiones moleculares en la activación o inhibición de la célula T. Se observó in vivo que la cola citoplásmica de CDd6 es absolutamente necesaria para las respuestas de CTL antivirales y para la producción de citocina Thl (Tabla 4) Sin embargo, la falla de la molécula de supresión de la cola citoplásmica de CDdO (pV80C80T?) para inducir la activación de la célula T, no permitió el mapeo de la región inhibitoria de esta molécula al dominio C de CDdO o la cola citoplásmica. Esta cuestión se resolvió mediante la coinmunización de ratones con los genes que codifican el inmunógeno y la molécula CDdO suprimida del dominio C (Figuras 1, 2A y 2B) . Se observó un mejoramiento dramático de la activación de la célula T en los ratones que se coinyectaron con pVdOC?TdO y pCEnv. Parece que tanto la cola citoplásmica de CDdO, como la cola citoplásmica de CD66 estuvieron involucradas en la activación de la célula T y no estuvieron involucradas en la inhibición de la activación de la célula T. La cola citoplásmica desempeñó un papel importante tanto den la redistribución como en la oligomerización de eta molécula sobre la superficie del APC profesional . De manera importante, se ha demostrado también que la activación de las células transfectadas CDdO con ionomicina y/o PMA, dio como resultado la asociación de una fosfoproteína de 30kDa con la cola citoplásmica de CDdO. Se ha reportado el tamaño similar de la proteína que se fosforiló de manera inducible sobre tirosina después de la reticulación de la CDdO. Finalmente, se reportó que el disparo de las moléculas CD66 activa la expresión de nuevo genes de inmunoglobulina en la células B. Estos resultados indican fuertemente que las moléculas B7 pueden proporcionar una señal directa al APC. Basándose en estos resultados, así como en nuestros datos que se presentaron anteriormente, nosotros tenemos la hipótesis además de que las B7 podrían proporciona una señal directa a APC y, a su vez, inducir la secreción/expresión de ciertas moléculas (citocinas, linfocinas, quimiocinas, etcétera) , las cuales son importantes para la activación o inhibición de las respuestas inmunes celulares. Los ejemplos de estas moléculas pueden incluir IL-la, ILlß, IL-12, y citocinas TNF, las cuales se producen mediante APC profesional y desempeñan un papel importante en la activación inmune. De hecho recientemente, se demostró directamente que estas citocinas modulan las respuestas inmunes antivirales humorales y celulares durante la coinmunización de ADN. Otra observación importante fue que el dominio C de CDdO, pero no aquel de CDd6, inhibió de alguna manera la coestimulación de las células T. Cuando menos los mutantes suprimidos de dominio C pudieron incrementar de manera significativa la activación de la célula T en nuestros experimentos (Figuras 1, 2A y 2B) , mientras que la molécula de tipo silvestre no lo pudo hacer (Tabla 4) . Estudios recientes demostraron que un mecanismo de desactivación de la célula T está mediado por las interacciones de CTLA-4 con una cadena del TCR. De conformidad con lo anterior, nuestros experimentos sugieren que los dominios V- y C- de CDdO, pueden ser esenciales para la fijación de CTLA-4 y la señal inhibitoria subsecuente que se envía por medio de TCR anula las señales de activación de CD26 que se transmitió de manera simultánea. Para probar de manera directa esta hipótesis, se coinmunizaron los animales con un inmunógeno de ADN y una combinación de moléculas CDdO y CDd6. La coinyección de pCDdO con pCDd6, junto con el inmunógeno de ADN, eliminó la fuerte respuesta CTL de CDd" antiviral que se ve normalmente después de la coestimulación de pCD66 (Figuras 3, 4) : De manera importante, la forma borrada del dominio C de la molécula CDdO no generó esta señal inhibitoria (Figura 3) . Por lo tanto, las moléculas que expresan los dominios tanto V- como C- de CDdO, no solamente evitaron la activación de la célula T, probablemente a través de la fijación preferencial al CTLA-4, sino que también podría superar la señal positiva que se proporcionó mediante la activación del ligando CD2d mediante los dominios V de las dos moléculas CDdO y CD66. De hecho, ha habido una predominancia demostrada de la señalización de CTLA-4 sobre CD26, en la cual la trayectoria de activación de CD2d se inhibe directamente como un resultado de la reticulación simultánea de CTLA-4. Debido a que la molécula CDdO puede fijarse tanto a CD2d, como a CTLA-4, deberá haber diferencias estructurales importantes que cambien el equilibrio a favor de la trayectoria de inhibición de CTLA-4, sobre la trayectoria de activación de CD2d. El análisis de resonancia de plasmón superficial midió un incremento de catorce veces en la fijación entre el CTLA4 y la CDdO cuando el dominio C. Es más probable que esta diferencia sea realmente mayor, debido a que es probable que ocurra la interacción multivalente de CTLA-4 y B7. La velocidad de la disociación del componente individual de CTLA-4 con CDdO es similar a la disociación monomérica. Sin embargo, debido a que la CDdO todavía se mantendrá mediante la segunda interacción de CTLA-4, la velocidad observada de la disociación deberá ser mucho más lenta, formando así un complejo CTLA-4/CD80 más estable. De conformidad con lo anterior, si se calcula la diferencia en la avidez de fijación de la membrana CTLA-4 con la CDdO de la membrana o los mutantes borrados de dominio C de CDdO, será un múltiplo de 14. Los datos indican claramente que el dominio C de CDdO no solamente evita la activación de la célula T, sino que también altera las relaciones de función de la estructura de esta molécula con la CTLA-4. La expresión de los genes que codifican el mutante de supresión de dominio C de la CDdO, indujo no solamente la activación de la célula T, sino también la infiltración enorme dentro del músculo de los animales experimentales . Esta infiltración fue todavía mayor que la infiltración que se observó después de la coexpresión de pCD66 y pCEnv (Figura 5) . Recientemente, se reportó la actividad de APC de células musculares humanas in vi tro . Después de la activación con las citocinas, los mioblastos pueden humanos pueden expresar moléculas coestimuladoras y pueden funcionar como APC restringido de clase II del MHC profesional. Además, se demostró el efecto in vivo de las células musculares en la activación de la célula T. Las células de músculo de ratón se han convertido en APC restringido clase I del MHC mediante la expresión de la CD86, pero no de las moléculas CD80. Los datos que se reportan en la presente se pueden interpretar como mostrando que la inmunización por ADN con pcEnv, induce una infiltración pequeña de las células inmunocompetentes dentro del sitio de la inyección. Estas células T de infiltración se pueden activar mediante las células de músculo transfectadas que expresan las moléculas clase i de MHC y el péptido extranjero, así como las moléculas CD66. Las células T activadas a su vez, pueden producir quimiocinas y atraer más células T al sitio de la inflamación. De conformidad con lo anterior, se observó una infiltración enorme en el tejido del músculo, en el caso de la coinmunización con pcEnv más pCDd6 (Figura 5) . El mismo mecanismo aplicará después de la coinmunización con el inmunógeno de ADN y pVdOC?TdO. Sin embargo, a coadministración de pCDdO y pcEnv indujo solamente una pequeña infiltración en el tejido del músculo de animales experimentales. Si uno recuerda que la molécula CDdO puede fijarse tanto a CD2d, como a CTLA-4, deben haber fuerzas que cambien el equilibrio a favor de la trayectoria de inhibición de CTLA-4 sobre la trayectoria de activación de CD2d. Parece que la presencia del dominio C de las células de músculo de CDdO que se transfectaron con la CDdO de tipo silvestre, tiene un efecto inhibitorio muy temprano en la infiltración y/o la proliferación de los linfocitos activados en este tejido y puede reflejar una fijación preferencial a, y la señalización a través de la CTLA-4. Por lo tanto, las células T en el sitio de la inyección no producirá quimiocinas y no inducirá la migración de otros linfocitos en el área de inmunización (Figura 6) . De manera importante, no se ha evaluado si una de las moléculas coestimuladoras funciona o no de preferencia mediante la interacción con la CTLA-4 en oposición a la CD26, y la base estructural para esta interacción todavía no es clara. Anteriormente, un número de estudios ha reportado los resultados de los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio que investigaron las relaciones de función de la estructura de las moléculas B7 y CD2d/CTLA-4. De manera colectiva, estos estudios implicaron más de 20 residuos sobre los dominios V- y C- de la CDdO crítica para la fijación de CTLA-4. Sin embargo, la región exacta importante para la interacción de la molécula CDdO a la CTLA-4 y la CD2d, no está definida. Los nodulos del bazo y linfáticos de ratones han mostrado que tienen una forma que se une de manera alternativa de CDdO que carece del dominio C. Esta molécula IgV que se sintetizó de manera natural se fijó muy bien a CD2d=Ig (comparable con la CDdO) , aunque su fijación a la CTLA-4 se reprimió de manera significativa. Cuando menos un grupo demostró también que la supresión del dominio C de la molécula CDdO tuvo un efecto mayor sobre la fijación a la CTLA-4=Ig, que la CD26=Ig. De manera importante, la región parecida a IgV de la CDdO, podría activar la proliferación de las células T activadas in vi tro. Los datos in vivo que muestran la coestimulación efectiva que se proporciona mediante la molécula de supresión del dominio C de la CDdO, apoyan estos resultados. Cualesquier explicaciones para la naturaleza inhibitoria de las moléculas que expresan el dominio C de la CDdO, deberán considerar la avidez incrementada de la fijación de CDdO mediante CTLA-4, en comparación con la CD2d. Las mediciones recientes indican que la avidez de fijación de la CDdO a la CTLA-4 dimérica es mucho más elevada que a la CD26 dimérica. De manera importante, la CTLA-4 dimérica se fija a la CDdO con mayor avidez que a la CDd6. Esta resistencia a la fijación mayor puede explicar porqué la señal inhibitoria inducida por la CTLA-4 predomina en este sistema experimental. A fin de revelar adicionalmente las diferencias importantes en la región de fijación de la CTLA-4 de CDdO y Cdd6, construimos modelos tridimensionales de los dominios C. La correlación de los estudios mutacionales con modelos tridimensionales del domino C de la CDdO, proporciona algún discernimiento sobre la fijación del receptor. Tanto la CDdO como la CD66 despliegan homología de secuencia con los pliegues - de Ig, lo que sugiere que los dos adoptan conformaciones similares (Tabla 6) . En consecuencia, la mayoría de los análisis mutacionales se han enfocado en los residuos conservados cambiantes entre la CDdO de ser humano y de ratón y aquellos que se conservan entre CDdO y Cd86. Parece que varios residuos conservados en el dominio C de la CDdO son críticos para la fijación a la CTLA-4=Ig (Tabla 6) . Un modelo ha establecido que los Q157, D15d, E162 y L163 se agrupan de manera espacial en posiciones accesibles superficiales cerca del extremo de terminal amino del dominio en el ciclo entre las cadenas D y E y al inicio de la cadena E. Otros residuos (FlOd, Pili, e 1113) se mapean para la cadena A (vea Tabla 6) . El segundo modelo que se construyó sobre la base del análisis mutacional, también demuestra un papel crítico para P135 y P137 en el ciclo B-C, así como Q157, D15d y P159 en el ciclo D-E para la CTLA-4 de fijación. De manera colectiva, los residuos importantes para la fijación del receptor se mapean para la cara ABCED del dominio de IgC. La Figura 6 muestra rastros de Ca de la molécula CDdO con los residuos de la región de fijación de CTLA-4 que se representan como productos de CPK, en donde se muestran los aminoácidos P136 y P136 del ciclo B-C y los residuos Q157, D15d, P159 del ciclo D-E. En el modelo correspondiente de CDd6 hay una inserción de 4 residuos 144-147 (KKMS) que se muestra en cursivas en la Tabla 6 y en la Figura 6. Esta inserción en la CDd6 cambia la conformación del ciclo B-C en esta molécula, en comparación con la CDdO, de manera que la región de fijación se hace significativamente más pequeña. Debido a esa inserción, la distancia entre P159 y P135 disminuye de 16 Á en CDdO a 12 Á para los residuos correspondientes de CDd6. Además, la distancia entre Q157 y P137 disminuye de 13 Á en la CDdO a 10 Á para los residuos correspondientes de la CDd6. Por lo tanto, esta inserción cambia la conformación del ciclo B-C de la molécula CD66, en comparación con la CDdO, de modo que el área de superficie total de la fijación de CTLA-4 en la molécula CD66es significativamente más pequeña que la misma región en la CDdO (compare con la Figura 6) . De esta manera, el moldeo de CDdO y Cd86 sugiere que la conformación del ciclo B-P es diferente en estas moléculas y que el inserto KKMS en la CD86 puede desempeñar un papel importante en la disminución de la avidez de fijación a la CTLA-4 y, en consecuencia, puede disminuir la señal inhibitoria que se está apuntando para las células T. En resumen, las discrepancias con respecto a los sitios de fijación/funcional de los dominios V- y C- de la CDdO y a un grado menor de las moléculas CDd6 con los ligandos de CTLA-4 y/o CD2d, se pueden explicar mediante diferentes antígenos y sistemas experimentales que se usan en diferentes laboratorios. Por ejemplo, se obtuvieron muchos resultados con la coestimulación de la célula T con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 (Ia señal) y las formas solubles de moléculas B7 (CDdO=Ig, CD86=Ig) (2* señal) . Este modelo generó datos muy importantes. Sin embargo, Los resultados que se publicaron recientemente demostraron que solamente las células que expresan formas oligoméricas de las moléculas coestimuladoras pueden impeler la activación de la A en el tratamiento de enfermedades autoinmunes. A la inversa, una vacuna de tumor más efectiva pudiera ser el resultado de la coinmunización que se proporciona a través del domino V de la CD80, con una capacidad disminuida para inhibir la activación de la célula T. Adicionalmente, se pueden proporcionar vacunas que se dirigen hacia la inmunidad celular mejorada, usando los adyuvantes moleculares que se describen en la presente.

Tabla 1 Familia Picornavirus Género: Rinovirus: (Médico) responsable por ~ 50% de resfriado común. Eterovirus (Médico) incluye poliovirus, coxsackievirus, ecovirus, y enterovirus humano tal como el virus de la hepatitis A. Aftovirus: (Veterniario) estos son virus de enfermedades de los pies y la boca. Antígenos objetivo: VP1, VP2, VP3, VP4, VPG Familia Caleivirus Género: Grupo Norwalk de Virus: (Médico) estos virus son un agente causativo importante de la gastroenteritis epidémica.

Familia Togavirus Género: Alfavirus: (médico y Veterinario) los ejemplos incluyen el virus Senilis, virus RossRiver y la encefalitis Equina Eastern y Western. Reovirus: (Médico) virus Rubella. célula T. Por otro lado, aún el uso de las células transfectadas CDdO y CD86 para la coestimulación de la célula T, no se puede considerar como un modelo óptimo. Se reportó que la CTLA-4 interactúa con la TCR? después de disparar con moléculas anti-CD3 y CD80 fijadas a la membrana. Estos resultados sugieren que el modelo apropiado debería incluir la interacción de APC, que expresa el MHC clase I/II, y CD80/Cdd6 con células T, que expresan el TCR y CD/2d/CTLA-4. De conformidad con lo anterior, la condiciones fisiológicas para la interacción de APC y la célula T pudieran ser más apropiadas para descubrir el (los) mecanismo (s) de la coestimulación de la célula T. Usando este sistema modelo, se han demostrado las diferencias funcionales entre la CDdO y la CD86, así como entre los dominios V- y C- de la molécula CDdO. Los estudios actuales proporcionan información importante para el desarrollo de planteamientos nuevos para la regulación de las respuestas inmunes de la célula T. De manera específica, se puede proporcionar una forma del ligando B7 para, por ejemplo, incluir los dominios V- y C-que podrían desactivar una respuesta inmune humana progresiva probablemente por medio de disparar de manera preferencial a las moléculas CTLA-4, que se expresan en las células T específicas del antígeno. Esta construcción puede tener aplicaciones importantes para la tolerancia al transplante o Familia Flariviridue Los ejemplos incluyen: (Médico) virus del dengue, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis de San Luis y encefalitis transmitida por garrapata.

Virus de Hepatitis C: (Médico) estos virus no se colocan en una familia, pero se cree que son ya sea un togavirus o un flavivirus. La similitud más grande es con la familia de los togavirus .

Familia Coronavirus: (Médico y Veterinario) Virus de bronquitis infecciosa (aves de corral) Virus gastroentérico transmisible porcino (cerdo) Virus de éncefalomielitis hemaglutinante porcina (cerdo) Virus de peritonitis infecciosa felina (gatos) Coronavirus entérico felino (gatos) Coronavirus canino (perros) El coronavirus respiratorio humano provoca ~40 casos de resfriado común. EX.224E, 0C43 Nota: los coronavirus pueden provocar hepatitis no-A, B o C. Antígenos objetivo: El - también llamado proteína M o matriz E2 - también llamado proteína S o Spike E3 - también llamado glicoproteína HE o hemaglutina-elterosa (no presente en todos los coronavirus) N - nucleocápsido Familia Rabdovirus Género: Vesiliovirus Lyssavirus: (médico y veterniario) rabia Antígeno objetivo: Proteína G Proteína N Familia Filoviridue: (Médico) Virus de fiebre hemorrágica tales como los virus Marburg y Ebola.

Familia Paramixovirus: Género: Paramixovirus: (Médico y Veterinario) virus de parotiditis, virus de la enfermedad de New Castle (patógeno importante en pollos) Morbillivirus: (Médico y Veterinario) Sarampión, moquillo canino Pneuminvirus : (Médico y Veterinario) Virus sincitial respiratorio Familia Ortomixovirus (Médico) El virus de la influenza Familia Bungavirus Género: Bungavirus: (Médico) encefalitis de California, LA Crosse Flebovirus : (Médico) Fiebre del Valle de Rift Hantavirus : el Puremala es un virus de fiebre hemahagina Nairvirus : (Veterinario) enfermedad de las ovejas de Nairobi También muchos bungavirus no asignados Familia Arenavirus (Médico) LCM, virus de fiebre de Lassa Familia Reovirus Género: Reovirus un posible patógeno humano Rotavirus: gastroenteritis aguda en niños Orbivirus: (Médico y Veterinario) Fiebre de las Montañas de Colorado, Lebombo (humanos) encefalosis equina, lengua azul Familia Retrovirus Subfamilias : Oncorrivirinal (Veterinario) (Médico) virus de leucemia felina, HTLVI y HTLVII Lentivirinal: (Médico y Veterinario) HIV, virus de inmunodeficiencia felina, infecciones equinas, virus de anemia Spumavirinal .

Familia Papovavirus Subfamilias Poliomavirus: (Médico) Virus BKU y JCU Subfamilia: Papilomavirus: (Médico) muchos tipos de virus asociados con cánceres o la progresión maligna de papiloma. Adenovirus (Médico) EX, AD7, ARD, O.B. - provocan enfermedades respiratorias - algunos adenovirus tal como el 275, provocan enteritis Familia Parvovirus (Veterinaria) Parvovirus felino: provoca enteritis felina Panleucopeniavirus felino Parvovirus canino Parvovirus porcino Familia Herpesvirus Subfamilia: alfaherpesviridue Género: Simplexvirus (Médico) HSVI, HSVII Varicelovirus : (Médico - Veterinario) pseudorrabia - varicela zóster Subfamilia: betaherpesviridue Género: Citomegalovirus (Médico) HCMV Muromegalovirus Subfamilia: Gamaherpesviridue Género: Linfocriptovirus (Médico) EBV - (linfo de Burkitts) Radinovirus Familia Poxvirus Subfamilia: Cordopoxviridue (Médico - Veterinario) Género: Varióla (viruela) Vaccinia (vacuna) Parapoxivirus - Veterinario Auipoxvirus - Veterinario Capripoxvirus Leporipoxvirus Suipoxvirus Subfamilia: Entemopoxviridue Familia Hepadnavirus Virus de hepatitis B No Clasificado Virus de hepatitis delta Tabla 2 Patógenos bacterianos: Las bacterias cocáceas gram-positivas patogénicas incluyen: neumocócicas; estafilocócicas; y estreptocócicas. Las bacterias cocáceas gram-negativas patogénicas incluyen: meningocócicas; y gonocócicas.

Los bacilos gram-negativos entéricos patogénicos incluyen: enterobacteriaceae; pseudomona; acineto-bacteria y eikenella; melioidosis, salmonela, shigellosis; hemophilus; chancroide; brucelosis; tularemia; yersinia (pasteurella) ; estreptobacilo monoliforme y spirillum; monocitogenes de listeria; erisipelotrix rhusiopathiae; difteria; cólera; ántrax; donovanosis (granuloma inguinale) ; y bartonellosis .

Las bacterias anaerobias patogénicas incluyen: tétanos, botulismo; otras clostridias; tuberculosis; lepra; y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patogénicas incluyen: sífilis; treponematosas; sífilis de quijadas, pinta y endémica y leptospirosis . Otras infecciones provocadas por bacterias patógenas más elevadas y hongos patogénicos incluyen: actinomicosis; nocardiosos; criptococcosis; blastomicosis; histoplas-mosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergillosis, y mucormicosis; esporotricois; paracoccidiodomicosis, petrielidiosis, torulopsosis; micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis .

Las infecciones por ricketssia incluyen rickettsiales y rickettsiasis .

Los ejemplos de micoplasma e infecciones por clamidia L . incluyen: micoplasma pneumoniae; linfogranuloma venereum; psitacosis; e infecciones por clamidia perinatal.

Eucariotes Patogénicos : Los protozoos patogénicos y helmintos e infecciones mediante los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; pneumocistits carinii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; tremátodos o duela; e infecciones por cestodos (solitaria) . Tabla 3 Eficiencia de Expresión de las construcciones que codifican las formas de tipo silvestre, quiméricas, o truncadas de las moléculas CDdO y CD86 que se detectaron mediante el ensayo FACS Plásmidos Representación Esquemática de Descripción de Fl*. los Dominios Ig* Proteina codificada Control de Vector Sin Inserto 2.S Pcd80 CD 80 de Tipo Silvestre 8.S PV80C?T80 CD80 Truncada, Supresión del 6.3.3 dominio C PV80C86T86 7r"m Quimérica, dominio V de CD86 S.9 sustituido por el dominio V de CD80 PV80C80T? CD80 Truncado, supresión del 5.8 dominio Citoplásmico (T) PCD86 i v i c p CD86 de Tipo Silvestre 5.99 PV86C?T86 H^l CD86 Truncada, Supresión del 7.1 dominio C PV86C80T80 Quimérica, dominio V de CD80 7.4 sustituido por el dominio V de CD86 PV86C86T? i " i c i CD86 Truncado, supresión del 11.16 dominio Citoplásmico (T) L .

* Los cuadros representan los dominios V, C, y T (cola citoplásmica) de las moléculas CDdO (sombreada) y CDdß (abierta) (no se removió la secuencia de transmembrana) .

** Se cotransfectaron las células de rabdomiosarcoma con plásmidos experimentales o de control, y una construcción que codifica la proteína de fluorescencia verde (GFP) . Se detectó la Intensidad de Fluorescencia (Fl) de las células que expresaban las moléculas B7 (canal promedio rojo) en la población de células que expresaban la GFP.

Tabla 4 Respuestas inmunes celulares (producción de citocina CTL y Thl) en ratones coinmunizados con plásmidos, que codifican el antígeno viral y diferentes formas de moléculas B7 1.

* Dos semanas después de la última inmunización se recolectaron los bazos y se realizaron ensayos de citocina de CTL y Thl, como se describió en Materiales y Métodos. Estos experimentos se han repetido tres (para la detección de CTL) y dos (para la detección de citocinas) veces, con resultados similares .

Tabla 5 Parámetros de fijación para la interacción de CTLA-4/CD80 calculada a partir de los ataques a un modelo Langmuir Tabla 6 Alineación de Secuencia de los dominios C de CDdO y Cd86 humanos * Las alineaciones se hicieron usando CLUSTALW (Thompson, 1994) y después se ajustaron de manera manual. Los residuos en el extremo e cada fila se numeraron a partir de su término N respectivo. Los residuos de CDdO críticos para la fijación del receptor superficial de la célula T CTLA-4 de acuerdo a la literatura (Ellis, 1996; Fargeas, 1995; Guo, 1995; Guo, 1996; Peach, 1995) se muestran en negritas. Las dos variantes presumibles de cuatro insertos de aminoácidos en CD66 se muestran en cursivas y podrían muy probablemente perturbar la fijación al CTLA-4 (vea detalles en la discusión) . Las cadenas beta resaltadas en CD80 y Cdd6 se basan en la estructura de cristal de sB7-l (Ikemizu, 2000) .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> The Trustees of The University of Pennsylvania Sekaly, Rafick P Holterman, Mark <120> CDdO Mutante de Humano y Composiciones y Métodos Para Hacer y Usar Las Mismas <130> UPAP0377 <140> <141> <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 10 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 1 ctgcttgctc aactctacgt c 21 15 <210> 2 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 20 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 25 — ? WT~- o-"*-*--* • • » • .. , - . .aata^s 1 ctgaagttag ctttgactga taacg 25 <210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 3 gcaatagcat cacaaatttc a 21 <210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 4 cagtcaaagc taacttcagt caacc 25 1 <210> 5 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 5 gggaagtcag caagcactga cagttc 26 <210> 6 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 6 tcagtgcttg ctgacttccc tacacc 26 <210> 7 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 7 tcttgcttgg ctttgactga taacgtcac 29 <210> d <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> d tcagtcaaag ccaagcaaga gcattttcc 29 <210> 9 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 5 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 9 10 tcctcaagct caagcactga cagttc 26 <210> 10 <211> 23 <212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa 20 <400> 10 tcagtgcttg agcttgagga ccc 23 <210> 11 25 <211> 22 ^j&*^jjtt^^ftfi^aj^^jj¡^*^& <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 11 tctggatcct catcttgggg ca 22 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia Novedosa <400> 12 tctggatcct catttccata g 21 <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser lie Ser Asp Phe Glu lie Pro Thr 1 5 10 15 Ser Asn lie Arg Arg lie lie Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu 20 25 30 Pro <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 14 Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu lie Val Pro lie Ser Asn lie Thr 1 5 10 15 Glu Asn Val Tyr lie Asn Leu Thr Cys Ser Ser lie His Gly Tyr Pro 20 25 30 Glu Pro <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 15 His Leu Ser Trp Leu Glu 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 16 Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 33 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 17 Asn Gly Glu Glu Leu Asn ala lie Asn Thr Thr Val SerGln Asp Pro 1 5 10 15 Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr 20 25 30 Thr <210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Homo Sapiens i <400> 14 Asn Ser Thr lie Glu Tyr Asp Gly lie Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn 1 5 10 15 Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser lie Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro 20 25 30 Asp Val Thr Ser 35 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 19 Asn His Ser Phe Met Cys Leu lie Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn 1 5 10 15 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr 20 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 14 Asn Met Thr lie Phe Cys lie Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu 1 5 10 15 Ser Ser Pro Phe Ser lie Glu Leu 20

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una proteína aislada que comprende cuando menos uno de dOV, dOtm, y dOct, y está libre de dOC; en donde esa proteína comprende ya sea dOV u 66V o ambos, y opcionalmente comprende uno o más de d6C, dOtm d6tm, dOct y d6ct, en donde: dOV es el dominio variable de CDdO o un fragmento funcional del mismo; 86V es el dominio variable de CDd6 o un fragmento funcional del mismo; d6C es el dominio C de CDd6 o un fragmento funcional del mismo; dOtm es la región de transmembrana de CDßO o un fragmento funcional de la misma; d6tm es la región de transmembrana de CD86 o un fragmento funcional de la misma; dOct es la cola citoplásmica de CDdO o un fragmento funcional de la misma; y 86ct es la cola citoplásmica de CD86 o un fragmento funcional de la misma. 2. La proteína aislada de la reivindicación 1, en donde: ßOV es el dominio variable de CD80; d6V es el dominio variable de CD86; 86C es el dominio C de CD86; dOtm es la región de transmembrana de CDdO; d6tm es la región de transmembrana de CD66; dOct es la cola citoplásmica de CDdO; y 66ct es la cola citoplásmica de CD66. 3. La proteína aislada de la reivindicación 1, que tiene la fórmula: R1-R-R3-R4-R5-R6-R7-Rß-R9 en donde R1 es 0-50 aminoácidos; R2 es dOV u 66V; R3 es 0-50 aminoácidos; R4 es d6C ó 0 aminoácidos; R5 es 0-50 aminoácidos; Re es dOtm u d6tm; R7 es 0-50 aminoácidos; R8 es dOct u 86ct; y R9 es 0-50 aminoácidos. 4. La proteína aislada de la reivindicación 3, en donde : R1 es 0-25 aminoácidos; R3 es 0-25 aminoácidos; R5 es 0-25 aminoácidos; R7 es 0-25 aminoácidos; y R9 es 0-25 aminoácidos. 5. La proteína aislada de la reivindicación 3, en donde : R1 es 0-10 aminoácidos; R3 es 0-10 aminoácidos; R5 es 0-10 aminoácidos; R7 es 0-10 aminoácidos; y R9 es 0-10 aminoácidos. 6. La proteína de la reivindicación seleccionada a partir del grupo que consiste de: dOV/dele/dOtm/dOct d0V/dele/d0tm/d6ct dOV/dele/d6tm/60ct d6V/dele/d0tm/d0ct d6V/dele/d0tm/d6ct d6V/dele/d6tm/d0ct dOV/dele/86tm/86ct d0V/d6C/d0tm/d0ct d0V/d6C/d0tm/d6ct 60V/d6C/d6tm/d0ct; 66V/86C/80tm/d0ct ; d6V/d6C/d0tm/66ct 86V/86C/86tm/80ct; d0V/d6C/86tm/d6ct; dOV/dele/dOtm/dele d6V/dele/d0tm/dele; d0V/86C/80tm/dele; dOV/d6C/d6tm/dele d6V/86C/80tm/dele; d6V/66C/d0tm/dele; 66V/d6C/dele/d0ct d0V/d6C/dele/d0ct ; 80V/dele/dele/80ct ; 66V/dele/dele/d0ct dOV/d6C/dele/dele; y dOV. 7. Una proteína quimérica que comprende una porción de proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y una porción inmunogénica. d . Una composición que comprende una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y una proteína inmunogénica o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora que codifica un inmunógeno, dicha secuencia codificadora enlazada operablemente a elementos A. reguladores . 9. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, la secuencia 5 codificadora enlazada operablemente a elementos reguladores. 10. Un plásmido que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9. 11. Un plásmido de la reivindicación 10, que también comprende una secuencia codificadora que codifica un 10 inmunógeno, esa secuencia codificadora enlazada operablemente a elementos reguladores . 12. Una composición que comprende un plásmido de las reivindicaciones 10 u 11, que también comprende una proteína inmunogénica o un plásmido, que comprende una 15 secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia codificadora que codifica un inmunógeno, la secuencia codificadora enlazada operablemente a elementos reguladores. 13. Una vacuna recombinante o vacuna atenuada que comprende la composición que comprende una molécula de ácido 20 nucleico de la reivindicación 9. 14. Una composición de vacuna recombinante o composición de vacuna atenuada que comprende el asunto objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1-13. 15. Una composición farmacéutica que comprende el 25 asunto objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1-14. M-^^-^¿jgg¡¡^¡^» ^^Xf em 16. Un método de inmunización de un individuo contra un inmunógeno, que comprende una composición que comprende las composiciones de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15. 17. El método de la reivindicación 16, en donde la inmunización es profiláctica. ld. El método de la reivindicación 16, en donde la inmunización es terapéutica. 19. El método de la reivindicación 16, en donde el inmunógeno es un alérgeno. 20. El método de la reivindicación 16, en donde el inmunógeno es un antígeno patógeno. 21. El método de la reivindicación 16, en donde el inmunógeno es un antígeno asociado con una enfermedad autoinmune . 22. El método de la reivindicación 16, en donde dicho inmunógeno es un antígeno asociado con una enfermedad hiperproliferativa . 23. Una proteína no CDdO aislada que comprende cuando menos el dominio C de CDdO o un fragmento funcional del mismo. 24. La proteína no CDdO aislada de la reivindicación 23, que comprende cuando menos el dominio C de CD80. 25. La proteína no CDdO aislada de la reivindicación 23, que tiene la fórmula: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9 en donde R1 es 0-50 aminoácidos; R2 es 80V u 66V; R3 es 0-50 aminoácidos; R4 es dOC; R5 es 0-50 aminoácidos; R6 es dOtm u d6tm; R7 es 0-50 aminoácidos; R8 es dOct u d6ct; y R9 es 0-50 aminoácidos, en donde dOV es el dominio variable de CDdO o un fragmento funcional del mismo; d6V es el dominio variable de CDd6 o un fragmento funcional del mismo; dOC es el dominio C de CDdO o un fragmento funcional del mismo; dOtm es la región de transmembrana de CDdO o un fragmento funcional de la misma; d6tm es la región de transmembrana de CD66 o un fragmento funcional de la misma; dOct es la cola citoplásmica de CDdO o un fragmento funcional de la misma; y 66ct es la cola citoplásmica de CDd6 o un fragmento funcional de la misma. 26. La proteína aislada de la reivindicación 25, en donde : R1 es 0-25 aminoácidos; R3 es 0-25 aminoácidos; R5 es 0-25 aminoácidos; R7 es 0-25 aminoácidos; y R9 es 0-25 aminoácidos. 27. La proteína aislada de la reivindicación 3, en donde : R1 es 0-10 aminoácidos; R3 es 0-10 aminoácidos; R5 es 0-10 aminoácidos; R7 es 0-10 aminoácidos; y R9 es 0-10 aminoácidos. 2d. La proteína no CDdO aislada de la reivindicación 23, que tiene la fórmula seleccionada a partir del grupo que consiste de : R-dele-R-80C-R-80tm-R-d0ct-R; R-dele-R-d0C-R-80tm-R-dele-R; R-dOV-R-dOC-R-dOtm-R-dele-R; R-d0V-R-d0C-R-dele-R-dele-R R-66V-R-d0C-R-60tm-R-d0ct-R R-d6V-R-d0C-R-d0tm-R-dele-R R-d6V-R-dOC-R-dele-R-dele-R; R-60V-R-d0C-R-66tm-R-d0ct-R; R-dele-R-80C-R-86tm-R-80ct-R; R-dele-R-60C-R-66tm-R-dele-R; 5 R-dOV-R-dOC-R-d6tm-R-dele-R; R-dOV-R-80C-R-80tm-R-d6ct-R; R-dele-R-d0C-R-d0tm-R-d6ct-R; R-d6V-R-d0C-R-d6tm-R-d0ct-R; R-d6V-R-d0C-R-d0tm-R-d6ct-Rj 10 R-d6V-R-dOC-R-d6tm-R-dele-Rj R-dele-R-dOC-R-d6tm-R-d6ct-R; y R-66V-R-dOC-R-d6tm-R-86ct-R; en donde 80V es el dominio variable de CDdO o un fragmento 15 funcional del mismo; d6V es el dominio variable de CDd6 o un fragmento funcional del mismo; dOC es el dominio C de CD80 o un fragmento funcional del mismo; 20 80tm es la región de transmembrana de CD80 o un fragmento funcional de la misma; 86tm es la región de transmembrana de CD86 o un fragmento funcional de la misma; dOct es la cola citoplásmica de CDdO o un fragmento 25 funcional de la misma; fclÉIltife^iltlIf'li 66ct es la cola citoplásmica de CD66 o un fragmento funcional de la misma; dele es 0 aminoácidos; y R son cada una independientemente 0-100 aminoácidos. 29. La proteína no CDdO aislada de la reivindicación 2d, en donde cada R son independientemente 0-50 aminoácidos. 30. La proteína no CDdO aislada de la reivindicación 26, en donde cada R son independientemente 0-30 aminoácidos. 31. La proteína no CDdO aislada de la reivindicación 2d, en donde cada R son independientemente 0-20 aminoácidos. 32. La proteína no CDdO aislada de la reivindicación 23, seleccionada a partir del grupo que consiste de: un CDdO mutante con el dominio variable suprimido, un CDdO mutante con el dominio variable suprimido y la cola citoplásmica suprimida, un CDdO mutante con la cola citoplásmica suprimida, un CDdO mutante con la región de transmembrana suprimida y la cola citoplásmica suprimida, un CDdO mutante con un dominio variable de CD86 sustituido en lugar del dominio variable de CDdO, i ... . . . . i.1... *»*«,.j un CDdO mutante con un dominio variable de CDd6 sustituido en lugar del dominio variable de CDdO, y la cola citoplásmica suprimida, un CDdO mutante con un dominio variable de CDd6 5 sustituido en lugar del dominio variable de CDdO, y la región de transmembrana suprimida, y la cola citoplásmica suprimida, un CDdO mutante con una región de transmembrana sustituida en lugar de la región de transmembrana de CDdO, un CDdO mutante con la región variable suprimida y 0 una región de transmembrana de CDd6 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CDdO, un CDdO mutante con la región variable suprimida, la cola citoplásmica suprimida, y una región de transmembrana de CDd6 sustituida en lugar de la región de transmembrana de 5 CD80, un CD80 mutante con la cola citoplásmica suprimida, y una región de transmembrana de CD86 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CDdO, un CDdO mutante con una cola citoplásmica de CDd6 0 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CD80, un CDdO mutante con la región variable suprimida, y una cola citoplásmica de CDd6 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CDdO, un CDdO mutante con un dominio variable de CDd6 5 sustituido en lugar del dominio variable de CDdO, y una ¿^^g región de transmembrana de CDd6 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CDßO, un CD80 mutante con un dominio variable de CDd6 sustituido en lugar del dominio variable de CDdO, y una cola citoplásmica de CD66 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CDdO, un CDdO mutante con un dominio variable de CDd6 sustituido en lugar del dominio variable de CDdO, y una región de transmembrana de CDd6 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CDdO, y la cola citoplásmica suprimida, un CDdO mutante con el dominio variable suprimido, y una región de transmembrana de CD66 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CDdO, y una cola citoplásmica de CD66 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CDdO, y un CDdO mutante con un dominio variable de CDd6 sustituido en lugar del dominio variable de CDdO, y una región de transmembrana de CDd6 sustituida en lugar de la región de transmembrana de CDdO, y la cola citoplásmica de CD66 sustituida en lugar de la cola citoplásmica de CDßO. 33. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, la secuencia codificadora operablemente enlazada a elementos reguladores. 34. Un plásmido que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 33. 35. Una composición que comprende un plásmido de la reivindicación 34 y/o una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32 36. Un vector recombinante que comprende la composición que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 33. 37. Una composición farmacéutica que comprende el asunto objeto de cualquiera de las reivindicaciones 23-36. 3d. Un método de inmunosupresión de un individuo, que comprende administrar una composición que comprende las composiciones de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-37. 39. El método de la reivindicación 3d, en donde el individuo tiene una enfermedad autoinmune. 40. El método de la reivindicación 3d, en donde dicho individuo ha tenido, está sufriendo, o está a punto de sufrir un procedimiento de trasplante.