KR100620481B1 - 개선된 백신 - Google Patents

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마이클 마다이오
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Abstract

개선된 백신이 개시되어 있다. 이 개선된 백신은, 세포내 위치지정 (targeting) 서열을 포함하거나 이에 연결된 면역원성 표적 단백질을 포함하는 코딩 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 조절 요소에 작동가능하게 연결된다.
백신, 유전자 백신, DNA 백신, 면역

Description

개선된 백신 {Improved Vaccines}
본 발명은 개선된 예방 및 치료용 백신, 및 항원에 대해 면역 반응을 예방적 및(또는) 치료적으로 유도하는 개선된 방법에 관한 것이다.
DNA 백신은 장애, 질병, 질환 및 감염과 관련된 항원에 의해 개체에서의 면역 반응을 유도함으로써 그러한 장애, 질병, 질환, 감염을 예방 및 치료하는 수단을 제공하는 대표적인 신생 분야이다. 그 본질상, 항원의 코딩 서열이 유전자 발현에 필요한 조절 요소에 작동가능하게 연결된 상태로 포함되어 있는 플라스미드 DNA가 개체에 투여된다. 개체의 세포가 이 플라스미드 DNA를 획득하면 코딩 서열이 발현된다. 이렇게 생산된 항원은 면역 반응의 표적이 된다. 이 항원에 대한 면역 반응에 의해 개체는, 이 항원에 대한 면역 반응에 의해 인식된 에피토프를 지닌 모든 알레르겐, 병원체, 암 세포 또는 자기면역 세포에 대해 예방적 또는 치료적 이점을 얻게 된다.
DNA 백신으로는 있는 그대로의 편리한 백신도 있다. 더구나 이들은 물질을 조직에 투여하는 여러 상이한 장치들을 포함한 각종 기술에 의해 투여될 수 있다. DNA 백신 기술의 여러 면을 설명하고 이 기술을 사용해서 얻은 많은 결과 리포트 중 일부를 인용하는 여러 리뷰 논문이 출판되어 있다. 본원에 참고로 도입된 다음 의 리뷰 논문은 각각의 리뷰 논문에 인용된 참고문헌들이며 DNA 백신 기술을 설명한다 (McDonnel W. M. and F. K. Askari 1996 New Engl. J. Med. 334(1)42-45; Robinson, A. 1995 Can. Med. Assoc. J. 152(10): 1629-1632; Fynan, E. F. et al. 1995 Int. J. Immunopharmac. 17(2)79-83; Pardoll, D. M. and A. M. Beckerleg 1995 Immunity 3: 165-169; and Spooner et al. 1995 Gene Therapy 2: 173-180).
이러한 백신은 병원체 감염이나 사람의 질병을 예방 또는 치료하도록 개체를 면역시키는데 종종 효과가 있지만, 개선된 백신에 대한 요구가 남아 있다. 향상된 면역 반응을 일으키는 조성물 및 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 면역원성 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 세포 내에서 면역원성 표적 항원의 위치를 지정하는 (trafficking) 신호 서열 (signal sequence)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 진핵 세포에서의 발현에 필요한 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 플라스미드에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시태양에서는 상기 면역원성 표적 항원이 병원체 항원, 암 관련 항원, 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서는, 세포내에서 면역원성 표적 항원의 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이, 면역원성 표적 항원이 분비되거나, 세포질, 세포막, 소포체 (ER), 리소좀 중 어느 하나에 위치하도록 지정하는 신호 서열을 코딩한다. 어떤 실시태양에서는, 면역원성 표적 항원의 세포내 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비천연 신호 서열이다.
본 발명은, 면역원성 표적 항원을 코딩하며 이 면역원성 표적 항원의 세포내에서 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 들어있는 뉴클레오타이드 서열이 진핵 세포에서의 발현에 필요한 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 포함되어 있는 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체내에서 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시태양에서는 상기 면역원성 표적 항원이 병원체 항원, 암 관련 항원, 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서는, 세포내에서 면역원성 표적 항원의 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이, 면역원성 표적 항원이 분비되거나, 세포질, 세포막, 소포체 (ER), 리소좀 중 어느 하나에 위치하도록 지정하는 신호 서열을 코딩한다. 어떤 실시태양에서는, 면역원성 표적 항원의 세포내 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비천연 신호 서열이다.
본 발명은, 면역원성 표적 항원을 코딩하며 이 면역원성 표적 항원의 세포내에서 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 들어있는 뉴클레오타이드 서열이 진핵 세포에서의 발현에 필요한 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 포함되어 있는, 개선된 DNA 백신에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시태양에서는 상기 면역원성 표적 항원이 병원체 항원, 암 관련 항원, 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서는, 세포내에서 면역원성 표적 항원의 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이, 면역원성 표적 항원이 분비되거나, 세포질, 세포막, 소포체 (ER), 리소좀 중 어느 하나에 위치하도록 지정하는 신호 서열을 코딩한다. 어떤 실시태양에서는, 면역원성 표적 항원의 세포내 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비천연 신호 서열이다.
본 발명은, 면역원성 표적 항원을 코딩하며 이 면역원성 표적 항원의 세포내에서 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 들어있는 뉴클레오타이드 서열이 진핵 세포에서의 발현에 필요한 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 포함되어 있는 DNA 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원체, 암, 자기면역 질환 중 어느 하나에 대해 개체를 면역시키는 방법에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시태양에서는 상기 면역원성 표적 항원이 병원체 항원, 암 관련 항원, 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서는, 세포내에서 면역원성 표적 항원의 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이, 면역원성 표적 항원이 분비되거나, 세포질, 세포막, 소포체 (ER), 리소좀 중 어느 하나에 위치하도록 지정하는 신호 서열을 코딩한다. 어떤 실시태양에서는, 면역원성 표적 항원의 세포내 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비천연 신호 서열이다.
도 1a, 1b, 1c는 H221 결합의 FACS 분석 데이타를 보여준다.
도 2a는 VH 또는 Fv 영역이 클로닝된 유전자 면역 벡터의 지도를 보여준다.
도 2b는 세포 내에서 상이한 위치로 V 영역을 겨냥시키는데 사용되는 V 영역을 코딩하는 삽입체의 구조 지도를 보여준다.
도 3은 세포 내에서 여러 위치로 겨냥되도록 설계된 상이한 제작물을 이들의 세포독성 T 세포 및 증식 반응의 유도와 비교한 실험 결과를 보여준다.
도 4a, 4b, 4c는 각종 세포내 겨냥된 (intracellular targeted) DNA 백신에 의해 유도된 CTL 반응을 평가한 실험 결과를 보여준다.
도 5a, 5b, 5c는 가변 영역이 DNA 백신에 의해 코딩된 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 사용하는 종양 공격 실험의 결과를 보여준다.
도 6a와 6b는 특이적인 리더 서열을 포함하는 본 발명의 유전자 제작물을 보여준다.
도 7a와 7b는 ER 체류를 위한 각종 C 말단 서열을 보여준다.
도 8은 DNA 백신의 구조를 보여준다. 사용된 이 DNA 백신 주쇄 (backbone)는 pBBkan 주쇄였다. 이것에는 CMV 프로모터와 RSV 인핸서가 전사를 유도하는데 사용된다. 이 삽입체에는 리더 펩티드 (쥐의 IgG로부터 얻은 소수성 리더 (Ig 리더) 또는 시토졸 겨냥을 위한 친수성 리더 (Cyto 리더)), VH Fv (VH에 결합된 VL) 영역, 추가된 막횡단 (transmembrane) 및 소포체 체류 신호를 갖는 시토졸 테일 (CD4 TM & E19 Cyto)이 차례로 포함되며, 표 4에 나타냈다.
도 9는 단일 DNA 접종에 이은 지라세포의 증식 반응을 평가한 실험 결과를 보여준다.
도 10a, 10b, 10c는 단일 DNA 접종에 이은 세포독성 T 세포 (CTL) 반응을 평가한 실험 결과를 보여준다. 도 10a는 분비를 위해 소포체로 H221 VH 또는 Fv 영역을 겨냥한 백신 실험 데이타를 보여준다. 도 10b는 체류를 위해 소포체로 H221 VH 또는 Fv 영역을 겨냥한 백신 실험 데이타를 보여준다. 도 10c는 시토졸로 H221 VH 또는 Fv 영역을 겨냥한 백신 실험 데이타를 보여준다.
도 11a, 11b는 DNA 백신 접종 및 공격 이후에 생존 및 종양 무게에 관한 데이타를 보여준다.
도 12는 종양 공격의 생존체에서 증식 반응을 평가한 실험 데이타를 보여준다.
본 발명은 개선된 DNA 백신에 관한 것이다. DNA 백신에 관해서는 본원에 참고로 도입된, 미국 특허 제5,589,466호 및 제5,973,972호 및 공개된 PCT 출원 PCT/US90/01515, PCT/US93/02338, PCT/US93/048131, PCT/US94/00899 및 이들의 우선권 출원에 설명되어 있다. 이들 출원에 기재되어 있는 운반 프로토콜 (delivery protocol) 이외에, DNA를 운반하는 다른 방법은 본원에 참고로 도입되어 있는, 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호에 기재되어 있다. 또한 상기의 인용된 리뷰 논문은 DNA 백신 기술을 설명하고 있으며, DNA 백신의 예를 기재하고 있다. 각각의 경우에 플라스미드 DNA는 개체의 세포로 운반되며, 이 세포는 플라스미드를 획득하여 이 플라스미드에 의해 코딩된 면역원성 표적 단백질을 발현시킨다. 이 면역원성 표적 단백질에 대한 면역 반응은 백신 접종된 개체에 예방적 또는 치료적 효과를 제공한다.
본 발명에 따르면 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 플라스미드 상의 코딩 서열에는, 이 단백질 상에 존재하면서 발현된 단백질이 특징적인 세포내 위치로 자리잡도록 하는 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열이 포함되어 있다. 세포내 단 백질의 위치를 지정하는 아미노산 서열을 코딩하며 DNA 백신 조성물으로 사용되는 플라스미드 제작물 내에 포함된 면역원성 단백질의 코딩 서열 안에 포함되는 뉴클레오타이드 서열은, 세포내에서 특이적 부위로 위치를 지정하여 특이적 면역 반응을 향상시킨다.
본원에 사용된 용어 "유전자 제작물 (genetic construct)"은 면역원성 표적 단백질과 세포내 단백질 위치를 저정하는 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열이 진핵 세포내에서 이 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 포함된 플라스미드를 가리킨다. DNA 발현에 필요한 조절 요소에는 프로모터와 폴리아데닐화 시그날이 있다. 또한 코작 (Kozak) 영역 등과 같은 다른 요소도 유전자 제작물에 포함될 수 있다. 개시 및 종료 시그날도 필요한 조절 요소들이며 종종 이들은 코딩 서열의 일부로 간주된다. 본 발명의 유전자 제작물의 코딩 서열에는 기능적인 개시 및 종료 시그날이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "면역원성 표적 단백질 (immunogenic target protein)"은 알레르겐, 병원체 항원, 암 세포 또는 자기면역 질환에 관련된 세포 관련 항원 등과 같이 상태, 감염, 질병, 장애 중 어느 하나에 관련된 단백질에 대한 면역 반응의 표적인 항원을 가리키는 의미이다. 면역원성 표적 항원은 DNA 백신에 사용된 유전자 제작물의 코딩 서열에 의해 코딩된다. DNA 백신은 백신 접종될 개체에 투여되며, 유전자 제작물이 개체의 세포에 의해 흡수되면, 코딩 서열이 발현되어 면역원성 표적 단백질이 생산된다. 면역원성 표적 단백질은 개체 내에서 면역원성 표적 단백질에 대한 면역 반응을 유도한다. 면역 반응은 알레르겐, 병원체 항원, 암 세포 또는 자기면역 질환과 관련된 세포 관련 항원 등과 같은, 상태 또는 감염 또는 질병 또는 장애에 관련된 단백질에 대해 유발된다. 따라서 백신 접종된 개체는 상태, 감염, 질병 또는 장애를 예방 또는 치료할 수 있게 예방적으로 또는 치료적으로 면역될 수 있다. 면역원성 표적 단백질은 면역 반응의 표적 단백질로 기능하는, 본 발명의 유전자 제작물에 의해 코딩된 펩티드 및 단백질을 일컫는다. 용어 "면역원성 표적 단백질"은 면역 반응을 유발시킬 수 있는 단백질을 의미한다. 면역원성 표적 단백질은 면역되어야할 필요가 있는, 알레르겐, 병원체 또는 바람직하지 못한 단백질 중의 단백질 또는 암세포나 자기면역 질환 관련 세포 등의 세포 형태와 적어도 하나의 에피토프를 공유한다. 면역원성 표적 단백질에 대한 면역 반응은 알레르겐, 병원체 또는 바람직하지 못한 단백질 중의 단백질 또는 세포형태와 관련된 특별한 감염이나 질병으로부터 개체를 보호하고 개체를 치료한다. 면역원성 표적 단백질은 면역 반응이 필요한 단백질과 동일할 필요하는 없다. 오히려 면역원성 표적 단백질은 면역 반응이 필요한 단백질에 대해 교차 반응하는 면역 반응을 유도할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비천연 신호 서열 (non-native signal sequence)"이란 면역원성 표적 항원의 세포내 위치를 지정하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 이종 (heterologous)인 신호 서열을 의미한다. 비천연 신호 서열은 천연 상태에서는 면역원성 표적 단백질에 연결된 채로 발견되지 않으며 오히려 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 면역원성 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 연결된 유전자 제작물을 제조함으로써 발생한다. 일부 실시태양에서는, 천연 신호 서열을 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 코딩 서열로부터 제거하고, 천연 서열이 지정하는 단백질의 위치와 상이한 위치로 단백질의 위치를 지정하거나 또는 천연 신호 서열이 지정하는 위치와 동일한 위치로 더욱 효과적으로 위치를 지정하는 비천연 신호 서열로 대체한다.
본 발명에 따르면, 면역원성 표적 단백질은 세포내에서 그것의 위치를 지정하는 서열을 포함한다. 단백질의 위치를 지정하는 천연 발생 서열은, 신호 서열을 제공하거나 키메라 단백질을 설계하거나 서열을 면역원성 단백질 서열에 이식함으로써 DNA 백신의 면역원성 표적 단백질에 혼입될 수 있다. DNA 백신은 플라스미드이며, 면역원성 표적 단백질의 코딩 서열은 분자생물학적 표준 방법으로 조작되어, 세포내 단백질 위치를 지정하는 신호 서열을 포함하는 면역원성 표적 단백질 또는 세포내 단백질 위치를 지정하는 영역을 포함하는 키메라 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 코딩서열이 만들어 진다. 더욱이 통상적인 분자생물학적 기술을 사용하여 면역원성 표적 단백질의 아미노산 서열을 그 안에 세포내 단백질 위치 지정을 유발하는 서열이 포함되도록 변화시킬 수 있다. 일부 실시태양에서는, 면역원성 표적 항원의 세포내 위치 지정을 유발하는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비천연 신호 서열이다. 한 단백질의 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 잘 알려진 기술을 사용하여 동정하고, 단리하고, 상이한 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 연결시킬 수 있다.
면역원성 표적 단백질의 세포내 위치는 면역원성 표적 단백질에 대해 개체에 의해 유발되는 면역 반응에 영향을 준다. DNA 백신의 유전자 제작물에 의해 코딩 된 면역원성 표적 단백질의 세포내 위치 지정으로 면역원성 표적 항원에 대한 면역 반응이 증진된다는 것이 발견되었다. 세포내 위치 지정 신호의 코딩 서열을 면역원성 표적 단백질의 코딩 서열의 일부로 제공함으로써, 면역원성 표적 단백질을 세포의 한 부위로 위치시킨다. 특정 위치는 면역 반응의 향상된 특이적 형태와 관련되어 있음이 발견되었다. 예를 들면 단백질을 소포체, 특히 조면 소포체에 체류하도록 하거나 재순환하도록 위치를 지정하면 백신 접종된 동물에게서 특이적 세포내 위치 지정 서열이 없는 백신을 사용하여 관찰한 것에 비해 향상된 CTL 반응이 유도된다는 것이 발견되었다.
본 발명의 개선점은 DNA 백신을 투여한 개체의 세포 내에서 생산된 면역원성 표적 단백질의 세포내 위치를 지정하는 유전 물질을 도입한 것에 있다.
본 발명은 단백질 및 펩티드에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 이 단백질 및 펩티드를 코딩하는 유전 물질을 개체의 세포 내로 도입하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 상기 코딩 서열이 발현에 필요한 조절 요소에 작동가능하게 연결된 DNA를 개체의 조직에 투여하는 단계를 포함한다. 코딩 서열에는 면역원성 표적 단백질을 위한 코딩 서열이 세포내 위치 지정 신호를 위한 코딩 서열에 연결되거나 또는 이를 포함하고 있다.
세포내 위치 지정 서열은 잘 알려져 있다.
일부 실시태양에서는, 단백질이 분비될 것이다. 그러한 단백질은 N-말단 소수성 서열을 포함하고 있다. RNA가 번역될 때 N 말단의 이 소수성 서열은 단백질을 조면 소포체에 접착시킨다. 계속해서 이 소수성 서열은 프로테아제에 의해 잘 려지며, 단백질은 분비된다. 본 발명의 일부 실시태양에서는 면역원성 표적 단백질이, 세포내에서 발현된 면역원성 표적 단백질을 분비시키는 N 말단 소수성 리더 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서는, 단백질이 막에 결합될 것이다. 그러한 단백질은 N-말단 소수성 서열과 내부 소수성 영역을 갖는다. 분비형에서처럼 RNA가 번역될 때 소수성 서열은 단백질을 조면 소포체에 접착시킨다. N 말단 소수성 서열은 이후에 프로테아제에 의해 잘린다. 단백질은 동일한 분비 경로를 따르지만 내부 소수성 서열이 분비를 막기 때문에 단백질은 막에 결합된다. 본 발명의 일부 실시태양에서는 면역원성 표적 단백질이 N 말단 소수성 리더 서열과 내부 소수성 서열을 포함하고 있어서 면역원성 표적 단백질이 세포내에서 발현될 때 막 결합 단백질이 되도록 할 수 있다.
일부 실시태양에서는, 단백질이 시토졸에 위치하게 될 것이다. 그러한 단백질은 N 말단 소수성 서열을 갖지 않는다. RNA가 번역될 때 단백질은 조면 세포체에 접착되지 않으며 시토졸 단백질이 된다. 본 발명의 일부 실시태양에서는 면역원성 표적 단백질이 N 말단 소수성 리더 서열이 없어서 세포내에서 발현될 때 면역원성 표적 단백질이 시토졸 단백질이 된다.
일부 실시태양에서는, 단백질이 리소좀 내로 위치하게 된다. 그러한 단백질은 단백질을 리소좀으로 위치시키는 DKQTLL (서열 1)을 포함할 것이다. 본 발명의 일부 실시태양에서는 면역원성 표적 단백질이 DKQTLL (서열 1)을 포함하고 있어서 면역원성 표적 단백질이 세포내에서 발현될 때 리소좀으로 위치하게 된다.
일부 실시태양에서는 단백질이 골지체로서부터 ER로 되돌려질 것이다. 그러한 단백질은 C 말단에 ER로 재순환되도록 단백질의 위치를 지정하는 서열 KDEL (서열 2)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서는 면역원성 표적 단백질이 C 말단에 서열 KDEL (서열 2)을 가지고 있어서 면역원성 표적 단백질이 ER로 보내지게 된다.
그러한 "ER 재순환 신호"의 또다른 예로는 아데노바이러스로부터 얻은 E19 단백질의 C 말단 서열이라고 보고되어 있다. 이 단백질은 ER로 옮겨가서 MHC에 결합하여, 면역 반응을 유도하는 일원인 T 세포 수용체와 MHC가 복합체를 형성하는 표면에서 MHC에 의해 제공될 단백질을 MHC가 적재하지 못하도록 효과적으로 억제 한다. E109 단백질은 헥사펩티드 DEKKMP (서열 3)이다. 일부 실시태양에서는 단백질이 C 말단에 DEKKMP를 포함하고 있어서 ER에 위치하게 될 것이다. 본 발명의 일부 실시태양에서는, 면역원성 표적 단백질이 서열 DEKKMP (서열 3)을 C 말단에 포함하고 있어서, 면역원성표적 단백질이 ER에 위치하게 된다.
향상시키고자 하는 면역 반응의 종류에 따라서, 상이한 세포내 위치 지정이 필요하다. 클래스 I 면역 반응의 경우에는, 세포 내에서 합성된 단백질이 분해되고, ER로 운반되어, 여기에서 이들은 MHC 상으로 적재되며, 이어서 MHC가 세포 표면으로 이동하여 CD8+ T 세포의 T 세포 수용체와 복합체를 형성한다. 이런 작용으로 CTL 반응이 유발된다. 클래스 II 면역 반응의 경우에는 단백질이 항원 제공 세포 (antigen presenting cell, APC)와 복합체를 형성하며, APC는 CD4+ T 세포와 상 호작용하여 항체 반응과 관련된 헬퍼 T 세포를 비롯한 헬퍼 T 세포를 끌어들인다.
클래스 I 면역 반응을 향상시키기 위해서는, 시토졸 또는 ER로 단백질의 위치를 지정하면 그러한 단백질이 클래스 I 경로에 더욱 잘 접근할 수 있게 해 준다.
클래스 II 면역 반응을 향상시키기 위해서는, 단백질의 위치를 막횡단 (transmembrane) 또는 리소좀으로 지정하거나 단백질을 분비시키면 그러한 단백질은 클래스 II 경로에 더욱 잘 접근할 수 있다.
본 발명은, 세포내 위치지정을 위한 서열을 포함하는 면역원성 표적 단백질의 코딩 서열이 있는 DNA 백신으로서 유용한 유전자 제작물을 제공한다.
어떤 실시태양에서는 유전자 제작물이 문헌 (Biocca, S. et al., 1990 EMBO J. 9: 101-108)에 기재되어 있는 위치 지정 리더를 포함한다. 유전자 제작물은 도 6a에 나타낸 것과 동일한 방향의 리더 서열을 포함한다. 구체적으로는 리더 서열이 프로모터와 원하는 단백질의 코딩 서열 사이에서 단백질의 N 말단에 바로 이어서 존재한다. 일부 실시태양에서는 본 발명의 유전자 제작물이 본 출원의 도 6a에 기재한 리더 서열 중 하나를 포함한다. 어떤 실시태양에서는 본 발명의 유전자 제작물이 본 출원의 도 6b에 기재된 리더 서열 중 하나를 포함한다.
일부 실시태양에서는 유전자 제작물이 소포체에서의 체류를 위해 아데로바이러스 E19 단백질로부터 얻은 말단 헥사펩티드를 포함한다. DNA 백신의 면역원성 표적 단백질의 C 말단이 DEKKMP (서열 3)인 경우에 이 단백질은 ER에 체류하게 될 것이다.
일부 실시태양에서는 유전자 제작물이 소포체에서의 체류를 위한 C 말단 사 펩티드 (quadrapeptide)를 포함한다. DNA 백신의 면역원성 표적 단백질의 C 말단이 KDEL (서열 2)인 경우에는 이 단백질은 ER에 체류하게 될 것이다.
도 7a 및 7b는 ER 체류를 위한 C 말단 서열을 보여준다. 문헌 (Jackson, M. R., et al. 1990 EMBO J. 9: 3153-3162)은 도 7a의 C 말단 서열이 만일 정상적으로는 ER에 체류하지 않는 단백질의 C 말단에 연결될 경우 이 키메라 단백질을 ER에 체류시킨다고 보고했다.
일부 실시태양에서는 유전자 제작물이 면역원성 표적 단백질의 C 말단 테일에 리소좀 표적화 쌍을 포함한다. 이 C 말단 테일은 마지막 20 내지 30개의 아미노산이다. 단백질은 LL 및(또는) YQ 및(또는) QY 쌍을 포함함으로써 리소좀으로 보내진다. 일부 실시태양에서는 리소좀 표적화 쌍을 하나 이상 포함하는 C 말단 테일이 막횡단 단백질의 세포질 테일이다. 일부 실시태양에서는 이 리소좀 표적화 쌍이 면역원성 단백질 서열의 마지막 30개의 아미노산 내에 포함된다.
본 발명에 따르면, 개체를 알레르겐, 병원체, 질병과 관련된 비정상적인 세포 또는 단백질 중 어느 하나에 대해 예방 및(또는) 치료적으로 면역시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 표적 단백질 즉, 알레르겐 또는 병원체 또는 표적이 되는 항원 또는 세포에서 발견되는 면역원성 단백질과 적어도 하나의 에피토프를 공유하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전 물질, 및 세포내 위치 지정 신호를 코딩하는 유전 물질. 유전 물질은 개체의 세포내에서 발현되며, 면역 반응을 유발시키는 면역원성 표적으로 기능한다. 세포내 위치지정 신호가 존재하면 원하는 면역 반응을 유도하는데 더욱 효과적인 세포내 위치로 단백질을 위치시킨다. 알레르 겐 또는 병원체 또는 항원 또는 세포와 반응하는, 상기 결과 발생한 면역 반응은 세포내 위치 지정 신호가 없는 유사한 유전자 제작물에 의해 유도된 면역 반응과 비교할 때 더 향상된다.
본 발명은 알레르기와 특이적으로 관련된 단백질 또는 병원체 또는 개체 자신의 "비정상적" 세포에 대한 면역 반응을 유발시키는데 유용하다. 본 발명은 알레르겐 또는 병원성 물질 및 유기체에 대해 개체를 면역시켜서 병원체 단백질에 대한 면역 반응이 병원체에 대한 보호적 면역성을 제공하도록 하는데 유용하다. 본 발명은 과증식 (hyperproliferative) 세포와 특이적으로 관련된 표적 단백질에 대해 면역 반응을 유발시켜서 암과 같은 과증식성 질병 및 장애를 억제하는데 유용하다. 본 발명은 자기면역 상태에 관련된 세포와 특이적으로 관련된 표적 단백질에 대해 면역 반응을 유발시킴으로써 자기면역 질병 및 장애를 억제하는데 유용하다.
본 발명에 따르면, DNA는 세포내 위치 지정 신호 서열에 연결되거나 세포내 위치 지정 신호를 포함하는 펩티드 서열에 연결된 면역원성 표적 단백질을 코딩한다. 신호 서열은 세포의 정상적인 단백질 프로세싱을 받아 절단될 것이다. 또한 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 DNA는 이 단백질의 코딩 서열 안에 세포내 위치 지정 서열을 포함할 수 있다. DNA 발현을 위한 조절 요소에는 프로모터와 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 또한 코작 영역과 같은 다른 요소도 유전자 제작물 내에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현가능한 형태"란 필요한 조절 요소가 유전자 제작물 내에서 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작용가능하게 연결되어 있어 서 개체의 세포내에 존재할 때 코딩 서열이 발현되는 유전자 제작물을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "에피토프를 공유하는"이란 다른 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 에피토프를 하나 이상 포함하는 단백질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 유사한 에피토프"란 그 구조가 어떤 단백질의 에피토프와 일치하지는 않지만 그 단백질과 교차 반응하는 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유발하는 구조를 갖는 에피토프를 의미한다.
유전자 제작물은, 세포내 위치 지정 서열을 포함하는 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 유전자 발현을 위해 필요한 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 포함한다.
이 유전자 제작물(들)이 세포에 의해 획득되면 기능성 염색체외 분자로 세포 내에 남아있거나(고) 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. DNA는 플라스미드 또는 플라스미드들의 형태로 세포내에 도입되어 별도의 유전 물질로서 남아있을 수 있다. 또한, 염색체에 통합될 수 있는 선형 DNA도 세포내로 도입될 수 있다. DNA를 세포내로 도입할 때 염색체로 DNA의 통합을 촉진하는 시약을 첨가할 수 있다. 통합을 촉진하는데 유용한 DNA 서열이 DNA 분자 내에 포함될 수도 있다. 또한 RNA도 세포에 투여할 수 있다. 또한 유전자 제작물을 동원체, 텔로미어, 복제 개시점을 가진 선형 미니 염색체로 제공하는 것도 생각할 수 있다. 유전자 제작물은 독성이 감쇠된 (attenuated) 살아있는 미생물내의 유전 물질의 일부로서 또는 세포내에서 사는 재조합 미생물 벡터로 남아있을 수 있다. 유전자 제작물은 재조합 바이러스 백신 유전체 (genome)의 일부일 수 있으며 여기서 유전 물질은 세포의 염색체 안으로 통합되거나 염색체외의 것으로 남는다.
유전자 제작물은 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 그런 요소로는 프로모터, 개시 코돈, 중지 코돈, 폴리아데닐화 시그날 등이 있다. 또한 종종 인핸서가 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 서열의 유전자 발현에 필요하다. 이들 요소는 원하는 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결되어야 하며, 조절 요소는 그것이 투여될 개체에서 작동가능해야 한다.
일반적으로 개시 코돈 및 중지 코돈은 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주된다. 그러나 이들 요소가 유전자 제작물이 투여될 개체에서 기능적일 필요가 있다. 개시 및 종료 코돈은 코딩 서열의 프레임 내에 있어야 한다.
사용되는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포 내에서 기능적이어야 한다.
본 발명을 실시하는데, 특히 인체용 유전자 백신의 제조에 있어서 유용한 프로모터의 예로는 원숭이 바이러스 40 (SV40), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 예를 들면 HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 시토메갈로바이러스 (CMV), 예를 들면 CMV 초초기 (immediate early) 프로모터, 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 로우스 사코마 바이러스 (RSV)에서 얻은 프로모터 뿐만 아니라, 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 등에서 얻은 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.
본 발명을 실시하는데, 특히 인체용 유전자 백신의 제조에 있어서 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예로는, SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날이 있으나 이것으로 제한되는 것은 아니다. 그 중에서도 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날로 불리는 pCEP4 플라스미드 (Invitrogen, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재) 내의 SV40 폴리아데닐화 시그날을 사용한다.
DNA 발현에 필요한 조절 요소 이외에 다른 요소도 DNA 분자에 포함될 수 있다. 그러한 추가의 요소로는 인핸서가 있다. 인핸서는 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴과, CMV, RSV, EBV의 인핸서와 같은 바이러스 인핸서를 포함하는 군에서 선택될 수 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.
유전자 제작물을 염색체외의 것으로 유지하면서 세포내에서 다수의 복제본을 생성시키기 위해서 유전자 제작물에 포유동물 복제 개시점을 제공할 수 있다. 플라스미드 pCEP 및 pREP4 (Invitrogen, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)는 엡스타인 바 바이러스 복제 개시점과 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함하며, 이 영역은 통합되지 않고도 고복제수로 에피좀식 복제 (episomal replication)를 일으킨다.
면역 분야에 관련된 몇가지 바람직한 실시태양에서는, 표적 단백질, IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 추가로 이런 표적 단백질에 대한 면역 반응을 더 향상시키는 단백질을 위한 유전자를 포함하는 핵산 분자(들)가 투여된다. 상기 유전자의 예로는 사이토킨 및 림포카인, 예를 들면 α-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, B7.2를 코딩하는 것들이다. 일부 실시태양에서는 GM-CSF의 유전자가 면역 조성물에 사용되는 유전자 제작물에 포함되는 것이 바람직하다.
어떠한 이유로 유전자 제작물을 투여받은 세포를 제거할 필요가 있다면 세포 파괴를 위한 표적으로 기능하는 추가의 요소를 추가할 수 있다. 허피스 티미딘 키나아제 (tK) 유전자는 발현가능한 형태로 유전자 제작물에 포함될 수 있다. 약품 강사이클로비어 (gangcyclovir)를 개체에 투여할 수 있는데, 이 약품은 tK를 생산하는 모든 세포를 선택적으로 죽이기 때문에 유전자 제작물을 갖고 있는 세포를 선택적으로 파괴하는 수단이 된다.
단백질 생산을 최대화하기 위해서는 조절 서열을 제작물이 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합한 것으로 선택할 수 있다. 또한 코돈을 그 세포에서 가장 효과적으로 전사되는 것으로 선택할 수 있다. 당업자라면 세포에서 기능적인 DNA 제작물을 생산할 수 있을 것이다.
본 발명의 방법은 개체의 조직에 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서는 핵산 분자가 근육내, 비강내, 복강내, 피하, 피내, 국소 투여 중 어느 하나로 투여되거나 또는 질, 직장, 요도, 협측, 설하로 이루어진 군에서 선택된 점막 조직으로 세척 (lavage)에 의해 투여된다.
일부 실시태양에서는, 핵산 분자가 촉진제를 투여와 함께 운반된다. 촉진제는 또한 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서 또는 유전자 백신 촉진제로 불리기도 한다. 촉진제는 본원에 참고로 도입된, 미국 특허 출원 제08/008,342호 (1993년 1월 26일 출원), 미국 특허 출원 제08/029,336호 (1993년 3월 11일 출원), 미국 특허 출원 제08/125,012호 (1993년 9월 21일 출원), 국제특허출원 제PCT/US94/00899호 (1994년 1월 26일 출원)에 기재되어 있다. 또한 촉진제는 본원에 참고로 도입된 PCT 출원 제PCT/US95/04071호 (1995년 3월 30일 출원)에 기재되어 있다. 핵산 분자와 함께 투여되는 촉진제는 핵산 분자와의 혼합물로서 투여하거나 또는 별로도 핵산 분자의 투여와 동시에 또는 전후에 투여할 수 있다. 또한 형질감염제 및(또는) 복제제 및(또는) 염증제로 기능하는 다른 제제를 촉진제와 함께 또는 촉진제 없이, 병용 투여할 있으며, 그 예로는 α-인토페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, B7.2 등의 성장 인자, 사이토킨, 림포카인 뿐만 아니라 섬유아세포 성장 인자, 면역-자극 복합체 (ISCOMS) 등의 표면 활성제, 프로인트 불완전 보조제, LPS 유사체 포함 모노포스포릴 리피드 A (MPL), 뮤라밀 펩티드, 퀴논 유사체, 스쿠알렌 등의 베지클 (vesicle) 및 스쿠알렌이 있으며, 히아누론산도 유전자 제작물과 함께 투여될 수 있다.
일부 바람직한 실시태양에서는 본 발명의 유전자 제작물이 국소 마취제의 군에 속하는 것과 같은, 벤조산 에스테르, 아닐리드, 아미딘, 우레탄 및 이들의 히드로클로라이드염으로 이루어진 군에서 선택된 촉진제와 함께 조제되거나 함께 투여된다.
일부 바람직한 실시태양에서의 촉진제는 다음 식 중 하나를 갖는 화합물일 수 있다.
Ar-R1-O-R2-R3
또는
Ar-N-R1-R2-R3
또는
R4-N-R5-R6
또는
R4-O-R1-N-R7.
식 중, Ar은 벤젠, p-아미노벤젠, m-아미노벤젠, o-아미노벤젠, 치환된 벤젠, 치환된 p-아미노벤젠, 치환된 m-아미노벤젠, 치환된 o-아미노벤젠 (아미노벤젠화합물의 아미노기는 아미노, C1-C5 알킬아민, C1-C5, C1 -C5 디알킬아민일 수 있고, 치환된 화합물에서 치환체는 할로겐, C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시임)이고,
R1은 C=O이고,
R2는 분지된 알킬들을 포함하는 C1-C10 알킬이고,
R3은 수소, 아민, C1-C5 알킬아민, C1-C5, C1 -C5 디알킬아민이고,
R2 + R3은 시클릭 알킬, C1-C10 알킬 치환된 시클릭알킬, 시클릭 지방족 아민, C1-C10 알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C1-C10 알킬 N-치환 헤테로사이클을 포함하는 C1-C10 알킬 치환된 헤테로사이클을 형성할 수 있고,
R4는 Ar, R2 또는 C1-C5 알콕시, 시클릭 알킬, C1-C 10 알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C1-C10 알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C1-C10 알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C1-C10 알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10 알콕시 치환된 헤테로사이클이고,
R5는 C=NH이고,
R6은 Ar, R2 또는 C1-C5 알콕시, 시클릭 알킬, C1-C 10 알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C1-C10 알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C1-C10 알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C1-C10 알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10 알콕시 치환된 헤테로사이클이고,
R7은 Ar, R2 또는 C1-C5 알콕시, 시클릭 알킬, C1-C 10 알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C1-C10 알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C1-C10 알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C1-C10 알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10 알콕시 치환된 헤테로사이클이다.
에스테르의 예로는 벤조산 에스테르 (피페로카인, 메프릴카인, 이소부카인 등), 파라아미노벤조산 에스테르 (프로카인, 테트라카인, 부테타민, 프로폭시카인, 클로로프로카인 등), 메타아미노벤조산 에스테르 (메타부타민, 프리마카인 등), 파라에톡시벤조산 에스테르 (파르에톡시카인 등) 등이 있다. 아닐리드의 예로는 리도카인, 에티도카인, 메피바카인, 부피바카인, 피로카인, 프릴로카인 등이 있다. 그러한 화합물의 다른 예로는 디부카인, 벤조카인, 디클로닌, 프라목신, 프로파라카인, 부타카인, 베녹시네이트, 카르보카인, 메틸 부피바카인, 부타신 피크레이트, 페나카인, 디오탄, 루카인, 인트라카인, 누페르카인, 메타부톡시카인, 피리도카인, 비펜아민, 식물성 비사이클 (예: 코카인, 신나모일코카인, 트룩실린, 코카에틸렌 등) 및 이들 모든 화합물의 히드로클로라이드와의 착물 등이 있다.
바람직한 실시태양에서는, 촉진제가 부피바카인이다. 부피바카인과 메피바카인 사이의 차이점은 부피바카인은 메피바카인의 N-메틸기 대신에 N-부틸기를 갖고 있는 것이다. 화합물은 그 N에 C1-C10을 갖고 있다. 화합물들은 프로카인과 클로로프로카인처럼 할로겐으로 치환될 수 있다. 아닐리드가 바람직하다.
촉진제는 유전자 제작물 보다 먼저 또는 유전자 제작물과 동시에 또는 유전자 제작물 보다 나중에 투여한다. 촉진제와 유전자 제작물은 동일한 조성물 내로 조제될 수 있다.
부피바카인-HCl의 화학명은 2-피페리딘카르복사미드, 1-부틸-N-(2,6-디메틸 페닐)-모노히드로클로라이드, 일수화물이며 제약용으로 여러 공급처 (Astra Pharmaceutical Products Inc. (미국 매사추세츠주 웨스트보로 소재), Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (미국 뉴욕주 뉴욕 소재), Eastman Kodak (미국 뉴욕주 로체스터 소재) 등)로부터 널리 구입할 수 있다. 부피바카인은 메틸파라벤과 함께 또는 이것 없이, 에피네프린과 함께 또는 이것 없이 상업적으로 조제된다. 그러한 제제 모두가 사용될 수 있다. 제약용으로 0.25 , 0.5 , 0.75 농도가 시판되며, 이를 본 발명에 사용할 수 있다. 필요하다면, 다른 범위의 농도, 그 중에서도 바람직한 효과를 유도하는 0.05 내지 1.0 의 농도를 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면 부피바카인 약 250 ㎍ 내지 약 10 mg을 투여한다. 일부 실시태양에서는 약 250 ㎍ 내지 약 7.5 mg을 투여한다. 일부 실시태양에서는 약 0.05 mg 내지 약 5.0 mg을 투여한다. 일부 실시태양에서는 약 0.5 mg 내지 약 3.0 mg을 투여한다. 일부 실시태양에서는 약 5 내지 50 ㎍을 투여한다. 예를 들면, 일부 실시태양에서는 등장 제약 담체 중의 0.25 - 0.50 부피바카인-HCl 및 0.1 메틸파라벤 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ml을 백신이 투여되기 전에 또는 백신 투여와 동시에 또는 백신 투여후 동일한 위치로 투여한다. 이와 유사하게 일부 실시태양에서는 등장 제약 담체 중의 0.25 - 0.50 부피바카인-HCl 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ml를 백신이 투여되기 전에 또는 백신 투여와 동시에 또는 백신 투여후 동일한 위치로 투여한다. 부피바카인 및 임의의 다른 유사한 활성 화합물, 특히 국소 마취제의 친족에 속하는 것들을 세포의 유전자 제작물 획득의 필요한 촉 진율을 제공하는 농도로 투여할 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서는 개체에 유전자 제작물을 투여하기 전에 우선 촉진제를 주입한다. 다시 말하면, 예를 들어 유전자 제작물을 투여하기 약 1 주일 내지 10일 전까지 촉진제를 먼저 개체에 주입한다. 일부 실시태양에서는 유전자 제작물을 투여하기 전후의 약 1 내지 5일에, 어떤 실시태양에서는 24시간에 촉진제를 주입한다. 또한 이왕 사용한다면 촉진제는 유전자 제작물과 동시에, 유전자 제작물을 투여하기 전후 수분내에 투여한다. 따라서 촉진제와 유전자 제작물을 합해서 단일한 제약 조성물을 제조할 수 있다.
일부 실시태양에서는 유전자 제작물을 촉진제 없이 투여하며, 다시 말하면 유전자 제작물의 투여를 촉진제의 투여와 병용하지 않는 투여 프로토콜을 사용하기 때문에, 제제 내에 촉진제가 없다.
본 발명에 따라 세포로 운반되는 핵산 분자는 예방적 및(또는) 치료적 면역제로 기능하는 단백질을 위한 유전자 주형으로 기능할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는 핵산 분자가, 동물 세포 내에서 코딩 영역이 전사 및 번역되기 위해 필요한 조절 서열을 포함한다.
본 발명은 바이러스, 원핵생물, 단세포 병원성 유기체 및 다세포 기생충 등의 병원성 진핵생물 등의 모든 병원체에 대해 개체를 면역시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 세포를 감염시키는 병원체로서 바이러스 및 임균, 리스테리아, 시겔라 등의 원핵생물처럼 캡슐화되지 않은 병원체에 대해 개체를 면역시키는데 특히 유용하다. 또한 본 발명은 자신이 세포내 병원체로 존재하는 곳에서 생활 주기 중 한 단계를 갖는 원생동물 병원체에 대해 개체를 면역시키는데도 유용하다. 본원에서 사용된 용어 "세포내 병원체 (intracellular pathogen)"란 번식 또는 생활 주기 중 적어도 일부가 숙주 세포내에 이루어지며, 그 안에서 병원성 단백질을 생산하거나 생산시키는 바이러스 또는 병원성 유기체를 의미한다. 표 1은 본 발명에 따른 백신이 만들어질 수 있는 바이러스과 및 속의 일부를 나열한 목록이다. 이 표에 열거된 항원과 같은 병원체 항원 상에 나타나는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 에피토프를 적어도 하나 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 포함된 DNA 제작물이 백신에 유용하다. 더욱이 본 발명은 원핵 및 진핵 원생동물 병원체 뿐만 아니라 표 2에 열거된 것과 같은 다세포 기생충을 포함하는 다른 병원체에 대해서 개체를 면역시키는데도 유용하다.
병원체 감염으로부터 보호하기 위한 유전자 백신을 제조하기 위해서는, 보호 면역 반응을 유발시키는 면역원성 단백질을 코딩하는 유전 물질을 표적의 코딩 서열로서 유전자 제작물에 포함시켜야 한다. 병원체가 세포내로 감염시키든 (이 경우에 본 발명이 특히 유용함) 또는 세포외로 감염시키든, 모든 병원체 항원이 보호 반응을 유도하는 것은 아닐 것이다. DNA와 RNA는 둘다 상대적으로 작고 상대적으로 용이하게 제조될 수 있기 때문에, 본 발명은 복수의 병원체 항원으로 백신 접종할 수 있다는 추가의 이점이 있다. 유전자 백신에 사용되는 유전자 제작물에는 다수의 병원체 항원을 코딩하는 유전 물질이 포함될 수 있다. 예를 들면 여러 바이러스 유전자를 하나의 제작물에 포함시킴으로써 다수의 표적을 제공할 수 있다.
표 1과 2는 병원성 매개 및 유기체 중에서 이들에 의한 감염으로부터 개체를 보호하기 위해 이들에 대한 유전자 백신을 제조할 수 있는 것들 일부의 목록을 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에서는, 병원체에 대해 개체를 면역시키는 방법이 HIV 또는 HTLV 또는 HBV에 대한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 과증식성 질병에서 특징적으로 나타나는 과증식 세포에 대한 광범위한 근거에서 출발된 (broad based) 보호 면역 반응을 유발하는 방법 및 과증식성 질병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "과증식성 질병"이란, 세포의 과증식에 의해 특징지워지는 질병 및 장애를 의미한다. 과증식성 질병의 예로는 모든 형태의 암 및 건선이 있다.
면역원성 "과증식 세포" 관련 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 제작물을 개체에게 도입하면 개체의 백신 접종된 세포에서 상기의 단백질이 생성된다는 것을 발견하였다. 본원에서 사용된 용어 "과증식 관련 단백질"이란 과증식성 질병과 관련된 단백질을 말한다. 과증식성 질병에 대해 면역시키기 위해서, 과증식성 질병과 관련된 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 제작물을 개체에게 투여한다.
과증식 관련 단백질이 효과적인 면역원성 표적이 되기 위해서는, 정상 세포와 비교하여 과증식성 세포에서만 배타적으로 또는 고농도로 생성되는 단백질이어야 한다. 표적 항원에는 상기와 같은 단백질, 이와 같은 단백질 상에서 발견되는 에피토프를 적어도 하나 포함하는 그의 단편 및 펩티드가 포함된다. 어떤 경우에는, 과증식 관련 단백질은 단백질을 코딩하는 유전자 돌연변이의 산물이다. 돌연변이된 유전자는 정상 단백질 상에서 발견되지 않는 상이한 에피토프를 초래하는 약간 상이한 아미노산 서열을 갖는다는 점을 제외하고는, 정상 단백질과 거의 동일한 단백질을 코딩한다. 이러한 표적 단백질에는 myb, myc, fyn과 같은 종양 유전자, 및 트랜스로케이션 유전자 bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF에 의해 코딩되는 단백질이 포함된다. 표적 항원으로서 종양 유전자 생성물 외에, 항암 치료 및 보호적 양생법을 위한 표적 단백질로는 B 세포 림프종에 의해 제조된 항체의 가변 영역들 및 T 세포 림프종의 T 세포 수용체의 가변 영역이 있으며, 이들은 어떤 실시태양에서는 자기면역 질환에 대한 표적 항원으로 사용된다. 다른 종양 관련 단백질은 단일클론 항체 17-1A에 의해 인지되는 단백질 및 폴레이트 결합 단백질을 비롯하여 종양 세포에서 고농도로 발견되는 단백질과 같은 표적 단백질로 사용될 수 있다.
본 발명이 1종 이상의 암 형태에 대해 개체를 면역시키는데 사용할 수 있지만, 특히 본 발명은 특정 암이 발병될 소인을 지니거나 암이 발병되었던 그래서 재발의 가능성이 있는 개체를 예방적으로 면역시키는데 유용하다. 유전학과 기술 및 피부학의 발전으로 개체에게서 암의 발병 확률을 측정하고 위험성 평가할 수 있게 되었다. 유전자 스크리닝 및(또는) 가계의 병력을 이용하여, 특정 개체에서 여러 유형의 암 중 어느 하나가 발병될 가능성을 예측할 수 있다.
유사하게, 이미 암이 발병했거나, 암 퇴치를 위해 치료를 받았거나, 병이 소강된 개체들은 특히 재발의 가능성을 지닌다. 치료 양생법의 일부로서, 이러한 개체들은 재발을 방지하기 위하여 이미 발병된 것으로 진단되는 암에 대해 면역될 수 있다. 따라서, 소정의 암이 발병되었던 그리고 재발의 위험이 있는 개체는 그 사 실이 알려지는 경우에, 그들의 면역계가 미래의 언젠가에 그 암이 발현되는 것을 방지하도록 면역될 수 있다.
본 발명은 과증식성 질병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 유전자 제작물의 도입은 면역 치료적이며 표적 단백질을 생성하는 과증식성 세포와 대항하기 위하여 개체의 면역계를 지휘 및 증진시키는 작용을 한다.
본 발명은 "자기"-지시적 항체를 생성하는 세포 및 세포 수용체를 비롯해서 자기면역성과 관련된 표적에 대해 광범위한 보호 면역 반응을 부여함으로써, 자기면역 질병 및 장애 환자의 치료 방법을 제공한다.
T 세포 매개된 자기면역 질병에는 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 유육종증, 인슐린 의존성 진성당뇨병(IDDM), 자기면역 갑상선염, 리엑티브 관절염, 강직성 척추염, 공피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 맥관염, 웨그너 육아종증, 크론 질병 및 궤양성 대장염이 포함된다. 각 질병은 내인성 항원에 결합하고 자기면역 질병과 관련된 염증성 캐스캐이드를 개시하는 T 세포 수용체에 의해 특성화된다. T 세포의 가변 영역에 대한 백신 접종은 T 세포를 제거하는 CTL를 비롯한 면역 반응을 유발시킨다.
류마티스성 관절염의 경우에는 이 질병에 관여하는 T 세포 수용체의 수개의 특정 가변 영역(TCR)의 특징이 규명되었다. 이 TCR에는 Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 및 Vα-17이 포함된다. 따라서, 상기 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA 제작물을 이용한 백신 접종은 류마티스성 관절염에 관여하는 T 세포를 표적으로 하는 면 역 반응을 유발시킬 것이다 [참조: Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253:325-329; Williams, W.V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90:326-333, 상기 문헌들은 본원에 참고문헌으로 인용됨].
다발성 경화증의 경우에는 이 질병에 관여하는 TCR의 수가지의 특정 가변 영역의 특징이 규명되어 있다. 이 TCR에는 Vβ-7 및 Vα-10이 포함된다. 따라서, 상기 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA 제작물을 이용한 백신 접종은 다발성 경화증에 관여하는 T 세포를 표적으로 하는 면역 반응을 유발시킬 것이다 [참조: Wucherpfenning, K.W. et al., 1990 Science 248:1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature:345:344-346; 상기 문헌들은 본원에 참고문헌으로 인용됨].
피부경화증에서는 이 질병에 관여하는 TCR의 수개의 특정 가변 영역의 특징이 규명되어 있다. 이 TCR에는 Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 및 Vα-12 등이 있다. 따라서, 상기 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA 제작물을 이용한 백신 접종은 피부경화증에 관여하는 T 세포를 표적화하는 면역 반응을 유발시킬 것이다.
T 세포 매개 자기면역 질병, 특히 TCR의 가변 영역의 특징이 이미 규명된 T 세포 매개 자기면역 질병을 앓는 환자를 치료하기 위하여, 활액의 생물 검사를 수행할 수 있다. 존재하는 T 세포의 시료를 취하여, TCR의 가변 영역을 표준 기술을 사용하여 확인하였다. 유전자 백신은 이러한 정보를 사용하여 제조될 수 있다.
B 세포 매개 자기면역 질병에는 낭창(SLE), 그라브병, 근무기력증, 자기면역 용혈성 빈혈, 자기면역 혈소판감소증, 천식, 한성글로불린혈증, 1차 담낭 경화증 및 악성 빈혈이 포함된다. 각 질병들은 내인성 항원에 결합되고 자기면역 질병과 관련된 염증성 캐스캐이드를 개시하는 항체에 의해 특성화된다. 항체의 가변 영역에 대한 백신화는 항체를 생성하는 B 세포를 제거하기 위하여, CTL을 포함하는 면역 반응을 유발시킬 것이다.
B 세포 매개된 자기면역 질병 환자를 치료하기 위하여, 자기면역 활성에 관여하는 항체의 가변 영역은 확인되야 한다. 생체검사를 수행하여, 염증 부위에 존재하는 항체 시료를 채취할 수 있다. 이와 같은 항체의 가변 영역은 표준 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 유전적 백신은 이러한 정보를 사용하여 제조될 수 있다.
낭창의 경우에는, 하나의 항원은 DNA로 믿어진다. 따라서, 낭창에 대해 면역화된 환자에서, 이들의 혈청은 항DNA 항체에 대해 스크리닝되고, 이러한 혈청에서 발견되는 상기 항DNA 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 제작물을 포함하는 백신을 제조할 수 있다.
TCR과 항체 모두의 가변 영역 중 공통적인 구조적 특징은 공지되어 있다. 특정 TCR 또는 항체를 코딩하는 DNA 서열은 문헌[Kanat, et al., 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD, 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 기재된 일반적으로 공지된 방법에 따라 발견될 수 있다. 이 외에, 항체로부터의 기능적 가변 영역을 클로닝하는 일반적인 방법은 문헌[Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066, 본원에 참고문헌으로 인용됨]에서 발견될 수 있다.
<실시예 1>
신염유발성 자기항체 (autoantibody) 항DNA IL/IM:
이 mAb는 신장염에 걸린 MRL-1pr/1pr 마우스의 신장에서 용출된 Ig와 항원 결합 특성을 공유하기 때문에, MRL-1pr/1pr 마우스에서 유래된 하이브리도마의 큰 평판에서 동정했다 (Vlahakos, et al., 1992 Kidney Int 41,1690-1700). 항DNA IL/IM은 pI가 5.1인 J558 VH 유전자 패밀리의 IgG2a 항체이다. 항DNA IL/IM Ab는 ssDNA, dsDNA, SmRNP, 사구체 추출물에 특이적으로 결합한다. 정상적인, 조직적합성 마우스에 항DNA IL/IM를 투여하면 이는 신장내에서 사구체맥관막 (mesangial), 내피밑 (subendothelial) 및 관강내 (intraluminal)의 면역 침전물을 형성한다.
항DNA IL/IM을 생산하는 하이브리도마 세포를 조직적합성 마우스로 복강내 투여하는 경우, 이들은 막내 및 관강내의 농밀한 침전물을 만들어 내며, 이는 모세혈관벽이 두꺼워지는 것, 사구체맥관막 삽입 및 팽창, 동맥류의 확장작용 및 사구체 모세혈관 루프의 관강내 패쇄, 및 심한 단백뇨와 관련이 있다. 사구체 면역 침전물의 형태학적 외관은 한성글로불린혈증과 관련된 것을 상기시키지만, 혈청 항DNA Ab 활성이 높은, 항DNA IL/IM 하이브리도마를 가진 마우스에서는 한성글로불린 또는 류마티스성 인자 활성을 검출할 수 없었다. 사구체 면역 침전물 형성은 모세혈관벽이 두꺼워지는 것, 사구체맥관막 삽입 및 팽창, 동맥류의 확장작용 및 사구체 모세혈관 루프의 관강내 패쇄, 및 심한 단백뇨와 관련이 있다.
교차 반응성의 상이한 신염유발성이 있기 때문에, 항DNA-IL/LM이 사구체 Ag와 직접적인 상호작용에 의하여 면역 침전물을 형성하는 것인지에 대한 분석을 고려에 넣었다. 이 가능성을 알아보기 위해, 단일클론 항DNA IgG2a Ab, 항DNA IL/IM이 사구체 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 용량을 측정했다. 항DNA IL/IM은 정상적인 마우스에 투여된 후 생체내에서 사구체맥관막, 내피밑 및 관강내 침전물을 만들어 냈다. FACS에 의하면 항DNA IL/IM (하이브리도마 번호 H221로 불림)는 사구체맥관막, 관 내피 및 대동맥 내피세포 표면에 결합했던 반면 사구체 면역 침전물을 생산하지 않았던 이소형 대응 (isotype matched) 항DNA 항체에 의한 표면 결합은 관찰되지 않았다. 결과를 도 1a, 1b, 1c에 도시했다 (쥐의 내피세포는 펜실바니아 대학 신장부 (Renal Division)의 Dr. Fuad Ziyadeh가 제공한 것이었음).
항DNA 항체로 탐침된, 구성하고 있는 사구체 세포들의 전체 세포 용해물을 사용하는 웨스턴 블롯 결과, 항DNA IL/IM은 다수의 밴드와 반응하는 것으로 나타난 반면, 면역 침전물을 형성하지 않은 항DNA 항체는 그렇지 않았다. 세포 표면 항원을 바이오티닐화하고 항DNA IL/IM으로 면역침전시킨 후, 이소형 대응 비교용 모노클로날 항DNA 항체에 의해 인식되지 않는 사구체맥관막 세포 용해물 내의 100 kD 밴드를 동정했다.
따라서, 항DNA IL/IM mAb는 쥐의 신장 사구체맥관막 세포 및 대동맥 내피 세포에 결합하는 것으로 입증되었으며, 가능성 있는 후보 표면 단백질 표적을 동정했다. 이는 이 mAb의 다특이성 (polyspecific) 항원 결합성을 의미하는 것으로, 이 성질은 병원성 SLE 항체들의 공통적인 특징이며, 사구체 면역 침전물 형성의 초기 에 세포 표면 항원에 결합을 유발할 수 있다.
항DNA IL/IM (H221)의 서열 분석을 수행했다. 완전한 VL-JL 서열 (서열 4) 및 VH-DH-JH (서열 6)의 거의 완전한 서열을 아래에 나타냈다.
<서열 4>
H221 VL-JL 서열
Figure 111999003750555-pct00001
<서열 6>
H221 VH-DH-JH 서열
Figure 111999003750555-pct00002
분석 결과, 항DNA IL/IM (H221)이 J558 VH 패밀리에 속하는 것이며 아래의 연구 설계 및 방법란에 기재한 실험을 수행하기 위한 시료를 제공한다는 것이 확인되었다. 추가의 서열 분석은 중쇄의 서열을 완성하기 위해 진행중이다.
항DNA IL/IM에 대한 유전자 면역화:
AKR x DBA/2 마우스를 항DNA IL/IM VH 또는 Fv 영역을 코딩하는 DNA 제작물로 면역시킨 후, 하이브리도마 모세포의 치사량으로 공격하는 예비 연구를 수행했다. 간략하게 말하면 도 2a에 나타낸 바와 같이, V 영역을 CMV 프로모터의 조절하에 놓이게 하면서 VH 또는 Fv 영역을 유전자 면역 벡터로 클로닝했다. 도 2b에 나타낸 바와 같이 V 영역은 세포막으로 위치지정되거나 분비되거나 시토졸에 남거나 아데노바이러스 E19 단백질 ER 체류 신호를 사용하여 소포체에 체류했다. 리소좀으로 위치지정된 제작물도 또한 개발했다.
본원에 참고로 도입된 문헌 (Biocca, S. et al. 1990 EMBO J. 9(1):101-108)는 세포막, 분비, 시토졸 위치로의 위치지정을 설명하고 있다. 문헌 (Nilsson et al. 1989 Cell 58: 707-718), 문헌 (Jackson et al. 1993 J. Cell Biol. 121(2) 317-333), 및 문헌 (Jackson et al. 1990 EMBO J. 9:3153-3162)은 아데노바이러스 E19 단백질 ER 체류 신호를 사용하여 소포체 내에서 체류하는 단백질을 설명했다. 문헌 (Letourneur, F. and R. D. Klausner 1992 Cell 69: 1143-1157)에는 리소좀으로 위치지정되는 단백질에 대해 기재한다.
예비 실험에서는, 부피바카인 예비처리 후, 정제된 플라스미드 DNA로 마우스를 접종하고, 여러 번 추가 면역 후, 마우스를 항체 반응에 대해 평가했다. 비교용은 죽은 하이브리도마 세포와 정제된 항체 Fv 영역을 포함했다. 이들 면역원은 아무것도 항DNA IL/IM Fab 단편에 대해 혈청 반응을 유발할 수 없었다 (표지된 Staph. 단백질 G로 검출). 예비 연구에서, 증식 및 세포독성 T 세포 반응은 여러 제작물에 의해 유발되었다. 최고의 제작물을 선별하여, 많은 마우스 집단에서 평가했다. AKR x DBA/2 마우스 4 마리로 이루어진 군들을 부피바카인과 함께 100 ㎍ 플라스미드 DNA로 동시에 한번 면역화시켰다. 일주일 후, 이들을 죽이고 세포독성 T 세포 및 증식 반응에 대해 평가했다. 증식은 정제된 H221 mAb (25 또는 5 = B5g/웰)로 또는 20,000 또는 100,000 죽은 항DNA IL/IM 하이브리도마 세포로 면역 지라세포를 자극한 후 적정된 티미딘 펄스를 밤새 가함으로써 평가했다. 결과를 도 3에 나타냈다.
최고의 증식 반응은 죽은 하이브리도마 세포에 의해 유도되었다. 측정할 수 있을 정도의 반응 (벡터 단독과 비교할 때)이 대부분의 제작물에 대해 발견되었으나 그다지 크지 않았다. 정제된 mAb에 대한 증식 반응은 죽은 세포 또는 ER 위치지정 백신으로 면역시킨 마우스에 있어서 상당했다 (주쇄 비교용을 넘는 표준 오차 > 2). 하이브리도마 세포에 대한 증식 반응은 ER 위치지정 백신과 VH 가용성 및 VH 시토졸 백신 모두의 경우에 상당했다 (주쇄 비교용을 넘는 표준 오차 > 2). 이와 대조적으로, 유도된 CTL 반응은 현저하게 나타났다. 이 결과를 도 4a, 4b, 4c에 나타냈다.
면역 지라 세포를 죽은 항DNA IL/IM 자극인자 (지라 세포 대 자극 인자의 비율 20 : 1)의 존재하에 7 일 동안 배양했다 (처음 2일 동안은 콘카나발린 A의 존재하에, 그 다음은 자극인자만 존재하는 상태로 수행). 항DNA IL/IM 하이브리도마 세포를 51Cr로 표지하고 바닥이 둥근 마이크로타이터 플레이트에서 용해율을 결정했다. 평균 =B1 표준 편차 특이적 용해율 () (CD4에 대해 상기한 바와 같음)을 여러 작용인자 : 표적의 비율에 대해 나타낸다. 흥미로운 것은 하나 (가용성 중쇄 V 영역 또는 VH sol)만 제외하면 모든 제작물이 양성 비교용인 죽은 세포과 같은 정도로 양호하거나 더 나은 관찰된 CTL 활성을 유도했다는 점이다. 특히 시토졸 위치지정 제작물 및 ER 위치지정 제작물의 경우에는 특별한 반응이 관찰되었다. 이는 이러한 세포내 기관으로 위치를 지정하면 CTL 반응을 증진시킨다는 것을 나타낸다.
이런 연구는 실험한 대부분의 DNA 백신에 의해 CTL 반응이 양호하게 내지는 탁월하게 유도된다는 것을 나타낸다. 이 실험은 연구를 수행하기 위한 특정 백신 을 선별하고 나머지를 제외시키는데 사용하는 전략의 예가 될 수 있다. 따라서, 시토졸로 위치지정된 Fv 제작물은 다른 제작물 보다 분명하게 더 높은 ( > 2 표준 오차) CTL 반응을 유도했다. 이런 분석을 기초로, 이 백신을 추가 평가했다. 이와 유사하게 VH 가용성 백신은 양호한 CTL 반응을 유도하지 않았다. 따라서 이 백신은 가설에 따르면 CD4계 내에서 발생하는 보호 반응을 유도할 것으로 예상되지 않기 때문에 추가 분석에서 제외되었다.
이 백신을 이용한 추가 실험은 이것이 정말 그 경우임을 입증했다. 이 실험에서 5 또는 6마리의 마우스로 이루어진 군들을 DNA 백신 100 = B5g's로 3회 면역접종했다. 그 다음 이들을 항DNA IL/IM 하이브리도마 세포로 복강내 공격했다. 4주후, 비교용 동물에서 종양이 발생했을 때, 모든 마우스를 죽여서 종양 무게 및 복수량을 측정했다. 종양이 발생한 마우스의 비율을 정량했다. 그 결과를 도 5a, 5b, 5c에 나타냈다.
도 5a는 종양이 발생한 마우스의 비율을 보여준다. 도 5b는 각 군별로 평균 종양의 질량 및 개별 마우스에 대한 값을 보여준다. 이와 유사하게 도 5c는 얻은 악성 복수의 부피를 나타낸다. 이런 구체적인 실험에서, 죽은 세포 (양성 비교용)로 면역 접종한 마우스는 벡터만 (음성 비교용)으로 면역접종한 마우스와 어떻게 측정하든 별다르지 않았다. 이럼에도 불구하고, 여러 DNA 백신은 명백한 보호 활성을 보였으며, 그 중에서도 Fv 시토졸 위치지정 백신과 Fv 및 VH 소포체 (ER) 위치지정 백신이 명백한 보호 활성을 나타냈다. 이는 CTL 반응을 유도하는 이들 백신의 능력과 명백하게 관련되어 있다. VH 가용성 백신은 보호 활성을 나타내지 않 았으며, 이는 CTL 활성을 나타내지 못했던 것과도 일치한다.
<실시예 2>
사람의 여러 질병이 B 및 T 세포의 병리적 증식과 관련되어 있다. 이런 질병에는 림프종 및 백혈병 등의 악성 또는 과증식성 질병 및 전신성홍반성낭창 (SLE) 등의 자기면역 질환 (여기서는 병원성 자기항체가 조직 손상을 매개함) 등이 있다. 이들 질병의 현행 치료법은 불충분하며, 높은 발생율의 부작용을 동반한다. 이런 질병의 치료법에 대한 보다 국소적 접근 방식은 병원성 세포를 특이적으로 제거하는 것이다. 이는 병원성 세포의 가변 영역을 겨냥하는 활발한 면역요법에 의해 이루어질 수 있을 것이다. V 영역에 대한 활발한 면역요법은 병원성 세포를 제거할 수 있는 가능성이 있다. 또한 보호적 면역성을 유도함으로써, 병원성 클론의 재출현을 일소할 수 있다. 그러나, 면역 접종에 의해 유도된 면역 반응은 또한 해로운 결과를 일으킬 가능성도 있다. 예를 들면 이상적으로는, B 세포 V 영역을 생산하는 자기항체에 대한 백신접종은 세포독성 T 세포 (CTL) 반응을 유도해야하며 동시에 병원성 B 세포를 제거하고 자기항체 생산을 제한해야 한다. 그러나 만약 헬퍼 T 세포 (즉 TH2형 반응)가 유도된다면, 자기항체 생산은 사실상 증가하여 환자에게 해를 줄 것이다. 따라서, 병원성 B 또는 T 세포 V 영역에 대한 활발한 면역화는 원하는 면역 반응 (예: CTL 반응)을 유도하면서 잠재적으로 해로운 반응 (예: TH2 반응)을 제한하도록 설계해야 한다.
자기항체 V 영역에 대한 DNA 백신 접종을 다음과 같이 측정했다. 자기항체 생산 하이브리도마 항DNA IL/IM (H221로도 불림)을 MRL-1pr/1pr 마우스로부터 유래된 하이브리도마의 대형 평판로부터 선택했다. 항DNA IL/IM 생산 하이브리도마 세포를 조직적합성 마우스에 복강내 투여할 경우 이들은 막내 및 관강내의 농밀한 침전물에 의해 특징지워지는 사구체신염을 일으키며, 이는 모세혈관벽이 두꺼워지는 것, 사구체맥관막 삽입 및 팽창, 동맥류의 확장작용 및 사구체 모세혈관 루프의 관강내 패쇄, 및 심한 단백뇨와 관련된다. 이는 병원성 자기항체 V 영역을 겨냥하는 유전형 (idiotype) DNA 백신 접종의 보호 면역성을 유도하는데 있어서의 효능을 측정하는 생체내 계를 제공한다. 이들 DNA 백신의 면역원성을 향상시키는 가능성을 연구하기 위해, 유전자 발현을 특이적인 세포내 기관 대 세포외 기관 (시토졸, 분비를 위한 소포체 (ER) 및 체류를 위한 소포체)으로 겨냥시켰다. 단일 V 영역 (VH 영역)에 대한 백신 접종 및 전체 Fv (VL에 연결된 VH) 단편에 대한 백신 접종을 사용했다. 결과는 H221 VH 및 Fv 영역에 대한 DNA 접종이, V 영역이 시토졸에서 발현되거나 또는 ER에 체류하도록 위치를 지정함으로써 CTL 활성을 향상시켜, 특이적인 세포성 면역 반응, 특히 강력한 CTL 반응을 유발한다는 것을 나타낸다. 또한 유전형 DNA 백신 접종은 H221 세포에 대해 보호 면역성을 유도했으며, 특히 유전자 생성물이 ER에서 체류하도록 위치지정된 경우에 그러하다.
재료 및 방법
DNA 제작물
pBBkan은 전사를 지휘하는데 CMV 프로모터 및 RSV 인핸서를 사용하는 진핵세 포 발현벡터이다 (도 8). 우선 이것을 NotI 및 XbaI 위치 사이에 다수의 클로닝 위치 내로 마우스 IgG로부터 얻은 분비 리더 또는 세포질 리더를 삽입하여 변형시켰다. 분비 리더를 갖고 있는 벡터는 분비 및 ER 체류 백신을 위한 모(母)벡터가 된다. 마찬가지로 세포질 리더를 갖고 있는 벡터는 세포질에서 발현된 백신에 대한 모(母)벡터가 된다. H221 VH 및 VL 영역을 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 증폭시키고, 재조합 PCR을 사용하여 Fv 코딩 서열을 제조했다 (Srikatan, et al. 1994 AIDS 8: 1525-32, 본원에 참고로 도입됨). XbaI 제한 위치는 단일 중쇄 생성물 5' 말단 및 카파 경쇄 생성물 (Fv)의 5' 말단으로 클로닝했다. CPR 생성물을 제한 소화시킨 후 2 저용융 아가로오즈로부터 표준 페놀-클로로포름 추출, 겔 정제법으로 정제하고 벡터내로 직접 라이게이션시키거나 (리더 서열의 경우처럼) 또는 다른 단편에 라이게이션시키고, 나타낸 3' 위치지정 서열 (CD4 TM 내지 E19, Fv 또는 Vh 내지 CD4-E19)에서 스플라이싱하는 추가의 PCR 반응을 위한 주형으로 사용했다. E19 신호 서열은 CD8-E19로부터 증폭시켰다 (Nilsson, et al. 1989 CELL 58: 707-718, 본원에 참고로 도입됨). 사용된 프라이머를 표 3에 열거했다. 면역글로불린 리더 (분비 또는 체류를 위한 ER 위치지정)의 아미노산 서열 (서열 22), 시토졸 리더의 아미노산 서열 (서열 23), H221 VL 영역의 아미노산 서열 (서열 24), 링커 펩티드의 아미노산 서열 (서열 25), H221 VH 영역 (서열 26) 및 CD4 막횡단 및 E19 세포질 도메인 (ER 체류용) (서열 27)이 표 4에 열거되어 있다. 면역글로불린 리더 (서열 22)는 쥐의 면역글로불린 리더로서 분비 또는 ER 체류를 위해 유전자 생 성물을 ER로 위치하도록 하는데 사용되었다. 시토졸 리더 (서열 23)는 항체의 세포내 발현에 대해 이미 보고된 서열이었다 (Biocca, et al. 1990 EMBO J. 9:101-108, 본원에 참고로 도입됨). VH 및 VL 서열 (각각 서열 24, 서열 26)은 PCR 생성물을 클로닝한 후 결정했다. 링커 펩티드 (서열 25)를 Fv 영역의 기능적 발현을 위해 사용했다. 사람 CD4 막횡단 영역을 ER 체류를 위한 아데노바이러스 E19 위치지정 서열과 결합시켰다 (서열 27).
이들 PCR 생성물을 pBBkan으로 클로닝하고 이것으로 DH5 알파 대장균 (E. coli) (Life Technologies Inc., 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)을 형질감염시키고 정확한 제한 패턴을 가진 클론을 ABI 형광 서열분석 키트 (Applied Biosystems Inc., 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 서열 분석했다. 생성물을 정제하고 키트 지시에 따라서 건조하고, 겔 영동시키고 펜실바니아 대학 암센터 코어 시퀀싱 설비 (Core sequencing Facility)로 분석했다. 서열 분석을 통해 H221이 Vk1 유전자와 쌍을 이루는 J558 VH 및 JH3 유전자를 사용한다는 것이 밝혀졌다. 벡터, 제작물 및 삽입체 서열을 도 8 및 표 4에 나타냈다. 플라스미드는 슈퍼 브로쓰 (1.2 w/v Difco 트립톤, 2.4 w/v Difco 효모 추출물, 0.5 v/v 글리세롤, 72 mM 인산칼륨 (이염기성), 28 mM 인산칼륨 (일염기성))에서 증식시켜 퀴아겐 500 팁을 제조자의 프로토콜 (Qiagen Inc., 미국 캘리포니아주 캐츠워쓰 소재)에 따라 정제했다. DNA 접종을 부피바카인 예비처리와 함께 수행했다 (Wang, et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156-4160, 본원에 참고로 도입됨).
증식 분석
백신 접종한 마우스로부터 얻은 개별 지라를 멸균 상태로 추출하고 RPMI로 부드럽게 파쇄하고 게이 용액 (Gey's sol)으로 처리하여 적혈구를 용해시킨다. 지라세포를 96 웰 평판 조직 배양 플레이트 (Falcon 3072; Becton Dickinson, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재)에 웰당 500,000로 최종 부피 200 ㎕ 되도록 플레이팅한다. 3개의 동일한 웰을 배지 단독, 2 ㎍/ml 콘카나발린 A, 5 및 25 ㎍/ml Mab H221, 및 5 : 1 또는 25 : 1 (지라세포 : 자극인자) 미토마이신 C에 의해 죽은 H221 하이브리도마 세포에 노출시킨다. 106 하이브리도마 세포/ml을 37 ℃에서 45 분 동안 PBS 내에서 25 ㎍/ml 미토마이신 C로 처리한 후 PBS로 3회 세척하여 독소를 제거했다. 5 CO2, 37 ℃에서 3 일 동안 배양한 후, 1 μCi 적정된 티미딘 (NEN Life Sciences, 미국 매사추세츠주 보스턴 소재)을 배지 20 ㎕에 첨가하고 18 시간 후에 Tomtec Harvester 96 (Tomtec, 미국 코넥티커트주 오렌지 소재)로 수확했다. 필터매트를 건조한 후 마이크로베타 1450 섬광 계수기 (Wallac Inc., 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재) 상에서 베타 섬광으로 계수했다.
세포독성 T 세포 분석
지라세포를 2 ㎍/ml 콘카나발린 A 및 미토마이신 C 처리된 자극인자가 담긴 5 x 105/ml (20 : 1 지라세포 대 자극인자)에서 배지가 미토젠이 제거되도록 변하는 시점인 24 시간 동안 배양한다. 추가로 4 일 동안 더 배양한 후, 세포를 배지 10 ml 안에 모으고, 20 분 동안 1500 g으로 Ficoll로 원심분리했다. 그 다음 세포를 계수하고, 바닥이 둥근 웰 각각에 표적 세포수를 일정하게 하면서, 100 : 1, 50 : 1, 25 : 1, 12.5 : 1의 작용인자 : 표적이 되도록 플레이팅했다. 표적 세포는 250 ㎕ 배지 중의 107 살아있는 H221 세포를 재현탁시키고 75 μCi 51Cr-크롬산나트륨 (NEN/Life Sciences Inc., 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)을 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션시켜 준비했다. 그 다음 이들 세포를 RPMI 완전 배지로 3회 세척하고 재현탁시키고 플레이팅했다. 플레이트를 2 분 동안 800 rpm에서 원심분리한 후, 37 ℃에서 5 시간 및 16 시간 인큐베이션시키고, 이 때 상층물 50 ㎕을 조심스럽게 제거하고, 섬광 계수기로 Optiphase 섬광 유체 (Wallace Inc., 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)를 사용하여 계수했다. 특이적 용해율 ()는 다음의 방정식에 따라 계산했다.
Figure 111999003750555-pct00003
(자연 방출량은 오직 배지 단독에만 인큐베이션시킨 세포에서 방출된 cpm 값이고, 총 방출량은 1 SDS에서 인큐베이션시킨 표적 세포의 총 용해에 의해 방출된 것임)
생체내 종양 공격
마우스를 3회 DNA 접종 중 마지막에 프리스테인 (1 ml, 복강내)으로 마시게 했다. 1 주 후에 이 마우스 (1 군당 6마리)에게, 멸균 PBS로 2회 세척하고 107/ml로 재현탁시켜둔 106 살아있는 H221 하이브리도마 세포를 복강내 주입했다. 마우스 를 종양 성장 징후에 대해 (촉진가능한 덩어리 및(또는) 복수) 처음 2 주 동안은 매주 점검하고 그 후에는 격주로 점검했다. 공격한지 4 주 후에 마우스를 죽이고, 충실성 종양을 절제하여 중량을 달아 종양 질량을 정량했다. 악성 복수증에 걸린 마우스의 경우 복수의 세포 함량을 측정하고 종양 질량에 더했다.
항DNA 항체 분석
마우스에서 얻은 혈청을 항 dsDNA ELISA (Madaio, et al., 1984 J. Immunol. 132: 872, 본원에 참고로 도입됨)로 시험했다.
결과
유전형 DNA 접종은 특이적 면역 반응을 유도한다
예비 실험에서, 정제된 플라스미드 DNA로 AKR x DBA/ 2 마우스를 접종하고, 여러 차례 추가 면역 후, 마우스를 세포성 및 체액성 면역 반응에 대해 평가했다. 비교용은 죽은 하이브리도마 세포 및 정제된 H221 mAb를 포함했다. 림프구 증식 반응 및 세포독성 T 세포 반응 모두 항DNA IL/IM Fab 단편에 대한 검출가능한 혈청 반응이 없는 상태에서 (검출은 표지된 스트렙토코쿠스의 단백질 G로 행함) 제작물에 의해 H221 세포에 대해 유도되었다. 세포성 면역 반응을 더 자세히 평가했다. AKR x DBA/2 마우스 4마리로 이루어진 군들을 부피바카인-HCl과 동시에 플라스미드 DNA를 1회 접종했다. 1주 후에, 이들을 죽이고 세포독성 T 세포 및 증식 반응에 대해 평가했다. 결과를 도 9 및 10에 나타냈다.
단일 DNA 접종 후 지라세포의 증식 반응을 평가하는 실험에서 마우스는 0.25 부피바카인 중의 100 ㎍ 플라스미드 DNA로 1회 접종하고, 1 주일 후, 지라세포를 꺼내어 배지 단독, 죽은 H221 세포가 든 배지, 또는 H221 Fab가 든 배지 중 어느 하나에 인큐베이션시켰다. 증식을 정제된 H221 mAb (25 또는 5 ㎍/웰) 또는 죽은 항DNA IL/IM 하이브리도마 세포 (20,000 또는 100,000/웰)로 면역 지라세포를 자극함으로써 평가했다. 양성 비교용은 죽은 H221 세포 (죽은 세포)로 접종하고, 음성 비교용은 벡터만으로 접종했다. 3일간 배양한 후, 세포를 적정된 티미딘으로 밤새 펄스를 가하고, 혼입된 분당 카운트 (cpm)를 측정했다. 평균 Δcpm (실험값 - 배지 단독) ± 3개 동일한 웰의 표준 편차를 Fab 두 개의 농도 및 죽은 H221 세포의 2 개 농도에 대해 나타냈다. 그 결과를 도 9에 나타냈다.
단일 DNA 접종 후 세포독성 T 세포 (CTL) 반응을 평가하는 실험에서는 마우스를 0.25 부피바카인 중의 플라스미드 DNA 100 ㎍로 한번 접종하고, 1 주일 후 지라세포를 꺼내어 콘카나발린 A 및 죽은 H221 세포 (20 : 1 작용인자 : 자극인자 비율)와 함께 인큐베이션시켰다. 24 - 48 시간 후 콘카나발린 A를 제거하고, 세포를 배양하며, 총 5일간 계속 배양했다. 양성 비교용은 죽은 H221 세포 (죽은 세포)로 접종하고, 음성 비교용은 벡터만으로 접종했다. 5 일간 배양한 후, 작용인자 세포를 불연속 구배 원심분리법으로 분리하고 나타낸 여러 비율에서 51Cr 표지 표적 세포를 용해시키는데 사용했다. 특이적 용해율 ()은 <재료 및 방법>란에 나타낸 바와 같이 계산했다. 평균 ± 표준편차 특이적 용해율 ()을 3회 반복 측정에 대해 얻는다. 비교용 (죽은 H221 세포 및 벡터 단독)을 3개의 그래프 모두에 참조를 위해 나타냈다. 결과를 도 10a, 10b, 10c에 나타냈다.
다른 실험에서처럼, 최고의 증식 반응은 죽은 하이브리도마 세포에 의해 유도되었다 (도 9). 측정가능한 반응 (벡터 단독과 비교할 때)이 대부분의 제작물에 대해 관찰되었으나 그 정도가 별로 크지 않았다. 정제된 mAb에 대한 증식 반응은 죽은 세포 또는 ER 위치지정 백신으로 면역시킨 마우스에 있어서 상당했다 (주쇄 비교용을 넘는 표준 오차 > 2). 하이브리도마 세포에 대한 증식 반응은 ER 위치지정 백신과 VH 가용성 및 VH 시토졸 백신 모두의 경우에 상당했다 (주쇄 비교용을 넘는 표준 오차 > 2).
이와 대조적으로 유도된 CTL 반응은 현저하게 나타났다 (도 10). 가용성 중쇄 V 영역 (VH sol)을 제외하고는 모든 제작물이 분석을 위한 양성 비교용인 죽은 세포 정도로 양호하거나 더 나은 CTL 활성을 유도했다. 다른 실험에서는 VH sol은 비교용과 비교할 때 상당한 CTL 반응을 유도했다 (고유한 실험에서 VH sol 제작물 때 비교용의 100 : 1 작용인자 : 표적에서의 특이적 용해율은 22 대 10 ). 시토졸 위치지정 제작물 및 ER 위치지정 제작물의 경우에는 특별한 반응이 관찰되었다. 이는 이러한 세포내 기관으로 위치를 지정하면 CTL 반응을 증진시킨다는 것을 나타낸다. Fv 제작물은 일반적으로 더 강력한 CTL를 유도한다 (ER 체류 백신의 경우는 예외).
하이브리도마 공격으로부터의 보호
자기항체 생산 하이브리도마 세포를 이용한 생체내 공격으로부터 보호하는데 있어서 이들 DNA 백신의 효능을 평가하기 위해, 5 내지 6 마리의 마우스로 이루어 진 군들을 격주 간격으로 부피바카인 중의 DNA 백신 100 ㎍으로 3회 면역 접종했다. 이 마우스를 살아있는 항DNA LK/IM 하이브리도마 세포 (H221 세포)로 복강내 공격했다. 4 주 후, 마우스를 종양 무게 및 복수에 대해 평가했다. 종양 또는 복수를 갖고 있는 모든 마우스를 죽이고 종양을 절제하여 종양의 무게를 측정했다. 그 결과를 도 11a 및 11b에 나타냈다. 도 11a는 백신 접종된 각각 군에 대해 종량의 질량을 보여준다. 평균값을 막대 그래프로 나타냈으며, 개별 마우스에 대한 값은 그위에 부가했다. 도 11b는 각 군 가운데서 4 주 시점에서 종양이 발생한 마우스의 비율을 보여준다. DNA 백신 중 여러 개가 평균 종양 무게 감소에 의해 입증되는 특별한 효과를 나타냈다. Fv 및 VH ER 체류 백신은 둘 다 각각 6/6 및 4/5에서 종양 형성을 억제했으며, 이는 죽은 세포로 면역시켰을 때의 3/6과 벡터 비교용을 투여했을 때의 2/5와 대조적이다.
평가한 거의 모든 마우스가 기저선 반응과 비교할 때 혈청 항DNA 적정농도가, 비교적 작기는 하지만 증가한 것으로 드러났다. 이 파라미터의 경우에 각 군 사이에 현저한 차이는 없었으나 벡터 단독 비교용과 비교할 때 Fv ER 체류 백신으로 면역시킨 군에서 더 낮은 항DNA 수준이 관찰되었다 (Fv ER-체류 백신에 대해 0.83 ± 0.41의 적정 농도 증가, 벡터 비교용 마우스는 1.6 ± 0.55, p = 0.025 Student's t-Test). 따라서 대부분의 강력한 백신은 이 모델에서 순환하는 항DNA량도 상당히 감소시켰다.
생존 동물에서의 면역 반응
종양 공격을 견디고 살아남은 여러 마우스에서, 죽은 H221 세포에 반응하는 CTL 활성 및 증식을 평가했다. 죽은 세포로 면역된 3 마리의 마우스, 시토졸 Fv 제작물로 면역된 3 마리의 마우스, ER 체류 Fv 제작물로 면역된 3 마리의 마우스로 실험을 수행했다. 마우스를 5 주에 죽이고 (처음 종양 공격 후 38일), 죽은 H221 세포에 대한 지라세포의 증식을 도 9에 나타낸 바와 같이 측정했다. 3개의 동일한 웰의 평균 혼입 cpm을 개별 마우스에 대해 나타냈으며, 이 마우스는 자신이 투여받은 백신으로 표지되었다. CTL 반응은 미미했고 (분석 전에 마우스는 추가 면역을 받지 않았음), 최고의 반응 (작용인자 : 표적의 비가 50 : 1일 때 특이적 용해율 13 )은 ER 체류 제작물로 면역된 마우스에서 관찰되었으나 이와 유사한 반응이 다른 것에서도 관찰되었다 (죽은 세포로 면역된 마우스에서 7 , Fv 시토졸 제작물로 면역된 마우스에서 7 ). 이와 대조적으로 증식 반응은 여전히 격렬했다 (도 12). 처음에 죽은 세포 또는 시토졸 위치지정 Fv 제작물로 면역된 마우스는 시험관내에서 죽은 H221 세포에 대해 반응했다 (각각 평균값 7,488 ± 5,864 CPM dn 6,663 ± 4,171 CPM, 배지 단독 비교용에 대해 721 ± 409 및 5,044 ± 1902와 대조적). 이와 대조적으로 처음에 ER 체류 Fv 제작물로 면역시킨 마우스는 죽은 세포에 대해 시험관내에서 반응했다 (평균 37,351 ± 9,004 CPM, 배지 단독의 경우 4,651 ± 1,345). 이런 풍부한 증식 반응은 유사한 배양에서 향상된 IL-2 생산을 통해 관찰되었다 (평균적으로 죽은 세포로 면역시킨 마우스와 비교할 때 Fv ER 체류 백신에서 2 배가 높았다). 또한 이들 결과는 Fv ER 체류 백신으로 면역시킨 공격에서 살아남은 마우스에서의 강력한 세포 증식 반응을 지시한다.
토론
이런 연구는 유전형 DNA 백신 접종으로 체액성 면역 반응이 검출되지 않는 상태에서 세포성 면역 반응을 유발시킬 수 있음을 보여준다. 또한 평가한 대부분의 백신의 경우에 CTL 반응이 죽은 세포에 의해 유도된 CTL 반응과 동등하거나 이를 능가했다 (도 10). 그러나, 죽은 세포 백신과 대조적으로 증식 반응 (전형적으로는 TH 반응과 관련)은 DNA 백신 접종 후에 거의 검출할 수 없었다 (도 9). 따라서 유전형 DNA 백신으로는 단지 약간의 TH 반응과 함께 강력한 CTL 반응을 유도할 수 있다. 이는 보호 면역성을 유도하는데 있어서 CTL의 효능 연구를 가능하게 한다. 이들 유전형 DNA 백신의 면역원성은 DNA 백신을 특정한 세포내 기관, 특히 CTL 반응과 관련된 세포내 기관으로 위치지정함으로써 현저하게 개선되었다 (도 10). MHC 클래스 I 제한된 반응에 대해 예상되는 바와 같이, 시토졸 및 ER 체류로 위치지정하면 CTL 반응을 향상시킨다. Fv 백신 (VH 및 VL 영역 모두)은 VH 영역 단독 보다는 더 면역원성이 큰 것으로 관찰되었다. 이는 면역계로 제공되는 많은 에피토프에 의한 것으로 보인다. 링커 펩티드의 직접적 영향은 배제될 수 없다.
유전형 DNA 백신 접종은 적절한 세포내 기관으로 백신을 위치지정하면 조직적합성 종양 공격으로부터 마우스를 보호할 수 있다 (도 11). 이 보호 반응은 세포 면역성에 의한 것이 분명한데, 왜냐하면 체액 면역성은 종양 공격에서 살아남은 마우스에서도 이 계에서 검출되지 않았기 때문이다. 가장 가능성 있게 보이는 보호 반응은 유도된 CTL 반응에 의한 것인데, 왜냐하면 강력한 CTL 반응은 가장 보호성이 큰 백신인 ER 체류 백신에 의해 유발되었기 때문이다. 이는 ER에서 항원의 농도 및 CTL의 유도에 의해 보호 면역성이 야기됨을 의미한다. 다른 요인도 백신으로 사용되는 제작물 내에 비자기 항원성 결정소 (determinant)의 존재와 같이 보호 반응에 기여할 수 있다. ER 체류 백신으로 면역된, 종양 공격에서 살아남은 마우스는 현저한 증식 반응을 개시했다 (도 12). 이는 ER 체류 Fv DNA 백신이 유전형 특이적 T 세포의 현저한 확장과 함께 종양 공격에 대한 제2 반응을 위해 면역계를 준비시킨다는 것을 의미한다. 이 증식 반응은 죽은 세포 또는 Fv 시토졸 백신으로 처음 면역시킨 살아남은 마우스에서처럼 높지는 않았다. 이는 공격 후 면역 반응의 시기에 관련될 수 있는데, 왜냐하면 단지 하나의 시점이 이 연구에서 샘플이었기 때문이다. 그러나 강력한 제2 반응을 준비하는데 있어서 ER 체류 백신의 선택적인 효과는 이 군에서 종양 공격으로부터의 완벽한 보호에 의해 뒷받침된다.
DNA 백신의 발현, 세포 위치 및 다른 파라미터를 조작할 수 있다면 DNA 백신을, 생체내에서 보호를 유발할 수 있는 유도된 면역 반응의 성질에 대한 연구에 특히 적합하게 만들 수 있다. DNA 백신 접종은 사람의 CD4를 발현하는 쥐의 림프종 세포를 사용한 본 연구를 비롯한 각종 모델 종양 항원, 베타-갈락토시다제 유전자를 사용하는 유사한 계, 사람 암배아 (carcinoembryonic) 항원, 사람 p53 유전자의 돌연변이 형태로부터 얻은 단일 에피토프를 억제하는데 사용했다. 이런 연구 결과 모델 종양 항원에 대해 DNA 백신 접종의 유용함이 정립되었다. 사용된 모든 항원이 사실상 임상적으로 부딪히는 종양 자기항원 보다 대체로 더 면역원성이 큰 외래 단백질이었다.
사람 GM-CSF의 연결된 발현과 함께 또는 없이 사람 Cγ1 및 Cκ를 코딩하는 발현 벡터에 쥐의 림프종의 VH 및 VL 영역을 사용하는 것이 보고되었다 (Syrengelas, et al. 1996 Nature Medicine 2 : 1038-1041, 본원에 참고로 도입됨). 따라서 면역원은 원하는 자기-V 영역에 연결된 외래 항원 결정소를 가진다. 이런 제작물을 이용한 근육내 또는 피내 DNA 접종은 항-유전형 항체 반응뿐만 아니라 생체내 종양 공격으로부터 부분적인 보호를 야기한다. 사람 GM-CSF의 연결된 발현은 유도된 반응을 현저하게 향상시킨다. DNA 면역 접종은 약한 그렇지 않으면 인식되지 않은 종양 항원에 대해 면역 반응을 유발했으며, 이는 DNA (즉, 사람 불변 영역 및 GM-CSF)를 이용한 추가의 자극에 따라 달라졌다.
분리된 동일유전자계 (syngeneic) V 영역 DNA 면역 접종은 자기면역 질환의 쥐 모델에서 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 쥐 Vβ8.2 유전자에 대한 DNA 기재 면역화는 실험적 자기면역 뇌척수염 (EAE)로부터 H-2u 마우스를 보호하는 것으로 나타났다 (Waisman, et al. 1996 Nature Medicine 2 : 899-905, 본원에 참고로 도입됨). 세포성 면역 반응이 입증되었으며, 그 데이타는 DNA 면역화가 이 계에서 Vβ8.2를 발현하는 클론이 지배적인 병원성 T 세포를 완전히 차단했음을 의미했다. 이들의 백신화 방법으로 Vβ8.2 함유 세포의 검출 증거는 전혀 나타나지 않았다 (연결된 리더 펩티드 또는 CDR3가 없는 분리된 V 영역을 사용).
피코르나바이러스과 (Picornavirus) 속(屬) 리노바이러스: (의학) 감기의 약 50와 관련됨
에테로바이러스: (의학) 폴리오바이러스, 콕스삭키에바이러스, 에코바이러스, 및 감염 A 바이러스 등의 사람 엔테로바이러스
아프토바이러스: (수의학) 발 및 구강 질병 바이러스임
표적 항원 VP1, VP2, VP3, VP4, VPG
칼시바이러스과 (Calcivirus) 속 바이러스의 노르워크군 (Norwalk Group): (의학) 이들 바이러스는 전염성 위장염의 주요한 원인 매개물이다.
토가바이러스과 (Togavirus) 속 알파바이러스: (의학 및 수의학) 예를 들면 세닐리스 바이러스, 로스리버 바이러스, 이스턴 및 웨스턴 말뇌염 등이 있음
레오바이러스: (의학) 루벨라 바이러스
플라리비리듀과 (Flariviridue) 예: (의학) 뎅그열, 황열, 일본 뇌염, 세인트 루이스 뇌염 및 진드기 발생 뇌염 바이러스
간염 C 바이러스 (Hepatitis C virus) (의학) 이들 바이러스는 아직 과로 정해지지 않았으나 토가바이러스 또는 플라비바아러스과 중 하나인 것으로 생각된다. 가장 유사한 것은 토가바이러스과이다.
코로나바이러스과 (Coronavirus) (의학 및 수의학) 감염성 기관지염 바이러스 (가금), 돼지 전달가능한 위장 바이러스 (돼지), 돼지 혈구응집 뇌척수염 바이러스 (돼지), 고양이 감염성 복막염 바이러스 (고양이), 고양이 장 코로나바이러스 (고양이), 개 코로나바이러스 (개), 사람 호흡기 코로나바이러스는 약 40가지의 감기 EX. 224E, 0C43를 유발한다. 코로나바이러스는 비A, B, C 간염을 일으킬 수 있다.
표적 항원 E1 - M 또는 매트릭스 단백질로 불리움
E2 - S 또는 스파이크 단백질로 불리움
E3 - HE 또는 헤마글루틴-엘터로오즈 당단백질 (모든 코로나바이러스에 있는 것은 아님)로도 불림
N - 뉴클레오캡시드
랍도바이러스과 (Rhabdovirus) 속 베실리오바이러스
리사바이러스: (의학 및 수의학) 광견병
표적 항원 G 단백질
N 단백질
필로비리듀과 (Filoviridue) (의학) 마르버그 (Marburg)및 에볼라 바이러스 등의 출혈열 바이러스
파라믹소바이러스과 (Paramyxovirus) 속 파라믹소바이러스: (의학 및 수의학) 멈프스 바이러스, 뉴캣슬병 바이러스 (닭에게 중요한 병원체)
모르빌리바이러스: (의학 및 수의학) 홍역, 개디스템퍼
뉴민바이러스: (의학 및 수의학) 호흡기 합포체 바이러스
오르토믹소바이러스과 (Orthomyxovirus) (의학) 인플루엔자 바이러스
분가바이러스과 (Bungavirus) 속 분가바이러스: (의학) 캘리포니아 뇌염, LA 크로스
플레보바이러스: (의학) 리프트계곡열
한타바이러스 : 푸레말라는 헤마하긴 열 바이러스이다.
나이어바이러스 (수의학) 나이로비 양 병
이외에 많은 정해지지 않은 분가바이러스
아레나바이러스과 (Arenavirus) (의학) LCM, 라사 열 바이러스
레오바이러스과 (Reovirus) 속 레오바이러스 : 가능성이 있는 사람 병원체
로타바이러스 : 소아의 급성 위장염
오르비바이러스 : (의학 및 수의학) 콜로라도 진드기 열, 레봄보 (사람) 말뇌증, 청설병
레트로바이러스과 (Retrovirus) 하위과 온코리비리날 (Oncorivirinal): (수의학) (의학) 고양이 백혈병 바이러스, HTLVI 및 HTLVII
렌티비리날 (Lentivirinal): (의학 및 수의학) HIV, 고양이 면역결핍 바이러스, 말 감염증, 빈혈 바이러스
스푸마비리날 (Spumavirinal)
파포바바이러스과 (Papovavirus) 하위과 폴리요마바이러스: (의학) BKU 및 JCU 바이러스
하위과 파필로마바이러스: (의학) 암 또는 유두종의 악성 진행과 관련된 많은 바이러스 종류
아데노바이러스 (Adenovirus) (의학)
EX AD7, ARD., O.B. - 호흡기 질환 유발, 275와 같은 아데노바이러스는 장염을 유발한다.
파르보바이러스과 (Parvovirus) (수의학)
고양이 파르보바이러스: 고양이의 장염을 유발
고양이 판로이코페니아바이러스
개 파르보바이러스
돼지 파르보바이러스
허피스바이러스과 (Herpesvirus) 하위과 알파 허피스 비리듀
속 심플렉스바이러스 (의학)
HSVI, HSVII
바리셀로바이러스: (의학-수의학) 가광견병 - 수두 대상포진
하위과 베타 허피스 바리듀
속 시토메갈로바이러스 (의학)
HCMV
뮤로메갈로바이러스
하위과 감마 허피스 비리듀
속 림포크립토바이러스 (의학)
EBV - (부르키츠 림포)
라디노바이러스
폭스바이러스과 (Poxvirus) 하위과 코르도폭스비리듀 (의학- 수의학)
속 바리올라 (천연두)
백시니아 (우두)
파라폭시바이러스 - 수의학
오우이폭스바이러스 - 수의학
카프리폭스바이러스
레포리폭스바이러스
슈이폭스바이러스
하위과 엔테모폭스비리듀
헤파드나바이러스과 (Hepadnavirus) 간염 B 바이러스
미분류 간염 델타 바이러스
세균성 병원체
병원성 그람 양성 콕시 (cocci)에는 뉴모코칼 (pneumococcal), 스태필로코칼 (staphylococcal), 및 스트렙토코칼 (streptococcal)이 포함되고, 병원체 그람 음성 콕시에는 메닝고코칼 (meningococcal), 및 고노코칼 (gonococcal)이 포함됨
병원성 장내 그람 음성 바실리 (bacilli)에는 엔테로박테리아 (enterobacteriaceae), 슈도모나스 (pseudomonas), 액시네토박테리아 (acinetobacteria) 및 에이케넬라 (eikenella), 멜리오이도시스 (melioidosis), 살모넬라 (samonella), 시겔로시스 (shigellosis), 헤모필러스 (hemophilus), 찬크로이드 (chancroid), 브루셀로스 (brucellosis), 투랄레미아 (tularemia), 에르시니아(yersinia) (파스테렐라(pasteurella)), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 (streptobacillus moniliformis) 및 스피릴륨 (spirillum), 리스테리아 모노시토겐 (listeria monocytogenes), 에리시펠로트릭스 류지오파티아 (erysipelothrix rhusiopathiae), 디프테리아 (diphtheria), 콜레라 (cholera), 안트락스 (anthrax), 도노바노시스 (donovanosis), 그래뉼로마 인기날 (granuloma inguinale) 및 바르토넬로시스 (bartonellosis)가 포함된
병원성 혐기성 세균에는 파상풍, 보툴리즘, 다른 클로스트리디아, 결핵균, 레프로시 (leprosy) 및 다른 미코박테리아 (mycobacteria)가 포함됨, 병원성 스피로헤탈 (sprirochetal) 질병에는 시필리스 (syphilis), 트레포네마토스 (treponematoses), 야스 (yaws), 핀타 (pinta) 및 엔데믹 시필리스 (endemic syphilis), 및 렙토스피로시스 (leptospirosis)가 포함됨. 병원성 세균 및 진균에 의한 감염에는 액티노마이코시스 (actinomycosis), 노카르디오시스 (nocardiosis), 크립토코코시스(cryptococcosis), 블라스토미코시스 (blastomycosis), 히스토플라즈모시스 (histoplasmosis) 및 코시디오도미코시스 (coccidiodomycosis), 캔디다시스 (candidasis), 아스퍼질로시스 (aspergillosis), 및 뮤코르미코시스 (mucormycosis), 스포로트리코시스 (sporotrichosis), 파라코시디오도미코시스 (paracoccidiodomycosis), 페트리엘리디오시스 (petriellidiosis), 토룰로소시스 (torulopsosis), 미세토마 (mycetoma) 및 크로모미코시스 (chromomycosis) 및 더마토피토시스 (dermatophytosis)가 포함됨.
리케치알 감염에는 리케치알(rickettsial) 및 리케치오스(rickettsioses)가 포함됨
미코플라즈마 및 클라미디알 감염에는 미코플라즈마 뉴모니에 (mycoplasma pneumoniaes), 림포그래뉼로마 베네륨 (lymphogranuloma venerum), 앵무새병 (psittacosis), 및 페리나탈 클라미디알 (perinatal chlamydial) 감염이 포함됨.
진핵 병원체
원생동물 및 기생충 및 감염물에는 아메바증 (amebiasis), 말라리아, 레슈마니아시스 (leishmaniasis), 트립파노소미아시스 (trypanosimiasis), 톡소플라즈모시스 (toxoplasmosis), 뉴모시스티스 (pneumocystis), 카리니 (carinii), 바베시오시스 (babesiosis), 기아르디아시스 (giardiasis), 트리키노시스 (trichinosis), 필라리아시스 (filariasis), 시스토소미아시스 (schistosomiasis), 선충, 흡충류(trematode) 또는 흡충(fluke), 및 조충류(조충) 감염이 포함됨
Figure 111999003750555-pct00030
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Claims (48)

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  7. 세포내 위치지정(targeting) 서열에 연결되거나 이를 포함하는 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조절 요소에 작동가능하게 연결된 상태로 포함하고, 상기 세포내 위치지정 서열이 상기 면역원성 표적 단백질의 C 말단의 DEKKMP (서열 3)인 것인 플라스미드.
  8. 제7항의 플라스미드 및 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 항원에 대해 개체를 면역시키기 위한 제약 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 추가로 촉진제를 포함하는 제약 조성물.
  10. 세포내 위치지정 서열에 연결되거나 또는 이를 포함하는 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조절 요소에 작동가능하게 연결된 상태로 포함하고, 상기 세포내 위치지정 서열이 상기 면역원성 표적 단백질이 분비되도록 지시하는 것이고, 상기 세포내 위치지정 서열이 서열 22를 포함하는 것인 플라스미드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역원성 표적 단백질이 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환과 관련된 세포 관련 항원이거나 또는 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환과 관련된 세포 관련 항원과 교차 반응하는 면역 반응을 유발할 수 있는 것인 플라스미드.
  12. 제10항에 있어서, 상기 면역원성 표적 단백질이 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원인 플라스미드.
  13. 제10항에 있어서, 상기 세포내 위치지정 서열이 N-말단 소수성 리더 서열 또는 면역글로블린 리더 서열인 플라스미드.
  14. 삭제
  15. 제10항의 플라스미드를 포함하는 항원에 대해 개체를 면역시키기 위한 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 추가로 촉진제를 포함하는 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 촉진제가 부피바카인(bupivacaine)인 제약 조성물.
  18. 세포내 위치지정 서열에 연결되거나 또는 이를 포함하는 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조절 요소에 작동가능하게 연결된 상태로 포함하고, 상기 세포내 위치지정 서열이 상기 면역원성 표적 단백질이 세포의 세포질 내에 위치하도록 지시하는 것이고, 상기 세포내 위치지정 서열이 서열 23을 포함하는 것인 플라스미드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역원성 표적 단백질이 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원이거나 또는 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원과 교차 반응하는 면역 반응을 유발할 수 있는 것인 플라스미드.
  20. 제18항에 있어서, 상기 면역원성 표적 단백질이 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원인 플라스미드.
  21. 삭제
  22. 제18항의 플라스미드를 포함하는 항원에 대해 개체를 면역시키기 위한 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 추가로 촉진제를 포함하는 제약 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 촉진제가 부피바카인인 제약 조성물.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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  30. 삭제
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  32. 세포내 위치지정 서열에 연결되거나 또는 이를 포함하는 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조절 요소에 작동가능하게 연결된 상태로 포함하고, 상기 세포내 위치지정 서열이 상기 면역원성 표적 단백질이 세포의 소포체 내에 위치하도록 지시하는 것이고, 상기 면역원성 표적 단백질이 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원이거나 또는 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원과 교차 반응하는 면역 반응을 유발할 수 있는 것이고, 또한, 상기 세포내 위치지정 서열이 상기 면역원성 표적 단백질의 C 말단에서 서열 3 또는 서열 22-27를 포함하는 것인 플라스미드.
  33. 제32항에 있어서, 상기 면역원성 표적 단백질이 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원인 플라스미드.
  34. 제32항의 플라스미드를 포함하는 항원에 대해 개체를 면역시키기 위한 제약 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 추가로 촉진제를 포함하는 제약 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 촉진제가 부피바카인인 제약 조성물.
  37. C 말단에서 세포내 위치지정 서열에 연결된 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조절 요소에 작동가능하게 연결된 상태로 포함하고, 상기 세포내 위치지정 서열이 상기 면역원성 표적 단백질이 세포의 리소좀에 위치하도록 지시하는 것이고, 상기 세포내 위치지정 서열이 서열 1인 플라스미드.
  38. 제37항에 있어서, 상기 면역원성 표적 단백질이 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원이거나 또는 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원과 교차 반응하는 면역 반응을 유발할 수 있는 것인 플라스미드.
  39. 제37항에 있어서, 상기 면역원성 표적 단백질이 알레르겐, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자기면역 질환 관련된 세포 관련 항원인 플라스미드.
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
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  44. 제7, 10, 18 및 32항 중 어느 한 항의 플라스미드를 사람을 제외한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대해 개체를 면역화시키기 위한 방법.
  45. 삭제
  46. 세포내 위치지정 서열에 연결되었거나 또는 이를 포함하는 병원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조절 요소에 작동가능하게 연결된 상태로 포함하고, 상기 세포내 위치지정 서열이 상기 병원성 표적 단백질이 세포의 리소좀 내에 위치하도록 하고, 상기 세포내 위치지정 서열이 서열 1인 플라스미드.
  47. 삭제
  48. 제7, 10, 18 및 32항 중 어느 한 항의 플라스미드를 포함하는, 암 또는 자기면역 질환 치료를 위한 제약 조성물.
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