CN1684972A - 由聚合物和HIVgp41衍生肽组成的共轭物以及他们在治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的是包含一种其上可操作地结合至少两个来源于HIV gp41的合成肽分子的共轭物。本发明还提供了使用这些共轭物通过添加一定有效量的抑制细胞被病毒的感染来抑制HIV至靶细胞的传播的方法；和通过将每个合成肽分子经反应官能团可操作地结合到聚合物上来制备该共轭物的方法。

Description

由聚合物和HIVgp41衍生肽组成的共轭物以及他们在治疗中的应用
技术领域
本发明涉及由聚合物和来源于艾滋病毒(HIV)gp41的合成肽组成的共轭物。更特别地，本发明包含一种通过将不低于2个分子的包含来源于HIV-1gp41的HR1区或HR2区的氨基酸序列的合成肽可操作地结合到聚合物上形成的共轭物。
背景技术
目前众所周知，细胞能通过一种发生在细胞膜与病毒膜之间的融合过程被HIV感染。这个过程通常公认的模式是，病毒外壳糖蛋白复合体(gp120/gp41)与靶细胞膜上的细胞表面受体相结合。在gp120结合到细胞受体上之后(例如，CD4与chemokine共同受体如CCR-5或CXCR-4结合)，诱导gp120/gp41复合体内构象的变化，使得gp41插入到靶细胞膜内并调节膜融合。
在不同的HIV菌株中，gp41的氨基酸序列和它的突变体是为大家所熟知的。图1是通常公认的gp41功能区的图示(注意根据HIV菌株，氨基酸序列号可稍微变化)。融合肽(融合基因(fusogenic)区域)被认为参与插入和破坏靶细胞膜。含有跨膜锚序列的跨膜区域位于该蛋白的C-末端。在融合肽和跨膜锚之间是两个独特的区域，通称为7个一组重复(HR)区域，每个区域具有许多七个一组。HR1区，比HR2区距离N-末端更近，通常被描述为包含具有SEQ ID NO：1序列的氨基酸序列。然而，由于自然发生的多态现象，因此根据氨基酸序列被推断的病毒菌株，HIV-1gp41的HR1区的氨基酸序列(残基的编号)可能变化。同样被描述于图1和序列2的另一个区域，HR2，也能因为其内的多态现象而发生变化。包含HR1区的氨基酸序列和包含HR2区的氨基酸序列的每一个在HIV-1的外壳蛋白内都是高度保守的区域(Shu et al.，1999，Biochemistry，38：5378-5385；Hanna et al.，2002，AIDS 16：1603-8)。HR区域具有许多7个氨基酸残基连续部分或“7个一组”(在每个7个一组内的7个氨基酸命名为“a”至“g”)，其中在“a”位置和“d”位置的氨基酸通常是疏水的。并且存在于每个HR区内的是一个或多个亮氨酸拉链状基序(又指的是“亮氨酸拉链状重复”)，含有以异亮氨酸或亮氨酸为起始和终止的8氨基酸序列。最为频繁地，HR2区只具有一个亮氨酸拉链状基序，而HR1区具有5个亮氨酸拉链状基序。这些7个一组和亮氨酸拉链状基序有助于形成gp41的卷曲螺旋结构和来自于HR区的肽的卷曲螺旋结构。通常，已知卷曲螺旋由两个或更多个彼此相互环绕形成寡聚物的螺旋组成，卷曲螺旋带有这样的特点，具有在第一(“a”)和第四(“d”)个位置疏水残基优势的氨基酸的7个一组重复，带电的残基常常在第五(“e”)和第七(“g”)个位置，且在“a”位置和“d”位置的氨基酸是影响寡聚状态和链方向的决定因子(见，如，Akey et al.，2001，Biochemistry，40：6352-60)。
在体外试验和体内临床研究中发现来源于HIV gp41的HR1区(HR1肽)或HR2(HR2肽)区的合成肽抑制HIV到寄主细胞的传播(见，例如，Wild et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9770-9774；授权给本发明受让人的美国专利5,464,933和5,656,480；和Kilby et al.，1998，Nature Med.4：1302-1306)。更特别地HR1肽正如通过DP107(也通称为T-21；SEQ ID NO：3)举例说明，以1μg/ml的50％有效浓度值(EC50)阻止了T细胞的感染(见，例如，Lawless et al.，1996，Biochemistry，35：13697-13708)。HR2肽，正如通过DP178(也通称为T-20；SEQ IDNO：4)举例说明，以ng/ml范围的50％有效浓度值(EC50)典型地阻止了T细胞的感染。最先发现的有效的合成肽已在前面被描述过，其含有一个或多个连接到核心HIVgp41氨基酸序列上的增强序列，抑制HIV膜融合并因而阻止病毒至寄主细胞的传播(见，如，美国专利6,258,782和6,348,568)。然而，HIVgp41衍生的合成肽具有一个相对低的分子量。象本领域公知的其它肽，为了有效的作为治疗剂，这些合成肽必须被经常用药(如，日常注射)以在血流中达到和维持足够治疗作用的水平。为了努力克服这种局限性，研究人员试图化学修饰一种治疗剂，如一种肽或仿生肽(peptidomimetic)，例如通过将治疗剂连接到水溶性聚合物如聚乙二醇(PEG)上以使得治疗剂能在体内存活更长时间(如，提高在血流中的半衰期和/或抑制治疗剂在血流中的降解)。然而，正如本领域那些技术人员所公知(见，如，美国专利6258774和6113906)，对治疗剂的这些修饰具有内在的局限性，如，这些修饰典型地限制治疗剂的生物利用率。更特别地，将水溶性聚合物连接到治疗剂上，特别是小肽上，往往能以有毒的方式调节治疗剂的生物活性。这种即在活性又在治疗有效性上的损失通常是具有与生物活性不相关的较少连接位点的低分子量(如，小于4000道尔顿)肽的情况。尽管现有技术可能教导了将治疗剂结合到水溶性聚合物上，但现有技术却没有教导包含连接到两个或多个合成肽分子上的聚合物的共轭物，其中的共轭物保持实质上的生物活性(如，与单独的合成肽相比保持实质上的生物活性)，和持久性(针对能抵抗以非共轭物形式的合成肽的HIV-1菌株的实质上的生物活性与合成肽进行对比)。
因此，需要一种共轭物，其能干扰参与病毒融合过程的gp41的不同区域的相互作用，更优选能干扰影响融合所需的gp41的构象变化，从而抑制HIVgp41对靶细胞膜的融合。此外，需要一种能抑制HIV至靶细胞传播的共轭物，但保持实质上的生物活性并表现出持久性。本发明满足这些需求。
发明内容
本发明提供一种共轭物，包含一种被连接了两个和多个来源于gp41HR区(HR1区，HR2区，或他们的组合)的合成肽的聚合物，和其提供了保持实质上的生物活性(如，针对HIV的抗病毒活性)并表现出持久性(与单独的合成肽相比(如，不是共轭物的一部分))的优点。其它特征，如提高为该共轭物一部分的合成肽的生物半衰期(如，与单独的合成肽相比，在被降解和/或从血流中被移除之前，使该合成肽在体内存活更长久)，从本申请中的描述对本领域技术人员来说将是显而易见的。本发明的共轭物可进一步包含药学上可接受的载体。
此外，本发明提供一种使用根据本发明的共轭物抑制HIV至靶细胞的传播的方法，包括向病毒和细胞中添加一定量的根据本发明的共轭物以抑制细胞被病毒感染。这种方法可被用于治疗感染HIV的个体。在一个优选的具体实例中，抑制HIV至靶细胞的传播包括抑制gp41介导的HIV-1至靶细胞的融合。
本发明进一步提供制备本发明的共轭物的方法，本申请中披露的一种方法包括如下步骤：(a)将第一个合成肽分子与聚合物反应形成一个包含第一中间体的中间体，其中第一个合成肽分子可操作地结合到该聚合物的第一个反应官能团上；(b)将包含第一中间体的中间体与第二个合成肽分子反应形成一个共轭物，其中第二个合成肽分子通过该共聚物的第二个反应官能团可操作地结合到包含第一中间体的中间体上。本领域技术人员很清楚该方法也能包括将很多合成肽分子同时添加到聚合物上，其中一个以上合成肽分子变成可操作地结合到该聚合物上形成共轭物，其中每个变成可操作结合的合成肽分子被可操作地结合到该聚合物的反应官能团(functionality)上。
当与附图相结合阅读时，本发明的上述和其它目的、特征、以及优点将在下面的发明详述中显而易见。
附图说明
图1是HIV-1 gp41的示意图，显示了7个一组重复1区(HR1)和7个一组重复2区(HR2)，连同gp41的其它功能区。用于说明目的和根据菌株HIVIIIB的gp160，显示了对应于HR1和HR2的代表性的氨基酸序列，和氨基酸位置编号。
图2是本发明的共轭物的合成的具体实例示意图。
具体实施方式
发明详述
定义
术语“第一”、“第二”、“第三”及其类似用语，用于此处可能是：(a)表明顺序；或(b)区别分子(如，彼此相互比较的在合成物中不同的合成肽或中间体或共轭物)；或(c)(a)和(b)的结合。然而，术语“第一”、“第二”、“第三”及其类似用语，并不另外解释为对本发明的限制。
术语“可操作地结合”(和它的时态)，对于说明书和权利要求来说，指的是足够稳定性的融合或结合或联合以抵抗聚合物在体内所遭遇的环境，从而保持连接到两个或多个合成肽分子上一段充足的时间以提高为根据本发明共轭物一部分的合成肽的生物半衰期(与单独的合成肽相比)。正如本领域技术人员所公知，结合可包含一种或多种共价的、离子的、氢的、范德华的、静电的、及其类似的。正如本领域技术人员所公知，以及通过下述具体实例将显而易见，有几种方法和组合，其内两个或多个分子能利用反应官能团被可操作地结合。正如在这里详细描述，反应官能团包括，但不限于，自由化学基团(如，硫醇、或羧基、羟基、胺、磺基，等)，和反应化学基(与自由化学基反应的)。
术语“个体”，当在此使用时，对于说明书和权利要求书来说，指的是哺乳动物，特别是人。
术语“靶细胞”，当在此时用时，对于说明书和权利要求书来说，指的是能被HIV感染的细胞，优选，该细胞是人的一个细胞或人的多个细胞；更优选，是能被HIV通过包括膜融合的过程感染的人的多个细胞。
术语“药学上可接受的载体”，当在此时用时，对于说明书和权利要求书来说，指的是不能实质上改变其被加入到的活性成分(如，根据本发明的共轭物，或根据本发明方法发现的成分)的生物活性的载体剂。正如本领域技术人员所公知，合适的药学上可接受的载体可包含一种或多种物质，包括，但不限于，水、缓冲水、生理盐水、0.3％甘氨酸、含水酒精、等渗含水缓冲剂；并可进一步包括一种或多种物质例如甘油、油脂、盐如钠、钾、镁和铵、磷酸盐、碳酸酯、脂肪酸、糖类、多糖、糖蛋白(增强稳定性)、赋形剂、和防腐剂和/或稳定剂(用以增强自身寿命或作为组合物的制造和配送所必需的且适合的)。优选，载体适合于静脉、肌肉、皮下或肠胃外用药(例如，通过注射)。
术语“氨基酸”，对于说明书和权利要求来说以及根据本发明中所使用的合成肽，指的是具有至少一个自由氨基和至少一个自由羟基的分子。该氨基酸可以具有一个以上自由氨基，或一个以上自由羟基，或可进一步包含除氨基或羟基之外的一个或多个自由化学反应基团(如，羟基、巯基，等)。该氨基酸可以是自然产生的氨基酸(如，L-氨基酸)、非自然产生的氨基酸(如，D-氨基酸)、合成氨基酸、经修饰的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸前体、和保守置换。本领域任一技术人员都将知道，合并入肽的氨基酸的选择在某种程度上取决于所需的抗病毒肽特有的物理、化学或生物学特性。例如，本领域技术人员从这里的描述将知道合成肽的氨基酸可由一个或多个自然产生的(L)-氨基酸和非自然产生的(D)-氨基酸组成。可使用优选的氨基酸，把除了优选之外的氨基酸排除在外。
“氨基酸置换”，与本发明提供的合成肽的氨基酸序列相关，是下文中使用的术语，对于说明书和权利要求来说，指的是合成肽序列中一个或多个氨基酸置换，致使结合到HIV gp41的HR区上的能力和抑制gp41介导的融合实质上没有改变(如，能通过表现为ng/ml或μg/ml范围内的IC50的抗病毒活性来测量，正如本申请中详细阐明的)。典型地，氨基酸置换数量的范围为合成肽内大约1个氨基酸到大约10个氨基酸，优选为合成肽内1个氨基酸到大约5个氨基酸。正如本领域所公知，氨基酸置换可包括“保守置换”，其通过前述功能来定义，并包括，具有实质上相同极性、大小、亲水性、和/或芳香性的氨基酸作为替换氨基酸的置换。这些保守性的置换对于本领域那些普通技术人员来讲是公知的，其包括，但不限于，甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸；异亮氨酸-亮氨酸；色氨酸-酪氨酸；天冬氨酸-谷氨酸；精氨酸-赖氨酸；天冬酰胺-谷氨酰胺；和丝氨酸-苏氨酸。氨基酸置换也可包括根据发现于HIV的实验室和/或临床分离株中的HR1区或HR2区的不同氨基酸位置的多态现象，根据这个区域合成肽被衍生。这些多态现象从公开的基因数据库，如GenBank，和其它公开的可获得的HIV氨基酸序列数据库中很容易获得。
术语“反应官能团”，当用于此处对说明书和权利要求来说，指的是化学基团或能形成共价键的化学部分或用于将聚合物可操作地结合到合成肽上的键。关于化学基团，反应官能团被本领域那些技术人员所公知包含一种基团包括，但不限于，马来酰亚胺、硫醇、羧基、磷酰基、酰基、羟基、乙酰基、疏水性的、氨基、丹酰、磺基、琥珀酰亚胺、硫醇活性的、氨基活性的、羧基活性的、及其类似物。化学部分可包括连接物。连接物已知指的是充当分子桥的化合物或一部分用以可操作地连接两个不同的分子(如，其中连接物的一部分连接到合成肽上，且该连接物的另一部分连接到聚合物上形成根据本发明的共轭物)。这两个分子可以以逐步的方式连接到连接物上。对连接物没有特别的大小和含量的限制，只要它能履行作为分子桥的目的。连接物对本领域那些技术人员来讲是公知的，包括，但不限于，化学链、化学成分(如，试剂)、氨基酸、及其类似物。该连接物可包括，但不限于，具有两种相同功能的连接物、具有两种不同功能的连接物、生物稳定的连接物、和生物降解的连接物，正如本领域所公知。优选，当一连接物被使用时，其为非平面的(如，使得可操作结合的合成肽并不严格固定到聚合物上)。具有两种不同功能的连接物，本领域技术人员众所周知，包含一个具有特定连接第一个分子的第一个反应官能团末端，和一个具有特定连接第二个分子的第二个反应官能团的相反末端。本领域那些技术人员很清楚，多种具有两种功能的或多种功能的试剂，相同和不同功能的(如描述于the Pierce Chemical Co.，Rockford，III.的目录的那些)，能被用作根据本发明的连接物。根据要被连接的分子的因素，和进行连接的条件，用于优化保存生物功能稳定性、抵抗某种化学和/或温度参数、和充分的立体选择性或大小的这些特性的连接剂在长度和组成上可以不同。例如，该连接物实质上不应当干扰合成肽(它被连接到)对HIV融合和HIV传播至靶细胞这两者或其中一者的抑制剂功能的能力。在应用本发明时，可使用优选的反应官能团，把除了优选之外的反应官能团排除在外。
术语“聚合物”，当在此使用时，对说明书和权利要求来说，包括均聚物和共聚物，并可进一步具有包含本领域那些技术人员所公知的分支结构和线型结构的结构。优选，该聚合物是水溶性聚合物；更优选，当在个体体内应用时是实质上无毒的水溶性聚合物。这样的水溶性聚合物的说明性实施例包括，但不限于，多元醇、聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇(“PPG”)、葡聚糖、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、聚烯吡酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、聚氨基酸(均聚物，如聚赖氨酸、或杂聚物，如聚(D-L-丙氨酸)-聚(L-赖氨酸))、聚(烯化氧)、乙二醇/PPG的共聚物、PEG和氨基酸的共聚物、PEG/硫基苹果酸的共聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷的共聚物。优选，使用的聚合物是分离的种类，如每个分子由同样数目聚合物单位组成(如，在一个PEG内6个乙烯单位)，而不是带有不同大小的聚合物种类的混合。对于本发明来说，“聚合物”也可包含分支的或直链的烷基(在这里将更显而易见，见表5)。然而用于制作本发明的共轭物的聚合物能具有很大范围的分子量，在一个优选的具体实例中该聚合物的分子量范围为大约200道尔顿到大约100,000道尔顿；并且在一个更优选的具体实例中，该聚合物的分子量范围为大约300道尔顿到大约20,000道尔顿。许多反应官能团能被连接到聚合物上或成为其一部分，合成肽被可操作地结合到该聚合物上，并且多于一种形式的反应官能团在聚合物上能被获得用以选择性地结合合成肽(如，每种形式可获得的反应官能团可操作地结合一个合成肽分子，其中每个合成肽分子可以是相同序列或在序列上不同于其它要被结合的合成肽分子)。这样的反应官能团的例子已在先前被描述，额外的例子可包括，但不限于，酮、酯、羧酸、乙醛、乙醇、胺、及类似基团。在那点上，使用标准的有机化学技术可对聚合物进行合适的构造、修饰、或适当的功能化，以产生或暴露能被用于可操作地结合两个或多个合成肽分子形成根据本发明的共轭物的聚合物的反应官能团。由于许多水溶性聚合物和许多反应官能团在本发明中具有应用，因此产生或连接反应官能团的化学合成方法取决于聚合物和人们在该聚合物上想要的反应官能团。优选，用于本发明的聚合物具有下述特征：(a)是水溶性的，优选溶于含水系统如典型地发现于体内的那些；(b)具有一个以上反应官能团(或者是同种类型或者是不同类型；如，关于化学组成)，其中两个或多个合成肽分子能通过聚合物的一个以上反应官能团被可操作地结合到该聚合物上(优选，每个想要被用于可操作地结合合成肽的聚合物的反应官能团能可操作地结合到单个合成肽分子的反应官能团上)；和(c)当被可操作地结合到合成肽上形成根据本发明的共轭物时，实质上不干扰合成肽的生物活性(如抗病毒活性)，正如本申请中将详细描述的，能通过用于评价体外和/或体内抗病毒活性的方法被测定。应用于本发明的优选的聚合物包括多元醇，应用于本发明的更优选的聚合物包括PEG。本发明可使用优选的聚合物，把除了优选之外的聚合物排除在外。
术语“持久性”，与本发明的共轭物相关，用于此处对说明书和权利要求来说指的是，当与单独的合成肽的抗病毒活性相比时(从本申请中的描述将更显而易见)，显示更多潜在的针对能抵抗一种或多种单独的合成肽(未连接到聚合物上的单体)的HIV-1菌株的抗病毒活性的共轭物。优选，共轭物的持久性包括针对此种HIV-1抵抗菌株的抗病毒活性，能通过低于(如，ng/ml)或等于1μg/ml(如，相对于合成肽)(见，表5)的IC50或EC50来测量。
术语“合成肽”，与本发明所使用的肽相关，用于此处对说明书和权利要求来说指的是肽(a)通过化学合成、重组表达、大分子的生物化学或酶的破碎作用、大分子的化学分解、前述的组合来制备或者，通常通过本领域任何其它方法生产，并被分离；(b)包括长度不低于大约16个氨基酸且不高于大约60个氨基酸序列，并且由至少14个邻接的发现于HIV(其内可包括一个或多个氨基酸置换)gp41的HR1区或HR2区的氨基酸组成；和(c)能抑制HIV至靶细胞的传播(优选，通过结合到HIVgp41的HR区和/或阻止HIV-1和靶细胞之间的融合)，能通过评价将详细描述于本申请的体内和/或体外的抗病毒活性来确定。术语“分离的”，当根据肽使用时，指的是合成肽实质上不含有没有成为肽自身内部结构一部分的成分；举例来说，例如当通过重组技术生产时，实质上不含有细胞材料或培养基，或者当化学合成或利用生化或化学方法生产时，实质上不含有化学前体或化学药品。合成肽的氨基酸序列可包括发现于HIV gp41相关区域的序列内的一个或多个氨基酸置换和/或一个或多个多态现象，或者可包括一个或多个能增加螺旋结构稳定性和/或影响低聚反应的氨基酸置换，致使肽自身组装成三聚体(trimer)。此外，该氨基酸序列除了具有来源于HIV gp41的核心肽之外，还可包括一个或多个连接到核心肽上的增强肽，如在N-末端，在C-末端或在N-末端和C-末端，或者具有来源于一个或多个HIV-1、HIV-2、和SIV的核心肽(见，如美国专利6,258,782，也可见包含SEQ ID NOs：5，& 46到59所示的氨基酸序列的合成肽)。根据所使用的合成肽，该可操作地结合到聚合物上的合成肽可以单体或寡聚物形式如三聚体存在。在一个实施例中，合成肽以三聚体存在，只有一个单个分子能被可操作地结合到该聚合物上，而其余的包含三聚体的合成肽分子围绕着可操作结合的合成肽分子自我组装。例如，优选自我组装成三聚体(如由三个合成肽分子组成的三聚体)的包含其内具有氨基酸置换的(比如SEQ ID NO：1)HR1肽的说明性合成肽包括SEQID NOs：61到74所示的氨基酸序列。优选，应用于本发明的合成肽可包括长度不低于大约16个氨基酸且不多于大约60个氨基酸残基的序列，优选长度不低于36个氨基酸且不多于大约51个氨基酸残基，更优选，长度不低于大约41个氨基酸且不多于大约51个氨基酸残基。优选对于包含来源于HIV gp41的HR1区序列的合成肽来说该合成肽包含SEQ ID NO：1的至少18-54的氨基酸残基的邻接序列(通过单个字母命名，NNLLRAIEAQQHLLQL TVWGIKQLQARILAVERYL KD)或它的多态现象，作为HR1区部分内关键的决定因素已被发现影响本申请中描述的生物化学和抗病毒参数。来源于HR1区的说明性合成肽包括，但不限于具有SEQ ID Nos：3，和6到31所示的氨基酸序列的肽。可使用一优选的来源于HR1区的合成肽来生产根据本发明的共轭物，把除了优选的合成态之外的HR1肽排除在外。优选，对于来源于HIV gp41的HR2区的合成肽序列来说，该合成肽包含SEQ ID NO：2的至少43-51的氨基酸残基的邻接序列(如，QQEKNEQEL)，作为HR2区部分内关键的决定因素已被发现影响本申请中描述的生物化学和抗病毒参数。来源于HR2区的说明性合成肽包括，但不限于具有SEQ ID Nos：4，32，75到99，和114所示的氨基酸序列的肽。可使用一优选的来源于HR2区的合成肽来生产根据本发明的共轭物，把除了优选的合成肽之外的HR2肽排除在外。许多可被应用于本发明的此种合成肽先前已被披露于，例如，美国专利5,656,480、6,133,418，和6,258,782中；他们的披露在本申请中被全部结合作为参考。术语“单独的合成肽”，用于此处，对说明书和权利要求来说，指的是没有可操作地结合到聚合物上的合成肽，如，以缺乏聚合物的非结合形式。
本发明将在下面的实施例中被详细说明，这些实施例不是限制目的。
                    实施例1
该具体实例阐明了制备根据本发明的共轭物的方法。在此披露的一个此种方法包括如下步骤(a)将第一个合成肽分子与一聚合物反应形成包含一个第一中间体的中间体，其中第一个合成肽分子可操作地结合到该聚合物的第一个反应官能团上；(b)将该包含一个第一中间体的中间体与一个第二个合成肽分子反应形成一个共轭物，其中该第二个合成肽分子通过该聚合物的第二个反应官能团可操作地结合到包含第一中间体的中间体上。本领域技术人员将很清楚这个方法也可包括同时添加许多合成肽分子到聚合物上，其中一个以上的合成肽分子变得可操作地结合到该聚合物上形成共轭物，其中每个变得可操作地结合的合成肽分子被可操作地结合到该聚合物的一个反应官能团上。
这些肽通过使用标准的固相合成技术和标准的FMOC肽化学(还见，由本受让人受让的美国专利6,015,881)在肽合成仪上合成。在这个实施例中，合成肽进一步包含反应官能团；即，通过以酰基封锁N-末端和通过氨基封锁C-末端。从树脂上切离下来后，沉淀合成肽，并将沉淀物冻干。然后使用反相高效液相色谱法纯化这些肽；再使用电喷雾(electrospray)质谱分析来证实肽的一致性。在这个实施例中，T20(SEQ IDNO：4)被用于可操作地结合到聚合物上制成根据本发明的共轭物。正如本申请先前详细描述的，由于本质上相同的作用机制(抑制融合)，由于结构上相似的基本单位(7个一组和亮氨酸拉链状基序)，还由于相似的构象结构(α螺旋和卷曲螺旋)，包含合成肽而不是T20(SEQ ID NO：4)的共轭物，无论来源于HIV-1 gp41的HR1区还是HR2区，都将与说明于此的包含T20(SEQ ID NO：4)的不同共轭物功能相同。其它这样的合成肽包括，但不限于，包含SEQ ID NOs：3，5-99和114的氨基酸序列。此外，可使用相同或相似的方法将任何合成肽可操作地结合到共聚物上。尽管这个实施例只显示了一种类型(如相同的氨基酸序列)来源于HIV gp41的HR2区的合成肽，但本领域技术人员从这里的描述很清楚一种以上类型的合成肽都能被可操作地结合到同样的聚合物分子上。例如，在制备包含不低于两个合成肽分子可操作地结合到一个聚合物分子上的共轭物时，可应用其它不同的组合，其包括，但不限于，每个来源于HIVgp41的HR1区的合成肽分子，并且与其它包含共轭物的合成肽相比包含相同的(同样的)氨基酸序列；每个合成肽分子来源于HIV gp41的HR1区，并且至少一个合成肽分子在氨基酸序列上与包含该共轭物的其它合成肽相比不同(当一共轭物包含两个可操作地结合到聚合物上的合成肽分子时，如，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：27)；每个合成肽分子来源于HIV gp41的HR2区，并且与其它包含共轭物的合成肽相比包含相同的(同样的)氨基酸序列；每个合成肽分子来源于HIV gp41的HR2区，并且至少一个合成肽分子在氨基酸序列上与包含该共轭物的其它合成肽相比不同(当一共轭物包含两个可操作地结合到聚合物上的合成肽分子时，如，SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5)；或者至少一个合成肽分子包含来源于HR1区且能在溶液中自我组装成三聚体(如，SEQ ID NO：63)的氨基酸序列，和至少一个合成肽分子，其包含来源于HIV gp41的HR2区的氨基酸序列(如，SEQ ID NO：4)(这是因为少数三聚体优选结合到一些来源于HR2的合成肽，且比较不容易结合到来源于HR2的其它合成肽)。从这里的描述本领域技术人员很清楚，当两个以上合成肽分子被可操作地结合到聚合物分子上时，也可使用合成肽分子的不同组合。要可操作地结合到聚合物分子上的合成肽分子的数量取决于这样的因素其包括，但不限于，聚合物大小、聚合物组成、合成肽组成、和可获得的用于可操作地结合合成肽的聚合物的反应官能团的数量。优选，可操作地结合到聚合物分子上的合成肽分子的数量范围为2到大约20，更优选，为2到大约5。而且，本领域技术人员很清楚，还取决于用于将合成肽可操作地结合到聚合物上的反应官能团，不低于两个合成肽分子能通过合成肽的一部分，选自羧基末端(C-末端)、氨基末端(N-末端)、和内部的赖氨酸、以及他们的组合(如，其中一个合成肽分子通过其C-末端被可操作地结合，和另一个合成肽分子通过其N-末端被可操作地结合；等。)被可操作地结合到聚合物上。
在一个说明性的具体实例中，关于图2，通过借助于合成肽的N-末端将两个T20(SEQ ID NO：4)分子连接到一聚合物，PEG，的反应官能团上来制备根据本发明的共轭物。更特别地，一个T20分子(SEQ ID NO：4)通过一个酰胺键被可操作地结合到PEG的一个酸上，而另一个T20分子(SEQ ID NO：4)通过一个酰胺键被可操作地结合到PEG的第二个酸上形成包含T20-PEG二聚体的共轭物。例如，将PEG二酸(大约300道尔顿，11.4mg，0.0339mmol)、7-氮杂-1-羟基苯并三唑(HOAT，10mg，0.0746mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，13.1mg，0.102mmol)溶解于二甲替乙酰胺DMF(5mL)中，然而加入O-苯并三唑-1-yl-N，N，N’，N’-四甲基脲(鎓)盐四氟硼酸盐(TBTU，21.8mg，0.0678mmol)。室温搅拌溶液5分钟，并加入侧链保护的T20(500mg，0.0678mmol)。室温搅拌溶液24小时。加入(15ml)水沉淀肽。通过真空过滤收集固体，用水(2×5ml)洗涤并干燥至产生96％产量的侧链保护的T20 PEG二聚体(487mg)。将该侧链保护的T20-PEG二聚体(485mg)溶于含有水(0.35ml)和作为阳离子清除剂的二硫苏糖醇(DTT，0.35g)的三氟乙酸(TFA，6.3ml)。室温和氮气下搅拌溶液4小时。为了沉淀粗糙的T20-PEG二聚体，加入了甲级特丁基醚(MTBE)。固体在离心机中被旋转下来并将MTBE轻轻倒入废料中。重复MTBE循环洗涤两次。将固体溶于3∶1的水/ACN(乙腈，40ml)中并用氢氧化铵将pH值调至6-7。通过加入乙酸(0.5ml)将溶液的pH值降低至4-5。将最后得到的浑浊溶液室温静置过夜以完成侧链脱保护。将稀浆调pH值至7-8使所有的固体都回到溶液中，然后冷冻，之后冻干产生粗糙的T20-PEG二聚体(375mg)。使用C18，通过高效液相色谱(HPLC)对这些粗糙的T20-PEG进行纯化，5微米反相填料作为静止相和0.1％TFA的乙腈/水作为流动相(40-50％有机物超过90分钟)。含有碎片的纯的产物被集中、冷冻和冻干产生40mg共轭物(通过HPLC 89.8％，MS发现9196.545，计算9196.489)。
虽然这个说明性的实施例描述了将合成肽的N-末端可操作地结合到聚合物上，但本领域技术人员很清楚，很多不同的方法都可被用于将合成肽可操作地结合到聚合物上。例如，使用本领域公知的标准方法可将合成肽的羧基末端可操作地结合到聚合物上(如，具有末端胺的合成肽的羧基末端被可操作地结合到PEG羧酸上)。在另一个实施例中，使用本领域公知的方法(如，使用带有N-羟基丁二酰亚胺的活性酯方法活化PEG，修饰合成肽的氨基酸序列内部的赖氨酸残基侧链内的氨基)将合成肽的一个内部赖氨酸(通过一个胺反应官能团)可操作地结合到聚合物上。
例如，通过合成肽C-末端，将合成肽可操作地结合到聚合物上形成根据本发明的共轭物。更特别地，在一连串的合成步骤中，两个合成肽分子(T20，SEQ ID.NO：4)通过他们各自的反应官能团被可操作地连接到PEG6二胺上。
步骤1，PEG6-(NH-Phe-Z)2的形成
将Z-Phe-OH(0.43g，1.43mmol，2eq)，6-Cl-HOBT(0.27g，1.57mmol，2.2eq)，乙腈(6ml)和DIEA(0.37ml，2.14mmol，3eq)装入一装备有磁力搅拌器的50ml圆底烧瓶。将所得的黄色溶液通过冰浴在0-5℃冷却，然后加入HBTU(0.60g，1.57mmol，2.2eq)。通过CH2Cl2(2ml×2)向上述溶液中加入PEG6二胺(0.20g，0.714mmol，1.0eq)。反应混合物在0-5℃被搅拌15分钟，然后被温热至室温并再搅拌1.5小时。通过CH2Cl2(10ml×3)将反应混合物转移到一个125ml的分液漏斗中，并用NaHCO3溶液(0.33M，15ml×3)和NaCl溶液(15ml)洗涤。经过MgSO4干燥有机相并过滤。去除溶剂后将残渣应用于已在己烷中被10％Et3N钝化的硅胶柱。通过CH2Cl2-MeOH(20∶1)洗提期望获得的产物。去除供给化合物1，PEG6-(NH-Phe-Z)2的溶剂，作为无色油剂(0.23g，40％)。
步骤2，PEG6-(NH-Phe-H)2的形成
将化合物1，PEG6-(NH-Phe-Z)2，(0.20g，0.24mmol)，10％Pd-C(干的，50mg)和MeOH(10ml)装入一装备有磁力搅拌器的50ml圆底烧瓶。在室温下用H2气球过夜的氢化作用之前，通过N2/H2将该反应器脱气两次。Pd-C被滤出并且溶剂被去除产生了化合物2，PEG6-(NH-Phe-H)2，作为无色油剂(0.13g，95％)。
步骤3，PEG6-(NH-AA(36-27)-Fmoc)2的形成
注意AA36-27指的是SEQ ID NO：4的氨基酸36-27。将化合物2，PEG6-(NH-Phe-H)2，(0.44g，0.76mmol，1eq)，Fmoc-AA(27-35)-OH(3.34g，1.53mmol，2eq)，HOAT(0.31g，2.3mmol，3.0eq)，DIEA(0.53ml，3.1mmol，4eq)和DMF(20ml)装入一装备有磁力搅拌器的100ml圆底烧瓶。将所得的黄色溶液通过冰浴在0-5℃冷却，然后加入HBTU(0.61g，1.61mmol，2.1eq)。该反应混合物在0-5℃被搅拌10分钟，然后被温热至室温并再搅拌3小时。伴随着冰浴将水(30ml)加入该反应混合物中，并在真空过滤前将所得的白色稀浆搅拌30分钟。用水(30ml)洗涤白色固体并在真空烘箱(35℃)中干燥过夜(3.85g，粗糙的化合物3，PEG6-(NH-AA(36-27)-Fmoc)2)。
步骤4，PEG6-(NH-AA(36-27)-H)2的形成
向在DMF(10ml)中的粗糙化合物3，PEG6-(NH-AA(36-27)-Fmoc)2，(3.30g，0.67mmol)的溶液中加入哌啶(0.53ml，5.4mmol，8eq)，室温搅拌4小时后，通过冰浴将反应混合物冷却并加入水(15ml)。在过滤前将获得的白色稀浆搅拌20分钟。通过MTBE-Heptane(1∶1，25ml×2)洗涤白色固体然后将白色固体转移到一个100ml的烧瓶中并用EtOH-H2O(1∶1，10ml)研磨。通过真空过滤收集固体并用EtOH-H2O(1∶1，20ml)洗涤。重复过滤和用EtOH-H2O洗涤一次。粗糙的化合物4，PEG6-(NH-AA(36-27)-H)2，在真空烘箱中(35℃)被干燥过夜(2.53g)。
步骤5，PEG6-(NH-AA(36-17)-Fmoc)2的形成
注意，在这个步骤中SEQ ID NO：4的氨基酸26-17被加入。将化合物4，PEG6-(NH-AA(36-27)-H)2，(1.82g，0.41mmol，1eq)，Fmoc-AA(17-26)-OH(1.87g，0.82mmol，2eq)，HOAT(0.17g，1.23mmol，3.0eq)，DIEA(0.31ml，1.64mmol，4eq)和DMF(25ml)装入一装备有磁力搅拌器的100ml圆底烧瓶。将所得的黄色溶液通过冰浴在0-5℃冷却，然后加入HBTU(0.33g，0.86mmol，2.1eq)。该反应混合物在0-5℃被搅拌15分钟，然后被温热至室温并再搅拌3小时。伴随着冰浴将水(30ml)加入该反应混合物中，并在真空过滤前将所得的白色稀浆搅拌30分钟。用水(30ml)洗涤白色固体，然后返回到装有IPA-H2O(95∶5，20ml)的100ml烧瓶中。将该反应混合物加热至60℃ 5分钟，并逐渐冷却到室温通过真空过滤收集固体并通过IPA(5ml×4)洗涤。粗糙的化合物5，PEG6-(NH-AA(36-17)-Fmoc)2，在真空下在漏斗上被干燥(4.4g，未完全干)。
步骤6，PEG6-(NH-AA(36-17)-H)2的形成
向在NMP(10ml)中的粗糙化合物5，PEG6-(NH-AA(36-17)-Fmoc)2，(3.0g，未干)的溶液中加入DBU(100μl)。室温搅拌1小时后，加入PL-SO3H树脂(150mg)并持续搅拌40分钟。将该树脂滤出并通过NMP(10ml)洗涤。用水(30ml)处理NMP溶液产生了乳状乳化液。向乳化液中加入水(100ml)，然后将该混合物冻干。产生的黄色粘稠油料用EtOH(10ml)悬浮，并被加热至50℃ 5分钟，然后冷却至室温。在添加水(20ml)后形成了白色稀浆，并被搅拌30分钟。通过真空过滤收集白色固体并通过EtOH-H2O(1∶1，10ml×2)洗涤。粗糙的化合物6，PEG6-(NH-AA(36-17)-H)2，在真空烘箱(35℃)中干燥过夜。
步骤7，PEG6-(NH-AA(36-1)-Ac)2的形成
注意，在这步中，加入的是SEQ ID NO：4的氨基酸16-1。将化合物6，PEG6-(NH-AA(36-17)-H)2，(0.48g，0.056mmol，1eq)，Fmoc-AA(1-16)-Ac(0.37g，0.112mmol，2eq)，HOAT(0.023g，0.169mmol，3.0eq)，DIEA(0.040ml，0.225mmol，4eq)和DMF(5ml)装入一装备有磁力搅拌器的50ml圆底烧瓶。将所得的黄色溶液通过冰浴在0-5℃冷却，然后加入HBTU(0.047g，0.124mmol，2.2eq)。该反应混合物在0-5℃被搅拌15分钟，然后被温热至室温并再搅拌3小时。当在冰浴中将水(30ml)加入该反应混合物，并在真空过滤前将所得的白色稀浆搅拌30分钟。用水(30ml)洗涤白色固体，然后返回到50ml烧瓶中并用MeCN-H2O(9∶1)研磨。通过真空过滤收集固体，并通过水(10ml×2)洗涤。粗糙的化合物7，PEG6-(NH-AA(36-1)-Ac)2，在真空下在漏斗上被干燥(0.73g，未完全干)。
步骤8，PEG6-(T20)2的形成
将一个装有粗糙化合物7，PEG6-(NH-AA(36-1)-Ac)2，(0.20g)的25ml烧瓶用TFA/DTT/H2O(90∶5∶5，2.5ml)充满。将所得的黄色溶液室温搅拌2小时。通过冰浴向冷却的反应混合物中加入MTBE(8ml)，并在真空过滤前将所得的稀浆搅拌20分钟。黄色固体通过MTBE(5ml×2)洗涤，并在真空下在漏斗上被干燥30分钟(未完全干)。将黄色固体溶于MeCN/H2O(1∶1，1ml)中。所获得的黄色悬浮液通过棉花被过滤并通过MeCN/H2O(1∶1，1ml×2)被洗涤。通过NaHCO3溶液(0.33N)调节组合溶液的pH值至4。向上述溶液中加入HOAc(60ul)，该浅黄色溶液在室温下被搅拌过夜。通过K2CO3溶液(1M)将反应混合物的pH值调至8。用MeCN-H2O(15∶85，3ml)稀释该溶液并将其应用于HPLC来分离。(PLRP-XL，300A，10um，20×300mm；缓冲剂A，100mM NH4OAc于H2O中，pH 8.5通过NH4OH调节；缓冲剂B，MeCN：剃度，在60min内，20％到40％；流速，15ml/min)。分别通过HPLC检查收集的碎片，将纯化的碎片集中起来用于冻干。获得了作为白色粉末的包含根据本发明的共轭物(PEG6-(T20)2)的终产物5.5mg。
                    实施例2
在这个实施例中阐述的是，与单独的合成肽的半衰期相比，本发明的共轭物的生物利用率增强(如，延长体内半衰期循环)。在此使用实施例1中教导的方法和组分制备合成肽和共轭物。注意将用于测定生物利用率的标准动物模型与人体内合成肽的生物利用率相关连起来是重要的(详细描述于美国专利6,258,782)。简单地，给插管的老鼠静脉给药合成肽，或者本发明的共轭物，使用Edelhoch方法测定剂量给药的溶液浓度，以动物体重获得10mg/kg剂量进行调整。在预定的时间间隔(0，15，30分钟和1，2，4，6，和8小时)取血液样品，并加入到含有抗凝剂(EDTA)的收集管内。从每支收集管内收集血浆，然后通过荧光高压液相层析(HPLC)进行分析。除了样品稀释外，在缓冲剂以及血浆内对剂量溶液进行连续稀释，并用于对已知浓度的肽产生相关峰面积的标准曲线。考虑进行的所有稀释和在柱状物上注射的量，然后使用该曲线计算血浆中肽的浓度。单独合成肽的半衰期(t1/2)和总AUC(曲线下的面积)，以及根据本发明的含有合成肽的共轭物的半衰期(t1/2)和总AUC(曲线下的面积)如下所示：
                    表1
  试验的试剂   AUC(μg*hr/ml)   t1/2(小时)
  T20肽   158   1.6
  共轭物   500   4.3
正如通过表1的结果所阐述的，与单独的合成肽的循环半衰期相比，根据本发明的共轭物能具有一个较大增强的循环半衰期。
                    实施例3
在这个实施例中阐述的是，使用根据本发明的共轭物的意想不到的抗病毒潜能结果。在使用体外试验证明抗病毒潜能中，注意将显示于体外试验的合成肽的抗病毒效果与体内合成肽的抗病毒效果相关连起来是重要的。在测定根据本发明的共轭物的抗病毒活性(如，一种测量是抑制HIV至靶细胞传播的能力)中，使用的是体外试验，其已通过使用来源于HIV gp41的任何一个HR区所产生的数据被显示，来推测体内观察到的抗病毒活性。更特别地，使用体外感染试验(“Magi-CCR5感染试验”；见，如，美国专利6,258,782)观察到的抗病毒活性已被显示与体内观察到的同样HIV gp41来源的肽的抗病毒活性合理相关(见，如，Kilby et al.，1998，Nature Med.4：1302-1307).为了进一步强调这一点，T20(SEQ ID NO：4)和T1249(SEQ.ID NO：5)每一个都在体外感染试验和人临床试验中显示了潜在的针对HIV的抗病毒活性。
这些感染试验应用表达衍生cMAGI的指示器细胞系MAGI或CCR5记录了感染病毒滴定度的降低。两个细胞系都利用HIV-1 tat的能力来激活由HIV-LTR驱动的β-半乳糖苷酶报告子基因的表达。β-gal报告子已被修饰定位于核内，并且由于感染后的几天内强烈的核染色，所以能被X-gal底物检测到。如果在染色之前只有一轮感染，那么被染色的核的数量因此能被解释为等于激发的接种体内感染病毒粒子的数量。使用CCD-成像仪计数受感染的细胞，初期的和实验室的合适的分离株在输入的病毒和通过成像仪目测的受感染细胞的数量之间显示为线性关系。在MAGI和cMAGI试验中，感染滴定度降低50％(Vn/Vo＝0.5)是很有意义的，并提供了评价抗病毒活性初步中止值(“IC50”定义为产生感染滴定度降低50％的稀释)。一个二级中止值Vn/Vo＝0.1，相当于感染滴定度降低90％也是估定的(“IC90”)。用于测试抗病毒活性的肽被稀释至不同浓度，并被测试于两倍或三倍的针对调节产生大约1500-2000个受感染细胞/容皿的HIV的接种体，该容皿为48容皿微量滴定板的容皿。肽(在各自配方内)被加到cMAGI或MAGI细胞，接下来是病毒接种体；24小时后，加入感染和细胞-细胞融合的一种抑制剂(如T20)来阻止第二轮HIV感染和细胞-细胞的病毒传播。这些细胞被培养2天多，然后用X-gal底物固定和染色来检测感染HIV的细胞。用CCD-成像仪来测定每个对照中受感染细胞的数量和肽稀释，然后计算IC50和IC90(以μg/ml表示)。
在这个第一个抗病毒潜能的实施例中，从感染同样HIV的个体中获得了两个临床HIV分离株。第一个分离株，为解除描述，据此被命名为“HIV-1T20S”，在体外和体内都对T20(SEQ ID NO：4)的抗病毒效果敏感。第二个分离株，为解除描述，据此被命名为“HIV-1T20R”，在体外和体内都表现出抵抗T20(SEQ ID NO：4，单独的合成肽；表2“T20”肽)的抗病毒效果。这两个临床分离株，HIV-1 T20S和HIV-1 T20R，都被用于体外感染试验，其中T20(SEQ ID NO：4)的抗病毒效果与根据本发明的共轭物(如，包含两分子T20(SEQ ID NO：4)可操作地结合到PEG上的共轭物；表2“共轭物”)相比，并与具有一分子合成肽(T20)可操作地结合到其上的聚合物(如，PEG)相比(表2，“PEG-T20-单体”)。这些结果，以ng/ml表示IC50，说明于表2。
                    表2
  试验试剂   HIV-1 T20S：IC50   HIV-1 T20R：IC50
  T20肽   10   1,211
  共轭物   32   49
  PEG-T20单体   1,149   ＞20,000
从表2中阐明的结果可以得出几个结论。第一，正如通过使用T20-敏感的HIV分离株的结果所示，与单独的合成肽(如，只有一个3折叠(fold)差别，比对数差别更少)相比，根据本发明的共轭物(其中至少两个合成肽分子被可操作地结合到一个聚合物分子上)保持实质上的生物活性(抗病毒)。相反，正如通过使用T20敏感的HIV分离株的结果所示，具有单个合成肽分子被可操作地结合到其上的聚合物(如，表2，“PEG-T20单体”)，与单独的合成肽相比，在生物活性上显示出重大变化(对数降低)。这是一个意想不到的结果，即与PEG-T20单体相比，共轭物生物活性的保持，大于每个化合物合成肽分子的数目可能导致的副作用(如，两个可操作地结合到聚合物上的合成肽分子与一个可操作地结合到聚合物上的合成肽分子相对)。
第二，正如通过使用T20-抵抗的HIV分离株的结果所示，一个意想不到的结果是根据本发明的共轭物显示出更多潜在的针对显示出能抵抗单独合成肽(还显示出抵抗PEG-T20单体)的HIV分离株的抗病毒活性(至少一个对数差别)。更特别地，非常惊讶地观察到具有两分子T20可操作结合到其上的共轭物，对T20-抵抗的HIV分离株(表现持久性)具有重大的抗病毒活性。总之，结果显示于表2，显示了与单独的合成肽相比，根据本发明的共轭物保持了实质上的生物活性，包括针对HIV的抗病毒活性，和针对HIV抵抗菌株的持久性。这一生物活性显示于体外试验，其与体内观察到的抗病毒效果相关连。
为进一步说明这个意想不到的结果，即根据本发明的共轭物显示出潜在的针对显示出能抵抗单独合成肽的HIV分离株的抗病毒活性，使用体外感染试验对其它几种T20-敏感的分离株和T20-抵抗的分离株(分离株“A-D”)进行试验。如表3所示，IC50和IC90以μg/ml表示。
总之，结果显示于表3，显示了根据本发明的共轭物不仅保持实质上的生物活性，包括针对HIV的抗病毒活性(与单独的合成肽相比)，而且令人惊讶地显示了持久性，包括针对能抵抗单独合成肽的HIV分离株的潜在的抗病毒活性。
                    表3
病毒   T20肽IC50   T20肽IC90   共轭物IC50   共轭物IC90
  HIV-1 T20S-A   0.006   0.078   0.034   0.200
  HIV-1 T20R-A   ＞5   ＞5   0.330   2.524
  HIV-1 T20S-B   0.029   0.117   0.013   0.087
  HIV-1 T20R-B   1.898   7.179   0.044   0.257
  HIV-1 T20S-C   0.006   0.073   0.024   0.151
  HIV-1 T20R-C   1.544   6.285   0.105   0.610
  HIV-1 T20S-D   0.018   0.208   0.063   0.457
  HIV-1 T20R-D   2.039   ＞5   0.030   0.210
在体外还试验了额外的HIV菌株以进一步说明，当与单独的合成肽相比时，根据本发明的共轭物保持实质上的生物活性。参考表4，IC50和IC90以μg/ml表示。
                    表4
病毒   T20肽IC50   T20肽IC90   共轭物IC50   共轭物IC90
  IIIB/CEM4   0.007   0.052   0.035   0.206
  3’GIV/CEM4   0.008   0.050   0.034   0.194
  SIM/CEM4   0.584   3.398   0.038   0.216
总之，结构如表4所示，显示了根据本发明的共轭物不仅保持实质上的生物活性，包括针对HIV的抗病毒活性(与单独的合成肽相比)，而且有时令人惊讶地显示了比单独的合成肽更多的抗病毒潜能。
在此使用实施例1中教导的方法，通过变化聚合物，被可操作地结合到聚合物上的合成肽的末端，以及用于将合成肽可操作地结合到聚合物上的反应官能团，制备额外的共轭物。两个合成肽分子(如，SEQ ID NO：4)被可操作地结合到聚合物上。这些共轭物随后针对HIV分离株IIIB，和HIV-1 T20S和HIV-1 T20R(见，表2对于HIV抵抗菌株)的抗病毒活性进行试验，抗病毒活性(IC50)以μg/ml表示。对于不同共轭物(表5，A-Q)，用于可操作地结合聚合物的合成肽的末端(表5，C-末端表示为“C”，N-末端表示为“N”)或者是否使用了内部的赖氨酸(表5，“赖氨酸18”，表示合成肽的氨基酸序列内的氨基酸残基18)，针对HIV-1菌株IIIB(表5，“IIIB”)的抗病毒活性(IC50)，针对HIV-1 T20S(表5，“T20S”)的抗病毒活性(IC50)和针对HIV-1 T20R(表5，“T20R”)的抗病毒活性(IC50)的这些结果都显示于表5。
                    表5
  试验的   末端   聚合物   IIIB   T20S   T20R
  单独合成肽   无   无   .007   .010   1.2
  A   N   PEG6   .037   .029   .050
  B   C   PEG6   .117   .053   .070
  C   C   PEG6   .065   .046   .050
  D   N   alkylC5   .039   .036   .049
  E   N   PEG8   .018   .026   .020
  F   N   alkylC8   .089   .049   .087
  G   N   alkylC11   .174   .176   .218
  H   N   AT   .046   .047   .124
I N   PEG4-6-4 .029 .012 .029
  J   N   PEG3   .036   .028   .049
  K   N   PEG4   .033   .026   .067
L C   GLY-PEG3 .107 .061 .066
  M   C   GLY-C2   .139   .085   .114
  N   N   PEG10   .039   .017   .023
  O   C   GLY-C6   .140   .083   .044
P C   GLY-PEG6 .088 .031 .051
  Q   Lys18   PEG6   .057   .055   .120
对于表5，紧接着PEG的数字指的是包含PEG的乙烯单位的数量(重数相当于许多PEG单位，每个不连续的种类被可操作地结合在一起)；后面带有数字的烷基指的是烷基链，带有的数字指的是包含烷基链的碳原子的数量。GLY指的是氨基酸甘氨酸，其被用作聚合物和合成肽之间的连接物；和AT指的是三元酸(如，三琥珀酰亚胺基氨(trisuccinimidylamino)三醋酸酯)。总之，结果显示于表5。显示了根据本发明的共轭物的不同说明，他们的每一个不仅保持实质上的生物活性，包括针对HIV-1的抗病毒活性(与单独的合成肽相比)，而且还出乎意料地显示了，当与单独的合成肽相比时，针对HIV抵抗分离株的持久性。
                    实施例4
在另一个说明性的具体实施例中，通过将两分子SEQ ID NO：114经合成肽的N-末端可操作地连接到一聚合物，PEG的反应官能团上来制备根据本发明的共轭物。更特别地，一分子SEQ ID NO：114被可操作地结合到一个PEG酸上，其中另一个SEQ ID NO：114分子被可操作地结合到PEG的第二个酸上形成包含SEQ IDNO：114-PEG二聚体的共轭物。例如，将PEG-6二酸(5.4mg，0.016mmol)，和O-(1H-6-chloro苯并三唑-1-yl)-N，N，N′，N′-四甲基脲(鎓)盐四氟硼酸盐(TCTU，11.4mg，0.032mmol)溶于1.5ml 2∶1的DCM∶DMF(二氯甲∶二甲基甲酰胺)。加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA，11.1μl，0.064mmol)，随后侧链立即被保护H(氢)-SEQ IDNO：114(250mg，0.032mmol)。室温搅拌该溶液4小时。旋转蒸发去除DCM，然后加入水(5ml)沉淀肽。通过真空过滤收集固体，用水(3×5ml)洗涤并干燥产生产量为90％的侧链保护的SEQ ID NO：114-PEG-6二聚体(225mg)。将该侧链保护的SEQID NO：114-PEG-6二聚体(225mg)溶于含有水(0.25ml)和作为阳离子清除剂的二硫苏糖醇(DTT，0.25g)的三氟乙酸(TFA，4.5ml)。室温搅拌该溶液6小时。沉淀粗糙的SEQ ID NO：114-PEG-6二聚体，加入甲基叔-丁基醚(MTBE)。将溶剂轻轻倒出并用MTBE洗涤几次，然后过滤并风干。将固体溶于10ml of 1∶1水∶乙腈并用稀释的氢氧化铵调节pH至6-7。通过加入乙酸(0.2ml)将溶液的pH降低到4和5之间。所得的澄清溶液允许在室温搅拌过夜以完成侧链脱保护。冷冻该溶液并冻干产生粗糙的SEQ ID NO：114-PEG-6二聚体(150mg)。使用C18，通过高效液相色谱(HPLC)对这些粗糙的SEQ ID NO：114-PEG-6二聚体进行纯化，5微米反相填料作为静止相和0.1％TFA的乙腈/水作为流动相(40-70％有机物超过90分钟)。含有碎片的纯的产物被集中、冷冻和冻干产生本发明的共轭物8mg(通过HPLC 89.2％，MS发现9268.43计算9268.35)。
在此使用实施例3中概括的方法来测定抗病毒活性，在体外感染试验中使用对包含SEQ ID NO：114(表6，“114-S”)的肽的抗病毒效果敏感的HIV-1菌株和对包含SEQ ID NO：114(表6，“114-R”)的肽的抗病毒效果有抵抗力的HIV-1菌株，其中将包含SEQ ID NO：114(表6，“单独的合成肽”)的合成肽的抗病毒效果与本发明的共轭物(如，包含两分子SEQ ID NO：114可操作地结合到PEG6上的共轭物；表6，“共轭物”)相比。以μg/ml表示IC50和IC90，这些结果显示于表6。
                    表6
  实验的试剂   114-S：IC50 IC90   114-R：IC50 IC90
  单独的合成肽   0.005    0.034   2.40     ＞20
  共轭物   0.016    0.169   0.151    2.46
总之，结果显示于表6，显示了意想不到的结果，本发明的共轭物不仅保持了实质上的生物活性，包括针对HIV的抗病毒活性(与单独的合成肽相比)，而且令人惊讶地显示出持久性，包括针对能抵抗单独的合成肽的HIV分离株的潜在的抗病毒活性。此外，在这个实施例中阐述的共轭物证明了来源于HIV-1gp41的HR1区或HR2区之间的合成肽在制备本发明的共轭物是有用的这一共有的特性。
                    实施例5
本发明提供了共轭物，其正如通过他们的抑制HIV至靶细胞传播的能力被证明的具有抗病毒活性；以及提供一种抑制HIV至靶细胞传播的方法，包括添加给病毒和细胞一定量的根据本发明的共轭物，以有效抑制细胞被HIV感染，更优选，抑制病毒和靶细胞之间的融合。该方法可被用于治疗感染HIV的个体(治疗性地)或治疗以新的方式暴露或以高危方式暴露(如，通过毒品使用或高危性行为)于HIV的个体(预防性地)。因此，例如，在个体感染HIV-1的情况下，一定有效量的共轭物将成为足够(通过其自身和/或与摄入的剂量相结合)降低HIV病毒在被治疗个体中组装的剂量。本领域技术人员众所周知，有几种标准方法用于测量HIV病毒的组装，其包括，但不限于，通过外周血单核细胞的定量培养和通过血浆HIV RNA的测量。本发明的共轭物能单次用药地、间歇地、周期性地、或连续地被施用，正如被医疗从业者所测定的，如通过监测病毒的组装。根据含有共轭物的配方，以及例如这些因素：用于形成共轭物的聚合物和合成肽的合成物，和是否进一步包括药学上可接受的载体，以及该药学上可接受的载体的性质，根据本发明的共轭物可被周期性用药，范围从天到星期或可能更长。此外，根据本发明的共轭物能显示出增效结果，当与其它用于治疗HIV的抗病毒药物(如，包括，但不限于，其它HIV进入抑制剂(如，CCR5抑制剂，人类同族体(retrocyclin)，及其类似物)，HIV整合酶抑制剂，反转录酶抑制剂(如，核苷或非核苷)，蛋白酶抑制剂，及其类似物，以及本领域技术人员公知的)联合使用(如，当同时使用，或与一种或另一种循环交替使用)时能抑制HIV至靶细胞的传播。
要被施用的本发明共轭物的有效剂量能通过本领域公知的程序来确定；如，通过测定潜能性、生物半衰期、生物利用率、和毒性。在一个优选的具体实例中，本领域技术人员使用本领域公知的常规的体外和体内研究所得的数据来确定有效的共轭物剂量范围。例如，体外抗病毒活性感染试验，如描述于本申请的，能使本领域技术人员测定用于阻止一定量病毒感染(如，50％抑制，IC50；或90％抑制IC90)所需的共轭物的平均抑制浓度(IC)。然后本领域技术人员使用从一个或多个标准动物模型中获得的药代动力学数据能选择出合适的剂量，致使能获得共轭物的最小血浆浓度(C[min])，其等于或超过预先确定的IC值。然而，剂量范围典型地依赖选择用药的路线和剂量的配方，因此，根据本发明的共轭物的代表性剂量范围为不低于0.1μg/kg体重且不高于10mg/kg体重；优选剂量范围为大约0.1-100μg/kg体重；更优选，共轭物的一个剂量为从大约10mg到大约250mg。
本发明的共轭物能以任何能使活性剂到达靶细胞(能被HIV感染的细胞)的方式给个体用药。因此，本发明的共轭物能以任何合适的技术，包括口腔、注射(如，肌肉的、腹膜内的、静脉内的、或皮下注射或输入、真皮下的、或植入)、鼻的、肺部的、阴道的、直肠的、舌下的、或局部路线给药，也能被配制成适合每种给药路线的剂量形式。给药的特效路线将依赖于，如，个人的病历，包括来自此用药的任何觉察的或预期的副作用，和被给药的共轭物配方(如，共轭物包含的聚合物和合成肽的性质)。最优选，给药是通过注射(使用，如，静脉或皮下方式)，但也能通过连续输入(使用，如，缓释装置，或小型真空泵如渗透泵，及类似装置)。根据本发明的共轭物能进一步包含一种或多种药学上可接受的载体；并且能进一步依赖于期望获得的配方、输送部位、给药方法、给药时间安排、和医师公知的其它因素。此外，共轭物可包含编码聚合物和合成肽的核苷酸序列，正如本申请中详细描述的，其根据用药，使用本领域公知的技术和表达载体，在感兴趣的细胞中被表达。
                    实施例6
从这里的描述本领域技术人员很清楚，用于生产根据本发明的共轭物的聚合物是聚氨基酸基础的，编码此种共轭物的聚核苷酸能被合成或构建，并且此种共轭物能通过作为制造方法(如，体内制备)和/或作为抑制HIV至靶细胞传播的方法的重组DNA技术来制备。本领域技术人员还很清楚一种以上的聚核苷酸序列能编码根据本发明的共轭物，并且此种聚核苷酸能以已知编码该共轭物氨基酸序列的氨基酸的三联体密码子为基础被合成，由于第三个碱基简并性，因此，选择期望进行表达的寄主细胞(如原核或真核种类等)偏爱的三联体密码子。例如，一个聚合物可包括聚赖氨酸，赖氨酸能通过AAA或AAG中任何一个密码子来编码。在另一个实施例中，可使用由赖氨酸和丙氨酸组成的杂聚物，丙氨酸由GCA，GCG，GCC，或GCU中的任何一个来编码。在另一个实施例中，其内一个合成肽分子被连接到聚合物的氨基末端，而第二个合成肽分子被连接到该聚合物的羧基末端，一种具有能将合成肽分子可操作地连接到聚合物上的灵活的连接物可能是被期望获得的。本领域公知，一种能被应用于将两种氨基酸序列可操作地连接在一起的灵活的连接物包括肝氨酸或结合有其它氨基酸如丝氨酸的甘氨酸。已知甘氨酸由GGU，GGC，GGA，或GGG中的一种或多种编码；而丝氨酸已知由AGU，AGC，UCU，UCC，UCA，或UCG中的任何一种或多种编码。说明性的实施例可包括，但不限于，(数字表示分子的数量)：Gly(3)，GlySerGly，Gly(4)Ser(3)，GlySer，及类似物。使用本领域标准的方法能确定优选的连接物。因此，例如，一共轭物可包括；
合成肽-灵活的连接物-聚合物-灵活的连接物-合成肽
只是说明目的，并非限制性的，编码能被应用于根据本发明的共轭物的合成肽的聚核苷酸的例子包括SEQ ID Nos：100-106(对于合成肽分别包括SEQ IDNOs：63，65，66，61，62，4和5)；然而，可以理解编码与原始密码子相同的氨基酸的不同密码子能被置换。此外，基于本申请中阐述的偏爱密码子，本领域技术人员能很容易地确定用于相似序列和/或原始的合成肽的密码子(如，来源于HR1或HR2区，如，氮不限于，SEQ ID NOs：3，6-60，64，和67-99)。继续这个实施例，SEQ IDNOs：107-113编码与SEQ ID NOs：100-106相同的各自合成肽。然而，SEQ IDNOs：100-106代表含有细菌表达偏爱使用的密码子的聚核苷酸，而SEQ IDNOs：107-113代表含有哺乳动物表达系统表达偏爱使用的密码子的聚核苷酸。
在一个具体实例中，提供的是一个含有编码根据本发明共轭物的聚核苷酸的原核表达载体，以及其对于重组生产共轭物的应用。在一个实施例中，该聚核苷酸可能位于原核表达载体致使当共轭物在寄主细胞中被表达时，它能被生成为带有有助于该共轭物纯化的序列的融合蛋白。例如，本领域那些技术人员公知有些序列，其作为一个带有期望被表达的多肽的融合蛋白的部分，促进在发现于用于表达的原核细胞细胞质中的包含体内生产(见，如，Tokatlidis et al.，1993，Protein Eng.6：947-952)。使用本领域公知的方法包括变性剂，以及分馏法(如，离心、柱层析，剂类似方法)能将该包含体从其它原核细胞成分中分离出来。在另一个实施例中，有一些商业上可获得的载体，其内插入了要被表达为蛋白或肽的想要获得的感兴趣的核苷酸序列，以至通过表达，该基因产物也含有许多末端组氨酸残基(“His tags”)，能被用于使用本领域公知的方法纯化基因产物。
本领域技术人员很清楚，编码根据本发明共轭物的核苷酸序列能被插入到除了许多质粒外的一个治疗或载体，以及其它能被使用的表达系统包括，但不限于，用噬菌体载体转化的细菌，或cosmid DNA；含有酵母载体的酵母；含有真菌载体的真菌；用病毒感染的昆虫细胞系(如，杆状病毒(baculovirus))；和用质粒或病毒表达载体转染的，或用重组病毒感染的(如，牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒，等)哺乳动物细胞系。共轭物的成功表达需要包含共轭物编码序列的重组DNA分子，或载体自身，含有和用于表达的特定寄主系统一致的，并被识别的转录和翻译所需的控制因子。假如共轭物的增强表达与所使用的特定寄主细胞系统相适合(例如，无毒的)，那么使用本领域公知的分子生物学方法，包括上述方法，将不同的启动子和增强子融合到载体或包含编码序列的DNA分子中，来增强共轭物的表达。本领域技术人员很清楚，启动子的选择将依赖于使用的表达系统。启动子在强度上不同，如，为了获得高水平的基因转录和表达成基因产物而使用强大的启动子是令人期望的。例如，从其中能观察到在包含E.coli的寄主细胞系统中高水平转录的本领域公知的细菌、噬菌体或质粒启动子，包括lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、P.sub.R和P.sub.L启动子、lacUV5、ompF、bla、lpp及类似启动子，能被用于提高插入的编码合成肽的核苷酸序列的转录。通常使用的用于哺乳动物表达系统的表达载体中的哺乳动物启动子是来源于哺乳动物病毒基因的启动子。实施例包括SV40早期启动子、鼠乳房瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病毒启动子、和CMV启动子。
在共轭物的表达对于寄主细胞是致命的或决定性的情况下，可选自寄主菌株/系和表达载体致使启动子的行为被抑制直到特殊诱导。例如，在某些操纵子中，特殊诱导物的加入对于插入DNA的有效转录是必要的(如，lac操纵子被乳糖或异丙基-β-D-半乳糖苷的加入所诱导；trp操纵子在当色氨酸在生长培养基中缺失时被诱导；以及四环素能被用于具有一个tet敏感启动子的哺乳动物表达载体)。因此，共轭物的表达能通过在这种控制编码序列表达的启动子未被诱导的情况下培养转化的或转染的细胞而被控制。其它本领域公知的对于有效的基因转录或信息翻译的控制因素包括增强子、转录或翻译起始信号、转录终止和多聚腺嘌呤序列，及类似物。
本发明具体实施例的上述描述已被详细描述用于说明目的。鉴于描述和说明，本领域的其它技术人员，通过应用现有知识，能合理地修改和/或改编本发明用于不同应用，而不背离基本方案；因此，这些修饰和/或改编被规定为在所附的权利要求的意义和范围之内。
序列表
<110>特里梅里斯公司
<120>由聚合物和HIVgp41衍生肽组成的共轭物以及他们在治疗中的应用
<130>TRM-004
<150>60/414,439
<151>2002-09-27
<150>10/
<151>2003-09-23
<160>114
<170>PatentIn译文3.2
<210>1
<211>60
<212>PRT
<213>艾滋病毒
<400>1
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1               5                   10                  15
Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
            20                  25                  30
Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val
        35                  40                  45
Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile
    50                  55                  60
<210>2
<211>64
<212>PRT
<213>艾滋病毒
<400>2
Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn
1               5                   10                  15
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
            20                  25                  30
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
        35                  40                  45
Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
    50                  55                  60
<210>3
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>3
Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu
            20                  25                  30
Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
        35
<210>4
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>4
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe
        35
<210>5
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>5
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
        35
<210>6
<211>43
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>6
Gly Ser Thr Met Gly Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg
1               5                   10                  15
Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala
            20                  25                  30
Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr
        35                  40
<210>7
<211>54
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>7
Gly Ser Thr Met Gly Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg
1               5                   10                  15
Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala
            20                  25                  30
Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys
        35                  40                  45
Gln Leu Gln Ala Arg Ile
    50
<210>8
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>8
Gly Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln
            20                  25                  30
Gln His Leu Leu
        35
<210>9
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>9
Gly Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln
            20                  25                  30
Gln His Leu Leu Gln Leu
        35
<210>10
<211>40
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>10
Gly Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln
            20                  25                  30
Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val
        35                  40
<210>11
<211>50
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>11
Gly Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln
            20                  25                  30
Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala
        35                  40                  45
Arg Ile
    50
<210>12
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>12
Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly
1               5                   10                  15
Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln
            20                  25                  30
His Leu Leu Gln
        35
<210>13
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>13
Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile
1               5                   10                  15
Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His
            20                  25                  30
Leu Leu Gln Leu
        35
<210>14
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>14
Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val
1               5                   10                  15
Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu
            20                  25                  30
Leu Gln Leu Thr
        35
<210>15
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>15
Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln
1               5                   10                  15
Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu
            20                  25                  30
Gln Leu Thr
        35
<210>16
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>16
Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln
1               5                   10                  15
Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu
            20                  25                  30
Gln Leu Thr Val
        35
<210>17
<211>34
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>17
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1               5                   10                  15
Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
            20                  25                  30
Leu Thr
<210>18
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>18
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1               5                   10                  15
Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
            20                  25                  30
Leu Thr Val
        35
<210>19
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>19
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1               5                   10                  15
Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
            20                  25                  30
Leu Thr Val Trp
        35
<210>20
<211>37
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>20
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1               5               10                      15
Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
            20              25                      30
Leu Thr Val Trp Gly
        35
<210>21
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>21
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1               5                   10                  15
Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
            20                  25                  30
Leu Thr Val Trp Gly Ile
        35
<210>22
<211>44
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>22
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1               5                   10                  15
Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
            20                  25                  30
Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg
        35                  40
<210>23
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>23
Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln
1               5                   10                  15
Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu
            20                  25                  30
Thr Val Trp Gly
        35
<210>24
<211>42
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>24
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp
            20                  25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
        35                  40
<210>25
<211>47
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>25
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp
            20                  25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr
        35                  40                  45
<210>26
<211>49
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>26
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp
            20                  25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
        35                  40                  45
Lys
<210>27
<211>51
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>27
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp
            20                  25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
        35                  40                  45
Lys Asp Gln
    50
<210>28
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>28
Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln
            20                  25                  30
Ala Arg Ile Leu
        35
<210>29
<211>45
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>29
Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln
            20                  25                  30
Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
        35                  40                  45
<210>30
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>30
Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
            20                  25                  30
Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
        35                  40
<210>31
<211>34
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>31
Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly
1               5                   10                  15
Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys
            20                  25                  30
Asp Gln
<210>32
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>32
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
            20                  25                  30
Leu Leu Glu Leu
        35
<210>33
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>33
Cys Gly Gly Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
            20                  25                  30
Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
        35                  40
<210>34
<211>31
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>34
Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val
            20                  25                  30
<210>35
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>35
Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu
            20                  25                  30
Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gly Gly Cys
        35                  40
<210>36
<211>44
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>36
Cys Gly Gly Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
            20                  25                  30
Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gly Gly Cys
        35                  40
<210>37
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>37
Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu
1               5                   10                  15
Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu
            20                  25                  30
Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val
        35
<210>38
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>38
Tyr Thr Asn Thr Ile Tyr Thr Leu Leu Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe
        35
<210>39
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>39
Tyr Thr Gly Ile Ile Tyr Asn Leu Leu Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Asn Leu
            20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe
        35
<210>40
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>40
Tyr Thr Ser Leu Ile Tyr Ser Leu Leu Glu Lys Ser Gln Ile Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe
        35
<210>41
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>41
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Phe Asn Phe Phe
        35
<210>42
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>42
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn Ile Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu
            20                  25                  30
Leu Gln Lys Leu
        35
<210>43
<211>42
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>43
Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu
1               5                   10                  15
Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu
            20                  25                  30
Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
        35                  40
<210>44
<211>48
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>44
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
        35                  40                  45
<210>45
<211>42
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>45
Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
            20                  25                  30
Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys
        35                  40
<210>46
<211>46
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>46
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn Ile Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu
            20                  25                  30
Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
        35                  40                  45
<210>47
<211>50
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>47
Asn Asn Met Thr Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Val Arg Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
Ala Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys
            20                  25                  30
Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
        35                  40                  45
Trp Phe
    50
<210>48
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>48
Trp Asn Trp Phe Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe
        35
<210>49
<211>46
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>49
Trp Gln Glu Trp Asp Arg Glu Ile Ser Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu
            20                  25                  30
Leu Gln Lys Leu Asp Glu Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
        35                  40                  45
<210>50
<211>40
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>50
Trp Gln Glu Trp Glu Arg Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Ser Leu Ile Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Ile Glu Tyr Glu
            20                  25                  30
Leu Gln Lys Leu Glu Trp Glu Trp
        35                  40
<210>51
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>51
Trp Gln Glu Trp Asp Arg Glu Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
        35
<210>52
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>52
Trp Gln Glu Trp Asp Arg Glu Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Glu Trp
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
        35
<210>53
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>53
Trp Gln Glu Trp Asp Arg Glu Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Glu Trp
            20                  25                  30
Glu Trp Phe
        35
<210>54
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>54
Trp Gln Glu Trp Glu Arg Glu Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Ile Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Ile Glu Trp
            20                  25                  30
Glu Trp Phe
        35
<210>55
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>55
Trp Gln Glu Trp Glu Arg Glu Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Ile Glu Trp
            20                  25                  30
Glu Trp Phe
        35
<210>56
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>56
Trp Gln Glu Trp Glu Arg Glu Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Ile Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Glu Trp
            20                  25                  30
Glu Trp Phe
        35
<210>57
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>57
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
        35
<210>58
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>58
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Iys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp
            20                  25                  30
Ala Gly Leu Trp Glu Trp Phe
        35
<210>59
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>59
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ala Gly Leu Trp Ala Trp Phe
        35
<210>60
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>60
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Ile Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Ile Glu Trp
            20                  25                  30
Glu Trp Phe
        35
<210>61
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>61
Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Leu Thr Ala Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
            20                  25                  30
Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
        35                  40
<210>62
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>62
Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Leu Thr Val Ala Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
            20                  25                  30
Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
        35                  40
<210>63
<211>49
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>63
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1                   5               10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Ala Leu Gln Ala Thr Val Trp
                20              25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
            35              40                  45
Lys
<210>64
<211>51
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>64
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Ala Leu Gln Ala Thr Val Trp
            20                  25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
        35                  40                  45
Lys Asp Gln
    50
<210>65
<211>49
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>65
Gln Ala Arg Gln Leu Val Ser Gly Leu Val Gln Gln Gln Asn Asn Ile
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Leu Glu Ala Thr Gln His Ala Val Gln Ala Leu Val Trp
            20                  25                  30
Gly Val Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Leu Glu Arg Tyr Ile
        35                  40                  45
Lys
<210>66
<211>49
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>66
Gln Ile Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Ile Gln His Ala Leu Gln Ala Ile Val Trp
            20                  25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
        35                  40                  45
Lys
<210>67
<211>49
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>67
Gln Ala Arg Gln Leu Val Ser Gly Leu Val Gln Gln Gln Asn Asn Ile
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Leu Glu Ala Thr Gln His Ala Val Gln Ala Leu Val Trp
            20                  25                  30
Gly Val Arg Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Leu Glu Arg Tyr Ile
        35                  40                  45
Lys
<210>68
<211>51
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>68
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Thr Gln His Ala Val Gln Ala Leu Val Trp
            20                  25                  30
Gly Val Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Leu Glu Arg Tyr Ile
        35                  40                  45
Lys Asp Gln
    50
<210>69
<211>51
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>69
Gln Ala Arg Gln Leu Val Ser Gly Leu Val Gln Gln Gln Asn Asn Ile
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Leu Glu Ala Gln Gln His Ala Leu Gln Ala Thr Val Trp
            20                  25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Leu Glu Arg Tyr Ile
        35                  40                  45
Lys Asp Gln
    50
<210>70
<211>51
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>70
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Ala Leu Gln Ala Thr Val Trp
            20                  25                  30
Gly Val Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
        35                  40                  45
Lys Asp Gln
    50
<210>71
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>71
Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Leu Thr Val Phe Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
            20                  25                  30
Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
        35                  40
<210>72
<211>49
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>72
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Phe
            20                  25                  30
Gly Ile Arg Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
        35                  40                  45
Lys
<210>73
<211>51
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>73
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Ala Thr Val Trp
            20                  25                  30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
        35                  40                  45
Lys Asp Gln
    50
<210>74
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>74
Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Ala Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
            20                  25                  30
Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
        35                  40
<210>75
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>75
Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met
1               5                   10                  15
Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile
            20                  25                  30
His Ser Leu Ile
        35
<210>76
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>76
Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp
1               5                   10                  15
Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu
            20                  25                  30
Glu Ser Gln Asn
        35
<210>77
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>77
Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp
1               5                   10                  15
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu
            20                  25                  30
Ser Gln Asn Gln
        35
<210>78
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>78
Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg
1               5                   10                  15
Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser
            20                  25                  30
Gln Asn Gln Gln
        35
<210>79
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>79
Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu
1               5                   10                  15
Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln
            20                  25                  30
Asn Gln Gln Glu
        35
<210>80
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>80
Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile
1               5                   10                  15
Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn
            20                  25                  30
Gln Gln Glu Lys
        35
<210>81
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>81
Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn
1               5                   10                  15
Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln
            20                  25                  30
Gln Glu Lys Asn
        35
<210>82
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>82
Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn
1               5                   10                  15
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
            20                  25                  30
Glu Lys Asn Glu
        35
<210>83
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>83
Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu
            20                  25                  30
Lys Asn Glu Gln
        35
<210>84
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>84
Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
            20                  25                  30
Asn Glu Gln Glu
        35
<210>85
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>85
Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser
1               5                   10                  15
Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn
            20                  25                  30
Glu Gln Glu Leu
        35
<210>86
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>86
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Ile His Ser Lau Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Leu
        35
<210>87
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>87
Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile
1               5                   10                  15
His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln
            20                  25                  30
Glu Leu Leu Glu
        35
<210>88
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>88
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
            20                  25                  30
Leu Leu Glu Leu
        35
<210>89
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>89
Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser
1               5                   10                  15
Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu
            20                  25                  30
Leu Glu Asp
        35
<210>90
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>90
Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu
1               5                   10                  15
Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lyg Asn Glu Gln Glu Leu Leu
            20                  25                  30
Glu Leu Asp Lys
        35
<210>91
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>91
Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile
1               5                   10                  15
Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu
            20                  25                  30
Leu Asp Lys Trp
        35
<210>92
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>92
Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln
1               5                   10                  15
Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser
            20                  25                  30
Leu Trp Asn Trp
        35
<210>93
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>93
Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu
1               5                   10                  15
Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp
            20                  25                  30
Asn Trp Phe Asn
        35
<210>94
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>94
Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
1               5                   10                  15
Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
            20                  25                  30
Trp Phe Asn Ile
        35
<210>95
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>95
Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn
1               5                   10                  15
Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp
            20                  25                  30
Phe Asn Ile Thr
        35
<210>96
<211>43
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>96
Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu
1               5                   10                  15
Arg Glu Ile Asp Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Tyr Ser Leu Ile Glu Glu
            20                  25                  30
Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
        35                  40
<210>97
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>97
Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Asp Asn Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Tyr Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
            20                  25                  30
Asn Glu Gln Glu
        35
<210>98
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>98
Glu Trp Glu Arg Glu Ile Asp Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Tyr Ser Leu
1               5                   10                  15
Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
            20                  25                  30
<210>99
<211>29
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>99
Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg
1               5                   10                  15
Glu Ile Asp Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Tyr Ser Leu Ile
            20                  25
<210>100
<211>147
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>100
caggctcgtc agctgctgtc tggtatcgtt cagcagcaga acaacctgct gcgtgctatc    60
gaagctcagc agcacgctct gcaggctacc gtttggggta tcaaacagct gcaggctcgt    120
atcctggctg ttgaacgtta cctgaaa                                        147
<210>101
<211>147
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>101
caggctcgtc agctggtttc tggtctggtt cagcagcaga acaacatcct gcgtgctctg    60
gaagctaccc agcacgctgt tcaggctctg gtttggggtg ttaaacagct gcaggctcgt    120
gttctggctc tggaacgtta catcaaa                                        147
<210>102
<211>147
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>102
cagatccgtc agctgctgtc tggtatcgtt cagcagcaga acaacctgct gcgtgctatc    60
gaagctatcc agcacgctct gcaggctatc gtttggggta tcaaacagct gcaggctcgt    120
atcctggctg ttgaacgtta cctgaaa                                        147
<210>103
<211>123
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>103
cagcagcaga acaacctgct gcgtgctatc gaagctcagc agcacctgct gcagctgacc    60
gcttggggta tcaaacagct gcaggctcgt atcctggctg ttgaacgtta cctgaaagac    120
cag                                                                  123
<210>104
<211>123
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>104
cagcagcaga acaacctgct gcgtgctatc gaagctcagc agcacctgct gcagctgacc    60
gttgctggta tcaaacagct gcaggctcgt atcctggctg ttgaacgtta cctgaaagac    120
cag                                                                  123
<210>105
<211>108
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>105
tacacctctc tgatccactc tctgatcgaa gaatctcaga accagcagga aaaaaacgaa    60
caggaactgc tggaactgga caaatgggct tctctgtgga actggttc                 108
<210>106
<211>117
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>106
tggcaggaat gggaacagaa aatcaccgct ctgctggaac aggctcagat ccagcaggaa    60
aaaaacgaat acgaactgca gaaactggac aaatgggctt ctctgtggga atggttc       117
<210>107
<211>147
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>107
caggcccgcc agctgctgtc cggcatcgtg cagcagcaga acaacctgct gcgcgccatc    60
gaggcccagc agcacgccct gcaggccacc gtgtggggca tcaagcagct gcaggcccgc    120
atcctggccg tggagcgcta cctgaag                                        147
<210>108
<211>147
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>108
caggcccgcc agctggtgtc cggccgcgtg cagcagcaga acaacatcct gcgcgccctg    60
gaggccaccc agcacgccgt gcaggccctg gtgtggggcg tgaagcagct gcaggcccgc    120
gtgctggccc tggagcgcta catcaag                                        147
<210>109
<211>147
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>109
cagatccgcc agctgctgtc cggcatcgtg cagcagcaga acaacctgct gcgcgccatc    60
gaggccatcc agcacgccct gcaggccatc gtgtggggca tcaagcagct gcaggcccgc    120
atcctggccg tggagcgcta cctgaag                                        147
<210>110
<211>123
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>110
cagcagcaga acaacctgct gcgcgccatc gaggcccagc agcacctgct gcagctgacc    60
gcctggggca tcaagcagct gcaggcccgc atcctggccg tggagcgcta cctgaaggac    120
cag                                                                  123
<210>111
<211>123
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>111
cagcagcaga acaacctgct gcgcgccatc gaggcccagc agcacctgct gcagctgacc    60
gtggccggca tcaagcagct gcaggcccgc atcctggccg tggagcgcta cctgaaggac    120
cag                                                                  123
<210>112
<211>108
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>112
tacacctccc tgatccactc cctgatcgag gagtcccaga accagcagga gaagaacgag    60
caggagctgc tggagctgga caagtgggcc tccctgtgga actggttc                 108
<210>113
<211>117
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>113
tggcaggagt gggagcagaa gatcaccgcc ctgctggagc aggcccagat ccagcaggag    60
aagaacgagt acgagctgca gaagctggac aagtgggcct ccctgtggga gtggttc       117
<210>114
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>114
Leu Thr Trp Gln Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Ile Tyr Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Glu Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Leu
        35

Claims (30)

1、一种共轭物，包括一个其上至少可操作地结合两个合成肽分子的聚合物，其中每个合成肽分子通过一个反应官能团被可操作地结合到该聚合物上，其中每个合成肽包括来源于艾滋病毒(HIV)gp41的7个一组重复区域的氨基酸序列，其中合成肽包括不低于大约16个氨基酸且不多于大约60个氨基酸的氨基酸序列，和其中该共轭物具有包括针对能抵抗单独合成肽的HIV菌株的抗病毒活性的持久性。
2、根据权利要求1所述的共轭物，其中该聚合物含有的分子量范围为从大约200道尔顿到大约20,000道尔顿。
3、根据权利要求2所述的共轭物，其中该聚合物包含由特定数量的乙烯单位组成的聚乙二醇。
4、根据权利要求1所述的共轭物，其中该共轭物的每个合成肽包括来源于HIVgp41的HR1区的氨基酸序列。
5、根据权利要求4所述的共轭物，其中该共轭物的每个合成肽包括同样的氨基酸序列。
6、根据权利要求1所述的共轭物，其中该共轭物的每个合成肽包括来源于HIVgp41的HR2区的氨基酸序列。
7、根据权利要求6所述的共轭物，其中该共轭物的每个合成肽包括同样的氨基酸序列。
8、根据权利要求1所述的共轭物，其中该共轭物的至少一个合成肽分子包含来源于HIV gp41的HR1区的氨基酸序列，和其中该共轭物的至少一个合成肽分子包含来源于HIV gp41的HR2区的氨基酸序列。
9、根据权利要求1所述的共轭物，其中合成肽分子通过选自于由N-末端、C-末端、和内部的赖氨酸组成的每个合成肽的一部分被可操作地结合到聚合物上。
10、一种制备共轭物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将第一个合成肽分子与聚合物反应形成一个包含第一中间体的中间体，其中第一个合成肽分子可操作地结合到该聚合物的第一个反应官能团上；和
(b)将包含第一中间体的中间体与第二个合成肽分子反应，其中第二个合成肽分子通过该聚合物的第二个反应官能团可操作地结合到包含第一中间体的中间体上，形成一个由其上可操作地结合不少于两个合成肽分子的聚合物组成的共轭物；和
其中每个合成肽分子通过一个反应官能团被可操作地结合到聚合物上，其中每个合成肽包含来源于艾滋病毒(HIV)gp41的7个一组重复区域的氨基酸序列，其中合成肽包含不低于大约16个氨基酸且不多于大约60个氨基酸的氨基酸序列，和其中该共轭物具有包括针对能抵抗单独合成肽的HIV菌株的抗病毒活性的持久性。
11、根据权利要求10所述的方法，其中该聚合物含有的分子量范围为从大约200道尔顿到大约20,000道尔顿。
12、根据权利要求11所述的方法，其中该聚合物包含由特定数量的乙烯单位组成的聚乙二醇。
13、根据权利要求10所述的方法，其中该共轭物的每个合成肽包括来源于HIVgp41的HR1区的氨基酸序列。
14、根据权利要求13所述的方法，其中该共轭物的每个合成肽包括同样的氨基酸序列。
15、根据权利要求10所述的方法，其中该共轭物的每个合成肽包括来源于HIVgp41的HR2区的氨基酸序列。
16、根据权利要求15所述的方法，其中该共轭物的每个合成肽包括同样的氨基酸序列。
17、根据权利要求10所述的方法，其中该共轭物的至少一个合成肽分子包含来源于HIV gp41的HR1区的氨基酸序列，和其中该共轭物的至少一个合成肽分子包含来源于HIV gp41的HR2区的氨基酸序列。
18、根据权利要求10所述的方法，其中合成肽分子通过选自于由N-末端、C-末端、和内部的赖氨酸组成的每个合成肽的一部分被可操作地结合到聚合物上。
19、一种抑制HIV至靶细胞传播的方法，该方法包括向病毒和细胞中添加一定有效量的共轭物以抑制细胞被病毒感染；其中该共轭物包含一个其上至少可操作地结合两个合成肽分子的聚合物，其中每个合成肽分子通过一个反应官能团被可操作地结合到该聚合物上，其中每个合成肽包括来源于艾滋病毒(HIV)gp41的7个一组重复区域的氨基酸序列，其中合成肽包括不低于大约16个氨基酸且不多于大约60个氨基酸的氨基酸序列，和其中该共轭物具有包括针对能抵抗单独合成肽的HIV菌株的抗病毒活性的持久性。
20、根据权利要求19所述的方法，其中该聚合物含有的分子量范围为从大约200道尔顿到大约20,000道尔顿。
21、根据权利要求20所述的方法，其中该聚合物包含由特定数量的乙烯单位组成的聚乙二醇。
22、根据权利要求19所述的方法，其中该共轭物的每个合成肽包括来源于HIVgp41的HR1区的氨基酸序列。
23、根据权利要求22所述的方法，其中该共轭物的每个合成肽包括同样的氨基酸序列。
24、根据权利要求19所述的方法，其中该共轭物的每个合成肽包括来源于HIVgp41的HR2区的氨基酸序列。
25、根据权利要求24所述的方法，其中该共轭物的每个合成肽包括同样的氨基酸序列。
26、根据权利要求19所述的方法，其中该共轭物的至少一个合成肽分子包含来源于HIV gp41的HR1区的氨基酸序列，和其中该共轭物的至少一个合成肽分子包含来源于HIV gp41的HR2区的氨基酸序列。
27、根据权利要求19所述的方法，其中合成肽分子通过选自于由N-末端、C-末端、和内部的赖氨酸组成的每个合成肽的一部分被可操作地结合到聚合物上。
28、根据权利要求19所述的方法，其中该共轭物以抑制病毒对细胞的感染来抑制病毒和靶细胞之间的融合。
29、根据权利要求19所述的方法，其中该共轭物进一步包含药学上可接受的载体。
30、根据权利要求29所述的方法，其中将该共轭物给感染HIV的个体用药。
CNA038230216A 2002-09-27 2003-09-26 由聚合物和HIVgp41衍生肽组成的共轭物以及他们在治疗中的应用 Pending CN1684972A (zh)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013127299A1 (zh) * 2012-02-28 2013-09-06 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 用于抑制hiv的多肽及其作用靶点

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002096935A2 (en) 2001-05-31 2002-12-05 Conjuchem, Inc. Long lasting fusion peptide inhibitors for hiv infection
US7556813B2 (en) * 2002-09-27 2009-07-07 Trimeris, Inc. Antiviral peptide-polymer conjugate comprising a polymer covalently attached to two or more synthetic HIV gp41 HR1 and/or HR2 peptides
WO2005089805A2 (en) * 2004-03-15 2005-09-29 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-based compositions and conjugates of hiv entry inhibitors
CA2565658A1 (en) * 2004-05-06 2005-11-17 Conjuchem Biotechnologies Inc. Compounds for specific viral target
JP2008534640A (ja) * 2005-04-05 2008-08-28 イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー タンパク質の機能部位またはエピトープの遮蔽方法
JP2009531444A (ja) * 2006-03-28 2009-09-03 ノバルティス アーゲー ＨＩＶＴＡＴタンパク質およびＥｎｖタンパク質の共有結合的に連結された複合体
US7936463B2 (en) * 2007-02-05 2011-05-03 Palo Alto Research Center Incorporated Containing analyte in optical cavity structures
US8828931B2 (en) * 2008-05-28 2014-09-09 New York Blood Center, Inc. Bifunctional molecules for inhibiting HIV entry
AU2009305577A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 New York Blood Center Immunoenhancer-linked oligomeric HIV vaccines
WO2010072228A1 (en) * 2008-12-22 2010-07-01 Xigen S.A. Novel transporter constructs and transporter cargo conjugate molecules
CA2751865A1 (en) * 2009-02-09 2010-08-12 New York Blood Center, Inc. Trimeric hiv fusion inhibitors for treating or preventing hiv infection
US9052304B2 (en) 2009-03-13 2015-06-09 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
CA2794632A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 New York Blood Center, Inc. Bifunctional molecules for inactivating hiv and blocking hiv entry

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
ATE183515T1 (de) 1992-07-20 1999-09-15 Univ Duke Zusammensetzungen die die hiv replikation inhibieren
US5464933A (en) * 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
AU723537B2 (en) * 1995-06-07 2000-08-31 Trimeris Inc. The treatment of HIV and other viral infections using combinatorial therapy
US5767078A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US6258774B1 (en) 1998-03-19 2001-07-10 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Carrier for in vivo delivery of a therapeutic agent
US6281331B1 (en) * 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
US6258782B1 (en) 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6656906B1 (en) * 1998-05-20 2003-12-02 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
EP1264840B1 (en) * 1999-05-17 2009-09-23 ConjuChem Biotechnologies Inc. Long lasting fusion peptide inhibitors of viral infection
US7556813B2 (en) * 2002-09-27 2009-07-07 Trimeris, Inc. Antiviral peptide-polymer conjugate comprising a polymer covalently attached to two or more synthetic HIV gp41 HR1 and/or HR2 peptides

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013127299A1 (zh) * 2012-02-28 2013-09-06 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 用于抑制hiv的多肽及其作用靶点

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