CN1901931A - HIV gp41 HR2－来源的合成肽,及其在抑制人类免疫缺陷性病毒传递的治疗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供以HIV gp41 HR2的天然序列为基础的合成肽，除了该合成肽具有多个氨基酸替换外，其包括(a)螺旋促进氨基酸，或(b)螺旋促进氨基酸和为了在该合成肽中形成离子对而被引入的带电氨基酸的组合；其中该合成肽与具有无多个氨基酸取代的氨基酸序列的肽相比表现意料不到的、改善的生物活性。本发明也提供编码该合成肽的多核苷酸，以及利用这些合成肽抑制HIV传递至靶细胞或作为抑制该传递的组合物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及来源于人类免疫缺陷性病毒(HIV)gp41的HR2区域的合成肽，及其在抗逆转录病毒治疗中作为抗病毒剂而抑制HIV传递至靶细胞的用途。更特别地，本发明包括含有多个氨基酸取代(与天然序列相比)而产生意料不到的、改善的生物活性的肽家族。
背景技术
目前众所周知，细胞可通过在细胞膜和病毒膜之间发生的融合过程而被HIV感染。这个过程的普遍接受的模型是病毒包膜糖蛋白复合物(gp120/gp41)与靶细胞膜上的细胞表面受体相互作用。gp120结合至细胞受体后(例如，CD4与趋化因子共同受体，例如CCR-5或CXCR-4结合)，诱导gp120/gp41复合物中的构象变化而使得gp41插入靶细胞的膜并介导膜融合。
gp41的氨基酸序列，及其在不同HIV毒株当中的变体是众所周知的。图1是普遍接受的gp41功能域的图解说明(注明氨基酸序列数目可根据HIV毒株而有略有不同)。认为该融合肽(基因融合(fusogenic)结构域)涉及插入和破坏靶细胞膜。包含跨膜锚定序列的跨膜结构域位于该蛋白质的C-末端。融合肽和跨膜锚定之间是两个独特的区域，被称为七肽重复(heptad repeat，HR)区域，各个区域具有多个七肽。比HR2区域更靠近该蛋白质N-末端的HR1区域一般被描述为包括gp160氨基酸序列的大约第545位至大约第595位的氨基酸残基。然而，gp160的氨基酸数目取决于推导出该氨基酸序列的毒株。包括HR1区域的氨基酸序列和包括HR2区域的氨基酸序列是在HIV-1包膜蛋白中各自高度保守的区域。HR2区域一般被描述为包括gp160氨基酸序列的大约第628位至大约678位的氨基酸。进一步如图1所示，HR区域具有多个7氨基酸残基延伸段或“七肽”(每个七肽内的7个氨基酸被命名为“a”至“g”)，其中在“a”位置和“d”位置的氨基酸一般是疏水的。存在于每个HR区域中的还有一个或多个亮氨酸拉链状基序(也称为“亮氨酸拉链状重复”)，其包括以异亮氨酸或亮氨酸起始和终止的8氨基酸序列。最经常地，该HR2区域只有一个亮氨酸拉链状基序，而HR1区域具有5个亮氨酸拉链状基序。这些氨基酸序列的特点是促进形成gp41的卷曲螺旋结构，和来源于HR区域的肽的卷曲螺旋结构。一般地，已知卷曲螺旋由两个或多个相互卷绕形成寡聚物的螺旋组成，该卷曲螺旋的标志是氨基酸的七肽重复，其优势在于在第一(“a”)和第四(“d”)位为疏水残基，在第五(“e”)和第七(“g”)位经常为带电残基，并且在“a”位和“d”位的氨基酸为影响寡聚状态和链方向的主要决定因素。
在体外测定和体内临床研究中，都发现来源于HIV gp41的HR1区域(“HR1肽”)或HR2区域(“HR2肽”)的肽抑制HIV至宿主细胞的传递(参见例如，Wild et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9770-9774；授权给本受让人的美国专利号5,464,933和5,656,480；和Kilby et al.，1998，Nature Med.4：1302-1306。也参见转让于本受让人的美国专利号6,258,782和6,348,568)。更特别地，以DP178(亦称为T20、enfuvirtide、和Fuzeon；SEQ ID NO：1)、T651(SEQ ID NO：2)、T649(SEQ ID NO：3)为例的HR2肽，以分别为0.5ng/ml(针对HIV-1LAI的EC50；参见例如Lawless et al.，1996，Biochemistry，35：13697-13708)、5ng(IC50；HIV-1IIIB)、和2ng(IC50；HIV-1IIIB)的效力阻断靶细胞感染。T651(SEQ ID NO：2)和T649(SEQ ID NO：3)各自的氨基酸序列也公开于美国专利号6,479,055(转让于本受让人)中。进一步地，临床研究已经显示，用包含T20(SEQ ID NO：1)的抗病毒剂治疗HIV感染个体，与接受相同但没有T20治疗方式的治疗个体相比，显著减少HIV-1病毒负载，并显著增加循环的CD4+细胞群。
已经试图改善HIV来源的HR2肽的生物活性。例如，已经各自采用肽序列中非天然螺旋偏好氨基酸取代(即，α-氨基异丁酸)的应用，和化学交联剂(即，二氨基链烷交联剂)的应用来稳定低生物活性(IC50为＞500μM)的短的(14个氨基酸)HIV来源HR2肽的螺旋构象(Sia et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14664-14669)。所产生的这些肽显示效力仅增加大约4倍至15倍的生物活性范围(例如，抑制活性)，而其它的显示没有抑制活性(Sia etal.，2002，上文)。因此，通过这个方法只在已经很弱的抑制剂(IC50为＞500μM)中获得很小的增加。此外，Sia等证实了本领域中目前的流行想法；即一般在螺旋倾向和生物活性之间没有相关性。例如，显示最高螺旋含量的肽经常是HIV诱导的膜融合的最弱抑制剂。
另外试图改善HIV来源的HR2肽的生物活性，使谷氨酸和赖氨酸以i，i+4排列(3个氨基酸分开Glu和Lys)在肽“C34”氨基酸序列的不同位置进行取代，以使得能在Glu和Lys之间形成离子对(在i和i+4位置)(Otaka et al.，2002，Angew.Chem.Int.Ed.41：2938-2940)。加入以Glu和Lys不同组合的10个氨基酸至17个氨基酸范围的取代，以促进在Glu和Lys之间形成离子对(即，显示为可能包含6和10之间的i，i+4排列)。所得到的具有可能合成的内螺旋盐桥的3个肽(SEQ ID NOs：96-98)显示螺旋度增加，测量为增加大约20至大约30个百分数(参见例如，表2)。然而，3个肽的生物活性显示与未被导入取代的亲本肽相比，抑制活性没有增加或最多有3倍增加(使用MAGI测定EC50，抗-HIV活性；Otaka et al.，2002，上文)。
如同已经对其他抗逆转录病毒剂所证实的，可在使用融合抑制剂肽，例如T20(SEQ IDNO：1)减少对药物疗法的敏感性的治疗期间，在HIV中发生突变。因此，需要另外的化合物来作为具有改善生物活性的融合抑制剂。就来源于HR2区域的合成肽来说，这种改善的生物活性可包括但不限于，抑制针对对已知HR2肽有发展抗性的HIV毒株的活性，特别是针对对SEQ ID NOs：2-4所示肽中任何一个或多个有发展抗性的HIV毒株的活性增加大约100倍至大约1,000倍(与其来源的基本(天然)HR2序列组成的肽相比)。
发明内容
发明概述
本发明涉及来源于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的一个或多个基本氨基酸序列(“基本序列”)的合成肽，其中该合成肽与所述基本序列的差别在于，加入多个氨基酸替换所述基本序列中的氨基酸，其中该合成肽表现意料不到的、改善的生物活性，并且与其所来源的基本序列相比可进一步包括增加的螺旋度。
提供来源于gp41的HR2区域的合成肽，其中这种合成肽各自包括SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4的一个或多个基本氨基酸序列，但与所述基本序列的差别在于进一步包括包含一个或多个螺旋促进氨基酸的多个氨基酸取代(与所述的基本序列相比)，其中该合成肽表现意料不到的、改善的生物活性，并且与该基本序列相比可进一步包括增加的螺旋度。螺旋促进氨基酸的多个取代可以是大约5至大约15个氨基酸的范围，这取决于其来源的基本序列的长度；更特别地是，该基本序列的大约5％至大约50％范围的氨基酸可替换为一个或多个螺旋促进氨基酸以产生本发明所述的合成肽。
提供包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中一个或多个基本序列的合成肽，除了该合成肽与所述基本序列的差别在于：(a)包括一个或多个螺旋促进氨基酸的多个氨基酸取代，和(b)在该合成肽的氨基酸序列中空间远离相反电荷氨基酸，而形成多个离子对的带电氨基酸(优选，为i，i+4排列和/或i，i+3排列)；以及(c)表现改善的生物活性。优选地，该合成肽中的离子对数目是大约3至大约10的范围。优选地，该合成肽与其来源的基本序列相比进一步包括增加的螺旋度。包括一个或多个螺旋促进氨基酸和多个带电氨基酸的多个氨基酸取代可以是大约5至大约25个氨基酸的范围，这取决于其来源的基本序列的长度；更特别地，该基本序列的大约5％至大约60％的氨基酸可被螺旋促进氨基酸和带电氨基酸的组合取代以生产本发明所述的合成肽。
提供来源于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中一个或多个基本序列的合成肽，其中该合成肽具有包括：(a)螺旋促进氨基酸，和(b)在相反电荷的氨基酸之间形成离子对而被导入的多个带电氨基酸(优选，为i，i+3排列和/或i，i+4排列)的多个氨基酸取代(与其来源的基本序列的氨基酸序列相比)；其中该合成肽具有改善的生物活性。该合成肽与其来源的基本序列相比可进一步包括螺旋度的增加，并且具有通过大约36℃至大约75℃范围内Tm(熔解温度)测量的稳定性。包括螺旋促进氨基酸和带电氨基酸的多个氨基酸取代可以是大约5至大约25个氨基酸的范围，这取决于该基本序列的长度；更特别地，该基本序列的大约5％至大约60％的氨基酸可被包括螺旋促进氨基酸和带电氨基酸的组合取代以生产本发明所述的合成肽。
本发明所述的合成肽如更详细描述的，可进一步包括N-末端基团、C-末端基团、或同时包括N-末端基团和C-末端基团。
提供本发明所述的合成肽作为活性治疗物质在HIV感染治疗中的用途。也提供本发明所述的合成肽在制造用于包括HIV治疗的治疗应用的药物中的用途。
根据本发明，也提供抑制HIV传递至细胞的方法，包括在存在细胞时，使所述病毒接触有效抑制该细胞被HIV感染的本发明所述的适量合成肽。另外提供抑制HIV传递至细胞的方法，包括向病毒和细胞加入有效抑制该细胞被HIV感染的适量合成肽。也提供抑制HIV融合(例如，在HIV感染靶细胞期间，HIV gp41介导病毒膜和细胞膜之间融合的过程)的方法，包括在存在细胞时，使所述病毒接触有效抑制HIV膜融合的浓度的本发明所述的合成肽。这些方法可用于治疗HIV-感染的个体。本发明的上述内容、其他特性和优点在下文的发明详述中，当结合附图阅读时，将是显而易见的。
附图说明
图1是HIV gp41显示与gp41的其他功能区域一起的七肽重复1区域(HR1)和七肽重复2区域(HR2)的图解。为了例证说明的目的，显示相应于HIVLAI HR1和HR2的例证性的肽序列。根据其在gp160、毒株HIVLAI中的位置编号氨基酸残基。
图2显示从不同的实验室毒株和临床分离物测定的HIV gp41的HR2区域中SEQ ID NO：2内含有的多态性比较，其中通过单字母氨基酸密码表明氨基酸序列中的变异。
具体实施方式
发明详述
定义：
术语“个体”，当在此处用于本说明书和权利要求书的目的时，是指哺乳动物，优选是人。
术语“靶细胞”，当在此处用于本说明书和权利要求书的目的时，是指能够被HIV感染的细胞。优选地，该细胞是人细胞或人类细胞；更优选地，人类细胞能够借助于包括膜融合的过程被HIV感染。
术语“药物学上可接受的载体”，当在此用于本说明书和权利要求书的目的时，是指不显著改变加入的活性成分的生物活性(例如，本发明所述的合成肽)的载体介质。如本领域技术人员已知的，适当的药物学上有效的载体可包括一种物质，包括但不限于，水、缓冲水、盐水、0.3％甘氨酸、含水乙醇、等渗的含水缓冲液；并且可进一步包括一种或多种物质，例如水溶性聚合物、甘醇、聚乙二醇、丙三醇、油类、盐，例如钠、钾、镁和铵，膦酸酯、碳酸酯、脂肪酸、糖类、多糖、糖蛋白(用于增加稳定性)、赋形剂，和防腐剂和/或稳定剂(为了增加储存期限或根据需要和适于该组合物的制造和分配)。优选地，该载体适合于静脉内的、肌内的、皮下的或肠胃外给药。
通过术语“氨基酸”，为了本说明书和权利要求书的目的并且关系到本发明所述的合成肽，是指具有至少一个游离胺基和至少一个游离羧基的分子。氨基酸可具有多于一个游离胺基，或多于一个游离羧基，或可进一步包括除了胺或羧基之外的一个或多个游离的化学反应基(例如，羟基、巯基等)。该氨基酸可以是天然存在的氨基酸(例如，L-氨基酸)、非天然存在的氨基酸(例如D-氨基酸)、合成的氨基酸、修饰的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸前体，和保守置换。本领域的技术人员已知，选择掺入肽的氨基酸将部分地依赖于为抗病毒肽所需要的特异的物理、化学或生物学特性。这种特性部分地通过螺旋度(在此更详细描述的)和抗病毒活性(在此更详细描述的)的测定来确定。例如，熟练的技术人员将从在此的说明区分合成肽中的氨基酸可由一个或多个天然存在的(L)-氨基酸和非天然存在的(D)-氨基酸组成。优选的氨基酸可用于排除除优选氨基酸之外的氨基酸。
“螺旋促进氨基酸”，为了本说明书和权利要求书的目的是指，具有促进包含这种螺旋促进氨基酸的氨基酸序列形成α螺旋的高倾向的氨基酸。本领域已知为螺旋促进氨基酸的天然存在的氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸，和色氨酸(trytophan)，以及非天然存在的氨基酸，例如氨基丁酸(例如，α-氨基异丁酸)。根据这些螺旋促进氨基酸，螺旋状倾向的顺序(最大的/较高的至较小的/较低的)是：谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、组氨酸，和色氨酸。因此，根据本发明，合成肽与其来源的基本序列相比包括多个氨基酸取代，其中氨基酸取代包括在合成肽的氨基酸序列位置的螺旋促进氨基酸，其与该合成肽来源的基本序列的氨基酸序列的相应位置的氨基酸相比具有更高的螺旋状倾向。在另一个实施方案中，不带电的螺旋促进氨基酸取代基本序列中的带电氨基酸。术语“螺旋促进”，当在此用于本说明书和权利要求书的时，通常是指一个或多个氨基酸取代对肽的螺旋度促进作用；更特别地，观察到一个或多个α螺旋稳定的作用，或如本领域已知的螺旋度增加。
关于本发明所述的合成肽氨基酸序列的“保守置换”，是在此用于本说明书和权利要求书的术语，是指合成肽的序列中一个或多个氨基酸取代，以使得该合成肽如在此所详细描述的仍然表现(保持)意料不到的、改善的生物活性。如本领域已知的，通过上述功能定义“保守置换”，并且包括基本上与被替换的氨基酸具有相同电荷、大小、亲水性、和/或芳香性的氨基酸取代。这种取代是本领域普通技术人员已知的，包括但不限于，甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸；异亮氨酸-亮氨酸；色氨酸-酪氨酸；天冬氨酸-谷氨酸；精氨酸-赖氨酸；天门冬酰胺-谷氨酰胺；和丝氨酸-苏氨酸。如在图2中举例说明的，这种取代也可包括如在实验室的SEQ IDNO：2、HIV的不同分化体，和/或临床分离物中发现的不同氨基酸位置的多态性。
术语“天然序列”，当在此用于本说明书和权利要求书的目的并且关系到HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列，是指在实验室的HIV毒株和/或HIV临床分离物中发现的天然存在的序列。这种序列可容易地以从公众基因数据库，例如GenBank获得。为了例证说明，而不是限制，图2中举例说明了这种天然序列中的一些，其中在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，不同的氨基酸位置注明了例证性的取代(例如，多态性)。术语“基本序列”，当用于本说明书和权利要求书时，是指本发明所述的合成肽所来源的天然序列(或由天然序列组成的肽)。因此，例如，来源于基本序列的合成肽包括该基本序列的一些氨基酸序列，除了与该基本序列的差别在于，向该合成肽的氨基酸序列加入(a)多个螺旋促进氨基酸，或(b)向该合成肽的氨基酸序列加入组合的螺旋促进氨基酸和带电氨基酸(形成离子对)；以与未包含这种增加氨基酸的基本序列相比，赋予该合成肽意料不到的、改善的生物活性。
术语“反应官能团”，当在此用于本说明书和权利要求书的目的时，是指能够形成共价键和/或是保护性(例如.保护肽衍生物避免与其本身或其他的分子反应)的化学基团或化学部分(moiety)。关于化学基团，反应官能团是本领域技术人员已知的，包括的基团包括但不限于，顺丁烯二酰亚胺、硫醇、羧基、磷酰基、酰基、羟基、乙酰基、疏水基、酰胺基、丹酰基、芴基甲氧羰基(Fmoc)、t-丁氧羰基(Boc)、磺基、琥珀酰亚胺、硫羟反应性、氨基反应性、羧基反应性等。例如，加至合成肽的N-末端氨基酸，以阻断该肽氨基末端的化学反应性的化学基团包括N-末端基团。这种用于保护肽的氨基末端的N-末端基团是本领域已知的，并且包括但不限于，低级烷酰基基团、酰基基团、磺酰基团，和氨基甲酸酯形成基团。优选的N-末端基团可包括乙酰基、Fmoc，和Boc。例如，加至合成肽的C-末端氨基酸，以阻断该肽羧基末端的化学反应性的化学基团包括C-末端基团。用于保护该肽羧基末端的这种C-末端基团是本领域已知的，并且包括但不限于酯或酰胺基。化学部分可包括接头。已知接头是起可操作地连接两个不同分子的分子桥作用的化合物或部分(例如，其中该接头的一部分结合本发明所述的肽，而其中该接头的另一部分结合高分子载体或已知抑制HIV传递至靶细胞的另一个抗病毒肽)。两个不同分子可以逐步的方式连接至该接头。对于该接头没有特别的大小或容量限制，只要它可实现其作为分子桥的目的。本领域技术人员已知的接头包括但不限于，化学链、化合物(例如，反应剂)等。该接头可包括但不限于，同双官能的接头和异双官能的接头。本领域技术人员已知的异双官能的接头包含具有特异连接第一分子的第一反应官能团的一个末端，和具有特异连接第二分子的第二反应官能团的相对末端。对本领域的技术人员来说，各种双官能或多官能团的反应剂是显然的，同和异功能(例如在PierceChemical Co.，Rockford，Ill的目录中描述的)或顺丁烯二酰亚胺可用作本发明所述的接头。根据待连接的分子，和进行该连接的条件的这些因素，该接头可能在长度和用于最优化例如保持生物功能稳定性、对某些化学品和/或温度参数的耐受性，以及足够的立体选择性或大小的特性的组成方面不同。例如，该接头不应显著妨碍本发明所述的肽(其将连接的)起HIV融合和HIV传递至靶细胞的抑制剂作用的能力。优选的反应官能团可用于排除除该优选反应官能团外的反应官能团。
术语“高分子载体”，当在此用于本说明书和权利要求书的目的，是指连接、结合或融合(例如，化学地或通过重组方式)至本发明所述的一个或多个肽的分子，由此该分子相对于缺少该分子的一个或多个肽来说，能够赋予该一个或多个肽一种或多种稳定性、增加该一个或多个肽的生物活性，或增加该一个或多个肽的血清半衰期(例如，延长该一个或多个肽在机体内的持久性)。这种高分子载体是本领域已知的，包括但不限于，血清蛋白、聚合物、碳水化合物，和脂类-脂肪酸共轭物。一般用作高分子载体的血清蛋白包括但不限于，转铁蛋白、白蛋白(优选人)、免疫球蛋白(优选人IgG或其一个或多个链)，或激素。一般用作高分子载体的聚合物包括但不限于，聚赖氨酸或聚(D-L-丙氨酸)-聚(L-赖氨酸)，或多元醇。优选的多元醇包括水溶性的聚(烯基氧化物)聚合物，并且可具有线性或分支的链。适当的多元醇包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、和PEG-PPG共聚物。优选的多元醇包括具有选自大约1,000道尔顿至大约20,000道尔顿范围的平均分子大小的PEG。可使用的、一般具有高于20,000分子量的其他类型的高分子载体是本领域已知的。
涉及本发明所述的肽，在下文中为了本说明书和权利要求书的目的使用术语“合成的”，是指通过化学合成、重组表达、大分子的生化或酶促片段化、大分子的化学裂解、上述的组合产生，或通常通过本领域的任何其他方法制备和分离的肽。术语“分离的”当用于涉及肽时，是指该合成肽基本上无未曾成为该肽本身的整体结构一部分的组分；例如当通过重组技术生产时，基本上无细胞物质或培养基，或当利用生化或化学方法化学合成或生产时，基本上无化学前体或其他的化学品。
术语“离子对”，当在此用于本说明书和权利要求书的目的时，通常是指氨基酸序列中相反带电离子之间(例如，两个相反带电氨基酸之间)简单的静电相互作用。每个相反带电离子是在氨基酸的侧链上。对于不同类型的离子对，“盐桥”是通过本领域已知的核磁共振或其他标准方法测定的处于紧密空间关系的离子对(本领域已知的)。在优选的实施方案中，离子对由包含于形成螺旋的氨基酸序列中的连续序列中通过3个氨基酸(即，为i，i+4排列)或两个氨基酸(即，为i，i+3排列)空间间隔的2个相反带电的氨基酸残基形成。因此，带正电的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)可与带负电的氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸)形成离子对。因此，例如在一个实施方案中，合成肽来源于基本序列，除了包括在该合成肽的相应位置内的在中性(电荷)或带负电的氨基酸(如在基本序列中)的位置放置带正电的氨基酸，以使得与带负电的氨基酸形成离子对(例如，为i，i+3排列或i，i+4排列)。在另一个实施方案中，合成肽来源于基本序列，除了包括在该合成肽的相应位置内的在中性(电荷)或带正电的氨基酸(如在基本序列中)的位置是氨基酸序列位置中带负电的氨基酸，以使得与带正电的氨基酸形成离子对(例如，为i，i+3排列或i，i+4排列)。在另一实施方案中，带负电的氨基酸和带正电的氨基酸都包括在合成肽中，其排列使得在该合成肽中形成离子对，而该离子对在该合成肽来源的基本序列中不存在。
术语“改善的生物活性”，当在此用于本说明书和权利要求书的目的，并涉及本发明所述的合成肽时，是指(a)与其来源的基本序列的抗病毒活性相比，针对对该基本序列抗病毒活性显示易感性(″抗性″)降低的HIV毒株，该合成肽的抗病毒活性增加(例如，如通过本领域用于测量抗病毒效力的IC50或其它测量标准测量的)；或(b)与该合成肽来源的基本序列的抗病毒活性相比，针对对该基本序列抗病毒活性显示耐受性的HIV毒株，该合成肽的抗病毒活性增加；以及与该合成肽来源的基本序列的药物代谢动力学特性相比，合成肽的药物代谢动力学特性(例如，通过一个或多个参数，例如曲线下面积(AUC)、生物学半衰期，和/或清除率；或本领域用于测量药物代谢动力学特性的其它测量标准)改善。相信这种改善的生物活性是意料不到的。在一个实施方案中，改善的生物活性包括抗病毒活性增加，优选不少于该活性的20倍，正如在该基本序列和涉及抗该基本序列的病毒分离物(突变体)中所观察到的。在更优选的实施方案中，这种改善的生物活性包括针对抗该基本序列的病毒分离物的IC50小于或等于0.500μg/ml。更优选地，这种合成肽的IC50是在纳克/ml或皮克/ml范围。在本发明的优选实施方案中，该基本序列由选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4，及其组合的氨基酸序列组成。重要的是，注意到合成肽针对抗基本序列的病毒分离物的改善生物活性还可与针对抗T20(SEQ ID NO：1)的分离物HIV的意料不到和改善抗病毒活性相互关联。当具有一个或多个(a)更长的生物半衰期(t)，和(b)降低的生物清除率(Cl)时，该合成肽与其来源的基本序列相比具有改善的药物代谢动力学特性。在优选的实施方案中，该合成肽一般提供相对于其来源的基本序列减少不少于30％的清除率，正如在此处的实施例中所更详细显示的。在另一优选实施方案中，该合成肽与其来源的基本序列的生物半衰期相比，一般提供增加不少于5倍的生物半衰期，正如在此处的实施例中所更详细显示的。
术语“药物代谢动力学特性”，当在此用于本说明书和权利要求书时，是指可随时间系统获得的药物组合物中活性成分(例如，合成肽的类似物)的总量。可通过单独测量给药后合成肽类似物随时间的总的全身浓度，或与合成肽的单独给药后的药物代谢动力学特性(即，没有酰胺形成氨基酸与其可操作结合)相比来确定药物代谢动力学特性。举例来说，药物代谢动力学特性可用术语曲线下面积(AUC)、生物半衰期，和/或清除率表示。AUC是全身性活性成分浓度随时间的积分测量，其单位是质量×时间/体积。给药活性成分剂量后，来自给药时间至机体中没有活性成分剩余的时间的AUC是使该个体暴露于该活性成分的测量值(和/或活性成分的代谢产物)。清除率定义为剂量/AUC，并表示为体积/重量/时间的单位。
术语“稳定性”，当在此用于本说明书和权利要求书涉及本发明所述合成肽的目的时，是指该肽的α-螺旋卷绕结构的稳定性。本领域的技术人员已知，可通过本领域已知的标准方法，例如通过测定该肽的熔解温度(“Tm”)(参见例如，此处的实施例1)来测量稳定性。在优选的实施方案中，包括在此所描述的多个氨基酸取代的合成肽，与该合成肽来源的基本序列相比表现更大的稳定性，这可通过观察该合成肽与该合成肽来源的基本序列的熔解温度相比，有更高的熔解温度来加以鉴别。这种一个或多个氨基酸取代可包括在固有的位置导入螺旋促进氨基酸(例如，替换较低螺旋倾向的侧链)；或在起稳定卷曲螺旋作用的一个或多个七肽重复中导入螺旋促进氨基酸和带电氨基酸(形成离子对)。
术语“同一性百分数”，当在此用于本说明书和权利要求涉及本发明所述序列的目的时，是指该序列(“被比较序列”)与描述的或参考序列(“参考序列”)相比较；其中根据下列公式确定同一性百分数：
同一性百分数＝[1-(xC/yR)]×100
其中xC是参考序列和被比较序列之间跨越被比较序列和参考序列之间排列对比长度的差异的数目，其中(a)不具有被比较序列中相应排列定位的碱基或氨基酸的参考序列中的每个碱基或氨基酸，和(b)参考序列中每个缺口，以及(c)被比较序列中每个排列定位的、不同于参考序列中序列对比的碱基或氨基酸，组成差异；并且yR是跨越被比较序列长度的参考序列中碱基或氨基酸的数目，参考序列中产生的任何缺口也作为碱基或氨基酸的排列对比的结果。用于两个预定序列之间排列的方法和软件是本领域中已知的。因此，例如参考序列可能是具有SEQ ID NOs：5-98中任何一个氨基酸序列的合成肽，而被比较序列是与参考序列比较同一性百分数的合成肽。
术语“治疗”或“疗法”就HIV感染而论可互换使用，并且为了本说明书和权利要求书的目的，是指合成肽(或具有该合成肽作为活性药物物质的组合物)可用来影响一种或多种与HIV感染有关的过程，或用作确定这种治疗或疗法的治疗(例如，“治疗学应用”)效力的指示物的一个或多个参数或端点。例如，该合成肽可用来抑制一种或多种下列过程：传递HIV至靶细胞；HIV和靶细胞之间的融合(“HIV融合”)；病毒进入(在感染过程期间HIV或其遗传物质进入靶细胞的过程)；和合胞体形成(例如，HIV-受感染细胞和靶细胞之间)。病毒抑制(通过本领域已知的、用于测量体液或组织中HIV的病毒负载的方法测定)是通常使用的主要端点，而血流中循环的CD4+细胞数目增加是通常使用的第二端点，都可用于评估HIV感染治疗或疗法中药物的效力；各自都是抑制HIV传递至靶细胞的可测量效力。因此，合成肽可用来影响包括病毒抑制和/或循环CD4+细胞的相对数目增加的治疗应用。
本发明的合成肽包括下列分类和功能特征。
A.序列
本发明所述的合成肽来源于HIV-1 gp41的HR2区域的天然序列，更特别地包括SEQ IDNO：2、3或4中任何一个或多个作为基本序列；然而该合成肽与所述基本序列的差别在于，在该合成肽的氨基酸序列中包含多个氨基酸取代(与该合成肽来源的基本序列中的相应位置相比)来产生意料不到的、改善的生物活性，并且与该合成肽所来源的基本序列相比可进一步包括螺旋度的增加。在一个实施方案中，该合成肽与该基本序列的不同在于：(a)用螺旋促进氨基酸取代该基本序列的大约5％和大约50％之间的氨基酸(例如，添加具有更大螺旋倾向的氨基酸代替比该替换氨基酸具有更低螺旋倾向的氨基酸，或添加不带电的螺旋促进氨基酸代替带电氨基酸)；以及(b)包括改善的生物活性。通过具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：5具有90％同一性的氨基酸序列，并且与所述基本序列的不同在于(i)与该合成肽来源的基本序列中相应氨基酸位置相比加入多个螺旋促进氨基酸，以及(ii)改善生物活性的合成肽来举例说明这种合成肽。在另一个实施方案中，该合成肽具有至少包括一个七肽中“a”位置和不同(优选相邻的)七肽中“d”位置的两个或多个取代而与该合成肽来源的基本序列相比，令人惊讶地产生改善的生物活性。更优选地，用螺旋-促进氨基酸取代的基本序列“a”和“d”位置的总数是2至5的范围。在优选的实施方案中，螺旋促进氨基酸是亮氨酸或异亮氨酸，或亮氨酸和异亮氨酸的组合，与该合成肽来源的基本序列相比，形成1至3个附加的亮氨酸拉链状基序。通过SEQ ID NOs：82、84、85、86和87举例说明这种合成肽。
在另一实施方案中，合成肽与基本序列的不同在于：(a)该基本序列的大约5％和大约60％之间的氨基酸取代为(i)螺旋促进氨基酸，和(ii)带电氨基酸残基，导致在该合成肽中形成在该合成肽来源的基本序列中不存在的多个离子对，以及更优选地在其排列中该合成肽包括大约3个离子对至大约10个离子对范围数目的离子对；和(b)包括改善的生物活性。通过具有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、和SEQ ID NO：95的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：6-81、83和88-95中任何一个或多个具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且与基本序列的不同在于(i)与该合成肽来源的基本序列中相应氨基酸位置相比添加多个螺旋促进氨基酸，(ii)与其来源基本序列相应位置相比添加多个带电的氨基酸，以及(iii)改善的生物活性的合成肽来例证说明合成肽。本发明所述的合成肽不是SEQ ID NOs：96-98中的任何一个。优选的合成肽可用于排除除该优选合成肽之外的合成肽。
在另一个实施方案中，除其中产生取代的基本序列之外，本发明所述的合成肽可进一步包括一个或多个：在从该合成肽来源的基本序列的N-末端(例如，在相应的N-末端氨基酸)添加附加的1至大约20个氨基酸；在从该合成肽来源的基本序列的N-末端(例如，N-末端和向内的)缺失大约1至10个氨基酸；在从该合成肽来源的基本序列的C-末端(例如，在相应的C-末端氨基酸)添加附加的1至大约20个氨基酸；以及在从该合成肽来源的基本序列的C-末端(例如，C-末端和向内的)缺失大约1至10个氨基酸。这个实施方案的例证说明包括但不限于，SEQ ID NOs：14-23、37-49、63、64、66、68、69、72-75、78、80和88。
为了举例说明本发明的目的，基本序列(SEQ ID NOs.2、3和4)共享下列氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：
WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL
在一个实施方案中，与其来源的基本序列相比，合成肽包括添加多个螺旋促进氨基酸替换该基本序列中存在的氨基酸(例如，较少螺旋倾向、或带电氨基酸)以产生具有改善生物活性的合成肽。
这种取代的实例包括如下：其中氨基酸位置下的“h”表明加入螺旋促进氨基酸代替SEQID NO：3的相应氨基酸位置中带电氨基酸(例如，谷氨酸)或较少螺旋倾向的氨基酸(包括但不限于被认为没有螺旋倾向的氨基酸)。
就实施例(b)-(d)而论，该合成肽具有至少包括一个七肽中“a”位置和不同(优选相邻的)七肽中“d”位置的两个或多个取代而与该合成肽来源的基本序列相比，令人惊讶地产生改善的生物活性。更优选地，用螺旋-促进氨基酸取代的基本序列“a”和“d”位置的总数是2至5的范围。在优选的实施方案中，螺旋促进氨基酸是亮氨酸或异亮氨酸，或亮氨酸和异亮氨酸的组合，与该合成肽来源的基本序列相比，形成1至3个附加的亮氨酸拉链状基序。
在另一个实施方案中，本发明所述的合成肽与由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的基本序列相比具有多个附加的氨基酸(例如，取代氨基酸)，其包括但不限于下列中的任何一个或多个；其中氨基酸位置下“c”表明加入带电氨基酸代替SEQ ID NO：3的相应氨基酸位置的不带电氨基酸，来与适当空间间隔的相反电荷氨基酸(即，与加入氨基酸的电荷相反)形成离子对；而该氨基酸位置下“h”表明加入螺旋促进氨基酸代替SEQ ID NO：3的相应氨基酸位置中的带电氨基酸(例如，谷氨酸)或较少螺旋倾向的氨基酸(包括但不限于被认为没有螺旋倾向的氨基酸)。
*表示可用螺旋促进氨基酸或带电氨基酸替换的氨基酸位置。
用带电(其中“+”表示带正电的，而“-”表示带负电的)氨基酸(以“c”标明)取代后可在该氨基酸位置形成离子对的实例包括但不限于下列中的任何一个或多个。
因此，在优选的实施方案中，本发明所述的合成肽(当与其来源的基本序列相比时)具有的氨基酸序列，具有：(a)不少于2个螺旋促进氨基酸，且不多于14个螺旋促进氨基酸，其所在位置是在缺乏螺旋促进氨基酸的基本序列的相应位置；以及(b)不少于2个带电氨基酸，且不多于10个带电氨基酸，其所在位置是在缺乏带电氨基酸的基本序列的相应位置。
B.螺旋度
螺旋度是生物物理学参数。如通过圆二色光谱(在此参见实施例1)所评估的，由基本序列组成的肽的螺旋度一般是大约9％至大约10％的范围。本发明所述的合成肽一般具有大约25％至大约100％范围，且优选大约48％至大约85％范围的螺旋度。
C.大小
本发明所述的合成肽可包括长度不少于大约15个氨基酸且不多于大约60个氨基酸残基，以及优选长度不少于28个氨基酸且不多于大约38个氨基酸的序列。本发明所述的合成肽来源于(例如，包括至少连续氨基酸残基的连续序列)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4中任何一个或多个，或其部分，其中在该合成肽中包含不同于(氨基酸取代)该合成肽来源的基本序列相应位置中的一些氨基酸。已经发现该氨基酸序列中的差异(合成肽中的与其来源的基本序列的相比)影响在此更详细描述的生物物理学(例如，螺旋度和稳定性)和生物学(例如，抗病毒)参数。该合成肽与其来源的基本序列相比可进一步包括一个或多个保守置换。如在此更详细描述的，本发明所述的合成肽可进一步包括高分子载体。
D.改善的生物活性
本发明所述的每个合成肽的重要特性是显示改善的生物活性。由于下列理由该改善的生物活性是意料不到的。迄今为止对于抗逆转录病毒试剂的种类(通常关于作用机制的种类)，例如逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，简单的病毒突变(仅在一个或多个氨基酸残基)可导致抗逆转录病毒种类对这种病毒突变体的效力(″抗性″)减少或丢失。例如，特别在HIV-1逆转录酶指状亚结构域的密码子(例如，在密码子69或密码子151)中的单个突变，与对全部核苷逆转录酶抑制剂的广泛交叉抗性有关。虽然非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)可以是化学互异的，单个突变(在被认为处于逆转录酶的疏水凹槽或NNRTI结合部位的第103位氨基酸)导致对NNRTIs的广泛交叉抗性。不管该蛋白酶抑制剂(PIs)的结构多样性，HIV-1毒株已经显现出具有对这个种类的全部成员的交叉抗性。更特别地，该HIV蛋白酶中有限数目的突变(例如，在第10和90位氨基酸的独立组合取代，并且也存在其他的突变)导致对PIs的广泛交叉抗性。因此，本领域的技术人员将预料到gp41氨基酸序列(例如，在HR1区域中)中单个或有限数目的突变可赋予对来源于HIV gp41的广泛种类融合抑制剂肽(例如，包括本发明所述的合成肽)的抗性。因此，意料不到的结果是来源于HR2区域并且已经根据本发明在该氨基酸序列中进行改变的合成肽可表现针对使得该病毒抵抗来源于HIV gp41天然序列的肽的病毒突变体的改善生物活性(即，增加的抗病毒效力)。例如，当针对抗来源于HIV gp41天然序列的肽(例如，基本序列、或T20(SEQ ID NO：1))的病毒时，本发明所述的合成肽包括意料不到的，改善的生物活性，其显示IC50小于或等于0.3μg/ml，并且优选地小于0.10μg/ml。因此，本发明所述的合成肽不是由SEQ ID NOs：96、97或98中任何一个组成的。
另外，在优选的实施方案中，本发明所述的合成肽与该合成肽来源的基本序列相比，针对抗来源于HIV-1gp41天然序列的肽(例如，该合成肽来源的基本序列)的病毒具有增加的抗病毒活性，并且具有改善的药物代谢动力学特性。例如，如利用在此描述的方法所测量的，就由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的基本序列而言，清除值(为L/K/hr)各自大于0.30。为了比较的目的并且利用相同的测量方法，本发明所述的合成肽可具有大约0.005至大约0.07的清除值(表示为L/K/hr)。因此，优选地以不少于30％的清除率减少来举例说明改善的药物代谢动力学性质。在另一实施例中，就由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的基本序列而论，如利用在此描述的方法所测量的，生物半衰期(在此也定义为“终末消除半衰期”或“t”；表示为小时(hr)或其分式)各自小于0.50hr。为了比较的目的并且利用相同的测量方法，本发明所述的合成肽可具有大约3hr至大于20hr范围的生物半衰期。因此，以不少于5倍增加的生物半衰期例证说明该合成肽的改善药物代谢动力学特性；优选地，不少于10倍增加的生物半衰期；以及更优选地不少于30倍增加的生物半衰期。
E.稳定性
稳定性是本领域已知的蛋白质和肽的生物物理学参数。存在本领域技术人员已知的用于测定稳定性的不同方法。在优选的实施方案中，本发明所述的合成肽由大约25℃至大约75℃范围的熔解温度(“Tm”)表示的稳定性，以及更优选为大约36℃至大约65℃。
如在此更详细描述的，合成肽可进一步包括选自一个或多个反应官能团的组分(例如，在C-末端，或N-末端，或其组合(同时在C-末端和N-末端))，药物学上可接受的载体，高分子载体及其组合。
在下列不是旨在限制的实施例中举例说明本发明。
实施例1
在下列实施例中，评估多种生物物理学参数和生物学参数。用于测定这些参数的通常方法学如下。
在肽合成仪上，利用标准的固相合成技术并利用标准的FMOC肽化学合成肽，包括合成肽和基本序列。在这个实施例中，该合成肽可进一步包括反应官能团；即大多数通过乙酰基在N-末端阻断和/或通过酰胺基在C-末端，或在N-末端或C-末端包括接头。从树脂切割下来后，沉淀该肽，并且冻干该沉淀物。然后利用反相高效液相色谱法纯化该肽；用电喷射质谱分析法证实肽的身份。
通过圆二色光谱(“CD”)如下评估螺旋度。简要地，利用装有热电温度控制器的光谱仪获得圆二色性谱。在25℃，以0.5纳米(nm)分级200至260nm，带宽1.5nm，和4秒/级的典型平均时间获得光谱。减去细胞/缓冲液空白后，利用符合保守窗口大小以产生随机余数的三级最小平方多项式(using a third-order least-squares polynomial fit with a conservativewindow size to give random residuals)使光谱平滑。利用标准方法将原始的椭圆率值转换为平均剩余椭圆率，并且以波长(200至260nm)对[θ]×10-3(度cm2/dmol)作图。然后利用标准方法计算螺旋度百分数值(通常表示为在10μM，25℃的螺旋度百分数)。通过监测当温度随1分钟平衡时间，逐步升高2℃，CD信号在222nm的变化进行热稳定性的评估。如由Tm值所代表的每个样品(例如合成肽)的稳定性，是相当于第一个衍生物热转化的最大值的温度。
在确定本发明所述合成肽的抗病毒活性中(例如，一个量度是抑制HIV传递至靶细胞的能力)，使用体外测定，其通过利用来源于HIV gp41的HR区域的肽产生的数据已经显示在体内观察到的抗病毒活性的预兆。更特别地，利用体外感染性测定观察到的抗病毒活性(“Magi-CCR5感染性测定”；参见例如，美国专利号6,258,782)已经显示与在体内针对相同HIV gp41来源的肽所观察到的抗病毒活性相当有关联(参见例如，Kilby et al.，1998，NatureMed.4：1302-1307)。使用指示细胞系MAGI或表达衍生cMAGI的CCR5记录这些测定中感染性病毒滴定度的减少。两个细胞系都利用HIV-1反式活化(transactivate)由HIV-LTR驱动的β-半乳糖苷酶报告基因表达的能力。已经改变β-gal报告子以定位在核中，并且可在感染几天内用X-gal底物通过强烈的核染色来检测。因此如果在染色前只有一轮感染，可将染色的核的数目解释为等于被攻击的接种物中感染性病毒体的数目。利用CCD-成像计数感染细胞，并且初级的和实验室改变的分离物都显示，病毒输入和由目测的感染细胞数目之间的线性关系。在MAGI和cMAGI测定中，感染性滴定度减少50％(Vn/Vo＝0.5)是显著的，并且提供用于评估抗病毒活性的初级截断值(“IC50”定义为导致感染性病毒滴定度减少50％的活性成分的浓度)。将用于测试抗病毒活性的肽稀释成为不同的浓度，并且一式两份或三份地针对HIV接种物进行测试调节至产生48孔微量滴定板中大约1500-2000个感染细胞/孔。将该肽(以各自的稀释度)加入cMAGI或MAGI细胞，然后是病毒接种物；24小时后，加入感染抑制剂和细胞-细胞融合抑制剂(例如，T20)，以防止第二轮的HIV感染和细胞-细胞病毒传播。培养该细胞2天以上，然后用X-gal底物固定染色以检测HIV-感染的细胞。用CCD-成像测定各个对照和肽稀释物的感染细胞数目，然后计算IC50(表示为μg/ml)。
可利用标准的实验室方法生产抗由基本序列组成的肽的抗病毒活性的病毒。基本上，计算IC50和IC90后，培养物(包括此后细胞分裂)中细胞与病毒和肽混合(例如，在接近于IC90的浓度)。保持和监测该培养物直到出现合胞体。从第一轮培养物收获的病毒用于在第二轮培养物中感染细胞，其中该肽存在的浓度高于用于第一轮培养物的浓度(2至4倍)。保持第二轮培养物并监测抗该肽的抗病毒活性病毒的存在。可能需要后续轮的培养物最终产生抗该肽抗病毒活性的病毒分离物(以针对这种分离物的预确定水平IC50的肽)。
为了测定药物代谢动力学特性，将合成肽或合成肽来源的基本序列静脉内给药于短尾猴(Macaca fasicularis)(如本领域已知的，其他的动物模型也可用于测定药物代谢动力学特性)。在给药后的不同时间，提取血样并通过离心作用分离血浆。冷冻储存血浆样品直到通过LC-MS以电喷射、阳离子模式进行分析(液体色谱/质谱测定法)。用在10mM乙酸铵，pH6.8缓冲液中的梯度乙腈从C18HPLC柱洗提合成肽或基本序列。在分析的时候，用包含0.5％甲酸的两或三体积的乙腈除蛋白。同时制备短尾猴血浆样品中的双份刻度标准，因为该样品和分析前后的样品包含合成肽或基本序列。利用单指数或二指数的数学模型从血浆浓度-时间数据计算药物代谢动力学特性。通过非线性最小平方法优化导出模型。使用浓度的1/C2加权。使用下列等式计算血浆浓度对时间曲线下的面积(AUC)、全身清除率(Cl)，和终末消除半衰期(t)。
AUC＝A/-a+B/-b
其中A和B是截距，a和b是分别描述分布和消除阶段的指数方程的速率常数。当使用单指数模型时，剔除“A”和“a”特性。
Cl＝剂量/AUC (表示为L/K/hr)
t＝-0.6903/b (表示为hr)
实施例2
在本发明所述的一个实施方案中，合成所述的合成肽，除了与其氨基酸序列来源的基本序列相比，增加多个包括一个或多个螺旋促进氨基酸的氨基酸。通过具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的合成肽所举例说明的，合成本发明所述的合成肽以包括涉及由SEQ ID NO：4组成的基本序列的多个螺旋促进氨基酸取代。参考表1，本发明所述的合成肽与具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的基本序列肽比较，利用此处实施例1中所描述的方法论测定的生物物理学参数和生物参数。在通过抗病毒活性评估确定生物活性中，利用抗具有SEQ ID NO：2或SEQID NO：4基本氨基酸序列的肽的抗病毒活性的病毒突变体(在表1和随后的表格中该抗病毒的分离物指定为“RY”)。
参考表1，与其来源的HR2天然序列的肽(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4基本序列中的任何一个)相比，本发明所述的合成肽：(a)表现螺旋度增加(例如，增加大约3倍至大约5倍或更大的范围)；和(b)表现抗病毒活性，对抗具有任何一个基本序列(例如，SEQID NOs：2或4)的肽的病毒(例如，病毒分离物HIV RY)的意料不到的、改善的生物活性显著增加。
表1：生物物理学和生物学(抗病毒活性)参数
| SEQ ID NO： | 螺旋度(％) | Tm(℃) | 抗病毒活性HIV-IIIB IC50 | 抗病毒活性HIV-RY IC50 |
| 2 | 9 | ＜10 | ＜0.10 | ＞4.0 |
| 4 | 10 | ＜10 | ＜0.10 | ＞4.0 |
| 5 | 51 | ＞20 | ＜0.10 | ＜0.30 |
| 82 | 11 | ＞10 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 84 | 18 | ＞15 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 85 | 91 | 45 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 86 | 66 | 30 | ＜0.10 | ＜0.30 |
| 87 | 11 | ＜0.10 | ＜0.10 |
实施例3
在另一个实施方案中，生产的合成肽包括加入包含螺旋-促进氨基酸和带电氨基酸(以形成多个离子对)的氨基酸来代替存在于基本序列SEQ ID NOs：2-4中任何一个或多个中的氨基酸。为了例证说明，利用此处实施例1中列出的方法来生产和评估通过具有SEQ ID NOs：6-81，和83-95中任何一个的氨基酸序列举例说明的合成肽。参考表2，利用在此处实施例1中先前详细描述的方法，使这些合成肽与来源于HR2区域的天然序列的肽(基本序列，ID NO：4)相比，并且相对于具有单独由i，i+4排列(即，没有加入任何螺旋-促进氨基酸)组成的取代的肽，例如SEQ ID NOs：96-98比较生物物理学参数和生物参数。
表2：生物物理学和生物学(抗病毒活性)参数
| SEQ ID NO： | 螺旋度(％) | Tm(℃) | 抗病毒活性HIV-IIIB IC50 | 抗病毒活性HIV-RY IC50 |
| 4 | 10 | 10 | ＜0.10 | ＞4.0 |
| 6 | 72 | 38 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 7 | 45 | 25 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 8 | 74 | 48 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 9 | 75 | 56 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 10 | 67 | 48 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 11 | 65 | 42 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 12 | 73 | 45 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 13 | 83 | 57 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 14 | 90 | 62 | ＜0.20 | ＜0.30 |
| 15 | 87 | 59 | ＜0.20 | ＜0.30 |
| 16 | 66 | 41 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 17 | 59 | 43 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 18 | 65 | 47 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 19 | 59 | 42 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 20 | 60 | 44 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 21 | 64 | 45 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 22 | 67 | 46 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 23 | 56 | 41 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 24 | 71 | 40 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 25 | 89 | 42 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 26 | 82 | 38 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 27 | 88 | 59 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 28 | 68 | 39 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 29 | 82 | 42 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 30 | 78 | 43 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 31 | 54 | 29 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 32 | 61 | 31 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 33 | 63 | 34 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 34 | 69 | 36 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 35 | 6 | ＜10 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 36 | Agg | Agg | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 37 | 80 | 43 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 38 | 65 | 49 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 39 | 78 | 44 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 40 | 68 | 42 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 41 | 96 | 65 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 42 | 97 | 64 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 43 | 92 | 65 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 44 | 55 | 37 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 45 | 61 | 39 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 46 | 70 | 41 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 47 | 73 | 42 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 48 | 65 | 39 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 49 | 63 | 37 | ＜0.10 | ＜0.50 |
| 50 | 90 | 59 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 51 | 97 | 65 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 52 | ＞99 | 72 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 53 | 94 | 59 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 54 | 95 | 75 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 55 | 57 | 25 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 56 | 57 | 28 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 57 | 73 | 39 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 58 | 88 | 41 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 59 | 89 | 46 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 60 | 78 | 46 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 61 | 41 | 25 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 62 | ＜0.10 | ＜0.10 | ||
| 63 | 65 | 38 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 64 | 91 | 41 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 65 | 38 | ＜0.10 | ＜0.20 | |
| 66 | 99 | 57 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 67 | 95 | 43 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 68 | 73 | ≤0.10 | ＜0.20 | |
| 69 | 77 | ＜0.10 | ＜0.10 | |
| 70 | 58 | 36 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 71 | 84 | ＜0.10 | ＜0.10 | |
| 72 | ＜0.10 | ＜0.10 | ||
| 73 | ＜0.10 | ＜0.20 | ||
| 74 | ≤0.10 | ＜0.20 | ||
| 75 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 76 | ＜0.10 | ＜0.10 | ||
| 77 | 67 | 40 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 78 | ＜0.10 | ＜0.10 | ||
| 79 | 72 | 38 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 80 | 80 | 61 | ≤0.10 | ＜0.20 |
| 81 | 91 | 46 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 83 | 34 | 11 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 88 | ＜0.10 | ＜0.10 | ||
| 89 | 89 | 44 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 90 | 80 | 44 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 91 | 95 | 69 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 92 | 97 | 73 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 93 | 93 | 70 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 94 | 96 | 83 | ＜0.10 | ＜0.20 |
| 95 | 90 | 53 | ＜0.10 | ＜0.10 |
| 96 | 17 | ＜10 | ＜0.10 | ＞2.0 |
| 97 | 37 | ＜10 | ＜0.10 | ＞0.50 |
| 98 | 47 | 23 | ＜0.10 | ＞1.0 |
Agg-凝聚的
参考表2，与其来源的HR2天然序列的肽(例如，基本序列SEQ ID NOs：2-4中任何一个)相比，本发明所述的合成肽表现抗病毒活性，对抗具有基本序列(例如，SEQ ID NOs：2或4)中任何一个的肽的病毒(例如，病毒分离物HIV RY)的出乎意料的、改善的生物活性显著增加。另外，合成肽与基本序列中的任何一个(例如，SEQ ID NOs：2或4)相比可进一步表现螺旋度增加(例如，范围为大约3倍到大约5倍或更大)。
参考表2和另一个优选方案，与其来源的HR2天然序列的肽(例如，基本序列SEQ IDNOs：2-4中的任何一个)相比，本发明所述的合成肽另外(例如除表现螺旋度增加和意料不到的、改善的生物活性之外)并且优选表现如例如通过大约25℃至大约75℃，以及更优选大约36℃至大约65℃范围的Tm来测量的稳定性。
表1和表2证明本发明所述的合成肽的意料不到的、改善的生物活性，这可通过(a)确定该合成肽对表现抗该合成肽来源的基本序列活性的HIV毒株的抗病毒活性；和(b)证明该合成肽具有如通过对表现抗该合成肽来源的基本序列活性的HIV毒株为小于0.10μg/ml的IC50测量的抗病毒活性的来评估。在这种意料不到的生物活性的另一个证明中，本发明所述的合成肽用于试图在体外产生抗病毒。因此例如，表明更难产生抗合成肽的病毒是这种合成肽与来自HR2和/或基本序列的天然序列相比具有意料不到的、改善的生物活性的这种合成肽的证据。
利用实施例1中列出的方法，具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10氨基酸序列的合成肽在设计产生抗HIV的实验中与具有SEQ ID NO：2基本序列的肽相比较。在一组实验中，在存在单独的合成肽或基本序列时，传代HIV-感染细胞的体外培养物以努力达到生成HIV分离物的端点，其中该HIV分离物在与HIV-感染细胞一起培养的肽浓度为10μg/ml至20μg/ml时是有抗性的。因此一般地，从该合成肽或基本序列浓度在其IC50和IC90之间开始，体外培养该HIV-感染细胞，并且在分裂期间每隔2至3天加入合成肽或基本序列，以在存在恒定和一致数量的合成肽或基本序列时维持HIV-感染细胞。当在低水平浓度的合成肽或基本序列产生抗性分离物时(如通过细胞病理效果/合成形成所测量的；被认为是一个传代)，用产生自该传代物的抗性分离物感染细胞，然后在存在高浓度(例如，2至3倍的用于先前传代的浓度)的合成肽或基本序列时培养该细胞直到产生抗性的分离物。重复这个方法直到获得终点。确定需要达到终点的培养中的传代数目和天数(每个成功传代(产生有活力的病毒)中的天数，然后将全部成功传代的天数总计在一起)。对于每个举例说明的基本序列或合成肽平均结果。如表3所示，出乎意料地，为了产生表示终点的抗性HIV分离物，与基本序列相比，在存在本发明的合成肽时需要(如果完全获得)明显更多的传代(表3，“传代#”)和传代中的天数(表3，“天数#”)。表3中的结果是通过合成肽与该合成肽来源的基本序列相比所证明的意料不到的、改善的生物活性的另一个指标。
表3-体外抗性的生成
| SEQ ID NO： | 平均#传代 | 平均#天数 |
| SEQ ID NO：2 | 15 | 115 |
| SEQ ID NO：9 | 19 | 188 |
| SEQ ID NO：10 | ＞20NA | ＞200NA |
“NA”是指未获得终点。
实施例4
这个实施例中例证说明了本发明所述的合成肽与该合成肽来源的基本序列相比有改善的药物代谢动力学特性。利用如先前在实施例1中详细描述的用于评估药物代谢动力学的方法，表4例证说明将合成肽代表物的药物代谢动力学性质与由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3组成的基本序列的药物代谢动力学性质相比。
表4
| SEQ ID NO： | 清除率(L/K/hr) | 半衰期(t；hr) |
| 2 | ＞0.4 | ＜0.5 |
| 3 | ＞0.3 | ＜0.5 |
| 10 | ＜0.05 | ＞5.0 |
| 11 | ＜0.05 | ＞5.0 |
| 50 | ＜0.10 | ＞3.0 |
| 51 | ＜0.05 | ＞15.0 |
| 52 | ＜0.05 | ＞10.0 |
| 53 | ＜0.05 | ＞5.0 |
| 54 | ＜0.01 | ＞20.0 |
如表4中举例说明的，合成肽与其来源的基本序列相比，如在一个或多个药物代谢动力学性质(例如，在清除率或t中，或两者皆是)显示药物代谢动力学性质有明显的改善。优选地，以不少于30％的清除率减少来例证说明改善的药物代谢动力学性质。优选地，通过不少于5倍的生物学半衰期增加，优选不少于10倍的生物学半衰期增加，以及更优选不少于30倍的生物学半衰期增加，来例证说明合成肽的改善的药物代谢动力学性质。
实施例5
本发明提供本发明所述的合成肽，其具有如通过其能够抑制HIV传递(包括，意料不到的，对该合成肽来源的基本序列有抗性的分离物)至靶细胞(例如，参见表1和表2)证明的抗病毒活性。另外，提供本发明所述的合成肽的用途。例如，本发明所述的合成肽可用作HIV感染治疗中的活性治疗物质。本发明所述的合成肽也可用来制造用于包括HIV治疗的治疗应用的药物。另外，本发明所述的合成肽可用于HIV的治疗，包括其治疗学应用(例如，在治疗的个体中减少HIV的病毒负载，和/或增加CD4+细胞群)。在一个实施方案中，治疗HIV感染个体的方法包括给予该个体有效治疗该个体或以获得所需要的治疗学应用的适量合成肽(包括其中该合成肽为活性治疗物质的组合物/药物)。就后者而论，在用该合成肽治疗前，从临床样品获得基准值(来自病毒负载参数和/或CD4+细胞计数的测量)。在用合成肽开始治疗后获得一个或多个临床样品，并且从这种样品测量参数(“测试值”)。比较该基准值和测试值以确定是否从使用合成肽的治疗获得所需要的治疗学应用(例如，测试值和基准值之间的差异可能是获得所需要的治疗学应用的指标)。
在另一个实施方案中，提供抑制HIV传递至靶细胞的方法，包括向病毒和细胞加入有效抑制该细胞被HIV感染的适量的本发明所述的合成肽。在另一个实施方案中，提供抑制HIV传递至细胞的方法，包括在存在细胞时使病毒接触有效抑制该细胞被HIV感染的适量的本发明所述的合成肽。另外，提供抑制HIV融合的方法(例如，在HIV感染靶细胞期间，HIV gp41介导病毒膜和细胞膜融合的过程)，包括在存在细胞时使病毒接触有效抑制HIV融合的适量的本发明所述的合成肽。这些方法可用来治疗HIV-感染的个体(治疗性地)或治疗最近暴露于HIV或处于暴露于HIV的高风险的个体(例如，通过药物滥用或高风险的性行为)(预防性地)。因此例如，就HIV-1感染的个体来说，有效量是足够(单独和/或结合剂量服法)减少HIV病毒加载至正被治疗的个体的剂量。如本领域技术人员已知的，存在用于测量HIV病毒负载的几个标准方法，包括但不限于定量培养外周血液单核细胞，血浆HIV RNA测量，以及通过涉及利用本领域已知标准方法的核酸扩增的定量法来测量病毒核酸。用于确定CD4+细胞水平的方法(“CD4+细胞计数”)是本领域的标准。这种方法包括但不限于，流式细胞光度术、免疫测定、磁性分离然后是细胞计数、免疫细胞化学和免疫染色。用于表现出HIV感染和AIDS不同阶段的HIV病毒负载和CD4+细胞计数的标准是本领域已知的。这种标准的一个来源是疾病控制中心。
本发明的合成肽可以单个给药、间歇地、周期地、或连续地给药，这可通过开业医师利用例如监测病毒负载和/或合成肽的血液水平的方法来确定。根据包含合成肽的制剂，以及该合成肽是否进一步包括高分子载体，本发明所述的合成肽可一次给药或每日多次给药，或在一周期间周期给药，或在一个月期间周期给药。进一步地，本发明所述的合成肽当用作包含一个或多个用于治疗HIV的附加抗病毒药物的组合物或治疗方式中的成分时(例如，当同时使用，或随一个药物循环上去而随另一个药物循环脱离时)，可显示抑制HIV传递至靶细胞的协同结果或增加的治疗学益处，其中所述的附加抗病毒药物包括但不限于，如本领域已知的HIV进入抑制剂(例如，其他HIV融合抑制剂(T20、T1249等)、CCR5抑制剂、逆细胞周期蛋白(retrocyclins)等)、HIV整合酶抑制剂、逆转录酶抑制剂(例如，核苷或非核苷)、蛋白酶抑制剂、病毒特异的转录抑制剂、病毒加工抑制剂、HIV成熟抑制剂、尿嘧啶核苷磷酸化酶的抑制剂、HIV疫苗等。
例如，在一个优选的实施方案中，可使用包括一个或多个本发明所述的合成肽的抗病毒剂的组合，从而增加治疗的效力，减轻病毒对抗病毒药物变得有抗性的能力。可从目前已被批准或将被批准的有效量的抗病毒剂(对治疗HIV感染有用)制备组合物，其包括但不限于，阿巴卡韦、AZT、delaviridine、ddC、ddI、依法韦仑、FTC、GS 840、HBY097、3TC、奈韦拉平、d4T、FLT、恩曲他滨、amprenivir、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、印地那韦、那非那韦、PNU-140690、利托那韦、沙奎那韦、替利那韦、替诺福韦、阿德福韦、阿扎那韦(atazanavir)、洛匹那韦、VX 478、PRO-542，和桦木醇和二水合桦木醇衍生物(例如，PA-457)。这些可用于与本发明所述的合成肽组合的例证性抗病毒剂的有效剂量是本领域已知的。这种组合可包括能够根据给药途径和所需要的药理学效应而通过一种或多种途径、顺序或同时给药的许多抗病毒剂，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
被施用的本发明合成肽的有效剂量可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过测定效力、生物半衰期、生物利用率和毒性来确定。在优选的实施方案中，通过本领域技术人员，利用来自本领域技术人员已知的体外途径和体内研究的数据来确定有效的合成肽剂量范围。例如，抗病毒活性的体外感染测定，例如在此所描述的，使本领域的技术人员能够确定为阻断一些数量的病毒感染性所必需的合成肽的平均抑制浓度(IC)(例如，50％抑制，IC50；或90％抑制，IC90)。因此本领域的技术人员可利用来自一个或多个标准动物模型的药物代谢动力学数据选择适当的剂量，以便获得等于或大于预先确定的IC值的肽的最小血浆浓度(C[min])。虽然剂量范围一般取决于所选择的给药途径和剂量配制，本发明所述的合成肽的例证性剂量范围可以是不小于0.1μg/kg体重到不大于10mg/kg体重的范围；优选大约0.1-100μg/kg体重的剂量范围；以及更优选，大约10mg至大约250mg合成肽之间的剂量。例如，如果本发明所述的合成肽进一步包括导致合成肽在血液中比单独的合成肽保持更长时间活化的高分子载体(即，获得更长循环的血浆浓度)，与不包含高分子载体的制剂中合成肽的数量相比，该剂量中合成肽的数量可被减少，和/或比不包含高分子载体的制剂更少频繁地给药。
本发明的组合物，包括药物(例如，优选具有一个或多个药物学上可接受的载体和高分子载体的合成肽)可以使活化剂能够到达靶细胞(可被HIV感染的细胞)的任何方式被施用于个体。因此，本发明的组合物可通过任何合适的技术被施用，包括口服、肠胃外的(例如，肌内的、腹膜内的、静脉内的、或皮下注射或输液、皮内的、或植入)、鼻部的、肺部的、阴道的、直肠的、舌下的、或局部途径给药，并且可配制为适于各个给药途径的剂型。该特异的给药途径可依赖于例如，个体的病史，包括来自这种给药的任何感觉的或预期的副作用，以及正被施用的合成肽的配方(例如，该合成肽可进一步包括的药物学上可接受的载体和/或高分子载体的特性)。最优选地，给药是通过注射(利用，例如静脉内的或皮下的方式)，而且还可以通过连续输液(利用，例如缓释装置或例如渗透泵的小型真空泵等)。制剂可包括本发明所述的合成肽，其进一步包括一个或多个药物学上可接受的载体和高分子载体；并且可进一步取决于递送的位点、给药的方法、给药的时间表，及开业医师已知的其他因素。优选的制剂是其中本发明所述的合成肽进一步包括或与一个或多个特别是在其被给予个体后，抑制或延缓或延迟合成肽的新陈代谢/降解的试剂、药物、反应官能团、高分子载体、或药物学上可接受的载体组合。例如，其中本发明的合成肽受酶(例如，吸收前的消化酶、存在于血液中的蛋白水解酶等)保护而免于水解的可注射制剂、缓释剂型，和口服制剂在此也包括在内。另外，制剂可包括如此处详细描述的编码本发明所述合成肽的核苷酸序列，当其被施用时，利用本领域已知的技术和表达载体在令人感兴趣的细胞中被表达。
实施例6
对本领域技术人员显而易见的是，根据本发明所述合成肽各自的氨基酸序列，编码这种合成肽的多核苷酸可被合成或构建，并且这种合成肽可通过重组DNA技术的方法而被生产，作为制造方式和/或(例如，通过体内导入这种多核苷酸进行体内生产而作为基因或细胞治疗的方式)用于抑制HIV传递至靶细胞的方法。对本领域的技术人员显而易见的是，多于一个的多核苷酸序列可编码本发明所述的合成肽，而且这种多核苷酸可根据已知编码该合成肽氨基酸序列的氨基酸的三联密码子、三碱基简并性，和选择其中需要表达的宿主细胞(例如，原核或真核的、物种等)偏好的三联密码子使用率而被合成。只为了例证说明的目的，而不是为了限制，提供的SEQ ID NO：99是编码SEQ ID NO：2、基本序列的多核苷酸，对本领域的技术人员显而易见的是，密码子使用率通常适用于本发明合成肽的编码多核苷酸。因此，例如，利用与SEQ ID NO：2有关的SEQ ID NO：99，本领域的技术人员可容易地构建编码SEQ IDNO：5的多核苷酸(参见例如，作为说明性实施例的SEQ ID NO：100)。同样地，作为另一个实施例，本领域的技术人员从这些信息可容易地构建编码SEQ ID NO：11的多核苷酸(参见例如，作为说明性实施例的SEQ ID NO：101)。然而，可理解不同的密码子能够被取代为相同氨基酸的密码子而作为起始密码子。进一步地，对本领域的技术人员显而易见的是，密码子使用率可能在用于细菌表达的偏好密码子使用率，或在哺乳动物表达系统中表达的偏好密码子使用率之间略有不同。在优选的实施方案中，编码本发明所述的合成肽的多核苷酸包括编码选自下列合成肽的核酸序列：SEQ ID NOs：5-98、或与SEQ ID NOs：5-98中任何一个或多个具有至少(例如，不少于)90％同一性的氨基酸序列，并且该氨基酸序列与基本序列的不同在于(i)与该合成肽来源的基本序列中相应氨基酸位置相比加入多个螺旋促进氨基酸，或与该合成肽来源的基本序列中相应氨基酸位置相比加入多个螺旋-促进氨基酸，并且与其来源的基本序列相应的位置相比，加入多个带电氨基酸，以及(ii)意料不到的、改善的生物活性。
在一个实施方案中，提供包含编码本发明所述合成肽的多核苷酸的原核表达载体，及其用于重组生产合成肽的用途。在一个实施例中，该多核苷酸可位于原核表达载体中，使得当在细菌宿主细胞中生产合成肽时，其产生为具有帮助该合成肽纯化的融合蛋白质。例如、存在本领域技术人员已知的、作为具有需要表达的融合蛋白质一部分的序列，其中该序列帮助生产在用于表达的原核细胞的细胞质中存在的包涵体和/或帮助包含这种序列的融合蛋白质纯化。可通过本领域已知的方法，包括变性剂和分馏法(例如，离心、柱色谱法等)从其他的原核细胞成分分离包涵体。在另一个实施例中，存在被插入令人感兴趣的可表达为蛋白质或肽的所需要核酸序列的商业购买载体，使得当表达时，该基因产物也包含多个可利用本领域的方法标准来纯化该基因产物的末端组氨酸残基(“His标记”)。
对本领域技术人员显而易见的是，编码本发明所述合成肽的核酸序列可被插入质粒或除质粒外的载体，可被使用的其他表达系统包括但不限于，用噬菌体载体转化的细菌、或柯斯质粒DNA；包含酵母载体的酵母；包含真菌载体的真菌；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系；和其中已经被导入(例如，被转染)质粒或病毒表达载体的哺乳动物细胞系，或用重组病毒(例如牛痘病毒、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒等)感染的哺乳动物细胞系。该合成肽的成功表达需要包括该合成肽的编码序列或该载体本身的重组DNA分子，包含与用于表达的特定宿主系统相容并被其识别的、为转录和翻译所必需的调控元件。利用分子生物学领域已知的方法，包括如上所述的方法，可将不同的启动子和增强子整合到包括该编码序列的载体或重组DNA分子中以增加该合成肽的表达，只要该合成肽的表达增加适合(例如，无毒的)所使用的特定宿主细胞系统。对本领域技术人员显而易见的是，启动子的选择可取决于所使用的表达系统。启动子的强度不同，即促进转录的能力不同。通常，为了表达克隆的基因，需要使用强启动子以便获得该基因的高水平转录和表达成为基因产物。例如，本领域已知的、在包括大肠杆菌的宿主细胞系统中已经观察到高水平转录的细菌、噬菌体或质粒启动子，包括lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、P.sub.R和P.sub.L启动子、lacUV5、ompF、bla、lpp等，都可用于提供插入的编码该合成肽的核苷酸序列的转录。通常在用于哺乳动物表达系统的表达载体中使用的哺乳动物启动子是来自哺乳动物病毒基因的启动子。实例包括SV40早期启动子、鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病毒启动子，和CMV启动子。
在合成肽的表达可能对宿主细胞是致死或有害的情况下，可选择宿主细胞株/系和表达载体以使得该启动子的作用被抑制直到受到特异地诱导。例如，在某些操纵子中，加入特异诱导物是为插入DNA的有效转录所必需的(例如，通过加入乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)；当在生长培养基中缺乏色氨酸时，trp操纵子被诱导；以及四环素可用于具有tet敏感的启动子的哺乳动物表达载体)。因此，可通过在使得控制编码序列表达的启动子不被诱导的条件下培养转化或转染的细胞，并且当细胞在生长培养基中达到合适的密度时，诱导该启动子表达编码序列来控制合成肽的表达。用于有效基因转录或信息翻译的其他调控元件是本领域已知的，包括增强子、转录或翻译起始信号、转录终止和多聚腺苷酸化序列等。
实施例7
在另一个优选的实施方案中，本发明所述的合成肽进一步包括高分子载体。这种高分子载体是本领域已知的，包括但不限于，血清蛋白(全部蛋白质、或其实质性部分)、聚合物、碳水化合物，和脂类-脂肪酸共轭物、脂肪酸等。一般用作高分子载体的血清蛋白，包括但不限于，转铁蛋白、白蛋白、免疫球蛋白(优选IgG或其一个或多个链)、或激素；其中该蛋白质优选是人蛋白质，更优选是重组的人蛋白质。一般用作高分子载体的聚合物包括但不限于，聚赖氨酸或聚(D-L-丙氨酸)-聚(L-赖氨酸)，或多元醇。优选的多元醇包括水溶性的聚(氧化烯)聚合物，并且可具有线性或分支的链。合适的多元醇包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、和PEG-PPG共聚物。
在一个实施例中，该高分子载体可被共轭至合成肽。例如，使用多元醇时，一般该多元醇被偶联剂衍生化或与偶联剂起反应以形成具有一个或多个可用于通过本领域的方法标准与合成肽的反应官能团(例如，优选游离胺基)反应的末端反应基的“活化”多元醇。这种反应基可包括但不限于，羟基、氨基、醛基等。所使用的多元醇可包括直链或支链的聚合物。在另一个实施例中，合成本发明所述的合成肽，该合成过程的最后步骤是加入马来酰亚胺基团(例如，通过加入3-马来酰亚胺丙酸(3-maleimidoproprionic acid)的固相合成步骤、洗涤、然后从树脂切割下包含马来酰亚胺基团的合成肽)。这种方法是本领域已知的(参见例如，WO 00/69902)。然后该合成肽可被施用(优选肠胃外地)至个体以使得该合成肽共轭至例如血液成分(优选，血清蛋白、以及更优选白蛋白)的高分子载体。在另一个实施例中，重组的人蛋白质(例如，白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白等)可以是带电荷的(“阴离子化的”)，以及随后利用本领域已知的偶联剂被硫醇盐硫醇化(例如，利用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代-乙酸酯)。硫醇化的、带电荷的重组人蛋白质可利用本领域已知的标准偶连反应剂(利用m-马来酰亚胺苯酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)而与抗生物素蛋白偶连在一起。然后所得到的抗生物素蛋白酰化的人蛋白质可与先前已经利用本领域的方法标准生物素酰化的合成肽起反应。因此，得到已经与高分子载体连接的合成肽。
在备选的实施例中，高分子载体一般可随着合成肽表达；例如作为融合蛋白质的一部分表达。例如，编码白蛋白的DNA序列可与编码接头的DNA序列和编码本发明所述合成肽的DNA序列一起被克隆到载体中，使得所得到的基因产物是包括在白蛋白的C-末端、N-末端或同时在C-末端和N-末端连接有合成肽的白蛋白的白蛋白融合蛋白质。这种载体和表达系统，优选用于酵母表达的载体和表达系统是本领域已知的(参见例如，美国专利号5,728,553和5,965,386)。有用的酵母质粒载体一般是可商业购买的(例如，pRS403-406系列和pRS413-416系列)，并且可整合入酵母选择标记(例如，his3、trp1、leu2、ura3等)。包含用于酵母表达的编码白蛋白-合成肽融合蛋白质的多核苷酸的表达载体可包括表达盒，其包括：酵母启动子(例如，糖酵母PRB1启动子)；编码促进分泌表达的基因产物的分泌前导序列(例如，可以是天然人白蛋白分泌前导序列和/或酵母-来源的分泌前导序列)；编码人白蛋白的序列(例如，在Genbank中所公开的)；编码接头的序列(例如，包括5-20个氨基酸延伸，更优选包括甘氨酸和丝氨酸的氨基酸的接头)；编码合成肽的多核苷酸；和转录终止子(例如，糖酵母ADH1)。对本领域的技术人员显而易见的是，需要具有位于白蛋白融合蛋白质N-末端区域的合成肽，然后编码合成肽的多核苷酸被置于启动子和编码人白蛋白的DNA之间。然后所得到的表达载体可用于转化酵母，并且利用本领域已知的方法进行用于重组生产的培养状况，以及进行该重组产品的纯化。因此，可获得进一步包括高分子载体的合成肽。
作为说明性的实施例，生产包含本发明所述合成肽的融合蛋白质。利用本领域已知的标准方法构建的表达载体，包含编码包括麦芽糖结合蛋白(“MBP”)、可切割接头、和合成肽(SEQ ID NO：11)融合蛋白质(SEQ ID NO：103)的多核苷酸(SEQ ID NO：102)。将所得到的表达载体转化入作为宿主表达系统的E.coli菌株，并且使转化的细胞生长，然后利用本领域已知的标准方法向细菌培养物加入IPTG来诱导该细胞表达融合蛋白质。用微流化剂裂解被诱导的细菌细胞，利用本领域已知的标准方法通过离心来清除该裂解物的细菌碎片。然后利用装填有用于结合该融合蛋白质(借助于MBP部分)的直链淀粉树脂的柱子对澄清的裂解物进行色谱层析。洗涤该柱子，然后用含有麦芽糖的溶液洗提该融合蛋白。利用实施例1中所列出的方法测试包含合成肽的分离融合蛋白的抗病毒活性，显示针对HIV-1的抗病毒活性(例如，针对HIV IIIB的IC50为＜0.10μg/ml)。
为了例证说明的目的，本发明具体实施方案的上述说明已经被详细描写。鉴于本说明书和例证性说明，本领域的其他技术人员可通过应用现有知识，容易地改变和/或修改本发明来用于不同的应用而不背离基本的概念；因此，这种修饰和/或改进被确定为在所附的权利要求的意义和范围之内。
序列表
<110>特里梅里斯公司
<120>HIV gp41HR2-来源的合成肽，及其在抑制人类免疫缺陷性病毒传递的治疗中的用途
<130>TRM-007PCT
<150>60/534810
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<160>103
<170>PatentIn译文3.2
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35
<210>47
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>47
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg
35
<210>48
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>48
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu
35
<210>49
<211>33
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>49
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala
<210>50
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>50
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ile Leu Arg Glu Leu
35
<210>51
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>51
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>52
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>52
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
lle Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ile Leu Arg Glu Leu
35
<210>53
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>53
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>54
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>54
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>55
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>55
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>56
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>56
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
lle Glu Ala Ala Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>57
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>57
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Ala
35
<210>58
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>58
Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu
1 5 10 15
Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala
20 25 30
Leu Arg Glu Leu
35
<210>59
<211>37
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>59
Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu
1 5 10 15
Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala
20 25 30
Leu Arg Glu Leu Ala
35
<210>60
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>60
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Ala Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>61
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>61
Glu Thr Trp Lys Glu Trp Asp Arg Ala Ile Glu Glu Tyr Lys Lys Arg
1 5 10 15
Ile Glu Glu Leu lle Lys Ala Ala Glu Asn Gln Gln Glu Lys Asn Lys
20 25 30
Glu Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>62
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>62
Met Ala Trp Met Glu Trp Asp Arg Arg Ile Glu Ala Tyr Ala Arg Leu
1 5 10 15
Ile Ala Glu Leu Ile Ala Arg Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>63
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>63
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Gln Gln Leu Arg Glu Trp Glu Trp Phe
35 40
<210>64
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>64
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Trp Glu Trp Ile
35 40
<210>65
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>65
Thr Thr Trp Asp Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Asp Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Asp Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Asp Gln Gln Glu Lys Asn Asp
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>66
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>66
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Ala Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Trp Glu Trp Phe
35 40
<210>67
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>67
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>68
<211>52
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>68
Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Thr
1 5 10 15
Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu
20 25 30
Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala
35 40 45
Leu Arg Glu Leu
50
<210>69
<211>52
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>69
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp Ala Ser Leu
35 40 45
Trp Glu Trp Phe
50
<2l0>70
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>70
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Gln Glu Leu Arg Glu Leu
35
<210>71
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>71
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1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Ala Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>72
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>72
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1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Trp Trp Trp Trp
35 40
<210>73
<211>47
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>73
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1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu Asp Lys Trp Ser Leu Trp Arg Trp Phe
35 40 45
<210>74
<211>47
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>74
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Ala Leu Asp Lys Trp Glu Ala Leu Trp Arg Phe
35 40 45
<210>75
<211>41
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>75
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Trp Glu Trp Phe
35 40
<210>76
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>76
Leu Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>77
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>77
Thr Thr Trp Met Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>78
<211>55
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>78
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
35 40 45
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
50 55
<210>79
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>79
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Ala Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>80
<211>59
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>80
Gly Ala Lys Glu Ala Ala Gln Arg Ala Asn Ala Thr Thr Trp Glu Ala
1 5 10 15
Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Ile
20 25 30
Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu
35 40 45
Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
50 55
<210>81
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>81
Pro Ala Asn Trp Lys Ala Trp Glu Ala Gln Ile Gln Lys Tyr Gln Arg
1 5 10 15
Gln Ile Ala Glu Leu Ile Ala Asn Ala Lys Lys Gln Gln Glu Gln Asn
20 25 30
Glu Lys Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>82
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>82
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ile Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Gln Glu Leu Leu Glu Leu
35
<210>83
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>83
Thr Thr Trp Glu Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Glu Tyr Thr Ser Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ser Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Ala
20 25 30
Ala Ala Leu Ala Glu Leu
35
<210>84
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>84
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ile Gln Asn Ile Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Gln Glu Leu Leu Glu Leu
35
<210>85
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>85
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ile Gln Asn Ile Gln Glu Lys Ile Glu
20 25 30
Gln Glu Leu Leu Glu Leu
35
<210>86
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>86
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ile Gln Asn Ile Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Gln Ile Leu Leu Glu Leu
35
<210>87
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>87
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ala Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Gln Ala Leu Leu Glu Leu
35
<210>88
<211>42
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>88
Pro Ala Asn Trp Lys Ala Trp Glu Ala Gln Ile Gln Lys Tyr Gln Arg
1 5 10 15
Gln Ile Ala Glu Leu Ile Ala Asn Ala Lys Lys Gln Gln Glu Gln Asn
20 25 30
Glu Lys Ala Leu Arg Glu Trp Glu Trp Phe
35 40
<210>89
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>89
Ala Asn Trp Lys Ala Trp Glu Ala Gln Ile Gln Lys Tyr Gln Arg Gln
1 5 10 15
Ile Ala Glu Leu Ile Ala Asn Ala Lys Lys Gln Gln Glu Gln Asn Glu
20 25 30
Lys Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>90
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>90
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Val Leu Arg Glu Leu
35
<210>91
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>91
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Val Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>92
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>92
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Ile Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>93
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>93
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ile Leu Arg Glu Leu
35
<210>94
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>94
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Leu Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>95
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>95
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Leu Leu Arg Glu Leu
35
<210>96
<211>34
<<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>96
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Lys
1 5 10 15
Lys Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Lys Glu
20 25 30
Leu Lys
<210>97
<211>34
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>97
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Ile Lys Lys Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Lys Glu
20 25 30
Leu Lys
<210>98
<211>35
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>98
Trp Glu Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys Asn Glu Glu Glu
20 25 30
Leu Lys Lys
35
<210>99
<211>108
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>99
atgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat acactcctta 60
attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattg 108
<210>100
<211>114
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>100
atgacctgga tggcttggga cagagctatt gctaattacg ctgctttaat acacgcttta 60
attgaagctg ctcaaaacca gcaagaaaag aatgaagctg ctttattgga atta 114
<210>101
<211>114
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>101
accacctggg aagcttggga cagagctatt gctgaatacg ctgctagaat agaagcttta 60
attagagctg ctcaagaaca gcaagaaaag aatgaagctg ctttaagaga atta 114
<210>102
<211>1338
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>102
atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140
aacctcggga tcgagggaag gatcccaacg accgaaaacc tgtattttca gggcgctaaa 1200
gaagctgctc agcgtgctaa cgctaccacc tgggaagctt gggaccgtge tatcgctgaa 1260
tacgctgctc gtatcgaagc tctgatccgt gctgctcagg aacagcagga aaaaaacgaa 1320
gctgctctgc gtgaactg 1338
<210>103
<211>446
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<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>103
Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
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Glu Gly Arg Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Lys
385 390 395 400
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405 410 415
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala
420 425 430
Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
435 440 445
Claims (34)
1.一种包括来源于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中一个或多个基本序列的氨基酸序列的合成肽；其中该合成肽与所述的基本序列相比另外具有多个氨基酸取代；其中该氨基酸取代包括一个或多个螺旋促进氨基酸，和为了与该合成肽氨基酸序列中带相反电荷的氨基酸形成离子对而被引入的多个带电氨基酸；并且其中该合成肽与该基本序列相比表现改善的生物活性；其中所述改善的生物活性包括(a)针对抗基本序列的HIV毒株的抗病毒活性增加，和(b)改善的药物代谢动力学特性中的一种或多种。
2.一种具有来源于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中一个或多个基本序列的氨基酸序列的合成肽；其中该合成肽与所述基本序列的差别在于，通过添加多个氨基酸来替换该基本序列中的氨基酸；其中所述的多个氨基酸包括螺旋促进氨基酸；并且其中该合成肽与该基本序列相比表现改善的生物活性；其中所述改善的生物活性包括(a)针对抗基本序列的HIV毒株的抗病毒活性增加，和(b)改善的药物代谢动力学特性中的一种或多种。
3.一种包括来源于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中一个或多个基本序列的氨基酸序列的合成肽；其中该合成肽与所述基本序列的差别在于：(a)包括(i)一个或多个螺旋促进氨基酸，和(ii)多个带电氨基酸的多个氨基酸取代，其中该带电氨基酸在该合成肽中形成多个离子对；以及(b)表现改善的生物活性，其中所述改善的生物活性包括(a)针对抗基本序列的HIV毒株的抗病毒活性增加，和(b)改善的药物代谢动力学特性中的一种或多种。
4.一种包括来源于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中一个或多个基本序列的氨基酸序列的合成肽；其中该合成肽与所述基本序列的差别在于：(a)添加多个氨基酸来替换所述基本序列中的氨基酸，包括(i)一个或多个螺旋促进氨基酸，和(ii)空间上远离带相反电荷氨基酸而形成离子对的多个带电氨基酸；以及(b)表现改善的生物活性，其中所述改善的生物活性包括(a)针对抗基本序列的HIV毒株的抗病毒活性增加，和(b)改善的药物代谢动力学特性中的一种或多种。
5.一种具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：95中任何一个氨基酸序列的合成肽。
6.如权利要求1、2、3或4中任何一项所述的合成肽，其中大约5％至大约50％之间的所述基本序列用螺旋促进氨基酸取代或替换。
7.如权利要求1、3或4中任何一项所述的合成肽，其中大约5％至大约60％之间的所述基本序列用螺旋促进氨基酸和带电氨基酸的组合取代或替换。
8.如权利要求1、3或4中任何一项所述的合成肽，其中所述的离子对处于选自i，i+4排列、i，i+3排列或其组合的排列。
9.如权利要求1、2、3或4中任何一项所述的合成肽，其中该合成肽与所述基本序列的螺旋度相比具有增加的螺旋度。
10.如权利要求1、2、3或4中任何一项所述的合成肽，其中该合成肽与所述基本序列的稳定性相比具有增加的稳定性。
11.如权利要求1、2、3、4或5中任何一项所述的合成肽，进一步包括：在该合成肽来源的基本序列的N-末端添加附加的1至大约20个氨基酸；在该合成肽来源的基本序列的N-末端缺失大约1至10个氨基酸；在该合成肽来源的基本序列的C-末端添加附加的1至大约20个氨基酸；以及在该合成肽来源的基本序列的C-末端缺失大约1至10个氨基酸中的一个或多个。
12.如权利要求1、2、3、4或5中任何一项所述的合成肽，进一步包括选自一个或多个反应官能团、药物学上可接受的载体、高分子载体及其组合的成分。
13.如权利要求11所述的合成肽，进一步包括选自一个或多个反应官能团、药物学上可接受的载体、高分子载体或其组合的成分。
14.如权利要求1、2、3、4或5中任何一项所述的合成肽作为HIV感染治疗中的活性治疗物质的用途。
15.如权利要求14所述的合成肽的用途，其中该合成肽用作包含用于治疗HIV感染的一种或多种附加抗病毒剂的治疗方式的一部分。
16.如权利要求1、2、3、4或5中任何一项所述的合成肽在制造用于包括治疗HIV的治疗应用的药物中的用途。
17.一种包括权利要求11所述的合成肽，和药物学上可接受的载体的药物组合物。
18.一种包括权利要求12所述的合成肽的药物组合物。
19.编码SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、EQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：95中任何一个的核苷酸序列。
20.一种抑制HIV传递至细胞的方法，包括在存在细胞时，使所述的病毒接触有效抑制该细胞被HIV感染的适量的权利要求1、2、3、4或5中任何一项所述的合成肽。
21.一种抑制HIV传递至细胞的方法，包括在存在细胞时，使所述的病毒接触有效抑制该细胞被HIV感染的适量的权利要求11所述的合成肽。
22.一种抑制HIV传递至细胞的方法，包括在存在细胞时，使所述病毒接触有效抑制该细胞被HIV感染的适量的权利要求12所述的合成肽。
23.一种抑制HIV传递至细胞的方法，包括向病毒和所述细胞加入有效抑制该细胞被HIV感染的适量的权利要求1、2、3、4或5中任何一项所述的合成肽。
24.如权利要求23所述的方法，其中加入该合成肽作为治疗方式的组分。
25.一种抑制HIV传递至细胞的方法，包括向病毒和所述细胞加入有效抑制该细胞被HIV感染的适量的权利要求11所述的合成肽。
26.如权利要求25所述的方法，其中加入该合成肽作为治疗方式的组分。
27.一种抑制HIV传递至细胞的方法，包括向病毒和所述细胞加入有效抑制该细胞被HIV感染的适量的权利要求12所述的合成肽。
28.如权利要求27所述的方法，其中加入该合成肽作为治疗方式的组分。
29.一种抑制HIV融合的方法，包括在存在细胞时，使病毒接触有效抑制HIV融合的适量的权利要求1、2、3、4或5中任何一项所述的合成肽。
30.一种抑制HIV融合的方法，包括在存在细胞时，使病毒接触有效抑制HIV融合的适量的权利要求11所述的合成肽。
31.一种抑制HIV融合的方法，包括在存在细胞时，使病毒接触有效抑制HIV融合的适量的权利要求12所述的合成肽。
32.一种用于治疗HIV感染个体的方法，包括对所述个体施用适量的权利要求1、2、3、4或5中任何一项所述的合成肽，而在该治疗个体中有效获得选自HIV病毒负载减少、循环的CD4+细胞群增加、及其组合的治疗应用。
33.一种用于治疗HIV感染个体的方法，包括对所述个体施用适量的权利要求11所述的合成肽，而在该治疗个体中有效获得选自HIV病毒负载减少、循环的CD4+细胞群增加、及其组合的治疗应用。
34.一种用于治疗HIV感染个体的方法，包括对所述个体施用适量的权利要求12所述的合成肽，而在该治疗个体中有效获得选自HIV病毒负载减少、循环CD4+细胞群增加、及其组合的治疗应用。
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