KR20070006708A

KR20070006708A - ＨＩＶｇｐ41 ＨＲ2-유래된 합성 펩티드 및 인간 면역결핍바이러스의 전염을 저해하는 치료에서 이들의 용도

Info

Publication number: KR20070006708A
Application number: KR1020067014866A
Authority: KR
Inventors: 마리 케이. 델메디코; 존 드와이어
Original assignee: 트라이머리스 인코퍼레이티드
Priority date: 2004-01-07
Filing date: 2004-12-21
Publication date: 2007-01-11
Also published as: NO20063556L; US20060247416A1; RU2006128593A; CN1901931A; WO2005067960A1; BRPI0418304A; AU2004313242A1; CA2551082A1; IL176721A0; EP1708734A4; JP2007517522A; EP1708734A1

Abstract

(a) 나선-조장 아미노산, 또는 (b) 나선-조장 아미노산 및 합성 펩티드에 이온쌍을 형성하기 위하여 도입된 하전된 아미노산의 조합을 보유한다는 점을 제외하고, HIV gp41의 HR2의 고유 서열에 기초한 합성 펩티드를 제시한다; 여기서, 이들 합성 펩티드는 복수의 아미노산 치환이 없는 아미노산 서열을 보유하는 펩티드와 비교하여 예상치 않게 향상된 생물 활성을 나타낸다. 또한, 이들 합성 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HIV의 표적 세포로의 전염을 저해하기 위하여 이들 합성 펩티드(또는 이들을 함유하는 조성물)를 이용하는 방법을 제시한다.

합성 펩티드

Description

ＨＩＶｇｐ41 ＨＲ2-유래된 합성 펩티드 및 인간 면역결핍 바이러스의 전염을 저해하는 치료에서 이들의 용도{HIV gp41 HR2-DERIVED SYNTHETIC PEPTIDES, AND THEIR USE IN THERAPY TO INHIBIT TRANSMISSION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS}

본 발명은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) gp41의 HR2 영역으로부터 유래된 합성 펩티드 및 HIV의 표적 세포로의 전염을 저해하는 항바이러스제로서 항레트로바이러스 요법에서 이들의 용도에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 예상치 않게 향상된 생물 활성을 유도하는 복수의 아미노산 치환(고유 서열과 비교하여)을 보유하는 펩티드 집단에 관계한다.

세포는 세포 막과 바이러스 막 사이에 융합이 진행되는 과정을 통하여 HIV에 감염될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이런 과정의 일반적으로 수용되는 모델은 표적 세포의 막에서 바이러스 외피 당단백질 복합체(gp120/gp41)와 세포 표면 수용체의 상호작용이다. 세포 수용체에 gp120의 결합(가령, 케모킨 보조-수용체, 예를 들면, CCR-5 또는 CXCR-4와 공동으로 CD4)이후, gp120/gp41 복합체에서 형태 변화가 유도되는데, 이는 gp41이 표적 세포의 막에 삽입되어 막 융합을 매개할 수 있도록 한다.

gp41의 아미노산 서열 및 여러 HIV 균주에서 이의 변이는 널리 공지되어 있 다. 도 1은 gp41의 일반적으로 수용되는 기능적 도메인의 개요도이다(아미노산 서열 번호는 HIV 균주에 따라 다소 변한다). 융합 펩티드(용해성 도메인)는 표적 세포 막으로의 삽입과 파괴에 관여하는 것으로 생각된다. 막통과 고정 서열을 보유하는 막통과 도메인은 상기 단백질의 C-말단에 위치한다. 융합 펩티드와 막통과 고정 서열 사이에는 헵타드 반복(heptad repeat, HR) 영역으로 알려진 2개의 독립된 영역이 존재하는데, 각 영역은 복수의 헵타드를 보유한다. HR2 영역보다 상기 단백질의 N-말단에 근접하여 위치하는 HR1 영역은 gp160의 아미노산 서열 중에서 대략 545번에서 595번 위치까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 알려져 있다. 하지만, gp160의 아미노산 넘버링(numbering)은 이런 아미노산 서열이 유래된 균주에 좌우된다. HR1 영역을 포함하는 아미노산 서열과 HR2 영역을 포함하는 아미노산 서열은 HIV-1 외피 단백질에서 고도로 보존된 영역이다. HR2 영역은 gp160의 아미노산 서열 중에서 대략 628번에서 678번 위치까지의 아미노산을 포함하는 것으로 알려져 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, HR 영역은 복수의 7개 아미노산 잔기 또는 “헵타드(heptad)”(각 헵타드에서 7개 아미노산은 "a" 내지 "g"로 지정된다)를 보유하는데, "a" 위치와 "d" 위치에서 아미노산은 일반적으로 소수성이다. 각 HR 영역에는 이소루이신이나 루이신으로 시작되고 종결되는 8개의 아미노산 서열을 포함하는 하나이상의 루이신 지퍼-유사 모티프(“루이신 지퍼-유사 반복”)가 또한 존재한다. 더욱 빈번하게는, HR2 영역은 하나의 루이신 지퍼 유사-모티프를 보유하는 반면, HR1 영역은 5개의 루이신 지퍼-유사 모티프를 보유한다. 이들 아미노산 서열 특징은 gp41의 꼬인 코일 구조 및 HR 영역으로부터 유래된 펩티드의 꼬인 코일 구 조의 형성에 기여한다. 일반적으로, 꼬인 코일은 서로를 둘러싸고 올리고머를 형성하는 2개 이상의 나선으로 구성되는데, 꼬인 코일의 증표는 첫 번째("a")와 네 번째("d") 위치에서 소수성 잔기가 우세하고 다섯 번째("e")와 일곱 번째("g") 위치에서 극성 잔기가 빈번하게 나타나는 아미노산의 헵타드 반복이고, "a" 위치와 "d" 위치에서 아미노산은 올리고머 상태와 가닥 방향에 영향을 주는 결정인자이다.

HIV gp41의 HR1 영역("HR1 펩티드") 또는 HR2 영역("HR2 펩티드")의 고유 서열로부터 유래된 펩티드는 시험관내 검사와 생체내 임상 연구에서 HIV의 숙주 세포로의 전염을 저해한다(참조: Wild et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9770-9774; U.S. Patent No. 5,464,933과 5,656,480; Kilby et al., 1998, Nature Med. 4:1302-1306; U.S. Patent No. 6,258,782와 6,348,568). 더욱 구체적으로, DP178(T20; 엔푸비리티드(enfuvirtide)와 Fuzeon®; SEQ ID NO:1), T651(SEQ ID NO:2), T649(SEQ ID NO:3)로 예시되는 HR2 펩티드는 각각 0.5 ng/㎖(HIV-1_LAI에 대한 EC50; Lawless et al., 1996, Biochemistry, 35:13697-13708), 5 ng(IC50; HIV-1IIIB), 2 ng(IC50; HIV-1IIIB)의 효능으로 표적 세포의 감염을 차단하였다. T651(SEQ ID NO:2)과 T649(SEQ ID NO:3)의 개별 아미노산 서열 역시 U.S. Patent No. 6,479,055에 기술된다. 더 나아가, 임상 연구에서 T20(SEQ ID NO:1)을 보유하는 항바이러스제의 섭생으로 HIV-감염된 개체의 치료가 HIV-1 바이러스 부하(viral load)를 현저하게 감소시키고, T20이 없는 동일한 섭생을 섭취하는 개체에 비하여 이들 처리된 개체에서 순환 CD4⁺세포 개체군을 현저하게 증가시키는 것으로 밝혀졌 다.

HIV-유래된 HR2 펩티드의 생물 활성을 개선하려는 시도가 있어 왔다. 가령, 낮은 생물 활성(>500 μM의 IC50)의 짧은(14개 아미노산) HIV-유래된 HR2 펩티드의 나선 형태를 안정화시키기 위하여, 펩티드 서열에서 비자연 나선-조장 아미노산 치환(가령, α-아미노이소부틸산) 및 화학적 가교결합제(즉, 디아미노알칼 가교제)가 이용되고 있다(Sia et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14664-14669). 이들 펩티드는 효능(가령, 저해 활성)에서 대략 4배 내지 15배 범위에서 생물 활성을 보인 반면, 다른 펩티드는 저해 활성을 보이지 않았다(Sia et al., 2002, supra). 따라서, 상기 방법으로는 기존의 약한 저해물질(>500 μM의 IC50)에서 근소한 개선만 달성되었다. 이에 더하여, Sia 등은 현재 당분야의 통상적인 의견, 다시 말하면, 나선 성향(helical propensity)과 생물 활성 사이에 상관관계의 부재를 확인하였다. 가령, 최대 나선을 보유하는 펩티드는 빈번하게, HIV-유도된 막 융합의 가장 약한 저해물질이다.

HIV-유래된 HR2 펩티드의 생물 활성을 개선하기 위한 다른 시도에서, Glu와 Lys(i 및 i + 4 위치에서) 사이에 이온쌍이 형성될 수 있도록 i,i + 4 정렬에서 펩티드 "C34"의 아미노산 서열(Lys로부터 Glu를 분리하는 3개의 아미노산)의 다양한 위치에서 글루탐산과 리신을 치환시켰다(Otaka et al., 2002, Angew. Chem. Int. Ed. 41:2938-2940). Glu와 Lys의 다양한 조합에서 10개 아미노산 내지 17개 아미노산 범위의 치환을 추가하여 이온쌍 형성을 촉진하였다(즉, 6개 내지 10개의 i,i + 4 정렬을 보유하는 것으로 보일 수도 있음). 나선내 염다리(intrahelical salt bridge)를 보유하는 생성된 3개의 펩티드(SEQ ID NO:96-98)는 대략 20 내지 30% 증가된 헬리시티(helicity)를 나타냈다(표 2 참조). 하지만, 3개의 펩티드의 생물 활성은 치환이 도입된 부모 펩티드와 비교하여, 저해 활성에서 증가 없음, 또는 기꺼해야 3배 증가(EC50, MAGI 검사를 이용한 항-HIV 활성; Otaka et al., 2002, supra)를 보였다.

다른 항레트로바이러스제에서 입증된 바와 같이, T20(SEQ ID NO:1)과 같은 융합 저해물질 펩티드를 이용한 약물 요법에 대한 감수성(sensitivity)을 감소시키는 돌연변이가 치료동안 HIV에서 산출될 수 있다. 따라서, 개선된 생물 활성을 보유하는 융합 저해물질로서 추가적인 화합물이 요구된다. HR2 영역으로부터 유래된 합성 펩티드의 경우에, 이런 개선된 생물 활성에는 공지된 HR2 펩티드에 대한 저항성이 발생된 HIV 균주, 더욱 구체적으로, SEQ ID NO: 2-4로 대표되는 하나이상의 펩티드에 대한 저항성이 발생된 HIV 균주에 대한 저해 활성(최초(고유) HR2 서열로 구성되는 펩티드와 비교하여)에서 대략 100배 내지 1,000배 증가가 포함될 수 있지만 여기에 국한되지 않는다.

본 발명의 요약

본 발명은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 중에서 하나이상의 기본 아미노산 서열(“기본 서열”)로부터 유래된 합성 펩티드에 관계하는데, 여기서 상기 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에서 아미노산을 치환함에 있어 복수의 아미노산의 추가에 의해 상기 기본 서열과 구별되고, 상기 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 예상치 않게 향상 된 생물 활성을 보이고 헬리시티에서 증가를 추가로 나타낼 수 있다.

gp41의 HR2 영역으로부터 유래된 합성 펩티드를 제시하는데, 여기서 각 합성 펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 중에서 하나이상의 기본 서열을 포함하지만, 하나이상의 나선-조장(helix-promoting) 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산 치환(기본 서열과 비교하여)을 추가로 보유함으로써 상기 기본 서열과 구별되는데, 상기 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 예상치 않게 향상된 생물 활성을 보이고 헬리시티에서 증가를 추가로 나타낼 수 있다. 나선-조장 아미노산으로 복수의 치환은 기본 서열의 길이에 따라 대략 5개 내지 15개 아미노산의 범위에서 달성될 수 있다; 더욱 구체적으로, 기본 서열의 대략 5% 내지 50%의 아미노산을 하나이상의 나선-조장 아미노산으로 치환하여 본 발명에 따른 합성 펩티드를 생산할 수 있다.

SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 중에서 하나이상의 기본 서열을 포함하지만, (a) 하나이상의 나선-조장 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산 치환; (b) 복수의 이온쌍(적절하게는, i,i + 4 정렬 및/또는 i,i + 3 정렬)을 형성함에 있어 합성 펩티드의 아미노산 서열에서 반대로 하전된 아미노산으로부터 이격된 복수의 하전된 아미노산; (c) 향상된 생물 활성에 의해 기본 서열과 구별되는 합성 펩티드를 제시한다. 적절하게는, 합성 펩티드에서 이온쌍의 개수는 대략 3개 내지 10개이다. 적절하게는, 이들 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여, 헬리시티에서 증가를 추가로 나타낸다. 하나이상의 나선-조장 아미노산 및 복수의 하전된 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산 치환은 기존 서열의 길이에 따라 대략 5개 내지 25개 아미노산의 범위에서 달성될 수 있다; 더욱 구체적으로, 기본 서열의 대략 5% 내지 60%의 아미노산을 나선-조장 아미노산과 하전된 아미노산의 조합으로 치환하여 본 발명에 따른 합성 펩티드를 생산할 수 있다.

SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 중에서 하나이상의 기본 서열로부터 유래된 합성 펩티드를 제시하는데, 여기서 상기 합성 펩티드는 (a) 하나의 나선-조장 아미노산; (b) 반대로 하전된 아미노산 사이에 이온쌍(적절하게는, i,i + 3 정렬 및/또는 i,i + 4 정렬)을 형성하도록 도입된 복수의 하전된 아미노산 중에서 하나이상을 포함하는 복수의 아미노산 치환(기본 서열의 아미노산 서열과 비교하여)을 보유하고, 향상된 생물 활성을 보유한다. 상기 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여, 헬리시티에서 증가를 추가로 나타내고, Tm(용융 온도)에 의한 측정에서 대략 36℃ 내지 75℃ 범위에서 안정성을 보인다. 나선-조장 아미노산과 하전된 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산 치환은 기본 서열의 길이에 따라, 대략 5 내지 25개 아미노산의 범위에서 달성될 수 있다; 더욱 구체적으로, 기본 서열의 대략 5% 내지 60%의 아미노산을 나선-조장 아미노산과 하전된 아미노산의 조합으로 치환하여 본 발명에 따른 합성 펩티드를 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 합성 펩티드는 상세한 설명에 기술된 바와 같이, N-말단기, C-말단기, 또는 N-말단기와 C-말단기 모두를 추가로 포함할 수 있다.

HIV 감염의 치료에서 활성 치료 물질로서 본 발명에 따른 합성 펩티드의 용도를 제시한다. 또한, HIV 치료를 비롯한 치료 목적의 약물의 제조를 위한 본 발명 에 따른 합성 펩티드의 용도를 제시한다.

또한, 본 발명에 따라, HIV의 세포로의 전염을 저해하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 세포의 존재하에, HIV에 의한 세포의 감염을 저해하는 효과량의 본 발명에 따른 합성 펩티드와 상기 바이러스를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이에 더하여, HIV의 세포로의 전염을 저해하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIV에 의한 세포의 감염을 저해하는 효과량의 합성 펩티드를 이들 바이러스와 세포에 첨가하는 단계를 포함한다. 또한, HIV 융합(가령, HIV에 의한 표적 세포의 감염동안 HIV gp41이 바이러스 막과 세포 막 사이의 융합을 매개하는 과정)을 저해하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 세포의 존재하에, HIV 막 융합을 저해하는 효과적인 농도의 본 발명에 따른 합성 펩티드와 상기 바이러스를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이들 방법은 HIV-감염된 개체를 치료하는 데에도 이용될 수 있다. 본 발명의 이들 특징은 첨부된 도면과 함께, 아래에 기술된 상세한 설명으로부터 명확하다.

도 1은 gp41의 다른 기능성 영역과 함께, 헵타드 반복 1 영역(HR1)과 헵타드 반복 2 영역(HR2)을 보여주는 HIV gp41의 개요도이다. HIV_LAIHR1과 HR2에 상응하는 전형적인 펩티드 서열은 예시의 목적으로 도시한다. 이들 아미노산 잔기는 gp160, 균주 HIV_LAI에서 이들의 위치에 따라 넘버링(numbering)된다.

도 2는 다양한 실험실 균주와 임상 분리물로부터 결정된 HIV gp41의 HR2 영역의 SEQ ID NO:2 내에 포함된 다형성의 비교를 보여주는데, 여기서 아미노산 서열 에서 변이는 단일 문자 아미노산 코드로 표시된다.

정의:

본 명세서에서 “개체”는 포유동물, 바람직하게는 인간을 의미한다.

본 명세서에서 “목표 세포”는 HIV에 의해 감염될 수 있는 세포를 의미한다. 적절하게는, 상기 세포는 인간 세포, 바람직하게는 막 융합을 비롯한 임의의 과정을 통하여 HIV에 감염될 수 있는 인간 세포를 의미한다.

본 명세서에서 “제약학적으로 허용되는 담체”는 투여되는 활성 성분(가령, 본 발명에 따른 합성 펩티드)의 생물학적 활성을 현저하게 변화시키지 않는 담체 매체를 의미한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 적합한 제약학적으로 허용되는 담체는 물, 완충수(buffered water), 염수, 0.3% 글리신, 수성 알코올, 등장성 수성 완충액을 비롯한 한가지이상의 물질을 함유하고, 또한 수용성 중합체, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 오일, 염(예, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 암모늄 염), 포스포네이트, 카보네이트 에스테르, 지방산, 사카라이드, 폴리사카라이드, 당단백질(안정성 강화), 부형제, 방부제 및/또는 안정제(저장 기간을 증가시키거나 조성물의 제조와 유통에 필요하고 적합한)를 함유할 수 있다. 적절하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하 또는 장관외(예, 주사) 투여에 적합하다.

본 발명에 따른 합성 펩티드와 관련하여, 본 명세서에서 “아미노산”은 적어도 하나의 유리 아민기와 적어도 하나의 유리 카르복실기를 보유하는 분자를 의미한다. 아미노산은 하나이상의 유리 아민기 또는 하나이상의 유리 카르복실기를 보유하거나, 또는 아민이나 카르복실기 이외에 다른 하나이상의 유리 화학적 반응기(가령, 하이드록실, 설피드릴 등)를 추가로 포함할 수 있다. 아미노산은 자연 발생 아미노산(가령, L-아미노산), 비-자연 발생 아미노산(가령, D-아미노산), 합성 아미노산, 변형된 아미노산, 아미노산 유도체, 아미노산 전구물질, 보존성 치환체일 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 펩티드에 통합되는 아미노산의 선택은 부분적으로, 항바이러스 펩티드의 요구되는 특정 물리적, 화학적 또는 생물학적 특성에 좌우된다. 이런 특성은 부분적으로, 헬리시티 및 항바이러스 활성의 결정으로 확인된다. 가령, 합성 펩티드에서 아미노산은 하나이상의 자연 발생 (L)-아미노산 및 비-자연 발생 (D)-아미노산으로 구성될 수 있다. 바람직한 아미노산은 이런 바람직한 아미노산 이외의 다른 아미노산을 배제하는데 이용될 수 있다.

본 명세서에서 “나선-조장 아미노산”은 이런 나선-조장 아미노산을 보유하는 아미노산 서열의 알파 나선 형성을 조장하는 높은 성향을 보이는 아미노산을 의미한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 나선-조장 아미노산인 자연 발생 아미노산에는 글루탐산, 알라닌, 루이신, 메티오닌, 글루타민, 이소루이신, 리신, 아르기닌, 페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판이고, 비-자연 발생 아미노산은 아미노-부틸산(가령, α-아미노이소부틸산)이다. 이들 나선-조장 아미노산에서, 나선 성향의 순서(최대/상위에서 최대미만/하위)는 글루탐산, 알라닌, 루이신, 메티오닌, 글루타민, 리신, 아르기닌, 페닐알라닌, 이소루이신, 히스티딘, 트립토판이다. 따라서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 복수의 아미노산 치환을 보유하고, 여기서 아미노산 치환은 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 아미노산 서열의 상응하는 위치에서 아미노산과 비교하여 더욱 높은 나선 성향을 보이는 합성 펩티드의 아미노산 서열의 위치에서 나선-조장 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, 하전되지 않은 나선-조장 아미노산은 기본 서열에서 하전된 아미노산을 대체한다. 본 명세서에서 “나선-조장”은 통상적으로, 펩티드의 헬리시티에 대한 하나이상 아미노산 치환의 기여 효과; 더욱 구체적으로, 당분야에 공지된 바와 같이 하나이상의 알파 나선 안정화, 또는 헬리시티에서 증가로서 관찰되는 효과를 지칭한다.

본 발명에 따른 합성 펩티드의 아미노산 서열과 관련하여, 본 명세서에서“보존성 치환”은 합성 펩티드가 예상치 않게 향상된 생물 활성을 여전히 나타내는 합성 펩티드 서열에서 하나이상의 아미노산 치환을 의미한다. 당분야에 공지된 바와 같이, “보존성 치환”은 상기한 기능으로 정의되고, 치환되는 아미노산과 실질적으로 동일한 전하, 크기, 친수성 및/또는 방향족성(aromaticity)을 보유하는 아미노산의 치환을 포괄한다. 이런 치환에는 글리신-알라닌-발린; 이소루이신-루이신; 트립토판-티로신; 아스파라긴산-글루탐산; 아르기닌-리신; 아스파라긴-글루타민; 세린-트레오닌이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 치환은 HIV의 실험실, 다양한 클레이드(clade) 및/또는 임상 분리물에서 발견되는 바와 같이 SEQ ID NO:2의 다양한 아미노산 위치에서 다형성을 포함할 수도 있다(도 2).

HIV-1 gp41의 HR2 영역의 아미노산 서열과 관련하여, 본 명세서에서“고유 서열”은 실험실 HIV 균주 및/또는 HIV 임상 분리물에서 발견되는 자연 발생 서열을 의미한다. 이런 서열은 GenBank와 같은 공개된 유전자 데이터베이스로부터 용이하게 입수가능하다. 설명의 목적으로, 이들 고율 서열 중에서 일부가 도 2에 예시되는데, 여기서 SEQ ID NO:2로 대표되는 아미노산 서열에서 다양한 아미노산 위치에서 예시적 치환(가령, 다형성)이 언급된다. 본 명세서에서 “기본 서열(basic sequence)”은 본 발명에 따른 합성 펩티드가 유래되는 고유 서열(또는 고유 서열로 구성되는 펩티드)을 의미한다. 따라서, 예로써 합성 펩티드는 (a) 합성 펩티드의 아미노산 서열로 복수의 나선-조장 아미노산의 추가, 또는 (b) 합성 펩티드의 아미노산 서열로 나선-조장 아미노산과 하전된 아미노산(이온쌍 형성)의 조합의 추가에 의해 기본 서열로부터 구별될 뿐만 아니라 기본 서열의 아미노산 서열중 일부를 포함한다는 점에서 기본 서열로부터 유래되는데, 상기 합성 펩티드는 이런 추가된 아미노산을 보유하지 않는 기본 서열에 비하여 향상된 생물 활성을 보유한다.

본 명세서에서 “반응적 기능성(reactive functionality)은 공유 결합할 수 있고 및/또는 보호하는(가령, 자체적인 또는 다른 분자와의 반응으로부터 펩티드 유도체를 보호하는) 화학적 작용기 또는 화학적 일부분을 의미한다. 화학적 작용기와 관련하여, 반응적 기능성에는 말레이미드, 티올, 카르복시, 포스포릴, 아실, 하이드록실, 아세틸, 소수성, 아미도, 단실, 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc), t-부틸옥시카르보닐(Boc), 설포, 숙신이미드, 티올-반응성, 아미노-반응성, 카르복실-반응성 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 가령, 펩티드의 아미노 말단의 화학적 반응성을 차단하기 위하여 합성 펩티드의 N-말단 아미노산에 추가되는 화학적 작용기는 N-말단기이다. 펩티드의 아미노 말단을 보호하기 위한 이들 N-말단기에는 저급 알카노일기, 아실기, 설포닐기, 카바메이트 형성기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 선호되는 N-말단기는 아세틸, Fmoc, BOC이다. 가령, 펩티드의 카르복시 말단의 화학적 반응성을 차단하기 위하여 합성 펩티드의 C-말단 아미노산에 추가되는 화학적 작용기는 C-말단기이다. 펩티드의 카르복시 말단을 보호하기 위한 이들 C-말단기에는 에스테르 또는 아마이드 기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 화학적 일부분은 링커를 포함할 수 있다. 링커는 2개의 상이한 분자를 작동가능하게 연결하는 분자 다리(molecular bridge)로서 기능하는 화합물 또는 일부분을 의미한다(가령, 링커의 한 부분은 본 발명에 따른 펩티드에 결합하고, 링커의 다른 부분은 거대 담체, 또는 표적 세포로의 HIV 전염을 저해하는 것으로 알려진 다른 항바이러스 펩티드에 결합한다). 2개의 상이한 분자는 단계별 방식으로 링커에 결합될 수 있다. 분자 다리로서 목적을 완수할 수 있다면 링커의 크기 또는 함량에 제한이 없다. 링커에는 화학적 사슬, 화학적 화합물(가령, 시약) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 링커에는 동종이중기능성 링커와 이종이중기능성 링커가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 당업자에게 널리 공지된 이종이중기능성 링커는 제 1 분자를 특이적으로 연결하는 제 1 반응성 기능기를 보유하는 한 말단 및 제 2 분자에 특이적으로 연결되는 제 2 반응성 기능기를 보유하는 반대 말단을 보유한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 동종-과 이종-기능성의 다양한 이중기능이나 다중기능 시약(가령, Pierce Chemical Co.,(Rockford, Ill.)의 카탈로그에 기술된 시약) 또는 말레이미드가 본 발명에서 링커로 이용될 수 있다. 연결되는 분자 및 연결이 실행되는 조건과 같은 인자에 따라, 링커는 생물학적 기능 안정성의 보존, 특정 화학약품 및/또는 온도 파라미터에 대한 내성, 충분한 입체-선택성(stereo-selectivity)이나 크기와 같은 특성을 최적화시키기 위하여 길이와 조성이 변할 수 있다. 가령, 링커는 HIV의 목표 세포로의 융합 및/또는 HIV의 목표 세포로의 전염의 저해물질로서 기능하는 본 발명에 따른 펩티드(링커가 연결된)의 능력을 현저하게 간섭하지 않아야 한다. 선호되는 반응성 기능기는 이런 선호되는 반응성 기능기 이외의 반응성 기능기를 배제하는데 이용될 수 있다.

본 명세서에서 “거대분자 담체”는 본 발명에 따른 하나이상의 펩티드에 연결되거나, 결합되거나, 또는 융합된(가령, 화학적으로 또는 재조합 수단을 통하여) 분자를 의미하는데, 상기 분자는 하나이상의 펩티드에 안정성, 하나이상의 펩티드의 생물학적 활성에서 증가, 또는 상기 분자가 부재하는 하나이상의 펩티드와 비교하여 하나이상의 펩티드의 혈청 반감기에서 증가(가령, 체내에서 하나이상의 펩티드의 저항성 연장)를 공여할 수 있다. 당분야에 널리 공지된 이들 거대분자 담체에는 혈청 단백질, 중합체, 탄수화물, 지질-지방산 공액체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 거대분자 담체로서 전형적으로 이용되는 혈청 단백질에는 트랜스페린, 알부민(가급적, 인간 알부민), 면역글로불린(가급적, 인간 IgG 또는 하나이상의 이의 사슬), 또는 호르몬이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 거대분자 담체로서 전형적으로 이용되는 중합체에는 폴리리신 또는 폴리(D-L-알라닌)-폴리(L-리신), 또는 폴리올이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 선호되는 폴리올은 수용성 폴리(산화알킬렌) 중합체이고, 선형이나 가지형 사슬을 보유할 수 있다. 적절한 폴리올에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), PEG-PPG 공중합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 선호되는 폴리올은 대략 1,000 달톤(Dalton) 내지 20,000 달톤 범위에서 선택되는 평균 분자량을 보유하는 PEG이다. 전체적으로 20,000 초과의 분자량을 보유하는 다른 유형의 거대분자 담체는 당분야에 공지되어 있다.

본 발명에 따른 펩티드와 관련하여, 본 명세서에서 “합성(synthetic)”은 펩티드가 화학적 합성, 재조합 발현, 더욱 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 단편화, 더욱 큰 분자의 화학적 절단, 이들의 조합으로 생산되거나, 또는 당분야의 임의의 다른 방법으로 제조되고, 분리됨을 의미한다. 펩티드와 관련하여 “분리된”은 합성 펩티드가 펩티드 자체의 일체 구조가 일부가 아닌 구성요소, 예를 들면, 재조합 기술로 생산되는 경우에 세포 물질이나 배양 배지, 또는 생화학적 또는 화학적 공정에 의해 화학적으로 합성되거나 생산되는 경우에 화학 전구물질이나 다른 화학물질이 실질적으로 존재하지 않음을 의미한다.

본 명세서에서 “이온쌍(ion pair)”은 통상적으로, 아미노산 서열에서 반대로 하전된 이온(가령, 2개의 반대로 하전된 아미노산) 사이의 단순한 정전 상호작용을 의미한다. 각각의 반대로 하전된 이온은 아미노산의 측쇄에 존재한다. 상이한 유형의 이온쌍 중에서, “염다리(salt bridge)”는 핵 자기 공명 또는 당분야에 공지된 다른 표준 방법에 의한 측정에서, 밀접한 공간적 상관관계로 존재하는 이온쌍이다. 바람직한 구체예에서, 이온쌍은 나선을 형성함에 있어 아미노산 서열에 포함된 연속 서열에서 3개의 아미노산(즉, i,i + 4 정렬) 또는 2개의 아미노산(즉, i,i + 3 정렬)에 의해 공간적으로 이격된 2개의 반대로 하전된 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 따라서, 양으로 하전된 아미노산(가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘)은 음으로 하전된 아미노산(가령, 글루탐산, 아스파라긴산)과 이온쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 합성 펩티드는 중성(전하) 또는 음으로 하전된 아미노산(기본 서열에서처럼)의 위치에 양으로 하전된 아미노산이 합성 펩티드에서 상응하는 아미노산 위치에 포함되어, 음으로 하전된 아미노산과 이온쌍(가령, i,i + 3 정렬 또는 i,i + 4 정렬)이 형성되는 점을 제외하고 기본 서열로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 합성 펩티드는 중성(전하) 또는 양으로 하전된 아미노산(기본 서열에서처럼)의 위치에 음으로 하전된 아미노산이 합성 펩티드에서 상응하는 아미노산 위치에 포함되어, 양으로 하전된 아미노산과 이온쌍(가령, i,i + 3 정렬 또는 i,i + 4 정렬)이 형성되는 점을 제외하고 기본 서열로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 음으로 하전된 아미노산과 양으로 하전된 아미노산이 한 정렬로 합성 펩티드에 포함되어, 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에는 부재하는 이온쌍이 합성 펩티드에서 형성된다.

본 발명에 따른 합성 펩티드와 관련하여, 본 명세서에서 “향상된 생물 활성”은 (a) 기본 서열의 항바이러스 활성에 대하여 감소된 감수성(“저항성”)을 보이는 HIV 균주에 대한 기본 서열의 항바이러스 활성과 비교하여 합성 펩티드의 증가된 항바이러스 활성(가령, IC50 또는 항바이러스 효능을 측정하기 위한 당분야의 다른 측정 기준에 의한 측정에서); 또는 (b) 기본 서열의 항바이러스 활성에 대하여 “저항성”을 보이는 HIV 균주에 대한 기본 서열의 항바이러스 활성과 비교하여 합성 펩티드의 증가된 항바이러스 활성 및 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 약동학적 특성과 비교하여 합성 펩티드의 향상된 약동학적 특성(가령, 곡선하 영역(Area Under the Curve, AUC), 생물학적 반감기 및/또는 제거율과 같은 하나이상의 파리미터에 의한 측정; 또는 약동학적 특성을 측정하기 위한 당분야의 다른 측정 기준에 의한 측정에서)을 의미한다. 이들 향상된 생물 활성은 예상치 못한 것이다. 한 구체예에서, 향상된 생물 활성은 기본 서열에 저항하는 바이러스 분리물(돌연변이)과 관련하여 기본 서열에서 관찰되는 항바이러스 활성에 비하여 20배 증가된 항바이러스 활성이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 이런 향상된 생물 활성은 기본 서열에 저항하는 바이러스 분리물에 대한 0.500 ㎍/㎖ 이하의 IC50이다. 더욱 적절하게는, 합성 펩티드의 IC50은 나노그람/㎖ 또는 피코그람/㎖ 범위에 존재한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 기본 서열은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, 이들의 조합에서 선택되는 아미노산 서열로 구성된다. 기본 서열에 저항하는 바이러스 분리물에 대한 합성 펩티드의 향상된 생물 활성은 T20(SEQ ID NO:1)에 저항하는 분리물 HIV에 대한 예상치 않게 향상된 항바이러스 활성과도 연관될 수 있다. 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 (a) 더욱 길어진 생물학적 반감기(t½) 및 (b) 생물학적 제거율(CI)에서 감소 중에서 하나이상을 보유하는 경우에 향상된 약동학적 특성을 보유한다. 바람직한 구체예에서, 상기 합성 펩티드는 아래의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 제거율이 전형적으로 30% 이상 감소한다. 다른 바람직한 구체예에서, 합성 펩티드는 아래의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 기본 서열과 비교하여 생물학적 반감기가 5배 이상 증가한다.

본 명세서에서 “약동학적 특성”은 시간의 흐름에서 전신적으로 이용가능한 제약학적 조성물에서 활성 성분(가령, 합성 펩티드 유사체)의 전체 양을 의미한다. 약동학적 특성은 합성 펩티드 단독(즉, 여기에 작동가능하게 결합되는 아마이드-형성 아미노산 없이)의 투여이후 단수로서 또는 약동학적 특성과 비교하여, 투여이후 시간의 흐름에서 합성 펩티드 유사체의 전체 전신 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예로써, 약동학적 특성은 곡선하 영역, 생물학적 반감기 및/또는 제거율로서 표시될 수 있다. AUC는 질량 x 시간/부피의 단위로 시간의 흐름에서 전신 활성 성분 농도의 통합된 척도이다. 1회 분량의 활성 성분의 투여이후, 투약 시점에서부터 활성 성분이 체내에 존재하지 않는 시점까지 AUC는 활성 성분(및/또는 활성 성분의 대사물질)에 대한 개체의 노출 척도이다. 제거율은 용량/AUC로 정의되고, 부피/중량/시간의 단위로 표시된다.

본 발명에 따른 합성 펩티드와 관련하여, 본 명세서에서 “안정성”은 상기 펩티드의 알파-나선 꼬인 코일 구조의 안정성을 의미한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 안정성은 당분야에 공지된 표준 방법, 예를 들면, 펩티드의 용융 온도(melting temperature, "Tm")를 결정함으로써 측정될 수 있다(실시예 1). 바람직한 구체예에서, 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 앞서 기술된 복수의 아미노산 치환을 보유하는 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 용융 온도와 비교하여 합성 펩티드의 더욱 높은 용융 온도에 의해 확인되는 바와 같이 더욱 높은 안정성을 보인다. 이런 하나이상 아미노산 치환은 적절한 위치에 나선-조장 아미노산의 도입(가령, 낮아진 나선 성향의 측쇄 치환); 또는 꼬인 코일을 안정화시키는 역할을 하는 하나이상의 헵타드 반복에 나선-조장 아미노산과 하전된 아미노산(이온쌍 형성)의 통합을 포괄한다.

본 발명에 따른 서열과 관련하여, 본 명세서에서 “상동성 비율(percent identity)”은 상기 서열이 참고 서열과 비교됨을 의미한다(“비교된 서열”); 상동성 비율은 아래의 공식에 따라 결정된다:

상동성 비율 = [1-(xC/yR)] x 100

여기서, xC는 비교된 서열과 참고 서열 사이의 정렬 전장에서 참고 서열과 비교된 서열 사이의 차이 개수인데, (a) 비교된 서열과 비교하여 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산을 보유하지 않는 참고 서열에서 각 염기 또는 아미노산, (b) 참고 서열에서 각 갭(gap), (c) 참고 서열에서 정렬된 염기 또는 아미노산과 구별되는 비교된 서열에서 각 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이를 구성한다; yR은 비교된 서열의 전장에서 참고 서열에서 염기 또는 아미노산 개수인데, 정렬의 결과로서 참고 서열에서 발생된 임의의 갭 역시 염기 또는 아미노산으로 산정된다. 2개의미리 결정된 서열 사이의 정렬을 위한 방법과 소프트웨어는 당분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 예로써, 참고 서열은 SEQ ID NO: 5-98중에서 하나의 아미노산 서열을 보유하는 합성 펩티드이고, 비교된 서열은 상동성 비율을 위하여 참고 서열과 비교되는 합성 펩티드이다.

HIV 감염과 관련하여, 본 명세서에서 “치료” 또는 “요법”은 합성 펩티드(또는 활성 약물로서 합성 펩티드를 함유하는 조성물)가 HIV 감염과 연관된 한가지이상의 과정, 또는 이런 치료 또는 요법(가령, “치료적 적용”)의 치료 효과를 결정하기 위한 표지로서 이용되는 파라미터 또는 종점에 영향을 주는데 이용될 수 있음을 의미한다. 가령, 합성 펩티드는 아래의 과정 중에서 하나이상을 저해하는데 이용될 수 있다: HIV의 표적 세포로의 감염; HIV와 표적 세포 사이의 융합(“HIV 융합”); 바이러스 진입(HIV 또는 이의 유전 물질이 감염 과정동안 표적 세포로 들어가는 과정); 합포체 형성(syncytia formation)(가령, HIV-감염된 세포와 표적 세포 사이). HIV 감염의 치료 또는 요법에서 약물의 효능 평가에서, 바이러스 억제(체액 또는 조직에서 HIV의 바이러스 하중을 측정하기 위한 당분야에 공지된 방법으로 측정됨)는 통상적으로 이용되는 일차 종점이고, 혈류에서 순환하는 CD4⁺ 세포의 수치에서 증가는 통상적으로 이용되는 이차 종점이다; 각각은 HIV의 표적 세포로의 감염을 저해하는 측정가능 효과이다. 따라서, 합성 펩티드는 바이러스 억제 및/또는 순환 CD4⁺ 세포의 상대적 수치에서 증가를 비롯한 치료적 적용을 달성하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 합성 펩티드는 아래의 현저한 기능적 특징을 보유한다.

A. 서열

본 발명에 따른 합성 펩티드는 HIV-1 gp41의 HR2 영역의 고유 서열로부터 유래되고, 더욱 구체적으로 기본 서열로서 SEQ ID NO: 2, 3, 또는 4중에서 하나이상을 포함한다; 하지만, 상기 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에 비하여 예상치 않게 향상된 생물학적 활성을 유도하는 복수의 아미노산 치환(합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에서 상응하는 위치와 비교하여)의 합성 펩티드의 아미노산 서열로의 함입에 의해 기본 서열과 구별되고, 헬리시티에서 증가를 더욱 나타낸다. 한 구체예에서, 합성 펩티드는 (a) 나선-조장 아미노산으로 기본 서열의 아미노산의 대략 5% 내지 50%의 치환(가령, 낮은 나선 성향을 보유하는 아미노산 대신에 높은 나선 성향을 보유하는 아미노산의 치환, 또는 하전된 아미노산 대신에 하전되지 않은 나선-조장 아미노산의 치환); (b) 향상된 생물 활성으로 기본 서열과 구별된다. 전형적으로, 이들 합성 펩티드는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 보유하는 합성 펩티드, 또는 SEQ ID NO:5와 90% 상동성을 보유하고 (i) 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에서 상응하는 아미노산 위치와 비교하여 복수의 나선-조장 아미노산의 추가, (ii) 향상된 생물 활성으로 기본 서열과 구별되는 아미노산 서열이다. 다른 구체예에서, 이들 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 현저하게 향상된 생물 활성을 유도하는 한 헵타드에서 "a" 위치 및 상이한(가급적, 인접한) 헵타드에서 "d" 위치를 적어도 포함하는 2개 이상의 치환을 보유한다. 더욱 적절하게는, 나선-조장 아미노산으로 치환되는 기본 서열의 "a"와 "d" 위치의 총 개수는 2개 내지 5개이다. 바람직한 구체예에서, 나선-조장 아미노산은 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 1개 내지 3개 추가의 루이신 지퍼-유사 모티프를 형성하는 루이신 또는 이소루이신, 또는 루이신과 이소루이신의 조합이다. 이들 합성 펩티드는 SEQ ID NO:82, 84, 85, 86, 87에 의해 예시된다.

다른 구체예에서, 합성 펩티드는 (a) (i) 나선-조장 아미노산과 (ii) 하전된 아미노산 잔기로 기본 서열의 아미노산의 대략 5% 내지 60%의 치환, 이는 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에 존재하지 않는 합성 펩티드에서 복수의 이온쌍의 형성, 더욱 바람직하게는 합성 펩티드가 대략 3개 이온쌍 내지 대략 10개 이온쌍 범위의 다수의 이온쌍을 포함하는 정렬을 유도한다; (b) 향상된 생물 활성으로 기본 서열과 구별된다. 합성 펩티드는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, and SEQ ID NO:95; 또는 SEQ ID NO:6-81, 83, 88-95 중에서 하나이상과 적어도 90% 상동성을 보유하고 (i) 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에서 상응하는 아미노산 위치와 비교하여 복수의 나선-조장 아미노산의 추가, (ii) 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에서 상응하는 아미노산 위치와 비교하여 복수의 하전된 아미노산의 추가, (iii) 향상된 생물 활성으로 기본 서열과 구별되는 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 보유하는 합성 펩티드에 의해 예시된다. SEQ ID NO:96-98은 본 발명에 따른 합성 펩티드에 포함되지 않는다. 선호되는 합성 펩티드는 선호되는 합성 펩티드 이외의 합성 펩티드를 배제하는데 이용될 수 있다.

다른 구체예에서, 치환이 진행된 기본 서열 이외에, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 N-말단에 대략 1개 내지 20개 아미노산의 추가(가령, 기본 서열에 상응하는 N-말단 아미노산); 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 N-말단으로부터 대략 1개 내지 10개 아미노산의 결실(가령, N-말단 단부와 내부); 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 C-말단에 대략 1개 내지 20개 아미노산의 추가(가령, 기본 서열에 상응하는 C-말단 아미노산); 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 C-말단으로부터 대략 1개 내지 10개 아미노산의 결실(가령, C-말단 단부와 내부) 중에서 하나이상을 더욱 포함할 수 있다. 이런 구체예의 예시에는 SEQ ID NO: 14-23, 37-49, 63, 64, 66, 68, 69, 72-75, 78, 80, 88이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명을 예시하는 목적으로, 기본 서열(SEQ ID NO. 2, 3, 4)은 아래의 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)을 공유한다.

WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL

한 구체예에서, 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여, 기본 서열에 존재하는 아미노산(가령, 낮은 나선 성향이나 하전된 아미노산)을 치환하여 향상된 생물 활성을 보유하는 합성 펩티드를 유도하는 복수의 나선-조장 아미노산의 추가를 포함한다.

이런 치환의 예에는 아래의 치환이 포함되는데, 여기서 SEQ ID NO:3의 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 위치 아래 "h"는 하전된 아미노산(가령, 글루탐산) 또는 나선 성향이 낮은 아미노산(나선 성향을 보유하지 않는 것으로 간주되는 아미노산이 포함되지만 이들에 국한되지 않음) 대신에 나선-조장 아미노산의 추가를 표시한다.

실례 (b)-(d)에서, 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 현저하게 향상된 생물 활성을 유도하는 한 헵타드에서 "a" 위치 및 상이한(가급적, 인접한) 헵타드에서 "d" 위치를 적어도 포함하는 2개 이상의 치환을 보유한다. 더욱 적절하게는, 나선-조장 아미노산으로 치환되는 기본 서열의 "a"와 "d" 위치의 총 개수는 2개 내지 5개이다. 바람직한 구체예에서, 나선-조장 아미노산은 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 1개 내지 3개 추가의 루이신 지퍼-유사 모티프를 형성하는 루이신 또는 이소루이신, 또는 루이신과 이소루이신의 조합이다.

다른 구체예에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 구성되는 기본 서열과 비교하여 복수의 추가된 아미노산(가령, 치환된 아미노산)을 보유하는데, 여기서 SEQ ID NO:3의 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 위치 아래 "c"는 공간적으로 적절하게 이격된 반대로 하전된 아미노산(즉, 추가된 아미노산과 반대 전하)과 이온쌍을 형성하기 위하여 SEQ ID NO:3의 상응하는 아미노산 위치에서 하전되지 않은 아미노산 대신에 하전된 아미노산의 추가를 표시하고, 아미노산 위치 아래 "h"는 하전된 아미노산(가령, 글루탐산) 또는 나선 성향이 낮은 아미노산(나선 성향을 보유하지 않는 것으로 간주되는 아미노산이 포함되지만 이들에 국한되지 않음) 대신에 나선-조장 아미노산의 추가를 표시한다.

*는 나선-조장 아미노산 또는 하전된 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치를 나타낸다.

하전된(여기서 "+"는 양으로 하전을 나타내고, "-"는 음으로 하전을 나타낸다) 아미노산("c"로 표시됨)으로 치환이후, 아미노산 위치에서 형성되는 이온쌍의 실례에는 아래와 같은 이온쌍이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드(이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여)는 (a) 나선-조장 아미노산이 부재하는 기본 서열의 상응하는 위치에서 2개의 나선-조장 아미노산 내지 14개의 나선-조장 아미노산 및 (b) 하전된 아미노산이 부재하는 기본 서열의 상응하는 위치에서 2개의 하전된 아미노산 내지 10개의 하전된 아미노산을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다.

B. 헬리시티(Helicity)

헬리시티는 생물물리학적 파라미터이다. 펩티드의 헬리시티는 원편광 이색성(circular dichroism)에 의한 평가에서 대략 9% 내지 10% 범위에 존재한다(실시예 1). 본 발명에 따른 합성 펩티드는 일반적으로, 대략 25% 내지 100%, 바람직하게는 대략 48% 내지 85% 범위의 헬리시티를 보유한다.

C. 크기

본 발명에 따른 합성 펩티드는 대략 15개 아미노산 내지 대략 60개 아미노산, 바람직하게는 대략 28개 아미노산 내지 대략 38개 아미노산 길이의 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 상응하는 위치에서 아미노산과 구별되는 일부 아미노산의 합성 펩티드로의 함입(아미노산의 치환)으로 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, 또는 이들의 일부분 중에서 하나이상으로부터 유래된다(가령, 적어도 연속 아미노산 잔기의 연속 서열을 포함한다). 아미노산 서열에서 차이(합성 펩티드 및 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에서 아미노산 서열 차이)는 아래에 더욱 상세하게 기술되는 생물물리학적 파라미터(가령, 헬리시티와 안정성) 및 생물학적 파라미터(가령, 항바이러스 활성)에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 하나이상의 보존성 치환을 추가로 포함할 수 있다. 아래에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 거대분자 담체를 추가로 포함할 수 있다.

D. 향상된 생물 활성

본 발명에 따른 각 합성 펩티드의 중요한 특징은 향상된 생물 활성을 보인다는 점이다. 이런 향상된 생물 활성은 아래의 이유로 예상치 못한 것이었다. 역전사효소 저해물질과 프로테아제 저해물질과 같은 현재의 항레트로바이러스 약물의 종류(일반적으로, 작용 기전을 지시하는 종류)의 경우에, 단순한 바이러스 돌연변이(하나이상의 아미노산 잔기에서)가 바이러스 돌연변이체에 대한 한 종류의 항레트로바이러스 약물의 효능 상실이나 감소(“저항성”)를 유발할 수 있다. 가령, 특히 HIV-1 역전사효소 핑거 서브도메인의 연결 루프에 대한 코돈(가령, 코돈 69 또는 코돈 151)에서 단일 돌연변이는 모든 뉴클레오시드 역전사효소 저해물질에 대한 폭넓은 교차 저항성(cross resistance)과 연관한다. 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해물질(NNRTI)이 화학적으로 다양하긴 하지만, 단일 돌연변이(역전사효소의 소수성 공동(hydrophobic cavity) 또는 NNRTI 결합 부위에 존재하는 것으로 생각되는 아미노산 103에서)는 NNRTI에 대한 폭넓은 교차 저항성을 유발한다. 프로테아제 저해물질(PI)의 구조적 다양성에도 불구하고, 이런 종류의 모든 구성원에 대한 교차-저항성을 보유하는 HIV-1 균주가 출현하고 있다. 더욱 구체적으로, HIV 프로테아제에서 제한된 수의 돌연변이(가령, 독자적으로 및 다른 돌연변이의 존재하에 아미노산 10과 90에서 통합된 치환)는 PI에 대한 폭넓은 교차-저항성을 유도한다. 이런 이유로, 당업자는 gp41 아미노산 서열(가령, HR1 영역)에서 단일 또는 제한된 숫자의 돌연변이가 HIV gp41로부터 유래된 폭넓은 종류의 융합 저해물질 펩티드(본 발명에 따른 합성 펩티드 포함)에 대한 저항성을 공여한다. 따라서, HR2 영역으로부터 유래되고 본 발명에 따른 아미노산 서열에서 변형된 합성 펩티드가 HIV gp41의 고유 서열로부터 유래된 펩티드에 바이러스 저항성을 유발하는 바이러스 돌연변이에 대한 향상된 생물 활성(즉, 증가된 항바이러스 효능)을 나타낼 수 있다는 사실은 예상치 못한 결과이다. 가령, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 HIV-1 gp41의 고유 서열로부터 유래된 펩티드(가령, 기본 서열, 또는 T20(SEQ ID NO:1))에 저항하는 바이러스에 대하여 0.3 ㎍/㎖ 이하, 바람직하게는 0.10 ㎍/㎖ 미만의 IC50을 나타내는 경우에 예상치 않게 향상된 생물 활성을 보유한다. 따라서, 본 발명에 따른 합성 펩티드에는 SEQ ID NO: 96, 97, 또는 98이 포함되지 않는다.

부가적으로, 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 HIV-1 gp41의 고유 서열로부터 유래된 펩티드(가령, 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열)에 저항하는 바이러스에 대한 항바이러스 활성에서 증가 및 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 향상된 약동학적 특성을 보유한다. 가령, SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 구성되는 염기 서열의 경우에, 각각의 제거율 수치(L/K/hr)는 본 명세서에 기술된 방법을 이용한 측정에서 0.30 이상이었다. 비교의 목적으로 동일한 방법을 이용한 측정에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 대략 0.005 내지 0.07(L/K/hr) 범위의 제거율 수치를 보유한다. 따라서, 적절하게는, 향상된 약동학적 특성은 제거율에서 30% 이상의 감소로 예시된다. 다른 실례에서, SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 구성되는 염기 서열의 경우에, 각각의 생물학적 반감기(“소실 반감기(terminal elimination half-life)”, 또는 시간(hr)이나 이의 분획으로 표시되는 "t½")는 본 명세서에 기술된 방법을 이용한 측정에서 0.50 hr 이상이었다. 비교의 목적으로 동일한 방법을 이용한 측정에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 대략 3 hr 내지 20 hr 초과의 생물학적 반감기를 보유한다. 따라서, 합성 펩티드의 향상된 약동학적 특성은 생물학적 반감기에서 5배 이상 증가; 바람직하게는, 생물학적 반감기에서 10배 이상 증가, 더욱 바람직하게는 생물학적 반감기에서 30배 이상 증가로 예시된다.

E. 안정성

안정성은 당분야에 공지된 단백질과 펩티드의 생물물리학적 파라미터이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 안정성을 결정하는 다양한 방법이 존재한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 대략 25℃ 내지 75℃, 바람직하게는 대략 36℃ 내지 65℃ 범위의 용융 온도("Tm")로 대표되는 안정성을 보유한다.

아래에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 합성 펩티드는 하나이상의 반응성 기능기(가령, C-말단 단부 또는 N-말단 단부, 또는 이들의 조합(C-말단 단부와 N-말단 단부 모두)), 제약학적으로 허용되는 담체, 거대분자 담체, 이들의 조합에서 선택되는 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 아래의 무제한적 실시예에 예시된다.

실시예 1

아래의 실시예에서, 다양한 생물물리학적 파라미터와 생물학적 파라미터를 평가하였다. 이들 파라미터를 결정하기 위한 일반적인 방법은 아래와 같다:

합성 펩티드와 기본 서열을 비롯한 펩티드는 표준 고체-상 합성 기술 및 표준 FMOC 펩티드 화학을 이용하여 펩티드 합성기에서 합성하였다. 본 실시예에서, 합성 펩티드는 반응성 기능기를 더욱 포함할 수 있다; 다시 말하면, 대부분은 아세틸기에 의해 N-말단에서 및/또는 아마이드기에 의해 C-말단에서 차단되거나, 또는 N-말단 또는 C-말단에서 링커를 포함하였다. 수지로부터 절단이후, 펩티드는 침전시키고, 침전물은 냉동 건조시켰다. 이후, 이들 펩티드는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제하고, 펩티드 상동성은 전자분사 질량 분광분석법(electrospray mass spectrometry)으로 확인하였다.

헬리시티는 아래와 같이 원편광 이색성(circular dichroism, "CD")으로 평가하였다. 간단히 말하면, CD 스펙트럼은 열전 온도 조절기(thermoelectric temperature controller)가 구비된 분광분석기(spectrometer)를 이용하여 획득하였다. 상기 스펙트럼은 25℃, 200 내지 260 nm에서 0.5 nm 단계, 1.5 nm 대역폭, 4 초/단계의 전형적인 평균 시간에서 획득되었다. 세포/완충액 블랭크(blank)를 제외한 이후, 스펙트럼은 무작위 잔차(random residual)를 제공하는 보수적 윈도우 크기(conservative window size)를 갖는 3차 최소 제곱 다항 적합(third-order least-squares polynomial fit)을 이용하여 부드럽게 하였다. 표준 방법을 이용하여 거친 타원율 수치(raw ellipticity value)를 평균 잔여 타원율(mean residue ellipticity)로 전환시키고, 파장(200 내지 260 nm) vs. [θ] x 10-3(degrees cm²/dmol)을 도면에 기입하였다. 이후, 표준 방법을 이용하여 헬리시티 비율 수치(percent helicity value)를 계산하였다(일반적으로 10μM, 25℃에서 헬리시티 비율로 표시됨). 열 안정성의 평가는 1 분 평형 시간(equilibrium time)에서 온도가 2℃ 단계로 상승함에 따라 222 nm에서 CD 신호의 변화를 모니터함으로써 수행하였다. Tm 수치로 대표되는 각 샘플(가령, 합성 펩티드)에 대한 안정성은 열 전이(thermal transition)의 일계도 함수(first derivative)의 최대값에 상응하는 온도이다.

본 발명에 따른 합성 펩티드의 항바이러스 활성(가령, HIV의 표적 세포로의 감염을 저해하는 능력 척도)을 결정하는데 시험관내 검사가 이용되었는데, 이는 생체내에서 관찰되는 항바이러스 활성을 전조하는 HIV gp41의 HR 영역으로부터 유래된 펩티드를 이용하여 산출된 데이터에 의해 입증된다. 더욱 구체적으로, 시험관내 감염력(infectivity) 검사를 이용하여 관찰된 항바이러스 활성(“Magi-CCR5 감염력 검사"; U.S. Patent No. 6,258,782)에서 동일한 HIV gp41 유래된 펩티드에 대하여 생체내에서 관찰되는 항바이러스 활성과 합리적인 상관관계가 확인되었다(참조: Kilby et al., 1998, Nature Med. 4:1302-1307). 이들 검사법은 표지 세포주 MAGI 또는 CCR5 발현 유도체 cMAGI를 이용하여 감염성 바이러스 역가의 감소를 평가한다. 양 세포주는 HIV-LTR에 의해 유도되는 β-갈락토시다아제 리포터 유전자의 발현을 전이활성화(transactivation)시키는 HIV-1 tat의 능력을 이용한다. β-gal 리포터는 핵에 집중되도록 변형되고, 감염 수일 내에 강한 핵 염색(intense nuclear staining)에 의해 X-gal 기질로 검출될 수 있다. 염색된 핵의 개수는 염색에 앞서 1차 감염된 경우에 공격 접종물에서 감염성 비리온의 개수와 동동한 것으로 간주될 수 있다. 감염된 세포는 CCD-촬영 장치를 이용하여 계산하는데, 일차 분리물과 실험실 적응된 분리물 모두 바이러스 입력(virus input) 및 상기 촬영 장치에 의해 가시화되는 감염된 세포의 개수 사이의 선형 상관관계를 보여준다. MAGI과 cMAGI 검사에서, 감염성 역가에서 50% 감소(Vn/Vo = 0.5)는 현저하고, 항바이러스 활성을 평가하기 위한 일차 컷오프 수치(cutoff value)를 제공한다("IC50"은 감염성 바이러스 역가에서 50% 감소를 유도하는 활성 성분의 농도로 정의된다). 항바이러스 활성이 검사되는 펩티드는 다양한 농도로 희석하고, 48 웰 마이크로역가 평판의 대략 1500-2000개의 감염된 세포/웰을 산출하도록 조정된 HIV 접종물에 대하여 이중 또는 삼중으로 검사하였다. 펩티드(개별 희석도에서)를 cMAGI 또는 MAGI 세포에 첨가하고, 이후 바이러스 접종물을 첨가하였다; 24시간후, 감염과 세포-세포 융합의 저해물질(가령, T20)을 첨가하여 2차 HIV 감염과 세포-세포 바이러스 확산을 예방하였다. 이들 세포는 2일간 추가로 배양하고, 이후 고정시키고 X-gal 기질로 염색하 여 HIV-감염된 세포를 검출하였다. CCD-촬영 장치를 이용하여 각 대조와 펩티드 희석액에 대한 감염된 세포의 개수를 결정하고, 이후 IC50을 계산하였다(㎍/㎖로 표시됨).

기본 서열로 구성되는 펩티드의 항바이러스 활성에 저항하는 바이러스는 표준 실험실 방법을 이용하여 생산할 수 있다. 기본적으로, IC50과 IC90을 계산한 이후, 세포는 바이러스 및 배양(세포가 분할된 경우 포함) 펩티드(가령, IC90에 근접하는 농도에서)와 혼합하였다. 이들 배양액은 유지시키고 합포체(syncytia)가 존재할 때까지 모니터한다. 1차 배양액으로부터 수확된 바이러스를 이용하여 2차 배양액상의 세포를 감염시키는데, 펩티드는 1차 배양액에 이용된 농도보다 높은(2 내지 4배) 농도로 존재한다. 2차 배양액은 유지시키고 펩티드의 항바이러스 활성에 저항하는 바이러스의 존재를 모니터한다. 펩티드의 항바이러스 활성에 저항하는 바이러스 분리물을 최종적으로 산출하기 위하여 후속 배양액이 필요할 수도 있다(이런 분리물에 대한 펩티드의 미리 결정된 IC50 수준에서).

약동학적 특성을 결정하기 위하여, 합성 펩티드 또는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열을 키노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)(Macaca fasicularis)에 정맥내 투약하였다(당분야에 공지된 다른 동물 모델 역시 약동학적 특성을 결정하는데 이용될 수 있다). 다양한 투약 시점에서, 혈액 샘플을 채취하고 원심분리로 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플은 전자분사 양성-이온 모드(electrospray, positive-ion mode)에서 LC-MS(액체 크로마토그래피/질량 분광분석법)에 의한 분석 때까지 동결 보관하였다. 합성 펩티드 또는 기본 서열은 10 mM 암모늄 아세테이트 의 완충액, pH 6.8에서 아세토니트릴의 구배로 C18 HPLC 칼럼으로부터 용리하였다. 분석 시점에서, 혈장 샘플은 0.5% 포름산을 함유하는 2 또는 3 볼륨(volume)의 아세토니트릴로 제단백하였다. 이들 샘플과 동일한 시점에 키노몰구스 혈장 샘플에서 이중 보정 표준(duplicate calibration standard)을 준비하고, 합성 펩티드 또는 기본 서열을 보유하는 샘플 전후에 분석하였다. 약동학적 특성은 단일-지수(mono-exponential) 또는 이중-지수(bi-exponential) 수치 모형을 이용하여 혈장-농도-시간 데이터로부터 산정하였다. 모형은 비-선형 최소 제곱 최적화(non-linear least squares optimization)로 유도하였다. 농도의 1/C²가중(weighting)을 이용하였다. 아래의 방정식을 이용하여 혈장 농도 vs. 시간 곡선 아래 영역(AUC), 전신 제거율(Cl), 소멸 반감기(t½)를 산정하였다.

AUC = A/-a + B/-b

여기서 A와 B는 절편(intercept)이고 a와 b는 각각 분산과 제거 단계를 기술하는 상기 지수 방정식의 상수이다. 단일-지수 모형이 이용되는 경우에, "A"와 "a" 속성은 배제되었다.

Cl = 용량/AUC(L/K/hr로 표시됨)

t ½ = -0.6903/b(hr로 표시됨)

실시예 2

본 발명에 따른 한 구체예에서, 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드의 아미노산 서열이 유래되는 기본 서열과 비교하여 하나이상의 나선-조장 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산이 추가된 점을 제외하고 동일하게 합성되었다. SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 보유하는 합성 펩티드에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 SEQ ID NO:4로 구성되는 기본 서열과 관련하여 복수의 나선-조장 아미노산 치환을 포함하도록 합성하였다. 표 1을 참조하면, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 실시예 1에 기술된 방법을 이용한 결정에서, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 기본 서열을 보유하는 펩티드와 생물물리학적 파라미터 및 생물학적 파라미터를 비교하였다. 항바이러스 활성에 의한 평가로 생물 활성을 결정함에 있어, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 기본 아미노산 서열을 보유하는 펩티드의 항바이러스 활성에 저항하는 바이러스 돌연변이체가 이용되었다(상기 저항성 바이러스 분리물은 표 1 및 이후의 표에서 "RY"로 지시된다).

표 1을 참조하면, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 이런 펩티드가 유래되는 HR2의 고유 서열의 펩티드(가령, 기본 서열 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 중에서 임의의 한 서열)와 비교하여 (a) 헬리시티에서 증가(가령, 대략 3배 내지 5배 또는 그 이상 증가)를 보이고; (b) 기본 서열 중에서 한 서열(가령, SEQ ID NO:2 또는 4)을 보유하는 펩티드에 저항하는 바이러스(가령, 바이러스 분리물 HIV RY)에 대한 예상치 않게 현저하게 향상된 항바이러스 활성을 보인다.

생물물리학적 파라미터와 생물학적(항바이러스 활성) 파라미터

SEQ ID NO:	헬리시티 (%)	Tm (℃)	항바이러스 활성 HIV-IIIB IC50	항바이러스 활성 HIV-RY IC50
2	9	<10	<0.10	>4.0
4	10	<10	<0.10	>4.0
5	51	>20	<0.10	<0.30
82	11	>10	<0.10	<0.20
84	18	>15	<0.10	<0.20
85	91	45	<0.10	<0.10
86	66	30	<0.10	<0.30
87	11		<0.10	<0.10

실시예 3

다른 구체예에서, 기본 서열 SEQ ID NO: 2-4 중에서 하나이상에 존재하는 아미노산 대신에 나선-조장 아미노산과 하전된 아미노산(복수의 이온쌍 형성)을 포함하는 아미노산의 추가를 보유하는 합성 펩티드를 생산하였다. 설명의 목적으로, SEQ ID NO:6-81과 83-95 중에서 하나를 보유하는 아미노산으로 예시되는 합성 펩티드를 실시예 1에 개설된 방법을 이용하여 생산하고 평가하였다. 표 2를 참조하면, 이들 합성 펩티드는 실시예 1에 상세하게 기술된 방법을 이용하여, HR2 영역의 고유 서열로부터 유래된 펩티드(기본 서열, SEQ ID NO:4) 및 i,i + 4 정렬 단독(즉, 임의의 나선-조장 아미노산의 추가 없이)으로 구성되는 치환을 보유하는 펩티드(가령, SEQ ID NO:96-98)와 생물물리학적 파라미터와 생물학적 파라미터를 비교하였다.

Agg-결집됨

표 2를 참조하면, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 이런 펩티드가 유래되는 HR2의 고유 서열의 펩티드(가령, 기본 서열 SEQ ID NO:2 내지 SEQ ID NO:4 중에서 임의의 한 서열)와 비교하여 기본 서열 중에서 한 서열(가령, SEQ ID NO:2 또는 4)을 보유하는 펩티드에 저항하는 바이러스(가령, 바이러스 분리물 HIV RY)에 대한 예상치 않게 현저하게 향상된 항바이러스 활성을 보인다. 부가적으로, 합성 펩티드는 기본 서열 중에서 한 서열(가령, SEQ ID NO:2 또는 4)과 비교하여 헬리시티에서 증가(가령, 대략 3배 내지 5배 또는 그 이상)를 더욱 나타낸다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 이런 펩티드가 유래되는 HR2의 고유 서열의 펩티드(가령, 기본 서열 SEQ ID NO:2 내지 SEQ ID NO:4 중에서 임의의 한 서열)와 비교하여, 예로써 대략 25℃ 내지 75℃, 바람직하게는 대략 36℃ 내지 65℃ 범위의 Tm으로 측정되는 안정성을 부가적으로(가령, 헬리시티에서 증가 및 예상치 않게 향상된 생물 활성에 더하여) 및 우선적으로 나타낸다.

표 1과 2에서는 (a) 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 활성에 저항성을 나타내는 HIV 균주에 대한 합성 펩티드의 항바이러스 활성을 결정하고; (b) 상기 합성 펩티드가 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열의 활성에 저항성을 나타내는 HIV 균주에 대한 0.10 ㎍/㎖ 미만의 IC50으로 측정되는 항바이러스 활성을 보유한다는 것을 입증함으로써 본 발명에 따른 합성 펩티드의 예상치 않게 향상된 생물 활성을 뒷받침한다. 이런 예상치 않은 생물 활성의 다른 증거에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 시험관내 저항성 바이러스를 발생시키는 시도에 이용되었다. 따라서, 합성 펩티드에 대한 저항성 바이러스를 발생시키는 것이 더욱 어렵다는 증거는 이런 합성 펩티드가 HR2로부터 고유 서열 및/또는 기본 서열과 비교하여 예상치 않게 향상된 생물 활성을 보유한다는 것을 증명한다.

실시예 1에 개설된 방법을 이용하여, SEQ ID NO:9 & SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 보유하는 합성 펩티드는 저항성 HIV를 발생시키도록 설계된 실험에서 SEQ ID NO:2의 기본 서열을 보유하는 펩티드와 비교하였다. 일단의 실험에서, HIV-감염된 세포의 시험관내 배양액은 HIV-감염된 세포와 함께 배양되는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖ 농도의 펩티드에 저항하는 HIV 분리물의 발생 종점에 도달하기 위하여 개별 합성 펩티드 또는 기본 서열의 존재하에 계대배양하였다. 전형적으로, HIV-감염된 세포는 IC50 내지 IC90 사이의 농도에서 합성 펩티드 또는 기본 서열로 시작한 이후, 시험관내에서 배양하고 2 내지 3일마다 분할하며, 분할동안 합성 펩티드 또는 기본 서열을 추가하여 지속적이고 일정한 양의 합성 펩티드 또는 기본 서열의 존재하에 HIV-감염된 세포를 유지시켰다. 낮은 농도 수준의 합성 펩티드 또는 기본 서열에서 저항성 분리물(세포변성 효과/합포체 형성으로 측정됨; 1회 계대배양으로 간주)을 발생시킨 이후, 세포는 상기 계대배양으로부터 발생된 저항성 분리물로 감염시키고, 이후 이들 세포는 저항성 HIV 분리물이 발생될 때까지 더욱 높은 농도(가령, 이전 계대배양에서 이용된 농도의 2 내지 3배)의 합성 펩티드 또는 기본 서열의 존재에서 배양하였다. 상기 절차는 종점이 달성될 때까지 반복하였다. 종점에 도달하는데 필요한 계대배양 횟수 및 배양 일수(성공적인 각 계대배양(생존 바이러스가 산출되고, 이후 모든 성공적인 계대배양에 대하여 합계되는 경우에)에서 일수)를 결정한다. 결과는 예시된 각 기본 서열 또는 합성 펩티드에 대하여 평균하였다. 표 3에 도시된 바와 같이, 종점을 상징하는 저항성 HIV 분리물을 발생시키기 위하여, 기본 서열에 비하여 본 발명의 합성 펩티드의 존재하에 훨씬 많은 계대배양 횟수(표 3, “계대배양 #”)와 계대배양 일수(표 3, “일수 #”)가 요구된다(달성된다면). 표 3의 결과는 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 이런 합성 펩티드에 의해 달성되는 예상치 않게 향상된 생물 활성의 다른 표지이다.

시험관내 저항성 생성

SEQ ID NO:	평균 계대배양 #	평균 일자 #
SEQ ID NO:2	15	115
SEQ ID NO:9	19	188
SEQ ID NO:10	>20 NA	>200 NA

"NA"는 종점에 도달하지 않음을 의미한다.

실시예 4

본 실시예에서는 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 본 발명에 따른 합성 펩티드의 향상된 약동학적 특성을 예시한다. 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이 약동학적 특성을 평가하는 방법을 이용하여, 표 4에서는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3으로 구성되는 기본 서열의 약동학적 특성과 비교하여 대표적인 합성 펩티드의 약동학적 특성을 예시한다.

SEQ ID NO:	제거율(L/K/hr)	반감기(t½ hr)
2	> 0.4	< 0.5
3	> 0.3	< 0.5
10	< 0.05	> 5.0
11	< 0.05	> 5.0
50	< 0.10	> 3.0
51	< 0.05	> 15.0
52	< 0.05	> 10.0
53	< 0.05	> 5.0
54	<0.01	> 20.0

표 4에 예시된 바와 같이, 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열과 비교하여 한가지이상의 약동학적 특성(가령, 제거율 및/또는 t½)에서 관찰되는 약동학적 특성의 현저한 향상을 보였다. 적절하게는, 향상된 약동학적 특성은 제거율에서 30% 이상의 감소로 예시된다. 적절하게는, 향상된 약동학적 특성은 생물학적 반감기에서 5배 이상의 증가, 바람직하게는 생물학적 반감기에서 10배 이상의 증가, 더욱 바람직하게는 생물학적 반감기에서 30배 이상의 증가로 예시된다.

실시예 5

본 발명에서는 본 발명에 따른 합성 펩티드를 제시하는데, 이들 펩티드는 HIV(합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에 저항하는 분리물 포함)의 표적 세포로의 감염을 저해하는 능력으로 입증되는 항바이러스 활성을 보유한다(참조: 표 1 & 2). 부가적으로, 본 발명에 따른 합성 펩티드의 용도를 제시한다. 가령, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 HIV 감염의 치료에서 활성 치료 물질로서 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 HIV의 치료를 비롯한 치료 목적의 약물을 제조하는데 이용될 수 있다. 부가적으로, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 HIV의 치료에 이용될 수 있다(가령, 처리된 개체에서 HIV의 바이러스 하중을 감소시키고 및/또는 CD4+ 세포 개체군을 증가시킬 수 있다). 한 구체예에서, HIV-감염된 개체를 치료하는 방법은 개체를 치료하거나 원하는 치료 목적을 달성하는 효과량의 합성 펩티드(합성 펩티드가 활성 치료 물질로서 존재하는 조성물/약물 포함)을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 후자와 관련하여, 기준 수치(baseline value)(바이러스 하중 및/또는 CD4+ 세포 수)는 합성 펩티드로 처리이전의 임상 샘플로부터 획득한다. 합성 펩티드로 처리의 개시이후 하나이상의 임상 샘플을 채취하고, 이들 샘플로부터 파라미터(“검사 수치(test value)”)를 측정한다. 기준 수치와 검사 수치를 비교하여 합성 펩티드로 처리로부터 원하는 치료 효과가 달성되었는지를 결정한다(가령, 검사 수치와 기준 수치 사이의 차이는 원하는 효과가 달성되었음을 지시할 수 있다).

다른 구체예에서, HIV의 표적 세포로의 전염을 저해하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIV에 의한 세포의 감염을 저해하는 효과량의 본 발명에 따른 합성 펩티드를 이들 바이러스와 세포에 첨가하는 단계를 포함한다. 부가적으로, HIV 융합(가령, HIV에 의한 표적 세포의 감염동안 HIV gp41이 바이러스 막과 세포 막 사이의 융합을 매개하는 과정)을 저해하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 세포의 존재하에, HIV 막 융합을 저해하는 효과량의 본 발명에 따른 합성 펩티드와 상기 바이러스를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이들 방법은 HIV-감염된 개체(치료 목적)를 치료하거나, 또는 HIV에 새로이 노출되거나 노출의 위험이 높은(가령, 약물 남용 또는 고위험 성적 행위) 개체(예방 목적)를 치료하는데 이용될 수 있다. 따라서, HIV-1 감염된 개체의 경우에, 효과량은 치료되는 개체에서 HIV 바이러스 하중을 감소시킬 만큼 충분한 양이다(단독으로 및/또는 투약 섭생과 공동으로). 당업자에게 공지된 바와 같이, HIV 바이러스 하중을 측정하는 여러 방법이 존재하는데, 여기에는 말초 혈액 단핵 세포의 정량적 배양, 혈장 HIV RNA 측정, 당분야에 공지된 표준 방법을 이용한 핵산 증폭을 수반하는 정량적 방법에 의한 바이러스 핵산 측정이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. CD4⁺ 세포 수준(“CD4⁺ 세포 수”)을 결정하는 방법은 당분야에서 표준이다. 이들 방법에는 유세포분석법(flow cytometry), 면역검사법(immunoassay), 자성 분리와 세포 산정, 면역세포화학(immunocytochemical), 면역염색(immunostaining)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다양한 단계의 HIV 감염과 AIDS를 지시하는 HIV 바이러스 하중과 CD4⁺세포 수에 대한 기준은 당분야에 공지되어 있다. 이런 기준에 대한 한 출처는 질병 통제 센터(Centers for Disease Control)이다.

본 발명의 합성 펩티드는 단일, 간헐적, 주기적, 또는 지속적으로 투여될 수 있는데, 이는 바이러스 하중 및/또는 합성 펩티드의 혈액 수준을 모니터하는 것과 같은 방법을 이용하여 의료 종사자에 의해 결정될 수 있다. 합성 펩티드를 함유하는 제제(formulation) 및 합성 펩티드가 거대분자 담체를 추가로 포함하는 지의 여부에 따라, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 일일 1회 또는 수회, 또는 1주일동안 주기적으로, 또는 1개월 주기적으로 투여될 수 있다. 더 나아가, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 HIV 진입 저해물질(가령, 다른 HIV 융합 저해물질(T20, T1249 등), CCR5 저해물질, 레트로사이클린 등), HIV 인테그라제 저해물질, 역전사효소 저해물질(가령, 뉴클레오시드 또는 비-뉴클레오시드), 프로테아제 저해물질, 바이러스-특이적 전사 저해물질, 바이러스 공정 저해물질(viral processing inhibitor), HIV 성숙 저해물질, 우리딘 포스포릴화 효소(uridine phosphorylating enzyme) 저해물질, HIV 백신 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 HIV 치료에 사용되는 한가지이상의 추가 항바이러스제를 함유하는 조합 또는 치료 섭생(가령, 동시에, 또는 한 약물의 사이클링 온(cycling on)과 다른 약물의 사이클링 오프(cycling off)로 사용되는 경우에)에서 한 구성요소로서 이용되는 경우에, HIV의 표적 세포로의 감염을 저해하는 상승적 결과 또는 증가된 치료 효능을 보일 수 있다.

가령, 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 하나이상의 합성 펩티드를 함유하고, 따라서 치료 효능을 증가시키고 바이러스가 항바이러스제에 저항하는 능력을 감소시키는 항바이러스제의 조합이 이용될 수 있다. 조합은 현재 승인되거나 앞으로 승인될 효과량의 항바이러스제(HIV 감염의 치료에 유효)로부터 제조될 수 있는데, 이런 항바이러스제에는 아바카비르(abacavir), AZT, 델라비리딘(delaviridine), ddC, ddI, 에파비렌즈(efavirenz), FTC, GS 840, HBY097, 3TC, 네비라핀(nevirapine), d4T, FLT, 엠트리시타빈(emtricitabine), 암프레니비르(amprenivir), CGP-73547, CGP-61755, DMP-450, 인디나비르(indinavir), 넬피나비르(nelfinavir), PNU-140690, 리토나비르(ritonavir), 사퀴나비르(saquinavir), 텔리나비르(telinavir), 테노포비르(tenofovir), 아데포비르(adefovir), 아타자나비르(atazanavir), 로피나비르(lopinavir), VX 478, PRO-542, 베툴린(betulin)과 디하이드로베툴린(dihydrobetulin) 유도체(가령, PA-457)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명에 따른 합성 펩티드와 조합으로 이용되는 이들 예시적인 항바이러스제의 효과량은 당분야에 공지되어 있다. 이들 조합은 당업자가 인지하는 바와 같이 투여 경로 및 원하는 약리학적 효과에 따라, 하나이상의 경로로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있는 다수의 항바이러스제를 함유한다.

본 발명에 따른 합성 펩티드의 투여 효과량은 당분야에 공지된 절차를 통하여, 예를 들면, 효능, 생물학적 반감기, 생체이용효율, 독성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 합성 펩티드의 효과량 범위는 당업자에게 널리 공지된 통상적인 시험관내와 생체내 연구로부터 획득된 데이터를 이용하여 당업자에 의해 결정된다. 가령, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항바이러스 활성의 시험관내 감염력 검사는 상당한 수준의 바이러스 감염력을 차단하는데 필요한 합성 펩티드의 평균 저해 농도(IC)(가령, 50% 저해, IC₅₀; 또는 90% 저해, IC₉₀)의 결정을 가능하게 한다. 이후, 적절한 용량은 하나이상의 표준 동물 모형으로부터 약동학적 데이터를 이용하여 당업자에 의해 선택될 수 있고, 따라서 미리 결정된 IC 값과 동등하거나 이를 초과하는 최소 혈장 농도(C[min])의 펩티드가 수득될 수 있다. 용량 범위가 선택된 투여 경로와 투약 제제에 주로 좌우되긴 하지만, 본 발명에 따른 합성 펩티드의 전형적인 용량 범위는 0.1 ㎍/kg 체중 내지 10 ㎎/kg 체중; 바람직하게는 대략 0.1 내지 100 ㎍/kg 체중; 더욱 바람직하게는, 대략 10 ㎎ 내지 250 ㎎ 합성 펩티드이다. 가령, 본 발명에 따른 합성 펩티드가 합성 펩티드 단독보다 이런 합성 펩티드를 더욱 오랫동안 혈액에서 유지되도록 하는 거대 담체를 추가로 포함하는 경우에, 합성 펩티드는 거대 담체를 함유하지 않는 제제에서 합성 펩티드와 비교하여 감소된 용량 및/또는 축소된 빈도로 투여될 수 있다.

본 발명의 약물(가령, 한가지이상의 제약학적으로 허용되는 담체 및 거대분자 담체와 함께)을 함유하는 조성물은 활성제가 표적 세포(HIV에 의해 감염될 수 있는 세포)에 도달할 수 있도록 하는 임의의 수단으로 개체에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 경구, 비경구(가령, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 주사 또는 주입, 피내, 또는 이식), 비강, 폐, 질, 직장, 설하, 또는 국소 투여 경로를 비롯한 임의의 적절한 기술로 투여될 수 있고, 각 투여 경로에 적합한 제형(dosage form)으로 조제될 수 있다. 특정 투여 경로는 이런 투여로부터 인정되거나 예상되는 부작용을 비롯한 개체의 병력 및 투여되는 제약학적 조성물의 제제(가령, 합성 펩티드가 추가로 포함하는 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 거대분자 담체의 특성)에 좌우된다. 가장 적절하게는, 투여는 주사(가령, 정맥내 또는 피하 수단)에 의해 수행될 뿐만 아니라 연속 주입(예로써 서방 장치, 또는 삼투압 펌프와 같은 미니펌프를 이용)으로 달성될 수도 있다. 본 발명에 따른 합성 펩티드를 함유하는 조성물은 한가지이상의 제약학적으로 허용되는 담체와 거대분자 담체를 추가로 함유할 수 있고, 또한 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자에 좌우될 수 있다. 바람직한 제제는 본 발명에 따른 합성 펩티드가 한가지이상의 작용제, 약물, 반응적 기능성(reactive functionality), 거대분자 담체, 또는 특히 개체에 투여된 이후 합성 펩티드의 대사/분해를 저해하거나 지연시키거나 지체시키는 제약학적으로 허용되는 담체를 통합하거나 이들을 추가로 포함하는 제제이다. 예로써, 본 발명의 합성 펩티드가 효소(가령, 흡수이전 소화 효소, 혈액에 존재하는 단백분해 효소 등)에 의한 가수분해로부터 보호되는 주입가능 제제, 서방 제제, 경구 제제가 여기에 포함된다. 부가적으로, 제제는 본 명세서에 상세하게 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는데, 상기 서열은 투여이후, 당분야에 널리 공지된 기술과 발현 벡터에 의해 목적 세포에서 발현된다.

실시예 6

본 발명에 따른 합성 펩티드의 개별 아미노산 서열에 기초하여, 이들 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 합성되거나 작제되고 이들 합성 펩티드가 HIV의 표적 세포로의 감염을 저해하는 방법을 위한 제조 수단으로서 재조합 DNA 기술에 의해 생산(가령, 유전자 또는 세포 요법의 수단으로서 이들 폴리뉴클레오티드를 생체내 도입함으로써 생체내 생산)될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명에 따른 합성 펩티드를 인코딩할 수 있고 이들 폴리뉴클레오티드가 이런 합성 펩티드의 아미노산 서열의 아미노산을 인코딩하는 것으로 알려져 있는 삼중항 코돈(triplet codon), 세 번째 염기 축퇴성, 발현이 요구되는 숙주 세포(가령, 원핵이나 진핵, 종 등)에 의해 선호되는 삼중항 코돈 사용빈도(codon usage)의 선택에 기초하여 합성될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 설명의 목적으로, 기본 서열 SEQ ID NO:2를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:99로서 제시되는데, 이로부터 코돈 사용빈도는 본 발명의 합성 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 전반적으로 적용된다. 따라서, SEQ ID NO:2와 관련하여 SEQ ID NO:99를 이용함으로써, 당업자는 SEQ ID NO:5를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(가령, 예시적인 실례로서 SEQ ID NO:100)를 용이하게 작제할 수 있다. 유사하게, 이런 정보로부터 당업자는 SEQ ID NO:11을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(가령, 예시적인 실례로서 SEQ ID NO:101)를 용이하게 작제할 수 있다. 하지만, 최초 코돈과 동일한 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈으로 치환될 수 있다. 더 나아가, 코돈 사용빈도는 박테리아 발현에 선호되는 코돈 사용빈도, 또는 포유동물 발현 시스템에서 발현에 선호되는 코돈 사용빈도와 다소 상이할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5-98, 또는 SEQ ID NO:5-98 중에서 임의의 하나와 적어도(가령, 이상) 90% 상동성을 보유하고 (i) 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에서 상응하는 아미노산 위치와 비교하여 복수의 나선-조장 아미노산의 추가; 또는 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에서 상응하는 아미노산 위치와 비교하여 복수의 나선-조장 아미노산의 추가 및 합성 펩티드가 유래되는 기본 서열에 상응하는 위치와 비교하여 복수의 하전된 아미노산, (ii) 예상치 않게 향상된 생물 활성에 의해 기본 서열과 구별되는 아미노산 서열에서 선택되는 합성 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유하는 원핵 발현 벡터 및 합성 펩티드의 재조합 생산에서 이의 용도를 제시한다. 한 실례에서, 폴리뉴클레오티드는 원핵 발현 벡터에 위치하고, 따라서 박테리아 숙주 세포에서 생산되는 합성 펩티드는 이런 합성 펩티드의 정제를 보조하는 서열과의 융합 단백질로서 생성된다. 가령, 발현이 요구되는 펩티드와의 융합 단백질의 일부로서, 발현에 이용된 원핵 세포의 세포질에서 발견되는 봉입체(inclusion body)의 생산을 조장하고 및/또는 이런 서열을 보유하는 융합 단백질의 정제를 보조하는 서열은 당분야에 공지되어 있다. 봉입체는 변성제(denaturing agent) 및 분별(가령, 원심분리, 칼럼 크로마토그래피 등)을 비롯한 당분야에 공지된 방법으로 다른 원핵 세포 성분으로부터 분리할 수 있다. 다른 실례에서, 발현이후 유전자 산물이 당분야의 표준 방법에 의한 유전자 산물의 정제에 이용될 수 있는 복수의 말단 히스티딘 잔기("His tag")를 보유하도록, 단백질 또는 펩티드로의 발현이 요구되는 목적 핵산 서열이 삽입된 벡터는 상업적으로 입수가능하다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 플라스미드 또는 플라스미드 이외의 벡터에 삽입될 수 있고, 박테리아 벡터 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아; 효모 벡터를 보유하는 효모; 진균 벡터를 보유하는 진균; 바이러스(가령, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포주; 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터가 도입되거나 재조합 바이러스(가령, 우두 바이러스. 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스 등)로 감염된 포유동물 세포주를 포함하지만 이들에 국한되지 않는 다른 발현 시스템이 이용될 수 있다. 합성 펩티드가 성공적으로 발현되려면, 합성 펩티드의 인코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자 또는 벡터 자체가 발현에 이용된 특정 숙주 시스템과 양립하고 이런 시스템에 인식되는 전사와 번역을 위하여 필요 조절 요소를 보유해야 한다. 상기한 방법을 비롯한 분자생물학 분야에 공지된 방법을 이용하여, 합성 펩티드의 증가된 발현이 특정 숙주 세포 시스템과 양립(가령, 비-독성)하는 조건하에, 합성 펩티드의 발현을 증가시키기 위하여 인코딩 서열을 포함하는 벡터 또는 재조합 DNA 분자에 다양한 프로모터와 인헨서를 통합할 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 프로모터의 선택은 이용된 발현 시스템에 좌우된다. 프로모터는 길이, 다시 말하면, 전사를 조장하는 능력에서 차별된다. 일반적으로, 클론된 유전자를 발현하는 경우에는 높은 수준의 유전자 전사 및 유전자 산물로의 발현을 달성하기 위하여 강한 프로모터를 이용하는 것이 바람직하다. 가령, 대장균(E. coli)을 비롯한 숙주 세포 시스템에서 높은 수준의 전사가 관찰되는 당분야에 공지된 박테리아, 파지 또는 플라스미드 프로모터에는 lac 프로모터, trp 프로모터, recA 프로모터, 리보솜 RNA 프로모터, P.sub.R과 P.sub.L 프로모터, lacUV5, ompF, bla, lpp 등이 포함되는데, 이들은 합성 펩티드를 인코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열의 전사를 제공하는데 이용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템용 발현 벡터에 통상적으로 이용되는 포유동물 프로모터는 포유동물 바이러스 유전자로부터 프로모터이다. 전형적인 실례는 SV40 조기 프로모터, 생쥐 유선 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 단순 포진 바이러스 프로모터, CMV 프로모터이다.

합성 펩티드의 발현이 숙주 세포에 치명적이거나 유해한 경우에는 특이적으로 유도될 때까지 프로모터의 작용이 저해되도록 숙주 세포 계통/세포주 및 발현 벡터를 선택할 수 있다. 가령, 특정 오페론에서 삽입된 DNA의 효율적인 전사를 위하여 특정 유도인자의 추가가 필요하다(가령, lac 오페론은 락토오스 또는 이소프로필티오-베타-D-갈락토시드(“IPTG”)의 추가에 의해 유도된다; trp 오페론은 성장 배지에서 트립토판이 부재하는 경우에 유도된다; 테트라사이클린은 tet 민감성 프로모터를 보유하는 포유동물 발현 벡터에 사용될 수 있다). 따라서, 합성 펩티드의 발현은 인코딩 서열로부터 발현을 조절하는 프로모터가 유도되지 않고 세포가 성장 배지에서 적절한 밀도에 도달한 이후에 발현을 위하여 프로모터가 인코딩 서열로부터 유도될 수 있는 조건하에, 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 조절할 수 있다. 효율적인 유전자 전사 또는 메시지 번역을 위한 다른 조절 요소는 당분야에 널리 공지되어 있는데, 여기에는 인헨서, 전사 또는 번역 개시 신호, 전사 종결과 폴리아데닐화 서열 등이 포함된다.

실시예 7

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 거대분자 담체를 추가로 포함한다. 이런 거대분자 담체는 당분야에 공지되어 있는데, 여기에는 혈청 단백질(전체 단백질 또는 이의 실질적인 일부분), 중합체, 탄수화물, 지질-지방산 공액체, 지방산 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 거대분자 담체로서 전형적으로 이용되는 혈청 단백질에는 트랜스페린, 알부민, 면역글로불린(가급적, IgG 또는 하나이상의 이의 사슬), 또는 호르몬이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다; 여기서 단백질은 바람직하게는 인간 단백질, 더욱 바람직하게는 재조합 인간 단백질이다. 거대분자 담체로서 전형적으로 이용되는 중합체에는 폴리리신 또는 폴리(D-L-알라닌)-폴리(L-리신), 또는 폴리올이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 선호되는 폴리올은 수용성 폴리(산화알킬렌) 중합체이고, 선형이나 가지형 사슬을 보유할 수 있다. 적절한 폴리올에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), PEG-PPG 공중합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

한 실례에서, 거대 분자는 합성 펩티드에 공액될 수 있다. 가령, 폴리올을 이용하는 경우에, 전형적으로 폴리올은 당분야의 표준 방법을 이용하여 유도화거나 결합제(coupling agent)와 반응시켜, 합성 펩티드의 반응적 기능성(바람직하게는, 유리 아민기)과 반응하는데 이용될 수 있는 하나이상의 말단 반응기를 보유하는 “활성화된” 폴리올을 형성한다. 이런 반응기에는 하이드록시기, 아민기, 알데하이드기 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이용된 폴리올은 선형 사슬 또는 가지형 사슬 중합체를 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 본 발명에 따른 합성 펩티드는 합성되는데, 이런 합성 과정의 최종 단계는 말레이미드기의 추가이다(가령, 3-말레이미도프로피온산을 첨가하고 세척하며, 이후 말레이미드기를 보유하는 합성 펩티드를 수지로부터 절단하는 고형 상 합성에서 한 단계에 의해). 이들 방법은 당분야에 공지되어 있다(참조: WO 00/69902). 이후, 합성 펩티드는 개체에 투여(바람직하게는, 비경구)되어, 혈액 성분(바람직하게는, 혈청 단백질; 더욱 바람직하게는 알부민)과 같은 거대분자 담체에 공액된다. 다른 실례에서, 당분야에 공지된 표준 결합제(가령, N-숙시니미딜 S-아세틸티오-아세테이트)를 이용하여, 재조합 인간 단백질(가령, 알부민, 트랜스페린, 면역글로불린 등)을 양성화(cationization) 및 티올화(thiolation)시킨다. 티올화되고 양성화된 재조합 인간 단백질은 당분야에 공지된 표준 결합 시약(가령, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)을 이용하여 아비딘에 결합시킨다. 이후, 생성된 아비딘화된 인간 단백질은 당분야의 표준 방법을 이용하여 미리 비오틴화된 합성 펩티드와 반응시킨다. 이런 방식으로, 거대분자 담체에 결합된 합성 펩티드가 생성된다.

대안적 실례에서, 거대분자 담체는 예로써 융합 단백질의 일부로서 합성 펩티드와 함께 유전적으로 발현될 수 있다. 가령, 알부민을 인코딩하는 DNA 서열을 링커를 인코딩하는 DNA 서열 및 본 발명에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열과 함께 벡터에 클론하여, 합성 펩티드가 알부민의 C-말단, N-말단, 또는 C-말단과 N-말단 모두에 연결되는 알부민을 포함하는 알부민 융합 단백질을 유전자 산물로서 수득할 수 있다. 특히 효모 발현을 위한 이들 벡터와 발현 시스템은 당분야에 널리 공지되어 있다(참조: U.S. Patent No. 5,728,553 & 5,965,386). 유용한 효모 플라스미드 벡터는 상업적으로 구입가능하고(가령, pRS403-406 시리즈, pRS413-416 시리즈), 효모 선별가능 마커(가령, his3, trp1, leu2, ura3 등)를 포함할 수 있다. 효모 발현을 위한 알부민-합성 펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유하는 발현 벡터는 효모 프로모터(가령, 사카로마이세스(Sacchromyces) PRB1 프로모터); 발현된 유전자 산물의 분비를 용이하게 하는 분비 리더(secretion leader)(가령, 자연 인간 알부민 분비 리더 및/또는 효모-유래된 분비 리더)를 인코딩하는 서열; 인간 알부민을 인코딩하는 서열(가령, Genbank에 개시된 서열); 링커(가령, 5-20개 아미노산 가닥, 바람직하게는 글리신과 세린을 보유하는 아미노산을 포함하는 링커)를 인코딩하는 서열; 합성 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 전사 종결인자(가령, 사카로마이세스(Saccharomyces) ADH1)를 포함하는 발현 카세트를 보유한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 알부민 융합 단백질의 N-말단 영역에 합성 펩티드를 위치시키는 경우에, 합성 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 인간 알부민을 인코딩하는 DNA 사이에 위치시킨다. 이후, 생성된 발현 벡터를 이용하여 효모를 형질전환시키는데, 재조합 생산을 위한 배양 조건과 재조합 산물의 정제는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 이렇게 수득된 합성 펩티드는 거대분자 담체를 추가로 포함한다.

예시적인 실례로서, 본 발명에 따른 합성 펩티드를 보유하는 융합 단백질을 생산하였다. 당분야에 공지된 표준 방법을 이용하여, 말토오스 결합 단백질("MBP"), 절단가능 링커, 합성 펩티드(SEQ ID NO:11)를 포함하는 융합 단백질(SEQ ID NO:103)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO:102)를 보유하는 발현 벡터를 작제하였다. 생성된 발현 벡터는 숙주 발현 시스템으로서 대장균(E. coli) 균주에 형질전환시키고, 형질전환된 세포는 성장시키고, 당분야에 공지된 표준 방법을 이용한 IPTG의 박테리아 배양액으로의 첨가로 융합 단백질이 발현되도록 유도하였다. 유도된 박테리아 세포는 마이크로플루다이저(microfludizer)로 용해시키고, 용해물은 당분야에 공지된 표준 방법을 이용한 원심분리로 박테리아 파편을 제거하였다. 이후, 정화된 용해물은 융합 단백질과의 융합(MBP 부분을 통한)을 위하여 아밀로오스 수지로 채워진 칼럼을 이용한 크로마토그래피를 수행하였다. 이들 칼럼은 세척하고 말토오스-함유 용액으로 융합 단백질을 용리시켰다. 실시예 1에 개설된 방법을 이용한 항바이러스 활성의 검사에서, 합성 펩티드를 보유하는 분리된 융합 단백질은 HIV-1에 대한 항바이러스 활성(가령, <0.10 ㎍/㎖의 HIV IIIB에 대한 IC50)을 보였다.

본 발명의 특정 구체예에 관한 상기한 설명은 예시를 목적으로 한다. 상기 상세한 설명과 실시예에 비추어, 본 발명의 기본적인 개념을 벗어나지 않는 다양한 개변은 당업자에게 자명하고, 이런 개변은 첨부된 특허청구범위에 포섭된다.

SEQUENCE LISTING <110> Trimeris, Inc. <120> HIV gp41 HR2-derived synthetic peptides, and their use in therapy to inhibit transmission of Human Immunodeficiency Virus <130> TRM-007PCT <150> 60/534810 <151> 2004-01-07 <160> 103 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized <400> 1 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30 Trp Asn Trp Phe 35 <210> 2 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized <400> 2 Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu 1 5 10 15 Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu 20 25 30 Gln Glu Leu Leu 35 <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized <400> 3 Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His 1 5 10 15 Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Leu 35 <210> 4 <211> 38 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taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatcccaacg accgaaaacc tgtattttca gggcgctaaa 1200 gaagctgctc agcgtgctaa cgctaccacc tgggaagctt gggaccgtgc tatcgctgaa 1260 tacgctgctc gtatcgaagc tctgatccgt gctgctcagg aacagcagga aaaaaacgaa 1320 gctgctctgc gtgaactg 1338 <210> 103 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized <400> 103 Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile 370 375 380 Glu Gly Arg Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ala Ala Gln Arg Ala Asn Ala Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg 405 410 415 Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala 420 425 430 Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 435 440 445

Claims

SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 하나이상의 기본 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 보유하는 합성 펩티드에 있어서, 상기 합성 펩티드는 나선-조장 아미노산을 포함하는 2개 내지 5개의 아미노산으로 기본 서열과 구별되고, 이들 나선-조장 아미노산은 기본 서열 내에서 헵타드의 "a"와 "d" 위치에 상응하는 위치에서 기본 서열에서 아미노산을 대체하고, 상기 나선-조장 아미노산은 기본 서열에서 발견되는 루이신 지퍼-유사 모티프의 개수와 비교하여 합성 펩티드에서 1개 내지 3개의 추가 루이신 지퍼-유사 모티프의 형성을 유도하고, 상기 합성 펩티드는 기본 서열과 비교하여 향상된 생물 활성을 나타내고, 향상된 생물 활성에는 (a) 기본 서열에 저항하는 HIV 균주에 대한 항바이러스 활성에서 증가 및 (b) 향상된 약동학적 특성이 포함되는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 1항에 있어서, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87 중에서 임의의 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
(a) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, 또는 SEQ ID NO:95 중에서 임의의 아미노산 서열; 또는

(b) SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 중에서 하나이상으로부터 1 개 내지 3개의 아미노산 치환으로 구별되지만 (i) SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 중에서 하나이상의 기본 서열 내에서 상응하는 아미노산 위치와 비교하여 복수의 나선-조장 아미노산의 추가, (ii) 기본 서열에서 부재하는 합성 펩티드에서 복수의 이온쌍을 형성함에 있어, 복수의 하전된 아미노산으로 대체되는 기본 서열 내에서 상응하는 아미노산 위치와 비교하여 복수의 하전된 아미노산의 추가, (iii) 기본 서열과 비교하여 향상된 생물 활성을 여전히 보유하는 아미노산 서열을 보유하는 합성 펩티드.
SEQ ID NO:51의 아미노산 서열에서 1개 또는 2개의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열과 구별되는 아미노산 서열을 보유하는 합성 펩티드.
제 1항에 있어서, 하나이상의 반응성 기능기, 제약학적으로 허용되는 담체, 거대분자 담체, 이들의 조합에서 선택되는 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 3항에 있어서, 하나이상의 반응성 기능기, 제약학적으로 허용되는 담체, 거대분자 담체, 이들의 조합에서 선택되는 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 4항에 있어서, 하나이상의 반응성 기능기, 제약학적으로 허용되는 담체, 거대분자 담체, 이들의 조합에서 선택되는 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 5항에 있어서, 합성 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 형성함에 있어 거대분자 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 6항에 있어서, 합성 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 형성함에 있어 거대분자 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 7항에 있어서, 합성 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 형성함에 있어 거대분자 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 1항에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
제 3항에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
제 4항에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
제 5항에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
제 6항에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
제 7항에 따른 합성 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
제 1항에 따른 합성 펩티드를 함유하는 HIV 감염 치료용 제약학적 조성물.
제 3항에 따른 합성 펩티드를 함유하는 HIV 감염 치료용 제약학적 조성물.
제 4항에 따른 합성 펩티드를 함유하는 HIV 감염 치료용 제약학적 조성물.
제 5항에 따른 합성 펩티드를 함유하는 HIV 감염 치료용 제약학적 조성물.
제 6항에 따른 합성 펩티드를 함유하는 HIV 감염 치료용 제약학적 조성물.
제 7항에 따른 합성 펩티드를 함유하는 HIV 감염 치료용 제약학적 조성물.
제 17항에 있어서, HIV 감염의 치료를 위한 한가지이상의 보조 항바이러스제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 18항에 있어서, HIV 감염의 치료를 위한 한가지이상의 보조 항바이러스제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 19항에 있어서, HIV 감염의 치료를 위한 한가지이상의 보조 항바이러스제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 20항에 있어서, HIV 감염의 치료를 위한 한가지이상의 보조 항바이러스제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 21항에 있어서, HIV 감염의 치료를 위한 한가지이상의 보조 항바이러스제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 22항에 있어서, HIV 감염의 치료를 위한 한가지이상의 보조 항바이러스제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.