JP4805911B2 - Ｈｉｖ侵入阻害剤のポリマー系組成物及び複合体 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は概ね、HIV侵入阻害剤(EI)の持続送達に関する。より具体的には、本発明は、HIV侵入阻害剤の水溶性ポリマー複合体及びポリマー系組成物に関する。加えて、本発明は、このような複合体及び組成物の合成方法、並びに、本明細書中に記載された組成物を投与することによりHIV感染を阻害する方法を含む。

関連出願の相互参照
本出願は、2004年3月15日付けで出願された仮出願第60/553,146号明細書の優先権を主張する。この仮出願明細書全体を参考のため本明細書中に引用する。

発明の背景
1981年に米国内で最初に報告されたAIDS(後天性免疫不全症候群)が、世界的に蔓延している。AIDSは、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)によって引き起こされる。ヒト免疫不全ウィルスは、身体の免疫系の細胞を殺す又は損傷することによって、感染症及び或る種の癌と戦う身体能力を徐々に破壊するように作用する。或る推定によれば、米国内の百万に近い人が現在HIVに感染している可能性がある。

AIDSが米国内で最初に明らかになったときには、HIVに対抗する薬剤はなかった。しかし、過去11年にわたって、HIV感染、並びにその関連の感染症及び癌の両方と戦うために、薬物が開発されてきた。これらの薬物は、作用様式に応じて種々異なるクラスに分類することができる。3つのクラスの抗HIV薬がウィルス・ライフ・サイクル中の種々異なる時点に作用するが、これらの抗HIV薬は、ウィルスがT細胞に感染した後でウィルス複製を妨害する。これらのクラスの抗HIV薬は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)、プロテアーゼ阻害剤(PI)、及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)を含む。これらの種々のクラスに該当する薬物は、AZT、ザルシタビン、ジデオキシイノシン、スタブジン、及びラミブジン(ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤)；デルバリジン、ネビラピン、及びエフラビレンツ(非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤)、及びリトナビル、サクイニビル、及びインジナビル(プロテアーゼ阻害剤)を含む。しかし、別のクラスの抗レトロウィルス薬、すなわち前記慣用的クラスの抗HIV薬とは異なるように働く侵入阻害剤がある。侵入阻害剤は、T細胞感染後にHIVに対して働くのではなく、そもそもHIVがT細胞に感染するのを実際に防止する。より具体的には、侵入阻害剤は、T細胞の表面上のタンパク質又はHIVの表面上のタンパク質に阻害剤自体を付着させることにより働く。HIVがT細胞に結合するために、HIVの外皮上のタンパク質は、T細胞の表面上のタンパク質に結合しなければならない。侵入阻害剤はこのような結合の発生を防止する。いくつかの侵入阻害剤は、HIVの表面上のgp 120又はgp 41タンパク質をターゲットにするのに対して、その他の侵入阻害剤は、T細胞の表面上のCD4タンパク質、又はCCR5又はCXCR4受容体をターゲットにする。侵入阻害剤はT-20(エンフビルチドとも呼ばれる)、PRO-542、SCH-C、SCH-D、及びT-1249を含む。今日まで、1種の侵入阻害剤T-20しかFDAによって承認されていない。T-20は、HIV-1とCD4+細胞との融合を阻害する。

侵入阻害剤(融合阻害剤を含む)は、有望な新しいタイプの抗HIV薬である。T-20のような侵入阻害剤は、伝統的な抗HIV薬、例えばPI、NRTI及びNNRTIを単独又は複合治療で使用して応答しなかったHIV陽性の個人にとっては特に魅力的である。T-20は、アセチル化N末端と、カルボキサミドとして修飾されたC末端とを有する36アミノ酸合成ペプチドである。T-20(FUZEON（登録商標）)は、2003年3月にFDAから販売の承認を受けた。残念ながら、高い期待にもかかわらず、この薬物の販売は、その値段の高さによって、そしてより重要なことには、投与の難しさによって阻まれている。T-20は、1日2回、皮下注射される。このような頻繁な患者への投与は、患者にとっては極めて魅力のないものとなるおそれがある。このような患者の多くは結局のところ、高い投与頻度、投与様式、並びに薬物の調製及び投与に関連する作業に起因して、必要な投薬計画を守らない。事実、FUZEON（登録商標）患者の98%が、痛みのある又は厄介な局所注射部位反応(ISR)の1つ以上の事例を報告した。ISR症状は、疼痛/不快さ、硬化、紅斑、及び小節/嚢胞を含む。報告された過敏性反応は、発疹、発熱、吐気及び嘔吐、悪寒、硬直、及び低血圧を含む。T-20のような薬物が、患者が容易に摂取できる薬物ではないことがますます明らかになってきている。ISRと関連する疼痛は、軽度から中度と考えられ、またそれぞれのISRの平均継続時間は、約7日である。さらに、完全投与量が一貫した基準で摂取されない場合には、T-20に対する耐性が極めて速く発生するおそれがある(GMHC Treatment Issues, 第17巻、第1/2号、2003年1/2月)。従って、測定可能な、そしてより好ましくは有意な活性度を維持しつつ血流中のより長い循環半減期を有し、これにより患者への投与頻度の低減、ひいては局所注射部位反応の発生の低減を可能にする、改善された抗HIV薬、具体的には改善された侵入阻害剤が必要である。本発明はこれらの必要を満たす。

発明の概要
従って、1つの観点において、本発明は、抗レトロウィルスHIV薬、具体的にはペプチジル系侵入阻害剤、例えばとりわけT-20及びT-1249の持続送達組成物を提供する。本発明の複合体及び組成物は、徐放特性、例えば未修飾EI対応物よりも長い血流中の循環半減期を有し、これにより、未修飾EI、例えばT-20に関する投与関連問題のいくつかを解決する。

本明細書中に記載された複合体及び組成物は、有利には、免疫原性を低減する。等しく重要なことであるが、本発明の複合体及び組成物は、複合形態又は非複合形態における、水溶性ポリマーの存在しない伝統的なEI組成物と比較して、投与頻度が少なくて済む。このように、本明細書中に記載された複合体及び組成物は、これらの徐放特性が血流中に治療レベルのEI、好ましくはポリペプチド系EIを長時間提供するように作用することにより、共有結合された又は組み合わされた水溶性ポリマーが存在しない対応の侵入阻害剤薬を摂取するHIV-1感染患者が通常我慢している、痛みを伴う注射の回数及び関連する局所注射部位反応の回数を、有利に低減する。

1つの観点において、本発明は、水溶性ポリマーと侵入阻害剤化合物との複合体に関する。本発明のこの観点による複合体例を、本明細書中の表に示す。

好ましい実施態様の場合、本発明の複合体及び組成物は分解可能であり、すなわち、分解可能な1つ以上の結合、好ましくは加水分解可能な結合を含む。

例えば、本発明の複合体及び組成物中に含有される加水分解可能な結合は、加水分解可能な部分、例えばカルボキシレートエステル、ホスフェートエステル、カルバメート、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、又はカーボネートを含有することができる。

1つの好ましい実施態様の場合、加水分解可能な部分は、加水分解可能なカルバメート、エステル及びカーボネートである。

さらに別の実施態様の場合、本発明の複合体は下記構造：

[式中、POLYは水溶性ポリマーであり、L_Dは分解可能な結合であり、EIは侵入阻害剤であり、そして、kは、独立したポリマー・セグメント(POLY-L_D)が共有結合されるEI上の反応部位の数に相当する。]
を含み、ポリマー・セグメントのそれぞれ(すなわちポリマー・セグメントの個々の成分)は独立して選択されるが、好ましくはEIに共有結合されるポリマー・セグメントのそれぞれは同じである。典型的には、kは約1〜約8、すなわち1、2、3、4、5、6、7及び8から成る群から選択される。好ましくは、kは1、2、3、又は4、或いはさらにより好ましくは1である。

本発明のこの観点及び他の観点の好ましい実施態様の場合、水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。

水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコールの分子量は典型的には、下記範囲：約500ダルトン〜約100,000ダルトン、約2,000ダルトン〜約85,000ダルトン、約5,000ダルトン〜約60,000ダルトン、約10,000ダルトン〜約50,000ダルトン、約15,000ダルトン〜約40,000ダルトンの1つの中に含まれ、そして多数のアーキテクチャ(例えば線状、分枝状、及びフォーク状など)のうちのいずれかを有することができる。

本発明の複合体及び組成物中に使用するための侵入阻害剤は、例えばT-20、T-1249、PRO 542(CD4-IgG2としても知られる)、PRO-140、PRO-367、SCH-417690、TXN-355、UK-427、UK-857、GSK-873、GSK-140、PA9、PA10、PA11、及びPA12を含む。特定の実施態様の場合、侵入阻害剤は、T-20、T-1249、PRO 542、又はPRO-140である。

別の実施態様の場合、構造Iにおいて上に示したようなポリマー・セグメントが結合されるEI反応部位は独立して、N-末端、C-末端、アミノ基、ヒドロキシル基、及びチオールから成る群から選択される。

一般に、L_Dの長さは、例えば原子数約1〜約20、約2〜約15、約3〜約10である。すなわち、典型的には、L_Dの全長は、原子数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20から成る群から選択される。

本発明のさらに別の特定の実施態様は、下記一般化された構造：

[式中、Lは-O-又は-NH-C(O)であり、Arは芳香族基、例えばオルト、メタ又はパラ-置換型フェニルであり、構造II内の-NH-は、EIからのアミノ残基であり、Pはスペーサーであり、Zは-O-、-NH-、又は-CH₂-であり、そして構造III内のOは、EIからのヒドロキシル残基である、のうちの一方を含む複合体であって、上記式中、Lは-O-又は-NH-C(O)であり、Arは芳香族基、例えばオルト、メタ又はパラ-置換型フェニルであり、構造II内の-NH-は、EIからのアミノ残基であり、Pはスペーサーであり、Zは-O-、-NH-、又は-CH₂-であり、そして構造III内のOは、EIからのヒドロキシル残基である。]
の1つを含む、複合体である。

より具体的な実施態様において、構造III内で、Pは、-NH-P-Z-C(O)-と一緒にした状態で、天然型又は非天然型アミノ酸の残基である。

「POLY-NH-」が、EI部分のない状態の、表1のポリマー1-1〜1-40に相当するような構造IIIに相当する複合体も、本発明のこの観点を形成する部分である。

さらに付加的な実施態様の場合、本発明による複合体は、構造：

[式中、nは2〜約3400である。]
によって特徴付けられる。

多アーム状水溶性ポリマーの複合体も、本発明の形成部分である。

本発明のこの観点の1つの特定の実施態様の場合、多アーム状ポリマーは中心コアを含み、中心コアから3つ又は4つ以上のポリマー・アームが延び、ポリマー・アームは典型的にはホモポリマー又はコポリマーである。

本発明による多アーム状ポリマー複合体のさらに別の実施態様の場合、それぞれのポリマー・アームは、中心コアに共有結合された内側ポリペプチド・セグメントと、ポリペプチド・セグメントに共有結合された外側親水性ポリマー・セグメントとを含むコポリマーを含む。

本発明のこの観点による複合体の例は一般に、下記構造：

[式中、Rはコア分子であり、POLYは水溶性ポリマーであり、L_Dは分解可能な結合であり、EIは侵入阻害剤であり、そして、yは3〜15である。]
を含むことになる。

或いは、複合体は構造：

[式中、mは3、4、5、6、7、及び8から選択される。]
を含んでもよい。

さらに別のより具体的な実施態様の場合、このタイプの複合体は、構造：

[式中、Pはスペーサーであり、Zは-O-、-NH-、又は-CH₂-であり、そしてOは、EIからのヒドロキシル残基である。好ましい実施態様の場合、Pは、-NH-P-Z-C(O)-と一緒にした状態で、天然型又は非天然型アミノ酸の残基である。]
に相当してもよい。

さらに別の観点の場合、本発明は、複数のモノ-ポリマーEI複合体を含む組成物を含む。これらのモノ-ポリマーEI複合体は、EIに共有結合された、しかしEI上の種々異なる反応部位又は反応位置で共有結合された1つのポリマー試薬をそれぞれ有するEI複合体を意味する。

本発明の別の観点の場合、EIは、ヒドロゲル、より好ましくは加水分解的に分解可能なヒドロゲル、すなわち生理学的条件下で分解するヒドロゲルと混和される。このようなヒドロゲルは、架橋型又は非架橋型であってよい。好ましい実施態様の場合、ヒドロゲルは、侵入阻害剤、及びゲル成分の1つとしてポリ(アルキレンオキシド)を含む非逆ゲル化ヒドロゲルである。具体的な実施態様の場合、侵入阻害剤は、水溶性ポリマー複合体の形態を成している。或いは、侵入阻害剤は任意には、1つ又は2つ以上のゲル成分に共有結合される。

ポリマー複合体を製造する方法も本発明の形成部分である。この方法は、複合条件下で、侵入阻害剤と、水溶性高分子試薬とを接触させることにより、ポリマー侵入阻害剤複合体を形成するステップを含む。好ましくは、このような複合体は、分解可能な結合を含む。

さらに別の観点において、侵入阻害剤を含む非逆ゲル化ヒドロゲルを製造する方法が提供される。このような方法は、好適なヒドロゲル前駆体試薬を、前駆体試薬のゲル化を促進するのに効果的な条件下で互いに、そして侵入阻害剤と接触させ、これにより、侵入阻害剤が取り込まれた非逆ゲル化ヒドロゲルを形成するステップを含む。侵入阻害剤は、複合された又は複合されていない形態を成し、そしてヒドロゲル前駆体試薬は、逆ゲル化特性を示さない。

本発明のさらに別の実施態様の場合、製薬上許容される賦形剤との組み合わせで本発明の複合体を含む組成物が提供される。組成物は全てのタイプの製剤、及び具体的には注射に適した製剤、例えば再構成できる粉末、並びに液体(例えば懸濁液及び溶液)を含む。

本発明の付加的な実施態様の場合、HIV感染を阻害する方法が提供される。この方法において、EI複合体、又は治療上有効な量のこのような複合体を含む組成物が、HIV-1に感染した患者又は細胞に投与される。典型的には、EI複合体又は組成物を投与するステップは、注射によって行われる(例えば筋内注射、静脈内注射、及び皮下注射など)。

本発明の付加的な目的、利点及び新規の構成要件を、下の記述において示す。そしてこれらは、下記のものを読めば部分的には当業者にとって明らかとなり、或いは本発明の実施によって知ることもできる。

発明の詳細な説明
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定のポリマー、ヒドロゲル、合成技術、及び侵入阻害剤などに限定されるものではなく、添付の説明及び図面から明らかなように、そのようなものとして変化し得ることを理解するべきである。

留意しなければならないのは、本明細書及び特許請求の範囲において使用される単数形は、文脈上明らかに指示されない限り、複数形を含むことである。従って例えば、「ポリマー」に言及した場合、これは、単数のポリマー、並びに、同じ又は異なるポリマーのうちの2つ又は3つ以上を含み、「任意の賦形剤」は、単数の任意の賦形剤、並びに、同じ又は異なる任意の賦形剤のうちの2つ又は3つ以上を意味する、というようになる。

本発明を説明して主張する上で、以下の用語は、下記定義に従って使用されることになる。

本明細書中で使用される「PEG」、「ポリエチレングリコール」及び「ポリ(エチレングリコール)」は相互に置き換え可能であり、任意の水溶性ポリ(エチレンオキシド)を含むものとする。典型的には、本発明に従って使用するためのPEGは、下記構造「-(OCH₂CH₂)_n-」を含み、上記式中(n)は2〜約4000である。本明細書中で使用される「PEG」という用語は、末端の酸素が置換されているかいないかに応じて、特定の構造「CH₂CH₂-O(OCH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-」又は「-(OCH₂CH₂)_nO-」を意味することもできる。明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「PEG」という用語は、種々の末端又は「エンドキャップ」基などを有する構造を含むことを覚えておくべきである。「PEG」という用語は、大部分が、すなわち50%超が-OCH₂CH₂-反復サブユニットであるポリマーを意味する。特定の形態に関して、PEGは、任意の数の種々様々な分子量、並びに例えば下で詳細に説明するような「分枝状」、「線状」、「フォーク状」、及び「多官能性」などのような構造又はジオメトリーを成すことができる。

「エンドキャップされる」及び「末端キャップされる」という用語は、エンドキャップ部分を有するポリマーの末端又は終点を意味する。必ずしも必要というわけではないが、典型的には、エンドキャップ部分は、ヒドロキシ又はC_1-20アルコキシ基又はベンジルオキシ基、より好ましくはC_1-10アルコキシ基、さらにより好ましくはC_1-5アルコキシ基を含む。このように、エンドキャップ部分の例は、アルコキシ(例えばメトキシ、エトキシ及びベンジルオキシ)、並びに、アリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロなどを含む。エンドキャップ部分は、ポリマー中の末端モノマーの1つ又は2つ以上の原子を含んでよい[例えば、CH₃(OCH₂CH₂)_n-中のエンドキャップ部分「メトキシ」]ことを覚えておかなければならない。加えて、前記のもののそれぞれの飽和型、不飽和型、置換型、無置換型形態が考えられる。さらに、エンドキャップ基はシランであってもよい。エンドキャップ基は有利には、検出可能な標識を含んでもよい。ポリマーが、検出可能な標識を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマーの量又は位置、及び/又はポリマーがカップリングされた部分(例えば活性物質)を、好適な検出器を使用することにより決定することができる。このような標識の一例としては、蛍光剤、化学発光剤、酵素標識付けに使用される部分、比色(例えば色素)標識、金属イオン、及び放射性部分などが挙げられる。好適な検出器は、光度計、フィルム、及び分光計などを含む。エンドキャップ基は、有利にはリン脂質を含むこともできる。ポリマーがリン脂質を含むエンドキャップ基を有する場合には、固有の特性がポリマー及び結果として生じる複合体に付与される。リン脂質の一例としては、ホスファチジルコリンと呼ばれるクラスのリン脂質から選択されたものが挙げられる。具体的なリン脂質の一例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、及びレシチンから成る群から選択されたものが挙げられる。

本明細書中に記載されたポリマーに関する「非天然型」とは、その存在が自然界では見いだされないポリマーを意味する。本発明の非天然型ポリマーはしかし、ポリマー構造全体が自然界では見いだされない限り、天然の1種又は2種以上のモノマー又はモノマーのセグメントを含有してよい。

「水溶性ポリマー」におけるような「水溶性」ポリマーという用語は室温で水溶性の任意のポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーは、濾過後の同じ溶液によって透過される光の約75%以上、より好ましくは約95%以上を透過することになる。重量を基準とした場合、水溶性ポリマーは、好ましくは約35%(重量)以上の水溶性、より好ましくは約50%(重量)以上の水溶性、さらにより好ましくは約70%(重量)以上の水溶性、さらにより好ましくは約85%(重量)以上の水溶性を有することになる。しかし、水溶性ポリマーが95%(重量)以上の水溶性を有するか、又は完全に水溶性であることが最も好ましい。

本発明の水溶性ポリマー、例えばPEGとの関連における分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量として表現することができる。特に断りのない限り、本明細書中の分子量についての言及は全て、重量平均分子量を意味する。数平均及び重量平均双方の分子量決定は、ゲル透過クロマトグラフィ又は他の液体クロマトグラフィ技術によって測定することにより行うことができる。分子量値を測定する他の方法、例えば末端基分析、又は束一性(例えば凝固点降下、沸点上昇、又は浸透圧)の測定を用いることにより、数平均分子量を決定することができ、又は光散乱技術、超遠心分離又は粘性測定を用いることにより、重量平均分子量を決定することができる。本発明のポリマーは典型的には多分散であり(すなわち、ポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量が等しくない)、低い多分散性値、好ましくは約1.2未満、より好ましくは約1.15未満、さらにより好ましくは約1.10未満、さらにより好ましくは約1.05未満、そして最も好ましくは約1.03未満の値を有している。

例えば本発明のリンカーとの関連における原子全長とは、単鎖内の原子の数を意味し、置換基はカウントしない。例えば-CH₂-はリンカー全長に関して1原子と見なし、-CH₂CH₂O-は3原子長と見なし、そしてフェニル環のような非線状基は、4原子長と見なす。

「活性」又は「活性化された」という用語は、特定の官能基との関連において使用される場合、別の分子上の求電子物質又は求核物質と容易に反応する反応性官能基を意味する。この基は、反応するために強い触媒又は極めて非実用的な反応条件を必要とする基(すなわち「非反応性」又は「不活性」基)とは対照的である。

本明細書中に使用される「官能基」又はその任意の同義語は、その保護された形態、並びに保護されていない形態を含むものとする。

「結合(linkage)」又は「リンカー」という用語は、相互接続する部分、例えばポリマー・セグメントの末端と侵入阻害剤(例えばT-20又はT-1249)とをリンクするために任意に使用される原子又は原子集合を意味する。リンカーは加水分解的に安定であってよく、或いは、生理学的に加水分解可能であるか、或いは酵素的に分解可能な結合を含んでもよい。

「アルキル」は、典型的には原子数約1〜15の長さの炭化水素鎖を意味する。このような炭化水素鎖は、必ずしも必要というわけではないが好ましくは飽和型であり、そして分枝鎖又は直鎖であってよいが、典型的には直鎖が好ましい。アルキル基の一例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、1-メチルブチル、1-エチルプロピル、及び3-メチルペンチルなどが挙げられる。本明細書中に使用される「アルキル」はシクロアルキル、並びにシクロアルキレン含有アルキルを含む。

「低級アルキル」は、炭素原子数1〜6のアルキル基を意味し、そしてメチル、エチル、n-ブチル、i-ブチル、及びt-ブチルによって例示されるように、直鎖又は分枝鎖であってよい。

「シクロアルキル」は、好ましくは炭素原子数3〜約12、より好ましくは3〜約8の、架橋、縮合又はスピロ環状化合物を含む、飽和型又は不飽和型環状炭化水素鎖を意味する。「シクロアルキレン」は、環系内の任意の2つの炭素に当該鎖を結合することにより、アルキル鎖内に挿入されたシクロアルキル基を意味する。

「アルコキシ」は、-O-R基を意味し、前記式中Rはアルキル又は置換型アルキル、好ましくはC_1-6アルキル(例えばメトキシ、エトキシ、及びプロピロキシなど)である。

例えば「置換型アルキル」におけるような「置換型」という用語は、1つ又は2つ以上の不干渉置換基で置換された部分(例えばアルキル基)を意味し、例えばアルキル、C_3-8シクロアルキル(例えばシクロプロピル、及びシクロブチルなど)；ハロ、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨード；シアノ；アルコキシ、低級フェニル；及び置換型フェニル；などが挙げられる。「置換型」アリールは、置換基として1つ又は2つ以上の不干渉基を有するアリールである。フェニル環上の置換の場合、置換基は任意の配向を成してよい(すなわち、オルト、メタ、又はパラ)。

「不干渉置換基」は、分子内に存在する場合に、その分子内部に含有される他の官能基と典型的には非反応性である基である。

「アリール」は、それぞれのコア炭素原子数が5又は6である、1つ又は2つ以上の芳香族環を意味する。アリールは複数のアリール環を含み、これらのアリール環は、ナフチルにおけるように縮合されてよく、又はビフェニルにおけるように縮合されなくてもよい。アリール環は、1つ又は2つ以上の環状炭化水素、ヘテロアリール、又は複素環と縮合されても縮合されなくてもよい。本明細書中で使用される「アリール」はヘテロアリールを含む。

「ヘテロアリール」は、1〜4つのヘテロ原子、好ましくは硫黄、酸素、又は窒素、又はこれらの組み合わせを含有するアリール基である。ヘテロアリール環は、1つ又は2つ以上の環状炭化水素、複素環、アリール、又はヘテロアリール環と縮合されてもよい。

「複素環」又は「複素環式」は、不飽和又は芳香族特性の有無には関係ない、そして、炭素以外の1つ以上の環原子を有する、炭素原子数5〜12、好ましくは5〜7の1つ又は2つ以上の環を意味する。好ましいヘテロ原子は硫黄、酸素、及び窒素を含む。

「置換型ヘテロアリール」は、置換基として1つ又は2つ以上の不干渉基を有するヘテロアリールである。

「置換型複素環」は、不干渉置換基から形成された1つ又は2つ以上の側鎖を有する複素環である。

「求電子物質」及び「求電子基」は、求電子中心、すなわち電子を求める中心を有し、そして求核物質と反応することができるイオン、又はイオン性であってよい原子又は原子集合を意味する。

「求核物質」及び「求核基」は、求核中心、すなわち求電子中心を求める中心を有し、そして求電子物質と反応することができるイオン、又はイオン性であってよい原子又は原子集合を意味する。

「生理学的に切断可能」又は「加水分解可能」又は「分解可能」な結合は、生理学的条件下で水と反応する(すなわち加水分解される)結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、2つの中心原子を接続する一般的なタイプの結合に依存するだけでなく、これらの中心原子に結合された置換基にも依存することになる。加水分解的に不安定又は弱い適切な結合の一例としては、カルボキシレートエステル、ホスフェートエステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明の或る特定の実施態様の場合、好ましいのは、pH 8、25℃における加水分解半減期が約30分未満の結合であるが、このような優先順位は、いかなる意味においても限定的であるようには意図されない。

「酵素的に分解可能な結合」は、1種又は2種以上の酵素によって分解させられる結合を意味する。

「加水分解的に安定な」結合は、水中で実質的に安定である化学結合、すなわち、長時間にわたって好適な程度まで生理学的条件下で加水分解を被ることのない化学結合、典型的には共有結合を意味する。加水分解的に安定な結合の一例としては、炭素-炭素結合(例えば脂肪族鎖内)、エーテル、アミド、及びウレタンなどが挙げられる。一般に、加水分解的に安定な結合は、生理学的条件下で1日当たり約1〜2%未満の加水分解速度を示す結合である。代表的な化学結合の加水分解速度は、たいていの標準的な化学の教科書に見いだすことができる。

「製薬上許容される賦形剤又は担体」は、本発明の組成物中に任意に含むことができ、また患者に対して著しい不都合な毒性作用を引き起こさない賦形剤を意味する。「薬理学的に有効な量」、「生理学的に有効な量」、及び「治療上有効な量」は、相互に置き換え可能に使用されて、血流中又はターゲット組織中の所望の複合体レベル(又は対応する、複合されていない侵入阻害剤レベル)を提供するのに必要とされる侵入阻害剤複合体又は組成物(例えばヒドロゲル)量を意味する。正確な量は多数のファクター、例えば特定の侵入阻害剤、治療用組成物の成分及び物理的特性、所期の患者個体群、及び個々の患者の考慮事項などに依存することになり、また、本明細書中に提供された情報に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。

ポリマーのジオメトリー又は構造全体に関連する「分枝状」は、分枝点から延びる2つ又は3つ以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを意味する。分枝状ポリマーは2つ、3つ、4つ、6つ、8つ以上のポリマー・アームを有することができる。分枝状ポリマーのサブセットは多アーム状ポリマー、すなわち、中心コアから延びる3つ又は4つ以上のアームを有するポリマーである。

「分枝点」は、ポリマー又はリンク基が線状構造から1つ又は2つ以上の付加的なポリマー・アームに分割又は枝分かれする位置における1つ又は2つ以上の原子を含む分岐点を意味する。

「反応性」又は「活性化された」という用語は、有機合成の慣用的条件下で容易に又は実用的な速度で反応する官能基を意味する。この基は、反応しないか、又は反応するために強い触媒又は極めて非実用的な反応条件を必要とする基(すなわち「非反応性」又は「不活性」基)とは対照的である。

「保護された形態」における官能基は、保護基を担持する官能基を意味する。本明細書中で使用される「官能基」又はその任意の同義語は、その保護された形態を含むものとする。代表的な保護基は、Greene, T., Wuts, P.G., 「Protective Groups in Organic Synthesis」第3版、John Wiley & Sons, Inc., 1999に記載されている。

「多官能性」は、3つ又は4つ以上の官能基が含有されたポリマーを意味する。官能基は同じ又は異なるものであってよい。本発明の多官能性高分子試薬は、典型的には、約3〜100個の官能基、又は約3〜50個の官能基、又は約3〜25個の官能基、又は約3〜15個の官能基、又は約3〜10個の官能基、又は3、4、5、6、7、8、9又は10個の官能基をポリマー骨格内部に含有することになる。

「侵入阻害剤」は、ターゲット細胞のウィルス感染前に発生するHIVのライフサイクル中の所定のステップをターゲットにする特定のクラスの抗レトロウィルス薬である。具体的には、これらはHIV-1の複製機能、最も顕著にはHIV-1細胞融合及び侵入を妨害するように構成された化合物である。侵入阻害剤は融合阻害剤、付着阻害剤、及びコレセプター阻害剤を含む。全ての侵入阻害剤は、HIVが侵入に成功してこれによりターゲット細胞に感染する能力をブロックすることにより働く。必ずしも必要というわけではないが、典型的には、この侵入阻害剤は、ペプチド又は修飾ペプチド、例えばハイブリッド融合タンパク質、又はその他のキメラ・ペプチドであり、高分子試薬との反応に適した1つ以上の求電子基又は求核基を有する。「侵入阻害剤」又は「EI」という用語は、複合前並びに複合後の両侵入阻害剤を含む。

「ヒドロゲル」は、溶剤(例えば水)を吸収し、識別可能な溶解なしに急速に膨潤させられ、そして可逆変形可能な三次元網状構造を維持する材料である。ヒドロゲルは、非架橋型又は架橋型であってよい。親水性ポリマーの、共有結合により(化学的に)架橋された網状構造、例えばPEGは、水和状態でヒドロゲル(又はアクアゲル)を形成することができる。非架橋型ヒドロゲルは典型的には、親水性領域と疎水性領域とを有するブロック・コポリマーである。これらの非架橋型材料は、水性環境中に置かれると、イオン吸引、水素結合、ファンデルワールス力などから生じる物理的架橋力により、ヒドロゲルを形成することができる。これらの材料は、水を吸収することができるが、しかし親水性領域と疎水性領域との存在により、溶けることはない。

「実質的に」又は「事実上」は、ほぼ全体的に又はほぼ完全にということ、例えば何らかの所与の量の95%以上であることを意味する。

「患者」という用語は、本発明の活性物質(例えば複合体)の投与によって予防又は治療することができる状態を患う生体又はこのような状態になりやすい生物を意味し、ヒト及び動物の両方を含む。

「任意の」又は「任意には」は、続いて記述される状況が発生し得る又は発生し得ないことを意味するので、このような記述は、その状況が発生する事例と、発生しない事例とを含む。

ペプチド内のアミノ酸残基は、下記のように、単一の文字での省略形又は対応アミノ酸の省略形で略記される：
F Phe フェニルアラニン
L Leu ロイシン
I Ile イソロイシン
M Met メチオニン
V Val バリン
S Ser セリン
P Pro プロリン
T Thr トレオニン
A Ala アラニン
Y Tyr チロシン
H His ヒスシジン
Q Gln グルタミン
N Asn アスパラギン
K Lys リシン
D Asp アスパラギン酸
E Glu グルタミン酸
C Cys システイン
W Trp トリプトファン
R Arg アルギニン
G Gly グリシン

概観：侵入阻害剤の徐放ポリマー組成物
前述のように本発明は、HIV侵入阻害剤化合物、例えばT-20、T-1249、及びその他を持続送達するための組成物及び方法を提供する。ここに記載されるのは、投与時に少なくとも測定可能な、より好ましくは有意なレトロウィルス活性度を維持しつつ、短時間作用型の侵入阻害剤化合物、具体的にはペプチド系化合物の半減期を長くするための、一例としてのポリマー、複合体、及び組成物である。或る事例では、本明細書中で以下に詳しく説明するような、in vivoで複合体のポリマー部分を解放するように構成された1つ又は2つ以上の加水分解可能な結合を有するポリマー複合体、又は分解可能なヒドロゲル系組成物が好ましい。具体的に、侵入阻害剤のような薬物の場合、1つ又は2つ以上の分解可能な結合を有する複合体の利点は、循環半減期が延長されること、そしてポリマーが加水分解時に侵入阻害剤から解放されるというポリマー結合の分解可能な性質により、in vivoでの生体活性を示すこと、の両方である。従って、このような実施態様の場合、ポリマー結合のサイズ及び位置が、HIVがT細胞に侵入するのを防止するEIの能力に及ぼす影響は、さほど重要ではない。それというのは、分子のポリマー部分は侵入阻害剤を解放するために体内で脱落するからである。

侵入阻害剤
侵入阻害剤
本発明の複合体及び組成物は、好ましくは侵入阻害剤である1種以上の抗HIV薬を含む。侵入阻害剤は構造において、総称的に本明細書中では「EI」と称される。本発明において使用するのに好ましい侵入阻害剤は、ペプチド系である阻害剤、すなわち、3つ又は4つ以上の連続するアミノ酸残基を含む阻害剤である。このようなEIは、T-20、T-1249、PRO 542(CD4-IgG2とも知られている)、PRO-140、PRO-367、SCH-417690、TXN-355、UK-427、UK-857、GSK-873、及びGSK-140を含む。

上記最初の侵入阻害剤に眼を転じると、T-20は、アセチル化されたN末端と、C末端のカルボキサミド基とを有する線状36アミノ酸合成ペプチドである。T-20の分子量は4492である。T-20は、天然型L-アミノ酸から成り、そして配列番号1として下に示した一次アミノ酸配列：
配列番号1 アセチル-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH₂
を有する。

アミノ酸省略形を使用して、配列番号1は代わりに下記：
配列番号1 YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF
のように表すこともできる。

T-20は、ウィルス膜と細胞膜との融合を阻害することにより、HIV-1が細胞内に侵入するのを妨害する。T-20は、ウィルス・エンベロープ糖タンパクのgp41サブユニット中の第1ヘプタッド反復(HR1)に結合し、これにより膜融合に必要とされる構造変化を阻止する。gp120がCD4に結合した後でだけ、HR1はT-20に接近可能になる。コレセプター結合は、膜融合を引き起こす最終構造変化を誘発すると考えられる。T-20は、融合プロセスにおいて構造中間体に結合するように見え、そして、融合する細胞間に介在するために極めて狭い動態窓を有するように見える。その作用メカニズムにより、本発明の1実施態様において好ましいのは、T-20のような融合阻害剤との共有結合のための低分子量ポリマーであり、或いは別の実施態様において好ましいのは、T-20とgp41の最初の螺旋領域(HR1)との結合が妨げられないような、1つ又は2つ以上の加水分解可能な結合を有するポリマーである。それというのもこのポリマーはin vivoでの加水分解時に脱落するからである。

本発明における使用のために、T-20ポリペプチド配列は、米国特許第5,464,933号明細書に記載されているように、そのアミノ末端又はカルボキシ末端のうちの一方又は両方で封鎖及び/又は誘導体化されてよく、或いは、リシン位置のうちの1つ又は2つ以上に封鎖基を有することにより、例えばポリマーをEIに結合するために採用された化学物質に応じて、部位選択的なポリマー結合を支援することもできる。T-20の配列は位置Lys18及びLys28にリシンを含有し、これらの位置のそれぞれ又は両方は、本発明の或る実施態様において、水溶性ポリマーの共有結合にとって好ましい。

具体的には、チロシン・アミノ末端は、アリール基で封鎖及び/又は誘導体化されてよく、そしてフェニルアラニン・カルボキシ末端は、アミノ基で封鎖及び/又は誘導体化されてよい。

本発明における使用のために考えられる付加的なT-20様配列は、米国特許第5,464,933号明細書(この内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する)に記載されているように、HIV-1_LAIgp41タンパク質のアミノ酸638〜673、及びその断片、類似体、及び同族体を含む。具体的に好ましいペプチド配列は、米国特許第5,464,933号明細書に記載された配列番号1, 3, 4, 5, 6,及び7に相当する。これらの配列は、本明細書中では配列番号1〜6にそれぞれ相当する。好ましい水溶性ポリマー結合部位は、リシンのアミノ基、N-末端、C-末端、チロシン、トレオニン、又はセリン上に存在するヒドロキシル基を含む。

上述のように、本発明の組成物中に使用するための付加的なT-20様配列は、下記：
配列番号2 YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF
配列番号3 YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF
配列番号4 YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF
配列番号5 LEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDIFGNWF
配列番号6 LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNWL
のものを含む。

上記中、各アミノ酸残基はその単一文字コードによって表される。

T-1249は、本発明の複合体中に使用するための別の侵入阻害剤である。T-20と同様に、T-1249も、種々のレトロウィルス・エンベロープ(gp41)タンパク質配列に由来するが、しかしT-20よりも若干改善された薬物動態特性を有する。T-1249は、エンハンサー・ペプチド配列にリンクされたコア・ポリペプチド配列を含有するハイブリッド・ポリペプチドである。T-1249は、39個のアミノ酸を有し、T-20とはわずかに異なるHIV gp41領域に結合している。T-1249のアミノ酸配列は、米国特許第6,656,906号明細書の図13Bに示されている。T-1249は、HIV-1、HIV-2、及びSIV単離物に対してin vitro活性を示す。

T1249のポリペプチド配列は：
配列番号7 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF
である。

上記配列から判るように、N末端アミノ酸はトリプトファンであり、C末端アミノ酸はフェニルアラニンである。米国特許第6,348,568号明細書(配列番号1071)の表1に記載されているように、T-1249配列は、そのアミノ末端又はカルボキシ末端のうちの一方又は両方で封鎖及び/又は誘導体化されてよい。例えば、トリプトファン末端はアシル基で封鎖又は誘導体化されてよく、フェニルアラニン・カルボキシ末端はアミノ基で封鎖又は誘導体化されてよく、これによりアミド官能性が形成される。T-1249の配列は、次の4つの位置にリシンを含有する。これらの位置は、採用されるポリマー試薬のタイプ如何では、水溶性ポリマーの共有結合に適する場合がある(Lys7、Lys21、Lys28及びLys31)。

本発明において使用するための付加的な(T-1249の配列と同様の)侵入阻害剤配列が、米国特許第6,656,906号明細書に記載されている。この明細書の内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する。特に好ましい配列は、米国特許第6,656,906号明細書の図13A〜Cに示されたものである。上記ハイブリッドgp-41に由来するポリペプチド配列のいずれかの抗ウィルス活性、又は対応ポリマー複合体又はその組成物の活性を決定するのに有用な方法も、米国特許第6,656,906号明細書に記載されている。

別の好ましいペプチド系侵入阻害剤は、PRO-542であり、CD受容体のHIV結合領域と、ヒト抗体分子とを組み合わせたハイブリッド融合タンパク質である。PRO-542は、gp 120に結合することによりHIVを中和し、これにより宿主細胞とのウィルス結合を防止する。より具体的には、PRO 542は、米国特許第6,187,748号明細書(この内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する)に記載されているようなアミノ酸の配列を有するCD4-IgG2キメラヘテロ四量体である。さらにより具体的には、PRO 542は、IgG2の軽鎖及び重鎖の定常領域に融合されたヒトCD4のN末端ドメインから形成される。PRO 542は結合阻害剤と考えられ、そしてウィルス侵入プロセスの極めて早期に作用する。合胞体阻害アッセイのようなアッセイ、及びこのようなハイブリッド融合タンパク質の抗ウィルス特性を決定する方法は、米国特許第6,187,748号明細書に記載されており、また、対応するポリマー複合体又は組成物の抗ウィルス活性を同様に決定するように、当業者によって採用することができる。本発明の好ましい実施態様は、下記に詳しく説明するような、水溶性ポリマー、例えばPEGが、分解可能な共有結合を介して、PRO 542、又は本明細書中に記載された他の侵入阻害剤のうちのいずれか1つに共有結合されるような実施態様である。

本発明における使用のためのペプチド系侵入阻害剤の付加的な一例は、そのスルホン化形態及び非スルホン化形態双方のCCR5ペプチド、例えばPRO 140及びPRO 367を含む。硫酸化CCR5ペプチドが、米国特許出願公開第2003/0139571号明細書に記載されている。

PRO 140(以前はPA14と呼ばれた)は、CCR5コレセプター阻害剤として分類されるマウス免疫グロブリンG1ヒト化モノクローナル抗体である。PRO 140、及び抗CCR5モノクローナル抗体は、CCR5上の複数の細胞外ドメインにまたがる複合エピトープに結合する。PRO 140は、ターゲット細胞、つまりCD4 + T細胞及びマクロファージに対するCCR5媒介型のHIV-1侵入を、CC-ケモカイン・シグナル伝達を妨げない濃度で、強力に阻害する(Trkola, A.他、Journal of Virology, 2001年1月、第75巻、第2号、579-588)。PRO 140の調製、単離、及び精製は典型的には、Olsen, W. C. 他、1999年、J. Virol. 73:4145-4155に記載されているように行われる。モノクローナル抗体、PRO 140はまた、Olsen他、米国特許出願公開第2004/0228869号明細書に記載されているように、ATCC受入番号HB-12610に相当する。

本発明における使用に適した付加的なモノクローナル抗体は、Olsen他、米国特許出願公開第2004/0228869号明細書に記載されているような、PA8(ATCC受入番号HB-12605)、PA9(ATCC受入番号HB-12606)、PA10(ATCC受入番号HB-12607)、PA11(ATCC受入番号HB-12608)、及びPA12(ATCC受入番号HB-12609)と称される抗体を含む。これらの抗体は、ケモカイン受容体5(CCR5)のエピトープに結合する相補性決定領域(CDR)を含む。CCR5は、ケモカインのC-C群の構成員に結合するケモカイン受容体であり、このケモカイン受容体のアミノ酸配列は、Genbank受入番号1705896に提供された配列を含む。このエピトープは、i)CCR5のN末端、ii)CCR5の3つの細胞外ループ領域のうちの1つ、又はiii)(i)と(ii)との組み合わせ、に存在する連続したアミノ酸残基を含む。

少なくともある程度の抗レトロウィルス活性を維持する前記のもののいずれかのの生体活性断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体が、本発明によるEIとして役立つこともできる。本発明のEIは、組換え技術、又は当業者によく知られた合成法によって形成することができる。

本発明のEIは有利には、1つ又は2つ以上のアミノ酸残基、例えばリシン、システイン及び/又はアルギニンを含むように、必要な場合に変更することにより、アミノ酸の側鎖内部の原子にポリマーを容易に結合するのを可能にすることができる。アミノ酸残基を付加する技術が当業者によく知られている。J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure 第4版を参照されたい。

水溶性ポリマーの共有結合のためのペプチジルEI上の好ましい部位は、N末端、C末端、リシンのアミノ基、チロシン、トレオニン、又はセリン上に存在するヒドロキシル基、及びシステインのスルヒドリル基を含む。

EIの調製
一般にポリペプチドの合成及び調製のために当業者によく知られた下記合成アプローチのうちの1つ又は2つ以上を用いて、上記侵入阻害剤のいずれかを調製することができる。例えばEIは、例えばAdvanced Chemtech., Louisville, Ky.から入手可能なAdvanced Chemtech モデル200、Millipore, Bedford Mass.から入手可能なMillipore 9050+、又はその他の入手可能な機器を使用して、例えばChemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, William他編、1997年、CRC Press, Boca Raton Fla、及びこれに引用された参考文献；Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherson & Sheppard編、1989年、IRL Press, Oxford, England；及びSheppard, R. C.編、J. Chem. Soc. Chem. Comm.,第165〜166頁(1985)に記載されているように、慣用的段階的溶解又は固相合成、断片縮合、F-MOC又はT-BOC化学反応によって、合成することができる。

或いは、本発明のEI化合物は、機能性ウィルス・ベクター又は環状プラスミドDNAベクター内にcDNAコード配列を組み込むことにより、組換え技術で製造することもできる。この場合、ベクター又はプラスミドは、選択された微生物をトランスフェクト又は形質転換するために使用される。形質転換又はトランスフェクトされた微生物を導電性条件下で培養し、ベクターによって担持されたDNA配列を発現させ、次いで、成長培地から所望のペプチドを単離する。例えば米国特許第5,955,422号明細書を参照されたい。使用できるベクターは、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNAに由来するものを含む。例えば、pcDNA3、pBR322、pUC 19/18、pUC 118, 119及びM13 mpシリーズのベクターのようなプラスミド・ベクターを使用することができる。バクテリオファージ・ベクターは、λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R、及びEMBLシリーズのバクテリオファージ・ベクターを含む。利用することができるコスミド・ベクターの一例としては、pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、及びpNNIが挙げられる。

ヘルペス・ウィルス、レトロウィルス、ワクシニア・ウィルス、アデノウィルス、又はバキュロウィルスに由来するものを含む組換えウィルス・ベクターを使用することもできる。

本発明のEI化合物は、当業者によく知られた標準的な組換えDNA技術、例えばSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第2版(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)、又はAusubel他、Current Protocols in Molecular Biologyに記載された技術を用いて、調製することができる。両文献を参考のため本明細書中に引用する。T-1249及びT-20の調製法の一例が、米国特許第6,767,993号明細書、同第6,015,881号明細書(T-20)、米国特許第6,258,782号明細書(T-1249)、及び同第6,348,568号(T-1249)に記載されている。

切断及び脱保護後、例えばイオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティ・クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、沈降などによって、ポリペプチドEIを精製することができる。或いは、順相又は逆相HPLCを採用して、より小さな断片から完全長ポリペプチドを精製/分離することもできる。

例えば、Applied Biosystems製のもののような自動アミノ酸シーケンサーを使用して、標準アミノ酸分析、並びに各アミノ酸の手動又は自動のEdman分解及び決定によって、侵入阻害剤のアミノ酸配列を確認して同定することができる。好適な自動シーケンサーは、Applied Biosystems 476 A Protein Sequencer 又はProcise 494 Protein Sequencerを含む。これら両装置は、気相又はパルス化液体のEdman分解化学反応を用いる。HPLC分析又は質量分析を用いて、所与のEIの同一性を確認することもできる。

ヒト化モノクローナル抗体、例えばPRO 140、PA 8、9、10、11又は12は、Olsen, W. C. 他、J. of Virol. 1999年5月、第4145-4155頁、第73巻、第5号、及び米国特許出願公開第2004/0228869号明細書に記載されているように調製される。手短に言えば、このようなモノクローナル抗体は、ヒト化抗体製造技術と結び付けた標準的なハイブリドーマ技術によって、マウスL1.2-CCR5⁺細胞(Wu, L.他、Nature, 384:179-183, 1996)から調製することができる。ヒト化抗体をいかにして製造するかを説明する刊行物の一例としては、米国特許第4,816,567号明細書、米国特許第5,225,539号明細書、米国特許第5,585,089号明細書、米国特許第5,693,761号明細書、及び国際公開第90/07861号パンフレットが挙げられる。

CD4-IgG2キメラ・ヘテロ四量体であるPRO-542は、米国特許第6,451,313号明細書に記載された技術及び発現ベクターを用いて、調製することができる。

付加的な侵入阻害剤、例えば硫酸化CCR4ペプチドは、米国特許出願公開第2003/0139571号明細書に記載されているように調製される。

ポリマー
前述のように、本発明の1つの観点は、本明細書中でしばしば単にPOLYと称される水溶性ポリマーに結合されたEI、例えばT-20又はT-1249又は(上記のような)これに類するものの複合体に関する。水溶性ポリマーに関して、水溶性ポリマーは、非ペプチド性、非毒性、非天然型且つ生体適合性である。或る物質を単独で又は別の物質(例えば侵入阻害剤のような活性物質)と一緒に、生きている組織との関連で使用した場合、これに付随する有益な効果が、臨床医学者、例えば医師が評価して、有害な効果を上回る場合、その物質は一般に生体適合性と考えられる。非免疫原性に関しては、物質のin vivoでの所期用途が望ましくない免疫応答を形成(例えば抗体の形成)しない場合、又は、免疫応答が形成されても、このような応答が、臨床医学者が評価して臨床的に有意又は重要であるとみなされない場合に、その物質は非免疫原性と考えられる。本発明の水溶性ポリマーが生体適合性であり且つ非免疫原性であることが特に好ましい。

このようなポリマーの一例としては、ポリ(アルキレングリコール)、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(プロピレングリコール)(「PPG」)、エチレングリコール及びポリプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィンアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、多糖、ポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)、及び前記のもののいずれかの組み合わせが挙げられる。本発明のポリマーは、前記ポリマーのうちのいずれかのモノマーから形成されたホモポリマー、交互コポリマー、ランダム・コポリマー、ブロック・コポリマー、交互トリポリマー、ランダム・トリポリマー、又はブロック・トリポリマーである。好ましくはポリマーは、例えばポリエチレングリコールのコポリマーであり、又はより好ましくは、ホモポリマーである。本明細書における議論のほとんどは、例示のための水溶性ポリマーとしてPEGに焦点を当てているが、本明細書中に提供される論議及び構造は、上記水溶性ポリマーのいずれかを含むものとする。より具体的には、水溶性ポリマーとして「PEG」を示す構造及び図面の例に関して、「PEG」という用語は、本明細書中に記載された別の水溶性ポリマーのいずれかと置き換えられ、これにより、本明細書中に提供される構造及び図面は明確に、このような代わりの水溶性ポリマーにまで範囲が及ぶものとする。

EIとの複合前のポリマー自体は、典型的には、2〜約300個の末端、より好ましくは約2〜約25個の末端、さらにより好ましくは2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10個の末端を有するものとして特徴付けられる。

ポリマーは特定の構造に限定されず、線状(例えばエンドキャップされたPEG又は線状二官能性PEG)、分枝状、又は多アーム状であってよい。典型的には、PEG及び他の水溶性ポリマーは、EIとの複合前に、EI上の所望の部位にカップリングするのに適した活性化基で活性化される。これらのポリマーと活性部分とを複合するための代表的な高分子試薬及び方法は、当業者に知られており、また、Zalipsky, S.他、「Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides」 (Polyethlene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992))、Zalipsky(1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182、Roberts, M.他「Chemistry for Peptide and Protein PEGylation」, Advanced Drug Delivery Review 54(2002): 459-476、及び「Nektar Advanced PEGylation: Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation」, Catalog 2004にさらに記載されている。

典型的には、複合体中の非ペプチド性水溶性ポリマーの重量平均分子量は、約100ダルトン〜約150,000ダルトンである。しかし、重量平均分子量の範囲の例としては、約500ダルトン〜約100,000ダルトン、約2,000ダルトン〜約90,000ダルトン、約5,000ダルトン〜約85,000ダルトン、約10,000ダルトン〜約50,000ダルトン、約15,000ダルトン〜約40,000ダルトンが挙げられる。

加水分解可能な結合によってEIに共有結合されるこの事例では、より高い分子量のポリマー、例えば約20,000ダルトン以上、又は約30,000ダルトン以上、又は約40,000ダルトン以上、又は約50,000ダルトン以上の大きい分子量を有するポリマーが好ましい。1実施態様の場合、高分子量及び/又は分枝状の分解可能なポリマーの使用が好ましい。それというのも、ポリペプチジルEIに対する空間的制約により、高分子量ポリマーの1つ又は2つの分子だけをEIに共有結合することが可能であるからである。このようにして、加水分解可能なモノ-ポリマー複合体(すなわち、EIに1つのポリマー分子だけが共有結合される)、又はジ-ポリマー複合体を形成することが好ましい。このことは、複数の複合体種の形成が行われないため、よりきれいな複合体合成、これに続く分離、精製、及び特徴付けが行われるとともに、収量が高くなるので有利であるが、以下に詳しく説明するように、異なるPEG-マー(活性物質に、1, 2, 3又は4つ以上のポリマー鎖が共有結合されている複合体)を分離することもできる。さらに、複合体のin vivoでの作用を考えると、モノ-ポリマー複合体の加水分解が特に有利である。それというのは、単一の加水分解反応だけが関与するからであり、すなわちこの反応は、EI及びポリマーを解放するのに効果的な加水分解である。これとは対照的に、EI上の複数の反応部位にポリマーを分解可能に共有結合すると、或いは、多アーム状ポリマーに複数のEI薬を共有結合すると、複数の加水分解ステップ及び中間種に関与する動態によって、ポリマー又は薬物の解放が複雑になってしまう。分解可能な、より大きい分子量のポリマーを使用すると、或る事例においては、別の複合体の構造又はアーキテクチャを上回る特定の利点がもたらされるが、そうかといって、EIに単一又は多重に結合された小さなポリマーを使用するといった別の実施態様、又は本明細書中に記載した他の付加的な実施態様が、それ自体に付随する利点を有していないわけではない。これに関しては下で詳しく説明する。

水溶性ポリマー・セグメントのための重量平均分子量の一例としては、約100ダルトン、約200ダルトン、約300ダルトン、約400ダルトン、約500ダルトン、約600ダルトン、約700ダルトン、約750ダルトン、約800ダルトン、約900ダルトン、約1,000ダルトン、約2,000ダルトン、約2,200ダルトン、約2,500ダルトン、約3,000ダルトン、約4,000ダルトン、約4,400ダルトン、約5,000ダルトン、約6,000ダルトン、約7,000ダルトン、約7,500ダルトン、約8,000ダルトン、約9,000ダルトン、約10,000ダルトン、約11,000ダルトン、約12,000ダルトン、約13,000ダルトン、約14,000ダルトン、約15,000ダルトン、約20,000ダルトン、約22,500ダルトン、約25,000ダルトン、約30,000ダルトン、約35,000ダルトン、約40,000ダルトン、約45,000ダルトン、約50,000ダルトン、約55,000ダルトン、約60,000ダルトン、約65,000ダルトン、約70,000ダルトン、約75,000ダルトンが挙げられる。前述のうちのいずれかの総分子量を有する水溶性ポリマーの分枝状変異形又はその他の多アーム変異形(例えば2つの20,000ダルトン・ポリマー「アーム」を有する分枝状40,000ダルトン水溶性ポリマー)を使用することもできる。

ポリマーがPEGである事例において、PEGは典型的には、多数の(OCH₂CH₂)モノマーを含む。説明全体を通して使用される反復単位の数は、「(OCH₂CH₂)_n」の下付き文字「n」によって同定される。こうして、(n)の値は典型的には、下記範囲のうちの1つ又は2つ以上に含まれる：2〜約3,400、約100〜約2,300、約100〜約2,300、約100〜約2,270、約136〜約2,050、約225〜約1,930、約450〜約1,930、約1,200〜約1,930、約568〜約2,727、約660〜約2,730、約795〜約2,730、約909〜約2,730、及び約1,200〜約1,900。分子量が既知である任意の所与のポリマーの場合、ポリマーの総分子量を反復単位の分子量で割算することにより、反復単位の数(すなわち「n」)を決定することが可能である。

本発明における使用のための1つの特に好ましいポリマーは、エンドキャップされたポリマーである。このポリマーは、比較的不活性の基、例えば低級C_1-6アルコキシ基又はベンジルオキシ基でキャップされた1つ以上の末端を有するポリマーである。ただしヒドロキシル基を使用することもできる。ポリマーがPEGの場合、例えば、メトキシ-PEG(一般にmPEGと呼ばれる)を使用することが多くの事例において好ましい。メトキシ-PEGは、ポリマーの一方の末端がメトキシ(-OCH₃)基であるのに対して、他方の末端が、ヒドロキシル基、又は任意には化学的に修飾することができる他の官能基である、典型的には線状の1PEG形態である。

mPEGの構造を以下：
CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-
に示す。(n)の値は上記の通りである。

或いは、エンドキャップされるのではなく、ポリマー反応物質(及び対応生成物)は、ダンベル状構造又は二官能性線状構造を有することにより、結果として得られた複合体において、EIが中央の線状POLY、例えばPEGによって相互接続されるようになっていてもよい。より具体的には、1実施態様の場合、このような複合体は構造EI-PEG-EIによって表される。EIは同じ又は異なっていてもよい。すなわち、それぞれの個別のEIは、T-20、T-1249、PRO 542、PRO-140、PA 8、PA 9、PA 10、PA 11、PA 12、PRO-367、SCH-417690、TXN-355、UK-427、UK-857、GSK-873、及びGSK-140から成る群から選択される。好ましくは、本発明の複合体は、ポリマーPOLYが、T-20、T-1249、PRO 542、及びPRO-140から成る群から選択されたEIに共有結合された複合体である。複合治療が有利であるような状況、例えば複合治療がHIV耐性の防止に有用である場合、又は相乗効果が存在する場合、ポリマーに2種の異なるEI薬が共有結合された複合体が、好ましい実施態様である。例えば、T-20はPRO 542及びPRO-140と組み合わされた状態で、健常細胞の感染をブロックするように相乗的に作用する(4th Annual Fortis Bank Biotechnology Conference, London, 2004年5月4日)。このように、本発明のこの観点による一例としての実施態様は、互いに対向する末端にT-20及びPRO-542が結合された、又は互いに対向する末端にT-20及びPRO-140が結合された、又は互いに対向する末端にPRO-542及びPRO-140が結合された、ダンベル状ポリマー構造を含み、この場合第3のEIは単純にこれと同時投与される。さらに別の実施態様の場合、三アーム状ポリマー・アーキテクチャが採用される。3種のEI薬のうちの1つがそれぞれ、ポリマー・アームのそれぞれに共有結合される。さらに別の実施態様の場合、本発明による複合体は、一方のポリマー末端にT-20を有し、そして他方の末端にT-1249を有するダンベル状構造を有する。さらに別の実施態様の場合、線状二官能性複合体は、構造EI-POLY-1を有し、Aはその最も広義において、別の部分との結合に適した官能基を表す。好ましくは、Aはレトロウィルス薬であり、そして最も好ましくはEIと相乗作用する抗HIV薬である。

本発明において使用するためのポリマーは、2つのアーム、3つのアーム、4つのアーム、5つのアーム、6つのアーム、7つのアーム、8つ以上のアームを有してよい。多アーム状ポリマーを使用して複合体を形成することができ、或いは、多アーム状ポリマーを使用してヒドロゲルを形成することもでき、また、2〜300個ほどの反応性末端を任意の場所に有することができる。

本発明の1実施態様の場合、好ましいのは、2つ又は3つ以上のポリマー・アームを有する分枝状ポリマー・セグメントである。米国特許第5,932,462号明細書に記載されているような、例示の分枝状POLYは、構造：

に相当する。

この表示において、R''は、非反応性部分、例えばH、メチル、又はPEGであり、そしてP及びQは非反応性結合である。上記具体的な分枝状構造において、分枝状ポリマー・セグメントは、任意にはリンカーを介してEIを位置決めするための「C」分枝点から延びる単一の反応性部位を有する。リンカーは任意には、分解可能な結合を含んでもよい。

例示の実施態様の場合、分枝状PEGポリマー・セグメントは、EIとの共有結合のために単一の結合部位を有する、メトキシポリ(エチレングリコール)二置換型リシンである。EI上の結合部位に応じて、二置換型リシンの反応性エステル基をさらに変更又は活性化することにより、EI薬上のターゲット基と反応するのに適した官能基を形成することができる。

本発明において使用するための上記一般構造を有する分枝状PEGは典型的には、4つ未満のPEGアーム、より好ましくは2つ又は3つのPEGアームを有することになる。このような分枝状PEGが提供する利点は、線状PEG対応物よりも大きく稠密なポリマー雲とカップリングされた単一の反応性部位を有することである。1つの特定タイプの分枝状PEG EI複合体は、構造：(MeO-PEG-)_iG-に相当し、iは2又は3に等しく、またGはリシン、又はEIとの結合に適した部位を有する、他の好適なアミノ酸残基である。

本発明において使用するための付加的な分枝状PEGは、国際公開第2005/000360号パンフレットに記載されたものを含む。例えば、EI複合体を調製するための付加的な分枝状ポリマーは、下記構造：

[式中、POLY¹は水溶性ポリマーであり；POLY²は水溶性ポリマーであり；(a)は0、1、2、又は3であり；(b)は0、1、2、又は3であり；(e)は0、1、2、又は3であり；(f)は0、1、2、又は3であり；(g)は0、1、2、又は3であり；(h)は0、1、2、又は3であり；(j)は0〜20であり；それぞれのR¹は独立して、H、又はアルキル、置換型アルキル、アルケニル、置換型アルケニル、アルキニル、置換型アルキニル、アリール及び置換型アリールから成る群から選択された有機基であり；X¹は、存在するときには、第1スペーサー部分であり；X²は、存在するときには、第2スペーサー部分であり；X⁵は、存在するときには、第5スペーサー部分であり；X⁶は、存在するときには、第6スペーサー部分であり；X⁸は、存在するときには、第8スペーサー部分であり；R⁵は分枝部分であり；そしてZは、任意には介在するスペーサーを介して、EIにカップリングするための反応基である。]
を有する。好ましくは、前記分枝状ポリマー構造におけるPOLY¹及びPOLY²は同一であり、すなわち同じポリマー・タイプ(構造)及び分子量を有する。

本発明における使用に適した、上記分類に当てはまる代表的な分枝状ポリマーは：

[式中、(m)は2〜4000であり、また(f)は0〜6であり、そして(n)は0〜20である。]
である。

本発明の複合体又はヒドロゲルを調製するのに有用な分枝状ポリマーは加えて、より一般的には式R(POLY)_yによって表されるポリマーを含む。Rは中心又はコア分子であり、ここから2つ又は3つ以上のPOLYアーム、例えばPEGが延びる。変数yはPOLYアームの数を示し、ポリマー・アームのそれぞれは独立してエンドキャップすることができ、或いはその末端に反応性官能基を有することもできる。本発明のこの実施態様に従うより明確な構造は、構造R(POLY-Z)_yを有する。それぞれのZは独立してエンドキャップ基、又は、架橋剤又はEIとの反応に適した反応基である。Zが反応基であるさらに別の実施態様の場合、Zが例えば架橋剤又はEIと反応すると、結果として生じる結合は加水分解的に安定であることができ、或いは分解可能、すなわち加水分解可能であってもよい。典型的には1つ以上のポリマー・アームが、EIとの反応に適した末端官能基を有する。上記R(PEG)_yによって一般に表されるような分枝状PEGのポリマー・アーム数は、2〜約300である(すなわちyは2〜約300)。好ましくは、このような分枝状PEGのポリマー・アーム数は、約2〜約25、より好ましくは2〜約20、さらにより好ましくは2〜約15、又は3〜15以下である。多アーム状ポリマーの最も好ましいアーム数は、3、4、5、6、7又は8である。

上記分枝状PEG内の好ましいコア分子はポリオールである。ポリオールは次いでさらに官能化される。このようなポリオールは、炭素原子数1〜10、及びヒドロキシル基数1〜10の脂肪族ポリオールを含み、エチレングリコール、アルカンジオール、アルキルグリコール、アルキリデンアルキルジオール、アルキルシクロアルカンジオール、1,5-デカリンジオール、4,8-ビス(ヒドロキシメチル)トリシクロデカン、シクロアルキリデンジオール、ジヒドロキシアルカン、及びトリヒドロキシアルカンなどを含む。直鎖状又は閉環状の糖及び糖アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、ケブラチトール、トレイトール、アラビトール、エリトリトール、アドニトール、デュシトール、ファコース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、ソルボース、マンノース、ピラノース、アルトロース、タロース、タギトース、ピラノシド、スクロース、ラクトース、及びマルトースなどを含む脂環式ポリオールを採用することもできる。付加的な脂肪族ポリオールは、グリセルアルデヒド、グルコース、リボース、マンノース、ガラクトースの誘導体、及び関連する立体異性体を採用することもできる。使用できる他のコア・ポリオールは、クラウンエーテル、シクロデキストリン、デキストリン、及びその他の炭水化物、例えば澱粉及びアミロースを含む。好ましいポリオールは、グリセロール、ペンタエリトリトール、ソルビトール、及びトリメチロールプロパンを含む。

本発明の多アーム状ポリマー複合体に対応する代表的な多アーム構造を下に示す。yは、好ましくは約3〜約8であり、Rは上記の通りであり、そしてLは、任意には加水分解可能な結合を介してEIに各ポリマー・アームを共有結合するリンカーである。下記リンカーの項でより詳細に説明するように、任意の数の結合を使用して、EIにポリマー又はポリマー・アームを共有結合することができるが、或る事例においては、結合は好ましくは分解可能であり、本明細書中ではL_Dと称され、すなわち、生理学的条件下で加水分解する1つ以上の結合又は部分、例えばエステル、加水分解可能なカルバメート、カーボネート、又はその他のこのような基を含有する。

本発明の多アームEI-複合体又はヒドロゲルを形成するのに有用な付加的な多アーム・ポリマーは、Nektar(Huntsville, Alabama)から入手可能な多アームPEGを含む。本発明の方法において使用するのに好ましい多アーム状活性化ポリマーが、下記構造に相当する。Eは、EIにカップリングするのに適した反応基を表す。1実施態様の場合、Eは好ましくは-OH(EIカルボキシ基又は同等のものとの反応のため)、カルボン酸又は同等のもの、又は炭酸(EI-OH基との反応のため)、又はアミノ基(C末端との反応のため)である。

PEGは-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-であり、mは、3、4、5、6、7及び8から成る群から選択される。もちろん、対応するEIポリマー複合体生成物は、反応基Eが「-L-EI」によって置換されることを除いて上記構造を有する(Lは、Eと、EI上に存在する反応基との反応によって形成された結合を表す)。前述のように、或る実施態様の場合、好ましい結合はエステル、カルボキシル、及び加水分解可能なカルバメートであるので、複合体のポリマー部分はin vivoで加水分解されて、EI及びポリマーを解放する。このような事例の場合、リンカーLはL_Dと称される。

或いは、ポリマー複合体は全体的にフォーク状の構造を有してもよい。フォーク状PEGの一例は、下記一般構造：

[式中、PEGは本明細書中に記載されたPEGの形態のいずれかであり、Eは、EIとの共有結合に適した反応基であり、Aはリンク基、好ましくは加水分解的に安定な結合、例えば酸素、硫黄、又は-C(O)-NH-であり、F及びF'は、任意に存在する加水分解的に安定なスペーサー基であり、そしてLは上記の通りである。]
に相当し、第1の構造は活性化されたフォーク状PEGを表し、そして第2の構造はフォーク状EIポリマー複合体を表す。好ましい実施態様の場合、リンカーLは、1つ以上の加水分解可能な官能基を含有する。右側の複合体構造において、EIは同じであっても異なっていてもよい。前の実施態様におけるのと同様に、明示してはいないが、EIのうちの一方が別のレトロウィルス薬又は抗HIV薬によって置換されているフォーク状構造も考えられる。A、F及びF'に相当するリンカー及びスペーサー基の例が、米国特許第6,362,254号明細書に記載されており、また、本発明に従ってポリマー複合体を形成するのに有用である。F及びF'は、同じであっても異なっていてもよいスペーサー基である。上記の特定の1実施態様の場合、PEGはmPEGであり、Aは、-C(O)-NH-であり、そしてF及びF'は両方ともメチレン又は-CH₂-である。このタイプのポリマー・セグメントは、2種の活性物質との反応に有用であり、2種の活性物質は、F及びF'の選択に応じて、正確な又は所定の間隔を置いて配置される。

ここに提供された代表的な構造のいずれにおいても、ポリマー・セグメント中に1つ又は2つ以上の分解可能な結合を付加的に含有することにより、最初に投与された複合体中にあるよりも小さなPEG鎖を有する複合体をin vivoで生成するのを可能にすることができる。生理学的に切断可能な好適な結合の一例としては、エステル、カーボネートエステル、カルバメート、スルフェート、ホスフェート、アシルオキシアルキルエーテル、アセタール、及びケタールが挙げられる。このような結合は、所与のポリマー・セグメント中に含有されると、好ましくは、貯蔵時及び最初の投与時に安定になる。

より具体的には、概ね上記のように、加水分解可能な結合によって接続された2つ又は3つ以上のポリマー・セグメントは、次の構造：PEG1-W-PEG2(PEG1及びPEG2は同じものであっても異なっていてもよい)によって表すことができ、Wは弱い加水分解可能な結合を表す。これらのポリマー構造は、米国特許出願公開第2002/0082345号明細書に詳しく記載されているように、in vivoで除去可能(すなわち切断可能)であるPEGセグメントを含有する。

本発明の複合体を調製するのに使用されるPEGポリマーは、PEG鎖の端部ではなくPEGの長さに沿って共有結合された反応基、例えばカルボキシルを有するペンダントPEG分子を含んでよい。ペンダント反応基はPEGに直接に、又はスペーサー部分、例えばアルキレン基を介して結合することができる。

本発明の複合体を調製する際に使用するための、線状又は分枝状構造を有する付加的な代表的なPEGは、Nektar Therapeutics(前Shearwater Corporation, Huntsville, Alabama)から購入することができる。実例の構造は、Nektar 2004カタログに記載されている。その内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する。

ポリマー骨格内部の分解可能な結合として有用であるだけでなく、好ましくは本明細書の事例において、ポリマーをEIに共有結合するためにも有用である、加水分解的に分解可能な結合は、カーボネート；例えばアミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン(例えばOuchi他(1997) Polymer Preprints 38(1): 582-3参照)；例えばアルコールとホスフェート基とを反応させることにより形成されたホスフェートエステル；例えばヒドラジドとアルデヒドとの反応によって形成されたヒドラゾン；アルデヒドとアルコールとの反応により形成されたアセタール；例えばホルメートとアルコールとの反応により形成されたオルトエステル；及び或る特定のウレタン結合を含む。

本発明における使用のための付加的なPEG試薬は、加水分解可能なPEG及びリンカー、例えば国際公開第04/089280号パンフレットに記載されたものを含む。このアプローチを利用する上で、本明細書中に記載されたEI内部の遊離官能基のうちの1つ又は2つ以上、例えばアミノ、ヒドロキシル、メルカプト、ホスフェート及び/又はカルボキシ基が、弱塩基性条件に対して感受性の基、例えば9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)又は2-スルホ-9-フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)で誘導体化される。この基は、ポリマー・セグメント、例えばPEG部分に共有結合される。結果として生じる複合体において、EI及びポリマーは、骨格Fmoc又はFMS構造の異なる位置にそれぞれ共有結合され、そして生理学的条件下で解放可能である。

ポリマー複合体のこのような任意の特徴、すなわち、ポリマー鎖内へ1つ又は2つ以上の分解可能な結合を導入することにより、投与時に複合体の最終的な所望の薬理学的特性を付加的にコントロールすることが可能になる。例えば大きい、そして比較的不活性の複合体(すなわち1つ又は2つ以上の高分子量PEG鎖、例えば分子量が約10,000を上回る1つ又は2つ以上のPEG鎖が結合された複合体であり、この複合体は生体活性を事実上全く又はほとんど有さない)を投与することができる。この複合体は加水分解されて、元のPEG鎖の一部を有する生体活性EI複合体を生成する。或いは、分解可能な結合を使用することにより、EIをポリマーに共有結合する場合、加水分解は、ポリマー・セグメントが存在しない元のEIをもたらし、或いは、ポリマー・セグメントの加水分解から残された短い標識部分を有する修飾EI薬をもたらす。修飾EIは、そのHIV侵入阻害剤特性をまだ維持している。このようにして、複合体の特性をより効果的に調整することにより、投与時に複合体の薬理学的特性のバランスをとることができる。

当業者には明らかであるが、実質的に水溶性のポリマー・セグメントに関する前記論議は、決して包括的ではなく例示的に過ぎず、また、上記品質を有する全ての高分子材料が考えられる。本明細書中に使用された「高分子試薬」という用語は一般に、水溶性ポリマー・セグメントと官能基とを含むことができる分子全体を意味する。

結合及びEI複合体の例
上述のように、本発明の複合体は、EIに共有結合された水溶性ポリマーPOLYを含む。典型的には、いかなる所与の複合体に関しても、1〜約4つの水溶性ポリマーがEIに共有結合されることになる。ポリマーは、本明細書中に記載された形態のいずれかを有することができる。好ましい実施態様の場合、EIには、1つ又は2つのポリマーが共有結合される。

EIをポリマーに共有結合する具体的な結合は、多数のファクターに依存する。このようなファクターは、例えば、採用された特定の結合化学物質、特定のEI、EI内部の共有結合のために利用可能な官能基、及び、任意には保護基を必要とすることがあるEI内部の付加的な反応性官能基の潜在的な存在、などを含む。

本発明の複合体は、必ずしも必要というわけではないが、プロドラッグであることが可能である。これは、ポリマーとEIとの間の結合が、EI部分の解放を可能にするように加水分解的に分解可能であることを意味する。このような結合は、本出願の教示内容との関連で当業者によって普通採用されるカップリング法によって、ペプチジルEI(例えば、タンパク質のカルボキシル基C末端、又はタンパク質内部に含有されたアミノ酸、例えばセリン又はトレオニンの側鎖ヒドロキシル基)、及び/又は高分子試薬を適切に変更することにより、容易に調製することができる。しかし最も好ましいのは、好適に活性化されたポリマーと、EI内部に含有された非修飾官能基とを、任意には介在リンカーを介して反応させることにより形成された加水分解可能な結合である。

或いは、加水分解的に安定な結合、例えばアミド、ウレタン(カルバメートとしても知られる)、アミン、チオエーテル(スルフィドとしても知られる)、又は尿素(カルバミドとしても知られる)結合を、EIのカップリングのための結合として採用することもできる。加水分解的に安定な1つの好ましい結合はアミドである。

複合体は(複合されていないEIとは異なり)、ポリマーが分解可能なリンカーを介して共有結合されるか、又は加水分解的に安定なリンカーを介して共有結合されるかに応じて、測定可能なレトロウィルス活性度を有しても有しなくてもよい。すなわち、本発明によるポリマー複合体は、いずれの場合にも、変更されていない親EIの抗HIV活性の約0.1%〜約100%以上を有することになる。好ましくは、活性をほとんど又は全く有しない複合体は、ポリマーをEIに接続する加水分解可能な結合を含有するので、複合体中には活性が欠如しているにもかかわらず、加水分解可能な結合が水によって切断されると、活性EI(又はその誘導体)が解放される。

EIをポリマーにカップリングする加水分解的に安定な結合を有する複合体の場合、複合体は典型的には、測定可能な抗ウィルス活性度を有することになる。例えば、このようなポリマー複合体は典型的には、好適なモデル、例えば当業者によく知られたモデルで測定して、変更されていない親EIの活性度に対して、少なくとも約2%、約5%、約15%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約100%以上の活性度を有するものとして特徴付けられる。好ましくは、加水分解的に安定な結合(例えばアミド・結合)を有する複合体は、変更されていない親EIの生体活性の少なくともある程度を有することになる。

本発明によるポリマー複合体の例を以下に説明する。

EI内部に含有された反応性アミノ基との共有結合を形成するのに有用な、好適な水溶性高分子試薬には、数多くの例がある。対応する複合体とともに、具体的な例を下記表1に示す。表中、変数(n)は、反復モノマー単位の数を表し、そして「-NH-EI」は、水溶性ポリマーとの複合後のEIを表す。「-NH-」はEI上のアミノ基を表す。表中に示したそれぞれの高分子部分は、「CH₃」基で終わっているが、これに代えて他の基(例えばH、エチル及びベンジル)を置換することができる。さらに、この本明細書中の表は一般に、EI薬に結合された単一のポリマー試薬を示しているが、これは例示を目的としたものにすぎない。言うまでもなく、所与のポリマー試薬は、採用される反応基、合成法、ポリマーのサイズなどに応じて、EI上の複数の部位に共有結合することができる。理解を容易にするために、下記表に例示した構造は、EI上の1つの部位に共有結合された1つのポリマー試薬を示してはいるが、このような構造は、付加的に、2つ以上の部位に共有結合された当該ポリマー試薬をも含むものとする。

加えて、表1中のポリマー複合体のいずれも、もし図示のように分解可能でないならば、これを変更して下記のような分解可能な結合を含む複合体を形成することができる。例えば、二官能性スペーサー、好ましくは、EIと解放可能に結合することができるスペーサー、例えばアミノ酸が、EI上の反応性部位に共有結合される。好ましくは、二官能性スペーサーは一方の端部にアミノ基を有するので、表1中の一例としてのポリマー試薬との反応が容易に促進される。二官能性スペーサーの他方の端部には、例えば、EI化合物上に存在する1つ又は2つ以上のヒドロキシル基との反応時に加水分解可能なエステルを形成するのに効果的なカルボキシル基が位置するので、加水分解時にはポリマーとスペーサーとが切断され、その結果、親EI薬が解放される。

本発明の1つの好ましい実施態様の場合、下記構造を有する複合体が提供される。複合体はEIのプロドラッグ：

[式中、POLYは、本明細書中に記載された水溶性ポリマーであり、Lはリンク基であり、Arは芳香族基であり、そして結合されたNH-EIは、アミノ基を有するEIを表す。]
を有する。この特定の構造は、加水分解可能なカルバメート結合を有するので、加水分解時にはEIが解放される。好ましくは、加水分解時には、CO₂及び対応する芳香族アルコールと一緒に、親EIが解放される。好ましい芳香族基は、オルト、メタ、又はパラ置換型フェニルである。本発明のこの特定の実施態様のための好ましいL基は、-O-及び-NH-C(O)-である。このような複合体の特定の実施態様が、上記表1に示されている。また上記のものには、POLY末端との同一の結合を介して結合されたEI又は他の抗HIV薬を有するダンベル型構造も含まれる。上記一般構造内部に含まれる具体的なポリマー及び複合体は、米国特許第6,413,507号明細書に記載されており、この内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する。好ましいポリマー試薬は、米国特許第6,413,507号明細書の例に記載されたものを含み、上記表1に示される。

上述のようなアミノ選択的試薬を採用し、また加水分解可能な複合体が所望される本発明の実施態様の場合、加水分解可能なスペーサーが解放可能に結合された侵入阻害剤化合物が、例えば実施例1〜15によって例示されたように採用される。一般に、この方法は、下記合成ステップ：1)典型的な保護基化学物質、例えばBocを採用して、任意のEI一次アミン、すなわちリシンを最初に保護し、2)分解可能な結合、例えばカルボキシ基を介して、EIのチロシン、セリン、又はトレオニンのヒドロキシル官能基に、好適なスペーサー(例えばグリシン、アラニンなど)を付加し、3)スペーサー基を脱保護し、4)続いてアミン選択的PEG試薬と複合し、5)最後に一次アミンを脱保護する、ことを伴う。一般に、このスペーサー・アプローチは、本明細書中に記載されたポリマー試薬、具体的には表1の試薬のいずれかを変更するのに適しており、これにより、本発明の好ましい実施態様に従って、解放可能な特性を付与する。

すぐ上で説明したタイプのポリマーを採用するゲル製剤について、下記項で詳しく論議する。

EIと、特定の分解可能なカルバメート・リンク型PEGとの複合を、付加的な図形として以下に示す。PEG試薬はパラ置換型フェニル環である。例えば、EIがT-20である場合、例示のPEG試薬は、ペプチドのリシン・アミノ基のうちの一方又は両方に潜在的にカップリングすることができる。

POLY部分としてmPEGが示されているが、本明細書中に記載されたPOLY構造のいずれをも利用することができる。水溶性ポリマーを、EI内部に含有された唯1つのアミノ基に共有結合することが望ましい事例において、或いは、リシン上に存在するアミノ基のように、2つ以上の反応性アミノ基がEI上に存在する事例においては、当業者に広く知られた保護/脱保護法を採用し、或いは、分離/精製技術を採用することにより、所望の複合体、又はランダムなPEG化アプローチから生じるタイプの複合体(例えばモノ-PEGマー、ジ-PEGマー、トリ-PEGマーなど)を単離することができる。

本発明の1つの好ましい実施態様において、EIがT-20又はT-1249であり、水溶性ポリマーが、アルデヒドを末端とする水溶性ポリマーとの反応を介してN-末端に結合される場合、このような水溶性ポリマーは、内部アミド基を欠き、さらにより具体的には、タイプ：PEG-O-(CH₂)_m-C(O)-NH0(CH₂)_p-CHO(mは約1〜17であり、nは約10〜1,000であり、そしてpは約1〜3である)の構造とは異なる構造を有する。アルデヒドを末端とするポリマーの使用が好ましい事例において、ポリマーは例えば、同一所有者による国際特許出願No.PCT/US03/28221号明細書、標題「Water-Soluble Polymer Alkanals」に記載されたポリマーである。その内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する。

PEGをEIにカップリングするための反応条件は、EI、所望のPEG化度、及び利用される具体的な試薬に応じて変化する。典型的には、高分子試薬とEIのアミノ基との複合は、pH約5〜約9.5、好ましくは約8〜約9.5、及び室温で行われ、反応時間は約30分〜数時間である。PEG試薬とタンパク質との好ましいモル比は、約1:1〜5:1、又は10:1、又は最大100:1である。pHが高くなると反応速度も高くなるのに対して、pHが低くなると反応速度も低くなる。(例えばN末端における)選択的反応は、ケトン又はアルファ-メチル分枝型アルデヒドで官能化されたポリマーを用いて、且つ/又は特定の反応条件(例えば低pH)下で行うことができる。例えば実施例1〜3及び6〜15を参照されたい。これらの例は、本発明の例示のEIポリマー複合体及び組成物を形成するための、ランダムなポリマー結合及び部位選択的なポリマー結合の両方を示している。

カルボキシル基は、EI上の結合点として役立つことができる別の官能基である。構造的には、複合体は下記：

[式中、EIと隣接するカルボニル基とは、カルボキシル含有EIに相当し、Xは結合、好ましくは、O、N(H)、及びSから選択されたヘテロ原子であり、そしてPOLYは水溶性ポリマー、例えばPEGであり、任意にはエンドキャップ部分で終わっている。]
を含むことになる。

C(O)-X結合は、末端官能基を担持するポリマー試薬とカルボキシル含有EIとの反応から生じる。上述のように、特定の結合は、利用される官能基のタイプに依存することになる。ポリマーがヒドロキシル基で末端官能化又は「活性化」されるのならば、その結果として生じる結合はカルボン酸エステルとなり、XはOとなる。ポリマーがチオール基で官能化されるならば、その結果として生じる結合はチオエステルとなり、XはOとなる。或る特定の多アーム状、分枝状、フォーク状のポリマーが採用されるときには、C(O)X部分、具体的にはX部分は比較的より複雑になる場合があり、より長い結合構造を含むことができる。

ヒドラジド部分を含有する水溶性誘導体はまた、カルボキシル基における複合に有用である。このような基は、カルボキシ官能基、例えばアミノ酸を含有する小さなスペーサーの結合を介して、又はヒドロキシルの酸化によって、EI内に導入することができる。このような誘導体の一例は、下記構造：

を有するポリマーを含む。

EI内部に含有又は導入されたチオール基は、水溶性ポリマーのための効果的な結合部位として役立つことができる。具体的には、EIがペプチドであるか又はペプチド部分を含む場合、システイン残基がチオール基を提供する。このようなシステイン残基内のチオール基は、米国特許第5,739,208号明細書及び同第6,602,498号明細書、及び国際公開第01/62827号明細書に記載されているように、次いで、チオール基との反応に対して特異的である活性化PEG、例えばN-マレイミジルポリマー又は他の誘導体と反応させることができる。

対応する複合体とともに具体例を、下記表2に示す。表中、変数(n)は、反復モノマー単位の数を表し、そして「-S-EI」は水溶性ポリマーとの複合に続くEIを表す。表2中に示したそれぞれの高分子部分は、「CH₃」基で終わっているが、これに代えて他の基(例えばH、エチル及びベンジル)を置換することができる。

1つ又は2つ以上のマレイミド官能基を担持する水溶性ポリマーから形成された複合体に関して(マレイミドがEI上でアミンと反応するかチオールと反応するかにかかわらず)、水溶性ポリマーの対応するマレアミド酸形態がEIと反応することもできる。或る特定の条件(例えばpH約7〜9、及び水の存在)下では、マレイミド環は「開く」ことにより、対応するマレアミド酸を形成する。マレアミド酸は、国際公開第04/060966号に記載されているように、例えばEIのアミン基又はチオール基と反応することができる。マレアミド酸に基づく反応例を下に概略的に示す。POLYは水溶性ポリマーを表し、そしてEIは侵入阻害剤を表す。

別の実施態様の場合、本発明による代表的な複合体が下記構造：

[式中、POLYは水溶性ポリマーであり、Lは任意のリンカーであり、Zは、O、NH、及びSから成る群から選択されたヘテロ原子であり、そしてYは、C_2-10アルキル、C_2-10置換型アルキル、アリール、及び置換型アリールから成る群から選択される。]
を有する。EIと反応してその結果このタイプの複合体をもたらすことができる高分子試薬は、国際公開第04/063250号パンフレットに対応する、2004年1月6日付けで出願された同時係属中の米国特許出願第10/753,047号明細書、標題「Thiol-Selective Water Soluble Polymer Derivatives」に記載されている。

高分子試薬に関しては、ここにそして他の場所に記載された試薬を供給元(例えばNektar Therapeutics, Huntsville AL)から購入することができる。加えて、高分子試薬を調製する方法が文献中に記載されている。

必ずしも必要ではないが、典型的には、EIと高分子試薬との間の結合は、1つ又は2つ以上の原子、例えば炭素、窒素、硫黄、及びこれらの組み合わせのうちの1つ又は2つ以上を含む。例えば、好ましい加水分解的に安定な結合は、アミド、二次アミン、カルバメート、チオエーテル、又はジスルフィド基を含む。任意には、付加的な原子が、高分子試薬内部の反復モノマーの鎖に結合を接続することができる。同じことが、結合が分解可能である実施態様、すなわち、結合が加水分解的に分解可能な部分を含む実施態様にも当てはまる。典型的には、分解可能な結合は、全体的に考えて、分解可能な部分自体をポリマー及び/又はEIに接続する付加的な原子又は原子の組み合わせを含有する。本明細書中でPOLYと称される反復モノマー鎖にEIを接続する特定の一連の原子の一例としては、-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH₂-、-CH₂-C(O)-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-、-C(O)-O-CH₂-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-NH-CH₂-、-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-CH₂-、-C(O)-CH₂-、-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-[CH₂]_0-6-(OCH₂CH₂)_0-2-、-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-、-O-C(O)-CH₂-、-O-C(O)-CH₂-CH₂-、及び-O-C(O)-CH₂-CH₂-CH₂-から成る群から選択されたものが挙げられる。加えて、二官能性リンカー、例えばアミノ酸、又は二官能性PEGオリゴマーを使用して、EIをポリマー試薬に接続することもできる。

複合体は典型的には組成物の一部である。組成物は、単一のタイプのポリマー複合体、例えば専らPEG-EIモノマー(すなわち、EIに共有結合された唯1つのPEG鎖を有するが、PEGは、EI内部の異なる位置、例えば配列内部の異なるアミノ酸に共有結合することもできる)を含有することができ、或いは、複数の複合体、好ましくは、必ずしも必要なわけではないが、それぞれが、1つのEIに共有結合された約1つ〜約3つの水溶性ポリマーを有する複合体を含有することもできる。

上に手短に論じたように、適正な高分子試薬、高分子試薬とEIとの比、温度、pH条件、及び複合反応の他の特徴を選択することにより、所与のEIに対する所望のポリマー数をコントロールすることができる。加えて、不所望の複合体(例えば4つ又は5つ以上のポリマーが結合された複合体)を、精製により低減又は排除することができる。

付加的な多アーム状ポリマー複合体
複数のEI又は他の抗HIV薬が共有結合された複合体を形成する上で使用するための多アーム状ポリマーについて、本明細書において前述した。多アーム状ポリマーは、治療上有効な量を送達するのに高投与量のEI、例えばT-20又はT-1249が必要となる事例において特に魅力的である。このようにして薬物は、共有結合に適したいくつかの反応性部位を有する単一ポリマー分子上に、好ましくは解放可能に「積み上げられる」。

最大のEIローディングを達成するための多アーム状ポリマーの1つの好ましいタイプは、ポリペプチド・セグメントが共有結合された中心コア分子によって画定された内側コア領域と、ポリペプチド・ポリマー・セグメントのそれぞれに共有結合された親水性ポリマー・セグメントによって画定された外側親水性領域とを有する多アーム状ブロック・コポリマーである。従って、多アーム構造の各アームは、内側(すなわち中心コア分子に近い又は近位側の)ポリペプチド・ポリマー・セグメントと、外側(すなわち中心コア分子から遠い又は遠位側の)親水性ポリマー・セグメントとを含むブロック・コポリマーである。このような多アーム状ブロック・コポリマーは、内側コア領域内部の生体活性分子のカプセル封入又は取り込みに特に適している。この文脈において使用される「カプセル封入」又は「取り込み」は、それが共有結合によるものであれ、電荷相互作用によるものであれ、金属-酸錯体によるものであれ、ファンデルワールス力によるものであれ、又は他の吸引力又は結合力によるものであれ、コポリマーの内側コア領域内部にEIを物理的に閉じ込めることを意味するものである。このような単分子多アーム状ブロック・コポリマーの総数平均分子量は、典型的には、約5,000 Da〜約120,000 Da、好ましくは約10,000 Da〜約100,000 Da、より好ましくは約20,000 Da〜約80,000 Daである。

外側親水性ポリマー・セグメントは好ましくはポリ(エチレングリコール)であるが、他の親水性ポリマー・セグメントを使用することもできる。単分子多アーム構造の内側コア領域の一部としてポリペプチド・ポリマー・セグメントを使用することにより、多アーム構造の薬物送達特性を設計・調節する上で著しいフレキシビリティが提供される。単分子多アーム構造のEIとコア領域との相互作用は、薬物ローディング特性及び薬物放出特性に大きな影響を与えることができる。本発明の場合、ポリペプチド・ポリマー・セグメントの構造に応じて、内側コア領域は疎水性であるか、荷電されているか、薬物分子との共有結合に適しているか、或いはこれらの組み合わせであることが可能である。

好ましくは、中心コア分子は、アミン基を担持する3つ以上の末端を有するポリアミンの残基である。ポリアミン・コアの使用が好ましいのは、コアのアミン基がアミノ酸のカルボン酸基と容易に反応することにより、アミド・結合を形成するからである。しかし、コポリマー・アームとの結合に利用可能な他の官能基を有するコア分子を使用することもできる。ポリアミン・コアを利用する実施態様の場合、アミン基の数は、多アーム構造内のコポリマー・アームの数を決定することになる。好ましくは、ポリアミンのアミン基の数は3〜約25である。種々の実施態様において、ポリアミンのアミン基の数は、約5以上、約8以上、又は約10以上である。これらのタイプの構造を有する多アーム状ポリマーは、国際公開第04/060977号パンフレットに対応する、2003年12月24日付けで出願された同一所有者による標題「Multi-Arm Polypeptide Poly(ethylene Glycol) Block Copolymers as Drug Delivery Vehicles」に詳細に記載されている。この内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する。本発明のこの観点の代表的な実施態様は実施例14cに示される。

例示のポリマー構造は、構造のポリペプチド・コアに複数のEIが共有結合された多アーム(アーム数3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12)状ポリ(ベンジルアスパルテート)-PEG、ポリ(アスパラギン酸)-PEGを含み、必ずしも必要と言うわけではないが、この共有結合は好ましくは、分解可能な結合、例えばエステル及び加水分解可能なカルバメートを介して行われる。或いは、共有結合されるのではなく、EIは、内側コア領域内部に取り込むことができる。

EIの特定のヒドロキシル基と多アーム状ポリマーとの共有結合の実例を以下に概略的に示す。末端に反応基、例えばアミンを有するスペーサー分子を介して、EI内部の1つのヒドロキシ部位にポリマーを選択的に結合する。例えば実施例11〜15を参照されたい。

より具体的には、本発明のこの実施態様の場合、カップリングされていない自由端部に例えば反応性アミノ基を有するスペーサーを介して、加水分解可能な結合(例えばカーボネート又はエステル)を結合・導入するための選択的な点として、EI内のヒドロキシル基、例えばチロシンヒドロキシルが使用される。このアプローチは、チロシンヒドロキシルとセリンヒドロキシルとの反応性の差を利用することにより、チロシンヒドロキシル基における部位選択的反応を達成する。チロシンヒドロキシルにおける反応の前に、EI内部のアミノ基が、当業者に知られた任意の好適なアミノ保護基を使用して、カップリングに対して保護又はブロックされる。下記概略図におけるt-Bocの使用は例示を目的としたものにすぎない。下記実施態様の場合、スペーサはEIに対して遠位の端部に、反応基、例えばアミンを有する。この反応基は、多アーム状PEG、又は上述のような内側疎水性領域と外側親水性領域とを有するコポリマーPEG系との複合に適している。EI内の他の反応性アミンの保護は、EIから延びる1つの特定のアミノ部位の選択的導入を可能にし、さらに、このアプローチは、分子内に分解可能な共有結合を導入するためのメカニズムを提供する。延長されたリンカー又はスペーサーが共有結合された修飾EIは、次いで、本明細書中に記載されているような水溶性ポリマーに共有結合される。このアプローチは、「リンカー」又は「リンカー前駆体」がEI内に、好ましくは選択的に先ず導入されることにより、一例としてのEI中間体(EI-O-C(O)-Z-スペーサー-NH₂)を形成し、このEI中間体が、線状、分枝状又は多アーム状であってよいポリマーとの結合に適しているという意味で、本明細書中で前述したアプローチとは異なる。この構造において、EI-O-は、EI内部に存在するヒドロキシル基の残基を表す。

この点において、EIのモノ-アミノ誘導体を、例えば多アーム状ポリマー内に慣用的様式でリンクすることができる。複合が完了したら、周知の技術によってt-Boc基が除去される。上記図において、Zは好ましくはO、NH、又はCH₂であり、そしてスペーサーは、例えばアミノ酸又はアミノ酸のセグメント、或いはオリゴマーPEG、例えば二官能性PEG、又はモノマー・サブユニット数が1〜約20、好ましくは1〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、6、7及び9から選択されたポリマー・リンカーであってよい。

わずかに異なるアプローチにおいて、カルボン酸基、例えばアミノ酸、グルタミン酸又はアスパラギン酸内に含有されるカルボン酸基を利用することが望ましい場合、全ての反応性アミノ基及びヒドロキシル基の保護が好ましい。-COOH基とヒドロキシル末端スペーサーとのモノ複合により加水分解可能なカルボキシ・エステルを形成することに続いて、多アーム状PEGなどとの共有結合を同様に達成することができる。これらのような合成法は、本明細書の教示内容及び当業者において広く利用可能な知識と併せて考えて、当業者によって決定することができる。この方法の範囲を広げることにより、他の(例えば分解可能、又は分解不能な)結合を有する同様の多アーム状複合体を調製することができる。

ヒドロゲル
前述の複合体又は共有結合されたEI組成物とは異なり、本明細書中に付加的に提供されるのは、ヒドロゲル-EI組成物であり、EIはポリマー成分に必ずしも共有結合されず、ポリマー成分はゲルの形態で存在する。このようなヒドロゲルは、架橋型又は非架橋型であってよく、そして好ましくはPEG-成分を含有することができる。1つの特定の実施態様の場合、ヒドロゲル成分は非架橋型であるか、又はEIの解放を容易にするために軽く架橋されている。EIは複合形態及び/又は未複合形態を成して存在してよい。

例示のためのヒドロゲルは、芳香族で加水分解可能な上述のカルバメート・セグメントを有する。具体的には、ヒドロゲルは、加水分解可能なカルバメート・結合を介して架橋剤に結合されたポリマーから成る。好ましい実施態様における架橋剤は、式：

[式中、POLY、POLY'、L、L'、X、X'、Ar、及びAr'は前記の通りである。]
を有する前記のような二官能性ポリマーである。

好ましい実施態様の場合、架橋剤は式：

[式中、X及びLは上記の通りである。]
を有する。従って、上記架橋剤によって複数のアミノ基を有するポリマーを架橋することを、以下：

[式中、ジグザグの記号は、アミン基を有するポリマーを表し、そしてLは上記の通りである。]
に示す。

明らかなように、ポリマー部分と架橋剤とのカルバメート・結合は加水分解可能である。こうして、このヒドロゲルは、カルバメート・結合の加水分解の結果として、体内で徐々に崩壊又は分解する。

持続送達EI組成物を調製するための有利なヒドロゲルの別のタイプは、カーボネート・結合を有する。より具体的には、同一所有者による米国特許第6,348,558号明細書に記載されているように(この内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する)、加水分解的に分解可能なカーボネート・結合によって一緒にリンクされた2つ又は3つ以上のオリゴマーから成る水溶性の非ペプチド性ポリマーが提供される。このポリマーは水性環境、例えばin vivoで加水分解的に分解されて小さなオリゴマーになることができ、そして分解可能なヒドロゲルを調製するように使用することができる。

この種類の代表的なポリマーは式：

X-O-[(-CH₂CH₂-O-)_n-CO₂-]_m-(CH₂CH₂O)_n-Y

[式中、nは約2〜約2,000の整数であり、mは約2〜約200の整数であり、そしてX及びYはそれぞれ独立して、H、アルキル、アルケニル、アリール、又は反応性部分であり、そして同じ又は異なるものであってよい。]
によって表され、X又はY(又は両方)がEIの官能基と反応性である事例において、EIは任意には、本発明の別の実施態様において、これに共有結合されてよい。

さらに別の実施態様において、EI組成物を調製する際に使用するためのヒドロゲルは、2003年12月31日付けの同一所有者による「Methods for the Formation of Hydrogels Using Thiosulfonate Compositions and Uses Thereof」と題される実用特許出願明細書(この内容を参考のため本明細書中に明示的に引用する)に記載されているようなチオスルホネート・ゲルである。

より具体的には、本発明のこの実施態様によれば、ヒドロゲル形成成分は、好ましくは、多アーム・チオスルホネート・ポリマー誘導体であり、この誘導体は、塩基に対して暴露されると、架橋型ポリマー組成物を形成し、この場合、第2の架橋剤、レドックス触媒又は放射線の存在は必要にならない。このようなチオスルホネート・ポリマー誘導体は、2つ以上のチオール基を有する水溶性ポリマーと反応することにより、ヒドロゲルを形成することもできる。

一般に、このような組成物は、下記式：

[式中、POLYは、水溶性ポリマーであり、nは3〜約100であり、Xはリンク基であり、Yは3つ以上の求核基を有する分子に由来する部分であり、そしてRはアルキル基又はアリール基である。]
に相当するヒドロゲル形成成分を含む。リンク基の例は本明細書の他の箇所に記載されている。ポリマーは任意には、1つ以上の分解可能な結合、例えばエステル、カーボネート、アセタール、オルトエステル、ホスフェート、又はチオールエステルを含有することができる。1つ又は2つ以上の分解可能な結合の存在は、(例えば加水分解又は酵素的分解により)ポリマー鎖の分解を可能にすると同時に、ヒドロゲルを崩壊して溶解させる。好ましい実施態様の場合、特にEIがT-20又はT-1249であるときには、ヒドロゲルを形成するのに効果的な、ヒドロゲル又はポリマーを含有する組成物は、逆ゲル化を示しない組成物、すなわち、生理学的温度未満では液体として存在するが、しかし、生理学的温度ではヒドロゲルを形成する組成物である。一例としては、ヒドロゲル又はポリマーを形成するこのような組成物は、典型的には、Poloxomer 407（登録商標）以外のポリマーから形成されることになる。

本発明のヒドロゲル組成物は使用前に調製することができる。形成されたヒドロゲル組成物には任意には脱水又は凍結乾燥を施すことにより、結合された水を除去し、そして、これを無傷のヒドロゲルとして使用するか、又は粉砕して粉末形態又は粒子形態にすることができる。本発明のヒドロゲル組成物は、形成された物体のまま、脱水又は凍結乾燥なしに採用することもでき、又は、例えば眼内挿入体、坐剤、ペッサリー、経皮パッチ、又はヒドロゲル組成物を充填したカプセルを含む送達システム内に組み込むことができる。

ヒドロゲル形成組成物又はヒドロゲル組成物の形態とは無関係に、組成物を単回使用容器、複数回使用容器、又はバルク容器内にパッケージングすることが可能である。調製物は任意には、当業者に認識された手順によって滅菌することができる。1つの好ましい実施態様の場合、材料は滅菌単回使用容器内にパッケージングされる。他の実施態様の場合、単回又は複数回使用容器内に水、水溶液又は懸濁液を添加することにより戻しやすくするように、材料がパッケージングされる。別の実施態様の場合、材料は、ゲル形成を開始するベースとともにキットとして販売される。

複合体の精製
本発明のポリマー-EI複合体は、異なる複合型種を獲得/分離するように精製することもできる。具体的には、生成物混合物は、1EI当たり、いかなる場所でも平均1つ、2つ、3つ又はそれ以上のPEGを得るように精製することができる。好ましいのは、1つのポリマー分子が結合されたEI複合体である。最終的な複合体反応混合物を精製するための方法は、多数のファクター、例えば採用される高分子試薬の分子量、特定のEI、所望の投与計画、並びに、個々の複合体の残留活性及びin vivo特性に依存することになる。

所望の場合には、種々異なる分子量を有する複合体は、ゲル濾過クロマトグラフィ及び/又はイオン交換クロマトグラフィによって単離することができる。すなわちゲル濾過クロマトグラフィを用いて、異なる番号を付けられた、ポリマーとEIとの比(例えば1-マー、2-マー、3-マーなどであり、「1-マー」はEIにポリマーが1つ結合されていることを意味し、「2-マー」はEIにポリマーが2つ結合されていること、などを意味する)を、これらの異なる分子量を基準として(この差は水溶性ポリマー部分の平均分子量に事実上相応する)画分する。例えば、100,000ダルトンのポリペプチドが、分子量約20,000ダルトンの高分子試薬にランダムに複合される反応例において、その結果として生じる反応混合物は、未修飾タンパク質(分子量約100,000ダルトン)、モノPEG化タンパク質(分子量約120,000ダルトン)、及びジPEG化タンパク質(分子量約140,000ダルトン)、などを含有することができる。

このアプローチを用いて、種々異なる分子量を有するPEG及び他のポリマー-EI複合体を分離することはできるものの、このアプローチは、EI内部に異なるポリマー結合部位を有する位置異性体を分離するためには、一般に効果的でない。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィによって、PEG 1-マー、2-マー、3-マーなどの混合物を互いに分離することができるものの、回収されたPEG-マー組成物のそれぞれは、そのEIの異なる反応性アミノ基(例えばリシン残基)又はその他の官能基に結合されたPEGを含有することがある。

このタイプの分離を実施するのに適したゲル濾過カラムは、Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)から入手可能なSuperdex（登録商標）及びSephadex（登録商標）カラムを含む。具体的なカラムは、所望の分画範囲に応じて選択されることになる。好適な緩衝剤、例えばリン酸塩又は酢酸塩などを用いて、溶離が一般に行われる。数多くの種々異なる方法、例えば、(i)タンパク質含量に対応する280nmにおける光学濃度(OD)、(ii)ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質分析、(iii)PEG含量に関するヨウ素試験(Sims他(1980)、Anal. Biochem. 107, 60-63)、及び(iv)ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法(SDS PAGEゲル)、及びこれに続くヨウ化バリウムでの染色、によって、捕集された画分を分析することができる。

逆相-高性能液体クロマトグラフィ(RP-HPLC) C18カラム(Amersham Biosciences又はVydac)を用いた逆相クロマトグラフィによって、或いは、イオン交換カラム、例えばAmersham Biosciencesから入手可能なSepharose（登録商標）イオン交換カラムを使用したイオン交換クロマトグラフィによって、位置異性体が分離される。どちらかの方法を用いることによって、同じ分子量を有するポリマー-活性物質異性体(位置異性体)を分離することができる。

その結果得られた精製済組成物には、好ましくは、抗レトロウィルス活性を有しないタンパク質は実質的にない。加えて、組成物には、他の全ての非共有結合型の水溶性ポリマーは実質的にない。

活性の評価
本発明の複合体及び組成物の抗ウィルス活性は、採用された特定のEIの既知の活性に基づいて、好適なin vivo又はin vitroモデルを使用して決定することができる。本発明のEI複合体及び組成物を決定する方法は、細胞融合アッセイ、無細胞ウィルス感染アッセイ、逆転写酵素アッセイなどを含み。これらはすべて抗レトロウィルス活性の好適なインジケーターである。本明細書中に記載されたT-20又はT-20関連配列の抗ウィルス活性、又は対応するポリマー複合体又は組成物の活性を決定するのに有用な方法が、米国特許第5,464,933号明細書に記載されている。加えて、抗ウィルス活性を決定するのに適したin vivoアッセイが実施例16に記載されている。比較のための標準として、T-1249自体のIC50は0.003 μg/mlであり、そのIC90は、0.023 μg/mlである。加えて、T-20は、90 mgの単回皮下投与量(N=12)として投与されると、平均半減期3.8±0.6 h及び平均±SD見かけクリアランス24.8±4.1 mL/h/kgを示す(Fuzeon（登録商標） Package Insert)。抗CCR5マウス・モノクローナル抗体PA8、PA9、PA10、PA11、PA12、及びPA14(PRO14)の複合体又は組成物の抗ウィルス活性は、例えばOlson, W.他、J. of Virology, 1999年5月、73(5)、4145-4155に記載されたgp120-sCD4結合アッセイ及びRETアッセイ(エンベロープ媒介型膜融合及びHIV-1侵入の阻害を検出する)によって、或いは、Trkola, A.他、J. of Virology, 2001, 75(2), 579-588に記載されているような、PBMC培養又はマクロファージ培養におけるHIV-1複製の阻害を評価することによって、評価される。硫酸化CCR5のポリマー複合体及び組成物の抗ウィルス活性が、米国特許出願公開第2003/0139571号明細書に記載されているような、複合ペプチド結合を検出するための固相ELISAによって評価される。CD4-IgG2キメラのポリマー複合体及び組成物の抗ウィルス活性が、例えばELISA法を用いてモノマーgp120に対する結合親和性を評価することにより、且つ/又は、無ウィルス合胞体アッセイを用いてHIV-1エンベロープ媒介型合胞体形成の阻害を試験することにより、且つ/又は、米国特許第6,451,313号明細書に記載されているように、実験室用に適合された菌株及びHIV-1の一次単離物を用いた中和研究により、試験される。

医薬組成物
任意には、本発明の組成物はさらに、医薬組成物を提供するために、1種又は2種以上の製薬上許容される賦形剤を含むことができる。賦形剤の例としては、炭水化物、無機塩、抗菌薬、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基及びこれらの組み合わせが挙げられる。注射可能な組成物に適した賦形剤は、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、及び界面活性剤を含む。

炭水化物、例えば糖、誘導体化された糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖、及び/又は糖ポリマーが賦形剤として存在してよい。具体的な炭水化物賦形剤は、例えば：単糖、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、及びソルボースなど；二糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、及びセロビオースなど；多糖、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、及び澱粉など；及びアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール(グルシトール)、ピラノシルソルビトール、及びミオイノシトールなどを含む。

賦形剤は、無機塩又は緩衝剤、例えばクエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせを含むこともできる。

組成物は、微生物の成長を防止又は阻止するための抗菌薬を含むこともできる。本発明に適した抗菌薬の一例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール及びこれらの組み合わせが挙げられる。

組成物中には抗酸化剤が存在することもできる。抗酸化剤を使用して酸化を防止することにより、複合体又はその他の調製物成分の劣化が防止される。本発明において使用するのに適した抗酸化剤は、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせを含む。

界面活性剤が賦形剤として存在してよい。界面活性剤の例は、ポリソルベート、例えば「Tween 20」及び「Tween 80」、並びにプルロニック、例えばF68及びF88(これらは両方ともBASF(Mount Olive, New Jersey)から入手可能である)；ソルビタン・エステル；脂質、例えばリン脂質(例えばレシチン)及びその他のホフファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン(ただしリポソーム形態以外の形で好ましい)、脂肪酸及び脂肪エステル；ステロイド、例えばコレステロール；及びキレート剤、例えばEDTA、亜鉛及びその他のこのような好適なカチオンを含む。

組成物中には、賦形剤として酸又は塩基が存在してよい。使用可能な酸の一例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びこれらの組み合わせから成る群から選択された酸が挙げられる。好適な塩基の一例としては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びこれらの組み合わせから成る群から選択された塩基が挙げられる。

組成物中の複合体(すなわちEIと高分子試薬との間に形成された複合体)の量は、数多くのファクターに応じて変化するが、しかし、組成物が単位投与容器(例えばバイアル)内に貯蔵されると、最適に治療上有効な量になる。加えて、製薬調製物はシリンジ内に収容することができる。複合体の量を増加させながら繰り返し投与して、どの量が臨床上望ましい終点を形成するかを決定するにより、治療上有効なな投与量を試験から決定することができる。

組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の具体的なニーズに応じて変化することになる。典型的には、日常的に行われる試験によって、すなわち、種々の量(少量から多量まで)の賦形剤を含有する組成物を調製し、安定性及びその他のパラメータを試験し、次いで、著しい副作用なしにどの範囲において最適なパフォーマンスが得られるかを測定することによって、任意の個々の賦形剤の最適な量が決定される。

しかし一般には、賦形剤は約1重量%〜約99重量%、好ましくは約5重量%〜約98重量%、より好ましくは約15重量%〜約95重量%で組成物中に存在することになり、この場合、30重量%の濃度が最も好ましい。

これらの前述の製薬賦形剤は、その他の賦形剤とともに、「Remington: The Science & Practice of Pharmacy」(第19版、Williams & Williams, (1995))、「Physician's Desk Reference」(第52版、Medical Economics, Montvale, NJ (1998)、及びKibbe, A.H.,「Handbook of Pharmaceutical Excipients」(第3版、American Pharmaceutical Association, Washington, D.C. 2000)に記載されている。

組成物は、全てのタイプの製剤、具体的には、注射に適した製剤、例えば戻すことができる粉末又は凍結乾燥物、並びに液体を包含する。注射前に固形組成物を戻すのに適した希釈剤の例は、注射用静菌水、デキストロース5%水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、及びこれらの組み合わせを含む。液体医薬組成物に関しては、溶液及び懸濁液が考えられる。

好ましくは、本明細書中に記載されたEI組成物は単位投与形態を成す。すなわち、単回投与に適した量の本発明の複合体又は組成物が、予め測定又は予めパッケージングされた形態で含まれる。

投与
本発明の医薬組成物は、必ずしも必要というわけではないが、典型的には注射を介して投与されるので、投与直前には一般に溶液又は懸濁液の状態にある。製薬調製物は他の形態、例えばシロップ、クリーム、軟膏、錠剤、及び粉剤などの形態を成すこともできる。他の投与様式、例えば肺、直腸、経皮、経粘膜、経口、くも膜下、皮下、及び動脈内なども含まれる。

本発明はまた、複合体による治療に対して応答する状態を患う患者に、本明細書中に記載された複合体を投与する方法を提供する。この方法は、治療上有効な量の複合体(好ましくは医薬組成物の一部として提供される)を、一般には注射を介して投与することを含む。前述のように、複合体は静脈内注射によって、或いはあまり好ましくはないが筋内又は皮下注射によって、非経口投与することができる。非経口投与に適した製剤タイプは、とりわけ、注射の準備ができた注射溶液、使用前に溶剤と組み合わせるための乾燥粉末、注射の準備ができた懸濁液、使用前にビヒクルと組み合わせるための乾燥不溶性組成物、及び投与前に希釈するためのエマルジョン及び液体濃縮物を含む。

この投与方法は、EI複合体の投与によって改善又は予防することができる任意の状態を治療するために用いることができる。特定の複合体がどの状態を効果的に治療できるかが当業者には明らかである。例えば、複合体を使用することにより、HIVに感染した個体を治療することができる。投与されるべき実際の投与量は、患者の年齢、体重及び全身状態、並びに治療を受けている状態の重症度、医師の判断、及び投与される複合体に応じて変化することになる。治療上有効な量は当業者によって決定することができ、またそれぞれの特定の事例の特定の要件にあわせて調節される。一般に治療上有効なEIの量は、約0.001mg〜300mgとなり、好ましくは1日2回当たり約0.01 mg/〜1日2回当たり200 mgの投与量、好ましくは約0.01 mg/日〜200 mg/日の投与量、より好ましくは約0.10 mg/日〜100 mg/日の投与量となる。

所与の複合体(この場合もやはり、好ましくは製薬調製物の一部として提供される)の単位投与量は、医師の判断、及び患者のニーズなどに応じて、種々の投与スケジュールで投与することができる。具体的な投与スケジュールは当業者によって明らかになるか、或いは、日常的に行われる方法を用いて試験により決定することができる。投与スケジュールの一例としては、1日5回、1日4回、1日3回、1日2回、1日1回、1週3回、1週2回、1週1回、ひと月2回、ひと月1回、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。好ましい複合体及び組成物は、所要投与頻度が1日1回未満である複合体及び組成物である。すなわち、好ましくは、本発明の組成物は、1日2回、1日1回、1日おきに1回、1週2回、1週1回、隔週1回、又はひと月1回投与される。より好ましいのは、1週1回以下の頻度で、より好ましくはひと月2回(隔週)以下の頻度で、複合体及び組成物を投与することである。

本発明の或る特定の複合体を投与する1つの利点は、ポリマー全体を含む個々の水溶性ポリマー部分を切断することができることである。このような結果は、身体からのクリアランスがポリマー・サイズに起因して潜在的に問題をはらむ場合に有利である。最適には、各水溶性ポリマー部分の切断は、生理学的に切断可能な且つ/又は酵素的に分解可能な結合、例えばウレタン、カーボネート、又はエステル含有結合を使用することにより容易になる。こうして、複合体の(個々の水溶性ポリマー部分の切断を介した)クリアランスは、ポリマー分子のサイズ、及び所望のクリアランス特性を提供するタイプの官能基を選択することにより、調節することができる。当業者ならば、ポリマーの最適な分子サイズ、並びに切断可能な官能基を見極めることができる。例えば、種々異なるポリマー重量と切断可能な官能基とを有する種々のポリマー誘導体を先ず調製し、次いで本明細書中に記載されたin vitro又はin vivoアッセイを実施して効力を評価することにより、好ましいポリマー分子サイズ、構造、及び/又は切断可能な官能基を決定することができる。或いは、好適なin vivoモデルを使用して、(例えば定期的な血液又は尿の採取を通して)クリアランス・プロフィールを得ることができる。

本発明のEI複合体及び組成物は、典型的には複合治療と呼ばれるアプローチにおいて、1種又は2種以上の付加的な抗ウィルス薬又は抗レトロウィルス薬と一緒に同時投与することができる。本発明の組成物中に存在し得る、或いは同時投与することができる他の抗ウィルス薬は、DP107、rIFNα、rIFNβ、rIFNγ、AZT、3TC、d4T、ddI、アデフォビル、アバカビル、デラビリジンメシレート、ネビラピン、エファビレンツ、リバビリン、リトナビル、ネルフィナビルメシレート、アンプレナビル、サキナビル、インジナビル、ABT538、アンフォテリシンB、及びカスタノスペルミン、又は本明細書中に記載されたEIのいずれかを含む。

好ましい特定の実施態様と関連して本発明を説明してきたが、言うまでもなく前述の記載内容並びに以下の例は説明のために示すものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。本発明の範囲内に含まれる他の観点、利点及び変更形が、本発明が関連する分野における当業者には明らかである。

全ての論文、書籍、特許明細書、特許公報及びその他の刊行物の全体を、参考のため本明細書中に引用する。

略語
EI 侵入阻害剤
AIDS 後天性免疫不全症候群
HIV ヒト免疫不全ウィルス
NRTI ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤
PI プロテアーゼ阻害剤
NNRTI 非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤
AZT アジドチミジン(ジドブジン又は3'-アジド-3'-デオキシチミジンとも呼ばれる)
PEG ポリエチレングリコール
trt トリチル
Boc t-ブチルオキシカルボニル
PBS リン酸緩衝生理食塩水
Troc 2,2,2-トリクロロエチルカルバメート
Teoc 2-トリメチルシリルエチルカルバメート
TEA トリエチルアミン
DMAP 4-ジメチルアミノピリジン
DIC 1,3-ジイソプロピルカルボジイミド
DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM ジクロロメタン
TFA トリフルオロ酢酸
PTSA p-トルエンスルホン酸
4-アームPEG-SCM

PG ポリグルタミン酸
IPA イソプロピルアルコール

材料
添付の例で言及される全ての化学的な試薬は、特に断りのない限り、商業的に入手可能であるか、又は入手可能な情報に基づいて当業者によって調製することができる。

添付の例で言及される全てのPEG試薬は、Nektar (Huntsville, AL)から入手可能である。全ての¹HNMRデータは、Brukerによって製造された300又は400 MHz NMR分光計によって生成された。

実施例1
水性反応におけるmPEG-スクシニミジルベンズアミド-カーボネート、20 kDA(mPEG-SBC 20kDa)によるT1249のPEG化

アルゴン下において-20℃で貯蔵された、Nektar Therapeutics(Huntsville, Alabama)から入手可能なmPEG-SBC 20kDaを周囲温度まで加熱した。反応は室温で行った。加熱されたmPEG-SBC 20kDaの計算量(414mg、絶対ペプチド含量を基準として8倍モル過剰のmPEG-SBC 20kDaを得るため)を、磁気撹拌バーを含有する5 mLガラス・バイアル内に計量して入れた。T1249ペプチドの4.5 mg/mL溶液(N末端をアセチル化；C末端をアミド基で就職；リン酸緩衝生理食塩水PBS, pH 7.4中で調製)の2.0 mLアリコートを添加し、そして容積を付加的なPBSで4.5 mLにした。PEGが完全に溶けるまで、磁気撹拌器を用いて混合物を最大速度で撹拌した。撹拌速度を50%まで低減し、そして反応を2.5時間にわたって進めておき、その結果、複合体溶液を得た。反応終了時の複合体溶液のpHは、6.1であり、そして0.1 M HClによってさらに5.5まで低減した。

複合体溶液をSDS-PAGE(図1、レーン4)及びRP-HPLC(C18)によって分析した。図1から判るように、遊離ペプチド、モノ-、ジ-、及びトリ-PEG化材料が目に見えるので、水性反応は完成には至らなかった。

実施例2
DMSO反応混合物におけるmPEG-スクシニミジルベンズアミド-カーボネート、20 kDAによるT1249のPEG化
アルゴン下において-20℃で貯蔵された、mPEG-スクシニミジルベンズアミド-カーボネート、20kDaを周囲温度まで加熱した。反応は室温で行った。3つの異なるモル比(ペプチド：mPEG-SBC 20kDaの比1:1、1:2及び1:4)を用いた。加熱されたmPEG-SBC 20kDaの計算量(比1:1、1:2及び1:4に対してそれぞれ29 mg、58 mg、及び116 mg)を、上記実施例1におけるガラス・バイアル内に計量して入れた。各バイアル内で、PEG-SBC 20kDaを(撹拌により)1mLのDMSO中に溶解した後、5 mg/mL T1249ペプチド溶液の1 mLアリコートもDMSO中に溶解した。反応を3時間にわたって続けておき、その結果、複合体溶液を得た。

複合体溶液をSDS-PAGE(図1、レーン3、モル比4:1)及びRP-HPLCによって分析した。図1のレーン3から判るように、残留した遊離ペプチドはなく、また、目に見えるのは主にトリ及びそれよりも高次のPEGマーであるので(66.3 kDaを上回るマーカー)、複合反応は完成には至った。

実施例3
1:1 水性/DMSO反応におけるmPEG-スクシニミジルベンズアミド-カーボネート、20 kDAによるT1249のPEG化
アルゴン下において-20℃で貯蔵された、mPEG-スクシニミジルベンズアミド-カーボネート、20kDaを周囲温度まで加熱した。反応は上記実施例2に記載したように、室温で行ったが、ただしここではペプチドは1 X PBS中に溶解した。

上記実施例1〜3に記載された試験を要約するために、水性/DMSO混合反応条件(実施例3)及び純粋なDMSO反応条件(実施例2)の両方を用いてモル比1:1、2:1、及び4:1で反応を実施した。結果は両方法に関して同様であった。典型的な結果を図2に示す。モノ-PEG化ペプチドの最高収率は、1:1比(レーン3)で得られ、この場合、生成物の＞50%がモノPEG化された。図示のトリ-PEG化材料の上に、微量のテトラ-PEG化複合体を図2で見ることができた。

図3は、実施例3の1:1モル比から得られた複合体混合物のHPLCクロマトグラムを示す。曲線下面積を計算することによって、付加的な精製の前における収率が、モノPEG T1249は51%、ジ-及びトリPEG T1249は17%、及び遊離ペプチドは32%であることが示された。注入された試料は、水性/DMSO反応における1:1モル比であり、図2のレーン3におけるものと同様のペプチド及び生成物の分布を示した。

実施例4
複合体混合物の分析
実施例1、2及び3で調製された複合体溶液を、SDS PAGEによって分析した。

SDS-PAGE
MES緩衝剤を使用して、4〜12% Novex Bis-Trisゲル(Invitrogen)上で、ペプチド及び複合体を分離した。電気泳動運転時間は35分であった。製造業者の指示書に従って、ゲルをSimply Blue ゲル染色剤(Invitrogen)で染色した。タンパク質標準MARK 12(Invitrogen)を、全てのゲル上で使用した。

実施例5
例示のPEG-EI複合体混合物の精製
実施例3(混合水性/DMSO反応、1:1モル比)から得られた複合体組成物上で、付加的な精製を行った。

A. 陰イオン交換クロマトグラフィ
実施例3から得られたT1249のPEG化形態を、5mlのQ-HPカラム(Pharmacia)を使用して精製した。2種の緩衝剤を精製に使用した。緩衝剤Aは20 mM MES pH 6.0であり、緩衝剤Bは20 mM MES pH 6.0及び0.5 M NaClである。精製のためにAkta Purifier(Pharmacia)を使用した。5 mlのQ-HPカラム(Pharmacia)を、14% Bにおいて平衡させた(全ての事例において、緩衝剤Aの濃度は100 - %Bであった)。試料を注入し、カラムを通して14% Bの5カラム容積をポンプで供給することにより、結合しない画分を溶離させておいた。2つ又は3つ以上のPEG部分(「ハイマー」)を含有するPEG化T1249を、緩衝剤B含有率を17%(5カラム容積)まで増大させることにより、カラムから溶離した。緩衝剤B含有率を45%(5カラム容積)まで増大させることにより、モノPEG化形態を溶離した。最後に、緩衝剤B含有率を70%(5カラム容積)まで高めることにより、非PEG化T1249を溶離した。画分を捕集し、そしてSDS PAGEによって分析した。

モノPEG化プールのSDS PAGEを図4に示す。低レベル(＜10%)のジ-及びトリ-PEG化材料がプール材料中に存在した。

付加的な精製を行うことにより、ジ-及びトリ-PEG化材料の残りを除去した。

B. Amicon濃縮
モノPEG-T1249を含有するクロマトグラフィ画分をプールし、そしてAmicon濾過(YM 10膜、10,000 MWCO)(Millipore)によって濃縮した。

C. HPLC法
Zorbax 80 A Extend-C18カラム(Agilent) 4.6 X 250 mmを、Agilent 1100 HPLCと一緒に使用した。移動相Aは、milli-Q水中0.1%のTFAであり、そして移動相Bは、アセトニトリル中0.1%のTFAであった。カラムは温度58℃で維持した。タイムテーブルは下記の通りであった。

この方法は4分の後時間を含んだ。
上記条件下で、遊離T1249ペプチドの保持時間は、4.5±0.1分であった。遊離PEGの保持時間は、18.0±0.1分であった。精製されたモノPEG化調製物は、19.8分目及び20.6分目に2つの主なピークを示した。これらのピークは推定上、モノPEG化材料の2つの位置異性体に相当する。ジ-及びトリ-PEG化材料は、それぞれ21.6分間及び22.6分間の保持時間を有する2つのピークで溶離した。

D. モノPEG化T1249の分解
モノPEG化T1249の試料(450 μl)を、1/10容積(50 μl)の10X PBSと合体させた。pHを7.4まで高め、そして試料を一晩にわたって37℃でインキュベートした。試料をHPLCによって分析した。

HPLC分析によって、複合体試料のin vitroでの加水分解を確認した。モデル・ペプチド-SPCモノ-PEG複合体のin vitroにおける、すなわちpH7.4及び37℃のPBS中で生じた加水分解のプロットを図5に提供する。この図面から明らかなように、HPLC分析によって検出したところ、モノ-PEG複合体が加水分解するに伴って遊離ペプチドが出現する。384時間目(すなわち16日目)に、複合体の約50%が加水分解して遊離ペプチドを放出する。このことは、本明細書中に提供された複合体の代表的な徐放プロフィールを実証する。

上記例において、4つのリシンのうちの3つだけがPEG化のために容易に利用可能であるように見えた。DMSO単独反応又は混合反応(水性/DMSO)における4:1比の反応は、強制的に完了させられたときに主にトリPEG化材料を産出したが、微量のテトラPEG化材料が観察された。T-1249上の2つのリシン(Lys 28及び31)は、アミノ酸2つ分しか離れておらず、一方の部位におけるPEG化は、例えば立体障害により、他方の部位におけるPEG化に潜在的に影響を与える可能性があった。

採用されたイオン交換精製法において、3つ以上のモノPEG化ピークを意図的に1つに合体させた。これらの個々のピークは位置異性体を表し、これらの異性体はさらに精製して、所望の場合にはペプチド・マッピングによって特徴付けることができる。

実施例6
mPEG-スクシニミジルベンズアミド-カーボネート、30 kDA(mPEG-SBC 30kDa)によるT1249のPEG化
種々の溶剤系(水性、DMSO、水性DMSO)を使用して、上記実施例1〜3において記載されたように、T-1249をPEG化するが、ただしここでは、採用されたPEG試薬の分子量は30 kDaである。結果として得られた複合体化合物を、上記実施例4及び5に記載したように分析し、そしてさらに精製する。

実施例7
mPEG-スクシニミジルベンズアミド-カーボネート、40 kDA(mPEG-SBC 40kDa)によるT1249のPEG化
種々の溶剤系(水性、DMSO、水性DMSO)を使用して、上記実施例1〜3において記載されたように、T-1249をPEG化するが、ただしここでは、採用されたPEG試薬の分子量は40 kDaである。結果として得られた複合体化合物を、上記実施例4及び5に記載したように分析し、そしてさらに精製する。

実施例8
水性反応におけるmPEG-スクシニミジルフェニル-カーボネート、20 kDA(mPEG-SPC 20kDa)によるT1249のPEG化

アルゴン下において-20℃で貯蔵された、Nektar Therapeutics(Huntsville, Alabama)から入手可能なmPEG-SPC 20kDaを周囲温度まで加熱する。反応は室温で行う。絶対ペプチド含量を基準として絶対8倍モル過剰のmPEG-SPC試薬を使用する。PEG試薬を、磁気撹拌バーを含有する5 mLガラス・バイアル内に計量して入れる。T1249ペプチドの4.5 mg/mL溶液(N末端をアセチル化；C末端をアミド基で就職；リン酸緩衝生理食塩水PBS, pH 7.4中で調製)の2.0 mLアリコートを添加し、そして容積を付加的なPBSで4.5 mLにする。PEGが完全に溶けるまで、磁気撹拌器を用いて混合物を最大速度で撹拌する。撹拌速度を50%まで低減し、そして反応を約2.5〜3時間にわたって進めておき、その結果、複合体生成物を形成する。反応終了時の複合体溶液のpHを測定し、そして、必要であれば0.1 M HClを添加することによってさらに酸性化して、最終溶液のpHを約5.5にする。

複合体溶液を次いでSDS-PAGE及びRP-HPLC(C18)によって分析することにより、反応の程度を決定した(すなわち、反応が完成に至ったか否か)。

上記のように行われた付加的な反応を、Nektar Therapeutics(Huntsville, Alabama)から入手可能な、(i) mPEG-SPC 30kDa、及び(ii) mPEG-SPC 40kDaを用いて行う。

実施例9
DMSO反応混合物におけるmPEG-スクシニミジルフェニル-カーボネート、20 kDA (mPEG-SPC 20kDa)によるT1249のPEG化
アルゴン下において-20℃で貯蔵された、mPEG-スクシニミジルフェニル-カーボネート、20kDaを周囲温度まで加熱する。反応は室温で行う。3つの異なるモル比(ペプチド：mPEG-SPC 20kDaの比1:1、1:2及び1:4)を用いる。加熱されたmPEG-SPC 20kDaの計算量(それぞれ比1:1、1:2及び1:4)を、上記実施例8におけるようなガラス・バイアル内に計量して入れる。各バイアル内で、PEG-SPC 20kDaを(撹拌により)1mLのDMSO中に溶解した後、5 mg/mL T1249ペプチド溶液の1 mLアリコートもDMSO中に溶解する。反応を3〜5時間にわたって続けておき、その結果、複合体溶液を得る。

各反応の結果として得られた複合体溶液を、次いでSDS-PAGE及びRP-HPLCによって分析することにより、反応の程度を決定する。

実施例10
1:1 水性/DMSO反応におけるmPEG-スクシニミジルフェニル-カーボネート、20 kDAによるT1249のPEG化
アルゴン下において-20℃で貯蔵された、mPEG-スクシニミジルフェニル-カーボネート、20kDaを周囲温度まで加熱する。反応は上記実施例9に記載したように、室温で行うが、ただしここではペプチドは1 X PBS中に溶解する。

実施例8〜10から得られた生成物組成物の付加的な分析、精製及び加水分解を、上記実施例4及び5において記載したように行う。

実施例11〜15は、下記一般スキームに関する。このアプローチでは、分解可能な結合が最終複合体構造内に、リンカーの結合を介して導入される。この事例では、一例としてのアミノ酸、グリシンが、分解可能なエステル・結合を介してペプチド薬に結合される。下記例は、本発明のこの観点に従って侵入阻害剤複合物を生成するための合成ステップを記述する。

例証的反応スキーム：

T-1249に対して特異的な上記反応スキームは、本明細書中に記載されたような他の侵入阻害剤に適用することができるので、上記スキームにおける「T-1249」という表示は、一般用語「EI」(侵入阻害剤)によって置き換えることができる。

実施例11
T-1249一次アミノ基の初期保護
Nε-Troc-T-1249:水(30 mL/gペプチド薬)及びテトラヒドロフラン(THF、12 mL/gペプチド)中のペプチドT-1249の撹拌溶液に、トリエチルアミン(TEA、20当量)及び2,2,2-トリクロロエチルスクシニミジルカーボネート(Troc-OSu、20当量)を添加する。混合物を室温で16時間にわたって撹拌する。溶液を濃塩酸(HCl)で酸性化してpH4〜6にした後、有機溶剤を減圧下で除去し、そして水性層を乾くまで凍結乾燥させる。次いで残留物をジエチルエーテル(300 mL/gペプチド)中に沈澱させる。ペプチドを5分間にわたって12,000 rpmで遠心分離した後、エーテルをデカントして除去し、沈殿物を冷却ジエチルエーテル(2 x 100 mL/g ペプチド)で洗浄する。或いは、生成物を吸引濾過することにより捕集し、そして冷却ジエチルエーテル(2 x 100 mL/g ペプチド)で洗浄する。初期分析に基づいて必要に応じて、例えば調製HPLCによって付加的な精製を行う。薬物生成物Nε-Troc-T-1249を真空で一晩にわたって乾燥させる。質量分析(MS)によって特徴付けし、そしてHPLCによって純度を決定する。

Nε-Teoc-T-1249:アミン基の保護を、Nε-Troc-T-1249に関して上述したように実施し、ただしここでは、異なる保護基1-[(2-トリメチルシリル)エトキシカルボニルオキシ]ピロリジン-2,5-ジオン(Teoc-OSu)を採用する。

実施例12
アミンで保護されたT-1249への、保護されたアミノ酸スペーサーの添加
T-1249骨格内に存在する3つの異なるヒドロキシル基(セリン、トレオニン、及びチロシン)の中で、セリン一次ヒドロキシル基が、最高の反応性を示すと予期されるが、他の前述の部位上での置換を支援するように調節することができる。

N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249：N^ε-Troc-T-1249をジクロロメタン(DCM、35 mL/gペプチド)中に溶解し、そして少量のジメチルスルホキシド(DMSO、＜3 mL/gペプチド)を添加してペプチド溶解度を高める。N^α-tert-ブトキシカルボニルグリシン(N^α-Boc-グリシン-OH、1.2当量)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、1.2当量)を添加し、そして反応物を約10分間にわたって室温で撹拌する。1,3-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、2当量)を添加し、そして反応を約16時間にわたって室温で続けさせておく。DCM溶液を減圧下で濃縮し、氷浴(300mL/gペプチド)内で冷却されたジエチルエーテルを使用して、残留物を沈澱させる。ペプチドを5分間にわたって12,000 rpmで遠心分離した後、有機相をデカントして除去し、沈殿物を冷却ジエチルエーテル(2 x 80 mL/g ペプチド)で洗浄する。或いは遠心分離の代わりに、生成物を吸引濾過することにより捕集し、そして冷却ジエチルエーテル(2 x 100 mL/g 薬)で洗浄し、続いて、生成物の分析に基づいて必要に応じて、調製HPLCによる任意の付加的な精製を行う。薬物生成物N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249を真空で一晩にわたって乾燥させる。質量分析(MS)によって特徴付けし、そしてHPLCによって生成物純度を決定する。

実施例13
N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249におけるスペーサーの脱保護
A. Gly-N^ε-Troc-T-1249：N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249をDCM(30 mL/gペプチド)中に溶解し、少量のDMSO(＜3 mL/gペプチド)を添加することにより、ペプチドの溶解度を高める。無水トリフルオロ酢酸(TFA、4mL/gペプチド)を添加し、そして反応物を2時間にわたって室温で撹拌する。TFA/DCM溶剤を減圧下で除去し、そして残留物をジエチルエーテル(2 x 80 mL/g ペプチド)で洗浄し、そしてこれをジエチルエーテル(300 mL/g ペプチド)中に沈澱する前にその都度、乾くまで蒸発させる。ペプチドを5分間にわたって12,000 rpmで遠心分離した後、有機相をデカントして除去し、沈殿物を冷却ジエチルエーテル(2 x 100 mL/g ペプチド)で洗浄する。或いは遠心分離の代わりに、生成物を吸引濾過することにより捕集し、そして冷却ジエチルエーテル(2 x 100 mL/gペプチド)で洗浄する。必要な場合には、例えば調製HPLCによって任意の付加的な精製を行うことができる。生成物Gly-N^ε-Troc-T-1249 TFA塩を真空で一晩にわたって乾燥させる。質量分析(MS)によって特徴付けし、そしてHPLCによって生成物純度を決定する。

B. Gly-N^ε-Troc-T-1249：N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249を、THF(40 mL/g)とDMSO(5 mL/gペプチド)との混合物中に溶解する。エタノール(6mL/g薬)中のp-トルエンスルホン酸(PTSA、1.0当量)の溶液を添加する。この溶液を回転蒸発器上に置き、そして溶剤混合物を除去する。浴温度を60〜65℃に上昇させ、温度をさらに20分にわたって維持する。室温まで冷却されたら、残留物をジエチルエーテル(300 mL/g ペプチド)中に沈澱させる。ペプチドを5分間にわたって12,000 rpmで遠心分離した後、有機相をデカントして除去し、沈殿物を冷却ジエチルエーテル(2 x 100 mL/g ペプチド)で洗浄する。或いは遠心分離の代わりに、生成物を吸引濾過することにより捕集し、そして冷却ジエチルエーテル(2 x 100 mL/g薬)で洗浄する。例えば調製HPLCによって付加的な精製を任意に行うことができる。生成物Gly-N^ε-Troc-T-1249 PTSA塩を真空で一晩にわたって乾燥させる。質量分析(MS)によって特徴付けし、そしてHPLCによって生成物純度を決定する。

実施例14
分解可能なPEG-T-1249複合体を提供するための、Gly-N^ε-Troc-T-1249とPEG試薬例との共有結合
a.1)線状PEG複合体(CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249：
上記式中「NH-Gly」は、グリシンアミノ基との共有結合を示す)：上記実施例13から得られたGly-N^ε-Troc-T-1249塩をDCM(30 mL/g薬)中に溶解し、少量のDMSO(＜3 mL/g薬)を添加することにより、ペプチドの溶解度を高める。トリエチルアミン(TEA、10当量)を添加し、そして反応溶液を5分間にわたって室温で撹拌する。DCM(10 mL/g薬)中のPEG_20KD-SCM(1当量)、CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂C(O)-スクシニミドを添加し、そして反応を約16時間にわたって室温で進めておく。溶剤を減圧下で除去し、そしてジエチルエーテル(300 mL/g 薬)を添加することにより、残留物を沈澱させる。吸引濾過後にPEG_20KD-Gly-N^ε-Troc-T-1249(実際の構造は上に示されている)として略記された所期生成物を捕集し、真空下で一晩にわたって乾燥させる。

a.2)線状PEG複合体(CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：
上記実施例13から得られたGly-N^ε-Troc-T-1249塩をDCM(30 mL/g薬)中に溶解し、少量のDMSO(＜3 mL/g薬)を添加することにより、ペプチドの溶解度を高める。トリエチルアミン(TEA、10当量)を添加し、そして反応溶液を5分間にわたって室温で撹拌する。DCM(10 mL/g薬)中のPEG_30KD-SCM(1当量)、CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂C(O)-O-スクシニミドを添加し、そして反応を約16時間にわたって室温で進めておく。溶剤を減圧下で除去し、そしてジエチルエーテル(300 mL/g 薬)を添加することにより、残留物を沈澱させる。吸引濾過後にPEG_30KD-Gly-N^ε-Troc-T-1249(実際の構造は上に示されている)として略記された所期生成物を捕集し、真空下で一晩にわたって乾燥させる。

a.3)線状PEG複合体(CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：
上記実施例13から得られたGly-N^ε-Troc-T-1249塩をDCM(30 mL/g薬)中に溶解し、少量のDMSO(＜3 mL/g薬)を添加することにより、薬物溶解度を高める。トリエチルアミン(TEA、10当量)を添加し、そして反応溶液を5分間にわたって室温で撹拌する。DCM(10 mL/g薬)中のPEG_30KD-SPA(1当量)、PEG-スクシニミジルプロピオネート、CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂C(O)-O-スクシニミドを添加し、そして反応を約16時間にわたって室温で進めておく。溶剤を減圧下で除去し、そしてジエチルエーテル(300 mL/g 薬)を添加することにより、残留物を沈澱させる。吸引濾過後に生成物CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249を捕集し、真空下で一晩にわたって乾燥させる。

a.4)線状PEG複合体(CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：
上記実施例13から得られたGly-N^ε-Troc-T-1249塩をDCM(30 mL/g薬)中に溶解し、少量のDMSO(＜3 mL/g薬)を添加することにより、薬物溶解度を高める。トリエチルアミン(TEA、10当量)を添加し、そして反応溶液を5分間にわたって室温で撹拌する。DCM(10 mL/g薬)中のPEG_20KD-SPA(1当量)、PEG-スクシニミジルプロピオネート、CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂CH₂C(O)-O-スクシニミドを添加し、そして反応を約16時間にわたって室温で進めておく。溶剤を減圧下で除去し、そしてジエチルエーテル(300 mL/g 薬)を添加することにより、残留物を沈澱させる。吸引濾過後に生成物CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249を捕集し、真空下で一晩にわたって乾燥させる。

a.5)線状PEG複合体(CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂-CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：
上記実施例13から得られたGly-N^ε-Troc-T-1249塩をDCM(30 mL/g薬)中に溶解し、少量のDMSO(＜3 mL/g薬)を添加することにより、薬物溶解度を高める。トリエチルアミン(TEA、10当量)を添加し、そして反応溶液を5分間にわたって室温で撹拌する。DCM(10 mL/g薬)中のPEG_30KD-SBA(1当量)、PEG-スクシニミジルブタノエート、CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂CH₂C(O)-O-スクシニミドを添加し、そして反応を約16時間にわたって室温で進めておく。溶剤を減圧下で除去し、そしてジエチルエーテル(300 mL/g 薬)を添加することにより、残留物を沈澱させる。吸引濾過後に生成物CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249を捕集し、真空下で一晩にわたって乾燥させる。

a.6)線状PEG複合体(CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂-CH(CH₃)-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：
上記実施例13から得られたGly-N^ε-Troc-T-1249塩をDCM(30 mL/g薬)中に溶解し、少量のDMSO(＜3 mL/g薬)を添加することにより、薬物溶解度を高める。トリエチルアミン(TEA、10当量)を添加し、そして反応溶液を5分間にわたって室温で撹拌する。DCM(10 mL/g薬)中のPEG_30KD-SMB(1当量)、mPEG-スクシニミジルα-メチルブタノエート、CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂CH(CH₃)C(O)-O-スクシニミドを添加し、そして反応を約16時間にわたって室温で進めておく。溶剤を減圧下で除去し、そしてジエチルエーテル(300 mL/g 薬)を添加することにより、残留物を沈澱させる。吸引濾過後に生成物CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂CH(CH₃)-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249を捕集し、真空下で一晩にわたって乾燥させる。

b)多アームPEG(4-アーム-PEG_20K-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：

4-アーム-PEG_20K-SCM(上記略記の項目内の構造を参照)を無水塩化メチレン中に溶解する。別個の丸底フラスコ内に、Gly-N^ε-Troc-T-1249塩(1.0当量)をDCM中に溶解し、TEAで処理し、室温で5分間にわたって撹拌する。次いで、4-アーム-PEG_20K-SCMの塩化メチレン溶液に、T-1249溶液を添加し、そして反応物を室温で約15時間にわたって撹拌する。生成物4-アーム-PEG_20K-Gly-N^ε-Troc-T-1249をジエチルエーテル中に沈澱させ、そして吸引濾過によって捕集する。ペプチド薬物ローディングの純度及び程度をHPLC分析によって決定する。

c)「コアリンク」(コアリンク-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：
「コアリンク」という用語は、下記構造、国際公開第04/060967号パンフレットに記載された4-アーム-PEG-PGA-PEGポリマー系(4-アーム-PEG2K-PG-PEG10k(MW〜47k)とも呼ばれる)に相当する。

1. 4-アーム-PEG-NH₂の合成。トルエン(100 ml)中の4-アーム-PEG(20g, MW = 2,000 Da)(Nektar Therapeutics, Huntsville Alabama)を、油性粘稠度が得られるまで共沸した。油性粗生成物を、トリエチルアミン(12.9 ml)とともにトルエン(100 ml)中に溶解し、5分間にわたって撹拌した。次いでメタン塩化スルホニル(6.5 ml)を溶液に添加し、そして結果として生じた溶液を16時間にわたって室温で撹拌した。エタノール添加後、回転蒸発によって溶剤を除去し、そしてPEG-メシレートを一晩にわたって乾燥させた。塩化アンモニウム(PEG 1グラム当たり6グラム)を水酸化アンモニウム(PEG 1グラム当たり40 ml)中に溶解した。これに、PEGメシレートを添加し、結果として生じた溶液を室温で48時間にわたって撹拌した。この溶液に塩化ナトリウム(10%溶液)を添加し、続いてジクロロメタンで抽出した。溶剤を除去し、そして4-アーム-PEG-NH₂を真空下で乾燥させた。生成物収率は約85〜90パーセントであった。

2. Glu-NCA(BLG-NCA)の合成。テトラヒドロフラン(10 ml/グラム)中に、ベンジル-L-グルタメート、BLG(1.0当量)を、トリホスゲン(1.2当量)とともに溶解した。溶液を3時間にわたって60℃で撹拌した。次いで、ヘキサンを溶液に添加することにより、固形物を沈澱させ、次いでこの沈殿物を濾過した。回収された沈殿物をクロロホルム中に溶解し、そしてヘキサンでもう一度沈澱させた。次いで、沈殿物を濾過し、そして真空下で乾燥させた。収率：90パーセント収率。

3. PEG-PBLGの合成。4-アーム-PEG_2K-NH₂(700 mg)をトルエン(50ml)中で2回共沸し、次いで真空下で一晩にわたって乾燥させた。4-アーム-PEG_2K-NH₂(700 mg)をジメチルホルムアミド(7 ml)中に溶解した。次いで上記BLG-NCA(3.68 g)を溶液に添加した。溶液を窒素下で3時間にわたって撹拌した。次いで試料を溶液から取り出し、そして沈澱させた。生成物を混合D及びNMR法によって特徴付けることにより、コアの形成を保証し、続いて活性化PEG試薬PEG-SCM、CH₃O-(CH₂CH₂O)_10kD-CH₂C(O)-O-スクシニミドでポリマーをPEG化した。付加的にジシクロヘキシルカルボジイミド(335 mg)及び4-(ジメチルアミノ)ピリジン(20 mg)を含有するジクロロメタン中に、m-PEG10K-SCM(14グラム)を溶解した。これに上記BLG-NCA溶液を添加した。結果として得られた溶液を室温で一晩にわたって撹拌した。

4. 「コアリンク」4-アーム-PEG_2K-PG-PEG_10k(MW〜47k)を形成するためのPEG-PBLGの脱ベンジル化。PEG-PBLG(16グラム)を酢酸(16 ml)、脱イオン水(16 ml)、及びジメチルホルムアミド(80 ml)中に溶解する。この溶液にアンモニウムホルメート(16 グラム)及びパラジウム/炭素(1.6グラム)を添加した。溶液を48時間にわたって室温で撹拌し、続いてセライト床上の濾過により、炭素粒子の大部分を除去した。次いで溶液を水中で透析することにより、溶液から溶剤を除去した。30,000 MWフィルターによる超濾過後、未結合PEGを溶液から除去した。次いで溶液を20,000 RPMで3時間にわたって遠心分離することにより、炭素粒子の残りを除去した。生成物収率は45〜55パーセントであった。

5. コアリンク-Gly-N^ε-Troc-T-1249。4-アーム-PEG_2K-PG-PEG_10k(MW〜47k)をDMF中に溶解し、この中に、N-ヒドロキシスクシニミド及びDCCを室温で添加する。反応物を一晩にわたって撹拌する。Gly-N^ε-Troc-T-1249塩をDMF中に溶解し、そしてTEAで処理し、次いで多アームPEG試薬(「コアリンク」)溶液に添加する。反応物を室温で約36時間にわたって撹拌し、次いでジエチルエーテル中に沈澱させる。結果として得られた固形生成物を、吸引濾過によって捕集する。薬物ローディングの純度及び程度をHPLC分析によって決定する。

実施例15
分解可能なGly-N^ε-Troc-T-1249 PEG複合体の最終脱保護
実施例14(上記a.1〜a.6からc)における複合体のそれぞれに対して：
対応するPEG_n-Gly-N^ε-Troc-T-1249を、酢酸-水-テトラヒドロフラン(3:1:1)の混合物中に室温で溶解し、そして24時間にわたって撹拌する。有機溶剤を減圧下で除去し、そして水を凍結乾燥により除去する。結果としての残基を先ずジエチルエーテル中に沈澱させ、そしてメタノール(10 mL/g薬)及びIPA(30 mL/g薬)中で精製する。純度及び加水分解速度をHPLC分析によって測定する。

実施例14(上記a.1〜a.6からc)における複合体のそれぞれに対して：
PEG_n-Gly-N^ε-Teoc-T-1249を、THF(30 mL/g薬)とリン酸二水素カリウム(1.0 M, 30mL)との混合物中に溶解する。新鮮な亜鉛粉(60当量)を添加し、そして混合物を室温で24時間にわたって撹拌した後、これを水(100 mL/g薬)で希釈する。Zn固形物を濾過し、そしてTHFで洗浄する。有機溶剤を減圧下で除去し、そして水性相をDCM(3 x 25 mL/g)で抽出する。合体された有機相を氷温の5%NaOH(20 mL)及びブライン(20 mL)で洗浄し、MgSO₄上で乾燥させ、そして溶剤を減圧下で除去する。結果として得られた残基をエーテル中に先ず沈澱させ、更なる精製をメタノール(10 mL/g薬)及びIPA(30 mL/g薬)中で実施する。純度及び加水分解速度をHPLC分析により測定する。

実施例16
抗ウィルス活性を評価するためのin vitroアッセイ
インジケーター細胞系MAGI(Multinuclear Activation of a Galactosidase Indicator：ガラクトシダーゼ・インジケーターの多核活性化)、又はCCR5発現誘導体cMAGIを採用して、感染性ウィルス滴定量の低減をスコアするアッセイを用いることにより、本発明の複合体/組成物の抗ウィルス活性の指示を可能にする。

MAGI細胞系は、CD4及びHIV-1 LTR駆動型β-galリポーターの遺伝子を、両種性レトロウィルス・ベクターを用いて導入することにより、親HeLa細胞から誘導される(Kimpton J, Emerman M, J Virol 66:2232-9, 1992)。cMAGI細胞系は、両種性レトロウィルス・ベクターPA317を使用してCCR5遺伝子を導入することにより、MAGI細胞系から誘導される(Chackerian B他、J. Virol 71:3932-9, 1997に記載)。cMAGI細胞は一次NSI(R5)単離物及び実験室適合型X4ウィルスの複製を支援するのに対して、MAGI細胞はX4ウィルスだけの複製を支援する。両細胞系は、HIV-LTRによって駆動されたβ-ガラクトシダーゼ・リポーター遺伝子の発現を転写活性化するHIV-1 tatの能力を活用する。β-galリポーターは、核内に局在化するように変更され、そして感染から数日以内に染色する強力な核として、X-gal基質で検出することができる。染色された核の数は、染色前の感染ラウンドが1つだけの場合、攻撃接種材料中の感染性ビリオンの数に等しいものと解釈される。

感染及び細胞間融合の阻害剤、例えばT-1249又はT-20(Wild C.他、AIDS Res Hum Retroviruses, 9:1051-3, 1993)、又は本明細書中に記載された別のEIを、感染から24時間後に添加することにより、単一の感染ラウンドを表す読出しを可能にする。感染された細胞を、CCD画像形成装置を使用して数え上げる。MAGI及びcMAGIアッセイの場合、感染滴定量の50%の低減(V_n/N_o = 0.5)が有意であり、そして抗ウィルス活性を評価するための一次カットオフ値を提供する。感染滴定量(V_n/N_o)の90%低減が、抗ウィルス活性を評価する上での付加的なカットオフ値として用いられる。

48-ウェル・マイクロタイター・プレート1ウェル当たりの感染細胞数1500-2000を産出するように調節されたウィルス接種に対して、それぞれの試験化合物希釈物を2部ずつ試験する。試験化合物をcMAGI又はMAGI細胞に添加し、続いてウィルス接種し、そして24時間後に、感染及び細胞間融合の既知の阻害剤(Wild C.他、AIDS Res Hum Retroviruses, 9:1051-3, 1993)を添加することにより、感染及び細胞間ウィルス拡大の二次ラウンドを防止する。細胞を典型的には、さらに2日間にわたって培養し、定着させ、そしてX-gal基質で染色することにより、感染細胞を検出する。次いで、それぞれの対照及び試験化合物希釈物に対応する感染細胞の数を、CCD画像形成装置を用いて測定し、そして対応するIC₅₀及びIC₉₀の値を次いで測定し、そして例えばポリマーのない侵入阻害剤自体と比較する。値は典型的にはμg/mlで報告される。IC₅₀は、感染ウィルス滴定量の50%低減をもたらす試験化合物の希釈として定義され、そしてIC₉₀は、感染滴定量の90%低減をもたらす希釈として定義される。

実施例17
薬物動態
9匹のオスのWistarラット(Charles River Laboratories, Wilmington, Del.)(n = 3/時点)に、本明細書中、例えば実施例1、2、3、6、7、8、9、10、及び11〜15に記載されているような、T1249又はT-20のポリマー複合体/組成物の単回皮下投与量を施す。

試験mPEG複合体を、生理食塩水又は5%デキストロース注射液と混合する。pHを希釈NaOH又はHCl溶液で調節することにより、pH範囲約6.2〜7.4及び浸透圧約290 mOsm/kgの薬物溶液を調製する。採用される複合体は、最終製剤中1ml当たり約50〜250 mgの複合体の濃度を提供するのに十分な量である。ラットに、体重1 kg当たり8 mgの活性成分で投与する。

投与後、それぞれの時点で眼窩後洞から捕集する。時点は、投与後0.5、1、3、6、8、16、24、32、48、72、96及び120時間である。各試料をすぐに処理することにより、血漿又は血清を捕集し、そして分析まで-70℃で貯蔵する。液体クロマトグラフィによって逆相法を用いて、各試料をアッセイする。逆相法は、主な被分析物及び代謝産物が吸光度検出(280 nm)によって、又は質量分析(シングル又はトリプル・クワド)によって検出されるのを可能にする。複合体及びEI自体でスパイクされた血清抽出物を校正標準として使用して、プロットから濃度を推定する。次いで、プールされた血清中の、複合体、解放されたEI、検出可能な代謝産物、及びこれらの組み合わせの濃度を使用して、濃度対時間プロフィールから薬物動態パラメーターを導出する。商業的な薬物分析ソフトウェア・パッケージ、例えばPharsight Corporation ,Mountain View, Califから入手可能なWIN-NONLINを使用して非コンパートメント分析から報告される。

図1は、実施例1(レーン4)及び実施例2(4:1モル比)(レーン3)から得られた一例としての複合体試料のSDS-PAGEゲルである。レーン2は、基準としての遊離ペプチドT-1249に相当する。レーン1は、MARK 12標準に相当する。 図2は、実施例2(DMSO溶剤系)及び実施例3(混合水性DMSO溶剤系)から得られた一例としての複合体試料のSDS-PAGEゲルである。レーン1は、MARK 12標準に相当する。レーン2は、遊離ペプチドT-1249に相当し、レーン3は、1:1モル比DMSO反応(実施例2)に相当し、レーン4は、1:2モル比DMSO反応(実施例2)に相当し、レーン5は、4:1モル比を用いた水性/DMSO混合反応(1:1)(実施例3)に相当する。 図3は、実施例3から得られた1:1モル比の複合体混合物のHPLCクロマトグラムを示す。注入された試料は、水性/DMSO混合反応において1:1モル比であり、図2のレーン3に示されたものと同様のペプチド及び生成物の分布を示した。 図4は、実施例5Aに記載されたような精製済モノ-PEG T1249のSDS-PAGEゲルに対応する。レーン1は標準であり、レーン2はT1249だけであり、そしてレーン3及び4は、異なるローディング量の最終精製済調製物を表す。 図5は、一例としての分解可能なmPEG試薬、mPEG-スクシニミジルフェニル-カーボネート、20kDaに共有結合されたモデル・ペプチドを使用して調製されたモノ-PEG化複合体のin vitroの加水分解を示すプロットである(実施例5D)。

Claims (24)

1. 抗HIV活性を有するペプチド（EI）に対する加水分解可能な結合を含む加水分解可能な連結（L _D ）によって1〜3個の水溶性ポリマー（POLY）に共有結合された抗HIV活性を有するペプチドを含む単離された複合体であって、該複合体は下記の構造：
   

   

   [式中、kは、ポリマー・セグメント(POLY-L _D )が共有結合されるEI上の反応部位の数に相当し、1、2又は3である。]
   を含み、
   該加水分解可能な結合は、ホスフェートエステル、カルバメート、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、及びカーボネートから成る群から選択され、
   該EIは、T-20、T-1249、PRO 542（CD4-IgG2としても知られる）、PRO-140、PRO-367、SCH-417690、TXN-355、UK-427、UK-857、GSK-873、GSK-140、PA9、PA10、PA11、及びPA12から成る群から選択される、複合体。
2. 前記加水分解可能な結合が、加水分解可能なカルバメート、ホスフェートエステル及びカーボネートから成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
3. POLYは、ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリオキサゾリン、及びポリ(アクリロイルモルホリン)から成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
4. POLYは、ポリ(アルキレンオキシド)である、請求項３に記載の複合体。
5. 前記ポリ(アルキレンオキシド)が、ポリ(エチレングリコール)である、請求項４に記載の複合体。
6. 前記ポリ(エチレングリコール)が、ヒドロキシ、アルコキシ、置換型アルコキシ、アルケノキシ、置換型アルケノキシ、アルキノキシ、置換型アルキノキシ、アリールオキシ及び置換型アリールオキシから成る群から選択されるエンドキャップ部分で末端キャップされる、請求項５に記載の複合体。
7. 前記ポリ(エチレングリコール)が、メトキシで末端キャップされる、請求項６に記載の複合体。
8. 前記ポリ(エチレングリコール)の分子量が、2,000ダルトン〜85,000ダルトンの範囲である、請求項５に記載の複合体。
9. POLYは、線状、分枝状、及びフォーク状から成る群から選択されたアーキテクチャを含む、請求項１に記載の複合体。
10. 前記EIは、T-20、T-1249、PRO 542、及びPRO-140から成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
11. 前記ポリマー・セグメントが結合されるEI反応部位が独立して、N-末端、C-末端、アミノ基、ヒドロキシル基、及びチオールから成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
12. 前記ポリマー・セグメントが結合されるEI反応部位が、アミノ又はヒドロキシルである、請求項１１に記載の複合体。
13. 前記L_Dの長さが、原子数1〜20である、請求項１に記載の複合体。
14. 下記の構造：
    

    

    [式中、Lは-O-又は-NH-C(O)であり、Arは芳香族基であり、構造II内の-NH-は、EIからのアミノ残基であり、Pはスペーサーであり、Zは-O-又は-NH-であり、そして構造III内のOは、EIからのヒドロキシル残基である。]
    から選択された構造を含む、請求項１に記載の複合体。
15. 構造III内で、Pは、-NH-P-Z-C(O)-と一緒にしたとき、天然型又は非天然型アミノ酸の残基である、請求項１４に記載の複合体。
16. Arはオルト、メタ又はパラ-置換型フェニルである、請求項１４に記載の複合体。
17. 構造III内で、「POLY-NH-」は、以下：
    

    

    

    

    

    から成る群から選択される、請求項１４に記載の複合体。
18. 下記の構造：
    

    

    [式中、nは2〜3400である。]
    に相当する、請求項１４に記載の複合体。
19. kが1に等しい、請求項１に記載の複合体。
20. 請求項１に記載の多数の複合体を含む組成物であって、該組成物中の各複合体は、請求項１に記載の抗HIV活性を有するペプチドに共有結合された1個の水溶性ポリマーを含む、組成物。
21. 請求項１に記載の複合体と製薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
22. 複合条件下で、請求項１に記載の抗HIV活性を有するペプチドと、該抗HIV活性を有するペプチドに対する加水分解可能な結合を形成するために有効な官能基を含む水溶性高分子試薬とを接触させることを含む、請求項１に記載のポリマー複合体を製造する方法であって、
    該加水分解可能な結合は、ホスフェートエステル、カルバメート、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、及びカーボネートから成る群から選択される、製造方法。
23. HIV感染を阻害するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の治療上有効量の複合体と、製薬上許容される賦形剤とを含む、医薬組成物であって、該組成物はHIV感染の阻害を必要とする対象に投与される、医薬組成物。
24. 1種又は2種以上の付加的な抗ウィルス剤と組み合わせて投与される、請求項２３に記載の医薬組成物。

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