KR100561768B1

KR100561768B1 - 부위특이적인 폴리에틸렌 글리콜-ｇｒｆ 접합물질

Info

Publication number: KR100561768B1
Application number: KR1020007005736A
Authority: KR
Inventors: 베로네즈프란세스코마리아; 칼리세티파올로; 쇼이아본오돈
Original assignee: 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2006-03-16
Also published as: US6528485B1; CN1280483A; BG104484A; KR20010032494A; ATE236607T1; AR017780A1; WO1999027897A9; DE69813291D1; EP0922446A1; HUP0100507A2; JP2010024245A; EP1037587A1; NO20002664D0; JP2001524505A; UA73716C2; EP1037587B1; JP5431874B2; SK8242000A3; SI1037587T1; DE69813291T2

Abstract

본 발명은 Lys¹²또는 Lys²¹또는 N^α에 공유적으로 결합된 한 개 PEG(hGRF)이상을 포함하는 부위특이적인 hGRF-PEG 접합물질을 만드는 방법에 관계하는데, hGRF 펩티드 및 활성화된 PEG간의 접합 반응은 용액에서 실시되고, 원하는 hGRF-PEG 접합물질은 크로마토그래피 방법으로 정제하는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 방법으로 준비된 접합물질 및 이를 생장 호르몬 결핍의 치료, 예방 또는 진단에 이용하는 것도 본 발명의 목적이다.

Description

부위특이적인 폴리에틸렌 글리콜-ＧＲＦ 접합물질{SITE-SPECIFIC PREPARATION OF POLYETHYLENE GLYCOL-GRF CONJUGATES}

본 발명은 Lys¹²또는 Lys²¹또는 N^α에 공유적으로 결합된 한 개 PEG(hGRF)이상을 포함하는 부위특이적인 hGRF-PEG 접합물질을 만드는 방법에 관계하는데, hGRF 펩티드 및 활성화된 PEG간의 접합 반응은 용액에서 실시되고, 원하는 hGRF-PEG 접합물질은 크로마토그래피 방법으로 정제하는 것을 특징으로 한다.

1980년 초에, 몇 가지 군이 분리되어, 생장 호르몬 방출 인자(GRF)로 분류되었다. GRF(Somatorelin이라고도 불림)은 시상하부에서 방출되는 펩티드로써, 시상하부의 수용체에 반응하고, 뇌하수체전엽으로부터 생장 호르몬(GH) 방출을 촉진시킨다. 주로 44-,40-,37-아미노산으로된 펩티드로 존재하고, 44-개 아미노산형은 생리학적으로 짧은 형으로 전환될 수 있다. 이들 세가지 형이 모두 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 활성은 주로 처음 29개 아미노산 잔기에 있는 것으로 보인다. 사람의 GRF[hGRF(1-29)] 1-29 아미노산 서열에 상응하는 합성 펩티드를 세르모레린(Sermorelin)이라고 하는데, 이는 European Patent EP 105 759에서 설명하는 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있다.

세르모레린의 아세테이트형을 이용하여, 생장 호르몬 결손 진단 및 치료를 한다.

GRF는 또한 특정 생장 호르몬 관련 질환의 치료에 치료요법적으로 가치가 있는 것으로 보인다. GH 방출을 촉진시키는데, GRF를 이용하는 것은 장시간 뼈 생장또는 단백질 동화작용을 촉진시킨다.

GRF를 이용하는 것과 관련된 한 가지 문제점은 이의 생물학적 반감기가 짧다는 것이다(약 12-30분). hGRF(1-29)-NH₂는 효소적으로 분해되어, Ala² 및 Asp³사이를 절단하는 디펩티딜펩티다제IV(DPP-IV)를 통하여 혈장에서 신속하게 분해된다.

따라서, 효소적 분해를 예방하거나 천천히 되도록 하기 위해, 화학적으로 특이하게 변형된 GRF를 이용하여, 생물학적으로 안정하고, 장시간 작용할 수 있는 GRF 유사체를 개발하는 것이 유익하다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 친수성 있고, 생물학적으로 적합한 비-독성 고분자로 일반식은 H(OCH₂CH₂)_nOH(이때, n??4이다)이다. 이의 분자량은 200 부터 20,000 달톤까지 다양하다.

단백질 또는 펩티드에 모노메톡실화된 GRF가 화학적으로 접합되면 생물학적 작용을 상당히 증가시킨다는 것이 설명된 바 있다. 당단백질에서 탄수화물 부분과 같이, PEG는 보호성 피막을 제공하고, 분자의 크기를 증가시켜, 이들의 대사 분해 및 신장에 의해 제거되는 속도를 줄여준다.

PEG 접합은 Davis and Abuchowski(Abuchowski et al., 1977a and 1977b)의 기초 연구에서 개척된 펩티드 및 단백질 운반 방법으로 이미 정립된 바 있다. 펩티드 또는 단백질에 PEG가 접합되면, 일반적으로 PEG가 한 개 이상의 아미노산 잔기에 비-특이적인 화학적 결합을 하게 된다. 이 기술의 주요 결과 중에 하나는 특정 아미노산 잔기에 공유적으로 PEG 분자가 접합되는 적절한 화학적 방법을 발견하였다는 것이다.

예를 들면, 독성이 있고, 비-특이적으로 반응하는 것으로 알려진 트리클로로트리아진-활성화된 PEG는 아미노기(Benchamp et al., 1983; Veronese et al., 1985; Zalipsky et al., 1983; Zalipski et al., 1990; and Delgado et al., 1990) 또는 SH기(Sartore et al., 1991; and Morpurgo et al., 1996) 또는 구아니디노 잔기(Pande et al., 1980)에 특이적으로 결합하는 화학적 링커와 다양한 PEG 시약으로 나중에 대체될 수 있다.

다양한 PEG-단백질 공액물질은 단백질 분해로부터 보호되고 면역원성이 감소된 것으로 밝혀졌다(Monfardini et al., 1995; and Yamsuki et al., 1988).

단백질 페글리레이션(peglyation)에서 또 다른 기술적인 어려움은 PEG-단백질 접합물질은 항상 다양한 수의 부착된 PEG 분자를 가지고 있어, 여러 가지 다른 PEG:단백질 화학량론적인 접합물질 혼합물이 된다는 것이다. 부위-특이적인 페글리리이션의 경우에 화학적인 문제는 남아있게 된다. GH에 PEG가 접합되는 것이 이와 같은 문제의 전형적인 예가 된다(Clark et al., 1996). 이는 GH의 Lys-잔기가 무작위한 위치에서 페글리레이션된다는 것이 설명된 바 있다.

효소 활성 손실을 피하거나 손실을 줄이기 위해, 활성 부위를 미리 보호해두 고, 비-특정 부위에 효소 페글리레이션이 발생되도록 한다(Caliceti et al., 1993).

또 다른 방식은 고형상 펩티드 합성에 의해 준비된 GRF와 같은 분자량이 적은 펩티드에 부위 특이적으로 PEG를 접합시키는 것에 대해 제안된 바 있다. 이와 같은 접합에서, 미리 준비한 페글리레이션화된 아미노산을 고형-상 합성 동안에 펩티드 서열에 도입시킨다. 그러나, 이와 같은 과정은 고형상 합성에서 중요한 단계로 알려진 생성물 정제가 상당히 복잡하게 얽혀있다. 상당히 높은 분자량과 분산성을 가지는 PEG가 존재함으로써 수용불가능한 불순도를 가지는 최종 생성물을 만들게 되거나 아미노산이 상실된 생성물을 만들게 되고, 이는 Merrifield 과정에서 흔히 발생되는 것으로 간주된다.

[Ala¹⁵-hGRF(1-29)-NH₂의 특정 아미노산 잔기에 고형-상 합성을 이용하여, 한 개의 PEG 분자가 부착되는 모노-페글리레이션이 문헌에서 최근에 보고된 바 있다(Felix et al., 1995). 이 연구에서 21 또는 25 잔기에 페글리레이션된 [Ala¹⁵]-hGRF(1-29)-NH₂은 모 화합물 [Ala¹⁵]-hGRF(1-29)-NH₂의 in-vitro 효능을 완전히 보유한다. 그러나, 이와 같은 페글리레이션화된 접합물질이 페글리레이션안된 것에 비하여 더 오래 작용을 한다는 in-vivo 자료는 없다.

좀더 최근에는, 고형상 합성을 이용하여, 상이한 분자량을 가진 PEG가 hGRF의 몇 가지 유사체의 C-말단에 부착시키면 페글리레이션화안된 것과 비교하였을 때 돼지와 생쥐에서 작용 기간이 강화되었다는 것이 설명된 바 있다(Campbell et al., 1997).

상기에서 언급한 모노-페글리레이션화된 hGRF를 고형상에서 준비하는 것과는 대조적으로, 본 발명은 용액상에서 hGRF의 부위-특이적인 페글리레이션화시키는 것을 포함한다.

hGRF는 대부분의 효과적인 페글리레이션 반응이 일어나는 화학적 조건에서 중성/알칼리 용액에서 용해도가 매우 낮은 것으로 알려졌다. 희석된 hGRF 용액에서, 활성화된 PEG(PEG 에스테르)의 가수분해는 페글리레이션 반응 수득률을 감소시키는 경향이 있다.

출원인에 따르면, hGRF의 용해도가 높은 적절한 용매에서, 용액상에서 부위-특이적인 페글리화반응을 실행하는 것이 가능하다. 이와 같은 방식에서, 출발 hGRF 펩티드가 보호되지 않은 경우라도, PEG 사슬은 반응 조건에 따라 Lys¹²,Lys²¹ N^α의 주요 아미노산 기(ε기)에 거의 전적으로 높은 수득률로 결합된다. 다음의 4가지 접합물질이 본 발명에서 얻은 것으로, 접합물질에서 hGRF:PEG 화학량 비율은 주로 PEG에 대한 hGRF의 몰 비율에 따라 달라진다는 것이다;

hGRF-PEG 접합물질, 1개 PEG 분자가 Lys¹²에 공유적으로 결합됨;

hGRF-PEG 접합물질, 1개 PEG 분자가 Lys²¹에 공유적으로 결합됨;

hGRF-2PEG 접합물질, 2개 PEG 분자가 Lys¹² 및 Lys²¹에 공유적으로 결합됨;

hGRF-3PEG 접합물질, 3개 PEG 분자가 Lys¹², Lys²¹, N^α에 공유적으로 결합됨;

N^α는 본 발명에서, 펩티드(Tyr)의 N-말단에 아미노산을 의미한다.

이 단계에서, 반응에서 수득된 접합물질을 겔 여과 또는 물/아세토니트릴 농도차에 의해 용출된 C18 HPLC 컬럼에 직접 사용하여 간단하게 크로마토그래피에 의한 분취를 실행할 수 있다. 생성물을 대규모로 준비하고, 정제할 수 있기 때문에두 번째 방법이 적절하다.

따라서, 본 발명의 주요 구체예는 Lys¹², Lys²¹, N^α에 공유적으로 결합된 한 개의 PEG단위(hGRF) 이상을 포함하는 부위-특이적인 여러 가지 다른 hGRF-PEG 접합물질을 준비하는 방법에 관한 것으로 이때 페글리레이션 반응은 용액에서 실시하고, 원하는 hGRF-PEG 접합물질은 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제한다.

본 발명에서는 Lys¹², Lys²¹, N^α에 공유적으로 결합된 한 가지 이상의 PEG 단위(hGRF의 몰당)을 포함하는 hGRF-PEG 접합물질도 포함된다. Lys¹² 또는 Lys²¹에 공유 결합된 1개 PEG분자를 가지는 hGRF-PEG가 본 발명의 적절한 생성물이 된다.

본 발명의Eh 다른 구체예에 따르면, PEG가 결합된 이와 같은 세 개 아미노산 기중에 한 개 이상이 페글리레이션에 의해 특정 화학기에 의해 가역적으로 보호를 받는 경우에, 페글리레이션 반응은 특정 페글리레이션 부위를 가지는 원하는 접합 물질을 바로 제공할 수 있고, 이는 반응 혼합물에서 한외여과 또는 다른 크로마토그래피 방법에 의해 분리시킬 수 있다. 이와 같은 경우에, 준비 방법은 선택적으로 탈-보호 반응이 추가로 포함될 수 있다.

탈-보호 반응은 공지의 방법에 따라 실시하는 것이 바람직하고, 제거될 화학적 보호기에 따라서 달라질 수 있다.

본 발명에서, "hGRF"는 다른 언급이 없는 한, 임의의 사람 GRF 펩티드를 말하는 것으로, 1-44, 1-40, 1-29개 펩티드 및 이에 상응하는 아미드(N-말단 또는 C-말단에 아미드 기를 포함)를 포함한다. 적절한 hGRF 펩티드는 hGRF(1-29)-NH₂로써, 이의 아미노산 서열은 서열 1에 나타내었다.

"활성화된 PEG"(또는 "페글리레이션 물질")은 임의 PEG 유도체로써, 이는 단백질 변형물질로 이용되는데, 그 이유는 단백질/펩티드에 있는 일부 기능기와 반응할 수 있는 기능기를 보유하여, PEG-단백질/펩티드 접합물질을 만들기 때문이다. 단백질 변형물질로 유용한 PEG 유도체는 Harris (1985)에서 찾아 볼 수 있다. 활성화된 PEG는 알킬화된 물질로써, PEG 알데히드, PEG 에폭시드 또는 PEG 트레실레이트이 되고, 아실화된 물질 즉, PEG 에스테르가 될 수 있다.

활성화된 PEG는 모노-메톡실화된 형으로 이용하는 것이 바람직하다. 적절한 분자량은 약 2,000 내지 20,000사이가 된다. 모노-메톡실화된 PEG₅₀₀₀이 본 발명에따른 활성화된 PEG를 준비하는데 특히 적절하다.

활성화된 PEG가 아실화된 물질인 경우에는 아미드 연결을 통한 PEG 부분에 결합된 노르루이신 또는 오르니틴 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같은 잔기는 펩티드 몰당 연결된 PEG 단위를 정확하게 결정할 수 있도록 한다(예를 들면 Sartore et al., 1991를 참고). 따라서, 특히 적절한 활성화된 PEG는 노르루이신의 알파 아미노기에 아미드 결합에 의해 모노-메톡실화된 PEG_5,000-linked를 말하고, 이는 카르복실기에서 숙시니미딜 에스테르로 활성화된다.

통상적으로는 분지쇄 PEG도 이용된다. 분지쇄 PEG는 (R(-PEG-OH)_m로 나타내는데, 이때 R은 중앙에 코어 부분을 나타내는 것으로 펜타에리트리톨 또는 글리세롤을 나타내고, m은 분지쇄 연결 다리의 수를 나타낸다. 분지쇄 다리(m)의 수는 3부터 백개이상이 된다. 하이드록실 기가 화학적 변형을 받게 된다.

PCT 특허 출원 WO 96/21469에서 설명하는 것과 같은 또 다른 분지쇄 형은 화학적 변형을 받게되는 단일 말단을 가진다. 이와 같은 타입의 PEG는 (CH₃O-PEG-)_pR-X로 나타내고, 이때 p는 2 또는 3이 되고, R은 리신 또는 글리세롤과 같은 중앙 코어를 나타내고, X는 화학적 활성화가 될 카르복실과 같은 기능기가 된다. 또 다른 분지쇄형으로 "펜던트 PEG"는 PEG쇄의 말단보다는 PEG 골격구조를 따라 카르복실과 같은 반응기를 가진다.

이와 같은 모든 분지쇄 PEGs는 상기에서 지적한 바와 같은 "활성화된"으로 말할 수 있다.

"크로마토그래피 방법"은 용매(이동상)가 흐르는 서포트(정지상)에서 이를 제공하여 혼합물에서 성분을 분리하는데 이용되는 임의 기술을 말한다. 크로마토 그래피의 분리 원리는 정지 및 이동상의 물리학적으로 다른 특징을 기초로한 것이다.

문헌에 잘 알려진 크로마토그래피 방법의 일부 특정 타입은 액체 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 분리 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과 크로마토그래피 또는 박층 크로마토그래피등이 있다.

"페글리레이션"은 활성화된 PEG 및 이에 상응하는 단백질/펩티드를 출발물질로 하여 PEG-단백질/펩티드 접합물질을 수득하는 반응을 말한다.

PEG:hGRF의 몰 비율은 접합물질이 높은 수득율로 얻을 수 있는 것에 따라 달라지는데, 1:1, 2:1, 3:1이 될 수 있다.

페글리레이션 반응의 용매는 고도로 농축된 니코틴아미드 수용액, 완충된 디폴딩 물질(요소) 수용액, 디메틸 설폭시드, 디메틸 포름아미드/완충액 또는 아세토니트릴/완충액에서 선택된 극성 용매에서 선택된다.

용액의 pH는 항상 7 내지 9사이에 유지시킨다.

Lys¹² 및 Lys²¹의 보호기로는 Alloc(아릴옥시카르보닐), Dde(1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸), Adpoc(1-(1'-아다만틸)-1-메틸-에톡시카르보닐) 또는 2-Cl-Z(2-클로로벤질옥시카르보닐)등을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. Alloc가 리신 기의 적절한 보호기가 된다.

페글리레이션반응후에, Alloc는 Greene T.W. et al., 1991에서 설명하는 방법중 한가지를 이용하여 제거할 수 있다. Dde는 2% 하으드라진/DMF에서 제거할 수 있다(see W.C. Chan et al., 1995). Adpoc는 Alloc와 유사하게 제거할 수 있다(see also Dick F. et al., 1997). 2-Cl-Z는 더 강한 산 탈보호(HF, TFMSA, HBr) 또는 수소화반응(see also Tam et al., 1987)을 요구한다.

N^α에 대한 보호기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 벤질, 사이클로헥실과 같은 알킬기가 될 수 있다. 이소프로필이 적절하다. 이와 같은 알킬기는 환원성 알킬화반응으로 도입된다(see Murphy et al., 1988 or Hocart et al., 1987).

[N^α-isopropyl-Tyr¹, Lys(Alloc)¹²]-hGRF 및 [Lys(Alloc)^12,21]-hGRF도 본 발명에 포함되는데 이들은 페글리레이션 반응의 새로운 중간생성물로 유용하다.

본 발명의 페글리레이션은

1. 펩티드의 모양을 변형시키지 않고;

2. 단백질 분해에 대한 저항성을 증가시키고;

3. 페글리레이션 반응 정도에 따라 생물학적 활성에 영향을 주지 않거나 또는 약간 감소시키고; 그리고

4. 수용성 완충 용액에서 좀더 용해성이 큰 생성물(접합물질)을 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 또 다른 목적은 실제 정제된 형의 hGRF-PEG 접합물질을 제공하여, 제약학적 조성물에서 활성 성분으로 이용할 수 있도록 한다.

본 발명에서는 생장 호르몬 결핍(GHD) 특히 어린이 생장 호르몬 결핍과 같은 생장 호르몬-관련된 질환의 치료, 예방, 진단을 위한 약물을 제조하는데 본 발명의 접합물질을 유용하게 이용하는 것을 제공한다.

제약학적 조성물에는 본 발명의 접합물질과 한가지 이상의 제약학적으로 수용 가능한 담체/부형제로 구성된 형태로 제공된다. 이와 같은 제약학적 조성물도 본 발명의 특징에 속한다.

본 발명의 구체예는 생장 호르몬관련된 질환이 발생할 위험이 있는 개체 또는 이미 이와 같은 질병을 가진 환자에게 병인이 서서히 나타나도록 하기 위해 본 발명의 접합물질을 치료요법적으로 효과량을 투여하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생장 호르몬-관련된 질환의 치료, 예방 및 진단하는 방법을 제공하는데, 이는 한 가지 이상의 제약학적 수용가능한 부형제 존재하에 본 발명의 접합물질 효과량을 투여하는 것으로 구성된다.

"효과량"은 상기에서 설명하는 질병의 과정 및 심각성에 영향을 주어 이와 같은 병인의 감소 또는 완화시킬 수 있을 정도의 충분한 양의 활성 성분의 양을 말한다. 효과량은 환자의 상태 및 투여 경로에따라 달라진다.

"제약학적으로 수용 가능한"은 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 간섭하지 않고, 투여하였을 경우에 숙주에 독성이 없는 임의 운반체를 의미한다. 예를 들면, 장관외 투여하였을 경우에 상기 활성 성분은 염, 덱스트로즈 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반체에 주사할 수 있는 단위 약형으로 조제된다.

제약학적으로 수용 가능한 담체이외에 본 발명의 조성물에는 안정화제, 부형제, 완충액, 보존제와 같은 소량의 첨가제가 추가로 포함된다.

활성 성분과 필적할 수 있는 임의 투여 경로를 이용한다. 적절한 것으로는 피하, 근육내, 또는 정맥등을 통한 장관외 투여가 된다. 투여되는 활성 성분의 양의 환자의 나이, 체중, 개인의 반응등에 따라 의학적인 처방에 기초하여 달라질 수 있다.

사람을 치료하기 위한 활성 성분의 약량은 5 내지 6,000㎍/㎏이 되고, 적절한 약량범위는 약 10 내지 300㎍/㎏이 된다.

본 발명은 특정 구체예를 통하여 설명하나, 청구범위를 벗어나지 않고 당업자가 생각할 수 있는 모든 변형 및 치환이 설명에 포함된다.

본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명하나 이에 본 발명을 한정시키는 것이 아니다. 실시예는 다음의 명시된 도면을 통하여 설명한다.

도 1은 hGRF(1-29)-NH₂의 아미노산 서열을 나타낸다. 화살표는 페글리레이션이 가능한 부위를 나타낸다.

도 2는 실시예 1에의 설명에 따라 실시된 DMSO에서 페글리레이션 반응후에 수득된 혼합물의 역상 HPLC 크로마토그래피를 나타낸다. 처음 두 개 주요 피크는 hGRF 몰당 1개 PEG를 포함하는 접합물질을 나타낸다. 다음에 나오는 적은 피크는 hGRF:2PEG를 나타내고, 마지막으로 나오는 작은 피크는 hGRF:3PEG를 나타낸다.

도 3a는 서브틸리신에 의해 본 발명의 PEG 및 hGRF(1-29) 접합물질이 분해되는 것을 나타낸 것이다.

도 3b는 키모트립신에 의해 본 발명의 PEG 및 hGRF(1-29) 접합물질이 분해되는 것을 나타낸 것이다.

도 4는 원편광 이색성으로 실행한 [Lys(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)^12,21-hGRF(1-29)NH₂]의 분광 특징을 나타낸다. 스펙트럼은 고유 hGRF의 것과 겹쳐진다.

도 5는 CHO-hGRF-LUC in vitro 검사에서 처음 DMSO 준비물로부터 다양한 hGRF-PEG 접합물질의 생물학적 효과를 나타내는 것이다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸 것이다.

도 6은 CHO-hGRF-LUC in vitro 검사에서 두번째 DMSO 준비물로부터 다양한 hGRF-PEG 접합물질의 생물학적 효과를 나타내는 것이다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸 것이다.

도 7은 CHO-hGRF-LUC in vitro 검사에서 니코틴아미드 준비물로부터 다양한 hGRF-PEG 접합물질의 생물학적 효과를 나타내는 것이다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸 것이다.

도 8은 쥐의 뇌하수체 세포에서 in vitro 상에서 GH 방출시에 다양한 hGRF-PEG 접합물질(처음 DMSO 물질)의 생물학적 효과를 설명한다.

도 9는 쥐의 뇌하수체 세포에서 in vitro 상에서 GH 방출시에 다양한 hGRF-PEG 접합물질(두번째 DMSO 물질)의 생물학적 효과를 설명한다.

도 10은 수컷 쥐에 hGRF(400㎍/rat)를 주사한 후에 혈장 hGRF 및 혈청 GH 수준이 시간에 따라 변화되는 곡선을 나타낸다. 각 점은 9마리 쥐에서 수득한 평균±SEM을 나타낸다.

도 11A(페이지의 처음 그래프)는 수컷 쥐에 hGRF-PEG 접합물질(DMSO 물질)(400㎍/rat)를 주사한 후에 혈장 hGRF 및 혈청 GH 수준이 시간에 따라 변화되는 곡선을 나타낸다. 각 점은 3마리 쥐에서 수득한 평균값을 나타낸다.

도 11B(페이지의 두번째 그래프)는 수컷 쥐에 hGRF-PEG 접합물질(DMSO 물질)(400㎍/rat)를 주사한 후에 혈장 hGRF 및 혈청 GH 수준이 시간에 따라 변화되는 곡선을 나타낸다. 각 점은 3마리 쥐에서 수득한 평균값을 나타낸다.

도 12는 GRF 활성을 평가하는데 이용되는 리포터 유전자 검사에 이용된 플라스미드 pcDNA3-hGRF-R의 제한효소 유전자 지도를 나타낸다.

도 13는 GRF 활성을 평가하는데 이용되는 리포터 유전자 검사에 이용된 플라스미드 pTF5-53 LUC의 제한효소 유전자 지도를 나타낸다.

약어

아세토니트를[Acetonitrile](ACN);

아릴카르보닐[allyloxycarbonyl](Alloc);

벤질[Benzyl](BZL);

3차-부틸옥시카르보닐[tert-Butyloxycarbonyl](Boc);

디클로로메탄[Dichloromethane](DCM);

디이소프로필에틸아민[Diisopropylethylamine](DIEA);

디메틸 포름아미드[Dimethyl Formamide](DMF);

디메틸 설폭시드[dimethyl sulphoxide](DMSO);

9-플로오에닐메틸옥시카르보닐[9-Fluorenylmethyloxycarbonyl](FMOC);

2-[1H-벤조트리아졸-1-일]-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플로로포스페이트[2-[1H-Benzotriazole-l-yl]-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate](HBTU);

1-하이드록시벤조트리아졸[1-hydroxybenzotriazole](HOBt);

메틸-부틸 에테르[methyl-butyl ether](MTBE);

노르루이신[norleucine](Nle);

N-메틸 피롤리돈[N-methyl pyrrolidone](NMP);

2,2,5,7,8-펜타메틸-크로만-6-설포닐[2,2,5,7,8-Pentamethyl-chroman-6-sulfonyl(Pmc);

3차-부틸[tert-Butyl](tBu);

트리플로오르아세트산[Trifluoroacetic Acid](TFA);

트리페닐메틸[Triphenylmethyl](Trt).

실시예 1; hGRF의 용액상 페글리레이션 반응

이와 같은 실험에서 노르루이신의 알파 아미노 기에 아미드 결합에 의해 연결된 모노-메톡실화된 PEG_5,000(MPEG_5,000)은 숙시니미딜 에스테르와 같은 카르복시시 에서 활성화되어, 페글리레이션 반응 물질로 이용된다. 이는 Lu et al., 1994.에서 설명하는 실시예에 따라 만들 수 있다.

사람의 GRF_1-29 hGRF(1-29)-NH₂(Bachem에서 제공)을 hGRF 펩티드로 이용한다.

페글리레이션에 필요한 중성 또는 약간 알칼리성 pH에서 물 용액에 hGRF(1-29)의 용해도가 낮을 경우에, 또 다른 반응 조건 A 내지 E를 이용한다.

A. 디메틸 설폭시드; 20㎎ 펩티드를 1㎖ DMSO에 용해시키고, 한번에 적정한 양의 페글리레이션 시약을 첨가한다.

B. 디메틸 포름아미드/0.2M 붕산염 완충액 pH8.0에(1:1 용적비); 펩티드와와 적정양의 페글리레이션 시약을 한번에 첨가한다.

C. 상당히 농축된 니코틴아미드 수용액(200 ㎎/㎖): 200㎎ 니코틴아미드를 40㎎ hGRF(1-29)/1㎖ 10mM 아세트산 용액에 첨가한다. 1㎖ 0.2M 붕산염 완충액(pH8.0)을 산성 용액에 첨가하여, 원하는 pH를 만들고, 적정한 양의 페글리레이션 물질을 첨가한다.

D. 아세토니트릴/0.2M 붕산염 완충액(pH8.0)(용적비는 1:1); 적절한 양의 페글리레이션 반응 물질을 한번에 첨가한다.

E. 0.2M 붕산염 완충액, 5M 요소,pH 8.0; 적절한 양의 페글리레이션 반응 물질을 한번에 첨가한다.

건조 PEG 시약을 교반하에서 첨가하여, 최종 PEG:hGRF의 몰비를 1:1, 2:1, 3:1로 만든다. 2:1 비율이 적절하다.

상이한 PEG:hGRF 몰비를 이용하면, 원하는 접합물질이 되는 주요 접합물질을 가지는 반응 혼합물을 준비할 수 있다.

반응 용액은 정제하기 전에 실온에서 5시간 동안 방치한다.

다음의 4가지 hGRF-PEG 접합물질(A1-A4)을 수득하였다;

A1:[Lys(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)¹²-hGRF(1-29)-NH₂],

A2:[Lys(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)²¹-hGRF(1-29)-NH₂],

A3:[Lys(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)^12,21-hGRF(1-29)-NH₂],

A4:N^α-(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)^12,21-hGRF(1-29)-NH₂].

1,000D을 차단하는 막을 이용하여 과량의 DMSO, 디메틸 포름아미드, 아세토니트릴, 요소 및 반응물의 부산물(하이드록시숙시니미드)를 제거한다. 용적은 10mM 아세트산을 이용하여, 10㎖로 만들고, 그 다음 이를 1㎖로 줄인다. 과정은 3회 반복한다.

hGRF-PEG 접합물질은 겔 여과 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피에 의해 분리한다.

실시예 2; 겔 여과 크로마토그래피

겔 여과 크로마토그래피에 의해 생성물은 성분의 상이한 분자량에 기초하여 분취한다(이 경우에, 접합물질 hGRF-PEG 1:1 MW =8,358, hGRF-PEG 1:2 MW=13,358, and hGRF-PEG 1:3 MW=18,358, 접합안된 hGRF MW = 3358). 분당 1.5㎖ 유속으로 10㎖ 아세트산으로 용출시킨 일련의 컬럼 시스템 Superdex 75-Superose 12 resin(Biotech, Pharmacia)을 이용하여 분리시킨다.

1㎖씩 분취된 분취물에 포함된 단백질 함량은 OD 280nm에서 분석하고, PEG 함량은 요오드 세트트한다(Sims et al., 1980).

hGRF:PEG 몰비 1:1을 이용하여 DMSO에서 페글리레이션 반응 후에, 세 개의 피크를 얻을 수 있다;

hGRF-PEG 접합물질(용출 용적 132㎖-주요 피크);

hGRF-PEG 접합물질(용출 용적 108㎖-작은 피크);

접합안된 hGRF 물질(용출 용적 108㎖-작은 피크).

hGRF:PEG 몰비 1:2을 이용하여 DMSO에서 페글리레이션 반응 후에, 세 개의 피크를 얻을 수 있다;

hGRF-PEG 접합물질(용출 용적 108㎖-주요 피크);

hGRF-PEG 접합물질(용출 용적 132㎖-작은 피크);

접합안된 hGRF 물질(용출 용적 73㎖-작은 피크).

hGRF:PEG 몰비 1:3을 이용하여 DMSO에서 페글리레이션 반응 후에, 두 개의 피크를 얻을 수 있다;

hGRF-PEG 접합물질(용출 용적 73㎖-주요 피크);

hGRF-PEG 접합물질(용출 용적 108㎖-작은 피크).용출된 피크를 수집하고, 1,000D 차단 막을 이용하여 한외여과에 의해 농축시키고, 10mM 아세트산에 용해시키고, 이를 확인하고, 정량화한후에 특징으로 알 수 있다.

73㎖ 용출 용적에서 나타낸 피크는 화합물 A4에 상응하는 것으로 밝혀졌다.

132㎖ 용출 용적에서 나타낸 피크는 화합물 A3에 상응하는 것으로 밝혀졌다.

108㎖ 용출 용적에서 나타낸 피크는 화합물 A2 및 A1 혼합물에 상응하는 것으로 밝혀졌다.

232㎖ 용출 용적에서 나타낸 피크는 접합물질안된 hGRF에 상응하는 것으로 밝혀졌다.

그러나, 이와 같은 정제 방법을 이용해도, 동일한 분자량을 가졌으나, 다른 페글리레이션 부위(위치상 동사체)를 가진 hGRF-PEG는 분리할 수 없다.

실시예 3: 역상 크로마토그래피

RP-HPLC C18 컬럼을 이용하여 소수성 크로마토그래피에 의해 좀더 특이적인 분취를 할 수 있다. 이와 같은 과정은 동일한 분자량을 가지는 동소체를 실제 분리시킬 수 있다. 사실, 이와 같은 방법을 이용하면, 겔 여과에 의해 수득된 1개 PEG가 결합된 접합물질에 상응하는 단일 피크는 두 개 피크로 분리되어 있다는 것을 알 수 있다.

역상 크로마토그래피는 RP-HPLC C18 예비 컬럼(Vydac)을 이용하여 실행하는데, 이는 H₂O/0.05%TFA(Eluent A) 및 아세토니트릴/0.5% TFA(Eluent B)로 다음과 같이 용출시킨다;

0-5분 35% A

5-35 분 35% A ?? 2% A

35-38 분 2% A

38-40 분 2% A ?? 35% A

유속 ; 10㎖/분; loop 1 ㎕; UV-Vis. 감지기(280nm).

hGRF:PEG 몰비 1:1을 이용하여 DMSO에서 페글리레이션 반응 후에, 다음의 4개 피크를 얻는다;

1 13.2 분 major peak;

2 13.7 분 major peak;

3 14.4 분 minor peak;

4 8.9 분 minor peak.

hGRF:PEG 몰비 1:2을 이용하여 DMSO에서 페글리레이션 반응 후에, 다음의 4개 피크를 얻는다;

1 13.2 분 minor peak;

2 13.7 분 minor peak;

3 14.4 분 major peak;

4 15.5 분 minor peak.

hGRF:PEG 몰비 1:3을 이용하여 DMSO에서 페글리레이션 반응 후에, 다음의 4개 피크를 얻는다;

1 14.4 분 minor peak;

2 15.5 분 major peak.

용출된 피크를 수집하고, 기화시켜, 아세토니트릴 및 TFA를 제거하고, 동결건조시킨다. 건조 생성물을 10mM 아세트산 용액에 용해시키고, 여기에서 보고된 바와 같이 분리된 종의 확인 및 정량화를 위해 분석하였다.

hGRF-PEG 접합물질(13.2분에 용출됨)은 화합물 A1(GRF-1PEG,처음 피크)로 밝혀졌다.

hGRF-PEG 접합물질(13.7분에 용출됨)은 화합물 A2(GRF-1PEG, 두 번째 피크)로 밝혀졌다.

hGRF-PEG 접합물질(14.4분에 용출됨)은 화합물 A3(GRF-2PEG)로 밝혀졌다.

hGRF-PEG 접합물질(15.5분에 용출됨)은 화합물 A4(GRF-3PEG)로 밝혀졌다.

8.9분에 용출된 피크는 접합물질안된 hGRF로 밝혀졌다. 일반적으로, 2:1 PEG:hGRF 몰리를 이용하여 수득된 페글리레이션 반응 생성물의 역상 크로마토그래피는 도 2에 나타내었다.

건조 생성물은 용매 기회/동결건조를 이용하여 수득하였다.

실시예 3a: PEG _10,000 을 이용한 hGRF의 용액-상 페글리레이션 반응

이 실시예에서는 분자량이 10,000 Dalton인 분지쇄 모노메톡시 PEG와 스페이스로 리신(Shearwater Polymers, Inc.)을 이용하였다. 이와 같은 분지쇄 PEG는 리신의 각 아미노산이 PEG_5,000에 연결하여 수득하였다.

숙시니미딜 에스테르로 활성화된 스페이스 리신의 카르복시기는 DMSO에서 hGRF(1-29)-NH₂의 아미노기와 반응시키는데 이때 0.9 몰의 PEG와 1몰의 GRF를 이용한다.

용매는 제거하고, 잔기는 별도의 컬럼 Superose 12TM에서 겔 압출 크로마토그래피에 의해 분취시킨다. 두 개의 hGRF-PEG 접합물질에 상응하는 두 개 피크가 용출되었다. 처음 작은 피크는 hGRF에 결합된 두 개의 PEG_10,000단위를 가지는 접합물질에 상응하고, 두 번째 큰 피크는 hGRF에 대해 한 개의 PEG_10,000를 포함하는 접합물질에 상응한다.

실시예 3b; PEG _20,000 을 이용하여, hGRF의 용액상 페글리레이션

이 실시예에서는 분자량이 20,000 Dalton인 분지쇄 모노메톡시 PEG와 스페이스로 리신(Shearwater Polymers, Inc.)을 이용하였다. 이와 같은 분지쇄 PEG는 리신의 각 아미노산이 PEG_10,000에 연결하여 수득하였다.

용매는 동결건조에 의해 제거하고, 잔기는 별도의 컬럼 Superose 12TM에서 겔 압출 크로마토그래피에 의해 분취시킨다. 한 개의 피크를 얻었는데, 피크는 hGRF에 결합된 한 개의 PEG_10,000단위를 가지는 접합물질에 상응한다.

실시예 4: hGRF-PEG 접합물질의 분석학적 특징

전에 보고된 생성물을 다음의 검사에 기초하여 결합된 PEG 쇄에 대해 검사하였다;

1. 자유 아미노기 결정을 위해 트리니트로벤젠 설포네이트에 기초한 발색 방법(described in Habeed et al., 1966);

2. PEG 함량을 결정하기 위해, 요오드 검사에 기초한 발색 방법(as described in Sims et al., 1980);

3. 아미노산 분석에서 사슬 리포터로 노르루이신을 이용한 PEG 쇄의 수(as described in Sartore et al., 1991);

4. 접합물질의 분자량을 결정하기 위해 질량 스펙트로스코피를 이용.

MALDI-질량 스펙트로스코피를 이용하여, 접합물질의 분자량을 밝히고, 출발 PEG의 다중분산성(polydispersivity)으로 인한 접합물질의 다중분산성을 밝혔다.

아미노산 서열을 분석하여, hGRF-PEG 접합물질의 PEG 부착 부위를 분석하였다. 각 샘플은 100-배 희석하였다. 그 다음 이용액 10㎕(50 pmol)를 시퀀서기에 얹는다.

최종 생성물의 순도는 RP-HPLC 분석 크로마토그래피를 이용하여 실시하였다.

C18 분석용 컬럼(Vydac)을 이용하여, H₂O/0.05% TFA(Eluent A) 및 아세토니트릴0.05% TFA (Eluent B)를 다음과 같이 용출시켜 분석을 하였다.

0-5 분 80% A

5-50 분 80% A ?? 5% A

50-52 분 5% A

52-54 분 5% A ?? 80% A

유속은 1㎖/분, loop 20㎕, UV-Vis, 226nm에서 감지.

접합안된 hGRF는 20.7분에 용출되었다.

화합물 A1은 22.9분에서 용출되었고, 화합물 A2는 23.4분에 용출되었고, 화합물 A3는 24.4분에 용출되었고, 화합물 A4는 25.5분에 용출되었다.

"고유" 및 고분자-결합된 펩티드의 모양상 특징은 CD 분석으로 확인한다.

접합안된 hGRF 및 hGRF-PEG 접합물질의 스펙스로스코피상의 특징은 190-300nm 범위에서 CD 분석으로 확인한다. 샘플(50㎍/㎖)을 10mM 아세트산 또는 메탄올/10mM 아세트산(몰비는 30:70 또는 60:40)에 용해시킨다. 상기 용액에서, 접합안된 hGRF 및 hGRF-PEG 접합물질은 겹쳐지는 거동을 나타내는데, 이는 도 4의 화합물 3에 대해서 볼 수 있는 것과 같다. 아세트산 용액에서는 펩티드 무작위 모양을 나타내는데 비해, 메탄올 함량을 증가시키면, 펩티드는 α-헬릭스 모양이 된다.

결과를 보면, PEG 접합물질의 경우에 펩티드의 구조적인 성질에 상당히 변화를 주지않는다는 것을 알 수 있다.

실시예 5; hGRF-PEG 접합물질의 안정성 평가

hGRF 및 hGRF-PEG 접합물질의 단백질 분해에 대한 안정성은 스브티리신 및 키모트립신과 같은 단백질분해 효소를 이용하여 조사하였다.

서브티리신을 이용하여, 4℃에 0.297mM 펩티드/0.1M Tris HCl, 0.05M CaCl₂ pH 8.0 용액(펩티드/프로테아제 몰비는 1:50,000)을 배양한다.

키모트립신의 경우에, 펩티드는 0.08M Tris HCl, 0.1M CaCl₂ pH 7.8에 용해시키고, 펩티드/프로테아제의 몰비는 1:15,000를 사용하였다.

실시예 4에서 보고된 동일한 조건하에서 용출시킨 C18 컬럼을 이용한 분석 RP-HPLC을 이용하여 분해 거동을 조사하였다. 출발 화합물의 피크에 해당되는 높이는 단백질분해 효소로 배양하기 전에 그리고 배양시간 후에 계산하였다. 예정된 시간에서 잔기 높이는 도 3a 및 b에서 볼 수 있다.

hGRF는 다른 아실화 기 및 알킬화기로 활성화된 모노-메톡실화된 PEG로 접합시켰다.

알킬화된 PEG는 리신 잔기에서 양전하를 유지시키면서 접합을 하는 장점을 제공하였다.

실시예 1-4에서 설명하는 것과 같이 분리 및 특징을 조사하였다.

실시예 7: hGRF-PEG 접합물질의 활성 평가

물질

시험 화합물

사람 GRF_1-29hGRF(1-29)-NH₂, bATCH 1299201,(Bachem사에서 공급);

사람 GRF_3-29hGRF(3-29)-NH₂,(Bachem사에서 공급);

사람 GRF_3-29, (ISL사에서 공급);

상기에서 설명한 것과 같이 준비된 hGRF-PEG 접합물질

시약

CHO-hGRF-LUC in vitro

MEM 알파 배지+리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드(Gibco)+10% 태아송아지 혈청(Gibco)+600㎍/㎖ G418 설페이트(Gibco);

세포 배양물 용해 시약(Promega);

루시페라제 검사 시약(Promega);

Luclite(Packard)

In vitro 쥐 뇌하수체 세포 생검

Earle's Balanced Salts(EBSS)(Gibco)+50㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트(Sigma);

Medium 199(M199)+ Earle's Salts(Gibco)+12.5% 태아 송아지 혈청(FBS)(Gibco)+ 50㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트

쥐 GH 검사 키트(Amersham)

조직 분해용 효소 용액(30㎖ EBSS로 구성)

120㎎ 콜라게나제(Sigma)

30㎎ 히알루로니다제(Sigma)

30㎎ Dnase I (Sigma)

900㎎ BSA (Sigma)

재구성후에, 용액은 여과에 의해 살균시키고, 37℃에 둔다.

In vivo 생검

쥐 GH 방사능면역검사 키트(Amersham)

사람 GRF(1-44) 방사능면역검사 키트(Phoenix Pharmaceutical).

동물

SPF 성인 쥐 Sprague-Dawley rats, 200-250g(Charles River에서 제공), 순응시간 적어도 7일이상.

방법

CHO-hGRF-LUC in vitro 검사

CHO-hGRF-LUC(클론 1-11-20)은 pcDNA3-hGRF-R 및 pTF5-53 LUC 벡터를 CHO-DUKX 세포주에 공동트렌스펙션시켜 수득한 클론된 세포주이다.

플라스미드 pcDNA3-hGRF-R는 사람의 생장 호르몬 방출인자 수용체 (hGRF-R)cDNA를 pcDNA3 발현벡터에 삽입하여 만든 것이다. hGRF-R cDNA를 포함하는 Bluescropt 플라스미드는 Dr. B. Gaylinn(University of Virginia)에서 제공하였다. pcDNA3 포유류 발현벡터는 Invitrogen에서 구하였다. hGRF-R 코딩 서열은 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 이용하여 실시한다. 이의 제한효소 유전자 지도는 도 12에 나타내었다.

플라스미드 pTF5-53LUC는 플라스미드 poLuc에서 루시페라제 코딩 서열의 이의 내생 프로모터 상류를 따라 c-fos cAMP 반응 원소를 삽입하여 만든 것이다. cAMP 반응 원소 및 c-fos 프로모터는 플라스미드 pTF5-53에서 얻었다(Fish et al, 1989). 루시페라제 코딩 서열의 상류 다중 클로닝 부위를 가지는 프로모터없는 리포터 유전자 벡터(poLuc)는 Dr. Brasier(University of Texas, Galveston)가 제공하였다. 이의 제한효소 유전자 지도는 도 13에 나타내었다.

상기에서 설명하는 공동-트랜스펙션에 의해 수득한 이와 같은 CHO-DUKX 세포는 리보뉴클레아제 및 데옥시리보뉴클레아제를 포함하는 MEM 알파 배지(10% 태아 송자지 혈청+600㎍/㎖ 젠타마이신 G418 설페이트)에서 생장시킨다.

세포는 흰색 96-웰 플레이트(Dynatech)에 접종시키고(40,000세포/웰), 검사하기 전에 200㎕ 생장 배지에서 16-18시간동안 배양시킨다.

그 다음날, 배지를 제거하고, 다른 농도의 hGRF(1-29) 기준 표준(Bachem)을 포함하는 배지 또는 다른 hGRF-PEG 접합물질을 포함하는 배지로 대체시켜, 플레이트를 2시간동안 37℃, 5% CO₂에서 배양시킨다. 배양이 종료될 무렵, CHO-hGRF-LUC 세포에서 200㎕ PBS(Sigma)으로 2회 세척을 하고, 그 다음 세포 배양물 용해 시약(Promega) 50㎕을 첨가하여 용해시킨다. 실온에서 추가 15분간 배양한 후에, 150㎕ 루시페라제 검사 시약(Promega)을 넣은 후에, 발광계(Dynatech)에서 읽는다.

또 다른 방법에서, CHO-hGRF-LUC 세포(50,000 cells/well)를 상이한 hGRF-PEG 접합물질로 배양이 종료되는 시점에서, 상기에서 설명한 것과 같이 PBS로 세척한다. 각 웰에 칼슘 및 마그네슘 이온을 포함하는 100㎕ PBS를 첨가하고, 100㎕ Luclite(Packard)를 첨가한다. 실온에서 10분간 배양한 후에 플레이트는 발광계(Lumicount-Packard)에서 판독한다.

결과는 상대적인 광 단위(RLU)로 나타낸다.

in vivo 에서 쥐 뇌하수체 세포에서 hGRF(1-29)의 생검

동물(SPF male Sprague-Dawley 쥐 200g, b.w.)을 CO₂를 흡입시키게 함으로써 죽이고, 뇌하수체를 제거한다. 조직을 잘게 저미고, 이를 조직 절단을 위한 효소 용액이 든 병에 넣는다. 병은 1시간 동안 37℃의 배양기에 둔다.

절단된 조직을 회수하여, 세포를 세척하고, 그 수를 헤아려, 5×10⁵/㎖농도로 조정한다. 세포는 48-웰 플레이트(200㎕/well)에 얹고, 플레이트는 72시간동안 배양기에 둔다.

72시간 후에, 세포는 4시간 동안 다른 농도의 hGRF로 배양한다. 배양이 종료될 시점에 상청액을 회수하여 -80℃에 저장한다.

각 샘플에 있는 GH 함량은 통상적인 쥐 GH 방사능면역검사 키트를 이용하여 검사하였다.

In vivo 검사

동물에게 i.v.로 hGRF(1-29)(400 ㎍/rat)를 주사하였다. 혈액을 수집하기 몇분전에, 동물을 마취시킨다(케타민-실라진). 각 쥐의 대정맥 아래에서 2㎖의 혈액을 빼낸다. 샘플은 둘로 나눈다; 1㎖은 이와 같이 수득하고, 혈청은 37℃에서 약 3시간동안 배양후에 수득한 다음 연속하여 원심분리시키고, 나머지 1㎖은 50㎕ 4㎎/㎖ 헤파린 용액을 포함하는 바이알에 넣고, 바로 얼음에 저장하고, 혈장은 4℃에서 원심분리시킨 후에 스득한다.

다른 동물을 이용하여 테스트 화합물을 주사한 후부터 다른 시간대에서 혈액 샘플을 취한다. 각 실험에서 각 시간대에 총 세 마리 쥐를 이용하였다.

혈장 및 혈청 샘플은 바로 냉동시켜, -20℃에 저장한다.

GH 혈장 수준은 시판되는 RIA 키트를 이용하여 측정하고, hGRF 혈장 수준은 시판되는 RIA 키트를 이용하여 hGRF(1-44)에 대해 측정한다.

결과

주; 이 단락과 관련 도면에서 "GRF-1PEG 1^st 피크"는 [Lys(MPEG_5,000-CH ₂-CO-Nle-CO)²¹-hGRF(1-29)-NH₂]에 상응하는 것이고;

"GRF-1PEG 2^nd 피크"는 [Lys(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)¹²-hGRF(1-29)-NH₂]에 상응하는 것이고;

"GRF-2PEG"는 [Lys(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)^12,21-hGRF(1-29)-NH ₂]에 상응하는 것이고;

"GRF-3PEG"는

N^α-(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG_5,000-CH₂-CO-Nle-CO) ^12,21-hGRF(1-29)-NH₂]에 상응하는 것이다.

CHO-hGRF-LUC in vitro 검사

도 5와 6에서는 DMSO를 이용하여 CHO-hGRF-LUC in vitro 검사에서 준비된 두 가지 다른 배취 hGRF-PEG 접합물질의 활성을 나타내었다.

모든 물질은 "고유" hGRF(hGRF는 페글리레이션화된 화합물이 되기 위해 동일 한 정제 과정을 밟는다)의 것과 비교하였을 때, 조금 적기는 하지만, 활성이 있는 것으로 밝혀졌다. GRF-1PEG(1^st 및 2^nd)는 GRF-2PEG 및 GRF-3PEG보다 좀더 활성이 큰 것으로 나타났다. hGRF 및 "고유" hGRF사이에는 차이가 없었다(데이타는 나타내지 않음).

둘 다 DMSO에서 준비된 hGRF-PEG 접합물질(도 5와 6)과 니코틴아미드 용액에서 준비된 접합물질(도 7)은 유사한 in vitro 활성이 있는 것으로 관찰되었다. 또한 도6에서는 두 가지 다른 hGRF(3-29)이 hGRF(1-29)의 것과 비교하였을 때, 상당한 in vitro 활성을 가지지는 않는다는 것을 볼 수 있다.

hGRF _1-29 에 대한 In vitro 쥐 뇌하수체 세포 생검

두 가지 DMSO에서 얻은 hGRF-PEG 접합물질을 이용하여 실시한 검사에서, GRF-1PEG의 처음 피크가 가장 활성이 있는 화합물이고, 그 다음은 GRF-1PEG 두 번째 피크, GRF-2PEG 및 GRF-3PEG의 순이 된다(도 8 및 9). 이와 같은 발견은 리포터 유전자 검사에서 수득한 것과 일치한다.

In vivo 검사

예비 실험에서 쥐에 400㎍ hGRF를 i.v.로 주사한 후에 혈청 GH 및 혈장 hGRF 수준을 측정하였다. 관련 결과는 도 10에 나타내었다. 보는 바와 같이, hGRF 주사후에 10분경에 GH 및 hGRF가 피크로 나타났다. 그 다음 혈청 GH 농도는 급격히 감소되어, 60분후에는 기저수준으로 되돌아갔지만, 혈장 hGRF 농도는 동일한 시간 간격에서 일정한 수준이 지속적으로 유지되었다.

도 11A 및 11B에서는 400㎍ GRF-1PEG 1^st 및 2^nd 피크, GRF-2PEG GRF-3PEG(DMSO제제)로 처리한 쥐에서 48시간까지 다른 시간대에서 혈액에서의 GH 및 GRF 수준에 대해 나타내고 있다.

모든 페글리레이션화된 제제에는 hGRF_1-29와 유사하게 i.v. 주사후 10분경에 GH 혈청 피크를 포함한다. 그러나, GRF-1PEG 1^st 및 2^nd피크 및 GRF-2PEG이 hGRF_1-29얻은 것과 비교할 수 있는 GH 수준을 유도할 수 있다는 것은 GRF-3PEG가 in vitro에서 발견된 것과 같이 활성이 낮다는 것을 확인할 수 있는 것이다.

GRF 혈장 수준에 관련하여서, 제제로 어떤 것이 이용되었느냐와는 관계없이(DMSO 또는 니코틴아미드), GRF-2PEG 및 GRF-3PEG와 비교하였을 때, GRF-1PEG 1^st 및 2^nd피크는 완전히 다른 패턴을 나타낸다. GRF-1PEG 1^st및 2^nd을 주사한 후에 48시간 경에 GRF 혈장 농도는 기저 수준으로 복귀되었으나, GRF-2PEG 및 GRF-3PEG의 경우에는 좀더 지속적으로 수준이 유지되었다.

실시예 8; 페글리레이션 과정에서 시작 화합물로 부위-보호된 hGRF(1-29)-NH ₂ 유도체를 고형상에서 합성하는 과정

Lys 12 및 21에 있는 1차 아미노산에서 특정 보호기(N-알릴옥시카르보닐-기)를 포함하는 hGRF(1-29)-NH₂유도체의 고형상 합성을 실시하였다. 이는 N^α말단에서 부위-특이적인 페글리레이션을 할 수 있도록 한다. 또 다른 아미노-보호된 유도체 는 아실화반응을 통하여, N^α말단을 차단하고, Lys 12는 N-아릴옥시카르보닐기로 보호한다. 이와 같은 유도체는 Lys21에서 부위-특이적인 페글리레이션 반응을 하는데 이용된다.

재료 및 방법

펩티드 합성 과정

모든 hGRF 유도체 펩티드-수지는 Applied Biosystems Inc. Model 431A 펩티드 합성기를 이용하여 Fmoc 화학으로 어셈블리하고, 낮은 치환(0.16mmol/g) PAL-PEG-PS 수지를 이용하여, 이중-결합 및 각 잔기의 캡핑 과정을 거쳐, 원료 생성물의 양과 순도를 최적화시켰다. 추가로, [N-isopropyl-Tyr¹, Lys(Allco)¹²]-hGRF(1-29)-NH₂펩티드-수지는 환원성 알킬화 과정으로 수작업하여, N-말단 이소프로필 기를 첨가한다.

모든 펩티드 수지는 TFA/1,2-에탄디티올/티오아니졸/물[10:0.5:0.5:0.5 (v/v)] 혼합물로 2시간동안 절단시켜 두고, 원료 펩티드는 MTBE에서 침천 및 원심분리에 의해 분리시킨다. 동결건조된 원료 펩티드는 역상 농도차 HPLC에 의해 정제하는데, 이때 Vydac C18 준비 컬럼 및 0.15 TFA Water/Acetonitrile을 이용한다. 모든 정제된 펩티드는 분석용 역상 HPLC 및 MALDI-TOF Mass Spectrometry를 이용하여 특징을 조사한다.

재료

Fmoc-L-아미노산(Bachem Bioscience, Perseptive Biosystems, NovaBiochem);

DMF, 20ℓdrum(J.T. Baker);

피페리딘(Applied Biosystems, Chem-lmpex);

HBTU(Rainin, Richelieu Biotechnologies);

NMM(Aldrich);

아세트 안하이드리드(Applied Biosystems);

수지(Perseptive Biosystems, NovaBiochem);

a-시아노-4-하이드록시-시나믹산(Sigma);

시나피닉산(Aldrich);

아세토니트릴(J.T.Baker);

TFA(Sigma, Pierce);

탈이온수(Milipore Milli-Q Water System).

다른 용매 및 시약은 다음과 같다;

용매/시약 업체

NMP Applied Biosystems Inc., J.T.Baker

HBTU Applied Biosystems Inc.,

Richelieu Biotechnologies Inc.

0.5 M HOBt/DMF Applied Biosystems Inc.

2.0 M DIEA/NMP Applied Biosystems Inc.

피페리딘 Applied Biosystems Inc.

디클로로메탄 Applied Biosystems Inc.

아세트 안하이드리드 Applied Biosystems Inc.

아미노산; ABI 431A 합성기에 이용된 대부분의 FMOC 아미노산은 Applied Biosystems에서 1.0mmol 카트릿지로 미리 무게를 달아 구입하였다. FMOC-Lys(Alloc)-OH는 전량 Perseptive Biosystems(Framingham, MA)에서 구입하였고, 이용된 모든 아미노산은 L-형이다.

수지; hGRF 유사체에 이용되는 1차 수지는 PAL-PEG-PS(Peptide Amide Linker-Polyethylene Glycol-Polystyrene) 수지이다. PerSeptive Biosystems에서 구입한 PAL-PEG-PS 서포트는 원료 생성물의 순도 및 수득율에 일관성있게 좋은 결과를 제공한다. 모든 유도체에 대해 저치환 수지 0.16mmol/g를 이용하였다. 낮게 치환되는 수지는 길고 어려운 서열에 흔히 이용되는데, 이는 펩티드 사슬이 커가면서 공간적 방해 및 β-쉬트 형성을 감소시켜 더 우수한 결합을 보장한다.

방법

사슬 어셈블리-Applied Biosystems, Inc. Model 431A 펩티드 합성기

Applied Biosystem Inc.의 Model 431A 펩티드 합성기에서 FMOC 방법을 이용하여, 처음 어셈블리하는데, 이때 합성기는 프로그램된 빠른 FMOC 과정(FastMoc^TM)을 이용한다. HBTU는 활성화 및 결합에 이용되고, 20% 피페리딘은 탈보호에 이용되고, NMP는 탈보호, 아미노산 용해 및 수지 세척에 이용되는 주요 용매이다. 아미노산은 미리 무게를 잰 1.0mmol 카트릿지에 도입시킨다. 0.25mmol FastMoc^TM과정에는 1.0mmol 카트릿지가 이용되고, 40㎖ 반응 용기가 이용된다.

사슬 어셈블리-과정

0.25mmol 규모의 예정된 과정에 대한 단계는 다음과 같다;

1. 피페리딘 탈보호; 수지는 우선 NMP로 세척하고, 그 다음 18% 피페리딘/NMP 용액을 제공하고, 3분간 탈호보시킨다. 반응 용기를 배수시키고, 20% 피페리딘 용액을 제공하고, 탈보호는 약 8분간 지속시킨다.

2. 아미노산 용해- NMP(2.1g.) 및 0.9mmol 0.45M HBTU/HOBt/DMF(2.0 g.)를 카트릿지에 첨가하고, 6분간 혼합한다.

3. NMP 세척- 반응 용기를 배수하고, 수지는 NMP로 3회 세척한다.

4. 아미노산 활성화 및 반응용기(RV)로 이동- 1㎖ 2M DIEA/NMP를 카트릿지에 첨가하여, 용해된 아미노산이 활성화되도록 하고, 그 다음 카트릿지에서 RV로 옮긴다.

5. 커플링 및 최종 세척- 활성화된 아미노산과 N-말단 탈보호된 펩티드-수지사이에 결합 반응은 약 20분간 진행되고, 그 다음 RV를 배수하고, 수지는 NMP로 세척한다.

6. 캐핑(원하는 경우)- 약 12㎖ 0.5M 아세트산 안하이드리드, 0.125M DIEA 및 0.015M HOBt/NMP 용액을 반응 용기에 첨가하고, 5분간 교반시킨다. 이로써 수지에 있는 임의 결합안된 부위를 아세틸화하여, 결손 서열보다는 절두된 형으로 만들어, 나중에 정제 단계를 간단하게 할 수 있다.

이와 같은 과정으로 된 완전한 프로토콜은 Applied Biosystems 사용자 공보35(FastMoc^TM 0.25 and 0.10 on the Model 431A)에서 볼 수 있다.

전형적인 합성을 위한 표준 프로토콜 단계

단계 1; 수지를 DMF로 3회 세척

단계 2; 20% 피페리딘/DMF으로 5분간 2회 탈보호

단계 3; DMF로 수지를 6회 세척

단계 4; DMF내의 HBTU/NMM으로 활성화된 아미노산과 45분간 결합

단계 5; DMF로 수지를 3회 세척

어려운 서열인 경우에, 별도의 캐핑 단계를 결합과정후에 추가하는데, 이 경우에, 20분간 70% 아세트 안하이드리드/DMF를 이용하여, 펩티드-수지에 있는 임의 결합안된 부위를 아세틸화하여, 최종 정제안된 생성물에서 결손 서열보다는 절두형 서열을 만든다.

절단/추출

측쇄 보호기를 제거하고, 수지로부터 펩티드를 방출하는데 이용되는 절단 칵테일은 아르기닌 및(또는) 메티오닌을 포함하는 펩티드에 이용되는 표준 혼합물이다. 0.1-1.5g 펩티드-수지의 경우에, 10㎖ 트리플로오르아세트산, 0.5㎖ 탈이온수, 0.5㎖ 티오아니졸, 0.5㎖ 에탄에디톨(87% 트리플로오르산, 4.3% 탈이온수, 4.3 티오아니졸, 4.3% 에탄에디톨).

절단 과정

100㎎ -1g 펩티드-수지를 20㎖ 유리 용기에 넣고, 얼음 조에서 냉각시킨다. 절단 칵테일을 준비하고, 이것도 얼음조에 냉각시키고, 그 다음 최종 용적이 약 10㎖이 되도록 펩티드-수지에 첨가한다.

용기를 얼음조에서 빼내어, 실온이 되도록 한다. 용기에 뚜껑을 닫고, 반응 혼합물은 2시간동안 실온에서 교반시킨다.

2시간 후에, 용액은 중간정도의 또는 성긴 다공성을 가진 필터를 통하여 약 30㎖의 차가운 MTBE로 진공-여과시킨다. 반응 용기는 1㎖ TFA로 세척하고, 동일한 필터 펀넬을 통하여, 차가운 MTBE로 여과시킨다. 전체 현탁액을 다시 50㎖ 원심분리 튜브에 옮기고, 약 10분간, 실온에서 2,000rpm로 원심분리시킨다. 상청액을 빨아드리고, 침전물은 40㎖ 차가운 MTBE에 다시 현탁시키고, 다시 원심분리 시킨다. 이 단계를 1회 이상 반복시킨다. 최종 상청액을 빨아드리고, 침전물은 질소로 제거하여, 잔류한 에테르의 대부분을 기화시킨다.

그 다음 펩티드는 20-30㎖의 수용성 1%-10% 아세트산에 용해시키고, 약 100-150㎖ 탈이온수로 희석시키고, 냉동시키고, 동결시킨다.

정제

RP-HPLC 방법

시스템 - Waters Delta Prep 4000

컬럼 - Vydac reversed-phase C18, 10 ㎛, 2.2×25 cm(Cat No. 218TP1022)

완충액 -A :Water/0.1%TFA B:아세토니트릴/0.1%TFA

유속 -15㎖/minute

감지기 -Waters 484 UV detector, 220 nm

농도차 -다양, 통상 0.2% B/min - 1.0% B/min

냉동건조된 원료 펩티드는 50-100㎎ 펩티드를 200㎖ 수용성 0.1% TFA에 용해시켜 준비한다. 펩티드 용액을 "A"완충액 저장기 라인을 통하여 미리 준비된 컬럼에 바로 얹고, 농도차 프로그램을 시작한다.

수집된 분취물은 자동샘플수집기 분석용 HPLC 시스템에서 하룻밤동안 실시한다. 피크 적분을 통하여 순도가 >92%이상으로 판단되는 겹치지는 분취물을 모은 다음, 탈이온수로 4:1로 희석하고, 냉동시키고, 그 다음 Virtis 25 SL Freezedryer를 이용하여 냉동건조시킨다.

특징

역상 HPLC

조건;

시스템- Waters 510 pumps, 717 Autosampler, 490 Multiwavelength UV Detector

컬럼- Vydac C18, 5 ㎛, 0.46×25㎝ (Cat. No. 218TP54)

완충액- A:H₂O/0.1% TFA B:ACN/0.1% TFA

유속- 1㎖/minute

감지 - UV:214 nm, 280 nm

농도차 - 2% B/minute

정제된 동결건조된 펩티드 샘플은 0.2-1.0㎎ 펩티드를 0.1% TFA 수용액에 농 도가 0.5-1.0㎎/㎖이 되도록 용해시켜 준비한다.

15-18㎕를 컬럼에 주입시키고, 25분간 0-50% ACN 농도차 프로그램을 이용하여 용출시킨다. 크로마토그래피 데이터를 수집하고, 이를 Waters Expert-Ease 소프트웨어 시스템에 저장한다.

질량 스펙트럼

타입; MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionzation Time-of-flight)

시스템; Perseptive Biosystems Voyager Elite

매트릭스; a-Cyano 4-hydroxy cinnamic acid, 10 ㎎/㎖ in 67% ACN/0.1% TFA or Sinapinic Acid, 10 ㎎/㎖ in 50% ACN/0.1% TFA

펩티드 샘플은 1-20 μmol 농도로 50% ACN/0.1% TFA. 0.5㎕ 매트릭스 용액에서 준비하고, 그 다음 0.5㎕ 펩티드 샘플을 분석 플레이트 웰에 얹고, 건조되도록 한다. 분석 플레이트를 기계에 얹고, 샘플을 스캔하고, 펩티드에 최적화된 Reflector Delayed-Extraction 방법을 이용하여 분석하였다. 각 샘플에서, 32-128 laser tit에서 누적된 데이터 시그날을 수집하고, 분석하였다. 각 과정에는 계산을 위한 표준 펩티드를 샘플로 포함한다.

특정 합성

[Lys(Alloc) ^12,21 ]-hGRF(1-29)-NH ₂ 의 준비

[Lys(Alloc)^12,21]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS-수지는 Fmoc 화학을 이용하여, Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(상기 합성 방법 참고)-N-말단 잔기 Fmoc기의 탈보호 포함-를 이용하여 우선 어셈블리한다.

펩티드-수지는 2시간동안 TFA:1,2-에탄에디톨;티오아니졸;물[10:0.5:0.5:0.5 (v/v)] 혼합물로 절단하고, MTBE에서 침전에 의해 펩티드를 분리하여, 240㎎ 원료 펩티드를 얻는다. 미리 준비된 역상 HPLC와 Vydac C18 컬럼(22 ×250㎜)으로 정제하면, 정제된 생성물 60㎎(분석용 HPLC에 따르면 순도는 ＞95%). MALDI-TOF 질량 스펙트럼; 계산치: 3523.8, 실험치: 3524.2

[N ^α -isopropyl-Tyr ¹ , Lys(Alloc) ¹² ]-hGRF(1-29)-NH ₂ 의 준비

초기 [Lys(Alloc) ¹² ]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS-수지의 어셈블리

[Lys(Alloc)¹²]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS-수지는 Fmoc 화학을 이용하여, Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(상기 합성 방법 참고)-N-말단 잔기 Fmoc기의 탈보호 포함-를 이용하여 우선 어셈블리한다.

환원성 알킬화반응에 의한 N ^α -이소프로필화반응

Hocart, et al., 1987에서 설명하는 것과 같이 시아노보로하이드리드 나트륨및 이에 상응하는 케톤(아세톤)을 이용하여 펩티드-수지의 환원성 알킬화반응에 의해 N^α-이소프로필 기를 첨가한다. 880㎎ 펩티드-수지(약 70μmols)을 5㎖ DCM에서 30분간 팽창시키고, 그 다음 10mmol(174㎕) 아세톤/7㎖ MeOH/1% HOAc를 첨가하고, 혼합물은 실온에서 2시간동안 간헐적으로 교반시킨다. 2mmols(129㎎) 시아노 보로하이드리드 나트륨/12㎖ MeOH/1% HOAc을 첨가하고, 혼합물은 2시간동안 간헐적으로 교반시키고, 그 다음 하룻밤동안(15시간) 방치한다. 정량적으로 닌하이드린을 모니터한 결과 완전히 반응(청색이 없음)이 된 것을 알 수 있다. 펩티드-수지를 TFA:1,2-에탄에디톨;티오아니졸;물[10:0.5:0.5:0.5(v/v)] 혼합물로 2시간동안 절단시키고, 펩티드는 MTBE에서 침전시켜 분리하여, 약 200㎎의 원료 펩티드를 얻는다. 준비된 역상 농도차 HPLC와 Water/Acetonitrile/0.1% TFA 용매를 이용한 Vydac C 18 컬럼(22 × 250㎜)을 이용하여 정제하면, 50㎎의 순수한 생성물(분석용 HPLC에 의하면, 순도가 ＞95%)을 얻는다. MALDI-TOF 질량 스펙트로스코피; 계산치: 3481.9, 실험치: 3481.8.

실시예 9; 보호된 hGRF(1-29)의 페글리레이션반응

실시예 8에서 설명하는 것과 같이 준비된 hGRF 유도체는 실시예 1과 6에서 설명하는 것과 같은 활성화된 PEG로 접합시킨다.

이 경우에 정제과정은 과량의 시약 및 부산물을 분리하는 것이고, 반면에 실시예 2와 3에서 설명하는 것과 같은 과정을 실행할 필요는 없다.

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SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V. (B) STREET: 14 JOHN B. GORSIRAWEG (C) CITY: CURACAO (E) COUNTRY: THE NETHERLANDS ANTILLES (F) POSTAL CODE (ZIP): NONE (G) TELEPHONE: 639300 (H) TELEFAX: 614129 (ii) TITLE OF INVENTION: SOLUTION-PHASE SITE-SPECIFIC PREPARATION OF GRF-PEG CONJUGATES (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 1 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 29 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg 20 25 -1-

Claims

Lys¹²또는 Lys²¹또는 N^α에 공유적으로 결합된 한 개 PEG(hGRF)이상을 포함하는 부위특이적인 hGRF-PEG 접합물질을 만드는 방법에 있어서,

hGRF 펩티드 및 활성화된 PEG간의 접합 반응은 용액에서 실시되고 이때, 용액은 농축된 수용성 니코틴아미드 용액 또는 디폴딩제의 완충수용액이 되며 용액의 pH는 7 내지 9 사이에서 유지되며; 용매는 디메틸 설폭시드, 디메틸 포름아미드 완충액 또는 아세토니트릴 완충액에서 선택된 극성 유기 용매가 되며, 원하는 hGRF-PEG 접합물질은 반응 혼합물에서 분리되어, 크로마토그래피 방법에 의해 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서, hGRF 펩티드는 h-GRF(1-29)-NH₂인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 접합 반응이 일어나기 전에, hGRF 펩티드는 Lys¹²또는 Lys²¹또는 N^α위치 중 한가지 이상의 부위에서 보호된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 6 항에 있어서, 접합 반응후에 탈-보호 반응이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 활성화된 PEG는 알킬화반응 또는 아실화된 PEG로 단일-메톡실화된 형이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
Lys¹²또는 Lys²¹또는 N^α에 공유적으로 결합된 한 개 PEG(hGRF)이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 hGRF-PEG 접합물질.
제 9 항에 있어서, 1개 PEG단위가 Lys¹²에 공유 결합된 것을 특징으로 하는 hGRF-PEG 접합물질.
제 9 항에 있어서, 1개 PEG단위가 Lys²¹에 공유 결합된 것을 특징으로 하는 hGRF-PEG 접합물질.
제 9 항에 있어서, 1개 PEG단위가 Lys¹² 및 Lys²¹에 각각 공유 결합된 것을 특징으로 하는 hGRF-PEG 접합물질.
제 9 항에 있어서, 1개 PEG단위가 Lys¹²또는 Lys²¹또는 N^α에 각각 공유 결합된 것을 특징으로 하는 hGRF-PEG 접합물질.
청구항 1의 접합 반응의 중간생성물인 것을 특징으로 하는 [Lys(Alloc)^12,21]-hGRF.
청구항 1의 접합 반응의 중간생성물인 것을 특징으로 하는 [N^α-이소프로필-Tyr¹, Lys(Alloc)¹²]-hGRF.
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제 9 항 내지 13 항중 어느 한 항에 따른 접합물질을 활성성분으로 하고 한 가지 이상의 제약학적 수용 가능한 담체 또는 부형체가 포함된 생장호르몬 결핍(GHD) 상태 치료 또는 진단용 약학 조성물