EA004269B1

EA004269B1 - Способ сайт-специфичного получения конъюгатов рилизинг-фактора гормона роста человека и полиэтиленгликоля, конъюгаты, полученные данным способом, и их применение в производстве лекарственного средства

Info

Publication number: EA004269B1
Application number: EA200000601A
Authority: EA
Inventors: Франческо Мария Веронезе; Паоло Каличети; Оддоне Скьявон
Original assignee: Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2004-02-26
Also published as: US6528485B1; CN1280483A; BG104484A; KR20010032494A; ATE236607T1; AR017780A1; WO1999027897A9; DE69813291D1; EP0922446A1; HUP0100507A2; JP2010024245A; EP1037587A1; NO20002664D0; JP2001524505A; UA73716C2; EP1037587B1; JP5431874B2; SK8242000A3; SI1037587T1; DE69813291T2

Abstract

Описывается способ сайт-специфичного получения конъюгатов hGRF-PEG, содержащих один или несколько фрагментов PEG (в расчете на моль hGRF), ковалентно связанных с Lys, и/или Lys, и/или Nα, характеризующийся тем, что реакцию конъюгирования между пептидом hGRF и активированным PEG осуществляют в растворе и целевой конъюгат hGRF-PEG можно очистить с помощью хроматографии. Объектами настоящего изобретения являются также конъюгаты, полученные данным способом, а также их применение для лечения, профилактики и диагностики недостаточности гормона роста.

Description

Настоящее изобретение относится к способу сайт-специфичного получения конъюгатов ЬОКР-РЕО, содержащих одну или несколько РЕО единиц (в расчете на ЙОКР), ковалентно связанных с Ьук¹² и/или Ьук²¹ и/или Ν“ отличающемуся тем, что реакцию конъюгирования между пептидом ЙОКР и активированным РЕО проводят в растворе и целевой продукт - конъюгат ЙОКР-РЕО очищают хроматографическими методами.

Конъюгаты, полученные данным способом, а также их применение для лечения, профилактики и диагностики заболеваний, связанных с гормоном роста, также составляют объект настоящего изобретения.

Предпосылки изобретения

В начале 1980-х несколько групп исследователей выделили и охарактеризовали рилизингфактор гормона роста (ОКР).

ОКР (называемый также соматорелин) представляет собой пептид, секретируемый гипоталамусом, который действует на свой рецептор и может способствовать высвобождению гормона роста (ОН) из передней доли гипофиза. Он представляет собой пептид из 44, 40 или 37 аминокислотных остатков; его форма, состоящая из 44 аминокислотных остатков, может быть физиологически превращена в формы с более короткими последовательностями. Сообщается, что все три формы являются активными, причем активность сосредоточена, в основном, в первых 29 аминокислотных остатках. Синтетический пептид, соответствующий 1-29 аминокислотам последовательности человеческого ОКР[йОКР(1-29)], называемый также серморелином, был получен с помощью технологии рекомбинантных ДНК, как описано в европейском патенте ЕР 105759.

Серморелин в форме ацетата был использован для диагностики и лечения недостаточности гормона роста.

ОКР обладает реальной терапевтической ценностью при лечении определенных связанных с гормоном роста заболеваний. Использование ОКР для стимулирования высвобождения ОН представляет собой физиологический метод ускорения роста длинных костей или анаболизма белков.

Одна проблема, связанная с использованием ОКР, касается его короткого биологического времени полужизни (от около 12 до 30 мин). йОКР(1-29)-NН₂ подвергается ферментативному разрушению и быстро разрушается в плазме под воздействием дипептидилпептидазы 1У-(ЭРРIV) в точке между остатками А1а² и Акр³.

Таким образом целесообразно разработать биологически стабильные, длительно действующие аналоги ОКР путем специфической химической модификации ОКР для того, чтобы воспрепятствовать или уменьшить деградацию под воздействием фермента.

Полиэтиленгликоль (РЕО) - этот гидрофильный биосовместимый и нетоксичный полимер общей формулы Н(ОСН₂СН₂)_ПОН, где п>4. Его молекулярная масса может варьировать от 200 до 20 000 дальтон.

Было показано, что химическая конъюгация РЕО в его монометоксилированной форме с белками и/или пептидами значительно увеличивает продолжительность их биологического действия. Подобно углеводным остаткам в гликопротеине, РЕО обеспечивает защитное окружение и увеличивает размер молекулы, уменьшая тем самым его метаболическое разрушение и скорость его выведения почками.

Конъюгация с РЕО является уже разработанной совокупностью способов доставки пептидов и белков, приоритет в которых принадлежит фундаментальным исследованиям Όανίκ. АЬис1ю\\ък| (АЬисйо^кк1 е! а1., 1977а и 1977Ь). Конъюгация РЕО с пептидами или белками обычно приводит к неспецифическому химическому присоединению РЕО к нескольким аминокислотным остаткам. Одним из ключевых вопросов в данной технологии является, таким образом, изыскание подходящих химических способов ковалентного связывания молекулы (молекул) РЕО с определенными аминокислотными остатками.

Например, активированный трихлортриазином РЕО, относительно которого было установлено, что он токсичен и взаимодействует неспецифическим путем, был позднее заменен различными РЕО реагентами с химическими линкерами, которые могли специфично взаимодействовать с аминогруппами (Вепсйатр е! а1., 1983; Vе^оηеκе е! а1., 1985; 2айркку е! а1., 1983; 2айркк1 е! а1., 1990; апб Эе1дабо е! а1., 1990), с сульфгидрильными группами (Заботе е! а1., 1991; апб Мотритдо е! а1., 1996) или с остатками гуанидина (Рапбе е! а1., 1980).

Было установлено, что различные РЕО белковые конъюгаты защищены от протеолиза и/или обладают уменьшенной иммуногенностью (Моп1агб1ш е! а1., 1995; апб Уаткик! е! а1., 1988).

Другая техническая трудность, сопровождающая «Конъюгацию с РЕО» белков, возникает в связи с тем, что конъюгаты белков с РЕО обычно имеют различное количество присоединенных молекул РЕО, и это приводит к получению смеси конъюгатов с различной стехиометрией РЕО:белок. Сайт-специфичная конъюгация с РЕО остается химической проблемой. Конъюгирование РЕО и ОН представляет собой типичный пример, отражающий эту проблему (С1агк е! а1., 1996). Было показано, что конъюгация с РЕО Ьук-остатков ОН происходит по случайным положениям.

Для того, чтобы избежать или уменьшить воздействие фермента, активный сайт сначала должен быть защищен с тем, чтобы конъюгация

РЕС с ферментом происходила в неактивном сайте(-ах) (Са11ееб е! а1., 1993).

Недавно был предложен другой подход для сайт-специфичного конъюгирования РЕС с низкомолекулярными пептидами, такими как СКЕ, который получали твердофазным пептидным синтезом. В этих конъюгатах предварительно полученную и конъюгированную с РЕС аминокислоту вводили в пептидную цепочку с помощью твердофазного синтеза. Эта процедура, однако, требует весьма сложной очистки продукта, что, как известно, является пилигтирующей стадией при твердофазном синтезе. Наличие РЕС, в силу его высокой молекулярной массы и полидиспергируемости, с большой вероятностью приводит к получению целевого продукта с нежелательными примесями и/или продуктов с пропусканием (недостачей) аминокислотных остатков, причем последнее обычно происходит при использовании метода МетйеИ'а.

Недавно в литературе сообщалось (Еебх е! а1., 1995) о присоединении только одной молекулы РЕС к специфичному аминокислотному остатку [А1а¹⁵]-ИСКЕ(1-29)-МН2 с использованием твердофазного синтеза. В этом исследовании показано, что [А1а¹⁵]-ИСКЕ(1-29)-МН2, конъюгированный с РЕС в положениях 21-го или 25-го остатков, полностью сохраняет активность ίη νίίτο по сравнению с исходным [А1а¹⁵]-ИСКЕ(129)-ΝΗ₂. Однако отсутствуют данные, показывающие, проявляют ли эти конъюгированные с РЕС конъюгаты более продолжительное время свою активность ίη νίνο по сравнению с неконъюгированным с РЕС аналогом.

Совсем недавно было показано (Сашрбеб е! а1., 1997), что присоединение РЕС с различными молекулярными массами к С-концу различных аналогов ИСКЕ, опять же при использовании твердофазного синтеза, увеличивает продолжительность сохранения активности при испытаниях как на свиньях, так и на мышах, по сравнению с неконъюгированным с РЕС аналогом.

Описание изобретения

В противоположность методу твердофазного получения моноконъюгированного с РЕС ИСКЕ, упомянутому выше, настоящее изобретение относится к сайт-специфичному конъюгированию с РЕС ИСКЕ в растворе. Установлено, что ИСКЕ имеет низкую растворимость в нейтрально-щелочном буферном растворе, в результате чего имеет место химическое условие для наиболее эффективного осуществления реакции конъюгации с РЕС. В разбавленном растворе гидролиз активированного РЕС (например, РЕС-эфира) имеет тенденцию к уменьшению выхода реакции конъюгации с РЕС.

В данном изобретении установлено, что в подходящем растворителе, обеспечивающем высокую растворимость ИСКЕ, можно осуществлять реакцию сайт-специфичного конъюгирования с РЕС в жидкой фазе. В этом случае, даже если исходный пептид ИСКЕ незащищен, РЕСцепочки будут связываться с высокими выходами и почти исключительно с первичными аминогруппами (ε-аминогруппами) Бук¹², Бук²¹и/или Ν^α в зависимости от условий реакции. Были получены следующие четыре конъюгата, которые входят в объем настоящего изобретения, со стехиометрическим соотношением ИСКЕ:РЕС в конъюгатах, зависящим главным образом от молярного соотношения ИСКЕ и РЕС.

Конъюгат ИСКЕ-РЕС, в котором 1 молекула РЕС ковалентно присоединена к Бук¹², конъюгат ИСКЕ-РЕС, в котором 1 молекула РЕС ковалентно присоединена к Бук²¹, конъюгат ИСКЕ-2РЕС, в котором 2 молекулы РЕС ковалентно присоединены к Бук¹² и Бук²¹, и конъюгат ИСКЕ-3РЕС, в котором 3 молекулы РЕС ковалентно присоединены к Бук¹² и к Бук²¹ и к Ν^α

Ν^α означает в описании данного изобретения аминогруппу на Ν-конце пептида (Туг).

После этой стадии можно осуществлять простое хроматографическое фракционирование конъюгатов, полученных согласно указанной реакции, либо гель-фильтрацией, либо путем непосредственного нанесения на колонку С18 ВЭЖХ с элюцией градиентом смеси воды и ацетонитрила. Второй способ предпочтительнее, т. к. можно получить и очистить большие количества продуктов.

Поэтому главным объектом настоящего изобретения является способ сайтспецифичного получения различных конъюгатов ИСКЕ-РЕС, содержащих один или несколько РЕС-фрагментов (в расчете на ИСКЕ), ковалентно связанных с Бук¹², и/или Бук²¹, и/или Ν^α, характеризующийся тем, что реакцию конъюгации с РЕС проводят в растворе и целевой конъюгат ИСКЕ-РЕС очищают, например, хроматографическими способами.

Конъюгаты ИСКЕ и РЕС, содержащие один или несколько РЕС-фрагментов (на моль ИСКЕ), ковалентно связанных с Бук¹², и/или Бук²¹, и/или Ν“ также являются объектом настоящего изобретения. Предпочтительными продуктами настоящего изобретения являются конъюгаты ИСКЕ-РЕС, в которых 1 молекула РЕС ковалентно связана с Бук¹² и/или Бук²¹.

Согласно другому воплощению данного изобретения, если одна или более из этих трех аминогрупп, к которым присоединены цепочки РЕС, обратимо защищены определенными химическими группами от конъюгации с РЕС, реакция конъюгации с РЕС будет давать непосредственно целевой конъюгат со специфичными сайгами конъюгации с РЕС, который можно затем выделить из реакционной смеси, например, ультрафильтрацией или другими хромато5 графическими методами. В этом случае способ получения может далее необязательно включать реакцию снятия защиты.

Реакцию снятия защиты предпочтительно осуществляют известными способами и в зависимости от химической природы защитных групп, которые следует удалить.

В соответствии с изобретением имеется в виду, что под термин «ИСКР», если только это специально не оговорено, подпадают любые пептиды СКЕ человека, в особенности, это касается пептидов 1-44, 1-40, 1-29 и соответствующих им амидов (содержащих амидную группу на Ν- и С-концах). Предпочтительным пептидом ИСКЕ является §6ΚΕ(1-29)-ΝΗ₂, аминокислотная последовательность которого приводится в 8ЕО ГО N0:1.

Активированный РЕС (или «РЕСконъюгирующий агент») представляет собой любое производное РЕС, которое может быть использовано для модификации белков благодаря тому, что оно содержит функциональную группу, способную взаимодействовать с некоторыми функциональными группами в молекуле белка/пептида с получением конъюгата РЕС с белком или пептидом. Обзор производных РЕС, которые могут использоваться в качестве модификаторов белков, может быть найден у Нагл 5 (1985). Активированный РЕС может быть алкилирующим реагентом, таким как альдегидное или эпоксидное производные РЕС, РЕСтрезилат, или он может быть ацилирующим реагентом, таким как сложный эфир РЕС.

Активированный РЕС предпочтительно используют в монометоксилированной форме. Он предпочтительно имеет молекулярную массу между 2000 и 20000. Монометоксилированный РЕС₅₀₀₀ особенно предпочтителен для получения активированного РЕС согласно изобретению.

Если активированный РЕС является ацилирующим агентом, он предпочтительно содержит остаток либо норлейцина, либо орнитина, связанный с остальной частью молекулы РЕС с помощью амидной связи. Эти остатки позволяют сделать точное определение присоединившихся фрагментов РЕС на моль пептида (см. для примера 8аг1оге е! а1., 1991). Поэтому особенно предпочтительным активированным РЕС является Монометоксилированный РЕС₅₀₀, связанный с помощью амидной связи с альфааминогруппой норлейцина, так что карбоксигруппа превращается в сукцинимидную эфирную группу.

РЕС с разветвленной цепью также могут использоваться. Разветвленные РЕС могут быть представлены как К(-РЕС-0Н)_т, в которых К представляет собой центральный сердцевинный остаток молекулы, такой как пентаэритрит или глицерин, а т показывает количество разветвлений. Количество разветвлений (т) может варьировать от трех до ста и более. Гидроксиль ные группы могут быть химически модифицированы.

Другая разветвленная форма, такая как, например, описанная в заявке на выдачу патента РСТ \У0 96/21469, имеет единственную группу на конце молекулы, которая может быть подвергнута химической модификации. Этот тип РЕС может быть представлен как (СН₃О-РЕС-)рК-Х, где р равно 2 или 3, К представляет собой центральную сердцевинную часть молекулы, такую как лизин или глицерин, а Х представляет собой функциональную группу, такую как карбокси, которую можно химически активировать. Еще одна разветвленная форма имеет реакционноспособные группы, такие как карбоксигруппы, распределенные вдоль основной цепочки молекулы РЕС, а не на концах РЕС-цепей.

Все эти разветвленные РЕС и могут быть «активированы», как показано выше.

Под «хроматографическими методами» подразумевают любой метод, использующийся для выделения компонентов из смеси путем нанесения на носитель (в стационарной фазе), через который пропускают растворитель (подвижная фаза). Принципы хроматографического выделения базируются на различиях физической природы стационарной и подвижной фаз.

Некоторые разновидности хроматографических методов, которые хорошо известны из литературы, включают жидкостную, жидкостную высокого давления, ионообменную, адсорбционную, аффинную, разделительную, гидрофобную, обращенно-фазовую, гельфильтрационную, ультрафильтрационную или тонкослойную хроматографию.

«Конъюгация с РЕС» - это реакция, с помощью которой на основе активированного РЕС и белка или пептида получают РЕС - белок/пептидный соответствующий конъюгат.

Молярное соотношение РЕС: ИСКЕ может быть 1:1, 2:1 или 3:1 в зависимости от того, какой конъюгат получен с высокими выходами.

Растворитель для реакции конъюгации с РЕС выбирают из группы, состоящей из высококонцентрированного водного раствора никотинамида, водного буферного раствора денатурирующего агента (такого как мочевина), или им может быть полярный органический растворитель, выбранный из диметилсульфоксида, смеси диметилформамида с буфером или смеси ацетонитрила с буфером.

рН раствора обычно поддерживают между 7 и 9.

Перечень химических защитных групп для Ьук¹² и Ьук²¹ может (без ограничения) включать: А11ос (аллилоксикарбонил), Эбе (1-(4,4-Диметил-2,6-диоксоциклогекс-1 -илиден)этил), Аброс (1 -(1'-Адамантил)-1-метил-этоксикарбонил) или 2-Ο1-Ζ (2-Хлор-бензилоксикарбонил). А11ос является предпочтительной защитной группой для лизиновой группы. После конъюгации с РЕС А11ос может быть удален одним из способов,

Ί описанных в Огеепе с1 а1. (1991). Эбе может быть удален 2% гидразином в ДМФ (см. XV. С. С11ап еР а1., 1995). Аброс может быть удален аналогично А11ос (см. также Эюк Е.еР а1., 1997). Для снятия 2-Ο-Ζ может потребоваться более сильная кислота (НЕ, ТРМ8А, НВг) или гидрирование (см. также Еат еР а1., 1987).

Защитные группы для Ν^α могут представлять собой алкильные группы, такие как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет-бутил, бензил или циклогексил. Предпочтительной группой является изопропил. Эти алкильные группы могут быть введены восстановительным алкилированием (см. Митрйу еР а1., 1988 или НосагР еР а1., 1987).

|№'-изопропил-Туг¹. Еу8(А11ос)¹²]-Ь6ЯЕ и |ку5-(А11ос)^|2'^2||-11СРЕ также входят в объем настоящего изобретения как новые и используемые в качестве промежуточных соединений в реакции конъюгации с РЕО.

Было также установлено, что конъюгация с РЕО согласно изобретению

1) не изменяет конформации пептида,

2) увеличивает устойчивость к протеолитическому разложению,

3) не влияет или лишь очень слабо понижает биологическую активность в зависимости от степени конъюгации с РЕО и

4) . позволяет получать продукты (конъюгаты), которые обладают большей растворимостью в водных буферных растворах.

Другим объектом настоящего изобретения являются конъюгаты 11СРЕ-РЕС с высокой степенью чистоты, применимые в фармацевтических композициях в качестве активных ингредиентов.

Другим аспектом настоящего изобретения является применение конъюгатов изобретения в качестве лекарственного средства для лечения, профилактики или диагностики нарушений, связанных с гормоном роста, например, недостаточности гормона роста, в особенности, недостаточности гормона роста у детей.

Лекарственное средство предпочтительно находится в форме фармацевтической композиции, содержащей конъюгаты по изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями. Такие фармацевтические композиции составляют еще один объект настоящего изобретения.

Реализация изобретения заключается в введении фармакологически активного количества конъюгатов данного изобретения лицам, подверженным риску развития связанного с гормоном роста заболевания или уже имеющим такую патологию.

Другой объект данного изобретения представляет собой способ лечения, профилактики или диагностики расстройств, связанных с гормоном роста, предусматривающий введение эффективного количества конъюгатов по изобретению в присутствии одного или нескольких фармацевтически приемлемых наполнителей.

Термин «Эффективное количество» означает количество активных ингредиентов, достаточное для оказания эффекта на течение и тяжесть вышеописанных нарушений, приводя к облегчению или ремиссии этой патологии. Эффективное количество будет зависеть от способа введения и состояния пациента.

«Фармацевтически приемлемый» означает любой носитель, который не препятствует проявлению биологической активности активного ингредиента и нетоксичен для пациента, которому он вводится. Например, для парентерального введения вышеупомянутые активные ингредиенты могут быть представлены в виде составов в дозировочных формах для инъекций, таких как солевые, декстрозные растворы, раствор сывороточного альбумина и раствора Рингера.

Помимо фармацевтически приемлемого носителя композиции по изобретению могут включать минорные количества таких добавок, как стабилизаторы, наполнители, буферы и консерванты.

Может использоваться любой тип введения, совместимый с активным началом. Предпочтительным является парентеральное введение, такое как подкожная, внутримышечная или внутривенная инъекция. Доза активного ингредиента, которую нужно ввести, зависит в основном, от медицинских показаний, в соответствии с возрастом, массой тела и индивидуальной реакцией больного.

Доза активного ингредиента для лечения человека может составлять от 5 до 6000 мкг/кг массы тела и предпочтительно составляет от 10 до 3000 мкг/кг массы тела.

Настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные формы его воплощения, но содержание описания включает все модификации, которые могут быть выполнены специалистом в данной области, без выхода за пределы объема притязаний.

Далее изобретение будет описано с помощью примеров, которые не следует воспринимать как ограничивающие настоящее изобретение. Примеры будут соотнесены с графическими материалами, пояснения к которым приводятся ниже.

Описание графических материалов

На фиг. 1 показаны аминокислотная последовательность 1ιΟΡΕ(1-29)-ΝΗ₂.

Стрелками показаны возможные сайты конъюгации с РЕО.

На фиг. 2 показаны данные ВЭЖХ с обращенной фазой смеси, полученной после реакции конъюгации с РЕО в ΌΜ8Θ, проведенной как описано в примере 1. Первые два больших пика соответствуют конъюгатам, содержащим 1 РЕО цепочку на моль 11СРЕ. Следующий минорный пик соответствует конъюгату с соотношением ЙОРЕ :РЕО и последний минорный пик соответствует конъюгату с соотношением ЙОРЕ:3РЕО.

На фиг. ЗА показано разложение ЙОРЕ(129) и конъюгатов РЕО настоящего изобретения под воздействием субтилизина.

На фиг. ЗВ показано разложение ЙОРЕ(129) и конъюгатов РЕО настоящего изобретения под воздействием химотрипсина.

На фиг. 4 показана спектроскопическая характеристика [Ьу к(МРЕО₅₀(>₍-СН ₂-СО-Ы1е-СО)^12,21 ΕΟΒΡ(1-29)-ΝΗ₂], полученную путем кругового дихроизма. Спектры являются весьма впечатляющими по сравнению с таковыми «нативного» ЙОРЕ.

На фиг. 5 показан биологический эффект различных конъюгатов ЙОРЕ-РЕО (от 1-го ΌΜ8Ο получения) в СНО-ЙОРЕР-ЬиС в исследованиях ίη νίΐτο. Данные отображают средние результаты трех независимых экспериментов.

На фиг. 6 показан биологический эффект различных конъюгатов ЙОРЕ-РЕО (от 2-го ЭМ8О получения) в СНО-ЙОРЕР-ЬиС в исследовании ίη νίΐτο. Данные отображают средние результаты двух независимых экспериментов.

На фиг. 7 показан биологический эффект различных конъюгатов ЙОРЕ-РЕО (получены с никотинамидом) в СНО-ЙОРЕР-ЬиС исследовании ίη νίΐτο. Данные отражают средние результаты двух независимых экспериментов.

Фиг. 8 иллюстрирует биологическое действие различных конъюгатов ЙОРЕ-РЕО (1-е ЭМ8О получение) на выделение ОН из клеток гипофиза крысы ίη νίΐτο.

Фиг. 9 показывает биологическое действие различных конъюгатов ЙОРЕ-РЕО (2-е ЭМ8О получение) на выделение ОН из клеток гипофиза крысы ίη νίΐτο.

Фиг. 10 показывает кривую динамики зависимости уровней ЙОРЕ в плазме и ОН в сыворотке в зависимости от ЙОРЕ (400 мкг/крыса), при внутривенной инъекции крысам-самцам. Каждая точка представляет значение ± величина 8ЕМ, полученное на 9 крысах.

Фиг. 11А (см. первый график на странице) показывает кривую динамики во времени зависимости уровней сывороточного ОН после ί.ν. инъекции 400 мкг/крыса конъюгатов ЙОРЕ-РЕО (ЭМ8О получение) крысам-самцам. Каждая точка показывает значение, полученное для трех крыс.

Фиг. 11В (см. второй график на странице) показывает кривую динамики зависимости уровней ЙОРЕ плазмы после ί.ν. инъекции 400 мкг/крыса конъюгатов ЙОРЕ-РЕО (ЭМ8О получение) крысам-самцам. Каждая точка показывает значение, полученное для трех крыс.

На фиг. 12 представлена карта рестрикции плазмиды рс ^NΑ3-ЙОРЕ-Р. используемая в исследовании маркерного гена для определения

ОРЕ-активности.

На фиг. 13 показана карта рестрикции плазмиды рТЕ5-53-ЬиС, используемая в исследовании маркерного гена для определения ОРЕактивности.

Примеры

Сокращения

Ацетонитрил (ΑΟΝ), аллилоксикарбонил (ΑΙΙοο), бензил (ΒΖΕ), трет-бутилоксикарбонил (Вос), дихлорметан (ЭСМ), диизопропилэтиламин (ΌΙΡΑ), диметилформамид (ΌΜΡ), диметилсульфоксид (ЭМ§О), 9-фторфенилметилоксикарбонил (ЕМОС), гексафторфосфат 2-[1Нбензотриазол-1 -ил] - 1,1,3,3-тетраметилурония, 1 гидроксибензотриазол (НОВ1). метил-т-бутиловый эфир, норлейцин (ΝΕ) , Ν-метилпирролидон (ΝΜΕ), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6сульфонил (Ртс), трет-бутил (йВи), трифторуксусная кислота (ТЕА), трифенилметил (Тй).

Пример 1. Жидкофазная конъюгация ЙОРЕ с РЕО.

В этих экспериментах в качестве конъюгирующего с РЕО агента использовали монометоксилированный РЕО₅₀₀₀[МРЕО₅₀₀₀], связанный амидной связью с альфа-аминогруппой норлейцина, то есть активированный по карбоксигруппе до сукцинимидной эфирной группы. Это может быть выполнено, например, по Ьи еΐ а1.,

1994.

Человеческий ОРЕ1_-29 ЙОРЕ (1-29)-МН₂, который был получен от ВасЙет, использовался в качестве пептида ЙОРЕ.

При условии, что низкая растворимость ЙОРЕ(1-29) в водном растворе при нейтральных и слабощелочных значениях рН была необходима для конъюгации с РЕО, предварительно были подобраны альтернативные реакционные условия от А до Е:

A. Диметилсульфоксид: 20 мг пептида растворяли в 1 мл ЭМ8О и сразу же добавляли соответствующие количества конъюгирующего с РЕО реагента.

B. Диметилформамид/0,2 М боратный буфер рН 8,0 при объемном соотношении 1:1:пептид и соответствующие количества конъюгирующего с РЕО реагента добавляли сразу же.

C. Высококонцентрированный водный раствор никотинамида (200 мг/мл): 200 мг никотинамида добавляли к раствору 40 мг ЙОРЕ(129) в 1 мл 10 мМ уксусной кислоты. 1 мл 0,2 М боратного буфера при рН 8,0 добавляли к указанному раствору кислоты для достижения желаемого рН перед добавлением соответствующих количеств конъюгирующего с РЕО реагента.

Ό. Ацетонитрил/0,2 М боратный буфер рН

8,0 при объемном соотношении 1:1 и соответствующие количества конъюгирующего с РЕО реагента добавляли сразу же.

Е. 0,2 М боратный буфер, 5 М мочевина, рН 8,0 и соответствующие количества конъюгирующего с РЕО реагента добавляли сразу же.

Сухой РЕС реагент добавляли при перемешивании, чтобы достичь окончательного молярного соотношения РЕС:ИСКЕ 1:1, 2:1 или 3:1. Предпочтительным является 2:1.

Использование различных значений молярного соотношения РЕС:ИСКЕ позволило получать реакционную смесь, в которой преобладающим конъюгатом был целевой конъюгат.

Реакционный раствор перед очисткой оставляли на 3 ч при комнатной температуре.

Следующие 4 конъюгата ИСКЕ-РЕС (А1А4) были получены:

А1: [Ьу8(МРЕС_5ооо-СН₂-СО-№е-СО)¹²ИСКЕ(1-29)-ЛН₂],

А2: [Ьу 8(МРЕС_5ооо-СН₂-СО-№е-СО)²¹ ИСКЕ(1-29)-ЛН₂],

А3: [Ьу8(МРЕС_5ооо-СН₂-СО-№е-СО)¹²·²¹ИСКЕ(1-29)^Н₂], и

А4: \'-(МРЕС, -СН_;-СО-\1е-СО|Р\8 (МРЕС5ооо-СН2-СО-Ме-СО)¹²’²¹ -ИСКЕ( 1 -29)ΝΗ₂].

Избыток ЭМ8О. диметилформамида, ацетонитрила или мочевины и побочный продукт реакции (гидроксисукцинимид) удаляли гельфильтрацией, используя мембрану с 1ооо Д отсечением. Объем доводили до 1о мл 1о мМ уксусной кислотой и затем снижали до 1 мл. Эту процедуру повторяли трижды.

Конъюгаты ИСКЕ-РЕС выделяли гельфильтрацией или же хроматографией с обращенной фазой.

Пример 2. Гель-фильтрационная хроматография.

С помощью гель-фильтрационной хроматографии продукты были фракционированы по молекулярному весу компонентов (в этом случае МВ конъюгатов ИСКЕ-РЕС 1:1=8,358, МВ ИСКЕ-РЕС 1:2=13,358 и МВ ИСКЕ-РЕС 1:3= 18,358. МВ не конъюгированного ИСКЕ=3358). Выделение осуществляли на серии колонок системы Зиретбех 75-8ирего§е 12 смол (Вю1есИ, РИатшас1а) с элюцией 1о мл уксусной кислоты при скорости потока 1,5 мл/мин.

Собранные фракции объемом 1 мл анализировались по оптической плотности (ОИ) при 28о нм на содержание белка и с помощью иодного теста на содержание РЕС (81Ш5 е! а1., 198о).

После конъюгации с РЕС в ИМ8О при мольном соотношении ИСКЕ:РЕС 1:1 были получены 3 пика:

конъюгат ИСКЕ-РЕС при элюированном объеме в 132 мл (основной пик);

конъюгат ИСКЕ-РЕС при элюированном объеме в 1о8 мл (слабый, минорный пик); и неконъюгированный ИСКЕ при элюированном объеме в 1о8 мл (слабый пик).

После конъюгации с РЕС в ИМ8О при мольном соотношении ИСКЕ:РЕС 1:2 были получены три пика:

конъюгат ИСКЕ-РЕС при элюированном объеме в 1о8 мл (основной пик);

конъюгат ИСКЕ-РЕС при элюированном объеме в 132 мл (слабый пик; и конъюгат ИСКЕ-РЕС при элюированном объеме в 73 мл (слабый пик).

После конъюгации с РЕС в ИМ8О при мольном соотношении ИСКЕ:РЕС 1:3 были по лучены два пика:

конъюгат ИСКЕ-РЕС при элюированном объеме в 73 мл (основной пик); и конъюгат ИСКЕ-РЕС при элюированном объеме в 1о8 мл (слабый пик).

Элюированные пики собирали, концентрировали ультрафильтрацией на мембране с 1ооо Д отсечением, лиофилизировали, растворяли в 1о мМ уксусной кислоте и продукты охарактеризовывали, как здесь указано, после их идентификации и определения их количеств. Было установлено, что пик в элюированном объеме 73 мл соответствует соединению А4.

Установлено, что пик в элюированном объеме 132 мл соответствует соединению А3.

Установлено, что пик в элюированном объеме 1о8 мл соответствует смеси соединений А2 и А1.

Установлено, что пик в элюированном объеме 232 мл соответствует не конъюгированному ИСКЕ.

Однако данный метод очистки не позволяет разделить конъюгаты ИСКЕ-РЕС, имеющие одинаковые молекулярные веса, но различные сайты конъюгации с РЕС (позиционные изомеры).

Пример 3. Хроматография с обращенной фазой.

Более специфичное фракционирование выполняется путем гидрофобной хроматографии с использованием КР-НРЬС С 18 колонки. Этим способом можно разделить возможные получившиеся изомеры с одними и теми же молекулярными весами. Фактически было установлено, что при таком способе единичный полученный гель-фильтрацией пик, соответствующий конъюгатам с 1 ковалентно присоединенным РЕС, разделяется на два пика.

Обращеннофазовую хроматографию выполняли на КР-НРЬС С18 препаративной колонке (Уубас) с элюцией градиентом Н₂О/о,о5% ТЕА (элюент А) и ацетонитрил/о,5% ТЕА (элюент В), следующим образом:

о-5 мин 35% А

5-35 мин 35%А--2% А

35-38 мин 2% А

38-4о мин

2% А- 35%

Скорость потока: 1о мл/мин, 1оор 1 мкл;

ЬУ-УЬ Детектор при 28о нм.

После конъюгации с РЕС в ИМ8О при мольном соотношении ИСКЕ:РЕС 1:1 были получены 4 пика:

1. 13,2 мин основной пик;

2. 13,7 мин основной пик;

3. 14,4 мин 4. 8,9 мин	слабый пик; и слабый пик.
После конъюгации	с РЕС в ΌΜ8Θ при
мольном соотношении ЙСВР:РЕС 1:2 были по-
лучены 4 пика:
1. 13,2 мин	слабый пик;
2. 13,7 мин	слабый пик;
3. 14,4 мин	основной пик, и
4. 15,5 мин	слабый пик.

После конъюгации с РЕС в ΌΜ8Θ при мольном соотношении РЕС 1:3 были получены 2 пика:

1. 14,4 мин слабый пик; и

2. 15,5 мин основной пик.

Элюированные фракции, соответствующие пикам, собирали, выпаривали, чтобы удалить ацетонитрил и трифторуксусную кислоту, и затем лиофилизировали. Сухой продукт затем растворяли в 10 мМ растворе уксусной кислоты и анализировали, как здесь указано, после идентификации и определения количеств выделенных образцов.

Было установлено, что конъюгат ЙСВРРЕС, элюированный за 13,2 мин, является соединением А1 (СВР-1РЕС, первый пик).

Было установлено, что конъюгат ЙСВРРЕС, элюированный за 13,7 мин, является соединением А2 (СВР-РЕС, второй пик).

Было установлено, что конъюгат ЙСВРРЕС, элюированный за 14,4 мин, является соединением А3 (СВР-2РЕС).

Было установлено, что конъюгат 11СВРРЕС, элюированный за 15,5 мин, является соединением А4 (СВР-3РЕС).

Было установлено, что пик, элюированный за 8,9 мин, содержит неконъюгированный ЙСВР.

В качестве типичного примера обращеннофазовая хроматография продуктов конъюгации с РЕС, полученных при молярном соотношении РЕСШСВР 2:1, показана на фиг. 2.

Сухие продукты получали выпариванием растворителя или лиофилизацией.

Пример 3 а. Конъюгация 11СВР с помощью РЕС1₀₀₀₀ в растворе.

В этом примере использовался монометоксилированный РЕС с разветвленной цепью и молекулярной массой 10000 дальтон с лизином в качестве спейсера (получен от 811еаг\\Шег Ро1утег5 1пс.). Этот разветвленный РЕС был получен связыванием каждой аминогруппы лизина и РЕС5000.

Карбоксигруппа лизинового спейсера, активированная до сукцинимидного эфира, взаимодействовала в ΌΜ8Θ с аминогруппами

1ιΟΒΡ(1-29)-ΝΗ₂ при мольном соотношении 0,9 моль РЕС на 1 моль СВР.

Растворитель удаляли и остаток фракционировали гель-эксклюзивной хроматографией на препаративной колонке 8ирего§е 12 ТМ. Элюировались 2 пика, соответствующие двум конъюгатам ЙСВР-РЕС. Первый (слабый) пик соответствовал конъюгату, имеющему 2 фрагмента РЕС1₀₀₀₀, связанных с 11СВР. второй (основной) пик соответствовал конъюгату, содержащему один фрагмент РЕС1₀₀₀₀ на 11СВР.

Пример 3Ь. Конъюгация 11СВР с РЕС₂₀₀₀₀ в растворе.

В этом примере использовался монометоксилированный разветвленный РЕС с молекулярной массой 20000 дальтон с лизином в качестве спейсера (получен от 811еаг\та1ег Ро1утег5, 1пс.).

Этот разветвленный РЕС был получен связыванием каждой аминогруппы лизина и ^РЕС10000^.

Карбоксигруппа лизинового спейсера, активированная до сукцинимидного эфира, взаимодействовала в ΌΜ8Θ с аминогруппами 11СВР(1-29)^Н₂ при молярном соотношении 0,9 моль ПЭГ на 1 моль СВР.

Растворитель удаляли лиофилизацией, а остаток фракционировали гель-эксклюзивной хроматографией на препаративной колонке 8ирегоке 12 ТМ. Был получен единственный пик, соответствующий конъюгату, содержащему один фрагмент РЕС₂₀₀₀₀ в расчете на ЙСВР.

Пример 4. Аналитическая характеристика конгьюгатов ЙСВР-РЕС.

Продукты, полученные так, как описано выше, были проверены на наличие связанных цепей РЕС с помощью следующих методик:

1. Колориметрический способ, основанный на (использовании) тринитробензолсульфоната, использовали для определения свободных аминогрупп (как описано у НаЬееб е! а1., 1966);

2. Колориметрический метод, основанный на иодном анализе, был использован для определения содержания РЕС (как описано у 811115 е! а1., 1980);

3. Использовали количество цепей РЕС, основанное на (использовании) норлейцина в качестве показателя в аминокислотном анализе (как описано у 8аг!оге е! а1., 1991);

4. Масс-спектроскопия использовалась для определения молекулярной массы конъюгатов.

ΜΑΕΌΙ - масс-спектрометрия использовалась, чтобы определить молекулярную массу конъюгатов и их полидиспергируемость, порожденную полидиспергируемостью исходного РЕС.

Анализ конъюгатов ЙСВР-РЕС в отношении сайта присоединения РЕС проводили с помощью аминокислотной последовательности. Каждый образец разбавляли в 100 раз. Затем 10 мкл этого раствора (около 50 пикомоль) загружали в секвенатор.

Чистота конечного продукта подтверждалась данными ВР НРЬС аналитической хроматографии.

Анализ выполняли с помощью С18 аналитической колонки (Уубас) с элюцией градиентом Н₂О/0,05% трифторуксусной кислоты (элюент А) и смесью ацетонитрила и 0,05% трифторуксусной кислоты (элюент В) следующим образом:

0-5 мин	80% А
5-50 мин	80% А >5% А
50-52 мин	5% А
52-54 мин	5% А >80% А

Скорость потока 1 мл/мин, 1оор 20 мкл, иУ-У18. Детектор при 226 нм.

Неконъюгированный ИСКЕ элюировали за 20,7 мин.

Соединение А1 элюировали за 22,9 мин, соединение А2 элюировали за 23,4 мин, соединение А3 - за 24,4 мин и соединение А4 - за 25,5 мин.

Конформационная характеристика «нативного» и полимер-связанных пептидов осуществлялась на основе анализа кругового дихроизма.

Спектроскопическую характеристику неконъюгированного ИСКЕ и конъюгатов 1СКЕРЕС осуществляли на основе анализа кругового дихроизма в пределах 190-300 нм. Образцы (50 мкг/мл) растворяли в 10 мМ уксусной кислоте или смеси метанол/10 мМ уксусная кислота с молярным соотношением 30:70 и 60:40. Во всех вышеперечисленных растворах неконъюгированный ИСКЕ и конъюгаты ИСКЕ-РЕС проявили свои особенности, как это показано на фиг. 4 для соединения А3. В растворе уксусной кислоты пептиды были в хаотичной конформации, тогда как при повышении концентрации метанола пептиды принимали α-спиралевидную структуру.

Результаты показывают, что конъюгация РЕС не изменяет значительно структурных особенностей этого пептида.

Пример 5. Определение стабильности конъюгатов ИСКР-РЕС.

Стабильность ИСКР и конъюгатов ИСКРРЕС в отношении протеолиза исследовали с помощью протеолитических ферментов, таких как субтилизин и химотрипсин.

Опыт с субтилизином осуществляли путем инкубирования при 4°С 0,297 мМ пептидного раствора в 0,1 М Трис НС1 0,05 М СаС1₂ рН 8,0 при мольном соотношении пептид/протеаза 1:50000.

В случае с химотрипсином пептид был растворен в 0,08 М Трис НС1, 0,1 М СаС1₂ рН 7,8 и использовалось мольное соотношение пептид/протеаза 1:15000.

После режима деградации проводили аналитическую КР-НРЬС с помощью колонки С18 с элюцией в тех же условиях, что приведены в примере 4. Высота, соответствующая пику исходного соединения, была вычислена перед инкубацией с протеолитическим ферментом и после намеченной по плану продолжительности инкубации. Процентная доля остаточной высоты при намеченной продолжительности была вычислена, и она показана на фиг. 3 а и 3Ь.

Пример 6. Конъюгация с алкилированным РЕС.

ИСКР конъюгировали с монометоксилированным РЕС, активированным различными ацилирующими группами, а также алкилирующими группами.

Алкилирующий РЕС обладает тем преимуществом, что позволяет получать конъюгаты, у которых сохраняется положительный заряд на остатке лизина.

Выделение и оценка свойств осуществлялись так же, как описано в примерах 1-4.

Пример 7. Оценка активности контюгатов ИСКР-РЕС.

Материалы

Используемые соединения

Человеческий СКЕ_!-29 ИСКР(1-29)-ЫН₂, партия 1299201, поставлен ВасИет;

Человеческий СКР3-29 ИСКР(3-29), поставлен ВасИет;

Человеческий СКР_3-29, поставлен 18Ь; и конъюгаты ИСКР-РЕС приготовлены, как описано выше.

Реагенты

СНО-ИСКЕК-ЬИС для исследований ίη νίίτο.

Среда МЕМ альфа с рибонуклеозидами и дезоксирибонуклеозидами (С1Ьсо), содержащая 10% околоплодной сыворотки теленка (С1Ьсо) плюс 600 мкг/мл сульфата дженетицина С418 (С1Ьсо);

Реагент для лизиса клеточной культуры (Рготеда);

Реагент для анализа на основе люциферазы (Рготеда); и

Ьис1йе (Раскагб).

Ιη νίΙΐΌ биоисследование гипофизарных клеток крысы

Набор сбалансированных солей Еаг1е (ЕВ88)(С1Ьсо), содержащий 50 мкг/мл сульфата гентамицина (81§та), Среда 199 (М199) с солями Еаг1е (С1Ьсо) с 12,5% околоплодной сыворотки теленка (РВ8) (С1Ьсо) и 50 мкг/мл сульфата гентамицина.

Набор для исследования СН крысы, поставлен АтеткИат.

Ферментный раствор для биодеструкции тканей (приготовленный на 30 мл ЕВ88):

120 мг коллагеназы (81§та) мг гиалуронидазы (8фта) мг ДНКазы I (8фта)

900 мг БСА (81дта)

После составления раствора его стерильно фильтруют и помещают в термостат при 37°С.

Биологический анализ ίη νίΙΐΌ.

Набор для радиоиммуноанализа СН крысы, поставлен Атеткйат. Набор для радиоиммуноанализа СКР (1-44) человека, поставлен

РИоетх РИаттасеибса!.

Животные

8РР взрослые крысы-самцы 8ртадиеИаМеу, весом 200-250г, поставка Сйаг1ек ЯЯет, использовались после периода акклиматизации, продолжавшегося, по меньшей мере, 7 дней.

Методы

Исследование ίη νίίτο СНО-БОЯРЯ-ЬИС.

СНО-БОЯРЯ-ЬИС (клон 1-11-20) представляет собою линию клона клеток, которая была получена путем совместной трансфекции векторами рсИХА3-йОЯР-Я и рТР5-53 ЬИС СНО-ИИКХ клеточной линии.

Плазмида рсИХА3-йОЯР-Я была сконструирована включением сИИА рецептора рилизинг-фактора гормона роста человека (БОЯР-Я) в вектор экспрессии рсИИАЗ. В1иекспр1 плазмида, содержащая сИИА-БОЯР-Я, была любезно представлена д-ром В.Сау1шп (Ишуегкйу οί νίτфша), экспрессирующий вектор рсИИА млекопитающих был получен от Ιηνίίτο^η. Кодирующая БОЯР-Я последовательность была получена с помощью промотора цитомегаловируса (ίΜν) человека. Ее карта рестрикции приведена на фиг. 12.

Плазмида рТР5-53ЬИС была сконструирована встраиванием с-ίοκ элемента ответа цАМФ в область расположения эндогенного промотора выше кодирующей люциферазу последовательности в плазмиде роЬик. Элемент ответа из цАМФ и с-ίοκ промотор были получены из плазмида рТР5-53 (описана Р18Й еί а1., 1989). Вектор, содержащий беспромоторный маркерный ген (роЬик) с множественными сайтами клонирования в области, расположенной над последовательностью, кодирующей люциферазу, был получен от д-ра Вгащет (Ишуегкйу οί Техак, ОакекФи). Его карта рестрикции приводится на фиг. 13.

Эти клетки СНО-ИИКХ, полученные, как указано выше, котрансфекцией, обычным способом культивировали на среде МЕМ альфа, содержащей рибонуклеозиды и дезоксирибонуклеозиды, а также 10% околоплодной сыворотки теленка плюс 600 мкг/мл сульфата дженетицина О418.

Перед исследованием клетки высевали (40000 клеток на лунку) на белые 96-луночные планшеты (Иу па1ес11) и инкубировали в течение 16-18 ч в 200 мкг/мл культуральной среды.

На следующий день среду удалили и заменили ее средой, содержащей различные концентрации йОЯР(1-29), введенные в эталонный стандарт (Васйет), или различные конъюгаты ЙОЯР-РЕО, перед инкубированием планшета при 37°С и 5% СО₂ в течение 2 ч. В конце инкубирования СНО-ОЯРЯ-ЬИС-клетки дважды промывали 200 мкл РВ8 (81дта) и затем лизировали добавлением в каждую ячейку 50 мкл специального реагента для лизиса клеток (Рготеда). После дальнейшего 15-минутного инкубирования при комнатной температуре и введении 150 мкл люциферазного реагента для анали за (Рготеда) пластины просмотрели в люминометре (Иупа1ес11).

В качестве альтернативного способа СНОБОЯРЯ-ЬИС-клетки, засеянные по 50000 клеток в ячейку, в конце инкубирования с различными конъюгатами БОЯР-РЕО промывали РВ8, как описано выше. В каждую ячейку добавляли 100 мкг/мл РВ8, содержащего ионы кальция и магния, затем добавляли 100 мкл Ьис1йе (Раска гб). После 10-минутной выдержки при комнатной температуре пластины считывались в люминометре (ΕιιιηΚοιιηΙ^κίΜ-ιΦ).

Результаты выражали в относительных световых единицах (ЯИИ).

Оценка биологической активности (1-29) на клетках гипофиза крыс

Животные (8РР крысы-самцы 8ртадиеИаМеу с массой тела 200 г) были умерщвлены ингаляцией СО2 и у них были удалены гипофизы. Ткань тщательно измельчали и помещали в емкость с раствором фермента для биодеструкции ткани. Емкость помещали в термостат при 37°С на 1 ч.

Деструктированную ткань извлекали и клетки дважды промывали, подсчитывали и доводили концентрацию до 5х10⁵/мл. Клетки помещали на пластину с 48 ячейками (200 мкл/ячейка), пластину помещали в термостат на 72 ч.

Спустя 72 ч клетки инкубировали с БОЯР при различных его концентрациях в течение 4 ч. По завершении инкубирования собирали надосадочные жидкости и хранили их при -80°С.

Содержание ОН в каждом образце определяли с помощью имеющегося в продаже набора для радиоиммуноанализа крысиного ОН.

Исследование ίη νίνο

Животным ί.ν. вводили йОЯР(1-29) (400 мкг/крыса). За несколько минут до забора крови животных анестезировали (кетамин-ксилазин). У каждой крысы из нижней полой вены отбиралось по 2 мл крови. Образец делили на 2 аликвоты: 1 мл отбирали сам по себе и сыворотку получали после инкубирования в течение около 3 ч при 37°С с последующим центрифугированием; оставшийся 1 мл собирали в ампулу, содержащую 50 мкл раствора гепарина с концентрацией 4 мг/мл, немедленно помещали на лед и получали плазму после центрифугирования при 4°С.

Образцы крови отбирали в различные моменты времени после инъекции испытуемого соединения от различных животных. В каждом эксперименте для каждого момента времени использовалось по три крысы.

Образцы плазмы и сыворотки немедленно замораживались и хранились при -20°С.

Уровни содержания ОН в сыворотке измеряли с помощью набора, который есть в продаже, уровни содержания в плазме измеряли с помощью продаваемого Я1А набора для ЙОЯР(144).

Результаты

Примечание: В этом разделе и соответствующих фигурах ОКР-1РЕО 1-й пик соответствует | Е\ к( М РЕО, -С1Е-СО-\1е-СС))^;' йСКР(1-29)^2], ОКР-1РЕО 2-й пик'' соответствует | Р\ к( М РЕО, -С1 Е-СО-\1е-СС)Гй6КР(1-29)^2], ОКР-2РЕО соответствует [Ьук(МРЕО5000-СН2-СО-№е-СО)¹²’²¹ -ЙОКР(1 29)-ΝΉ2] и ОКР-3РЕО соответствует Ν^α(МРЕО5000-СН2-СО-Ше-СО) |1л8(\1РЕО,, -С1РСО-Ме-СО)¹²’²¹ -ЙОКР( 1 -29)-ΝΉ₂].

Исследование ш уйго СНО-йОКРК-ЬиС

Активности двух различных групп конъюгатов ЙОКР-РЕО, приготовленных с использованием ЭМЗО, при исследовании ш уйго СНОйОКРК-ЬиС, показаны на фиг. 5 и 6.

Было установлено, что все препараты активны, несмотря на меньший уровень содержания по сравнению с «нативным» ЙОКР (ЙОКР, подвергнутый тем же стадиям очистки, использовался для конъюгации с РЕО соединений), причем ОКР-1РЕО (и 1-й, и 2-й пики) был более активным, чем ОКР-2РЕО и ОКР-3РЕО. Никакой разницы между ЙОКР и «нативным» ИСКЕ не наблюдалось (данные не приводятся).

Наблюдалась подобная ш уйго биологическая активность конъюгатов ЙОКР-РЕО из обеих полученных с использованием ЭМ8О партий (фиг. 5 и фиг. 6), а также конъюгатов, из партии, полученной с использованием раствора никотинамида (фиг. 7). На фиг. 6 показаны также 2 различных ЙОКР (3-29) препарата, не обладающих значительной ш уйго активностью по сравнению с ЙОКР (1-29).

Исследование ш уйго гипофизарных клеток крысы на активность йОКР1_-29

В обоих исследованиях, проведенных на основе конъюгатов ЙОКР-РЕО, полученных с использованием ЭМЗО, было установлено, что ОКР-1РЕО 1-й пик соответствует самому активному соединению, затем идет ОКР-1РЕО 2-й пик, затем - ОКР-2РЕО и, наконец, ОКР-3РЕО (фиг. 8 и 9). Эти выводы хорошо согласуются с теми, что получены при исследовании маркерного гена.

Исследование ш у1уо

В предыдущих опытах уровни сывороточного ОН и плазменного ЙОКР определялись на крысах, исход из Εν. инъекции 400 мкг ЙОКР. Соответствующие результаты проиллюстрированы на фиг. 10. Как показано, и ОН и ЙОКР дают пики спустя 10 мин после инъекции ЙОКР. Затем концентрации ОН в сыворотке быстро понижаются и возвращаются к базальному уровню через 60 мин, тогда как концентрации ЙОКР в плазме сохраняются на прежнем уровне в течение того же временного интервала.

На фиг. 11А и 11В показаны уровни ОН и

ОКР в крови в различные моменты времени в течение 48 ч у крыс, которым были ί.ν. введены по 400 мкг 1-го и 2-го пиков ОКР-1РЕО; ОКР2РЕО и ОКР-3РЕО (приготовленные с ЭМЗО).

Все конъюгированные с РЕО препараты дают пик сывороточного ОН спустя 10 мин после ί.ν. инъекции подобно йОКР_1-29. Однако, хотя 1-й и 2-й пики ОКР-1РЕО и ОКР-2РЕО показывают уровни сывороточного ОН, сравнимые с теми, что получены от ЙОКР_1-29, подтверждается, что ОКР-3РЕО является менее активным, чем это установлено в испытаниях ш νίίΐΌ.

Что же касается уровней ОКР в плазме, то здесь наблюдается совершенно иная картина в отношении 1-го и 2-го пиков ОКР-1РЕО по сравнению с ОКР-2РЕО и ОКР-3РЕО безотносительно типа приготовления используемого препарата (с использованием ЭМЗО или никотинамида). В течение 48 ч после инъекции ОКР-1РЕО 1-го и 2-го пиков концентрации ОКР в плазме возвращаются к базальному уровню, тогда как наиболее долго сохраняющиеся уровни содержания соответствуют ОКР-2РЕО и ОКР-3РЕО.

Пример 8. Твердофазный синтез сайтзащищенных производных йОКР(1-29)-МН₂ в качестве исходных соединений в процессе конъюгации с РЕО.

Был осуществлен твердофазный синтез производных йОКР(1-29)-МН₂, содержащих специфическую защитную группу (Νаллилоксикарбонил-группу) в положении первичных аминогрупп как Ьук¹², так и Ьук²¹. Это позволяет проводить сайт-специфичную конъюгацию с РЕО №+концов. Другое аминозащищенное производное получают блокированием №“-конца посредством ацилирования и Ьук¹² Νаллилоксикарбонильной группой. Это производное используют для сайт-специфичной конъюгации с РЕО.

Материалы и методы

Операции пептидного синтеза

Все продукты присоединения ЙОКР пептидных производных к смолам были первоначально собраны Ртос-химическим методом с помощью пептидного синтезатора фирмы Аррйеб Вюкук!етк 1пс. модель 431 А, с использованием РАЬ-РЕО-РЗ смолы с низкой степенью замещения (0,16 ммоль/г) и двойного сочетания с введением протокола для каждого остатка, чтобы оптимизировать количество и чистоту получаемого неочищенного продукта. Дополнительно продукт присоединения пептида Νизопропил-Туг¹, ^ук(А11ос)¹²-йОКЕ(1-29)-NН₂ к смоле подвергали выполняемой вручную процедуре восстановительного алкилирования, чтобы присоединить Ν-терминальную изопропильную группу.

Все продукты присоединения пептидов к смоле расщепляли смесью трифторуксусной кислоты (ТРА), 1,2-этандитиола, тиоанизола и воды [10:0,5:0,5:0,5 (объем/объем)] в течение 2 ч и неочищенные пептиды выделяли осаждением в МТВЕ и центрифугированием. Лиофилизиро21 ванные неочищенные пептиды очищали градиентной ВЭЖХ с обращением фаз на препаративной колонке Уубас С 18 с помощью 0,1% ТЕЛ - вода/ацетонитрильной буферной системы. Все очищенные пептиды были охарактеризованы с помощью аналитической хроматографии с обращением фаз к ΜΑΒΌΙ-ΤΟΕ массспектрометрии.

Материалы

Етос-Ь-аминокислоты (Васбет Вюкскпсе, Регкербуе Вюкук!етк, ХоуаВюсйет), ДМФ, 20 л бочка (ЕТ. Вакег), пиперидин (Аррбеб Вюкукктк, Сйет-1трех), НВТи (Кшпт, КкНебеи Вю!есбпо1одкк), ΝΜΜ (А1бпсЬ), уксусный ангидрид (Аррбеб Вюкук!етк), смолы (Регкербуе Вюкукктк, №еа Вюсбет), а-циано-4гидрокси-коричная кислота (81дта), синапиновая кислота (А1бг1сП), ацетонитрил (ЕТ. Вакег), ТЕА (81дта, Р1егсе), деионизированная вода (МИйроге Μί11ί-0 \Уа1ег 8ук1ет). Другие растворители и реагенты перечисляются ниже: Реагенты/растворители Продавцы

ΝΜΡ Аррбеб Вюкук!етк 1пс.,

1.Т. Вакег

НВТИ

0,5 НОВ! в ΌΜΕ 2,0 М Э1ЕА в ΝΜΡ Пиперидин Дихлорметан Уксусный ангидрид

Аррбеб Вюкукктк 1пс., ШсбеНеи Вю1ес1то1ощек 1пс.

Аррбеб Вюкук!етк 1пс.

Аррбеб Вюкукктк 1пс.

Аминокислоты: большая часть ΕΜΟС аминокислот, используемых на синтезаторе АВ1 431А, были закуплены у Аррбеб Вюкукктк в виде 1,0 ммолярных картриджей с предопределенным весом. Етос-Ьук(А11ос)-ОН была закуплена у Регкербуе Вюкук!етк (Егатшдйат, ΜΑ) по массе и картриджи заполнялись на месте. Все используемые аминокислоты были Ьконфигурации.

Смолы: исходные смолы, используемые для НСКЕ-аналогов были РАЬ-РЕ6-Р8 (пептидамидный линкер - полиэтиленгликольполистирол)смолы. РАЬ-РЕ6-Р8 носители, закупленные у Регкербуе Вюкук!етк, постоянно показывают превосходные результаты по чистоте и выходу неочищенного продукта. Смолу с низкой степенью замещения 0,16 ммоль/г использовали для всех производных. Смолы с низкой степенью замещения обычно используют для длинных тяжелых цепей, чтобы обеспечить лучшее сочетание и уменьшить стерические затруднения и возникновение эффекта βраспластывания в наращиваемых пептидных цепочках.

Методы

Сборка цепочки - пептидный синтезатор фирмы

Аррбеб Вюкукктк 1пс., модель 431 А

Цепочки защищенных пептидов сначала собирают с помощью Етос-метода на пептидном синтезаторе фирмы Аррбеб Вюкукктк 1пс., модель 431 А, в котором используются программные циклы быстрого Етос (Еак! Мос™) НВТИ используется для активации и сочетания, 20% пиперидин - для снятия защиты, а ΝΜ^ основной растворитель, используемый для снятия защиты, растворения аминокислот и промывки смолы. Аминокислотами заполняют 1,0 ммоль картриджи, рассчитанные на заранее предопределенный вес. В 0,25 ммольных Еак! Мос™ циклах используют 1,0 ммольные картриджи и реакционную емкость объемом 40 мл.

Сборка цепочки - способ

Стадии для программных циклов, калиброванных по 0,25 ммоль, могут быть в целом охарактеризованы следующим образом:

1. Снятие защиты пиперидином. - Смолу сначала промывают ΝΜ^, затем обрабатывают 18% раствором пиперидина в NΜΡ, и снятие защиты происходит за 3 мин. Жидкости в реакционной емкости дают стечь, заливают 20% раствор пиперидина и процесс снятия защиты продолжается около 8 мин.

2. Растворение аминокислоты - NΜΡ (2,1 г) и 0,9 ммоль 0,45М НВТИ/НОВ! в ^ΜΕ (2,0 г)добавляют в картридж и перемешивают в течение 6 мин.

3. Промывание ΝΜ^ - из реакционной емкости дают стечь жидкости и промывают смолу NΜΡ 5 раз.

4. Активация аминокислоты и перенос в реакционную емкость (КУ) - 1 мл 0, 2 М Э1ЕА в ΝΜ^ добавляют в картридж, чтобы начать активацию аминокислоты, затем переносят из картриджа в КУ.

5. Сочетание и конечное промывание - Реакция сочетания между активированной аминокислотой и пептидом со снятой Ν-концевой защитой, присоединенным к смоле, продолжается около 20 мин, затем жидкую фазу из КУ сливают и смолу промывают ΝΜ^.

6. Завершение (при желании) - Приблизительно 12 мл 0,5 М уксусного ангидрида, 0,125 М Э1ЕА и 0,015 НОВ! в растворе NΜΡ добавляют в реакционную емкость и взбалтывают в течение 5 мин. Это должно приводить к ацетилированию любых свободных не подвергнувшихся сочетанию точек на смоле, что дает в результате усеченные, а не делетированные цепочки, что затем значительно упрощает стадии очистки.

Полный протокол для этих циклов можно найти в Аррбеб Вюкукктк Икег Ви11ебп Ν 35 ^ак^ос™ 0,25 и 0,10 для Модели 431А).

Стандартный план для типичного синтеза Стадия 1. Промывка смолы 3Х ^ΜΕ. Стадия 2. Снятие защиты 2Х по 5 мин 20% пиперидином в ΌΜ^.

Стадия 3. Промывка смолы 6Х ^ΜΕ.

Стадия 4. Сочетание в течение 45 мин аминокислоты, активированной смесью

НВТИ/ΝΜΜ в ΌΜ^.

Стадия 5. Промывка смолы 3Х ΌΜΕ.

Для тяжелых цепей дополнительная стадия завершения, в которой используется 70% уксусный ангидрид в ΌΜΕ в течение 20 мин для ацетилирования любых незанятых точек на смоле с присоединенным пептидом, что дает в результате в конечном неочищенном продукте усеченные, а не делегированные цепи, может осуществляться после стадии сочетания.

Отщепление/Экстракция

Отщепляющая смесь, используемая для удаления защищающих групп и отсоединения пептида от смолы, является стандартной смесью, применяемой для пептидов, содержащих аргинин и/или метионин. Для 0,1-1,5 г продукта присоединения пептида к смоле: 10 мл трифторуксусной кислоты, 0,5 мл деионизированной воды, 0,5 мл тиоанизола, 0,5 мл этандитиола (87% трифторуксусной кислоты, 4,3% деионизированной воды, 4,3% тиоанизола, 4,3% этандитиола).

Процедура отщепления

100 мг-1 г присоединенного к смоле пептида помещают в 20 мл стеклянный сосуд и охлаждают в бане со льдом. Готовят отщепляющую смесь и также охлаждают ее на льду, затем добавляют к пептиду, связанному со смолой, до конечного объема примерно 10 мл.

Сосуд извлекают из ледяной бани и дают ему нагреться до комнатной температуры. Сосуд закрывают крышкой и перемешивают реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч.

Спустя 2 ч раствор отфильтровывают под вакуумом через пористый фильтр, обеспечивающий протекаемость среды, в приблизительно 30 мл холодного МТВЕ. Реакционный сосуд промывают 1 мл трифторуксусной кислоты и фильтруют через ту же самую фильтрующую воронку в холодный МТВЕ. Вся суспензия затем переносится в 50 мл центрифужную пробирку и центрифугируются в течение ~10 мин при 2000 об./мин при комнатной температуре.

Супернатант отсасывают, остаток ресуспендируют в 40 мл холодного МТВЕ и центрифугируют снова. Эту стадию повторяют еще раз. Конечный супернатант отсасывают, а осадок продувают азотом для испарения основного количества оставшегося в нем эфира.

Затем пептид растворяют в 20-30 мл 1-10% водного раствора уксусной кислоты, разбавленного примерно 100-150 мл деионизированной воды, замораживают и лиофилизируют.

Очистка

Методы ВЭЖХ с обращенной фазой

Система - \Уа1егк Эе11а Ргер 4000

Колонка - Уубас обращение - фазовая С18, 10 мкм; 2,2х25 см (Кат. № 218ТР 1022)

Буферы - А: Вода/0,1% ТФК В; Ацетонитрил/0,1% ТФК

Скорость потока - 15 мл/мин

Детекция - \Уа1ег5 484 УФ детектор, 220 нм,

Градиент - изменяющийся, обычно 0,2% В/мин вплоть до 1,0% В/мин.

Лиофилизированные неочищенные пептиды получают растворением 50-100 мг пептида в 200 мл 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты. Пептидный раствор затем наносят непосредственно на препаративную колонку через резервуарную линию буфера «А» и включают программу градиента.

Собранные фракции в течение ночи прогоняют на анализирующей ВЭЖХ системе с автопробником. Выходящие фракции, достигающие в пике более 92% чистоты, собираются, разбавляются деионизированной водой в соотношении 4:1, замораживаются и затем лиофилизируются в νίτίίδ 258Ь замораживающей сушилке.

Характеристика Обращенно-фазовая ВЭЖХ

Условия:

Система - насосная \Уа1егк 510, 717 Автопробник,

УФ детектор 490 мультидлинноволновый,

Колонка - Vубас С18, 5 мкм, 0,46х25 см (Кат. № 218ТР54)

Буферы - А: Н₂О/0,1% ТЕА В: АСМ0,1% ТЕА

Скорость потока - 1 мл/мин

Детекция - УФ: 214 нм, 280 нм.

Градиент - 2% В/мин.

Очищенные лиофилизированные пептидные образцы готовят растворением 0,2-10 мг пептида в 0,1% водной трифторуксусной кислоте до концентрации 0,5-1,0 мг/мл.

15-18 5 мкл наносят на колонку и элюируют с помощью градиентной программы 0-50% ацетонитрила через 25 мин. Результаты хроматографии собирают и хранят, используя \Уа1ег5 Ехрей-Еаке кой^аге.

Масс-спектрометрия

Тип: МАБО1-ТОЕ (Матрикссопутствующая лазерная десорбция) ионизация периода полета

Система: Регкерйуе Вюкуйетк ^уадег Е1йе

Матрицы: а-циано-4-гидроксикоричная кислота, 10 мг/мл в 67% АС.’Ш).1% ТЕА или синапиновая кислота, 10 мг/мл в 50% АСШ), 1% ТЕА.

Образцы пептидов готовят концентрацией 1-20 мкмоль в 50% АСМ0,1% ТЕА. 0,5 мкл раствора матрикса, а затем 0,5 мкл образца пептида наносят на ячейки пластинки для анализа и дают высохнуть. Аналитическую пластину загружают в машину, и образцы сканируют и анализируют, используя КеПесЮг Ое1ауеб-Ех1гас1юп метод, оптимизированный для пептидов. Для каждого образца данные в виде кумулятивного сигнала от 32-128 лазерных доз собирались и анализировались. В каждый прогон для калиб25 ровки включалась ячейка с пробой контрольного пептида.

Специфический синтез Получение [Бук(А11ос)^12,21]-ИСКЕ(1-29)-ХН₂

Продукт связывания [Бук(А11ос)^12,21]ИСКЕ(1-29)-РАБ-РЕС-Р8-смола первоначально синтезировали Етос-методом на пептидном синтезаторе Аррбеб В1окук!етк 431 А (см. Методы синтеза выше), включающим снятие защиты Ν-концевой Етос-группы.

Продукт пептид - смола расщепляли смесью ТЕА: 1,2-этандитиол:тиоанизол:вода [10:0,5:0,5:0,5 (объем/объем)] в течение 2 ч и выделяли пептид осаждением в МТВЕ с получением 240 мг неочищенного пептида. Очистка препаративной обращеннофазовой ВЭЖХ на колонке Уубас С18 (22х250 мм) приводила к получению 60 мг очищенного продукта (>95% аналитическая ВЭЖХ). МАБББТОЕ массспектр.

Вычислено: 3523,8. Найдено: 3524,2. Получение ^“-изопропил-Туг¹, Бук(А11ос)¹²]ЬОКЕ(1-29)-ИН₂

Сборка начального продукта [Бук(А11ос)¹²]ИСКЕ(1-29)-РАБ-РЕС-Р8-смола.

[Бук(А11ос)¹²]-ИСКЕ(1-29)-РАБ-РЕС-Р8смолу собирают Етос-методом на пептидном синтезаторе 431А фирмы Аррбеб В1окук!етк (см. выше Методы синтеза), включая снятие защиты Етос группы Ν-концевого остатка.

^-изопропилирование путем восстановительного алкилирования ^-изопропильную группу присоединяли восстановительным алкилированием присоединенного к смоле пептида с помощью натрийцианборгидрида и соответствующего кетона (ацетона), как описано Носаг! е! а1., 1987. 880 мг пептида, присоединенного к смоле (~70 мкмоль) замачивали для набухания в 5 мл БСМ в течение 30 мин, затем добавляли 10 ммоль (174 мкл) ацетона в 7 мл МеОН/1% НОАс и смесь периодически взбалтывали в течение 2 ч при температуре окружающей среды. Затем добавляли 2 ммоля (129 мг) натрий-цианборгидрида в 12 мл МеОН/1% НОАс, смесь периодически взбалтывали в течение 2 ч и затем оставили на ночь (15 ч). Качественный мониторинг с нингидрином показал завершение реакции (отсутствие голубого окрашивания). Пептид отсоединили от смолы смесью ТЕА:1,2-этандитиол:тиоанизол: вода [10:0,5:0,5:0,5 (объем/объем)] за 2 ч и выделили пептид осаждением в МТВЕ с получением ~200 мг неочищенного продукта. Очистка препаративной обращенно-фазовой градиентной ВЭЖХ в системе растворителей Вода/Ацетонитрил/0,1% трифторуксусная кислота на колонке Уубас С18 (22х250 мм) привела к получению 50 мг чистого продукта (>95%аналитическая ВЭЖХ). МАББ1-ТОЕ массспектр: Вычислено: 3481,9, Найдено: 3481,8.

Пример 9. Конъюгация с РЕС защищенных ИСКЕ(1-29).

Производные ИСКЕ, полученные как описано в примере 8, конъюгировали с активированным РЕС, как описано в примерах 1 и 6.

Очистка в этом случае включала только выделение из избытка реагентов и побочных продуктов, тогда как не было необходимости осуществлять процедуру, описанную в примерах 2 и 3.

Список литературы

АЬис1ю\укк| А. е! а1., БВюБСИет., 252, 3571-3581, 1977а;

АЬисИо^кк1 А. е! а1., БВюБСИет., 252, 3582-3586, 1977Ь;

ВепсИатр С.О. е! а1., АпаБВюсИет., 131, 25-33, 1983;

Сабсеб е! а1., БВюасбуе СотрабЫе Ро1утег,8,41-50, 1993;

Сатрбеб К. е! а1., БРерббе Кек., 49, 527537, 1997;

СИап XV.С. е! а1., БСИет. 8ос. СИет. Соттип., р.2209, 1995;

С1агк К. е! а1., БВюБСИет., 36, 2196921977, 1996;

Бе1дабо С. е! а1., Вю!есбпо1оду апб Аррбеб ВюсИетИбу, 12, 119-128, 1990;

Е. Бюк е! а1., Рерббек 1996. Ргосеебтдк оГ !Ие 24'¹' Еигореап Рерббе 8утрокшт, ЕбтЬигдИ, 8собапб, 1997;

Еебх А.М. е! а1., 1п!.БРерббе Рго!ет Кек., 46, 253-264, 1995;

Е1кИ е! а1., Сепек апб Беуе1ортеп1, 3, 1989, 198-211;

Сгеепе Т.^. е! а1., Рго!ес!йе Сгоирк т Огдатс 8уп!бек1к, 1обп \УПеу апб 8опк, 1пс. РиЬ., рр.331-333, 1991;

НаЬееб А.8.Е.А. е! а1., АпаБВюсИет., 14, 328-336, 1966;

Натк 1.М., Кеу.МасготоЕ СИет.РИук., С25, рр.325-76, 1985;

Носаг! е! а1., БМеб.СИет., 30(4), 739-743, 1987;

Би е! а1., 1п!.1.Рерббе Рго!ет Кек. 43, 1994, 127-138;

МопГагб1ш е! а1., Вюсоп.СИет., 6, 62-69, 1995;

Могригдо е! а1., Вюсоп.СИет., 7, 363-368, 1996;

МигрИу, XV.А. е! а1., Рерббе КекеагсИ, 1(1), 36, 1988;

Рапбе С.8. е! а1., Ргос.№!1.Асаб.8сБи8А, 77, 895-899, 1980;

8аг!оге Б. е! а1., Арр1.ВюсИет.Вю!есбпо1., 27, 45, 1991;

8аг!оге Б. е! а1., Аррбеб. ВюсИет. Вю!есИпо1., 31, 213-22, 1991;

81тк С.Е.С. е! а1., Апа1. ВюсИет., 107, 6063, 1980;

Тат БР. е! а1., 8!гопд ас1б берго!есбоп оГ куп!бебс рерббек. 1п ТИе Рерббек, 9, 8. ибеп27

Гпепб апб 1. Мс1сп1юГсг. ебз., Лсабешк Ргезз, ΝΥ, рр. 185-248, 1987;

Уегопеке ЕМ. е! а1., Арр1.В1осЙет., 11, 141152 (1985);

Уатзик! е! а1., Адпс.ВюкСЙет., 52, 21852196, 1988;

2а11р§ку 8. е! а1., Ро1утепс Игидз апб Эгид Ое1Аегу 8уз!етз, абгз 9-110 АС8 8утрозшт зепез 469, 1990; апб

2а11р§ку 8. е! а1., Еигор.Ро1ут.1, 19, 11771183, 1983.

Перечень последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

(ί) ЗАЯВИТЕЛЬ (A) НАЗВАНИЕ: АРРЫЕЭ ИЕ8ЕАИСИ 8Υ8ΤΕΜ8 АК8 1 ΙΟΕΙίΙΧΟ Ν.ν.

(B) УЛИЦА: 14 1ΟΗΝ В.ООИ81ИАУЕО (C) ГОРОД: СИКАСАО (Е) СТРАНА: ΤΗΕ \ЕТНЕ1К.А1)8 АИТП.ЕЕ8 (Б) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС (ΖΙΡ): ΝΟΝΕ (О) ТЕЛЕФОН: 639300 (Η) ФАКС: 614129 (ίί) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: ЖИДКОФАЗНОЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ (ίίί) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 1 (ίν) ТИП КОМПЬЮТЕРНОГО СЧИТЫВАНИЯ (A) ТИП НОСИТЕЛЯ: ГИБКИЙ ДИСК (B) КОМПЬЮТЕР: РС СОВМЕСТИМЫЙ С ΙΒΜ (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РСΌΟ8/Μ8-ΌΟ8 (Ό) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Ра!еп!1п Ке1еазе #1.0, Vе^з^оп #1.30 (ЕРО) (2) ДАННЫЕ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1:

(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 29 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ίίί) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: НЕТ (ίν) АНТИЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ: НЕТ (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕО ГО ΝΟ:1:

Туг А1а Азр А1а Не РЬе ТЬг Азп 5ег Туг Агд Ъуз Уа1 Ьей С1у 51п

10 15

Ъеи Зег А1а Агд Ъуз Ъеи Ъеи 61п Азр 11е МеС Зег Агд

25

Claims

1. Способ сайт-специфичного получения конъюгатов рилизинг-фактора гормона роста человека и полиэтиленгликоля (ЙОКБ-РЕО), содержащих одно или несколько звеньев РЕО (в расчете на ЙОКБ), ковалентно связанных с Ьуз¹², и/или Ьуз²¹, и/или Ν^α, отличающийся тем, что реакцию конъюгирования между пептидом ЙОКБ и активированным РЕО осуществляют в растворе и целевой конъюгат ЙОКБ-РЕО выделяют из реакционной смеси и очищают.

2. Способ по п.1, в котором раствор представляет собой концентрированный водный раствор никотинамида или водный буферный раствор денатурирующего агента.

3. Способ по п.1, в котором растворитель представляет собой полярный органический растворитель, выбранный из диметилсульфоксида, смеси диметилформамида и буфера или смеси ацетонитрила и буфера.

4. Способ по п.1, в котором конъюгат ЙОКБ-РЕО выделяют из реакционной смеси и очищают хроматографическими методами.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором пептид ЙОКБ представляет собой ЙОКБ(1-29)-ИП₂.

6. Способ по п.1, в котором перед реакцией конъюгации с РЕО пептид ЙОКБ защищают по одному или нескольким из положений Ν^α, Ьуз¹²и Ьуз²¹.

7. Способ по п.1 или 6, который включает снятие защиты после реакции конъюгации с РЕО.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором активированный РЕО является алкилирующим или ацилирующим РЕО в монометоксилированной форме.

9. Конъюгат ЙОКБ-РЕО, полученный способом по любому из пп.1-8, содержащий один или несколько звеньев РЕО (в расчете на ЙОКБ), ковалентно связанных с Ьуз¹², и/или Ьуз²¹, и/или Ν^α.

10. Конъюгат ЙОКБ-РЕО по п.9, в котором одно звено РЕО ковалентно связано с Ьуз¹².

11. Конъюгат ЙОКБ-РЕО по п.9, в котором одно звено РЕО ковалентно связано с Ьуз²¹.

12. Конъюгат ЙОКБ-РЕО по п.9, в котором одно звено ковалентно связано и с Ьуз¹², и с Ьуз²¹.

13. Конъюгат ЙОКБ-РЕО по п.9, в котором одно звено ковалентно связано с каждым из Ьуз¹², Ьуз²¹ и Ν^α.

14. [Ьуз(А11ос)¹²’²¹]-ЙОКБ в качестве промежуточного соединения в реакции конъюгации с РЕО по п.1.

15. [УЕизопропил-Туг¹, Ьуз(А11ос)¹²]-ЙОКБ в качестве промежуточного соединения в реакции конъюгации с РЕО по п.1.

16. Применение конъюгатов по любому из пп.9-13 в производстве лекарственных средств для лечения, профилактики или диагностики нарушений, связанных с гормоном роста.

17. Применение по п.16 в производстве лекарственного средства для лечения или диагностики недостаточности гормона роста.

ψ ψ ψ

ΝΗ» - Туг · А1а - Аар - А1а - <1е - Р1и · 7Кг · Азп - 5« - Туг - Агд - 1у» · Уа1 - |_«и - С1у · С1п - 1еи · Зег - А1а · Агд · 1у» - Ιβυ - 1еи - С1п - Азр - На - Ме1 · бег - А/д- ΝΗ}

Фиг. 1

Фиг. 2

Биодеструкция под воздействием субтилизина

Фиг. ЗА

Фиг. 4

Биодеградация под воздействием химотрипсина

Фиг. 5

О 50 100 160 200 260 300 350 400 450 500

Вреш (минуты)

Фиг. ЗВ

Фиг. 6

Фиг. 7

I ί

-^ьсар^ — минуты _ время

Фиг. 11А

1 ПСНР^Ся^^е) г СКР—ч (ЕС_М 14.55)

ОНР-1 РЕО 1*' пик (ЕС_а 4.65)

СРР-1 РЕО г¹*¹ пик (ЕС_а 91.69) СЯР-2 РЕО (ЕС_а 252.3)

СНР-3 РЕО (ЕС_а 59.13)

Фиг. 11В ' 0.01 лМ контроль

0.1 пМ

1 пМ

10 пМ 100 пМ ΙΟΟΟηΜ 10000 пМ

РЕ6-НОКР1: 2-я партия

Фиг. 8 ροΟΝΑ3-6ΒΡ-Β вектор а ΠΟΡΕίΕς^Γββ) * ОКР (ЕС_К 2.62) ♦ СЙР-1 РЕО 1*' пик (ЕС_И 7.12) • СЯР-1 РЕО 2⁰¹¹ пик (ЕС_И 57.77) о СЯР-2 РЕО (ЕС_М 229.4) β 6ЙР-ЗРЕО ( неопр. )

РЕО-КОРРв: 3-я партия

Фиг. 9

Фиг. 12

Уровня СВР в плазме (пг/мл) рТР5-53ЬиС вектор

С-1О5 Рго.

Время (минуты)