TWI254641B - Solution-phase site-specific preparation of GRE-PEG conjugates, and composition of the conjugate - Google Patents
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Description
A7 1254641 __B7_ 五、發明說明(/ ) 發明領域 本發明係關於內含一或多個與Lys(賴胺酸)12和/或 Lys21和/或Να共價結合之PEG單元(對每一個hGRF而言) 之hGRF-PEG共軛體之位置專一性製備方法,其特徵在於 該hGRF肽與活性PEG間的共軛反應係在溶液中進行,並 以色層分析法來純化所欲之hGRF-PEG共軛體。 發明背景 在1980年代初期有數個實驗室分離出生長激素釋出 因子(GRF)並詳加描述其特徵。 GRF(又稱生長激素釋放因子(somatorelin))乃是由下視 丘所分泌的一種肽,能作用在其本身的受體上並促進腦下 垂體後葉釋出生長激素。其可以是具有44、40或37個氨 基酸之肽,其中含44個胺基酸形式之肽在生理情況下可被 轉變成較短的形式。所有三種不同長度的肽都具有活性, 且其活性主要是來自最前面的29個胺基酸殘基。在歐洲專 利申請案EP 105 759中描述了一段以重組DNA技術所製 備、相當於人類GRF之1-29個胺基酸序列[hGRF(l-29)]之 合成肽,又稱類生長激素釋放因子(sermorelin)。 曾以類生長激素釋放因子之乙酸鹽形式來診斷並治療 生長激素不足的現象。 GRF對某些與生長激素相關的疾病之治療上的確具有 療效。在生理情況下可藉由GRF刺激GH的釋出以促進長 3 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-|> n n 11 n I 一一 0,e An i I l§ n n amtw I A7 1254641 _____ B7____ 五、發明說明(:!) 骨生長及蛋白質之合成代謝。 GRF在使用上相關的一個問題,即其生物半衰期相當 短(約12至30分鐘)。hGRF(l-29)-NH2會被酵素降解,且 很快即會在血漿中被第IV型二肽基肽酶(DPP-IV)在Ala(丙 胺酸)2及Asp(天門冬胺酸)3殘基間切割而快速降解。 因此,將GRF經過特定化學性修飾,以開發出具生物 安定性之長效GRF類似物來預防或延緩其被酵素降解乃是 極具優勢的。 聚乙二醇(PEG)乃是一種親水性、生物可相容之無毒 聚合物,其可用H(OCH2CH2)nOH之通式表示,其中n-4 ,其分子量在200至20,000道耳吞(Daltons)之間。 已證實PEG以其單甲氧基化形式與蛋白質和/或肽之 化學共軛可顯著的增加其生物作用的持續時間。一如醣蛋 白上的碳水化物部分,PEG可提供一保護性外層並增加分 子體積,因此能減低其代謝降解及其腎臟被移除的速率。 由Davis及Abuchowski兩人所進行之先驅性基礎硏究 中’已知對傳送肽及蛋白質而言,PEG共軛體已是一項習 知的方法(Abuchowski et al·,1977a 及 1977b)。一般來說, PEG和肽或蛋白質的共軛會使PEG非專一性的化學性連接 在超過一個胺基酸殘基上。因此,此項技術的重點之一乃 是找到適當的化學方法,將PEG分子共價地共軛在特定的 胺基酸殘基上。 4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -n I 1 Βϋ ϋ n 一OJ· I— «1 I ϋ n ϋ f A7 1254641 ___B7__ 五、發明說明(3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如,由三氯三吖畊活化之PEG,被發現其不僅有毒 且以非專一性方式反應,後來被各種具有能與胺基 (Benchamp et al.? 1983; Veronese et al.? 1985; Zalipsky et al.,1983; Zalipsky et al·, 1990; and Delgado et al·,1990)、 氫硫基(Sartore et al·,1991; and Morpurgo et al·,1996)或胍 基(Pande et al.,1980)產生專一性反應之化學連接子的PEG 反應試劑取代。 已知各種PEG-蛋白質共軛體都不會被蛋白質水解和/ 或具有降低的免疫原性(Monfardini et al·,1995; and Yamsuki et al.,1988) 0 另一項在蛋白質聚乙二醇化作用上的技術性問題,係 來自PEG-蛋白質共軛體通常都連接不同數目的PEG分子 ,且形成一種含不同PEG:蛋白質化學計量比例之共軛體 混合物。位置專一性的聚乙二醇化作用仍爲一項化學上的 挑戰。將PEG共軛於GH上代表了這類蛋白質中的典型實 例(Clark et al.,1996)。已證實軛合係發生在GH之任意賴 胺酸殘基位置上。 爲避免或降低酵素活性的喪失,可預先保護活性位置 ,使於非活性位置上進行酵素聚乙二醇化作用(Caliceti et al·,1993) 〇 最近提出另一種可將PEG共軛在以固相肽合成法製備 之諸如GRF這類低分子量肽上專一性位置的方法。在這些 共軛體中,將預先製備之聚乙二醇化胺基酸於固相合成時 引入肽序列中。但是,此程序會使產物純化步驟變得極複 5 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 1254641 ____B7__ 五、發明說明(+ ) 雜,而已知產物純化步驟係固相合成反應的關鍵步驟。 PEG的存在,因其高分子量及多樣性,可能會使終產物中 出現讓人無法接受的不純物和/或產物中少了某些胺基酸, 後者在Merdfield程序中係極常見的現象。 最近文獻中曾提到單聚乙二醇化作用,亦即以固相合 成法將一個PEG分子連接到[Ala15]-hGRF(l-29)-NH2特定 之胺基酸殘基上(Felix et al·,1995)。此硏究顯示於第21或 25個殘基上被聚乙二醇化之[Ala15]-hGRF(l-29)-NH2可保 有其母分子[Ala15]-hGRF(l-29)-NH2之完整的體外活性。但 是,目前並未有體內數據顯示相較於非聚乙二醇化配對體 而言,這些聚乙二醇化共軛體可展現出較長的作用時間。 最近更有報導指出相較於相對非聚乙二醇化配對體而 言,在豬隻及老鼠動物模型系統中,同樣以固相合成法將 不同分子量之PEG接在數個hGRF類似物之C-端可延長其 作用期限。 發明說明 與上述單聚乙二醇化hGRF之固相製備方法相反的是 ,本發明係關於溶液相中hGRF之位置專一性聚乙二醇化 作用。 已知hGRF在其中最有效聚乙二醇化反應能發生的化 學條件之中性/鹼性緩衝溶液中的溶解度很低。在稀釋的 hGRF溶液中,活化之PEG(如PEG酯)的水解會降低聚乙 6 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 裝·--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- 9.. A7 1254641 一― ___B7 _ 五、發明說明(5") 二醇化反應之產率。 本案申請人發現,在hGRF溶解度很高的適當溶劑中 ,可於溶液相中進行具位置專一性的聚乙二醇化反應。如 此,即使起始之hGRF肽並未加以保護,其PEG鏈絕大部 分都會只和Lys12、Lys21和/或Να之一級胺基團(£ -胺基團 )結合且產率相當高,視反應條件而定。下列所獲四種亦屬 本發明範疇中之共軛體,其共軛體中hGRF : PEG的化學 計量比例主要係視PEG與hGRF之莫耳比例而定。 hGRF-PEG共軛體,其中1個PEG分子係被共價結合 在Lys12上, hGRF-PEG共軛體,其中1個PEG分子係被共價結合 在Lys21上, hGRF-2PEG共軛體,其中2個PEG分子係被共價結 合在Lys12及Lys21上;且 hGRF-3PEG共軛體,其中3個PEG分子係被共價結 合在 Lys12、Lys21 及 Να上。 “Να”在本案整篇說明書中係代表肽Ν-端(Tyr )上之胺 基團。 接著可對反應中所得的共軛體進行簡單的色層分餾, 藉由凝膠過濾或直接將共軛體加到C18之HPLC管柱中以 水/乙腈梯度將其洗出。由於可獲得大量製備及純化產物, 因此較好是使用第二種方法。 因此,本發明主要具體實施例乃是內含一或多個與 7 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝
n n ϋ n^OJ· I n 1 ·1 1« —9 I f A7 1254641 _._B7___ 五、發明說明(‘) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Lys12和/或Lys21和/或Να共價結合之PEG單元(對每一個 hGRF而言)之不同hGRF-PEG共軛體之位置專一性製備方 法,其特徵在於該聚乙二醇化反應係在溶液中進行’並以 例如色層分析法來純化所欲求之hGRF-PEG共軛體。 內含一或多個與Lys12和/或Lys21和/或Να共價結合 之PEG單元(對每莫耳hGRF而言)之hGRF-PEG共軛體也 在本發明範疇內。其中1個PEG分子被共價結合在Lys12 或Lys21上之hGRF-PEG共軛體乃是本發明中較佳之產物 〇 依據本發明之另一具體實施例,如果這三個PEG鏈可 結合之胺基團中有一或多個基團受到特定化學基團之可逆 轉的保護而無法進行聚乙二醇化反應,則聚乙二醇化反應 就會在特定位置上進行,直接產生欲求的共軛體,稍後這 些共軛物可藉由諸如超過濾或其他色層分析法由反應混合 物中被分離出來。在這種情況下,製備法可進而選擇性地 包括一個去保護基團的反應。 去保護基團反應較好是依已知方法並視所欲移除之化 學保護基團來進行。 依據本發明,除非特別述明,”hGRF”一詞係包含任何 人類GRF肽,特別是含1-44、1-4〇、1-29個胺基酸的肽 及其相對之醯胺化合物(在N-端或C-端含一個醯胺基團), 較佳之hGRF肽乃是hGRF(l-29)-NH2,其胺基酸序列如胺 基酸序列編號:1。 “活性PEG”(或”聚乙二醇化劑”)乃是可作爲蛋白質修 8 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 1254641 五、發明說明(y ) 飾劑之任一 PEG衍生物,因其所含官能基能與蛋白質/肽 中的某些官能基團反應,產生PEG-蛋白質/肽共軛體。 Hairis(1985)曾詳細評論了能作爲蛋白質修飾劑之PEG衍 生物。活化之;PEG分子也可以是一種烷化劑,如PEG醛 、PEG環氧化物或PEG崔司化物(PEGtresylate),或是其亦 可爲醯基化劑,如PEG酯。 活化之PEG較好是以單-甲氧基化的形式來使用。其 較佳之分子量範圍介於2,000至20,〇〇〇間。依據本發明, 單-甲氧基化之PEGlqoo特別適合用來製備活化之peg。 如果活化之PEG爲一種乙醯化劑,較好是內含一正亮 胺酸或鳥胺酸殘基並以醯胺基鍵結連接在PEG部分上。藉 著這些殘基可正確推算出每莫耳肽中鍵結了多少PEG單元 (參見Sartore et al·,1991)。因此,較佳之活化的PEG乃是 單-甲氧基化之PEG^ooo,並以醯胺鍵連接在正亮胺酸之心 胺基團上,且以琥珀醯亞胺酯在其羧基團上被活化。 帶有支鏈的PEGs也很常被使用。帶有支鏈的pEGs可 以R(-PEG-OH)m表示,其中R代表諸如季戊四醇或乙三醇 之中央核心部分,m代表支鏈數目。支鏈數目可以由3至 100或以上。羥基團則可被化學性修飾。
另一種支鏈形式,係如pct專利申請案W096/21469 中所描述的,具有能被化學性修飾的一端。此種型式的 PEG可以(CH3〇-PEG-)pR-X表不,其中p等於2或3,R 代表諸如賴胺酸或甘油之中央核心部分,且χ代表一可被 9 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐)^ -- (請先閱讀背面之注音?事項再填寫本頁)
· emmt ·ϋ I ϋ· n n ί · ϋ ·ϋ n n ϋ —ϋ I I mw. A7 1254641 ---___B7_____ 五、發明說明($ ) 化學性活化諸如羧基的官能基團。另一種支鏈形式’“具 側基的PEG” ,在其PEG主鏈上而非PEG鏈末端,具有 諸如羧基這類具反應性的基團。 所有這類帶有支鏈的PEGS都可以如上述之法加以活 化。 “色層分析法”意指任一種藉由溶劑(移動相)流過支持 物(靜止相)上而將混合物之成分加以分開來的技術。色層 分析法分離物質的原則係基於移動相和靜止相間不同的物 理性質之故。 某些特定形式的色層分析法,乃是文獻中熟知的,包 括:液相、高壓液相、離子交換、吸附、親和力、分配、 親油、逆相、凝膠過滤、超過爐或薄層色層分析法。 “聚乙二醇化反應(pegylation)”係指由活性PEG和其相 對之蛋白質/肽反應生成PEG-蛋白質/肽共軛體之反應。 PEG : hGRF之莫耳比率可以是1 : 1、2 : 1或3 : 1, 視所欲產率較高之共軛體而定。 聚乙二醇化反應之溶劑可選自高濃度菸鹼醯胺水溶液 、去折疊劑(如尿素)之緩衝水溶液或選自二甲基亞碾、二 甲基甲醯胺/緩衝液或乙腈/緩衝液之極性有機溶劑中。 溶液之pH値一般均維持在7和9間。
Lys 12和Lys 21之化學保護基團的例子如下,但不限於 此:Alloc(烯丙氧羰基)、Dde(l-(4,4-二甲基_2,6-二氧環己- 10 V紙張尺度適用中關家標準(CNS)A4規格(21Q x 297公餐1 一 ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-ϋ ϋ in n ·ϋ n n 一OJ> I* ϋ n 1 ϋ n mmmmf I 1254641 A7 B7 五、發明說明(1 ) 1-亞烯基)乙基)、Adpoc(l-(l’-金剛烷基)-1-甲基-乙氧羰基) 或2-Cl-Z(2-氯苄氧羰基)。對賴胺酸而言,較佳之保護基 團爲Alloc。 聚乙二醇化反應後,可依Greene T.W.等人(Greene T.W. et al.,1991)所述方法之一將Alloc移除。Dde則可以 2%於DMF聯胺之DMF溶液加以移除(W.C· Chan et al·, 1995)。Adpoc可以類似移除Alloc的方法進行移除⑺丨心?· et al.,1997)。2-C1-Z 則需藉強酸去保護(HF、TFMSA、 HBr)或氫化才可移除(Tam et al.,1987)。 Να的保護基團可以是諸如甲基、乙基、丙基、異丙基 、丁基、三級丁基、节基或環己基之院基團。較好是異丙 基。可藉還原性烷化作用將這些烷基團引入(Murphy et al.,1988 或 Hocart et al·,1987) 〇 [Να-異丙基-Tyr1, Lys(Alloc)12]-hGRF 及 [Lys(Alloc)12,21]-hGRF亦涵蓋在本發明範疇中,爲聚乙二 醇化反應中有用且新穎之中間物。 已知本發明之聚乙二醇化反應: 1. 不會改變肽本身的組態, 2. 會增加對蛋白酶降解反應之抵抗性, 3. 不會影響,或只稍微降低生物活性,端視聚乙二醇 化反應的程度而定,且 4. 可獲得較易溶於緩衝水溶液之產物(共軛體)。 本發明之另一項目的係提供幾近純化形式以作爲活性 成分適用於藥學組成物中的hGRF-PEG共軛體。 11 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
_ 0 n n an I n IV ϋ n >ϋ 1_ϋ ϋ I mw. A7 1254641 ______B7_____ 五、發明說明(丨ϋ ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在另一方面,本發明進而係提供本發明之共軛體來製 備可供治療、預防或診斷諸如生長激素不足(GHD),特別 是小兒生長激素不足這類型與生長激素相關病變之醫藥。 這類醫藥較好是以包含本發明共軛體及一或多種藥學 上可接受的載體和/或賦形劑之藥學組成物的形式存在。這 類藥學組成物也構成本發明之另一項方面。 本發明具體實施例之一乃是在有發展出與生長激素相 關疾病之虞或已經出現這類病徵之患者身上施用一藥學活 性量之本發明共軛體。 本發明更進一步的目的係關於治療、預防或診斷與生 長激素相關疾病之方法,包括在一或多種藥學上可接受之 賦形劑存在下施用一有效量之本發明共軛體。 “有效量”在此係指足以影響上述疾病之其病程及嚴重 程度,使病情得到減輕或緩解之活性成分量。有效量係視 施用途徑及患者情況而定。 “藥學上可接受”一詞涵蓋不會干渉活性成分的生物活 性效用且不會對所施用宿主造成毒害之任何載體。例如, 對非經腸胃道的施用途徑而言,可將上述活性成分製成配 方於媒液諸如生理食鹽水、右旋糖溶液、血淸白蛋白及林 格氏溶液(Ringer’s solution)內之可供注射的單一劑量形式 〇 除藥學上可接受之載體外,本發明組成物也可包括諸 如安定劑、賦形劑、緩衝液及防腐劑之類的微量添加物。 可使用任何符於活性原則的施用途徑。較好是採諸如 12 . 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 1254641 ______Β7___ 五、發明說明(ίί ) 皮下注射、肌肉注射或靜脈注射這類之非經腸胃道的途徑 。所施用活性成分之劑量視依患者年齡、體重及個人反應 所開設之醫藥處方而定。 用來治療人類的活性成分劑量介於每公斤體重5至 6,〇〇〇μ§間,且較好是介於每公斤體重1〇至300吨間。 以下將藉實施例來闡述本發明,但其敘述內容涵蓋習 知技藝人士在不悖離本發明申請專利範圍之意義及目的下 所有的修改或置換。 以下實施例僅爲闡述本發明之用,本發明並不因此而 受到限制。實施例中將會提及下列附圖。 凰式簡單說明 圖1顯示hGRF(l-29)-NH2之胺基酸序列。箭頭代表可 能發生聚乙二醇化反應的位置。 圖2顯示依實施例1所述方法在DMSO中進行之聚乙 二醇化反應中所得混合物之逆相-HPLC色層分析結果。前 兩個主要波峰爲每莫耳hGRF含1PEG鏈之共軛體所造成 的。接下來的小波峰爲hGRF : 2PEG共軛體所造成的,最 後一個小波峰爲hGRF : 3PEG共軛體所造成的。 圖3a顯示hGRF(l-29)及本發明PEG共軛體被枯草桿 菌蛋白酶降解的情形。 圖3b顯示hGRF(l-29)及本發明PEG共軛體被胰凝乳 蛋白酶降解的情形。 圖 4 顯示以環形二色法對[Lys(MPEG5,〇〇crCH2-CO-Nle-CO)12’21-hGRF(l-29)-NH2]所進行的光譜分析。該光譜可和” 13 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *裝 A7 1254641 ____B7___ 五、發明說明(/>) 天然”hGRF之光譜重疊。 圖5顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自DMSO之第一 次製備)在CHO-hGRFR-LUC體外分析試驗中之生物效用。 數據爲三次獨立試驗的平均値。 圖6顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自DMSO之第二 次製備)在CHO-hGRFR-LUC體外分析試驗中之生物效用。 數據爲兩次獨立試驗的平均値。 圖7顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自菸鹼醯胺製備) 在CHO-hGRFR-LUC體外分析試驗中之生物效用。數據爲 兩次獨立試驗的平均値。 圖8顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自DMSO之第一 次製備)在由老鼠腦下垂體細胞釋出GH之體外試驗中之生 物效用。 圖9顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自DMSO之第二 次製備)在由老鼠腦下垂體細胞釋出GH之體外試驗中之生 物效用。 圖10顯示雄鼠在靜脈注射hGRF(400pg/老鼠)後其血 漿中hGRF及血淸中GH量的時間-反應曲線。每一個數據 點爲9隻老鼠之平均値+標準偏差。 圖11A(參見該頁第一個圖形)顯示雄鼠在靜脈注射 4〇〇pg/每隻老鼠之hGRF-PEG共軛體(DMSO製備)後,其 血淸中GH量的時間-反應曲線。每一個數據點爲3隻老鼠 之平均値。 圖11B(參見該頁第二個圖形)顯示雄鼠在靜脈注射 14 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tA---I I I I I 訂-----I--- 9 A7 1254641 _______B7___ 五、發明說明(〇 ) 400pg/每隻老鼠之hGRF-PEG共軛體(DMSO製備)後,其 血漿中hGRF量的時間-反應曲線。每一個數據點爲3隻老 鼠之平均値。 圖12顯示用來評估GRF活性之基因分析中pcDNA3-hGRF-R質粒之限制酶圖。 圖13顯示用來評估GRF活性之基因分析中pTF5-53LUC質粒之限制酶圖。 實施例 縮寫 乙腈(ACN),烯丙氧羰基(Alloc),苄基(BZL),三級-丁氧羰基(Boc),二氯甲烷(DCM),二異丙乙胺(DIEA),二 甲基甲醯胺(DMF),二甲基亞楓(DMSO),9-氟甲氧羰基 (FMOC),2-[1Η-苯并三唑-1-基]-1,1,3,3·四甲基糖醛六氟磷 酸酯(HBTU),1-羥基苯并三唑(HOBt),甲基-三級丁基醚 (MTBE),正亮胺酸(Nle),N-甲基吡咯酮(NMP),2,2,5,7,8-五甲基-咯酸-6-硫醯基(Pmc),三級-丁基(tBu),三氟醋酸 (TFA),三苯甲基(Trt)。 置施例1 : hGRF之溶液相聚乙二醇化反應 在這些實驗中,單甲氧基化之PEG^a/MPEGMoo)係 以醯胺鍵接在正亮胺酸之α-胺基團上,並以琥珀醯亞胺酯 在其羧基團上被活化,並當作聚乙二醇化劑來使用。可依 Lu等人(Lu et al·,1994)所述方法來製備。 15 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
n n n e n n ai_l 1 I mw. A7 1254641 _._B7 _ 五、發明說明( 以購自Bachem公司之人類hGRF(l-29)-NH2作爲 hGRF 肽。 因hGRF( 1-29)在聚乙二醇化反應所需之中性或弱鹼 pH値下於水溶液中之溶解度相當低,因此採用了 A至E 之其他反應條件來進行反應。 A. 二甲基亞« :將20mg肽溶於1ml DMSO中並立即 加入適量之聚乙二醇化劑。 B, 二甲某甲醯胺/0.2M硼酸緩衝液pH8.0及體積比爲 1 ··肽及適量之聚乙二醇化劑立即加入。 1高濃縮菸鹼醯胺水溶液(200mg/ml):將200mg菸鹼 醯胺加入1毫升內含40mg hGRF(l-29)之10 mM醋酸溶液 中。在加入適量聚乙二醇化劑前,先加入1毫升pH8.0之 0.2M硼酸緩衝液至該酸性溶液中以達到欲之pH値。 乙腈/0.2M硼酸緩衝液PH8.0及體積比爲1 : 1,並 立即加入適量之聚乙二醇化劑。 硼酸緩衝液,5M尿η,並立即加入適 量之聚乙二醇化劑。 一邊攪拌一邊加入乾燥的PEG試劑,使PEG : hGRF 最終旲耳比例爲1:1、2:1或3:1。較好是2 : 1。 使用不同:PEG : hGRF莫耳比例可使大部分的反應混 合物製備爲所欲共軛體。 純化前讓反應溶液在室溫下靜置5小時。 16 本紙張尺度適用1國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐1 ------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^'Γ—----11 訂--------- A7 1254641 _____^_B7__ 五、發明說明(f ) 可得以下四種hGRF-PEG共轭體(A1-A4): (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Al : [Lys(MPEG5,〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(l-29)-NH2], A2 : [Lys(MPEG5,〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(l-29)-NH2], A3 ·· [Lys(MPEG5}〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)12>21-hGRF(l-29),NH2]及 A4:Na-(MPEG5,_-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5,_-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF(l-29)-NH2]。 藉由可去除1000D之薄膜以凝膠超過濾除去超過量的 DMSO、二甲基甲醯胺、乙腈或尿素及反應副產物(羥基琥 珀醯亞胺)。以10mM醋酸將體積稀釋至10毫升,之後再 濃縮至1毫升。重複此步驟3次。 以凝膠過濾色層分析或逆相色層分析分離出hGRF-PEG共軛體。 實施例2 :凝膠過濾色層分析 在凝膠過濾色層分析法中,產物係依其成分不同的分 子量來進行分餾(在此情況下,hGRF-PEG 1 : 1之分子量 =8,358,hGRF-PEG 1 : 2 之分子量=13,358,且 hGRF-PEG 1 : 3之分子量=18,358,未共軛的hGRF之分子量 =3358)。以10毫升醋酸,每分鐘1.5毫升之流速沖提一系 歹fj Superdex75-Superosel2 樹脂管柱系統(Biotech, 17 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 1254641 ____B7 _ 五、發明說明(β )
Pharmacia)來進行分離。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在280 nm下測定所收集1毫升分餾液的〇D値以決定 其蛋白質含量,並以碘試驗來測定PEG含量(Sims et a1·, 1980)° 使用hGRF : PEG之莫耳比例=1 ·· 1在DMSO中進行 完聚乙二醇化反應後,可獲得3個波峰: 在沖提液體積爲132毫升(主要波峰)時出現一個hGRF_PEG 共軛體; 在沖提液體積爲108毫升(次要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共軛體;及 在沖提液體積爲108毫升(次要波峰)時出現一個未共軛之 hGRF 〇 使用hGRF : PEG之莫耳比例=1 : 2在DMSO中進行 完聚乙二醇化反應後,可獲得3個波峰: 在沖提液體積爲1〇8毫升(主要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共軛體; 在沖提液體積爲132毫升(次要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共軛體;及 在沖提液體積爲73毫升(次要波峰)時出現一個hGRF_PEG 共軛體。 使用hGRF : PEG之莫耳比例=1 : 3在DMSO中進行 完聚乙二醇化反應後,可獲得2個波峰: 在沖提液體積爲73毫升(主要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共軛體;及 18 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公麓) A7 1254641 五、發明說明(/7) /
在沖提液體積爲108毫升(次要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共轭體。 收集波峰出現時之沖提液,使用可隔絕1000D之濾膜 以超過濾進行濃縮、冷凍乾燥後並溶於ΙΟπιΜ醋酸中’且 下在鑑別及定量時均使用此種形式。 已知在沖提液體積爲73毫升時出現的波峰係相當於 A4化合物。 已知在沖提液體積爲132毫升時出現的波峰係相當於 A3化合物。 已知在沖提液體積爲108毫升時出現的波峰係相當於 A2及A1化合物之混合物。 而於沖提液體積爲232毫升時出現的波峰係相當於未 共軛的hGRF。 但是,此種純化方法無法將分子量相同但聚乙二醇化 位置不同的hGRF-PEG共軛體分開(即位置異構物)。 實施例3 ··逆相色層分析 一種更專一性的分餾係以使用在RP-HPLC C18管柱的 疏水性色層分析來進行。此步驟可將相同分子量的異構物 加以分開。事實上,以此種方法,於凝膠過濾法中所得相 當於1個PEG共價結合之共軛體之單一波峰會分裂爲兩個 波峰。 逆相色層分析法係使用RP-HPLC C18製備管柱 (Vydac)進行,其以H20/0.05%TFA(A沖提液)及乙腈 19 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝
n n n n 一-口,· n ϋ ϋ n H ί n I mp. 1254641 A7 B7 五、發明說明(丨f) /=0.05%TFA(B沖提液)之溶液梯度進行沖提,如下述: 0-5分鐘 5-35分鐘 35-38分鐘 38-40分鐘
35%A 35%A~>2%A 2%A 2%A->35%A 流速:每分鐘1〇毫升;迴線Ιμΐ ; UV-Vis.偵測器, 係在280nm下進行偵測。 使用hGRF : PEG之莫耳比例μ : 1在DMSO中進行 聚Z :二醇化反應後 ,可獲得4個波峰: 1 13.2分鐘 主要波峰; 2 13.7分鐘 主要波峰; 3 14.4分鐘 次要波峰;及 4 8.9分鐘 次要波峰。 使用hGRF · PEG之旲耳比例y : 2在DMS〇中進行 聚乙二醇化反應後 ,可獲得4個波峰: 1 13.2分鐘 次要波峰; 2 13.7分鐘 次要波峰; 3 14.4分鐘 主要波峰;及 4 15.5分鐘 次要波峰。 使用hGRF : PEG之莫耳比例叫:3在DMS〇中進行 聚乙二醇化反應後 ,可獲得2個波峰: 1 14.4分鐘 次要波峰;及 2 15.5分鐘 主要波蜂。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 χ 297^^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --— II---訂--------
P A7 1254641 _____B7_ 一 五、發明說明(丨| ) 收集波峰出現時之沖提液,揮發並去除乙腈及TFA後 將其冷凍乾燥。將乾燥產物溶於10mM醋酸溶液中,且以 在鑑定及定量分離物種後在此所示之方式來分析。 已知在13.2分鐘被沖提出之hGRF-PEG共軛體係爲 A1化合物(GRF-1PEG,第1個波峰)。 已知在13.7分鐘被沖提出之hGRF-PEG共軛體係爲 A2化合物(GRF-1PEG,第2個波峰)。 已知在14.4分鐘被沖提出之hGRF-PEG共軛體係爲 A3 化合物(GRF-2PEG)。 已知在15.5分鐘被沖提出之hGRF-PEG共軛體係爲 A4 化合物(GRF-3PEG)。 於8.9分鐘出現之波峰係爲未共轭之hGRF。 在一典型實施例中,以PEG : hGRF莫耳比例爲2 : 1 所得聚乙二醇化產物之逆相色層分析結果如圖2所示。 藉由溶劑揮發/冷凍乾燥可得乾燥產物。 實施例3a :使用PEG1Q,QQQ所進行之hGRF的溶液相聚乙^ 醇化反應 在此實施例中所用的是分子量l〇,〇〇〇Da且以賴胺酸作 間隔序列之帶有支鏈的單甲氧基化PEG(由Shearwater Polymers,Inc所供應)。將每一賴胺酸之胺基團接上 PEGM(K)即可產生帶有支鏈的PEG。 作爲間隔序列之賴胺酸上的羧基,係以琥珀醯亞胺基 21 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I> 訂---------· 1254641 A7 ___ B7_ 五、發明說明(>〇) 酯的形式被活化,以0.9莫耳PEG比1莫耳grf之莫耳比 例於DMSO中與hGRF(l_29)-NH2之胺基團反應。 將溶劑移除並以排除式凝膠色層分析法在Superose 12 TM管柱中對殘餘物進行分餾,可沖提出相當於兩個 hGRF-PEG共軛體之兩個波峰。第一個次要波峰係相當於 具有結合於hGRF的兩個PEG1M(H)單元之共軛體,第二個 主要波峰係相當於每一個hGRF中含有一個PEGlM⑼之共 軛體。 實施例3a :使用PEG2q,qq〇所進行之hGRF的溶液相聚乙二 醇化反應 在此實施例中所用的是分子量20,000Da且以賴胺酸作 間隔序列之帶有支鏈的單甲氧基化PEG(由Shearwater Polymers,Inc 戶斤供應)。 將每一賴胺酸之胺基團接上PEG1MG()即可產生帶有支 鏈的PEG。 作爲間隔序列之賴胺酸上的羧基,係以琥珀醯亞胺基 酯的形式被活化,以〇·9莫耳PEG比1莫耳GRF之莫耳比 例於DMSO中與hGRF(l-29)-NH2之胺基團反應。 以冷凍乾燥法將溶劑移除並以排除式凝膠色層分析法 在Superose 12 TM管柱中對殘餘物進行分餾。可獲得相當 於每一個hGRF中含有一個PEG2〇,_單元之共軛體的單一 波峰。 22 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ϋ n n a n ϋ n ·ϋ ϋ n .費. A7 1254641 ____B7_ 五、發明說明(:>/ ) 實施例4 : hGRF-PEG共軛體之特件分析 以下列分析檢視前述所得產物結合之PEG鏈: 1. 以三硝基苯次磺酸鹽爲基礎的比色分析法來決定自 由胺基團數目(Habeed et al·,1966); 2. 以碘試驗爲基礎的比色分析法來決定所含PEG量(如 Sims et al·,1980 中所述); 3. 在胺基酸分析中以正亮胺酸當作提示鏈來決定PEG 鏈的數目(如Sartore et al·,1991中所述); 4. 以質譜儀來決定共軛體之分子量。 以MALDI質譜儀來決定共軛體之分子量及其之多分 散性,此乃係因起始物PEG之多分散性所致。 以胺基酸序列來評估hGRF-PEG共軛體之PEG連接位 置分析。將每一樣品稀釋1〇〇倍。之後將10 μΐ(約50 pmol)的溶液置入序列分析儀中。 以RP_HPLC色層分析來確認終產物的純度。 分析係在C18分析管柱(Vydac)中以H20/0.05%TFA(A 沖提液)及乙腈/=〇.〇5%tfa(b沖提液)之溶液梯度進行沖洗 ,如下述:
0-5 分鐘 80%A
5-50 分鐘 80%A—5%A
50-52 分鐘 5%A
52-54 分鐘 5%A—80%A 流速:每分鐘1毫升;迴線20μ1 ; UV-Vis·偵測器係 在226nm下進行偵測。 23 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · ϋ ϋ 1_1 in n i··— n 一-OJI a^i I n ϋ ϋ I 11 1 A7 1254641 ____._B7____ 五、發明說明()>) 未共軛之hGRF係在20.7分鐘時被洗提出。 化合物A1係在第22.9分鐘時被洗提出,化合物A2 係在第23.4分鐘時被洗提出,化合物A3係在第24.4分鐘 時被洗提出,而化合物A4則係在第25.5分鐘時被洗提出 〇 以環形二色分析法對天然物及結合聚合物之肽進行組 態分析。 未共軛之hGRF及hGRF-PEG共軛體之光譜分析係在 190-300nm範圍內以環形二色法進行分析。將樣品(50 pg/ml)溶於1〇 mM醋酸或莫耳比例爲30 : 70及60 : 40之 甲醇/10 mM醋酸溶液中。如圖4化合物A3所示,未共軛 之hGRF及hGRF-PEG共軛體在所有上述溶液中之光譜分 析結果均可彼此重疊。肽在醋酸溶液中呈隨機性組態,而 藉著增加甲醇量,該肽係被假設爲α-螺旋形結構。 此結果顯示PEG共軛體並不會大幅改變肽之結構。 實施例5 : hGRF-PEG共軛體之安定度評估 以諸如枯草桿菌蛋白酶及胰凝乳蛋白酶這類型之蛋白 水解酵素來檢測hGRF及hGRF-PEG共軛體對蛋白酶降解 之安定度。 以枯草桿菌蛋白酶所進行之硏究係藉著將具肽/蛋白酶 1 : 50,000 之莫耳比例之 〇.297mM 溶於 0.1M Tris HC1、 0.05MCaCl2、pH8.0之肽溶液在4它下培育。 在分析RP-HPLC之後以C18管柱於實施例4所述之 24 纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(21〇 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------· A7 1254641 ____B7 _ _ 五、發明說明())) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 相同條件下沖提來監測降解的情形,並計算與蛋白水解酵 素一同培育前及培育後預定時間之起始化合物的波峰高度 。估算出在預定時間出現之殘餘物波峰高度並將結果示於 圖3a及3b中。 實施例6 :使用烷化之PEG的聚乙二醇化反應 將hGRF與經過不同乙醯化基團及烷化基團活化之單 甲氧基化PEG共軛在一起。 烷化之PEG具有可產生保持賴胺酸殘基上正電荷之共 軛體的優點。 依實施例1-4所述進行分離及特性分析。 實施例7 :評佔hGRF-PEG共軛體夕活件 材料 測試化合物 人類 GRFuAGRFUdW,批號 1299201,由 Bachem 所供 應; 人類 GRF3_29hGRF(3-29),由 Bachem 所供應; 人類GRF3_29,由ISL所供應;及 依上述方法製備之hGRF-PEG共軛體。 試劑 CHO-hGRFR-LUC 體外分析 內含核糖核苷及去氧核糖核苷之ΜΕΜα培養基(Gibco),其 25 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 1254641 _i_B7___ 五、發明說明(乂p 中添加了 10%胎牛血淸(Gibco)及 600pg/ml之 geneticinG418 硫酸鹽(Gibco); (請先閱讀背面之注音?事項再填寫本頁) 細胞培養物溶解劑(Promega); 蟲螢光素酶分析試劑(Promega);及 Luclite(Packard) 〇 老鼠腦下垂體細胞體外生物活性分析試驗 爾氏之平衡鹽類(Earl’s Balanced Salts)(EBSS)(Gibco),添 加了 50 gg/ml之正大黴素硫酸鹽(Sigma) 內含爾氏鹽之199培養基,並添加了 12.5%胎牛血淸 (FBS)(Gibco)及5(^g/ml之正大黴素硫酸鹽。 由Amersham所提供之老鼠GH分析套組。 分解組織之酵素溶液(溶於30毫升之EBSS): 12〇毫克之膠原蛋白酶(Sigma) 3〇毫克之透明質酸酶(Sigma) 30毫克之去氧核糖核苷酶I(Sigma) 900 毫克之 BSA(Sigma) 重組後,將溶液過濾殺菌後置於37°C下。 體內生物活性分析試驗 由Amersham所提供之老鼠GH之放射性免疫分析套組。 由Phoenix Pharmaceutical所提供之人類GRF(l-44)之放射 性免疫分析套組。 26 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 1254641 _^_B7_ 五、發明說明 動物 經過至少7天適應期後,使用Charles River所提供, 體重在200-250克之SPF成年雄性Sprague-Dawley老鼠。 方法 CHO-hGRFR-LUC 蘑办分折 CHO-hGRFR-LUC (1-11-20株)是一種以無性生殖法產 生細胞株,其係藉由將PcDNA3-hGRF-R及PTF5-53 LUC· 載體一同轉移感染CHO-DUKX細胞株而得。 pcDNA3-hGRF-R質粒係藉由將人類生長激素釋出因子 受體(hGRF-R)之cDNA插入pcDNA3表現載體中而得。含 有hGRF-R cDNA的藍原本質粒係由維吉尼亞大學的蓋林 博士(Dr. B. Gaylinn)所提供,哺乳動物之pcDNA3表現載 體則係購自Invitrogen。hGRF-R密碼序列係由人類巨細胞 病毒(CMV)啓動子來啓動。圖12爲其之限制性斷片圖。 pTF5-53 LUC質粒則是藉由將c-fos cAMP反應元素及 其內源的啓動子一起插入poLuc質粒中蟲螢光素酶序列的 上游。cAMP反應元素及c-fos啓動子係來自pTF5-53質粒 中(如Fish等人所述,1989)。在蟲螢光素酶序列上游具有 多個可供基因轉殖位置、且無啓動子之通訊基因載體係由 德州大學(University of Texas,Galveston)的布賽爾博士(Dr· Brasier)所提供。圖13爲其之限制性斷片圖。 將依上述共同轉移感染方法所得之CH0-DUKX細胞 常規性的在ΜΕΜα培養基中進行培育,該培養基中含核糖 27 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-裝-Γ—--I---訂·-------I 黄. A7 1254641 ___B7__ 五、發明說明 核苷及去氧核糖核苷,並添加了 10%胎牛血淸及600叫仏1 之 geneticin G418 硫酸鹽。 將細胞培育在白色96個培養孔(每個培養孔中加入 40,000個細胞)之培養盤(Dynatech)中,並在進行實驗前以 200μ1的生長培養基培育16-18小時。 第二天,將培養基移除,並在37°C、5% C02的環境 下培育2小時之前以內含不同濃度之hGRF(l-29)參考標準 物(Bachem)或不同hGRF-PEG共軛體的培養基。培育終了 時,以200μ1的PBS(Sigma)淸洗每一個培養孔中的CHO-hGRFR-LUC細胞兩次,而後力口入50 μΐ的細胞培養物溶解 劑(Promega)將其溶解。在室溫下進一步培育15分鐘後, 加入150μ1蟲螢光素酶分析試劑(Promega)後以螢光儀 (Dynatech)來讀培養盤。 或者,在與不同的hGRF-PEG共軛體共同培育之最終 以每個培養孔50,000個細胞培育之CHO-hGRFR-LUC細胞 ,係如上述以PBS進行淸洗。於添加ΙΟΟμΙ Luclite (Packard)之前,先在每一個培養孔中加入100 μΐ內含鈣及 鎂離子的PBS溶液。經過室溫下10分鐘的培育後,以螢 光儀(Lumicount-Packard)來讀培養盤。 結果是以相對光度來表示。 老鼠腦下垂體細胞中hGRF(l-29)之體外生物分析 藉吸入C02來殺死動物(SPF之Sprague-Dawley雄鼠 ,體重200克)並取出其腦下垂體。將組織磨碎並放入含有 28 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1« I n n 1* — n 一一一0, · I n «ϋ ϋ 1 I n I 1254641 B7 五、發明說明) 可分解組織之酵素溶液的瓶中。將瓶子置於37°C培養箱中 1小時。 回收經消化的組織,且細胞淸洗兩次後計算所得細胞 數目,並調整細胞濃度至5xl05/毫升。將細胞培育在含48 個培養孔之培養盤中(每個培養孔加入200 μΐ的細胞溶液) 並將其置於培養箱中72小時。 經72小時培育後,再以不同濃度的hGRF培育4小時 。在培育終了時,收集其上淸液並儲存於-80°C下。 以市售老鼠GH之放射性免疫分析套組來分析每一個 樣品中GH的含量。 體內分析 經由靜脈對動物注射hGRF(l-29)(每隻老鼠400μ§)。 在採血前幾分鐘,先將動物麻醉(氯胺酮/xylazine)。每隻動 物都由後腔靜脈抽2毫升血。將樣品分成兩分:1毫升係 取血淸,先在37°C下培育約3小時而後離心而得;剩下的 1毫升係集入內含50 μΐ 4mg/ml肝素溶液的小管中,立即 放在冰上並在4°C下離心收集其血漿。 於不同動物體中注入測試化合物後,在不同時間點下 收集血液樣品。在每一個實驗之每一時間點上均用了三隻 老鼠。 立即將血漿及血淸樣品冷凍並儲存於-20°C下。 以市售之RIA套組來測定血淸中GH含量;並以市售 測定hGRF(l-44)之RIA套組來測定血漿中hGRF含量。 29 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐「 '' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϋ ϋ mlm ϋ n n 心 口,· n ϋ n n I n_i -¾. A7 1254641 __B7____ 五、發明說明) 結果 註:在這一整段文及相關附圖中,”GRF-1PEG之第 一個波峰”係相當於[Ly (MPEG5,_-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(l-29)-NH2],”GRF-1PEG之第二個波峰”係相當於 [Lys (MPEG5,00(rCH2_CO-Nle-CO)12-hGRF(l-29)-NH2] , ”GRF-2PEG” 係相當於[Lys (MPEG5,G〇()-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF(l-29)-NH2],且”GRF-3PEG”係相當於,-(MPEG5,〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5,〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF(l-29)-NH2]。 CHO-hGRFR-LUC 鐙必分折 以DMSO製備之兩批不同hGRF-PEG共軛體之活性在 CHO-hGRFR-LUC體外分析之結果分別示於圖5及圖6。 所有的製備物都具有活性,雖然其活性較”天然”的 hGRF(曾接受與用於聚乙二醇化之化合物同樣的純化步驟 處理)爲弱,其中GRF-1PEG(第一及第二波峰)較GRF-2PEG及GRF-3PEG更有活性。至於hGRF和”天然”hGRF 之活性則無差異(數據未示出)。 由DMSO所製備的兩種hGRF-PEG共軛體(圖5與圖 6)及由菸鹼醯胺溶液中製備之hGRF-PEG共軛體(圖7)觀察 到相似之體外生物活性。圖6也顯示相較hGRF(l-29),兩 種不同的hGRF(3-29)製備並未具有顯著的體外活性。 30 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n I n n n n 一一OJ ϋ I n Βϋ ϋ ϋ. n I · A7 1254641 _____Β7___ 五、發明說明〇|) 老鼠腦下垂體細胞中hGRF^之體外牛物分析 在兩個由DMSO製備物中所產生的hGRF-PEG共軛體 所進行之試驗中,GRF-1PEG之第一個波峰乃是最具活性 之化合物,其次是GRF-1PEG之第二個波峰,GRF-2PEG 及GRF-3PEG(圖8及圖9)。這些結果和通訊基因試驗中所 得的結果一致。 體內試驗 在先驅試驗中,以靜脈注射400pg hGRF至老鼠體內 後,測量其血淸中GH含量及血漿中hGRF之含量。其相 關結果示於圖1〇中。如圖所示,GH及hGRF的波峰均在 注射hGRF後10分鐘出現。其後,血淸中GH濃度會迅速 下降並在60分鐘後回到基礎値,而同一時間內血漿中 hGRF濃度則會維持在一恒定値。 在圖11A及11B中則示出經靜脈注射400μ§ GRF-1PEG之第一及第二波峰化合物、GRF-2PEG和GRF-3PEG(DMSO製備物)至老鼠體內後,在48小時內不同時間 點所量測到血液中GH及GRF之量。 所有的聚乙二醇化製備物,和hGRFi.29類似,其血淸 中GH波峰都會在靜脈注射後10分鐘出現。但是,GRF-1PEG之第一及第二波峰化合物及GRF-2PEG所引發的GH 波峰和hGRFN29所引發的類似,而GRF-3PEG則和體外試 驗中的結果一致,證明其活性較低。 31 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I n I n ϋ ϋ ϋ 一一OJ_ ·ϋ ϋ n 1« I ϋ n 1 · A7 1254641 一 —__B7 _ 五、發明說明) 至於血漿中的GRF濃度模式則大爲不同,無論是使用 那一種製備物〇)MSO製備物或菸鹼醯胺製備物),GRF-1PEG之第一及第二波峰化合物所引發的波峰均與GRF-2PEG和GRF-3PEG所引發的波峰類似。靜脈注射GRF-1PEG之第一及第二波峰化合物48小時後,血漿中GRF濃 度會回到基礎値,若是注射GRF-2PEG和GRF-3PEG,其 濃度則會維持較長的一段時間。 實施例8 :於固相下合成在特定位置具保護某團之 hGRFn-29VNH2衍生物作爲聚乙二醇化反應中的起始化合 於固相下合成內含在第12及第21位置之賴胺酸的一 級胺基上具特定保護基團(N-烯丙氧羰基團)之hGRF(l-29)二 NH2衍生物。此係爲了讓位置專一性的聚乙二醇化反應可 在Να-端上進行。另一個具胺基保護基團之衍生物乃是藉 由醯化作用將Να-端抑制且以Ν-烯丙氧羰基團保護賴胺酸 12來進行製備的。將此衍生物用於在賴胺酸21上所進行 的位置專一性的聚乙二醇化反應。 材料及方法 狀合成程序
所有的hGRF-肽樹脂起初都是以Fmoc化學法在應用 生物系統公司(Applied Biosystem Inc)所出產、型號431A 的肽合成儀上製備,並對每一殘基使用低取代的PAL- 32 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-n n H ϋ ammt I 一 · n n n 1· 1· ϋ I A7 1254641 ____B7 _ 五、發明說明(Y ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) PEG-PS樹脂(0.16 mmol/g)及一雙耦合自動加帽程序,使粗 產物之量及純度均能達到最大。此外,藉手動方式以還原 性的烷基化程序來處理[N-異丙基·TyrUyMAlloc)12]-hGRF(l-29)-NH2肽樹月旨,以在其N-端上力口上一個異丙基 團。 以TFA/1,2-乙烷二硫醇/硫代茴香醚/水[1〇 ·· 〇·5 : 〇.5 :〇.5(Wv)]之混合物來裂解所有的肽樹脂2小時,以 MTBE沉澱肽粗產物並離心。將肽粗產物冷凍乾燥並以逆 相HPLC梯度在Vydac C18管柱上以0.1〇/〇TFA/水/乙腈之 緩衝液系統來純化粗產物。以分析性逆相HPLC及 MALDI-TOF質譜儀來分析所純化之肽。 材料
Fomc_L-胺基酸(Bachem Bioscience,Perseptic Biosystems, NovaBiochem)、DMF、20 升的鼓輪(J.T. Baker)、六氫吡啶 (Applied Biosystems, Chem-Impex) 、 HBTU(Rainin, Pichelieu Biotechnologies)、NMM(Aldrich)、乙酉变 (Applied Biosystems)、樹月旨(Perseptic Biosystems, NovaBiochem)、a-氰基-4-經基-肉桂酸(Sigma)、芥酸 (Aldrich)、乙膳(J.T_ Baker)、TFA(Sigma,Pierce)、去離子 水(Millipore Milli-Q Water System)。其他的溶劑及試劑詳 列於下: 溶劑/試劑 供應商 NMP Applied Biosystems Inc.5 33 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 1254641 A7 B7
HBTU 0.5M HOBt 溶於 DMF 中 2.0 M DIEA 溶於 NMP 中 六氫毗啶 二氯甲烷 乙酸酑 五、發明說明(3工) J.T. Baker
Applied Biosystems Inc., Pichelieu Biotechnologies Inc.
Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc. 胺基酸:大部分用於ABI 431A肽合成儀上的FMOC 胺基酸均是以已稱好重量之1.0毫莫耳小匣的形式購自應 用生物系統公司(Applied Biosystem Inc)。FMOC-Lys(Alloc)-OH貝[]係以大包裝方式購自Perseptive Biosystems公司(Framingham,ΜΑ),並自行充塡於反應匣 室內。所使用的胺基酸均爲L-組態。 樹脂: 用於hGRF類似物之一級樹脂爲PAL-PEG-PS(連接肽 之胺基-聚乙二醇-聚苯乙烯)樹脂。PAL-PEG-PS支持物則 係購自Perseptive Biosystems公司,其無論在粗產物的純 度及產量上都表現出一致且優異的結果。在所有衍生物中 均使用了 〇·16 mmol/g之低取代樹脂。在比較長、且較困 難合成的序列上一般均會使用取代度較低的樹脂,以降低 立體障礙及在不斷增長的肽鏈上形成β-平板來確保較佳的 34 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 x 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϋ n n ϋ n n 一一OJ· n I n ϋ It I - 1254641 A7 __— B7__ 五、發明說明(乃) 耦合程度。 方法 鏈的形成-應用生物系統公司、型號431A的狀合成儀 帶有保護基團的肽鏈最初係以FMOC方法以應用生物 系統公司所出品、型號431A的肽合成儀來加以組成,此 儀器係採用已設定好的快速FMOC循環(FastMoc™)來進行 合成。以HBTU來進行活化及耦合反應,以20%的六氫[]比 啶來去除保護基,並以NMP爲其主要溶劑來去除保護基、 溶解胺基酸及淸洗樹脂。以事先稱好重量之1.0豪莫耳的 小匣來引入胺基酸。在0.25毫莫耳的FastMoc™循環中約 需1.0豪莫耳的小匣及40毫升的反應瓶。 形成鍵的程序 產量爲〇·25毫莫耳的設定循環步驟如下列: 1·以六氫吡啶來去除保護基團-先以ΝΜΡ淸洗樹脂 ,之後送入18%之六氫账[]定/ΝΜΡ溶液並進行去除保護基 反應3分鐘。將反應瓶排空後注入20%之六氫吡啶溶液並 持續去除保護基約8分鐘。 2·溶解胺基酸-在反應匣內加入ΝΜΡ(2·1克)及0.9 毫莫耳、0.45Μ的HBTU/HOBt之DMF(2.0克)溶液並混合 反應溶液6分鐘。 3. 以NMP進行淸洗-將反應瓶排空並以NMP淸洗 樹脂5次。 4. 將胺基酸活化並轉移至反應瓶(RV)中-將1毫升、 35 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注音?事項再填寫本頁)
-n ϋ 1 n ϋ n n I I ϋ n ϋ I n ϋ I $. 1254641 A7 ___;_B7___ 五、發明說明(3升} 2M之DIEA的NMP溶液加入匣中以便活化已溶出的胺基 酸,然後將其由匣中轉移至反應瓶(RV)。 5.耦合及最後的淸洗步驟-活化之胺基酸與已去除保 護基團之肽鏈-樹脂的N-端間的耦合反應將持續進行約20 分鐘,之後將RV排空並以NMP淸洗樹脂。 6·加帽作用(視需要與否而定)-將約12毫升、0.5M 的醋酸酐,0.125M的DIEA及0.015M之HOBt的NMP溶 液加到反應瓶中並搖盪混合約5分鐘。此將使樹脂上任何 未發生耦合反應的位置被乙醯化,導致切斷式序列而非移 除式序列的生成,此舉將使最後的純化步驟更爲簡單。 有關此循環完整的流程記載於應用生物系統公司所出 版、編號第35號的使用者手冊中(FastMoc™0.25 and 0.10 on the Model 43ΙΑ) 〇 一般典型分析之標準流程步驟 第1步:以DMF淸洗樹脂3次 第2步:以20%之六氫毗啶/ΝΜΡ溶液進行去保護基 反應2次 第3步:以DMF淸洗樹脂6次 第4步:以經HBTU/NMM之DMF溶液活化的胺基酸 進行耦合反應45分鐘 第5步:以DMF淸洗樹脂3次 對於較難合成的序列,可在耦合反應後插入一額外的 36 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -I I 1 I I I I ^ « — — — — — — I — A7 1254641 _____ B7_____ 五、發明說明(Κ) 加帽步驟,該步驟將會使用70%醋酸酐之DMF溶液反應 20分鐘以便將肽-樹脂鏈上所有未發生耦合的位置加以乙 醯化,使最終粗產物中出現切斷式序列而非移除式序列。 切斷/萃取 用來除去支鏈上的保護基團並將肽由樹脂中釋放出來 的組合切斷試劑乃是一種內含精胺酸和/或甲硫胺酸之肽專 用的標準混合物。對0.1-1.5克的肽-樹脂物而言,需10毫 升三氟醋酸、0.5毫升去離子水、〇.5毫升硫代茴香醚、〇.5 毫升乙烷二硫醇(87%三氟醋酸、4.3%去離子水、4.3%硫代 茴香醚、4.3%乙烷二硫醇)。 裂解產物 將1〇〇毫克-1克的肽-樹脂物置於20毫升玻璃瓶中 並以冰浴冷卻。將準備好的切斷試劑也置於冰浴中冷卻, 之後將其加入至肽-樹脂物中使終體積達到約10毫升左右 〇 將玻璃瓶由冰浴中移除並使其於室溫下緩緩回溫。將 玻璃瓶蓋好並在室溫下攪拌反應混合物2小時。 經過2小時後,以中等至粗糙孔隙的濾紙將溶液真空 過濾至體積約爲30毫升的冷ΜΤΒΕ中。以1毫升TFA淸 洗反應瓶並以同樣的過濾漏斗將其濾至冷的ΜΤΒΕ溶液中 。將整個懸浮液轉移至50毫升的離心管中並在室溫下以約 2000 rpm的轉速離心約10分鐘。將上淸液吸除,並將沉 37 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注音W事項再填寫本頁} 零裝--------訂-------- A7 1254641 ______B7___ 五、發明說明(%) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 澱重新懸浮於40毫升冰冷的MTBE溶液中再離心一次。 再重複此步驟一次。將最後一次的上淸液吸除,並通入氮 氣將沉澱中殘餘的醚揮發。 將肽溶於20-30毫升1%-1〇%之醋酸溶液中,以去離 子水將其稀釋至約100-150毫升,冷凍並噴霧乾燥。 純化 逆相HPLC法 系統一 Waters Delta Prep 4000 管柱-Vydac逆相C-18、ΙΟμπι、2_2x25公分(目錄編號: 218TP1022)
緩衝液-A :水/0.1%TFA B :乙腈/0.1%TFA 流速-15毫升/分鐘 偵測—Waters 484 UV detector,220 nm p 梯度-可變、通常是0.2% B/分鐘至1.0% B/分鐘 將50-100毫克的肽溶於200毫升0.1%TFA溶液中來 製備冷凍乾燥後的肽粗產物。之後將肽溶液經由”A”緩衝 液區直接載入管柱中並立即啓動梯度程序。 在自動化HPLC分析系統上隔夜收集各分餾部分。重 ^ 疊部分將波峰積分後若純度超過92%則將其收集在一起, 用去離子水以4 : 1的比例稀釋,冷凍後在Virtis 25 SL冷 凍乾燥儀上進行冷凍乾燥。 特性 38 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 x 297公釐) A7 1254641 ____B7___ 五、發明說明(7)
逆相HPLC 條件:
系統-Waters 510幫浦、717自動樣品儀、490多波長UV 偵測器 管柱-Vydac C-18、5μηι、0.46x25 公分(目錄編號: 218ΤΡ54)
緩衝液一 A :水/0_1%TFA B ··乙腈/0.1%TFA 流速-1毫升/分鐘 偵測一 UV : 214 nm,280 nm 梯度-2% B/分鐘 將0.2-1.0毫克的肽溶於0.1%TFA溶液使其濃度達 0.5-1.0毫克/毫升,來製備純化後冷凍乾燥的肽樣品。 將15-18μ1樣品注入管柱中並以25分鐘約0-50% ACN 的梯度程序將其由管柱中沖提出來。以Waters Expert-Ease 軟體系統來收集並儲存色層層析數據。 質譜分析 型式:MALDI-TOF(由基質輔助之雷射去吸附/游離時間) 系統:Perseptive Biosystems Voyager Elite 基質:α-氰基-4-羥基肉桂酸、10毫克/毫升在 67%ACN/0.1%TFA中或白芥酸中、10毫克/毫升 在 50%ACN/0.1%TFA 中 肽樣品係以1-20 μιηοΐ濃度在50%ACN/0.1%TFA、 0.5 μΐ之基質溶液中製備,接著將0.5 μΐ的肽樣品加到分 39 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 零裝 n an I n 一:^· I MM a··· I I MM 雷 $. 1254641 A7 --- - B7 _ 五、發明說明( 析盤孔中並讓其乾燥。將分析盤載入儀器中,以專門分析 肽之延緩反射萃取法來掃瞄並分析樣品。對每一樣品,均 收集累計32-128次雷射點的資料進行分析。每一次實驗中 均涵蓋了用來作校正計算的標準肽樣品。 專一性合成
Uy-S(All〇c)12’21l-hGRFil-7Q)-7<fH2 之製備 剛開始係以Fmoc化學法在應用生物系統431A肽合 成儀(梦見上述合成方法)上來合成[Lys (Alloc)12,21]-hGRF(l-29)-PAL-PEG-PS-樹脂,包括將 N-端之 Fmoc 殘基 去除。 以TFA : 1,2-乙烷二硫醇:硫代茴香醚:水[1〇 : 〇.5 : 〇·5 : 0·5(ν/ν)]之混合物作用2小時將肽由樹脂上切出,並 以ΜΤΒΕ將肽沉澱可得240毫克的狀粗產物。以Vydac C18管柱(22x250毫米)之逆相HPLC法來進行純化,可得 6〇毫克的純化產物(以HPLC分析其純度>95%)。MALDI-TOF質譜光譜:計算結果:3523.8,觀察結果:3524.2。 [Na-異丙某-Tw1 丄 vs(Alloc)12l-hGRF(l-29)-NHL 之製備 組合[Lys(All〇c)12]-hGRF(l-29)-PAL-PEG-PS-樹脂 剛開始係以Fmoc化學法在應用生物系統431A肽合 成儀(參見上述合成方法)上來合成[Lys(All〇c)12]-hGRF(l- 40 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
* I n n n em§ n n · 1« ϋ 1_1 n I IV n I p ΚΙ 1254641 ___Β7 _ 五、發明說明()f') 29)-PAL-PEG-PS-樹脂,包括將N_端之Fmoc殘基去除。 以還原性烷化反應進行Na-異丙基化 如Hocart等人(Hocart et al·,1987)所述以氰硼烷鈉及 相對之酮化物(丙酮)藉還原性烷化反應在肽樹脂上加上Να-異丙基。讓88〇毫克的肽樹脂(約70 μηιοί)在5毫升DCM 中膨脹約30分鐘,之後加入10毫莫耳(174 μΐ)溶於7毫升 甲醇/l%HOAc之丙酮溶液並在室溫下繼續攪拌混合物2小 時。加入2毫莫耳(129毫克)溶於12毫升甲醇/l%HOAc之 氰硼烷鈉溶液並繼續攪拌混合物2小時後靜置隔夜(15小 時)。由定量之水合郎三酮監測可知反應是否已達終點(無 藍色)。以TFA : 1,2-乙烷二硫醇:硫代茴香醚:水[1〇 : 0·5 : 0.5 : 0·5(ν/ν)]之混合物作用2小時將肽由樹脂上切出 ,並以ΜΤΒΕ將肽沉澱可得2〇0毫克的肽粗產物。以逆相 HPLC梯度沖堤法(溶劑爲水/乙腈/0.1%TFA)在Vydac C18 管柱(22x250毫米)來進行純化,可得50毫克的純化產物( 以HPLC分析其純度>95%)。MALDI-TOF質譜光譜:計算 結果:3481.9,觀察結果:3481.8。 1施例9 :具保護基團之hGRF(l-29)上的聚乙二醇化反應 將如實施例8所製備之hGRF衍生物與如實施例1和 6中活化的?£0共軛在一起。 41 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 馨 — — — — — — —
P 1254641 A7 ___B7___ 五、發明說明( 在此情況下其純化反應只需涉及將過多的反應試劑與 副產物分開,而無需進行如實施例2及3中所述的其他程 序。 參考文獻
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Claims (1)
1254641 A8B8C8D8 | 〆 f/I㈧ 广'.TV丨 六、申請專利範圍 1 · 一種內含一或多個與Lys12、Lys21和Να中至少一 者共價結合之PEG單元(對每一個hGRF而言)之hGRF-PEG共軛體之位置專一性製備方法,其包括在pH介於7 與9間之溶劑中,在溶液中進行hGRF肽與活性PEG間的 共軛反應,其中該溶劑係選自於高濃度菸鹼醯胺水溶液、 去折疊劑(如尿素)之緩衝水溶液或選自二甲基亞碾、二甲 基甲醯胺/緩衝液或乙腈/緩衝液之極性有機溶劑所組成之 群組,然後由反應混合物中分離並純化出所欲之hGRF-PEG共軛體。 2 ·如申請專利範圍第1項之方法,其中該溶液是菸 鹼醯胺之濃縮水溶液或是一種去折疊劑(defolding agent)之 緩衝水溶液。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法,其中該溶劑是一 種選自以下的極性有機溶劑:二甲基亞楓、二甲基甲醛/緩 衝溶液或乙腈/緩衝溶液。 4 ·如申請專利範圍第1項之方法,其中該hGRF-PEG共軛體係自反應混合物中分離出來並以色層分析法加 以純化。 5 ·如申請專利範圍第1-4項中任一項之方法,其中 該 hGRF 肽是 h-GRF〇29)-NH2。 6 ·如申請專利範圍第1項之方法,其中在共軛反應 發生前,hGRF肽係在Na、Lys12和Lys21等位置中的一或 多個位置受到保護。 7 ·如申請專利範圍第1或6項之方法,其進而包括 1 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 0^ 8 8 ABCD 1254641 六、申請專利範圍 _ 一個在共軛反應後的去保護基團反應。 8 ·如申請專利範圍第1-4和6項中任一項之方法, 其中g亥活性PEG是一種以單甲氧基化形式存在之院化或醯 化的PEG。 9 ·如申請專利範圍第5項之方法,其中該活性PEG 是一種以單甲氧基化形式存在之烷化或醯化的PEG。 10 ·如申請專利範圍第7項之方法,其中該活性PEG 是一種以單甲氧基化形式存在之烷化或醯化的PEG。 11 ·如申請專利範圍第1-4和6項中任一項之方法, 其中該共軛反應係於周圍溫度下進行。 12 ·如申請專利範圍第5項之方法,其中該共轭反應 係於周圍溫度下進行。 13 ·如申請專利範圍第7項之方法,其中該共軛反應 係於周圍溫度下進行。 14 ·如申請專利範圍第8項之方法,其中該共軛反應 係於周圍溫度下進行。 15 ·如申請專利範圍第9項之方法,其中該共軛反應 係於周圍溫度下進行。 16 ·如申請專利範圍第1〇項之方法,其中該共軛反 應係於周圍溫度下進行。 Π · —種根據申請專利範園第1項之方法所製備的內 含至少一個與LyS12、Lys 21和Να中至少一者共價結合之 PEG單元(對每一個hGRF而言)之hGRF-PEG共軛體。 18 ·如申請專利範圍第π項之hGRF-PEG共轭體, 2 張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X ~一 震S 1254641 六、申請專利範圍 其中1個PEG單元係共價結合在Lys 12上。 19 ·如申請專利範圍第17項之hGRF-PEG共軛體, 其中1個PEG單元係共價結合在Lys 21上。 20 ·如申請專利範圍_ 17項之hGRF-PEG共轭體, 其中在Lys 12和Lys 21每一者上各共價結合1個PEG單 元。 21 ·如申請專利範圍第17項之hGRF-PEG共軛體, 其中在Lys 12、Lys 21和,之每一者上各共價結合1個 PEG單元。 22 · —種[LysCAlloc/WiphGRF,其係申請專利範圍 第1項之共軛反應的中間物。 23 · —種[Να-異丙基、Tyri,Lys(Alloc)12]-hGRF,其係 申請專利範圍第1項之共鲍反應的中間物。 24 ·—種如申請專利範圍第17至21項之hGRF-PEG 共軛體作爲治療、預防或診斷與生長激素相關疾病之藥物 之用途。 25 ·如申請專利範圍第24項之用途,其係用來製備 一種可治療、預防或診斷與生長激素相關疾病的藥物。 26 ·如申請專利範圍第25項之用途,其係用來製備 —種可治療或診斷生長激素不足(〇1113)的藥物。 27 β 一種用於治療、預防或診斷與生長激素相關疾病 之藥學組成物,其包含申請專利範圍桌17至21項中任一 項所述之共軛體與一或多種藥學上可接受的載體和/或賦形 劑。 ---- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 x 29/公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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