TWI254641B - Solution-phase site-specific preparation of GRE-PEG conjugates, and composition of the conjugate - Google Patents
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Description
A7 1254641 __B7_ 五、發明說明（/ ) 發明領域 本發明係關於內含一或多個與Lys(賴胺酸）12和/或 Lys21和/或Να共價結合之PEG單元(對每一個hGRF而言) 之hGRF-PEG共軛體之位置專一性製備方法，其特徵在於 該hGRF肽與活性PEG間的共軛反應係在溶液中進行，並 以色層分析法來純化所欲之hGRF-PEG共軛體。 發明背景 在1980年代初期有數個實驗室分離出生長激素釋出 因子(GRF)並詳加描述其特徵。 GRF(又稱生長激素釋放因子(somatorelin))乃是由下視 丘所分泌的一種肽，能作用在其本身的受體上並促進腦下 垂體後葉釋出生長激素。其可以是具有44、40或37個氨 基酸之肽，其中含44個胺基酸形式之肽在生理情況下可被 轉變成較短的形式。所有三種不同長度的肽都具有活性， 且其活性主要是來自最前面的29個胺基酸殘基。在歐洲專 利申請案EP 105 759中描述了一段以重組DNA技術所製 備、相當於人類GRF之1-29個胺基酸序列[hGRF(l-29)]之 合成肽，又稱類生長激素釋放因子(sermorelin)。 曾以類生長激素釋放因子之乙酸鹽形式來診斷並治療 生長激素不足的現象。 GRF對某些與生長激素相關的疾病之治療上的確具有 療效。在生理情況下可藉由GRF刺激GH的釋出以促進長 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-|> n n 11 n I 一一 0，e An i I l§ n n amtw I A7 1254641 _____ B7____ 五、發明說明（：！） 骨生長及蛋白質之合成代謝。 GRF在使用上相關的一個問題，即其生物半衰期相當 短(約12至30分鐘）。hGRF(l-29)-NH2會被酵素降解，且 很快即會在血漿中被第IV型二肽基肽酶(DPP-IV)在Ala(丙 胺酸)2及Asp(天門冬胺酸)3殘基間切割而快速降解。 因此，將GRF經過特定化學性修飾，以開發出具生物 安定性之長效GRF類似物來預防或延緩其被酵素降解乃是 極具優勢的。 聚乙二醇(PEG)乃是一種親水性、生物可相容之無毒 聚合物，其可用H(OCH2CH2)nOH之通式表示，其中n-4 ，其分子量在200至20,000道耳吞(Daltons)之間。 已證實PEG以其單甲氧基化形式與蛋白質和/或肽之 化學共軛可顯著的增加其生物作用的持續時間。一如醣蛋 白上的碳水化物部分，PEG可提供一保護性外層並增加分 子體積，因此能減低其代謝降解及其腎臟被移除的速率。 由Davis及Abuchowski兩人所進行之先驅性基礎硏究 中’已知對傳送肽及蛋白質而言，PEG共軛體已是一項習 知的方法(Abuchowski et al·，1977a 及 1977b)。一般來說， PEG和肽或蛋白質的共軛會使PEG非專一性的化學性連接 在超過一個胺基酸殘基上。因此，此項技術的重點之一乃 是找到適當的化學方法，將PEG分子共價地共軛在特定的 胺基酸殘基上。 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -n I 1 Βϋ ϋ n 一OJ· I— «1 I ϋ n ϋ f A7 1254641 ___B7__ 五、發明說明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如，由三氯三吖畊活化之PEG，被發現其不僅有毒 且以非專一性方式反應，後來被各種具有能與胺基 (Benchamp et al.? 1983; Veronese et al.? 1985; Zalipsky et al.，1983; Zalipsky et al·, 1990; and Delgado et al·，1990)、 氫硫基（Sartore et al·，1991; and Morpurgo et al·，1996)或胍 基(Pande et al.，1980)產生專一性反應之化學連接子的PEG 反應試劑取代。 已知各種PEG-蛋白質共軛體都不會被蛋白質水解和/ 或具有降低的免疫原性（Monfardini et al·，1995; and Yamsuki et al.，1988) 0 另一項在蛋白質聚乙二醇化作用上的技術性問題，係 來自PEG-蛋白質共軛體通常都連接不同數目的PEG分子 ，且形成一種含不同PEG:蛋白質化學計量比例之共軛體 混合物。位置專一性的聚乙二醇化作用仍爲一項化學上的 挑戰。將PEG共軛於GH上代表了這類蛋白質中的典型實 例(Clark et al.，1996)。已證實軛合係發生在GH之任意賴 胺酸殘基位置上。 爲避免或降低酵素活性的喪失，可預先保護活性位置 ，使於非活性位置上進行酵素聚乙二醇化作用（Caliceti et al·，1993) 〇 最近提出另一種可將PEG共軛在以固相肽合成法製備 之諸如GRF這類低分子量肽上專一性位置的方法。在這些 共軛體中，將預先製備之聚乙二醇化胺基酸於固相合成時 引入肽序列中。但是，此程序會使產物純化步驟變得極複 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1254641 ____B7__ 五、發明說明（+ ) 雜，而已知產物純化步驟係固相合成反應的關鍵步驟。 PEG的存在，因其高分子量及多樣性，可能會使終產物中 出現讓人無法接受的不純物和/或產物中少了某些胺基酸， 後者在Merdfield程序中係極常見的現象。 最近文獻中曾提到單聚乙二醇化作用，亦即以固相合 成法將一個PEG分子連接到[Ala15]-hGRF(l-29)-NH2特定 之胺基酸殘基上(Felix et al·，1995)。此硏究顯示於第21或 25個殘基上被聚乙二醇化之[Ala15]-hGRF(l-29)-NH2可保 有其母分子[Ala15]-hGRF(l-29)-NH2之完整的體外活性。但 是，目前並未有體內數據顯示相較於非聚乙二醇化配對體 而言，這些聚乙二醇化共軛體可展現出較長的作用時間。 最近更有報導指出相較於相對非聚乙二醇化配對體而 言，在豬隻及老鼠動物模型系統中，同樣以固相合成法將 不同分子量之PEG接在數個hGRF類似物之C-端可延長其 作用期限。 發明說明 與上述單聚乙二醇化hGRF之固相製備方法相反的是 ，本發明係關於溶液相中hGRF之位置專一性聚乙二醇化 作用。 已知hGRF在其中最有效聚乙二醇化反應能發生的化 學條件之中性/鹼性緩衝溶液中的溶解度很低。在稀釋的 hGRF溶液中，活化之PEG(如PEG酯)的水解會降低聚乙 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裝·--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- 9.. A7 1254641 一― ___B7 _ 五、發明說明（5") 二醇化反應之產率。 本案申請人發現，在hGRF溶解度很高的適當溶劑中 ，可於溶液相中進行具位置專一性的聚乙二醇化反應。如 此，即使起始之hGRF肽並未加以保護，其PEG鏈絕大部 分都會只和Lys12、Lys21和/或Να之一級胺基團（£ -胺基團 )結合且產率相當高，視反應條件而定。下列所獲四種亦屬 本發明範疇中之共軛體，其共軛體中hGRF : PEG的化學 計量比例主要係視PEG與hGRF之莫耳比例而定。 hGRF-PEG共軛體，其中1個PEG分子係被共價結合 在Lys12上， hGRF-PEG共軛體，其中1個PEG分子係被共價結合 在Lys21上， hGRF-2PEG共軛體，其中2個PEG分子係被共價結 合在Lys12及Lys21上；且 hGRF-3PEG共軛體，其中3個PEG分子係被共價結 合在 Lys12、Lys21 及 Να上。 “Να”在本案整篇說明書中係代表肽Ν-端(Tyr )上之胺 基團。 接著可對反應中所得的共軛體進行簡單的色層分餾， 藉由凝膠過濾或直接將共軛體加到C18之HPLC管柱中以 水/乙腈梯度將其洗出。由於可獲得大量製備及純化產物， 因此較好是使用第二種方法。 因此，本發明主要具體實施例乃是內含一或多個與 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝
n n ϋ n^OJ· I n 1 ·1 1« —9 I f A7 1254641 _._B7___ 五、發明說明（‘） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Lys12和/或Lys21和/或Να共價結合之PEG單元(對每一個 hGRF而言)之不同hGRF-PEG共軛體之位置專一性製備方 法，其特徵在於該聚乙二醇化反應係在溶液中進行’並以 例如色層分析法來純化所欲求之hGRF-PEG共軛體。 內含一或多個與Lys12和/或Lys21和/或Να共價結合 之PEG單元(對每莫耳hGRF而言)之hGRF-PEG共軛體也 在本發明範疇內。其中1個PEG分子被共價結合在Lys12 或Lys21上之hGRF-PEG共軛體乃是本發明中較佳之產物 〇 依據本發明之另一具體實施例，如果這三個PEG鏈可 結合之胺基團中有一或多個基團受到特定化學基團之可逆 轉的保護而無法進行聚乙二醇化反應，則聚乙二醇化反應 就會在特定位置上進行，直接產生欲求的共軛體，稍後這 些共軛物可藉由諸如超過濾或其他色層分析法由反應混合 物中被分離出來。在這種情況下，製備法可進而選擇性地 包括一個去保護基團的反應。 去保護基團反應較好是依已知方法並視所欲移除之化 學保護基團來進行。 依據本發明，除非特別述明，”hGRF”一詞係包含任何 人類GRF肽，特別是含1-44、1-4〇、1-29個胺基酸的肽 及其相對之醯胺化合物(在N-端或C-端含一個醯胺基團）， 較佳之hGRF肽乃是hGRF(l-29)-NH2，其胺基酸序列如胺 基酸序列編號：1。 “活性PEG”(或”聚乙二醇化劑”)乃是可作爲蛋白質修 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1254641 五、發明說明（y ) 飾劑之任一 PEG衍生物，因其所含官能基能與蛋白質/肽 中的某些官能基團反應，產生PEG-蛋白質/肽共軛體。 Hairis(1985)曾詳細評論了能作爲蛋白質修飾劑之PEG衍 生物。活化之；PEG分子也可以是一種烷化劑，如PEG醛 、PEG環氧化物或PEG崔司化物(PEGtresylate)，或是其亦 可爲醯基化劑，如PEG酯。 活化之PEG較好是以單-甲氧基化的形式來使用。其 較佳之分子量範圍介於2,000至20,〇〇〇間。依據本發明， 單-甲氧基化之PEGlqoo特別適合用來製備活化之peg。 如果活化之PEG爲一種乙醯化劑，較好是內含一正亮 胺酸或鳥胺酸殘基並以醯胺基鍵結連接在PEG部分上。藉 著這些殘基可正確推算出每莫耳肽中鍵結了多少PEG單元 (參見Sartore et al·，1991)。因此，較佳之活化的PEG乃是 單-甲氧基化之PEG^ooo，並以醯胺鍵連接在正亮胺酸之心 胺基團上，且以琥珀醯亞胺酯在其羧基團上被活化。 帶有支鏈的PEGs也很常被使用。帶有支鏈的pEGs可 以R(-PEG-OH)m表示，其中R代表諸如季戊四醇或乙三醇 之中央核心部分，m代表支鏈數目。支鏈數目可以由3至 100或以上。羥基團則可被化學性修飾。
另一種支鏈形式，係如pct專利申請案W096/21469 中所描述的，具有能被化學性修飾的一端。此種型式的 PEG可以（CH3〇-PEG-)pR-X表不，其中p等於2或3，R 代表諸如賴胺酸或甘油之中央核心部分，且χ代表一可被 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）^ -- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)
· emmt ·ϋ I ϋ· n n ί · ϋ ·ϋ n n ϋ —ϋ I I mw. A7 1254641 ---___B7_____ 五、發明說明（$ ) 化學性活化諸如羧基的官能基團。另一種支鏈形式’“具 側基的PEG” ，在其PEG主鏈上而非PEG鏈末端，具有 諸如羧基這類具反應性的基團。 所有這類帶有支鏈的PEGS都可以如上述之法加以活 化。 “色層分析法”意指任一種藉由溶劑（移動相）流過支持 物（靜止相）上而將混合物之成分加以分開來的技術。色層 分析法分離物質的原則係基於移動相和靜止相間不同的物 理性質之故。 某些特定形式的色層分析法，乃是文獻中熟知的，包 括：液相、高壓液相、離子交換、吸附、親和力、分配、 親油、逆相、凝膠過滤、超過爐或薄層色層分析法。 “聚乙二醇化反應(pegylation)”係指由活性PEG和其相 對之蛋白質/肽反應生成PEG-蛋白質/肽共軛體之反應。 PEG : hGRF之莫耳比率可以是1 : 1、2 : 1或3 : 1， 視所欲產率較高之共軛體而定。 聚乙二醇化反應之溶劑可選自高濃度菸鹼醯胺水溶液 、去折疊劑（如尿素）之緩衝水溶液或選自二甲基亞碾、二 甲基甲醯胺/緩衝液或乙腈/緩衝液之極性有機溶劑中。 溶液之pH値一般均維持在7和9間。
Lys 12和Lys 21之化學保護基團的例子如下，但不限於 此：Alloc(烯丙氧羰基）、Dde(l-(4,4-二甲基_2,6-二氧環己- 10 V紙張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格（21Q x 297公餐1 一 ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-ϋ ϋ in n ·ϋ n n 一OJ> I* ϋ n 1 ϋ n mmmmf I 1254641 A7 B7 五、發明說明（1 ) 1-亞烯基）乙基）、Adpoc(l-(l’-金剛烷基)-1-甲基-乙氧羰基) 或2-Cl-Z(2-氯苄氧羰基）。對賴胺酸而言，較佳之保護基 團爲Alloc。 聚乙二醇化反應後，可依Greene T.W.等人（Greene T.W. et al.，1991)所述方法之一將Alloc移除。Dde則可以 2%於DMF聯胺之DMF溶液加以移除(W.C· Chan et al·， 1995)。Adpoc可以類似移除Alloc的方法進行移除⑺丨心？· et al.，1997)。2-C1-Z 則需藉強酸去保護（HF、TFMSA、 HBr)或氫化才可移除(Tam et al.，1987)。 Να的保護基團可以是諸如甲基、乙基、丙基、異丙基 、丁基、三級丁基、节基或環己基之院基團。較好是異丙 基。可藉還原性烷化作用將這些烷基團引入（Murphy et al.，1988 或 Hocart et al·，1987) 〇 [Να-異丙基-Tyr1， Lys(Alloc)12]-hGRF 及 [Lys(Alloc)12,21]-hGRF亦涵蓋在本發明範疇中，爲聚乙二 醇化反應中有用且新穎之中間物。 已知本發明之聚乙二醇化反應： 1. 不會改變肽本身的組態， 2. 會增加對蛋白酶降解反應之抵抗性， 3. 不會影響，或只稍微降低生物活性，端視聚乙二醇 化反應的程度而定，且 4. 可獲得較易溶於緩衝水溶液之產物(共軛體）。 本發明之另一項目的係提供幾近純化形式以作爲活性 成分適用於藥學組成物中的hGRF-PEG共軛體。 11 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
_ 0 n n an I n IV ϋ n >ϋ 1_ϋ ϋ I mw. A7 1254641 ______B7_____ 五、發明說明（丨ϋ ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在另一方面，本發明進而係提供本發明之共軛體來製 備可供治療、預防或診斷諸如生長激素不足(GHD)，特別 是小兒生長激素不足這類型與生長激素相關病變之醫藥。 這類醫藥較好是以包含本發明共軛體及一或多種藥學 上可接受的載體和/或賦形劑之藥學組成物的形式存在。這 類藥學組成物也構成本發明之另一項方面。 本發明具體實施例之一乃是在有發展出與生長激素相 關疾病之虞或已經出現這類病徵之患者身上施用一藥學活 性量之本發明共軛體。 本發明更進一步的目的係關於治療、預防或診斷與生 長激素相關疾病之方法，包括在一或多種藥學上可接受之 賦形劑存在下施用一有效量之本發明共軛體。 “有效量”在此係指足以影響上述疾病之其病程及嚴重 程度，使病情得到減輕或緩解之活性成分量。有效量係視 施用途徑及患者情況而定。 “藥學上可接受”一詞涵蓋不會干渉活性成分的生物活 性效用且不會對所施用宿主造成毒害之任何載體。例如， 對非經腸胃道的施用途徑而言，可將上述活性成分製成配 方於媒液諸如生理食鹽水、右旋糖溶液、血淸白蛋白及林 格氏溶液(Ringer’s solution)內之可供注射的單一劑量形式 〇 除藥學上可接受之載體外，本發明組成物也可包括諸 如安定劑、賦形劑、緩衝液及防腐劑之類的微量添加物。 可使用任何符於活性原則的施用途徑。較好是採諸如 12 . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1254641 ______Β7___ 五、發明說明（ίί ) 皮下注射、肌肉注射或靜脈注射這類之非經腸胃道的途徑 。所施用活性成分之劑量視依患者年齡、體重及個人反應 所開設之醫藥處方而定。 用來治療人類的活性成分劑量介於每公斤體重5至 6,〇〇〇μ§間，且較好是介於每公斤體重1〇至300吨間。 以下將藉實施例來闡述本發明，但其敘述內容涵蓋習 知技藝人士在不悖離本發明申請專利範圍之意義及目的下 所有的修改或置換。 以下實施例僅爲闡述本發明之用，本發明並不因此而 受到限制。實施例中將會提及下列附圖。 凰式簡單說明 圖1顯示hGRF(l-29)-NH2之胺基酸序列。箭頭代表可 能發生聚乙二醇化反應的位置。 圖2顯示依實施例1所述方法在DMSO中進行之聚乙 二醇化反應中所得混合物之逆相-HPLC色層分析結果。前 兩個主要波峰爲每莫耳hGRF含1PEG鏈之共軛體所造成 的。接下來的小波峰爲hGRF : 2PEG共軛體所造成的，最 後一個小波峰爲hGRF : 3PEG共軛體所造成的。 圖3a顯示hGRF(l-29)及本發明PEG共軛體被枯草桿 菌蛋白酶降解的情形。 圖3b顯示hGRF(l-29)及本發明PEG共軛體被胰凝乳 蛋白酶降解的情形。 圖 4 顯示以環形二色法對[Lys(MPEG5,〇〇crCH2-CO-Nle-CO)12’21-hGRF(l-29)-NH2]所進行的光譜分析。該光譜可和” 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *裝 A7 1254641 ____B7___ 五、發明說明（/>) 天然”hGRF之光譜重疊。 圖5顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自DMSO之第一 次製備)在CHO-hGRFR-LUC體外分析試驗中之生物效用。 數據爲三次獨立試驗的平均値。 圖6顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自DMSO之第二 次製備)在CHO-hGRFR-LUC體外分析試驗中之生物效用。 數據爲兩次獨立試驗的平均値。 圖7顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自菸鹼醯胺製備) 在CHO-hGRFR-LUC體外分析試驗中之生物效用。數據爲 兩次獨立試驗的平均値。 圖8顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自DMSO之第一 次製備)在由老鼠腦下垂體細胞釋出GH之體外試驗中之生 物效用。 圖9顯示各類hGRF-PEG共軛體(來自DMSO之第二 次製備)在由老鼠腦下垂體細胞釋出GH之體外試驗中之生 物效用。 圖10顯示雄鼠在靜脈注射hGRF(400pg/老鼠)後其血 漿中hGRF及血淸中GH量的時間-反應曲線。每一個數據 點爲9隻老鼠之平均値+標準偏差。 圖11A(參見該頁第一個圖形）顯示雄鼠在靜脈注射 4〇〇pg/每隻老鼠之hGRF-PEG共軛體(DMSO製備)後，其 血淸中GH量的時間-反應曲線。每一個數據點爲3隻老鼠 之平均値。 圖11B(參見該頁第二個圖形）顯示雄鼠在靜脈注射 14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tA---I I I I I 訂-----I--- 9 A7 1254641 _______B7___ 五、發明說明（〇 ) 400pg/每隻老鼠之hGRF-PEG共軛體(DMSO製備)後，其 血漿中hGRF量的時間-反應曲線。每一個數據點爲3隻老 鼠之平均値。 圖12顯示用來評估GRF活性之基因分析中pcDNA3-hGRF-R質粒之限制酶圖。 圖13顯示用來評估GRF活性之基因分析中pTF5-53LUC質粒之限制酶圖。 實施例 縮寫 乙腈(ACN)，烯丙氧羰基(Alloc)，苄基(BZL)，三級-丁氧羰基(Boc)，二氯甲烷(DCM)，二異丙乙胺(DIEA)，二 甲基甲醯胺（DMF)，二甲基亞楓(DMSO)，9-氟甲氧羰基 (FMOC)，2-[1Η-苯并三唑-1-基]-1，1，3,3·四甲基糖醛六氟磷 酸酯（HBTU)，1-羥基苯并三唑（HOBt)，甲基-三級丁基醚 (MTBE)，正亮胺酸(Nle)，N-甲基吡咯酮(NMP)，2,2,5,7,8-五甲基-咯酸-6-硫醯基(Pmc)，三級-丁基(tBu)，三氟醋酸 (TFA)，三苯甲基(Trt)。 置施例1 : hGRF之溶液相聚乙二醇化反應 在這些實驗中，單甲氧基化之PEG^a/MPEGMoo)係 以醯胺鍵接在正亮胺酸之α-胺基團上，並以琥珀醯亞胺酯 在其羧基團上被活化，並當作聚乙二醇化劑來使用。可依 Lu等人(Lu et al·，1994)所述方法來製備。 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
n n n e n n ai_l 1 I mw. A7 1254641 _._B7 _ 五、發明說明（ 以購自Bachem公司之人類hGRF(l-29)-NH2作爲 hGRF 肽。 因hGRF( 1-29)在聚乙二醇化反應所需之中性或弱鹼 pH値下於水溶液中之溶解度相當低，因此採用了 A至E 之其他反應條件來進行反應。 A. 二甲基亞« :將20mg肽溶於1ml DMSO中並立即 加入適量之聚乙二醇化劑。 B, 二甲某甲醯胺/0.2M硼酸緩衝液pH8.0及體積比爲 1 ··肽及適量之聚乙二醇化劑立即加入。 1高濃縮菸鹼醯胺水溶液(200mg/ml):將200mg菸鹼 醯胺加入1毫升內含40mg hGRF(l-29)之10 mM醋酸溶液 中。在加入適量聚乙二醇化劑前，先加入1毫升pH8.0之 0.2M硼酸緩衝液至該酸性溶液中以達到欲之pH値。 乙腈/0.2M硼酸緩衝液PH8.0及體積比爲1 : 1，並 立即加入適量之聚乙二醇化劑。 硼酸緩衝液，5M尿η，並立即加入適 量之聚乙二醇化劑。 一邊攪拌一邊加入乾燥的PEG試劑，使PEG : hGRF 最終旲耳比例爲1:1、2:1或3:1。較好是2 : 1。 使用不同：PEG : hGRF莫耳比例可使大部分的反應混 合物製備爲所欲共軛體。 純化前讓反應溶液在室溫下靜置5小時。 16 本紙張尺度適用1國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐1 ------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^'Γ—----11 訂--------- A7 1254641 _____^_B7__ 五、發明說明（f ) 可得以下四種hGRF-PEG共轭體(A1-A4): (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Al ： [Lys(MPEG5,〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(l-29)-NH2]， A2 ： [Lys(MPEG5,〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(l-29)-NH2]， A3 ·· [Lys(MPEG5}〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)12>21-hGRF(l-29)，NH2]及 A4:Na-(MPEG5，_-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5，_-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF(l-29)-NH2]。 藉由可去除1000D之薄膜以凝膠超過濾除去超過量的 DMSO、二甲基甲醯胺、乙腈或尿素及反應副產物(羥基琥 珀醯亞胺）。以10mM醋酸將體積稀釋至10毫升，之後再 濃縮至1毫升。重複此步驟3次。 以凝膠過濾色層分析或逆相色層分析分離出hGRF-PEG共軛體。 實施例2 :凝膠過濾色層分析 在凝膠過濾色層分析法中，產物係依其成分不同的分 子量來進行分餾(在此情況下，hGRF-PEG 1 : 1之分子量 =8,358，hGRF-PEG 1 : 2 之分子量=13,358，且 hGRF-PEG 1 : 3之分子量=18,358，未共軛的hGRF之分子量 =3358)。以10毫升醋酸，每分鐘1.5毫升之流速沖提一系 歹fj Superdex75-Superosel2 樹脂管柱系統（Biotech， 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1254641 ____B7 _ 五、發明說明（β )
Pharmacia)來進行分離。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在280 nm下測定所收集1毫升分餾液的〇D値以決定 其蛋白質含量，並以碘試驗來測定PEG含量（Sims et a1·， 1980)° 使用hGRF : PEG之莫耳比例=1 ·· 1在DMSO中進行 完聚乙二醇化反應後，可獲得3個波峰： 在沖提液體積爲132毫升(主要波峰)時出現一個hGRF_PEG 共軛體； 在沖提液體積爲108毫升(次要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共軛體；及 在沖提液體積爲108毫升(次要波峰)時出現一個未共軛之 hGRF 〇 使用hGRF : PEG之莫耳比例=1 : 2在DMSO中進行 完聚乙二醇化反應後，可獲得3個波峰： 在沖提液體積爲1〇8毫升(主要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共軛體； 在沖提液體積爲132毫升(次要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共軛體；及 在沖提液體積爲73毫升(次要波峰)時出現一個hGRF_PEG 共軛體。 使用hGRF : PEG之莫耳比例=1 : 3在DMSO中進行 完聚乙二醇化反應後，可獲得2個波峰： 在沖提液體積爲73毫升(主要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共軛體；及 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公麓） A7 1254641 五、發明說明（/7) /
在沖提液體積爲108毫升(次要波峰)時出現一個hGRF-PEG 共轭體。 收集波峰出現時之沖提液，使用可隔絕1000D之濾膜 以超過濾進行濃縮、冷凍乾燥後並溶於ΙΟπιΜ醋酸中’且 下在鑑別及定量時均使用此種形式。 已知在沖提液體積爲73毫升時出現的波峰係相當於 A4化合物。 已知在沖提液體積爲132毫升時出現的波峰係相當於 A3化合物。 已知在沖提液體積爲108毫升時出現的波峰係相當於 A2及A1化合物之混合物。 而於沖提液體積爲232毫升時出現的波峰係相當於未 共軛的hGRF。 但是，此種純化方法無法將分子量相同但聚乙二醇化 位置不同的hGRF-PEG共軛體分開(即位置異構物）。 實施例3 ··逆相色層分析 一種更專一性的分餾係以使用在RP-HPLC C18管柱的 疏水性色層分析來進行。此步驟可將相同分子量的異構物 加以分開。事實上，以此種方法，於凝膠過濾法中所得相 當於1個PEG共價結合之共軛體之單一波峰會分裂爲兩個 波峰。 逆相色層分析法係使用RP-HPLC C18製備管柱 (Vydac)進行，其以H20/0.05%TFA(A沖提液）及乙腈 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝
n n n n 一-口，· n ϋ ϋ n H ί n I mp. 1254641 A7 B7 五、發明說明（丨f) /=0.05%TFA(B沖提液)之溶液梯度進行沖提，如下述： 0-5分鐘 5-35分鐘 35-38分鐘 38-40分鐘
35%A 35%A~>2%A 2%A 2%A->35%A 流速：每分鐘1〇毫升；迴線Ιμΐ ; UV-Vis.偵測器， 係在280nm下進行偵測。 使用hGRF : PEG之莫耳比例μ : 1在DMSO中進行 聚Z :二醇化反應後 ，可獲得4個波峰： 1 13.2分鐘 主要波峰； 2 13.7分鐘 主要波峰； 3 14.4分鐘 次要波峰；及 4 8.9分鐘 次要波峰。 使用hGRF · PEG之旲耳比例y : 2在DMS〇中進行 聚乙二醇化反應後 ，可獲得4個波峰： 1 13.2分鐘 次要波峰； 2 13.7分鐘 次要波峰； 3 14.4分鐘 主要波峰；及 4 15.5分鐘 次要波峰。 使用hGRF : PEG之莫耳比例叫：3在DMS〇中進行 聚乙二醇化反應後 ，可獲得2個波峰： 1 14.4分鐘 次要波峰；及 2 15.5分鐘 主要波蜂。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297^^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --— II---訂--------
P A7 1254641 _____B7_ 一 五、發明說明（丨| ) 收集波峰出現時之沖提液，揮發並去除乙腈及TFA後 將其冷凍乾燥。將乾燥產物溶於10mM醋酸溶液中，且以 在鑑定及定量分離物種後在此所示之方式來分析。 已知在13.2分鐘被沖提出之hGRF-PEG共軛體係爲 A1化合物(GRF-1PEG，第1個波峰）。 已知在13.7分鐘被沖提出之hGRF-PEG共軛體係爲 A2化合物(GRF-1PEG，第2個波峰）。 已知在14.4分鐘被沖提出之hGRF-PEG共軛體係爲 A3 化合物(GRF-2PEG)。 已知在15.5分鐘被沖提出之hGRF-PEG共軛體係爲 A4 化合物(GRF-3PEG)。 於8.9分鐘出現之波峰係爲未共轭之hGRF。 在一典型實施例中，以PEG : hGRF莫耳比例爲2 : 1 所得聚乙二醇化產物之逆相色層分析結果如圖2所示。 藉由溶劑揮發/冷凍乾燥可得乾燥產物。 實施例3a :使用PEG1Q，QQQ所進行之hGRF的溶液相聚乙^ 醇化反應 在此實施例中所用的是分子量l〇,〇〇〇Da且以賴胺酸作 間隔序列之帶有支鏈的單甲氧基化PEG(由Shearwater Polymers，Inc所供應）。將每一賴胺酸之胺基團接上 PEGM(K)即可產生帶有支鏈的PEG。 作爲間隔序列之賴胺酸上的羧基，係以琥珀醯亞胺基 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I> 訂---------· 1254641 A7 ___ B7_ 五、發明說明（>〇) 酯的形式被活化，以0.9莫耳PEG比1莫耳grf之莫耳比 例於DMSO中與hGRF(l_29)-NH2之胺基團反應。 將溶劑移除並以排除式凝膠色層分析法在Superose 12 TM管柱中對殘餘物進行分餾，可沖提出相當於兩個 hGRF-PEG共軛體之兩個波峰。第一個次要波峰係相當於 具有結合於hGRF的兩個PEG1M(H)單元之共軛體，第二個 主要波峰係相當於每一個hGRF中含有一個PEGlM⑼之共 軛體。 實施例3a :使用PEG2q,qq〇所進行之hGRF的溶液相聚乙二 醇化反應 在此實施例中所用的是分子量20,000Da且以賴胺酸作 間隔序列之帶有支鏈的單甲氧基化PEG(由Shearwater Polymers，Inc 戶斤供應）。 將每一賴胺酸之胺基團接上PEG1MG()即可產生帶有支 鏈的PEG。 作爲間隔序列之賴胺酸上的羧基，係以琥珀醯亞胺基 酯的形式被活化，以〇·9莫耳PEG比1莫耳GRF之莫耳比 例於DMSO中與hGRF(l-29)-NH2之胺基團反應。 以冷凍乾燥法將溶劑移除並以排除式凝膠色層分析法 在Superose 12 TM管柱中對殘餘物進行分餾。可獲得相當 於每一個hGRF中含有一個PEG2〇，_單元之共軛體的單一 波峰。 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ϋ n n a n ϋ n ·ϋ ϋ n .費. A7 1254641 ____B7_ 五、發明說明（：>/ ) 實施例4 : hGRF-PEG共軛體之特件分析 以下列分析檢視前述所得產物結合之PEG鏈： 1. 以三硝基苯次磺酸鹽爲基礎的比色分析法來決定自 由胺基團數目（Habeed et al·，1966); 2. 以碘試驗爲基礎的比色分析法來決定所含PEG量(如 Sims et al·，1980 中所述）； 3. 在胺基酸分析中以正亮胺酸當作提示鏈來決定PEG 鏈的數目（如Sartore et al·，1991中所述）； 4. 以質譜儀來決定共軛體之分子量。 以MALDI質譜儀來決定共軛體之分子量及其之多分 散性，此乃係因起始物PEG之多分散性所致。 以胺基酸序列來評估hGRF-PEG共軛體之PEG連接位 置分析。將每一樣品稀釋1〇〇倍。之後將10 μΐ(約50 pmol)的溶液置入序列分析儀中。 以RP_HPLC色層分析來確認終產物的純度。 分析係在C18分析管柱(Vydac)中以H20/0.05%TFA(A 沖提液)及乙腈/=〇.〇5%tfa(b沖提液)之溶液梯度進行沖洗 ，如下述：
0-5 分鐘 80%A
5-50 分鐘 80%A—5%A
50-52 分鐘 5%A
52-54 分鐘 5%A—80%A 流速：每分鐘1毫升；迴線20μ1 ; UV-Vis·偵測器係 在226nm下進行偵測。 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · ϋ ϋ 1_1 in n i··— n 一-OJI a^i I n ϋ ϋ I 11 1 A7 1254641 ____._B7____ 五、發明說明（）>) 未共軛之hGRF係在20.7分鐘時被洗提出。 化合物A1係在第22.9分鐘時被洗提出，化合物A2 係在第23.4分鐘時被洗提出，化合物A3係在第24.4分鐘 時被洗提出，而化合物A4則係在第25.5分鐘時被洗提出 〇 以環形二色分析法對天然物及結合聚合物之肽進行組 態分析。 未共軛之hGRF及hGRF-PEG共軛體之光譜分析係在 190-300nm範圍內以環形二色法進行分析。將樣品（50 pg/ml)溶於1〇 mM醋酸或莫耳比例爲30 : 70及60 : 40之 甲醇/10 mM醋酸溶液中。如圖4化合物A3所示，未共軛 之hGRF及hGRF-PEG共軛體在所有上述溶液中之光譜分 析結果均可彼此重疊。肽在醋酸溶液中呈隨機性組態，而 藉著增加甲醇量，該肽係被假設爲α-螺旋形結構。 此結果顯示PEG共軛體並不會大幅改變肽之結構。 實施例5 : hGRF-PEG共軛體之安定度評估 以諸如枯草桿菌蛋白酶及胰凝乳蛋白酶這類型之蛋白 水解酵素來檢測hGRF及hGRF-PEG共軛體對蛋白酶降解 之安定度。 以枯草桿菌蛋白酶所進行之硏究係藉著將具肽/蛋白酶 1 : 50,000 之莫耳比例之 〇.297mM 溶於 0.1M Tris HC1、 0.05MCaCl2、pH8.0之肽溶液在4它下培育。 在分析RP-HPLC之後以C18管柱於實施例4所述之 24 纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------· A7 1254641 ____B7 _ _ 五、發明說明（）)） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 相同條件下沖提來監測降解的情形，並計算與蛋白水解酵 素一同培育前及培育後預定時間之起始化合物的波峰高度 。估算出在預定時間出現之殘餘物波峰高度並將結果示於 圖3a及3b中。 實施例6 :使用烷化之PEG的聚乙二醇化反應 將hGRF與經過不同乙醯化基團及烷化基團活化之單 甲氧基化PEG共軛在一起。 烷化之PEG具有可產生保持賴胺酸殘基上正電荷之共 軛體的優點。 依實施例1-4所述進行分離及特性分析。 實施例7 :評佔hGRF-PEG共軛體夕活件 材料 測試化合物 人類 GRFuAGRFUdW，批號 1299201，由 Bachem 所供 應； 人類 GRF3_29hGRF(3-29)，由 Bachem 所供應； 人類GRF3_29，由ISL所供應；及 依上述方法製備之hGRF-PEG共軛體。 試劑 CHO-hGRFR-LUC 體外分析 內含核糖核苷及去氧核糖核苷之ΜΕΜα培養基(Gibco)，其 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1254641 _i_B7___ 五、發明說明（乂p 中添加了 10%胎牛血淸（Gibco)及 600pg/ml之 geneticinG418 硫酸鹽(Gibco); (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 細胞培養物溶解劑(Promega); 蟲螢光素酶分析試劑(Promega);及 Luclite(Packard) 〇 老鼠腦下垂體細胞體外生物活性分析試驗 爾氏之平衡鹽類（Earl’s Balanced Salts)(EBSS)(Gibco)，添 加了 50 gg/ml之正大黴素硫酸鹽(Sigma) 內含爾氏鹽之199培養基，並添加了 12.5%胎牛血淸 (FBS)(Gibco)及5(^g/ml之正大黴素硫酸鹽。 由Amersham所提供之老鼠GH分析套組。 分解組織之酵素溶液(溶於30毫升之EBSS): 12〇毫克之膠原蛋白酶(Sigma) 3〇毫克之透明質酸酶(Sigma) 30毫克之去氧核糖核苷酶I(Sigma) 900 毫克之 BSA(Sigma) 重組後，將溶液過濾殺菌後置於37°C下。 體內生物活性分析試驗 由Amersham所提供之老鼠GH之放射性免疫分析套組。 由Phoenix Pharmaceutical所提供之人類GRF(l-44)之放射 性免疫分析套組。 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1254641 _^_B7_ 五、發明說明 動物 經過至少7天適應期後，使用Charles River所提供， 體重在200-250克之SPF成年雄性Sprague-Dawley老鼠。 方法 CHO-hGRFR-LUC 蘑办分折 CHO-hGRFR-LUC (1-11-20株)是一種以無性生殖法產 生細胞株，其係藉由將PcDNA3-hGRF-R及PTF5-53 LUC· 載體一同轉移感染CHO-DUKX細胞株而得。 pcDNA3-hGRF-R質粒係藉由將人類生長激素釋出因子 受體(hGRF-R)之cDNA插入pcDNA3表現載體中而得。含 有hGRF-R cDNA的藍原本質粒係由維吉尼亞大學的蓋林 博士(Dr. B. Gaylinn)所提供，哺乳動物之pcDNA3表現載 體則係購自Invitrogen。hGRF-R密碼序列係由人類巨細胞 病毒(CMV)啓動子來啓動。圖12爲其之限制性斷片圖。 pTF5-53 LUC質粒則是藉由將c-fos cAMP反應元素及 其內源的啓動子一起插入poLuc質粒中蟲螢光素酶序列的 上游。cAMP反應元素及c-fos啓動子係來自pTF5-53質粒 中（如Fish等人所述，1989)。在蟲螢光素酶序列上游具有 多個可供基因轉殖位置、且無啓動子之通訊基因載體係由 德州大學(University of Texas，Galveston)的布賽爾博士(Dr· Brasier)所提供。圖13爲其之限制性斷片圖。 將依上述共同轉移感染方法所得之CH0-DUKX細胞 常規性的在ΜΕΜα培養基中進行培育，該培養基中含核糖 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-裝-Γ—--I---訂·-------I 黄. A7 1254641 ___B7__ 五、發明說明 核苷及去氧核糖核苷，並添加了 10%胎牛血淸及600叫仏1 之 geneticin G418 硫酸鹽。 將細胞培育在白色96個培養孔（每個培養孔中加入 40,000個細胞)之培養盤(Dynatech)中，並在進行實驗前以 200μ1的生長培養基培育16-18小時。 第二天，將培養基移除，並在37°C、5% C02的環境 下培育2小時之前以內含不同濃度之hGRF(l-29)參考標準 物(Bachem)或不同hGRF-PEG共軛體的培養基。培育終了 時，以200μ1的PBS(Sigma)淸洗每一個培養孔中的CHO-hGRFR-LUC細胞兩次，而後力口入50 μΐ的細胞培養物溶解 劑(Promega)將其溶解。在室溫下進一步培育15分鐘後， 加入150μ1蟲螢光素酶分析試劑（Promega)後以螢光儀 (Dynatech)來讀培養盤。 或者，在與不同的hGRF-PEG共軛體共同培育之最終 以每個培養孔50,000個細胞培育之CHO-hGRFR-LUC細胞 ，係如上述以PBS進行淸洗。於添加ΙΟΟμΙ Luclite (Packard)之前，先在每一個培養孔中加入100 μΐ內含鈣及 鎂離子的PBS溶液。經過室溫下10分鐘的培育後，以螢 光儀(Lumicount-Packard)來讀培養盤。 結果是以相對光度來表示。 老鼠腦下垂體細胞中hGRF(l-29)之體外生物分析 藉吸入C02來殺死動物（SPF之Sprague-Dawley雄鼠 ，體重200克)並取出其腦下垂體。將組織磨碎並放入含有 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1« I n n 1* — n 一一一0, · I n «ϋ ϋ 1 I n I 1254641 B7 五、發明說明) 可分解組織之酵素溶液的瓶中。將瓶子置於37°C培養箱中 1小時。 回收經消化的組織，且細胞淸洗兩次後計算所得細胞 數目，並調整細胞濃度至5xl05/毫升。將細胞培育在含48 個培養孔之培養盤中（每個培養孔加入200 μΐ的細胞溶液) 並將其置於培養箱中72小時。 經72小時培育後，再以不同濃度的hGRF培育4小時 。在培育終了時，收集其上淸液並儲存於-80°C下。 以市售老鼠GH之放射性免疫分析套組來分析每一個 樣品中GH的含量。 體內分析 經由靜脈對動物注射hGRF(l-29)(每隻老鼠400μ§)。 在採血前幾分鐘，先將動物麻醉(氯胺酮/xylazine)。每隻動 物都由後腔靜脈抽2毫升血。將樣品分成兩分：1毫升係 取血淸，先在37°C下培育約3小時而後離心而得；剩下的 1毫升係集入內含50 μΐ 4mg/ml肝素溶液的小管中，立即 放在冰上並在4°C下離心收集其血漿。 於不同動物體中注入測試化合物後，在不同時間點下 收集血液樣品。在每一個實驗之每一時間點上均用了三隻 老鼠。 立即將血漿及血淸樣品冷凍並儲存於-20°C下。 以市售之RIA套組來測定血淸中GH含量；並以市售 測定hGRF(l-44)之RIA套組來測定血漿中hGRF含量。 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐「 '' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϋ ϋ mlm ϋ n n 心 口，· n ϋ n n I n_i -¾. A7 1254641 __B7____ 五、發明說明) 結果 註：在這一整段文及相關附圖中，”GRF-1PEG之第 一個波峰”係相當於[Ly (MPEG5，_-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(l-29)-NH2]，”GRF-1PEG之第二個波峰”係相當於 [Lys (MPEG5,00(rCH2_CO-Nle-CO)12-hGRF(l-29)-NH2] ， ”GRF-2PEG” 係相當於[Lys (MPEG5，G〇()-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF(l-29)-NH2]，且”GRF-3PEG”係相當於，-(MPEG5,〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5,〇〇〇-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF(l-29)-NH2]。 CHO-hGRFR-LUC 鐙必分折 以DMSO製備之兩批不同hGRF-PEG共軛體之活性在 CHO-hGRFR-LUC體外分析之結果分別示於圖5及圖6。 所有的製備物都具有活性，雖然其活性較”天然”的 hGRF(曾接受與用於聚乙二醇化之化合物同樣的純化步驟 處理）爲弱，其中GRF-1PEG(第一及第二波峰）較GRF-2PEG及GRF-3PEG更有活性。至於hGRF和”天然”hGRF 之活性則無差異(數據未示出）。 由DMSO所製備的兩種hGRF-PEG共軛體(圖5與圖 6)及由菸鹼醯胺溶液中製備之hGRF-PEG共軛體(圖7)觀察 到相似之體外生物活性。圖6也顯示相較hGRF(l-29)，兩 種不同的hGRF(3-29)製備並未具有顯著的體外活性。 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n I n n n n 一一OJ ϋ I n Βϋ ϋ ϋ. n I · A7 1254641 _____Β7___ 五、發明說明〇|) 老鼠腦下垂體細胞中hGRF^之體外牛物分析 在兩個由DMSO製備物中所產生的hGRF-PEG共軛體 所進行之試驗中，GRF-1PEG之第一個波峰乃是最具活性 之化合物，其次是GRF-1PEG之第二個波峰，GRF-2PEG 及GRF-3PEG(圖8及圖9)。這些結果和通訊基因試驗中所 得的結果一致。 體內試驗 在先驅試驗中，以靜脈注射400pg hGRF至老鼠體內 後，測量其血淸中GH含量及血漿中hGRF之含量。其相 關結果示於圖1〇中。如圖所示，GH及hGRF的波峰均在 注射hGRF後10分鐘出現。其後，血淸中GH濃度會迅速 下降並在60分鐘後回到基礎値，而同一時間內血漿中 hGRF濃度則會維持在一恒定値。 在圖11A及11B中則示出經靜脈注射400μ§ GRF-1PEG之第一及第二波峰化合物、GRF-2PEG和GRF-3PEG(DMSO製備物)至老鼠體內後，在48小時內不同時間 點所量測到血液中GH及GRF之量。 所有的聚乙二醇化製備物，和hGRFi.29類似，其血淸 中GH波峰都會在靜脈注射後10分鐘出現。但是，GRF-1PEG之第一及第二波峰化合物及GRF-2PEG所引發的GH 波峰和hGRFN29所引發的類似，而GRF-3PEG則和體外試 驗中的結果一致，證明其活性較低。 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I n I n ϋ ϋ ϋ 一一OJ_ ·ϋ ϋ n 1« I ϋ n 1 · A7 1254641 一 —__B7 _ 五、發明說明) 至於血漿中的GRF濃度模式則大爲不同，無論是使用 那一種製備物〇)MSO製備物或菸鹼醯胺製備物），GRF-1PEG之第一及第二波峰化合物所引發的波峰均與GRF-2PEG和GRF-3PEG所引發的波峰類似。靜脈注射GRF-1PEG之第一及第二波峰化合物48小時後，血漿中GRF濃 度會回到基礎値，若是注射GRF-2PEG和GRF-3PEG，其 濃度則會維持較長的一段時間。 實施例8 :於固相下合成在特定位置具保護某團之 hGRFn-29VNH2衍生物作爲聚乙二醇化反應中的起始化合 於固相下合成內含在第12及第21位置之賴胺酸的一 級胺基上具特定保護基團(N-烯丙氧羰基團）之hGRF(l-29)二 NH2衍生物。此係爲了讓位置專一性的聚乙二醇化反應可 在Να-端上進行。另一個具胺基保護基團之衍生物乃是藉 由醯化作用將Να-端抑制且以Ν-烯丙氧羰基團保護賴胺酸 12來進行製備的。將此衍生物用於在賴胺酸21上所進行 的位置專一性的聚乙二醇化反應。 材料及方法 狀合成程序
所有的hGRF-肽樹脂起初都是以Fmoc化學法在應用 生物系統公司（Applied Biosystem Inc)所出產、型號431A 的肽合成儀上製備，並對每一殘基使用低取代的PAL- 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-n n H ϋ ammt I 一 · n n n 1· 1· ϋ I A7 1254641 ____B7 _ 五、發明說明（Y ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) PEG-PS樹脂(0.16 mmol/g)及一雙耦合自動加帽程序，使粗 產物之量及純度均能達到最大。此外，藉手動方式以還原 性的烷基化程序來處理[N-異丙基·TyrUyMAlloc)12]-hGRF(l-29)-NH2肽樹月旨，以在其N-端上力口上一個異丙基 團。 以TFA/1，2-乙烷二硫醇/硫代茴香醚/水[1〇 ·· 〇·5 : 〇.5 :〇.5(Wv)]之混合物來裂解所有的肽樹脂2小時，以 MTBE沉澱肽粗產物並離心。將肽粗產物冷凍乾燥並以逆 相HPLC梯度在Vydac C18管柱上以0.1〇/〇TFA/水/乙腈之 緩衝液系統來純化粗產物。以分析性逆相HPLC及 MALDI-TOF質譜儀來分析所純化之肽。 材料
Fomc_L-胺基酸（Bachem Bioscience，Perseptic Biosystems， NovaBiochem)、DMF、20 升的鼓輪(J.T. Baker)、六氫吡啶 (Applied Biosystems, Chem-Impex) 、 HBTU(Rainin， Pichelieu Biotechnologies)、NMM(Aldrich)、乙酉变 (Applied Biosystems)、樹月旨（Perseptic Biosystems, NovaBiochem)、a-氰基-4-經基-肉桂酸（Sigma)、芥酸 (Aldrich)、乙膳(J.T_ Baker)、TFA(Sigma，Pierce)、去離子 水（Millipore Milli-Q Water System)。其他的溶劑及試劑詳 列於下： 溶劑/試劑 供應商 NMP Applied Biosystems Inc.5 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1254641 A7 B7
HBTU 0.5M HOBt 溶於 DMF 中 2.0 M DIEA 溶於 NMP 中 六氫毗啶 二氯甲烷 乙酸酑 五、發明說明（3工） J.T. Baker
Applied Biosystems Inc.， Pichelieu Biotechnologies Inc.
Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc. 胺基酸：大部分用於ABI 431A肽合成儀上的FMOC 胺基酸均是以已稱好重量之1.0毫莫耳小匣的形式購自應 用生物系統公司（Applied Biosystem Inc)。FMOC-Lys(Alloc)-OH貝[]係以大包裝方式購自Perseptive Biosystems公司（Framingham，ΜΑ)，並自行充塡於反應匣 室內。所使用的胺基酸均爲L-組態。 樹脂： 用於hGRF類似物之一級樹脂爲PAL-PEG-PS(連接肽 之胺基-聚乙二醇-聚苯乙烯）樹脂。PAL-PEG-PS支持物則 係購自Perseptive Biosystems公司，其無論在粗產物的純 度及產量上都表現出一致且優異的結果。在所有衍生物中 均使用了 〇·16 mmol/g之低取代樹脂。在比較長、且較困 難合成的序列上一般均會使用取代度較低的樹脂，以降低 立體障礙及在不斷增長的肽鏈上形成β-平板來確保較佳的 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϋ n n ϋ n n 一一OJ· n I n ϋ It I - 1254641 A7 __— B7__ 五、發明說明（乃） 耦合程度。 方法 鏈的形成-應用生物系統公司、型號431A的狀合成儀 帶有保護基團的肽鏈最初係以FMOC方法以應用生物 系統公司所出品、型號431A的肽合成儀來加以組成，此 儀器係採用已設定好的快速FMOC循環(FastMoc™)來進行 合成。以HBTU來進行活化及耦合反應，以20%的六氫[]比 啶來去除保護基，並以NMP爲其主要溶劑來去除保護基、 溶解胺基酸及淸洗樹脂。以事先稱好重量之1.0豪莫耳的 小匣來引入胺基酸。在0.25毫莫耳的FastMoc™循環中約 需1.0豪莫耳的小匣及40毫升的反應瓶。 形成鍵的程序 產量爲〇·25毫莫耳的設定循環步驟如下列： 1·以六氫吡啶來去除保護基團-先以ΝΜΡ淸洗樹脂 ，之後送入18%之六氫账[]定/ΝΜΡ溶液並進行去除保護基 反應3分鐘。將反應瓶排空後注入20%之六氫吡啶溶液並 持續去除保護基約8分鐘。 2·溶解胺基酸-在反應匣內加入ΝΜΡ(2·1克)及0.9 毫莫耳、0.45Μ的HBTU/HOBt之DMF(2.0克)溶液並混合 反應溶液6分鐘。 3. 以NMP進行淸洗-將反應瓶排空並以NMP淸洗 樹脂5次。 4. 將胺基酸活化並轉移至反應瓶(RV)中-將1毫升、 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)
-n ϋ 1 n ϋ n n I I ϋ n ϋ I n ϋ I $. 1254641 A7 ___；_B7___ 五、發明說明（3升} 2M之DIEA的NMP溶液加入匣中以便活化已溶出的胺基 酸，然後將其由匣中轉移至反應瓶(RV)。 5.耦合及最後的淸洗步驟-活化之胺基酸與已去除保 護基團之肽鏈-樹脂的N-端間的耦合反應將持續進行約20 分鐘，之後將RV排空並以NMP淸洗樹脂。 6·加帽作用（視需要與否而定）-將約12毫升、0.5M 的醋酸酐，0.125M的DIEA及0.015M之HOBt的NMP溶 液加到反應瓶中並搖盪混合約5分鐘。此將使樹脂上任何 未發生耦合反應的位置被乙醯化，導致切斷式序列而非移 除式序列的生成，此舉將使最後的純化步驟更爲簡單。 有關此循環完整的流程記載於應用生物系統公司所出 版、編號第35號的使用者手冊中（FastMoc™0.25 and 0.10 on the Model 43ΙΑ) 〇 一般典型分析之標準流程步驟 第1步：以DMF淸洗樹脂3次 第2步：以20%之六氫毗啶/ΝΜΡ溶液進行去保護基 反應2次 第3步：以DMF淸洗樹脂6次 第4步：以經HBTU/NMM之DMF溶液活化的胺基酸 進行耦合反應45分鐘 第5步：以DMF淸洗樹脂3次 對於較難合成的序列，可在耦合反應後插入一額外的 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -I I 1 I I I I ^ « — — — — — — I — A7 1254641 _____ B7_____ 五、發明說明（Κ) 加帽步驟，該步驟將會使用70%醋酸酐之DMF溶液反應 20分鐘以便將肽-樹脂鏈上所有未發生耦合的位置加以乙 醯化，使最終粗產物中出現切斷式序列而非移除式序列。 切斷/萃取 用來除去支鏈上的保護基團並將肽由樹脂中釋放出來 的組合切斷試劑乃是一種內含精胺酸和/或甲硫胺酸之肽專 用的標準混合物。對0.1-1.5克的肽-樹脂物而言，需10毫 升三氟醋酸、0.5毫升去離子水、〇.5毫升硫代茴香醚、〇.5 毫升乙烷二硫醇（87%三氟醋酸、4.3%去離子水、4.3%硫代 茴香醚、4.3%乙烷二硫醇）。 裂解產物 將1〇〇毫克-1克的肽-樹脂物置於20毫升玻璃瓶中 並以冰浴冷卻。將準備好的切斷試劑也置於冰浴中冷卻， 之後將其加入至肽-樹脂物中使終體積達到約10毫升左右 〇 將玻璃瓶由冰浴中移除並使其於室溫下緩緩回溫。將 玻璃瓶蓋好並在室溫下攪拌反應混合物2小時。 經過2小時後，以中等至粗糙孔隙的濾紙將溶液真空 過濾至體積約爲30毫升的冷ΜΤΒΕ中。以1毫升TFA淸 洗反應瓶並以同樣的過濾漏斗將其濾至冷的ΜΤΒΕ溶液中 。將整個懸浮液轉移至50毫升的離心管中並在室溫下以約 2000 rpm的轉速離心約10分鐘。將上淸液吸除，並將沉 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音W事項再填寫本頁} 零裝--------訂-------- A7 1254641 ______B7___ 五、發明說明（％) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 澱重新懸浮於40毫升冰冷的MTBE溶液中再離心一次。 再重複此步驟一次。將最後一次的上淸液吸除，並通入氮 氣將沉澱中殘餘的醚揮發。 將肽溶於20-30毫升1%-1〇%之醋酸溶液中，以去離 子水將其稀釋至約100-150毫升，冷凍並噴霧乾燥。 純化 逆相HPLC法 系統一 Waters Delta Prep 4000 管柱-Vydac逆相C-18、ΙΟμπι、2_2x25公分（目錄編號： 218TP1022)
緩衝液-A :水/0.1%TFA B :乙腈/0.1%TFA 流速-15毫升/分鐘 偵測—Waters 484 UV detector，220 nm p 梯度-可變、通常是0.2% B/分鐘至1.0% B/分鐘 將50-100毫克的肽溶於200毫升0.1%TFA溶液中來 製備冷凍乾燥後的肽粗產物。之後將肽溶液經由”A”緩衝 液區直接載入管柱中並立即啓動梯度程序。 在自動化HPLC分析系統上隔夜收集各分餾部分。重 ^ 疊部分將波峰積分後若純度超過92%則將其收集在一起， 用去離子水以4 : 1的比例稀釋，冷凍後在Virtis 25 SL冷 凍乾燥儀上進行冷凍乾燥。 特性 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） A7 1254641 ____B7___ 五、發明說明（7)
逆相HPLC 條件：
系統-Waters 510幫浦、717自動樣品儀、490多波長UV 偵測器 管柱-Vydac C-18、5μηι、0.46x25 公分（目錄編號： 218ΤΡ54)
緩衝液一 A :水/0_1%TFA B ··乙腈/0.1%TFA 流速-1毫升/分鐘 偵測一 UV : 214 nm，280 nm 梯度-2% B/分鐘 將0.2-1.0毫克的肽溶於0.1%TFA溶液使其濃度達 0.5-1.0毫克/毫升，來製備純化後冷凍乾燥的肽樣品。 將15-18μ1樣品注入管柱中並以25分鐘約0-50% ACN 的梯度程序將其由管柱中沖提出來。以Waters Expert-Ease 軟體系統來收集並儲存色層層析數據。 質譜分析 型式：MALDI-TOF(由基質輔助之雷射去吸附/游離時間） 系統：Perseptive Biosystems Voyager Elite 基質：α-氰基-4-羥基肉桂酸、10毫克/毫升在 67%ACN/0.1%TFA中或白芥酸中、10毫克/毫升 在 50%ACN/0.1%TFA 中 肽樣品係以1-20 μιηοΐ濃度在50%ACN/0.1%TFA、 0.5 μΐ之基質溶液中製備，接著將0.5 μΐ的肽樣品加到分 39 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 零裝 n an I n 一：^· I MM a··· I I MM 雷 $. 1254641 A7 --- - B7 _ 五、發明說明（ 析盤孔中並讓其乾燥。將分析盤載入儀器中，以專門分析 肽之延緩反射萃取法來掃瞄並分析樣品。對每一樣品，均 收集累計32-128次雷射點的資料進行分析。每一次實驗中 均涵蓋了用來作校正計算的標準肽樣品。 專一性合成
Uy-S(All〇c)12’21l-hGRFil-7Q)-7<fH2 之製備 剛開始係以Fmoc化學法在應用生物系統431A肽合 成儀（梦見上述合成方法）上來合成[Lys (Alloc)12,21]-hGRF(l-29)-PAL-PEG-PS-樹脂，包括將 N-端之 Fmoc 殘基 去除。 以TFA : 1，2-乙烷二硫醇：硫代茴香醚：水[1〇 : 〇.5 : 〇·5 : 0·5(ν/ν)]之混合物作用2小時將肽由樹脂上切出，並 以ΜΤΒΕ將肽沉澱可得240毫克的狀粗產物。以Vydac C18管柱(22x250毫米)之逆相HPLC法來進行純化，可得 6〇毫克的純化產物(以HPLC分析其純度>95%)。MALDI-TOF質譜光譜：計算結果：3523.8，觀察結果：3524.2。 [Na-異丙某-Tw1 丄 vs(Alloc)12l-hGRF(l-29)-NHL 之製備 組合[Lys(All〇c)12]-hGRF(l-29)-PAL-PEG-PS-樹脂 剛開始係以Fmoc化學法在應用生物系統431A肽合 成儀（參見上述合成方法）上來合成[Lys(All〇c)12]-hGRF(l- 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
* I n n n em§ n n · 1« ϋ 1_1 n I IV n I p ΚΙ 1254641 ___Β7 _ 五、發明說明（）f') 29)-PAL-PEG-PS-樹脂，包括將N_端之Fmoc殘基去除。 以還原性烷化反應進行Na-異丙基化 如Hocart等人(Hocart et al·，1987)所述以氰硼烷鈉及 相對之酮化物(丙酮)藉還原性烷化反應在肽樹脂上加上Να-異丙基。讓88〇毫克的肽樹脂(約70 μηιοί)在5毫升DCM 中膨脹約30分鐘，之後加入10毫莫耳（174 μΐ)溶於7毫升 甲醇/l%HOAc之丙酮溶液並在室溫下繼續攪拌混合物2小 時。加入2毫莫耳（129毫克)溶於12毫升甲醇/l%HOAc之 氰硼烷鈉溶液並繼續攪拌混合物2小時後靜置隔夜（15小 時）。由定量之水合郎三酮監測可知反應是否已達終點（無 藍色）。以TFA : 1，2-乙烷二硫醇：硫代茴香醚：水[1〇 : 0·5 : 0.5 : 0·5(ν/ν)]之混合物作用2小時將肽由樹脂上切出 ，並以ΜΤΒΕ將肽沉澱可得2〇0毫克的肽粗產物。以逆相 HPLC梯度沖堤法(溶劑爲水/乙腈/0.1%TFA)在Vydac C18 管柱(22x250毫米)來進行純化，可得50毫克的純化產物( 以HPLC分析其純度>95%)。MALDI-TOF質譜光譜：計算 結果：3481.9，觀察結果：3481.8。 1施例9 :具保護基團之hGRF(l-29)上的聚乙二醇化反應 將如實施例8所製備之hGRF衍生物與如實施例1和 6中活化的？£0共軛在一起。 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 馨 — — — — — — —
P 1254641 A7 ___B7___ 五、發明說明（ 在此情況下其純化反應只需涉及將過多的反應試劑與 副產物分開，而無需進行如實施例2及3中所述的其他程 序。 參考文獻
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Claims (1)
1254641 A8B8C8D8 | 〆 f/I㈧ 广'.TV丨 六、申請專利範圍 1 · 一種內含一或多個與Lys12、Lys21和Να中至少一 者共價結合之PEG單元（對每一個hGRF而言）之hGRF-PEG共軛體之位置專一性製備方法，其包括在pH介於7 與9間之溶劑中，在溶液中進行hGRF肽與活性PEG間的 共軛反應，其中該溶劑係選自於高濃度菸鹼醯胺水溶液、 去折疊劑（如尿素）之緩衝水溶液或選自二甲基亞碾、二甲 基甲醯胺/緩衝液或乙腈/緩衝液之極性有機溶劑所組成之 群組，然後由反應混合物中分離並純化出所欲之hGRF-PEG共軛體。 2 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該溶液是菸 鹼醯胺之濃縮水溶液或是一種去折疊劑(defolding agent)之 緩衝水溶液。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該溶劑是一 種選自以下的極性有機溶劑：二甲基亞楓、二甲基甲醛/緩 衝溶液或乙腈/緩衝溶液。 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該hGRF-PEG共軛體係自反應混合物中分離出來並以色層分析法加 以純化。 5 ·如申請專利範圍第1-4項中任一項之方法，其中 該 hGRF 肽是 h-GRF〇29)-NH2。 6 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中在共軛反應 發生前，hGRF肽係在Na、Lys12和Lys21等位置中的一或 多個位置受到保護。 7 ·如申請專利範圍第1或6項之方法，其進而包括 1 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） 0^ 8 8 ABCD 1254641 六、申請專利範圍 _ 一個在共軛反應後的去保護基團反應。 8 ·如申請專利範圍第1-4和6項中任一項之方法， 其中g亥活性PEG是一種以單甲氧基化形式存在之院化或醯 化的PEG。 9 ·如申請專利範圍第5項之方法，其中該活性PEG 是一種以單甲氧基化形式存在之烷化或醯化的PEG。 10 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中該活性PEG 是一種以單甲氧基化形式存在之烷化或醯化的PEG。 11 ·如申請專利範圍第1-4和6項中任一項之方法， 其中該共軛反應係於周圍溫度下進行。 12 ·如申請專利範圍第5項之方法，其中該共轭反應 係於周圍溫度下進行。 13 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中該共軛反應 係於周圍溫度下進行。 14 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中該共軛反應 係於周圍溫度下進行。 15 ·如申請專利範圍第9項之方法，其中該共軛反應 係於周圍溫度下進行。 16 ·如申請專利範圍第1〇項之方法，其中該共軛反 應係於周圍溫度下進行。 Π · —種根據申請專利範園第1項之方法所製備的內 含至少一個與LyS12、Lys 21和Να中至少一者共價結合之 PEG單元（對每一個hGRF而言）之hGRF-PEG共軛體。 18 ·如申請專利範圍第π項之hGRF-PEG共轭體， 2 張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X ~一 震S 1254641 六、申請專利範圍 其中1個PEG單元係共價結合在Lys 12上。 19 ·如申請專利範圍第17項之hGRF-PEG共軛體， 其中1個PEG單元係共價結合在Lys 21上。 20 ·如申請專利範圍_ 17項之hGRF-PEG共轭體， 其中在Lys 12和Lys 21每一者上各共價結合1個PEG單 元。 21 ·如申請專利範圍第17項之hGRF-PEG共軛體， 其中在Lys 12、Lys 21和，之每一者上各共價結合1個 PEG單元。 22 · —種[LysCAlloc/WiphGRF，其係申請專利範圍 第1項之共軛反應的中間物。 23 · —種[Να-異丙基、Tyri，Lys(Alloc)12]-hGRF，其係 申請專利範圍第1項之共鲍反應的中間物。 24 ·—種如申請專利範圍第17至21項之hGRF-PEG 共軛體作爲治療、預防或診斷與生長激素相關疾病之藥物 之用途。 25 ·如申請專利範圍第24項之用途，其係用來製備 一種可治療、預防或診斷與生長激素相關疾病的藥物。 26 ·如申請專利範圍第25項之用途，其係用來製備 —種可治療或診斷生長激素不足(〇1113)的藥物。 27 β 一種用於治療、預防或診斷與生長激素相關疾病 之藥學組成物，其包含申請專利範圍桌17至21項中任一 項所述之共軛體與一或多種藥學上可接受的載體和/或賦形 劑。 ---- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 29/公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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