UA73716C2 - Site-specific preparation of grf conjugated with polyethylene glycol - Google Patents
Site-specific preparation of grf conjugated with polyethylene glycol Download PDFInfo
- Publication number
- UA73716C2 UA73716C2 UA2000063885A UA2000063885A UA73716C2 UA 73716 C2 UA73716 C2 UA 73716C2 UA 2000063885 A UA2000063885 A UA 2000063885A UA 2000063885 A UA2000063885 A UA 2000063885A UA 73716 C2 UA73716 C2 UA 73716C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- res
- conjugate
- conjugation
- poke
- peptide
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 31
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- 240000007643 Phytolacca americana Species 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 8
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 6
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 29
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 29
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001190694 Muda Species 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- -1 1-(1-Adamantyl)-1 -methyl-ethoxycarbonyl Chemical group 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 4
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 2-[di(propan-2-yl)amino]ethylsulfanyl-methylphosphinic acid Chemical compound CC(C)N(C(C)C)CCSP(C)(O)=O UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 2
- UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 6-amino-2-[[(e)-(3-formylphenyl)methylideneamino]carbamoylamino]-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1NC(=O)N\N=C\C1=CC=CC(C=O)=C1 SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- WGWPRVFKDLAUQJ-MITYVQBRSA-N sermorelin Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WGWPRVFKDLAUQJ-MITYVQBRSA-N 0.000 description 2
- 229960002758 sermorelin Drugs 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UUWGERKZCVYLKW-UHFFFAOYSA-N 3-(2-cyano-4-hydroxyphenyl)prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1C#N UUWGERKZCVYLKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZKGFGLOQNSMBS-UHFFFAOYSA-N 4,5,6-trichlorotriazine Chemical compound ClC1=NN=NC(Cl)=C1Cl LZKGFGLOQNSMBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 108010040864 CERE Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000840267 Moma Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000005844 Thymol Substances 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000011929 mousse Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013550 pizza Nutrition 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- JAHCMOSSKRAPEL-IBFVROBCSA-N somatorelin Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAHCMOSSKRAPEL-IBFVROBCSA-N 0.000 description 1
- 229960002090 somatorelin Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000790 thymol Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
Description
Опис винаходу
Даний винахід стосується способу сайт-специфічного отримання кон'югатів НЗКЕ-РЕС, що містять одну або декілька РЕС одиниць (в розрахунку на ПОРЕ), ковалентно пов'язаних з ув 77 і/або (ув?! і/або Мо, який відрізняється тим, що реакцію кон'югування між пептидом ПОКЕ і активованим РЕС проводять в розчині і цільовий продукт - кон'югат ПОКЕ-РЕС очищають хроматографічними методами.
Кон'югати, отримані даним способом, а також їх застосування для лікування, профілактики і діагностики / захворювань, пов'язаних з гормоном росту, також складають об'єкт даного винаходу.
На початку 1980-х декілька груп дослідників виділили і охарактеризували рилізинг-ч-инник гормону росту (ОКЕ).
СК (званий також соматорелін) являє собою пептид, який секретується гіпоталамусом, який діє на свій рецептор і може сприяти вивільненню гормону росту (СН) з передньої частки гіпофіза. Він являє собою пептид з 44, 40 або 37 амінокислотних залишків; його форма, що складається з 44 амінокислотних залишків, може бути то фізіологічно перетворена в форми з більш короткими послідовностями. Повідомляється, що всі три форми є активними, причому активність зосереджена, в основному, в перших 29 амінокислотних залишках. Синтетичний пептид, відповідний 1-29 амінокислотам послідовності людського ЗКЕ|ПОКЕ(1-29)), званий також сермореліном, був отриманий за допомогою технології рекомбінантних ДНК, як описано в Європейському патенті ЕР 105759.
Серморелін в формі ацетату був використаний для діагностики і лікування недостатності гормону росту.
ОКЕ має реальну терапевтичну цінність при лікуванні певних, пов'язаних з гормоном росту захворювань.
Використання СКЕ для стимулювання вивільнення СН являє собою фізіологічний метод прискорення росту довгих кісток або анаболізму білків.
Одна проблема, пов'язана з використанням ОКЕ, стосується його короткого біологічного часу напівжиття (від ря біля 12 до ЗОхв). ПОКЕ (І-29)-МН» зазнає ферментативного руйнування і швидко руйнується в плазмі під впливом с дипептиділпептидази ІМ-(ОРР-ІМ) в точці між залишками Аа? і Авр3. о)
Таким чином доцільно розробити біологічно стабільні, тривало діючі аналоги ЗКЕ шляхом специфічної хімічної модифікації СКЕ для того, щоб перешкодити або зменшити деградацію під впливом ферменту.
Поліетиленгліколь (РЕС) - цей гідрофільний біосумісний і нетоксичний полімер загальної формули. Н со зо (ОСНо.СНО)ОН, де п»4. Його молекулярна маса може варіювати від 200 до 20000 дальтон.
Було показано, що хімічна кон'югація РЕС в його монометоксильованій формі з білками і/або пептидами -- значно збільшує тривалість їх біологічної дії. Подібно вуглеводним залишкам в глікопротеїні, РЕС забезпечує М захисне оточення і збільшує розмір молекули, зменшуючи тим самим його метаболічне руйнування і швидкість його виведення нирками. о
Кон'югація з РЕС є вже розробленою сукупністю способів доставки пептидів і білків, пріоритет в яких ї- належить фундаментальним дослідженням Раміз, Ариспомузкі | АВиспому»кі еї аї., 1977а і 19778). Кон'югація РЕС з пептидами або білками звичайно приводить до неспецифічного хімічного приєднання РЕС до декількох амінокислотних залишків. Одним з ключових питань в даній технології є, таким чином, вишукування відповідних хімічних способів ковалентного скріплення молекули (молекул) РЕС з певними амінокислотними залишками. «
Наприклад, активований трихлортриазином РЕС, відносно якого було встановлено, що він токсичний і з с взаємодіє неспецифічним шляхом, був пізніше замінений різними РЕС реагентами з хімічними лінкерами, які могли специфічно взаємодіяти з аміногрупами (ІВепспатр еї аїЇ.,, 1983; Мегопезе еї а!., 1985; 7/аїїрзКу еї аї., ;» 1983; 7аїїрзекі еї аІ., 1990; апа ОеїЇдадо еї аІ., 1990), з сульфгідрильними групами |Загіоге еї аї., 1991; апа
Могригоо еї а/ї., 1996) або із залишками гуанідину (Рапае еї аї., 19801.
Було встановлено, що різні РЕС - білкові кон'югати захищені від протеолізу і/або мають зменшену -І імуногенність (Мопгагаїпі еї аі!., 1995; апа Хатзвгикі еї аї., 1988).
Інша технічна трудність, супроводжуюча "Кон'югацію з РЕС" білків, виникає в зв'язку з тим, що кон'югати о білків з РЕС звичайно мають різну кількість приєднаних молекул РЕС, і це приводить до отримання суміші -І кон'югатів з різною стехиометрією РЕС:білок. Сайт - специфічна кон'югація з РЕС залишається хімічною 5р проблемою. Кон'югування РЕС і СН являє собою типовий приклад, що відображає цю проблему |Сіагк еї аї|., - 1996). Було показано, що кон'югація з РЕ І уз - залишків СН відбувається за випадковими положеннями.
Ф Для того, щоб уникнути або зменшити вплив ферменту, активний сайт спочатку повинен бути захищений з тим, щоб кон'югація РЕС з ферментом відбувалася в неактивному сайті(-ах) Саїісеїі еї аї., 19931.
Недавно був запропонований інший підхід для сайт-специфічного кон'югування РЕС з низькомолекулярними в пептидами, такими як СЕРЕ, який отримували твердофазним пептидним синтезом. У цих кон'югатах заздалегідь отриману і кон'юговану з РЕС амінокислоту вводили в пептидний ланцюжок за допомогою твердофазного (Ф, синтезу. Ця процедура, однак, вимагає вельми складного очищення продукту, що, як відомо, є пілігтуючою ка стадією при твердофазному синтезі. Наявність РЕС, внаслідок його високої молекулярної маси і полідиспергованості, з великою ймовірністю приводить до отримання цільового продукту з небажаними бо домішками і/або продуктів з пропущенням (недостачею) амінокислотних залишків, причому останнє звичайно відбувається при використанні методу Мегтійеїа'а.
Недавно в літературі повідомлялося (Реїїх еї аІ., 1995| про приєднання тільки однієї молекули РЕС до специфічного амінокислотного залишку ІАІа "У-пОвЕ(1-29)-МН» з використанням твердофазного синтезу. У цьому дослідженні показано, що ІАТа"51-пО В (1-29)-МН», кон'югований з РЕС в положеннях 21-го або 25-го залишків, 65 повністю зберігає активність іп міго по порівнянню з вихідним (Аа У)1-иСЕ(1-29)-МН». Однак відсутні дані, що показують, чи виявляють ці кон'юговані з РЕС кон'югати більш тривалий час свою активність іп мімо в порівнянні з некон'югованим з РЕС аналогом.
Зовсім недавно було показано І(Сатррбеї! еї аі., 1997), що приєднання РЕС з різною молекулярною масою до
С-кінця різних аналогів НОКРЕ, знову ж при використанні твердофазного синтезу, збільшує тривалість збереження активності при випробуваннях як на свинях, так і на мишах, в порівнянні з некон'югованим з РЕС аналогом.
У протилежність методу твердофазного отримання монокон'югованого з РЕС НОКЕ, згаданого вище, даний винахід відноситься до сайт-специфічного кон'югування з РЕС пОКЕ в розчині. Встановлено, що пОКЕ має низьку розчинність в нейтрально-лужному буферному розчині, внаслідок чого має місце хімічна умова для найбільш ефективного здійснення реакції кон'югації з РЕС. У розбавленому розчині гідроліз активованого РЕО 7/0 (наприклад, РЕС-ефіру) має тенденцію до зменшення виходу реакції кон'югації з РЕ.
У даному винаході встановлено, що у відповідному розчиннику, що забезпечує високу розчинність НОКЕ, можна здійснювати реакцію сайт-специфічного кон'югування з РЕС в рідкій фазі. У цьому випадку, навіть якщо початковий пептид ПОКЕ незахищений, РЕС-ланцюжки будуть зв'язуватися з високими виходами і майже виключно з первинними аміногрупами (є аміногрупами ) Гуз!?, Гув2! або Мо в залежності від умов реакції. 75 Були отримані наступні чотири кон'югати, які входять в об'єм даного винаходу, зі стехиометричним співвідношенням ПОКЕ:РЕС в кон'югатах, що залежить головним чином від молярного співвідношення ПОКЕ і
РЕ.
Кон'югат ЯНОКЕ-РЕС, в якому 1 молекула РЕС ковалентно приєднана до І ув "7, кон'югат НОКЕ-РЕС, в якому 1 молекула РЕС ковалентно приєднана до Гув7, кон'югат ПОВЕ-2РЕС, в якому 2 молекули РЕС ковалентно приєднані до І ув 12 і І ув, Ї кон'югат ПОВЕ-ЗРЕС, в якому З молекули РЕО ковалентно приєднані до І уз 12 і до І ув! і до Мо. "Мо" означає в описі даного винаходу аміногрупу на М-кінці пептиду (Туг).
Після цієї стадії можна здійснювати просте хроматографічне фракціонування кон'югатів, отриманих згідно з сч ов вказаною реакцією, або гель-фільтрацією, або шляхом безпосереднього нанесення на колонку С18 ВЕРХ з елюцією градієнтом суміші води і ацетонітрилу. Другий спосіб більш переважний, так як можна отримати і (о) очистити великі кількості продуктів.
Тому головним об'єктом даного винаходу є спосіб сайт-специфічного отримання різних кон'югатів НЗКЕ-РЕО, що містять один або декілька РЕС-фрагментів (в розрахунку на НОР), ковалентно пов'язаних з І уз 12 і/або І ув?! «о зо мМабо Мо, що характеризується тим, що реакцію кон'югації з РЕС проводять в розчині і цільовий кон'югаті
ПОКЕ-РЕС очищають, наприклад, хроматографічним способами. -
Кон'югати НОКЕ і РЕС, що містять один або декілька РЕС-фрагментів (на моль ПОКР), ковалентно пов'язаних р. з Гув2 і/або І ув"! і/або Мо, також є об'єктом даного винаходу.
Переважними продуктами даного винаходу є кон'югати ПОКЕ-РЕС, в яких 1 молекула РЕС ковалентно о 35 пов'язана з І уз 2 і/або І ув7!, М.
Згідно з іншим втіленням даного винаходу, якщо одна або більш з цих трьох аміногруп, до яких приєднані ланцюжки РЕС, оборотно захищені певними хімічними групами від кон'югації з РЕС, реакція кон'югації з РЕО буде давати безпосередньо цільовий кон'югат зі специфічними сайтами кон'югації з РЕС, який можна потім « виділити з реакційної суміші, наприклад, ультрафільтрацією або іншими хроматографічними методами. У цьому 40 випадку спосіб отримання може далі необов'язково включати реакцію зняття захисту. т с Реакцію зняття захисту переважно здійснюють відомими способами і в залежності від хімічної природи в захисних груп, яку потрібно видалити. -» Відповідно до винаходу мається на увазі, що під термін "пОКЕ", якщо тільки це спеціально не обумовлено, підпадають будь-які пептиди КЕ людини, особливо, це стосується пептидів 1-44, 1-40, 1-29 і відповідних до 45 них амідів (утримуючих амідну групу на М- і С-кінцях). Переважним пептидом ПОКЕ є пПОКЕ-(1-29)-МН 5, -і амінокислотна послідовність якого приводиться в 5ЕО ІЮ МО:1. с "Активований РЕС" (або "РЕС-кон'югуючий агент") являє собою будь-яку похідну РЕС, яка може бути використана для модифікації білків завдяки тому, що вона містить функціональну групу, здатну взаємодіяти з - деякими функціональними групами в молекулі білкаулептиду з отриманням кон'югата РЕС з білком або -лщ 20 пептидом. Огляд похідних РЕС, які можуть використовуватися в якості модифікаторів білків, може бути знайдений у Наїтіз (1985). Активований РЕС може бути алкілуючим реагентом, таким як альдегідні або епоксидні
І) похідні РЕС, РЕС-трезилат, або він може бути ацилованим реагентом, таким як складний ефір РЕО.
Активований РЕС переважно використовують в монометоксильованій формі. Він переважно має молекулярну масу між 2000 і 20000. Монометоксильований РЕС50О00О особливо переважний для отримання активованого РЕС згідно з винаходом.
Ге! Якщо активований РЕС є ацилованим агентом, він переважно містить залишок або норлейцину, або орнітину, пов'язаний з іншою частиною молекули РЕС за допомогою амідного зв'язку. Ці залишки дозволяють зробити де точне визначення фрагментів РЕС, що приєдналися на моль пептиду |див. для прикладу Загіоге еї аї!., 19911.
Тому особливо переважним активованим РЕС є монометоксильований РЕСьоо, пов'язаний за допомогою 60 амідного зв'язку з альфа-аміногрупою норлейцину, так що карбоксигрупа перетворюється в сукцинимідну ефірну групу.
РЕС з розгалуженим ланцюгом також можуть використовуватися. Розгалужені РЕС можуть бути представлені як К(- РЕС-ОН) уд, в яких К являє собою центральний серцевинний залишок молекули, такий як пентаєритрит або гліцерин, а т показує кількість розгалужень. Кількість розгалужень (т) може варіювати від 65 трьох до ста і більше. Гідроксильні групи можуть бути хімічно модифіковані.
Інша розгалужена форма, така як, наприклад, описана в заявці на видачу патенту РСТ УУО 96/21469, має єдину групу на кінці молекули, яка може бути піддана хімічній модифікації. Цей тип РЕС може бути представлений як (СН 3О-РЕС-)рК-Х, де Р дорівнює 2 або 3, К являє собою центральну серцевинну частину молекули, таку як лізин або гліцерин, а Х являє собою функціональну групу, таку як карбокси, яку можна хімічно активувати. Ще одна розгалужена форма має реакційно здатні групи, такі як карбоксигрупи, розподілені вздовж основного ланцюжка молекули РЕбС, а не на кінцях РЕС - ланцюгів.
Всі ці розгалужені РЕС і можуть бути "активовані", як показано вище.
Під "хроматографічними методами" мають на увазі будь-який метод, що використовується для виділення компонентів з суміші шляхом нанесення на носій (в стаціонарній фазі), через який пропускають розчинник /о0 (рухома фаза). Принципи хроматографічного виділення базуються на відмінностях фізичної природи стаціонарної і пересувної фаз.
Деякі різновиди хроматографічних методів, які добре відомі з літератури, включають: рідинну, рідинну високого тиску, іонообмінну, адсорбційну, афінну іонообмінну, розділову, гідрофобну, зворотно-фазову, гельфільтраційну, ультрафільтраційну або тонкошарову хроматографію. "Кон'югація з РЕС" - це реакція, з допомогою якої на основі активованого РЕС і білка або пептиду отримують РЕС - білок/пептидний відповідний кон'югат.
Молярне співвідношення РЕС: пОКЕ може бути 1:1, 2:11 або 3:1 в залежності від того, який кон'югат отриманий з високими виходами.
Розчинник для реакції кон'югації з РЕС вибирають з групи, що складається з висококонцентрованого водного 2о розчину нікотинаміду, водного буферного розчину денатуруючого агента (такого як сечовина), або ним може бути полярний органічний розчинник, вибраний з диметилсульфоксиду, суміші диметилформаміду з буфером або суміші ацетонітрилу з буфером. рН розчину звичайно підтримують між 7 і 9.
Перелік хімічних захисних груп для ув.» і Гувої може (без обмеження) включати: АйПос (алилоксикарбоніл), сч дв Юае (1-4,4-Диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-іліден)етил), Адрос (1-(1-Адамантил)-1-метил-етоксикарбоніл) або 2-С1-2 (2-Хлор-бензилоксикарбоніл). АМПос є переважною захисною групою для лізинової групи. Після кон'югації і) з РЕС АПос може бути видалений одним з способів, описаних в Сгеепе еї аї!. (1991). Оде може бути видалений 2905 гідразином в ДМФ |див. МУ.С. Спеп еї аї!., 1995). Адрос може бути видалений аналогічно АПЇПос |див. також ріск Р.еї аІ.,, 1997)Ї. Для зняття 2-СІ-2 може бути потрібна більш сильна кислота (НЕ, ТЕМ5А, НВг) або «о зо Гідрування |див. також Рат еї а1., 1987).
Захисні групи для Мо; можуть являти собою алкильні групи, такі як метил, етил, пропил, ізопропил, бутил, -- третбутил, бензил або циклогексил. Переважною групою є ізопропил. Ці алкильні групи можуть бути введені р відновним алкилюванням |див. Мигрпу еї а/!., 1988 або Носагчі еї а/!., 19871.
ІМо-ізопропил-Туг", І ув (АЇПос)7-пОРЕ і (І ув-(АПос)227|-НОВБЕ також входять в об'єм даного винаходу в о
Якості нових і що використовуються як проміжні сполуки в реакції кон'югації з РЕС. їч-
Було також встановлено, що кон'югація з РЕС згідно з винаходом: 1. не змінює конформації пептиду, 2. збільшує стійкість до протеолітичного розкладання, « 3. не впливає або лише дуже слабо знижує біологічну активність в залежності від міри кон'югації з РЕС і 4. дозволяє отримувати продукти (кон'югати), які мають більшу розчинність у водних буферних розчинах. - с Іншим об'єктом даного винаходу є кон'югати ПОКЕ-РЕС з високою мірою чистоти, які застосовуються в ц фармацевтичних композиціях в якості активних інгредієнтів. "» Іншим аспектом даного винаходу є застосування кон'югатів винаходу в якості лікарського засобу для лікування, профілактики або діагностики порушень, пов'язаних з гормоном росту, наприклад, недостатності гормону росту, особливо, недостатності гормону росту в дітей. - І Лікарський засіб переважно знаходиться в формі фармацевтичної композиції, що містить кон'югати за винаходом разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями і/або наповнювачами. Такі о фармацевтичні композиції складають ще один об'єкт даного винаходу. - І Реалізація винаходу полягає у введенні фармакологічно активної кількості кон'югатів даного винаходу цу 5 особам, схильним до ризику розвитку, пов'язаного з гормоном росту, захворювання або що вже має таку патологію. о Інший об'єкт даного винаходу являє собою спосіб лікування, профілактики або діагностики розладів, пов'язаних з гормоном росту, що передбачає введення ефективної кількості кон'югатів за винаходом в присутності одного або декількох фармацевтично прийнятних наповнювачів.
Термін "Ефективна кількість" означає кількість активних інгредієнтів, достатньої для надання ефекту на течію і тяжкість вищеописаних порушень, приводячи до полегшення або ремісії цієї патології. Ефективна
ІФ) кількість буде залежати від способу введення і стану пацієнта. ко "Фармацевтично прийнятний" означає будь-який носій, який не перешкоджає вияву біологічної активності активного інгредієнта і нетоксичний для пацієнта, якому він вводиться. Наприклад, для парентерального 60 введення вищезазначені активні інгредієнти можуть бути представлені у вигляді сумішей в дозованих формах для ін'єкцій, таких як сольові, декстрозні розчини, розчин сировоточного альбуміну і розчину Рінгера.
Крім фармацевтично прийнятного носія композиції по винаходу можуть включати мінорні кількості таких добавок, як стабілізатори, наповнювачі, буфери і консерванти.
Може використовуватися будь-який тип введення, сумісний з активним початком. Переважним є 65 парентеральне введення, таке як підшкірне, внутрішньом'язове або внутрішньовенна ін'єкція. Доза активного інгредієнта, яку треба ввести, залежить в основному, від медичного показання, відповідно до віку, маси тіла і індивідуальної реакції хворого.
Доза активного інгредієнта для лікування людини може складати від 5 до бОООмкг/кг маси тіла і переважно складає від 10 до ЗО0б0Омкг/кг маси тіла.
Даний винахід описаний з посиланням на конкретні форми його втілення, але зміст опису включає всі модифікації, які можуть бути виконані фахівцем в даній області, без виходу за межі об'єму домагань.
Далі винахід буде описаний за допомогою прикладів, які не треба сприймати як такі, що обмежують даний винахід. Приклади будуть співвіднесені з графічними матеріалами, пояснення до яких приводяться нижче.
На Фігурі 1 показані амінокислотна послідовність НОКЕ(1-29)-МН». 70 Стрілками показані можливі сайти кон'югації з РЕС.
На Фігурі 2 показані дані ВЕРХ із зверненою фазою суміші, отриманою після реакції кон'югації з РЕОС в
ОМ5О, проведеної як описано в прикладі 1. Перші два більших піки відповідають кон'югатам, що містить 1 РЕО ланцюжок на моль ПОКР. Наступний мінорний пік відповідає кон'югату з співвідношенням НОКЕ:РЕС і останній мінорний пік відповідає кон'югату з співвідношенням АОКЕ:ЗРЕО.
На Фігурі За показано розкладання ПОКК(1-29) і кон'югатів РЕС даного винаходу під впливом субтилізину.
На Фігурі 365 показане розкладання НОКН(1-29) і кон'югатів РЕС даного винаходу під впливом хімотрипсину.
На Фігурі 4 показана спектроскопічна характеристика | уУб(МРЕСвьод-СНо-СО-Ме-СО)1221-пвЕ(1-29)-МНОЇ, отриману шляхом кругового дихроїзму. Спектри є вельми вражаючими в порівнянні з такими "нативного" ПОКЕ.
На Фігурі 5 показаний біологічний ефект різних кон'югатів ПНОКЕ-РЕС (від 1-го "ОМ5БО отримання) в СНО-пОКЕК-ЦОС ов дослідженнях іп мйго. Дані відображають середні результати трьох незалежних експериментів.
На Фігурі 6 показаний біологічний ефект різних кон'югатів ПОКЕ-РЕС (від 2-го. МБО отримання) в
СНО-пОКЕК-ЦОС в дослідженні іп міїго. Дані відображають середні результати двох незалежних експериментів.
На Фігурі 7 показаний біологічний ефект різних кон'югатів ПОКЕ-РЕС (отримані з нікотинамідом) в с
СНО-пПОКЕК-ЦС дослідженні іп міїго. Дані відображають середні результати двох незалежних експериментів.
Фігура 8 ілюструє біологічну дію різних кон'югатів АЗКЕ-РЕС (1-е ОМ5О отримання) на виділення СН з клітин і9) гіпофіза пацюка іп міго.
Фігура 9 показує біологічну дію різних кон'югатів АЗКЕ-РЕС (2-е ОМ5О отримання) на виділення ОН з клітин гіпофіза пацюка іп міго. (Те)
Фігура 10 показує криву динаміки залежності рівнів ПОКЕ в плазмі і ОН в сироватці в залежності від НОКЕ (400мкг/пацюк), при внутрішньовенній ін'єкції пацюкам-самцям. Кожна точка представляє значення -ї- величина --
ЗЕМ, отримана на 9 пацюках. їч-
Фігура 11А (див. перший графік на сторінці) показує криву динаміки у часі залежності рівнів сировоточного
СН після ім. ін'єкції 40Омкг/пацюк кон'югатів АЗКЕ-РЕС (0М5О отримання) пацюкам-самцям. Кожна точка о показує значення, отримане для трьох пацюків. -
Фігура 118 (див. другий графік на сторінці) показує криву динаміки залежності рівнів НОКЕ плазми після ім. ін'єкції 40Омкг/пацюк кон'югатів НЗКЕ-РЕС (0ОМ5О отримання) пацюкам-самцям. Кожна точка показує значення, отримане для трьох пацюків. «
На Фігурі 12 представлена карта рестрикції плазміди рс ОМАЗ-пПОКЕ-К, що використовується в дослідженні 470 маркерного гену для визначення ОКР-активності. - с На Фігурі 13 показана карта рестрикції плазміди ртТЕ5-53--(ОС, що використовується в дослідженні ц маркерного гену для визначення ОКР-активності. "» Приклади
Скорочення
Ацетонітрил (АСМ), алілоксикарбоніл (АїПос), бензил (871), трет-бутилоксикарбоніл (Вос), дихлорметан - І (ОСМ), диїзопропілетиламін (ОПІБА), диметилформамід (ОМРЕ), диметилсульфоксид (0М59), 9-фторфенілметилоксикарбоніл (ЕМОС), гексафторфосфат 2-(/1Н-бензотриазол-1-іл|-1,1,3,3- тетраметилуронію, о 1-гідроксибензотриазол (НОВО, метил-т-бутиловий ефір, норлейцин (Міє), М-метилпіролідон (ММР), - І 2,2,5,1,8-пентаметил-хроман-б-сульфоніл (Р тс), трет-бутил (ІВи), трифтороцтова кислота (ТЕА), трифенілметил шу 20 (т.
Приклад 1. 4) Рідиннофазна кон'югація ПНОКЕ з РЕО
У цих експериментах в якості кон'югуючого з РЕС агента використали монометоксильований
РЕОБороІМРЕС»000| пов'язаний амідним зв'язком з альфа-аміногрупою норлейцину, тобто активований за карбоксигрупою до сукцинімідної ефірної групи. Це може бути виконано, наприклад, по І и еї аї., 1994.
Людський ОКЕ1-29 ПОКЕ(1-29)-МН», який був отриманий від Васпет, використовувався як пептид пПОКЕ.
ІФ) При умові, що низька розчинність НОКН(1-29) у водному розчині при нейтральних і слаболужних значеннях ко рН була необхідна для кон'югації з РЕС, заздалегідь були підібрані альтернативні реакційні умови від А до Е:
А. Диметилсульфоксид: 20мг пептиду розчиняли в їмл ЮОМ5О і відразу ж додавали відповідні кількості 60 кон'югуючого з РЕС реагенту.
В. Диметилформамід/0,2М боратний буфер рН 8,0 при об'ємному співвідношенні 1:1:пептид і відповідні кількості кон'югуючого з РЕС реагенту додавали відразу ж.
С. Висококонцентрований водний розчин нікотинаміду (200мг/мл): 200мг нікотинаміду додавали до розчину 40мг пОКг(1-29) в їмл 10мММ оцтової кислоти. тїмл 0,2М боратного буфера при рН 8,0 додавали до вказаного 65 розчину кислоти для досягнення бажаного рН перед доданням відповідних кількостей кон'югуючого з РЕС реагенту.
О. Ацетонітрил 0,2М боратний буфер рН 8,0 при об'ємному співвідношенні 1:1 і відповідні кількості кон'югуючого з РЕС реагенту додавали відразу ж.
Е. 0,2М боратний буфер, 5М мочевина, рН 8,0 і відповідні кількості кон'югуючого з РЕС реагенту додавали відразу ж.
Сухий РЕС реагент додавали при перемішуванні, щоб досягнути остаточного молярного співвідношення
РЕС: ПОКЕ 1:21, 2:1 або 3:1. Переважним є 2:11.
Використання різних значень молярного співвідношення РЕС:ЛОКЕ дозволило отримувати реакційну суміш, в якій переважаючим кон'югатом був цільовий кон'югат. 70 Реакційний розчин перед очищенням залишали на З години при кімнатній температурі.
Наступні 4 кон'югата НЗКЕ-РЕС (А1-А4) були отримані:
А1: (УВ(МРЕСодо-СНо-СО-Міе-СО) 72-пОв(1-29)-МНаЇ,
А2: |УВ(МРЕС5одо-СНо-СО-Міе-СО) 21-пО в (1-29)-МНаЇ,
АЗ: | УВ(МРЕС5одо-СНо-СО-Міе-СО) 1221-пО В (1-29)-МНО) і 19 Ад: Меа-(МРЕС5оро-СНо-СО-Міе-СО|( уУв(МРЕС5000-СН 5-СО-МІе-СО) 1221-нО В Е(1-29)-МНУЇ.
Надлишок ОМ5О, диметилформаміду, ацетонітрилу або мочевини і побічний продукт реакції (гідроксисукцинимід) видаляли гельфільтрацією, використовуючи мембрану з 1000Д відсіканням. Об'єм доводили до 1Омл 10мММ оцтовою кислотою і потім знижували до Тмл. Цю процедуру повторювали тричі.
Кон'югати НОКЕ-РЕС виділяли гельфітрацією або ж хроматографією з зверненою фазою.
Приклад 2.
Гельфільтраційна хроматографія
З допомогою гельфільтраційної хроматографії продукти були фракціоновані по молекулярній вазі компонентів (в цьому випадку МВ кон'югатів НОКЕ-РЕС 1:1-8,358, МВ пОКЕ-РЕС 1:2-13,358 і МВ пОКЕ-РЕО 1:3-18,358. МВ некон'югованого пОКЕ-3358). Виділення здійснювали на серії колонок системи Зирегдех с 75-ВЗирегове 12 смол (Віоїесі, Рпагтасіа) з елюцією 10мл оцтової кислоти при швидкості потоку 1,5мл/хв. г)
Зібрані фракції об'ємом Тмл аналізувалися по оптичній щільності (ОО) при 280нм на вміст білка і за допомогою йодного тесту на вміст РЕС |Зітзвг еї а/., 19801.
Після кон'югації з РЕС в ОМ5О при мольному співвідношенні НОКЕ:РЕС 1:1 були отримані З піки: - кон'югат
ПОКЕ-РЕС при елюйованому об'ємі в 132мл (основний пік); ісе) - кон'югат НОКЕ-РЕС при елюйованому об'ємі в 108мл (слабий, мінорний пік); і «- - некон'югований НОКЕ при елюйованому об'ємі в 108мл (слабий пік). Після кон'югації з РЕС в ОМ5О при мольному співвідношенні НОКЕ:РЕС 1:2 були отримані три піки: ї- кон'югат НОКЕ-РЕС при елюйованому об'ємі в 108мл (основний пік); со кон'югат НОКЕ-РЕС при елюйованому об'ємі в 132мл (слабий пік); і
Зо кон'югат НОКЕ-РЕС при елюйованому об'ємі в 7Змл (слабий пік). ї-
Після кон'югації з РЕС в ОМ5О при мольному співвідношенні НЗКЕ:РЕС 1:3 були отримані два піки: кон'югат НОКЕ-РЕС при елюйованому об'ємі в 7Змл (основний пік); і кон'югат НОКЕ-РЕС при елюйованому об'ємі в 108мл (слабий пік). «
Елюйовані піки збирали, концентрували ультрафільтрацією на мембрані з 1000Д відсіканням, ліофілізували, розчиняли в 10ММ оцтової кислоти і продукти охарактеризували, як тут указано, після їх ідентифікації і З с визначення їх кількостей. Було встановлено, що пік в елюйованому об'ємі 7Змл відповідає сполуці А4. "» Встановлено, що пік в елюйованому об'ємі 132мл відповідає сполуці АЗ. " Встановлено, що пік в елюйованому об'ємі 108мл відповідає суміші сполук А2 і А1.
Встановлено, що пік в елюйованому об'ємі 232мл відповідає некон'югованому ПОКЕ.
Однак, даний метод очищення не дозволяє розділити кон'югати НЗКЕ-РЕС, що мають однакову молекулярну ш- вагу, але різні сайти кон'югації з РЕС (позиційні ізомери). 2) Приклад 3.
Хроматографія із зверненою фазою
Ш- Більш специфічне фракціонування виконується шляхом гідофобної хроматографії з використанням КР-НРІ С -кл 20 С 18 колонки. Цим способом можна розділити можливі ізомери, що вийшли з однією і тією ж молекулярною вагою. Фактично було встановлено, що при такому способі одиничний отриманий гельфільтрацією пік, 0 відповідний кон'югатам з 1 ковалентно приєднаним РЕС, розділяється на два піки.
Зверненофазову хроматографію виконували на КР-НРІС С18 препаративній колонці (Мудас) з елюцією градієнтом НьО/0,0595 ТЕА (Елюент А) і ацетонитрил/-0,595 ТРА (Елюент В), таким чином: о О-бхв о ЗБОБА іме) Б-ЗБхв ЗБОБА. У296А 35-ЗВхв 296А 60 38-4бхв 296А. 53596
Швидкість потоку: 1Омл/хв, Іоор Тмкл;
ОМ-Мів Детектор при 28Онм.
Після кон'югації з РЕС в ОМ5О при мольному співвідношенні НОКЕ:РЕС 1:1 були отримані 4 піки: б5 1. 13,2хв основний пік;
2. 13,7хв основний пік; 3. 14 4хв слабий пік; і 4. 8,бхв слабий пік 9 Після кон'югації з РЕС в ОМ5О при мольному співвідношенні НОКЕ:РЕС 1:2 були отримані 4 піки: 1. 13,2хв слабий пік; 2. 13,7хв слабий пік; 3. 14,4хв основний пік, і 4. 15,Бхв слабий пік.
Після кон'югації з РЕС в ОМ5О при мольному співвідношенні: РЕС 1:3 були отримані 2 піки: 1. 14 4хв слабий пік; і 2. 15,5хв основний пік.
Елюйовані фракції, відповідні пікам, збирали, випаровували, щоб видалити ацетонітрил і трифтороцтову кислоту, і потім ліофілізували. Сухий продукт потім розчиняли в 10мММ розчині оцтової кислоти і аналізували, як тут указано, після ідентифікації і визначення кількостей виділених зразків.
Було встановлено, що кон'югат ПОКЕ-РЕС, елюйований за 13,2хв, є сполукою АТ (СКЕ-1РЕбС, перший пік).
Було встановлено, що кон'югат ПОКЕ-РЕС, елюйований за 13,7хв, є сполукою А2 (СКЕ-РЕС, другий пік).
Було встановлено, що кон'югат ПОКЕ-РЕС, елюйований за 14 4хв, є сполукою АЗ (СКЕ-2РЕВ).
Було встановлено, що кон'югат ПОКЕ-РЕС, елюйований за 15,5хв, є сполукою А4 (СКЕ-ЗРЕВ).
Було встановлено, що пік, елюйований за 8,9хв, містить некон'югований ПНОКЕ. са
Як типовий приклад зворотно-фазова хроматографія продуктів кон'югації з РЕС, отриманих при молярному (5) співвідношенні РЕС:ХАОКЕ 2:1, показана на Фіг.2.
Сухі продукти отримували випаровуванням розчинника або ліофілізацією.
Приклад За.
Кон'югація НОКЕ за допомогою РЕС 10000 в розчині. (Се)
У цьому прикладі використовувався монометоксильований РЕС з розгалуженим ланцюгом і молекулярною - масою 10000 Дальтон з лізином в якості спейсера (отриманий від Зпеагмайег Роїутегзв Іпс.). Цей розгалужений
РЕС був отриманий скріпленням кожної аміногрупи лізину і РЕСворо. -
Карбоксигрупа лізинового спейсера, активована до сукцинимідного ефіру, взаємодіяла в ОМ5О з с аміногрупами ПОКЕ-(1-29)-МН» при мольному співвідношенні О,9моль РЕС на моль ОКР.
Розчинник видаляли і залишок фракціонували гельексклюзивною хроматографією на препаративній колонці -
Зцрегозе 12 ТМ. Елюювались 2 піки, відповідні двом кон'югатам НОКЕ-РЕС. Перший (слабий) пік відповідав кон'югату, що має 2 фрагменти РЕС10000, пов'язаних з ПОКЕР, другий (основної) пік відповідав кон'югату, що містить один фрагмент РЕС10000 на пОКЕ. «
Приклад ЗБ.
Кон'югація НОКЕ з РЕС20000 в розчині - с У цьому прикладі використовувався монометоксильований розгалужений РЕС з молекулярною масою 20000 и Дальтон з лізином в якості спейсера (отриманий від Зпеагмайег РоїЇутегв, Іпс.). є» Цей розгалужений РЕС був отриманий скріпленням кожної аміногрупи лізину і РЕС10000.
Карбоксигрупа лізинового спейсера, активована до сукцинимідного ефіру, взаємодіяла в ОМ5О з аміногрупами ПОКР-(1-29)-МН» при молярному співвідношенні О,9моль ПЕГ на Тїмоль СКЕ. -і Розчинник видаляли ліофілізацією, а залишок фракціонували гельексклюзивною хроматографієєю на препаративній колонці Зирегозе 12 ТМ. Був отриманий єдиний пік, відповідний кон'югату, що містить один (95) фрагмент РЕС20000 в розрахунку на ПОКЕР. - і Приклад 4. -л 20 Аналітична характеристика кон'югатів НОКЕ-РЕО.
Продукти, отримані так, як описано вище, були перевірені на наявність пов'язаних ланцюгів РЕС за 42) допомогою наступних методик: 1. Колориметричний спосіб, заснований на (використанні) тринітробензолсульфонату, використали для визначення вільних аміногруп (як описано у Набееа еї а!., 1966); 2. Колориметричний метод, заснований на йодному аналізі, був використаний для визначення вмісту РЕС |Як о описано у 5ітзвг еї а!., 19801;
З. Використали кількість ланцюгів РЕС, засновану на (використанні) норлейцину в якості показника в їмо) амінокислотному аналізі (як описано у 5Загіоге еї аї., 19911; 4. Мас-спектроскопія використовувалася для визначення молекулярної маси кон'югатів. 60 МАГОЇ - мас-спектрометрія використовувалася, щоб визначити молекулярну масу кон'югатів і їх полідиспергованість, породжену полідиспергованістю початкового РЕО.
Аналіз кон'югатів НОКЕ-РЕС відносно сайта приєднання РЕС проводили за допомогою амінокислотної послідовності. Кожний зразок розбавляли в 100 раз. Потім 1Омкл цього розчину (біля 5Опікомоль) завантажували в секвенатор. 65 Чистота кінцевого продукту підтверджувалася даними КР НРІ С аналітичної хроматографії.
Аналіз виконували за допомогою С18 аналітичної колонки (Мудас) з елюцією градієнтом НьО/0,0590 трифтороцтової кислоти (елюент А) і сумішшю ацетонітрилу і 0,0595 трифтороцтової кислоти (елюент В) таким чином:
О-бхв /8096А 9 5-БОхв 8096А. »595А 50О-Бохв БоБА 52-54хв 5956А-»809А 70 Швидкість потоку мл/хв, сор 20мкл/ ОМ-Мів. Детектор при 226бнм.
Некон'югований НОКЕ елюювали за 20,7хв.
Сполуку АТ елюювали за 22,9хв, сполуку А2 елюювали за 23,4хв, сполуку АЗ за 24 4хХв і сполуку А4 за 25,5хв.
Конформаційна характеристика "нативного" і полімерпов'язаних пептидів здійснювалася на основі аналізу кругового дихроїзму.
Спектроскопічну характеристику некон'югованого ПОКЕ і кон'югатів НОКЕ-РЕС здійснювали на основі аналізу кругового дихроїзму в межах 190-300нм. Зразки (5Омкг/мл) розчиняли в Т1О0мММ оцтової кислоти або суміші метанол/10мММ оцтової кислоти з молярним співвідношенням 30:70 і 60:40. У всіх вище перелічених розчинах некон'югований ПОКЕ і кон'югати НЗКЕ-РЕС виявили свої особливості, як це показано на Фіг.4 для сполуки АЗ. У розчині оцтової кислоти пептиди були в хаотичній конформації, тоді як при підвищенні концентрації метанолу ор пептиди приймали о-спіралевидну структуру.
Результати показують, що кон'югація РЕС не змінює значно структурних особливостей цього пептиду.
Приклад 5.
Визначення стабільності кон'югатів НОКЕ-РЕО
Стабільність ПОКЕ і кон'югатів НЙОКЕ-РЕС у відношенні протеолізу досліджували за допомогою с протеолітичних ферментів, таких як субтилізин і хімотрипсин.
Досвід з субтилізином здійснювали шляхом інкубування при 42С 0,297мММ пептидного розчину в 0,1М Тріс НСІ о 0,О05М Сасі. рН 8,0 при мольному співвідношенні пептид/протеазу 1:50000.
У випадку з хімотрипсином пептид був розчинений в 0,08М Тріс НОСІ, 0,1М Сасі. рН 7,8 і використовувалося мольне співвідношення пептид/протеазу 1:15000. Ге)
Після режиму деградації проводили аналітичну КР-НРІ С за допомогою колонки С18 з елюцією в тих же умовах, що приведені в прикладі 4. Висота, відповідна піку початкової сполуки, була обчислена перед -- інкубацією з протеолтичним ферментом і після наміченої за планом тривалості інкубації. Відсоткова частка че залишкової висоти при наміченій тривалості була обчислена, і вона показана на Фігурах За і ЗБ.
Приклад 6. о
Кон'югація з алкилюванням РЕОС че
ПОКЕ кон'югували з монометоксильованим РЕС, активованим різними ацилованими групами, а також алкілувальними групами. Алкілюючий РЕС мав перевагу, що дозволяє отримувати кон'югати, в яких зберігається позитивний заряд на залишку лізину.
Виділення і оцінка властивостей здійснювалися так само, як описано в прикладах 1-4. «
Приклад 7. шщ с Оцінка активності кон'югатів НОКЕ-РЕО. й Матеріали «» Сполуки, що використовуються
Людський ОКЕ1-29 пОКЕ(1-29)-МН», партія 1299201, поставлений Васпет;
Людський СКЕЗ3-29 пОКг(3-29), поставлений Васнепт; -і Людський ОКЕЗ3-29, поставлений ІІ; і кон'югати ПОКЕ-РЕС приготовані, як описано вище. о Реагенти -І СНО-пОКЕК-ЦШС для досліджень іп мікго.
Середовище МЕМ альфа з рибонуклеозидами і дезоксирибонуклеозидами (Сірсо), що містить 1090 - навколоплідної сироватки теляти (бірсо) плюс бО0Омкг/мл сульфату дженетицину 5418 (бірсо);
Ф Реагент для лізису клітинної культури (Рготеда);
Реагент для аналізу на основі люциферази (Рготеода); і
Ї исійе (Раскага).
Іп міго біообстеження гіпофізарних клітин пацюка.
Набір збалансованих солей Еагпе (ЕВЗБ5)((зірсо), що містить 5Омкг/мл сульфату гентаміцину (Зідта). іФ) Середовище 199 (М199) з солями Еагпіе (бірсо) з 12,595 навколоплідної сироватки теляти (ЕВ) (Сібсо) і 5Омкг/мл ко сульфату гентаміцину.
Набір для дослідження СН пацюка, поставлений Атегепат. Ферментний розчин для біодеструкції тканин бо (приготований на ЗоОмл ЕВЗ5): 120мг колагенази (Зідта)
Зомг гіалуронидази (5ідта)
ЗОмг ДНКази І (Зідта) 900мг БСА (Зідта) 65 Після складання розчину його стерильно фільтрують і вміщують в термостат при 372
Біологічний аналіз іп мікго.
Набір для радіоїмуноаналізи (ЇН пацюка, поставлений Атегепат. Набір для радіоїмуноаналізу СКЕ (1-44) людини, поставлений Ріоепіх РІіаптасеціїсаї.
Тварини
ЗРЕ дорослі пацюки - самці Зргадое-ОСаміеу, вагою 200-250г, постачання Спагіез Кімег, використовувалися після періоду акліматизації, що продовжувався, щонайменше, 7 днів.
Методи
Дослідження іп міго СНО-ПОКЕК-І ОС.
СНО-пОКЕК-ЦОС (клон 1-11-20) представляє собою лінію клону клітин, яка була отримана шляхом спільної /о трансфекції векторами рсоОМАЗ-пеКР-К і ртТЕ5-53 ОС СНО-РИКХ клітинних лінії.
Плазміда рсоОМАЗ-пОКЕ-К була сконструйована включенням СОМА рецептора рилізинг-чинника гормону росту людини (ПОКЕ-К) у вектор експресії рсОМАЗ. ВіІпезстгірі плазміда, що містить СОМА-пОКЕ-К, була люб'язно представлена д-ром В.Сауїїпп (Опімегейу ої Мігдіпіа), експресуючий вектор рсОМА ссавців був отриманий від
Іпмйгодеп. Кодуюча ПОКЕ-К послідовність була отримана за допомогою промотора цитомегаловірусу (СММ) /5 людини. її карта рестрикції приведена на Фіг.12.
Плазміда рТЕ5-53 ОС була сконструйована вбудуванням с-о5з елемента відповіді ЦАМФ в область розташування ендогенного промотора вище кодуючої люциферази послідовності в плазміді роЇ и5. Елемент відповіді з ЦАМФ і с-юз промотор були отримані з плазміди рТЕ5-53 (описана Рїзп еї аї!., 1989). Вектор, що містить безпромоторний маркерний ген (роЇ и5) з багатьма сайтами клонування в області, розташованій над 2о послідовністю, що кодує люциферазу, був отриманий від д-ра Вгазієг (Опімегейу ої Техаз, Саїмевіоп). Його карта рестрикції приводиться на Фіг.13.
Ці клітини СНО-БШКХ, отримані, як указано вище, котрансфекцією, звичайним способом культивували на середовищі МЕМ альфа, що містить рибонуклеозиди і дезоксирибонуклеозиди, а також 1095 навколоплідної сироватки теляти плюс бООмкг/мл сульфату дженетицину 5418. сч
Перед дослідженням клітини висівали (40000 клітин на лунку) на білі 9б-луночні планшети (Бупаїесі) і інкубували протягом 16-18 годин в 200мкг/мл культурального середовища. і)
На наступний день середовище видалили і замінили його середовищем, що містить різні концентрації
ОК (1-29), введені в еталонний стандарт (Васпет), або різні кон'югати ПОКЕ-РЕС, перед інкубуванням планшету при 372С і 595 СО» протягом 2-х годин. У кінці інкубування СНО-СОКЕК-І ОС-клітини двічі промивали Ге 3о 20Омкл РВЗ (Зідта) і потім лізували доданням в кожний осередок 50мкл спеціального реагенту для лізису клітин (Рготеда). Після подальшого 15-хвилинного інкубування при кімнатній температурі і введенні 15О0мкл - люциферазного реагенту для аналізу (Рготеда) пластини переглянули в люмінометрі (Оупайесі). ї-
В якості альтернативнного способу СНО-пПОКЕК-І ОС-клітини, засіяні по 50000 клітин в осередок, в кінці інкубування з різними кон'югатами НЗКЕ-РЕС промивали РВ5, як описано вище. В кожний осередок додавали і.
ООмкг/мл РВ5, що містить іони кальцію і магнію, потім додавали 10Омкл І исійе (РасКага). Після 10-хвилинної ї- витримки при кімнатній температурі пластини зчитувалися в люмінометрі (І итісоипі-РаскКага).
Результати виражали у відносних світлових одиницях (КІ )).
Оцінка біологічної активності (1-29) на клітинах гіпофізу пацюків
Тваринні (ЗРЕ пацюки-самці Зргадце-Оваулеу з масою тіла 200г були умертвлені інгаляцією СО» і в них були « видалені гіпофізи. Тканину ретельно подрібнювали і вміщували в місткість з розчином ферменту для шщ с біодеструкції тканини. Місткість вміщували в термостат при 372С на 1 годину. ц Деструктировану тканину витягували і клітини двічі промивали, підраховували і доводили концентрацію до ня Бх105/мл. Клітини вмі 48 і х . щували на пластину з осередками (200мкл/осередок), пластину вміщували в термостат на 72 години.
Через 72 години клітини інкубували з ПОКЕР при різних його концентраціях протягом 4 годин. По завершенні - інкубування збирали надосадкові рідини і зберігали їх при -8020. с Вміст СН в кожному зразку визначали за допомогою набору, що є в продажі для радіоїмуноаналізу щурячого
Он. - Дослідження іп мімо -оУу 70 Тваринам ім. вводили НОКЕ (1-29) (400мкг/пацюк). За декілька хвилин до забору крові тварин анестезували (кета-мін-ксилазин). У кожного пацюка з нижньої порожнистої вени відбиралося по два мл крові. Зразок ділили ії; на 2 аліквоти: 1мл відбирали сам по собі і сироватку отримували після інкубування протягом біля З годин при 3720 з подальшим центрифугуванням; їмл, що залишився збирали в ампулу, що містить 5Омкл розчину гепарину з концентрацією 4мг/мл, негайно поміщали на лід і отримували плазму після центрифугування при 429С. 25 Зразки крові відбирали в різні моменти часу після ін'єкції випробуваної сполуки від різних тварин. У
ГФ) кожному експерименті для кожного моменту часу використовувалося по троє пацюків. юю Зразки плазми і сироватки негайно заморожувалися і зберігалися при -2090.
Рівні вмісту СН в сироватці вимірювали за допомогою набору, який є в продажу, рівні вмісту в плазмі вимірювали за допомогою КІА набору, що продається для ПОКЕ(1-44). бо Результати
Примітка: У цьому розділі і відповідних фігурах "СКЕ-ІРЕО 1-й пік" відповідає
І .У(МРЕС5000-СН2-СО-Міе-СО) 21-пО В Е(1-29)-МН», "СВЕ-ТРЕС 2-й пік" відповідає
І УВ(МРЕО, у 307УН,-СО-Міве-СО) 12. (1-29)-МНаЇ, "ОКЕ-2РЕС" відповідає 65 І Уг(МРЕС водо СН.-СО-Міе-СО) 12277 -пОвВ(1-29)-МНЇ і "СКЕ-ЗРЕС" відповідає Мо-(МРЕЄСводо-СНо-СО-Міе-СО)
ІСУЗ(МРЕСвьовсо-СНо-СО-Міе-СО) 1221-НОВЕ(1-29)-МНУ1.
Дослідження іп міго СНО-ПОКЕК-Г ОС
Активність двох різних груп кон'югатів ПОКЕ-РЕС, приготованих з використанням ЮОМ5О, при дослідженні іп
Мо СНО-пОКЕК-ЦШС, показана на Фігурах 5 і 6.
Було встановлено, що всі препарати активні, незважаючи на менший рівень вмісту в порівнянні з "нативним"
НЯОКЕ (ПОКЕ, підданий тим же стадіям очищення, використовувався для кон'югації з РЕС сполук), причому
СКЕ-ІРЕС (ії 1-й, і 2-й піки) був більш активним, ніж СКЕ-2РЕС і ЗКЕ-ЗРЕО. Ніякої різниці між пОКЕ і "нативним" ПОКЕ не спостерігалося (дані не приводяться). 70 Спостерігалася подібна іп омйго біологічна активність кон'югатів ПОКЕ-РЕС з обох отриманих з використанням ЮОМ5О партій (Фіг.5 ме Фіг.б), а також кон'югатів, з партії, отриманої з використанням розчину нікотинаміду (Фіг.7). На Фіг.б показані також 2 різних ПНОКН(3-29) препарати, що не мають значну активність іп міо в порівнянні з НОКЕ (1-29).
Дослідження іп міїго гіпофізарних клітин пацюка на активність НОКЕ 29.
У обох дослідженнях, проведених на основі кон'югатів НЗКЕ-РЕС, отриманих з використанням ОМ5О, було встановлено, що ЗКЕ-1РЕС 1-й пік відповідає самій активній сполуці, потім йде СКЕ-1РЕС 2-й пік, потім -
СКЕ-2РЕС і нарешті, ЗКЕ-ЗРЕС (Фігури 8 і 9). Ці висновки добре узгоджуються з тими, які отримані при дослідженні маркерного гену.
Дослідження іп мімо
У попередніх дослідах рівні сировоточного СН і плазмений ПОКЕ визначалися на пацюках, вихід з ім. ін'єкції 4А0О0мкг АЯОКР. Відповідні результати проілюстровані на Фіг.10. Як показано, і СН і ПОКЕ дають піки через 1Охв після ін'єкції НОКЕ. Потім концентрації СОН в сироватці швидко знижуються і повертаються до базального рівня через бОхв, тоді як концентрації НОКЕ в плазмі зберігаються на колишньому рівні протягом того ж тимчасового інтервалу. с
На Фіг.11А ї 118 показані рівні СН і ОКЕ в крові в різні моменти часу протягом 48 годин у пацюків, яким були і.м. введені по 40Омкг 1-го і 2-го піків ЗКЕ-ТРЕС; СКЕ-2РЕС і СКЕ-ЗРЕС (приготовані з ОМ5О). і9)
Всі кон'юговані з РЕС препарати дають пік сировоточного СН через 10хв після ім. ін'єкції подібно ПОКЕ 1-29. Однак, хоч 1-й і 2-й піки ЗКЕ-1РЕС і ЗКЕ-2РЕС показують рівні сировоточного СН, порівнянні з тими, що отримані від НОКЕ..2о, підтверджується, що СКЕ-ЗРЕС є менш активним, ніж це встановлено у випробуванняхіп.о «о
М.
Що ж до рівнів ОКЕ в плазмі, то тут спостерігається абсолютно інша картина у відношенні 1-го і 2-го піків --
СКЕ-ІРЕС ов порівнянні з СКЕ-2РЕС і ОКЕ-ЗРЕС безвідносно типу приготування препарату, що рч- використовується (з використанням ОМ5О або нікотинаміду). Протягом 48 годин після ін'єкції ЗКЕ-ІТРЕС 1-го і 2-го піків концентрації СОКЕ в плазмі повертаються до базального рівня, тоді як рівні вмісту, що найбільш о довго зберігаються відповідають ЗКЕ-2РЕС і СКЕ-ЗРЕО. -
Приклад 8.
Твердофазний синтез сайт-захищених похідних пПОКЕ(1-29)-МНо, в якості початкових сполук в процесі кон'югації з РЕО. «
Був здійснений твердофазний синтез похідних ПОКЕ(1-29)-МНо, що містять специфічну захисну групу (М-алілоксикарбоніл-групу) в положенні первинних аміногруп як Гуз 72, так і ув", Це дозволяє провести - с сайт-специфічну кон'югацію з РЕС Мо-кінців. Інші амінозахищені похідні отримують блокуванням Мо-кінця за "» допомогою оацилювання і Гуз 72 Мо-лілоксикарбонільною групою. Цю похідну використовують для " сайт-специфічної кон'югації з РЕО.
Матеріали і методи
Операції пептидного синтезу
Ш- Всі продукти приєднання ПОКЕР пептидних похідних до смол були спочатку зібрані Етос-хімічним методом за
Га допомогою пептидного синтезатора фірми Арріїед Віозузіетв Іпс. модель 431А, з використанням РАГ-РЕОС-Р5 смоли з низькою мірою заміщення (0,1бммоль/г) і подвійного поєднання з введенням протоколу для кожного - залишку, щоб оптимізувати кількість і чистоту неочищеного продукту, що отримується. Додатково продукт - 70 приєднання пептиду |(М-изопропил-Туг ", І ув(АПос) 2-пОВЕ(1-29)-МНо до смоли піддавали процедурі відновного алкилювання, що виконується вручну, щоб приєднати М-термінальну ізопропільну групу. с Всі продукти приєднання пептидів до смоли розщеплювали сумішшю трифтороцтової кислоти (ТЕА), 1,2-етандитиола, тіоанізолу і води 1(10:0,5:0,5:0,5 (об'єм/об'єм) протягом 2 годин і неочищені пептиди виділяли осадженням в МТВЕ і центрифугуванням. Ліофілізовані неочищені пептиди очищали градієнтною ВЕРХ 29 |з зверненням фаз на препаративній колонці Мудас С18 з допомогою 0,195 ТРА - вода/ацетонітрильної буферної
ГФ) системи. Всі очищені пептиди були охарактеризовані за допомогою аналітичної хроматографії із зверненням фаз до МАЇ 0І-ТОЕ мас-спектрометрії. іме) .
Матеріали.
Етос-І -амінокислоти (Васпет Віозсіепсе, Регзеріїме Віозузіетв, МомаВіоспет), ДМФ, 20л бочка (9.Т. ВакКег), 60 піперидин (Арріїей Віозузіетв, Спет-Ітрех), НВТИШ (Каїпіп, Кіспеїйеи Віоїесппоіодіеєв), МММ (Аїагіс!п), оцтовий ангідрид (Арріїед Віозузіетв), смоли (Регзеріїме Віозувіетв, Мома Віоспет), о-ціано-4-гідрокси-корична кислота (бБідта), синапінова кислота (А1-агістп), ацетонітрил (У.Т. ВаКег), ТЕА (Зідта, Ріегсе), деїонізована вода (МіПроге Міїї-О УМагег Ззузіет). Інші розчинники і реагенти перераховуються нижче: б5 Реагенти/Розчинники Продавці
ММ Арріїеа Віовувіетв Іпс., У.Т. Вакег нвт Арріїеа Віозувіетв Іпс.,
Кіснеїїеи Віоїеснпоіодіев Іпс. 0,5 НОВІ в ОМЕ Арріїей Віозувіетв Іпс. 2,0М ОІЕА в ММР Арріїей Віозувіетв Іпс. піперидин Арріїей Віозувіетв Іпс. дихлорметан Арріїей Віозувіетв Іпс. оцтовий ангідрид Арріїей Віозувіетв Іпс.
Амінокислоти: велика частина ЕМОС - амінокислот, що використовуються на синтезаторі АВІ 431А, були закуплені у Арріїєд Віозувіетз у вигляді 1,0ммолярних картриджів з визначеною вагою. Етос-1І уз(АЇПос)-ОН була закуплена у Регзеріїме Віозувіетвз (РгатіпдаН2т, МА) по масі і картриджі заповнювалися на місці. Всі амінокислоти, що використовуються були І -конфігурації.
Смоли: початкові смоли, ті, що використовуються для пОКЕ-аналогів були РАІ -РЕС-РЗ (пептид-амідний лінкер - поліетиленгліколь-полістирол)смоли. РАГЇ-РЕС-РОЗ носії, закуплені у Регзеріїме Віозузіетв, постійно показують чудові результати по чистоті і виходу неочищеного продукту. Смолу з низькою мірою заміщення 0О,1бммоль/г використали для всіх похідних. Смоли з низькою мірою заміщення звичайно використовують для довгих важких ланцюгів, щоб забезпечити краще поєднання і зменшити стеричне ускладнення і виникнення 2о ефекту р-розпластання в пептидних ланцюжках, що нарощуються.
Методи
Збирання ланцюжка - пептидний синтезатор фірми Арріїєд Віозузіетвзв Іпс., модель 431А.
Ланцюжки захищених пептидів спочатку збирають за допомогою Етос-методу на пептидному синтезаторі фірми Арріїеа Віозувзіетзг Іпс., модель 431А, в якому використовуються програмні цикли швидкого Етос(Раві с
Мостм) НВТИи використовується для активації і поєднання, 2095 піперидин - для зняття захисту, а ММР - основний розчинник, що використовується для зняття захисту, розчинення амінокислот і промивки смоли. Амінокислотами і) заповнюють 1,0ммоль картриджі розраховані на заздалегідь визначену вагу. У 0,25ммольних Раві Мостм циклах використовують 1,О0ммольні картриджі і реакційну місткість об'ємом 4Омл.
Збирання ланцюжка - спосіб (се)
Стадії для програмних циклів, каліброваних по О0,25ммоль, можуть бути загалом охарактеризовані таким чином: - 1. Зняття захисту піперидином. - Смолу спочатку промивають ММР, потім обробляють 1895 розчином ї- піперидину в ММР, і зняття захисту відбувається за Зхв. Рідині в реакційній місткості дають стекти, заливають 2090 розчину піперидину і процес зняття захисту продовжується біля 8хв. о 2. Розчинення амінокислоти - ММР (2,1г) і О0,Уммоль 0,45М НВТИО/НОВІ в ОМЕ (2,0г)додають в картридж і че перемішують протягом 6 хвилин.
З. Промивання ММР - з реакційної місткості дають стекти рідині і промивають смолу ММР 5 раз. 4. Активація амінокислоти і перенесення в реакційну місткість (КМ) - їмл 0,2М ОІЕА в ММР додають в « картридж, щоб почати активацію амінокислоти, потім переносять з картриджа в КМ. 5. Поєднання і кінцеве промивання - Реакція поєднання між активованою амінокислотою і пептидом зі знятим - с М-кінцевим захистом, приєднаним до смоли, продовжується біля 20 хвилин, потім рідку фазу з КМ зливають і ц смолу промивають ММР. ,» 6. Завершення (при бажанні) - Приблизно 12мл 0,5М оцтового ангідриду, 0,125М ОІЕА і 0,015 НОВІ в розчині
ММР додають в реакційну місткість і збовтують протягом 5 хвилин. Це повинно приводити до ацетилювання будь-яких вільних точок, що не зазнали поєднання на смолі, що дає в результаті усічені, а не делеговані - І ланцюжки, що потім значно спрощує стадії очищення. с Повний протокол для цих циклів можна знайти в Арріїей Віо-зувіетвз Овег ВиПейп М 35 (РГазіМостм 0,25 і 0,10 для Моделі 431А). -і Стандартний план для типового синтезу -л 20 Стадія 1. Промивка смоли ЗХ ОМЕ.
Стадія 2. Зняття захисту 2Х по 5хв 2095 піперидином в ОМЕ. 4) Стадія 3. Промивка смоли 6Х ЮОМЕ.
Стадія 4. Поєднання протягом 45хв амінокислоти, активованої сумішшю НВТО/МММ в ОМЕ.
Стадія 5. Промивка смоли ЗХ ОМЕ.
Для важких ланцюгів додаткова стадія завершення, в якій використовується 7095 оцтовий ангідрид в ОМЕ о протягом 20хв для ацетилювання будь-яких незайнятих точках на смолі з приєднаним пептидом, що дає в результаті в кінцевому неочищеному продукті усічені, а не делеговані ланцюги, може здійснюватися після стадії ко поєднання.
Відщеплення/Екстракція 6о0 Суміш, яка відщдеплюється, що використовується для видалення захищаючих груп і від'єднання пептиду від смоли, є стандартною сумішшю, що застосовується для пептидів, що містять аргинін і/або метіонін. Для 0,1-1,5г продукту приєднання пептиду до смоли: 1Омл трифтороцтової кислоти, 0,5мл деїонізованої води, 0,5мМл тіоанізолу, О,5мл етандитіолу (8796 трифтороцтової кислоти, 4,390 деїонізованої води, 4,390 тіоанізолу, 4,390 етандитіолу). бБ Процедура відщеплення 100мг-1г приєднаного до смоли пептиду вміщують в 20мл скляну посудину і охолоджують в бані з льодом.
Готують відщеплюючу суміш і також охолоджують Її на льоду, потім додають до пептиду, пов'язаного зі смолою, до кінцевого об'єму приблизно 1Омл.
Посудину витягують з крижаної бані і дають йому нагрітися до кімнатної температури. Посудину закривають кришкою і перемішують реакційну суміш при кімнатній температурі протягом 2 годин.
Через 2 години розчин відфільтровують під вакуумом через пористий фільтр, що забезпечує протікаємість середовища, в приблизно ЗОмл холодного МТВЕ. Реакційну судину промивають тТмл трифтороцтової кислоти і фільтрують через ту ж саму фільтруючу воронку в холодний МТВЕ. Вся суспензія потім переноситься в 5Омл центрифужну пробірку і центрифугується протягом «10хв при 2000об/хв при кімнатній температурі. 70 Супернатант відсмоктують, залишок ресуспендують в 40мл холодного МТВЕ і центрифугують знову. Цю стадію повторюють ще раз. Кінцевий супернатант відсмоктують, а осад продувають азотом для випаровування основної кількості ефіру, що залишився в ньому.
Потім пептид розчиняють в 20-ЗОмл 1-1095 водного розчину оцтової кислоти, розбавленого приблизно 100-15Омл деїіонізованої води, заморожують і ліофілізують.
Очищення
Методи ВЕРХ із зверненою фазою
Система - М/айег: Оей(а Ргер 4000
Колонка - Мудас звернено - фазовий С18, 10мкм; 2,2х25см (Кат. Мо218ТР1022)
Буфери - А: Вода/0,1956 ТФК В:Ацетонітріл/0,1956 ТФК
Швидкість потоку - 15мл/хв
Детекція - УУа(егв 484 УФ детектор, 220нм,
Градієнт - такий, що змінюється, звичайно 0,295 В/хв аж до 1,095 В/хв.
Ліофілізовані неочищені пептиди отримують розчиненням 50-100мг пептиду в 200мл 0,195 водного розчину трифтороцтової кислоти. Пептидний розчин потім наносять безпосередньо на препаративну колонку через с ов резервуарну лінію буфера "А" і включають програму градієнта.
Зібрані фракції протягом ночі проганяють на аналізуючій ВЕРХ системі з автопробником. Фракції, які і) виходять, що досягають в піці більше за 9295 чистоти, збираються, розбавляються деїонізованою водою в співвідношенні 4-1, заморожуються і потім ліофілізуються в Міпіз 2551. заморожуючій сушарці.
Характеристика «о зо Звернено-фазовий ВЕРХ.
Умови: -
Система - насосна УУаїегз 510, 717 Автопробник, М
УФ детектор 490 мультидовгохвильовий,
Колонка - Мудас С18, 5мкм, 0,46Хх25см (Кат. Мо218ТРБ4) і
Буфери - А: НьО/0,195 ТЕА В: АСМ/О,195 ТЕА ї-
Швидкість потоку -Імл/хв.
Детекція - УФ: 214нм, 280нм.
Градієнт - 295 В/хв.
Обчищені ліофілізовані пептидні зразки готують розчиненням 0,2-1Омг пептиду у 0,195 водній трифтороцтової « 470 Кислоті до концентрації 0,5-1,Омг/мл. шщ с 15-185мкл наносять на колонку і елюють за допомогою градієнтної програми 0-5095 ацетонітрилу через 25хв. й Результати хроматографії збирають і зберігають, використовуючи УУ/адегз Ехреп-Еазе зоїмаге. «» Мас-спектрометрія
Тип: МАСО1І-ТОЕ (Матрикс-супутня лазерна десорбція) іонізація періоду польоту
Система: Регзеріїме Віозувіетз Моуадег ЕШе -І Матриці: а-ціано-4-гідроксикорична кислота, 1Омг/мл в 6795 АСМ/О,195 ТРА або синапінова кислота, 1Омг/мл в 5Одо АСІМ/О,190 ТЕА. о Зразки пептидів готують концентрацією 1-20мкмоль в 50956 АСМ/О,195 ТЕА. 0,5мкл розчину матрикса, а потім -І О,бБмкл зразка пептиду наносять на осередки пластинки для аналізу і дають висохнути. Аналітичну пластину 5о завантажують в машину, зразки сканують і аналізують, використовуючи КейПесіог ОеІауед-Ехігасіопметод, - оптимізований для пептидів. Для кожного зразка дані у вигляді кумулятивного сигналу від 32-128 лазерних доз
Ф збиралися і аналізувалися. У кожний прогон для калібрування включався осередок з пробою контрольного пептиду.
Специфічний синтез
Отримання ЦІ м5(АПос) 122711-НО В Е(1-293МН» о Продукт скріплення |(ГУз(АйПос) 12211-пОвЕ(1-29)-РАІ -РЕС-РЗ-смола спочатку синтезували Ріпос-методом на пептидноме синтезаторі Арріїейа Віозувіетв 431А (див. Методи синтезу вище), що включає зняття захисту ко М-кінцевої Етос-групи.
Продукт пептид - смола розщеплювали сумішшю ТЕА: 1/2-етандитіол:тіоанізол:івода 1(10:0,5:0,5:0,5 60 (об'єм/об'єм)| протягом 2 годин і виділяли пептид осадженням в МТВЕ з отриманням 240мг неочищеного пептиду. Очищення препаративною зверненофазовою ВЕРХ на колонці Мудас С18 (22 х250мм) приводило до отримання бОмг очищеного продукту (295905 - аналітична ВЕРХ). МАГ0І-ТОЕ мас-спектр.
Обчислено: 3523/8. Знайдено: 35242.
Отримання (Мео-ізопропіл- Туг!, І ув(АїПос) 2-пОВЕ(1-29)-МН» бо Збирання початкового продукту (ГГ Уз(АїПос) 171-пЛОВЕ(1-29)-РАІ -РЕС-РОЗ-смола.
І ув(АШос) 171-пО В Е(1-29)-РАЇ-РЕС-РЗ-смолу збирають Етос-методом на пептидному синтезаторі 431А фірми Арріїей Віозувіетвз (див. вище Методи синтезу), включаючи зняття захисту ЕГтос групи М-кінцевого залишку.
Мо-ізопропілювання шляхом відновного алкілювання
Ма-іїзопропільну групу приєднували відновним алкілюванням приєднаного до смоли пептиду з допомогою натрій-ціанборгідриду і відповідного кетону (ацетону), як описано Носагі еї аї.,, 1987. 880мг пептиду, приєднаного до смоли (77Омкмоль) замочували для набухання в бмл ЮОСМ протягом ЗОхв, потім додавали 1О0ммоль (174мкл) ацетону в 7мл МеоОнН/195 НОАс і суміш періодично збовтували протягом 2 годин при 70 температурі навколишнього середовища. Потім додавали 2ммоля (129мг) натрій-ціанборгідриду в 12мл
Меон/лияв НОАс, суміш періодично збовтували протягом 2 годин і потім залишили на ніч (15 годин). Якісний моніторинг з нінгідрином показав завершення реакції (відсутність блакитного фарбування). Пептид від'єднували від смоли сумішшю ТЕА;:1,2-етандитіол:тіоанізол:вода (|10:0,5:0,5:0,5 (об'єм/об'єм)| за 2 години і виділили пептид осадженням в МТВЕ з отриманням «200мг неочищеного продукту. Очищення препаративною 75 звернено-фазовою градієнтною ВЕРХ в системі розчинників Вода/Ацетонітрил/0,195 трифтороцтова кислота на колонці Мудас С18 (22х250мм) привела до отримання 5Омг чистого продукту ( 29595-аналітична ВЕРХ).
МА! 0І-ТОЕ мас-спектр: Обчислено:3481, 9, Знайдено: 3481,8.
Приклад 9:
Кон'югація з РЕС захищених ПпОКН(1-29)
Похідні НОКЕ, отримані як описано в прикладі 8, кон'югували з активованим РЕС, як описано в прикладах 1 і 6.
Очищення в цьому випадку включало тільки виділення з надлишку реагентів і побічних продуктів, тоді як не було необхідності здійснювати процедуру, описану в прикладах? І 3.
Список літератури с
Ариспомузкі А. еї аї., 9У.ВіоІ.Спет., 252, 3571-3581, 1977а; о
Ариспомузкі А. еї а/., У.Віої.Спет., 252, 3582-3586, 19776;
Вепспатр С.О.еї а!.. АпаіІ.Віоспет., 131, 25-33, 1983;
Саїісейїі еї аї., У.Віоасіїме Сотраїйбіе Роїутег, 8,41-50,1993;
Сатрреї! МК. еї аї. 9У.Рерііде Кез., 49, 527-537, 1997; (се)
Спап МУ.С.еї а!., У.Спет.Зос.Спет.Соттип., р.2209, 1995; «-
Сіагк МК. еї а1., У.Віої.Спет., 36, 21969-21977, 1996;
Бедавдо С. еї а!., Віоїесппоіоду апа Арріїей4 Віоспетівігу, 12, 119-128,1990; -
Е.ріск еї а!., Реріідез 1996. Ргосеєдіпоз ої (пе 24 Епгореап Реріїде Зутрозішт, Едіпригой, ЗсойМапа, 1997; с
Ееїїх А.М. еї аї., Іпї..Рерііде Ргоїеїіп Кез., 46, 253-264, 1995;
Рівй еї аІ,, Сепез апа ЮОемеіІортегпі, З, 1989, 198-211; -
Сгеепе Т.МУ. еї аі.. Ргоїесіїме Сгоиурз іп Огдапіс Зупіпевзів, допп УмМПеу апа Бопв, Іпс. Риб., рр.331-333, 1991;
Набреей А.5.Р.А. еї аї., Апаї.Віоспет., 14, 328-336, 1966. Наїтів 9У.М., Кем.Масготої. Спет.РПуз., С25, рр.325-76, 1985; «
Носагі еї а!., У.Меа.Спет., 30(4), 739-743, 1987;
Гм еї аї.. Іпі. 9У.Рерііде Ргоїеіп Кезв. 43, 1994, 127-138; - с Моптгагаїпі еї аї!., Віосоп.СНет., 6, 62-69, 1995; ч Могригоо еї а!., Віосоп.Спет., 7, 363-368, 1996; ,» Мигрпу, МУ.А. еї аі., Реріїде Кезеагспі, 1(1), 36, 1988;
Рапаеє С.5. еї а)., Ргос.Мак.Асайд.Зсі.О5А, 77, 895-899, 1980; запоге І. еї аї., Аррі.Віоспет.ВіогесппоїЇ., 27, 45, 1991; -і запоге І. еї аі., Арріїеа.Віоспет.Віоїесппо)., 31, 213-22, 1991; с Зітвз О.Е.С. єї аї., Апаї. Віоспет., 107, 60-63, 1980;
Тагп Р. еї аї.. Бігопуд асій дергоїесіоп ої зупіпеїййс рер-йдев. Іп Те Рерііде5, 9, 5.Одепітіепа апа -і У.Меїйепгрогег, едз.. Асадетіс Ргезв, МУ, рр. 185-248, 1987; шу 70 Мегопезе Г.М. еї аї., Аррі.Віоспет., 11, 141-152(1985);
Уатзвикі еї а!., Адгіс. Віої.Спет., 52, 2185-2196, 1988; 4; 7аїїрзКу 5. егаіІ., Роїутегіс Огидз апа Огид Оеїїмегу Зувіетв, адг: 9-110 АС5 Зутрозіцт зегіез 469, 1990, апа 7аїїрзКу 5. еї аіІ., Еигор.Роїут..)., 19, 1177-1183, 1983.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
(1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: о () ЗАЯВНИК (А) НАЗВА-АРРІИЕО КЕЗЕАКСН 5УЗТЕМ5 АК НОЇ ОІМО М.М. де (В) ВУЛИЦЯ: 14 ХОНМ В.СОБКБІКАУЕО (С) МІСТО: СОКАСАО 60 (Е) КРАЇНА: ТНЕ МЕТНЕКІ АОБ АМТІС Е5 (Р) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС (7ІР): МОМЕ (б) ТЕЛЕФОН: 639300 (Н) ФАКС: 614129 (ї) НАЗВА ВИНАХОДУ: РІДИННОФАЗНЕ САЙТ-СПЕЦИФІЧНЕ ОТРИМАННЯ КОН'ЮГАТІВ 65 (її) ЧИСЛО ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: І (м) ТИП КОМП'ЮТЕРНОГО ПРОЧИТАННЯ
(А) ТИП НОСІЯ: ГНУЧКИЙ ДИСК (В) КОМП'ЮТЕР: РС СУМІСНИЙ З ІВМ (С) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: рс-дов/тв-дов (Б) ПРОГРАМНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ: Раїепіїп Кеїеазе 241.0, Мегвіоп К 1.30 (ЕРО) (2) ДАНІ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ ЗЕО ІО МО:1: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 29 амінокислот (В) ТИП: амінокислотна 70 (С) ЛАНЦЮЖНІСТЬ (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ГІПОТЕТИЧНІСТЬ: НЕМАЄ (м) АНТИЧУТЛИВІСТЬ: НЕМАЄ (хї) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО МО: І:
Claims (1)
- Формула винаходу 20 1. Спосіб сайт-специфічного одержання кон'югату ПОКЕ-РЕС, що містить одну або декілька ланок РЕС (у розрахунку на ПОРЕ), ковалентно зв'язаних щонайменше з одним з І уз 72, | ув?! і МА, який включає проведення реакції кон'югації між пептидом ПОКЕ і активованим РЕС у розчині при значенні рН 7-9 і виділення й очищення цільового кон'югату НОКЕ-РЕС з реакційної суміші.2. Спосіб за п. 1, у якому розчин являє собою концентрований водний розчин нікотинаміду або водний сч 25 буферний розчин денатуруючого агента.З. Спосіб за п. 71, у якому розчинник являє собою полярний органічний розчинник, вибраний з і) диметилсульфоксиду, суміші диметилформаміду і буфера або суміші ацетонітрилу і буфера.4. Спосіб за п. 1, у якому кон'югат НОКЕ-РЕС виділяють з реакційної суміші й очищають хроматографічними методами. Ге зо 5. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому пептид АОКЕ являє собою ПОКЕ(1-29)-МН» .6. Спосіб за п. 1, у якому перед реакцією кон'югації з РЕСО пептид ПОБЕ захищають по одному або декількох (87 з положень М", І ув? і І ув, М7. Спосіб за п. 1 або 6, який додатково включає зняття захисту після реакції кон'югації з РЕС.8. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому активований РЕС є алкілуючим або адилюючим РЕС у о з5 Ммонометоксильованій формі. ч-9. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому реакцію кон'югації з РЕС проводять при температурі навколишнього середовища.10. Кон'югат ПОКЕ-РЕС, що містить щонайменше одну ланку РЕС (у розрахунку на ПОКЕР), ковалентно « зв'язану щонайменше з одним з І уз 72, І ув?! і МА, 40 11. Кон'югат ПОРЕ-РЕС за п. 10, у якому одна ланка РЕС ковалентно зв'язана з І уз 72, т с 12. Кон'югат НОБЕ-РЕС за п. 10, у якому одна ланка РЕС ковалентно зв'язана з І ув7". » 13. Кон'югат НОБЕ-РЕС за п. 10, у якому одна ланка РЕС ковалентно зв'язана і з І ув 77, і з І ув",14. Кон'югат НОРБЕ-РЕС за п. 10, у якому одна ланка РЕС ковалентно зв'язана з кожним з І уз 12, І ув?! і МА,15. (Суз (Аїос)2211-НОРЕ, проміжна сполука в реакції кон'югації з РЕС за п. 1. -і 16. (МА -ізопропіл-ТУг!, І уз (АПос)12)-НОРЕ, проміжна сполука в реакції кон'югації з РЕС за п. 1.17. Кон'югати АЗКЕ-РЕС за пп. 10-14, застосовні як лікарський засіб. о 18. Застосування кон'югатів за будь-яким з пп. 10-14 у виробництві лікарського засобу для лікування, -І профілактики або діагностики порушень, пов'язаних з гормоном росту.19. Застосування за п. 18 у виробництві лікарського засобу для лікування або діагностики недостатності - гормону росту. Ф 20. Фармацевтична композиція, що містить кон'югати за будь-яким з пп. 10-14 разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями і/або наповнювачами. Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97121264A EP0922446A1 (en) | 1997-12-03 | 1997-12-03 | Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates |
| PCT/EP1998/007748 WO1999027897A1 (en) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA73716C2 true UA73716C2 (en) | 2005-09-15 |
Family
ID=8227732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2000063885A UA73716C2 (en) | 1997-12-03 | 1998-01-12 | Site-specific preparation of grf conjugated with polyethylene glycol |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6528485B1 (uk) |
| EP (2) | EP0922446A1 (uk) |
| JP (2) | JP2001524505A (uk) |
| KR (1) | KR100561768B1 (uk) |
| CN (1) | CN1149967C (uk) |
| AR (1) | AR017780A1 (uk) |
| AT (1) | ATE236607T1 (uk) |
| AU (1) | AU755285B2 (uk) |
| BG (1) | BG64815B1 (uk) |
| BR (1) | BR9815159A (uk) |
| CA (1) | CA2312004C (uk) |
| DE (1) | DE69813291T2 (uk) |
| DK (1) | DK1037587T3 (uk) |
| EA (1) | EA004269B1 (uk) |
| EE (1) | EE200000319A (uk) |
| ES (1) | ES2194376T3 (uk) |
| HK (1) | HK1034203A1 (uk) |
| HU (1) | HUP0100507A3 (uk) |
| IL (2) | IL136551A0 (uk) |
| NO (1) | NO327238B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ504570A (uk) |
| PL (1) | PL192082B1 (uk) |
| PT (1) | PT1037587E (uk) |
| SI (1) | SI1037587T1 (uk) |
| SK (1) | SK8242000A3 (uk) |
| TR (1) | TR200001615T2 (uk) |
| TW (1) | TWI254641B (uk) |
| UA (1) | UA73716C2 (uk) |
| WO (1) | WO1999027897A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA9811068B (uk) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010055581A1 (en) | 1994-03-18 | 2001-12-27 | Lawrence Tamarkin | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| US6407218B1 (en) * | 1997-11-10 | 2002-06-18 | Cytimmune Sciences, Inc. | Method and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs |
| US7229841B2 (en) * | 2001-04-30 | 2007-06-12 | Cytimmune Sciences, Inc. | Colloidal metal compositions and methods |
| AU9558901A (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-15 | Ares Trading Sa | Regioselective liquid phase pegylation |
| EP1234583A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| US20030171285A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-09-11 | Finn Rory F. | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
| ATE371680T1 (de) * | 2002-01-16 | 2007-09-15 | Biocompatibles Uk Ltd | Polymerkonjugate |
| US7998705B2 (en) * | 2002-08-06 | 2011-08-16 | FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U.S.A., Inc | Increased dynamic binding capacity in ion exchange chromatography by addition of polyethylene glycol |
| MXPA05002991A (es) * | 2002-09-18 | 2005-10-05 | Univ Montreal Ct Hospitalier Chum | Analogos de ghrh. |
| GB0301014D0 (en) * | 2003-01-16 | 2003-02-19 | Biocompatibles Ltd | Conjugation reactions |
| US7662915B2 (en) * | 2003-01-18 | 2010-02-16 | Pegsphere Co., Ltd. | Peptides having protected amines of untargeted sites, methods for production thereof and of specifically conjugated PEG peptides using the same |
| US20050058658A1 (en) * | 2003-07-15 | 2005-03-17 | Barros Research Institute | Compositions and methods for immunotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) |
| CA2532250A1 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-03 | Barros Research Institute | Compositions and methods for immunotherapy of cancer and infectious diseases |
| JP2008504216A (ja) * | 2003-12-02 | 2008-02-14 | サイトイミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | モノクローナル抗体の生成のための方法および組成物 |
| US20050175584A1 (en) * | 2004-01-28 | 2005-08-11 | Paciotti Giulio F. | Functionalized colloidal metal compositions and methods |
| CN100355784C (zh) * | 2004-02-12 | 2007-12-19 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法 |
| US20050261475A1 (en) * | 2004-02-13 | 2005-11-24 | Harvard Medical School | Solid-phase capture-release-tag methods for phosphoproteomic analyses |
| US6986264B1 (en) * | 2004-07-15 | 2006-01-17 | Carrier Corporation | Economized dehumidification system |
| EP1824988B1 (en) | 2004-11-12 | 2017-04-19 | Bayer HealthCare LLC | Site-directed modification of fviii |
| EP1907067B2 (en) | 2005-07-26 | 2017-06-28 | Solvay USA Inc. | Polymers with pendant poly(alkyleneoxy) substituent groups and their use in personal care applications |
| US20070238656A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-11 | Eastman Kodak Company | Functionalized poly(ethylene glycol) |
| US20080096819A1 (en) | 2006-05-02 | 2008-04-24 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| EP2018437A2 (en) | 2006-05-02 | 2009-01-28 | Allozyne, Inc. | Non-natural amino acid substituted polypeptides |
| DK2054074T3 (da) * | 2006-08-04 | 2014-11-03 | Prolong Pharmaceuticals Llc | Modificeret erythropoietin |
| US20080083154A1 (en) * | 2006-10-05 | 2008-04-10 | Timothy M Gregory | Bait retention fish hook |
| CA2707840A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| US20090104114A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-04-23 | Cytimmune Sciences, Inc. | Nanotherapeutic Colloidal Metal Compositions and Methods |
| US20110014118A1 (en) * | 2007-09-21 | 2011-01-20 | Lawrence Tamarkin | Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods |
| CA2706700A1 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Compositions and methods for generating antibodies |
| CA2742710A1 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Janssen Pharmaceutica Nv | Crhr2 peptide agonists and uses thereof |
| KR101164453B1 (ko) | 2009-03-20 | 2012-07-11 | 한미사이언스 주식회사 | 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법 |
| EP2421547A1 (en) * | 2009-04-20 | 2012-02-29 | Theratechnologies Inc. | Use of (hexenoyl trans-3)hgrf(1-44)nh2 and ritonavir in combination therapy |
| US20100267636A1 (en) * | 2009-04-20 | 2010-10-21 | Theratechnologies Inc. | Use of cytochrome p450-metabolized drugs and grf molecules in combination therapy |
| CN102869384B (zh) | 2009-06-22 | 2016-01-13 | 伯纳姆医学研究所 | 使用带有c-端元件的肽和蛋白质的方法和组合物 |
| EP2496248A2 (en) | 2009-11-04 | 2012-09-12 | Janssen Pharmaceutica, N.V. | Method for treating heart failure with stresscopin-like peptides |
| WO2012118778A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated car peptides and methods and compositions using truncated car peptides |
| WO2012142706A1 (en) | 2011-04-21 | 2012-10-26 | Theratechnologies Inc. | Growth hormone releasing factor (grf) analogs and uses thereof |
| EP2715291A4 (en) | 2011-05-31 | 2015-10-21 | Airware Inc | NON-DISPERSIVE GAS SENSORS WITH ABSORPTION INFRARED ABSORPTION (NDIR) |
| US10179801B2 (en) | 2011-08-26 | 2019-01-15 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated LYP-1 peptides and methods and compositions using truncated LYP-1 peptides |
| WO2013190520A2 (en) | 2012-06-22 | 2013-12-27 | The General Hospital Corporation | Gh-releasing agents in the treatment of vascular stenosis and associated conditions |
| US10064940B2 (en) | 2013-12-11 | 2018-09-04 | Siva Therapeutics Inc. | Multifunctional radiation delivery apparatus and method |
| WO2016187712A1 (en) | 2015-05-28 | 2016-12-01 | Institut National De La Recherche Scientifique | Inhibitors of prototypic galectin dimerization and uses thereof |
| CN109153712B (zh) * | 2016-04-19 | 2022-09-16 | 格里芬制药国际公司 | Peg化生物活性肽及其用途 |
| CN110317826B (zh) * | 2019-05-22 | 2020-11-10 | 中国农业大学 | 调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用 |
| WO2021133407A1 (en) | 2019-12-27 | 2021-07-01 | Compagnie Generale Des Etablissements Michelin | Rubber mix with high specific surface area and high structure acetylene carbon black |
| US11623949B2 (en) | 2021-01-28 | 2023-04-11 | Talem Therapeutics Llc | Anti-spike glycoprotein antibodies and the therapeutic use thereof |
| WO2024081918A1 (en) | 2022-10-14 | 2024-04-18 | Talem Therapeutics Llc | Anti-trkb/cd3 antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| ATE136315T1 (de) * | 1989-05-27 | 1996-04-15 | Sumitomo Pharma | Verfahren für die herstellung von polyethylenglykolderivate und modifizierte proteine. |
| ZA914983B (en) * | 1990-06-29 | 1992-03-25 | Hoffmann La Roche | His-grf-analogs |
| JP3051145B2 (ja) * | 1990-08-28 | 2000-06-12 | 住友製薬株式会社 | 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド |
| JPH05507939A (ja) * | 1991-04-09 | 1993-11-11 | エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー | 成長ホルモン放出因子の類似体 |
| EP0518295A3 (en) * | 1991-06-14 | 1993-09-01 | Millipore Corporation | Allyl side chain protection in peptide synthesis |
| FR2687681B1 (fr) * | 1992-02-20 | 1995-10-13 | Transgene Sa | Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses. |
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| WO1997017367A1 (en) * | 1995-11-03 | 1997-05-15 | Theratechnologies Inc. | Method of grf peptides synthesis |
-
1997
- 1997-12-03 EP EP97121264A patent/EP0922446A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-01-12 UA UA2000063885A patent/UA73716C2/uk unknown
- 1998-12-01 NZ NZ504570A patent/NZ504570A/en unknown
- 1998-12-01 TR TR2000/01615T patent/TR200001615T2/xx unknown
- 1998-12-01 AT AT98959898T patent/ATE236607T1/de active
- 1998-12-01 JP JP2000522885A patent/JP2001524505A/ja active Pending
- 1998-12-01 CN CNB988117592A patent/CN1149967C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-01 WO PCT/EP1998/007748 patent/WO1999027897A1/en active IP Right Grant
- 1998-12-01 PL PL341139A patent/PL192082B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-12-01 HU HU0100507A patent/HUP0100507A3/hu unknown
- 1998-12-01 EP EP98959898A patent/EP1037587B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 KR KR1020007005736A patent/KR100561768B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-01 PT PT98959898T patent/PT1037587E/pt unknown
- 1998-12-01 EA EA200000601A patent/EA004269B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-12-01 DK DK98959898T patent/DK1037587T3/da active
- 1998-12-01 SK SK824-2000A patent/SK8242000A3/sk unknown
- 1998-12-01 ES ES98959898T patent/ES2194376T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 SI SI9830400T patent/SI1037587T1/xx unknown
- 1998-12-01 IL IL13655198A patent/IL136551A0/xx unknown
- 1998-12-01 DE DE69813291T patent/DE69813291T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 BR BR9815159-2A patent/BR9815159A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-01 EE EEP200000319A patent/EE200000319A/xx unknown
- 1998-12-01 CA CA002312004A patent/CA2312004C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 AU AU15633/99A patent/AU755285B2/en not_active Expired
- 1998-12-02 AR ARP980106098A patent/AR017780A1/es active IP Right Grant
- 1998-12-03 ZA ZA9811068A patent/ZA9811068B/xx unknown
-
1999
- 1999-01-26 TW TW088101139A patent/TWI254641B/zh not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-24 NO NO20002664A patent/NO327238B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-05-29 BG BG10448A patent/BG64815B1/bg unknown
- 2000-06-04 IL IL136551A patent/IL136551A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-05 US US09/587,460 patent/US6528485B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-07-16 HK HK01104960A patent/HK1034203A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-11-20 US US10/299,790 patent/US6869932B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-12-15 US US11/011,617 patent/US7317002B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-10-30 JP JP2009251100A patent/JP5431874B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA73716C2 (en) | Site-specific preparation of grf conjugated with polyethylene glycol | |
| US5661020A (en) | Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances | |
| JP2003206236A (ja) | 接合安定化されたポリペプチド組成物 | |
| UA79430C2 (en) | Method for the stepwise attachment of polyethylene glycol to polypeptide | |
| KR20090089316A (ko) | Ｐｅｇ 변형된 엑센딘 또는 엑센딘 유사체 및 조성물 및 이의 용도 | |
| JP2015512369A (ja) | Ｃ１阻害剤のポリマーコンジュゲート | |
| JP5458416B2 (ja) | 二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモン、その製造方法およびその使用 | |
| US5114926A (en) | Tetrapeptide inhibiting the entry into cycle of hemopoietic stem cells processes for its preparation, and its uses | |
| TW200944236A (en) | G-CSF conjugates modified by water-soluble polymers | |
| KR101104574B1 (ko) | 폴리에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도 | |
| KR100550206B1 (ko) | 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 및 이의제조방법 | |
| SK279227B6 (sk) | Peptidy s ochrannou aktivitou na organizmus, terap | |
| JPH06256394A (ja) | 修飾インターロイキン６ | |
| Huang et al. | A novel insulin derivative chemically modified with dehydrocholic acid: synthesis, characterization and biological activity | |
| CN101385858A (zh) | 纯化的peg化人生长激素缀合物及其药物制剂 | |
| KR20040066712A (ko) | 인간 성장 호르몬의 결합체 | |
| CZ20002055A3 (cs) | Způsob selektivní přípravy specifických konjugátů polyethylenglykol - GRF | |
| MXPA00005138A (en) | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates |