CN101385858A - 纯化的peg化人生长激素缀合物及其药物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特别适于药物应用的高纯度的聚乙二醇化的人生长激素缀合物，其纯度不小于96％。另外，本发明还涉及包含该缀合物的药物制剂、该缀合物的制备方法及其药物应用。
Description
发明领域
本发明属于生物制药领域，具体而言，本发明涉及特别适于药物应用的高纯度的PEG化人生长激素缀合物，并同时涉及包含该缀合物的药物制剂。另外，本发明还涉及该缀合物的制备方法以及其药物应用。
技术背景
天然的人生长激素(hGH)是由人脑下垂体分泌的蛋白质，其由191个氨基酸残基组成，分子量为22kDa。hGH的主要生物学功能是促进幼小的哺乳动物身体组织的生长并保持住老年哺乳动物的组织，其中所涉及的组织包括骨骼、结缔组织、肌肉、以及诸如肝、肠、和肾等器官的组织。因此，hGH可用于治疗因脑垂体机能不足而导致的侏儒症或Turner综合症，另外也可用于促进儿童生长，治疗慢性肾功能不全、艾滋病衰竭、和衰老等。
人生长激素可以通过成熟的基因重组技术获得，如可参见Chang等(Gene，55：189，1987)、Goeddel等(Nature，281：544，1979)和Gray等(Gene，39：247，1985)的工作。当前已经有多种重组hGH可以从市场上购买，如Genotropin、Nutropin和Somatonorm。
直接给药hGH等蛋白质将由于身体内对蛋白质的高清除率而使其药理学活性作用时间较短，影响其稳定性。为此，人们通过用水溶性聚合物化学修饰这些蛋白质来有效阻滞蛋白水解酶与蛋白质主链直接接触，防止其降解，从而有效降低了其体内清除率，改善其稳定性，增加了其在体内循环的时间，从而可以减少给药次数。聚乙二醇(PEG)是最常用于化学修饰蛋白质的水溶性聚合物之一。PCT申请WO9300109A就报道了用PEG修饰人生长激素。然而，据Clark等(Journal of Biological Chemistry，271：21969-21977，1996)的研究分析，并非所有PEG化的hGH缀合物都能保持原有hGH活性，某些hGH的PEG化形式甚至将大大降低其体外活性，以至于无法进行具有实用性的应用。
人们进行大量尝试来开发在特定位点上进行特异PEG修饰的hGH缀合物，以期在保持hGH活性的基础上，降低不均一性和体内清除率、增加其在体内的循环时间、提高稳定性。例如，PCT申请WO9711178A公开了通过在hGH中的赖氨酸位点上进行PEG化，但是这需要在天然人生长激素中引入新的赖氨酸(如K168A和K172R的取代)。PCT申请WO2003044056A和中国专利申请CN1477126A分别披露了在hGH的N端进行PEG修饰的缀合物，然而其中公开的制备步骤只能使最终缀合产物中只有大约90％的PEG缀合到hGH的N端上，即使再加上其中公开的进一步纯化的步骤，最终产生的PEG化的hGH缀合物也只能达到95％左右的纯度，其中包括未缀合的PEG、hGH及它们的降解产物。尽管中国专利申请CN1565624A声称可以获得纯度大于98％的缀合物，但是其制备(纯化)的工艺细节被刻意掩盖，甚至没有PCT申请WO2003044056A和中国专利申请CN1477126A所披露的达到95％左右的纯度的技术方案详细，也没有通过公认的检测手段确认该纯度产物的存在，无法预期能取得相应纯度效果。
本发明人经过艰苦和长期的研究，惊人地优化出了一种N端PEG化的hGH缀合物的制备方法，它可以在不增加生产成本的条件下，通过特定缀合和纯化步骤的优化组合，所获得的缀合物的纯度可以远远超过95％，甚至可以达到用高效大小排阻层析(SEC-HPLC)和反相高效液相层析(RP-HPLC)等通用检测手段检测达到99％以上的纯度水平。除了具有现有技术中PEG化的hGH缀合物的优点之外，在当前药物不良反应越来越引起患者和药物监管部门重视的情况下，这种高纯度的hGH缀合物对于制备高质量的药物制剂有着非常重要的意义，不但能减少由于不均一而引起的药物不良反应，而且便于药物制剂生产中的质量管理。另外，本发明人也优化出了一种包含PEG化的hGH缀合物的药物制剂，其能长期有效地保持其中活性成分的稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度的PEG化的hGH缀合物，其通过特定缀合和纯化步骤的组合而得，可以在不增加成本的条件下，增加所得产物的纯度，从而可以更有利于将其作为药物有效成分使用，一方面可以减少由于不均一而引起的药物不良反应，更便于在药物制剂生产中加强质量管理，在生产中具有很好的实际意义。本发明的目的还在于提供上述hGH缀合物的制备方法，包括特定的缀合和纯化步骤。另外，本发明的目的还在于包含上述hGH缀合物的药物组合物或药物制剂以及药物应用。
具体而言，在第一方面，本发明提供了基本纯的缀合物，其特征在于，所述缀合物由聚乙二醇通过连接基团与人生长激素的单一游离氨基共价连接而成，所述缀合物的纯度不小于96％。也就是说，本文中所用的“基本纯”与纯度不小于96％有相同的含义。人生长激素(本文中简称为hGH)是促进儿童身体组织的生长并保持住成年人组织的蛋白质。人生长激素可以是提取获得的，但优选是通过基因重组技术获得的。从现有发展状况来看，通过基因重组技术获得hGH是成熟的技术，而且目前也已经有市售的产品。在本发明中，优选的hGH是天然的hGH，其氨基酸序列如Seq ID NO：1所示。hGH的单一游离氨基可以是其N端的α氨基或其侧链的游离氨基(如赖氨酸的侧链氨基)，优选是hGH的N端的α氨基。在优选的情况下，聚乙二醇通过连接基团与人生长激素N端苯丙氨酸的α氨基共价连接。本发明也优选适于在大肠杆菌中表达而得到的hGH，其氨基酸序列可以是在Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的N端再添加一个甲硫氨酸。这样，聚乙二醇通过连接基团与人生长激素N端甲硫氨酸的α氨基共价连接。
在本文中，术语“纯度”具有蛋白制药领域技术人员常规理解的含义，其含义相当于均一性。由于制备蛋白缀合物时，由于蛋白质的降解或没有有效缀合或缀合位点的不同，造成除了目的产品之外，还会产生蛋白质降解产物或其缀合物、没有发生缀合的产物、缀合位点不同或同时在多个位点缀合的产物等副产物，由此造成制备出的蛋白缀合物是目的产品与副产物的混合物，并非完全均一(或纯)的目的产品。这种不均一性(或不纯)造成药物产品质量难以控制。纯度可以用制备出的蛋白缀合物中的目的产品与蛋白缀合物的质量百分比或摩尔百分比来表示，但是在实践中，通常使用常规的检测仪器中代表目的产品的峰与代表包括不均一产物的峰的面积的百分比值来表示。在本发明中，如无特别说明，均采用后者所述的百分比来表示纯度。
在本发明中，本发明人通过优化摸索，采用本发明第三方面所述的制备方法，获得了纯度不小于的96％缀合物。纯度的测定是用本领域技术人员所公知的仪器及检测步骤来进行，通常这些测定方法都来自于相应药品检测的规定和标准，优选通过本发明具体实施方式中所列的鉴定方法来进行。本发明优选缀合物的纯度不小于97％，优选不小于98％，更优选不小于99％，最优选用高效大小排阻层析(SEC-HPLC)和/或反相高效液相层析(RP-HPLC)检测纯度达到99％以上。由于本发明能够获得纯度高的产物，因此只要适当添加入不均一成分，如可以表征产品来源的痕量无害成分，就可以方便地实现相应纯度较低的产品。
在本发明的第一方面中，聚乙二醇与连接基团共价连接，形成活化的聚乙二醇(即，聚乙二醇与连接基团共价连接的产物)，再通过活化的聚乙二醇中的连接基团与hGH连接。其中，连接基团能与hGH的单一游离氨基共价连接，优选能与N端的α氨基共价连接，如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)或醛等，优选N-羟基琥珀酰亚胺基。PEG可以是直链PEG，也可以是支链PEG，优选是支链PEG。PEG的分子量为10kDa~120kDa，优选为30~90kDa，更优选为约40kDa或约80kDa。其中，“约”表示上下限为所示数值的±10％，如约40kDa为36~44kDa。除了通过化学反应共价连接聚乙二醇与连接基团来制备活化的聚乙二醇之外，也可以直接采用已经商品化的活化的聚乙二醇，如Shearwater公司提供的甲氧基PEG丙醛(mPEG-ALD)、双甲氧基PEGN-羟基琥珀酰亚胺基酯(mPEG2-NHS)和甲氧基PEG琥珀酰亚胺丙酸酯(PEG-SPA)等，用以直接与hGH缀合。
在第二方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明第一方面所述的缀合物和药学上可接受的载体。采用高纯度的缀合物原料制备药物组合物，能够改善产生的产品的质量。在本文中，“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、缓冲剂、保护剂、防腐剂、包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如固体制剂(如片剂、膜剂、丸剂、胶囊、粉剂、粉针剂、或颗粒剂等)、液体制剂(如糖浆剂和乳液剂、消毒的住射用溶液或悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、或针剂等)、以及自动注射装置或栓剂，更优选是粉针剂和液体制剂。尤其是液体制剂无需在使用前临时配置，方便使用，因此本发明的药物组合物优选是液体制剂。
然而，由于与在固体环境中不同，在液体环境中，蛋白质或其缀合物更容易受水解而降解，因此开发含PEG化的hGH缀合物需要大量实验摸索。pH值对蛋白缀合物的稳定和溶解性质有很大影响，本发明的药物组合物的pH优选为约6.0，即为5.4~6.6，最优选为6.0。本发明的药物组合物包括的缓冲剂优选选自柠檬酸盐、组氨酸盐、和马来酸盐，其中通过本发明人的研究发现，当采用柠檬酸盐作为缓冲剂时，能够最大化地保持本发明的药物制剂稳定，因此本发明的药物组合物优选包括用作缓冲剂的柠檬酸盐，更优选柠檬酸盐的浓度为3-7mM，最优选柠檬酸盐的浓度为5mM。本发明的药物组合物包括的表面活性剂优选选自泊洛沙姆188、吐温80、和吐温20，其中通过本发明人的研究发现，当采用泊洛沙姆188作为表面活性剂时，能有效防止PEG化的hGH缀合物降解，因此本发明的药物组合物优选包括用作表面活性剂的泊洛沙姆188，更优选泊洛沙姆188的浓度为0.5~3mg/ml，最优选泊洛沙姆188的浓度为1mg/ml。在本发明的一个具体实施方式中，本发明的液体制剂包含5mM柠檬酸三钠，1mg/ml泊洛沙姆188，2.5mg/ml苯酚，9mg/ml氯化钠，和9.0mg/ml PEG化的hGH缀合物，该液体制剂pH为6.0。
在第三方面，本发明提供了制备本发明第一方面所述的缀合物的方法，其包括：
(a)将人生长激素溶液与活化的聚乙二醇混合，使人生长激素与聚乙二醇发生缀合反应；和
(b)将步骤(a)得到的反应混合液稀释，用以pH6.5-8.0的平衡缓冲液平衡的SephadexG-25层析柱纯化，收集第一个洗脱峰的洗脱液；和
(c)将步骤(b)得到的洗脱液上样于以pH6.5-8.0的平衡缓冲液平衡的Q-Sepharose层析柱，用含10mM NaCl的平衡缓冲液梯度洗脱，然后用含50mM NaCl的平衡缓冲液洗脱并收集洗脱液。其中，步骤(a)优选为：将人生长激素溶液与活化的聚乙二醇混合，于4℃以50-100rpm搅拌16～18小时，使人生长激素与聚乙二醇发生缀合反应。其中，平衡缓冲液的pH为为pH6.5-8.0，优选为pH7.0-7.8，更优选为pH7.2-7.6，最优选为pH7.4，在本发明的具体实施方式中，平衡缓冲液是Tris-HCl。其中，活化的聚乙二醇是聚乙二醇与连接基团共价连接的产物，优选是双甲氧基PEG N-羟基琥珀酰亚胺基酯，在本发明的具体实施方式中mPEG2-NHS中的mPEG的分子量为约40kDa。通过本发明第三方面的方法，可以得到本发明第一方面纯度不小于96％的缀合物。按照在本发明的具体实施方式中所述的方法，得到的缀合物用高效大小排阻层析(SEC-HPLC)和/或反相高效液相层析(RP-HPLC)检测纯度在99％以上。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的缀合物或本发明第二方面所述的药物组合物在制备促进生长的药物中的应用。本发明的药物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，来促进受试者(尤其是人)的生长。可用给药方式的例如注射、口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药，优选胃肠道外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由临床医生根据受试者实际情况(如，病人的病情、体重、年龄、性别等)而方便地确定。对于向儿童注射给药，本发明的药物剂量，以PEG化的hGH缀合物计，可以是0.05-0.5mg/kg体重，优选的剂量是0.1-0.3mg/kg体重，最优选的是0.2mg/kg体重。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
附图说明
图1.本发明的高纯度PEG化的hGH缀合物的SEC-HPLC图谱
图2.本发明的高纯度PEG化的hGH缀合物的RP-HPLC图谱
图3，本发明的高纯度PEG化的hGH缀合物的SDS-PAGE电泳图，其中第一道为PEG-GH，第二道为蛋白分子量标记
图4A本发明的高纯度PEG化的hGH缀合物的蛋白酶水解质谱图
图4B作为对照的hGH的蛋白酶水解质谱图
图4C本发明的高纯度PEG化的hGH缀合物的基质辅助激光解吸离子化飞行时间-质谱(MALDI-TOF-MS)图
图5本发明的高纯度PEG化的hGH缀合物的药效试验脑垂体摘除大鼠平均累积增重随时间变化的曲线图
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《蛋白质技术手册》(科学出版社，2000)等手册和相关药物法规、规定以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
【实施例1】人生长激素与聚乙二醇的缀合
1，将人生长激素溶液(人生长激素浓度为10mg/ml，溶于50mM磷酸盐缓冲液中，pH至6.5)置于无菌三角瓶中，以50-100rpm的速度搅拌。在持续搅拌的条件下，分批向加入反应容器中加入双甲氧基PEG-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(mPEG2-NHS，分子量为42.5kDa，购自Shearwater公司)，双甲氧基PEG N-羟基琥珀酰亚胺基酯的加入总重量为人生长激素的4倍(即其与rhGH的重量比为4∶1)，至加入的双甲氧基PEG N-羟基琥珀酰亚胺基酯全部溶解，于4℃以50-100rpm搅拌16～18小时，使人生长激素与聚乙二醇发生缀合反应，得反应混合液。
2，将人生长激素溶液(人生长激素浓度为10mg/ml，溶于50mM磷酸盐缓冲液中，pH至6.5)置于无菌三角瓶中，以50-100rpm的速度搅拌。在持续搅拌的条件下，分批向加入反应容器中加入双甲氧基PEG-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(mPEG2-NHS，分子量为42.5kDa，购自Shearwater公司)，双甲氧基PEG N-羟基琥珀酰亚胺基酯的加入总重量为人生长激素的6倍(即其与rhGH的重量比为6∶1)，至加入的双甲氧基PEG N-羟基琥珀酰亚胺基酯全部溶解，于4℃以50-100rpm搅拌16～18小时，使人生长激素与聚乙二醇发生缀合反应，得反应混合液。
【实施例2】PEG化的hGH缀合物的纯化
用10mM氢氧化钠洗涤Sephadex G-25层析柱(购自华美公司)，然后用注射用水冲洗至中性，接着用20mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液平衡该层析柱。平衡后，向记作1倍体积的实施例1-1得到的反应混合液加入5倍体积注射用水来稀释，然后上样，其中上样体积不超过柱体积的15％，用20mM Tris-Hcl pH7.4的缓冲液洗脱，上样和洗脱的流速介于150～250cm/h之间，在波长280nm处检测洗脱产物的光吸收值，收集第一个洗脱峰的洗脱液。
用10mM氢氧化钠洗涤Q-Sepharose层析柱(购自华美公司)，然后用注射用水冲洗至中性，接着用平衡缓冲液(即20mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液)平衡该层析柱。平衡后，将上述第一个洗脱峰的洗脱液上样到Q-Sepharose层析柱上，然后用平衡缓冲液洗涤层析柱至基线平稳，接着用含10mM NaCl的平衡缓冲液梯度洗脱杂质，然后用含50mM NaCl的平衡缓冲液洗脱，其中上样、洗涤至基线和洗脱的流速都介于90～150cm/h之间，检测波长280nm，收集用含50mM NaCl的平衡缓冲液洗脱的280nm处有吸收的吸收峰，得PEG化的hGH缀合物溶液，其中PEG与hGH上的单一游离氨基缀合。
【实施例3】PEG化的hGH缀合物的的鉴定
取实施例2所得的PEG化的hGH缀合物溶液，进行如下鉴定：
1，大小排阻高效液相层析(SEC-HPLC)
采用SEC-HPLC对实施例2所得的产物进行评价。根据厂商说明，采用Protein Pak300SW柱(7.8mm×300mm，购自Waters公司)以pH6.5的50mM磷酸缓冲液为流动相，0.1％SDS中，以流速0.6mL/分钟，进行SEC-HPLC分析，检测波长214nm。如图1所示，纯度99.14％。
2，反相高效液相层析(RP-HPLC)
采用RP-HPLC对实施例2所得的产物进行评价。根据厂商说明，采用Vydac(250mm×4.6mm)RP-HPLC柱(购自美国GRACE VYDAC公司)，进行RP-HPLC。实验在室温中进行，典型载样量为10mg蛋白质/试样。A相为pH6.5、50mM的磷酸缓冲液；B相为乙腈，梯度洗脱，20分钟内B相由0％增加至20％，流速0.6ml/min，检测波长为214nm。如图2所示，结果为单峰，纯度99.51％。
3，SDS-PAGE
以4.5％浓缩胶和10％分离胶对实施例2所得的产物进行SDS-PAGE。如图3所示，结果显示为分子量为64kDa左右的单一条带。
4，肽图分析
取实施例2所得的PEG化的hGH缀合物(以下简称为PEG-GH)和作为对照的未PEG化的hGH，进行肽图分析。取0.5mg的hGH和0.5mgPEG-GH脱盐、冻干，分成20ug/份，各取一份溶于10ul的pH8.5、25mM Tris缓冲液中制成测试样品，向测试样品中分别加入Lys-C内切蛋白酶(0.5mg/mL)2ul，在37℃保温16.5小时。于美国BioAge Pharmaceuticals Inc.进行质谱分析。结果如下表3.1和图4A和4B所示，只有一个N末端片段在hGH的质谱图中出现，但该片段未在PEG-GH的质谱图中出现，表明在PEG-GH中hGH的N端的α氨基上均一地缀合了PEG。
取20ug PEG-GH冻干样品溶于10ul的pH8.5、25mM Tris缓冲液中，于美国BioAgePharmaceuticals Inc进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间-质谱(MALDI—TOF—MS)，结果如图4C所示，显示PEG—GH的分子量为64918，表明一个PEG只偶联到一个生长激素分子上。
表3.1 质谱数据分析
| P1(N) | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | |
| hGH | √ | √ | √ | √ | √ | √ | ||||
| MW | 4580 | 403 | 3360 | 5126 | 2791 | 625 | 1489 | 1276 | 507 | 2130 |
| PEG-GH | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
【实施例4】PEG化的hGH缀合物的毒理和药效学研究
使用实施例2所得的PEG化的hGH缀合物进行动物实验，其中hGH缀合物用生理盐水稀释配制成注射液。
1、急性毒性试验
小鼠的急性毒性试验结果表明：PEG化的hGH缀合物以最大浓度(12mg/ml)和最大给药容积(0.25ml/10g体重)皮下注射给药后，小鼠的饮食、饮水正常，呼吸、粪便以及活动无异常表现，皮毛光滑，并且连续观察14天无一例动物死亡，未能测出半数致死量(LD50)。
2、长毒实验
大鼠的长期毒性试验结果表明：PEG化的hGH缀合物以高剂量16mg/kg；中剂量8mg/kg；低剂量3.2mg/kg三个剂量皮下注射给药(分别以大鼠药效剂量160μg/只换算为成人临床用量，相当于人等效剂量的125、62.5、25倍)，皮下注射容积均为0.2ml/100g体重，每周一次，连续给药24周。试验结果表明，hGH缀合物各剂量组大鼠活动正常、被毛光泽，进食量、体重与对照组比较无差异(P>0.05)；对呼吸以及粪便排泄等无明显影响；脏器系数与对照组比较无明显差异(P>0.05)；各剂量组血液学、血液生化学测定指标与对照组比较无统计学差异(P>0.05)，病理组织学检查镜下未见病理组织学改变。该长期毒性试验结果表明，长期大量皮下注射应用聚乙二醇重组人生长激素安全、无明显毒副作用。
3、药效试验
用雌性6周Sprague Dawley大鼠随机分为三组：阴性对照组10只(缓冲液载体，其组成为150mM氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH6.0)，每次每只大鼠1毫升，每天一次，连续14天；阳性对照组10只(hGH长春金赛药业)，每次每只大鼠10微克生长素，每天一次，连续给予14天；长效人生长激素组11只，每次每只大鼠相当70微克生长素的hGH缀合物，首日和第8日各给予一次。
使用电子台秤(ACCULAB V-350)测量大鼠体重。给药前每2—3天测量一次，从首次给药起每天于给药前测量大鼠体重。脑垂体摘除大鼠平均累积增重随时间变化的曲线如图5所示。结果表明经聚乙二醇偶联后的人生长素在大鼠体内能够在注射一次后在4—7天内保持刺激体重增加的活性；同等累积剂量时，长效人生长素对大鼠体重增加的效果相当于常规人生长素。
以上3个实验结果表明，本发明的高纯度的PEG化的hGH缀合物毒性低，对生长有十分显著的促进作用。
【实施例5】含PEG化的hGH缀合物的液体制剂研究
1，液体制剂配方：
5mM柠檬酸三钠，1mg/ml泊洛沙姆188，2.5mg/ml苯酚，9mg/ml氯化钠，9.0mg/ml PEG化的hGH缀合物，pH6.0。
2，制备方法：
准确称取柠檬酸三钠、泊洛沙姆188(下文简称PoL188)、苯酚、氯化钠，用注射用水配制成0.1M檬酸三钠溶液、50mg/ml泊洛沙姆溶液、20mg/ml苯酚溶液、4M氯化钠溶液。将PEG化的hGH缀合物与上述上述溶液及注射用水混合，用盐酸调pH值至6.0，使得终浓度为柠檬酸三钠5mM，1mg/ml泊洛沙姆188，苯酚2.5mg/ml，氯化钠9mg/ml和聚乙二醇重组人生长激素9.0mg/ml。
也可以在上述方法中换用其他试剂或浓度，进行以下对比试验。
3，液体制剂的筛选
对配方中缓冲剂、表面活性剂、浓度和pH进行研究，在40℃进行加速试验。结果如下表5.1～5.4所述。
表5.1 各种缓冲剂对PEG-GH的保护作用
结果显示，柠檬酸三钠与其他缓冲液相比，对于PEG-GH具有更好的保护作用。
表5.2 柠檬酸三钠缓冲液浓度对PEG-GH稳定性的影响
结果显示，柠檬酸三钠缓冲液浓度为5mM时对PEG-GH保护作用最好。
表5.3 pH对PEG-GH稳定性的影响
结果显示，当PEG-GH液体制剂pH在6.0时稳定性最好。
表5.4 表面活性剂及其浓度的确定
结果显示，1mg/ml Pol188对于PEG-GH具有最佳的保护作用。
3，液体制剂配方比较
根据上述研究，组合出如下不同配方的PEG-GH液体制剂：
配方1：5mM柠檬酸三钠，1mg/ml泊洛沙姆188，2.5mg/ml苯酚，9mg/ml氯化钠，9.0mg/mlPEG化的hGH缀合物，pH6.0；
配方2：5mM组氨酸，1mg/ml吐温80，2.0mg/ml苯酚，5mg/ml氯化钠，9.0mg/ml PEG化的hGH缀合物，pH6.0；
配方3：5mM马来酸，1mg/ml泊洛沙姆188，1.5mg/ml苯酚，9mg/ml氯化钠，9.0mg/ml PEG化的hGH缀合物，pH6.0。
分别将hGH液体制剂与PEG-GH液体制剂置于4℃放置，每隔2个月取样检测，比较它们的稳定性，结果如下表5.5所示。
表5.5 hGH液体制剂与PEG-GH液体制剂4℃稳定性比较
结果表明：PEG-GH液体制剂都较hGH液体制剂具有更好的稳定性。
序列表
<110>长春金赛药业有限责任公司
<120>纯化的PEG化人生长激素缀合物及其药物制剂
<160>1
<210>1
<211>191
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>1
Claims (15)
1，基本纯的缀合物，其特征在于，所述缀合物由聚乙二醇通过连接基团与人生长激素的单一游离氨基共价连接而成，所述缀合物的纯度不小于96％。
2，权利要求1所述的缀合物，所述缀合物的纯度不小于97％，优选不小于98％，更优选不小于99％，最优选用高效大小排阻层析和/或反相高效液相层析检测纯度达到99％以上。
3，前述任一项权利要求所述的缀合物，其中人生长激素的氨基酸序列如Seq ID N0：1所示。
4，前述任一项权利要求所述的缀合物，其中连接基团是N-羟基琥珀酰亚胺基。
5，前述任一项权利要求所述的缀合物，其中聚乙二醇的分子量约为40kDa。
6，药物组合物，其包含前述任一项权利要求所述的缀合物和药学上可接受的载体。
7，权利要求6所述的药物组合物，其为液体制剂。
8，权利要求7所述的药物组合物，其包括用作缓冲剂的柠檬酸盐、组氨酸盐、或马来酸盐，优选是柠檬酸盐。
9，权利要求7或8所述的药物组合物，其包括用作表面活性剂的泊洛沙姆188、吐温80、或吐温20，优选是泊洛沙姆188。
10，权利要求7-9之任一项所述的药物组合物，其pH为5.6-6.4，优选6.0。
11，制备权利要求1-5之任一项所述的缀合物的方法，其包括：
(a)将人生长激素溶液与活化的聚乙二醇混合，使人生长激素与聚乙二醇发生缀合反应；和
(b)将步骤(a)得到的反应混合液稀释，用以pH6.5-8.0的平衡缓冲液平衡的Sephadex G-25层析柱纯化，收集第一个洗脱峰的洗脱液；和
(c)将步骤(b)得到的洗脱液上样于以pH6.5-8.0的平衡缓冲液平衡的Q-Sepharose层析柱，用含10mM NaCl的平衡缓冲液洗脱，然后用含50mM NaCl的平衡缓冲液洗脱并收集洗脱液。
12，权利要求11所述的方法，其中步骤(a)为：将人生长激素溶液与活化的聚乙二醇混合，于4℃以50-100rpm搅拌16～18小时，使人生长激素与聚乙二醇发生缀合反应。
13，权利要求11或12所述的方法，其中活化的聚乙二醇是双甲氧基PEGN-羟基琥珀酰亚胺基酯。
14，权利要求11所述的方法，其中平衡缓冲液的pH为pH6.5-8.0，优选为pH7.0-7.8，更优选为pH7.2-7.6，最优选为pH7.4。
15，权利要求1-5之任一项所述的缀合物或权利要求6-10之任一项所述的药物组合物在制备促进生长的药物中的应用。
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