KR20080041661A - 생체적합성 폴리머와 컨쥬게이트된 인간 성장 호르몬 - Google Patents
생체적합성 폴리머와 컨쥬게이트된 인간 성장 호르몬 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생체적합성 폴리머와 hGH의 컨쥬게이트, 특히 PEG-hGH, 제조 방법 및 관련된 약제학적 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 활성화된 생체적합성 폴리머는 hGH의 카르복실기에 2:1 이하, 바람직하게는 1:1의 몰비로 컨쥬게이트된다.
상기 PEG-hGH 컨쥬게이트는 생체 내(in vivo) 반감기가 10배 증가되는 반면, 네이티브 hGH의 20% 이하의 활성을 갖는다. 상기 PEG-hGH 컨쥬게이트는 성장지연(growth retardation) 또는 성장부전(growth failure), 특히 어린이 저신장증(short stature in children), 및 노화와 관련된 증상을 치료하기 위해 치료적으로 사용될 수 있다.
Description
본 출원은 2005년 7월 22일에 출원된 미국 특허 제11/187,522호의 일부계속출원(continuation-in-part)이다.
서열 목록은 24쪽에 포함된다.
본 발명의 구체예는 생체적합성 폴리머와 1:1의 몰비로 컨쥬게이트된 인간 성장 호르몬(hGH), 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학조성물 및 키트에 관한 것이다. 치료적 처리 방법 또한 개시된다.
인간 성장 호르몬(hGH)은 191 아미노산으로 구성된 단일 폴리펩티드 사슬이다(Goeddel DV 등 1979. Nature 231:542-548; Pearlman R 등 1993. Stability and Characterization of Human Growth Hormone. in, Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories, YJ Wang 및 R Pearlman 편저. Plenum Press, New York). 내인성 성장 호르몬은 어린이 및 어른에서 정상적인 골격, 연결 조직, 근육 및 기관 성장을 촉진하는데 필수적이다. 이는 또한 성인 대사에서 중요한 역할을 한다. 소마토트로핀(somatotropin)(재조합 인간 성장 호르몬)은 성장 호르몬(hGH) 수용체에 결합하여, 성장을 촉진하는 다양한 생리적 효과 를 생성한다. 성장 호르몬의 여러 생물학적 작용은 반응하는 조직에 직접적으로 작용하는 인슐린-유사 성장 인자-1에 의해 매개된다(Clark R. 1997. Endocrine Reviews 18:157-179).
인간 성장 호르몬의 일차 구조는 하기 도 1에 나타내었다. 내인성 hGH는 뇌하수체 전엽에서 생성된다. 인간 성장 호르몬은 1956년 최초로 분리되었으며, 그의 구조는 1972년에 밝혀졌다(Pearlman R 등 1993. Stability and Characterization of Human Growth Hormone. in, Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories, YJ Wang 및 R Pearlman 편저. Plenum Press, New York). 1985년 이전, 성장 호르몬은 인간 시체로부터 수득되었으나, 1970년대 후기의 인간 성장 호르몬의 클로닝(cloning) 및 발현은 내인성 hGH의 모든 정상적 기능을 흉내내는(mimic) 여러가지의 시판되는 hGH 상품의 입수를 가능하도록 했다(Drake WM 등 2001. Endocrine Reviews 22:425- 450). 제넨테크(Genentech)의 프로트로핀(PROTROPIN®)은 본래 성장 호르몬 결핍에 기인한 성장 부전(growth failure) 치료용으로 1908년대 중반 FDA에 의해 승인되었다. 그 후 만성 신장 질환, 또는 터너증후군(Turner's syndrome)에서 나타나는 성장 결핍을 포함하는 다른 징후 및 악액질(cachexia) 및 AIDS 소모(AIDS wasting)의 치료를 위한 hGH의 사용이 승인되어 왔다(Drake WM 등 ibid.).
성장 호르몬 요법에서 유의한 진보는 지속성(long-acting) hGH 상품의 입수 가능성일 것이다. 통상적인 hGH는 어린이에게 1주에 6회 주사되어야 하므로, 1주 1회의 주사는 거대한 시장 효과를 가질 것이다. 제넨테크는 hGH의 지속성 제 형(NUTROPIN-Depot)을 시판하였으나 저조한 판매로 인해 시장으로부터 회수하였다. 이는 hGH의 저장(depot) 형태가 어린이의 성장 속도를 가속화하는데 효과적이지 않다는 소아 내분비학자들 사이에 널리 퍼져있는 믿음 때문이다. 본 발명의 구체예는 단백질의 PEG화(pegylation)에 의한, 지속성 성장 호르몬에 대한 더욱 흥미로운 접근에 관한 것이다.
생체적합성 폴리머에 대한, hGH와 같은 약제학적 활성 분자 또는 단백질의 컨쥬게이트는 그들이 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro)로 적용될 때 탁월한 이점을 제공한다. 생체적합성 폴리머에 공유 결합될 때, 생물학적 활성 물질은 변형된 표면 특성 및 용해도를 나타낼 수 있으며, 따라서 물 또는 유기용매에서 증가된 용해도를 갖는다. 또한, 생체적합성 폴리머의 존재는 생체 내에서 단백질 및/또는 폴리펩티드가 그들에게 더욱 안정하게 컨쥬게이트되도록 하고, 단백질의 생체적합성을 증가시키고 면역 반응을 감소시키며, 또한 소장, 신장, 비장 또는 간에 의한 단백질의 제거 속도(clearance rate)를 감소시킨다.
hGH를 PEG화하기 위한, 제넨테크에 의한 종래의 시도는 네이티브(native) hGH 단백질에 비해 단지 1/400의 활성을 갖는 hGH 제형(preparation)을 얻었다. 이는 이들보다 초기의 peg-성장 호르몬의 임상적 개발을 막았다. 만약 hGH와 같은 생물학적 활성 물질의 생물학적 활성이 폴리머와 소망하는 비율로 컨쥬게이트된 후 유지될 수 있다면, 부위-특이적(site-specific) 컨쥬게이트의 동종(homogenous species)이 수득될 수 있고, hGH와 같은 분자의 임상적 유용성은 현저하게 증가될 것이다. 본 발명은 이 문제점을 다룬다. 생체적합성 폴리머/hGH의 비율을 2:1 미 만, 바람직하게는 1:1로 유지함에 의한, 본원에 기술된 방법에 의해 향상된 안정성을 갖는 활성 hGH를 수득하였다. 비PEG화된(unpegylated) 단백질의 특이적 활성의 20% 이하를 가지고, 생체 내에서 증가된 반감기를 갖는, PEG화된 hGH가 제공된다.
본 발명의 구체예는 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH) 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기서 상기 생체적합성 폴리머는 2:1 이하의 몰비로 hGH의 카르복실기에 컨쥬게이트된다. 바람직하게는, 상기 생체적합성 폴리머는 PEG-20000 또는 PEG-30000이다.
바람직하게는, 상기 hGH의 카르복실기는 hGH의 C-말단이다. 바람직하게는, 상기 컨쥬게이트의 활성은 비컨쥬게이트된 hGH 단백질 활성의 10-20%이다. 더욱 바람직하게는, 상기 생체적합성 폴리머는 1:1의 몰비로 hGH의 카르복실기에 컨쥬게이트된다. 한층 더 바람직하게는, 상기 생체적합성 폴리머는 PEG이다.
본 발명의 구체예는 약제학적으로 허용가능한 양의 상기 생체적합성 폴리머-hGH 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구체예는,
(a) 정제된 hGH 단백질을 제공하는 단계;
(b) 커플링 시약(coupling reagent)을 단계적으로 첨가하여 생체적합성 폴리머를 활성화하는 단계; 및
(c) 상기 활성화된 생체적합성 폴리머를 hGH의 카르복실기에 2:1 이하의 몰비로 컨쥬게이트하는 단계;
중 하나 이상을 포함하는 생체적합성 폴리머-hGH 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 hGH의 상기 활성화된 생체적합성 폴리머에 대한 몰비는 1:1 내지 1:20이고, 상기 hGH의 상기 커플링 시약에 대한 비율은 1:1 내지 1:50이고, 또한 pH는 2 내지 5의 범위이다. 바람직하게는, 상기 생체적합성 폴리머는 카르복시산과 반응할 수 있는 반응성 작용기 및/또는 반응성 카르보닐기로 활성화된다. 바람직하게는, 상기 생체적합성 폴리머는 PEG-20000 또는 PEG-30000이다. 바람직하게는, 상기 카르복실기는 hGH의 C-말단이다.
바람직한 구체예에서, 상기 정제된 hGH는
(i) 재조합 숙주(recombinant host)에서 hGH를 생성하는 단계;
(ii) 암모늄 설페이트를 사용하여 hGH를 농축하는 단계; 및
(iii) 음이온성 교환 크로마토그래피에 의해 상기 농축된 hGH를 정제하는 단계;
중 하나 이상을 포함하는 방법에 의해 제공된다.
바람직한 구체예에서, 상기 크로마토그래피는 단일 단계로서 수행된다.
바람직한 구체예는 생체적합성 폴리머-hGH 컨쥬게이트의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함에 의한 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 생체적합성 폴리머는 PEG이다. 더욱 바람직하게는, 상기 PEG-hGH는 1:1의 몰비로 컨쥬게이트된다. 바람직하게는, 상기 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 hGH 단백질 활성의 10-20%를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 상기 성장부진 또는 성장지연은 호르몬 결핍, 만성 신장 질환, 터너증후군, 악액질 또는 AIDS 소모가 원인이다. 바람직하게는, 상기 컨쥬게이트는 약제학적으로 허용가능한 담체와의 조합으로 투여된다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 투여는 주사에 의해 수행된다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 투여는 경구 투여이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 주당 2번 이하로 투여된다.
바람직한 구체예는 PEG-hGH를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 주당 두번 이하의 빈도로 투여함에 의한 어린이 저신장증(short stature)의 치료 방법에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 PEG는 hGH의 C-말단 카르복실기에 1:1의 몰비로 컨쥬게이트되고, 상기 PEG-hGH는 비컨쥬게이트된 hGH 활성의 10-20%를 갖는다.
바람직한 구체예는 PEG-hGH를 필요로 하는 환자에게 이를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함에 의한, 순수 근육(lean muscle) 감소, 혈압 증가, 콜레스테롤 증가, 체지방 증가, 피부색(skin tone) 손실, 및 골밀도 감소와 같은 노화와 관련된 유해 효과(adverse effect)의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 PEG는 hGH의 카르복실기에 1:1의 몰비로 컨쥬게이트된다.
본 발명의 구체예는 생체적합성 폴리머-hGH 컨쥬게이트, 바람직하게는 동결건조된 형태의 생체적합성 폴리머-hGH 컨쥬게이트, 상기 컨쥬게이트의 재구성(reconstitution)을 위한 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 상기 재구성된 컨쥬게이트를 필요로하는 환자에게 이를 운반하기 위한 운반 장치를 포함하는 키트에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 키트는 또한 피부 소독제(skin antiseptic) 및 사용 설명서를 포함한다. 바람직하게는, 상기 사용 설명서는 상기 생체적합성 폴리머-hGH 컨쥬게이트 조성물을 필요로 하는 환자에게 상기 조성물을 주당 2회를 초과하지 않도록, 바람직하게는 주당 1회 투여하도록 지시한다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 시린지(syringe)에 프리로딩된(preloaded) 생체적합성 폴리머-hGH 컨쥬게이트를 포함한다.
본 발명의 추가적 양상, 특징 및 이점이 하기의 바람직한 구체예의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
기재된 구체예는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내지만, 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 한 변형이 일어날 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다. 본 발명의 목적은 따라서 첨부된 청구항에 의해 다만 한정되는 것이다.
본 발명의 구체예는 생체적합성 폴리머, 특히 PEG와 hGH의 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기서 상기 활성화된 생체적합성 폴리머는 생물학적 활성 hGH의 카르복실기에 2:1 이하, 바람직하게는 1:1의 몰비로 컨쥬게이트된다. 바람직한 구체예에서, PEG화(pegylation)는 본원에 참조로서 삽입된 미국 출원 제 10/947,513호에 기재된 바와 같이 수행된다. 간단히 말하면, 2 내지 5, 바람직하게는 ≤3.0의 pH에서 EDAC와 같은 커플링제가 hGH 및 생체적합성 폴리머에 단계적으로 첨가된다.
또 다른 관점에서, 본 발명의 구체예는 약제학적으로 허용가능한 양의 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 생체적합성 폴리머는 생물학적 활성 hGH의 C-말단에 2:1 이하, 바람직하게는 1:1의 몰비로 컨쥬게이트된다.
본 발명의 구체예는 2:1 이하, 바람직하게는 1:1의 몰비로의, 생물학적 활성 hGH의 C-말단에서의, 생체적합성 폴리머-생물학적 활성 hGH 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 것이다. 생물학적 활성 hGH는 재조합 방법에 의해 생산되고, 암모늄 설페이트 침전 및 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 상기 정제된 hGH는, 상기 생물학적 활성 hGH의 상기 활성화된 생체적합성 폴리머에 대한 몰비가 1:1 내지 1:20이고, 상기 생물학적 활성 hGH의 상기 커플링 시약에 대한 비가 1:1 내지 1:50이고, 또한 pH가 2 내지 5의 범위인 조건 하에서 커플링 시약의 단계적 첨가에 의해 상기 활성화된 생체적합성 폴리머에 컨쥬게이트된다.
생체적합성
폴리머
생물학적 활성 분자의 컨쥬게이션(conjugation)에 사용된 용어 "컨쥬게이팅 물질(conjugating material)"은 천연 또는 합성 폴리머와 같은 생물학적 활성 분자에 연결(link)될 수 있는 임의의 생체적합성 폴리머를 의미한다.
용어 "생체적합성(biocompatibility)"은 생체 조직(living tissue) 또는 생체 계(system)와의 생체적합성을 의미하고, 체내에서 위해(harm), 염증, 면역 반응 및/또는 발암(carcinogenesis)을 일으키지 않는, 비독성, 비염증성, 및 비발암성인 것을 의미한다.
생체적합성 폴리머는 hGH와 같은 생물학적 활성 물질과 컨쥬게이트된다. 본 발명의 유용한 폴리머는 다양한 용매에 쉽게 가용화되고, 약 300 내지 약 100,000 Da 사이, 바람직하게는 약 2,000 내지 약 40,000 Da의 분자량을 갖는다. 상기 생체적합성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리옥시에틸렌(POE), 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리유산(polylactic acid) 및 이의 유도체, 폴리아크릴산 및 이의 유도체, 폴리아미노산, 폴리비닐알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 이의 코폴리머(copolymer)와 다른 비면역원성(nonimmunogenic) 폴리머를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 생체적합성 폴리머는 선형 폴리머뿐만 아니라 하기의 폴리머 또한 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 생체적합성 폴리머는 지방족 링커 잔기(aliphatic linker residue)를 통해 친핵성(nucleophilically) 치환될 수 있는 활성화된 작용기에 연결된 가용성, 비항원성 폴리머를 포함한다 (미국 특허 제 5,643,575호 및 제5,919,455호). 또한, 본 발명의 생체적합성 폴리머는, 중심 탄소 원자를 둘러싸는 폴리머 아암들(arms), 단백질과 같은 생물학적 활성 물질에 부착되도록 활성화될 수 있는 잔기, 및 수소 또는 메틸기일 수 있는 측쇄(side chaim)를 갖는 두개의 링커 분절(fragment), 또는 다른 링커 분절을 갖는, 다중 아암의(multi-armed), 단일 작용성 및 가수분해적으로 안정한 폴리머를 포함한다 (미국 특허 제5,932,462). 또한, 본 발명의 생체적합성 폴리머는, 폴리머의 작용기가, 리포터 잔기를 갖는 링커 아암을 통해 생물학적 활성 물질에 부착되는 분지상(branched) PEG의 폴리머를 포함한다 (WO 00/33881).
이들 중, PEG는 본 발명의 가장 일반적인 생체적합성 폴리머 중 하나이다. 일반적으로, PEG는 반복 단위, HO-(CH2CH2O)n-H를 갖는 비독성 친수성 폴리머이다. PEG와 컨쥬게이트되었을 때 혈장 내에서 연장된 반감기, 증가된 용해성, 증가된 안정성, 및 감소된 면역원성(immunogenicity)를 나타내는 다양한 단백질이 보고되었다.
단백질 또는 펩티드와 같은 생물학적 활성 물질에 컨쥬게이트되는 PEG 분자의 분자량의 범위는 약 1,000 내지 100,000 Da이고, 1,000 Da를 초과하는 PEG의 독성은 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 1,000 내지 6,000 Da 범위의 PEG는 전신에 분포되며, 신장에서 제거된다. 40,000 Da의 분자량을 갖는 분지상 PEG는 혈액 또는 간을 포함하는 기관에 분포하며, 간 내에서 대사된다.
PEG는 가장 바람직한 생체적합성 폴리머이며, 그 이유는 PEG가 다양한 분자량 범위 내에서 상업적으로 이용 가능하고, 각 옥시에틸렌 단위는 접근하기 용이하도록 친수성으로 2-3 물분자와 결합하고, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜로부터 일말단(one-terminal) 작용기를 갖는 PEG 유도체의 합성이 용이하고, PEG는 항원-항체 반응의 위험성이 매우 낮고, 또한 관련 기술이 잘 개발되어 있기 때문이다.
생물학적 활성 물질(
Biologically
active
materials
)
용어 "생물학적 활성 분자" 또는 "생물학적 활성 물질"은 활성화된 생체적합성 폴리머와 컨쥬게이트되는 모든 친핵체(nucleophile)를 의미하고, 이는 컨쥬게이션 후에도 그들의 생물학적 활성의 적어도 일부를 유지한다. 바람직한 구체예는 hGH를 포함하는 생물학적 활성 분자에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "생물학적 활성"은 물리학적 또는 약제학적 활성에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 생물학적 활성 물질은 천연에서 분리되거나, 또는 재조합적(recombinantly) 또는 화학적으로 합성되며, 또한 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 효소, 바이오의약품(biomedicine), 유전자, 플라스미드(plasmid), 또는 유기 잔류물을 포함한다.
인간 성장 호르몬(
Human
Growth
Hormone
)
본원에 사용된 용어 인간 성장 호르몬(hGH)은 인간 성장 호르몬 및 또한 천연적으로 발생한 폴리펩티드와 동일한 기능을 갖는 hGH의 유사체(analog), 분절(fragment), 동족체(homolog), 유도체 또는 대립 변종(allelic variant)을 포함한다. 본 발명에 따른 성장 호르몬은 인간 또는 동물 근원으로부터 정제될 수 있고, 화학적으로 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. hGH 제제는 상업적으로 입수가능하다. 재조합적으로 생산된 hGH는 SYNTROPINTM으로 언급될 수 있다.
재조합 hGH 종(species)의 제조(manufacture)는 공지되어 있으며, 본원에 참조로서 삽입된 미국 특허 제6,566,328호; 제5,962,411호 및 제5,334,531호에 의해 교시된다. 하나 이상의 PEG에 부착된 hGH는 본원에서 "PEG화된 hGH(pegylated hGH)", PEG-hGH, PEG화된 SYNTROPINTM 또는 PEG-SYNTROPIN로 언급될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 재조합 hGH는 세균 숙주 세포를 이용하여 생산된다. 더욱 바람직하게는, 상기 세균 숙주 세포는 용해(lysis) 및 재조합 hGH의 방출을 야기하는 박테리오파아지 람다(bacteriophage lambda)로 형질감염(transfect)된다. 한층 더 바람직하게는, 상기 박테리오파아지 람다는 본원에 참조로서 삽입된 미국 특허 제6,773,899호에 의해 교시된 지연성 용해(delayed lysis)가 가능하다.
재조합적으로 또는 인간 조직 근원으로부터 분리하거나 하여 생산된 hGH 단백질은 이후에 암모늄 설페이트 침전, HPLC, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피, 겔 배제(gel exclusion) 등을 포함하는 컬럼 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 공지 수단으로 정제될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 암모늄 설페이트를 이용하는 농축 단계 이후 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 조합을 사용하는 정제가 수행된다. 가장 바람직한 구체예에서, 암모늄 설페이트에 의한 농축 후 음이온 교환 컬럼, 바람직하게는 Q 세파로스 FF 컬럼(Q sepharose FF column)을 이용한 단일 단계 컬럼 크로마토그래피가 사용된다. 바람직하게는, 상기 정제된 hGH 단백질은 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 그리고 한층 더 바람직하게는 90% 이상의 순도를 갖는다.
생체적합성
폴리머
-생물학적 활성
hGH
컨쥬게이트의
제조
생물학적 활성 hGH에 생체적합성 폴리머를 컨쥬게이트 하기 위해, 폴리머의 말단기(end group) 중 하나를 반응성 작용기로 변환하였다(convert). 이 공정은 "활성화(activation)"로, 생산물은 "활성화된(activated)" 폴리머로 언급된다. 예를 들어, 폴리(알킬렌 옥사이드, PAO)에 컨쥬게이트하기 위해, 상기 폴리머의 하이드록실 말단기 중 하나는 카르보네이트와 같은 반응성 작용기로 변환될 수 있고, 실온에서 가용성인 활성화된 PAO가 생성된다. 이 그룹(group)은 mPEG와 같은 단일 치환된 폴리(알킬렌 옥사이드) 유도체 또는 C1-4 말단기를 포함하는 다른 적합한 알킬-치환 PAO 유도체를 포함한다.
기술 및 본원에 사용된 용어 "반응성 작용기"는 생물학적 활성 hGH와 결합하도록 생체적합성 폴리머를 활성화시키는 기(group) 또는 잔기(residue)이다.
본원의 반응성 작용기는 카르복실산과 반응할 수 있는 작용기 및 반응성 카르보닐기, 예를 들어 일차 아민, 또는 (아실 하이드라지드, 카르바제이트(carbazate), 세미카르바제이트, 티오카르바제이트 등과 같은) 하이드라진 및 하이드라지드 작용기 중에서 선택된다.
기술 및 본원에 사용된 용어 "카르복실기의 커플링 시약(coupling reagent)" (이후 커플링 시약으로 언급됨)은 상기 반응성 작용기에서 활성화된 생체적합성 폴리머에 hGH와 같은 생물학적 활성 물질의 카르복실기를 커플링하기 위한 임의의 시약을 의미한다.
본 발명의 카르복실기의 커플링 시약은 카르보디이미딜 커플링제, 예를 들어 EDAC[N-(3-디메틸-아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드], DIC[1,3-디이소프로필 카르보디이미드], DCC[디사이클로헥실 카르보디이미드], 및 EDC[1-에틸-3-(3-디메틸아미노 프로필)-카르보디이미드]를 포함하나, 한정되는 것은 아니다. 카르복실기에 대한 바람직한 커플링제는 EDAC이다.
본 발명의 컨쥬게이트의 제조 방법은 생물학적 활성 분자의 내재적 생활성(bioactivity)의 적어도 일부를 유지하면서 충분한 컨쥬게이션이 가능할 수 있는 조건 하에서, 활성화된 생체적합성 폴리머와의 치환 반응을 수행할 수 있는 친핵체를 포함하는 생물학적 활성 hGH를 반응시키는 단계를 포함한다.
2:1 이하, 바람직하게는 1:1 비율로의 생물학적 활성 hGH-생체적합성 폴리머 컨쥬게이트는 생물학적 활성 물질과 화학량적으로(stoichiometric) 과량의 폴리머와의 반응에 의해 수득된다. 예를 들어, hGH-PEG의 제조에서, 생물학적 활성 hGH의 PEG에 대한 몰비는 약 1:1 내지 1:20, 보다 바람직하게는 1:1 내지 1:10의 범위이다. 생물학적 활성 물질의 카르복실기를 활성화하기 위한 시약은 하기의 군으로부터 선택되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, N-(3-디메틸-아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDAC), 3-[2-모르폴린일-(4)-에틸]과 같은 수가용성 카르보디이미드기, 및 p-톨루엔 술포네이트와 같은 5-치환된 이소옥사졸리니움염(5-substituted isoxazolinium salts), 우드워드 시약 K(Woodward's Reagent K).
본 발명에 사용된 생물학적 활성 hGH의 EDAC에 대한 몰비는 약 1:1 내지 1:50, 보다 바람직하게는 약 1:1 내지 1:30, 그리고 가장 바람직하게는 약 1:1 내지 1:20의 범위이다. 바람직하게는, EDAC의 첨가는, EDAC의 20배 몰 과량(20 fold molar excess)을 한번에 첨가하는 것보다는 5번을 초과하여, 바람직하게는 5 또는 6번으로 분할되는데, 그 이유는 EDAC가 수용액 내에서 쉽게 가수분해되기 때문이다.
활성화된 폴리머와 hGH의 컨쥬게이션 반응은 완충액으로서 작용하는 수용성 용매의 pH에 의존적이다. 일반적으로, 반응 완충액의 pH는 2 내지 5, 바람직하게는 2.5 내지 4.5의 범위이다. 이들 물질 및 반응 수율의 안정화를 위한 최적의 반응 조건은 당업계에 공지되어 있다. 컨쥬게이션 반응을 위한 적합한 온도는 0 내지 60 ℃의 범위이고, 바람직하게는 4 내지 30 ℃의 범위이다. 용매의 온도는 단백질 또는 펩티드의 변성 온도를 초과해서는 안된다. 10분 내지 5시간의 반응 시간이 바람직하다. 제조된 hGH 컨쥬게이트는 암모늄 설페이트 침전, 컬럼 크로마토그래피, 투석여과(diafiltration) 또는 이들 공정의 조합에 의해 재생되고 정제될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한 활성 성분으로서 치료적 유효량의 활성화된 생체적합성 폴리머-hGH 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
기술 및 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 인간에게 투여하였을 때 알러지 반응 또는 유사한 반응을 유발하지 않는 것을 의미한다.
약제학적 조성물의 활성 성분으로서의 생체적합성 폴리머-생물학적 활성 hGH 컨쥬게이트는 질환 예방 및 치료를 위해 그 자체로서 또는 약제학적으로 허용가능한 담체와의 조합으로 제형화되어 사용될 수 있다.
기술 및 본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 하나의 기관 또는 조직으로부터 다른 기관 또는 조직으로 생물학적 활성 hGH를 운반하기 위한 약제학적으로 허용가능한 분자, 조성물, 또는 용액, 희석제, 부형제 또는 용매와 같은 운반체(vehicle)을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 국부, 주사 또는 비경구적 경로로 또한 활성 성분으로서 치료적 유효량의 상기 생체적합성 폴리머-생물학적 활성 hGH 컨쥬게이트를 포함하는 이의 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 경구 투여를 위한 제형은 알약, 정제, 코팅정, 과립, 구내정(troche), 웨이퍼(wafer), 엘릭시르(elixir), 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 용액, 시럽, 유탁액(emulsion), 현탁액, 또는 스프레이 등을 포함하며, 또한 비경구적 투여를 위한 제형은 주사용 용액, 마이크로캡슐, 패치 및 그 외를 포함한다.
상기 약제학적 제형은 약제학적으로 허용 가능한 불활성 무기계 또는 유기계 첨가제를 이용하여 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 락토오스, 옥수수전분 및 이의 유도체, 탈크, 또는 스테아르산 및 이의 염이 알약, 정제, 및 경질 젤라틴 캡슐의 제조에 사용될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐 및 좌약의 첨가제는 예를 들어, 오일, 왁스, 반고체 또는 액체 폴리올, 및 천연 또는 경화 오일이다. 용액 또는 시럽의 제조를 위해 적합한 첨가제는 예를 들어, 물, 자당, 전화효소(invertase), 포도당, 및 폴리올이다. 주사용 용액의 제조에 적합한 첨가제는 물, 알코올, 글리세롤, 폴리올, 식물 오일 등이다. 주사용 용액은 보존제, 무통제(indolent agent), 가용화제 및 안정제의 조합으로서 사용될 수 있다. 국부 투여를 위한 제형은 또한 가스, 희석제, 윤활제 및 보존제의 조합으로서 사용될 수 있다. 마이크로캡슐 또는 이식을 위해 적합한 첨가제는 코폴리머 또는 글리콜산 및 젖산이다.
본 발명의 생체적합성 폴리머-생물학적 활성 hGH 컨쥬게이트의 용량은 당업계에 공지된 바와 같이 hGH의 흡수 속도, 용해도, 환자의 나이, 성별, 질환의 상태 및 중증도 등에 따라 다양하다. 하기에 나타낸 실시예 4에서, PEG화된 hGH 단백질(hGH)은 네이티브 hGH 활성의 20% 이하를 유지하며, 제시된 동물의 순환(circulation)에서 현저하게 더 큰 (10배 더 높음) 반감기를 갖는다. 바람직한 구체예에서, PEG-hGH는 네이티브 활성의 적어도 1%, 보다 바람직하게는 적어도 5%, 한층 더 바람직하게는 적어도 10%, 또한 한층 더 바람직하게는 적어도 15%를 유지한다. 바람직한 구체예는 네이티브 hGH 활성의 10-20%를 유지한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 PEG화된 hGH는 네이티브 hGH와 비교하여 생체 내 순환에서 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 5배, 한층 더 바람직하게는 적어도 7배, 그리고 한층 더 바람직하게는 적어도 10배 더 큰 반감기를 갖는다.
분명히 PEG-hGH는 훨씬 용이한 투여 형태로 조합된 임상적 유용성(utility)을 갖는 잠재성을 갖는다. 바람직한 구체예에서, PEG화된 hGH의 투여는 매일 이하, 바람직하게는 주당 5회 이하, 보다 바람직하게는 주당 4회 이하, 한층 더 바람직하게는 주당 3회 이하, 한층 더 바람직하게는 주당 2회 이하, 그리고 한층 더 바람직하게는 주당 1회 이하이다. 도 10의 동물 체중 증가 분석에서 나타난 바와 같이, PEG화된 hGH 또는 SYNTROPINTM(재조합 hGH)의 매주(weekly) 주사는, 시장에서 통용되는 모든 브랜드의 구성성분인, 네이티브 hGH의 매일 주사에 대한 역가(potency)와 상등하다. 인간 성장 기구(Human Growth Foundation)에 따르면, 미국 내 10,000-15,000 어린이가 성장 호르몬 결핍에 의한 성장 부전을 겪고 있는 것으로 추정된다. 이는 분명하게 hGH의 서방성 유형(slow release form)에 대한 필요성을 증명하는 것이다.
특히, 본 발명의 생체적합성 폴리머-생물학적 활성 hGH 컨쥬게이트의 투여는 매일 또는 이틀당 한번으로부터 매주 또는 격주 주사로 주사 간격을 변화시킨다. 따라서, 잦은 투여에 의한 약물의 독성 및 부작용이 실질적으로 감소된다.
치료적
용도
비변형된 성장 호르몬(GH)에 의한 치료를 받을 수 있는 임의의 병태는 본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH로 치료될 수 있다. 특히, 비록 보다 광범위한 테스팅이 성장 호르몬 결핍을 확증하지만, 본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 성장 호르몬 (GH) 결핍, 일반적으로 1년에 2인치 미만의 신장 성장으로 정의되는 어린이를 치료하는데 사용될 수 있다. 이 GH 결핍은 선천성 문제, 종양, 감염 또는 예를 들어 머리 및 목에 대한 종양에 대한 방사선 치료에 기인한다.
본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 자궁내 성장 제한(interuterine growth restriction)의 결과의 치료에도 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 유아는 임신 시기 동안 모체의 영양 섭취, 감염성 질환, 환경, 모체의 과량 알코올 섭취 또는 다른 요인에서 기인하여 작을 수 있다. PEG-hGH의 투여는 이러한 장애를 겪는 어린이들이 성장면에서 그들의 또래를 따라잡도록 한다.
본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 hGH가 성장을 촉진하는데 효과적임에 따라 어린이의 만성 신장 기능저하(insufficiency)의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 터너증후군을 치료하는데 사용될 수 있다. 비록 터너증후군이 GH 결핍에 의해 유발되는 것은 아니지만, GH의 투여는 터너증후군에 시달리는 소녀를 정상 신장에 이르도록 할 수 있다. 본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 프라더-윌리(Prader-Willi) 증후군의 증상의 치료에서 성장 및 마른 체중을 증가시키고, 체지방을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 특발성 저신장증(idiopathic short stature)을 치료하는데 사용될 수 있으며, 이는 어린이의 연령 및 성별에 대한 평균을 매우 밑도는 신장이다. 성장 호르몬 결핍을 나타내지 않고, 정상의 신체를 가지지만, 평균 신장을 2 표준 편차 초과하여 밑도는 어린이들을 위해, 본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH가 이들 어린이들의 신장을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
어린이 시절 성장 호르몬 요법을 받은 어린이는 종종 이 요법으로부터 성인 때도 혜택을 받는다. 성인은 더 크게 성장할 필요가 없지만, 여전한 성장 호르몬의 결핍은 지방 과잉, 감소된 근육량 및 낮은 생활성 등으로 이어질 수 있다. 또한, 어린이 시절 성장 호르몬 요법을 받지 않은 일부 성인은 성인으로서 불충분한 양의 성장 호르몬을 생산할 수 있다. GH 결핍 증상은 얼굴 및 복부 주변의 증가된 지방, 낮은 수준의 마른 신체 용적, 골손실, 잔주름을 갖는 박화되는(thinning) 피부, 저조한 발한(poor sweating) 또는 체온 조절, 성생활에 대한 낮은 흥미, 수면 문제, 저조한 근육 강도, 저조한 운동 수행, 높은 콜레스테롤 수치, 과다한 인슐린 생성 및 우울증을 포함한다. 본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 이들 환자에 대한 치료 프로그램에 사용될 수 있다.
GH는 성인에서의 AIDS에 의해 야기되는 소모성 증후군, 화상 또는 외상성 손상의 치료에 사용되기 위해 FDA 승인되었다. 본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 이들 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
GH는 또한 노화의 영향에 대항하는데 유용함이 밝혀져왔다. 노화 단계의 일부로서, GH의 생산이 감소한다. GH 결실은 (특히 복부 주변의) 증가된 체지방, 감소된 생활력, 감소된 근육 용적, 증가된 혈압 및 콜레스테롤과 저조한 일반적인 건강을 포함하는 노화의 전형적인 징후로서 주목된다. 본 발명의 구체예에 따른 PEG-hGH는 이들 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
상기한 바와 같은 컨쥬게이트된 hGH는 환자 또는 건강 관리 의료인에게 키트로서 편리하게 제공될 수 있다. 상기 키트는 hGH 컨쥬게이트, 바람직하게는 미리 측정된(pre-measured) 용량 형태의 hGH 컨쥬게이트를 포함한다. 상기 키트는 바람직하게는 미리 측정된 용량의 hGH 컨쥬게이트의 하나 이상의 용기를 포함한다.
상기 hGH 컨쥬게이트는 동결건조된 형태 또는 약제학적으로 허용가능한 담체로서 제공될 수 있다. 상기 hGH 컨쥬게이트가 동결건조 형태로 제공된다면, 상기 키트는 바람직하게는 상기 컨쥬게이트의 재구성을 위한 약제학적으로 허용가능한 담체도 포함할 것이다.
바람직한 구체예에서, 상기 키트는 치료될 개체로 상기 hGH를 운반하기 위한 운반 장치를 포함한다. 상기 운반 장치는 바람직하게는 시린지이다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 미리 측정된 용량의 hGH 컨쥬게이트가 프리로딩된 시린지를 포함할 수 있다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 또한 상기 운반 장치 또는 시린지를 사용하여 운반하기 전에 피부에 처리하기 위한 임의의 피부 소독제, 붕대 재료 및 사용 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 및 다른 특징은, 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명을 한정하는 것이 아닌 바람직한 구체예의 도면에 대한 참조로서 기재될 것이다.
도 1은 인간 성장 호르몬(hGH)의 일차 구조를 나타낸다.
도 2는 연속적인 정제 단계를 거친 신트로핀(SYNTROPIN) 약제 물질(drug substance)의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 레인 1: MW 마커; 레인 2: hGH 조정 배지(conditioned medium); 레인 3: (NH4)2SO4 침전된 hGH 배지; 레인 4: Q-세파로스(Q-Sepharose) 컬럼으로 정제된 hGH ; 레인 5: Q-세파로스 및 페닐-세파로스 컬럼으로 정제된 hGH.
도 3은 정제된 신트로핀 약제 물질의 SDS PAGE 겔의 농도계(densitometer) 스캔을 나타낸다. 물질의 99.9%는 피크#2 내에 있다.
도 4는 1 단계 컬럼 크로마토그래피 이후의 인간 성장 호르몬(hGH)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 도 4A는 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 도 4B는 레인 4의 농도 계 스캔을 나타낸다.
도 5는 크기 배제 컬럼(size exclusion column) 상에서의 PEG화(PEGylation)의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 6은 크기 배제 컬럼 상에서의 정제된 mono- 및 di-PET-hGH의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 도 6A는 mono-PEG-hGH의 프로파일을 나타낸다. 도 6B는 di-PEG-hGH의 프로파일을 나타낸다.
도 7은 세포 증식 분석에 의한 PEG-hGH의 생물학적 활성을 나타낸다.
도 8은 랫트에서의 PEG-hGH의 PK 연구를 나타낸다 (용량=200 ㎍/㎏, 피하(s.c.) 주사).
도 9는 전장(full-length) hGH 수용체를 발현하는 세포에서의 hGH의 생물학적 분석(bioassay)을 나타낸다.
도 10은 hGH 및 PEG-hGH를 하수체 적출된(hypophysectomized) 랫트 내로 주입하고 28일 기간에 걸쳐 상기 동물의 체중 증가를 모니터한 동물 연구를 나타낸다.
도 11은 하수체 적출된 랫트의 체중에 대해 상이한 용량의 hGH 및 PEG-hGH의 효과를 나타낸다. 상기 데이타는 평균값(mean) +/- S.E.M으로 표시되었다. 양성 대조군(G5) 및 시험 샘플은 일회(single) 용량으로 피하 주사에 의해 투여되었다. 운반체(Vehicle) 대조군(G1) 및 양성 대조군은 6일 동안 매일 피하 주사에 의해 투여되었다. Gl: 운반체 대조군(n=6); G2: 양성 대조군 hGH, 5 ㎍/마리, 매일 주사(n=9); G3: 양성 대조군 hGH, 10 ㎍/마리, 매일 주사(n=9); G4: 양성 대조군 hGH, 30 ㎍/마리, 매일 주사(n=9); G5: 양성 대조군 hGH, 180 ㎍/마리, 일회 주사(n=9); G6: 시험 샘플 PEG-hGH, 30 ㎍/마리, 일회 주사(n=9); G7: 시험 샘플 PEG-hGH, 60 ㎍/마리, 일회 주사(n=9); G8 시험 샘플 PEG-hGH, 180 ㎍/마리, 일회 주사(n=9). 도 11A는 단일 그래프 상에 G1-G8을 나타낸다. 도 11B는 G1-G4만을 나타낸다. 도 11C는 Gl 및 G5-G8만을 나타낸다.
하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에의 구체예를 추가로 설명하고 증명한다. 실시예는 다만 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 주어진 것으로, 이를 제한하기 위함이 아니고, 이의 다양한 변형은 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 한 가능하다.
실시예
실시예
1.
파아지
-의존성(
phage
-
dependent
) 방법에 의한 인간 성장 호르몬의 생산
재조합 hGH는 본원에 참조로서 삽입된 미국 특허 제6,773,899호에서 교시된 바와 같이 본질적으로 준비되었다. 대장균 BL21(DE3)(NOVAGEN)의 배양물은 인간 성장 호르몬을 인코딩하는(encoding) 화학적으로 합성된 유전자(서열번호 4) 1 카피(copy)를 함유하는 플라스미드에 의해 형질전환되었다. 해독된 아미노산 서열은 서열번호 5에 나타내었다. BL21(DE3) 배양물은 세균 게놈(genome) 내의 유도가능한(inducible) lac UV5 프로모터(promotor)의 제어 하의 T7 RNA 중합효소에 대한 유전자의 단일 카피를 함유한다 (Studier 등 (1986) J. MoI. Biol. 189: 113-130). 플라스미드 pET-24a(+) (NOVAGEN) 내로 T7 프로모터(promotor)의 제어 하에 인간 성장 호르몬 유전자를 삽입하였다. 인간 성장 호르몬 유전자의 발현은, IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도(induction)을 통해 매개되는 세포 내 T7 RNA 중합효소의 출현 이후에만 시작된다.
대장균 BL21(DE3)의 형질전환된 배양물은 50 ㎍/ml 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 LB 배지 내에서 2 x 108 세포수/ml의 밀도까지 37 ℃에서 진탕배양되었다. 그 후 상기 세포는 1 세균세포 당 약 10 파아지체(phage bodies)의 다중도(multiplicity)에서 파아지(phage) λ cI857 Qam117 Ram54로 감염되었으며, 23 ℃에서 약 14시간 동안 진탕배양되었다. 파아지와 동시에, 1 mM IPTG가 배지 내에 도입되었다.
파아지 λ cI857 Qam117 Ram54는 28 ℃의 LB 배지 내에서 집중 폭기(intensive aeration)하면서 대략 1 x 108 cells/ml의 밀도가 될때까지 키운 E. coli RLMI의 용원성(lysogenic) 배양물로부터 준비되었다. 상기 용원성 배양물은 43℃까지 가온하고, cI 억제제(repressor)를 불활성화하기 위해 20분간 인큐베이트(incubate)하였다. 그 후 온도를 37 ℃까지 강하시키고, 60-70분 후 상기 세균 세포를 용해(lysis)하고, 파아지가 1-2 x 1010PFL/ml 형성되었다.
파아지-감염된 세포와 14시간 배양 후, 원심분리에 의해 배양배지로부터 찌꺼끼(debris)를 제거하여 조정 배지(conditioned media)를 생성하였다.
실시예
2:
네이티브
hGH
-3의 정제 단계 방법
실시예 1의 조정 배지(방출된 단백질을 함유하는 세균 용해 후의 세균 성장 배지)를 암모니움 설페이트 침전으로 정제한 후, Q-세파로스 및 페닐 세파로스 컬럼 상에서 정제하였다. 도 2는 각 연속적 정제 단계 후 수득된 약제 물질의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 조정 배지 내의 가용성, 생물학적 활성 성장 호르몬 산물을 레인 2에 나타내었다 (도 2). 상기 약제 물질은 그 후 암모늄 설페이트 침전, 이후 Q-세파로스 및 페닐-세파로스 상에서의 연속적인 크로마토그래피 단계가 뒤따르는 3-단계 정제 과정에 적용된다. 도 2의 레인 5에 도시된, 정제된 최종 약제 물질은 도 3에 나타낸 바와 같이 이 레인의 농도계적 스캔에 의해 99%를 넘는 순수한 것으로 판단되었다. 이 공정은 국제적 성장 호르몬 표준에 상응하는 생물학적 활성을 갖는 고순도의 인간 성장 호르몬 제품을 생산한다. 이는 이후의 PEG화(pegylation) 연구에서 사용되었다.
실시예
3.
네이티브
hGH
의 준비 - 일
컬럼
방법
일부 연구에서, 일 컬럼 정제 방법이 사용되었다. 인간 성장 (hGH)에 대한 이 단백질 정제 절차는 단일 컬럼 크로마토그래피 단계를 요구한다. 제1의 암모늄 설페이트 침전 단계는 컬럼 크로마토그래피를 작동시키기 이전의 농축 단계이다.
(
NH
4
)
2
SO
4
침전 단계
실시예 1에 기재된 방법에 의해 생산된 hGH의 3 리터 발효물(fermentation)을 냉동하고, 용해된 세균 배양물을 4 ℃에서 해동하고, 조정 배지를 수득하기 위해 16000 g에서 원심분리하여 맑게 하였다. 최종 50% 포화 농도가 되도록 상기 조정배지를 교반하며 상기 배지 내에 동일 부피의 포화된 (NH4)2SO4 용액을 펌프하고, 상기 혼합물을 추가적으로 1시간 동안 교반하였다. 침전물은 16000 g에서 1시간 동안 원심분리하여 수합하였다. 펠렛(pellet)을 조정 배지의 1/10 부피의 20 mM TrisㆍCl pH8.0에 용해시켰다. 상기 용액을 20 mM TrisㆍCl pH8.0에 대해 투석하였다. 완충액으로 교환된 용액은 임의의 침전물을 제거하기 위해 원심분리하거나 여과하여 맑게하였다.
Q-
세파로스
FF
컬럼
크로마토그래피 단계
완충액으로 교환된 샘플을 20 mM TrisㆍCl, pH 8으로 평형화된(equilibrated) Q-세파로스 FF 컬럼에 적용하였다. 상기 컬럼은 A280 nm에서의 흡광도(absorption)가 기저선에 도달할 때까지 20 mM TrisㆍCl pH8.0으로 세척하였다. 상기 컬럼은 그 후 A280 nm에서의 흡광도(absorption)가 기저선에 도달할 때까지 70 mM NaCl-20mM TrisㆍCl pH8.0로 세척하였다. hGH는 120 mM NaCl-20mM TrisㆍCl pH8.0로 용리하였으며, 용리 피크를 수집하였다. 용리물(eluate)의 순도는 SDS-PAGE 및 HPLC로 측정하였다. 일반적으로, 95%를 초과하는 순수한 hGH가 수 득되었다.
도 4A는 SDS-PAGE 겔에 의한, 정제의 다양한 단계에서의 hGH 제제의 순도를 나타낸다. 도 4A는 분자량 표준을 나타내는 레인 1, 및 정제 단계를 거친 hGH 제제의 상대적 순도를 나타내는 레인 2-4를 갖는 실제의 겔 이미지를 나타낸다. 레인 2는 발효 가동(run) 이후 수득된 조정 배지 또는 파아지 용해물의 분획물(aliquot)이다; 레인 3은 암모늄 설페이트에 의한 조정배지의 침전 이후이다; 그리고 레인 4는 단일 Q-세파로스 크로마토그래피 단계 이후의 hGH의 분획물이다.
도 4B는 hGH의 상대적 순도를 계산하는 SDS-PAGE 겔의 레인 4의 농도계적 분석을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 상기 hGH는 단일 컬럼 크로마토그래피 단계 이후 99.4 퍼센트 순수한 것으로 판정되었다.
실시예4
.
PEG화된
(
pegylated
)
hGH
의 준비
상기에 기재된 방법 중 하나로 정제된 인간 성장 호르몬은, 본원에 참조로서 삽입된 미국 출원 제 10/947,513에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 PEG화되었다. 한편, hGH는 상업적 공급처로부터 수득될 수도 있다. 간단히 말하면, 1 ㎎의 hGH는 최종 농도가 2 ㎎/㎖이 되도록 50 mM MES 완충 용액에 대해 투석되었다(Centricon-10, Amicon, USA). 이 단백질 용액에, mPEG-하이드라지드(hydrazide)(Hz) (ISU화학, 한국, 0.0005 mmol)를 첨가하고, 그 후 20 ㎕의 dH2O에 2 ㎎의 EDAC를 용해하여 준비한 EDAC 용액을 20배 몰 초과하여 첨가하였다. EDAC는 PEG를 활성화하기 위해 15배 몰 초과하여 사용되었다. 상기 반응은 PEG (20000) 또는 PEG (30000) 중 어느것이든 사용하여 수행되었다. 상기 반응은 실온(20-25℃)에서 1시간동안 교반하며 수행되었다. 1시간 후, 비반응한 hGH 및 과잉의 시약은 크기 배제 컬럼 또는 이온-교환 컬럼에 의해 제거되었다. 바람직한 구체예에서, EDAC의 양은 20 내지 50배 몰 초과의 범위이고, mPEG-Hz는 10 내지 20배 몰 초과의 범위이다. Mono-PEG-hGH (하나의 PEG가 하나의 hGH 분자에 부착됨, Lot No BPM#04-003) 및 di-PEG-hGH (두 PEG가 하나의 hGH 분자에 부착됨, Lot No BPM#04-004)가 크기 배제 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 분리되었다. 상기 정제된 PEG-hGH 분획(fraction)은 추가의 분석까지 4-8℃의 PBS 용액에 보관되었으며, PEG-hGH의 시험관 내 생물학적 활성 및 랫트에서의 반감기를 평가하는데 사용되었다.
활성화된 PEG 유도체와 hGH의 반응은 도 5에 나타난 바와 같이 220 nm에서 모니터되는, 크기 배제 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 증명되었다. PEG-hGH의 농도는 UV-VIS 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 광학적 밀도(O.D.)에 의해 측정되었다. 대략 mono-PEG-hGH, di-PEG-hGH, 및 비반응한 hGH의 48 %, 31 %, 및 21 %가 각각 생성되었다. 각 분획은 그 후 크기 배제 컬럼에 의해 정제되었으며, 도 6A(mono-PEG-hGH) 및 6B(di-PEG-hGH)에 나타낸 바와 같이 HPLC 상에서 증명되었다. 각 PEG-hGH 샘플의 순도는 >95 %로 측정되었다.
PEG
-
hGH
의 생물학적 활성:
랫트에서의
PEG
-
hGH
의
PK
연구
mono- 및 di-PEG-hGH의 생물학적 활성은 세포 증식 분석에 의해 측정되었으 며, 네이티브 hGH(페이지 바이오텍 제품)와 비교되었다. mono- 및 di-PEG-hGH는 220-24Og 중량의 7주령의 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트(각 그룹당 5마리 이상의 랫트)에 각각 피하 주사에 의해 200 ㎍/㎏의 용량으로 투여되었다. 네이티브 hGH는 대조군으로서 사용되었다. 주사 후 0, 10분, 30분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48시간, 72 및 96 시간의 시간 간격에 혈액을 채취하였다. 혈청 샘플은 12000 rpm에서 원심분리하여 수득하였으며, 추가적 분석을 위해 -20 ℃에서 보관하였다.
도 7은 세포 증식 분석에 의해 측정된 네이티브 hGH뿐만 아니라 mono- 및 di-PEG-hGH의 생물학적 활성을 나타낸다. 생물학적 분석은 세포 증식 분석으로, 여기서 hGH는 인간 성장 호르몬 수용체 전장(full-length)이 안정적으로 감염되어 있는 BaF3 세포의 증식을 촉진한다. Baf-B03 B2B2로 불리는 이 세포주는 이의 hGH에 대한 반응의 점에서 광범위하게 특징화되어 있다 (Behncken SN 등 1997. J Biol Chem 272:27077- 27083). mono- 및 di-PEG-hGH의 활성은 각각 15±5% 및 8±2%로 측정되었다.
PEG-hGH의 약동학적(PK) 연구는 네이티브 hGH(페이지 바이오테크)와 비교하여, ELISA 분석을 이용하여 혈청 샘플 내의 hGH의 양을 측정하는 것에 의해 수행되었다. 도 8은 PEG-hGH의 PK 연구를 나타내고, 네이티브 hGH와 비교하였다. 네이티브 hGH는 주사 후 5시간 이내에 혈액으로부터 제거된 반면, mono- 및 di-PEG-hGH 모두는 주사 후 72시간 이후에도 검출된 것으로 나타났다.
본 발명자들은 mono- 및 di-PEG-hGH의 생물학적 활성이 네이티브 hGH와 비교 하여 각각 15±5 % 및 8±2 %로 유지되는 것을 관찰하였다. 그러나, 상기 PK 연구는 PEG-hGH가 랫트 내의 네이티브 hGH보다 훨씬 더 느리게 제거되었음을 나타낸다. 따라서, 본 연구의 PEG-hGH 샘플은 새로운 hGH의 지속방출성 약물(sustained released drug)을 제공할 수 있다.
실시예
5. 생물학적 분석
상기에 기재된 제제(preparatioin)의 활성은 BaF3 세포를 이용한 세포 증식 분석에 의해 테스트되었으며, 상업적으로 입수 가능한 hGH들과 비교되었다. SYNTROPINTM, NUTROPIN® 및 HUMATROPE®는 상업적으로 입수 가능한 hGH 유형이다. 대표적인 표준 곡선을 도 9에 나타내며, 여기서 4개의 상업적으로 입수 가능한 hGH들로의 유사 용량 반응 곡선이 나타내어진다. 상기에 기재된 바와 같이 준비된 hGH의 특이적 활성은 상업적으로 입수 가능한 hGH와 비교한다. 기대된 바와 같이, 네이티브 SYNTROPINTM의 PEG화는 네이티브 hGH에 비해 더 많은 PEG기가 부착한 것에서와 같이 더 많은 활성 손실이 발생하는 생물학적 활성의 손실을 야기한다.
표 1: 세포 증식 분석에서
테스트된
hGH 제제의
유효성(
Potency
) (
IU
/
mg
)
실시예
6.
하수체
적출된(
hypophysectomized
)
웅성
랫트에서의
신체 성장에 대한 PEG-hGH의 효과
이용된 두번째 생물학적 분석은, mono- 또는 di-PEG-SYNTROPIN을 최초 7일 동안 하루에 한번, 또는 1일째 일회 주입하는 것으로 hGH를 피하 주사한 후, 4-5주령의 하수체 적출된 랫트((주)오리엔트, 경기도 성남 상대원동 143-1)의 체중을 28일 기간에 걸쳐 모니터하는, 고전적인 랫트 체중 증가 분석이었다 (Roswall EC, 등 1996. Biologicals 24: 25-39). 세포-기반 생물학적 분석에서 PEG-SYNTROPIN의 다소 낮은 유효성 하에서 (표 1) 기대밖으로 현저하게도, PEG화된 SYNTROPIN는 네이티브 hGH를 매일 주사하는 것에 비교하여, 주당 일회만을 주사하였을 때 네이티브 hGH에 상응하는 활성을 나타내었다 (도 10 참조). 도 10에서, 7일째에 네이티브 hGH를 매일 주사받은 랫트는 mono-PEG-SYNTROPIN 또는 di-PEG-SYNTROPIN 중 어느 것이든 단일 주사받은 랫트와 거의 동일하게 무게가 나가는 것을 볼 수 있다. 또한 예기치 못한 것은, 네이티브 SYNTROPIN을 받은 이들 동물과 비교하여 PEG-SYNTROPIN이 투여된 동물들에서의 체중 증강 속도였다. 도 10에서, mono-PEG-hGH 또는 di-PEG-hGH 중 어느것이든 단일 투여받은 랫트는 네이티브 hGH를 매일 주사받은 이들 동물들에 비해 초기 4일에 걸쳐 확연히 더욱 빠른 속도로 체중이 증가되었다. 네이티브 hGH를 받은 동물들은 7일째까지는 PEG화된 성장 호르몬을 받은 동물들의 체중에 "따라잡기(catch up)"를 할 수 없다.
웅성의 하수체 적출된 랫트에서의 신체 성장에 대한 PEG-hGH의 효과는 추가적으로 상이한 용량으로 연구되었다. 4-5주령의 하수체 적출된 랫트를 구입하여, 5일간 보존하고, 피하 주사에 의해 일회 PEG-hGH(G6~G8)를 투여하고, 11일 동안 매일 체중을 측정하였다. 음성 대조군(운반체(vehicle) 대조군, Gl)인 염수(saline solution)와 네이티브 hGH(양성 대조군, G2-G4)는 피하 주사에 의해 6일간(1일-6일) 매일 투여되었으며, 각 랫트의 체중은 11일간 측정되었다. 또한, 고용량 (180 ㎍) hGH(G5)는 피하 주사에 의해 일회 투여되었으며, 체중은 다른 그룹들과 비교하기 위해 측정되었다.
임의의 처리의 결과로서 어떠한 비범한 증상도 관찰되지 않았으며, 체중에서의 어떠한 현저한 변화도 염수 대조군 (Gl, 도 11A-C) 또는 hGH 투여 그룹(G5, 도 11A, 11C)에서 관찰되지 않았다.
이 연구로부터, 양성 대조군인 G2, G3 및 G4의 랫트의 체중은 hGH의 일일(daily) 투여 동안 각각 7.37 %, 9.03 %, 및 10.79 %로 증가되는 것으로 나타났 으며 (도 11A, 11B), 반면 PEG-hGH 랫트인 G6, G7 및 G8의 체중은 PEG-hGH의 일회 투여 후 각각 8.42 %, 12.48 %, 및 18.37 %로 증가한 것으로 나타났다 (도 11A, 11C). 이 결과는 체중의 증가는 투여된 hGH 또는 PEG-hGH의 양에 비례적인 것을 나타낸다. 그러나, 고용량 hGH (180㎍/랫트)의 거환(bolus) 하나의 투여는 작고도 일시적인 반응만을 생성하고 (G5, 도 11A, 11C), 반면 PEG-hGH의 일회 투여는 더 크고도 더 지속적인 반응을 주었다.
하수체 적출된 랫트에게 PEG-hGH의 일회 주사는 체중을 눈에 띄게 증강시키고, 증강된 체중은 적어도 6일간 확실히 유지되는 것으로 관찰되었다. hGH의 매일 주사는 체중을 증강시키지만, 체중은 hGH의 투여를 중지하자마자 감소하기 시작하였다. hGH의 고용량의 단일 거환 주사 (G5)는 투여 후 다음날 체중을 <4 % 증강시켰으며, 그 후 비PEG화된 hGH 샘플에 대해 체중을 지속적으로 향상시키기 위해 네이티브 hGH의 지속적인 주사가 필요한 것을 지시하는 음성 대조군만큼 체중이 감소되었다.
용량 의존적인 체중 수득은 PEG-hGH뿐만 아니라 hGH에 대해서도 관찰되었다. 달리 말하면, 체중 수득은 하수체 적출된 랫트에 투여된 PEG-hGH 또는 hGH의 양에 비례하였다.
본 연구는 PEG-hGH의 일회 주사가 체중을 증강시키고, 하수체 적출된 랫트에서 적어도 6일간 체중을 확실히 유지시키나, 반면 랫트의 증강된 체중을 지속적으로 유지하기 위해 비PEG화된 hGH를 6일간 매일 주사하는 것이 필요한 것을 나타낸다. 매주 주사 가능한 약물로서의 PEG-hGH는 hGH의 매일 주사에 대해 전도유망한 대안이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 기술된 한, 당업자는 본 발명의 정신으로부터 벗어나지 않는한, 본원에서 상술한 청구항의 진정한 범위, 의미 및 이의 동등어 내에서의 이러한 모든 추가적 변형 및 변화를 포함하는 다른 구체예가 조성될 수 있음을 인식할 것이다. 상기 실시예는 또한 본 발명의 범위 내에서 구체예를 설명하고 증명한다. 상기 실시예는 단지 본 발명의 설명을 목적으로 하여 주어지는 것으로, 본 발명의 한정으로서 해석되는 것은 아니며, 본 발명의 다양한 변형은 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않는 한 가능하다.
SEQUENCE LISTING
<110> Phage Biotechnology Corporation
Jacobs, John, W.
Qin, Shiliang
Zhang, Mingyu
Li, Huaina
Park, Myung-Ok
<120> HUMAN GROWTH HORMONE CONJUGATED WITH
BIOCOMPATIBLE POLYMER
<130> PHAGE.020QPC
<150> 11/187,522
<151> 2005-07-22
<160> 5
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 192
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Pro Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
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<210> 2
<211> 1822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized sequence for Human Growth
Hormone using codons preferred for expression in
E. coli
<221> TATA_signal
<222> (102)...(107)
<221> CDS
<222> (193)...(202)
<221> intron
<222> (203)...(458)
<221> CDS
<222> (459)...(619)
<221> intron
<222> (620)...(828)
<221> CDS
<222> (829)...(948)
<221> intron
<222> (949)...(1041)
<221> CDS
<222> (1042)...(1206)
<221> intron
<222> (1207)...(1459)
<221> CDS
<222> (1460)...(1654)
<400> 2
ggagcttcta aattatccat tagcacaagc ccgtcagtgg ccccatgcat aaatgtacac 60
agaaacaggt gggggcaaca gtgggagaga aggggccagg gtataaaaag ggcccacaag 120
agaccggctc aaggatccca aggcccaact ccccgaacca ctcagggtcc tgtggacgct 180
cacctagctg ca atg gct aca g gtaagcgccc ctaaaatccc tttgggcaca 232
Met Ala Thr
1
atgtgtcctg aggggagagg cagcgacctg tagatgggac gggggcacta accctcaggt 292
ttggggcttc tgaatgagta tcgccatgta agcccagtat ggccaatctc agaaagctcc 352
tggtccctgg agggatggag agagaaaaac aaacagctcc tggagcaggg agagtgctgg 412
cctcttgctc tccggctccc tctgttgccc tctggtttct ccccag gc tcc cgg acg 469
Gly Ser Arg Thr
5
tcc ctg ctc ctg gct ttt ggc ctg ctc tgc ctg ccc tgg ctt caa gag 517
Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu
10 15 20
ggc agt gcc ttc cca acc att ccc tta tcc agg ctt ttt gac aac gct 565
Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala
25 30 35
atg ctc cgc gcc cat cgt ctg cac cag ctg gcc ttt gac acc tac cag 613
Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln
40 45 50 55
gag ttt gtaagctctt ggggaatggg tgcgcatcag gggtggcagg aaggggtgac 669
Glu Phe
tttcccccgc tgggaaataa gaggaggaga ctaaggagct cagggttttt cccgaagcga 729
aaatgcaggc agatgagcac acgctgagtg aggttcccag aaaagtaaca atgggagctg 789
gtctccagcg tagaccttgg tgggcggtcc ttctcctag gaa gaa gcc tat atc 843
Glu Glu Ala Tyr Ile
60
cca aag gaa cag aag tat tca ttc ctg cag aac ccc cag acc tcc ctc 891
Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu
65 70 75
tgt ttc tca gag tct att ccg aca ccc tcc aac agg gag gaa aca caa 939
Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln
80 85 90
cag aaa tcc gtgagtggat gccttgaccc caggcgggga tgggggagac 988
Gln Lys Ser
95
ctgtagtcag agcccccggg cagcacaggc caatgcccgt ccttcccctg cag aac 1044
Asn
cta gag ctg ctc cgc atc tcc ctg ctg ctc atc cag tcg tgg ctg gag 1092
Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu
100 105 110
ccc gtg cag ttc ctc agg agt gtc ttc gcc aac agc ctg gtg tac ggc 1140
Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly
115 120 125 130
gcc tct gac agc aac gtc tat gac ctc cta aag gac cta gag gaa ggc 1188
Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly
135 140 145
atc caa acg ctg atg ggg gtgggggtgg cgctaggggt ccccaatctt 1236
Ile Gln Thr Leu Met Gly
150
ggagccccac tgactttgag agctgtgtta gagaaacact gctgccctct ttttagcagt 1296
ccaggccctg acccaagaga actcacctta ttcttcattt cccctcgtga atcctctagc 1356
ctttctctac accctgaagg ggagggagga aaatgaatga atgagaaagg gagggagcag 1416
tacccaagcg cttggcctct ccttctcttc cttcactttg cag agg ctg gaa gat 1471
Arg Leu Glu Asp
155
ggc agc ccc cgg act ggg cag atc ttc aag cag acc tac agc aag ttc 1519
Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe
160 165 170
gac aca aac tca cac aac gat gac gca cta ctc aag aac tac ggg ctg 1567
Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu
175 180 185
ctc tac tgc ttc agg aag gac atg gac aag gtc gag aca ttc ctg cgc 1615
Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg
190 195 200
atc gtg cag tgc cgc tct gtg gag ggc agc tgt ggc ttc tagctgcccg 1664
Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
205 210 215
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cttggaagtt gccactccag 1724
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 1784
ctataatatt atggggtgga ggggggtggt ttggagca 1822
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50 55 60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
210 215
<210> 4
<211> 579
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized sequence for Human Growth
Hormone using codons preferred for expression in
E. coli
<400> 4
atgtttccga cgatcccgct gtcccgcctt tttgataacg cgatgctgcg tgcacatcgt 60
ctgcaccagc tggcgtttga cacctaccag gaattcgaag aggcttacat tccgaaagag 120
cagaaatact ctttcttgca gaacccacaa accagcctgt gtttcagcga atccatcccg 180
actccttcca atcgtgaaga gacccaacag aagagcaacc tggagttgtt gcgtatcagc 240
ctgctgctga ttcagtcatg gctggaaccg gtgcagtttt tacgcagcgt cttcgccaat 300
agcctggtat acggcgccag cgattcaaac gtctatgatc tgctgaagga cctggaagaa 360
ggcattcaga cgctgatggg tcgcctcgaa gacggttctc cgcgcacggg tcaaatcttt 420
aaacaaacct actctaaatt cgacactaac tcgcataatg atgatgcgtt gctgaagaac 480
tatggcctgc tgtactgttt tcgtaaagat atggataaag ttgaaacctt tttacgtatt 540
gtgcagtgcc gttctgtgga aggcagttgc ggcttctaa 579
<210> 5
<211> 192
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
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Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
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145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
1
2227509
122005
1
Claims (28)
- 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트로서, 여기서 상기 생체적합성 폴리머는 hGH의 카르복실기에 2:1 이하의 몰비로 컨쥬게이트된 것인, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머는 PEG-20000 및 PEG-30000로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트.
- 약제학적으로 허용가능한 양의 청구항 1에 따른 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 카르복실기는 hGH의 C-말단인, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 활성은 비컨쥬게이트된 hGH 단백질의 10-20%인, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머는 hGH의 카르복실기에 1:1의 몰 비로 컨쥬게이트되는, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트.
- 청구항 6에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머는 PEG인, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트.
- (a) 정제된 hGH 단백질을 제공하는 단계;(b) 커플링 시약(coupling reagent)을 단계적으로 첨가하여 생체적합성 폴리머를 활성화하는 단계; 및(c) 상기 활성화된 생체적합성 폴리머를 hGH의 카르복실기에 2:1 이하의 몰비로 컨쥬게이트하는 단계를 포함하는 청구항 1의 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트의 제조 방법으로서, 여기에서 상기 hGH의 상기 활성화된 생체적합성 폴리머에 대한 몰비는 1:1 내지 1:20이고, 상기 hGH의 상기 커플링 시약에 대한 비율은 1:1 내지 1:50이고, 또한 pH는 2 내지 5의 범위인, 청구항 1의 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트의 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머는 카르복실산과 반응할 수 있는 반응성 작용기 및/또는 반응성 카르보닐기로 활성화되는 것인, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트의 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머는 PEG-20000 및 PEG-30000로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트의 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 카르복실기는 hGH의 C-말단인, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트의 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서,(i) 재조합 숙주(recombinant host)에서 hGH를 생성하는 단계;(ii) 암모늄 설페이트를 사용하여 hGH를 농축하는 단계; 및(iii) 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 상기 농축된 hGH를 정제하는 단계에 의해 정제된 hGH를 제공함을 추가로 포함하는, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트의 제조 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 크로마토그래피는 단일 단계로 수행되는, 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH)의 컨쥬게이트의 제조 방법.
- 유효량의 청구항 1의 컨쥬게이트를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 의한 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머는 PEG인, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 PEG-hGH는 1:1의 몰비로 컨쥬게이트된 것인, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 hGH 단백질의 활성의 10-20%를 갖는, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 성장부전 또는 성장지연은 호르몬 결핍, 만성 신장 질환(chronic renal disease), 터너증후군(Turner's syndrome), 악액질(cachexia) 또는 AIDS 소모(AIDS wasting)에 기인한 것인, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합되어 투여되는, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 투여는 주사에 의해 수행되는, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 투여는 경구 투여인, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 주당 2회 이하로 투여되는, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation)의 치료방법.
- 청구항 2에 따른 PEG-hGH를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 주당 두번 이하의 빈도로 투여함에 의한 어린이 저신장증(short stature)의 치료 방법으로서, 여기서 상기 PEG는 hGH의 C-말단 카르복실기에 1:1의 몰비로 컨쥬게이트되고, 상기 PEG-hGH는 비컨쥬게이트된 hGH 활성의 10-20%를 갖는, 어린이 저신장증(short stature)의 치료 방법.
- 청구항 2에 따른 PEG-hGH를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함에 의한, 순수 근육(lean muscle)의 감소, 혈압 증가, 콜레스테롤 증가, 체지방 증가, 피부색(skin tone) 손실, 및 골밀도 감소로 구성되는 군으로부터 선택되는 노화와 관련된 유해 효과(adverse effect)의 치료 방법으로서, 여기서 상기 PEG는 hGH의 카르복실기에 1:1의 몰비로 컨쥬게이트되는 것인, 노화와 관련된 유해 효과(adverse effect)의 치료 방법.
- 동결건조된 형태인 청구항 1의 컨쥬게이트;상기 컨쥬게이트의 재구성(reconstitution)을 위한 약제학적으로 허용가능한 담체; 및상기 재구성된 컨쥬게이트를 이를 필요로하는 환자에게 운반하기 위한 운반 장치를 포함하는 키트.
- 청구항 25에 있어서,피부 소독제(skin antiseptic); 및사용 설명서를 추가로 포함하는, 키트.
- 청구항 26에 있어서, 상기 사용 설명서는 상기 생체적합성 폴리머-인간 성장 호르몬(hGH) 컨쥬게이트 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 주당 2회를 이하로 투여하도록 지시하는 것인, 키트.
- 시린지(syringe)에 프리로딩된(preloaded) 청구항 1의 컨쥬게이트를 포함하는 키트.
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