ES2226326T3

ES2226326T3 - Hormona de crecimiento humana para estimular la hematopoyesis y la reconstitucion del sistema inmune despues del trasplante de celulas madre hematopoyeticas en seres humanos.

Info

Publication number: ES2226326T3
Application number: ES99811135T
Authority: ES
Inventors: Scott Chappel
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2019-12-10
Also published as: JP2000178203A; EP1016414A2; ATE275418T1; EP1016414B1; DE69919969D1; DK1016414T3; SI1016414T1; DE69919969T2; US6348444B1; PT1016414E; EP1016414A3

Abstract

Uso de la hormona del crecimiento humana para la fabricación de un medicamento para estimular la hematopoyesis y la reconstitución del sistema inmune en pacientes humanos a los que ha de administrársele no antes de 30 días después del trasplante de células madres hematopoyéticas.

Description

Hormona de crecimiento humana para estimular la hematopoyesis y la reconstrucción del sistema inmune después del trasplante de células madre hematopoyéticas en seres humanos.

Fundamento de la invención Campo de la invención

La invención se refiere al uso de la hormona de crecimiento humana para la fabricación de un medicamento para estimular la hematopoyesis y la reconstitución del sistema inmune en pacientes humanos después del transplante de células madres hematopoyéticas.

Descripción de la técnica relacionada

La hormona del crecimiento humana (abreviadamente hGH, por sus iniciales en inglés human Growth Hormone), también conocida como somatotropina, es una hormona proteica producida y secretada por las células somatotrópicas de la pituitaria anterior. La hormona del crecimiento humana desempeña un papel clave en el crecimiento somático a través de sus efectos sobre el metabolismo de las proteínas, los carbohidratos y los lípidos. Además de sus efectos sobre el crecimiento somático, se ha demostrado que la hGH estimula la hematopoyesis (proliferación, maduración, y función de los linajes eritroide, mieloide y linfoide).

El efecto estimulador eritropoyético del tratamiento con hGH, tanto en pacientes sanos como en deficientes en la hormona del crecimiento (abreviadamente GHD, por sus iniciales en inglés Growth Hormone Deficient) ha sido descrito en publicaciones científicas. Por ejemplo, Valerio et al., (1987) describieron que in vivo, marcadores eritropoyéticos, tales como la hemoglobina (Hb), el hematocrito (Ht), y los recuentos de glóbulos rojos (abreviadamente RBC, por sus iniciales en inglés Red Blood Cell) aumentaban en niños GHD después de la terapia con hGH. Además, se ha descrito que los aumentos de la Hb en respuesta al tratamiento con hGH eran similares en pacientes con deficiencia de hGH y en los que tenían secreción normal de hGH (Vihervuori et al., 1996).

Por otra parte, recientes publicaciones muestran que la hGH aumenta la proliferación y la maduración/función de las series celulares mieloides. La hormona del crecimiento humana potencia la formación de colonias mieloides (Merchav et al., 1988), desencadena el estallido metabólico oxidante de los granulocitos en niños sanos y urémicos (Derfalvi et al., 1998) y potencia la quimiotaxis de los monocitos (Wiedermann et al., 1992).

Finalmente, varios informes demuestran que la hGH ejerce efectos estimuladores en la proliferación y maduración de series celulares linfoides. Derfalvi et al. (1998) describen que la administración de hGH estimula la linfoproliferación en niños sanos y urémicos, y Kimata et al., (1994) determinaron que la hGH potencia tanto la proliferación como la producción de Ig en líneas celulares plasmáticas. Geffner (1997) mencionó que se ha demostrado que la hGH estimula los recuentos de células CD8+ , y en menor extensión los recuentos de células CD4+.

El transplante de médula ósea y el transplante de células madres sanguíneas circulantes (en lo sucesivo denominado transplante de células madres hematopoyéticas, abreviadamente HSCT, por sus iniciales en inglés Hematopoietic Stem Cell Transplantation) son el tratamiento de elección en diversos trastornos que incluyen enfermedades malignas, deficiencias del sistema inmune combinadas graves (abreviadamente SCID, por sus expresión inglesa Severe Combined Immune Deficiencies), anormalidades hematopoyéticas determinadas congénita o genéticamente, anemia, anemia aplástica, leucemia y osteoporosis (Fischer et al., 1998). Durante los últimos diez años, el uso del HSCT creció desde menos de 5.000 a más de 40.000 anualmente (Waters et al., 1998).

El HSCT autólogo define un transplante de células madres en el cual el donante y el receptor son el mismo individuo. El HSCT no autólogo comprende HSCT en el cual el donante y el receptor son individuos diferentes, ya sean genéticamente idénticos (singénico) o ya sean genéticamente diferentes (alogénico).

El HSCT no autólogo está sometido a reacciones inmunológicas, es decir a enfermedades de injerto frente al hospedante y a la reacción de rechazo del hospedante frente al injerto (rechazo del injerto). Los mecanismos de los rechazos de injerto no son completamente conocidos, pero además de mecanismos inmunes, las células madres hematopoyéticas pueden también ser rechazadas por las células asesinas naturales (abreviadamente NK, por sus expresión en inglés Natural Killer). El sistema inmune del receptor puede ser suprimido para permitir HSCT no autólogos satisfactorios.

Para preparar para el HSCT, el sistema inmune del receptor se destruye por radiación y/o quimioterapia. Este procedimiento no sólo previene el rechazo del injerto no autólogo, sino que también sirve para matar las células leucémicas si esta es la enfermedad del paciente. Después del HSCT, las células hematopoyéticas e inmunes de los receptores son reemplazadas con las del donante.

Los tratamientos eficaces destinados a acelerar la hematopoyesis y la reconstitución del sistema inmune son de gran interés no solo para promover el injerto, sino también para reducir los riesgos de infecciones y acortar el tiempo de hospitalización. Se ha demostrado que el factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-GSF) y el factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-GSF) aceleran la recuperación de la medula ósea y aumentan el injerto a través de la estimulación de la proliferación de las células madres. (Appelbaum, 1993). Similarmente, se ha demostrado que la eritropoyetina recombinante humana (rhEPO) potencia el injerto eritroide después del transplante de médula ósea alogénico y disminuye los requerimientos de transfusión (Miller et al., 1994). Estos tratamientos con factor de crecimiento han demostrado resultados prometedores en pruebas clínicas y se usan corrientemente para mejorar el resultado del HSCT.

A este respecto la hormona del crecimiento humana representa una terapia alternativa atractiva puesto que ejerce un efecto estimulador en tres series celulares progenitoras hematopoyéticas.

En roedores, se describió que, después del transplante de médula ósea singénico, los animales tratados con hGH presentaban aumentos significativos en el contenido total de células progenitoras hematopoyéticas, tanto en la médula ósea como en el bazo (Tian et al., 1998). Tian et al., especificaron además un aumento en el marcador eritropoyético (Hb, Ht, RBC), en el contenido de progenitor de células eritroides, en el marcador de granulocitos BC5+ y finalmente en la recuperación de RBC y plaquetas después del transplante de médula ósea (abreviadamente BMT por sus expresión en inglés Bone Marrow Transplantation); y demostraron el beneficio de la terapia con hGH para estimular la reconstitución del sistema inmune después de BMT en ratones. Además, Tian et al., sugirieron que la hGH puede ser de uso clínico para acelerar la hematopoyesis después de transplante autólogo de médula ósea. Los estudios que conducen a estos resultados se realizaron en ratones. Las dosis de rhGH se administraron a ratones irradiados y trasplantados después de transplante de médula ósea singénico. Los ratones recibieron la misma dosis de rhGH desde el día uno cada dos días hasta un máximo de 20 días. Tian et al., describieron que los efectos promotores del crecimiento hematopoyético de la rhGH después de SBMT no produjeron toxicidad ni ganancia de peso.

Sin embargo, cuando se administró a seres humanos la hormona del crecimiento humana también demostró tener algunos inconvenientes.

Se demostró que la hormona del crecimiento humana aumentaba la incidencia de rechazos de injertos, por ejemplo en niños de crecimiento retardado con transplante de riñón los episodios de rechazo son más frecuentes en pacientes tratados con hGH que en el grupo placebo (Fine et al., 1991). Friedman (1997) describió que el tratamiento con la hGH recombinante no es seguro para niños con transplante renal. Friedman argumentó que el aumento mediado por hGH de la función inmune podría ser una razón para la pérdida aumentada de la función renal causada por el rechazo y señaló que la hGH no debe administrarse a niños después del aloinjerto renal. En una extensa prueba clínica que determina los resultados y efectos secundarios de tratar niños con hGH después de transplante de riñón, el tratamiento con hGH estaba correlacionado con una frecuencia creciente de rechazo agudo del injerto, particularmente en pacientes que tenían un historial de más de un episodio (Johansson et al., 1990) Broyer, 1996). Finalmente, en transplante de hígado la hGH mejora el crecimiento en niños que reciben tratamiento con glucocorticoides, pero también aumenta el riesgo de rechazo de injerto alogénico (Sarna et al., 1996).

A la luz de los datos presentados anteriormente, la terapia con hGH después de HSCT conlleva efectos tanto aprovechables como perjudiciales. La hormona del crecimiento humana sería beneficiosa a través de sus efectos positivos en la reconstitución del sistema inmune; la hGH promueve la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas, es decir células madres del donante, y por tanto, debe facilitar el injerto. El tratamiento con la hormona del crecimiento humana podría también proporcionar mejor protección contra los agentes patógenos a través de la estimulación global de las funciones del sistema inmune. Sin embargo, la hGH demostró también que aumentaba la incidencia del rechazo de injerto, que es un serio inconveniente de su uso en el tratamiento de pacientes.

Sumario de la invención

Por tanto es un objeto de la presente invención proporcionar un tratamiento para los pacientes transplantados con células madres hematopoyéticas empleando hormona del crecimiento humana recombinante para estimular la hematopoyesis y la reconstitución del sistema inmune, al mismo tiempo que evita los efectos secundarios perjudiciales de la administración de hGH, como por ejemplo los antes reseñados.

La invención se refiere al uso de hormona del crecimiento humana como se define en las reivindicaciones anexas. De acuerdo con la presente invención, la hormona del crecimiento humana se usa para la fabricación de un medicamento para estimular la hematopoyesis y la reconstitución del sistema inmune en pacientes humanos a los que no ha de administrarse antes de 30 días después del transplante de células madres hematopoyéticas. El régimen innovador de la administración de hGH está destinado a evitar el rechazo de injerto inducido por la hGH.

Definiciones

Con el fin de proporcionar una comprensión más clara y consistente de la parte descriptiva y las reivindicaciones incluyendo el alcance que se ha de dar a tales términos, se aportan las siguientes definiciones.

Transplante de células madres hematopoyéticas (HSCT). Un procedimiento clínico en el que se trasplantan a un paciente células madres hematopoyéticas pluripotentes obtenidas de médula ósea o sangre circulante.

Transplante de médula ósea (BMT): Un procedimiento clínico en el que se trasplantan a un paciente células madres hematopoyéticas pluripotentes obtenidas de médula ósea.

Transplante autólogo: Transplante en el que el donante y el receptor son el mismo individuo.

Transplante no autólogo: Transplante en el que el donante y el receptor son diferentes individuos de la misma especie, bien sean genéticamente idénticos (transplante singénico) o bien sean genéticamente diferentes (transplante alogénico).

Descripción detallada de la invención

El laboratorio del presente inventor ha descubierto sorprendentemente que si la hormona del crecimiento humana se administra a pacientes, a aproximadamente 30 días después del transplante, se mantienen los efectos beneficiosos de la hormona del crecimiento humana, es decir, la estimulación de la hematopoyesis, y la función inmune, mientras que se reducen, cuando no se eliminan, los efectos secundarios perjudiciales, es decir el riesgo aumentado de rechazo de injertos.

Por lo tanto, la invención se refiere al uso de la hormona del crecimiento humana para la fabricación de un medicamento para estimular la hematopoyesis y la reconstitución del sistema inmune en pacientes humanos, a los que no ha de administrarse antes de 30 días después del transplante de células madres hematopoyéticas.

El medicamento usado de acuerdo con la invención comprende una cantidad eficaz de hGH. La cantidad eficaz de hormona del crecimiento humana comprende preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 0,50 mg por semana. Más preferiblemente, comprende aproximadamente 0,10 a 0,30 mg por semana.

En una realización altamente preferida de la invención, la cantidad eficaz de la hormona del crecimiento humana comprende aproximadamente 0,20 mg por semana. Esto significa que para un individuo adulto medio de 70 kg de peso se administra una cantidad semanal de 14 mg de la hormona del crecimiento humana. La hormona del crecimiento humana se administra preferiblemente en dosis únicas de aproximadamente 0,07 mg/kg cada dos días (un día sí y otro no).

La hormona del crecimiento humana puede administrarse durante un periodo prolongado de tiempo, como durante varias semanas o años.

En realizaciones preferidas, el medicamento se administra sistémicamente. Ventajosamente, puede administrarse subcutáneamente o intramuscularmente.

Preferiblemente, el medicamento comprende además un vehículo, un excipiente, estabilizante o un agente auxiliar farmacéuticamente aceptables. Una formulación preferida de una composición farmacéutica que contiene la hormona del crecimiento humana se describe en la solicitud de patente internacional WO9535116, siendo esta una composición estabilizada por medio de sacarosa. El medicamento de acuerdo con la invención puede conservarse en forma liofilizada de la hormona del crecimiento humana.

En una realización preferida de la invención, el medicamento que comprende la hormona del crecimiento humana es una hormona de crecimiento humana se administra no antes de 30 días después del transplante.

La hormona del crecimiento humana (hGH), también conocida como somatotropina, es una hormona proteica producida y secretada por células somatotrópicas de la pituitaria anterior. La hGH desempeña un papel clave en el crecimiento somático a través de sus efectos sobre el metabolismo de proteínas, carbohidratos y lípidos.

La hormona del crecimiento humana es un polipéptido de una sola cadena de 101 aminoácidos que tiene dos enlaces disulfuro, uno entre Cys-53 y Cys-165, que forman un bucle grande en la molécula, y el otro entre Cys-182 y Cys-189, que forman un bucle pequeño cerca de C terminal.

Se conocen varias formas alternativas de hGH, incluyendo los derivados que se presentan de modo natural, variantes y productos metabólicos, productos de degradación, principalmente de hGH biosintética y variantes obtenidas por métodos de ingeniería genética de hGH obtenida por métodos genéticos. Para el fin de la presente invención puede usarse cualquier forma de hGH, siempre y cuando conserve la actividad biológica de la hGH.

La metionil-hGH fue la primera forma de hGH que se produjo a través de tecnología de DNA recombinante. Este compuesto es ahora una variante de la hGH que tiene un residuo de metionina adicional en su extremo terminal N (Goeddel et al., 1979).

El uso de acuerdo con la invención por tanto comprende también un medicamento que comprende una variante de la hormona del crecimiento humana siendo la variante preferiblemente metionil-hGH, que tiene un residido de metionina adicional en su extremo terminal N.

Se ha descrito que una variante de la hGH que se presenta de modo natural denominada 20-K-hGH está presente en la pituitaria, así como en el torrente sanguíneo (Lewis et al., 1978); Lewis et al., 1980). Este compuesto que carece de 15 residuos de aminoácidos desde Glu-32 hasta Gln-46, se produce por un empalme alternativo del ácido ribonucleico mensajero (DeNoto et al., 1981). Este compuesto comparte muchas, pero no todas, las propiedades biológicas del hGH.

El uso de acuerdo con la invención por tanto también comprende un medicamento que comprende una variante de hGH que carece de 15 residuos aminoácidos desde Glu-32 a Gln-46.

Se ha sido aislado e identificado hGH que está acetilada en el extremo terminal N (Lewis et al., 1979). No está claro si la acetilación desempeña un papel regulador o simplemente es una consecuencia de la purificación.

El uso de acuerdo con la invención comprende además un medicamento que comprende hGH que está acetilada en el extremo terminal N.

La hormona del crecimiento humana es una mezcla de monómero, dímero y oligómeros de peso molecular superior. Además, hay formas agregadas de hormona del crecimiento humana encontradas tanto en la pituitaria como en la circulación (Stolar et al., 1984; Stolar et al., 1986). Parece que hay tres tipos distintos de dímeros: un dímero de disulfuro conectado a través de enlaces disulfuros intercaternarios (Lewis et al., 1997), un dímero covalente irreversible que se detecta en geles de dodecilsulfato-poliacrilamida sódica y no es un dímero de disulfuro (Bewley et al., 1975); y un dímero no covalente que se disocia fácilmente en hGH monoméra por tratamiento con agentes que rompen las interacciones hidrófobas en las proteínas (Becker et al., 1987). Además, la hormona del crecimiento humana forma un complejo dímero con Zn^{2+}(Cunnigham, et al., 1991). El análisis de Scatchard ha revelado que se asocian dos iones Zn^{2+} por dímero de hGH de un modo cooperativo, y se encontró que este complejo dímero Zn^{2+}-hGH era más estable frente a la desnaturalización que la hGH monómera (Cunnigham et al., 1991).

El uso de acuerdo con la invención también comprende un medicamento que comprende un dímero la hormona del crecimiento humana seleccionado del grupo que consiste en un dímero de disulfuro conectado a través de enlaces disulfuro intercatenarios, un dímero no disulfuro covalente e irreversible, un dímero no covalente, y sus mezclas.

Por modificaciones proteolíticas de la molécula se produce cierto número de derivados de hGH. La ruta primaria para el metabolismo de la hGH implica proteolisis y se han descrito varios derivados de la hGH que tienen cortes o deleciones en esta región (Thorlaclus-Ussing, 1987). Esta región es un bucle grande de hGH y una escisión de un enlace peptídico allí da como resultado la generación de dos cadenas que están conectadas a través del enlace disulfuro en Cys-53 y Cys-165. Para muchas de estas formas de dos cadenas se ha descrito que tienen una actividad biológica aumentada (Singh et al., 1974). Muchos derivados de la hormona del crecimiento humana han sido generados artificialmente mediante el uso de enzimas. Las enzimas tripsina y subtilisina, así como otras se han usado para modificar la hGH en diversos puntos de la molécula (Lewis et al.,1977). Se encontró que se formaba uno de dichos derivados denominado proteína anabólica de dos cadenas (2-CAP) a través de la proteolisis controlada de hGH usando tripsina. Se encontró que la 2-CAP tenía propiedades biológicas muy distintas de las de la molécula de hGH intacta ya que si bien se retenía mayoritariamente la actividad promotora del crecimiento de la hGH, se abolían la mayoría de los efectos sobre el metabolismo de los carbohidratos.

Los residuos de asparagina y glutamina en proteínas son susceptibles de reacciones de desamidación en condiciones apropiadas. La hGH de la pituitaria ha demostrado experimentar este tipo de reacción, dando como resultado la conversión de Asn-152 en ácido aspártico, y también, en una menor extensión, la conversión de Gln-137 en ácido glutámico (Lewis et al, 1981). La hGH desamidada ha demostrado tener una susceptibilidad alterada a la proteolisis con la enzima subtilisina, lo que sugiere que la desamidación puede tener un significado fisiológico en la escisión proteolítica dirigida de la hGH. Se sabe que la hGH sintética se degrada en ciertas condiciones de conservación, dando como resultado la desamidación en una asparagina diferente (Asn-149). Este es el sitio primario de desamidación, pero también se observa la desamidación en Asn-152 (Becker et al., 1988). La desamidación de Gln 137 no se ha descrito en la hGH biosintética.

Por tanto, el uso de acuerdo con la invención también comprende un medicamento en el que la hormona del crecimiento humana esta desaminada.

Los residuos de metionina de las proteínas son susceptibles de oxidación, principalmente a sulfóxido. Tanto la hGH derivada de la pituitaria como la biosintética experimentan sulfoxidación en Met-14 y Met-125 (Becker et al., 1988). La oxidación en Met-170 también se ha descrito en la hGH de la pituitaria pero no en la biosintética. Se ha encontrado que tanto la hGH desamidada como la hGH con sulfóxido en Met-14 muestran plena actividad biológica (Becker et al., 1988).

Por tanto, el uso de acuerdo con la invención también comprende un medicamento, en el que la hormona del crecimiento humana esta sulfoxidada en uno o más residuos de metionina.

Las formas truncadas de la hGH se han producido a través de acciones de enzimas o por métodos genéticos. La 2-CAP, generada por acciones controladas de tripsina tiene eliminados los ocho primeros residuos del extremo terminal N. Se han producido otras versiones truncadas de la hGH modificando el gen antes de su expresión en un hospedante adecuado. Los primeros 13 residuos se ha eliminado para proporcionar un derivado que tiene propiedades biológicas distintivas en el cual la cadena polipeptídica no está escindida (Gerler et al., 1986).

Aunque la hormona del crecimiento humana se obtuvo originalmente a partir de glándulas pituitarias de cadáveres, estas preparaciones no son homogéneas electroforéticamente, y aparecían anticuerpos en los sueros de pacientes tratados con preparaciones de una pureza del 50%, atribuyéndose la inmunogenicidad a los componentes inactivos. La tecnología de DNA recombinante permitió la producción de suministros ilimitados de hGH en cierto número de sistemas. La purificación de la hGH a partir del medio de cultivo es facilitada por bajas cantidades de proteínas contaminantes presentes. De hecho, se ha demostrado que la hGH puede purificarse a escala de laboratorio por una sola etapa de purificación en una columna de HPLC de fase inversa.

En una realización preferida de la presente invención se usa la hormona del crecimiento humana producida recombinantemente.

La hGH recombinante se comercializa generalmente en viales que contienen hGH más excipientes adicionales, por ejemplo, glicina y manitol, en una forma liofilizada. Se proporciona un vial con un diluyente anexo, que permite que el paciente reconstituya el producto a la concentración deseada antes de la administración de la dosis. La cantidad de hGH por vial puede ser, por ejemplo, 4 a 6 mg.

Después de la administración intravenosa se describe la eliminación de la hGH por una cinética de primer orden con una semivida en el suero de 12-30 minutos, tanto en animales como en seres humanos (Moore et al., 1988; Hendricks et al., 1985). Tradicionalmente la inyección intramuscular ha sido el método de elección como ruta preferida de administración. En seres humanos la absorción de la hGH exógena parece ser más rápida desde el sitio intramuscular, con un tiempo de hasta dos a tres horas hasta la concentración máxima, comparado con cuatro a seis horas después de la administración subcutánea. La fase de desaparición del suero se ha descrito en el intervalo de 12-20 horas para la administración intramuscular (Albertson-Wikland et al., 1986; Jorgesen et al , 1987). En general, no se han observado diferencias significativas en las actividades farmacocinéticas o biológicas de la hGH de secuencia natural o recombinante, la N-metionil-hGH o el material derivado de pituitaria en seres humanos (Moore et al., 1988,; Jorgesen et al, 1988).

La hormona del crecimiento humana, tal como se usa en la presente invención, puede incluir derivados funcionales como se ha indicado antes, así como otros tipos de derivados, tales como fragmentos, variantes, análogos u otros derivados químicos. Un derivado natural retiene al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la hGH lo que permite su utilidad de acuerdo con la presente invención, es decir el tratamiento de HSCT.

Un "fragmento" de la hormona del crecimiento humana de acuerdo con la presente invención se refiere a un subconjunto de la molécula, es decir, a un péptido más corto.

Una "variante" de la hormona del crecimiento humana, de acuerdo con la presente invención, se refiere a una molécula que es sustancialmente similar al péptido completo o a uno de sus fragmentos. Los péptidos variantes pueden prepararse directamente por síntesis química directa del péptido variante, usando métodos bien conocidos en la técnica.

Alternativamente, las variantes de aminoácidos de hGH pueden prepararse mediante mutaciones en el cDNA que codifica los derivados de hCG sintetizados. Tales variantes comprenden deleciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Aunque también se puede realizar cualquier combinación de deleciones, inserciones y sustituciones siempre que la construcción final posea la actividad deseada, se prefiere que las sustituciones estén en el intervalo de uno a diez sustituciones de aminoácidos, más preferiblemente de uno a cinco sustituciones de aminoácidos. Se apreciará por los expertos en la técnica que las deleciones e inserciones, que pueda generarse fácilmente en los extremos terminales N o C, están dentro de la experiencia de la técnica para generar y ensayar la actividad de hGH sin experimentación indebida.

En el nivel genético, estas variantes ordinariamente se preparan por mutagénesis dirigida al sitio, como se ilustra con ejemplos por Adelman et al., (1983), de nucleótidos en el DNA que codifica la molécula peptídica, produciendo con ello DNA que codifica la variante, y por tanto, expresando el DNA en un cultivo de células recombinantes. Las variantes típicamente exhiben la misma actividad biológica cualitativa que el péptido no variante.

Un "análogo" de la hormona del crecimiento humana de acuerdo con la presente invención se refiere a una molécula no natural que es sustancialmente similar a cualquier molécula completa o uno de sus fragmentos activos.

Un "derivado químico" de la hormona del crecimiento humana de acuerdo con la presente invención contiene restos químicos adicionales que normalmente no son parte de la secuencia de aminoácidos del derivado de la hormona del crecimiento humana. Las modificaciones covalentes de las secuencias de aminoácidos están incluidas dentro del alcance de la presente invención. Tales modificaciones pueden introducirse en la hormona del crecimiento humana haciendo reaccionar residuos de aminoácidos direccionados (targeted) del péptido con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados.

Los tipos de sustitución, que pueden realizarse en la hormona del crecimiento humana de acuerdo con la presente invención pueden basarse en el análisis de frecuencias de cambio de aminoácidos entre una proteína homóloga de diferentes especies. Basándose en dicho análisis, las sustituciones conservativas pueden definirse como cambios dentro de uno de los siguientes grupos:

I.- Pequeños residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares:

: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

II.- Residuos polares cargados negativamente y sus grupos amidas:

: Asp, Asn, Glu, Gln

III.- Residuos polares cargados positivamente:

: His, Arg, Lys

IV.- Residuos grandes, alifáticos no polares:

: Met, Leu, Ile, Val, Cys

V.- Residuos aromáticos grandes:

: Phe, Try, Trp

Dentro de los grupos anteriores, se considera que las siguientes sustituciones "son altamente conservativas".

Asp/Glu

His/Agr/Lys

Phe/Tyr/Trp

Met/Leu/Ile/Val

Las sustituciones semi-conservativas se definen como cambios entre dos de los grupos I-IV anteriores que están limitados al supergrupo (A), que comprende I, II y III anteriores, o al supergrupo (B), que comprende los grupos IV y V anteriores. Las sustituciones no están limitadas a los aminoácidos codificados genéticamente o incluso a los que se presentan en la naturaleza. Cuando el epítopo se prepara por síntesis de péptidos, puede usarse directamente el aminoácido deseado. Alternativamente, un aminoácido codificado genéticamente puede modificarse haciéndolo reaccionar con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales.

Los residuos de cisteinilo muy comúnmente se hacen reaccionar con alfa-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también son derivatizados por reacción con bromotrifluoacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidazoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquil-maleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos de histidilo se derivatizan por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos de lisilo y aminos terminales se hacen reaccionar con anhídrido de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga en el residuo de lisina. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-aminoácidos incluyen: imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y la reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.

Los residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona; y ninhidrina. La derivatización de residuos de argininina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto valor del pKa del grupo funcional guanidina. Además estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como el grupo epsilon-amino de arginina.

La modificación específica de los residuos de tirosilo per se se ha estudiado exhaustivamente, con interés particular en introducir marcadores espectrales en residuos de tirosilo por reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Muy frecuentemente, se usan N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar especies de o-acetil-tirosilo y derivados de epsilon-nitro, respectivamente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R'N-C-N-R'), tales como 1-ciclohexil-3-[morfolinil-(4-etil)]carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además estos residuos de aspartilo y glutamilo se desamidan en condiciones suavemente ácidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de la presente invención.

En otras realizaciones ventajosas de la invención, los medicamentos usados de acuerdo con la invención comprenden un fragmento de la hormona del crecimiento humana. El fragmento puede ser una hormona del crecimiento humana truncada que carece de los primeros ocho aminoácidos o los primeros 13 aminoácidos.

La presente invención está destinada a tratar pacientes que sufren un transplante de células madres hematopoyéticas no autólogo como una realización preferida de la presente invención. La hormona del crecimiento humana administrada es preferiblemente hormona del crecimiento humana recombinante (hrGH).

Aunque la presente invención puede llevarse a cabo con derivados de hormona del crecimiento humana recombinante preparados por tecnología de DNA recombinante, por ejemplo, en células procariotas o eucariotas, estos derivados pueden también prepararse por métodos síntesis de proteínas convencionales, que son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El uso de un medicamento para la administración de acuerdo con la presente invención puede incluir hGH y/o fragmentos, variantes, análogos o derivados químicos de hGH en una forma farmacéuticamente aceptable, opcionalmente combinados con un vehículo aceptable.

Estas composiciones pueden administrarse por cualquier medio que consiga el fin deseado. Por ejemplo, la administración puede ser por las rutas subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica o bucal. La dosis administrada depende de la edad, salud y peso del receptor, tipo de tratamiento previo o simultáneo, si lo hay, frecuencia del tratamiento y la naturaleza de efecto deseado.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas del componente activo en una forma soluble en agua, por ejemplo sales solubles en agua. Además, pueden administrarse una suspensión de los compuestos activos en suspensiones oleosas adecuadas para inyección.

Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo aceite de sésamo, o ésteres de ácidos graso sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección que pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente la suspensión también puede contener estabilizantes.

La determinación de las cantidades de hGH que se han de administrar también puede determinarse individualmente. Está dentro del conocimiento de la técnica. Una dosificación puede empezar por aproximadamente 1 microgramo por kilogramo de peso del paciente, por día y será aumentada hasta que se consiga el efecto deseado. Se entenderá que la dosis adecuada dependerá de la edad, sexo y salud del receptor. La dosis más preferida será diseñada para el sujeto particular, como entenderán los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Avery's Drug Treatment: Principles and Practices of Clinical Pharmacology and Terapeutics. 3ª ed. ADIS Pres, Ltd. Wliliams and Wilkins, Baltimore, MD (1987) y Ebadi, Pharmacology, Litle Brown and Co., Boston, MA (1985), textos que se incorporan como referencia en la presente memoria.

La dosis total requerida para cada tratamiento puede administrarse en múltiples dosis o en una sola dosis. La composición puede administrarse sola o junto con otros productos terapéuticos dirigidos a la enfermedad o dirigidos a otros síntomas.

Referencias bibliográficas

Adelman et al., DNA 2:183-193 (1983).

Albersson-Wikland et al., Acta Pediatr. Scand. 75: 87-97 (1986).

Appelbaum F.R., Cancer, 72:3387-3392 (1993).

Becker et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 9: 478-487 (1987).

Becker et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 10:326-337 (1988).

Bewley et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 42:73-166 (1975).

Broyer et al., Acta Paedriatr. Suppl. 417:76-79 (1996)

Cunnigham et al., Science, 253:545-548 (1991).

DeNoto et al., Nucleic. Acids. Res. 9:3719-3730.

Derfalvi et al., Pediatr. Nephrol., 5:147-151 (1991).

Fischer et al., Springer Semin. Immunopathol., 19: 479-492 (1998).

Friedman et al., J. Pediatr., 131: S25-S27 (1997)

Geffner et al., Acta Paedriatr. Suppl. 423:76-79 (1997).

Gertler et al., Endocrinology, 118:720-726 (1986).

Goeddel et al., Nature, 281:544-548 (1979).

Hendricks et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 60:864-867 (1990).

Johansson et al., Acta Pediatr. Scand. Suppl.,370:36-42 and discussion 43 (1990).

Jorgensen et al., Acta Endocrinol. (Copenh.), 116:381-386 (1987).

Jorgensen et al., Pharmacol. Toxicol., 63:129-134 (1986).

Kimata et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 78:635-641 (1994).

Lewis et al., J. Biol.. Chem., 252:3697-3702 (1977a).

Lewis et al., Endocrinol., 101:1587-1603 (1977b).

Lewis et al., Endocrinol., 104: 1256-1265 (1979).

Lewis et al., J. Biol.. Chem., 256:11645-11650 (1981).

Lewis et al., Endocrinol., 101:1587-1603 (1977b)

Merchav et al., Br. J. Haematol., 70:267-271 (1988).

Miller et al., Hematol. Oncol. Clin. North. Am., 8:975-992 (1994).

Moore et al., Endocrinology, 122:2920-2926 (1988).

Sama et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: 1476-1482 (1996).

Singh et al., Endocrinology, 94:883-891-2926 (1974).

Stolar et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 59:883-891 (1984).

Stolar et al., Metabolism, 35:75-77 (1986).

Thorlaclus-Using, O., Neuroendocrinology, 45:233-242 (1987).

Tian et al., Stem Cells, 16:193-199 (1998).

Valerio et al., Horm. Res., 47:62-66 (1997).

Vihervuori et al., Blood, 87:2075-2081 (1998).

Waters et al., Bone Marrow Transplant., 21:641-650 (1988).

Wiedermann et al., Brain Behav. Immun. 6:387-393 (1992).

Claims

1. Uso de la hormona del crecimiento humana para la fabricación de un medicamento para estimular la hematopoyesis y la reconstitución del sistema inmune en pacientes humanos a los que ha de administrársele no antes de 30 días después del trasplante de células madres hematopoyéticas.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento comprende una cantidad eficaz de hormona de crecimiento humana.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la cantidad eficaz de hormona del crecimiento humana comprende de 0,01 a 0,50 mg por kg por semana.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la cantidad eficaz de hormona del crecimiento humana comprende de 0,10 a 0,30 mg por kg por semana.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la cantidad eficaz de hormona del crecimiento humana comprende 0,20 mg por kg por semana.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, el que la hormona del crecimiento humana se administra en dosis únicas de 0,07 mg/kg.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en le que la hormona del crecimiento humanase administra cada dos días (un día sí y otro no).

8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el medicamento se administra por vía subcutánea.

9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el medicamento se administra por vía intramuscular.

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende un fragmento, análogo, variante o derivado químico de la hormona del crecimiento humana que tiene la actividad estimuladora de la hematopoyesis de la hormona del crecimiento humana.

11. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende además un vehículo, excipiente, estabilizador o agente auxiliar farmacéuticamente aceptables.

12. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende hormona del crecimiento humana producida recombinantemente.

13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende una variante de la hormona del crecimiento humana.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la variante de la hormona del crecimiento humana es metionil-hormona del crecimiento humana, que tiene un residuo de metionina adicional en el extremo terminal N de la hormona del crecimiento humana.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la variante de la hormona del crecimiento humana es hormona del crecimiento humana que carece de 15 residuos de aminoácidos desde Glu-32 hasta Glu-46.

16. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende un fragmento de la hormona del crecimiento humana.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el fragmento es una hormona del crecimiento humana truncada con los ocho primeros residuos de aminoácidos eliminados en el extremo terminal N.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el fragmento es una hormona del crecimiento humana truncada con los primeros 13 residuos de aminoácidos eliminados en el extremo terminal N.

19. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende un dímero de hormona del crecimiento humana seleccionado del grupo que consiste en un dímero de disulfuro conectado a través de enlaces disulfuro intercatenarios, un dímero covalente irreversible no disulfuro, un dímero no covalente, y sus mezclas.

20. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende un derivado químico de la hormona del crecimiento humana.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la hormona del crecimiento humana está acetilada en el extremo terminal N.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la hormona del crecimiento humana está desaminada.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la hormona del crecimiento humana está sulfoxidada en uno o más residuos de metionina.