EA007967B1 - Защита, восстановление и усиление эритропоэтинреактивных клеток, тканей и органов - Google Patents

Защита, восстановление и усиление эритропоэтинреактивных клеток, тканей и органов Download PDF

Info

Publication number
EA007967B1
EA007967B1 EA200300738A EA200300738A EA007967B1 EA 007967 B1 EA007967 B1 EA 007967B1 EA 200300738 A EA200300738 A EA 200300738A EA 200300738 A EA200300738 A EA 200300738A EA 007967 B1 EA007967 B1 EA 007967B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
erythropoietin
molecule
modified
erythropoietic
cells
Prior art date
Application number
EA200300738A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300738A1 (ru
Inventor
Майкл Брайнс
Энтони Серами
Карла Серами
Original Assignee
Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26947185&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA007967(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US09/753,132 external-priority patent/US6531121B2/en
Application filed by Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк. filed Critical Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк.
Publication of EA200300738A1 publication Critical patent/EA200300738A1/ru
Publication of EA007967B1 publication Critical patent/EA007967B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к способам и композициям, предназначенным для защиты или усиления функции или жизнеспособности эритропоэтинреактивной клетки, ткани, органа или части тела in vivo, in situ или ex vivo у млекопитающих, включая человека, в результате системного или местного введения модулятора активности рецептора эритропоэтина, такого как обычный эритропоэтин или модифицированный эритропоэтин.

Description

Приоритет предварительной заявки на патент № 60/259245, поданной 29 декабря 2000 г., которая полностью включена в данное описание изобретения в качестве ссылки, установлен на основании раздела 35 Кодекса законов США, § 119(е) (1).
Предпосылки изобретения
На протяжении многих лет считалось, что единственной четко обоснованной физиологической ролью эритропоэтина является контроль за продуцированием эритроцитов. В последнее время появились различные данные, свидетельствующие о том, что эритропоэтин, являющийся членом суперсемейства цитокинов, выполняет также другие важные физиологические функции, обусловленные взаимодействием с рецептором эритропоэтина (эритропоэтин-В). Указанные функции включают митогенез, модуляцию поступления кальция в клетки гладких мышц и нервные клетки, а также воздействие на промежуточный обмен веществ. Считается, что эритропоэтин вызывает компенсаторные реакции, которые улучшают гипоксическое микроокружение клеток и модулируют запрограммированную гибель клеток, вызываемую метаболическим стрессом. Хотя исследования показывают, что внутричерепное введение эритропоэтина защищает нейроны от гипоксического поражения, такое введение является практически невозможным и неприемлемым способом в терапевтической практике, в частности, при лечении нормальных субъектов. Кроме того, результаты ранее выполненных исследований с участием страдающих малокровием пациентов, которым вводили эритропоэтин, показывают, что периферически вводимый эритропоэтин не поступает в головной мозг (Май е1 а1., 1997, Кйиеу Ιηΐ. 51:416-8; 1нн1 е1 а1., 1999, Реб1а1г. Век. 46:543-547; Виеш1 е1 а1., 2000, №р11го1. Э1а1. Тгапкр1ап1. 15:422-433).
В научной литературе описаны разные модифицированные формы эритропоэтина, действие которых направлено на улучшение эритропоэтической активности молекулы, например, эритропоэтин с заменой аминокислот у карбоксильного конца описан в патентах США №№ 5457089 и 4835260; изоформы эритропоэтина с разным количеством остатков сиаловой кислоты в молекуле описаны в патенте США № 5856292; полипептиды описаны в патенте США № 4703008; агонисты описаны в патенте США № 5767078; пептиды, связывающиеся с рецептором эритропоэтина, описаны в патентах США №№ 5773569 и 5830851; и низкомолекулярные миметики описаны в патенте США № 5835382.
Настоящее изобретение относится к применению эритропоэтина для защиты, сохранения, усиления или восстановления эритропоэтинреактивных клеток и сопутствующих клеток, тканей и органов ίη кйи и ех νίνο, к переносу эритропоэтина через барьер из эндотелиальных клеток с целью защиты и усиления эритропоэтинреактивных клеток и сопутствующих клеток, тканей и органов, отделенных от сосудистой сети, или к переносу сопутствующих молекул.
Краткое изложение существа изобретения
Одним объектом настоящего изобретения является применение эритропоэтина для получения фармацевтических композиций, предназначенных для защиты, сохранения, усиления или восстановления функции или жизнеспособности эритропоэтинреактивных клеток млекопитающих и сопутствующих клеток, тканей и органов. В соответствии с одним конкретным объектом изобретения эритропоэтинреактивные клетки млекопитающих и сопутствующие клетки, ткани или органы отделены от сосудистой сети непроницаемым барьером из эндотелиальных клеток. В соответствии с другим конкретным объектом изобретения клетки, ткани, органы или другие части тела удалены из организма млекопитающего, например, предназначены для использования в качестве трансплантатов. Неограничивающими примерами эритропоэтинреактивных клеток или тканей являются клетки или ткани нейронов, сетчатки, мышц, сердца, легкого, печени, почки, тонкого кишечника, коркового вещества надпочечника, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичка, яичника, поджелудочной железы или эндометрия. Приведенные примеры эритропоэтинреактивных клеток служат только для иллюстрации. В соответствии с одним объектом изобретения эритропоэтинреактивные клетки или сопутствующие клетки, ткани или органы не являются возбуждаемыми клетками, тканями или органами, либо, по существу, не содержат возбуждаемых клеток или тканей. В одном конкретном варианте осуществления изобретения клетки, ткани или органы млекопитающего, на которые воздействуют вышеуказанным производным эритропоэтина, находятся или будут находиться в течение определенного периода времени под влиянием по крайней мере одного фактора, ухудшающего жизнеспособность клетки, ткани или органа. Такие факторы включают травматическую гипоксию ίη кйи или нарушение обмена веществ, хирургически вызванную гипоксию ίη кйи или нарушение обмена веществ, а также действие токсина ίη κίΐυ. обусловленное химиотерапией или лучевой терапией. В одном варианте осуществления изобретения вредное воздействие может быть вызвано искусственным кровообращением (с помощью аппарата сердце-легкое), применяемым при выполнении некоторых хирургических операций.
Эритропоэтины предназначены для лечения или профилактики заболеваний центральной или периферической нервной системы у человека в основном с неврологическими или психиатрическми симптомами, а также глазных, сердечно-сосудистых, сердечно-легочных и респираторных заболеваний, болезней почек и мочеполовой системы, желудочно-кишечных заболеваний, нарушений функций желез внутренней секреции и обмена веществ.
Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим определенные производные эритропоэтина, которые предназначены для введения млекопитающим, предпочти
- 1 007967 тельно человеку. Такие фармацевтические композиции могут иметь форму, пригодную для перорального, назального или парентерального введения, или могут представлять раствор для перфузии, поддерживающий жизнеспособность клеток, тканей или органов ех νΐνο.
Производные эритропоэтина, пригодные для вышеуказанных целей, могут представлять любой нативный эритропоэтин или аналог эритропоэтина, миметический эритропоэтин, фрагмент эритропоэтина, гибридную молекулу эритропоэтина, молекулу, связывающуюся с рецептором эритропоэтина, агонист эритропоэтина, почечный эритропоэтин, эритропоэтин головного мозга, его олигомер, мультимер, мутеин, родственную форму, природную форму, синтетическую форму, рекомбинантную форму, гликозилированный вариант, дегликозилированный вариант или комбинацию указанных форм. Любая форма эритропоэтина, способная оказывать благоприятное воздействие на эритропоэтинреактивные клетки, входит в объем данного объекта изобретения.
Другие производные эритропоэтина, пригодные для достижения вышеуказанных целей и получения фармацевтических композиций, включают как нативные эритропоэтины, так и эритропоэтины, имеющие по крайней мере одну модификацию по сравнению с нативным эритропоэтином, предпочтительно по сравнению с нативным эритропоэтином человека. Такая модификация может представлять замену по крайней мере одной аминокислоты или одного углеводорода в молекуле эритропоэтина. Молекулы эритропоэтина, пригодные для достижения вышеуказанных целей, могут включать несколько модификаций по сравнению с нативной молекулой, например, несколько изменений аминокислотной части молекулы, несколько изменений углеводородной части молекулы или по крайней мере одно изменение аминокислотной части молекулы и по крайней мере одно изменение углеводородной части молекулы. Модифицированная молекула эритропоэтина сохраняет свою способность защищать, сохранять, усиливать или восстанавливать функцию или жизнеспособность эритропоэтинреактивных клеток млекопитающего, при этом другие свойства молекулы эритропоэтина, не относящиеся к вышеуказанным желательным свойствам, могут отсутствовать по сравнению с нативной молекулой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения производное эритропоэтина не является эритропоэтическим.
В одном варианте осуществления изобретения эритропоэтин по данному изобретению по крайней мере не имеет частей сиаловой кислоты. В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин является асиалоэритропоэтином и наиболее предпочтительно асиалоэритропоэтином человека. В другом варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин имеет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 частей сиаловой кислоты.
Во втором варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин по крайней мере не имеет Ν-связанных или О-связанных углеводородов.
В третьем варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин имеет по крайней мере меньшее число углеводородов, полученное в результате обработки эритропоэтина, содержащего нативные углеводороды, по крайней мере одной гликозидазой.
В четвертом варианте осуществления изобретения углеводородная часть модифицированной молекулы эритропоэтина имеет по крайней мере гликозилированную структуру немлекопитающего, полученную в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения модифицированные эритропоэтины экспрессируют в клетках насекомых или растений.
В пятом варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин имеет по крайней мере один или несколько окисленных углеводородов, которые могут быть химически восстановлены. В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин является эритропоэтином, окисленным периодатом; в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения окисленный периодатом эритропоэтин химически восстанавливают боргидридом, таким как боргидрид натрия или цианоборгидрид натрия.
В шестом варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин, предназначенный для вышеуказанных целей, имеет по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина. В одном варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин включает глиоксальную часть в одном или нескольких остатках аргинина, в частности, арилглиоксальную или алкилглиоксальную часть. В другом варианте осуществления изобретения по крайней мере один остаток аргинина модифицируют, осуществляя взаимодействие с родственным дикетоном, включающим, но не ограничивающимся ими, 2,3-бутандион или циклогександион.
В седьмом варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин имеет по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина, получаемую в результате взаимодействия остатка лизина или Νконцевой аминогруппы с веществом, модифицирующим аминогруппу.
Модифицированный остаток лизина далее может быть химически восстановлен. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эритропоэтин биотинилируют или карбамилируют при помощи одной или нескольких групп лизина. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения лизин подвергают взаимодействию и альдегидом или восстанавливающим сахаром с образованием имина, который может быть стабилизирован восстановлением цианоборгидридом натрия, в результате
- 2 007967 чего получают Ν-алкилированный лизин, такой как глюцитолиллизин, и который в случае использования восстанавливающих сахаров может быть стабилизирован при помощи перегруппировки Амадори или Хейнса, в результате чего получают альфа-дезокси-альфа-аминосахар, такой как альфа-дезокси-альфафруктозиллизин. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения группу лизина карбамилируют (карбамоилируют), осуществляя взаимодействие с ионом цианата, алкилкарбамилируют, арилкарбамилируют или арилтиокарбамилируют соответственно алкилизоцианатом, арилизоцианатом или арилизотиоцианатом, либо ацилируют реакционноспособным производным алкилкарбоновой или арилкарбоновой кислоты, осуществляя взаимодействие с уксусным ангидридом, янтарным ангидридом или фталевым ангидридом. По крайней мере одна группа лизина может быть также модифицирована тринитрофенилом в результате взамодействия с тринитробензолсульфоновой кислотой, предпочтительно с ее солями. В другом варианте осуществления изобретения остатки лизина могут быть модифицированы в результате взаимодействия с производным глиоксаля, например с глиоксалем, метилглиоксалем или 3дезоксиглюкозоном с образованием соответствующих альфа-карбоксиалкильных производных.
В восьмом варианте осуществления изобретения по крайней мере один остаток тирозина эритропоэтина может быть модифицирован в положении ароматического кольца электрофильным реагентом, например, нитрованием или йодированием.
В девятом варианте осуществления изобретения по крайней мере один остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты эритропоэтина может быть модифицирован, например, в результате взаимодействия с карбодиимидом и последующего взаимодействия с амином, который включает, не ограничиваясь им, глицинамид.
В десятом варианте осуществления изобретения по крайней мере один остаток триптофана эритропоэтина может быть модифицирован в результате взаимодействия с н-бромсукцинимидом или н-хлорсукцинимидом.
В одиннадцатом варианте осуществления изобретения получают модифицированную молекулу эритропоэтина, в которой удалена по крайней мере одна аминогруппа в результате взаимодействия с нингидрином и последующего восстановления полученной карбонильной группы в результате взаимодействия с боргидридом.
В двенадцатом варианте осуществления изобретения получают модифицированный эритропоэтин, имеющий по крайней мере разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина, в результате взаимодействия с восстановителем, таким как дитиотреитол, и последующего взаимодействия полученных сульфгидрилов с йодацетамидом, йодуксусной кислотой или другим электрофилом для предотвращения повторного образования дисульфидных связей.
В тринадцатом варианте осуществления изобретения получают модифицированный эритропоэтин, в котором по крайней мере одна из аминокислот, такая как лейцин, заменена остатками лизина, аргинина, триптофана, тирозина или цистеина методами молекулярной биологии.
В четырнадцатом варианте осуществления изобретения модифицированный эритропоэтин подвергают ограниченному химическому протеолизу, целенаправленно воздействующему на определенные остатки, например, вызывающему расщепление после остатков триптофана. Полученные фрагменты эритропоэтина входят в объем настоящего изобретениия.
Как указывалось выше, эритропоэтин, пригодный для достижения целей настоящего изобретения, может иметь по крайней мере одну из вышеуказанных модификаций, но число таких модификаций может быть больше. В качестве примера модифицированного эритропоэтина с одной модификацией углеводородной части молекулы и одной модификацией аминокислотной части можно привести асиалоэритропоэтин, содержащий биотинилированные или карбамилированные остатки лизина. В объем настоящего изобретения входят также композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие один или несколько вышеуказанных эритропоэтинов.
Другим объектом данного изобретения является способ защиты, сохранения, усиления или восстановления функции или жизнеспособности эритропоэтинреактивных клеток млекопитающего и сопутствующих клеток, тканей и органов, заключающийся в том, что нуждающемуся субъекту вводят эффективное количество одного или нескольких вышеуказанных эритропоэтинов. В соответствии с одним конкретным объектом изобретения эритропоэтинреактивные клетки млекопитающего и сопутствующие клетки, ткани или органы отделены от сосудистой системы непроницаемым барьером из эндотелиальных клеток. В соответствии с другим конкретным объектом изобретения клетки, ткани, органы или другие части тела удалены из тела млекопитающего, например, предназначены для использования в качестве трансплантатов. Неограничивающими примерами эритропоэтинреактивных клеток или тканей являются клетки или ткани нейронов, сетчатки, мышц, сердца, легкого, печени, почки, тонкого кишечника, коркового вещества надпочечника, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичка, яичника или эндометрия. Приведенные примеры эритропоэтинреактивных клеток служат только для иллюстрации. В одном варианте осуществления изобретения эритропоэтинреактивные клетки или сопутствующие клетки, ткани или органы не являются возбуждаемыми клетками, тканями или органами, либо, по существу, не содержат возбуждаемых клеток или тканей. В другом варианте осуществления изобретения клетки, ткани или органы млекопитающего, на которые воздействуют вышеуказанным производным эритропоэтина, находятся или будут находиться в течение определенного периода времени под влиянием
- 3 007967 по крайней мере одного фактора, ухудшающего жизнеспособность клетки, ткани или органа. Такие факторы включают травматическую гипоксию ίη δίΐιι или нарушение обмена веществ, хирургически вызванную гипоксию ίη 8Йи или нарушение обмена веществ, а также действие токсина ίη δίΐυ. обусловленное химиотерапией или лучевой терапией. Один вариант осуществления данного изобретения относятся к защите от вредного воздействия искусственного кровообращения.
В соответствии с другим объектом данного изобретения вышеуказанные эритропоэтины, а также любые другие молекулы эритропоэтина, включая нативный эритропоэтин человека, можно использовать для получения фармацевтической композиции, предназначенной для обработки клеток, тканей и органов ех νίνο с целью защиты, сохранения, усиления или восстановления функции или жизнеспособности эритропоэтинреактивных клеток млекопитающего и сопутствующих клеток, тканей и органов. Такая обработка ех νίνο является полезной, например, для сохранения клеток, тканей или органов, предназначенных для использования в качестве трансплантатов, в частности, аутотрансплантатов или ксенотрансплантатов. Клетки, ткани или органы могут быть погружены в раствор, содержащий эритропоэтин, либо раствор для перфузии вводят в орган через сосудистую сеть или каким-либо другим способом для сохранения функциональной способности клеток до тех пор, пока клетки, ткань или орган не будут интегрированы в сосудистую сеть донора или реципиента. Раствор для перфузии можно вводить донору до удаления органа, а также в удаленный орган и реципиенту. Кроме того, описанное выше применение эритропоэтина является полезным при отделении клетки, ткани или органа от сосудистой сети субъекта, в результате чего они существуют ех νίνο в течение некоторого периода времени; термин отделение означает ограничение кровотока или пережимание сосудистой сети клетки, ткани, органа или части тела, выполняемое во время хирургической операции, в частности, при хирургическом вмешательстве с применением искусственного кровообращения; при шунтировании сосудистой сети клетки, ткани, органа или части тела; при удалении клетки, ткани, органа или части тела у млекопитающего, производимого до ксенотрансплантации или до и во время аутотрансплантации; при травматической ампутации клетки, ткани, органа или части тела. Таким образом, рассмотренный объект изобретения относится к перфузии эритропоэтином ίη δίΐιι и ех νίνο. Эритропоэтин можно вводить в клетку, ткань или орган ех νίνο в виде консервирующего раствора. Указанное введение можно осуществлять в виде непрерывной перфузии, пульсирующей перфузии, инфузии, обработки в ванне, инъекции или катетеризации.
Другим объектом данного изобретения является способ защиты, сохранения, усиления или восстановления жизнеспособности клетки, ткани, органа или части тела млекопитающего, включающих эритропоэтинреактивные клетки или ткани, в соответствии с которым клетку, ткань, орган или часть тела отделяют от организма млекопитающего. Данный способ заключается в том, что отделенную клетку, ткань, орган или часть тела млекопитающего подвергают воздействию определенного количества эритропоэтина в течение периода времени, достаточного для защиты, сохранения, усиления или восстановления вышеуказанной жизнеспособности. В неограничивающих примерах термин отделение означает ограничение кровотока или пережимание сосудистой сети клетки, ткани, органа или части тела, выполняемое во время хирургической операции, в частности, при хирургическом вмешательстве с применением искусственного кровообращения; при шунтировании сосудистой сети клетки, ткани, органа или части тела; при удалении клетки, ткани, органа или части тела у млекопитающего, производимого до ксенотрансплантации или до и во время аутотрансплантации; при травматической ампутации клетки, ткани, органа или части тела. Таким образом, данный объект изобретения относится к перфузии эритропоэтином ίη δίΐιι и ех νίνο. Эритропоэтин можно вводить в клетку, ткань или орган ех νίνο в виде консервирующего раствора. Указанное введение можно осуществлять в виде непрерывной перфузии, пульсирующей перфузии, инфузии, обработки в ванне, инъекции или катетеризации.
В случае вышеописанного отделения клеток, тканей и органов или осуществления изобретения ех νίνο можно использовать любой из вышеуказанных эритропоэтинов, включая любой нативный эритропоэтин, аналог эритропоэтина, миметик эритропоэтина, фрагмент эритропоэтина, гибридную молекулу эритропоэтина, молекулу, связывающуюся с рецептором эритропоэтина, агонист эритропоэтина, почечный эритропоэтин, эритропоэтин головного мозга, его олигомер, мультимер, мутеин, родственную форму, природную форму, синтетическую форму, рекомбинантную форму, гликозилированный вариант, дегликозилированный вариант или комбинацию указанных форм. Любая форма эритропоэтина, способная оказывать благоприятное воздействие на эритропоэтинреактивные клетки, входит в объем данного объекта изобретения. Другие эритропоэтины включают, не ограничиваясь ими, асиалоэритропоэтин, Νдегликозилированный эритропоэтин, О-дегликозилированный эритропоэтин, эритропоэтин с меньшим содержанием углеводородов, эритропоэтин с измененной структурой гликозилирования, эритропоэтин с окисленными и восстановленными углеводородами, модифицированный арилглиоксалем эритропоэтин, модифицированный алкилглиоксалем эритропоэтин, модифицированный 2,3-бутандионом эритропоэтин, модифицированный циклогександионом эритропоэтин, биотинилированный эритропоэтин, Ν-алкилированный лизилэритропоэтин, глюцитолиллизинэритропоэтин, альфа-дезокси-альфа-фруктозиллизинэритропоэтин, карбамилированный эритропоэтин, ацетилированный эритропоэтин, сукцинилированный эритропоэтин, альфа-карбоксиалкилэритропоэтин, нитрованный эритропоэтин, йодированный эритропоэтин; выше приведены лишь некоторые типичные, не ограничивающие объем изобретения примеры.
- 4 007967
Эритропоэтин человека является предпочтительным, нативный эритропоэтин человека является наиболее предпочтительным. В другом варианте осуществления изобретения предпочтительным является асиалоэритропоэтин человека. Еще в одном варианте осуществления изобретения предпочтительным является фенилглиоксальэритропоэтин человека.
Неограничивающими примерами эритропоэтинреактивных клеток или тканей ех νίνο являются клетки или ткани нейронов, сетчатки, мышц, сердца, легкого, печени, почки, тонкого кишечника, коркового вещества надпочечника, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичка, яичника или эндометрия. Приведенные примеры эритропоэтинреактивных клеток служат только для иллюстрации.
Все рассмотренные выше способы и применения предпочтительно предназначены для человека, но могут быть использованы для любых млекопитающих, включающих, но не ограничивающихся ими, комнатных животных, домашних животных, крупный рогатый скот и животных, содержащихся в зоопарке. Способы введения вышеуказанных фармацевтических композиций включают пероральное, внутривенное, назальное, местное, внутрипросветное, ингаляционное или парентеральное введение, при этом парентеральный способ сведения включает внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подслизистое или внутрикожное введение. Для применения ех νίνο предпочтительным является перфузионный раствор или раствор для ванны. Данный способ включает перфузию отделенной части сосудистой сети ίη Щи.
В соответствии с другим объектом изобретения все вышеуказанные эритропоэтины пригодны для получения фармацевтической композиции, предназначенной для восстановления неправильно функционирующей клетки, ткани или органа, при введении в случае болезни или нарушения, вызывающих такую дисфункцию. В качестве неограничивающего примера можно привести фармацевтическую композицию, содержащую эритропоэтин, которая позволяет восстановить познавательную способность у животных с черепно-мозговой травмой даже при введении через продолжительное время (например, через 3 дня, 5 дней, неделю, месяц или больше) после нанесения травмы. Для таких применений можно использовать любые вышеуказанные эритропоэтины или любой нативный эритропоэтин, аналог эритропоэтина, миметик эритропоэтина, фрагмент эритропоэтина, гибридную молекулу эритропоэтина, молекулу, связывающуюся с рецептором эритропоэтина, агонист эритропоэтина, почечный эритропоэтин, эритропоэтин головного мозга, его олигомер, мультимер, мутеин, родственную форму, природную форму, синтетическую форму, рекомбинантную форму, гликозилированный вариант, дегликозилированный вариант или комбинацию указанных форм. Любая форма эритропоэтина, способная оказывать благоприятное воздействие на эритропоэтинреактивные клетки, входит в объем данного объекта изобретения. Другие производные эритропоэтина, пригодные для достижения вышеуказанных целей, и фармацевтические композиции включают как нативные эритропоэтины, так и эритропоэтины, имеющие по крайней мере одну модификацию по сравнению с нативным эритропоэтином, предпочтительно по сравнению с нативным эритропоэтином человека. Такая модификация может представлять замену по крайней мере одной аминокислоты или одного углеводорода в молекуле эритропоэтина. Молекулы эритропоэтина, пригодные для достижения вышеуказанных целей, могут включать несколько модификаций по сравнению с нативной молекулой, например, несколько изменений аминокислотной части молекулы, несколько изменений углеводородной части молекулы или по крайней мере одно изменение аминокислотной части молекулы и по крайней мере одно изменение углеводородной части молекулы. Модифицированная молекула эритропоэтина сохраняет свою способность защищать, сохранять, усиливать или восстанавливать функцию или жизнеспособность эритропоэтинреактивных клеток млекопитающего, при этом другие свойства молекулы эритропоэтина, не относящиеся к вышеуказанным желательным свойствам, могут отсутствовать по сравнению с нативной молекулой. Эритропоэтин человека является предпочтительным; нативный эритропоэтин человека является наиболее предпочтительным. В другом варианте осуществления изобретения предпочтительным является асиалоэритропоэтин человека.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способам применения описанного выше эритропоэтина для восстановления неправильно функционирующей клетки, ткани или органа при введении в случае болезни или нарушения, вызывающих такую дисфункцию. В качестве неограничивающего примера можно привести способы применения фармацевтической композиции, содержащей эритропоэтин, которые позволяют восстановить познавательную способность у животных с черепно-мозговой травмой даже при введении через продолжительное время (например, через 3 дня, 5 дней, неделю, месяц или более) после нанесения травмы. При осуществлении таких способов можно использовать любые вышеуказанные эритропоэтины или любой нативный эритропоэтин, аналог эритропоэтина, миметик эритропоэтина, фрагмент эритропоэтина, гибридную молекулу эритропоэтина, молекулу, связывающуюся с рецептором эритропоэтина, агонист эритропоэтина, почечный эритропоэтин, эритропоэтин головного мозга, его олигомер, мультимер, мутеин, родственную форму, природную форму, синтетическую форму, рекомбинантную форму, гликозилированный вариант, дегликозилированный вариант или комбинацию указанных форм. Любая форма эритропоэтина, способная оказывать благоприятное воздействие на эритропоэтинреактивные клетки, входит в объем данного объекта изобретения. Другие производные эритропоэтина, пригодные для достижения вышеуказанных целей, и фармацевтические композиции включают как нативные эритропоэтины, так и эритропоэтины, имеющие по крайней мере одну модификацию
- 5 007967 по сравнению с нативным эритропоэтином, предпочтительно по сравнению с нативным эритропоэтином человека. Такая модификация может представлять замену по крайней мере одной аминокислоты или одного углеводорода в молекуле эритропоэтина. Молекулы эритропоэтина, пригодные для достижения вышеуказанных целей, могут включать несколько модификаций по сравнению с нативной молекулой, например, несколько изменений аминокислотной части молекулы, несколько изменений углеводородной части молекулы или по крайней мере одно изменение аминокислотной части молекулы и по крайней мере одно изменение углеводородной части молекулы. Модифицированная молекула эритропоэтина сохраняет свою способность защищать, сохранять, усиливать или восстанавливать функцию или жизнеспособность эритропоэтинреактивных клеток млекопитающего, при этом другие свойства молекулы эритропоэтина, не относящиеся к вышеуказанным желательным свойствам, могут отсутствовать по сравнению с нативной молекулой. Эритропоэтин человека является предпочтительным; нативный эритропоэтин человека является наиболее предпочтительным. В другом варианте осуществления изобретениия предпочтительным является асиалоэритропоэтин человека.
Другим объектом настоящего изобретения являются способы, облегчающие трансцитоз молекулы через барьер из эндотелиальных клеток у млекопитающего благодаря введению композиции, в которой указанная молекула ассоциирована с эритропоэтином, причем в данном случае используют эритропоэтин, не имеющий частей сиаловой кислоты; эритропоэтин, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводородов; эритропоэтин, содержащий меньше углеводородов в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой; эритропоэтин, в котором углеводородная часть имеет структуру гликозилирования немлекопитающего в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводородов, которые могут быть химически восстановлены; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Νконцевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина; эритропоэтин, имеющий модифицированный остаток тирозина; эритропоэтин, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты; эритропоэтин, имеющий модифицированный остаток триптофана; эритропоэтин, в котором удалена по крайней мере одна аминогруппа; эритропоэтин, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина; эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или усеченный эритропоэтин.
Предназначенная для переноса молекула может быть ассоциирована с эритропоэтином при помощи неустойчивой ковалентной связи, устойчивой ковалентной связи или нековалентного соединения с сайтом связывания для данной молекулы. Барьеры из эндотелиальных клеток могут представлять гематоэнцефалический барьер, гематоофтальмический барьер, гематотестикулярный барьер, гематоовариальный барьер и гематоплацентарный барьер. Молекулы, пригодные для переноса спообом по настоящему изобретению, включают гормоны, такие как гормон роста, антибиотики и противораковые средства.
Другим объектом настоящего изобретения является композиция, облегчающая трансцитоз молекулы через барьер из эндотелиальных клеток у млекопитающего, в которой указанная молекула ассоциирована с эритропоэтином, причем в данном случае используют эритропоэтин, по крайней мере, не имеющий частей сиаловой кислоты; эритропоэтин, по крайней мере, не имеющий Ν-связанных или Освязанных углеводородов; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий меньше углеводородов в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой; эритропоэтин, в котором углеводородная часть, по крайней мере, имеет гликозилированную структуру немлекопитающего в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводородов, которые могут быть химически восстановлены; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана; эритропоэтин, в котором удалена по крайней мере одна аминогруппа; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина; эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или усеченный эритропоэтин.
Указанная ассоциация может быть, например, неустойчивой ковалентной связью, устойчивой ковалентной связью или нековалентным соединением с сайтом связывания для данной молекулы. Барьеры из эндотелиальных клеток могут представлять гематоэнцефалический барьер, гематоофтальмический барьер, гематотестикулярный барьер, гематоовариальный барьер и гематоплацентарный барьер. Молекулы, пригодные для переноса способом по настоящему изобретению, включают гормоны, такие как гормон роста, антибиотики и противораковые средства.
Другим объектом настоящего изобретения является применение описанных выше эритропоэтинов для получения фармацевтической композиции, облегчающей трансцитоз молекулы через барьер из эндо
- 6 007967 телиальных клеток у млекопитающего, в которой указанная молекула ассоциирована с эритропоэтином, причем в данном случае используют эритропоэтин, по крайней мере, не имеющий частей сиаловой кислоты; эритропоэтин, по крайней мере, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводородов; эритропоэтин, имеющий, по крайней мере, меньше углеводородов в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой; эритропоэтин, в котором углеводородная часть имеет, по крайней мере, гликозилированную структуру немлекопитающего в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводородов, которые могут быть химически восстановлены; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина; эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана; эритропоэтин, в котором удалена по крайней мере одна аминогруппа; эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина; эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или усеченный эритропоэтин.
Указанная ассоциация может быть, например, неустойчивой ковалентной связью, устойчивой ковалентной связью или нековалентным соединением с сайтом связывания для данной молекулы. Барьеры из эндотелиальных клеток могут представлять гематоэнцефалический барьер, гематоофтальмический барьер, гематотестикулярный барьер, гематоовариальный барьер и гематоплацентарный барьер. Молекулы, пригодные для переноса способом по настоящему изобретению, включают гормоны, такие как гормон роста, антибиотики и противораковые средства.
Указанные и другие объекты настоящего изобретения станут более очевидными со ссылкой на нижеследующие фигуры и подробное описание.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана транслокация парентерально введенного эритропоэтина в цереброспинальной жидкости; на фиг. 2 - защита эритропоэтином миокарда от ишемического поражения после временной окклюзии сосуда;
на фиг. 3 - сохранение эритропоэтином функции сердца, подготовленного к трансплантации;
на фиг. 4 сравнивается эффективность эритропоэтина и асиалоэритропоэтина ίη νίίτο по сохранению жизнеспособности клеток Р19, испытывающих потребность в сыворотке;
на фиг. 5 показаны результаты другого эксперимента, сравнивающего эффективность эритропоэтина и асиалоэритропоэтина ίη νίίτο по сохранению жизнеспособности клеток Р19, испытывающих потребность в сыворотке;
на фиг. 6 сравнивается эффективность эритропоэтина и модифицированного фенилглиоксалем эритропоэтина ίη νίίτο ηο сохранению жизнеспособности клеток Р19, испытывающих потребность в сыворотке;
на фиг. 7 показана защита эритропоэтином и асиалоэритропоэтином, обеспечиваемая в модели очаговой церебральной ишемии у крыс;
на фиг. 8 - реакция на дозу лекарственного средства, позволяющая сравнить эффективность эритропоэтина человека и асиалоэритропоэтина человека при окклюзии средней церебральной артерии в модели ишемического инсульта;
на фиг. 9 - результат воздействия биотинилированного эритропоэтина и асиалоэритропоэтина при выполнении анализа клеток Р19;
на фиг. 10 - активность йодированного эритропоэтина при выполнении анализа клеток Р19; на фиг. 11 - результаты лечения эритропоэтином с использованием модели глаукомы у крыс;
на фиг. 12 - степень сохранения эритропоэтином функции сетчатки с использованием модели глаукомы у крыс;
на фиг. 13 - восстановление познавательной способности после черепно-мозговой травмы в результате введения эритропоэтина через пять дней после травмы;
на фиг. 14 - восстановление познавательной способности после черепно-мозговой травмы в результате введения эритропоэтина через 30 дней после травмы;
на фиг. 15 - эффективность асиалоэритропоэтина человека при использовании модели церебрального токсикоза под действием каината.
Подробное описание изобретения
Термин эритропоэтинреактивная клетка означает клетку млекопитающего, функция или жизнеспособность которой может быть сохранена, стимулирована, усилена, восстановлена или любым другим образом улучшена под действием эритропоэтина. Неограничивающими примерами таких клеток являются клетки нейронов, сетчатки, мышц, сердца, легкого, печени, почки, тонкого кишечника, коркового вещества надпочечника, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичка, яичника и эндометрия. Кроме того, такие эритропоэтинреактивные клетки и благоприятные свойства, сообщаемые им
- 7 007967 эритропоэтином, могут косвенно защищать или усиливать другие клетки, которые не являются эритропоэтинреактивными, а также ткани или органы, содержащие клетки, не являющиеся эритропоэтинреактивными. Другие клетки, ткани или органы, которые получают косвенную пользу от усиления эритропоэтинреактивных клеток, представляют часть клеток, тканей или органов, определяемых как сопутствующие клетки, ткани и органы. Таким образом, благоприятное воздействие эритропоэтина может иметь место благодаря присутствию небольшого количества или части эритропоэтинреактивных клеток в ткани или органе, например, возбуждаемой или нервной ткани, имеющейся в такой ткани, или клеток Лейдига в яичке, вырабатывающих тестостерон. В соответствии с одним объектом изобретения эритропоэтинреактивные клетки или сопутствующие клетки, ткани или органы не являются возбуждаемыми клетками, тканями или органами или по существу не содержат возбуждаемых клеток или тканей.
Способы по данному изобретению обеспечивают локальную или системную защиту или усиление клеток, тканей и органов в организме млекопитающего в условиях воздействия разных нормальных и вредных факторов или защиту клеток, тканей и органов, переносимых в тело другого млекопитающего. Кроме того, указанные способы служат для восстановления или регенерации дисфункции. Как указывалось выше, способность эритропоэтина проникать через непроницаемый барьер из эндотелиальных клеток и оказывать положительное воздействие на эритропоэтинреактивные клетки (а также на клетки других типов), отделенные от сосудистой сети, создает возможность для предотвращения и лечения разных нарушений и заболеваний, которые в противном случае вызывают значительное поражение клеток и тканей у животного, включая человека, а также гарантирует успех ранее невозможным хирургическим операциям, при выполнении которых риск традиционно перевешивал предполагаемую пользу. Благодаря настоящему изобретению можно увеличить продолжительность и степень намеренного вредного воздействия, производимого с целью достижения конечной пользы, такого как усиленная химиотерапия, лучевая терапия, длительное сохранение жизнеспособности трансплантата ех νΐνο и продолжительные периоды хирургически вызванной ишемии. Однако данное изобретение не ограничено вышеизложенным и в качестве одного объекта включает способы или композиции, предназначенные для использования в тех случаях, когда эритропоэтинреактивные клетки-мишени отделены от сосудистой сети барьером или плотными соединениями из эндотелиальных клеток. Как правило, данное изобретение относится к любым эритропоэтинреактивным и сопутствующим клеткам, тканям и органам, на которые эритропоэтин оказывает благоприятное воздействие. Кроме того, под действием эритропоэтина можно восстановить или регенерировать дисфункцию клеток, тканей или органов после острого вредного воздействия (такого как травма).
Поэтому данное изобретение относится к применению эритропоэтинов для получения фармацевтических композиций, предназначенных для достижения вышеуказанных целей, в соответствии с которыми функция клеток может быть сохранена, стимулирована, усилена, восстановлена или улучшена любым другим образом. Настоящее изобретение относится также к способам сохранения, усиления, стимуляции или регенерации функции клеток путем введения млекопитающему эффективного количества описанного эритропоэтина. Данное изобретение относится далее к способам сохранения, стимуляции, усиления или восстановления функции клеток ех νΐνο в результате обработки клеток, ткани или органа эритропоэтином. Данное изобретение относится также к композиции для перфузии, содержащей эритропоэтин и предназначенной для сохранения органа или ткани.
При осуществлении способов по данному изобретению используют фармацевтическую композицию, которая содержит эффективное количество эритропоэтина, соответствующее определенному способу введения и продолжительности воздействия с целью достижения положительного эффекта или пользы для эритропоэтинреактивных клеток в организме млекопитающего или вне его. Если клеткимишени, ткани или органы, являющиеся объектами лечения, требуют преодоления эритропоэтином барьера из эндотелиальных клеток, фармацевтическая композиция содержит эритропоэтин в концентрации, достаточной для достижения требуемого воздействия на эритропоэтинреактивные клетки после прохождения через барьер из эндотелиальных клеток. В контексте настоящего изобретения весьма полезными являются молекулы, способные взаимодействовать с рецептором эритропоэтина и модулировать активность рецептора, которые далее именуются модуляторами активности эритропоэтина или рецепторов эритропоэтина. Указанные молекулы могут представлять, напрмер, природные, синтетические или рекомбинантные формы описанных выше молекул эритропоэтина или другие молекулы, которые могут отличаться от эритропоэтина во всех отношениях за исключением способности модулировать активность эритропоэтинреактивных клеток.
Эритропоэтин является гормоном гликопротеина, который в организме человека имеет молекулярную массу, равную примерно 34 кДа. Зрелый белок содержит 165 аминокислот, при этом гликозильные остатки составляют около 40 мас.% молекулы. Пригодные для использования в настоящем изобретении формы эритропоэтина включают природные, синтетические и рекомбинантные формы нижеследующих родственных эритропоэтину молекул человека и других млекопитающих: эритропоэтин, асиалоэритропоэтин, дегликозилированный эритропоэтин, аналоги эритропоэтина, миметики эритропоэтина, фрагменты эритропоэтина, гибридные молекулы эритропоэтина, молекулы, связывающиеся с рецептором эритропоэтина, агонисты эритропоэтина, почечный эритропоэтин, эритропоэтин головного мозга, их олигомеры, мультимеры, мутеины и родственные формы. Кроме того, формы эритропоэтина, пригодные
- 8 007967 для осуществления настоящего изобретения, включают белки, представляющие функционально эквивалентные генные продукты. Такой эквивалентный эритропоэтину генный продукт включает мутантные эритропоэтины, которые могут иметь делеции, в том числе внутренние делеции, добавления, в том числе добавления, образующие слитые белки, или замены консервативных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности и/или рядом с ней, вызывающие молчащую замену, выражающуюся в том, что такая замена позволяет получить функционально эквивалентный эритропоэтин. Такие замены аминокислот можно производить на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера используемых остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокиислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Альтернативно, замены неконсервативных аминокислот и более длинные инсерции и делеции можно использовать для создания функционально измененных мутантов эритропоэтина. Такие мутанты служат для желаемого изменения свойств эритропоэтина. Например, в одном варианте осуществления изобретения приемлемый эритропоэтин может быть мутантным эритропоэтином с заменой одной или нескольких аминокислот в четырех функциональных доменах эритропоэтина, влияющих на связывание с рецептором: Уб-ΟΒΥ и/или ΤΚΥΝΕΥΑΑ и/или §6ТК.§ЬТТЬ и/или 8ΝΕΕΚ.Ο. В другом варианте осуществления изобретения можно использовать эритропоэтины, содержащие мутации в окружающих областях молекулы, влияющих на кинетку или свойства связывания данной молекулы с рецептором.
Термин эритропоэтин включает разные аналоги, фрагменты, гибридные молекулы, агонисты, мутеины и другие описанные выше формы, а также сайты гликозилирования эритропоэтина, включая нативные, дегликозилированные, асиалилированные и другие частично гликозилированные формы эритропоэтина.
Неограничивающие примеры таких вариантов описаны в статье Ткиба с1 а1., 1990, Еиг. 1. Вюсбет. 188:405-411, которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. Приведенное выше определение эритропоэтина относится к бактериям, дрожжам, насекомым, растениям и млекопитающим, включая человека. Кроме того, для экспрессии и продуцирования рекомбинантного эритропоэтина можно использовать разные системы-хозяева, включающие, но не ограничивающиеся ими, клеточные системы бактерий, дрожжей, насекомых, растений и млекопитающих, включая человека. Например, рекомбинантный эритропоэтин, продуцированный в бактериях, которые не гликозилируют или сиалилируют продукт, можно использовать для получения негликозилированных форм эритропоэтина. Альтернативно, рекомбинантный эритропоэтин можно продуцировать в других системах, которые гликозилируют продукт, например, в растительных клетках, включая клетки человека.
Как указывалось выше, в объем данного изобретения входят все молекулы, модулирующие активность рецепторов эритропоэтина, которые способны сообщать положительную активность эритропоэтинреактивным клеткам независимо от структурной взаимосвязи данной молекулы с эритропоэтином.
Кроме того, сам эритропоэтин можно модифицировать для приведения его активности в соответствие со специфическими тканями. Несколько неограничивающих методов, обеспечивающих достижение требуемой тканевой специфичности, включают модификации, которые укорачивают полупериод существования в кровяном русле и таким образом уменьшают время взаимодействия эритропоэтина с эритроидными предшественниками, или модификации первичной структуры молекулы эритропоэтина. Одним способом уменьшения полупериода существования в кровяном русле является удаление или модификация частей гликозилирования, три из которых в эритропоэтине присоединены Ν-связью и одна присоединена О-связью. Такие варианты гликозилированного эритропоэтина можно получать различными способами. Например, сиаловые кислоты, которые находятся в конце цепей сахара, можно удалить при помощи специфичных сиалидаз в зависимости от химической связи, присоединяющей сиаловую кислоту к цепи сахара. Альтернативно, гликозилированную структуру можно удалить разными способами, используя другие ферменты, расщепляющие специфичные связи. Существует много методов модификации первичной структуры, которые включают замену конкретных аминокислот, химическую модификацию аминокислот или добавление других структур, которые препятствуют взаимодействию эритропоэтина с его рецепторами. Применение таких форм эритропоэтина входит в объем данного изобретения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полупериод существования неэритропоэтического эритропоэтина по данному изобретению уменьшен примерно на 90% по сравнению с аналогичным показателем нативного эритропоэтина.
Некоторые из указанных молекул тем не менее имитируют действие эритропоэтина в других тканях или органах. Например, 17-мер, содержащий аминокислотную последовательность 31-47 нативного эритропоэтина, утрачивает активность в отношении эритропоэза, но полностью сохраняет активность в отношении нервных клеток ίη νίΐτο (Сатрапа & О'Впеп. 1998; Ιηΐ. I. Мо1. Меб. 1:235-41).
Кроме того, молекулы производного эритропоэтина, используемые в описываемых применениях, можно получить, осуществляя гуанидинирование, амидирование, карбамилирование (карбамоилирование), тринитрофенилирование, ацетилирование, сукцинирование, нитрование или модификацию остатков аргинина, лизина, тирозина, триптофана, цистеина или карбоксильных групп наряду с такими мето
- 9 007967 дами, как ограниченный протеолиз, удаление аминогрупп и/или мутационная замена остатков аргинина, лизина, тирозина, триптофана или цистеина методами молекулярной биологии, используемыми для получения эритропоэтинов, сохраняющих соответствующий уровень активности лишь в определенных органах и тканях и не проявляющих активность в других случаях, например, в отношении эритроцитов (см., например, статью 8а1аке с1 а1., 1990, ВюсЫш. Вюрйуз. Ле1а 1038:125-9, которая полностью включена в данное описание изобретения в качестве ссылки). Одним неограничивающим примером, рассматриваемым ниже, является модификация остатков аргинина эритропоэтина в результате взаимодействия с глиоксалем, таким как фенилглиоксаль (методом, описанным в статье ТакайазЫ, 1977, 1. Вюсйеш. 81:395-402). Как будет описано ниже, такая молекула эритропоэтина полностью сохраняет нейротрофическое действие. Указанные молекулы эритропоэтина входят в объем данного изобретения и предназначены для разных применений и получения описанных здесь композиций.
В объем данного изобретения входят синтетические и рекомбинантные молекулы, такие как эритропоэтин головного мозга и почечный эритропоэтин, рекомбинантные формы эритропоэтина млекопитающего, а также его природные, выделяемые из опухоли и рекомбинантные изоформы, такие как рекомбинантно экспрессированные молекулы и молекулы, полученные гомологичной рекомбинацией. Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам, включающим пептиды, связывающимся с рецептором эритропоэтина, а также к рекомбинантным конструкциям или другим молекулам, обладающим частью или всеми структурными и/или биологическими свойствами эритропоэтина, включая фрагменты и мультимеры эритропоэтина или его фрагментов. Определение эритропоэтина охватывает молекулы с измененной активностью связывания с рецепторами эритропоэтина, предпочтительно с более высоким сродством к рецептору, в частности, с лучшим переносом через барьеры из эндотелиальных клеток. В объем данного изобретения входят мутеины, включающие молекулы с дополнительным или уменьшенным числом сайтов гликозилирования. Как указывалось выше, термин эритропоэтин и миметики, а также другие термины используются в данном описании изобретения взаимозаменяемо для обозначения молекул, родственных эритропоэтину, которые защищают или усиливают эритропоэтинреактивные клетки, и молекул, способных проходить через барьеры из эндотелиальных клеток.
Молекулы, продуцируемые трансгенными животными, также входят в объем данного изобретения. Следует отметить, что входящие в объем изобретения молекулы эритропоэтина необязательно подобны эритропоэтину в структурном или другом отношении за исключением способности взаимодействовать с рецептором эритропоэтина, модулировать активность эритропоэтина или активировать эритропоэтинактивируемые сигнальные системы, рассмотренные в данном описании изобретения.
Неограничивающие примеры форм эритропоэтина, пригодных для осуществления настоящего изобретения, включают мутанты эритропоэтина с измененными аминокислотами у карбоксильного конца, подобные описанным в патентах США №№ 5457089 и 4835260; асиалоэритропоэтин и изоформы эритропоэтина с разным числом остатков сиаловой кислоты в молекуле, подобные описанным в патенте США № 5856298; полипептиды, описанные в патенте США № 4703008; агонисты, описанные в патенте США № 5767078; пептиды, связывающиеся с рецептором эритропоэтина, подобные описанным в патентах США №№ 5773569 и 5830851; низкомолекулярные миметики, активирующие рецептор эритропоэтина, подобные описанным в патенте США № 5835382; и аналоги эритропоэтина, описанные в заявках на патент АО 9505465, АО 9718318 и АО 9818926. Все приведенные выше ссылки включены в данное описание изобретения в той степени, в которой они относятся к разным альтернативным формам или способам получения таких форм эритропоэтина по настоящему изобретению.
Эритропоэтин можно приобрести коммерческим путем, например, под товарными знаками РКОСК1Т фирмы Оййо Вю1есй 1пс., К.ап1аи, N1, и ЕРООЕЫ фирмы Ашдеи, 1пс., Тйоизаий Оакз, СА.
Активность (в единицах) эритропоэтина и эритропоэтинподобных молекул традиционно определяют с учетом их эффективности стимуляции продуцирования эритроцитов в моделях с использованием грызунов (и на основании международных стандартов качества эритропоэтина). Одна единица (Ед) обычного эритропоэтина (молекулярная масса ~34000) равна ~8 нг белка (1 мг белка составляет примерно 125000 Ед). Однако поскольку воздействие на эритропоэз является произвольным для требуемой активности и необязательно может быть обнаружено у определенных эритропоэтинов по данному изобретению, определение активности на основании эритропоэтической активности не соответствует требованиям. Поэтому единицу активности эритропоэтина или эритропоэтинродственных молекул определяют в виде количества белка, необходимого для достижения аналогичной активности в нейронах или других эритропоэтинреактивных клеточных системах при сопоставлении с международным стандартом эритропоэтина АНО (ВОЗ) в аналогичной системе. Специалист в данной области может легко определить единицы активности неэритропоэтического эритропоэтина или родственной молекулы в соответствии с приведенным руководством.
Помимо вышеуказанных модификаций эритропоэтина, пригодных для осуществления настоящего изобретения, в объем данного изобретения входят рассматриваемые ниже эритропоэтины.
Эритропоэтин по данному изобретеню может не иметь частей сиаловой кислоты, при этом он определяется как асиалоэритропоэтин. Эритропоэтин по данному изобретению предпочтительно является асиалоэритропоэтином человека. В альтернативным вариантах осуществления изобретения эритропоэтин
- 10 007967 по данному изобретению может иметь по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков сиаловой кислоты. Асиалоэритропоэтин может быть получен десиалилированием эритропоэтина при помощи сиалидазы в соответствии с описанием, приведенным в инструкции производителя для сиалидазы А фирмы ΡιόΖυπιο 1пс., 8аи Ьеаибго, СаНГогша. Для расщепления всех невосстанавливающих концевых остатков сиаловой кислоты в сложных углеводородах и гликопротеинах, таких как эритропоэтин, обычно используют сиалидазу (Ν-ацетилнейроаминатгликогидролаза, ЕС 3.2.1.18) 8ΙΑΕΎΏΑ8Ε А™ секвенирующего качества ΡΚΟΖΥΜΕ® СЬУСОРКО®. Указанным веществом расщепляют сиаловые кислоты с разветвленной цепью (связанные с внутренним остатком). Сиалидазу А выделяют из клона Аг1НгоЬас1ег игеа1ае1еп8.
Эритропоэтин может иметь меньшее число Ν-связанных углеводородов. Для удаления Ν-связанных углеводородов эритропоэтин можно обработать гидразином способами, описанными, например, в статье Негшепйп е1 а1., 1996, С1усоЬю1оду 6(2):217-30. Как указывалось выше, эритропоэтин имеет три Νсвязанные углеводородные части; в объем настоящего изобретения входят эритропоэтины с двумя, одним или без Ν-связанного углеводорода.
Эритропоэтин по данному изобретению может иметь меньшее число углеводородов в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой. Например, для указанной цели может быть использован способ, описанный СНеп апб ЕуапдеНйа, 1998, Е1есг1орНогем5 19(15):2639-44. Кроме того, О-связанный углеводород можно удалить способами, описанными в статье Нокке е1 а1., 1995, Еиг. 1. ВюсНет. 228(3):981-1008.
Углеводородная часть молекулы эритропоэтина может иметь гликозилированную структуру немлекопитающего, получаемую в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего. Эритропоэтины предпочтительно экспрессируют в клетках насекомых или растений. В качестве неограничивающего примера можно привести экспрессию эритропоэтина в клетках насекомых с использованием экспрессирующей системы бакуловируса, выполняемую способом, описанным Оне11е е1 а1., 1989, В1ооб 74(2):652-657. Другой способ описан в патенте США № 5637477. Экспрессию в растительной системе можно выполнить способом, описанным Ма18ито1о е1 а1., 1993, Вюкск Вю1есН. ВюсНет. 57(8):1249-1252. Альтернативно, экспрессия в бактериях позволяет получить негликозилированные формы эритропоэтина. Указанные способы приведены в качестве примеров получения эритропоэтина по данному изобретению без каких-либо ограничений.
Эритропоэтин по данному изобретению может иметь по крайней мере один или несколько окисленных углеводородов, которые могут быть также химически восстановлены. Например, эритропоэтин может быть окислен периодатом; окисленный периодатом эритропоэтин может быть также химически восстановлен боргидридом, таким как боргидрид натрия или цианоборгидрид натрия. Эритропоэтин может быть окислен периодатом способами, описанными, например, ЬтДеу е1 а1., 1994, Апа1. ВюсНет. 219 (2):207-17. Химическое восстановление после окисления периодатом можно осуществлять способами, описанными ТопеШ апб МетК 1978, 1. 8иргато1. 81гис1. 8(1):67-78.
Эритропоэтин для вышеуказанных применений может иметь по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина. Например, модифицированный эритропоэтин может включать Кглиоксальную часть в одном или нескольких остатках аргинина, где К может означать арил, гетероарил, низший алкил, низший алкокси, циклоалкильную группу или альфа-дезоксиглицитолильную группу. В используемом здесь значении термин низший алкил означает насыщенную алифатическую углеводородную группу с прямой или разветвленной цепью, предпочтительно имеющую 1-6 атомов углерода. Типичными примерами таких групп являются метил, этил, изопропил, изобутил, бутил, пентил, гексил и тому подобные. Термин алкокси означает вышеуказанную низшую алкильную группу, присоединенную к остальной части молекулы кислородом. Примеры алкокси включают метокси, этокси, пропокси, изопропокси и тому подобные. Термин циклоалкил означает циклические алкильные группы с 3-8 атомами углерода, включающие, например, циклопропил, циклобутил, циклогексил и тому подобные. Термин арил означает фенильные и нафтильные группы. Термин гетероарил означает гетероциклические группы, содержащие 4-10 атомов в кольце и 1-3 гетероатома, выбираемых из группы, включающей кислород, азот и серу. Примеры таких групп включают, не ограничиваясь ими, изоксазолил, фенилизоксазолил, фурил, пиримидинил, хинолил, тетрагидрохинолил, пиридил, имидазолил, пирролидинил, 1,2,4триазолил, тиазолил, тиенил и тому подобные. Группа К может быть замещена, например, 1,2,4-тригидроксибутильной группой 3-дезоксиглюкозона. Типичными примерами соединений К-глиоксаля являются глиоксаль, метилглиоксаль, 3-дезоксиглюкозон и фенилглиоксаль. Предпочтительными соединениями Кглиоксаля являются метилглиоксаль или фенилглиоксаль. Типичный способ выполнения такой модификации с использованием фенилглиоксаля описан в статье ХУегЬег е1 а1., 1975, Ег. 1. Меб. 8ск 11(11):1169-70.
В другом примере по крайней мере один остаток аргинина может быть модифицирован в результате взаимодействия с родственным дикетоном, таким как 2,3-бутандион или циклогександион, предпочтительно примерно в 50 миллимолярном боратном буфере при рН 8-9. Модификацию с использованием 2,3-бутадиона можно выполнить способом, описанным Кюгбап, 1973, ВюсНетМгу 12(20):3915-3923; и модификацию с использованием циклогексанона можно выполнить способом, описанным РайНу е1 а1., 1975, 1. Вю1. СНет. 250(2):565-9.
Эритропоэтин по данному изобретению может содержать по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эри
- 11 007967 тропоэтина; такие модификации выполняют в результате взаимодействия остатка лизина с веществом, модифицирующим аминогруппу. В другом варианте осуществления изобретения остатки лизина могут быть модифицированы в результате взаимодействия с производными глиоксаля, например, в результате взаимодействия с глиоксалем, метилглиоксалем и 3-дезоксиглюкозоном с образованием альфакарбоксиалкильных производных. В качестве примеров можно привести взаимодействие с глиоксалем с образованием карбоксиметиллизина способом, описанным в статье С1отЬ апй Моишет, 1995, 1. ΒίοΙ. С11сш. 270 (17):10017-26, или взаимодействие с метилглиоксалем с образованием (1-карбоксиэтил) лизина способом, описанным в статье ЭедеиНагй! е! а1., 1998, Се11. Мо1. Βίο1. (Мо18у-1едгаий) 44 (7):1139-45. Модифицированный остаток лизина может быть химически восстановлен. Например, эритропоэтин может быть биотинилирован при помощи групп лизина способом, описанным в примере 5, в соответствии с которым эфир Ν-гидроксисукцинимида О-биотиноил-е-аминокапроновой кислоты подвергают взаимодействию с эритропоэтином с последующим удалением непрореагировавшего биотина гель-фильтрацией на колонке СеШпеоп 10, как описано в статье \Уо)с1ю\\'5к| апй СаНаке, 1989, В1оой 74(3):952-8. Авторы указанной статьи описывают три разных способа биотинилирования эритропоэтина, каждый из которых можно использовать для получения эритропоэтинов по данному изобретению. Биотин можно добавлять к (1) частям сиаловой кислоты, (2) карбоксилатным группам или (3) аминогруппам.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения лизин может быть подвергнут взаимодействию с альдегидом или восстанавливающим сахаром с образованием имина, который можно стабилизировать, восстанавливая цианоборгидридом натрия с образованием Ν-алкилированного лизина, такого как глюцитолиллизин, или в случае использования восстанавливающих сахаров имин можно стабилизировать перегруппировкой Амадори или Хейнса с образованием альфа-дезокси-альфааминосахара, такого как альфа-дезокси-альфа-фруктозиллизин. В качестве примера можно привести способ получения модифицированного фруктозиллизином белка путем инкубации с 0,5М глюкозы в натрийфосфатном буфере при рН 7,4 в течение 60 дней, описанный в статье Макйа е! а1., 1992, 1. Вю1. С1ет. 267:5133-5138. В соответствии с другим примером группу лизина можно карбамилировать в результате взаимодействия с ионом цианата, алкил- или арилкарбамилировать или тиокарбамилировать алкил- или арилизоцианатом или изотиоцианатом либо ацилировать реакционноспособным производным алкил- или арилкарбоновой кислоты, например, в результате взаимодействия с уксусным ангидридом, янтарным ангидридом или фталевым ангидридом. Типичным примером являются способы модификации групп лизина 4-сульфофенилизотиоцинатом или уксусным ангидридом, которые описаны в статье Сао е! а1., 1994, Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 91 (25) :12027-30. Группы лизина можно также модифицировать тринитрофенилом в результате взаимодействия с тринитробензолсульфоновой кислотой или предпочтительно с ее солями. Такие способы описаны ниже в примере 5.
По крайней мере один остаток тирозина эритропоэтина в положении ароматического кольца можно модифицировать электрофильным реагентом таким способом, как нитрование или йодирование. В качестве неограничивающего примера можно привести взаимодействие эритропоэтина с тетранитрометаном (№§11ег е! а1., 1985, 1. Вю1. С1ет. 260(12):7316-21; или йодирование, описанное в примере 5.
Остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты эритропоэтина можно модифицировать в результате взаимодействия с карбодиимидом и последующего взаимодействия с амином, который включает, не ограничиваясь им, глицинамид. Примеры таких модификаций приведены в примере 5.
В соответствии с другим примером остаток триптофана эритропоэтина можно модифицировать в результате взаимодействия с н-бромсукцинимидом или н-хлорсукцинимидом способом, описанным в статье 1о88е е! а1., С1ет. Вю1. 1и!егас!. 1999, Мау 14:119-120.
В соответствии с другим примером молекулу эритропоэтина можно получить, удаляя по крайней мере одну аминогруппу в результате взаимодействия с нингидрином и последующего восстановления полученной карбонильной группы в результате взаимодействия с боргидридом.
В соответствии с еще одним примером эритропоэтин, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина, получают в результате взаимодействия с восстановителем, таким как дитиотреитол, и последующего взаимодействия полученных сульфгидрилов с йодацетамидом, йодуксусной кислотой или другим электрофилом для предотвращения повторного образования дисульфидных связей.
Эритропоэтин, в котором по крайней мере одна из аминокислот, такая как лейцин, заменена остатками лизина, аргинина, триптофана, тирозина или цистеина эритропоэтина, можно получить методами молекулярной биологии.
Модифицированный эритропоэтин можно получить, подвергая эритропоэтин ограниченному химическому протеолизу, целенаправленно воздействующему на конкретные остатки, например, вызывающему расщепление после остатков триптофана. Полученные таким образом фрагменты эритропоэтина входят в объем данного изобретения.
Как указывалось выше, эритропоэтин, пригодный для достижения целей по настоящему изобретению, может иметь по крайней мере одну из вышеописанных модификаций, но число таких модификаций может быть больше. В качестве примера можно привести модифицированный эритропоэтин с одной модификацией углеводородной части молекулы и одной модификацией аминокислотной части; модифицированный эритропоэтин может быть асиалоэритропоэтином и иметь биотинилированные или карбами
- 12 007967 лированные остатки лизина.
Таким образом, в объем данного изобретения входят разные молекулы эритропоэтина и содержащие их фармацевтические композиции, предназначенные для описанных здесь применений. Такие молекулы эритропоэтина включают, не ограничиваясь ими, асиалоэритропоэтин, Ν-дегликозилированный эритропоэтин, О-дегликозилированный эритропоэтин, эритропоэтин с меньшим содержанием углеводородов, эритропоэтин с измененной структурой гликозилирования, эритропоэтин с окисленными и восстановленными углеводородами, модифицированные арилглиоксалем эритропоэтины, модифицированные алкилглиоксалем эритропоэтины, модифицированные 2,3-бутандионом эритропоэтины, модифицированные циклогександионом эритропоэтины, биотинилированные эритропоэтины, Ν-алкилированный лизилэритропоэтин, глюцитолиллизинэритропоэтин, альфа-дезокси-альфа-фруктозиллизинэритропоэтин, карбамилированный эритропоэтин, ацетилированный эритропоэтин, сукцинилированный эритропоэтин, альфа-карбоксиалкилэритропоэтин, нитрованный эритропоэтин, йодированный эритропоэтин; выше приведены лишь некоторые типичные, не ограничивающие объем изобретения примеры. Предпочтительными являются вышеуказанные модифицированные формы на основании эритропоэтина человека.
Кроме того, некоторые вышеуказанные эритропоэтины являются новыми, и в объем данного изобретения входят такие соединения, а также содержащие их фармацевтические композиции. Неограничивающим примером таких новых эритропоэтинов являются окисленный периодатом эритропоэтин, глюцитолиллизинэритропоэтин, фруктозиллизинэритропоэтин, 3-дезоксиглюкозонэритропоэтин и карбамилированный асиалоэритропоэтин.
Для продуцирования эритропоэтинов и родственных эритропоэтину молекул по данному изобретению можно использовать разные системы экспрессирующий вектор-хозяин. Такие системы экспрессирующий вектор-хозяин представляют векторы, при помощи которых можно продуцировать и очищать представляющие интерес эритропоэтины, а также клетки, которые будучи трансформированными или трансфицированными соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями, позволяют получить модифицированный эритропоэтин ίη 511н как генный продукт. Указанные системы включают, не ограничиваясь ими, системы таких хозяев, как бактерии, насекомые, растения, млекопитающие, в том числе человек, а также системы клеток насекомых, инфицированных экспрессирующими векторами рекомбинантных вирусов (например, бакуловируса), содержащими кодирующие последовательности для продуцирования модифицированного эритропоэтина; системы растительных клеток, инфицированных экспрессирующими векторами рекомбинантных вирусов (например, вирус мозаики цветной капусты, СаМУ; вирус табачной мозаики, ТМУ) или трансформированных экспрессирующими векторами рекомбинантных плазмид (например, плазмиды Т1), содержащими последовательности, кодирующие родственные эритропоэтину молекулы; или системы клеток млекопитающего, включая системы клеток человека (например, НТ1080, СО8, СНО, ВНК, 293, 3Т3), несущие рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, выделенные из генома клеток млекопитающего (например, промотор, представляющий металлотионеин) или из вирусов млекопитающего (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7,5К вируса коровьей оспы).
Кроме того, можно выбрать штамм клеток-хозяев, который модулирует экспрессию инсертируемых последовательностей или модифицирует и процессирует генный продукт требуемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) или процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут иметь важное значение для функционирования белка. Разные клетки-хозяева имеют характерные и специфичные механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Можно выбрать соответствующие линии клеток или системы хозяев для достижения правильной модификации и процессинга экспрессированного чужеродного белка. С этой целью можно использовать эукариотические клетки-хозяева, обладающие клеточным механизмом для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клеткихозяева млекопитающего, в том числе клетки-хозяева человека, включают, не ограничиваясь ими, НТ1080, СНО, УЕКО, ВНК, НеЬа, СО8, МОСК. 293, 3Т3 и №138.
Для длительного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом предпочтительна стабильная экспрессия. Например, могут быть созданы линии клеток, которые стабильно экспрессируют генный продукт для родственной эритропоэтину молекулы. Вместо использования экспрессирующих векторов, содержащих вирусные репликаторы, клетки-хозяева можно трансформировать при помощи ДНК, контролируемой соответствующими элементами управления экспрессией (такими как промотор, энхансер, последовательности, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т.д.) и селектируемым маркером. После введения чужеродной ДНК созданные клетки выращивают в течение 1-2 дней в обогащенных средах и затем переносят в селективные среды. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде делает выбор устойчивым, позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в свои хромосомы и расти с образованием центров, которые в свою очередь можно клонировать и размножать в линиях клеток. Указанный способ можно успешно использовать для создания линий клеток, экспрессирующих генный продукт для родственной эритропоэтину молекулы. Такие созданные линии клеток могут быть особенно полезны в процессе скрининга и оценки соединений, влияющих на эндогенную активность генного продукта родственной эритропоэтину молекулы.
Альтернативно, характеристики экспрессии гена эндогенного эритропоэтина в линии клеток или
- 13 007967 микроорганизме можно модифицировать, встроив регуляторный элемент гетерологичной ДНК в геном устойчивой линии клеток или клонированного микроорганизма так, чтобы встроенный регуляторный элемент оперативно связывался с геном эндогенного эритропоэтина.
Например, ген эндогенного эритропоэтина, который обычно является транскрипционно молчащим, то есть ген эритропоэтина, который обычно не экспрессирован или экспрессирован в очень малой степени в линии клеток, можно активировать, встроив регуляторный элемент, который способен стимулировать экспрессию обычно экспрессируемого генного продукта в данной линии клеток или микроорганизме. Альтернативно, транскрипционно молчащий ген эндогенного эритропоэтина можно активировать, встроив беспорядочный регуляторный элемент, который действует в разных типах клеток.
Гетерологичный регуляторный элемент можно встроить в устойчивую линию клеток или клонированный микроорганизм так, чтобы он был оперативно связан с геном эндогенного эритропоэтина, используя такие методы, как целенаправленная гомологичная рекомбинация, которые хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, во французском патенте № 2646438, выданном институту Пастера, в патенте США № 4215051, выданном Скаррек в патенте США № 5578461, выданном 8кег\\тп с1 а1.; в международной заявке № РСТ/И8 92/09627 (УО 93/09222), поданной 8е1беп е! а1.; и в международной заявке на патент № РСТ/ϋδ 90/06436 (УО 91/06667), поданной 8кои11сЫ е! а1., которые полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки.
В одном варианте осуществления изобретения родственную эритропоэтину молекулу с недостаточным количеством или полным отсутствием остатков сиаловой кислоты можно продуцировать в клетке млекопитающего, включая клетку человека. Указанные клетки могут быть созданы с недостатком или отсутствием ферментов, которые сообщают активность сиаловым кислотам, таких как β-галактозид-а2,3-сиалилтрансфераза (а-2,3-сиалилтрансфераза) и в-галактозид-а-2,6-сиалилтрансфераза (α-2,6сиалилтрансфераза). В одном варианте осуществления изобретения используют клетку млекопитающего, в которой удален ген а-2,3-сиалилтрансферазы и/или ген а-2,6-сиалилтрансферазы. Такие делеции могут быть получены методами нокаута гена, хорошо известными в данной области. В другом варианте осуществления изобретения в качестве клетки-хозяина для продуцирования родственных рекомбинантному эритропоэтину молекул используют клетки яичника китайского хомячка (СНО) с отсутствием дигидрофолатредуктазы (ΌΗΡΚ). Клетки СНО не экспрессируют фермент а-2,6-сиалилтрансферазу и поэтому не вводят сиаловую кислоту в положение 2,6-связи с Ν-связанными олигосахаридами гликопротеинов, продуцируемых в указанных клетках. Благодаря этому рекомбинантные белки, продуцируемые в клетках СНО, не имеют сиаловой кислоты в положении 2,6-связи с галактозой (8а§ак1 е! а1. (1987; ТакеисЫ е! а1., кирга; Микаегк е! а1. Еиг. 1. Вюскет. 156, 651 (1986); ТакеисЫ е! а1., 1. СкготоЩг. 400, 207 (1987). В одном варианте осуществления изобретения для получения клетки-хозяина, предназначенной для продуцирования асиалоэритропоэтина, удаляют ген, кодирующий а-2,3-сиалилтрансферазу в клетках СНО. Клетки СНО, в которых отсутствует а-2,3-сиалилтрансфераза, полностью лишены активности сиалилтрансферазы и поэтому полезны для экспрессии рекомбинанта и продуцирования асиалоэритропоэтина.
В другом варианте осуществления изобретения асиалогликопротеины можно получить, препятствуя переносу сиаловой кислоты в аппарат Гольджи (см., например, Есккатб! е! а1., 1998, 1. Вю1. Скет. 273:20189-95). Используя методы, хорошо известные специалистам в данной области (см., например, Ое1тапп е! а1., 2001, 1. Вю1. Скет. 276:26291-300), можно произвести мутагенез нуклеотидного транспортера сахар СМР-сиаловая кислота для получения мутантов клеток яичника китайского хомячка. Такие клетки не могут вводит остатки сиаловой кислоты в гликопротеины, такие как эритропоэтин, и продуцируют только асиалоэритропоэтин. Трансфицированные клетки млекопитающего, продуцирующие эритропоэтин, также продуцируют цитозольную сиалидазу, которая при попадании в культуральную среду расщепляет сиалоэритропоэтин с высокой степенью эффективности (см., например, Статет е! а1., 1995, Вю!ескпо1оду, 13:692-698). Используя методы, хорошо известные специалистам в данной области (см., например, статью Реттап е! а1., 1994, С1усоЫо1о§у, 4:367-373), линии клеток можно трансфицировать, мутировать или любым другим способом заставить структурно продуцировать сиалидазу. Подобным образом можно продуцировать асиалоэритропоэтин в процессе его производства.
При осуществлении одного объекта настоящего изобретения описанную выше фармацевтическую композицию, содержащую эритропоэтин, можно вводить млекопитающему любым способом, который обеспечивает достаточный уровень эритропоэтина в сосудистой сети для прохождения через барьер из эндотелиальных клеток и благоприятного воздействия на эритропоэтинреактивные клетки. При использовании фармацевтической композиции для перфузии ткани или органа желательно достичь аналогичных результатов. Для перфузии ех νί\Ό используют все вышеуказанные формы эритропоэтина, не ограничиваясь ими, в том числе нативные эритропоэтины, включая эритропоэтин человека. В тех случаях, когда клетки или ткань не связаны с сосудистой сетью и/или клетки или ткань обрабатывают композицией по данному изобретению в ванне, фармацевтическая композиция содержит эффективное количество эритропоэтина, благоприятно воздействующее на эритропоэтинреактивные клетки. Барьеры из эндотелиальных клеток, через которые может проникать эритропоэтин, включают плотные соединения, перфорированные соединения, ячеистые соединения и любые другие типы эндотелиальных барьеров, имею
- 14 007967 щихся в организме млекопитающего. Предпочтительным барьером является плотное соединение из эндотелиальных клеток, но данное изобретение не ограничивается указанным барьером.
Вышеуказанные эритропоэтины полезны для лечения или профилактики заболеваний центральной или периферической нервной системы у человека, в основном с неврологическими или психиатрическими симптомами, а также глазных, сердечнососудистых, сердечно-легочных и респираторных заболеваний, болезней почек и мочеполовой системы, желудочно-кишечных заболеваний, нарушений функций желез внутренней секреции и обмена вещества. В частности, такие нарушения и заболевания включают гипоксию, которая оказывает вредное влияние на возбуждаемые ткани, находящиеся в тканях центральной и периферической нервной системы, сердечной или ретинальной ткани головного мозга, сердца или сетчатки/глаза. Поэтому данное изобретение можно использовать для лечения или профилактики поражения возбуждаемой ткани вследствие гипоксии, характерной для разных нарушений и заболеваний. Неограничивающие примеры таких нарушений и заболеваний приведены в нижеследующей таблице.
Патологии нервной ткани, поддающиеся лечению способами по настоящему изобретению, включают такие патологии, которые возникают в результате недостаточной оксигенации нервных тканей. Любое состояние, при котором сокращается доступ кислорода к нервной ткани, вызывая стресс, поражение и, наконец, гибель нервной клетки, можно лечить способами по настоящему изобретению. Такие состояния, обычно определяемые как гипоксия и/или ишемия, включают, не ограничиваясь ими, инсульт, окклюзию сосудов, пренатальную или постнатальную кислородную недостаточность, удушье, удушение, утопление, отравление угарным газом, вдыхание дыма, травму, в том числе вследствие хирургического вмешательства и лучевой терапии, асфиксию, эпилепсию, гипогликемию, хроническое обструктивное заболевание легких, эмфизему, респираторный дистресс-синдром взрослых, гипотензивный шок, септический шок, анафилактический шок, инсулиновый шок, серповидно-клеточный криз, остановку сердца, аритмию, помрачение сознания при аутоинтоксикации азотистыми соединениями и неврологические расстройства, вызываемые искусственным кровообращением.
В одном варианте осуществления изобретения можно вводить специальные композиции ЕРО для предотвращения травмирования или поражения ткани во время хирургического вмешательства, например при резекции опухоли или коррекции аневризмы. Другие патологии, вызываемые или возникающие вследствие гипогликемии, которые поддаются лечению способами по настоящему изобретению, включают передозировку инсулина, определяемую также как ятрогенная гиперинсулинемия, инсулиному, недостаточность гормона роста, гипокортицизм, передозировку наркотических средств и определенные опухоли.
Другие патологии, возникающие вследствие поражения возбуждаемой нервной ткани, включают эпилептические припадки, такие как эпилепсия, конвульсии или хронические припадки. Другие поддающиеся лечению нарушения и заболевания включают такие болезни, как инсульт, рассеянный склероз, гипотензия, остановка сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, корковый паралич, травма головного или спинного мозга, слабоумие, обусловленное СПИДом, возрастное ослабление познавательной способности, потеря памяти, амиотрофический латеральный склероз, эпилептические припадки, алкоголизм, ишемия сетчатки, поражение зрительного нерва вследствие глаукомы и утрата нервных клеток.
Определенные композиции и способы по данному изобретению можно использовать для лечения заболеваний и поражений ретинальной ткани. Такие заболевания включают, не ограничиваясь ими, ишемию сетчатки, дегенерацию желтого пятна, отслоение сетчатки, пигментный ретинит, склеротическую ретинопатию, гипертензивную ретинопатию, закупорку артерии сетчатки, закупорку вены сетчатки, гипотензию и диабетическую ретинопатию.
В другом варианте осуществления изобретения способы по данному изобретению можно использовать для защиты от радиационного поражения или лечения возбуждаемой ткани, подвергшейся радиационному поражению. Способы по настоящему изобретению пригодны для лечения отравления нейротоксином, таким как домоевая кислота моллюсков, нейролатиризма и болезни Гуама, амиотрофического латерального склероза и болезни Паркинсона.
Как указывалось выше, настоящее изобретение относится к способу усиления функции возбуждаемой ткани у млекопитающего в результате периферического введения описанного выше эритропоэтина. Разные заболевания и нарушения поддаются лечению указанным способом, и, кроме того, указанный способ полезен для усиления познавательной способности при отсутствии каких-либо нарушений или заболеваний. Такие применения настоящего изобретения более подробно описаны ниже и включают улучшение способности к обучению как у человека, так и у млекопитающих кроме человека.
Способами, относящимися к данному объекту настоящего изобретения, можно лечить нарушения и заболевания центральной нервной системы, которые включают, не ограничиваясь ими, подавленное настроение, беспокойство, депрессию, аутизм, повышенную активность с расстройством внимания и нарушение познавательной способности. На указанные нарушения благоприятно влияет усиление функции нервных клеток. Другие нарушения, поддающиеся лечению способами по настоящему изобретению, включают нарушение сна, например приступы апноэ во сне, и нарушения, возникающие во время путешествий/субарахноидальные и аневризматические кровотечения, гипотензивный шок, сотрясение мозга, септический шок, анафилактический шок и осложнения после разных энцефалитов и менингитов, например, вызванный энцефалитом коллагеноз, такой как волчанка. Другие применения включают профи
- 15 007967 лактику или защиту от отравления нейротоксинами, такими как домоевая кислота моллюсков, нейролатиризма и болезни Гуама, амиотрофического латерального склероза и болезни Паркинсона, послеоперационного эмболического или ишемического поражения, облучения головного мозга, серповидноклеточного криза и эклампсии.
Другая группа заболеваний, поддающихся лечению способами по настоящему изобретению, включает митохондриальную дисфункцию наследственного или приобретенного типа, которая является причиной разных неврологических заболеваний, обусловленных поражением или гибелью нейронов. Например, болезнь Лея (вызывающая некроз подострая энцефалопатия) характеризуется прогрессирующей потерей зрения, энцефалопатией вследствие гибели нейронов и миопатией. В таких случаях неправильный метаболизм митохондрии не обеспечивает достаточную высокоэнергетическую питательную среду для стимуляции обмена в возбуждаемых клетках. Модулятор активности рецептора эритропоэтина оптимизирует нарушенную функцию в целом ряде болезней митохондрии. Как указывалось выше, гипоксия оказывает вредное влияние на возбуждаемые ткани. К возбуждаемым тканям относятся, не ограничиваясь ими, ткани центральной нервной системы, периферической нервной системы и сердца. Помимо вышеописанных заболеваний способы по настоящему изобретению пригодны для лечения отравления вдыхаемым газом, таким как угарный газ и дым, астматического состояния, респираторного дистресссиндрома взрослых, удушения и утопления. Другие нарушения, вызывающие гипоксию или поражения возбуждаемой ткани, включают гипогликемию, которая может возникнуть при неправильном дозировании инсулина или под действием инсулинпродуцирующих опухолей (инсулинома).
Способами по настоящему изобретению можно лечить разные нейропсихологические расстройства, которые, как известно, возникают в результате поражения возбуждаемой ткани. Хронические нарушения, обусловленные поражением нейронов и подлежащие лечению способами по настоящему изобретению, включают заболевания центральной и/или периферической нервной системы, в том числе возрастную утрату познавательной способности и старческое слабоумие, хронические припадки, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, слабоумие, потерю памяти, амиотрофический латеральный склероз, рассеянный склероз, туберозный склероз, болезнь Вильсона, корковый и прогрессирующий наднуклеарный паралич, болезнь Гуама, паралитическое слабоумие Леви, предшествующие заболевания, такие как губчатая энцефалопатия, например, болезнь Крейтцфельда-Якоба, болезнь Хантингтона, миотоническая дистрофия, наследственная атаксия Фридрайха и другие атаксии, а также синдром Жилль де ла Туретта, припадки, такие как эпилепсия и хронические припадки, инсульт, травму головного или спинного мозга, слабоумие, вызванное СПИДом, алкоголизм, аутизм, ишемию сетчатки, глаукому, нарушения функций вегетативной нервной системы, таких как гипертензия и нарушения сна, и нейропсихиатрические расстройства, которые включают, не ограничиваясь ими, шизофрению, шизоаффективное расстройство, ослабление внимания, дистимию, депрессию, маниакальный синдром, навязчиво-компульсивное состояние, нарушения, вызванные психотропными средствами, беспокойство, паническое состояние, а также униполярные и биполярные аффективные расстройства. Дополнительные нейропсихиатрические и нейродегенеративные нарушения включают, например, болезни, приведенные в Диагностическом и статистическом справочнике психических заболеваний (Ό8Μ) Американской психиатрической ассоциации, самое последнее издание которого полностью включено в данное описание изобретения в качестве ссылки.
В другом варианте осуществления изобретения рекомбинантные химерные молекулы токсина, включающие эритропоэтин, можно использовать для терапевтического ввведения токсинов с целью лечения пролиферативных заболеваний, таких как рак, или вирусных инфекций, таких как подострый склерозирующий лейкоэнцефалит.
В нижеследующей таблице приведены дополнительные типичные, не ограничивающие объем изобретения показания для лечения вышеописанным эритропоэтином разных нарушений и заболеваний.
Клетка, ткань или орган Дисфункция или патология Нарушение или заболевание Тип
Сердце Ишемия Заболевание коронарной артерии Острое, хроническое, стабильное, нестабильное
Инфаркт миокарда Синдром Дресслера
Стенокардия
Врожденный порок сердца Вальвулярная кардиомиопатия
Стенокардия Принцметала
Разрыв миокарда Аневризматичес кая септальная перфорация
Ангиит
- 16 007967
Аритмия Тахиаритмия, брадиаритмия, надвентрикуляр ная, вентрикул ярная, нарушения проводимости Стабильная, нестабильная, гиперчувствите льный синуснокаротидный узел
Застойная сердечная недостаточность Левосторонняя, правосторонняя, бивентрикулярн ая Кардиомиопатия, в частности, идеопатическая семейная, инфекционная, метаболическая, болезнь накопления, недостаточность, коллагеноз, инфильтрация и гранулематоз, нейроваскулярная
Миокардит аут оиммунный, инфекционный, идиопатический
Заболевание легочной артерии
Закрытая и открытая травма
Токсины Кокаин
Сосуды Гипертензия Первичная, вторичная
Декомпрессионн ая болезнь
Фиброзномышечная гиперплазия
Аневризма Расслаивающая, разорванная, увеличивающаяся
Легкие Обструкция Астма, хронический бронхит, эмфизема и обструкция дыхательных путей
Ишемическая болезнь легких Эмболия легких, тромбоз легких, жировая эмболия
Болезни легких, вызываемые загрязнением окружающей среды
Ишемическая болезнь легких Эмболия легких, тромбоз легких
Коллагеноз легких Идиопатический фиброз легких
Врожденная болезнь легких Муковисцидоз
Заболевание легочной артерии
Травма
Пневмония и пневмонит Инфекционная, паразитическая, токсическая, травматическая, ожоговая, аспирационная
Саркоидоз
- 17 007967
Поджелудочная железа Эндокринный синдром Сахарный диабет типа I и II Поражение и дисфункция бета-клеток, диабетическая невропатия
Другие поражения эндокринных клеток поджелудочной железы
Экзокринный синдром Поражени экзокринных клеток поджелудочной железы Панкреатит
Кость Нарушение остеогенеза Первичное, вторичное Гипогонадизм, неподвижность, постклимактери ческое, возрастное, гиперпаратиреоз, гипертиреоз, недостаточность кальция, магния, фосфора и/или витамина ϋ
Остеомиелит
Некроз сосудов
Травма
Болезнь Педжета
Кожа Алопеция Гнездная, общая Первичная, вторичная, мужская алопеция
Витилиго Локальная, генерализованн ая форма Первичное, вторичное
Диабетическая язва
Заболевание периферических сосудов
Ожоги
Аутоиммунные заболевания Волчанка, эритема, болезнь Сиогрена, ревматоидный артрит, гломерулонефрит, ангиит
Гистиоцитоз Лангерана
Глаз Неврит зрительного нерва
Закрытые и открытые травмы, инфекции, саркоид, серповидноклеточная анемия, отслоение сетчатки, т емп ор ал ь ный артерит
Заболения эмбриона и плода Асфиксия
Ишемия
- 18 007967
Центральная нервная система Синдром хронической усталости, острый и хронический гипоосмолярный и гиперосмоляр ный синдромы, спид, слабоумие, смертельная электротравма
Энцефалит
Менингит
Субдуральная гематома
Никотиновая зависимость
Привыкание к наркотическим средствам и синдром отмены
Навязчивокомпульсивное состояние
Стеноз позвоночника, миелит поперечного отростка - позвонка, болезнь Гиллиана Барре, травма, сдавление нервного корешка, сдавление опухоли, тепловой удар
Ухо, горло, нос Шум в ушах, синдром Меньера, потеря слуха
Травма, баротравма
Почка Почечная недостаточность
Пурпура Геноха
Поперечнополосатая мышца Аутоиммунные заболевания
Миопатия
Тепловой удар
Бешенство, герпес
Кокаин, героин, крэк, марихуана, ЪЗБ, РСР, употребление нескольких наркотических средств, экстази, опиоиды, седативные снотворные средства, амфетамины, кофеин
Острая, хроническая Сосудистая/ише мическая, болезнь интерстициальн ой ткани, диабетическая болезнь почки, нефротические синдромы, инфекционные заболевания
Миастения, дерматомиозит, полимиозит
Наследственная, метаболическая, эндокринная и токсическая
- 19 007967
Разрывная травма
Острый некроз скелетных мышц
Болезнь митохондрии
Инфекционное заболевание
Половая система Центральная и периферическая нервная система
Печень Гепатит
Ишемическая болезнь
Цирроз, жировая инфиль трация печени
Инфиль трирующи е/метаболическ ие болезни
Желудочнокишечный тракт Ишемическая болезнь кишечника
Воспаление кишечника
Некротический энтероколит
Трансплантация органов Лечение донора и реципиента
Половые пути Бесплодие
Эндокринная железа Гипер- и гипофункция железы
Некротический фасцит
Импотенция вследствие лекарственного лечения
Вирусный, бактериальный, паразитический
Сосудистые, аутоиммунные болезни, заболевания матки, имплантация
Как указывалось выше, приведенные заболевания, нарушения или состояния служат только для иллюстрации преимуществ, предоставляемых эритропоэтинами по настоящему изобретению. Таким образом, данное изобретение относится к лечению или профилактике последствий механических травм или болезней. Предпочтение отдается лечению или профилактике заболеваний, нарушений или состояний центральной и/или периферической нервной системы. Возможно лечение или профилактика заболеваний, нарушений или состояний с психиатрическими симптомами. Данное изобретение относится к лечению или профилактике заболеваний, нарушений или состояний, которые включают, не ограничиваясь ими, глазные, сердечно-сосудистые, сердечно-легочные и респираторные заболевания, болезни почек и мочеполовой системы, желудочно-кишечные заболевания, нарушения функций желез внутренней секреции и обмена вещества.
В одном варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию, содержащую эритропоэтин, можно вводить системно для защиты или усиления клеток-мишеней, ткани или органа. Такую композицию можно вводить парентерально, путем ингаляции или через слизистую оболочку, например, перорально, назально, ректально, интравагинально, под язык, под слизистую оболочку или чрескожно. Предпочтительным является парентеральное введения, например, в виде внутривенных или внутрибрюшинных инъекциий, которое также включают, не ограничиваясь ими, внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное и подкожное введение.
Для других способов введения, предполагающих инъекции перфузионного раствора в орган, или для других видов местного применения получают фармацевтическую композицию, содержащую вышеуказанное количество эритропоэтина. Предпочтительное количество составляет около 15 пМ-30 нМ.
Фармацевтические композиции по данному изобретению могут содержать терапевтически эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления изобретения термин фармацевтически приемлемый означает вещество, которое утвержде
- 20 007967 но контролирующим органом федерального правительства или правительства штата, включено в фармакопею США или другую широко известную иностранную фармакопею и рекомендовано для введения животным, в частности, человеку. Термин носитель означает разбавитель, адъювант, наполнитель или растворитель, вместе с которым вводят лекарственное средство. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, например солевыми растворами в воде и маслах, включая вазелин, животного, растительного или синтетического происхождения, в частности, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобные. Солевой раствор является предпочтительным носителем при внутривенном введении фармацевтической композиции. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина можно также использовать в качестве жидких носителей, в частности, для получения инъекционных растворов. Приемлемыми фармацевтическими наполнителями являются крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, вода, этанол и тому подобные. При желании композиция может также содержать незначительные количества увлажнителей, эмульгаторов или рН-регулирующих буферных агентов. Указанные композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов пролонгированного действия и тому подобных. Композиция может быть получена в виде суппозитория с использованием известных связывающих веществ и носителей, таких как триглицериды. Соединения по данному изобретению могут быть получены в виде нейтральных веществ или солей. Фармацевтически приемлемые соли включают те, которые могут быть получены с использованием свободных аминогрупп, связанных с хлористо-водородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной и других кислот, а также с использованием свободных карбоксильных групп, связанных с натрием, калием, аммонием, кальцием, гидратами окиси железа, изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т.д. Примеры приемлемых фармацевтических носителей приведены в работе ΒοιηίηβΙοη'δ РЬаттасеиЬса1 8с1еисе5 Ьу Е.^. МатЬи. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения предпочтительно в очищенной форме вместе с приемлемым количеством носителя в форме, приемлемой для введения нуждающемуся субъекту. Препарат должен соответствовать способу введения.
Фармацевтические композиции, предназначенные для перорального введения, могут быть получены в виде капсул или таблеток, порошков или гранул, растворов, сиропов или суспензий (в водных или неводных жидкостях), съедобной пены, кремов или эмульсий. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут содержать лактозу, крахмал или их производные, стеарат магния, натрий-сахарин, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислоту или их соли. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Растворы и сиропы могут содержать воду, полиолы и сахара.
Активное вещество, предназначенное для перорального введения, может быть покрыто оболочкой или смешано с веществом, замедляющим дезинтеграцию и/или абсорбцию активного вещества в желудочно-кишечном тракте (например, можно использовать глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат). Таким образом можно обеспечить медленное высвобождение активного вещества в течение многих часов, и при необходимости активное вещество может быть защищено от разложения в желудке. Фармацевтические композиции, предназначенные для перорального введения, могут иметь состав, облегчающий высвобождение активного вещества в определенном месте желудочно-кишечного тракта благодаря определенному показателю рН или ферментативным условиям.
Фармацевтические композиции, предназначенные для чрескожного введения, могут быть получены в виде отдельных наклеек, остающихся в тесном соприкосновении с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени.
Фармацевтические композиции, предназначенные для местного применения, могут быть получены в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, распыляемых растворов, аэрозолей или масел. Для местного применения на коже, во рту, глазу или других наружных тканях предпочтительно используют мазь или крем. Для получения мази активный ингредиент можно объединять с парафиновой или смешивающейся с водой мазевой основой. Альтернативно, активный ингредиент может быть получен в виде крема с основой масло-в-воде или основой вода-в-масле Фармацевтические композиции, предназначенные для местного введения в глаз, включают глазные капли. В указанных композициям активный ингредиент может быть растворен или суспендирован в приемлемом носителе, например, в водном растворителе. Фармацевтические композиции, предназначенные для местного введения в ротовой полости, включают лепешки, пастилки и жидкости для полоскания рта.
Фармацевтические композиции, предназначенные для введения в нос и легкие, могут содержать твердые носители, такие как порошки (предпочтительно с размером частиц в диапазоне от 20 до 500 мкм). Указанные порошки можно вводить, вдыхая через нос, т. е. путем быстрого вдыхания через нос из емкости с порошком, которую держат рядом с носом. Альтернативно, композиции, предназначенные для введения в нос, могут содержать жидкие носители и представлять, например, распыляемые растворы или капли в нос. Прямую ингаляцию легких можно производить путем глубокого вдыхания через наконечник в ротовую часть глотки. Данные композиции могут содержать водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции, предназначенные для ингаляции, могут находиться в специальных устройст
- 21 007967 вах, включающих, не ограничиваясь ими, аэрозольные устройства, распылители или инсуффляторы, конструкция которых обеспечивает подачу заранее определенных доз активного ингредиента. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции по данному изобретению вводят непосредственно в носовую полость или легкие через носовую полость или ротовую часть глотки.
Фармацевтические композиции, предназначенные для ректального введения, могут быть получены в виде суппозиториев или клизм. Фармацевтические композиции, предназначенные для вагинального введения, могут быть получены в виде вагинальных суппозиториев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или распыляемых растворов.
Фармацевтические композиции, предназначенные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы или суспензии, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические факторы и растворенные вещества, которые делают указанные композиции изотоничными крови предполагаемого реципиента. Другими компонентами, которые могут присутствовать в таких композициях, являются вода, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Композиции, предназначенные для парентерального введения, могут находиться в емкостях, содержащих одну или несколько доз, например, в запаянных ампулах или флаконах, при этом они могут быть высушены вымораживанием (лиофилизованы) и требовать добавления стерильного жидкого носителя, например, стерильного солевого раствора для инъекций непосредственно перед применением. Инъекционные растворы и суспензии для немедленного введения можно получить из стерильных порошков, гранул и таблеток. Один вариант осуществления изобретения относится к аутоинъектору, содержащему инъекционный раствор эритропоэтина, который предназначен для использования в автомобилях скорой медицинской помощи, кабинетах неотложной помощи или полевых госпиталях, а также для самостоятельного введения в домашних условиях, особенно при возникновении опасности ампутации после травмы, например, при неправильном использовании газонокосилки.
Вероятность выживания клеток и тканей в травмированной стопе или пальце стопы после реплантации можно увеличить, если как можно быстрее ввести эритропоэтин в несколько мест травмированной конечности еще до прибытия медицинского персонала на место происшествия или поступления субъекта с травмой пальца стопы в кабинет неотложной помощи.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композицию получают обычными способами в виде фармацевтической композиции, предназначенной для внутривенного введения человеку. Композиции для внутривенного введения обычно представляют растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости такая композиция может также содержать солюбилизатор и местный анестетик, такой как лидокаин, для уменьшения боли в месте инъекции. Ингредиенты такой композиции поставляют отдельно или смешивают с получением дозированной лекарственной формы, например, в виде сухого лиофилизованного порошка или не содержащего воды концентрата в герметично запаянной емкости, такой как ампула, или саше, с указанием количества активного вещества. Композицию, предназначенную для введения путем инфузии, можно приобрести вместе с флаконом для инфузии, содержащим стерильную воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Для введения композиции путем инъекции можно использовать ампулу со стерильным физиологическим раствором и смешать ингредиенты непосредственно перед применением.
Суппозитории обычно содержат активный ингредиент в количестве 0,5-10 мас.%; препараты для перорального введения предпочтительно содержат 10-95% активного ингредиента.
Перфузионную композицию можно использовать в ваннах с трансплантируемым органом для перфузии ίη δίΐιι или для введения в сосудистую сеть донора до удаления органа. Такие фармацевтические композиции могут содержать эритропоэтин в количестве или форме, не приемлемой для неотложного или регулярного, местного или системного введения нуждающемуся субъекту, но выполняют функции, необходимые для сохранения трупа, обработки органа в ванне, введения перфузионного раствора в орган или перфузии ίη δίΐιι до удаления органа или снижения в нем уровней эритропоэтина перед возвратом обработанного органа или ткани в нормальное кровообращение. Для указанной цели можно использовать любой эритропоэтин, в частности, природные формы, такие как эритропоэтин человека, или любые вышеописанные эритропоэтины, такие как асиалоэритропоэтин или фенилглиоксальэритропоэтины, которые приведены в качестве неограничивающих примеров.
В объем данного изобретения входит фармацевтический комплект или набор, включающий одну или несколько емкостей, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по данному изобретению. К таким емкостям может прилагаться уведомление правительственного агентства по контролю за производством, применением или продажей лекарственных препаратов или биологических продуктов, в котором подтверждается безопасность изготовления, применения или продажи данного препарата для введению человеку.
В другом варианте осуществления изобретения эритропоэтин можно вводить в системе с регулируемым высвобождением. Например, полипептид можно вводить при помощи внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, чрескожной наклейки, липосом или других способов введения. В одном варианте осуществления изобретения можно использовать насос (см. Еаидег, кирга; Бейот, 1987, СКС Сгб. Кей. Вютеб. Εη§. 14:201; Βι.ιο1ι\ν;·ι16 е! а1., 1980, Бигдегу 88:507; Баибек е! а1., 1989, Ν. Εη§1. 1.
- 22 007967
Меб. 321:574). В другом варианте осуществления изобретения соединение можно вводить в везикулах, например, в липосомах (см. Бапдет, 8с1епсе 249:1527-1533 (1990); Тгеа1 е( а1., ίη Б1розотез ίη (Не Тйегару оГ 1пГес1юиз И1зеазе апб Сапсег, Борех-ВегезЮш апб Б1б1ег (ебз.), Б1зз, №\ν Уотк, рр. 353-365 (1989); АО 91/04014; патент США № 4704355; Борех-Верез^т, 1Ь1б., рр. 317-327; см. там же). В другом варианте осуществления изобретения можно использовать полимерные материалы (см. Меб1са1 АррНса11опз оГ Соп1го11еб Ре1еазе, Бапдет апб А1зе (ебз.), СРС Ргезз: Воса РаЮп. Нопба. 1974; Соп1го11еб Итид В1оауа11аЬ|Н1у. Итид Ргобис! Иез1дп апб РегГогтапсе, 8то1еп апб Ва11 (ебз.), Абеу: Ыете Уогк (1984); Рапдег апб Рерраз, ί. Масгото1. 8ск Кет. Масгото1. Сйет. 23:61, 1953; см. также Беуу е( а1., 1985, 8аепсе 228:190; Иигтд е( а1., 1989, Апп. №иго1. 25:351; Но\тагб е( а1., 1989, 1. Иеигозигд. 71:105).
В другом варианте осуществления изобретения система с регулируемым высвобождением активного ингредиента может быть размещена в непосредственной близости от объекта лечения, то есть клетокмишеней, ткани или органа, благодаря чему необходима только часть системно вводимой дозы (см., например, Оообзоп, рр. 115-138 ш Меб1са1 Аррйсабопз оГ Соп1го11еб Ре1еазе, уо1. 2, зирга, 1984). Другие системы с регулируемым высвобождением описаны Лангером (Бапдет, 1990, 8с1епсе 249:1527-1533).
В другом варианте осуществления изобретения эритропоэтин в составе соответствующего препарата можно вводить в нос, орально, ректально, вагинально или под язык.
В частном варианте осуществления изобретения может быть желательно местное применение эритропоэтинсодержащей композиции по данному изобретению путем нанесения на требующий лечения участок тела; в качестве неограничивающих примеров такого применения можно привести местную инфузию во время хирургической операции, местное применение, например, вместе с повязкой на рану после хирургической операции, а также введение в виде инъекции, при помощи катетера, в виде суппозитория или имплантата, причем указанный имплантат может быть пористым, непористым или желатинообразным веществом, включая мембраны, например, изготовленные из силастика, или волокна.
Предпочтительную эффективную дозу определяет специалист в данной области с учетом хорошо известных факторов. Такие факторы включают конкретную форму эритропоэтина и его фармакокинетические параметры, такие как биологическая доступность, метаболизм, полупериод существования и т.д., которые должны быть определены во время выполнения обычных процедур, используемых для получения разрешения на использование фармацевтическое соединения. Другие факторы, учитываемые при определении дозы, включают медицинские показатели конкретного нарушения или заболевания или предполагаемую пользу для нуждающегося субъекта, массу тела субъекта, способ введения, регулярность введения, сопутствующие лекарственные средства и другие факторы, которые, как известно, влияют на эффективность вводимых фармацевтических средств. Таким образом, точная доза должна быть определена лечащим врачом с учетом показателей нуждающегося субъекта, например, в зависимости от состояния и иммунного статуса пациента, в соответствии со стандартными клиническими методами.
Другим объектом данного изобретения является перфузат или перфузионный раствор, предназначенный для перфузии и хранения органов для трансплантации, который содержат эритропоэтин в количестве, достаточном для защиты эритропоэтинреактивных клеток и сопутствующих клеток, тканей или органов. Трансплантация включает, не ограничиваясь ею, ксенотрансплантацию, когда орган (включая клетки, ткань или другую часть тела) берут у донора и трансплантируют другому реципиенту; и аутотрансплантацию, когда орган берут из одной части тела и переносят в другую часть тела, включая хирургическое вмешательство, во время которого орган удаляют, подвергают резекции ех угуо, устраняют имеющийся дефект или производят какие-либо другие манипуляции, например, удаляют опухоль, и затем возвращают в первоначальное положение. В одном варианте осуществления изобретения перфузионный раствор является раствором, получаемым в Университете штата Висконсин (БА) (патент США № 4798824), который содержит от около 1 до около 25 Ед/мл эритропоэтина, 5% гидроксиэтилкрахмала (имеющего молекулярную массу от около 200000 до около 300000 и практически не содержащего этиленгликоля, этиленхлоргидрина, хлорида натрия и ацетона); 25 мМ КН2РО4; 3 мМ глутатиона; 5 мМ аденозина; 10 мМ глюкозы; 10 мМ буфера на основе НЕРЕ8; 5 мМ глюконата магния; 1,5 мМ СаС12; 105 мМ глюконата натрия; 200000 единиц пенициллина; 40 единиц инсулина; 16 мг дексаметазона; 12 мг фенолового красного; имеет рН 7,4-7,5 и осмолярность около 320 мО8т/л. Указанный раствор используют для сохранения трупных почек и поджелудочных желез до трансплантации. Используя данный раствор, время хранения можно увеличить сверх 30-часового предела, рекомендуемого для хранения трупной почки. Указанный перфузат приведен только в качестве иллюстрации целого ряда таких растворов, которые могут быть приведены в соответствие с настоящим изобретением в результате введения эффективного количества эритропоэтина. В другом варианте осуществления изобретения перфузионный раствор содержит от около 5 до около 35 Ед/мл эритропоэтиина или от около 10 до около 30 Ед/мл эритропоэтина. Как указывалось выше, при осуществлении данного варианта изобретения можно использовать любую форму эритропоэтина.
Хотя предпочтительным реципиентом эритропоэтина для достижения описанных здесь целей считается человек, указанные способы в равной степени относятся к другим млекопитающим, в частности, к домашним животным, крупному рогатому скоту, комнатным животным и животным, содержащимся в зоопарке. Однако данное изобретение не ограничивается указанными животными и может быть полезным для любого млекопитающего.
- 23 007967
В соответствии с другими объектами применения изобретения ех νίνο можно использовать любой эритропоэтин, не ограничиваясь вышеописанными эритропоэтинами, а также нативные эритропоэтины и их аналоги, миметик эритропоэтина, фрагмент эритропоэтина, гибридную молекулу эритропоэтина, молекулу, связывающуюся с рецептором эритропоэтина, агонист эритропоэтина, почечный эритропоэтин, эритропоэтин головного мозга, его олигомер, мультимер, мутеин, родственную форму, природную форму, синтетическую форму, рекомбинантную форму, гликозилированный вариант, дегликозилированный вариант или комбинацию указанных форм.
Другим объектом данного изобретения являются способы и композиции для усиления жизнеспособности клеток, тканей или органов, которые не отделены от сосудистой сети барьером из эндотелиальных клеток, поэтому клетки, ткани или органы подвергают непосредственному воздействию фармацевтической композиции, содержащей эритропоэтин, или вводят содержащую эритропоэтин фармацевтическую композицию в сосудистую сеть ткани или органа. Повышенная активность эритропоэтинреактивных клеток в подвергаемой лечению ткани или органе оказывает положительное действие.
Как описывалось выше, в основе данного изобретения, по крайней мере частично, лежит открытие того, что молекулы эритропоэтина могут перемещаться с люминальной поверхности к внутренней поверхности мембраны эндотелиальных клеток капилляров органов с плотными соединениями эндотелиальных клеток, включающих, например, головной мозг, сетчатку и яичко. Таким образом, эритропоэтинреактивные клетки, расположенные позади барьера, являются восприимчивыми мишенями для благоприятного воздействия эритропоэтина, а вместе с ними и другие типы клеток, тканей или органов, которые содержат эритропоэтинреактивные клетки или зависят от них полностью или частично, также являются объектами для применения способов по настоящему изобретению. Не ограничиваясь какими-либо теоретическими положениями, можно отметить, что после трансцитоза эритропоэтин может взаимодействовать с рецептором эритропоэтина на эритропоэтинреактивной клетке, такой как клетка нейрона, сетчатки, мышцы, сердца, легкого, печени, почки, тонкого кишечника, коркового вещества надпочечника, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичка, яичника или эндометрия, при этом связывание с рецептором инициирует путь передачи сигнала, благодаря чему активируется программа экспрессии гена в эритропоэтинреактивной клетке или ткани, что вызывает защиту клетки, ткани или органа от поражения токсинами, химиотерапевтическими средствами, лучевой терапией, гипоксии и т.д. Способы защиты ткани, содержащей эритропоэтинреактивные клетки, от поражения или гипоксического стресса и усиления функции такой ткани подробно описаны ниже.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения млекопитающее подвергают воздействию системной химиотерапии для лечения рака, включая лучевую терапию, которая обычно оказывает вредное влияние на нервы, легкие, сердце, яичник или яичко. Фармацевтическую композицию, содержащую описанный выше эритропоэтин, вводят до и во время химиотерапии и/или лучевой терапии для защиты разных тканей и органов от поражения химиотерапевтическим средством, например, для защиты яичек. Лечение можно продолжать до тех пор, пока концентрация химиотерапевтического средства в кровотоке не уменьшится ниже потенциально опасного уровня для организма млекопитающего.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения у жертвы автомобильной катастрофы удаляют разные органы для трансплантации нескольким реципиентам, причем некоторые органы необходимо транспортировать на значительное расстояние в течение длительного периода времени. До удаления органа жертву катастрофы инфузируют фармацевтической композицией, содержащей вышеописанный эритропоэтин.
Предназначенные для транспортировки органы перфузируют перфузатом, содержащим вышеописанный эритропоэтин, и хранят в ванне, содержащей эритропоэтин. Некоторые органы постоянно перфузируют при помощи перфузирующего устройства, используя перфузат, содержащий эритропоэтин по настоящему изобретению. Во время транспортировки, трансплантации и повторной перфузии органов ίη 811и происходит минимальное ухудшение функции органов.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения во время хирургической операции по восстановлению сердечного клапана необходима временная кардиоплегия и окклюзия артерии. До хирургической операции пациенту инфузируют 500 Ед эритропоэтина на кг массы тела. Такая процедура предотвращает гипоксическое и ишемическое поражение клеток, особенно после повторной перфузии.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения природный эритропоэтин или любой эритропоэтин по данному изобретению используют во время любой хирургической операции, например, с применением искусственного кровообращения. В одном варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию, содержащую вышеописанный эритропоэтин, вводят до, во время и/или после создания искусственного кровообращения для защиты головного мозга, сердца и других органов.
В приведенных выше примерах, в которых описано применение эритропоэтина по данному изобретению, в том числе природного эритропоэтина, ех νίνο или для воздействия на эритропоэтинреактивные клетки, такие как клетки нервной ткани, сетчатки, сердца, легкого, печени, почки, тонкого кишечника, коркового вещества надпочечника, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичка, яичника или эндометрия, фармацевтическую композицию используют в виде единичной дозированной формы, предназначенной для защиты или усиления эритропоэтинреактивных клеток, тканей или орга
- 24 007967 нов, отделенных от сосудистой сети, которая содержит эффективное нетоксичное количество активного ингредиента в пределах от около 50000 до 500000 единиц, от 60000 до 500000 единиц, от 70000 до 500000 единиц, от 80000 до 500000 единиц, от 90000 до 500000 единиц, от 100000 до 500000 единиц, от 150000 до 500000 единиц, от 200000 до 500000 единиц, от 250000 до 500000 единиц, от 300000 до 500000 единиц, от 350000 до 500000 единиц, от 400000 до 500000 единиц или от 450000 до 500000 единиц эритропоэтина, модулятор активности рецептора эритропоэтина или модулятор эритропоэтинактивируемого рецептора и фармацевтически приемлемый носитель. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эффективное нетоксичное количество эритропоэтина находится в пределах от около 50000 до 500000 единиц. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эритропоэтин в указанной композиции является неэритропоэтическим.
В соответствии с другим объектом данного изобретения установлено, что введение эритропоэтина восстанавливает познавательную функцию у животных с черепно-мозговой травмой. Даже при введении эритропоэтина через 5 или 30 дней после травмы происходит восстановление указанной функции по сравнению с контрольными животными, что свидетельствует о способности эритропоэтина регенерировать или восстанавливать активность головного мозга. Таким образом, данное изобретение относится также к применению эритропоэтина для получения фармацевтической композиции для лечения черепномозговых травм и других нарушений познавательной способности, включая лечение после травмы (например, через 3 дня, 5 дней, неделю, месяц или более длительный период времени). Данное изобретение относится также к способу лечения нарушения познавательной способности после травмы путем введения эффективного количества эритропоэтина. В соответствии с указанным объектом изобретения можно использовать любой вышеописанный эритропоэтин.
Данный объект изобретения относится к использованию любого эритропоэтина для получения фармацевтической композиции, предназначенной для восстановления дисфункции клетки, ткани или органа, при этом лечение начинают через значительный период времени после первоначального инсульта, вызвавшего указанное нарушение функции. Лечение эритропоэтином по данному изобретению можно производить на протяжении всего периода болезни от острой фазы до хронической фазы.
Если эритропоэтин по данному изобретению обладает эритропоэтической активностью, то в предпочтительном варианте осуществления изобретения эритропоэтин можно вводить системно в дозе от около 300 до около 10000 единиц/кг массы тела, предпочтительно около 500-5000 единиц/кг массы тела, наиболее предпочтительно около 1000 единиц/кг массы тела на одно введение. Указанная эффективная доза должна быть достаточной для достижения концентрации эритропоэтина в сыворотке выше примерно 10000, 15000 или 20000 мЕд/мл сыворотки после введения эритропоэтина. Такие уровни в сыворотке могут быть достигнуты примерно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ч после введения. При необходимости можно повторно ввести такие дозы. Например, лекарственное средство можно вводить ежедневно в течение всего клинически необходимого периода или через соответствующий интервал времени, например, через 1-12 недель, предпочтительно через 1-3 недели. В одном варианте осуществления изобретения эффективное количество эритропоэтина и фармацевтически приемлемый носитель могут находиться в ампуле на одну дозу или в другой емкости. В другом варианте осуществления изобретения эритропоэтин, используемый для указанных целей, является неэритропоэтическим, то есть он способен вызывать описанную активность, но не увеличивает концентрацию гемоглобина или гематокрита. Такая неэритропоэтическая форма эритропоэтина предпочтительна в случае постоянного использования способов по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления изобретения эритропоэтин вводят в дозе, превышающей необходимую дозу для максимульной стимуляции эритропоэза. Как указывалось выше, эритропоэтин по данному изобретению необязательно обладает эритропоэтической активностью, поэтому вышеуказанные дозы, выраженные в гематопозтических единицах, являются лишь иллюстративными для эритропоэтических эритропоэтинов; выше приведены молярные эквиваленты для доз, приемлемые для любого эритропоэтина.
Настоящее изобретение далее относится к способу облегчения переноса молекулы через барьер из эндотелиальных клеток у млекопитающего путем введения композиции, содержащей определенную молекулу, ассоциированную с вышеописанным эритропоэтином. Как было описано выше, плотные соединения между эндотелиальными клетками в некоторых органах тела создают барьер для прохождения определенных молекул. Для лечения разных заболеваний имеющего такой барьер органа необходимо средство, облегчающее прохождение лекарственных веществ. Эритропоэтин по данному изобретению является полезным носителем для доставки других молекул через гематоэнцефалический и другие подобные барьеры. Получают композицию, содержащую молекулу, предназначенную для прохождения через барьер вместе с эритропоэтином, благодаря чему при периферическом введении указанная композиция проходит через барьер. Переносимая через барьер молекула может быть ассоциирована с эритропоэтином при помощи неустойчивой ковалентной связи, поэтому после прохождения через барьер указанная молекула отсоединяется от эритропоэтина. Такой комплекс можно вводить, если требуемая фармакологическая активность молекулы сохраняется или не ухудшается при связывании с эритропоэтином.
Специалисту в данной области должны быть известны разные способы ассоциирования молекул с эритропоэтином по данному изобретению и другими вышеописанными веществами при помощи кова
- 25 007967 лентной, нековалентной и других типов связи; кроме того, эффективность такой композиции можно легко определить в экспериментальной системе. Молекулы можно ассоциировать с эритропоэтином разными способами, включающими неустойчивое ковалентное связывание, перекрестное сшивание и т.д. Можно использовать взаимосвязь биотин/авидин. Как указывалось выше, методами рекомбинантных ДНК или синтеза можно получить гибридную молекулу, содержащую, например, домен молекулы с требуемой фармакологической активностью и домен, ответственный за модуляцию активности рецептора эритропоэтина.
Молекула может быть сопряжена с эритропоэтином при помощи полифункциональной молекулы, то есть полифункционального поперечносшивающего агента. В используемом здесь значении, термин полифункциональная молекула означает молекулы, имеющие одну функциональную группу, которая может последовательно взаимодействовать несколько раз, такую как формальдегид, а также молекулы с несколькими реакционноспособными группами. В используемом здесь значении реакционноспособная группа означает функциональную группу поперечно-сшивающего агента, которая взаимодействует с функциональной группой молекулы (такой как пептид, белок, углеводород, нуклеиновая кислота, в частности гормон, антибиотик или противораковое средство, подлежащее переносу через барьер из эндотелиальных клеток) с образованием ковалентной связи между поперечно-сшивающим агентом и указанной молекулой. Термин функциональная группа имеет обычное значение, используемое в органической химии. Используемые полифункциональные молекулы предпочтительно являются биологически совместимыми сшивающими агентами, то есть они являются неканцерогенными, нетоксичными и по существу неиммуногенными ίη νίνο. Полифункциональные поперечно-сшивающие агенты, известные в данной области и рассмотренные в данном описании изобретения, можно легко испытать на животных моделях для определения их биологической совместимости. Полифункциональная молекула предпочтительно является бифункциональной. В используемом здесь значении термин бифункциональная молекула означает молекулу с двумя реакционноспособными группами. Бифункциональная молекула может быть гетеробифункциональной или гомобифункциональной. Гетеробифункциональный поперечно-сшивающий агент обеспечивает векторное сопряжение. Особенно предпочтительны полифункциональные молекулы, растворимые в воде в достаточной степени для осуществления поперечного сшивания в водных растворах, таких как забуференные водные растворы с рН 6-8, и позволяющие получить водорастворимый конъюгат для достижения более эффективного биологического распределения. Полифункциональная молекула обычно ковалентно связана с амино- или сульфгидрильной функциональной группой. Однако в объем настоящего изобретения входят также полифункциональные молекулы, взамодействующие с другими функциональными группами, такими как карбоновые кислоты или гидроксильные группы.
Гомобифункциональные молекулы имеют по крайней мере две одинаковые реакционноспособные функциональные группы. Реакционноспособные функцональные группы гомобифункцональной молекулы включают, например, альдегидные группы и активные сложноэфирные группы. Гомобифункциональные молекулы, имеющие альдегидные группы, включают, например, глутаральдегид и субаральдегид. Применение глутаральдегида в качестве поперечно-сшивающего агента описано в статье Рохпапхку с1 а1., 8с1епсе 223, 1304-1306 (1984). Гомобифункциональные молекулы, имеющие по крайней мере два активных сложноэфирных звена, включают сложные эфиры дикарбоновых кислот и Ν-гидроксисукцинимид. Некоторые примеры таких Ν-сукцинимидиловых сложных эфиров включают дисукцинимидилсуберат и дитиобис(сукцинимидилпропионат), растворимую биссульфоновую кислоту и биссульфонаты (соли), такие как натриевые и калиевые соли. Указанные гомобифункциональные реагенты можно приобрести в компании Р1егсе, КоскГогб, Ι11ίηοί§.
Гетеробифункциональные молекулы имеют по крайней мере две разные реакционноспособные группы. Указанные реакционноспособные группы взаимодействуют с разными функциональными группами, имеющимися, например, в эритропоэтине и молекуле. Две разные функциональные группы, взаимодействующие с реакционноспособной группой гетеробифункцонального поперечно-сшивающего агента, обычно представляют аминогруппу, например эпсилон-аминогруппу лизина; сульфгидрильную группу, например тиоловую группу цистеина; карбоновую кислоту, например карбоксилат аспарагиновой кислоты; или гидроксильную группу серина.
Разные молекулы эритропоэтина по данному изобретению могут не иметь реакционноспособных групп, пригодных для использования вместе с определенным поперечно-сшивающим агентом; однако, специалисту в данной области должно быть известно о возможности выбора поперечно-сшивающих агентов на основании групп для поперечного сшивания, имеющихся в эритропоэтине по настоящему изобретению.
Образуемая реакционноспособной группой гетеробифункциональной молекулы ковалентная связь с аминогруппой обычно является амидной или имидной связью. Реакционноспособная группа, образующая ковалентную связь с аминогруппой, может представлять, например, активированную карбоксилатную группу, галогенкарбонильную группу или сложноэфирную группу. Предпочтительной галогенкарбонильной группой является хлоркарбонильная группа. Сложноэфирные группы предпочтительно являются реакционноспособными сложноэфирными группами, такими как, например, сложноэфирная группа Ν-гидроксисукцинимида.
- 26 007967
Другая функциональная группа обычно является тиоловой группой, группой, превращаемой в тиоловую группу, или группой, образующей ковалентную связь с тиоловой группой. Ковалентная связь обычно является тиоэфирной связью или дисульфидом. Реакционноспособная группа, образующая ковалентную связь с тиоловой группой, может представлять двойную связь, которая взаимодействует с тиоловыми группами или активированным дисульфидом. Реакционноспособная группа, содержащая двойную связь, способную взаимодействовать с тиоловой группой, представляет малеимидогруппу, хотя возможны другие группы, такие как акрилонитрил. Реакционноспособная дисульфидная группа может представлять, например, 2-пиридилдитиогруппу или группу 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты). Некоторые примеры гетеробифункциональных реагентов, содержащих реакционноспособные дисульфидные связи, включают Ы-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (Саткзои, е1 а1., 1978, Вюсйет. 1.. 173:723-737), 8-4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метилбензилтиосульфат натрия и 4-сукцинимидилоксикарбонилальфа-метил(2-пиридилдитио)толуол. Предпочтительным является Ы-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат. Некоторые примеры гетеробифункциональных реагентов, содержащих реакционноспособные группы с двойной связью, взаимодействующие с тиоловой группой, включают сукцинимидил-4-(Ымалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат и сукцинимидил-м-малеимидобензоат.
Другие гетеробифункциональные молекулы включают сукцинимидил-3-(малеимидо)пропионат, сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират, сульфосукцинимидил-4-(Ы-малеимидометилциклогексан)1-карбоксилат, сложный эфир малеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимида. Предпочтительным является сульфонат натрия сукцинимидил-м-малеимидобензоата. Многие вышеуказанные гетеробифункциональные реагенты и их сульфонаты можно приобрести в компании Р1егсе Сйетка1 Со., КоскГогб, ΙΙΙίηοίδ, И8А.
Специалист в данной области может легко определить потребность в вышеописанных обратимых или неустойчивых конъюгатах. Конъюгат можно испытать ίη νίΙΐΌ на наличие эритропоэтина и требуемой фармакологической активности. Если конъюгат сохраняет оба свойства, его пригодность можно испытать ίη у1уо. Если сопряженная молекула требует отделения от эритропоэтина для восстановления активности, предпочтительна неустойчивая или обратимая связь с эритропоэтином. Характеристики неустойчивости можно также испытать при помощи стандартных методов ίη νίΙΐΌ до выполнения испытания ίη У1Уо.
Дополнительную информацию о получении и использовании указанных и других полифункциональных реагентов можно найти в нижеследующих и других научных публикациях, имеющихся в данной области:
Сат188ои, 1. е1 а1., 1978, Вюсйет. 1. 173:723-737.
СитЬет, кА. е1 а1., 1985, МеЙюбз ίη Вп/уто^ду 112:207-224.
1ие, В. е1 а1., 1978, Вюсйет 17:5399-5405.
8ии, Т.Т. с1 а1., 1974, Вюсйет. 13:2334-2340.
В1ай1ег, А.А. е1 а1., 1985, Вюсйет. 24:1517-152.
Ьш, Р.Т. е1 а1., 1979, Вюсйет. 18:690-697.
Уои1е, КД. аиб ЫеуШе, Ό.Μ. 1г., 1980, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8οΐ. И.8.А. 77:5483-5486.
Ьетет, К.А. е1 а1., 1981, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И.8.А. 78:3403-3407.
.Гиид, 8.М. аиб Мого1, М., 1983, Вюсйет. Вюрйуз. Ас1а 761:162.
Саи1Де1б, М.Р. е1 а1., 1984, Вюсйет. 81:7772-7776.
81аго5, IV., 1982, Вюсйет. 21:3950-3955.
Уозййаке, 8. е1 а1., 1979, Еиг. 1. Вюсйет. 101:395-399.
Уозййаке, 8. е1 а1., 1982, 1. Вюсйет. 92:1413-1424.
Р11сй, Р.Р. аиб С/есК, М.Р., 1979, 1. Вю1. Сйет. 254:3375-3381.
Ыоуюк, Ό. е1 а1., 1987, 1. Вю1. Сйет. 262:8483-8487.
ЬотаШ, АД. аиб РаДЬаикз, О., 1976, 1. Мо1. Вю1. 104:243-261.
Натаба, Н. аиб Тзигио, Т., 1987, Аиа1. Вюсйет. 160:483-488.
НазЫба, 8. е1 а1., 1984, 1. АррБеб Вюсйет. 6:56-63.
Кроме того, методы сшивания рассмотрены в статье Меаиз аиб Рееиеу, 1990, Вюсоищда1е Сйет. 1:2-12.
Барьеры, преодолеваемые при помощи вышеописанных способов и композиций по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, гематоэнцефалический барьер, гематоофтальмический барьер, гематотестикулярный барьер, гематоовариальный барьер и гематоплацентарный барьер.
Приемлемыми молекулами для переноса через барьер из эндотелиальных клеток являются, например, гормоны, такие как гормон роста, нейротрофические факторы, антибиотики или противогрибковые средства, которые обычно не достигают головного мозга или других защищенных барьером органов, пептидные радиофармацевтические средства, антисмысловые лекарственные средства, антитела против биологически активных веществ, фармацевтические препараты и противораковые средства. Неограничивающие примеры таких молекул включают гормон роста, фактор роста нервов (ΝΘΡ), выделенный из головного мозга нейротрофический фактор (ΒΟΝΕ), мерцательный нейротрофический фактор (СЫТР), основной фактор роста фибробластов (ЬРСР), трансформирующий фактор роста β1 (Т6рр1), трансформирующий фактор роста β2 (Т6Рв2), трансформирующей фактор роста β3 (Т6Рв3), интерлейкин 1, ин
- 27 007967 терлейкин 2, интерлейкин 3 и интерлейкин 6, ΑΖΤ, антитела против фактора опухолевого некроза и иммуносупрессивные средства, такие как циклоспорин.
Настоящее изобретение относится также к композиции, содержащей молекулу, переносимую при помощи трансцитоза через барьер с плотным соединением эндотелиальных клеток, и вышеописанный эритропоэтин. Данное изобретение далее относится к применению конъюгата между молекулой и вышеописанным эритропоэтином для получения фармацевтической композиции, предназначенной для переноса указанной молекулы через вышеописанный барьер.
Настоящее изобретение станет более очевидным со ссылкой на нижеследующие неограничивающие примеры, которые служат для иллюстрации данного изобретения. Нижеследующие примеры приведены для более полной иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления данного изобретения. Однако они не ограничивают широкий объем изобретения.
Пример 1. Прохождение эритропоэтина через плотный гематоцереброспинальный барьер.
Взрослых самцов крыс 8ргадие-Эа^1еу анестезируют и вводят им внутрибрюшинно рекомбинантный эритропоэтин человека. Пробы цереброспинальной жидкости берут из большой полости с 30минутными интервалами в течение 4 ч и определяют концентрацию эритропоэтина при помощи чувствительного и специфичного иммуноферментного анализа с аффинной хроматографией. Как показано на фиг. 1, исходная концентрация эритропоэтина в цереброспинальной жидкости (С8Р) равна 8 мЕд/мл. Через несколько часов уровни эритропоэтина, измеренные в С8Р, начинают повышаться и через 2,5 ч и позже существенно отличаются от исходной концентрации на уровне р<0,01. Максимальный уровень, равный примерно 100 мЕд/мл, находится в пределах диапазона, который, как известно, оказывает защитное действие ίη νίΐΓΟ (0,1-100 мЕд/мл). Время достижения максимальной концентрации составляет примерно 3,5 ч, что значительно отличается от достижения максимальных уровней в сыворотке (менее 1 ч). Результаты данного эксперимента показывают, что значительное количество эритропоэтина может проникать через плотное соединение клеток в результате парентерального введения эритропоэтина в виде болюса с соответствующей концентрацией.
Пример 2. Сохранение функции сердца, подготовленного к трансплантации.
Самцам крыс ХУШаг с массой тела 300-330 г вводят эритропоэтин (5000 Ед/кг массы тела) или носитель за 24 ч до удаления сердца для выполнения исследования ех νΐνο, производимого в соответствии с описанием, приведенным в статье Эе1сауге е1 а1., 1992, Атег. ί. Р11У5ю1. 263:Н1537-45. Животных умерщвляют пентобарбиталом (0,3 мл) и вводят внутривенно гепарин (0,2 мл). Сначала сердце уравновешивают в течение 15 мин. Баллонный катетер для левого желудочка надувают до объема, обеспечивающего конечное диастолическое давление, равное 8 мм Нд. Строят кривую зависимости давление-объем для левого желудочка, увеличивая объем баллонного катетера в виде приращений, равных 0,02 мл аликвотам. Нулевой объем определяют в виде точки, в которой конечное диастолическое давление в левом желудочке равно нулю. После построения кривой зависимости давление - объем баллонный катетер для левого желудочка сдувают, возвращая конечное диастолическое давление к 8 мм Нд, и после проверки кровотока в коронарной артерии устанавливают 15-минутный контрольный период. Затем работу сердца прекращают при помощи 50 мл Се18юг+то1еси1е и оставляют в состоянии покоя при 4°С под давлением 60 см Н2О. Сердце удаляют и хранят в течение 5 ч при 4°С в пластиковом контейнере, наполненном тем же раствором и окруженном дробленым льдом.
По окончании хранения сердце переносят в аппарат Лангендорфа. Баллонный катетер снова вводят в левый желудочек и надувают до объема, предшествующего ишемическому состоянию. Сердце перфузируют в течение по крайней мере 2 ч при 37°С. Повторную перфузию производят под давлением потока, равного 50 см Н2О, подаваемого в течение 15 мин, который увеличивают до 100 см Н2О в течение следующих 2 ч. Производят электрическую стимуляцию сердца (320 ударов в минуту). Изоволюметрические измерения индексов сокращения и диастолического давления выполняют по 3 раза во время повторной перфузии, выполняемой через 25, 45, 60, 120 мин. В указанный период времении строят кривые зависимости давление - объем и в течение 45 мин повторной перфузии собирают жидкость, вытекающую из коронарной артерии, для измерения утечки креатинкиназы. Результаты, полученные в двух экспериментальных группах, сравнивают при помощи непарного ΐ-критерия, и данные линейной регрессии, полученные с учетом конечного диастолического давления, используют для построения кривых диастолического расслабления желудочков сердца. Как показано на фиг. 2, показатели давления в левом желудочке значительно улучшаются после обработки эритропоэтином, при этом также улучшаются показатели кривой зависимости объем - давление, уменьшается диастолическое давление в левом желудочке и уменьшается утечка креатинкиназы.
Пример 3. Защита эритропоэтином миокарда от ишемического поражения.
Взрослых самцов крыс, которым предварительно вводили рекомбинантный эритропоэтин человека (5000 Ед/кг массы тела) за 24 ч до начала испытания, анестезруют и готовят к окклюзии коронарной артерии. В начале указанной процедуры вводят дополнительную дозу эритропоэтина, левую главную коронарную артерию пережимают на 30 мин и затем освобождают. Такую же дозу эритропоэтина вводят ежедневно в течение 1 недели после выполнения указанной процедуры. Затем у животных исследуют функцию сердца. Как показано на фиг. 3, у животных, которым делали инъекцию плацебо (физиологиче
- 28 007967 ский раствор), наблюдается большое увеличение диастолического давления в левом желудочке, что свидетельствует о расширенном жестком сердце вследствие инфаркта миокарда. В отличие от этого у животных, которым вводили эритропоэтин, не наблюдается ухудшения функции сердца по сравнению с контрольными животными (значимое различие на уровне р<0,01).
Пример 4. Молекулы эритропоэтина.
Нативный эритропоэтин можно модифицировать так, чтобы его активность соответствовала определенной ткани или тканям. Несколько неограничивающих методов, предназначенных для достижения требуемой тканевой специфичности, включают модификации, в соответствии с которыми удаляют или модифицируют части гликозилирования, где эритропоэтин имеет три Ν-связи и одну О-связь. Такие варианты гликозилированного эритропоэтина можно получить несколькими способами. Например, сиаловые кислоты, находящиеся в конце цепей сахара, можно удалить соответствующими сиалидазами в зависимости от химической связи, соединяющей сиаловую кислоту с цепью сахара. Альтернативно, гликозилированную структуру можно разрушить разными способами, используя другие ферменты, расщепляющие конкретные связи. Для обоснования указанных принципов рекомбинантный эритропоэтин человека десиалируют при помощи сиалидазы А (Ргохутс 1пс.) в соответствии с инструкцией производителя. Для подтверждения успешной химической модификации продукт реакции испытывают на полакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, окрашивая образовавшиеся полосы, в результате чего устанавливают, что химически модифицированный эритропоэтин имеет ожидаемую среднюю молекулярную массу ~31 кДа по сравнению с немодифицированным эритропоэтином, имеющим молекулярную массу ~34 кДа, и химическим способом измеряют количество оставшихся остатков сиаловой кислоты, число которых составляет <0,1 моль/моль эритропоэтина.
В соответствии с другой модификацией, при выполнении которой аминокислотные остатки эритропоэтина и остатки аргинина модифицируют фенилглиоксалем по методу Такахаши (ТакаЪакЫ, 1977, 1. В|ос11сш. 81:395-402), который выполняют в течение разных периодов времени от 0,5 до 3 ч при комнатной температуре. Реакцию заканчивают диализом реакционной смеси против воды. Применение таких модифицированных форм эритропоэтина полностью входит в объем данного изобретения.
Эффективность воздействия асиалоэритропоэтина и фенилглиоксальэритропоэтина на нервные клетки ίη νίίτο соответствует воздействию нативного эритропоэтина, как показано на фиг. 4-6. Испытание ίη νίΐΓο выполняют, используя нейроноподобные эмбриональные клетки карциномы (Р19), которые подвержены апоптозу после удаления сыворотки. За 24 ч до удаления сыворотки к культурам добавляют 1-1000 нг/мл обычного эритропоэтина или модифицированного эритропоэтина. На следующий день среду удаляют, клетки промывают свежей бессывороточной средой, после чего среду, содержащую испытуемое вещество (без сыворотки), вводят в культуры еще на 48 ч. Для определения количества жизнеспособных клеток выполняют анализ по восстановлению тетразолием (СеИТбег 96; Рготеда, 1пс.). Как показано на фиг. 4-5, асиалоэритропоэтин предотвращает гибель клеток в такой же степени, что и эритропоэтин. Модифицированный фенилглиоксалем эритропоэтин испытывают при помощи вышеописанного анализа с использованием нейроноподобных клеток Р19. Как показано на фиг. 6, такой химически модифицированный эритропоэтин полностью сохраняет нейрозащитное действие.
Сохранение нейрозащитной активности ίη νίνο подтверждают при помощи модели местной ишемии у крыс, в которой создают обратимое поражение в области средней церебральной артерии, как было описано выше (Вгшек е1 а1., 2000, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И.8.А. 97:10526-31). Взрослым самцам крыс 8ргадиеОа\\!еу вводят асилоэритропоэтин или эритропоэтин (внутрибрюшинная инъекция 5000 Ед/кг массы тела) или носитель сразу после окклюзии артерии. Через 24 ч животных умерщвляют и удаляют у них головной мозг для исследования. Делают несколько срезов и окрашивают их солями тетразолия для идентификации сохраняющих жизнеспособность областей головного мозга. Как показано на фиг. 7, асиалоэритропоэтин характеризуется такой же эффективностью, что и нативный эритропоэтин при обеспечении нейрозащиты через 1 ч после возникновения ишемии. На фиг. 8 показаны результаты, полученные в другой модели местной ишемии, при помощи которой сравнивают реакцию на дозу лекарственного средства, вызываемую эритропоэтином и асиалоэритропоэтином. При введении самой низкой дозы, равной 250 Ед/кг, асиалоэритропоэтин обеспечивает защиту, которую не создает немодифицированный эритропоэтин.
Пример 5. Модификация первичной структуры эритропоэтина и эффективность по защите нервных клеток.
Описан целый ряд молекул мутантного эритропоэтина, которые не связываются с рецептором эритропоэтина, продуцирующего эритроциты, и таким образом не поддерживают эритропоэз ίη νί\Ό или ίη νΐΐΐΌ. Некоторые из указанных молекул тем не менее имитируют действие эритропоэтина в других тканях или органах. Например, у 17-мера, содержащего аминокислотную последовательность 31-47 нативного эритропоэтина, отсутствует активность в отношении эритропоэза, но полностью сохраняется активность в отношении нервных клеток ίη νίίΐΌ (Сатрапа & О'Впен. 1998: Ιηί. 1. Мо1. Меб. 1:235-41).
Производные эритропоэтины, необходимые для вышеописанных применений, можно получить гуанидированием, амидированием, тринитрофенилированием, ацетилированием, сукцинилированием, нитрованием или модификацией остатков аргинина или карбоксильных групп, в результате чего получают эритропоэтины, сохраняющие свою активность в отношении конкретных органов и тканей и не
- 29 007967 проявляющие активность в других случаях, например, в отношении эритроцитов. Установлено, что, когда эритропоэтин подвергают вышеуказанным реакциям, полученная молекула обычно не обладает эритропоэтической активностью ίη νΐνο и ίη νίΐτο (например, 8а1аке е1 а1., 1990, ВюсЫт. Вюрйук. Ас1а 1038: 125-9). Ниже приведены некоторые примеры получения модифицированных эритропоэтинов.
Биотинилирование в положении свободных аминогрупп эритропоэтина. Эфир Ν-гидроксисукцинимида Ό-биотиноил-е-аминокапроновой кислоты (Βοейπηде^ Маппкеип № 1418165) растворяют в 100 мкл ДМСО. Полученный раствор объединяют с 400 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (РВ8), содержащего примерно 0,2 мг эритропоэтина в пробирке, закрытой фольгой. Раствор инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре, после чего непрореагировавший биотин отделяют гельфильтрацией на колонке Сеηΐ^^сοη 10. Как показано на фиг. 10, биотнилированный эритропоэтин защищает клетки Р19 при удалении сыворотки.
В статье Вюбпу1а1еб ι^οιηόίηαηΐ йитап е^уΐй^οрο^еΐ^η8: Вюасбуйу апб υΐίΐίΐν ак а гесерЮг йдапб Ьу \νοίθιο\ν51<ί е1 а1. Β1οο6, 1989, 74(3):952-8, описаны три разных способа биотинилирования эритропоэтина. Биотин добавляют к (1) частям сиаловой кислоты, (2) карбоксилатным группам и (3) аминогруппам. Используя анализ пролиферации клеток селезенки мыши, авторы показали, что (1) добавление биотина к частям сиаловой кислоты не инактивирует биологическую активность эритропоэтина, (2) добавление биотина к карбоксилатным группам вызывает значительную биологическую инактивацию эритропоэтина, (3) добавление биотина к аминогруппам вызывает полную биологическую инактивацию эритропоэтина. Указанные способы и модификации полностью входят в объем данного изобретения. На фиг. 9 показана активность биотинилированного эритропоэтина и асиалоэритропоэтина при выполнении анализа клеток Р19, испытывающих потребность в сыворотке.
Йодирование эритропоэтина.
Способ 1 - йодированные гранулы. Одну йодированную гранулу (Р1егсе, ЯοскΓο^б. II) в течение 5 мин инкубируют в 100 мкл РВ8 (20 мМ фосфата натрия, 0,15 М №С1, рН 7,5), содержащего 1 мКи свободного №ιΙ2'Ί. Затем к смеси добавляют 100 мкг эритропоэтина в 100 мкл РВ8. Смесь инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего реакцию прекращают, удаляя 200 мкл раствора из реакционного сосуда (оставляя йодированную гранулу). Избыток йода удаляют гель-фильтрацией на колонке ίχηίΓκοη 10. Как показано на фиг. 11, йодэритропоэтин, полученный таким способом, эффективно защищает клетки Р19 при удалении сыворотки.
Способ 2 - хлорамин Т. 100 мкг эритропоэтина в 100 мкл РВ8 добавляют к 500 мКи №1251 и смешивают в пробирке Эппендорфа. Добавляют 25 мкл хлораминов Т (2 мг/мл) и смесь инкубируют в течение 1 мин при комнатной температуре, затем добавляют 50 мкл буфера, прекращающего действие хлорамина Т (2,4 мг/мл метабисульфита натрия, 10 мг/мл тирозина, 10% глицерина, 0,1% ксилола в РВ8). Йодтирозин и йодированный эритропоэтин разделяют гель-фильтрацией на колонке ίχηΐΓχοη 10.
Модификации лизина. Карбамилирование. Эритропоэтин (100 мкг) модифицируют цианатом калия аналогично описанию, приведенному в статье Плаппа и др. (Р1арр е1 а1., АсРуйу οί Ьον^пе рапстеабс беοxу^^Ьοшс1еа8е А \\йй тοб^ί^еб атйю дгоирк 1971, I. Вю1. Сйет. 246, 939-845).
Тринитрофенилирование. Эритропоэтин (100 мкг) модифицируют 2,4,6-тринитробензолсульфонатом в соответствии с описанием, приведенным в статье Плаппа и др. (Р1арр е1 а1., АсРуйу οί Ьον^пе рапстеабс беοxу^^Ьοηис1еа8е А \\йй тοб^ί^еб атйю дгоирк 1971, I. Вю1. Сйет. 246, 939-845).
Ацетилирование. Эритропоэтин (100 мкг) инкубируют в 0,3 М фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем эквивалентное количество уксусного ангидрида, при 0°С в течение 1 ч. Реакцию прекращают диализом против дистиллированной воды.
Сукцинилирование. Эритропоэтин (100 мкл) в 0,5 М NаНСОз (рН 8,0) инкубируют с 15-молярным избытком янтарного ангидрида при 15°С в течение 1 ч. Реакцию прекращают диализом против дистиллированной воды.
Модификации аргинина. Эритропоэтин модифицируют 2,3-бутандионом в соответствии с описанием, приведенным в статье Риордана (Кютбап 1.Р., Рипс1юпа1 атдту1 ге81биек ίη са^хурерЕбаке А. Μο6ίйса1юп \\йй Ьи1апебюпе ВюсйетГбу 1973, 12(20):3915-3923).
Эритропоэтин модифицируют циклогексаноном в соответствии с описанием, приведенным в статье Патти и др. (Раббу, Ь., 8тйй. Е.Ь., 1бепбРюа1юп οί &пс1юпа1 агдтте теыбиек ίη Γ^οη^^τ^ А апб ^ю/упе I. Вю1. Сйет. 1975, 250(2):565-9).
Эритропоэтин модифицируют фенилглиоксалем в соответствии с описанием, приведенным в статье Вербера и др. ^етЬет, Μ.Μ., 8ο1<ο1ονκ1<ν Μ., Ргосеебтдк: Са^хурерЕбаке В: тοб^ί^саΐ^οη οί йипс1юпа1 атдшу1 теыбиек 1кг. I. Μеб. 8с1. 1975, 11(11):1169-70).
Модификации тирозина. Эритропоэтин (100 мкг) инкубируют с тетранитрометаном в соответствии с описанием, приведенным в статье Нестлера и др. (№к11ет РЕ., Сйас^ 6.К., 81таи88 ЕР. 3гб. 8бти1а1юп οί та1 ονа^^аη се11 8ΐе^ο^бοдеηе8^8 Ьу Ιιίβΐι бепкйу 1^рοр^οΐе^η8 тοб^ί^еб νίΐΒ 1ебаш1готе1йапе I. Вю1. Сйет., 1985, 1ип 25/ 260 (12):7316-21).
Модификации глутаминовой кислоты (и аспарагиновой кислоты). Чтобы модифицировать карбоксильные группы, эритропоэтин (100 мкг) инкубируют с 0,02 М ЕЭС в 1 М глицинамиде при рН 4,5 в течение 60 мин при комнатной температуре в соответствии с описанием, приведенным в статье Карравея и
- 30 007967 др. (Сатга^ау К.Ь., 8роет1 Р., КокЫаЫ Ό.Ε. 1т, СагЬоху1 дгоир ιηοάίΓίοηΙίοη ίη сйутоНуркш ηηά сйутοί^урктοдеη. 1. Мо1. Вю1., 1969 Мау 28; 42 (1):133-7).
Модификации остатков триптофана. Эритропоэтин (100 мкг) инкубируют с 20 мМ нбромсукцинимида в 20 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5) при комнатной температуре в соответствии с описанием, приведенным в статье АН е! а1., ί. Вю1. СЬет. 1995 Маг 3/ 270(9):4570-4. Число окисленных остатков триптофана определяют способом, описанным Корочкиной (Кото!сЬкша, Ь.С. е! а1., Рто!еш Ехрг. РипГ. 1995 ЕеЬ; 6(1):79-90).
Удаление аминогрупп. Чтобы удалить аминогруппы, эритропоэтин (100 мкг) инкубируют с РВ8 (рН 7,4), содержащим 20 мМ нингидрина (Р1егсе СНетюа1, ВоскГогб, Ι1), при 37°С в течение 2 ч в соответствии с описанием, приведенным в статье Коккини и др. (Кокк1ш, 6., е! а1. Мοά^Γ^са!^οη оГ НетоДоЬт Ьу ηίηΐινάπη В1ооб, Уо1. 556, Ыо. 4, 1980:701-705). Полученный альдегид восстанавливают, осуществляя взаимодействие продукта с боргидридом натрия или алюмогидридом лития. Эритропоэтин (100 мкг) инкубируют с 0,1 М раствором боргидрида натрия в РВ8 в течение 30 мин при комнатной температуре. Восстановление прекращают, охлаждая образцы на льду в течение 10 мин, и трижды диализуют продукт против РВ8 в течение ночи (Кокк1ш, 6., В1ооб, Уо1. 556, Ыо. 4, 1980:701-705). Продукт восстанавливают алюмогидридом лития, инкубируя эритропоэтин (100 мкг) с 0,1 М раствором алюмогидрида лития в РВ8 в течение 30 мин при комнатной температуре. Восстановление прекращают, охлаждая образцы на льду в течение 10 мин и трижды диализуя продукт против РВ8 в течение ночи.
Восстановление дисульфидом и стабилизация. Эритропоэтин (100 мкг) инкубируют с 500 мМ ΌΤΤ в течение 15 мин при 60°С. К смеси добавляют 20 мМ йодацетамида в воде и инкубируют в темноте в течение 25 мин при комнатной температуре.
Ограниченный протеолиз. Эритропоэтин может быть подвергнут ограниченному химическому протеолизу, целенаправленно воздействующему на определенные остатки. Эритропоэтин подвергают взаимодействию с 2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3'-броминдоленином, который расщепляет остатки после триптофана в 50-кратном избытке 50% уксусной кислоты в течение 48 ч в темноте при комнатной температуре в пробирках, закупоренных под давлением азота. Для прекращения реакции реакционную смесь гасят триптофаном и обессоливают.
Пример 6. Защита сетчатки от ишемии периферически вводимым эротропоэтином.
Клетки сетчатки очень чувствительны к ишемии, причем многие клетки погибают при ишемическом стрессе через 30 мин. Кроме того, подострая или хроническая ишемия вызывает ухудшение зрения, что характерно для ряда заболеваний человека, таких как сахарный диабет, глаукома и дегенерация желтого пятна. В настоящее время отсутствуют эффективные методы защиты клеток от ишемии. Между кровью и сетчаткой существует плотный барьер из эндотелиальных клеток, который препятствует проникновению большинства крупных молекул. Для испытания возможности защиты чувствительных к ишемии клеток периферически вводимым эритропоэтином используют модель острой обратимой глаукомы у крыс в соответствии с описанием, приведенным в статье Розенбаума и др. (ВокенЬант е! а1., 1997; У1к. Век. 37:3443-51). Физиологический раствор инъецируют в переднюю камеру глаза взрослым самцам крыс для повышения давления до величины, превышающей системное артериальное давление, и поддерживают такое давление в течение 60 мин. Животным внутрибрюшинно вводят физиологический раствор или 5000 Ед эритропоэтина/кг массы тела за 24 ч до индуцирования ишемии и продолжают вводить указанные вещества в виде суточной дозы в течение еще 3 дней. Через 1 неделю после лечения адаптированных к темноте крыс исследуют при помощи электроретинографии. На фиг. 11-12 показано, что введение эритропоэтина способствует получению хорошей электроретинограммы (ЕВС) (чертеж Ό) в отличие от животных, которым вводили только физиологический раствор (чертеж С) и у которых сохранилась незначительная часть зрительной функции. На фиг. 11 сравниваются а- и Ь-амплитуды электроретинограммы для групп, которым вводили эритропоэтин и физиологический раствор; полученные результаты свидетельствуют о существенной защите, обеспечиваемой эритропоэтином.
Пример 7. Восстановление эритропоэтином познавательной способности, нарушенной вследствие черепно-мозговой травмы.
Чтобы продемонстрировать способность эритропоэтина восстанавливать нарушенную познавательную способность у мышей с черепно-мозговой травмой, самкам мышей Ва1Ь/с наносят черепномозговую травму тупым предметом в соответствии с описанием, приведенным в статье Вттек е! а1. РЫА8 2000, 97; 10295-10672, и через 5 дней начинают ежедневно внутрибрюшинно вводить эритропоэтин в количестве 5000 Ед/кг массы тела. Через 12 дней после травмы у животных оценивают познавательную способность в водном лабиринте Морриса, выполняя четыре испытания в день. Хотя как подвергнутые лечению животные, так и контрольные животные показали плохие результаты в данном испытании (время выплывания равно примерно 80 из 90 возможных секунд), на фиг. 13 показано, что животные, которым вводили эритропоэтин, имеют лучшие результаты (в данном представлении отрицательное значение соответствует лучшему результату). Восстановление познавательной способности наблюдается даже в том случае, когда лечение эритропоэтином начинают через 30 дней после травмы (фиг. 14).
Пример 8. Модель нейротоксичности каината.
В модели нейротоксичности каината асиалоэритропоэтин вводят внутрибрюшинно в соответствии с
- 31 007967 методом Брайнса и др. (Вппек е! а1., Р!ос. Ναι. Асаб. 8с1. И.8.А. 2000, 97; 10295-10672) в дозе 5000 Ед/кг массы тела за 24 ч до введения 25 мг/кг каината; с учетом показателей времени до наступления смерти установлено, что асиалоэритропоэтин так же эффективен, как и эритропоэтин (фиг. 15).
Данное изобретение не ограничено конкретными описанными примерами, которые приведены с целью иллюстрации отдельных объектов изобретения, и в объем изобретения входят также функционально эквивалентные способы и компоненты. Специалисту в данной области должны быть очевидны другие модификации изобретения, помимо рассмотренных в данном описании изобретения и на прилагаемых чертежах. Такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Все приведенные публикации полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки.

Claims (57)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, который представляет собой:
    ί) эритропоэтин, не имеющий частей сиаловой кислоты;
    ίί) эритропоэтин, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводов;
    ϊϊΐ) эритропоэтин, имеющий, по крайней мере, меньшее содержание углеводов, полученное в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой;
    ίν) эритропоэтин, в котором углеводная часть молекулы эритропоэтина, по крайней мере, имеет гликозилированную структуру немлекопитающего, полученную в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего;
    ν) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов, которые могут быть химически восстановлены;
    νί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина;
    νίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина;
    νίίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина;
    ίχ) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
    х) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана;
    χί) эритропоэтин, у которого удалена по крайней мере одна аминогруппа;
    χίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина;
    χίίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или χίν) усеченный эритропоэтин для получения фармацевтической композиции, содержащей такое количество эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, которое является нетоксичным и эффективным для защиты, сохранения, усиления или восстановления функции или жизнеспособности эритропоэтинреактивных клеток млекопитающего, а также сопутствующих клеток, тканей и органов.
  2. 2. Применение по п.1, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой асиалоэритропоэтин.
  3. 3. Применение по п.2, в котором указанный асиалоэритропоэтин является асиалоэритропоэтином человека.
  4. 4. Применение по п.1, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, не имеет Ν-связанных углеводов.
  5. 5. Применение по п.1, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, не имеет О-связанного углевода.
  6. 6. Применение по п.1, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, обрабатывают по крайней мере одной гликозидазой.
  7. 7. Применение по п.1, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, экспрессируют в клетке насекомого или растения.
  8. 8. Применение по п.1, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой эритропоэтин, окисленный периодатом.
  9. 9. Применение по п.8, в котором указанный окисленный периодатом эритропоэтин химически восстановлен цианоборгидридом натрия.
  10. 10. Применение по п.1, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, имеет В-глиоксальную часть в одном или нескольких остатках аргинина, где В означает арильную или алкильную часть.
  11. 11. Применение по п.10, в котором указанный эритропоэтин является фенилглиоксальэритропоэтином.
  12. 12. Применение по п.1, в котором остаток аргинина указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, модифицирован в результате взаимодействия с вицинальным дикетоном, выбирае
    - 32 007967 мым из группы, включающей 2,3-бутандион и циклогександион.
  13. 13. Применение по п.1, в котором остаток аргинина указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, подвергают взаимодействию с 3-дезоксиглюкозоном.
  14. 14. Применение по п.1, в котором указанная молекула эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, имеет по крайней мере один биотинилированный лизин или Ν-концевую аминогруппу.
  15. 15. Применение по п.14, в котором указанная молекула эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, представляет собой биотинилированный эритропоэтин.
  16. 16. Применение по п.1, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой глюцитолиллизинэритропоэтин или фруктозиллизинэритропоэтин.
  17. 17. Применение по п.1, в котором остаток лизина указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, карбамилирован.
  18. 18. Применение по п.1, в котором остаток лизина указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, ацилирован.
  19. 19. Применение по п.18, в котором остаток лизина указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, ацетилирован.
  20. 20. Применение по п.18, в котором остаток лизина указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, сукцинилирован.
  21. 21. Применение по п.1, в котором остаток лизина указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, модифицирован натриевой или другой солью 2,4,6-тринитробензолсульфоната.
  22. 22. Применение по п.1, в котором остаток тирозина указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, нитрован или йодирован.
  23. 23. Применение по п.1, в котором остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты указанного эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, подвергают взаимодействию с карбодиимидом и последующему взаимодействию с амином.
  24. 24. Применение по п.21, в котором указанный амин является глицинамидом.
  25. 25. Применение по п.1, в котором указанная эритропоэтинреактивная клетка или ткань является клеткой или тканью нейрона, сетчатки, мышцы, сердца, легкого, печени, почки, тонкого кишечника, коркового вещества надпочечника, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичка, яичника или эндометрия.
  26. 26. Фармацевтическая композиция, содержащая нетоксичное, эффективное количество защищающего, сохраняющего, усиливающего или восстанавливающего эритропоэтинреактивные клетки млекопитающего эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, который представляет собой:
    ί) эритропоэтин, не имеющий частей сиаловой кислоты;
    ίί) эритропоэтин, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводов;
    ίίί) эритропоэтин, имеющий, по крайней мере, меньшее содержание углеводов, полученное в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой;
    ίν) эритропоэтин, в котором углеводная часть молекулы эритропоэтина, по крайней мере, имеет гликозилированную структуру немлекопитающего, полученную в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего;
    ν) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов, которые могут быть химически восстановлены;
    νί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина;
    νίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина, или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина;
    νίίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина;
    ίχ) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
    х) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана;
    χί) эритропоэтин, у которого удалена по крайней мере одна аминогруппа;
    χίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина;
    χίίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или χίν) усеченный эритропоэтин.
  27. 27. Фармацевтическая композиция по п.26, в которой указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой асиалоэритропоэтин или фенилглиоксальэритропоэтин.
  28. 28. Применение эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, для получения фармацевтической композиции, содержащей нетоксичное количество эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, для защиты, сохранения, усиления или восстановления функции или жизнеспособности эритропоэтинреактивной клетки млекопитающего или сопутствующих клеток, тканей или органов, в котором указанные клетки, ткани или органы не являются возбуждаемыми клетками, тканями или органами, или, по
    - 33 007967 существу, не содержат возбуждаемых клеток или тканей.
  29. 29. Применение по п.28, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой аналог эритропоэтина, миметик эритропоэтина, фрагмент эритропоэтина, гибридную молекулу эритропоэтина, молекулу, связывающуюся с рецептором эритропоэтина, агонист эритропоэтина, или олигомер, мультимер, мутеин, родственную форму, природную форму, синтетическую форму, рекомбинантную форму, гликозилированный вариант, дегликозилированный вариант или комбинацию любых из указанных форм.
  30. 30. Применение по п.28, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой фенилглиоксальэритропоэтин.
  31. 31. Способ защиты, сохранения или усиления жизнеспособности клетки, ткани или органа, удаленного из тела млекопитающего, заключающийся в том, что указанную клетку, ткань или орган подвергают воздействию фармацевтической композиции, содержащей нетоксичное количество эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим.
  32. 32. Способ по п.31, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой аналог эритропоэтина, миметик эритропоэтина, фрагмент эритропоэтина, гибридную молекулу эритропоэтина, молекулу, связывающуюся с рецептором эритропоэтина, агонист эритропоэтина, или олигомер, мультимер, мутеин, родственную форму, природную форму, синтетическую форму, рекомбинантную форму, гликозилированный вариант, дегликозилированный вариант или комбинацию любых из указанных форм.
  33. 33. Способ по п.32, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой:
    ί) эритропоэтин, не имеющий частей сиаловой кислоты;
    ίί) эритропоэтин, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводов;
    ϊϊΐ) эритропоэтин, имеющий, по крайней мере, меньшее содержание углеводов, полученное в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой;
    ίν) эритропоэтин, в котором углеводная часть молекулы эритропоэтина, по крайней мере, имеет гликозилированную структуру немлекопитающего, полученную в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего;
    ν) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов, которые могут быть химически восстановлены;
    νί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина;
    νίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина;
    νίίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина;
    1х) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
    х) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана;
    х1) эритропоэтин, у которого удалена по крайней мере одна аминогруппа;
    хи) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина;
    хш) эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или ,\ίν) усеченный эритропоэтин.
  34. 34. Способ по п.31, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой эритропоэтин человека.
  35. 35. Способ по п.31, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой фенилглиоксальэритропоэтин.
  36. 36. Применение эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, выбираемого из группы, включающей аналог эритропоэтина, миметик эритропоэтина, фрагмент эритропоэтина, гибридную молекулу эритропоэтина, молекулу, связывающуюся с рецептором эритропоэтина, агонист эритропоэтина, или олигомер, мультимер, мутеин, родственную форму, природную форму, синтетическую форму, рекомбинантную форму, гликозилированный вариант, дегликозилированный вариант или комбинацию любых из указанных форм, для получения фармацевтической композиции, содержащей нетоксичное количество эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, для восстановления познавательной способности у млекопитающего, имеющего нарушение познавательной способности.
  37. 37. Применение по п.36, в котором нарушение познавательной способности является результатом поражения, вызванного такими заболеваниями, как эпилептические припадки, рассеянный склероз, инсульт, гипотензия, остановка сердца, ишемия, инфаркт миокарда, воспаление, возрастное ослабление познавательной способности, лучевое поражение, корковый паралич, нейродегенеративное заболевание, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Лея, слабоумие, обусловленное СПИДом, потеря памяти, амиотрофический латеральный склероз, алкоголизм, депрессия, беспокойство, расстройство вни
    - 34 007967 мания, аутизм, болезнь Крейтцфельда-Якоба, травма или ишемия головного или спинного мозга, искусственное кровообращение, хроническая сердечная недостаточность, дегенерация желтого пятна, диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, глаукома, ишемия сетчатки или травма сетчатки.
  38. 38. Применение по п.36, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой фенилглиоксальэритропоэтин.
  39. 39. Применение по п.36, в котором указанный эритропоэтин, не являющийся эритропоэтическим, представляет собой:
    ί) эритропоэтин, не имеющий частей сиаловой кислоты;
    ίί) эритропоэтин, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводов;
    ίίί) эритропоэтин, имеющий, по крайней мере, меньшее содержание углеводов, полученное в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой;
    ίν) эритропоэтин, в котором углеводная часть молекулы эритропоэтина, по крайней мере, имеет гликозилированную структуру немлекопитающего, полученную в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего;
    ν) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов, которые могут быть химически восстановлены;
    νί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина;
    νίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина;
    νίίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина;
    ίχ) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
    х) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана;
    χί) эритропоэтин, у которого удалена по крайней мере одна аминогруппа;
    χίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина;
    χίίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или χίν) усеченный эритропоэтин.
  40. 40. Применение композиции, содержащей молекулу, ассоциированную с нетоксичным количеством эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, для доставки молекулы через барьер из эндотелиальных клеток, которые экспрессируют рецептор для эритропоэтина, где указанный эритропоэтин представляет собой:
    ί) эритропоэтин, не имеющий частей сиаловой кислоты;
    ίί) эритропоэтин, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводов;
    ίίί) эритропоэтин, имеющий, по крайней мере, меньшее содержание углеводов, полученное в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой;
    ίν) эритропоэтин, в котором углеводная часть молекулы эритропоэтина, по крайней мере, имеет гликозилированную структуру немлекопитающего, полученную в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего;
    ν) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов, которые могут быть химически восстановлены;
    νί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина;
    νίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина;
    νίίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина;
    ίχ) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
    х) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана;
    χί) эритропоэтин, у которого удалена по крайней мере одна аминогруппа;
    χίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина;
    χίίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или χίν) усеченный эритропоэтин.
  41. 41. Применение по п.40, в котором указанная ассоциация представляет неустойчивую ковалентную связь, устойчивую ковалентную связь или нековалентное соединение с сайтом связывания для данной молекулы.
  42. 42. Применение по п.40, в котором указанный барьер из эндотелиальных клеток выбирают из группы, включающей гематоэнцефалический барьер, гематоофтальмический барьер, гематотестикулярный
    - 35 007967 барьер, гематоовариальный барьер и гематоплацентарный барьер.
  43. 43. Применение по п.40, в котором указанная молекула представляет гормон агониста или антагониста рецептора, нейротрофический фактор, антимикробное вещество, радиофармацевтический пептид, антисмысловой олигонуклеотид, антитело, иммуносупрессор, токсин или противораковое лекарственное средство.
  44. 44. Композиция для переноса молекулы через барьер из эндотелиальных клеток, содержащая указанную молекулу в ассоциации с нетоксическим количеством эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, где указанный зритропоэтин представляет собой:
    ί) эритропоэтин, не имеющий частей сиаловой кислоты;
    ίί) эритропоэтин, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводов;
    ίίί) эритропоэтин, имеющий, по крайней мере, меньшее содержание углеводов, полученное в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой;
    ίν) эритропоэтин, в котором углеводная часть молекулы эритропоэтина, по крайней мере, имеет гликозилированную структуру немлекопитающего, полученную в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего;
    ν) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов, которые могут быть химически восстановлены;
    νί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина;
    νίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина;
    νίίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина;
    ίχ) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
    х) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана;
    χί) эритропоэтин, у которого удалена по крайней мере одна аминогруппа;
    χίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина;
    χίίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; или χίν) усеченный эритропоэтин.
  45. 45. Композиция по п.44, в которой указанная ассоциация представляет неустойчивую ковалентную связь, устойчивую ковалентную связь или нековалентное соединение с сайтом связывания для данной молекулы.
  46. 46. Композиция по п.44, в которой указанная молекула представляет гормон агониста или антагониста рецептора, нейротрофический фактор, антимикробное вещество, радиофармацевтический пептид, антисмысловой олигонуклеотид, антитело, иммуносупрессор или противораковое лекарственное средство.
  47. 47. Применение эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим и представляющего собой:
    ί) эритропоэтин, не имеющий частей сиаловой кислоты;
    ίί) эритропоэтин, не имеющий Ν-связанных или О-связанных углеводов;
    ίίί) эритропоэтин, имеющий, по крайней мере, меньшее содержание углеводов, полученное в результате обработки нативного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой;
    ίν) эритропоэтин, в котором углеводная часть молекулы эритропоэтина, по крайней мере, имеет гликозилированную структуру немлекопитающего, полученную в результате экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего;
    ν) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов, которые могут быть химически восстановлены;
    νί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков аргинина;
    νίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу в молекуле эритропоэтина;
    νίίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток тирозина;
    ίχ) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
    х) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий модифицированный остаток триптофана;
    χί) эритропоэтин, у которого удалена по крайней мере одна аминогруппа;
    χίί) эритропоэтин, по крайней мере, имеющий разрыв по крайней мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина;
    χίίί) эритропоэтин, имеющий по крайней мере одну замену по крайней мере одной аминокислоты; и усеченный эритропоэтин; который ассоциирован с молекулой для получения фармацевтической композиции, содержащей нетоксичное количество эритропоэтина, не являющегося эритропоэтическим, для
    - 36 007967 переноса указанной молекулы путем трансцитоза через барьер из эндотелиальных клеток.
  48. 48. Применение по п.47, в котором указанная ассоциация представляет неустойчивую ковалентную связь, устойчивую ковалентную связь или нековалентное соединение с сайтом связывания для данной молекулы.
  49. 49. Применение по п.47, в котором указанная молекула представляет гормон агониста или антагониста рецептора, нейротрофический фактор, антимикробное вещество, радиофармацевтический пептид, антисмысловой олигонуклеотид, антитело, иммуносупрессор или противораковое лекарственное средство.
  50. 50. Композиция, содержащая эритропоэтин, окисленный периодатом.
  51. 51. Композиция, содержащая глюцитолиллизинэритропоэтин.
  52. 52. Композиция, содержащая фруктозиллизинэритропоэтин.
  53. 53. Композиция, содержащая 3-дезоксиглюкозонэритропоэтин.
  54. 54. Композиция, содержащая карбамилированный асиалоэритропоэтин.
  55. 55. Композиция, содержащая биотинилированный асиалоэритропоэтин.
  56. 56. Композиция, содержащая сукцинилированный асиалоэритропоэтин.
  57. 57. Композиция, содержащая ацетилированный асиалоэритропоэтин.
EA200300738A 2000-12-29 2001-12-28 Защита, восстановление и усиление эритропоэтинреактивных клеток, тканей и органов EA007967B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25924500P 2000-12-29 2000-12-29
US09/753,132 US6531121B2 (en) 2000-12-29 2000-12-29 Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
PCT/US2001/049479 WO2002053580A2 (en) 2000-12-29 2001-12-28 Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300738A1 EA200300738A1 (ru) 2004-06-24
EA007967B1 true EA007967B1 (ru) 2007-02-27

Family

ID=26947185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300738A EA007967B1 (ru) 2000-12-29 2001-12-28 Защита, восстановление и усиление эритропоэтинреактивных клеток, тканей и органов

Country Status (33)

Country Link
EP (2) EP1406922B1 (ru)
JP (4) JP2005502584A (ru)
KR (3) KR20080041755A (ru)
CN (2) CN1505638A (ru)
AR (1) AR035412A1 (ru)
AU (1) AU2002239665B2 (ru)
BG (1) BG108030A (ru)
BR (1) BR0116587A (ru)
CA (1) CA2432853A1 (ru)
CL (1) CL2010000606A1 (ru)
CZ (1) CZ20032059A3 (ru)
DO (1) DOP2001000321A (ru)
EA (1) EA007967B1 (ru)
EE (1) EE200300267A (ru)
ES (1) ES2564552T3 (ru)
HR (1) HRP20030515A2 (ru)
HU (1) HUP0302549A3 (ru)
IL (2) IL156399A0 (ru)
IS (1) IS6843A (ru)
MX (1) MXPA03005893A (ru)
NO (1) NO332038B1 (ru)
NZ (2) NZ526722A (ru)
PA (1) PA8536201A1 (ru)
PE (2) PE20110236A1 (ru)
PH (1) PH12016500941A1 (ru)
PL (1) PL365876A1 (ru)
RS (1) RS52276B (ru)
SK (1) SK9572003A3 (ru)
SV (1) SV2003000814A (ru)
UA (1) UA91321C2 (ru)
UY (1) UY27111A1 (ru)
WO (1) WO2002053580A2 (ru)
ZA (1) ZA200304551B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2707060C1 (ru) * 2019-06-14 2019-11-21 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Способ коррекции эндотелиальной дисфункции асиалированным эритропоэтином при ADMA-подобной модели преэклампсии

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003048348A2 (en) 2001-12-07 2003-06-12 Crucell Holland B.V. Production of viruses, viral isolates and vaccines
US7604960B2 (en) 1999-04-15 2009-10-20 Crucell Holland B.V. Transient protein expression methods
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US8236561B2 (en) 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
US7192759B1 (en) 1999-11-26 2007-03-20 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7527961B2 (en) 1999-11-26 2009-05-05 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7521220B2 (en) 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
PA8536201A1 (es) * 2000-12-29 2002-08-29 Kenneth S Warren Inst Inc Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina
EP1930023A3 (en) * 2001-04-09 2008-08-06 East Carolina University Erythropoietin ameliorates chemotherapy-induced toxicity in vivo
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
DE10219545A1 (de) * 2002-04-26 2003-11-06 Lang Florian Regulation der Apoptose
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
BRPI0408358A (pt) 2003-03-14 2006-03-21 Neose Technologies Inc polìmeros hidrossolúveis ramificados e seus conjugados
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US7718363B2 (en) 2003-04-25 2010-05-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex and assays for identifying tissue protective compounds
WO2004099396A1 (en) 2003-05-09 2004-11-18 Crucell Holland B.V. Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom
AU2004240553A1 (en) 2003-05-09 2004-12-02 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
CN1897959A (zh) * 2003-09-29 2007-01-17 沃伦药品公司 用于治疗和预防脓毒病和粘连形成的组织保护细胞因子
US7842661B2 (en) 2003-11-24 2010-11-30 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin formulations
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
CA2552892C (en) 2004-01-08 2014-08-05 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation of peptides
EP1771190A4 (en) * 2004-07-02 2009-07-22 Kenneth S Warren Inst Inc METHOD FOR THE PRODUCTION OF COMPLETELY CARBAMYLATED ERYTHROPOIETIN
ES2325034T3 (es) * 2004-07-07 2009-08-24 H. Lundbeck A/S Nueva epo carbamilada y metodo para su produccion.
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
AT500929B1 (de) 2004-11-09 2007-03-15 Medizinische Uni Wien Muw Pharmazeutische zubereitung die erythropoietin enthält
CN101090973B (zh) * 2004-12-30 2012-03-28 克鲁塞尔荷兰公司 从表达腺病毒e1a蛋白的细胞中获得唾液酸化增加的重组蛋白质的方法及由此获得的蛋白质
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
EP1844068A4 (en) * 2005-01-25 2009-09-30 Apollo Life Sciences Ltd MOLECULES AND THEIR CHIMERIC MOLECULES
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
US20080255026A1 (en) 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
KR20170027868A (ko) 2005-08-05 2017-03-10 아라임 파마슈티칼즈, 인크. 조직 보호 펩티드 및 이의 용도
WO2007020922A1 (ja) * 2005-08-17 2007-02-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 脳疾患の治療剤および予防剤
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
AU2007206409A1 (en) 2006-01-18 2007-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of removing sialic acid and process for producing asialoerythropoietin
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
AR065613A1 (es) * 2007-03-09 2009-06-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes de proteccion para organos transplantados
KR20100016160A (ko) 2007-04-03 2010-02-12 바이오제너릭스 에이지 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
SG188161A1 (en) 2008-01-22 2013-03-28 Araim Pharmaceuticals Inc Tissue protective peptides and peptide analogs for preventing and treating diseases and disorders associated with tissue damage
WO2009102021A1 (ja) * 2008-02-14 2009-08-20 Kyoto University 骨髄由来幹細胞、前駆細胞機能賦活による網膜疾患治療
ES2476690T3 (es) 2008-02-27 2014-07-15 Novo Nordisk A/S Moléculas conjugadas del Factor VIII
CN102186879A (zh) * 2008-05-29 2011-09-14 韩诺生物制约株式会社 修饰的显示增加的蛋白酶抗性的促红细胞生成素(epo)多肽及其药物组合物
EP3216800A1 (en) 2008-09-26 2017-09-13 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
ES2632164T3 (es) 2010-07-06 2017-09-11 Augustinus Bader Aplicación tópica de eritropoyetina para uso en el tratamiento de lesiones de la córnea
US20150119325A1 (en) 2012-05-29 2015-04-30 North Carolina Central University Methods for the production of cytoprotective asialo-erythropoietin in plants and its purification from plant tissues
CN109310741A (zh) 2016-04-29 2019-02-05 阿拉伊姆药品公司 用于预防和治疗与组织损伤相关的疾病和障碍的组织保护肽
CN109415426B (zh) * 2016-07-12 2022-03-11 赫克萨尔股份公司 具有降低的唾液酸残基的乙酰化率的糖蛋白
RU2709833C1 (ru) * 2019-06-13 2019-12-23 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Способ коррекции микроциркуляции в плаценте асиалированным эритропоэтином при ADMA-подобной модели преэклампсии

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5625035A (en) * 1992-06-05 1997-04-29 The Regents, University Of California Erythropoietin binding protein from mammalian serum
US5767078A (en) * 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US5955422A (en) * 1983-12-13 1999-09-21 Kirin-Amgen, Inc. Production of erthropoietin

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4704355A (en) 1985-03-27 1987-11-03 New Horizons Diagnostics Corporation Assay utilizing ATP encapsulated within liposome particles
US4798824A (en) 1985-10-03 1989-01-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Perfusate for the preservation of organs
US4835260A (en) 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
JPH029900A (ja) * 1988-04-12 1990-01-12 Kirin Amgen Inc 修飾エリスロポエチン
US5308617A (en) * 1988-08-10 1994-05-03 Halzyme Ltd. Protein heparin conjugates
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
DE3923963A1 (de) 1989-07-20 1991-01-31 Behringwerke Ag Muteine des menschlichen erythropoetins, ihre herstellung und ihre verwendung
CA2025907A1 (en) 1989-09-21 1991-03-22 Franklin D. Collins Method of transporting compositions across the blood brain barrier
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
KR100263845B1 (ko) * 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
DE69032809T2 (de) 1989-11-06 1999-07-08 Cell Genesys Inc Herstellung von Proteinen mittels homologer Rekombination
JP3156236B2 (ja) * 1991-09-30 2001-04-16 雪印乳業株式会社 記憶障害改善治療剤
NZ245015A (en) 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production
US6153407A (en) * 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
WO1994026087A2 (en) 1993-05-14 1994-11-24 Connor Kim C O Recombinant protein production and insect cell culture and process
ZA946122B (en) 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5773569A (en) 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5830851A (en) 1993-11-19 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
KR100395420B1 (ko) 1995-11-13 2003-08-21 다카라츠죠 가부시키가이샤 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 방법
US5856292A (en) 1996-04-08 1999-01-05 Colgate Palmolive Company Light duty liquid cleaning compositions
US5835382A (en) 1996-04-26 1998-11-10 The Scripps Research Institute Small molecule mimetics of erythropoietin
CZ130199A3 (cs) 1996-10-25 1999-07-14 G. D. Searle & Co. Cirkulárně permutovaní agonisté receptoru erythropoietinu
DE19857609A1 (de) * 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
BR122013003013B8 (pt) * 1999-01-14 2021-07-06 Bolder Biotechnology Inc proteína isolada monopeguilada do hormônio do crescimento e método para sua obtenção
JP2003520194A (ja) * 1999-04-13 2003-07-02 ザ ケネス エス．ウォーレン インスティテュート，インコーポレーテッド 末梢投与したエリスロポエチンによる興奮組織機能のモジュレート
PA8536201A1 (es) * 2000-12-29 2002-08-29 Kenneth S Warren Inst Inc Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina
KR20130099071A (ko) 2010-08-25 2013-09-05 액세스 비지니스 그룹 인터내셔날 엘엘씨 무선 전원 공급 시스템 및 다층 심 조립체
KR101290029B1 (ko) 2011-01-20 2013-07-30 에스티팜 주식회사 시타글립틴의 중간체 제조방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5955422A (en) * 1983-12-13 1999-09-21 Kirin-Amgen, Inc. Production of erthropoietin
US5625035A (en) * 1992-06-05 1997-04-29 The Regents, University Of California Erythropoietin binding protein from mammalian serum
US5767078A (en) * 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2707060C1 (ru) * 2019-06-14 2019-11-21 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Способ коррекции эндотелиальной дисфункции асиалированным эритропоэтином при ADMA-подобной модели преэклампсии

Also Published As

Publication number Publication date
EP1406922A2 (en) 2004-04-14
IL156399A (en) 2016-02-29
AU2002239665B2 (en) 2006-11-16
YU53103A (sh) 2006-08-17
SV2003000814A (es) 2003-07-29
SK9572003A3 (en) 2003-11-04
NZ551445A (en) 2008-07-31
PL365876A1 (en) 2005-01-10
PH12016500941A1 (en) 2017-12-18
NZ526722A (en) 2007-05-31
MXPA03005893A (es) 2003-09-10
CN102319421A (zh) 2012-01-18
KR20090082513A (ko) 2009-07-30
WO2002053580A2 (en) 2002-07-11
CA2432853A1 (en) 2002-07-11
PA8536201A1 (es) 2002-08-29
RS52276B (sr) 2012-10-31
EP2281828A2 (en) 2011-02-09
HUP0302549A3 (en) 2010-01-28
IL156399A0 (en) 2004-01-04
NO332038B1 (no) 2012-06-11
JP2005502584A (ja) 2005-01-27
JP2010031017A (ja) 2010-02-12
HRP20030515A2 (en) 2005-04-30
BR0116587A (pt) 2005-06-28
KR100880201B1 (ko) 2009-01-28
AR035412A1 (es) 2004-05-26
KR20030082562A (ko) 2003-10-22
WO2002053580A3 (en) 2004-02-12
UA91321C2 (ru) 2010-07-26
CZ20032059A3 (cs) 2003-12-17
EA200300738A1 (ru) 2004-06-24
UY27111A1 (es) 2002-06-20
JP2013166775A (ja) 2013-08-29
BG108030A (bg) 2005-04-30
CL2010000606A1 (es) 2010-10-08
EP1406922B1 (en) 2015-12-09
DOP2001000321A (es) 2002-08-30
NO20032912L (no) 2003-06-28
PE20020744A1 (es) 2002-08-21
NO20032912D0 (no) 2003-06-24
ZA200304551B (en) 2005-08-31
CN1505638A (zh) 2004-06-16
EE200300267A (et) 2003-10-15
EP1406922A4 (en) 2005-06-01
JP2015221816A (ja) 2015-12-10
ES2564552T3 (es) 2016-03-23
JP6114099B2 (ja) 2017-04-12
IS6843A (is) 2003-06-13
HUP0302549A2 (hu) 2003-11-28
PE20110236A1 (es) 2011-04-11
KR100985615B1 (ko) 2010-10-05
EP2281828A3 (en) 2012-10-24
KR20080041755A (ko) 2008-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA007967B1 (ru) Защита, восстановление и усиление эритропоэтинреактивных клеток, тканей и органов
US7767643B2 (en) Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
EA010200B1 (ru) Рекомбинантные тканезащитные цитокины и кодирующие их нуклеиновые кислоты для защиты, восстановления и усиления чувствительных клеток, тканей и органов
US6531121B2 (en) Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
EA010371B1 (ru) Тканевые протективные цитокины для защиты, восстановления и стимуляции реактивных клеток, тканей и органов
EA015672B1 (ru) Тканезащитные пептиды и их применения
AU2002239665A1 (en) Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
MXPA05002617A (es) Eritropoyetinas de accion prolongada que mantienen la actividad protectora de tejidos de la eritropoyetina endogena.
US20200009221A1 (en) Methods for inhibiting necrosis
KCNfm International Bureau
AU2010202384A1 (en) Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU