BG108030A - Защита, възстановяване и усилване на еритропоетин-чувствителни клетки, тъкани и органи - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до методи и състави за защита или усилване на функцията или жизнеспособността in vivo, in situ или ех vivo на еритропоетин-чувствителна клетки, тъкани, органи или част от тяло на бозайници, включително хора, чрез системно или локално прилагане на модулатор на активността на еритропоетин рецептор, например еритропоетин или модифициран еритропоетин. а

Description

ЗАЩИТА, ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ И УСИЛВАНЕ НА ЕРИТРОПОЕТИН-ЧУВСТВИТЕЛНИ КЛЕТКИ, ТЪКАНИ И ОРГАНИ Приоритет от временна заявка № 60/259,245подадена на 29 Декември 2000, която е включена изцяло внастоящето, претендирай съгласно 35 и.3.С.§119 (е) (1) . ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА Дълги години за единстеваната изясненафизиологична роля на еритропоетин се считаше неговатауправляваща функция при производството на червени кръвнителца. Неоттдавна, 1 няколко доказателствени разработкисе споменава, че еритропоетин, като член на цитокинсуперфамилия, изпълнява други физиологични функции, коитосе извършват с посредническо взаимодействие с еритропоетинрецептор (еритропоетин-Р). Тези действия включватмитогенеза, модулация на калциев инфлукс в клетките нагладките мускули и нервните клетки, и въздействат върхумеждинния метаболизъм. Предполага се, че еритропоетиносигурява компенсаторни отговори, които служат да подобрятнедостатъчната концентрация на кислород в клетъчното микропространство, както и да модулират програмиранатаклетъчна смърт причинено от метаболичен стрес. Въпреки,че беше установено, че инжектиран интрекраниалноеритропоетин защитава невроните от хипоксично неврално поражение, интеркраниалното въвеждане е непрактичен инеприемлив начин на въвеждане за терапевтична употреба, ипо-специално за нормални индивиди. Освен това, отпредишните изследвания върху анемични пациенти, на които едаван еритропоетин, се заключава, че периферно въведенеритропоетин не се пренася до мозъка (МагЪт еб а1., 1997, Ктбпеу Ιηί. 51:416-8; СГии1 е£ а1., 1999, РесНабг. Кез .46:543-547; Виетт е£ а1., 2000, ΝβρΠτοΙ. Όϊβΐ. Тгапзр1аб.15:422-433). Различни модифицирани форми на еритропоетиндействащи директно за подобряване на еритропоетичнотодействие на молекулата бяха описани, такива като промененидо карбоксилен терминус аминокиселини, описани в Патент наСАЩ 5,457,089 и в Патент на САЩ 4,835,260; изоформи наеритропоетин с различен брой остатъци на сиалова киселиназа молекула, така както са описани в Патент на САЩ5,856,292; полипептиди описани в Патент на САЩ 4,703,008;агонисти описани в Патент на САЩ 5,767,078; пептиди, коитосе свързват с еритропоетин рецептор, както е описано вПатенти на САЩ 5,773,569 и 5,830,851; и ниско молекулнимиметици, както са описани в Патент на САЩ 5,835,382. Настоящето описание се отнася до използванена еритропоетин за защита, поддържане, усилване иливъзстановяване на еритропоетин-чувствителни клетки иасоциираните с тях клетки, тъкани и органи ϊη зИи, кактои ех νϊνο, и до доставяне на еритропоетин през ендотелнатаклетъчна бариера за да се защитят и увеличат еритропоетин-чувствителни клетки и свързаните с тях клетки, тъкани и органи, отдалечени от васкулатурата, или да се подкрепят асоциираните молекули. КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Съгласно един аспект настоящето изобретениесе отнася до използване на еритропоетин за приготвяне нафармацевтични състави за защита, поддържане, усилване иливъзстановяване на функцията или жизнеспособността наеритропоетин-чувствителни клетки на бозайници и асоциираните с тях клетки, тъкани или органи. В един частен случай, еритропоетин-чувствителните клетки на бозайник и асоциираните с тях клетки, тъкани или органи са отдалечени от васкулатурата посредством непроницаема 5 ендотелна клетъчна бариера. В друг частен аспект, клетките, тъканите, органите или други части на тялото саизолирани от тялото на бозайник, подобно на такивапредназначени за трансплантация. Като неограничаващипримери, еритропоетин-чувствителните клетки или тъкени 10 могат да бъдат нервни, ретинални, мускулни, сърдечни,белодробни, чернодробни, бъбречни, малки чревни,надбъбречни кортексни, надбъбречни медуларни, капилярниендотели, тестисни, яйчникови, панкреасни илиендометриални клетки или тъкани. Тези примери на 15 еритропоетин-чувствителни клетки са само илюстративни.Съгласно един аспект, еритропоетин-чувствителните клеткиили техните асоциирани клетки, тъкани или органи не савъзбудими клетки, тъкани или органи, или не съдържатпреобладаващо възбудими клетки или тъкани. В едно 20 специфично изпълнение, клетката, тъканта или органа набозайник, при които се използват гореспоменатите " еритропоетин производни, са такива, които са билиподлагани или ще бъдат подлагани на поне еднонеблагоприятно условие за жизнеспособността на клетката, 25 тъканта или органа. Такива състояния включват травматичнаίη вНи хипоксия или метаболитна дисфункция, хирургичноиндуцирана ίη зки хипоксия или метаболитна дисфункция,или ίη зИи токсично въздействие, като последното може дабъде асоциирано с химиотерапия или лъчетерапия. В едно 30 изпълнение, неблагоприятните състояния са в резултат на кардио-пулмонарен байпас (сърдечно-белодробен апарат),както се използва при някои хирургични процедури. Еритропоетините са полезни за терапевтичноили профилактично лечение на заболявания при човека на ЦНС 5 или периферната нервна система, които имат първичниневрологични или психиатрични симптоми, както иофталмологични заболявания, кардиоваскуларни заболявания,кардиопулмонарни заболявания, респираторни заболявания,бъбречни, пикочни или репродуктивни заболявания, 10 гастроинтестинални заболявания и ендокринни и метаболитнианормалности. Изобретението също се отнася и дофармацевтични състави съдържащи определени еритропоетиновипроизводни за прилагани при бозайници, за предпочитане при 15 човек. Такива фармацевтични състави могат да бъдат сформули за орално, интраназално или парентералноприлагане, или във формата на обливащ разтвор заподдържане жизнеспособността на клетки, тъкани или органиех νί νο. 20 Еритропоетин производни, които могат да *· бъдат полезни за гореспоменатите цели, могат да бъдат всеки природен еритропоетин или еритропоетин аналог,еритропоетин миметик и еритропоетин фрагмент, хибриднаеритропоетин молекула, еритропоетин молекулата, които не 25 са свързани с гореказаното еритропоетин-рецептор свързващамолекула, еритропоетин агонист, бъбречен еритропоетин,мозъчен еритропоетин, техен олигомер, техен мултимер,техен конгенер, тяхна природно срещана форма, тяхнасинтетична форма, тяхна рекомбинантна форма, техен 30 гликозилатен вариант, техен дегликозилатен вариант, или тяхна комбинация. Всяка форма на еритропоетин способна да въздейства благотворно на еритропоетин-чувствителни клеткие обхваната от това изобретение. Други еритропоетин производни, които могатда бъдат полезни за гореспоменатите цели и фармацевтичнисъстави включват както природни еритропоетини, така иеритропоетини, които са били променени чрез поне еднамодификация в сравнение с природния еритропоетин, и запредпочитане в сравнение с природен човешки еритропоетин.Поне едната модификация може да бъде модификация на понеедна аминокиселина на еритропоетин молекулата, илимодификация на поне един въглехидрат на еритропоетинмолекулата. Разбира се, еритропоетин молекули полезни занастоящите цели могат да имат множество модификации всравнение с природната молекула, като например множествомодификации на аминокиселинната част на молекулата,множество модификации на въглехидратната част намолекулата, или поне една модификация на аминокиселиннатачаст на молекулата и поне една модификация на въглехидратната част на молекулата. Модифициранатаеритропоетин молекула запазва способността си да защитава,поддържа, увеличава или възстановява функцията илижизнеспособността на еритропоетин-чувствителни клетки набозайник, както и други свойства на, някои свойства пожелание могат да отсъстват в сравнение с природнатамолекула. В едно предпочитано изпълнение еритропоетинпроизводната е не-еритропоетик. В едно изпълнение еритропоетина съгласноизобретението поне няма никаква следа от сиалова киселина.В предпочитано изпълнение модифицираният еритропоетин еасиалоеритропоетин, а най-предпочитано е човешки асиалоеритропоетин. В друго изпълнение модифицираният еритропоетин има 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12, или 13 следи на сиалова киселина. В едно второ изпълнение модифицираниятеритропоетин поне няма никакъв Ν-свързан или никакъв 0- 5 свързан въглехидрат. В едно трето изпълнение модифицираниятеритропоетин има поне намалено въглехидратно съдържаниеполучено чрез обработване на еритропоетин и неговиприродни въглехидрати с поне една гликозидаза. 10 В едно четвърто изпълнение въглехидратната част от модифицираната еритропоетин молекула има поне еднанебозайникова гликозилатна структура, получен от експресията на рекомбиниран еритропоетин в небозайниковиклетки. В предпочитано изпълнение модифицираните 15 еритропоетини са експресирани в клетки на инсекти или врастителни клетки. В едно пето изпълнение модифицираниятеритропоетин има поне един или повече оксидиранивъглехидрати, които могат също да бъдат химически 20 редуцирани. В едно предпочитано изпълнение модифицираният\ еритропоетин е периодат-оксидизиран еритропоетин; в друго предпочитано изпълнение периодат-оксидизиранияеритропоетин е химически редуциран с борохидридна сол,като например натриев борохидрид или натриев 25 цианоборохидрид. В едно шесто изпълнение модифицираният загореспоменатите употреби еритропоетин има поне един илиповече модифицирани остатъка. В едно изпълнениемодифицираният еритропоетин съдържа глиоксална частица в 30 един или повече аргининови остатъци, такива катоарилглиоксал или арилглиоксална частица. В друго изпълнение поне един аргининов остатък е модифициран чрезреакция с вицинален дикетон, такъв като, но неограничен до2,3-бутандион или циклохександион. В седмо изпълнение модифицираният 5 еритропоетин съдържа поне един или повече лизинови остатъци или модификация на Ν-терминална аминогрупа наеритропоетин молекулата, тези модификации са такива врезултат от реакцията на лизинов остатък или Ν-терминалнааминогрупа с аминогруп-модифициращо средство. 10 Модифицираният лизинов остатък понататък може да бъдехимически редуциран. В едно предпочитано изпълнение,еритропоетин е биотинизиран или карбамилизиран чрез еднаили повече лизинови групи. В друго предпочитаноизпълнение, лизинът влиза в реакция с алдехид или 15 редуцираща захар за да образува имин, който може да бъдестабилизиран чрез редукция или с натриев цианоборохидриддо образуване на Ν-алкилиран лизин, като напримерглюцитолил лизин, или който в случай на редуциращи захариможе да бъде стабилизиран чрез Атасюгт или Неупз 20 преподреждане до образуване на алфа-деокси алфа-амино захар, като например алфа-деокси-алфафруктолизин. В другопредпочитано изпълнение лизиновата група е карбамилизирана(карбамоилизирана), като например чрез реакция с алкил-изоцианат, арил-изоцианат, или арил-изотиоцианат, 25 съответно, или тя може да бъде ацилирана с алкилкарбоновреактив или дериват на арилкарбоновата киселина, катонапример чрез реакция с ацетен анхидрид, сукцинен анхидридили фталов анхидрид. Поне една лизинова група може същода бъде тринитрофенил модифицирана чрез реакция с 30 тринитробензолсулфонова киселина, или за предпочитане нейни соли. В друго изпълнение лизиновите остатъци могат 10 15 20 25 да бъдат модифицирани чрез реакция с глиоксалова производна, като например реакция с глиоксал; метилглиоксал или 3-деоксиглюкозон до образуване насъответни алфа-карбоксиалкилни производни. В осмо изпълнение поне един тирозиновостатък на еритропоетин може да бъде модифициран вразположение на ароматен пръстен чрез електрофиленреагент, като например нитрация или йодиране. В девето изпълнение, поне единеритропоетинов остатък на аспарагинова киселина или наглютаминова киселина може да бъде модифициран, катонапример чрез реакция с карбодиимид, последвана от реакцияс амин, като например, но не ограничено до глицинамид. В десето изпълнение поне един еритропоетиновостатък на триптофан е модифициран, като например чрезреакция с η-бромосукцинимид или п-хлоросукцинимид. В единадесето изпълнение е разкритамодифицирана еритропоетин молекула имаща поне еднаотстранена еритропоетин аминогрупа, като например чрезреакция с нинхидрин, последвана от редукция нарезултантната карбонилна група в реакция с борохидрид. В дванадесето изпълнение е разкритмодифициран еритропоетин имащ поне начало на поне една отцистинните връзки в еритропоетиновата молекула чрезреакция с редуциращ фактор, като например дитиотриитол,последвана от реакция на получените сулфхидрили сйодоацетамид, йодоацетна киселина, или с друг електрофилза да се предотврати преобразуването на дисулфиднитевръзки. 30 В тринадесето изпълнение е разкрит модифициран еритропоетин имащ поне една субституция на всяка една от множество аминокиселини, като например левцин, с поне един еритропоетинов остатък на лизин,аргинин, триптофан, тирозин или цистеин, при използване намолекулярни биологични техники. 5 В четиринадесето изпълнение модифициран еритропоетин е подчинен на лимитирана химическапротеолиза, която цели специфични остатъци, напримерпоследващо разцепване на триптофанови остатъци. Такиварезултантни еритропоетинови фрагменти са обхванати също от Ю изобретението. Както беше споменато по-горе, еритропоетин,който може да е полезен за настоящите цели, освен че можеда има поне една от гореспоменатите модификации, също можеда има повече от една от горните модификации. Чрез пример 15 на модифициран еритропоетин с една модификация във въглехидратната част на молекулата и една модификация ваминокиселинната част, модифицираният еритропоетин еасиалоеритропоетин и неговите лизинови остатъци сабиотинизирани или карбамилирани. Настоящето изобретение 20 също така обхваща състави, включително фармацевтични- състави, съдържащи един или повече от гореспоменаите I* еритропоетини. В едни друг аспект на изобретението еразкрит метод за защита, поддържане, усилване или 25 възстановяване функцията или жизнеспособността на еритропоетин-чувствителни клетки на бозайник и технитеасоциирани клетки, тъкани и органи, чрез прилагане наефективно количество от всеки един или повече отгореспоменатите еритропоетини. В един частен аспект на 30 метода, еритропоетин-чувствителните клетки на бозайник итехните асоциирани клетки, тъкани или органи са отдалечени 10 от васкулатурата посредством непроницаема ендотелнаклетъчна бариера. В един друг часетн аспект, клетките,тъканите, органите или други части на тялото са изолираниот талото на бозайника, като тези например, които са 5 предназначени за трансплантация. Чрез неограничаващипримери еритропоетин-чувствителните клетки или тъканимогат да бъдат нервни, ретинални, мускулни, сърдечни,белодробни, чернодробни, бъбречни, малки чревни,надбъбречни кортексни, надбъбречни медуларни, капилярни 10 ендотели, тестисни, яйчникови, или ендометриални клеткиζ* или тъкани. Тези примери на еритропоетин-чувствителни клетки са само илюстративни. В едно специфичноизпълнение, еритропоетин-чувствителните клетки или технитеасоциирани клетки, тъкани или органи не са възбудими 15 клетки, тъкани или органи, или не съдържат преобладаващовъзбудими клетки или тъкани. В друго специфичноизпълнение, клетката, тъканта или органа на бозайник, прикоито се използват гореспоменатите еритропоетинпроизводни, са такива, които са били подлагани или ще 20 бъдат подлагани за определен период от време на поне еднонеблагоприятно условие за жизнеспособността на клетката, с тъканта или органа. Такива състояния включват травматичнаίη зИи хипоксия или метаболитна дисфункция, хирургичноиндуцирана ίη зИ:и хипоксия или метаболитна дисфункция, 25 или ίη зИ:и токсично въздействие, като последното може дабъде асоциирано с химиотерапия или лъчетерапия. В едноизпълнение, изобретението претендира, че неблагоприятнитесъстояния са в резултат на кардио-пулмонарен байпас. В друг аспект на изобретението, всеки от 30 горепосочените еритропоетини, както и всяка друга еритропоетинова молекула, която включва природен човешки 11 10 15 20

25 еритропоетин, могат да бъдат използвани в препарат нафармацевтичен състав за ех-νϊνο третиране на клетки,тъкани или органи за целите на защита, поддържане,усилване или възстановяване функцията или жизнеспособността на еритропоетин-чувствителни клетки итехнике асоциирани клетки, тъкани или органи. Такова ех-νϊνο третиране е полезно, например при консервиране наклетки, тъкани или органи за трансплантиране, както при автотрансплантация, така и при ксенотрансплантация.Клетките, тъканта или органа могат да бъдат окъпани вразтвор съдържащ еритропоетин, или перфузията да сеизвърши капка по капка към органа през васкулатурата илипо друг начин, за да поддържа клетчното функциониране презпериода когато клетките, тъканта или органа не са свързанис васкулатурата на донора или реципиента. Прилагането наперфузията може да се извърши на донора преди отделянетона органа, както и към отделения орган и към реципиента.Освен това гореспоменатата употреба на всеки еритропоетине полезна и когато клетка, тъкан или орган са изолирани отваскулатурата на индивида, като по този начин съществуватобикновено ех-νϊνο за период от време, като терминътизолиран се отнася до ограничаване или клампиране наваскулатурата към клетката, тъканта, органа или частта оттялото, като например може да бъде извършено по време нахирургична операция, включително в частност до кардио-пулмонарна байпас хирургия; заобикаляне васкулатурата наклетката, тъканта, органа или частта от тялото;отстраняване клетката, тъканта, органа или частта от тялоот тялото на бозайник, като това може да се извършипредварително при ксенотрансплантация или преди и по времена автотрансплантация; или травматично ампутиране на 30 12 клетка, тъкан, орган или част от тяло. По този начин тозиаспект на изобретението се отнася до перфузия серитропоетин както ίη зИи, така и ех νίνο. Ех νίνοеритропоетина може да бъде вложен в консервираща течност 5 за клетка, тъкан или орган. При всеки аспект прилаганетоможе да бъде чрез непрекъсната перфузия, пулсиращаперфузия, инфузия, окъпване, инжектиране иликатетеризиране. В един следващ аспект изобретението се 10 отнася до метод за защита, поддържане, усилване или възстановяване на клетка, тъкан, орган или част от тяло,които вкючват еритропоетин-чувствителна клетка или тъкан,които клетка, тъкан, орган или част от тяло са изолираниот тялото на бозайник. Методът включва поне подлагане на 15 въздействие на клетка, тъкан или орган на бозайник иличаст от тялото на известно количество еритропоетин впродължителност, която е ефективна да защити, поддържа,увеличи или възстанови гореспоменатата жизнеспособност. Внеограничителни примери, изолацията се отнася до 20 ограничаване или клампиране на васкулатурата на или до клетката, тъканта, органа или частта от тялото, както може да се изпълни по време на хирургическа операция, вчастност кардио-пулмонарна байпас хирургия; заобикаляневаскулатурата на клетката, тъканта, органа или частта от 25 тялото; отстранявайки клетката, тъканта, органа или часттаот тялото от тялото на бозайник, което може да се извършипреди хсенотрансплантация, или преди и по време на автотрансплантация; или травматична ампутация на клетка,тъкан, орган или част от тяло. Така този аспект на 30 изобретението се отнася до перфузия на еритропоетин кактогп зИи, така и ех-νίνο. Εχ-νίνο еритропоетина може да 13 бъде предвиден в клетъчна, тъканна или органнаконсервираща течност. При всеки аспект прилагането можеда бъде чрез непрекъсната перфузия, пулсираща перфузия,инфузия, окъпване, инжектиране или катетеризиране. 5 В гореспоменатото изолиране или ех-νΐνο прилагане, полезен еритропоетин може да бъде всеки отгореспоменатите еритропоетини, включително природен еритропоетин, или еритропоетин аналог, еритропоетинмиметик и еритропоетин фрагмент, хибридна еритропоетин 10 молекула, еритропоетин-рецептор свързваща молекула,еритропоетин агонист, бъбречен еритропоетин, мозъченеритропоетин, техен олигомер, техен мултимер, техен мутеин, техен конгенер, тяхна природноно съществуващаформа, тяхна синтетична форма, тяхна рекомбинантна форма, 15 техен гликозилатен вариант, техен дегликозилатен вариант,или тяхна комбинация. Всяка форма на еритропоетинспособна да въздейства благоприятно на еритропоетин-чувствителни клетки е включена в този аспект наизобретението. Други еритропоетини включват, но не са 20 ограничени до асиалоеритропоетин, Ν-дегликозилат » еритропоетин, О-дегликозилат еритропоетин, еритропоетин с ·> намалено въглехидратно съдържание, еритропоетин спроменени гликозилатни структури, еритропоетин с окислении след това редуцирани въглехидрати, арилглиоксал 25 модифициран еритропоетин, алкилглиоксал модифициранеритропоетин, 2,3-бутандион модифициран еритропоетин,циклохександион модифициран еритропоетин, биотинизиранеритропоетин, Ν-алкилизиран-лизил еритропоетин, глюцитолиллизин еритропоетин, алфа-деокси-алфа-фруктолизин 30 еритропоетин, карбамилиран еротропоетин, ацетилизиранеритропоетин, сукцинилиран еритропоетин, алфа- 14 карбоксиалкил еритропоетин, нитриран еритропоетин, йодиран еритропоетин, като с горното се именоват неограничителни примери, базирани на изложените в настоящето описание изследвания. Предпочита се човешки еритропоетин; а най се 5 предпочита природен човешки еритропоетин. В друго изпълнение се предпочита човешки асиалоеритропоетин. Вследващо изпълнение се предпочита човешки фенилглиоксалеритропоетин. Чрез нелимитиращи примери гореспоменатите 10 ех-νίνο еритропоетин-чувствителни клетки или тъкани могатда бъдат или да съдържат нервни, ретинни, мускулни,сърдечни, белодробни, чернодробни, бъбречни, малки чревни,надбъбречни кортексни, надбъбречни медуларни, капилярниендотели, тестисни, яйчникови, или ендометриални клетки 15 или тъкани. Тези примери на еритропоетин-чувствителниклетки са само илюстративни. Всички от горните методи и използвания са запредпочитане приложими при човек, но така също са полезнии при всеки бозайник, като например, но не ограничено до 20 животни компаньони, домашни животни, добитък и животни от·' зоологическа градина. Начините на прилагане на гореспоменатите фармацевтични състави включват орално,интравенозно, интраназално, топично, интралуменално,инхалационно или парентерално прилагане, като последното 25 включва ентравенозно, интраартериално, субкутанно,интрамускулно, интраперитонеално, субмукозно илиинтрадермално. За ех-νίνο употреба се предпочита разтворза перфузия или окъпване. Това включва перфузия визолирана част от васкулатурата ίη зИи. 30 В един друг аспект на изобретението, всеки от гореспоменатите еритропоетини е полезен при приготвяне 15 10 15 20 25 на фармацевтичен състав за възстановяване нефункциониращиклетка, тъкан или орган, когато е приложен след началотона заболяването или условието, в резултат на което еполучена дисфункцията. Като неограничителен пример можеда се посочи прилагането на фармацевтичен състав съдържащеритропоетин за възстановяване когнитивната функция приживотни, прекарали преди това мозъчна травма, дори когатоприлагането е дълго след като травмата (например, три дни,пет дни, седмица, месец, или по-дълго) е утихнала.Еритропоетини полезни за такива приложения включват всекиот изброените по-горе еритропоетини или всеки природенеритропоетин, или еритропоетин аналог, еритропоетинмиметик и еритропоетин фрагмент, хибридна еритропоетинмолекула еритропоетин-рецептор свързваща молекула,еритропоетин агонист, бъбречен еритропоетин, мозъченеритропоетин, техен олигомер, техен мултимер, техенмутеин, техен конгенер, тяхна природноно срещана форма,тяхна синтетична форма, тяхна рекомбинантна форма, техенгликозилатен вариант, техен дегликозилатен вариант, илитяхна комбинация. Всяка форма на еритропоетин способна давъздейства благотворно на еритропоетин-чувствителни клеткие обхваната от това изобретение. Други еритропоетинпроизводни, които могат да бъдат полезни за гореспоменатите цели и фармацевтични състави включваткакто природни еритропоетини, така и еритропоетини, коитоса били променени чрез поне една модификация в сравнение сприродния еритропоетин, и за предпочитане в сравнение сприроден човешки еритропоетин. Поне едната модификацияможе да бъде модификация на поне една аминокиселина наеритропоетин молекулата, или модификация на поне единвъглехидрат на еритропоетин молекулата. Разбира се, 30 16 еритропоетин молекули полезни за настоящите цели могат даимат множество модификации в сравнение с природнатамолекула, като например множество модификации нааминокиселинната част на молекулата, множество модификации 5 на въглехидратната част на молекулата, или поне една модификация на аминокиселинната част на молекулата и понеедна модификация на въглехидратната част на молекулата.Модифицираната еритропоетин молекула запазва способносттаси да защитава, поддържа, увеличава или възстановява 10 функцията или жизнеспособността на еритропоетин- чувствителни клетки на бозайник, както и други свойства наеритропоетин молекулата неотнасящи се към гореспоменатото,а някои свойства по желание могат да отсъстват в сравнениес природната молекула. Предпочита се човешки 15 еритропоетин; а най се предпочита природен човешкиеритропоетин. В едно други изпълнение се предпочитачовешки асиалоеритропоетин. В едно друго изпълнение изобретениеторазкрива методи за използване на гореспоменатия 20 еритропоетин за възстановяване нефункциониращи клетка, > тъкан или орган, когато е приложен след началото на заболяването или условието, в резултат на което е полученадисфункцията. Като неограничителен пример могат да сепосочат методи за прилагането на фармацевтичен състав 25 съдържащ еритропоетин за възстановяване когнитивната функция при животни, прекарали преди това мозъчна травма,дори когато прилагането е дълго след като травмата(например, три дни, пет дни, седмица, месец, или по-дълго)е утихнала. Еритропоетини полезни за такива методи 30 включват всеки от изброените по-горе еритропоетини иливсеки природен еритропоетин, или еритропоетин аналог, 17 еритропоетин миметик и еритропоетин фрагмент, хибриднаеритропоетин молекула, еритропоетин-рецептор свързващамолекула, еритропоетин агонист, бъбречен еритропоетин,мозъчен еритропоетин, техен олигомер, техен мултимер,техен мутеин, техен конгенер, тяхна природно срещанаформа, тяхна синтетична форма, тяхна рекомбинантна форма,техен гликозилатен вариант, техен дегликозилатен вариант,или тяхна комбинация. Всяка форма на еритропоетинспособна да въздейства благотворно на еритропоетин-чувствителни клетки е обхваната от това изобретение. Други еритропоетин производни, които могат да бъдатполезни за гореспоменатите цели и фармацевтични съставивключват както природни еритропоетини, така и еритропоетини, които са били променени чрез поне еднамодификация в сравнение с природния еритропоетин, и запредпочитане в сравнение с природен човешки еритропоетин.Поне едната модификация може да бъде модификация на понеедна аминокиселина на еритропоетин молекулата, илимодификация на поне един въглехидрат на еритропоетинмолекулата. Разбира се, еритропоетин молекули полезни занастоящите цели могат да имат множество модификации всравнение с природната молекула, като например множествомодификации на аминокиселинната част на молекулата,множество модификации на въглехидратната част намолекулата, или поне една модификация на аминокиселиннатачаст на молекулата и поне една модификация на въглехидратната част на молекулата. Модифициранатаеритропоетин молекула запазва способността си да защитава,поддържа, увеличава или възстановява функцията илижизнеспособността на еритропоетин-чувствителни клетки набозайник, както и други свойства на еритропоетин 18 молекулата неотнасящи се към гореспоменатото, а някоисвойства по желание могат да отсъстват в сравнение сприродната молекула. Предпочита се човешки еритропоетин;а най се предпочита природен човешки еритропоетин. В едно 5 други изпълнение се предпочита човешки асиалоеритропоетин. В един друг следващ аспект на настоящетоизобретение са разкрити методи да улесняване трансцитозатана молекула през ендотелна клетъчна бариера у бозайникчрез прилагане на състав към молекула асоциирана с 10 еритропоетин, като например: еритропоетин нямащ поне следиот сиалова киселина; еритропоетин нямащ поне никакъв Ν-свързан или никакъв О-свързан въглехидрат; еритропоетинима поне намалено въглехидратно съдържание получено чрезобработване на еритропоетин и негови природни въглехидрати 15 с поне една гликозидаза; еритропоетин с въглехидратна частна еритропоетин молекулата имаща поне една небозайниковагликозилатна структура, получен от експресията нарекомбиниран еритропоетин в небозайникови клетки;еритропоетин имащ поне един или повече оксидирани 20 въглехидрати, които могат също да бъдат химическиредуцирани; еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; еритропоетин имащ понеедин или повече лизинови остатъци или модификация на Ν-терминална аминогрупа на еритропоетин молекулата; 25 еритропоетин имащ поне един или повече модифицирани тирозинови остатъци; еритропоетин имащ поне модифицираностатък на аспаргинова киселина или на глютаминоватакиселина; еритропоетин имащ поне модифициран триптофановостатък; еритропоетин имащ поне една отстранена амино 30 група; еритропоетин имащ поне начало на поне една от цистинните връзки в еритропоетиновата молекула; разкрит е 19 еритропоетин имащ поне една субституция на поне еднааминокиселина; или съкратен еритропоетин. 10

15 20 25 Свързването между молекулата, която трябвада се транспортира и еритропоетина може да бъде, например,лабилна ковалентна връзка, стабилна ковалентна връзка илинековалентна асоциация със свързваща страна за молекулата.Ендотелната клетъчна бариера може да бъде кръвно-мозъчнатабариера, кръвно-очната бариера, кръвно -тестиснатабариера, кръвно-яйчниковата бариера и кръвно-плацентнатабариера. Подходящи транспортни молекули за метода отнастоящето изобретение включват хормони, като напримеррастежен хормон, антибиотици и антиракови агенти. Следващ аспект на настоящето изобретениеразкрива състав за улесняване трансцитозата на молекулапрез ендотелна клетъчна бариера в бозайник, тоди съставвключва тази молекула в асоциация с еритропоетин, като например еритропоетин поне нямащ следи от сиалова киселина; еритропоетин поне нямащ никакви Ν-свързани илиО-свързани въглехидрати; еритропоетин имащ поне намаленосъдържание на въглехидрат от третиране на природенеритропоетин с поне една гликозидаза; еритропоетин свъглехидратна част на модифицираната еритропоетин молекулаимащ поне небозайникова гликозилатна структура, получен отекспресията на рекомбиниран еритропоетин в небозайниковиклетки; еритропоетин имащ поне един или повече оксидиранивъглехидрати, които могат също да бъдат химическиредуцирани; еритропоетин имащ поне един или повечеаргининови остатъци; еритропоетин съдържащ поне един илиповече модифицирани лизинови остатъци или модификация наΝ-терминална аминогрупа на еритропоетин молекулата;еритропоетин имащ поне модифициран тирозинов остатък; 30 20 еритропоетин имащ поне модифициран остатък на аспаргиновакиселина или на глютаминовата киселина; еритропоетин имащпоне модифициран триптофанов остатък; еритропоетин имащпоне една отстранена амино група; еритропоетин имащ поне начало на поне една от цистинните връзки в еритропоетиновата молекула; разкрит е еритропоетин имащпоне една субституция на поне една аминокиселина; илисъкратен еритропоетин. Свързването може да бъде, например, лабилнаковалентна връзка, стабилна ковалентна връзка илинековалентна асоциация със свързваща страна за молекулата.Ендотелната клетъчна бариера може да бъде кръвно-мозъчнатабариера, кръвно-очната бариера, кръвно -тестиснатабариера, кръвно-яйчниковата бариера и кръвно-плацентнатабариера. Подходящи транспортни молекули за метода отнастоящето изобретение включват хормони, като напримеррастежен хормон, антибиотици и антиракови агенти. В един друг следващ аспект на настоящетоизобретение всеки от гореспоменатите еритропоетини саполезни за приготвянето на фармацевтичен състав заулесняване трансцитозата на молекула през ендотелнаклетъчна бариера у бозайник, този състав съдържамолекулата асоциирана с еритропоетин, като например: еритропоетин нямащ поне следи от сиалова киселина;еритропоетин нямащ поне никакъв Ν-свързан или никакъв 0-свързан въглехидрат; еритропоетин има поне намаленовъглехидратно съдържание получено чрез обработване наприроден еритропоетин с поне една гликозидаза; еритропоетин с въглехидратна част на модифициранатаеритропоетин молекула имащ поне една небозайниковагликозилатна структура, получен от експресията на 21 рекомбиниран еритропоетин в небозайникови клетки; еритропоетин имащ поне един или повече оксидиранивъглехидрати, които могат също да бъдат химическиредуцирани; еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; еритропоетин имащ понеедин или повече модифицирани лизинови остатъци илимодификация на Ν-терминална аминогрупа на еритропоетинмолекулата; еритропоетин имащ поне модифициран тирозиновостатък; еритропоетин имащ поне модифициран остатък нааспаргинова киселина или на глютаминовата киселина;еритропоетин имащ поне модифициран триптофанов остатък;еритропоетин имащ поне една отстранена амино група; еритропоетин имащ поне начало на поне една от цистинните връзки в еритропоетиновата молекула; разкрит е еритропоетин имащ поне една субституция на поне еднааминокиселина; или съкратен еритропоетин. Свързването може да бъде, например, лабилнаковалентна връзка, стабилна ковалентна връзка илинековалентна асоциация със свързваща страна за молекулатаЕндотелните клетъчни бариери могат да бъдат кръвно-мозъчната бариера, кръвно-очната бариера, кръвно -тестисната бариера, кръвно-яйчниковата бариера и кръвно-плацентната бариера. Подходящи транспортни молекули заметода от настоящето изобретение включват хормони, катонапример растежен хормон, антибиотици и антиракови агенти Тези и други аспекти на настоящетоизобретение ще бъдат по-добре оценени при позоваването наследващите фигури и детайлното описание. 22 КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ Фигура 1описва транслокацията напарентерално въведен еритропоетин в цереброспиналната течност. 5 Фигура 2 показва защитата на миокарда от исхемични увреждания с помощта на еритропоетин след временна васкуларна оклузия. Фигура 3 показва поддържане функцията насърце, приготвено за трансплантация с помощта на 10 еритропоетин. ' Фигура 4 сравнява ίη-νίίΓο ефикасността на еритропоетин и асиалоеритропоетин върху жизнеспособносттана изтощени серумни Р19 клетки. Фигура 5 е друг експеримент, при който се 15 сравнява ίη-νίίΓΟ ефикасността на еритропоетин и асиалоеритропоетин върху жизнеспособността на изтощенисерумни Р19 клетки. Фигура б сравнява ϊη-νϊίΓΟ ефикасността наеритропоетин и фенилглиоксал модифициран еритропоетин 20 върху жизнеспособността на изтощени серумни Р19 клетки. Фигура 7 показва защитата на еритропоетин иасиалоеритропоетин при модел на огнищна церебрална исхемияпри плъх. Фигура 8 показва отговор на доза при25 сравняване ефикасността на човешки еритропоетин и човешки асиалоеритропоетин върху оклузия на средната церебралнаартерия при модел на исхемичен удар. Фигура 9 показва въздействието набиотинизиран еритропоетин и асиалоеритропоетин в пробата 30 Р19. 23 Фигура 10 показва активността на йодиранеритропоетин в пробата Р19. Фигура 11 описва ефектите от еритропоетинлечение върху модел на глаукома при плъх. Фигура 12 показва степенна на предпазване наретинната функция с помощта на еритропоетин върху модел наглаукома при плъх. Фигура 13 описва възстановяването накогнитивната функция след прекарана мозъчна травма приприлагане на еритропоетин, започвайки пет дена следтравмата. Фигура 14 описва възстановяването накогнитивната функция след прекарана мозъчна травма приприлагане на еритропоетин, започвайки 30 дена следтравмата. Фигура 15 описва ефикасността на човешкиасиалоеритропоетин върху модел кайнат на церебрална токсичност. ДЕТАЙЛНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО "Еритропоетин-чувствителна клетка" се отнасядо клетка на бозайник, чиято функция или жизнеспособностможе да бъде поддържана, подпомагана, увеличавана,съживена или по всякакъв друг начин подобрена подвъздействието на еритропоетин. Неограничаващи примери натакива клетки включват нервни, ретинални, мускулни,сърдечни, белодробни, чернодробни, бъбречни, малки чревни,надбъбречни кортексни, надбъбречни медуларни, капилярниендотели, тестисни, яйчникови, или ендометриални клетки.Освен това такива еритропоетин-чувствителни клетки и 24 осигурените ползи върху тях посредством еритропоетин могатда бъдат разширени и да се осигури защита или усилванеиндиректно към други клетки, които не са директно чувствителни на еритропоетин, или на тъкани или органи, 5 които съдържат такива клетки нечувствителни на еритропоетин. Тези други клетки, или тъкени или органи,които индиректно се облагодетелстват от усилването наеритропоетин-чувствителните клетки се представят като частот клетките, тъканите или органите като "асоциирани" 10 клетки, тъкани и органи. По този начин подобренията отеритропоетин, каквито са описаните тук, могат да бъдатпредвидени като резултат от наличието на малък брой иличаст от еритропоетин-чувствителни клетки в тъкан илиорган, например възбудими или нервни тъкани налични в 15 такава тъкан, или клетките на ЬеусИд в тестисите, коитопродуцират тестостерон. В един аспект, еритропоетин-чувствителната клетка или асоциираните към нея клетки,тъкани или органи не са възбудими клетки, тъкани илиоргани, или не съдържат преобладаващо количество възбудими 20 клетки или тъкани. Методите съгласно изобретението сапредвидени за локална или системна защита или усилване наклетки, тъкани и органи в тяло на бозайник, под голяморазнообразие от нормални и неблагоприятни състояния, или 25 защита на такива, които са предназначени за прехвърляве вдруго тяло на бозайник. В допълнение също така епредвидено възстановяването или съживяването надисфункция. Както беше споменато по-горе, способността наеритропоетин да преминава през непроницаема ендотелна 30 клетъчна бариера и да упражнява положителни ефекти върхуеритропоетин-чувствителни клетки (както и върху други 25 типове клетки) отдалечени от васкулатурата предлагапотенциалната възможност за предотвратяване, както илекуване на голямо разнообразие от състояния изаболявания, които иначе причиняват значителни клетъчни итъканни поражения при животни, включително и при човек, и освен това осигурява успех при до този момент неизвършвани хируртически процедури, при които рискът традиционнопреобладава над ползите. Продължителността и степента наумишлено предизвикани неблагоприятни състояния, причинявани за досигане до краен успух, такива като високадоза химиотерапия, лъчетерапия, удължено ех-νίνο оцеляванепри трансплантация, и удължени периоди на хирургическипричинена исхемия, могат да бъдат допускани при използванена предимствата на настоящето изобретение. Обаче изобретението не е по такъв начин ограничено, а включвакато един аспект митоди и състави, при които таргетните еритропоетин-чувствителни клетки са отдалечени от васкулатурата от ендотелната клетъчна бариера или отнепроницаеми ендотелни връзки. Най-общо изобретението сеотнася до всякакви еритропоетин-чувствителни клетки и асоциирани с тях клетки, тъкани и органи, които могат дасе повлияват благоприятно под въздействието наеритропоетин. Освен това клетъчна, тъканна или органнадисфункция може да бъде възстановена или съживена следакутно неблагоприятно събитие (като например травма) чрезвъздействие с еритропоетин. Изобретението затова основно е насочено къмизползването на еритропоетини за приготовление нафармацевтични състави за гореспоменатите цели, при коетоклетъчната функция се поддържа, подпомага, усилва,съживява, или във всеки случай се подобрява. 26 Изобретението също така е насочено към методи за поддържане, усилване, подпомагане или съживяване наклетъчна функция чрез прилагане върху животно на ефективноколичество еритропоетин, както е описано тук. Изобретението освен това е насочено към методи за поддържане, подпомагане, усилване или съживяване наклетъчна функция ех νϊνο чрез въздействие върху клетки,тъкан или орган с еритропоетин. Изобретението също така енасочено към перфузен състав съдържащ еритропоетин заизползване при консервиране на орган или или тъкан. Различни методи на изобретението използватфармацевтичен състав, който включва поне еритропоетин вефективно количество за определен начин или продължителност на въздействие за да се постигнат положителни въздействия или ползи върху еритропоетин-чувствителни клетки във или отстранени от тяло набозайник. Там където прицелната клетка, тъкани или органипри предвидената за целта терапия изисква еритропоетина дапремине през ендотелна клетъчна бариера, фармацевтичниясъстав включва еритропоетина в концентрация, коятопозволява, след преминаването през ендотелната клетъчнабариера, постигането на неговите желани въздействия върхуеритропоетин-чувствителните клетки. Молекули способни давзаимодействат с еритропоетин рецептори и да изменятактивността на рецептора, тук наречени като еритропоетинили еритропоетин рецептор модулатори на активността, саполезни в контекста на настоящето изобретение. Тезимолекули могат да бъдат например природно срещани,синтетични или рекомбинантни форми на еритропоетинмолекули, както е описано по-горе, или други молекули,които могат да не приличат задължително на еритропоетин в 27 какъвто и да е вид, освен да модулират активност в еритропоетин чувствителна клетка, както е описано тук. Еритропоетин е гликопротеинов хормон, койтопри хората има молекулно тегло от около 34 кОа. Изграденият протеин съдържа 165 аминокиселини, агликозилните остатъци съдържат около 40% от теглото намолекулата. Формите на еритропоети, които са полезни заизползване съгласно настоящето изобретение, обхващатприродно срещани, синтетични и рекомбинантни форми наследните човешки и на други бозайници еритропоетин-чувствителни клеткки: еритропоетин, асиалоеритропоетин, дегликозилатен еритропоетин, еритропоетинови аналози,еритропоетинови миметици, еритропоетинови фрагменти,хибридни еритропоетин молекули, еритропоетин-рецепторсвързващи молекули, еритропоетин агонисти, бъбреченеритропоетин, мозъчен еритропоетин, техен олигомер, техни олигомери и мултимери, техни мутеини, и техни конгенери. В допълнение формите на еритропоетин, които са полезни приприлагането на настоящето изобретение включват протеини,които функционално представляват еквиваленти на геннипродукти. Такъв еквивалентен на еритропоетин гененпродукт включва мутантни еритропоетини, които могат дасъдържат делеции, включително вътрешни делеции, вставки, включително вставки, носещи слети протеини, или консервативни субституции на аминокиселинни остатъци ви/или съседни на аминокиселинната секвенция, но коеторезултира в "тиха" промяна, при което промяната продуцирафункционално еквивалентен еритропоетин. Такивааминокиселинни субституции могат да бъдат направени набазата на подобие в поляритета, товара, разтворимостта,хидрофобността, хидрофилията, и/или амфипатичната природа 28 на въвлечените остатъци. Например, неполярни (хидрофобни)аминокиселини включат аланин, левцин, изолевцин, валин,пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярнинеутрални аминокиселини включват глицин, серин, треонин, 5 цистеин, тирозин, аспарагин, и глутамин; позитивнонатоварени (основни) аминокиселини включват аргинин,лизин, и хистидин; и негативно натоларени (кисели)аминокиселини включват аспаргинова киселина и грутаминовакиселина. Алтернативно, неконсервативни аминокиселинни 10 промени и големи вставки и делеции могат да бъдатизползвани за създаване на функционално променениеритропоетинови мутации. Такива мутации могат да бъдатизползвани за да се променят свойствата на еритропоетинапо желани начини. Например в едно изпълнение еритропоетин 15 полезен за прилагане на изобретението може да бъде мутиралеритропоетин, променен в една или повече аминокиселини вчетирите функционални зони на еритропоетин, коитовъздействат рецепторното свързване: νΣζ)ΚΥ и/или ΤΚνΝΓΥΑΝи/или ЗСЪКЗЬТТЬ и/или 3ΝΓΣΚΟ. В друго изпълнение могат да 20 бъдат използвани еритропоетините съдържащи мутации взаобикалящите области на молекулата, които въздействат * кинетичните или рецептор-свързващите свойства намолекулата. Термините "еритропоетин", както и "един 25 еритропоетин" могат да бъдат използвани равнозначно илизаедно, и различни аналози, фрагменти, хибридни молекули,агонисти, мутеини и други форми, както са описани по-горе,и обхващат вариантите по продълженията на и сайтовете наеритропоетин гликозилата, включително природен, 30 дегликозилатен, асиализиран и други частично гликозилатниформи на еритропоетин. Неограничаващи примери на такива 29 варианти са описани в Тзиба еб а1., 1990, Еиг. й.Вгосйет.188:405-411, включени тук с препратка. Бактерия, мая,инсект, растение, бозайник, включително човет. Вдопълнение множество от гостоприемните системи могат дабъдат използвани за експресия и произвеждане нарекомбинантен еритропоетин, включително, но не ограниченодо бактерия, мая, инсект, растение и бозайник, включителночовек, клетъчни системи. Например рекомбинантенеритропоетин продуциран в бактерия, който не правипродукта гликозилат или сиалат, може да бъде използван запроизвеждане на не-гликозилатни форми на еритропоетин.Алтернативно, рекомбинантен еритропоетин може да бъдепродуциран в други системи, които правят гликозилат, например растения, включително човешки клетки. Както беше отбелязано по-горе, настоящетоизобретение обхваща всяка и всички молекули модулатори наактивността на еритропоетин рецептори, способни даупражняват положително въздействие върху еритропоетин-чувствителни клетки, без да се вземат предвид всякаквивзаимоотношения на молекулата с еритропоетина. В допълнение сам за себе си еритропоетинаможе да бъде модифициран да въздейства върху специфичнатъкан или тъкани. Няколко неограничителни стратегии,които могат да се прилагат за да се получи тази желанатъканна специфичност включва модификации, които съкращаватциркулационния полуживот и по този начин намаляватвремето, за което еритропоетина може да взаимодейства серитроидни прекурсори, или модификация на първичнатаструктура на еритропоетин молекулата. Един подход занамаляване на циркулационния полуживот е да се отстраниили модифицират гликозилатните частици, при които 30 еретропоетин има три Ν-свързани и една О-свързана. Такиваварианти на гликозилатен еритропоетин могат да бъдатпродуцирани по множество начини. Например сиаловитекиселини, които завършват края на захарните вериги могат 5 да бъдат отстранени чрез специфични сиалидази в зависимостот химическата връзка свързваща сиаловата киселина къмзахарната верига. Алтернативно, гликозилатната структураможе да бъде разрушена по различни начини чрез използванена други ензими, които разцепват на специфични 10 съединявания. Техниките за модифициране на първичнатаструктура са неизброими и включват субституция наспецифични аминокиселини, химическо модифициране нааминокиселини, или добавяне на други структури, коитоинтерферират при взаимодействието на еритропоетин с всеки 15 от неговите рецептори. Използването на такива форми наеритропоетин е напълно обхванато от настоящето. В еднопредпочитано изпълнение полуживотът на не-еритропоетичнияеритропоетин от изобретението е намалено с около 90% оттози в природния еритропоетин. 20 Някои от тези молекули въпреки това ще имитират действията на самия еритропоетин в други тъканиили органи. Например, 17-мер съдържащ аминокиселиннатасеквенция от 31-47 на природен еритропоетин е неактивнапри еритропоеза, но е напълно активна при нервни клетки ίη 25 νϊίΓΟ (Сатрапа & О'Вгтеп, 1998: 1пР. 3. Мо1. Меб. 1:235-41). Освен това, производни еритропоетинови молекули, предпочитани при тук описаните използвания,могат да бъдат генерирани чрез гуанидинизация, амидинация,карбамилизация (карбамоилизация), тринитрофеилизация, 30 ацетилизация, сукцинилизация, нитриране, или модифициранена аргининови, лизинови, тирозинови, триптофанови, или 31 цистеинови остатъци или карбоксилни групи, сред другипроцедури, такива като лимитирана протеолиза, отстраняванена аминогрупи, и/мутационна субституция на аргининови,лизинови, тирозинови, триптофанови, или цистеиновиостатъци чрез молекулярни биологични техники, за да сепроизведат еритропоетини, които поддържат адекватно нивона активност за специфични органи и тъкани, но не задруги, такива като еритроцити (например, Забаке еб а1;1990, Βίοϋϊιίπι. ВъорЪуз. Ас£а 1038:125-9; инкорпорирано тукчрез препратка в неговата цялост). Един неограничителенпример, както е описан по-долу, е модификацията наеритропоетин аргининови остатъци чрез реакция с глиоксал,като например фенилглиоксал (съгласно протокола наТакаказЬг, 1977, В1осВет. 81:395-402). Както ще бъдепоказано по-долу, такава еритропоетинова молекула напълнозапазва нейния невротрофичен ефект. Такива еритропоетинови молекули са напълно обхванати за различните използвания и състави описани тук. Синтетични и рекомбинантни молекули, катонапример мозъчен еритропоетин и бъбречен еритропоетин,рекомбинантни форми на еритропоетин на бозайник, както инеговите природно срещащи се, извлечени от тумор ирекомбинантни изоформи, такива като експресия нарекомбинантни молекули и такива изготвени чрез хомоложнарекомбинация, са разкрити тук също. Освен това настоящетоизобретение включва молекули включващи пептиди, коитосвързват еритропоетин рецептора, както и рекомбинантноизградени или други молекули, които притежават част илицялата структура и/или биологичните свойства наеритропоетин, включително фрагменти и мултимери наеритропоетин или негови фрагменти. Описаният тук 32 еритропоетин обхваща молекули с променени еритропоетинрецептор свързващи свойства, за предпочитане с увеличенрецепторен афинитет, в частност отнасящ се до усиленпренос през ендотелните клетъчни бариери. Мутеини 5 съдържащи молекули, които имат допълнителен или намаленброй гликозилатни сайтове. Както беше отбелязано по-горе,терминът "еритропоетин" и "миметици", както и другитермини, са използвани тук без да се променят, като сеотнасят до еритропоетин-чувствителните клетъчни защитни и 10 усилващи молекули, отнасящи се до еритропоетин, както имолекулите, които са способни да преминават презендотелните клетъчни бариери. Освен това молекули получени чрезтрансгенеза при животни също са обхванати тук. Трябва да 15 се отбележи, че еритропоетиновите молекули, които саобхванати в настоящето, не наподобяват непременноструктурно еритропоетин, или по какъвто и друг начин,освен за способността за взаимодействие с еритропоетинрецептор или модулирана еритропоетин активност, или 20 активирани еритропоетин-активирани сигнални каскади, както е описано тук. Чрез неограничаващи примери, форми наеритропоетин, които са полезни за прилагането нанастоящето изобретение включват еритропоетинови мутеини, 25 като тези, с променени аминокиселини в карбоксилния край,описани в Патент на САЩ 5,457,089 и в Патент на САЩ4,835,260; изоформи на асиалоеритропоетин и наеритропоетин с различен брой на остатъците на сиаловакиселина за молекула, така както са описани в Патент на 30 САЩ 5,856,298; полипептиди описани в Патент на САЩ 4,703,008; агонисти описани в Патент на САЩ 5,767,078; 33 пептиди, които се свързват към еритропоетин рецептор,както е описано в Патент на САЩ 5,773,569 и 5,830,851;ниско молекулни миметици, които активират еритропоетинрецептора, както е описано в Патент на САЩ 5,835,382; и 5 еритропоетин аналози описани в N0 9505465, N0 9718318, иΡίΟ 9818926. Всички гореспоменати позовавания саинкорпорирани тук в такъв обхват, в какъвто тези разкритиясе отнасят до различните алтернативни форми или процеси заприготвяне на такива форми на еритропоетините от 10 настоящето изобретение. Еритропоетин може да се намери в търговската мрежа, например под търговските марки РКОСВ1Т, произвежданот ОгбПо ВгобесЬ 1пс., Каггбап, Ьи и ΕΡΟΟΕΝ от Атдеп, 1пс., Тйоизапб. оакз, СА. 15 Активността (в единици) на еритропоетин (еритропоетин) и еритропоетин подобни молекули обикновеносе определя на базата на неговата ефективност пристимулиране производството на червени клетки в модели нагризачи (и както се предвижда в международните стандарти 20 за еритропоетин). Една единица (и) от редовен еритропоетин (МДО от -34,000) е -8 пд протеин (1 тд протеине приблизително 125,000 и). Обаче, тъй като въздействиетовърху еритропоезата е случайно по отношение на желанататук активност и не е задължително да бъде доловимо 25 свойство на някои от еритропоетините от изобретението, неможе да се даде дефиниция на активността базирана върхуеритропоетичното действие. Така, както е използвано тук,активната единица еритропоетин, или еритропоетин свързанимолекули, е дефинирано като количеството протеин, 30 необходимо за предизвикване на същата активност в неутрални или други еритропоетин-чувствителни клетъчни 34 системи, както е установено в международните стандарти наСЗО за еритропоетин за същата система. Специалистът вобластта ще може лесно да определи единиците на не-еритропоетичния еритропоетин или свързана молекула, 5 следвайки дадените тук напътствия. Освен горесоменатите модификации наеритропоетин, които могат да бъдат полезни тук, следващатадискусия се простира върху различните еритропоетинисъгласно изобретението. 10 Еритропоетина съгласно изобретението поне може да няма никакви следи от сиалова киселина, катоотнесен към асиалоеритропоетин. За предпочитанееритропоетина от изобретението е човешки асиалоеритропоетин. В алтернативни изпълнения 15 модифицираният еритропоетин от изобретението може да иманай-малко 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12, или 13 остатъка отсиалова киселина. Може чрез десиалилиране да бъдеприготвен еритропоетин имащ сиалидаза, така както еописано от производителя Ргогуте 1пс., Зап Ьеапбго, 20 СаИ£огп1а върху опаковката за Сиалидаза А. Обикновено,ΡΚΟΖΥΜΕ® СЬУСОКРО® секвенция клас 3ΙΑ1.ΥΟΑ3Ε А™ (Νацетилневраминат гликохидролаза, ЕС 3.2.1.18) се използваза разцепване на всички нередуцирани терминални сиалокиселинни остатъци от комплекса въглехидрати и 25 гликопротеини, такива като еритропоетин. Това също щеразцепи разклонените сиалови киселини (свързани къмвътрешен остатък). Сиалидаза А е изолирана от клон наАг£ЪгоЪас£ег игеаГасгепз. Еритропоетин може да има поне намален брой 30 от Ν-свързани въглехидрати. За да се отстранят Ν-свързанивъглехидрати, еритропоетин може да бъде третиран с 35 хидразин, в съответствие например с методите описани отНегтепРтп ер а1., 1996, С1усоЬ1о1оду 6(2):217-30. Както еотбелязано по-горе, еритропоетин има три Ν-свързанивъглехидратни частици; настоящето изобретение обхваща тези 5 еритропоетини, които имат две, една или нямат Ν-свързанвъглехидрат. Еритропоетин от изобретението може да имапоне редуцирано въглехидратно съдържание чрез третиране наприроден еритропоетин с поне една гликозидаза. Например, 10 може да бъде следвана процедурата на СНеп и ЕчапдеИзРа,1998, Е1есРгор1югез1з 19(15):2639-44. Освен товаотстраняването на О-свързания въглехидрат може да бъдепостигнато следвайки методите описани в Нокке еР а1., 1995, Еиг. СГ.Втоскет. 228(3):981-1008. 15 Въглехидратната част на еритропоетиновата молекула може да има поне небозайников гликозилатен патернчрез експресията на рекомбиниран еритропоетин в небозайникови клетки. За предпочитане еритропоетините сабили експресирани в клетки на инсект или растение. С 20 помощта на неограничителен пример, експресия на еритропоетин в клетки на инсект при използването насистема за експресия на бакуловирус, може да бъдеизвършена в съответствие с 0ие11е ер а1., 1989, ΒΙοοΡ74(2):652-657. Друг метод е разкрит в Патент на САЩ 25 5,637,477. Експресия в растителна система може да бъде проведена в съответствие с метода на МаРзгтоРо ер а1.,1993, Втозсг. ВгоРесЬ. Вгоскет. 57(8):1249-1252.Алтернативно, експресия в бактерия ще резултира внегликозилатни форми на еритропоетин. Това са само 30 примерни методи, които могат да бъдат полезни при 36 производството на еротропоетин съгласно изобретението и поникакъв начин не са ограничителни. Еритропоетин съгласно изобретението може даима поне или най-малко един или повече окислени 5 въглехидрати, които също могат да бъдат химическиредуцирани. Например, еритропоетина може да бъдепериодат-окислен еритропоетин; периодат-окисленияеритропоетин също може да бъде химически редуциран сборохидридна сол, като например натриев борохидрид или 10 натриев цианоборохидрид. Периодатната оксидация на еритропоетин може да се извърши, например, чрез методитеописани от Ь1пз1еу еб а1., 1994, Апа1. Вд-осйет. 219(2):207-17. Химическа редукция след периодатнатаоксидация може да бъде извършена съгласно методите на 15 ТопеШ и Мегпбз, 1978, СГ.5иргатр1. Збгисб. 8(1):67-78. Еритропоетин за гореспоменатите употреби може да има поне един или повече модифицирани аргининостатъци. Например, модифицираният еритропоетин може дасъдържа Н-гликол следа върху единият или повече аргинин 20 остатъци, където К може да бъде арил, хетероарил, ниско1 алкил, ниско алкокси или циклоалкилна група. Както е Г използван тук, терминът ниско "алкил"-на група означавапроста- или разклонено-верижна наситена алифатичнавъглехидратна група, за предпочитане съдържаща 1-6 25 въглеродни атома. Представители на такива групи са метил,етил, изопропил, изобутил, бутил, пентил, хексил и другиподобни. Терминът "алкокси" означава ниско алкидна група,както е дефинирано по-горе, прикрепена към останалата частна молекулата чрез кислород. Примери на алкокси включват 30 метокси, етокси, пропокси, изопропокси или подобни. Терминът "циклоалкил" се отнася до циклични алкидни групи 37 с три до около 8 въглерода, включително напримерциклопропил, циклобутил, циклохексил и подобни. Терминътарил се отнася до фенил и нафтил групи. Терминътхетероарил се отнася до хетероциклични групи съдържащи 4- 5 10 пръстена и 1-3 хетероатоми избрани от групата състояща се от кислород, азот и сяра. Примери включват, но не саограничени до изоксазолил, фенилизоксазолил, фурил,пиримидинил, хинолил, тетрахидрохинолил, пиридил,имидазолил, пирролидинил, 1,2,4-триазойлил, триазолил, 10 тиенил, и други подобни. К-групата може да бъде субституирана, като например 4-трихидроксибутил групата на3-деоксиглюкозон. Типични примери на К-глиоксал съединения са глиоксал, метилглиоксал, 3-деоксиглюкозон, ифенилглиоксал. Предпочитани К-глиоксал съединения са 15 метилглиоксал и фенилглиоксал. Пример за метод за подобнамодификация беше намерен във ДОеЪег еб а1., 1975, 1зг. СГ.Меск 5с1. 11(11):1169-70, използвайки фенилглиоксал. В един следващ пример, поне еидн аргининовостатък може да бъде модифициран чрез реакция с вицинален 20 дикетон, като например 2,3-бутанедион или циклохексанедион, за предпочитане в са.50 милимолар боратбуфер с рН 8-9. Процедура за последната модификация с 2,3бутанедион боже да бъде изпълнена в съответствие сКтогбап, 1973, ВгосЬетгзбгу 12 (20) :3915-3923; и също с 25 циклохексанон в съответствие с Рабббу еб а1., 1975,Т.В1о1.СЬеш 250(2):565-9. Еритропоетин съгласно изобретението може дасъдържа поне един или повече модифицирани лизиновиостатъци или модификация на Ν-терминалната амино група на 30 еритропоетин молекулата, такива модификации като тези врезултат от реакция на лизиновия остатък с амино-груп- 38 модифициращ фактор. В друго изпълнение лизиновитеостатъци могат да бъдат модифицирани чрез реакция сглиоксал производни, такава като реакция с глиоксал,метилглиоксал и 3-деоксиглюкозон за формиране на алфа- 5 карбоксиалкил производни. Примери са реакция с глиоксалза образуване на карбоксиметиллизин, както е показано вС1отЬ и ΜοηηίβΓ, 1995, СГ. ΒίοΙ. СНет. 270 (17 ): 10017-26, или сметилглиоксал за формиране на (1-карбоксиетил) лизин,както е дадено в Оедепйагбб еб а1., 1998, Се11.Μοί.ΒίοΙ. 10 (П1о1зу-1е-дгапс1) 44(7):1139-45. Модифицираният лизиновостатък по-нататък може да бъде химически редуциран.Например, еритропоетина може да бъде биотинизиран презлизинови групи, както е в съответствие с метода описан вПример 5, в който О-биотинол-е-аминокапронова киселина-Ν- 15 хидроксисукцинамид естер беше в реакция с еритропоетин,последвано от отстраняване на нереагирал биотин с помощтана гел филтрация върху Сепбгбсоп 10 колонен, както еописано в Мозсйоизкб Саз1аке, 1989, Βίοοά 74(3):952-8. Втози доклад авторите използват три различни метода за 20 биотинизиране на еритропоетин, всеки от които може да бъдеизползван за приготовляването на еритропоетина занастоящите цели. Виотина може да бъде добавен към (1)следите на сиалова киселина (2) карбоксилатни групи или(3) амино групи. 25 В друго предпочитано изпълнение лизин може да реагира с алдехид или редуцираща захар за да образуваимин, който може да бъде стабилизиран чрез редукция, кактос натриев цианоборохидрид, за да образува Ν-алкилиранлизин, като например глюцитолил лизин, или който в 30 случаите на редуциращи захари може да бъде стабилизиранчрез Атабогб или Неупз преподреждане за да се образува 39 алфа-аеокси алфа амино захар, като например алфа-деокси-алфа-фруктозилизин. Като пример, приготвянето нафруктозилизин-модифициран протеин чрез термостатиране на0.5 М глюкоза в буфер от натриев фосфат при рН 7.4 за 60дни, както е описано от Макгба еР а1. , 1992, СГ.Βϊοΐ. СНет.267:5133-5138. В друг пример, лизиновата група може дабъде карбамилирана, като например чрез реакция с цианатйон, или алкил- или арил-карбамилирана или -тиокарбамилирана с алкил- или арил-изоцианат илиизотиоцианат, или може да бъде ацилирана чрезреактивеналкил- или производна на арилкарбоксилнатакиселина, като например чрез реакция с ацетен анхидрид илисукцинов анхидрид или фталов анхидрид. Като примери могатда се посочат модификацията на лизинови групи с 4-сулфофенилизотиоцианат или с ацетен анхидрид, както саописани в Сао еб а1., 1994, Ргос Иаб1 Асаб 5с1 иЗА91(25):12027-30. Лизиновите групи могат също да бъдаттринитрофенил модифицирани чрез реакция с тринитробензолсулфонова киселина или за предпочитане нейнисоли. Такива методи са описани по-долу в Пример 5. Най-малко един тирозинов остатък наеритропоетин може да бъде модифициран в разположение наароматен пръстен чрез електрофилен реагент, като напримерчрез нитрация или йодиране. С помощта на неограничителенпример, еритропоетин може да реагира с тетранитрометан(Иезб1ег еб а1., 1985, ΟΓ.ΒίοΙ. СПет. 260 (12): 7316-21; илийодиран, както е описано в Пример 5. Поне остатък на аспаргиновата киселина илиостатък на глутаминовата киселина на еритропоетин може дабъде модифициран, като например чрез реакция с карбодиимид, последвано от реакция с амин, като например, 40 но без да се ограничава до глицинамид. Примери на такивамодификации могат да бъдат намерени в Пример 5. В друг пример, трипотофанов остатък наеритропоетин може да бъде модифициран, като например чрез 5 реакция с η-бромосукцинимид или п-хлоросукцинимид, следвайки методите като например описаните в йоззе еб а1.,СПет Βϊοΐ 1пбегасб 1999 Мау 14:119-120. В още един друг пример, еритропоетиноватамолекула може да бъде приготвена чрез отстраняване на поне 10 една амино група, като същото може да се получи чрез реакция с нинхидрин последвано от редукция на подсеквенцията карбонилна група чрез реакция с борохидрид.В още един следващ пример, е разкрит еритропоетин, който има начало на поне една от цистинните 15 връзки в еритропоетиновата молекула чрез реакция с редуциращ агент, като например дитиотреитол, последвано отреакция с подсеквенцията хидросулфати с йодацетамид,йодоцетна киселина или друг електрофил, за да се предотврати реформирнето на дисулфидните връзки. 20 Еритропоетин е разкрит имк поне една . субституция на всяка една от многобройните аминокиселини,като например левцин, с поне един лизин, аргинин,триптофан, тирозин, или цистеин остатъци на еритропоетин,използвайки техники на молекулярната биология. 25 Модифициран еритропоетин може да бъде приготвен чрез подлагане на еритропоетин на ограниченахимическа протеолиза, която цели специфични остатъци,например да разцепи след триптофан остатъци. Такиварезултиращи еритропоетин фрагменти са обхванати от 30 настоящето. 10 15 20 25 30 41 Както беше споменато по-горе, еритропоетинполезен за целите на настоящето изобретение, може да имапоне една от гореспоменатите модификации, но може да има иповече от една от горните модификации. Като пример замодифициран еритропоетин с една модификация във въглехидратната част на молекулата и една модификация ваминокиселинната част, модифицирания еритропоетин може дабъде асиалоеритропоетин и неговите лизинови остатъци дабъдат биотинизирани или карбамилизирани. По този начин различни еритропоетиновимолекули и фармацевтични състави, които ги съдържат, и сапреднацначени за целите, които са описани тук, са включенив настоящето. Такива еритропоетинови молекули включват,но не са ограничени до асиалоеритропоетин, Ν- дегликозилатен еритропоетин, О-дегликозилатен еритропоетин, еритропоетин с намалено въглехидратно съдържание, еритропоетин с променен гликозилатен патерн, еритропоетин с оксидирани и след това редуцирани въглехидрати, арилглиоксал модифициран еритропоетин,алкилглиоксал модифициран еритропоетин, 2,3-бутандионмодифициран еритропоетин, циклохександион модифициранеритропоетин, биотинизиран еритропоетин, Ν-алкилиран лизилелитропоетин, глюцитол лизин еритропоетин, алфа-деокси-алфа-фруктосилизин еритропоетин, карбамилиранеритропоетин, ацетилиран еритропоетин, сукцинилиранеритропоетин, алфа-карбоксиалкил еритропоетин, нитриранеритропоетин, йодиран еритропоетин, като с горното сеименоват неограничителни примери, базирани на изложените внастоящето описание изследвания. Предпочита сегореспоменатите модифицирани форми да са базирани начовешки еритропоетин. 42 Освен това, някои от гореспоменатитееритропоетини са нови, и изобретението се отнася до тезивещества, както и до фармацевтичните състави, в които савключени. С помощта на неограничителен пример, такъв нов 5 еритропоетин включва периодат-оксидиран еритропоетин,глюцитолил лизн еритропоетин, фруктозил лизинеритропоетин, 3-деоксиглюкозон еритропоетин, икарбамилиран асиалоеритропоетин. 10 15 20 25 30 Различни хост-експресивни векторни системимогат да бъдат използвани за производство наеритропоетините и еритропоетин свързани молекули наизобретението. Такива хост-експресивни системипредставляват вехикулуми, чрез които интересуващия ниеритропоетин може да бъде продуциран и след товапречистен, но също така представляват и клетки, коитомогат, когато са трансформирани или трансфектирани сподходящите нуклеотидни кодиращи секвенции, ексхибиране намодифицирания еритропоетинов генен продукт гп зИи. Тевключват, но не са ограничени до бактерия, инсект,растение, бозайник, включително човешки хост системи, катонапример, но не ограничено до, клетъчни системи на инсект,инфектирани с рекомбинантни вектори с вирус експресия(например, бакуловирус) съдържащи модифицираните кодиращисеквенции на еритропоетиновия продукт; растителни клетъчнисистеми, инфектирани с рекомбинантни вектори с вирусекспресия (например, мозаечен вирус на цветното зеле, СаМУ; мозаечен вирус на тютюна, ТМУ) или трансформирани срекомбинантни вектори с плазмид експресия (например, Τίплазмид), съдържащи кодови секвенции на еритропоетин-свързана молекула; или клетъчни системи на бозайник,включително клетъчни системи на човек, (например НТ1080, 43 СОЗ, СНО, ВНК, 293, ЗТЗ), приемащи рекомбинантнитеекспресивни конструкции съдържащи промотори отделени отгенома на клетки на бозайник (например, металотионеинпромотор) или от вируси на бозайник (например, 5 аденовирусен последен промотор; промотор на вирусът 7.5Кна шарката при кравите). В допълнение, тенденцията на хост клеткаможе да бъде избрана така, че да модулира експресията навградените секвенции, или да модифицира и произведе генния ю продукт в предпочитаното специфично изпълнение. Такивамодификации (например, гликозилаза) и обработки (например,разцепване) на протеинови продукти може да бъде важно зафункцията на протеина. Различни хост клетки иматхарактеристики и специфични механизми за пост-транслиращ 15 процес и модификация на протеини и генни продукти. Подходящи клетъчни линии или хост системи могат да бъдатизбирани за да се осигури коректната модификация ипроцеса на експресията на чуждия протеин. С тази цел,могат да бъдат използвани еукариотни хост клетки, които 20 притежават клетъчен механизъм за правилно протичане напървичното копие, гликозилазата и фосфорилирането на г генния продукт. Такива хост клетки на бозайник, включително човешки хост клетки, включват, но не саограничени до НТ1080, СНО, νΕΕΟ, ВНК, НеЪа, СОЗ, МОСК, 25 293, ЗТЗ, и N138. За дълъг период, се предпочита високо производително производство на рекомбинантен протеин,устойчива експресия. Например клетъчни линии, коитоустойчиво експресират генен продукт с еритропоетин- 30 свързана молекула могат да бъдат проектирани. Поскоро отколкото използвайки вектори за експресия, които съдържат 44 живи източници на репликиране, хост клетки могат да бъдаттрансформирани с ДНК, управлявани чрез подходящиуправляващи експресията елементи (например, промотор,усилвател, секвенции, транскрибиращи регулатори,полиаденилиращи сайтове, и др.), и селективен маркер.Следвайки въвеждането на чуждата ДНК, проектираните клеткимогат да бъдат оставени да растат за 1-2 дена в обогатенасреда, а след това прехвърлени в селективна среда.Селектираният маркер в рекомбинантия плазмид придаваустойчивост на селекцията и позволява на клетките стабилнода интегрират плазмида в техните хромозоми и да нарастватза да формират фокуси, които в резултат могат да бъдатклонирани и да се разраснат в клетъчни линии. Този методможе преимуществено да бъде използван да се проектиратклетъчни линии, които експресират генен продукт с еритропоетин-свързана молекула. Алтернтивно, храктеристиката на експресиятана ендогенен ген на еритропоетин в клетъчна линия илимикроорганизъм, може да бъде модифицирана чрез вмъкване нахетероложен ДНК регулиращ елемент в генома на стабилнаклетъчна линия или клониран микроорганизъм, такб чевмъкнатия регулиращ елемент е оперативно свързан сендогенния еритропоетинов ген. Например ендогененеритропоетинов ген, който нормално е "транскрипционнотих", т.е. еритропоетинов ген, който нормално не еекспресиран, или е експресиран на много ниски нива вклетъчна линия, може да бъде активиран чрез вкарване нарегулиращ елемент, който е способен да подпомогнеекспресията на генен продукт с нормална експресия в тазиклетъчна линия или микроорганизъм. Алтернативно,"транскрипционно тихият" ендогенен еритропоетинов ген може 45 да бъде активиран чрез влагане на разнороден регулаторенелемент, който работи през клетъчните типове. Хетероложен регулаторен елемент може да бъдевложен в стабилна клетъчна линия или клониранмикроорганизъм, и такъв той е оперативно свързан сендогенен еритропоетинов ген, използвайки техники, катонапример целева хомоложна рекомбинация, които са добреизвестни на специалиста в областта и описан, например вПатент на Франция № 2646438 на Института Пастьор, Патентна САЩ № 4,215,051 на СНарре1; Патент на САЩ 5,578,461 наЗПеги1п еб а1.; Международна заявка № РСТ/и392/09627(N093/09222) на Зе1беп еб а1., Международна заявка №РСТ/61390/06436 (N091/06667) на Зкои1бсП1 еб а1., всеки откоито е инкорпориран тук по отношение на неговата цялост. В едно изпълнение на изобретението, дефицитна еритропоетин свързани молекули в сиалови остатъци, илипълното отсъствие на сиаливи остатъци, може да бъдепродуцирано в клетка на бозайник, включително в човешкаклетка. Такива клетки могат да бъдат проектирани да бъдатв дефицит на, или да липсват, ензими, които добавятсиалови киселини, т.е. активност на β-галактозид а 2,3сиалилтрансферазата ("а 2,3 сиалилтрансфераза") и β-галактозид а 2,6 сиалитрансферазата ("а 2,6 сиалилтрансфераза"). В едно изпълнение, клетка набозайник се използва, при която едния или двата а 2,3сиалилтрансфераза ген и/или а 2,6 сиалилтрансфераза ген, епремахнат. Такива делеции могат да бъдат изградени чрезизползване на генни нокаут техники, които са добреизвестни в областта. В друго изпълнение, дихидрофулатредуктаза (ОНГВ) непълни яйчникови клетки на китайскихамстер (СНО) са използвани като хост клетка за 46 производството на рекомбинантна еретиропоетин-свързанимолекули. СНО клетки не експресират ензима а 2,6сиалилтрансфераза и затова не прибавят сиалова киселина в2,6 скачване към Ν-свързан олигозахариди на гликопротеини 5 продуцирани в тези клетки. Като резултат, в рекомбинантнипротеини продуцирани в СНО клетки липсва сиалова киселинав 2,6 скачването към галактоза (ЗазакФ еб а1. (1987; Такеисбт еб а1. зирга; Мибзаегз еб а1 Еиг. СГ. ВФосбет.156,651 (1986); ТакеисЬб еб а1. Н.СЬготобдг. 400,207 10 (1987). В едно изпълнение, за да се продуцира хост клетка за продукцията на асиалоеритропоетин, генното кодиране а2,3 сиалилтрансфераза в СНО клетки е премахнато. Такива а2,3 сиалилтрансфераза нокаутирани СНО клетки напълнозагубват сиалилтрансферазна активност, и в резултат, са 15 полезни за рекомбинантната експресия и продукция наасиалоеритропоетин. В друго изпълнение, асиало гликопротеинимогат да бъдат продуцирани чрез интерфериране с транспортна сиалова киселина в апарат на Голджи, например, Ескбагбб 20 еб а1., 1998, И.Βϊοΐ.СНет. 273:20189-95). Използвайкидобре познати на специалиста в областта методи (например, ' 0е1тапп еб а1., 2001, ΟΟΒίοΙ.Сйет. 276:26291-300)мутагенеза на нуклеотидна захар СМР транспортьор насиалова киселина може да бъде изпълнен за да се продуцират 25 мутанти на яйчникови клетки на Китайски хамстер. Тези клетки не могат да добавят остатъци на сиаловата киселинакъм гликопротеини, като например еритропоетин, а продуцират само есиалоеритропоетин. Трансфектиранитеклетки на бозайник произвеждащи еритропоетин също така 30 продуцират цитозолна сиалидаза, която ако протича къмкултурната среда деградира сиалоеритропоетина с висока 47 ефективност (например, Сгатег еб а1., 1995 В1обесЬпо1оду13:692-698). Използвайки добре познати на специалиста вобластта методи (например, от информация разкрита въвЕеггагг еб а1, 1994, бИсоЬ1о1оду 4:367-373), клетъчни 5 линии могат да бъдат трансфектирани, мутирали или по другначин накарани да продуцират съставно сиалидаза. В Потози начин, асиалоеритропоетин може да бъде продуциран повреме на производството на асиалоеритропоетин. При практическото реализиране на един аспект 10 на настоящето изобретение, фармацевтичен състав, както еразкрит по-горе, съдържащ еритропоетин, може да бъдеприложен на бозайник по всякакъв начин, който предвиждадостатъчно ниво на еритропоетин във васкулатурата за дапозволи транслокация през ендотелна клетъчна бариера и 15 благотворно повлиява върху еритропоетин-чувствителниклетки. Когато се използва за целта на перфузия презтъкан или орган се желателни подобни резултати. В случаякогато еритропоетина е използван за ех νίνο перфузия,еритропоетина може да бъде всяка форма на еритропоетин, 20 като например гореспоменатите еритропоетини, но неограничено до тях, могже да бъде обхванат и природен * еритропоетин, включително човешки еритропоетин. В случаякогато клетките или тъканта е неваскуларна и/илиприлагането е чрез окъпване на клетките или тъканта със 25 състава от изобретението, фармацевтичния състав предвиждаефективно количество на еритропоетин, което е благотворноза еритропоетин-чувствителни клетки. Ендотелните клетъчнибариери, през които еритропоетина може да се транслоцира,включват плътни преходи, перфорирани преходи, ни преходи, 30 и всякакви други видове на ендотелни бариери присъстващи убозайник. Предпочитана бариера е ендотелен клетъчен 10

15 20 25 48 плътен преход, но изобретението не е ограничено по този начин. Обикновено гореспоменатите еритропоетини саполезни при терапевтични или профилактични третирания приболести на централната нервна система или на перифернатанервна система на човек, които имат първични неврологичниили психиатрични симптоми, офталмологични заболявания,кардиоваскуларни заболявания, гастроинтестинални болести иендокринни и метабилчни анормалности. В частност, такивасъстояния и болести включват състояния на хипоксия, коитонеблагоприятно въздействат на възбудими тъкани, катонапример възбудими тъкани в тъканта на централната нервнасистема, тъканта на периферната нервна система, илисърдечната тъкан или тъканта на ретината, като напримермозък, сърце или ретина/око. Затова, изобретението можеда бъде използвано за лечение или предпазване от уврежданена възбудима тъкан в резултат на състояния на хипоксия приразлични състояния и обстоятелства. Неограничителнипримери на такива състояния и обстоятелства са предвиденив таблицата, показана тук по-долу. В примера за защита на патологии на нервнатъкан, която може да бъде третирана съгласно настоящетоизобретение, такива патологии включват тези, които са врезултат на намален приток на кислород н невроннитетъкани. Всяко състояние, което намалява наличността накислород в невронната тъкан, в резултат на стрес,нараняване и накрая невронна клетъчна смърт, може да бъдетретирано чрез методите на настоящето изобретение.Обикновено позовавайки се до хипоксия и/или исхемия, тезисъстояния възникват от или включват, но не са огнариченидо удар, васкуларна оклуция, пренатално или постнатално 30 49 10 15 20 кислородно лишаване, задушаване, шок, пблизко до удавяне,отравяне с въглероден окис, вдишване на дим, травма,включително хирургична и лъчетерапия, асфиксия, епилепсия,хипогликемия, хронична обструктиван белодробна болест,емфизем, възрастов респираторен дистрес синдром,хипотензивен шок, септичен шок, анафилектичен шок,инсулинов шок, сърповидна клетъчна криза, кардиачен арест,дисритмия, азотна наркоза, и неврологични дефицитипричинени от сърдечно-белодробни байпас процедури. В едно изпълнение, например, специфичнотоЕРО състави могат да бъдат влагани за да предотвратятнараняване или тъканно увреждане в резултат на риск от нараняване или тъканно увреждане по време на хирургически процедури, като например резекция на тумор или възстановяване на аневризма. Други патологии причинени отили в резултат на хипогликемия, които са в състояние дабъдат третирани чрез методите описани тук, включватинсулинова свръхдоза, също познати като ятрогеннахиперинсулинемиа, инсулинома, недостиг на растежен хормон,хипокортиколизъм, наркотична свръхдоза, и някои тумори. Други патологии в резултат на увреждане на с възбудима нервна тъкан включват припадъчни разтройства,като например епилепсия, конвулсии, или хроничниприпадъчни разтройства. Други подлежащи на третиране 25 състояния и заболявания включват такива като удар, мултиплена склероза, хипотензия, кардиачен арест, болестна Алцхаймер, болест на Паркинсон, церебрална парализа,мозъчна или гръбначно-мозъчна травма, СПИН деменция,загуба на когнитивна функция свързана с възрастта, загуба 30 на памет, амиотрофична латерална склероза, припадъчни 50 разтройства, алкохолизъм, ретинална исхемия, увреждане наочния нерв в резултат на глаукома, и невронна загуба. Специфичните състави и методи наизобретението могат да бъдат използвани за третиране насъстяния и увреждания на ретиналната тъкан. Такиваразтройства включват, но не са ограничени до ретиналнаисхемия, макуларна дегенерация, отделяне на ретината, пигментозен ретинит, артериосклерозна ретинопатия,хипертензивна ретинопатия, ретинен артериален блокаж,ретинен венозен блокаж, хипотензия, и диабетнаретинопатия. В друго изпълнение, принципите на методитеот изобретението могат да бъдат използвани за защита илиза третиране увреждания в резултат на радиационнивредности върху възбудима тъкан. Следваща полза отметодите на настоящето изобретение е от третирането наневротоксично отравяне, като например отравяне с домоиккиселина на моюски, невролатиризъм, и болест на Гуам,амиотрофична латерална склероза, и Паркинсонова болест. Както беше споменато по-горе, настоящетоизобретение също е насочено и към метод за усилванефункцията на възбудима тъкан в тяло на бозайник чрзпериферно прилагане на еритропоетин, както е описано по-горе . Различни болести и състояния са променими чрезтретиране при използване на този метод, и освен това тозиметод е полезен за усилване на когнитивната функция приотсъствие на каквото и да е състояние или болест. Тезиизползвания а настоящето изобретение са описани в в по-големи подробности по-долу и включват подобряването наученето и тренирането както при човек, така и принечовешки бозайници. 51 10 15 20 Състоянията и заболяванията подлежащи натретиране при използване на методите от този аспект нанастоящето изобретение, и които са насочени къмцентралната нервна система, включват, но не са ограничени до нарушения в настоението, тревожност, депресия, аутизъм, намаляване на вниманието, хиперактивно разтройство, и когнитивна дисфункция. Тези състояния сеподобряват от усилването на невронната функция. Другиразтройства, лечими в съответствие с изследванията нанастоящето изобретение, включват нарушение на съня,например сънна апнея и разтройства свързани с пътувания;субарахноидни и аневризмални кървенета, хипотензивен шок,конвулсивно увреждане, септичен шок, анафиличен шок исеквеле на различни ецефалити и менингити, напримерзаболяване на съединителната тъкан свързани с церебритикато например лупус. Други използвания включватпредпазване от или защита от отравяне с невротоксини, като например отравяне с киселина на моюски, невролатиризъм, иболест на Гуам, амиотрофична латерална склероза, иПаркинсонова болест; постоперативно лечение след уврежданеот емболия или исхемия; иррадиация на целия мозък;сърповидно клетъчни кризи, и еклампсия. Следващ група от състояния, които могат дабъдат третирани чрез методите от настоящето изобретение, 25 включват дисфункция на митохондриите , от както наследствено, така и от придобито естество, коетопричината за голям брой неврологични заболявания,типизирани в невронно увреждане и смърт. Например, болестна Де1дД (субакутна некротизираща енцефалопатия) се 30 характеризира от прогресивна загуба на зрение и енцефалопатия, дължащи се на пропадане на невронния сигнал 52 и миопатия. В тези случаи, дефектиралия митохондриаленметаболизъм води до липса на достатъчно зареждане свисокоенергийни субстрати за да запали метаболизма навъзбудими клетки. Модулаторът на еритропоетин 5 рецепторната активност оптимизира липсващата функция вголям брой митохондриални заболявания. Както бешеспоменато по-горе, хипоксичните състояния въздействатнеблагоприятно върху възбудимите тъкани. Възбудимитетъкани включват, но не са ограничени до, тъкени на ю централната нервна система, тъкани на периферната нервнасистема и тъкани на сърцето. В допълнение към описанитепо-горе състояния, методите отнастоящето изобретение са отполза при третиране на дихателно отравяне, като например вдишване на въглероден окис или пушек, тежки асматични 15 пристъпи, синдром на респираторен дистрес при възрастни,както шок и състояние пред удавяне. Следващи състояния,които създават хипоксични състояния или по друг начининдуцират увреждания на възбудима тъкан, включватхипогликемия, която може да се появи от неподходящо 20 дозиране на инсулин, или при инсулин-продуцирани неоплазми(инсулинома). ' Различни нервнопсихологични разтройства, които се смята, че се причиняват от увреждане на възбудиматъкан, е възможно да бъдат третирани чрез текущите методи. 25 Хронични разтройства, при които има невронно уреждане, иза които е предвидено лечение чрез настоящото изобретение,включва разтройства отнасящи се до централната нервнасистема и/или периферната нервна система, включителнозагуба на когнитивна функция свързана с възрастта и 30 сенилна деменция, хронични разтройства с припадъци, болестна Алцхаймер, болест на Паркинсон, деменция, загуба на 53 памет, амиотрофична латерална склероза, мултипленасклероза, туберозна склероза, болест на Уилсън сцеребрална и прогресивна супрануклеарна парализа, болестна Гуам, деменция с тела на Леви, прион болест, като 5 например спонгиформна енцефалопатия, например болест наКройцфелд-Джейкъб, болест на Хънтингтън, миотоничнадистрофия, атаксия на Фрейдрих и други атаксии, както исиндром на Жил де ла Туре, разтройства с припадъци, катонапример епилепсия и хронично разтройство с припадъци, 10 удар, мозъчна или гръбначно-мозъчна травма, СПИН деменция,алкохолизъм, аутизъм, ретинална исхемия, глаукома,разтройства на автономната функция, като напримерхипертензия и разтройства на съня, и нервнопсихиатричниразтройства, които включват, но не са ограничени до 15 шизофрения, шизоафективни разтройства, дефицит на вниманието, дистимично разтройство, тежко депресивноразтройство, мания, натрапчиво компулсивно разтройство,разтройства на психоактивното използване на същността,тревожност, паника, както и еднополярни и биполярни 20 афектни разтройства. Допълнителни нервнопсихиатрични инервногенеративни разтрйства включват, например тези, /»· дадени в Диагностичния и Статистически наръчник наМенталните Разтройства (Ώ3Μ) на Американската ПсихиатричнаАсоциация, най-последното издание на който е инкорпориран 25 тук по отношение на неговата цялост. В друго изпълнение молекулите нарекомбинантния хемериричен токсин съдържащи еритропоетинмогат да бъдат използвани за терапевтично доставяне натоксини за лечение на пролиферативно заболяване, като 30 например рак, или вирусно заболяване, такова катосклерозиращ паненцефалит. 54 Следващата таблица показва списък надопълнителни примерни, не-ограничителни индикации, относнорезличните състояния и заболявания податливи на лечение сгореспоменатите еритропоетини.

Клеткатъкан илиорган Дисфункция илипатология Състояние илизаболяване Тип Сърце Исхемия Заболяване на коронарната артерия Акутно, хроничноСтабилно, нестабилно Миокардиален инфаркт Синдром на Дреслер Ангина Конгенитално сърдечно заболяване Васкуларна Кардиомиопатия Ангина наРг1пгте-Ьа1 Кардиална руптура Аневризматична Септална перфорация Ангиит Аритмия Тахи-, брадиаритмия Суправентрикуларн о, Вентрикуларно Състояние аномалии Стабилно, нестабилно Хиперсензитивнозадебеляване накаротидния синус Конгестивна сърдечена недостатъчност Лява, дясна,бивентрикуларна Кардиомиопатии, катоидиопатична фамилна,заразна, метаболитна,заболяване наакумулирането,недостатъчности,смущения в съединителната тъкан,инфилтрати игрануломи,невроваскуларни Миокардити Автоимунни, инфекциозни, идиопатични Белодробно сърце Тъпа и проникваща травма Токсини Кокаин Васку- латура Хипертенцзия Първична, вторична Декомпресионно гадене 55 Клеткатъкан илиорган Дисфункция илипатология Състояние илизаболяване Тип Фибромускулна хиперплазия Аневризма Дисектираща, разрив, разширяваща Бели дробове Обструкция Астма, хрониченбронхит, емфизм иобструкция навъздушния път Исхемично белодробно заболяване Пулмонарнаемболия,пулмонарнатромбоза, мастнаемболия Заболяване набелите дробовеот въздействиена околнатасреда Исхемично белодробно заболяване Пулмонарна емболия, пулмонарна тромбоза Интерстициално белодробно заболяване Идиопатична пулмонална фиброза Конгенитално Кистозна Фиброза Белодробно сърце Травма Пневмония ипневмонити Инфекциозни, паразитни, токсични, травматични, изгаране, аспирация Саркоидоза Панкреас Ендокринна Захарен диабет,тип I и II Недостиг на бетаклетки, дисфункцияДиабетична невропатия Друга ендокриннаклетъчна недостатъчност напанкреаса Екзокринна Екзокриннанедостатъчност напанкреаса Панкреатити Кости Остеопения Първична вторична Хипогонадизъм имобилизация Постменопауза Възрастови Хиперпаратироидизъм Хипертироидизъм Калциева, магнезиева,фосфорна и/или витамин Ώ недостатъчност 56

Клеткатъкан илиорган Дисфункция илипатология Състояние илизаболяване Тип Остеомиелит Аваскуларна некроза Травма Болест на Раде!; Кожа Алопеция Гнездова алопеция Първичва, Вторична, Мъжки тип оплешивяване Витилиго Локализирано генерализирано Първично, вторично Диабетична улцероза Заболяване на периферната васкулатура Изгаряния Автоимунни заболявания Лупус еритематозус, сииогрен, Ревматоиден артрит, Гломерулонефрит,Ангиит Лангерхансова хистиоцитоза Очи Оптични неврити Тъпи и проникващи повреди, Инфекции, Саркоид, Сърповидна клетъчна анемия, Отслояване на ретината. Темпорален артерит Ембрионални и зародишни заболявания Асфиксия Исхемия ЦНС Синдром нахронична умора,синдроми наостри и хроничнихипоосмози ихиперосмози, СПИН, Деменция,Токов удар Енцефалит Бяс, Херпес Минигит 57

Клеткатъкан илиорган Днсфункция илипатология Състояние илизаболяване Тип Субдурален хематом Никотинова зависимост Злоупотреба снаркотици иотказване Кокаин, хероин, крак, марихуана, лед, ПСП, Полинаркотична зависимост, екстази, опиуми, седативни хипнотици, амфетамини, кофеин Маниакални компулсивни заболявания Спиналнастеноза,Трансверзаленмиелит, Синдромна Гилен-Баре,Травма, Притискане нанервно коренче,Тумурнопритискане,Топлинен удар Уши, нос,гърло Тинитус, Синдромна Мениер, Загуба на слуха Травматично нараняване, баротравма Бъбрек Бъбречна недостатъчност Акутна, хронична Васкуларна/исхемична,интерстициалнозаболяване, диабетичнобъбречно заболяване,нефротични синдроми,инфекции Хенош-Шнолейн Зачервяване Скелетна мускулатура Автоимунни заболявания Миастения гравис, Дерматомиозит, Полимиозит Миопатии Наследствениметаболични,ендокринни итоксични Топлинен удар Смазване Рабдомилоза Заболяване намитохондрия Инфекция Улесняване намортификацията 58 Исхемично заболяване Цироза, затлъстял черендроб Инфилтративно/ метаболитно заболяване Стомашно-чревени Исхемична болестна червата Възпалителнозаболяване начервата Некротизиращ ентероколит Органна трансплан- тация Лечение на донори реципиент Репродукти-вен тракт безплодие ВаскуларноАвтоимунноАнормална маткаЗаболявания отприсаждане Ендокринни Хипер- ихипофункция нажлезите Както беше споменато по-горе, тезизаболявания, разтройства или състояния служат само заилюстрация на обхлата на благоприятните въздействия чрез ζ^5 еритропоетините от изобретението. Следователно, това изобретение основно има предвид терапия или профилактичнотертиране на последствията от механична травма и отзаболяване при човек. За предпочитане са терапия илипрофилактика на заболявания, разтройства или състояния на 10 ЦНС и/или периферната нервна система. Предвидени са терапевтични или профилактични третирания на заболявания,разтройства или състояния, които има психиатриченкомпонент. Предвидени са терапевтични или профилактичнитретирания на заболявания, разтройства или състояния, 15 включително, но не ограничени до такива, които имат 59 офталмологичен, кардиоваскуларен, кардиопулмонарен,респираторен, бъбречен, уринарен, репродоктивен,гастроинтестинален, ендокринен или метаболитен компонент. В едно изпълнение, такъв фармацевтичен 5 състав на еритропоетин може да бъде прилаган системно зазащита или усилване на таргетни клетки, тъкан или орган.Такова прилагане може да бъде парентерално, чрезинхалация, или трансмускулно, например орално, назално,ректално, интравагинално, сублингвално , субмукозно или 10 трансдермално. За предпочитане прилагането е „„„ парентерално, например чрез интравенозно или Чв* интраперитоално инжектиране, а също така, но не ограничено до интраартериално, интрамускулно, интрадермално исубкутанно прилагане. 15 При други начини на прилагане, такива като използване на перфузия, инжектиране в орган, или другологално приложение, ще се използва фармацевтичен състав,който резултира в подобни нива на еритропоетина, кактобеше описано по-горе. Ниво от около 15 рМ - 30 пМ е за 20 предпочитане. Фармацевтичните състави от изобретениетомогат да съдържат ефективно количество вещество ифармацевтично приемлив носител. В едно специфичноизпълнение, терминът "фармацевтично приемлив" означава 25 одобрен от оторизирана агенция на федералното или щатскоправителство, или включена във Фармакопеята на САЩ, илиобщо признати чуждестранни фармакопеи за използване приживотни, и специално при хора. Терминът "носител" деотнася до разтворител, прибавка, ексципиент, или вехикул, 30 с помощта на който терапевтикът се прилага. Такива фармацевтични носители могат да бъдат стерилни течности, 60 като например физиологични разтвори във вода и масла,включително и такива в петрол, с животински, растителенили синтетичен произход, като например фъстъчено масло,соево масло, минерално масло, сусамово масло и други 5 подобни. Физиологичният разтвор е предпочитан носителкогато фармацевтичният състав се прилага интравенозно.Физиологични разтвори, водна декстроза и глицериновиразтвори могат също да бъдат използвани като течниносители, и специално за инжекционни разтвори. Подходящи 10 фармацевтични ексципиенти включват скорбяла, глюкоза,лактоза, захароза, желатин, малц, ориз, брашно, калциевкарбонат, силикагел, натриев стеарат, глицерол моностеарат, талк, натриев хлорид, изсушен млечен каймак,глицерол, пропилен, гликол, вода, етанол и подобни. 15 Съставът, по желание може също да съдържа минималниколичества от омокрящи или емулгиращи агенти, или рНбуфериращи агенти. Тези състави могат да бъдат във вид наразтвори, суспензии, емулсия, таблетки, топчета, капсули,пудри, постепенно отделящи се смеси и подобни. Съставът 20 може да бъде във вид на супозиторий с традиционни свързващи вещества и носители, като например триглицериди. Чв- Веществата съгласно изобретението могат да бъдат във видна неутрални или солни форми. Фармацевтично приемливитесоли включват такива, които са формирани със свободни 25 амино групи, като тези производни на хлороводородна,фосфорна, оцетна, оксалова, тартарна киселини и др., итакива, формирани със свободни карбоксилни групи, катонапример тези производни на натрий, калий, амоний, калций,железни хидроокиси, изопропиламин, триетиламин, 2- 30 етиламино етанол, хистидин, прокаин, и др. Примери на подходящи фармацевтични носители са описани в "Кепщпдбоп'зРЬагтасеибгса! Зсгепсез" от Е.VI.Магбгп. Такила състави ще 61 съдържат терапевтично ефективно количество от веществото,за предпочитане в изчистена форма, заедно с подходящоколичество носител, така, че да се осигури формата заподходящо прилагане на пациента. Формулата трябва да е 5 пригодена към начина на прилагане. Фармацевтичните състави пригодени за орално приемане могат да бъдат изпълнени като капсули илитаблети; като пудри или гранули; като разтвори, сиропи илисуспензии (като водени или не-водни течности); като 10 ядливи пени или кремове; или като емулсии. Таблетите илитвърдите желатинови капсули могат да съдържат лактоза, •1^ скорбяла или техни производни, магнезиев стеарат, натриевзахарин, целулоза, магнезиев корбонат, стеаринова киселинаили нейни соли. Меките желатинови капсули могат да 15 съдържат растителни масла, восъци, мазнини, полутвърди илитечни полиоли и др. Разтворите и сиропите могат дасъдържат вода, полиоли и захари. Активен фактор предназначен за оралноприемане може да бъда покрит с или смесен с матерна, който 20 забавя дисинтеграцията и/или абсорбцията на активния фактор в стомашночревния тракт (например, могат да се Саг \ използват глицерил моностеарат или глицерил дистеарат). По този начин постепенното освобождаване на активнияфактор може да бъда получено за много часове и, ако е 25 необходимо, активният фактор може да бъда предпазен отразпадане в стомаха. Фармацевтичните състави за оралнаупотреба могат да бъдат формулирани така, че да улеснятосвобождаването на активния фактор в определена стомашночревна зона, по причина на специфични рН или ензимни 30 условия. 62 Фармацевтичните състави пригодени затрансдермално прилагане могат да бъдат изпълнени катопластири, предвидени да останат в близък контакт сепидермиса на реципиента за удължен период от време. 5 Фармацевтичните състави пригодени за топична употреба могат да бъдат изпълнени като мехлеми, кремове, суспензии,лосиони, пудри, разтвори, пасти, телове, спрейове,аерозоли или масла. За топично прилагане към кожата,устата, очите или други външни тъкани, за предпочитане е 10 да се използва топичен мехлем или крем. Когато е подформата на мехлем, активният инградиент може да бъдеупотребяван или на базата на парафин, или на водо-смесимапомада. Алтернативно, активният инградиент може да бъдевъв вид на крем на базата на масло-във-вода или вода-в- 15 масло. Фармацевтични състави пригодени за топично прилагане в очите включват очни капки. В тези състави,активният инградиент може да бъде разтворен илисуспендиран в подходящ носител, например във воденразтвор. Фармацевтичните състави пригодени за топично 20 прилагане в устата включват бавно разграждащи се твърдипрепарати, пастили и води за уста. Кнг Фармацевтичните състави пригодени за назално или пулмонарно прилагане могат да съдържат твърдиносители, такива като пудри (за предпочитане имащи размер 25 на частиците в обхвата от 20 до 500 микрона). Пудритемогат да бъдат прилагани по начина, по който се смъркаемфие, т.е. чрез бързо инхалиране през носа от контейнерана пудрата, който е приближен близко до носа. Алтернативно, съставите пригодени за назална употреба 30 могат да съдържат и течни носители, например назалниспрейове или назални капки. Алтернативно, инхалиране 63 директно в белите дробове може да бъде осъществено чрездълбока инхалация или поставяне през мундщук ворофарингса. Тези състави могат да съдържат водни илимаслени разтвори на активния инградиент. Съставите за 5 прилагане чрез инхалиране могат да бъдат доставяни вспециално пригодени устройства, включително, но неограничено до аерозоли под налягане, небулайзери илиинсуфлатори, които могат да бъдат така конструирани, че даосигуряват предварително определени дози на активния 10 инградиент. В едно предпочитано изпълнение, фармацевтичните състави от изобретението се прилагат вносната кухина директно, или в белите дробове през носнатакухина или през орофарингса. Фармацевтичните състави пригодени за 15 ректално прилагане могат да бъдат изпълнени като супозитории или клизми. Фармацевтичните състави пригодениза вагинално прилагане могат да бъдат изпълнени катопесари, тампони, кремове, телове, пасти, пени или спрейове. 20 Фармацевтичните състави пригодени за парентерално прилагане включват водни или неводни стерилни ‘ инжектабилни разтвори или суспензии, които могат дасъдържат антиоксиданти, буфери, бактериостатици иразтворими, които правят съставите по същество изотонични 25 с кръвта на предполагаемия реципиент. Други компоненти,които могат да присъстват в такива състави, включват например вода, авкохоли, полиоли, глицерин и растителнимасла. Състави пригодени за парентерално прилагане могатда се поставят в контейнери за еднократни дози или 30 мултидозни контейнери, например запечатани ампули ифлакони, и могат да се съхраняват като сублимати 64 (лиофилизати), изискващи само прибавянето на стерилентечен носител, например стерилен физиологичен разтвор заинжектиране, непосредствено преди употреба. Екстемпоралните инжекционни разтвори и суспензии могат да5 бъдат приготвяни от стерилни пудри, гранули и таблети. В едно изпълнение, автоинжектор съдържат инжектабилненразтвор на еритропоетин може да бъде използван за спешнаупотреба в амбулатории, спешни отделения и спасителниоперации, и дори за самостоятелно прилагане в домашна Ю обстановка, в частност когато може да възникне възможностза травматична ампутация, като например при непредпазливоизползване на косачка за трева. Вероятността такиваклетки и тъкани в отрязан крак или пръст на крак да оживеят след повторно присъединяване може да се увеличи 15 чрез прилагането на еритропоетин към множество места наотрязаната част колкото е възможно по-бързо, дори предипристигането на медицинското лице на място, или отиванетона пострадалия индивид с отрязания пръст в ликови влакна в спешното отделение. 20 В едно предпочитано изпълнение съставът е формулиран в съответствие с рутинните процедури като г фармацевтичен състав пригоден за интравенозно прилагане начовек. Обикновено, съставите за интравенозно прилагане саразтвори в стерилен изотоничен воден буфер. Където е 25 необходимо съставът може също да включва разтварящ агент илокален анестетик, като например лидокаин за успокояванена болката на мястото на инжектирането. В повечето случаиинградиентите се доставят или отделно или смесени заедно вединична дозна форма, например като суха лиофилизирана 30 пудра или несъдържащ вода концентрат в херметично запечатан контейнер, като например ампула или сашет, с 65 означение на количеството на активния фактор. Когатосъстава трябва да се прилага чрез инфузия, той може дабъде дозиран с бутилка за инфузия съдържаща стерилнафармацевтично окачествена вода или физиологичен разтвор. 5 Когато съставът се прилага чрез инжектиране, може да сепредвиди ампула със стерилен физиологичен разтвор, така чеинградиентите да могат да бъдат смесвани преди прилагането. Супозиторийте в повечето случаи съдържат 10 активен инградиент в обхвата от 0.5% до 10% тегловни;оралните формулировки съдържат 10% до 95% активенинградиент. Състав за перфузия може да бъде предвиден заизползване при обливания на трансплантиран орган, за ϊη 15 згби перфузия, или за прилагане към васкулатурата на донорния орган преди отделянето му. Такива фармацевтичнисъстави могат да съдържат нива на еритропоетин или формана еритропоетин, които не са подходящи за акутно или постоянно, локално или систематично прилагане към индивид, 20 но ще благоприятстват функциите очаквани тук в труп, къпане на орган, перфузия на орган, или ίη зФби перфузияпреди отделянето или връщането на третирания орган илитъкан към редовна циркулация. Еритропоетинът в тозиаспект на изобретението може да бъде всеки еритропоетин, 25 като природно съществуващи форми, такива като човешкиеритропоетин, или всеки от по-горе описанитееритропоетини, такила като асиалоеритропоетин ифенилглиоксал еритропоетин, като неогнаричаващи примери. Изобретението също предвижда фармацевтичен 30 пакет или кит, съдържащ един или повече контейнери напълнени с един или повече инградиенти на фармацевтичните 66 състави от изобретението. По избор, този контейнер(и)може да бъде(ат) снабден(и) с бележка във форма утвърденаот държавна агенция, надзираваща производството, използването или продажбата на фармацевтични или 5 биологични продукти, която бележка отразява одобрението отагенцията, надзираваща производството, използването илипродажбата за прилагане при човек. В друго изпълнение например, еритропоетинможе да се доставя в система контролираща отделянето. 10 Например полипептидът може да бъде прилаган при използванена интравенозна инфузия, имплантабилна осмотична помпа,трансдермален пластир, липозоми или други начини наприлагане. В едно изпълнение може да бъде използванапомпа (виж Ьапдег, зирга; Зе££оп, 1987, СНС Сг1£. Ке£. 15 Втотеб. Епд. 14:201; ВисЬиа1б е£ а1., 1980, Зигдегу 88:507; Заибек е£ а1., 1989, И.Епд1. СГ.Меб. 321:547). Вдруго изпълнение веществото може да бъде доставено вмехурче, в частност липозоми (виж Ьапдег, 5с£епсе249:1527-1533 (1990); Тгеаб е£ а1., в Ьтрозотез в £Ье 20 ТЬегару о£ 1п£ес£1оиз В1зеазе апб Сапсег, Ьорег-Вегез£е1папб Пб1ег (ебз), Ьтзз, Νβπ Уогк, рр. 353-365 (1989) ; N0 * 91/04014; и.5. Ра£еп£ Νο. 4,704,355; Ьорег-Вегезбетп, 1Ьб.б. , рр.317-327; виж общо тЬбб. ) . В друго изпълнениемогат да бъдат използвани полимерни материали 25 (виж МесИса1 АррИсаЬтопз о£ Соп£го11еб Ке1еазе, Ьапдегапб ДОтзе (ебз.), СКС Ргезз: Воса Ка£оп, Е1ог1ба, 1974;Соп£го11еб Ьгид ВтоачаНаЬШЬу, Огид РгобисЬ Ьезтдп апбРег£огтапсе, Зто1еп апб Ва11 (ебз.), ИНеу: Иеи Уогк(1984); Капдег апб Рерраз, б.Масгото1. Зсг.Кеч.Масгото1. 30 СЬет. 23:61, 1953; виж също Ьечу е£ а1., 1985, Зсгепсе 67 228:190; Оиггпд е£ а1., 1989, Αηη. Иеиго1. 25:351; Ноиагбе£ а1., 1989, СГ.Иеигозигд. 71:105). В още едно друго изпълнение, контролиращаотделянето система може да бъде разположена в близост дотерапевтичната цел, например таргетните клетки, тъкани илиоргани, изискващи само една фракция от системаната доза(виж например Сообзоп, рр. 115-138 в МесИса1 АррИсабФопзо£ СопбгоНеб Ке1еазе, νοΐ.2, зирга, 1984). Другиконтролиращи отделянето системи са дискутирани в прегледана Ьапдег (1990, Зсгепсе 249:1527-1533). В друго изпълнение еритропоетин, в завършенаформа, може да бъде прилаган назално, орално, ректално,вагинално или сублингвално. В едно специфично изпълнение може да бъдежелателно съставите с еритропоетин съгласно изобретениетода бъдат прилагани локално към мястото където е нужно дасе третира; това може да се изпълни например, но без да сесмята като ограничение, при локална инфузия по време нахирургична операция, топично прилагане, например заедно спревръка на рана след операция, чрез инжектиране, спомощта на катетър, чрез суозитории, или чрез имплант,като този имплант е порьозен, непорьозен или желатиновматериал, включително мембрани, такива като силастичнимембрани или фибри. Подбирането на предпочитаната ефективна дозаможе да бъде определена от подготвения професионалист присъобразяване на няколко фактора, които трябва да бъдатдобре познати от един обикновен специалист в областта. Тези фактори включват определената форма на еритропоетин,както и неговите фармакокинетични параметри, като напримержизнеспособност, метаболизъм, полуживот, и др., които 68 могат да бъдат установени с обикновените процедури наизследване, обикновено използвани при получаване наразрешение за използване на фармацевтично вещество. Другифактори при съобразяване на дозата включват състоянието и 5 болестта, които ще се лекуват, или очакваното подобрениепри нормален индивид, телесната маса на пациента, начина на прилагане, дали прилагането е акутно или постепенно,съпътстващите лечения, както и други фактори, които едобре известно, че целят постигане на ефективност при 10 прилагане на фармацевтичните средства. Така прецизиранатадозировка трябва да бъде решена в съотвествие с решениетона определящия в условията на всеки пациент поотделно, например в зависимост от условието и имунния статус наотделния пациент, съобразно стандартните клинични методи. 15 В един друг аспект на изобретението, е разкрит перфузат или разтвор за перфузия и съхранение наоргани за трансплантация, като разтворът за перфузиявключва количество еритропоетин, което е ефективно дазащити еритропоетин чувствителни клетки и асоциирани 20 клетки, тъкани или органи. Трансплантацията включва, ноне се ограничава до, ксенотрансплантация, където орган ' (включително клекти, тъкани или друга част от тялото) еотделен от донора и трансплантиран в друг реципиент; и автортрансплантация, където органът е взет от една част на 25 тялото и е преместен в друга, включително хирургическипроцедури на място, при които органът може да бъдеизваден, и както е ех νίνο, да бъде извършена резекция,възстановяване, или по друг начин да бъде обработен, таконапример отстраняване на тумор, и след това да бъде върнат 30 на мястото си. В едно изпълнение, разтворът за перфузия еразтворът на иптчегзгбу о£ МтзсопзФп (Патент на САЩ № 69 4,798,824), който съдържа от около 1 до около 25 и/т1еритропоетин, 5% хидроксиетилово нишесте (имащо молекулнотегло от около 200,000 до около 300,000 и по същество есвободно от етилен гликол, етилен хлорохидрин, натриев 5 хлорид и ацетон) ; 25тМ КН2РО4; ЗтМ глутатион; 5тМ аденозин; ЮтМ глюкоза; ЮтМ НЕРЕЗ буфер; 5тМ магнезиевглюконат; 1.5тМ СаС12; 105тМ натриев глюконат; 200,000единици пеницилин; 40 единици инсулин. 1бтд Дексаметазон;12тМ РЬепо1 Кеб; и имащ рН от 7.4 - 7.5 и осмотичност от 10 около 320 т03т/1. Разтворът се използва да поддържатрупни бъбреци и панкреаси преди трансплантация. ** Използването на разтвора може да бъде продължено извън 30часовия лимит, който е препоръчителен за съхранение натрупни бъбреци. Този именно перфузат е само за илюстрация 15 от много такива разтвори, които могат да бъдат пригодениза настоящето използване чрез инклузия на ефективноколичество еритропоетин. В едно следващо изпълнение,разтворът за перфузия съдържа от около 5 до около 35 и/т1еритропоетин, или от около 10 до около 30 и/т1 20 еритропоетин. Както беше споменато по-горе, всяка формана еритропоетин може да бъде използвана м този аспект наизобретението. Докато предпочитаният реципиент наеритропоетин за целите на настоящето изобретение е изцяло 25 човек, то методите от настоящето могат да се прилагат поедин и същи начин за други бозайници, в частност задомашни животни, добитък, животни компаньони и зооживотни. Обаче, изобретението не е ограничено и изгодитемогат да бъдат за всеки бозайник. зо В следващи аспекти на ех νίνο изобретението може да бъде включен всеки еритропоетин, като например, но 70 не ограничено до описаните по-горе, както и природенеритропоетин, както и негов аналог, еритропоетин миметик иеритропоетин фрагмент, хибридна еритропоетинова молекула,еритропоетин-рецептор-свързваща молекула, еритропоетин 5 агонист, бъбречен еритропоетин, мозъчен еритропоетин,негов олигомер, негов мултимер, негов мутеин, неговконгенер, естествено съществуваща негова форма, синтетичнанегова форма, рекомбинантна негова форма, гликозилатеннегов вариант, дегликозилатен негов вариант, или тяхна ю комбинация. В друг аспект на изобретението, сапредвидени методи и състави за усилване жизнеспособносттана клетки, тъкани или органи, които не са изолирани отваскулатурата от ендотелна клетъчна бариера чрез подлагане 15 на клетките, тъканите или органите директно на фармацевтичен състав съдържащ еритропоетин, или прилаганеили съприкосновение на съдържащ еритропоетин фармацевтиченсъстав към васкулатурата на тъканта или органа. Усиленотодействие на еретропоетин чувствителни клетки в третираните 20 тъкан или орган води до проявяване на положителни ефекти. Както е описано по-горе, изобретението е** базирано, в една своя част, на откритието, че еритропоетинови молекули могат да се транспортират отлуминалната повърхност към основната мембранна повърхност 25 на ендотелни клетки на капилярите на органи със здравиендотелни клетъчни връзки, включително например мозъка,ретината и тестисите. По този начин еритропоетинчувствителни клетки през бариерата са предполагани цели заположителните ефекти на еритропоетина, и други клетъчни 30 типове или тъкани или органи, които съдържат и зависят изцяло или частично от еритропоетин чувствителни клетки в 71 това отношение са в целите на методите на изобретението.Въпреки нежеланието да бъде обяснено с някоя определенатеория, след трансцитоза на еритропоетин, еритропоетинаможе да взаимодейства с еритропоетин рецептор на 5 еритропоетин чувствителна клетка, например нервна,ретинна, мускулна, сърдечна, белодробна, чернодробна,бъбречна, малка чревна, надбъбречна кортексна, надбъбречнамедуларна, капилярно ендотелна, тестисна, яйчникова, илиендометриална клетка, а рецепторната връзка може да ю инициира каскадна сигнална трансдукция резултираща в активирането на програма за генна експресия вътре в**" еритропоетин чувствителната клетка или тъкан, водеща до защитата на клетката или тъканта, или органа от увреждане, като например от токсини, хемотерапевтици, лъчева терапия, 15 хипоксия и др. Така, тук по-долу са описани методи за защита на тъкан съдържаща еритропоетин чувствителни клеткиот увреждане или хипоксичен стрес, и усилване на функцията на такава тъкан. При практикуването на едно изпълнение на 20 изобретението, пациент бозайник е подложен на системнахимиотерапия при лечение на рак, включително и лъчева ** терапия, която в повечето случаи има неблагоприятни ефекти, като например увреждания на нервите, белия дроб,сърцето, яйчниците или тестисите. Прилагането на 25 фармацевтичен състав съдържащ еритропоетин, както еописано по-горе се извършва преди или по време нахимиотерапията и/или лъчевата терапия, за да се защитятразлични тъкани и органи от увреждане от химиотерапевтичното средство, като например да се защитят 30 тестисите. Лечението може да бъде продължавано докато циркулиращите нива на химиотерапевтичното средство паднат 72 под нивото на потенциалната опасност за тялото на бозайника. При практикуването на едно друго изпълнениена изобретението, беше планирано различни органи да бъдатотделени от жертва на автомобилно произшествие за да бъдаттрансплантирани на множество реципиенти, някои от които изискваха транспортиране на дълго разстояние и за значителен период от време. Преди органът да бъдеизваден, жертвата беше инфузирана с фармацевтичен съставсъдържащ еретропоетин, както е описано по-горе. Отделените органи за пренасяне бяха перфузирани с перфузатсъдържащ еритропоетин, както е описано по-горе, и бяхасъхранени във ваничка съдържаща еритропоетин. Някоиоргани бяха непрекъснато перфузирани с пулсиращоустройство за перфузия, използвайки перфузат съдържащеритропоетин в съответствие с настоящето изобретение.Възникна минимално влошаване на функциите на органите повреме на транспортирането и през време на имплантирането иреперфузията на органите ίη зИи. В друго изпалнение на изобретението, прихирургична процедура за възстановяване на сърдечна клапасе изискваше временна кардиоплегия и артериална оклузия.Преди операцията, пациентът беше подложен на инфузия с 500и еритропоетин на килограм живо тегло. Такова трепиранепредпази от хипоксично исхемично клетъчно увреждане, и вчастност след реперфузията. В друго изпълнение на изобретението, прикаквато и да е хирургична процедура, като напримеркардиопулмонарна байпас операция, може да бъде използванприродно срещан еритропоетин или който и да е еритропоетинсъгласно изобретението. В едно изпълнение, прилагането на 73 фармацевтичен състав съдържащ еритропоетин, както бешеописано по-горе, се извършва преди да се извърши, по времена, и/или след байпас процедурата, за да се защитифункцията на мозък, сърце или други органи. 5 В горните примери, при които се използва еритропоетин съгласно изобретението, включително природносрещан еритропоетин, за ех νίνο прилагане, или затретиране на еритропоетин чувствителни клетки, такива катонервни тъкани, ретинна тъкан, сърдечни, белодробни, 10 чернодробни, бъбречни, малки чревни, надбъбречни кортексни, надбъбречни медуларни, капилярно ендотелни,тестисни, яйчникови, или ендометриални клетки или тъкани,изобретението предвижда фармацевтичен състав в единичнадозна форма пригодена за защита или усилване на 15 еритропоетин чувствителни клетки, тъкани или органи отдалечени от васкулатурата, съдържащ, за единична доза,ефективно нетоксично количество в границите от около 50, 000 ДО 500,000 Единици, 60,000 ДО 500,000 Единици, 70, 000 ДО 500,000 Единици, 80,000 ДО 500,000 Единици, 20 90, 000 ДО 500,000 Единици, 100,000 ДО 500,000 Единици, 150,000 до 500, 000 Единици, 200,000 ДО 500,000 Единици, 250,000 до 500, 000 Единици, 300,000 ДО 500,000 Единици, 350,000 ДО 500, 000 Единици, 400,000 до 500,000 Единици, 450,000 ДО 500, 000 Единици еритропоетин ., модулатор на 25 активността на еритропоетин рецептор, и фармацевтично приемлив носител. В предпочитано изпълнение, ефективнотонетоксично количество еритропоетин е вътре в границите отоколо 50,000 до 500,000 Единици. В едно предпочитаноизпълнение, еритропоетинът в горепосоченият състав не е зо еритропоетин. 74 В един следващ аспект на изобретението, бешеустановено, че прилагането на еритропоетин възстановявакогнитивната функция при животни имащи прекарана мозъчнатравма. Въпреки закъснение от 5 дена или 30 дена, 5 прилагането на еритропоети доведе до възстановяване нафункция в сравнение с третирани по друг начин животни,което е индикация за способността на еритрпоетина дарегенерира или възстановява мозъчна дейност. Такаизобретението също е насочено и към използване на 10 еритропоетин за приготвяне на фармацевтичен състав залечение на мозъчна травма и други когнитивни дисфункции,включително лечение дълго след увреждането (например, тридена, пет дена, седмица, месец, или по-дълго). Изобретението също така е насочено и към метод за лечение 15 на когнитивна дисфункция след увреждане чрез прилагане наефективно количество еритропоетин. Всеки еритропоетин,както е описано тук, може да бъде използван в този аспектна изобретението. Освен това, този възстановяващ аспект на 20 изобретението е насочен към използването на който и да етук описан еритропоетин за приготвянето на фармацевтиченсъстав за възстановяване на клетъчна, тъканна или органнадисфункция, където третирането е започнало след, или многослед първоначалния инсулт причинил дисфункцията. Освен 25 това, лечението с използване на еритропоетини съгласно изобретението може да обхване протичането на заболяванетоили състоянието по време на акутната фаза, както и прихроничната фаза. В примера, при който еритропоетин от 30 изобретението има еритропоетична активност, в еднопредпочитано изпълнение, еритропоетинът може да бъде 75 приложен системно при доза между около 300 и около 10,000Единици/кд живо тегло, за предпочитане около 500-5,000Единици/кд живо тегло, и най- за предпочитане около 1,000Единици/кд живо тегло, на прилагане. Тази ефективна доза 5 трябва да бъде достатъчна за да се постигнат серумни нивана еритропоетин по-големи от около 10,000, 15,000, или20,000 ти/т1 на серума след прилагането на еритропоетин.Такива серумни нива могат да се получат след около1,2,3,4,5,6,7,8,9, или 10 часа след прилагането. Тези 10 дози могат да бъдат повторени при необходимост. Например,прилагането може да бъде повтаряно ежедневно, толковадълго, колкото е клинично необходимо, или след подходящинтервал, например всеки 1 до 12 седмици, за предпочитанена всеки , до 3 седмици. В едно изпълнение, ефективното 15 количество еритропоетин и фармацевтично приемлив носителмогат да бъдат опаковани в мускал за единична дозе илидруг вид контейнер. В друго изпълнение, еритропоетинполезен за настоящите цели е нееритропоетик, т.е. той еспособен да проявява описаните тук действия, но не 20 причинява увеличаване на концентрацията на хемоглобин илина хематокрит. Такава не-еритропоетична форма на V еритропоетин е предпочитана в случай, че се очаква методите съгласно настоящето изобретение да се провеждатхронично. В друго изпълнение, еритропоетин е даван в доза 25 по-голяма от необходимата за да се стимулира максимално еритропоезата. Както беше споменато по-горе, еритропоетинсъгласно изобретението не е необходимо да притежаваеритропоетична активност, и затова горните дози изразени вхематопоетични единици са основно дадено като примери за 30 еритропоетини, които са еритропоетици; по-горе сапредвидени моларни еквиваленти на дозите, които са приложими при всеки еритропоетин. 76 Настоящето изобретение е освен това насоченои към метод за улесняване на транспорта на молекула презендотелна клетъчна бариера у бозайник чрез прилагане насъстав, който съдържа специфичната молекула свързана с 5 еритропоетин, както е описано по-горе. Както е описаногоре, здрави мръзки между ендотелните клетки в някоиоргани в тялото създават бариера за навлизане на някоимолекули. За лечение на различни състояния в преграденияорган са желателни средства за улесняване пасажана 10 фармацевтичните средства. Еритропоетинът от изобретениетое полезен като носител за доставяне на други молекули презкръвно-мозъчната и други подобни бариери. Съставътсъдържа приготвена молекула, която се желае да преминепрез бариерата заедно с еритропоетина, и периферно 15 прилагане на състава води до трансцитоза на състава презбариерата. Асоциацията между молекулата, която трябва дасе транспортира през бариерата и еретропоетина може дабъде лабилна ковалентна връзка, в който случай молекулатасе отделя от асоциацията с еритропоетина след преминаване 20 на бариерата. Ако желаната фармакологична активност намолекулата се поддържа или не се променя при асоцииране серитропоетин, този комплекс може да бъде прилаган. Специалистът в областта ще е запознат сразлични средства за асоцииране на молекули с еритропоетин 25 съгласно изобретението и другите агенти описани по-горе,чрез ковалентни, не-ковалентни и други начини; освен товаоценяването на полезността на състава може да бъде лесноизвършено чрез експериментални системи. Асоцииране намолекули с еритропоетин може да бъде остигнато с помощта 30 на много начини, включително нестабилно, ковалентно свързване, образуване на напречни връзки и др. Могат да 77 бъдат използвани биотин/авидин взаимодействия. Както бешеспоменато по-горе, хибридна молекула може да се приготвичрез рекомбинантни или синтетични начини, например катовкючва в обхвата си както молекула с определена 5 фармакологична активност, така и средата отговорна замодулацията на активността на еритропоетин рецептора. Една молекула може да бъде конюгирана къмеритропоетин чрез полифункционална молекула, т.е.,полифункционален крос-линкер. Както се използва тук, 10 терминът "полифункционална молекула" обхваща молекули, които имат една функционална група, който може да реагира Ш*' повече от един път последователно, като напримерформалдехид, както и молекули с повече от една реактивнагрупа. Както се използва тук, терминът "реактивна група" 15 се отнася до функционална група в крос-линкера, коятореагира с функционална група на молекула (например,пептид, протеин, въглехидрат, нуклеинова киселина, по-специално хормон, антибиотик, или антираков агент, да бъдедоставен през ендотелна клетъчна бариера), така че да 20 формира ковалентна връзка между крос-линкера и тази молекула. Терминът "функционална група" запазва своетостандартно заначение в органичната химия. Полифункционалните молекули, които могат да бъдатизползвани са за предпочитане биосъвместими линкери, т.е. 25 те са некарциногенни, нетоксични, и по същество неимуногенни ϊη νίνο. Полифункционалните крос-линкери,като тези познати в областта и които са описани тук, могатда бъдат лесно тествани при животински модели, за да сеопредели тяхната биосъвместимост. Полифункционалните 30 молекули за предпочитане са бифункционални. Както се използва тук, терминът "бифункционална молекула" се отнася 78 до молекула с две реактивни групи. Бифункционалнатамолекула може да бъде хетеробифункционална илихомобифункционална. Хетеробифункционалния крос-линкерпозволява векторно конюгиране. По специално е за 5 предпочитане полифункционалната молекула да бъде достатъчно разтворима във вода за да се появят крос-линкерни реакции във водни разтвори, такива като водниразтвори буферирани от рН б до 8, и резултантнотоконюгиране да остане водно разтворимо за по-ефективно био- 10 разпределение. Обикновено, полифункционалните молекулниковалентни връзки с амино или със сулфхидрилнафункционална група. Обаче, в настоящето изобретение сапредвидени и полифункционалните молекули, реагиращи сдруги функционални групи, като например карбонови киселини 15 или хидроксилни групи. Хомобифункционалните молекули имат най-малко две реактивни функционални групи, които са същите.Реактивните функционални групи в една хомобифункционалнамолекула включват, например, алдехидни групи и активни 20 естерни групи. Хомобифункционалните молекули имащиалдехидни групи включват, например глутаралехид исубаралалдехид. Използването на глутаралдехид като крос-линкерен агент беше разкрито от Рогпапзку еб а1., Зстепсе223, 1304-1306 (1984). Хомобифункционалните молекули 25 имащи поне две активни естерни единици включват естери надикарбоксилни киселини и Ν-хидроксисуксинамид. Някоипримери на такива Ν-суксинамидни естери включватдисуксинимидил суберат и дитио-бис-(суксинимидилпропионат), и техни разтворими дисулфоннова киселина и 30 дисулфонови соли, като например техни натриеви и калиеви 79 соли. Тези хомобифункционални реагенти могат да сенамерят от Р1егсе, Коск£огс1, ΙΙΙίηοίδ. Хетеробифункционалните молекули имат понедве реактивни групи. Реактивните групи реагират с 5 различни функционални групи, например, наличните веритропоетина и молекулата. Тези две различнифункционални групи, които реагират с реактивната група нахетеробифункционалния крос-линкер са обикновено аминогрупа, например епсилон амино групата на лизин; 10 сулфхидрилна група, например тиоловата група на цистеин; Λ··- карбонова киселина, например карбоксилатът на аспаргинова киселина; или хидроксилна група, например хидроксилната група на серин. Ясно е, че различните еритропоетинови 15 молекули от изобретението могат да нямат подходящиреактивни групи за използване с някои крос-линкерниагенти; обаче специалистът от областта ще бъде щедновъзнаграден от избора на крос-линкерни агенти базирани наналичните групи за крос-линк в еритропоетин от 20 изобретението. Когато реактивна група на хетерофункционалнамолекула формира ковалентна връзка с амино група,ковалентната връзка обикновено е амидо или имидо връзка.Реактивната група, която формира ковалентна връзка с амино 25 група може, например да бъде активирана карбоксилна група,халокарбонилна група или естерна група. Предпочитанатахалокарбонилна група е хлорокарбонилна група. Естернитегрупи са за предпочитане реактивни естерни групи, такивакато например Ν-хидроксисуксинамидна естерна група. зо Другата функционална група обикновено е или тиолова група, група способна да бъде конвертирана в 80 тиолова група, или група, която формира ковалентна връзкас тиолова група. Ковалентната връзка обикновено етиоетерна връзка или дисулфид. Реактивната група, коятоформира ковалентна връзка с тиолова група може, например, 5 да бъде двойна връзка, която реагира с тиолови групи илиактивиран дисулфид. Реактивна група съдържаща двойнавръзка способна да реагира с тиолова група е малеимидогрупа, въпреки че други, като например акрилонитрил сасъщо са възможни. Реактивна дисулфидна група може, 10 например да бъде 2-пиридилдитио група или 5,5-дитио-ди-(2нитробензоена киселина) група. Някои примери нахетеробифункционални реагенти съдържащи реактивнидисулфидни връзки включват Ν-суксинимидил 3-(2пиридил-дитио)пропионат (Саг1ззоп, е£ а1., 1978, ВгосЬет Д., 15 173:723-737), натрий 5-4-суксинимидилоксикарбонил-алфа- метил-(2-пиридилдитио)толуол. Ν-суксинимидил 3—(2—пиридилдитио)пропионат се предпочита. Някои примери нахетеробифункционални реагенти съдържащи реактивни групиимащи двойна връзка, която реагира с тиолова група 20 включват суксинимидил 4-(Ν-малеимидометил)циклохексан-1-карбоксилат и суксинимидил т-малеимидобензоат. Другихетеробифункционални молекули включват суксинимидил 3-(малеимидо)пропионат, сулфосуксинимидил 4(р-малеимидо-фенил)бутират, сулфосуксинимидил 4-(Ν-малеимидометил- 25 циклохексан)-1-карбоксилат, малеммидобензомл-М-хкдрокси-суксинимид естер. Натриевата сулфонатна сол насуксинимидил т-малеимидобензоат е за предпочитане. Многоот гореспоменатите хетеробифункционални реагенти и технитесулфонатни соли могат да се намерят при Ргегсе СЬет1са1 30 Со., Коск£огб, ИИпгз иЗА. 81 Необходимостта гореспоменатите конюгати дабъдат обратими или лабилни може лесно да се определи отпрактикуващия специалист. Конюгатът може да бъде тестуванίη νίίτο както за еритропоетина, така и за желаната 5 фармакологична активност. Ако конюгатът запазва и дветесвойства, неговата пригодност може тогава да бъдетестувана ίη νίνο. Ако конюгираната молекула изискваотделяне от еритропоетина за да се активира, ще сепредпочита лабилна връзка или обратима асоциация. ю Лабилните характеристики могат също да бъдат тестуваниизползвайки стандартни ίη νίίτο процедури преди ίη νίνοтествуване. Допълнителна информация по отношение на товакак да се направят и използват тези, както и други 15 полифункционални реагенти може да се получи от следнитепубликации или от други, които са налични в областта на техниката: - Саг1ззоп,Д. еб а1.,1978, В1осЬет. Д. 173&amp;723-737. - СитЬег,Д.А. еб а1., 1985, Меббюбз ϊη ΕηζΪΓηοΙοςγ 20 112:207-224. - Дие,Р. еб а1.,1978, Вгосйет 17:5399-5405. - 5ип,Т.Т. еб а1.,1974, Вбосбет. 13:2334-2340. - В1абб1ег,N.А. еб а1.,1985, Вгосйет. 18:690-697. - Уои1е,Р.Д. апб Νβνϊΐΐβ,ϋ.Μ.Дб.,1980, Ргос. Иаб1. 25 Асаб. Зсб.Д.З.А. 77:5483-5486-3407. - Ьегпег,Р.А. еб а1.,1981, Ргос.Даб1.Асаб.Зсб.ϋ.3.А. 78:3403-3407. - Дипд,З.М. апб Μογοϊ,Μ.,1983,Вгосбет.Вгорбуз.Асба 761:162. 30 - Саи1£1е1б,М.Р. еб а1.,1984, Вгосбет. 81:7772-7776. 82 - 3ίδΓθ5,σ.ν., 1982, Втоскет.21:3950-3955. - Уозк1каке,3. ек а1.,1979, Еиг. СГ. Втоскет. 101:395-399 - УозМкаке, 5. ек а1.,1982, СТ.В1Оскет. 92:1413-1424. - РИск,Р.Е. апб Сгеск,М. Р., 1979, ΟλΒΐοΙ .Скет. 254:3375-3381. - Νονίσ^ϋ. ек а1., 1987, СГ.ΒίοΙ. Скет. 262:8483-8487. - Ьотапк,А.11. апб ГаггЬапкз, С., 1976, СГ.Мо1. ΒίοΙ. 104:243-261. - Натаба,Н. апс! Тзигио, Т., 1987,Апа1.ΒΐοσΗίπι. 160 : 483-488 . 10 - Назк1с1а,5. ек а1., 1984, θ'. Αρρίίθά Вгоскет.6:56-63. В допълнение, методи на крос-линк са даденив прегледа на Меапз апс! Ееепеу,1990,Втосоп^идаке Скет.1:2-12. Бариерите, които се преминават чрез 15 гореописаните методи и състави на настоящето изобретениевключват, но не се ограничават до кръвно-мозъчнатабариера, кръвно-очната бариера, кръвно-тестисната бариера,кръвно-яйчниковата бариера, и кръвно-маточна бариера. Молекулите кандидатстващи за транспорт през^70 ендотелна клетъчна бариера включват, например, хормони, като например хормон на растежа, невротрофични фактори,антибиотици или антифунгициди, като тези, които нормалносе изключват от мозъка и други бариерни органи, пептиднилъчетерапевтици, антисензитивни лекарства, антитела срещу 25 биологично-активни средства, фармацевтици, и антираковисредства. Неограничителни примери на такива молекуливключват хормон на растежа, растежен фактор на нервите(Ν6Ε), нервотропичен фактор отделен от мозъка (ΒΟΝΕ),цилиарен невротрофичен фактор (ΟΝΤΡ), базов фибробласт 30 растежен фактор (ЬЕСЕ), трансформиращ растежен фактор βΐ 83 (ΤΟΕβΙ), трансформиращ растежен фактор β2 (ΤΟΕβ2),трансформиращ растежен фактор β3 (ΤΟΕβ3), интерлевкин 1,интерлевкин 2, интерлевкин 3, и интерлевкин 6, ΑΖΤ,антитела срещу туморен некротичен фактор, и 5 имуноподтискащи средства, такива като циклоспорин. Настоящето изобретение също така е насоченои към състав съдържащ молекула, която трябва да сетранспортира чрез трансцитоза през плътно преходнаендотелна клетъчна бариера и еритропоетин, както е описан 10 по-горе. Изобретението освен това е насочено и къмизползването на конюгат между молекула и еритропоетинкакто е описан по-горе за приготвянето на фармацевтиченсъстав за доставяне на молекулата през бариера, както еописана по-горе. 15 Настоящето изобретение може по-добре да бъде разбрано с помощтта на следните неограничителни Примери,които са представени като илюстрация на изобретението.Следващите примери са представени с цел по-пълно да сеилюстрират предпочитаните изпълнения на изобретението. Те 20 в никакъв случай не трябва да се тълкуват, обаче, като лимитиращи същинския обхват на изобретението. Чи»· Пример 1 ЕРИТРОПОЕТИН ПРЕМИНАВА ПЛЪТНО ПРЕХОДНАТА БАРИЕРА НА 25 КРЪВНО-ЦЕРЕБРОСПИНАЛНАТА ТЕЧНОСТ Възрастни мъжки 5ргадие-Оаи1еу плъхове бяха анестезирани и интраперитонеално беше въведенрекомбинантен човешки еритропоетин. Цереброспиналнатечност беше вземана от цистерна магна през 30 минутни 30 интервали в продължение на 4 часа и еритропоетиновата концентрация беше определяна с използване на сензитивна и 84 специфично ензим-свързана имунна проба. Както е показанона Фигура 1, базовата концентрация на еритропоетин в С5Е е8 ти/т1. Слез дабавяне от няколко часа нивата на еритропоетин измервани в С5Е започват да нарастват и след 5 2.5 часа и по-нататък се различават занчително от базовата концентрация при р<0.01 ниво. Пиковото ниво от около 100ти/πιΐ е вътре в обхвата, известен да упражнява защитниефекти ίη νίίτο (0.1 до 100 ти/ιηΐ) . Времето на пика еоколо 3.5 часа, което е значително забавено спрямо пика на 10 серумните нива (по-малко от 1 час). Резултатите от тозиексперимент илюстрират, че могат да се постигнат значителни нива на еритропоетин през плътен клетъченпреход чрез болус парентерално приемане на еритропоетин вподходящи концентрации. 15 Пример 2 ПОДДЪРЖАНЕ ФУНКЦИЯТА НА СЪРЦЕ, ПРЕДНАЗНАЧЕНО ЗАТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТлИзбаг мъжки плъхове тежащи от 300 до 330 д 20 са получавали еритропоетин (5000 и/кд живо тегло) иливехикул 24 часа преди да се отстрани сърцето за ех νίνοизследвания, извършени в съответствие с протокола наОес1ауге еб а1., 1992, Дтег. <7. РДузто! . 263:Н1537-45.Животните са омъртвени с пентобарбитал (0.3 тЪ), и 25 интравенозно с хепарин (0.2 шЪ). Сърцата първоначално саоставени да се успокоят за 15 минути. Левият вентрикулслед това е надут до обем, който дава крайно диастолноналягане от 8 ггап Нд. Кривата налягане-обем на левиявентрикул е построена чрез увеличаващо се надуване на 30 камерния обем с кратни на 0.02 т1. Нулев обем е дефиниранкато точката, при която крайното диастолно налягане на 85 левия вентрикул е нула. При цялостното завършване накривата налягане-обем, левият вентрикул е изпразнен доустановяване на крайно диастолно налягане обратно до 8 ттНд и контролния период е продължен до 15 минути, след 5 проверка на коронарния поток. След това сърцето е спрянос 50 тЬ Се1з1ог+ молекула и остава при 4°С под налягане от60 ст НгО. Сърцето след това е отстранено и съхранявано 5часа при 4°С в пластмасов контейнер пълен със същияразтвор и е обградено с натрошен лед. След завършване на 10 съхраняването сърцето е прехвърлено на апарат на Ьапдегсюг££. Камерният катетър е вкаран отново в левиявентрикул и е отново надувано до същия обем, както презвреме на преизхемичния период. Сърцето е подложено нареперфузия за най-малко 2 чака при 37°С. Налягането при 15 реперфузията е установено на 50 ст Н2О за 15 минути наповторен поток и след това е върнато до 100 ст Н2О презследващите 2 часа. Възстановен е пулсът (320 удара вминута). Изообемните измервания на индексите наконтракция и диастолното налягане са правени по три пъти 20 на 25, 45, 60, 120 минута от реперфузия. На тези времевиточки са изградени кривите налягане-обем и коронарното ί* изтичане през 45тп реперфузия е събирано за да се измерипропускането на креатин киназа. Сравнявани са дветретирани групи при използване на нечифтен £-тест, и е 25 използвана линейна регресия на данните за крайнотодиастолно налягане за да се очертаят кривите накомплианса. Както е показано на Фигура 2, чувствителноподобряване на устойчиво налягане в левия вентрикул следтретиране с еритропоетин, както и подобряване на кривата 30 обем-налягане, намаляване на диастолното налягане в левиявентрикул и намаляване на изтичането на креатин киназа. 86 Пример 3 ЕРИТРОПОЕТИН ЗАЩИТАВА МИОКАРДА ОТ ИСХЕМИЧНО УВРЕЖДАНЕВъзрастни мъжки плъхове, на които е даван рекомбинантен човешки еритропоетин (5000 и/кд живо тегло) 5 24 часа по-рано, са анестезирани и подготвени за коронарна артериална оклузия. Допълнителна доза от еритропоетин едаване в началото на процедурата и лявата главна коронарнаартерия е подложена на оклузия за 30 минути и след това еосвободена. Същата доза еритропоетин е давана ежедневно 10 една седмица след третирането. След това е изследвана сърдечната функция на животните. Както показва Фигура 3,животни, които са били инжектирани с плацебо (физиологиченразтвор) демонстрират голямо покачване в лявото крайнодиастолно налягане, индикатор за разширение, спиране на 15 сърцето, имащо за последствие инфаркт на миокарда. Заразлика, животни получаващи еритропоетин не страдат отнамаляване на сърдечната дейност, в сравнение с плацеботретираните контроли (чувствителна разлика при р<0.01нивото). 20 Пример 4 ЕРИТРОПОЕТИН МОЛЕКУЛИ Природен еритропоетин може да бъдемодифициран за да предаде своята активност на специфична 25 тъкан или тъкани. Няколко неограничителни стратегии,които могат да бъдат приложени за постигане на такаважелана специфичност на тъкан включват модификации, коитоотстраняват или модифицират гликозилатните частици, прикоито еритропоетина има три Ν-свързани и една О-свързана. 30 Такива варианти на гликозилатен еритропоетин могат дабъдат произведени по много начини. Например, сиалови 87 киселини, които завършват края на захарните вериги могатда бъдат отстранени с помощта на специфични сиалидази,зависещи от химическата връзка свързваща сиаловатакиселина към захарната верига. Алтернативно, 5 гликозилатната структура може да бъде оголена по различниначини с използавенето на други ензими, които се разцепватна специфични връзки. За да се валидизират тези принципирекомбинантен еритропоетин беше десиализиран използвайкиЗтаНбазе А (Ргогуте 1пс.) съгласно протокола на 10 производителя. Беше потвърдена успешна химическамодификация с поставяне на реагиращия продукт в ЗБЗполиакриламиден гел и оцветяване на резултантните връзки,което показа, че химически модифицираният еритропоетинпритежава, както се очакваше очевидно молекулно тегло ~31 15 кО, в сравнение с немодифициран еритропоетин, който беше~34 кБ и чрез премерване на остатъците сиаловата киселина,поддържани с химически средства да бъдат <0.01 молекула намолекула еритропоетин. В друга модификация, където аминокиселинните 20 остатъци на еритропоетин са модифицирани, аргининови остатъци бяха модифицирани при използване на фенилглиоксал г * съгласно протокола на ТакайазЬт (1977, <7. Втосйеш. 81: 395-402) проведен за времена с различна продължителност вобхвата от 0.5 до 3 часа при стайна температура. 25 Реакцията беше завършена с диализа на реагиращата смес свода. Използването на такива модифицирани форми наеритропоетин е изцялостно включено тук. Асиалоеритропоетин и фенилглиоксалеритропоетин бяха също толкова ефективни, 30 както и природния еритропоетин при нервни клетки ίη νΙίΐΌ,както е показано на Фигури 4-6. Ιη νϊίτο тестването беше 88 проведено при използване на невроподобни ембрионалникарциномни клетки (Р19), които претърпяват апоптоза приизтегляне на серум. Двадесет и четири часа предиотстраняването на серума, 1-1000 пд/ш1 еритропоетин илимодифициран еритропоетин беше прибавен към културите. Наследващия ден медиума беше отстранен, клетките промити счист, несъдържащ серум медиум, и медиум съдържащотовещество за теста (без серум) беше добавено обратно къмкултурите за допълнителни 48 часа. За определяне на брояна жизнеспособните клетки беше извършена тетразол редукцияпроба (Се11ТИег 96; Рготеда, 1пс.). Както е показано наФигури 4-5, се вижда, че асиалоеритропоетин има равнивъзможности както самия еритропоетин при предпазване отклетъчна смърт. Фенилглиоксал модифицираният еритропоетинбеше тестван при използване на описаната по-гореневроподобна Р19 клетъчна проба. Както е илюстрирано сФигура 6, този химически модифициран еритропоетин напълнозапазва нервозащитните си свойства. Ретенцията на неврозащитното свойство гпνίνο беше потвърдена чрез използване на модел на фокалнаисхемия при плъх, при който е предизвикано, както предитова е описано (Вггпез еб а1., 2000, Ргос.ИаЪ.Асад.5οί.и.З.А. 97:10526-31), реверсивно поражение в областта насредната мозъчна артерия. На възрастни мъжки Зргадие-Раи1еу плъхове беше въведен асиалоеритропоетин илиеритропоетин (5000 и/кдВ1лГ интраперитонеално) или вехикул вначалото на артериална оклузия. Двадесет и четири часапо-късно, животните бяха умъртвени и техните мозъци бяхаотделени за изследване. Бяха нарязани на части и оцветенис тетразолни соли за да се идентифицират живите участъцина мозъка. Както е показано на Фигура 7, при осигуряване 89 на нервозащита от 1 час от исхемията, асиалоеритропоетинабеше толкова ефективен, колкото и естественияеритропоетин. Фигура 8 показва резултатите от другфокален исхемичен модел, при който отговор беше получен с 5 еритропоетин и асиалоеритропоетин при сравними дози. Принай-малка доза от 250 и/кд, асиалоеритропоетина разрешавазащита, докато немодифицирания еритропоетин не. Пример 5 10 МОДИФИКАЦИЯ НА ПЪРВИЧНА СТРУКТУРА НА ЕРИТРОПОЕТИН И ЕФЕКТИВНОСТ ПРИ НЕВРОННА ЗАЩИТА Голям брой мутирали еритропоетинови молекулиса описани, които не се свързват към еритроцитеритропоетин рецептора и по този начин не поддържат 15 еритропоетин ίη νίνο и ίη νίίτο. Някои от тези молекулиникога няма да имитират действията на еритропоетина катотакъв в други тъкани или органи. Например, 17-мерсъдържащ аминокиселинна секвенция от 31-47 природенеритропоетин е неактивен за еритропоеза, но е напълно 20 активен за невронни клетки ίη νίΐτο (Сатрапа &amp; Ο'Βγϊθπ,1998:1пб. Ц. Мо1. Меб 1:235-41). Производни еритропоетини възможно да бъдатпожелани за тук описаните употреми, могат да бъдатгенерирани чрез гуанидиране, амидиране, 25 тринитрофенилиране, ацетилиране, суксинилиране, нитриране,или модифициране на арганинови остатъци или карбоксилнигрупи, сред другите процедури, както са споменати тук, за да се произведат еритропоетини, които поддържатвъздействията си върху специфични органи и тъкани, но 30 нямат въздействие върху други, като например еритроцити.Когато еритропоетинът е обект на горните реакции, беше 90 намерено, че най-общо резултиращата молекула губи както ϊηνϊνο, така и ίη νϊΐτο активността си като еритропоетик(например, Забаке еб а1.,1990,В1осЬ1т.В1орбуз.Асба1038:125-9). Някои примери на приготвяне на модифицирани 5 еритропоетини са описани по-долу. Биотинилация на свободни амино групи наеритропоетин. 0.2 тд ϋ-биотиноил-е-аминокапронова киселина-И-хидроксисуксинамид естер (Воейгбпдег Маппбетт#1418165) беше разтворен в 100 и1 ϋΜ3Ο. Този разтвор беше Ю комбиниран с 400 и1 РВЗ съдържащ приблизително 0.2 тд еритропоетин в покрита с фолио туба. След инкубиране за 4часа при стайна температура, нереагиралия биотин бешеотделен с помощта на гел филтрация в 10 колонна Сепбгтсоп.Както е показано на Фигура 10, този биотинизиран 15 еритропоетин защитава р19 клетки от изтласкване на серума. В "В1об1пу1абеб гесотЬ1папб битап егуббгоротебгпз: В1оасб1Ч1бу апб БбуИбу аз а гесербогИдапб" ДОо^боизкб еб а1 .Βίοοά, 1989, 74(3):952-8,авторите използват три различни метода за биотинизиране на 20 еритропоетин. Биотин е добавен към (1) частици сиалова киселина (2) карбоксилатни групи (3) амино групи. Чг' Авторите използват проба на клетъчна пролиферация на далакот мишка за да демонстрират, че (1) добавянето на биотинкъм частиците сиалова киселина не инактивира биологичната 25 активност на еритропоетин (2) добавянето на биотин къмкарбоксилатни групи води до чувствителна биологичнаинактивация на еритропоетин (3) добавянето на биотин къмамино групи резултира в пълно биологично инактивиране наеритропоетин. Тези методи и модификации са напълно 30 обхванати тук. Фигура 9 показва активността на 91 биотинизиран еритропоетин и асиалоеритропоетин в пробасерум-умартвени Р19. Йодиране на еритропоетин. Метод 1 - ΙοάοВеабз. Един Ιοάο Веаб (Ртегсе, Носк£огб, II) беше инкубиран 5 в 100 и1 РВЗ (20тМ натриев фосфат, 0.15М ИаС1, рН7.5)съдържан 1 тСФ свободен Иа1251 за 5 минути. 100 идеритропоетин в 100 и1 РВЗ беше добавен след това къмсместта. След десет минути период на инкубиране пристайна температура, реакцията беше спряна с отделяне на 10 200 и1 разтвор от реактивния съд (оставяйки зърно на йодозаместителя). Излишният йод беше отстранен с гелфилтрация в 10 колонна Сепбг1соп. Както е показано наФигура 11, йодозаместен еритропоетин, произведен по тозиначин е ефикасен при защита на Р19 клетки от изтласкване 15 на серума. Метод 2 - СН1огат1пе Т. 100 ид еритропоетинв 100 и1 РВЗ беше прибавен към 500 иС1Иа1251 и заедно бяхаразмесени в туба на Епендорф. 25 и1 хлорамини Т (2 тд/т1) бяха след това прибавени и сместта беше инкубирана за 1 20 минута при стайна температура. 50 и1 Сй1огат1пе Т стопбуфер (2.4 тд/ш1 натриев метабисулфит, 10 тд/т1 тирозин,10% глицерол, 0.1% ксилен в РВЗ) беше след това прибавен.Йодотирозинът и йодираният еритропоетин бяха след товаразделени с гел филтрация в 10 колонна Сепбггсоп. 25 Лизинови модификации: Карбамилиране: еритропоетин (ЮОид) беше модифициран с калиев цианат,както е описано в Р1арр еб а1 ("АсбгчЮу οί Ьочгперапсгеабтс беохуг1Ьопис1еазе А иИЬ тосИИеб атгподгоирз"1971, ά.ΒϊοΙ .СЬет. 246, 939-845) . 30 Тринитрофенилиране: еритропоетин (ЮОид) беше модифициран с 2,4,6-тринитробензинсулфонат, както е 92 описано в Р1арр е£ а1 ("Ασ£ίνί£γ о£ Ъочтпе рапсгеабтс. беохуг1Ьопис1еазе А итбН тоб1£1еб аттпо дгоирз" 1971, 6.Βίο1.СЬет.246,939-845) . Ацетилиране: еритропоетин (ЮОид) беше5 инкубиран в О.ЗП фосфатен буфер (рН7.2), съдържащ равно количество оцетен анхидрид при 0°С за 1 час. Реакциятабеше стопирана с диализа против дистилирана вода. Суксиниране: еритропоетин (ЮОид) в 0.5 МЯаНСОЗ (рН 8.0) беше инкубиран при излишък на 15 молара ю янтарен анхидрид при 15°С за 1 час. Реакцията бешестопирана с диализа против дистилирана вода. Аргининови модификации: еритропоетин бешемодифициран с 2,3 бутандион, както е описано в К1огбап("Еипс£1опа1 агд1пу1 гезтбиез ϊη сагЬохурербгбазе А. 15 МосИИсабтоп ит£Ь ЪибапесИопе" Шогбап 6Е, ВтосЬетгзбгу1973, 12 (20) :3915-3923) . Еритропоетин беше модифициран сцилкохексанон, както е в Ра££Ьу е£ а1 ("МепЦПсаИоп о££ипсб1опа1 агд1п1пе гезгбиез ίη г1Ьопис1еазе А апб 20 1узогуте" РаббЬу,Ъ,ЗтгбЬ ЕЬ, б.Βϊοΐ.СЬет 1975 250(2):565-9). Ч»· Еритропоетин беше модифициран сфенилглиоксал, както е описано във ДОегЪег е£ а1.("РгосеесИпд СагЬохурербгбазе В: тобЮЮабФоп о£ 25 £ипс£1опа1 агдтпу1 гезтбиез" ДОегЪег,ММ, 3ο)<ο1ον3}<γ М 1зг бМеб ЗС1 1975 11(11):1169-70). Тирозин модификации: еритропоетин (100 ид)беше инкубиран с тетранитрометан, къкто преди това еописано в Мез£1ег е£ а1 "3£1ти1а£1оп о£ га£ очаггап се11 30 збегогбодепезгз Ьу ЬгдЬ бепзгбу Ироргобетпз тобЮгеб иИЬ 93 бебгап1бготебНапе" Иезб1ег ИЕ, СЬаско СК, Збгаизз ЦЕ Згс3.σ ΒίοΙ СЬет 1985 СГип 25;260 (12) :7316-21) . Глутаминова киселина (и аспаргиновакиселина) модификации: За да се модифицират карбоксилни 5 групи, еритропоетин (100 ид) беше инкубиран с 0.02 Μ Εϋϋ в1П глицинамид при рН 4.5 при стайна температура за 60минути, както е описано в Саггамау еб а1 "СагЬоху1 дгоиртосНбтсабтоп ίη сЬутобгурз1п апб сЬутобгурз1подп" СаггаиауКЬ, Зроег1 Р, КозЬ1апб ϋΕ СГг. 3 Μοί ΒίοΙ 1969 Мау 10 28;42(1):133-7. Модификации с триптофанови остатъци:еритропоетин (100 ид) беше инкубиран с 20 иМ п-бромсуксинимид в 20 гаМ калиево фосфатен буфер (рН 6.5) пристайна температура, както е описано в Αίί еб а1., Ц ΒίοΙ 15 СЬет. 1995 Маг 3;270 ( 9) :4570-4 . Бройт на окислените триптофанови остатъци беше определен с метода описан отКогобсЬктпа (КогобсЬктпа,ЬС еб а1 Ргобебп Ехрг Риг1£. 1995ГеЬ;6(1):79-90). Отстраняване на амино групи: За да се 20 отстранят амино групи от еритропоетин (100 ид) беше,.·> инкубирано с РВЗ (рН 7.4) съдържащ 20 тМ нинхидрин (РФегсе СЬет1са1, Коскбогб, II) при 37°С за два часа, както е вКокктпт еб а1 (Кокк1пт,С, еб а1 "МосИбтсабтоп о£ Ьетод1оЬтп Ьу птпЬтбгбп" Βίοοά, νοί.556,Νο 4 1980: 701- 25 705). Беше осъществена редукция на резултантния алдехид чрез реакция на продукта с натриел борохидрид или литиевоалуминиев хидрид. По-специално, еритропоетин (100 ид)беше инкубиран с 0.1П натриел борохидрид в РВЗ за 30минути при стайна температура. Редукцията беше завършена 30 с охлаждане на образците в лед за 10 минути и подложени надиализа против РВЗ, три пъти, за една нощ. (Кокк1П1,С., 94 Βίοοά, νοΐ.556 Νο 4 1980: 701-705). Беше осъщественаредукция с използване на литиево алуминиев хидрид чрезинкубиране на еритропоетин (100 ид) с 0.1П литиевоалуминиев хидрид в РВЗ за 30 минути при стайна 5 температура. Редукцията беше завършена с охлаждане на образците в лед за 10 минути и подложени на диализа противРВЗ, три пъти, за една нощ. Редуциране на дисулфид и стабилизация:еритропоетин (100 ид) беше инкубиран с 500 тМ ОТТ за 15 10 минути при 6О°С. 20 тМ йодацетамид във вода беше след това прибавен към сместта и беше подложена на инкубиранеза 25 минути, при стайна температура на тъмно. Лимитирана протеолиза: Еритропоетин може дабъде предмет на лимитирана химическа протеолиза, която 15 цели специфични остатъци. Еритропоетин беше вкаран вреакция с 2-(2-нитрофенилсулфенил)-З-метил-З’-броминдоленин, който се разцепва по специфичен начин следтриптофанови остатъци при 50 пъти превишение в 50% оцетнакиселина след 48 часа на тъмно при стайна температура в 20 туби, затворени под налягане в азот. Реакцията бешезавършена чрез охлаждане чрез смесване с триптофан иобезсоляване. Пример 6 25 ЗАЩИТА ОТ РЕТИННА ИСХЕМИЯ ЧРЕЗ ПЕРИФЕРНО ПРИЛАГАН ЕРИТРОПОЕТИН Ретинните клетки са много чувствителни наисхемия, така че много могат да умрат след 30 минути отисхемичния стерс. Освен това, субакутна или хронична 30 исхемия подчертава влошаването на зрението, което съпътства много от разпространените заболявания на човека, 95 като например диабетес мелитус, глаукома, и макуларнадегенерация. В настоящия момент няма открити ефективнитерапии за защита на клетките от исхемия. Плътнаендотелна бариера съществува между кръвта и ретината, 5 която изключва повечето големи молекули. За да се тествадали периферно въведен еритропоетин ще защити клетки,чувствителни към исхемия, беше използван акутен реверсивенмодел на глаукома при плъхове, както е описано отКозепЬаит еб а1. (1997; Угз.Кез. 37:3443-51). По- ю специално беше инжектиран физиологичен разтвор в преднатакамера на окото на възрастни мъжки плъхове, за да се постигне налягане над системното артериално налягане ибеше поддържано 60 минути. В животните беше въведенинтраперитонеално физиологичен разтвор или 5000 и 15 еритропоетин на килограм живо тегло 24 часа преди индуцирането на исхемия и беше давано като дневна доза втри последователни дни. Беше направена електроретинография на плъхове адаптирани към тъмнина 1седмица след третирането. Фигури 11-12 илюстрират, че 20 въвеждането на еритропоетин се асоциира с добро запазванена електроретинограмата (ЕКС) (Панел Ό), за разлика от ’Ί*" животните третирани само с физиологичен разтвор (Панел С) ,при които се е запазила много малка част от функцията.Фигура 11 сравнява електроретинограма с а- и Ь-вълнови 25 амплитуди на третираните с еритропоетин и третираните сфизиологичен разтвор групи, и показва значителна защитаблагодарение на еритропоетина. 30 96 Пример 7 ВЪЗСТАНОВЯВАЩИ ЕФЕКТИ НА ЕРИТРОПОЕТИН ВЪРХУ НАМАЛЕНАКОГНИТИВНА ФУНКЦИЯ ВСЛЕДСТВИЕ НА МОЗЪЧНО УВРЕЖДАНЕ При изследване за да се демонстрираспособността на еритропоетин да възстановява намаленакогнитивна функция при мишки след мозъчна травма, бяхаподложени на тъпа мозъчна травма Ва1Ь/с мишки, както еописано в ВгФпез еб а1. ΡΝΑ3 2000, 97; 10295-10672 и петдена по-късно беше започнато интраперитонеално ежедневновкарване на еритропоетин по 5000 ϋ/кд-Ъм. Дванадесет денаслед увреждането, животните бяха тествани за когнитивнафункция във воден лабиринт на Могггз, с по четири опита наден. Докато както третираните, така и нетретиранитефивотни преминаваха лошо през теста (с време на плуванеоколо 80 секунди извън възможните 90 секунди), Фигура 13показва, че третираните с еритропоетин животни се справятпо-добре (в тази презентация негативните стойности са по-добри) Дори ако започването на третирането с еритропоетине забавено до 30 дена след травмата (Фигура 14), също сезабелязва възстановяване на когнитивната функция. Пример 8 КАЙНАТ МОДЕЛ В кайнат невротоксичен модел, беше въведенасиалоеритропоетин съгласно протокола на Вг1пез еб а1.Ргос. Каб. Асаб. Зсг. и.З.А. 2000, 97; 10295-10672 в дозаот 5000и/кд-Ьи давани интраперитонеално 24 часа предиприлагането на 25 тд/кд кайнат, беше показано, че толковаефективен, както и еритропоетин, както се вижда от времетона смъртта (Фигура 15). 97 Обхватът на изобретението не е лимитиран отописаните специфични изпълнения, които трябва да сеприемат като единични илюстрации на индивидуалните аспектина изобретението, и функционално еквивалентните методи и 5 компоненти са вътре в обхвата на изобретението. В действителност различни модификации на изобретението, вдопълнение към тези, които са показани и описани тук, щебъдат очевидни за специалиста в областта от горнотоописание и съпътстващите фигури. Такива модификации са 10 предвидени да попадат в обхвата на приложените претенции. Всички цитирани тук позовавания саинкорпорирани чрез препратки в тяхната цялост за всички възможни случаи. чЖ»1 Фигура 1

2.5 часа и повече р 0.01 сравнено с основата 1/15 Фигура 2

плацебо вехикул 2/15

време на отчитане 3/15

Фигура 4

Νβ/Мк ТЕСТВАНО ВЕЩЕСТВО 4/15 Фигура 5

X

ИЯ191П1 ИОбд НЗИ91И30Н1О Доза гНи-ЕРОилиасиалоеритропоетин (п§/т1) 5/15

I Ц

Пб/τηΐ добавено 4 1 4 ' 4 * «ί .........и ......4......г Т - 4 ?***> ;$ч}' V" © Чи» аневвзижзс!и оньчхвш) ониаиоонхо 6/15 АСИАЛОЕРИТРОПОЕТИН НАМАЛЯВА ГОЛЕМИНАТА НАИНФАРКТА ΚΑΚΤΟ ЕРИТРОПОЕТИН

ЗНАМ А51АЮ-ЕРО ЕРО 7/15

о о. ш о

I

Фигура 8 нсио ΕΖ _Ο Ι-Ο. он _ си о ПЗ н и ги си ω О сЕ

(сшш) У±>№ФНИ УН νΗΗίΛΏίΐτΧΙ П за всяка група е по-голям отили равен на 4 8/И Фигура 9 Биотиниран-ЕРО и Асиало-ЕРО запазватактивността в Р19 проба

9/15 Фигура 10

10/15 Фигура 11

X

X <υ

I § ο Ε= <υ κш εΟ ?X йд» φβ Й ГО ГО V * Σ ι— δ >·α. χ а н 2 ε Η § <υ α_ Ο α. Η ьс <υ β

X Λ Φ δ 4 Ц + (§ι

ο *2 8Й 14 ГО κ

X Σ φ

X υ

X β <η Μ- Π5 Ш (*п>/лпв'Ю)заП1гмйУ 11/15

р <0.05= 5 на група 12/15 —00

_\О —Μ- .СЧ -Ο —οο —Ό --4- СЧ ;ο (иУнЛизз) анваАии ен змас1а О93Т1¥1Л-1-Ос13 ДНИ НА ТРЕТИРАНЕ С ЕРО 13/15 Чш.·

(иИнАмаз) анваАии ве о±анас!а ачв еяи1/ее<] Ден на ЕРО третиране 14/15 с; <υ ο Ι- ΓΟ

I зН ЯЗ 1Л

упаямз 017 змзаа 15/15

Claims (43)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Използване на еритропоетин селектиран от групата състояща се от ί) еритропоетин нямащ поне следи от сиалова 5 киселина; ϋ) еритропоетин нямащ поне никакви Ν-свързани илиникакви О-свързани карбохидрати; ίίί) еритропоетин имащ поне намалено въглехидратносъдържание чрез третиране на природен еритропоетин с поне 10 една гликозидаза; ίν) еритропоетин с въглехидратна част наеритропоетиновата молекула имащ поне небозайниковгликозилатен патерн чрез експресията на рекомбинантенеритропоетин в небозайникови клетки; 15 ν) еритропоетин имащ поне един или повече оксидирани въглехидрати, които също могат да бъдат химическиредуцирани; νί) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; 20 νίΐ) еритропоетин имащ поне един или повече модифицирани лизинови остатъци или модификация на Ν-терминалната амино група на еритропоетин молекулата; νίϋ) еритропоетин имащ поне модифициран тирозиновостатък; 25 ίχ) еритропоетин имащ поне модифициран остатък на аспаргиновата киселина или остатък на глутаминовата киселина; х) еритропоетин имащ поне модифициран триптофанов остатък; χϊ) еритропоетин имащ поне една отстранена аминогрупа; χϋ) еритропоетин имащ поне начало на поне една отцистинните връзки в еритропоетиновата молекула; χίίί) еритропоетин предвиден да има поне еднасубституция на поне една амино група; и χίν) съкратен еритропоетин; служещ за приготвянето на фармацевтичен състав за защита,поддържане, усилване или възстановяване функцията илижизнеспособността на еритропоетин-чувствителни клетки набозайник и техни асоциирани клетки, тъкани или органи.
2. 2. Използването съгласно претенция 1,където еритропоетина е асиалоеритропоетин.
3. 3. Използването съгласно претенция 2,където асиалоеритропоетина е човешки асиалоеритропоетин.
4. 4. Използването съгласно претенция 1,където еритропоетина няма никакви Ν-свързани въглехидрати
5. 5. Използването съгласно претенция 1,където еритропоетина няма никакви О-свързани въглехидрати
6. 6. Използването съгласно претенция 1,където еритропоетина е третиран с поне една гликозидаза.
7. 7. Използването съгласно претенция 1,където еритропоетина е експресиран в клетка на инсект или на растение.
8. 8. Използването съгласно претенция 1,където еритропоетина е периодат-оксидиран еритропоетин.
9. 9. Използването съгласно претенция 8,където периодат-оксидирания еритропоетин е химическиредуциран с натриев цианоборохидрид.
10. 10. Използването съгласно претенция 1,където еритропоетина съдържа следа от К-глиоксал върхуедин или повече аргининови остатъци, където К е следа от алкил. 5 11. Използването съгласно претенция 10, където еритропоетина е фенилглиоксал еритропоетин.
11. 12. Използването съгласно претенция 1,където аргенинов остатък на еритропоетина е модифициранчрез реакция с вицинал дикетон, избран от групата състояща ю се от 2,3-бутандион и циклохексанедион.
12. 13. Използването съгласно претенция 1,където аргенинов остатък на еритропоетина е реагирал с 3-деоксиглюкозон.
13. 14. Използването съгласно претенция 1, 15 където еритропоетиновата молекула има поне един биотинизиран лизин или Ν-терминална амино група.
14. 15. Използването съгласно претенция 14,където еритропоетиновата молекула е биотинизиранеритропоетин. 20 16. Използването съгласно претенция 1, където еритропоетина е глюцитолил лизин еритропоетин илифруктозил лизин еритропоетин.
15. 17. Използването съгласно претенция 1,където лизинов остатък от еритропоетина е карбамилизиран. 25 18. Използването съгласно претенция 1, където лизинов остатък от еритропоетина е ацилиран.
16. 19. Използването съгласно претенция 18,където лизинов остатък на еритропоетина е ацетилиран.
17. 20. Използването съгласно претенция 18, 30 където лизинов остатък на еритропоетина е сукцинилиран.
18. 21. Използването съгласно претенция 1,където лизинов остатък на еритропоетина е модифициран чрез2,4,6 тринитробензенсулфонат натрий или друга негова сол.
19. 22. Използването съгласно претенция 1, 5 където тирозинов остатък на еритропоетина е нитриран илийодиран.
20. 23. Използването съгласно претенция 1,където остатък на аспаргинова киселина или на глютаминовакиселина на еритропоетина е реагирал с карбодиимид, ю последвано от реакция с амин.
21. 24. Използването съгласно претенция 21,където амина е глицинамид.
22. 25. Използванео съгласно претенция 1,където еритропоетин-чувствителна клетка или тъкан е 15 нервна, ретинална, мускулна, сърдечна, белодробна,чернодробна, бъбречна, малка чревна, надбъбречнакортексна, надбъбречна медуларна, капилярно ендотелна,тестисна, яйчникова, или ендометриална клетки или тъкан.
23. 26. Фармацевтичен състав съдържащ ефективно 20 еритропоетин-чуствителна клетка, защитаващо, поддържащо,усилващо или възстановяващо количество на еритропоетин селектиран от групата състояща се от ί) еритропоетин нямащ поне следи от сиалова киселина; 25 ϋ) еритропоетин нямащ поне никакви Ν-свързани или никакви О-свързани карбохидрати; ϋί) еритропоетин имащ поне намалено въглехидратносъдържание чрез третиране на природен еритропоетин с поне една гликозидаза; ίν) еритропоетин с въглехидратна част наеритропоетиновата молекула имащ поне небозайников гликозилатен патерн чрез експресията на рекомбинантенеритропоетин в небозайникови клетки; ν) еритропоетин имащ поне един или повече оксидиранивъглехидрати, които също могат да бъдат химически редуцирани; νϊ) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; 10

    15 20 νίί) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани лизинови остатъци или модификация на Ν- терминалната амино група на еритропоетин молекулата; νίϋ) еритропоетин имащ поне модифициран тирозинов остатък; ίχ) еритропоетин имащ поне модифициран остатък на аспаргиновата киселина или остатък на глутаминовата киселина; х) еритропоетин имащ поне модифициран триптофановостатък; χϊ) еритропоетин имащ поне една отстранена амино

    група; χίί) еритропоетин имащ поне начало на поне една отцистинните връзки в еритропоетиновата молекула; χίίί) еритропоетин предвиден да има поне една25 субституция на поне една амино група; и χίν) съкратен еритропоетин; служещ за приготвянето на фармацевтичен състав за защита,поддържане, усилване или възстановяване функцията илижизнеспособността на еритропоетин-чувствителни клетки на 30 бозайник и техни асоциирани клетки, тъкани или органи.
24. 27. Фармацевтичният състав от претенция 26,където еритропоетина е асиалоеритропоетин или фенилглиохалеритропоетин.
25. 28. Използване на еритропоетин заприготвяне на фармацевтичен състав за защита, поддържане,усилване или възстановяване на функциите или жизнеспособността на еритропоетин-чувствителна клетка илиасоциирани с нея клетки, тъкани или органи, където тезиклетки, клетки, тъкани или органи не са възбудими клетки,тъкани или органи, или не съдържат преобладаващо възбудими клетки или тъкани.
26. 29. Използването съгласно претенция 28,където еритропоетина е еритропоетин или природен еритропоетин, или еритропоетин аналог, еритропоетинмиметик, еритропоетин фрагмент, хибридна еритропоетиновамолекула, еритропоетин рецептор-свързваща молекула,еритропоетин агонист, бъбречен еритропоетин, мозъченеритропоетин, негов олигомер, негов мултимер, неговмутеин, негов конгенер, природно срещана негова форма,негова синтетична форма, негова рекомбинантна форма, неговгликозилатен вариант, негов дегликозилатен вариант, илинегова комбинация.
27. 30. Използването съгласно претенция 28,където еритропоетина е фенилглиоксал еритропоетин.
28. 31. Метод за защита, поддържане илиусилване жизнеспособността на клетка, тъкан или орган,изолиран от тяло на бозайник, съдържащ такава клетка,тъкан или орган, подложени на въздействие на фармацевтиченсъстав съдържащ еритропоетин.
29. 32. Метод съгласно претенция 31, къдетоеритропоетина е еритропоетин или природен еритропоетин, или еритропоетин аналог, еритропоетин миметик,еритропоетин фрагмент, хибридна еритропоетинова молекула,еритропоетин рецептор-свързваща молекула, еритропоетинагонист, бъбречен еритропоетин, мозъчен еритропоетин, 5 негов олигомер, негов мултимер, негов мутеин, негов конгенер, природно срещана негова форма, негова синтетичнаформа, негова рекомбинантна форма, негов гликозилатенвариант, негов дегликозилатен вариант, или негова комбинация. 10 33. Метода съгласно претения 32, където еритропоетина е ί) еритропоетин нямащ поне следи от сиалова киселина; ϋ) еритропоетин нямащ поне никакви Ν-свързани или 15 никакви О-свързани карбохидрати; ϋί) еритропоетин имащ поне намалено въглехидратносъдържание чрез третиране на природен еритропоетин с поне една гликозидаза; ίν) еритропоетин с въглехидратна част на20 еритропоетиновата молекула имащ поне небозайников с гликозилатен патерн чрез експресията на рекомбинантенеритропоетин в небозайникови клетки; ν) еритропоетин имащ поне един или повече оксидиранивъглехидрати, които също могат да бъдат химически 25 редуцирани; νί) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; νίί) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани лизинови остатъци или модификация на Ν- 30 терминалната амино група на еритропоетин молекулата; νίίϊ) еритропоетин имащ поне модифициран тирозиновостатък; ϊχ) еритропоетин имащ поне модифициран остатък нааспаргиновата киселина или остатък на глутаминовата 5 киселина; х) еритропоетин имащ поне модифициран триптофановостатък; χϊ) еритропоетин имащ поне една отстранена аминогрупа; 10 χίί) еритропоетин имащ поне начало на поне една от цистинните връзки в еритропоетиновата молекула; χϊϊϊ) еритропоетин предвиден да има поне еднасубституция на поне една амино група; и χίν) съкратен еритропоетин; 15 служещ за приготвянето на фармацевтичен състав за защита,поддържане, усилване или възстановяване функцията илижизнеспособността на еритропоетин-чувствителни клетки набозайник и техни асоциирани клетки, тъкани или органи.
30. 34. Методът съгласно претенция 31, където 20 еритропоетина е човешки еритропоетин.
31. 35. Методът съгласно претенция 31, къдетоеритропоетина е фенилглиоксал еритропоетин.
32. 36. Използване на еритропоетин избран отгрупата съсояща се от еритропоетин или природен 25 еритропоетин, или еритропоетин аналог, еритропоетин миметик, и еритропоетин фрагмент, хибридна еритропоетиновамолекула, еритропоетин рецептор-свързваща молекула,еритропоетин агонист, бъбречен еритропоетин, мозъченеритропоетин, негов олигомер, негов мултимер, негов 30 мутеин, негов конгенер, природно срещана негова форма, негова синтетична форма, негова рекомбинантна форма, неговгликозилатен вариант, негов дегликозилатен вариант, илинегова комбинация, за приготвянето на фармацевтичен съставза възстановяване на когнитивна дисфункция при бозайник. 10 15 20
33. 37. Използването съгласно претенция 36,където когнитивната дисфункция е в реултат на нараняванепричинено от припадък, мултиплена склероза, удар,хипотензия, кардиачен арест, исхемия, инфаркт на миокарда,възпаление, загуба на когнитивна функция свързана свъзрастта, лъчеви поражения, церебрална парализа,нервнодегенеративно заболяване, болест на Алцхаймер,болест на Паркинсон, болест на Ье1дЬ, СПИН деменция,загуба на памет, амиотрофична латерална склероза,алкохолизъм, нарушения в настоението, тревожност,намаляване на вниманието, аутизъм, болест на Кройцфелд-Джейкъб, мозъчна или гръбначно-мозъчна травма или исхемия,сърдечно-белодробен байпас, хронична сърдечна недостатъчност, макуларна дегенрация, диабетна невропатия,диабетна ретинопатия, глаукома, ретинна исхемия, илиретинална травма.
34. 38. Използването съгласно претенция 36, Сй. където еритропоетина е фенилглиоксал еритропоетин.
35. 39. Използването съгласно претенция 36,където еритропоетина е 25 Ϊ) еритропоетин нямащ поне следи от сиалова киселина; ϋ) еритропоетин нямащ поне никакви Ν-свързани илиникакви О-свързани карбохидрати; ίίί) еритропоетин имащ поне намалено въглехидратно30 съдържание чрез третиране на природен еритропоетин с поне една гликозидаза; 10 ίν) еритропоетин с въглехидратна част наеритропоетиновата молекула имащ поне небозайниковгликозилатен патерн чрез експресията на рекомбинантенеритропоетин в небозайникови клетки; ν) еритропоетин имащ поне един или повече оксидиранивъглехидрати, които също могат да бъдат химическиредуцирани; νϊ) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; νϋ) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани лизинови остатъци или модификация на Ν-терминалната амино група на еритропоетин молекулата; νίϋ) еритропоетин имащ поне модифициран тирозиновостатък; ίχ) еритропоетин имащ поне модифициран остатък нааспаргиновата киселина или остатък на глутаминовата киселина; х) еритропоетин имащ поне модифициран триптофанов остатък; χϊ) еритропоетин имащ поне една отстранена аминогрупа; χίί) еритропоетин имащ поне начало на поне една отцистинните връзки в еритропоетиновата молекула; χίϋ) еритропоетин предвиден да има поне еднасубституция на поне една амино група; и χίν) съкратен еритропоетин.
36. 40. Метод за улесняване на трансцитозата на молекула през ендотелна клетъчна бариера у бозайник,съдържащ прилагане върху бозайника на състав съдържащ 11 молекулата в асоциация с еритропоетин избран от групата състояща се от ϊ) еритропоетин нямащ поне следи от сиалова киселина; 10 15

    ϋ) еритропоетин нямащ поне никакви Ν-свързани илиникакви О-свързани карбохидрати; ίϋ) еритропоетин имащ поне намалено въглехидратносъдържание чрез третиране на природен еритропоетин с поне една гликозидаза; ίν) еритропоетин с въглехидратна част наеритропоетиновата молекула имащ поне небозайниковгликозилатен патерн чрез експресията на рекомбинантенеритропоетин в небозайникови клетки; ν) еритропоетин имащ поне един или повече оксидиранивъглехидрати, които също могат да бъдат химическиредуцирани; νϊ) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; νϋ) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани лизинови остатъци или модификация на Ν-терминалната амино група на еритропоетин молекулата; νίϋ) еритропоетин имащ поне модифициран тирозинов остатък; ίχ) еритропоетин имащ поне модифициран остатък на25 аспаргиновата киселина или остатък на глутаминовата киселина; х) еритропоетин имащ поне модифициран триптофановостатък; χϊ) еритропоетин имащ поне една отстранена амино30 група; 12 χϋ) еритропоетин имащ поне начало на поне една отцистинните връзки в еритропоетиновата молекула; χϋί) еритропоетин предвиден да има поне еднасубституция на поне една амино група; и 5 χίν) съкратен еритропоетин.
37. 41. Методът съгласно претенция 40, където асоциацията е лабилна ковалентна връзка, стабилнаковалентна връзка, или нековалентна асоциация със свързващсайт за тази молекула. 10 42. Методът съгласно претенция 40, където ендотелната клетъчна бариера е избрана от групата състоящасе от кръвно-мозъчна бариера, кръвно-очна бариера, кръвно-тестисна бариера, кръвно-яйчникова бариера и кръвно-плацентна бариера. 15 43. Методът съгласно претенция 40, където молекулата е рецепторен агонист или антагонист хормон,невротрофичен фактор, антимикробен агент, лъчефармацевтик,антисензитивен олигонуклеотид, антитяло, имуносупресант или антираково лекарство. 20 44. Състав за транспортиране на молекула Че, чрез трансцидоза през ендотелна клетъчна бариера съдържащ молекулата в асоциация с еритропоетин избран от групатасъстояща се от Ϊ) еритропоетин нямащ поне следи от сиалова 25 киселина; ϋ) еритропоетин нямащ поне никакви Ν-свързани илиникакви О-свързани карбохидрати; ϋί) еритропоетин имащ поне намалено въглехидратносъдържание чрез третиране на природен еритропоетин с поне 30 една гликозидаза; 13 ίν) еритропоетин с въглехидратна част наеритропоетиновата молекула имащ поне небозайниковгликозилатен патерн чрез експресията на рекомбинантенеритропоетин в небозайникови клетки; 5 ν) еритропоетин имащ поне един или повече оксидирани въглехидрати, които също могат да бъдат химическиредуцирани; νϊ) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; 10 νίί) еритропоетин имащ поне един или повече модифицирани лизинови остатъци или модификация на Ν- Чг терминалната амино група на еритропоетин молекулата; νϋί) еритропоетин имащ поне модифициран тирозиновостатък; 15 ίχ) еритропоетин имащ поне модифициран остатък на аспаргиновата киселина или остатък на глутаминовата киселина; х) еритропоетин имащ поне модифициран триптофановостатък; 20 χϊ) еритропоетин имащ поне една отстранена амино *вг· група; χϊϊ) еритропоетин имащ поне начало на поне една отцистинните връзки в еритропоетиновата молекула; χϊϊϊ) еритропоетин предвиден да има поне една 25 субституция на поне една амино група; и χϊν) съкратен еритропоетин.
38. 45. Композицията от претенция 44, където асоциацията е лабилна ковалентна връзка, стабилнаковалентна връзка, или нековалентна асоциация със свързващ 30 сайт за тази молекула. 14
39. 46. Композицията от претенция 44, къдетомолекулата е рецепторен агонист или антагонист хормон,невротрофичен фактор, антимикробен агент, лъчефармацевтик,антисензитивен олигонуклеотид, антитяло, имуносупресант или антираково лекарство.
40. 47. Използване на еритропоетин избран отгрупата състояща се от ϊ) еритропоетин нямащ поне следи от сиалова киселина; ϋ) еритропоетин нямащ поне никакви Ν-свързани илиникакви О-свързани карбохидрати; ίϋ) еритропоетин имащ поне намалено въглехидратносъдържание чрез третиране на природен еритропоетин с поне една гликозидаза; ίν) еритропоетин с въглехидратна част наеритропоетиновата молекула имащ поне небозайниковгликозилатен патерн чрез експресията на рекомбинантенеритропоетин в небозайникови клетки; ν) еритропоетин имащ поне един или повече оксидиранивъглехидрати, които също могат да бъдат химическиредуцирани; νί) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани аргининови остатъци; νίί) еритропоетин имащ поне един или повечемодифицирани лизинови остатъци или модификация на Ν-терминалната амино група на еритропоетин молекулата; νϋί) еритропоетин имащ поне модифициран тирозинов остатък; 15 ίχ) еритропоетин имащ поне модифициран остатък нааспаргиновата киселина или остатък на глутаминовата киселина; х) еритропоетин имащ поне модифициран триптофанов 5 остатък; χί) еритропоетин имащ поне една отстранена аминогрупа; χίί) еритропоетин имащ поне начало на поне една отцистинните връзки в еритропоетиновата молекула; 10 χίίί) еритропоетин предвиден да има поне една субституция на поне една амино група; и съкратенеритропоетин асоцииран с молекула за приготвянето на фармацевтиченсъстав за транспортиране на молекулата чрез трансцитоза 15 през ендотелна клетъчна бариера.
41. 48. Използването съгласно претенция 47,където асоциацията е лабилна ковалентна връзка, стабилнаковалентна връзка, или нековалентна асоциация със свързващсайт за тази молекула. 20 49. Композицията от претенция 47, където молекулата е рецепторен агонист или антагонист хормон,невротрофичен фактор, антимикробен агент, лъчефармацевтик,антисензитивен олигонуклеотид, антитяло, имуносупресант или антираково лекарство. 25 50 еритропоетин. 51 еритропоетин. 52 30 еритропоетин. Състав съдържащ периодат-оксидиран Състав съдържащ глюцитолил лизин Състав съдържащ фруктозил лизин 16
42. 53. Състав съдържащ З-Деоксиглюкозон еритропоетин. 54. Състав съдържащ карбамилиран асиалоеритропоетин. 55. Състав съдържащ биотинизиран асиалоеритропоетин.
43. 56. Състав съдържащ сукцинилиран асиалоеритропоетин • 57 . Състав съдържащ ацетилиран 10 асиалоеритропоетин. 20