RS52276B - Zaštita, obnavljanje i povećanje ćelija, tkiva i organa responzivnih na eritropoetin - Google Patents

Description

Prioritet provizorne prijave br. 60/259,245 koja je podneta29 decembra,. 2000, i koja

je pomoću reference ovde pripojena u celosti, traženje pod 35 U.S.C. § 119(e)(i).

STANJE TEHNIKE

U dugom vremenskom periodu, jedina razumljiva fiziološka uloga eritropoetina bila je kontrola proizvodnje crvenih krvnih ćelija. Od nedavno, veći broj dokaza ukazuje na to da eritropoetin, kao član citokin super familije, obavlja druge važne fiziološke funkcije pomoću posredne interakcije sa eritropoetin receptorom (eritropoetin-R). Ova dejstva obuhvataju mitogenezu, modulaciju ulaženja kalcijuma u ćelije glatkih mišića i nervne ćelije, i efekte na intermedijarni metabolizam. Veruje se da eritropoetin obezbeđuje naknadne response koji služe da se poboljša hipoksična ćelijska mikro sredina kao i da se moduliše programirana smrt ćelije prouzrokovana metabolitičkim stresom. Iako su ispitivanja utvrdila da eritropoetin ubrizgan intrakranijalno štiti neurone od hipoksične nervne povrede, intrakranijalno apliciranje je nepraktičan i neprihvatljiv način apliciranja za terapeutske svrhe, naročito kod normalnih osoba Osim toga, prethodna ispitivanja anemičnih pacijenata kojima je davan eritropoetin pokazala su da se periferno apliciran eritropoetin ne transportuje u mozak (Marti i dr., 1997, Kidney Int. 51:416-8; Juul i dr., 1999, Pediatr. Res. 46:543-547; Buemi i dr., 2000, Nephrol. Dial. Transplant. 15:422-433.).

Opisani su različiti modifikovani oblici entropoetina čije su aktivnosti usmerene ka poboljšanju eritropoetinskog dejstva molekula, takvih kao kod amino kiselina izmenjenih na karboksi položaju koje su opisane u U.S. Patent 5,457,089 i u U.S. Patent 4,835,260; eritropoetin izo oblici sa različitim brojem ostataka sijalinske kiseline po molekulu , kao što je opisano u U.S. Patent 5,856,292; polipeptidi opisani u U.S. Patent 4,703,008; agonisti opisani u U.S. Patent 5,767,078; peptidi koji se vezuju za eritropoetin receptor kao što je opisano u U.S.

Patent 5,773,569 i US Patent 5,830,851; i imitacije malih molekula kao što je opisano u U.S.

Patent 5,835,382.

Ovaj izum se odnosi na primenu eritropoetina za zaštitu, održavanje, povećavanje, ili obnavljanje ćelija i asociranih ćelija, tkiva i organa responzivnih na eritropoetinin situkao iex vivo,i na prenošenje eritropoetina preko endotelijalne ćelijske barijere radi zaštite i povećavanja ćelija i asociranih ćelija, tkiva i organa responzivnih na eritropoetin, i koji su distalni od vaskulatomog sistema, ili da drži asocirane molekule.

KRATAK SADRŽAJ IZUMA

U jednom aspektu ovoj izum se odnosi na primenu eritropoetina za dobijanje farmaceutskih smeša za zaštitu, održavanje, povećavanje ili obnavljanje funkcije ili sposobnosti za život ćelija sisara i njihovih asociranih ćelija, tkiva i organa, responzivnih na eritropoetin. U jednom određenom aspektu, ćelije sisara i njihove asocirane ćelije, tkivo ili organ su distalni od vaskulatomog sistema zbog čvrste endotelijalne ćelijske barijere. U drugom određenom aspektu, ćelije, tkiva, organi ili drugi delovi tela su izolovani iz tela sisara, takvi kao oni što su određeni za transplantaciju. U neograničavajućim primerima, ćelija ili tkivo responzivni na eritropoetin mogu biti iz nerava, retine, mišića, srca, pluća, jetre, bubrega, tankog creva, adrenalne kore, adrenalne moždine, kapilarnog endotelijala, testisa, jajnika, pankreasa ili endometrijalnih ćelija ili tkiva Ovi primeri ćelija responzivnih na eritropoetin samo su ilustrativni. U jednom aspektu, ćelije responzivne na eritropoetin ili njihove asocirane ćelije, tkiva ili organi nisu ekscitirine ćelije, tkiva ili organi, ili ne sadrže pretežno ekscitirane ćelije ili tkiva Kod određenog oblika izvođenja, ćelija, tkivo ili organ sisara za koji je primenjen napred pomenuti derivat eritropoetina su oni koji su proveli ili će provesti određen vremenski period u najmanje jednom stanju koje je štetno za sposobnost života ćelije, tkiva ili organa Takva stanja uključuju traumatskuin- situhipoksiju ili metaboličku disfunkciju, hirurški izazvanuin- situhipoksiju ili metaboličku disfunkciju, iliin- situizlaganje toksinima, pri čemu ovo poslednje može biti u vezi sa hemoterapijom ili terapijom zračenjem. Kod određenog oblika izvođenja, nepovoljna stanja su rezultat kardio-pulmonarnog bajpasa (aparat srce-pluća ), koji se koristi za određene hirurške postupke.

Eritropoetini su korisni za terapeutsko ili profilaktičko lečenje bolesti centralnog nervnog sistema CNS ili perifernog nervnog sistema kod ljudi, koje imaju primamo neurološke ili psihijatrijske simptome, kao i za očne bolesti, kardiovaskularne bolesti, kardiopulmonarne bolesti, respiratorne bolesti, bubrežne, uriname i reproduktivne bolesti, gastrointestinalne bolesti i endokrine i metaboličke abnormalnosti.

Ovaj izum se takođe odnosi na farmaceutske smeše koje sadrže određene derivate eritropoetina za apliciranje sisarima, naročito ljudima. Takve farmaceutske smeše mogu biti formulisane za oralno, intranazalno, ili parenteralno apliciranje, ili mogu biti u obliku rastvora za perfuziju radi održavanje sposobnosti za život ćelija, tkiva ili organaex vivo.

Derivati eritropoetina koji se koriste za napred navedene svrhe mogu biti bilo koji nativni eritropoetin, ili analog eritropoetina, imitacija eritropoetina, i fragment eritropoetina, hibridni molekul eritropoetina, molekul koji vezuje eritropoetin i receptor, eritropoetin agonist, renalni eritropoetin, moždani eritropoetin, njegov oligomer, njegov multimer, njegov mutein, njemu srodno jedinjenje, njegov oblik koji se nalazi u prirodi, njegov sintetički oblik, njegov rekombinantni oblik, njegova glikozilovana varijanta , njegova deglikozilovana varijanta, ili njihova kombinacija. Bilo koji oblik eritropoetina koji je delotvoran za ćelije responzivne na eritropoetin, obuhvaćen je u ovom aspektu izuma

Ostali derivati eritropoetina koji se koriste za napred navedene svrhe i farmaceutske smeše uključuju kako nativne eritropoetine tako i eritropoetine koji su bili izmenjeni pomoću najmanje jedne modifikacije u poređenju sa nativnim eritropoetinom, i poželjno u poređenju sa nativnim humanim eritropoetinom. Najmanje jedna modifikacija može pretstavljati modifikaciju od najmanje jedne amino kiseline iz molekula eritropoetina, ili modifikacuju najmanje jednog ugljenog hidrata iz molekula eritropoetina. Naravno, molekuli eritropoetina korisni za navedene svrhe mogu imati veliki broj modifikacija u poređenju sa nativnim molekulom, kao što su višestruke modifikacije dela molekula sa amino kiselinama, višestruke modifikacije dela molekula sa ugljenim hidratima, ili najmanje jedna modifikacija dela molekula sa amino kiselinama i najmanje jedna modifikacija dela molekula sa ugljenim hidratima. Modifikovani molekul eritropoetina zadržava svoju sposobnost za zaštitu, održavanje, povećavanje ili obnavljanje funkcije ili sposobnosti za život ćelija sisara responzivnih na eritropoetin, ali druge odlike molekula eritropoetina koje nisu u vezi sa napred pomenutim, kao što je željena karakteristika, mogu biti otsutne u poređenju sa nativnim molekulom. Kod prioritetnog oblika izvođenja, derivat eritropoetina nije eritropoetinski.

Kod jednog oblika izvođenja, eritropoetin iz ovog izuma ne sadrži delove sijalinske kiseline. Kod prioritetnog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin je asijaloeritropoetin, a priritetno je to humani asijaloeritropoetin. Kod sledećeg oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12, ili 13 delova sijalinske kiseline .

Kod drugog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin ne sadrži ugljene hidrate vezane preko N- ili O-veze.

Kod trećeg oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin ima smanjen sadržaj ugljenih hidrata zbog reagovanja eritropoetina i njegovih nativnih ugljenih hidrata sa najmanje jednom glikozidazom.

Kod četvrtog oblika izvođenja, deo modifikovanog molekula eritropoetina sa ugljenim hidratima ima najmanje jedan obrazac glikozilovanja kod životinja sem sisara na osnovu eksprimiranja rekombinantnog eritropoetina u ćelijama životinja sem sisara. Kod poželjnog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetini su eksprimirani u ćelije insekata ili biljaka.

Kod petog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin sadrži jedan ili više oksidisanih ugljenih hidrata koji takođe mogu biti hemijski redukovani. Kod prioritetnog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin je oksidisan perjodatom; kod sledećeg prioritetnog oblika izvođenja, eritropoetin oksidisan perjodatom je hemijski redukovan pomoću soli borhidrida kao što su natrijum borhidrid ili natnjum cijanoborhidrid.

Kod šestog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin za napred navedene primene sadrži najmanje jedan ili više ostataka arginina Kod jednog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin sadrži deo glioksala najednom ili više ostataka arginina, kao što je arilglioksal ili alkilglioksal deo. Kod sledećeg oblika izvođenja, najmanje jedan ostatak arginina je modifikovan reakcijom sa vicinalrum diketonom kao što je, ali nije ograničeno na, 2,3-butandion ili cikloheksandion.

Kod sedmog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin sadrži najmanje jedan ili više modifikovanih ostataka lizina ili modifikovanu N-terminalnu amino grupu iz molekula eritropoetina, takve modifikacije kao one što se dobijaju reakcijom ostatka lizina ili N-terminalne amino grupe sa sredstvom za modifikovanje amino grupe. Modifikovani ostatak lizina može dalje biti hemijski redukovan. Kod prioritetnog oblika izvođenja, eritropoetin je podvrgnut biotinilovanju ili karbamilovanju preko jedne ili više grupa lizina. Kod sledećeg prioritetnog oblika izvođenja, lizin reaguje sa aldehidom ili redukcionim šećerom da bi se dobio imin, koji može biti stabilizovan putem redukcije sa natrijum cijanoborhidridom da bi se dobio N-alkilovani lizin kao što je glucitolil lizin, ili koji u slučaju redukcionih šećera može biti stabilizovan pomoću Amadori-jevog ili Heyns-ovog preuređenja da bi se dobio alfa-deoksi- alfa-amino šećer kao što je alfa-deoksi-alfa-fruktosilizin. Kod sledećeg prioritetnog oblika izvođenja, lizinska grupaje karbamilovana, na osnovu reakcije sa jonom cijanata, alkil-karbamilovana, aril-karbamilovana, ili aril-tiokarbamilovana sa alkil-izocijanatom, aril-izocijanatorn, ili aril-izotiođjanatom,odnosno, ili lizinska grupa može biti acilovana pomoću reaktivnog derivata alkilkarboksilne ili arilkarboksilne kiseline, kao u reakciji sa anhidridom sirćetne kiseline, anhidridom ćilibarne kiseline i anhidridom ftalne kiseline. Najmanje jedna lizinska grupa može takode biti modifikovana tnnitrofenilom putem reakcije sa trinitrobenzensulfonskom kiselinom, ili poželjno sa njenom soli. Kod sledećeg oblika izvođenja, ostaci lizina mogu biti modifikovani reakcijom sa derivatom glioksala, kao što je reakcija sa glioksalom; metilglioksalom ili 3-deoksiglukozonom da bi se dobili odgovarajući alfa-karboksilovani derivati.

Kod osmog oblika izvođenja, najmanje jedan ostatak tirozina iz eritropoetina može biti modifikovan na položaju u aromatskom prstenu pomoću elektrofilnog agensa, kao što je putem nitrovanja ili jodiranja

Kod devetog oblika izvođenja, najmanje jedan ostatak asparaginske kiseline ili glutaminske kiseline iz eritropoetina može biti modifikovan reakcijom, kao što je reakcija sa karbodiimidom, iza koje sledi sledi reakcija sa aminom, kao što je, ali nije ograničen na, glicinamid.

Kod desetog oblika izvođenja, modifikuje se najmanje ostatak tritofana iz eritropoetina reakcijom, kao što je reakcija sa n-bromosukcinimidom ili n-hlorosukcinimidom

Kod jedanaestog oblika izvođenja, dobijen je modifikovan molekul eritropoetina iz koga je uklonjena najmanje jedna eritropoetin amino grupa reakcijom, kao što je reakcija sa ninhidrinom, koja je bila praćena redukcijom dobijene karbonilne grupe pomoću reakcije sa

borhidridom.

Kod dvanaestog oblika izvođenja, dobijen je modifikovani eritropoetin koji ima najmanje jedno slobodno mesto na najmanje jednoj od cistinskih veza u molekulu eritropoetina pomoću reakcije sa redukcionim agensom kao što je ditiotreitol, posle čega sledi reakcija sledećih sulfhidrila sajodoacetamidom, jodosirćetnom kiselinom ili drugim elektrofilnim agensom da bi se sprečilo ponovno uspostavljanje disulfidnih veza

Kod trinaestog oblika izvođenja, dobijen je modifikovani eritropoetin kod koga je supstituisana najmanje jedna od brojnih amino kiselina, kao što je leucin, sa najmanje jednim ostatkom lizina, arginina, triptofana, tirozina, ili cisteina iz eritropoetina, primenom postupaka iz molekularne biologije.

Kod četrnaestog oblika izvođenja, modifikovani eritropoetin podvrgnut je ograničenoj hemijskoj proteolizi koja pogađa specifične ostatke, na primer, radi razdvajanja ostataka tritofana. Tako dobijeni fragmenti eritropoetina su ovde obuhvaćeni.

Kao što je napred navedeno, eritropoetin koji se koristi za svrhe ovde navedene može imati najmanje jednu od napred pomenutih modifikacija, ali može imati i više od jedne od navedenih modifikacija. Primer za modifikovan eritropoetin sajednom modifikacijom na delu molekula sa ugljenim hidratima i sajednom modifikacijom na delu molekula sa amino kiselinama, pretstavlja asijaloeritropoetin čiji su lizinski ostaci biotinilovani ili karbamilovani. Ovaj izum obuhvata takođe smeše, uključujući farmaceutske smeše, koje sadrže jedan ili više od napred pomenutih eritropoetina.

U drugom aspektu ovog izuma, dat je postupak za zaštitu, održavanje, povećavanje ili obnavljanje funkcije ili sposobnosti za život ćelija sisara responzivnih na eritropoetin i njihovih asociranih ćelija, tkiva i organa, putem apliciranja efikasne količine bilo jednog ili više od napred pomenutih eritropoetina U jednom određenom aspektu ovog postupka, ćelije sisara responzivne na eritropoetin i njihove asocirane ćelije, tkivo ili organ su distalni od vaskulatomog sistema zbog čvrste endotelijalne ćelijske barijere. U drugom određenom aspektu , ćelije, tkiva, organi ili drugi delovi tela su izolovani od tela sisara, takvi kao da su predviđeni za transplantaciju. U neograničavajućim primerima, ćelija ili tkivo responzivni na eritropoetin mogu biti iz nervnog sistema, retine, mišića, srca, pluća, jetre, bubrega, tankog creva, adrenalne kore, adrenalne moždine, kapilarnog endotela, testisa, jajnika, pankreasa ili endometrijalnih ćelija ili tkiva Ovi primeri za ćelije responzivne na eritropoetin samo su ilustrativni. Kod određenog oblika izvođenja, ćelije responzivne na eritropoetin ili njihove asocirane ćelije, tkiva ili organi nisu ekscitirane ćelije, tkiva ili organi, ili ne sadrže pretežno ekscitirane ćelije ili tkiva. Kod sledećeg određenog oblika izvođenja, ćelija , tkivo ili organ sisara kod kojih napred pomenuti derivat eritropoetina može biti apliciran su oni koji su proveli ili će provesti određen vremenski period u najmanje jednom stanju koje je štetno za sposobnost života ćelije, tkiva ili organa Takva stanja mogu da uključuju traumatskuin- situhipoksiju ili metaboličku disfunkciju, hirurški izazvanuin- situhipoksiju ili metaboličku disfunkciju, iliin- situizlaganje toksinima, pri čemu ovo poslednje može biti u vezi sa hemoterapijom ili terapijom zračenjem. Kod jednog oblika izvođenja, ovaj izum pruža zaštitu od nepovoljnih stanja koja su rezultat kardio-pulmonamog bajpasa.

U drugom aspektu ovog izuma, svaki od prethodnih eritropoetina isto tako kao i bilo koji drugi molekuli eritropoetina, uključujući nativni humani eritropoetin, mogu se koristiti zadobijanje farmaceutskih smeša zaex- vivoobradu ćelija, tkiva i organa radi zaštite, održavanja, povećavanja ili obnavljanja funkcije ili sposobnosti za život ćelija responzivnih na eritropoetin i njihovih asociranih ćelija, tkiva i organa kod sisara Takvaex- vivoobrada je korisna, na primer, za čuvanje ćelija, tkiva ili organa za transplantaciju, bilo za autotransplantaciju ili za ksenotransplantciju. Ćelije, tkivo ili organ se mogu kupati u rastvoru koji sadrži eritropoetin, ili se rastvor za perfuziju uliva u organ putem krvnih sudova ili na druge načine, radi održavanja ćelijske funkcije u toku perioda u kome ćelije, tkivo ili organ nisu povezani sa krvnim sudovima davaoca ili primaoca Apliciranje perfuzionog rastvora se-može raditi kod davaoca pre nego što se izvadi organ, a takode i kod izvađenog organa i kod primaoca Šta više, gore pomenuta primena bilo kojeg eritropoetina je korisna kad god su ćelija, tkivo ili organ izolovani od krvnih sudova pojedinca i na taj način u suštini postojeex vivou određenom vremenskom periodu, pri čemu se izraz izolovani odnosi na restrikciju ili začepljenje krvnih sudova od ili prema ćeliji, tkivu, organu ili delu tela, takvo kao što se obavlja u toku hirurške intervencije, uključujući, naročito, kardio-pulmonarnu baj-pas operaciju; povezivanje krvnih sudova ćelije, tkiva, organa ili dela tela; uklanjanje ćelije, tkiva, organa ili dela tela sa tela sisara, takvo kao što se radi pre izvođenja ksenotransplantacije ili pre i u toku autotransplantacije; ili traumatsku amputaciju ćelije, tkiva, organa ili dela tela. Tako je ovaj aspekt izuma u vezi sa korišćenjem perfuzije sa eritropoetinomin situiex vivo. Kx vivo,eritropoetin se može nalaziti u rastvoru za čuvanje ćelije, tkiva ili organa U svakom slučaju, kod ovog načina rada može se koristiti kontinualna perfuzija pulsirajuća perfuzija infuzija kupanje, ubrizgavanje, ili kateterizacija

U sledećem aspektu, izum se odnosi na na postupak za zaštitu, održavanje, povećavanje, ili obnavljanje sposobnosti za život ćelije sisara tkiva organa ili dela tela koji uključuje ćeliju ili tkivo responzivne na eritropoetin, u kome je ćelija, tkivo, organ ili deo tela izolovan iz tela sisara Ovaj postupak uključuje izlaganje izolovane ćelije sisara, tkiva organa ili dela tela izvesnoj količini eritropoetina u toku vremenskog perioda koji je efikasan da zaštiti, održi, poveća, ili obnovi napred pomenutu sposobnost za život. U neograničavajućim primerima, izraz izolovan se odnosi na restrikciju ili začepljenje krvnih sudova od ili prema ćeliji, tkivu, organu ili delu tela, takvo kao što se obavlja u toku hirurške intervencije,uključujući, naročito, kardio-pulmonarnu baj-pas operaciju; povezivanje krvnih sudova ćelije, tkiva, organa ili dela tela; uklanjanje ćelije, tkiva, organa ili dela tela sa tela sisara, takvo kao što se radi pre izvođenja ksenotransplantacije ili pre i u toku auto transplantacije; ili traumatska amputacija ćelije, tkiva, organa ili dela tela. Tako je ovaj aspekt izuma u vezi sa korišćenjem perfuzije sa eritropoetinomin situiex vivo. Ex vivo,eritropoetin se može nalaziti u rastvoru za čuvanje ćelije, tkiva ili organa U svakom slučaju, kod ovog načina rada može se koristiti kontinualna perfuzija, pulsirajuća perfuzija, infuzija, kupanje, ubrizgavanje, ili kateterizacija

U napred pomenutom izolovanju iliex- vivoobliku izvođenja koristan eritropoetin može biti svaki od gore pomenutih eritropoetina, uključujući bilo koji nativni eritropoetin, ili analog eritropoetina imitaciju eritropoetina, i fragment eritropoetina hibridni molekul eritropoetina molekul koji vezuje eritropoetin i receptor, eritropoetin agonist, renalni eritropoetin, moždani eritropoetin, njegov oligomer, njegov multimer, njegov mutein, njemu srodno jedinjenje, njegov oblik koji se nalazi u prirodi, njegov sintetički oblik, njegov rekombinantni oblik, njegovu glikozilovanu varijantu, njegovu deglikozilovanu varijantu, ili njihovu kombinaciju. Bilo koji oblik eritropoetina koji može da bude delotvoran za ćelije responzivne na eritropoetin obuhvaćen je u ovom aspektu izuma. Drugi eritropoetini uključuju, ali nisu ograničeni na asijaloeritropoetin, N-deglikozilovani eritropoetin, O-degliko žilo vani eritropoetin, eritropoetin sa smanjenim sadržajem ugljenih hidrata, eritropoetin sa izmenjenim obrascima glikozilovanja, eritropoetin sa oksidisanim ugljenim hidratima a potom redukovanim, eritropoetin modifikovan arilglioksalom, eritropoetin modifikovan alkilglioksalom, eritropoetin modifikovan 2,3-butandionom, entropoetin modifikovan cikloheksandionom, biotinilovani eritropoetin, N-alkilovan-lizil-eritropoetin, glucitolil lizin eritropoetin, alfa-deoksi-alfa-fruktozil Iizin-eritropoetin, karbamilovani eritropoetin, acetilovani entropoetin, sukcinilovani eritropoetin, alfa-karboksialkil eritropoetin, nitrovani eritropoetin, jodirani eritropoetin, u cilju navođenja nekoliko reprezentativnih i još uvek neograničavajućih primera koji se zasnivaju na ovde iznetoj doktrini. Poželjan je humani eritropoetin; najpoželjniji je nativni humani eritropoetin. Kod drugog oblika izvođenja poželjan je humani asijaloeritropoetin. Kod sledećeg oblika izvođenja poželjan je humani fenilglioksal eritropoetin.

U neograničavajućim primerima, napred navedeniex- vivoćelija ili tkivo responzivni na eritropoetin mogu biti ili se sastojati od nerava, retine, mišića, srca, pluća, jetre, bubrega, tankog creva, adrenalne kore, adrenalne moždine, kapilarnog endotela, testisa, jajnika, pankreasa ili endometrijalnih ćelija ili tkiva Ovi primeri ćelija responzivnih na eritropoetin samo su ilustrativni.

Svi napred navedeni postupci i primene prioritetno se primenjuju za ljudska bića, ali mogu takode da se koriste za bilo kog sisara takve kao što su, ali nije ograničeno na životinje ljubimce, pripitomljene životinje,domaće životinje, i životinje iz zoološkog vrta Načini apliciranja napred navedenih farmaceutskih smeša uključuju oralno, intravenozno, intranazalno, lokalno, intraluminalno, inhalaciju ili parenteralno apliciranje, pri čemu ovo poslednje uključuje intravenozno, intraarterijalno, potkožno, intramuskularno, intraperitonealno, potsluzokožno ili intradermalno apliciranje. Za primenuex- vivo,poželjno je da se koristi perfuzioni rastvor ili rastvor za kupatilo.To uključuje izdvajanje izolovanog dela sistema krvnih sudovain situ.

U još jednom aspektu ovog izuma, svaki od napred pomenutih eritropoetina je koristan za dobijanje farmaceutske smeše za obnavljanje disfunkcionalne ćelije, tkiva ili organa, kada se apliciraju po pojavi bolesti ili stanja odgovornih za disfunkciju. U neograničavajućem primeru, apliciranje farmaceutske smeše koja sadrži eritropoetin obnavlja funkciju spoznaje kod životinja koje su prethodno doživele traumu mozga, čak i kada se daje dugo vremena posle( npr, tridana, pet dana, nedelju, mesec ili duže) pošto se trauma smirila Eritropoetini koji su korisni za takvu primenu uključuju bilo koji od određenih gore pomenutih eritropoetina ili bilo koji nativni eritropoetin, ili analog eritropoetina imitaciju eritropoetina i fragment eritropoetina hibridni molekul eritropoetina molekul koji vezuje eritropoetin i receptor, eritropoetin agonist, renalni eritropoetin, moždani eritropoetin, njegov oligomer, njegov multimer, njegov mutein, njemu srodno jedinjenje, njegov oblik koji se nalazi u prirodi, njegov sintetički oblik, njegov rekombinantni oblik, njegova glikozilovana varijanta, njegova deglikozilovana varijanta ili njihova kombinacija Bilo koji oblik eritropoetina koji je delotvoran za ćelije responzivne na eritropoetin obuhvaćen je u ovom aspektu izuma Ostali derivati eritropoetina pogodni za napred navedene svrhe i farmaceutske smeše uključuju i nativne eritropoetine kao i eritropoetine koji su bili izmenjeni pomoću najmanje jedne modifikacije u poređenju sa nativnim eritropoetinom, i poželjno u poređenju sa humanim eritropoetinom. Najmanje jedna modifikacija može pretstavljati modifikaciju od najmanje jedne amino kiseline iz molekula eritropoetina ili modifikacuju najmanje jednog ugljenog hidrata iz molekula eritropoetina. Naravno, molekuli eritropoetina pogodni za navedene svrhe mogu imati veliki broj modifikacija u poređenju sa nativnim molekulom, kao što su višestruke modifikacije dela molekula sa amino kiselinama, višestruke modifikacije dela molekula sa ugljenim hidratima, ili najmanje jedna modifikacija dela molekula sa amino kiselinama i najmanje jedna modifikacija dela molekula sa ugljenim hidratima. Modifikovani molekul eritropoetina zadržava svoju sposobnost za zaštitu, održavanje, povećavanje ili obnavljanje funkcije ili sposobnosti za život ćelija sisara responzivnih na eritropoetin, ali druge odlike molekula eritropoetina koje nisu u vezi sa napred pomenutim, kao što je željena karakteristika, mogu biti otsutne u poređenju sa nativnim molekulom. Poželjan je humani eritropoetin, a najpoželjniji je nativni humani eritropoetin. U drugom obliku izvođenja poželjan je humani asijaloeritropoetin.

Kod još jednog oblika izvođenja, ovaj izum daje postupke za primenu napred pomenutog eritropoetina za obnavljanje disfunkcionalne ćelije, tkiva ili organa, kada se apliciraju posle pojave bolesti ili stanja odgovornih za disfunkciju. U neograničavajućem primeru, postupci za apliciranje farmaceutske smeše koja sadrži eritropoetin obnavljaju funkciju spoznaje kod životinja koje su prethodno doživele traumu mozga, čak i kada se apliciraju dugo vremena posle( npr., tridana, pet dana, nedelju, mesec ili duže) pošto se trauma smirila Eritropoetini koji su korisni za takve postupke uključuju bilo koji od određenih gore pomenutih eritropoetina ili bilo koji nativni eritropoetin, ili analog eritropoetina, imitaciju eritropoetina i fragment eritropoetina hibridni molekul eritropoetina molekul koji vezuje eritropoetin i receptor, eritropoetin agonist, renalni eritropoetin, moždani entropoetin, njegov oligomer, njegov multimer, njegov mutein, njemu srodno jedinjenje, njegov oblik koji se nalazi u prirodi, njegov sintetički oblik, njegov rekombinantni oblik, njegovu glikozilovanu varijantu , njegovu deglikozilovanu varijantu, ili njihovu kombinaciju. Bilo koji oblik eritropoetina koji je delotvoran za ćelije responzivne na eritropoetin obuhvaćen je u ovom aspektu izuma Ostali derivati eritropoetina pogodni za napred navedene svrhe i farmaceutske smeše uključuju i nativne eritropoetine kao i eritropoetine koji su bili izmenjeni pomoću najmanje jedne modifikacije u poređenju sa nativnim eritropoetinom, i poželjno u poređenju sa humanim eritropoetinom. Najmanje jedna modifikacija može pretstavljati modifikaciju od najmanje jedne amino kiseline iz molekula eritropoetina, ili modifikacuju najmanje jednog ugljenog hidrata iz molekula eritropoetina Naravno, molekuli eritropoetina pogodni za navedene svrhe mogu imati veliki broj modifikacija u poređenju sa nativnim molekulom, kao što su višestruke modifikacije dela molekula sa amino kiselinama, višestruke modifikacije dela molekula sa ugljenim hidratima ih bar najmanje jedna modifikacija dela molekula sa amino kiselinama i bar najmanje jedna modifikacija dela molekula sa ugljenim hidratima Modifikovani molekul eritropoetina zadržava svoju sposobnost za zaštitu, održavanje, povećavanje ili obnavljanje funkcije ili sposobnosti za život ćelija sisara responzivnih na eritropoetin, ali druge odlike molekula eritropoetina koje nisu u vezi sa napred pomenutim, kao što je željena karakteristika mogu biti otsutne u poređenju sa nativnim molekulom. Poželjan je humani eritropoetin, a najpoželjniji je nativni humani eritropoetin. U drugom obliku izvođenja poželjan je humani asijaloeritropoetin.

U sledećem aspektu ovog izuma dati su postupci za ubrzavanje transcitoze molekula kroz endotelijalnu ćelijsku barijeru kod sisara putem apliciranja smeše molekula sa eritropoetinom kao što je: eritropoetin koji ne sadrži delove sijalinske kiseline; eritropoetin koji ne sadrži ugljene hidrate sa N-vezom ili O-vezom; eritropoetin koji ima smanjen sadržaj ugljenih hidrata zbog reagovanja nativnog eritropoetina sa najmanje jednom glikozidazom; eritropoetin sa delom molekula eritropoetina koji sadrži ugljene hidrate, koji ima najmanje jedan obrazac glikozilovanja kod životinja sem sisara na osnovu eksprimiranja rekombinantnog eritropoetina u ćelijama životinja sem sisara"eritropoetin koji ima najmanje jedan ili više oksidisanih ugljenih hidrata koji takođe mogu biti hemijski redukovani; entropoetin koji ima najmanje jedan ili više modifikovanih ostataka arginina; eritropoetin koji ima najmanje jedan ili više modifikovanih ostataka lizina ili modifikaciju N-terminalne amino grupe iz molekula eritropoetina; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak tirozina; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak asparaginske kiseline ili glutaminske kiseline; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak triptopfana; eritropoetin čija je najmanje jedna amino grupa uklonjena; eritropoetin koji ima najmanje jednu slobodno mesto na najmanje jednoj od cistinskih veza u molekulu eritropoetina eritropoetin koji ima najmanje jednu supstituciju najmanje jedne amino kiseline; ili nepotpun eritropoetin.

Asocijacija između molekula koji se transportuje i eritropoetina može biti, na primer, labilna kovalentna veza stabilna kovalentna veza ili nekovalentna asocijacija sa položajem za vezivanje molekula. Endotelijalna ćelijska barijera može biti barijera krv-mozak, barijera krv-oko, barijera krv-testiisi, barijera krv-jajnici i barijera krv-posteljica Molekul koji je pogodan za transport pomoću postupka iz ovog izuma uključuje hormone, kao što je hormon rasta, antibiotike i sredstva protiv kancera.

Sledeći aspekt ovog izuma je daobezbedi smešu za ubrzavanje transcitoze molekula preko endotelijalne ćelijske barijere kod sisara pomenuta smeša sadrži pomenuti molekul u asocijaciji sa entropoetinom kao što je entropoetin koji ne sadrži delove sijalinske kiseline; eritropoetiri koji ne sadrži ugljene hidrate sa N-vezom ili O-vezom; eritropoetin koji ima smanjen sadržaj ugljenih hidrata zbog reagovanja nativnog eritropoetina sa najmanje jednom glikoadazom; eritropoetin sa delom molekula eritropoetina koji sadrži ugljene hidrate, koji ima najmanje jedan obrazac glikozilovanja kod životinja sem sisara na osnovu eksprimiranja rekombinantnog eritropoetina u ćelijama životinja sem sisara; eritropoetin koji ima najmanje jedan ili više oksidisanih ugljenih hidrata koji takođe mogu biti hemijski redukovani; eritropoetin koji ima najmanje jedan ili više modifikovanih ostataka arginina; eritropoetin koji ima najmanje jedan ili više modifikovanih ostataka lizina ili modifikaciju N-terminalne amino grupe molekula eritropoetina; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak tirozina; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak asparaginske kiseline ili glutaminske kiseline; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak triptopfana; eritropoetin čija je najmanje jedna amino grupa uklonjena; eritropoetin koji ima najmanje jedno slobodno mesto na najmanje jednoj od cistinskih veza u molekulu eritropoetina; eritropoetin koji ima najmanje jednu supstituciju najmanje jedne amino kiseline; ili nepotpun eritropoetin.

Asocijacija može biti, na primer, labilna kovalentna veza, stabilna kovalentna veza ili nekovalentnia asocijacija sa položajem za vezivanje molekula. Endotelijalna ćelijska barijera može biti barijera krv-mozak, barijera krv-oko, barijera krv-testisi, barijera krv-jajnici i barijera krv-posteljica. Molekul koji je pogodan za transport pomoću postupka iz ovog izuma uključuje hormone, kao što je hormon rasta, antibiotike i sredstva protiv kancera

U još jednom aspektu ovog izuma, bilo koji od napred pomenutih eritropoetina je koristan za dobijanje farmaceutske smeše za ubrzavanje transcitoze molekula kroz endotelijalnu ćelijsku barijeru kod sisara putem apliciranja smeše molekula sa eritropoetinom kao što je : eritropoetin koji ne sadrži delove sijalinske kiseline; eritropoetin koji ne sadrži ugljene hidrate sa N-vezom ili O-vezom ugljene hidrate; eritropoetin koji ima smanjen sadržaj ugljenih hidrata na osnovu reagovanja nativnog eritropoetina sa najmanje jednom glikozidazom; eritropoetin sa delom molekula eritropoetina koji sadrži ugljene hidrate, koji ima najmanje jedan obrazac glikozilovanja kod životinja sem sisara na osnovu eksprimiranja rekombinantnog eritropoetina u ćelijama životinja sem sisara; eritropoetin koji ima najmanje jedan ili više oksidisanih ugljenih hidrata koji takođe mogu biti hemijski redukovani; eritropoetin koji ima najmanje jedan ili više modifikovanih ostataka arginina; eritropoetin koji ima najmanje jedan ili više modifikovanih ostataka lizina ili modifikaciju N-terminalne amino grupe molekula eritropoetina; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak tirozina; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak asparagmske kiseline ili glutaminske kiseline; eritropoetin koji ima najmanje jedan modifikovan ostatak triptopfana; eritropoetin čija je najmanje jedna amino grupa uklonjena; eritropoetin koji ima najmanje jedno slobodno mesto na najmanje jednoj od cistinskih veza u molekulu eritropoetina; eritropoetin koji ima najmanje jednu supstituciju najmanje jedne amino kiseline; ili nepotpun eritropoetin.

Asocijacija može biti, na primer, labilna kovalentna veza, stabilna kovalentna veza ili nekovalentna asocijacija sa položajem za vezivanje molekula. Endotelijalna ćelijska barijera može biti barijera krv-mozak, barijera krv-oko, barijera krv-testiisi, barijera krv-jajnici i barijera krv-posteljica. Molekul koji je pogodan za transport pomoću postupka iz ovog izuma uključuje hormone, kao što je hormon rasta, antibiotike i sredstva protiv kancera

Ovi i ostali aspekti ovog izuma biće bolje ocenjeni na osnovu reference za sledeće slike i detaljnog opisa

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 pretstavljatranslokaciju parenteralno apliciranog eritropoetina u cerebrospinalnu tečnost.

Slika 2 pokazuje zaštitu miokarda od oštećenja usled ishemije pomoću eritropoetina nakon privremene vaskularne okluzije.

Slika 3 pokazuje održavanje funkcije srca pripremljenog za transplantaciju pomoću eritropoetina.

Slika 4 upoređuje efikasnostin- vitroeritropoetina i asijaloeritropoetina na sposobnost za život ćelija Pl 9 koje su lišavane seruma

Slika 5 je drugi eksperiment koji upoređuje efikasnostin- vitroeritropoetina i asijaloeritropoetina na sposobnost za život ćelija Pl 9 koje su lišavane seruma.

Slika 6 upoređuje efikasnostin- vitroeritropoetina i eritropoetina modifikovanog fenilglioksalom na sposobnost za život ćelija Pl 9 koje su lišavane seruma.

Slika 7 pokazuje zaštitu eritropoetina i asijaloeritropoetina na modelu fokalne cerebralne ishemije kod pacova.

Slika 8 po kazuje od govor na dozu kojim se poredi efikasnost humanog eritropoetina i humanog asijaloeritropoetina kod okluzije srednje cerebralne arterije na modelu ishemičnog moždanog udara

Slika9 pokazuje efekat biotinilovanog eritropoetina i asijaloeritropoetina u Pl 9 analizi.

Slika 10pokazuje aktivnost jodiranog eritropoetina u P19 analizi.

Slika11 pretstavlja efekte lečenja sa eritropoetinom na modelu glaukoma kod pacova

Slika12 pokazuje obim čuvanja retinalne funkcije pomoću eritropoetina na modelu glaukoma kod pacova

Slika 13pretstavlja obnavljanje funkcije spoznaje nakon traume mozga putem apliciranja eritropoetina koje je počelo pet dana posle traume.

Slika 14pretstavlja obnavljanje funkcije spoznaje nakon traume mozga putem apliciranja eritropoetina koje je počelo trideset dana posle traume.

Slika 15pretstavlja efikasnost humanog asijaloentropoetina kod cerebralne toksičnosti na modelu sa kainatom.

DETALJAN OPIS IZUMA

Izraz "ćelija responzivna na eritropoetin" odnosi se na ćeliju sisara čija funkcija ili sposobnost za život mogu biti održani, izazvani, povećani, regenerisani, ili na bilo koji drugi način imati koristi od izlaganja eritropoetinu. Neograničavajući primeri za ovakve ćelije uključuju ćelije nerava, retine, mišića, srca, pluća, jetre, bubrega, tankog creva, adrenalne kore, adrenalne moždine, kapilarnog endotela testisa jajnika pankreasa ili endometrijalne ćelije. Šta više, takve ćelije responzivne na eritropoetin i korisno dejstvo eritropoetina može se proširiti da indirektno obezbedi zaštitu ili povećavanje ostalih ćelija koje nisu direktno responzivne na eritropoetin, ili na tkiva i organe koji sadrže takve ćelije koje nisu responzivne na eritropoetin. Ove druge ćelije, tkiva ili organi koji imaju indirektno koristi od povećavanja ćelija responzivnih na eritropoetin, prisutni su kao deo ćelija, tkiva ili organa kao "asocirane" ćelije, tkiva ili organi. Na taj način, korisna dejstva eritropoetina kao što su ovde opisana mogu se dobiti kao rezultat prisustva malog broja ili srazmemog dela ćelija responzivnih na eritropoetin u tkivu ili organu, na primer, ekscitirano ili nervno tkivo prisutno u takvom tkivu, ili Levdig-ove ćelije iz testisa, koje čine testosteron. U jednom aspektu, ćelije responzivne na eritropoetin ili njihove asocirane ćelije, tkiva ili organi nisu ekscitirane ćelije, tkiva ili organi, ili ne sadrže pretežno ekscitirane ćelije ili tkiva

Postupci izvođenja ovog izuma omogućavaju lokalnu ili sistematsku zaštitu ili povećavanje ćelija tkiva i organa u telu sisara u širokom opsegu normalnih i nepovoljnih stanja ili zaštitu onih koji su predviđeni za prebacivanje u telo drugog sisara Uz to, takođe je obezbedeno obnavljanje ili regeneracija disfunkcije. Kao što je napred pomenuto, sposobnost eritropoetina da pređe čvrstu endotelijalnu ćelijsku barijeru i ispolji pozitivne efekte na ćelije responzivne na eritropoetin (kao i na druge tipove ćelija) distalne od vaskulatomog sistema pruža mogućnost za sprečavanje i takođe za lečenje veoma različitih stanja i bolesti koji u suprotnom prouzrokuju oštećenja ćelija i tkiva kod životinja, uključujući ljude, i šta više omogućava uspeh onih hirurških postupaka koji nisu bili pokušavam ranije i kod kojih je rizik tradicionalno prevazilazio korist. Trajanje i stepen važnih nepovoljnih uslova koji se izazivaju radi krajnje koristi, takvi kao hemoterapija u velikim dozama, terapija zračenjem, produženiex- vivoopstanak transplatanta, i produženi periodi hirurški izazvane ishemije, mogu se obaviti koristeći prednosti ovog izuma. Međutim, izum nije tako ograničen, ali uključuje kao jedan aspekt, postupke i smeše u kojima su ciljne ćelije responzivne na entropoetin distalne od vaskulatomog sistema zbog ćelijske endotelijalne barijere ili endotelijalnih čvrstih veza. Uopšte, ovaj izum se odnosi na bilo koje ćelije responzivne na eritropoetin i asocirane ćelije, tkiva i organe kojima može koristiti izlaganje eritropoetinu. Osim toga, disfunkcija ćelije, tkiva ili organa se može obnoviti ili regenerisati posle akutnog nepovoljnog događaja (kao što je trauma) putem izlaganja eritropoetinu.

Stoga se ovaj izum odnosi uopšte na primenu eritropoetina za dobijanje farmaceutskih smeša za napred navedene svrhe kod kojih je ćelijska funkcija održana, pokrenuta, povećana, regenerisana, ili je na bilo koji drugi način dejstvo smeša bilo delotvorno. Izum se takođe odnosi na postupke za održavanje, povećavanje, pokretanje ili regenerisanje ćelijske funkcije putem apliciranja sisani efikasne količine eritropoetina, kao što je ovde opisano. Izum se dalje odnosi na postupke za održavanje, pokretanje, povećavanje, ili regeneraciju ćelijske funkcijeex vivoputem izlaganja ćelija, tkiva ili organa eritropoetinu. Izum se takođe odnosi na smeše za perfuziju koje sadrže eritropoetin i koriste se za čuvanje organa ili tkiva.

Različiti postupci rada iz ovog izuma koriste farmaceutsku smešu koja najmanje uključuje eritropoetin u količini efikasnoj za određeni način i trajanje izlaganja da bi se ispoljili pozitivni efekti ili delotvoma dejstva na ćeliji responzivnoj na eritropoetin koja se nalazi u, ili je uklonjena iz tela sisara. Kada je potrebno da za ciljnu ćeliju, tkiva ili organe, za koje se određuje terapija, eritropoetin pređe endotelijalnu ćelijsku barijeru, farmaceutska smeša sadrži eritropoetin u koncentraciji koja je u stanju da, pošto pređe ćelijsku endotelijalnu barijeru, ispolji željene efekte na ćelije responzivne na eritropoetin. Molekuli koji su sposobni za interakciju sa eritropoetin receptorom i modulaciju aktivnosti receptora, korisni su u kontekstu ovog izuma Ovi molekuli mogu biti, na primer, prirodni, sintetički, ili rekombinantni oblici molekula eritropoetina kao što je napred opisano, ilu drugi molekuli koji ne moraju neophodno da budu slični sa eritropoetinom na bilo koji način, osim da moduliraju aktivnost ćelija responzivnih na eritropoetin, kao što je ovde opisano.

Eritropoetin je glikoproteinski hormon koji kod ljudi ima molekulsku težinu od oko

34 kDa Potpuno formiran protein sadrži 165 amino kiselina, a glikozil ostaci čine oko 40% od težine molekula Oblici eritropoetina koji su korisni za izvođenje ovog izuma obuhvataju prirodne, sintetičke i rekombinantne oblike sledećih molekula ljudi i drugih sisara koji su responzivni na eritropoetin: eritropoetin, asijaloeritropoetin, deglikozilovani eritropoetin, analoge eritropoetina imitacije eritropoetina delove eritropoetina hibridne molekule eritropoetina molekule koji vezuju eritropoetin i receptor, eritropoetin agoniste, renalni eritropoetin, moždani eritropoetin, njihove oligomere i multimere,njihove mutene i njima srodna jedinjenja Pri tome, oblici eritropoetina koji se koriste za izvođenje ovog izuma uključuju proteine koji pretstavijaju fukcionalno ekvivalentne genske proizvode. Takav ekvivalentan genski proizvod eritropoetina uključuje mutantne eritropoetine, koji mogu da sadrže delecije, uključujući interne delecije, adicije, uključujući adicije pomoću kojih se dobijaju fuzionisani proteini, ili konzervativne supstitucije ostataka amino kiselina u i/ili u blizini sekvence amino kiseline, ali posledica toga je "tiha" promena što znači da promena proizvodi funkcionalno ekvivalentan eritropoetin. Takve supstitucije amino kiselina se mogu izvoditi na bazi sličnosti polariteta, naelektrisanja, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti, i /ili amfipatične ( sadrži i hidofilne i hidrofobne grupe, pnm.prev.) prirode ostatka koji je u postupku. Na primer, nepolarne ( hidrofobne) amino kiseline uključuju alanin, leucin,

izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan, i metionin; polarno neutralne amino kiseline uključuju gl i ci n, serin, treonin, cistein, tirosin, asparagin, i glutamin; pozitivno naelektrisane (bazne) amino kiseline uključuju arginin, lizin, i histidin; i negativno naelektrisane (kisele) amino kiseline uključuju asparaginsku i glutaminsku kiselinu. Alternativno, nekonzervativne promene amino kiselina, kao i veća umetanja i delecije mogu se primeniti radi stvaranja funkcionalno izmenjenih mutanata eritropoetina Takvi mutanti se mogu koristiti za izmenu osobina eritropoetina u željenom pravcu. Na primer, kod jednog oblika izvođenja, entropoetin koristan za obavljanje ovog izuma može biti mutant eritropoetina izmenjen u jednoj ili više amino kiselina u četiri funkcionalna domena eritropoetina koji deluju na vezivanje receptora: VLQRY i/ili TKVNFYAW i/ili SGLRSLTTL i/ili SNFLRG. Kod drugog oblika izvođenja mogu se koristiti eritropoetini koji sadrže mutacije u okolini molekula koje deluju na kinetiku ili na osobine vezivanja receptora kod molekula.

Izraz "eritropoetin" kao i "jedan eritropoetin" mogu se koristiti na smenu ili zajedno, i različiti analozi, delovi, hibridni molekuli, agonisti, muteini, i ostali oblici kao što je napred opisano uključuju varijante u obimu i položajima prilikom glikozilovanja eritropoetina uključujući nativni, deglikozilovani, asijalilovani, i ostale delimično glikozilovane oblike eritropoetina. Neograničavajući primeri takvih varijanti opisani su kod autora Tsuda i dr., 1990,Eur. J. Biochem.188:405^111, i ovde pridruženi putem reference. Uz to, mogu se koristiti različiti sistemi domaćina za eksprimiranje i proizvodnju rekombinantnog eritropoetina, uključujući, ali nije ograničeno na, ćelijske sisteme bakterije, kvasca, insekta, biljke, sisara, uključujući čoveka Na primer, rekombinantni eritropoetin proizveden u bakteriji, kod koje se ne dobija glikozilovan ili sijalizovan proizvod, može se koristiti za dobijanje oblika eritropoetina koji nisu glikozilovani. Alternativno, rekombinantni eritropoetin se može proizvesti u drugim sistemima u kojima se dobijaju glikozilati, npr., biljkama, uključujući humane ćelije.

Kao stoje napred napomenuto, ovaj izum obuhvata svaki i sve molekule modulatore aktivnosti eritropoetin receptora koji su u stanju da pokažu pozitivnu aktivnost prema ćelijama responzivnim na eritropoetin, bez obzira na bilo koje strukturno srodstvo tog molekula sa eritropoetinom

Uz to, sam eritropoetin može bih tako modifikovan da prilagodi svoje aktivnosti za specifično tkivo ili tkiva. Postoji nekoliko neograničavajućih strategija koje se mogu izvoditi da bi se postigla željena specifičnost tkiva i one uključuju, modifikacije koje skraćuju periodični polu-život i tako redukujući vreme eritropoetin može reagovati sa eritroidnim prekursorima ih modifikaciju primame strukture molekula eritropoetina. Jedan od pristupa za redukovanje periodičnog polu-života je da se uklone ili modifikuju delovi za glikozilovanje, od kojih eritropoetin ima tri sa N-vezom i i jedan sa O-vezom. Ovakve varijante glikozilovanog eritropoetina se mogu dobiti na više načina Na primer, sijalinske kiseline koje se nalaze na kraju lanaca šećera mogu biti uklonjene pomoću specifičnih sijalidaza u zavisnosti od hemijske veze kojom je sijalinska kiselina vezana za lanac šećera Alternativno, glikozilovana struktura može se ukloniti na različite načine upotrebom drugih enzima koji razgrađuju specifične veze. Postupci za modifikovanje primame strukture su mnogobrojni i uključuju supstituciju specifičnih amino kiselina, hemijsku modifikaciju amino kiselina, ili adiciju drugih struktura koje ometaju interakciju eritropoetina sa bilo kojim od njegovih receptora Primena takvih oblika eritropoetina ovde je potpuno obuhvaćena Kod poželjnog oblika izvođenja polu-život eritropoetina koji nije eritropoetinski, u ovom izumu skraćenje za oko 90% u odnosu na isti kod nativnog eritropoetina

Neki od ovih molekula će pored svega toga imitirati dejstva samog eritropoetina u drugim tkivima ili organima. Na primer, 17-mer koji sadrži sekvencu amino kiseline 31-47 nativnog eritropoetina neaktivan je za eritropoezu, ali je potpuno aktivan za nervne ćelijein vitro(Campana & O'Brien, 1998: Int. J. Mol. Med. 1:235-41).

Osim toga molekuli derivata eritropoetina koji su poželjni za ovde opisane primene mogu se dobiti gvanidinovanjem, amidinovanjem, karbamilovanjem (karbamoilovanjem), trinitrofenilovanjem, acetilovanjem, sukcinilovanjem, nitriranjem, ili modifikacijom ostataka ili karboksilnih grupa arginina, lizina tirozdna, triptofana ili cisteina, između ostalih postupaka kao ograničenom proteolizom. uklanjanjem amino grupa i/ih mutacionom supstitucijom ostataka arginina lizina, tirozina triptofana ili cisteina putem postupaka molekularne biologije, da bi se dobili eritropoetini koji održavaju odgovarajući nivo aktivnosti za specifične organe i tkiva ali ne i za druge, kao što su eritrociti (npr., Satake i dr; 199.0,Biochim. Biophvs. Acta1038:125-9; obuhvaćeno ovde preko reference u celosti). Jedan neograničavajući primer, kao što je u daljem tekstu opisano, pretstavlja modifikaciju eritropoetin arginin ostataka pomoću reakcije sa glioksalom kao što je fenilglioksal (prema protokolu Takahashi, 1977,J. Biochem.81:395-402). Kao što će se kasnije videti, takav molekul eritropoetina u potpunosti zadržava svoj neurotrofični efekat. Takvi molekuli eritropoetina su potpuno usvojeni za različite primene i smeše koje su ovde opisane.

Ovde su dati sintetički i rekombinantni molekuli, takvi kao moždani entropoetin i renalni eriitropoietin, rekombinantni oblici eritropoetina kod sisara, kao i prirodni, dobijeni iz tumora, i rekombinantni izo oblici, takvi kao rekombinantno-ekspnmirani molekuli i oni dobijeni homolognom rekombinacijom. Osim toga, ovaj izum obuhvata molekule uključujući peptide koji vezuju eritropoetin receptor, kao i rekombinantne spojeve ili druge molekule koji poseduju deo ili sve strukturne i/ili biološke odlike eritropoetina, uključujući fragmente i multimere eritropoetina ili njegove fragmente. Eritropoetin ovde obuhvata molekule sa promenjenim vezujućim aktivnostima eritropoetin receptora, poželjno sa povećanim afinitetom receptora, naročito što se tiče povećanja transporta kroz endotelijalne ćelijske barijere. Ovde su obuhvaćeni muteini koji sadrže molekule koji imaju povećan ili smanjen broj položaja za glikozilovanje. Kao što je napred pomenuto, izrazi "eritropoetin" i "imitacije" kao i ostali izrazi ovde, upotrebljeni su naizmenično da bi ukazali na molekule ćelija responzivnih na eritropoetin sa zaštitnim i povećavajućim odlikama srodne eritropoetinu, kao i molekule koji su u stanju da pređu endotelijalne ćelijske barijere. Osim toga, ovde su obuhvaćeni molekuli proizvedeni pomoću transgenskih životinja. Treba napomenuti da molekuli eritropoetina kao što su ovde obuhvaćeni nisu neophodno slični eritropoetinu po strukturi ili na bilo koji drugi način, osim po sposobnosti da reaguju sa eritropoetin receptorom ili da moduliraju aktivnost eritropoetin receptora ili da aktiviraju signalizujuće kaskade koje se aktiviraju na entropoetin, kao što je ovde opisano.

U neograničavajućim primerima, oblici eritropoetina korisni za izvođenje ovog izuma obuhvataju muteine eritropoetina, kao što su oni sa izmenjenim amino kiselinama na karboksi položaju opisani u U.S. Patent 5,457,089 i u U.S. Patent 4,835,260; asijaloeritropoetin i eritropoetin izo oblike sa različitim brojevima ostataka sijalinske kiseline u molekulu, kao stoje opisano u U.S. Patent 5,856,298; polipeptide opisane u U.S. Patent 4,703,008; agoniste opisane u U.S. Patent 5,767,078; peptide koji se vezuju za eritropoetin receptor kao što je opisano u patentima U.S. Patent 5,773,569 i U.S. Patent 5,830,851; imitacije koje sadrže mali broj molekula i koje aktiviraju eritropoetin receptor, kao što je opisano u U.S. Patent 5,835,382; i analoge eritropoetina opisane u WO 9505465,

WO 9718318, i WO 9818926. Sve napred navedene reference su ovde uključene u onoj meri u kojoj se takva otkrića odnose na različite alternativne oblike ili postupke za dobijanje takvih oblika eritropoetina iz ovog izuma.

Eritropoetin se može kupiti, na primer, pod zaštitnim žigom PROCRIT, kod firme Ortho Biotech Inc., Raritan, NJ, i EPOGEN, kod firme Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA.

Aktivnost (u jedinicama) eritropoetina (eritropoetin) i molekula sličnih eritropoetinu se definiše tradicionalno na osnovu njegove sposobnosti za stimulaciju proizvodnje crvenih ćelija kod modela glodara (i kao što je dobijeno pomoću internacionalnih standarda za eritropoetin). Jednajedinica (U) regularnog eritropoetina (MW od~34,000) je~8 ng proteina (1 mg proteina pretstavlja aproksimativno 125,000 U). Međutim, pošto je efekat na eritropoezu sporedan u odnosu na aktivnosti koje su ovde poželjne i ne mora neophodno da bude odlika određenih eritropoetina iz ovog izuma koja se primećuje, definicija aktivnosti zasnovana na entropoetinskoj aktivnosti je neodgovarajuća. Tako, kao što je ovde upotrebljeno, jedinica aktivnosti eritropoetina ili eritropoetinu sličnih molekula definisana je kao količina proteina potrebna da izazove istu aktivnost kod nervnih ili drugih ćelijskih sistema responzivnih na eritropoetin kao što je ona koju izazove eritropoetin po WHO internacionalnom standardu u istom sistemu. Stručnjak iz ove oblasti će lako odrediti jedinice eritropoetina koji nije eritropoetinski ili sličnih molekula prateći ovde dato uputstvo.

U vezi sa napred pomenutim modifikacijama eritropoetina koje se ovde koriste, sledeća diskusija će se proširiti na različite eritropoetine iz ovog izuma.

Jedan eritropoetin iz ovog izuma ne mora da sadrži delove sijalinske kiseline, što se odnosi na asijaloeritropoetin. Poželjno je da, eritropoetin iz ovog izuma bude humani asijaloeritropoetin. Kod alternativnog oblika izvođenja, eritropoetin iz ovog izuma može da ima najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, ili 13 ostataka sijalinske kiseline. Asijaloeirtropoetin se može dobiti desijalilizovanjem eritropoetina primenom sijalidaze, kao što je opisano u proizvođačkom pakovanju za proizvod po imenu Sialvdase A od firme ProZvme Inc., San Leandro, Califomia. Tipično, PROZYME® GLYCOPRO® sekvencioni kvalitet SIALYDASE A™ (N-acetilneuraminat glikohidrolaza EC 3.2.1.18) se koristi da odvoji sve terminalne ostatke sijalinske kiseline koji se ne redukuju iz složenih ugljenih hidrata i glukoproteina kao što je eritropoetin. On takođe odvaja i sijalinske kiseline sa račvastim nizom (vezane za jedan unutrašnji ostatak). Sijalidaza A je izolovana izklonaArthrobacter

ureafaciens.

Jedan eritropoetin može da ima najmanje smanjen broj ugljenih hidrata sa N-vezom. U cilju uklanjanja ugljenih hidrata saN-vezom, eritropoetin može biti tretiran sa hidrazinom, prema, na primer, postupcima opisanim kod autora Hermentin i dr., 1996, Glycobiology 6(2):217-30. Kao što je navedeno napred, eritropoetin ima tri N-vezana ugljovodonična dela; ovaj izum obuhvata one eritropoetine koji imaju dva, jedan ili nijedan N-vezan ugljeni hidrat.

Jedan eritropoetin iz ovog izuma može da ima najmanje smanjen sadržaj ugljenih hidrata usled tretiranja nativnog eritropoetina sa najmanje jednom glukozidazom. Na pnmer, može se slediti postupak autora Chen i Evangelista, 1998, Electrophoresis 19(15):2639-44. Osim toga, uklanjanje O-vezanih ugljenih hidrata može se postići upotrebom postupaka opisanih kod autora Hokke i dr., 1995, Eur. J. Biochem.228(3):981-1008.

Deo molekula eritropoetina sa ugljenim hidratima može imati najmanje jedan obrazac glikozilovanja kod životinja sem sisara na osnovu eksprimiranja rekombinantnog eritropoetina u ćelije životinja sem sisara Poželjno je da su eritropoetini eksprimirani u ćelije insekta ili biljke. U neograničavajućem primeru, eksprimiranje eritropoetina u ćelije insekta pomoću eksprimirajućeg sistema bakulovirusa može se izvoditi shodno radu autora Quelle i dr., 1989, Blood 74(2):652-657. Drugi postupak je opisan u U.S. Patent 5,637,477. Eksprimiranje u sistem biljke može se izvoditi shodno načinu rada autora Matsumoto i dr., 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57(8): 1249-1252. Alternativno, eksprimiranjem u bakteriju biće dobijeni oblici eritropoetina koji nisu glikozilovani. Ovo su samo primeri postupaka koji se koriste za dobijanje eritropoetina iz ovog izuma i ne pretstavljaju nikakvo ograničenje.

Jedan eritropoetin iz ovog izuma može imati najmanje jedan ili više oksidisanih ugljenih hidrata koji takođe mogu biti hemijski redukovani. Na primer, eritropoetin može biti perjodatom oksidisan eritropoetin; perjodatom oksidisan eritropoetin takođe može biti hemijski redukovan pomoću soli borhidrida kao što je natrijum borhidrid ili natrijum cijanoborhidrid. Oksidacija perjodatom borhidida može se izvoditi, na primer, postupcima koje su opisali autori Linslev i dr., 1994, Anal. Biochem.219(2):207-17. Hemijska redukcija koja sledi posle oksidacije perjodatom može se izvoditi prema postupcima autora Tonelli i Meints, 1978, J. Supramol. Struct. 8(l):67-78.

Jedan eritropoetin za napred pomenute primene može imati bar jedan ili više modifikovanih ostataka arginina. Na primer, modifikovani eritropoetin može da sadrži R-glioksalni deo na jednom ili više ostataka arginina, u kome R može biti aril, heteroaril, niži alkil, niži alkoksi, ili cikloalkil grupa, ili alfa-deoksiglicitolil grupa Kao što se koristi ovde, izraz niži "alkil" označava zasićenu alifatičnu ugljovodoničnu grupu sa pravim ili račvastim nizom koja poželjno sadrži 1 -6 atoma ugljenika. Primeri za ove grupe metil, etil, izopropil, izobutil, butil, pentil, heksil grupa i slične. Izraz "alkoksi" označava nižu alkil grupu kao što je napred definisano, koja je za ostali deo molekula vezana preko kiseonika. Primeri za alkoksi grupe uključuju metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi grupu i slične. Izraz "cikloalkil" se odnosi na ciklične alkil grupe sa tri do oko 8 ugljenikovih atoma, u koje su, na primer, uključene ciklopropil, ciklobutil, cikloheksil grupa i slične. Izraz " aril" odnosi se na fenil i naftil grupe. Izraz "heteroaril" odnosi se na heterociklične grupe koje sadrže 4-10 članova u prstenu i 1-3 heteroatoma odabranih iz grupe koja se sastoji od kiseonika azota i sumpora Primen uključuju, ali nisu ograničeni na izoksazolil, fenilizoksazolil, funl, pirimidinil, hinolil, tetrahidrohinolil, piridil, imidazolil, pirolidinil, 1,2,4-tirazoilil, tiazolil, tienil grupu i slične. R grupa može biti supstituisana kao na primer 4-trihidroksibutil grupa iz 3-deoksiglukozona Tipični primeri za R-glioksalnajedinjenjasu glioksal, metilglioksal, 3-deoksiglukozon i fenilglioksal. Poželjna R-glioksalna jedinjenja su metilglioksal ili fenilglioksal. Primer postupka za takvu modifikaciju može se naći kod autora Werber i dr, 1975, Isr. J. Med. Sci. 11(11): 1169-70, koji koristi fenilglioksal.

U sledećem primeru, bar jedan ostatak arginina može biti modifikovan pomoću reakcije sa vicinalnim diketonom kao stoje 2,3-butandion ili cikloheksandion, poželjno u puferu koji čini rastvor borata (koncentracije 50 milimola) na pH 8-9. Postupak za drugu modifikaciju sa 2,3-butandionom može se izvoditi prema radu autora Riordan, 1973, Biochemistrv 12(20): 3915-3923; a postupak sa cikloheksanonom prema radu autora Patthy i dr., 1975, J. Biol. Chem 250(2): 565-9.

Jedan eritropoetin iz ovog izuma može da sadrži najmanje jedan ili više modifikovanih ostataka lizina ili modifikaciju N-terrninalne amino grupe iz molekula eritropoetina, takve modifikacije kao one koje se dobijaju iz reakcije ostatka lizina sa sredstvom za modifikovanje amino grupe. Kod drugog oblika izvođenja, ostaci lizina mogu biti modifikovani putem reakcije sa derivatima glioksala, kao što je reakcija saglioksalom, metilglioksalom i 3-deoksiglukozonom u kojoj se dobijaju alfa-karboksialkil derivati. Primere pretstavljaju reakcija sa glioksalom da bi se dobio karboksimetil lizin kao kod autora Glomb i Monnier, 1995, J. Biol. Chem. 270(17): 10017-26, ili sa metilglioksalom da bi se dobio (l-karboksietil)lizin kao kod autora Degenhardt i dr., 1998, Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 44(7): 1139-45. Modifikovani ostatak lizina može dalje biti hemijski redukovan. Na primer, eritropoetin može biti biotinilovan preko lizinskih grupa, prema postupku opisanom u primeru 5, u kome je d-biotinoil-£-aminokaprinska kiselina -N-hidroksisukcinimid estar reagovao sa eritropoetinom, a zatim je biotin koji nije izreagovao uklonjen gel filtracijom na Centricon 10 koloni , kao što je opisano kod autora Wojchowski i Caslake, 1989, Blood 74(3):952-8. U ovom radu, autori koriste tri različita načina za biotinilovanje eritropoetina od kojih svaki može biti upotrebljen za primene ovde navedene. Biotin se može dodati na: (1) delove sijalinske kiseline, (2) karboksilovane grupe ili (3) amino grupe.

Kod drugog poželjnog oblika izvođenja, lizin može reagovati sa aldehidom ili redukcionim šećerom radi dobijanja imina, koji može biti stabilizovan putem redukcije sa natrijum

cijanoborhidridom, da bi se dobio N-alkilovani lizin kao stoje glucitolil lizin, ili koji u slučaju redukcionih šećera može biti stabilizovan pomoću Amadori-jevog ih Heyns-ovog preuređenja da bi se dobio alfa-deoksi- alfa-amino šećer kao što je alfa-deoksi-alfa-fruktozil lizin. Primer za dobijanje proteina modifikovanog fruktozil lizinom putem inkubacije sa 0.5 M glukozom u pufernom rastvoru natrijum fosfata na pH 7.4 u toku 60 dana, opisan je kod autora Makita i dr., 1992, J. Biol. Chem. 267:5133-5138. U drugom pirmeru, lizinska grupa može biti karbamilovana, na primer, putem reakcije sa jonom cijanata, ili može biti alkil- ili aril-karmabilovana ili -tiokarbamilovana sa alkil- ili aril-izocijanatom ili -izotiocijanatom, ili može biti acetilovana pomoću reaktivnog derivata alkil- ili arilkarboksilne kiseline, kao što je reakcija sa anhidridom sirćetne, ćilibame ili ftalne kiseline. Primerene su modifikacije lizinskih grupa sa 4-sulfofenilizotiocijanatom ili sa anhidridom sirćetne kiseline, obe opisane kod autora Gao i dr., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91(25): 12027-30. Lizinske grupe mogu takođe biti modifikovane trinitrofenilom reakcijom sa trirutrobenzensulfonskorn kiselinom ili poželjno sa njenom soli. Takvi postupci su opisani u daljem tekstu u primeru 5.

Najmanje jedan ostatak tirozina iz eritropoetina može se modifikovati u položaju aromatičnog prstena pomoću elektrofilnog reagensa, na primer, nitrovanjem ili jodiranjem. U neograničavajućem primeru, erirtropoietin može reagovati sa tetranitrometanom (Nestler i dr., 1985, J. Biol. Chem. 260(12):7316-21; ili može biti jodiran kao stoje opisano u primeru 5.

Najmanje jedan ostatak asparaginske ili glutaminske kiseline iz eritropoetina može se modifikovati, na primer, putem reakcije sa karbodiimidom koja je praćena reakcijom sa aminom, kao stoje, ali nije ograničeno na, glicinamid. Primeri ovakvih modifikacija se mogu naći u primeru 5.

U drugom primeru, ostatak triptofana iz eritropoetina može se modifikovati, na primer, reakcijom sa n-bromosukcinimidom ili n-hlorosukcinimidom, prema postupcima opisanim kod autora Josse i dr., Chem Biol Interact 1999 May 14; 119-120.

U sledećem primeru, molekul eritropoetina može se dobiti uklanjanjem najmanje jedne amino grupe, što se može postići reakcijom sa ninhidrinom koja je praćena redukcijom sledeće karbonilne grupe putem reakcije sa borhidridom.

U još jednom primeru, dobijen je eritropoetin koji ima najmanje jedno slobodno mesto u najmanje jednoj cistinskoj vezi u molekulu eritropoetina putem reakcije sa redukcionim sredstvom kao što je ditiotreitol, koja je praćena reakcijom dobijenih sulfhidrila sa jodoacetamidom, jodosirćetnom kiselinom ili drugim elektrofilnim reagensom da bi se sprečilo ponovno formiranje disulfidnih veza.

Dobijen je eritropoetin koji ima supstituisanu najmanje jednu od većeg broja amino kiselina, kao što je leucin, najmanje jednim ostatkom lizina, arginina, tpiptofana, tirozina ili cisteina iz eritropoetina, primenom postupaka molekularne biologije.

Modifikovani eritropoetin se može dobiti podvrgavanjem eritropoetina ograničenoj hemijskoj proteolizi koja pogađa specifične ostatke, na primer, radi odvajanja ostataka triptofana Tako dobijeni fragmenti eritropoetina su obuhvaćeni ovim izumom.

Kao što je napred navedeno, eritropoetin koji se koristi za svrhe ovog izuma može da ima najmanje jednu od napred navedenih modifikacija ali može imati i više od jedne napred navede modifikacije. Primer za modifikovani eritropoetin sajednom modifikacijom na delu molekula sa ugljenim hidratima i jednom modifikacijom na delu molekula sa amino kiselinama, može biti asijaloeirtropoetin čiji su ostaci lizina biotinilovani ili karbamilovani.

Ovim izumom su obuhvaćeni različiti molekuli eritropoetina i farmaceutske smeše koje ih sadrže za ovde opisane primene. Takvi molekuli eritropoetina uključuju, ali nisu ograničeni na asijaloeritropoetin, N-deglikozilovani eritropoetin, O-deglikozilovani eritropoetin, eritropoetin sa smanjenim sadržajem ugljenih hidrata eritropoetin sa izmenjenim obrascima glikozilovanja eritropoetin sa oksidisanim ugljenim hidratima a potom redukovanim, eritropoetin modifikovan aril<g>hoksalom, eritropoetin modifikovan alkilglioksalom, eritropoetin modifikovan 2,3-butandionom, eritropoetin modifikovan cikloheksandionom, biotinilovani eritropoetin, N-alkilovan-lizil-eritropoetin, glucitolil lizin eritropoetin, alfa-deoksi-alfa-fruktozil lizin-eritropoetin, karbamilovani eritropoetin, acetilovani eritropoetin, sukcinilovani eritropoetin, alfa-karboksialkil eritropoetin, nitrovani eritropoetin, jodirani eritropoetin, u cilju navođenja nekoliko reprezentativnih i još uvek neograničavajućih pnmera koji se zasnivaju na ovde iznetoj doktrini. Poželjni su napred navedeni modifikovani oblici koji se zasnivaju na humanom eritropoetinu.

Sta više, izvesni od napred navedenih eritropoetina su novi i izum se odnosi na takva jedinjenja kao i na farmaceutske smeše koje ih sadrže. U neograničavajućem primeru, takvi novi eritropoetini uključuju eritropoetin oksidisan perjodatom, glucitolil lizin eritropoetin, fruktozil lizin eritropoetin, 3-deoksiglukozon eritropoetin, i karbamilovani asijaloeritropoetin.

Različiti vektorski sistemi prisutni kod domaćina se mogu koristiti za dobijanje eritropoetina i molekula sličnih eritropoetinu iz ovog izuma. Takvi sistemi prisutni kod domaćina pretstavljaju prenosioce pomoću kojih se mogu proizvesti i potom prečistiti eritropoetini iz ovog izuma, ali takođe pretstavljaju i ćelije koje mogu da, kada se transformišu ili transficiraju sa odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, pretstavljaju modifikovan eritropoetin genski proizvodin situ.Tu su uključeni, ali nisu ograničeni na, sledeći sistemi domaćina: bakterije, insekta, biljke, sisara, uključujući humani sistem domaćina, kao što su ali nisu ograničeni na, ćelijski sistemi insekta inficirani sa rekombinantnim izraženim vektorima virusa( npr.,bakulovirus) koji sadrže kodirajuće sekvence modifikovanog proizvoda eirtropoetina; ćelijski sistemi biljke inficirani sa rekombinantnim izraženim vektorima virusa( npr.,mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus duvana, TMV) ili transformisani sa rekombinantnim u plazmi prisutnim vektorima( npr.,Ti plazmid) koji sadrže kodirajuće sekvence molekula sličnog eritropoetinu; ili ćelijski sistemi sisara, uključujući humane ćelijske sisteme,( npr..HT1080, COS, CHO, BHK, 293,3T3) koji štite rekombinantne eksprimirane spojeve koji sadrže promotore dobijene iz genoma ćelija sisara( npr.,metalotionein promotor) ili iz virusa sisara( npr..promoter

adenovirusa; promoter vakcina virusa 7.5K).

Uz to, vrsta ćelije domaćina može biti tako izabrana da modulira eksprimiranje ubačenih sekvenci, ili da modifikuje genski proizvod na željeni specifičan način. Takve modifikacije( npr.,glikozilovanje) iobrada ( npr.,razdvajanje) proteinskih proizvoda mogu biti od važnosti za funkciju proteina Različite ćelije domaćini imaju specifične i karakteristične mehanizme za obradu posle translacije i modifikaciju proteina i genskih proizvoda Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu biti izabrani tako da obezbede pravilnu modifikaciju i obradu proteina stranog porekla koji se eksprimiraju. Na kraju, mogu se koristiti eukariotske ćelije domaćina koje poseduju ćelijski mehanizam za podesnu obradu primarnog transkripta, glikozilovanje i fosforilovanje genskog proizvoda Takve ćelije domaćina sisara uključujući humane ćelije domaćina, obuhvataju, ali nisu ograničene na, HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa COS, MDCK, 293, 3T3, i WI38.

Za proizvodnju rekombinantnih proteina, dugoročnu i sa velikim prinosima, poželjno je stabilno eksprimiranje. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju molekule genskog proizvoda slične eritropoetinu mogu biti projektovane. Bolje je da se umesto primene eksprimiranih vektora koji sadrže virusne izvore replikacije, ćelije domaćina transformišu sa DNA kojaje kontrolisana odgovarajućim kontrolnim elementima za eksprimiranje( npr.,promoterom , pojačivačem, sekvencama transkripcionim terminatorima položajima za poliadenilovanje itd.), i selektivnim markerom Nakon ubacivanja DNA stranog porekla projektovane ćelije mogu biti ostavljene da rastu u toku 1-2 dana u obogaćenoj sredini, i onda prebačene u selektivnu sredinu. Selektivni marker u rekombinantnom plazrrudu pruža otpornost prema selekciji i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i da rastu da bi se formirali fokusi koji se mogu klonirati i proširiti u ćelijske linije. Ovaj postupak se može korisno primeniti za projektovanje ćelijskih linija koje eksprimiraju molekule genskog proizvoda slične eritropoetinu. Tako projektovane ćelijske linije mogu biti naročito korisne za zaštitu i procenu jedinjenja koja utiču na endogenu aktivnost molekula genskog proizvoda sličnog eritropoetinu.

Alternativno, iskazana karakteristika endogenog eritropoetin gena u okviru ćelijske linije ili mikroorganizma može se modifikovati ubacivanjem heterolognog DNA regulacionog elementa u genom stabilne ćelijske linije ili kloniranog mikroorganizma tako daje ubačeni regulacioni elemenat operativno povezan sa endogenim eritropoetin genom.. Na primer, endogeni eritropoetin gen koji je normalno "transkripcionalno tih ", npr., eritropoetin gen koji normalno nije eksprimiran, ili je eksprimiran samo u maloj meri u ćelijskoj liniji, može se aktivirati ubacivanjem regulacionog elementa koji je sposoban da pokrene eksprimiranje normalnog eksprimiranog genskog proizvoda u tu ćelijsku liniju ili mikroorganizam. Alternativno, transkripcionalno tihi, endogeni eritropoetin gen može se aktivirati ubacivanjem zajedničkog regulacionog elementa koji deluje na tipove ćelija

Heterologni regulacioni element može se ubaciti u stabilnu ćelijsku liniju ili klonirani mikroorganizam, tako da bude oprativno vezan sa endogenim eritropoetin genom, primenom postupka kao što je ciljana homologna rekombinacija koja je dobro poznata stručnjacima iz ove oblasti i kojaje opisana npr, u francuskom patentu No. 2646438

(Institut Pasteur), U.S. Patent No. 4,215,051 ( Chappel); U.S. Patent No. 5,578,461 (Shervvin i dr)., Internacionalna prijava No. PCT/US92/09627 (WO93/09222) ( Selden i dr.,) i Internacionalna prijava No. PCT/US90/06436 (W091/06667) ( Skoultchi i dr..) od kojih je

svaki ovde priključen putem reference.

Kod jednog oblika izvođenja ovog izuma, molekul srodan eritropoetinu koji ima nedovoljan broj sijalinskih ostataka, ili uopšte ne sadrži sijalinske ostatke, može biti proizveden u ćeliji sisara, uključujući humanu ćeliju. Takve ćelije se mogu projektovati da imaju nedovoljno, ili da im nedostaje, enzimi koje dodaju sijalinske kiseline, npr.. {3 -galaktozid d2,3 sijaliltransferaza ("d 2,3 sijaliltransferaza") i f3-galaktozidd2,6 sijaliltransferaza ("d2,6 sijaliltransferaza") aktivnost. Kod jednog oblika izvođenja upotrebljenaje ćelija sisara u kojoj su izbačena jedan iii oba gena, d 2,3 sijaliltransferaza gen i/ili d 2,6 sijaliltransferaza gen. Takve delecije se mogu napraviti primenom tzv. genskih nok-aut metoda, koje su dobro poznate u stanju tehnike. Kod drugog oblika izvođenja ćelije jajnika kineskog hrčka (Chinese Hamster Ovary) (CHO) deficitarne u dihidrofolatnoj reduktazi (DHFR) upotrebljene su kao ćelija domaćin za proizvodnju rekombinantnih molekula sličnih eritropoetinu. CHO

ćelije ne eksprimiraju enzim d 2,6 sijaliltransferazu i stoga ne dodaju sijalinsku kiselinu u 2,6 vezu N-vezanih oligosaharida iz glukoproteina proizvedenih u ovim ćelijama. Rezultat toga je da rekombinantni proteini proizvedeni u CHO ćelijama nemaju sijalinsku kiselinu u 2,6 vezi iz galaktoze (Sasaki i dr. (1987; Takeuchi i dr.; Mutsaers i dr. Eur. J. Biochem. 156, 651

(1986);Takeuchi i dr. J. Chromotgr. 400,207 (1987). Kod jednog oblika izvođenja da bi se proizvela ćelija domaćin za dobijanje asijaloeritropoetina izbrisan je gen sa kodom d 2,3 sijaliltransferaze u CHO ćelijama Takve CHO ćelije kod kojih je urađen nok-out d 2,3 sijaliltransferaze uopšte nemaju aktivnost sijaliltransferaze, i kao rezultat toga one se koriste za rekombinantno eksprimiranje i proizvodnju asijaloeritropoetina.

Kod drugog oblika izvođenja, asijalo glikoproteini mogu se prizvesti ometanjem transporta sijalinske kiseline u Goldžijevom aparatu, kao što je navedeno kod autora (Eckhardt i dr., 1998, J. Biol. Chem. 273:20189-95). Primenom postupaka koji su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti tehnike( npr.,Oelmann i dr., 2001, J. Biol. Chem. 276:26291-300), može se postići mutageneza transportera nukleotida šećera CMP-sijalinska kiselina da bi se proizveli mutanti ćelija jajnika kineskog hrčka. Ove ćelije nisu u stanju da dodaju ostatke sijalinske kiseline u glikoproteine kao što je eritropoetin i proizvode samo asijaloeritropoetin. Transfektovane ćelije sisara koje proizvode eritropoetin takođe proizvode i citosolnu sijalidazu, koja, ako ističe u medijum sa kulturom veoma efikasno razgrađuje asijaloeritropoetin.(e.g., Gramer i dr., 1995 Biotechnologv 13:692-698). Primenom postupaka dobro poznatih stručnjacima iz ove oblasti tehnike( npr.,iz informacije navedene kod autora Ferrari i dr., 1994, Glycobiology 4:367-373), ćelijske linije se mogu transfektovati, mutirati ili drugačije izazvati da u osnovi proizvode sijalidaze. Na taj način, asijaloeritropoetin može se proizvesti u toku spravljanja asijaloeritropoetina

Kod primene jednog aspekta ovog izuma, farmaceutska smeša, kao što je napred opisano, koja sadrži eritropoetin može se aplicirati sisaru na bilo koji način koji obezbeđuje dovoljan nivo eritropoetina u vaskulamom sistemu koji dopušta translokaciju preko endotelijalne ćelijske barijere i delotvome efekte kod ćelija responzivnih na eritropoetin. Kada se koristi za perfuziju tkiva ili organa, poželjni su slični rezultati. U slučaju kada se eritropoetin koristi za perfuzijuex- vivo,eritropoetin može imati bilo koji oblik eritropoetina takav kao što su napred pomenuti eritropoetini, ali nije ograničen na i može sadržati nativne eritropoetine, uključujući humani eritropoetin. U slučaju kada ćelije ili tkivo nisu u vezi sa vaskulamim sistemom i/ili apliciranje se vrši kupanjem ćelija ili tkiva sa smešama iz ovog izuma farmaceutska smeša daje efikasnu količinu eritropoetina koja je delotvoma za ćelije responzivne na eritropoetin. Endotelijalne ćelijske barijere preko kojih može da se translocira eritropoetin uključuju čvrste veze, perforirane veze, šupljikave veze i sve druge tipove endotelijalnih barijera prisutnih kod sisara. Poželjna je endotelijalna ćelijska barijera sa čvrstim vezom, ali izum nije tako ograničavajući.

Napred navedeni eritropoetini su korisni uopšte za terapeutsko ili profilaktičko lečenje bolesti centralnog nervnog sistema ili perifernog nervnog sistema kod ljudi, koje imaju primamo neurološke ili psihijatrijske simptome, kao i za očne bolesti, kardiovaskularne bolesti, kardiopulmoname bolesti, respiratorne bolesti, bubrežne, urinarne i reproduktivne bolesti, gastrointestinalne bolesti i endokrine i metaboličke abnormalnosti.

Osobito, takva stanja i bolesti obuhvataju stanja hipoksije, koja nepovoljno utiču na ekscitirana tkiva, kao što su ekscitirana tkiva u tkivu centralnog nervnog sistema, perifernog nervnog sistema ili u srčanom tkivu ili u retinalnom tkivu kao što je, na primer, mozak, srce ili retina/oko. Stoga, izum se može primeniti za lečenje ili sprečavanje povrede ekscitiranog tkiva koja se dešava kao rezultat stanja hipoksije u različitim uslovima i okolnostima Neograničavajući primeri za takve uslove i okolnosti ovde su prikazani u tabeli navedenoj u daljem tekstu.

Kod primera za zaštitu od patologija nervnih tkiva koje se mogu lečiti u skladu sa ovim izumom, takve patologije uključuju one koje nastaju zbog smanjene oksidacije nervnih tkiva. Svako stanje koje smanjuje raspoloživost kiseonika u nervnom tkivu, čije su posledice stres, povreda i na kraju smrt nervne ćelije, može se lečiti pomoću postupaka iz ovog izuma.. Opšte poznati kao hipoksija i/ili ishemija, ova stanja nastaju usled ili uključuju, ali nisu ograničeni na, kap, vaskulamu okluziju, prenatalni ili postnatalni gubitak kiseonika sufokaciju, gušenje, davljenje, trovanje ugljen monoksidom, udisanje dima, povrede, uključujući hirurške i prilikom terapije zračenjem, asfiksiju, epilepsiju, hipoglikemiju, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, emfizem, sindrom respiratornog poremećaja odraslih, hipotenzivru šok, septički šok, anafilaktički šok, insulinski šok, krize bolesnih ćelija, prekid rada srca, disritmiju, narkozu azotom, i neurološke deficite izazvane baj-pas postupcima za srce i pluća.

Kod jednog oblika izvođenja, na primer, specifična EPO smeša može biti aplicirana u cilju sprečavanja ozlede ili povrede tkiva usled rizika ozlede ili povrede tkiva tokom hirurških postupaka, kao što je, na primer, resekcija tumora ili oporavak aneurizme. Druge patologije, koje su izazvane ili su posledica hipoglikemije i mogu se lečiti pomoći ovde opisanih postupaka, uključuju prekomemu dozu insulina,, takođe poznato kao, jatrogena hiperinsulinemija, insulinom, nedostatak hormona rasta, smanjenje kortizona, prekomema doza droge i određeni tumori.

Druge patologije koje potiču iz ekscitiranog nervnog tkiva uključuju napade, kao stoje epilepsija, konvulzije, ili hronični napadi. Druga stanja i bolesti koje mogu da se leče, uključuju bolesti kao što je kap, multipl skleroza, hipotenzija, prekid rada srca, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, cerebralna paraliza, povrede mozga ili kičmene moždine, AIDS demencija, gubitak funkcije spoznaje u vezi sa godinama starosti, gubitak pamćenja, amiotrofična lateralna skleroza, napadi, alkoholizam, retinalna ishemija, povreda optičkog nerva koju izaziva glaukom i gubitak nervnih ćelija

Specifične smeše i postupci iz ovog izuma mogu se primeniti za lečenje stanja i povreda retinalnog tkiva Takvi poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na retinalnu ishemiju, degeneraciju makule,odvajanje retine, retinitis pigmentozu, arterioskleroticnu retinopatiju, hipertenzivnu retinopatiju, zapušavanje retinalne arterije, zapušavanje retinalne vene, hipotenziju i dijabetsku retinopatiju.

U drugom obliku izvođenja, principi postupaka iz ovog izuma mogu se primeniti za zaštitu ili lečenje ozleda koje su posledica povreda ekscitiranog tkiva u toku zračenja Sledeća korist od postupaka iz ovog izuma je kod lečenja trovanja neurotoksinom, kao što je trovanje školjkama, neurolatirizam i Guam-ova bolest, amiotrofična lateralna skleroza i Parkinsonova bolest."

Kao što je napred navedeno, ovaj izum se takođe odnosi na postupak za povećavanje funkcije ekscitiranog tkiva kod sisara pomoću perifernog apliciranja eritropoetin kao što je napred opisano. Različite bolesti i stanja su pristupačni za lečenje primenom ovog postupka, šta više, ovaj postupak je koristan za povećavanje funkcije spoznaje u otsustvu ma kog stanja ili bolesti. Navedene primene ovog izuma opisane su u daljem tekstu sa više detalja i obuhvataju povećavanje mogućnosti za učenje i vežbanje kako kod ljudi, tako i kod ostalih sisara

Stanja i bolesti koje se leče putem postupaka zasnovanih na ovom aspektu iz ovog izuma, koja se odnose na centralni nervni sistem, uključuju, ali nisu ograničeni na poremećaje raspoloženja poremećaje anksioznosti, depresiju, autizam, poremećaj hiperaktivnosti usled deficita pažnje, i disfunkciju spoznaje. Na ova stanja delotvorno deluje povećavanje funkcije nervnih ćelija Ostali poremećaji koji mogu da se leče u skladu sa doktrinom iz ovog izuma uključuju razbijen san, na primer, apnea u snu i poremećaje u vezi putovanja subarahnoidna i aneurizmalna krvavljenja hipotenzivni šok, povreda prouzrokovana udarcem, septički šok, anafilaktički šok i posledice različitih encefalitisa i meningitisa na primer, oboljenja vezivnog tkiva, kao što je lupus. Ostale primene uključuju predohranu ili zaštitu od trovanja neurotoksinima, kao što je trovanje školjkama, neurolatirizam, i Guam-ova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, Parkinsonova bolest; postoperativno lečenje povreda izazvanih embolijom ili ishemijom; ozračivanje celog mozga, krize bolesne ćelije; i eklampsia

Sledeća grupa stanja koja se mogu lečiti putem postupaka iz ovog izuma uključuje mitohondrialnu disfunkciju, bilo daje nasledna ili stečena, koja prouzrokuje različite neurološke bolesti obeležene povredom neurona i smrću. Na primer, Leigh'ova bolest (subacutna nekrotična encefalopatija) okarakterisana je progresivnim gubitkom vida i encefalopatijom, usled pada sadržaja neurina i miopatije. U ovim slučajevima, defektan mitohondrijalni metabolizam ne uspeva da snabde dovoljno supstrata velike energije da potstakne metabolizam ekscitranih ćelija. Modulator aktivnosti eritropoetin receptora optimizuje ovu nedovoljnu funkciju kod različitih mitohondrijalnih bolesti. Kao stoje napred pomenuto, stanja hipoksije nepovoljno utiču na ekscitirana tkiva Ekscitirana tkiva uključuju, ali nisu ograničena na, tkivo centralnog nervnog sistema, tkivo perifernog nervnog sistema i srčano tkivo. Osim kod stanja napred opisanih, postupci iz ovog izuma korisni su za lečenje trovanja udisanjem kao što je udisanje ugljen monoksida i dima, teških oblika astme, sindroma respiratornog poremećaja odraslih, gušenja i davljenja Ostali uslovi koji utiču na stanja hipoksije ili na drugi način izazivaju povrede ekscitiranog tkiva uključuju hipoglikemiju koja može da se dogodi kod neodgovarajućeg doziranja insulina ili sa neoplazmama koje proizvode insulin (insulinom).

Različiti neuropsihološki poremećaji za koje se veruje da potiču od povrede ekscitiranog tkiva leče se hitnim postupcima Hronični poremećaji koji obuhvataju povredu nervnih ćelija i za koje je lečenje predviđeno ovim izumom, uključuju poremećaje koji su u vezi sa centralnim nervnim sistemom i/ili perifernim nervnim sistemom uključujući gubitak funkcije spoznaje u vezi sa godinama starosti, hronične napade, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, demenciju, gubitak pamćenja, amiotrofičnu lateralnu sklerozu, multipl sklerozu, tuberoznu sklerozu, Wilson-ovu bolest, cerebralnu i supranuklearnu paralizu, Guam-ovu bolest, telesnu demenciju po Lewy-ju, bolesti priona, kao što su sunđeraste encefalopatije, npr., Creutzfeldt-Jakob-ova bolest, Huntington-ova bolest, miotonična distrofija, Freidrich-ova ataksija i ostale ataksije, kao i Gilles de Ia Tourette-ov sindrom, napadi kao što je epilepsija i hronični napadi, kap, povreda mozga ili kičmene moždine, AIDS demencija, alkoholizam, autizam, retinalna ishemija, glaukom, poremećaji autonomne funkcije kao štoje hipertenzija i poremećaji sna, i neuropsihijatrijski poremećaji koji uključuju, ali nisu ograničeni na, šizofreniju, šizoafektivne poremećaje, poremećaj deficita pažnje, distrofični poremećaj, glavni depresivni poremećaj, manija, opsesivno-kompulzivni poremećaj, poremećaji zbog upotrebe psihoaktivne supstance, anksioznost, panični poremećaj, kao i unipolarni i bipolarni afektivni poremećaji. Dodatni neuropsihijatrijski i neurodegenerativni poremećaji uključuju, na primer, one koji su navedeni u knjizi American Psvchiatric Association's Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders (DSM), čijaje najnovija verzija ovde obuhvaćena u celosti.

U drugom obliku izvođenja, rekombinantni molekuli himeričnog toksina, koji sadrže eritropoetin mogu se primeniti za terapeutsko davanje toksina radi lečenje poremećaja razmnožavanja, kao što je kancer, ili virusni poremećaj, kao što je subakutni sklerotični panencefalitis.

U sledećoj tabeli su navedene egzemplarno, neograničavajuće indikacije za različita stanja i bolesti koji se mogu lečiti pomoću napred navedenih eritropoetina.

Kao što je napred pomenuto, ove bolesti, poremećaji ili stanja samo ilustrativno pokazuju brojne koristi koje pružaju eritropoetini iz ovog izuma Shodno tome, ovaj izum uopšte obezbeđuje terapeutsko ili profilaktičko lečenje za posledice mehaničkih trauma ili bolesti ljudi. Poželjno je terapeutsko ili profilaktičko lečenje za bolesti, poremećaje ili stanja kod centralnog nervnog sistema CNS i/ili perifernog nervnog sistema.Obezbeđeno je terapeutsko ili profilaktičko lečenje za bolesti, poremećaje ili stanja koja imaju psihijatrijsku komponentu. Obezbeđeno je terapeutsko ili profilaktičko lečenje za bolesti, poremećaje ili stanja, koja uključuju, ali nisu ograničena na, ona koja sadrže oftalmološku, kardiovaskularnu, kardiopulmonamu, respiratornu, bubrežnu, urinarnu, reproduktivnu, gastrointestinalnu, endokrinu, ili metabolitičku komponentu.

Kod jednog oblika izvođenja, takva farmaceutska smeša sa eritropoetinom može se aplicirati sistemski radi zaštite ili povećavanja ciljnih ćelija, tkiva ili organa. Takvo apliciranje može biti parenteralno, putem inhalacije, ili transmukozalno, npr., oralno, nazalno, rektalno, intravaginalno, sublingvalno, submukozalno ili transdermalno. Poželjno je da apliciranje bude parenteralno, npr, putem intravenoznog ili intraperitonealnog ubrizgavanja, a takođe uključuje, ali nije ograničeno na, intra-arterijalno, intrarnuskularno, intradermalno i potkožno apliciranje.

Za druge načine apliciranja, kao što je primenom rastvora za perfuziju, ubrizgavanje u organ, ili drugo lokalno apliciranje, obezbeđena je farmaceutska smeša sa sličnim nivoima eritropoetina kao što je opisano u tekstu. Poželjan je nivo od oko 15pM-30 nM.

Farmaceutske smeše iz ovog izuma mogu se sastojati od terapeutski efikasne količine jedinjenja i farmaceutski prihvatljivog nosioca Kod specifičnog oblika izvođenja izraz "farmaceutski prihvatljiv " znači daje odobren od strane regulacione agencije državne uprave ili daje naveden u U.S. Pharmacopeia ili u drugoj opšte priznatoj inostranoj farmakopeji za primenu kod životinja i posebno kod ljudi. Izraz "nosioc" odnosi se na razblaživač, adjuvans, punioc, ili na prenosioc pomoću koga se terapija aplicira Takvi farmaceutski nosioci mogu biti sterilne tečnosti, kao što su slani rastvori u vodi i uljima uključujući ulja koja se dobijaju iz nafte, životinja biljaka ili sintetičkim putem, takva kao ulje iz kikirikija sojino ulje, mineralno ulje, ulje od sezama i slična. Slani rastvor je poželjan nosioc kada se farmaceutska smeša aplicira intravenozno. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerina mogi se upotrebiti kao tečni nosioci, naročito za rastvore koji se ubrizgavaju. Odgovarajući farmaceutski punioci uključuju škrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerin monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerin, propilen, glikol, vodu, etanol i slične. Ako je poželjno, smeša može da sadrži male količine sredstva za kvašenje ili emulgovanje, ili pH pufere. Ove smeše mogi biti u obliku rastvora suspenzija emulzija tableta pilula kapsula prahova formulacija sa usporenim otpuštanjem i slično. Smeša može biti formulisana kao supozitorija sa uobičajenim sredstvima za sprečavanje proliva i nosiocima kao što su trigliceridi. Jedinjenja iz ovog izuma mogu-biti formulisana kao neutralna ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one koje su formirane sa slobodnim amino grupama, takvim koje su dobijene iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i onih koje su obrazovane sa slobodnim karboksilnim grupama takvim koje su dobijene iz natrijuma kalijuma amonijuma kalcijuma hidroksida gvožđa izopropilamina trietilamina 2-etilamino etanola histidina, prokaina i dr. Pnmeri pogodnih farmaceutskih nosioca opisani su u knjizi "Remington Pharrnaceutical Sciences", autor E.W. Martin. Takve smeše sadrže terapeutski efikasne količine jedinjenja poželjno u prečišćenom obliku, zajedno sa podesnom količinom nosioca kako bi se obezbedio oblik, koji je pogodan za apliciranje

pacijentu. Formulacija treba da odgovara načinu apliciranja.

Farmaceutske smeše, prilagođene za oralno apliciranje mogu biti u obliku kapsula ili tableta ; praškova ili granula; rastvora, sirupa ili suspenzija (u vodi ili tečnostima koje nisu voda); jestivih pena ili kremova; ili emulzija. Tablete ili kapsule od tvrdog želatina mogu da sadrže laktozu, škrob ili njegove derivate, magnezijum stearat, natrijum saharin, celulozu, magnezijum karbonat, stearinsku kiselinu ih njene soli. Kapsule od mekog želatina mogu da sadrže biljna ulja, voskove, masti, polu-čvrste ili tečne poliole i dr. Rastvori ili sirupi mogu da sadrže vodu, poliole i šećere.

Aktivno sredstvo namenjeno za oralno apliciranje može biti prevučeno ili pomešano sa materijom koja usporava disintegraciju i/ili apsorpciju aktivnog sredstva u gastrointestinalnom traktu( npr.,mogu se primeniti gliceril monostearat ili gliceril distearat). Na taj način se može postići usporeno otpuštanje aktivnog sredstva u toku mnogo sati, i ako je neohodno, aktivno sredstvo može biti zaštićeno od razgradnje u želucu. Farmaceutske smeše za oralno apliciranje mogu tako biti formulisane da ubrzaju otpuštanje aktivnog sredstva na određenom mestu u gastrointestinalnom traktu u zavisnosti od specifičnog pH ili stanja enzima.

Farmaceutske smeše prilagođene za transdermalno apliciranje mogu biti u obliku odvojenih flastera namenjenih da ostanu u intimnoj vezi sa epidermom primaoca u dužem vremenskom periodu. Farmaceutske smeše prilagođene za lokalno apliciranje mogu biti u obliku masti, kremova, suspenzija, losiona, praškova, rastvora, pasta, gelova, sprejova. aerosola ili ulja. Za lokalno apliciranje na kožu, usta, oko ili druga spoljašna tkiva poželjno je da se koristi lokalna mast ili krem. Kada se formuliše u mast, aktivni sastojak može biti upotrebljen sa osnovom za mast, koja je parafinska ili se mesa sa vodom. Alternativno, aktivni sastojak se može formulisati u krem sa bazom koja sadrži ulje u vodi ili vodu u ulju. Farmaceutske smeše prilagođene za lokalno apliciranje u oko uključuju kapi za oči. U ovim smešama aktivni sastojak može biti rastvoren ili suspendovan u pogodnom nosiocu, npr, u vodenom rastvaraču. Farmaceutske smeše za lokalno apliciranje u usta uključuju tablete u obliku romba, pastile i rastvore za ispiranje usta.

Farmaceutske smeše prilagođene za nazalno i pulmonamo apliciranje mogu da se sastoje od nosioca u čvrstom stanju takvih kao što su praškovi (poželjno je da veličina čestica ima opseg od 20 do 500 microna). Praškovi mogu biti aplicirani na način na koji se ušmrkuje burmut, rj., putem brze inhalacije kroz nos iz posude sa praškom koja se drži uz nos. Alternativno, smeše prilagođene za nazalno apliciranje mogu da se sastoje od tečnih nosioca, tj., spreja za nos ili kapi za nos. Alternativno, inhaliranje direktno u pluća može se izvesti dubokim inhaliranjem ili ubacivanjem cevi u orofarinks. Ove smeše mogu činiti vodeni ili uljani rastvori aktivnog sastojka Smeše za apliciranje putem inhalacije mogu biti snabdevene specijalno adaptiranim uređajima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, aerosole pod pritiskom, raspršivače ili naprave za uduvavanje, koji mogu biti tako konstruisani da daju prethodno određene doze aktivnog sastojka. Kod poželjnog oblika izvođenja farmaceutske smeše iz ovog izuma aplicirane su u nosnu duplju direktno ili u pluća preko nosne duplje ili orofannksa

Farmaceutske smeše prilagođene za rektalno apliciranje mogu biti u obliku supozitonja ili klistira. Farmaceutske smeše predviđene za vaginalno apliciranje mogu biti u obliku pesara tampona kremova gela pasta, pena ili formulacija sa sprejom.

Farmaceutske smeše prilagođene za patenteralno apliciranje uključuju vođene i nevodene sterilne injekcione rastvore ili suspenzije, koji mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostatike i rastvorene supstance, koje čine da smeše budu u suštini izotonične sa krvlju predviđenog primaoca. U takvim smešama mogu da budu prisutne ostale komponente uključujući vodu, alkohole, poliole, glicerin i biljna ulja, na primer Smeše prilagođene za parenteralno apliciranje mogu biti u posudama sajednom dozom ili sa više doza, na primer, u zapečaćenim ampulama ili bočicama, i mogu da se čuvaju u hlađenjem osušenom (liofilizovanom) stanju koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosioca, npr., sterilnog fiziološkog rastvora za injekcije, neposredno pre upotrebe. Improvizovani injekcioni rastvori i suspenzije mogu se spraviti od sterilnih praškova, granula i tableta. Kod jednog oblika izvođenja, može se koristiti autoubrizgač koji sadrži injekcioni rastvor eritropoetina za potrebe hitne pomoći u ambulantama, prostorijama za hitnu pomoć i u ratnim situacijama, a čak i za samostalno apliciranje u domaćim prilikama, naročito tamo gde postoji mogućnost traumatske amputacije, takve kao stoje nesmotrena upotreba kosačice. Verovatnoća da će ćelije i tkiva u otkinutom stopalu ili nožnom prstu preživeti posle ponovnog spajanje može se povećati putem apliciranja eritropoetina na više mesta u otkinutom delu stoje pre moguće, čak i pre dolaska medicinskog osoblja na mesto događaja, ili dolaska unesrećene osobe sa otkinutim prstom pod okrilje hitne pomoći.

Kod prioritetnog oblika izvođenja, smešaje formulisana u skladu sa rutinskim postupcima kao farmaceutska smeša prilagođena za intravenozno apliciranje ljudimaTipično, smeše za intravenozno apliciranje su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je neophodno, smeša može takođe da sadrži sredstvo za rastvaranje i lokalni anestetik takav kao lidokain radi olakšavanja bola na mestu ubrizgavanja. Uopšte, sastojci se isporučuju posebno ili pomešani zajedno u obliku pojedinačne doze, na primer, kao suv liofilizovani prah ili bezvodni koncentrat u hermetički zapečaćenoj posudi kao što je ampula ili kesica, na kojoj je naznačena količina aktivnog sastojka. Kada se smeša aplicira putem infuzije, uz nju može biti dodata infuziona boca koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološki rastvor farmaceutskog kvaliteta. Kada se smeša aplicira putem ubrizgavanja, uz nju može biti dodata ampula sterilnog fiziološkog rastvora tako da se sastojci mogu izmešati pre apliciranja.

Supozitorije uopšte sadrže aktivni sastojak u opsegu od 0.5% do 10% težinskih; oralne formulacije prioritetno sadrže 10% do 95% aktivnog sastojka.

Smeša za perfuziju može da se koristi za primenu u kupatilima u kojima se drže organi za transplantaciju, za perfuziju in situ, ili za apliciranje u vaskulatomi sistem organa davaoca, pre nego što se organ odvoji od tela Takve farmaceutske smeše mogu da sadrže nivoe eritropoetina ili oblik eritropoetina koji nije podesan za akutno ili hronično, lokalno ili sistematsko apliciranje pojedincu, ali će posužiti za namenjene funkcije u lešu, kupatilu za organ, perfuzatu organa ili za perfuzat in situ pre uklanjanja ili smanjenja nivoa eritropoetina koji se u njima nalazi, pre nego što se lečeni organ ili tkivo izloži ili vrati normalnoj cirkulaciji. Eritropoetin za ovaj aspekt izuma može biti bilo koji eritropoetin, kao oblici koji se nalaze prirodi kao što je humani eritropoetin, ili bilo koji od eritropoetina u ovom tekstu napred opisanih , kao što su asijaloeirtropoetin i fenilglioksal-eritropoetini, u smislu neograničavajućih primera.

Ovaj izum takođe predviđa farmaceutski paket ili sanduk koji sadrži jedan ili više sudova napunjenih sa jednim ili više sastojaka farmaceutskih smeša iz ovog izuma Opciono, uz takav sud ili sudove može se nalaziti oglas u obliku propisanom od strane agencije državne uprave kojim se reguliše spravljanje, primena ili prodaja farmaceutskih ili bioloških proizvoda, i kojim oglasom se od strane agencije daje odobrenje za spravljanje, primenu ili za humano apliciranje.

Kod drugog oblika izvođenja, na primer, eritropoetin može biti isporučen u sistemu za kontrolisano otpuštanje leka Na primer, polipeptid se može aplicirati primenom intravenozne infuzije, osmotske pumpe za implantaciju, transdermalnog flastera, lipozoma, ili drugih načina apliciranja. Kod jednog oblika izvođenja može se koristiti pumpa (vidi Langer,supra;Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchvvald i dr., 1980, Surgerv 88:507; Saudek i dr., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Kod drugog oblika izvođenja jedinjenje može biti isporučeno u prenosiocu, naročito u lipozomu( vidiLanger,Science249:1527-1533

(1990); Treat i dr., Liposomes in the Therapv of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein i Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989), WO 91/04014; U.S. Patent No. 4,704,355; Lopez-Berestein,ibid.,pp. 317-327; vidi uopšteibid. J.Kod drugog oblika izvođenja mogu se primeniti polimerni materijali (vidi Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (eds.), CRC Press. Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailabilitv, Drug Product Design and Performance, Smolen i Bali (eds ), Wiley: Nevv York

(1984); Ranger i Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem 23:61,1953; vidi takođe Levv i dr, 1985, Science 228:190: During i dr., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Hovvard i dr., 1989, J. Neurosurg. 71:105).

Kod još jednog oblika izvođenja sistem za kontrolisano otpuštanje leka može biti smešten u blizinu terapeutskog cilja, tj., ciljne ćelije, tkiva ili organa zahtevajući na taj način samo deo sistemske doze (vidi, npr., Goodson, pp. 115-138 u Medical Applications of ControlledRelease, vol. 2, supra,1984). O ostalim sistemima za kontrolisano otpuštanje diskutovano je u pregledu koji je napisao Langer (1990, Science 249:1527-1533).

Kod drugog oblika izvođenja, eritropoetin, kada je ispravno formulisan, može se aplicirati nazalno, oralno, rectalno, vaginalno ili sublingvalno.

Kod specifičnog oblika izvođenja, može biti poželjno da se smeše eritropoetina iz ovog izuma apliciraju lokalno u predeo koji treba da se leči; ovo se može postići pomoću, na primer, ali nije ograničeno na, lokalne infuzije u toku hirurške intervencije, lokalnom primenom, npr., prilikom zavijanja rane posle hirurške intervencije, ubrizgavanjem, pomoću katetera, pomoću supozitorija ili pomoću implanta, pomenuti implant može biti napravljen od poroznog, neporoznog, ili želatinoznog materijala, uključujući membrane, kao što su silikonske membrane ili vlakna.

Izbor prioritetne efektivne doze odrediće stručnjak koji se zasniva na uzimanju u obzir više faktora poznatih običnom stručnjaku iz ove oblasti. Takvi faktori uključuju određeni oblik eritropoetina, i njegove farmakokinetičke parametre kao što su bioraspoloživost, metabolizam, polu-život, itd., koji će biti utvrđeni u toku uobičajenog postupka za dobijanje zakonskog odobrenja za farmaceutsko jedinjenje. Ostali faktori koji se uzimaju u obzir prilikom određivanja doze uključuju stanje ili bolest koja se leči ili korist koja se postiže kod normalnog pojedinca, masu tela pacijenta, način apliciranja, da li je apliciranje akutno ili hronično, lekove koji se uzimaju istovremeno, i druge faktore koji su dobro poznati da utiču na efikasnost apliciranog farmaceutskog sredstva Na taj način precizno doziranje mora se odrediti u skladu sa ocenom lekara i stanja svakog pacijenta, npr., u zavisnosti od stanja i imunog sistema pojedinog pacijenta, shodno standardnim kliničkim postupcima

U drugom aspektu ovog izuma predviđen je perfuzni rastvor za perfuziju i čuvanje organa za transplantaciju, pri čemu perfuzioni rastvor sadrži izvesnu količinu eritropoetina koja je sposobna da zaštiti ćelije i asocirane ćelije, tkiva i organe responzivne na eritropietin. Transplantacija uključuje, ali nije ograničena na ksenotransplantaciju, kod koje se organ (uključujući ćelije, tkivo ili drugi deo tela) odvaja od davaoca i presađuje u različitog-primaoca i na autotransplantaciju, kod koje se organ uzima sa jednog dela tela i zamenjuje na drugom, uključujući hirurške postupke na stolu, u kojima se jedan organ može ukloniti i dok jeex vivo,iseći, popraviti, ili na drugi način manipulisati, kao kod uklanjanja tumora, i ponovo vratiti na originalno mesto. Kod jednog oblika izvođenja, perfuzioni rastvor je poznat kao (UW) rastvor koji je napravio Univerzitet iz Vinskonsina i zaštitio (U.S. Patent No 4,798,824), koji sadrži od oko 1 do oko 25 U/ml eritropoetina,5%hidroksietil škroba (sa molekulskom težinom od oko 200,000 do oko 300,000 i koji uopšte ne sadrži etilen glikol, etilen hlorhidrin, natrijum hlorid i aceton); 25mM KH2PO4; 3mM glutationa; 5mM adenozina lOmM glukoze; lOmM HEPES pufera; 5mM magnezijum glukonata 1.5mM CaCb ,105mM natrijum glukonata 200,000 jedinica penicilina; 40 jedinica insulina; 16mg deksametazona 12mg fenol crvenog i ima pH od 7.4-7.5 i osmolarnost od oko 320 mOSm/1. Rastvor se koristi da se sačuvaju bubrezi i gušterače iz leševa pre transplantacije. Primenom rastvora može se produžiti čuvanje iznad 30-to časovne granice, koja se preporučuje za čuvanje bubrega iz leševa. Ovaj određeni rastvor za perfuziju pretstavlja samo ilustraciju većeg broja takvih rastvora koji mogu biti prilagođeni za ovu primenu dodavanjem efektivne količine eritropoetina. Kod sledećeg oblika izvođenja, rastvor za perfuziju sadrži od oko 5 do oko 35 U/ml eritropoetina, ili od oko 10 do oko 30 U/ml eritropoetina. Kao stoje pomenuto napred, bilo koji oblik eritropoetina može se primeniti u ovom aspektu izuma

Dok je prioritetni primaoc eritropoetina za svrhe navedene u ovom tekstu čovek, postupci iz ovog izuma se podjednako primenjuju na druge sisare, naročito na domaće životinje, pripitomljene životinje, životinje ljubimce i životinje iz zoološkog vrta Međutim, izum nije tako ograničavajući i može se korisno pnmeniti na svakog sisara.

U sledećim aspektima zaex- vivoizum, uključenje svaki eritropoetin takav kao, ali nije ograničeno, eritropoetini napred opisani, kao i nativni eritropoetini ili njihov analog, imitacija eirtropoetina i fragment eritropoetina hibridni molekul eritropoetina molekul koji vezuje eritropoetin i receptor, eritropoetin agonist, renalni eritropoetin, moždani eritropoetin, njegov oligomer, njegov multimer, njegov mutein, njemu srodno jedinjenje, njegov oblik koji se nalazi u prirodi, njegov sintetički oblik, njegov rekombinantni oblik, njegova glikozilovana varijanta, njegova deglikozilovana varijanta, ili njihova kombinacija.

U drugom aspektu ovog izuma, postupci i smeše za povećavanje sposobnosti za život ćelija tkiva ili organa koji nisu izolovani od vaskulatomog sistema pomoću endotelijalne ćelijske barijere prikazani su pomoću izlaganja ćelija, tkiva ili organa direktno dejstvu farmaceutske smeše koja sadrži eritropoetin, ili apliciranjem ili u kontaktu farmaceutske smeše koja sadrži eritropoetin sa vaskularnim sistemom tkiva ili organa. Povećana aktivnost ćelija responzivnih na eritropoetin u lečenom tkivu ili organu odgovorna je za ispoljene pozitivne efekte.

Kao što je napred opisano, ovaj izum se delimično zasniva na otkriću da se molekuli eritropoetina mogu transportovati od lurninalne površine do površine osnovne membrane

endotelijalnih ćelija iz kapilara organa sa čvrstim vezama endotelijalnih ćelija, uključujući, na primer, mozak, retinu i testise. Na taj način, ćelije responzivne na eritropoetin preko barijere pretstavljaju prijemčive ciljeve za delotvome efekte eritropoetina, kao što i ostali tipovi ćelija, tkiva ili organa koji sadrže ili zavise u potpunosti ili delimično od ćelija responzivnih na eritropoetin, pretstavljaju ciljeve postupaka iz ovog izuma Bez želje da se vezuje za određenu teoriju, nakon transcitoze eritropoetina eritropoetin može da reaguje sa eritropoetin receptorom na ćeliju responzivnu na eritropoetin, koja može biti na primer, iz nerava, retine, mišića, srca pluća jetre, bubrega tankog creva adrenalne kore, adrenalne moždine, kapilarnog endotelijala, testisa, jajnika, pankreasa ili endometrijalnih ćelija ili tkiva a vezivanje receptora može da inicira signalizujuću transdukcionu kaskadu čiji je rezultat aktivacija programa za eksprimiranje gena u okviru ćelije ili tkiva responzivnih na eritropoetin, a čiji je rezultat zaštita ćelije, tkiva ili organa od oštećenja koje može biti izazvano toksinima hemoterapeutskim sredstvima, terapijom zračenjem , hipoksijom itd. Tako su ovde u daljem tekstu detaljno opisani postupci za zaštitu tkiva koje sadrži ćelije responzivne na ertropoietin od povrede ili stresa usled hipoksije, i za povećavanje funkcije takvog tkiva

Kod jednog oblika izvođenja iz ovog izuma pacijent koji je sisar izdržava sistemsku hemoterapiju za lečenje kancera, uključujući terapiju zračenjem, koja najčešće ima nepovoljne efekte, kao što su oštećenja nerava pluća srca jajnika ili testisa Apliciranje farmaceutske smeše koja sadrži eritropoetin kao stoje napred opisano, izvodi se pre i u toku hemoterapije i/ili terapije zračenjem, u cilju zaštite različitih tkiva i organa od oštećenja izazvanih sredstvima za hemoterapiju, kao što je zaštita testisa. Lečenje se može produžiti sve dok periodični nivoi sredstva za hemoterapiju ne opadnu ispod nivoa koji pretstavlja

potencijalnu opasnost za telo sisara.

Kod drugog oblika izvođenja, bilo je planirano da se različiti organi uzmu sa tela žrtve automobilske nesreće za transplantaciju kod većeg broja primaoca, od kojih je neke trebalo transportovati na daljinu i u toku dužeg vremenskog perioda. Pre nego što je organ uzet, žrtvi je data infuzija sa farmaceutskom smešom koja je sadržala eritropoetin, kao što je ovde opisano. Uzeti organi radi transporta su stavljeni u rastvor za perfuziju koji je sadržao eritropoetin kao što je ovde opisano, i čuvani u kupatilu koje sadržalo eritropoetin. Određeni organi su kontinualno prelivani pomoću pulsirajućeg uređaja za perfuziju, uz upotrebu rastvora za perfuziju koji sadrži eritropoetin u skladu sa ovim izumom. U toku transporta dogodilo se minimalno opadanje funkcije organa i nakon presađivanja i ponovne perfuzije organain situ.

Kod drugog oblika izvođenja, hirurška intervencija na srčanom zalisku je zahtevala temporarnu kardioplegiju i arterijalnu okluziju. Pre operacije, pacijentu je data infuzija sa 500 U eritropoetina po kg telesne težine. Takvo lečenje sprečilo je oštećenje ćelija usled hipoksije i ishemije, naročito posle ponovljene perfuzije.

Kod drugog oblika izvođenja, kod ma kog hirurškog postupka, kao što je kardiopulmonami baj-pas, može se koristiti eritropoetin koji se nalazi u prirodi ili ma koji eritropoetin iz ovog izuma Kod jednog oblika izvođenja apliciranje farmaceutske smeše koja sadrži eritropoetin kao što je napred opisano, radi se pre, u toku i/ili posle baj-pas operacije, da bi se zaštitila funkcija mozga srca i ostalih organa.

Kod prethodnih primera u kojima je eritropoetin iz ovog izuma, uključujući entropoetin koji se nalazi u prirodi, upotrebljen zaex- vivoprimene, ili za lečenje ćelija responzivnih na eritropoetin kao što su ćelije iz nerava, retine, mišića, srca, pluća, jetre, bubrega, tankog creva, adrenalne kore, adrenalne moždine, kapilarnog endotelijala, testisa, jajnika, pankreasa ili endometrialnih ćelija ili tkiva, u ovom izumu je predviđena farmaceutska smeša u obliku pojedinačne doze prilagođena za zaštitu ili povećavanje ćelija responzivnih na eritropoetin, tkiva ili organe distalno od vaskulatomog sistema koja sadrži, u pojedinačnoj dozi, efikasnu netoksičnu količinu u opsegu od oko 50,000 do 500,000 U, 60,000 do 500,000 U, 70,000 do 500,000 U, 80,000 do 500,000 U, 90,000 do 500,000 U, 100,000 do 500,000 U, 150,000 do 500,000 U, 200,000 do 500,000 U, 250,000 do 500,000 U, 300,000 do 500,000 U, 350,000 do 500,000 U, 400,000 do 500,000 U, ili 450,000 do 500,000 U eritropoetina modulatora aktivnosti eritropoetin receptora, ili modulatora eritropoetin-aktivisanog receptora i farmaceutski prihvatljivog nosioca Kod prioritetnog oblika izvođenja, efikasna netoksična količina eirtropoetina kreće se u opsegu od oko 50,000 do 500,000 U. Kod prioritetnog oblika izvođenja, eritropoetin iz napred pomenute smeše nije eritropoetinski.

U sledećem aspektu ovog izuma, pronađeno je da apliciranje eritropoetina obnavlja funkciju spoznaje kod životinja koje su pretrpele traumu mozga Posle zakašnjenja od 5 ili 30 dana apliciranjem eritropoetina bilo je još uvek moguće obnoviti fukciju u poređenju sa prividno lečenim životinjama što ukazuje na sposobnost eritropoetina da regenenše ili obnovi aktivnost mozga Na ovaj način, izum se odnosi na primenu eritropoetina za dobijanje farmaceutske smeše za lečenje trauma mozga i drugih disfunkcija spoznaje, uključujući lečenje dugo vremena posle povrede (npr., tri dana pet dana nedelju dana mesec dana ili duže). Izum se takođe odnosi na postupak za lečenje disfunkcije spoznaje koja prati povredu pomoću apliciranja efikasne količine eritropoetina Za ovaj aspekt izuma može se primeniti svaki eritropoetin koji je ovde opisan.

Osim toga, ovaj aspekt izuma koji omogućava obnavljanje, odnosi se na primenu ma kog od eritropoetina iz ovog izuma za spravljanje farmaceutske smeše za obnavljanje disfunkcije ćelije tkiva ili organa kada se lečenje započinje posle i mnogo vremena posle dešavanja prvobitne povrede, koja je odgovorna zadisfukciju. Šta više, lečenje primenom eritropoetina iz ovog izuma može obuhvatiti tok bolesti ili stanja za vreme trajanja akutne faze, kao i hronične faze.

U slučaju kada eritropoetin iz ovog izuma ima eritropoetinsku aktivnost, kod prioritetnog oblika izvođenja, eritropoetin se može aplicirati sistemski u dozama između oko 300 i oko 10,000 U/kg telesne težine, poželjno je oko 500 do 5,000 U/kg telesne težine, a najpoželjnije je oko 1,000 U/kg telesne težine prilikom jednog apliciranja Ova efektivna doza trebalo bi da bude dovoljna da se postignu serumski nivoi eritropoetina veći od oko 10,000,15,000, ili 20,000 mU/ml seruma posle apliciranja eritropoetina Takvi serumski nivoi mogu se postići nakon oko 1,2,3,4,5,6,7,8,9, ili 10 sati posle apliciranja. Takve doze se mogu po potrebi ponavljati. Na primer, apliciranje može da se ponavlja dnevno, toliko dugo koliko je klinički neophodno, ili posle pogodnog vremenskog intervala, npr., od 1 do 12 nedelja poželjno od

1 do 3 nedelje. Kod jednog oblika izvođenja efikasna količina eritropoetina i farmaceutski prihvatljivog nosioca može se pakovati kao pojedinačna doza u bočicu ili u drugu posudu. Kod drugog oblika izvođenja eritropoetin koji je koristan za ovde navedene svrhe nije eritropoetinski, tj., on je sposoban da ispolji ovde opisane aktivnosti, ali nije u stanju da izazove povećanje koncentracije hemoglobina ili hematokrita Takav oblik eritropoetina koji nije eritropoetinski poželjan je u slučajevima kada se namerava da se postupci iz ovog izuma primenjuju hronično. Kod drugog oblika izvođenja daje se eritropoetin u dozi većoj od neophodne da bi se maksimalno stimulisala etritropoeza Kao što je napred navedeno, eritropoetin iz ovog izuma nema obavezno eritropoetinsku aktivnost i stoga navedena doza izražena u hematopoietinskim jedinicama samo pretstavlja primer za eritropoetine koji su eritropoetinski; u tekstu napred dati su molami ekvivalenti za doze koje se primenjuju za svaki eritropoetin

Ovaj izum se dalje odnosi na postupak za ubrzavanje transporta molekula preko endotelijalne ćelijske barijere kod sisara putem apliciranja smeše koja se sastoji od određenog molekula u asocijaciji sa eritropoetinom kao što ovde napred opisano. Kao što je napred opisano, čvrste veze između endotelijalnih ćelija u određenim organima u telu stvaraju barijeru za ulaz određenih molekula. Za lečenje različitih stanja u organu sa barijerom, poželjna su sredstva za ubrzavanje prolaza farmaceutskih agenasa Eritropoetin iz ovog izuma je koristan kao nosioc za prenošenje drugih molekula preko membrane krv-mozak i drugih sličnih membrana. Pripremljena je smeša koja sadrži molekul koji treba da pređe barijeru sa eritropoetinom i perifernim apliciranjem smeše postiže se transcitoza smeše preko barijere. Asocijacija između molekula koji treba da se transportuje preko barijere i eritropoetina može biti labilna kovalentna veza u kom slučaju se molekul oslobađa iz asocijacije sa eritropoetinom nakon prelaska barijere. Ako se željena farmakološka aktivnost molekula održi ili ostane nepromenjena u asocijaciji sa eritropoetinom, takav kompleks se može aplicirati.

Stručnjaku iz ove oblasti biće poznati različiti načini za asocijaciju molekula sa eritropoetinom iz ovog izuma i ostalim napred opisanim sredstvima pomoću kovalentnog, nekovalentnog, i drugim načinima; šta više, procena efikasnosti smeše se može brzo odrediti u eksperimentalnom sistemu. Asocijacija molekula sa eritropoetinom može se postići na različite načine, uključujući labilno, kovalentno vezivanje, formiranje ukrštenih veza, itd. Mogu se koristiti uzajamna dejstva biotin/avidin. Kao što je napred pomenuto, hibridni molekul se može dobiti pomoću rekombinantnih ili sintetičkih načina, na primer, takav koji sadrži i domen molekula sa željenom farmakološkom aktivnošću i domen koji je odgovoran za modulaciju aktivnosti eritropoetin receptora

Molekul može biti konjugovan sa eritropoetinom posredstvom polifunkcionalnog molekula tj., polifunkcionalnog reagensa za ukršteno vezivanje. Kao što se ovde koristi, izraz

"polifunkcionalni molekul" obuhvata molekule sajednom funkcionalnom grupom koja može da reaguje uzastopno više puta, kao što je formaldehid, a takođe i molekule koji imaju više od jedne reaktivne grupe. Kao što se ovde koristi, izraz "reaktivna grupa" odnosi se na funkcionalnu grupu kod reagensa za ukršteno vezivanje koja reaguje sa funkcionalnom grupom na molekulu( npr.,

peptida proteina ugljenog hidrata nukleinske kiseline, naročito hormona antibiotika ili sredstva protiv kancera koje treba da se prenese preko endotelijalne ćelijske barijere) tako da se formira kovalentna veza između reagensa za ukršteno vezivanje i tog molekula Izraz "funkcionalna grupa" zadržava svoje standardno značenje u organskoj herniji. Polifunkcionalni molekuli koji se mogu koristiti su prioritetno biokompatibilni reagensi za vezivanje, tj., oni koji ne izazivaju kancer, netoksični su i zaista su neimunogeniin vivo.Polifunkcionalni reagensi za ukršteno vezivanje, koji su poznati u stanju tehnike i opisani ovde, mogu se lako ispitati na životinjskim modelima radi određivanja njihove biokompaitbilnosti. Polifunkcionalni molekul je prioritetno bifunkcionalan. Kao što se ovde koristi, izraz "bifunkcionalni molekul" odnosi se na molekul sadve reaktivne grupe. Bi funkcionalni molekul može biti heterobifunkcionalan ili homobifunkcionalan. Hetrobifunkcionalni reagens za ukršteno vezivanje omogućava vektorsku konjugaciju. Za polifunkcionalni molekul naročito je poželjno da bude dovoljno rastvorljiv u

vodi da bi se reakcija ukrštenog vezivanja mogla da se odvija u vodenim rastvorima, kao što su vodeni rastvori sa puferom podešeni na pH 6 do 8, a za dobijeno konjugovano jedinjenje poželjno je da ostane rastvorljivo u vodi u cilju efikasnije bio-distribucije. Tipično, polifunkcionalni molekul se vezuje kovalentnim vezama sa amino ili sulfhidril funkcionalnom grupom. Međutim, polifunkcionalni molekuli koji reaguju sa drugim funkcionalnim grupama, kao što su karboksilne grupe kiselina ili hidroksilne grupe, ispitani su u ovom izumu.

Homobifunkcionalni molekuli imaju najmanje dve reaktivne funkcionalne grupe, koje su iste. Reaktivne funkcionalne grupe na homobifunkcionalnom molekulu uključuju, na primer, aldehiđne grupe i aktivne estarske grupe. Homobifunkcionalni molekuli sa aldehidnim grupama uključuju, na primer, glutaraldehid i subaraldehid. Primena glutaraldehida kao reagensa za ukršteno vezivanje otkrivena je od strane autora Poznanskv i dr., Science 223,1304-1306

(1984). Homobifunkcionalni molekuli koji imaju najmanje dve aktivne estarske jedinice uključuju estre dikarboksilnih kiselina i N-hidroksisukcinimida. Izvesni primeri takvih N-sukcinimidil estara uključuju disukcinimidil suberat (so plutne kiseline, prim.prev.) i ditio-bis-(sukcinimidil propionat), i njihovu rastvorljivu bis-sulfonsku kiselinu i rastvorljive soli bis-sulfonate, kao što su njihove soli natrijuma i kalijuma. Ovi homobifunkcionalni reagensi mogu se nabaviti od firme Pierce, Rockford, Illinois.

Heterobifunkcionalni molekuli imaju najmanje dve različite raktivne grupe. Reaktivne grupe reaguju sa različitim fukcionalnim grupama, npr., koje su prisutne na eritropoetinu i molekulu. Ove dve različite funkcionalne grupe koje reaguju sa reaktivnom grupom na heterobifunkcionalnom reagensu za ukršteno vezivanje obično su amino grupe, npr., peta amino grupa iz lizina; sulfhidrilna grupa, npr, tiolna grupa iz cisteina; karboksilna kiselina, npr., karboksilat na asparaginskoj kiselini; ili hidroksilna grupa, npr., hidroksilna grupa na serinu.

Naravno, različiti molekuli eritropoetina iz ovog izuma nemaju uvek odgovarajuće reaktivne grupe pristupačne za primenu sa određenim reagensom za ukršteno vezivanje, međutim, stručnjaku iz ove oblasti je dobro poznat izbor ovih reagenasa koji se zasniva na raspoloživim grupama za ukršteno vezivanje kod eritropoetina iz ovog izuma

Kada reaktivna grupa iz heterobifunkcionalnog molekula formira kovalentnu vezu sa amino grupom, ta kovalentna veza je obično amido ili imido veza Reaktivna grupa koja formira kovalentnu vezu sa amino grupom može biti, na primer, aktivisana karboksilna grupa, halokarbonilna grupa ili estarska grupa. Poželjna halokarbonilna grupa je hlorokarbonil grupa Poželjne estarske grupe su reaktivne estarske grupe kao što je, na primer, grupa N-hidroksi-sukcinimid estra

Druga tipična funkcionalna grupa je ili tiol grupa grupa koja može da se pretvori u tiol grupu ili grupa koja formira kovalentnu vezu sa tiol grupom. Kovalentna veza je obično veza tioetra ili disulfida Reaktivna grupa koja formira kovalentnu vezu sa tiol grupom može biti, na primer, dvostruka veza koja reaguje sa tiol grupama ili aktiviranim disulfidom. Takva reaktivna grupa koja sadrži dvostruku vezu sposobnu da reaguje sa tiol grupom je maleimido grupa iako su moguće i druge, kao što je akrilonitrilna grupa Reaktivna disulfidna grupa može biti, na primer, 2-piridilditio grupa ili 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoeva kiselina) grupa Izvesni primeri za heterobifunkcionalne reagense koji sadrže reaktivne disulfidne veze uključuju N-sukcinimidil 3-(2-piridil-ditio)propionat (Carlsson, i dr, 1978, Biochem J., 173:723-737), natrijum S-4-sukcinimidiloksikarbonil-afa-metilbenziItiosulfat, i 4-sukcirurnidiloksikarbonil-alfa-metil-(2-piridilditio)toluen. Poželjan je N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat Neki primeri za heterobifunkcionalne reagense koji sadrže reaktivne grupe sa dvostrukom vezom koja reaguje sa tiol grupom uključuju sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-l-karboksilat i sukcinimidil m-maleimidobenzoat. Ostali heterobifunkcionalni molekuli uključuju sukcinimidil 3-(maleimido)propionat, sulfosukcinimidil 4-(p-maleimido-fenil)butirat, sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil-cikloheksan)-l-karboksilat, maleimidobenzoil-N-hidroksi-sukcinimid estar. Poželjno je da se koristi so natrijum sulfonat sukcinimidil m-maleimidobenzoata Mnogi od napred pomenutih heterobifunkcionalnih reagenasa i njihovih soli sulfonata mogu se nabaviti kod firme Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois USA.

Stručnjaci iz ove oblasti lako mogu da odluče da li je potrebno da konjugovana jedinjenja budu reverzibilna ili labilna. Konjugovana jedinjenja se mogu ispitati in vitro na eritropoetin, i na željenu farmakološku aktivnost. Ako konjugovano jedinjenje zadržava obe osobine, njegova prikladnost se tada može ispitatiin vivo.Ako konjugovano jedinjenje zahteva odvajanje od eritropoetina zbog aktivnosti, tada je poželjna labilna veza ili reverzibilna veza sa eritropoetinom. Labilne karakteristike mogu se takođe ispitati primenom standardnih postupaka in vitro pre nego što se uradi ispitivanjein vivo.

Dodatne informacije o tome kako se prave ili primenjuju ovi kao i drugi polifunkcionalni reagensi, mogu se dobiti iz sledećih publikacija ili drugih raspoloživih radova iz ove oblasti:

Carlsson, J. i dr., 1978, Biochem. J. 173:723-737.

Cumber, J.A. i dr., 1985, Methods in Enzymology 112:207-224.

Jue, R. i dr., 1978, Biochem 17:5399-5405.

Sun,T.T. i dr., 1974, Biochem. 13:2334-2340.

Blattler, W.A. i dr., 1985, Biochem. 24:1517-152.

Liu, F.T. i dr., 1979, Biochem. 18:690-697.

YouIe, RJ. i Neville, D M. Jr., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:5483-5486. Lemer, RA. i dr., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3403-3407.

Jung, S.M. i Moroi, M., 1983, Biochem. Biophvs. Acta 761:162. Caulfield, M.P. i dr., 1984, Biochem. 81:7772-7776.

Staros, J.V., 1982, Biochem. 21:3950-3955.

Yoshitake, S i dr., 1979, Eur. J. Biochem. 101:395-399.

Yoshitake, S. i dr., 1982, J. Biochem. 92:1413-1424.

Pilch, P.F. i Czech, M.P., 1979, J. Biol. Chem. 254:3375-3381.

Novick, D. i dr., 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487.

Lomant, AJ. i Fairbanks, G., 1976, J. Mol. Biol. 104:243-261.

Hamada, H. i Tsumo, T., 1987, Anal. Biochem. 160:483^88.

Hashida, S. i dr., 1984, J. Applied Biochem. 6:56-63.

Uz to, postupci za ukršteno vezivanje su dati u pregledu autora Means i Feenev, 1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12.

Barijere koje se prelaze pomoću postupaka opisanih u tekstu i smeša iz ovog izuma, obuhvataju ali nisu ograničene na, barijeru krv-mozak, barijeru krv-oko, barijeru krv-testisi, barijeru krv-jajnici i barijeru krv-materica

Molekuli koji su kandidati za transport preko endotelijalne ćelijske barijere uključuju, na primer, hormone kao što je hormon rasta, neurotrofične faktore, antibiotike ili antifungale kao oni koji su normalno isključeni iz mozga i drugih organa sa barijerama, peptidne farmaceutske preparate za zračenje, antisens lekove, antitela protiv biološki aktivnih sredstava, farmaceutske preparate i sredstva protiv raka. Neograničavajući primeri takvih molekula uključuju hormon rasta, nervni faktor rasta (NGF), moždani neutrofični faktor (BDNF), cilijami neurotrofični faktor (CNTF), fibroblastični faktor rasta (bFGF), transformišući faktor rasta pi (TGFpi), transformišući faktor rasta P2 (TGFP2), transformišući faktor rasta P3 (TGFP3), interleukin 1, interleukin 2, interleukin 3, i interleukin 6, AZT, antitela protiv faktora nekroze tumora i imunosupresivne agense kao što je ciklosporin.

Ovaj izum se odnosi takođe na smešu koja sadrži molekul koji treba da se transportuje pomoću transcitoze preko endotelijalne ćelijske barijere sa čvrstom vezom i eritropoetina, kao što je napred opisano. Izum se dalje odnosi na primenu jedinjenja konjugovanih između molekula i eritropoetina kao stoje napred opisano, za dobijanje farmaceutske smeše za prenošenje molekula preko barijere, kao što je napred opisano.

Ovaj izum se može bolje razumeti obzirom na sledeće neograničavajuće primere, koji su dati kao egzemplar izuma Sledeći primeri su dati po redu kako bi se potpunije ilustrovali prioritetni oblici izvođenja ovog izuma Oni, međutim, ni na koji način ne bi trebalo da budu protumačeni kao ograničavajući za široki spektar ovog izuma

Primer 1

ERITROPOETIN PRELAZI ČVRSTU BARIJERU KRV-CEREBROSPINALNA TEČNOST

Odraslim mužjacima pacova vrste Sprague-Dawley data je anestezija i apliciran im je rekombinantni humani eritropoetin intraperitonealno. Uzorci cerebrospinalne tečnosti (CSF) su uzimani iz cisterne magna u intervalima od po 30 minuta u toku 4 sata i koncentracija eritropoetina određivana je pomoću osetljivog i specifičnog imunoenzimskog testa Kao što je ilustrovano uslici 1,početna koncentracija eritropoetina u CSF je 8 mU/ml. Posle odlaganja od nekoliko sati, nivoi eritropoetina mereni u CSF počeli su da rastu i u toku 2.5 sata i kasnije znatno su se razlikovali od početne koncentracije na p < 0.01 nivoa Najveći nivo od oko 100 mU/ml nalazi se u opsegu za koji je poznato da ispoljava zaštitne efekte in vitro (0.1 to 100 mU/ml). Vreme za postizanje najvećeg nivoa iznosi oko 3.5 sata, što je značajno kašnjenje u odnosu na najveće nivoe seruma (manje od 1 sata). Rezultati ovog eksperimenta ilustruju da značajni nivoi eritropoetina mogu da se prenesu preko čvrste ćelijske veze putem parenteralnog apliciranja eritropoetina u obliku velike pilule u odgovarajućim koncentracijama.

Primer 2

ODRŽAVANJE FUNKCIJE SRCA PRIPREMLJENOG ZA TRANSPLANTACIJU

Mužjacima pacova vrste Wistar težine 300 do 330g davanje eritropoetin (5000 U/kg telesne težine) ili prenosioc 24 sata pre uklanjanja srca za ex vivo ispitivanja koja su rađena prema protokolu autora Delcavre i dr., 1992, Amer. J. Phvsiol. 263:H1537-45. Životinje su žrtvovane sa pentobarbitalom (0.3mL), i intravenozno im je apliciran heparin (0.2mL). Srca su u početku ostavljena da se uravnoteže u toku 15 min. Balon leve komore je potom naduvan do zapremine koja daje krajnji dijastolni pritisak od 8 mm Hg. Kriva zavisnosti pritisak-zapremina u levoj komori, konstruisanaje putem povećanog naduvavanja zapremine balona u alikvotnim delovima od 0.02 ml. Nulta zapremina je definisana kao tačka na kojoj je krajnji dijastolni pritisak u levoj komori bio jednak nuli. Po završavanju krive zavisnosti pritisak-zapremina, balon leve komore je izduvan da bi se krajnji dijastolni pritisak vratio na 8mmHg i kontrolni period je produžen za 15 min, posle provere koronarne tečnosti. Tada je srce zaustavljeno sa 50 mL Celsior + molekul da miruje na 4°C pod pritiskom od 60cm H20. Srce je zatim uklonjeno i čuvano u toku 5 sati na 4°C u plastičnoj posudi napunjenoj istim rastvorom i opkoljenoj istucanim ledom

Po završetku čuvanja, srce je preneto u Langendorff-ov aparat. Balonski kateter je ponovo stavljen u levu komoru i ponovo naduvan na istu zapreminu koja je bila u periodu pre ishemije. Srce je ponovo podvrgnuto perfuziji u toku najmanje 2 sata na 37°C. Pritisak je podešen na 50cm H2O u toku 15min ponovnog toka, a zatim opet na lOOcm H2O u toku sledećih 2 sata. Ponovo je uspostavljena veštačka stimulacija srca (320 otkucaja u minutu). Izovolumetrijska merenja kontrakcionih indeksa i dijastolnog pritiska su uzimana u tri primerka na 25,45,60,120 minuta od početka ponovne perfuzije. U to vreme su urađene krive zavisnosti najvećih vrednosti za pritisak i zapreminu i sakupljena je koronarna tečnost u toku 45min ponovne perfuzije, da bi se odredilo isticanje kreatinin kinaze. Upoređene su dve tretirane grupe primenom neparnog t-testa, a linearna regresija koja koristi podatke za krajnji dijastolni pritisak upotrebljenaje za određivanje krivih saglasnosti. Kako je pokazano u slici 2 dogodilo se značajno poboljšanje pritiska u levoj komori posle lečenjasa eritropoetinom, kao

i poboljšanje krive zapremina-pritisak i smanjeno isticanje kreatin kinaze.

Primer 3

ERITROPOETIN ŠTITI MIOKARD OD ISHEMIJSKE POVREDE.

Odraslim mužjacima pacova dat je rekombinantni humani eritropoetin (5000 U/kg telesne težine) 24 sata pre nego što su anestezirani i pripremljeni za okluziju koronarne arterije. Na početku postupka data je dodatna doza eritropoetina i urađena je okluzija leve glavne koronarne arterije u toku 30 minuta i potom je oslobođena. Ista doza eritropoetina je davana dnevno u toku jedne nedelje posle okluzije. Zatim je kod životinja ispitivana srčana funkcija. Kako pokazujeslika3, životinje koje su primile lažnu injekciju (fiziološki rastvor) pokazale su veliko povećanje levog krajnjeg dijastolnog pritiska, koji je indikativan za prošireno, ukočeno srce koje je sekundarno kod miokardinalne infarkcije. Za razliku, životinje koje su primale eritropoetin nisu pretpele opadanje srčane funkcije u poređenju sa šam kontrolom (razlika je značajna pri p < 0.01 nivoa).

Primer 4

MOLEKULI ERITROPOETINA

Nativni eritropoetin može biti modifikovan kako bi se njegove aktivnosti prilagodile za specifično tkivo ili tkiva. Nekoliko neograničavajućih strategija koje se mogu sprovesti da bi se postigla željena specifičnost tkiva, uključuju modifikacije koje uklanjaju ili modifikuju glikozilovane delove, od kojih eritropoetin ima tri sa N-vezom ijednu sa O-vezom. Takve varijante glikozilovanog eritropoetina mogu se proizvesti na više načina. Na primer, sijalinske kiseline koje se nalaze na krajevima lanaca šećera mogu se ukloniti pomoću specifičnih sijalidaza u zavisnosti od hemijske veze kojom je sijalinska kiselina vezana za lanac šećera Alternativno, glikozilovane strukture mogu se razdvojiti na različite načine primenom drugih enzima koji cepaju specifične veze. Da bi se ovi principi potvrdili, rekombinantni humani eritropoetin je bio desijalizovan primenom Sialidase A (Prozvme Inc.) u skladu sa protokolom proizvođača. Potvrđena je uspešna hemijska modifikacija propuštanjem proizvoda reakcije kroz SDS poliakrilamidni gel i bojenjem dobijenih traka koje su pokazale da hemijski modifikovani eritropoetin poseduje prividnu molekulsku težinu od~31 kD kao što je očekivano, u poređenju sa nemodifikovanim eritropoetinom koji je imao -34 kD i merenjem zaostalih ostataka sijalinske kiseline za koje je hemijskim načinima utvrđeno da iznose < 0.1 mol/ molu eirtropoetina

Kod druge modifikacije, u kojoj su modifikovani ostaci amino kiseline iz eritropoetina modifikovani su ostaci arginina primenom fenilglioksala u skladu sa protokolom autora Takahashi (1977, J. Biochem. 81:395-402), a modifikacija je izvođena u različitim vremenskim periodima u trajanju 0.5 do 3 sata na sobnoj temperaturi. Reakcija je završena dijalizom reakcione smeše u vodi. Primena takvih modifikovanih oblika eritropoetina obuhvaćena je u ovom izumu u potpunosti.

Asijaloeirtropoetin i fenilglioksaleritropoetin bili su isto tako efikasni kao i nativni entropoetin za nervne ćelije in vitro kao što je pokazano na slikama 4-6. Ispitivanje in vitro urađeno je primenom embrionalnih ćelija karcinoma (P19) koje su slične nervnim ćelijama koje izdržavaju aptozu posle izdvajanja seruma. Dvadeset četiri sata pre uklanjanja seruma, u kulture je dodato 1-1000 ng/ml eritropoetina ili modifikovanog eritropoetina Sledećeg dana medijum je uklonjen, ćelije su isprane sa svežim medijumom koji ne sadrži serum, a medijum koji sadrži supstance za test (bez seruma) dodat je ponovo u kulture za sledećih 48 sati. Radi određivanja broja ćelija sposobnih za život urađena je analiza redukcije tetrazolijuma

(CellTiter 96; Promega Inc.). Kako pokazuju slike 4-5, asijaloeritropoetin ispoljava istu moć kao i sam eritropoetin za sprečavanje ćelijske smrti. Eritropoetin modifikovan fenilglioksalom ispitivanje analizom P19 ćelije koje su slične nervnim ćelijama, kao što je napred opisano. Kako pokazuje slika 6, ovaj hemijski modifikovan eritropoetin u potpunosti je sačuvao svoje dejstvo na zaštitu nervnih ćelija.

Zadržavanje aktivnosti zaštite nervnih ćelija in vivo potvrđeno je primenom modela za fokalnu ishemiju kod pacova kod koga se reverzibilna lezija u oblasti srednje cerebralne arterije izvodi kao što je prethodno opisano (Brines i dr, 2000, Proc. Nat. Acad. Sd. U.S. A. 97:10526-31). Odraslim mužjacima pacova vrste Sprague-Dawley apliciranje asijaloeritropoetin ili eritropoetin (5000 U/kg telesne težine intraperitonealno) ili prenosioc na početku arterijalne okluzije. Životinje su žrtvovane dvadeset četiri sata kasnije i njihovi mozgovi su odvojeni za ispitivanje. Isečeni su serijski preseci i obojeni tetrazolijumovim solima u cilju identifikovanja živih delova mozga Kao što je pokazano na slici 7, asijaloeritropoetin je bio isto tako uspešan kao i nativni eritropoetin u pružanju zaštite nervnim ćelijama od jednočasovne ishemije. Slika 8 pokazuje rezultate drugog modela fokalne ishemije u kome je urađen odgovor komparativne doze sa eritropoetinom i asijaloeritropoetinom. Sa najmanjom dozom od 250 U/kg, asijaloeritropoetin je pružao zaštitu, dok međutim nemodifikovani eritropoetin nije pružao zaštitu.

Primer 5

MODIFIKACIJA PRIMARNE STRUKTURE ERITROPOETINA I

SPOSOBNOST ZA ZAŠTITU NERVNIH ĆELIJA

Opisan je veći broj mutantnih molekula eritropoetina koji se ne vezuju za eritrocitni eritropoetin receptor i tako ne podržavaju eritropoezu in vivo ili in vitro. Neki od ovih molekula će pored svega toga imitirati dejstva samog eritropoetina u drugim tkivima ili organima. Na primer, 17-mer koji sadrži sekvence amino kiseline od 31-47 nativnog eritropoetina je neaktivan za eritropoezu, ali je potpuno aktivan za nervne ćelije in vitro (Campana & O'Brien, 1998: Int. J. Mol. Med. 1:235-41).

Derivati eritropoetina koji su poželjni za ovde opisane primene mogu se proizvesti putem kvanidinovanja, amidinovanja, trinitrofenilovanja, acetilovanja, sukcinilovanja, nitrovanja, ili modifikovanjem ostataka arginina ili karboksilnih grupa, koji su napred pomenuti u tekstu između ostalih postupaka, za dobijanje eritropoetina koji zadržavaju svoju aktivnost za specifične organe i tkiva, ali ne i za ostale, kao što su eritrociti. Kada se eritropoetin podvrgne navedenim reakcijama nađeno je da dobijenom molekulu uopšte nedostaje kako in vivo tako i in vitro eritropoetinska aktivnost (npr., Satake i dr; 1990, Biochim. Biophvs. Acta 1038:125-9). U daljem tekstu su opisani neki primeri za dobijanje modifikovanih eritropoetina

Biotinilovanje slobodnih amino grupa iz eritropoetina. 0.2 mg D-biotinoil-e-aminokaprinska kiselina-N-hidroksisukcinimid estar (Boehringer Mannheim #1418165) rastvoren je u 100 ml DMSO. Ovaj rastvor je pomešan sa 400 ml PBS koji je sadržao aproksimativno 0.2 mg eritropoetina u cevi pokrivenoj folijom. Posle inkubacije u toku 4 sata na sobnoj temperaturi, nereagovali biotin je odvojen pomoću filtracije gelom na koloni Centricon 10 . Kao što je pokazano naslici 10,ovaj biotinilovan eritropoetin štiti P 19 ćelije od izdvajanja seruma.

U naučnom radu pod nazivom "Biotinilovani rekombinantni humani eritropoetini: bioaktivnost i korist kao receptomi ligand" od autora Wojchowski i dr., Blood, 1989, 74(3):952-8, autori primenjuju tri različita postupka biotinilovanja eritropoetina. Biotin je dodat u (1) delove sa sijalinskom kiselinom (2) karboksilne grupe(3) i amino grupe (3). Autori koriste analizu razmnožavanja ćelija slezine kod miša da pokažu da (1) dodavanje biotina u delove sa sijalinskom kiselinom ne sprečava biološku aktivnost eritropoetina (2) dodavanje biotina u karboksilne grupe dovodi do znatne biološke neaktivnosti eritropoetina (3) dodavanje biotina u amino grupe ima za rezultat potpunu biološku neaktivnost eritropoetina. Ovi postupci i modifikacije su ovde u potpunosti obuhvaćeni.Slika9 pokazuje aktivnost biotinilovanog eritropoetina i asijaloeritropoetina u analizi sa serumski izgladnjivanim P19 ćelijama.

Jodiranje eritropoetina. Postupak 1 - Zrnca joda.. Jedno zrnce joda (Pierce, Rockford, II) držano je u inkubaciji u 100 ul PBS (20mM natrijum fosfata, 0.15M NaCl, pH7.5) sa sadržajem 1 mCi slobodnog Na<125>J u toku 5. minuta. Tada je u smešu dodato 100 ug eritropoetina u 100 ul PBS. Posle inkubacionog perioda od deset minuta na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena uklanjanjem 200ul rastvora iz posude za reakciju (ostavljajući zrnce joda unutra). Višak joda je uklonjen putem filtracije gelom na koloni Centricon 10. Kao što je pokazanona slici 11, jodo-eirtropoetinproizveden na ovaj način uspešno štiti P19 ćelije od izdvajanja seruma

Postupak 2 - Hloramin T. 100 ug eritropoetina u 100 ul PBS dodato je u 500 u Ci Nal25Jizajedno je mešano u ependorf cevi. Tada je dodato 25 ul hloramina T (2 mg/ml) i smeša je držana u inkubaciji u toku 1 minuta na sobnoj temperaturi. Dodato je zatim 50 ul rastvora pufera (2.4 mg/ml natrijum metabisulfit, 10 mg/ml tirozin, 10% glicerin, 0.1% ksilen u PBS), za zaustavljanje hloramina T. Jodotirozin i jodirani eritropoetin zatim su odvojeni putem filtracije gelom na koloni Centricon 10

Modifikacije lizina: karbamilovanje: eritropoetin (lOOug) je modifikovan sa kalijum cijanatom kao što je opisano kod autora Plapp i dr., ("Aktivnost deoksiribonukleaze A iz pankreasa govečeta sa modifikovanim amino grupama" 1971, J. Biol. Chem. 246, 939-845).

Trinitrofenilovanje: eritropoetin (100 ug) modifikovan je sa 2,4,6-trinitrobenzensulfonatom kao što je opisano kod autora Plapp i dr., ("Aktivnost deoksiribonukleaze A iz pankreasa govečeta sa modifikovanim amino grupama" 1971, J. Biol. Chem. 246, 939-845).

Acetilovanje: eritropoetin (100 ug) podvrgnut je inkubaciji u 0.3M fosfatnom pufemom rastvoru (pH7.2) koji sadrži istu količinu anhidrida sirćetne kiseline na 0 °C u toku 1 sata. Reakcija je zaustavljena pomoću dijalize u destilovanoj vodi.

Sukcinilovanje: eritropoetin (100 ug) u 0.5 M NaHC03 (pH 8.0) podvrgnut ie

inkubaciji sa 15 molarnim viškom anhidrida ćilibarne kiseline na temperaturi od 15 °C u toku 1 sata. Reakcija je zaustavljena pomoću dijalize u destilovanoj vodi.

Modifikacije arginina: eritropoetin je modifikovan sa 2,3 butandionom kao što je opisano u radu autora Riordan ("Funkcionalni arginil ostaci u karboksipeptidazi A. Modifikacija sa butandionom" Riordan JF, Biochemistrv 1973, 12(20): 3915-3923).

Eritropoetin je modifikovan sa cikloheksanonom kao u radu autora Patthy i dr., ("Identifikacija funkcionalnih ostataka arginina kod ribonukleaze A i lizozima" Patthy,L, Smith EL, J. Biol. Chem 1975 250(2): 565-9).

Eritropoetin je modifikovan sa fenilglioksalom kao što je opisano u radu autora Werber i dr., ("Izveštaji: Karboksipeptidaza B: modifikacija funkcionalnih arginil ostataka" Werber, MM, Sokolovsky M IsrJMedSci 1975 11(11): 1169-70).

Modifikacije tirozina: eritropoetin (100 ug) podvrgnut je inkubaciji sa tetranitrometanom kao što je prethodno opisano kod autora Nestler i dr., u radu "Stimulacija steroidogeneze iz jajne ćelije pacova pomoću lipoproteina velike gustine modifikovanih sa tetranitrometanom" Nestler JE, Chacko GK, Strauss JF 3rd. J Biol Chem 1985 Jun 25;260(12):7316-21).

Modifikacije glutaminske kiseline (i asparaginske kiseline) : U cilju modifikovanja karboksilnih grupa, eritropoetin (100 ug) je podvrgnut inkubaciji sa 0.02 M EDC u IM glicinamidu na pH 4.5 na sobnoj temperaturi u toku 60 minuta kao što je opisano kod autora Carravvav i dr., u radu "Modifikacija karboksilne grupe kod himotripsina i himotripsinogena" Carraway KL, Spoerl P, Koshland DE Jr. J Mol Biol 1969 May 28;42(l):133-7.

Modifikacije ostataka triptofana: eritropoetin (100 ug) je podvrgnut inkubaciji sa 20 uM n-bromosukcinimida u 20 mM pufemog rastvora kalijum fosfata(pH 6.5) na sobnoj temperaturi kao što je opisano kod autora Ali i dr., J Biol Chem. 1995 Mar3;270(9):4570-4. Broj oksidisanih ostataka triptofana određenje pomoću metode opisane u radu autora Korotchkina (Korotchkina, LG i dr., Protein Expr Purif. 1995 Feb;6(l):79-90).

Uklanjanje amino grupa: u cilju uklanjanja amino grupa eritropoetin (100 ug) je podvrgnut inkubaciji u rastvoru PBS (pH 7.4) koji sadrži 20mM ninhidrina (Pierce Chemical, Rockford, II), na temperaturi od 37 °C u toku dva sata kao što je opisano u radu autora Kokkini i dr., (Kokkini, G., i dr., "Modifikacija hemoglobina pomoću ninhidrina" Blood, Vol. 556, No 4 1980: 701-705). Redukcija dobijenog aldehida izvršena je reagovanjem proizvoda sa natrijum borhidridom ili litijum aluminijum hidridom Određeno, eritropoetin (100 ug) podvrgnut je inkubaciji sa 0. IM natrijum borhidridom u rastvoru PBS u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Redukcija je završena hlađenjem uzoraka ledom u toku 10 minuta i dijalizovanjem u rastvoru PBS, tri puta, preko noći. (Kokkini, G., Blood, Vol. 556, No 4 1980: 701-705). Redukcija sa litijum aluminijum hidridom urađenaje pomoću inkubacije eritropoetina (100 ug) sa 0.1 M litijum aluminijum hidridom u rastvori PBS u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Redukcija je završena hlađenjem uzoraka ledom u toku 10 minuta i dijalizovanjem u rastvoru PBS, tri puta, preko noći.

Disulfidna redukcija i stabilizacija: eritropoetin (100 ug) podvrgnut je inkubaciji sa 500 mM DTT u toku 15 minuta na 60 °C. Zatim je u smešu dodato 20 mM jodoacetamida u vodi i inkubacija je vršena u toku 25 minuta, na sobnoj temperaturi u tami.

Ograničena proteoliza: Eritropoetin može biti podvrgnut ograničenoj hemijskoj proteolizi koja pogađa specifične ostatke. Eritropoetin je reagovao sa 2-(2-nitrofenilsulfenil)-3-metil-3'-bromoindoleninom koji je specifičan reagens za odvajanje ostataka triptofana, u višku od 50-putau 50% sirćetnoj kiselini u toku 48 sati u tami na sobnoj temperaturi u cevima pod pritiskom azota. Reakcija je završena dodavanjem triptofana i odsoljavanjem.

Primer 6

ZAŠTITA OD RETINALNE ISHEMIJE PERIFERNO APLICIRANIM

ERITROPOETINOM.

Retinalne ćelije su veoma osetljive na ishemiju tako da mnoge od njih umiru nakon 30 minuta od ishemičnog stresa Zatim, subakutna ili hronična ishemija izražava pogoršavanje vida koje prati brojne zajedničke bolesti ljudi, takve kao stoje dijabetes melitus, glaukom i degeneracija makule. U današnje vreme ne postoji efikasna terapija koja može da zaštiti ćelije od ishemije. Između krvi i retine postoji čvrsta endotelijalna barijera koja isključuje najveći broj velikih molekula. Da bi se ispitalo da li će periferno apliciran eritropoetin zaštiti ćelije osetljive na ishemiju, korišćen je model reverzibilnog glaukoma kod pacova kao što je opisano kod autora Rosenbaum i dr, (1997; Vis. Res. 37:3443-51). Određeno, fiziološki rastvor je ubrizgavan u prednju komoru oka kod odraslog mužjaka pacova do veličine pritiska iznad sistemskog arterijskog pritiska i i takav pritisak je održavan u toku 60 minuta. Životinjama je apliciran fiziološki rastvor ili 5000 U eritropoetina/kg telesne težine intrapeirtonealno 24 sata pre indukcije ishemije, i to je produženo kao dnevna doza u toku 3 sledeće dana. Na pacovima adaptiranim na tamu urađena je elektroretinografija nedelju dana posle Itretiranja. Slike11i 12 pokazuju daje apliciranje eritropoetina uticalo da se u dobroj meri sačuva elektroretinogram (ERG) (Panel D), za razliku od životinja koje se primile samo fiziološki rastvor (Panel C), kod kojih je funkcija sačuvana u veoma maloj meri.Slika 11poredi elektroretinogram a- i b-talasnih amplituda za grupe životinja koje su primile eritropoetin i grupe koje su primile fiziološki rastvor, i pokazuje značajnu zaštitu koju pruža eritropoetin.

Primer7

OBNAVLJAJUĆI EFEKTI ERITROPOETINA NA SMANJENU FUNKCIJU

SPOZNAJE KOJA NASTAJE USLED POVREDE MOZGA

Kod ispitivanja sposobnosti eritropoetina da obnovi funkciju spoznaje kod miševa nakon povrede mozga, ženke miševa vrste Balb/c bile su izložene povredi mozga tupim predmetom kao što je opisano kod autora Brines i dr.,. PNAS 2000, 97; 10295-10672, i posle pet dana počelo je intrapeirtonealno dnevno apliciranje eritropoetina od 5000 U/kg telesne težine. Dvanaest dana posle povrede, kod životinja je ispitivana funkcija spoznaje u Morrisovom lavirintu sa vodom, četiri puta na dan. Iako su se obe grupe životinja, tretirane i one koje nisu bile tretirane na testu pokazale loše (sa vremenom plivanja od oko 80 sekundi od mogućih 90 sekundi),slika13 pokazuje da su se životinje koje su primale eritropoetin bolje ponašale (kod ovog ogleda negativna vrednost je bolja). Čak iako se početak lečenjasa eritropoetinom

odloži do 30 dana posle traume (slika 14), vidi se takođe obnavljanje funkcije spoznaje.

Primer 8

KAINATM MODEL

Kod kainatnog neurotoksičnog modela, u kome je asijaloeirtropoetin apliciran u skladu sa protokolom autoraBrines i dr.,. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000,97; 10295-10672 u dozi od 5000U/kg telesne težine koja je data intrapeirtonealno 24 sata pre apliciranja 25 mg/kg kainata, pokazalo se daje on isto tako efikasan kao i eritropoetin, kao što se vidi iz vrednosti vremena do smrti.(slika15).

Ovaj izum nije ograničen u obimu opisanih specifičnih oblika izvođenja koji su namenjeni samo za ilustraciju pojedinih aspekata ovog izuma, a i funkcionalno ekvivalentni postupci i komponente su u okviru ovog izuma. Stvarno različite modifikacije ovog izuma, uz one koje su ovde pokazane i opisane, biće očigledne stručnjacima iz ove oblasti na osnovu prethodnog opisa i pratećih crteža. Takve modifikacije se nalaze u obimu dodatnih patentnih zahteva..

Sve ovde citirane reference su preko navedenih podataka uključene u potpunosti za sve svrhe.

Claims (18)

1. Upotreba eritropoetina i farmaceutski prihvatljivog nosača za proizvodnju leka za zaštitu, održavanje, pospešivanje ili obnavljanje funkcije ili sposobnosti za život ćelije sisara responsivne na eritropoetin, tkiva koje sadrži ćelije responsivne na eritropoetin ili organa koji sadrži ćelije responsivne na eritropoetin, kod sisara koji ima, koji je imao, koji je u opasnosti od, ili prolazi kroz, multiplu sklerozu, moždani udar, povredu centralnog nervnog sistema, neuronalni gubitak, ishemiju, subarahnoidna krvarenja, aneurizmu, aneurizmalna krvarenja, zapaljenje, gubitak kognitivne funkcije u vezi sa starenjem, neurodegenerativnu bolest ili poremećaj, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, Hantingtonovu bolest, Tourette-ov sindrom, Leigh-ovu bolest, Guillan Barre-ovu bolest, demenciju, AIDS demenciju, senilnu demenciju, Lewy-jevu telesnu demenciju, gubitak memorije, amiotrofičnu lateralnu sklerozu, alkoholizam, neuropsihijatrijski ili neuropsihološki poremećaj, poremećaj raspoloženja, monopolarni afektivni poremećaj, depresiju, ozbiljan depresivni poremećaj, distimusni poremećaj, maniju, bipolarni afektivni poremećaj, poremećaj anksioznosti, anksioznost, shizofreniju, shizoafektivni poremećaj, opsesivno-kompulzivni poremećaj, poremećaj nedostatka pažnje, poremećaj hiperaktivnosti nedostatka pažnje, autizam, prionsku bolest kao što je Creutzfeldt-Jacob-ova bolest, Friedrich-ovu ataksiju, Wilson-ovu bolest, traumu, konkusivnu povredu, povredu mozga ili kičmene moždine, postoperativnu kognitivnu disfunkciju, postoperativno lečenje za embolijsku ili ishemijsku povredu, oštećenje tkiva oka, makularnu degeneraciju, dijabetsku neuropatiju, dijabetsku retinopatiju, glaukom, retinalnu ishemiju, retinalnu traumu, retinitis pigmentoza, oštećenje optičkog nerva, odvajanje retine, arteriosklerotičnu retinopatiju, hipertenzivnu retinopatiju, blokiranje retinalne arterije, blokiranje retinalne vene, gubitak kognitivne funkcije, subduralni hematom, distrofiju mišića, miotoničnu distrofiju ili panični poremećaj, naznačena time što je pomenuti eritropoetin karbamilovani eritropoetin, koji pomenuti karbamilovani eritropoetin ima (a) zaštitnu aktivnost za tkivo kao što je određenoin vitropomoću probe P 19 iliin vivopomoću probe lezije srednje cerebralne arterije i (b) smanjeni nivo eritropoetične aktivnosti u poređenju sa nativnim eritropoetinom.

2. Upotreba eritropoetina i farmaceutski prihvatljivog nosača za proizvodnju leka za zaštitu, održavanje, pospešivanje ili obnavljanje funkcije ili sposobnosti za život ćelije sisara responsivne na eritropoetin, tkiva koje sadrži ćelije responsivne na eritropoetin ili organa koji sadrži ćelije responsivne na eritropoetin kod sisara koji ima ili je u opasnosti od kognitivne disfunkcije, naznačena time što je pomenuti eritropoetin karbamilovani eritropoetin, koji pomenuti karbamilovani eritropoetin ima (a) zaštitnu aktivnost za tkivo kao što je određenoin vitropomoću probe P 19 iliin vivopomoću probe lezije srednje cerebralne arterije i (b) smanjeni nivo eritropoetične aktivnosti u poređenju sa nativnim eritropoetinom.

3. Upotreba prema zahtevu 2, naznačena time, što je pomenuta kognitivna disfunkcija prouzrokovana moždanom traumom.

4. Upotreba prema zahtevu 2, naznačena time, što je pomenuto pospešivanje kognitivne funkcije u stvari pospešivanje učenja.

5. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz cerebralnu ishemiju.

6. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz moždani udar.

7. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz Friedrich-ovu ataksiju.

8. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz multiplu sklerozu.

9. Upotreba prema zahtevu 1 naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz amiotrofičnu lateralnu sklerozu.

10. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz dijabetsku neuropatiju.

11. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz cerebralnu ishemiju, retinalnu ishemiju, fokalnu ishemiju, makularnu degeneraciju, glaukom, gubitak kognitivne funkcije, ili traumu, pri čemu je pomenuta trauma moždana trauma ili trauma od udara tupim predmetom.

12. Upotreba eritropoetina i farmaceutski prihvatljivog nosača za proizvodnju leka za zaštitu, održavanje, pospešivanje ili obnavljanje funkcije ili sposobnosti za život ćelije sisara responsivne na eritropoetin, tkiva koje sadrži ćelije responsivne na eritropoetin ili organa koji sadrži ćelije responsivne na eritropoetin kod sisara koji ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz, neurotoksičnost, epileptični napad, hronični epileptični napad, epilepsiju, konvulzije, kompresiju nervnog korena, hipotenziju, srčani zastoj, infarkt miokarda, radijaciono oštećenje, radioterapiju, ozračivanje celokupnog mozga, hemoterapiju, cerebralnu paralizu, cerebralnu i progresivnu supranuklearnu paralizu, bajpas srce-pluća, neurološke defekte iz bajpasa srce-pluća, okluziju koronarne ili cerebralne arterije, hipoksiju, mitohondrijalnu disfunkciju, povredu srca, povredu miokarda, srčanu traumu, hroničnu srčanu insuficijenciju, hipotenziju, bolesno stanje u vezi sa hipoglikemijom, dijabetes melitus, akutnu renalnu insuficijenciju, hepatitis ili nefrotički sindrom, naznačena time što je pomenuti eritropoetin karbamilovani eritropoetin, koji pomenuti karbamilovani eritropoetin ima (a) zaštitnu aktivnost za tkivo kao što je određenoin vitropomoću probe P 19 iliin vivopomoću probe lezije srednje cerebralne arterije i (b) smanjeni nivo eritropoetične aktivnosti u poređenju sa nativnim eritropoetinom.

13. Upotreba prema zahtevu 12, naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz neurotoksičnost ili epileptični napad.

14. Upotreba prema zahtevu 12, naznačena time, što sisar ima, imao je, u opasnosti je od, ili prolazi kroz, infarkt miokarda, okluziju koronarne ili cerebralne arterije, dijabetes melitus, bajpas srce-pluća ili hroničnu srčanu insuficijenciju.

15. Upotreba prema zahtevu 1, 2 ili 12, naznačena time, što je pomenuti karbamilovani eritropoetin ne-eritropoetičan.

16. Upotreba prema zahtevu 1, 2 ili 12, naznačena time, što se pomenuti lek formuliše za davanje posle nastupa povrede, bolesti ili bolesnog stanja.

17. Upotreba prema zahtevu 1, 2 ili 12, naznačena time, što se pomenuti lek formuliše za davanje pre nastupa povrede, bolesti ili bolesnog stanja.

18. Upotreba prema zahtevu 1, 2 ili 12, naznačena time, što se pomenuti lek formuliše za davanje za vreme akutne faze i/ili hronične faze povrede, bolesti ili bolesnog stanja.