NO20032912L - Beskyttelse, gjenoppbygging og styrking av erytropoietinresponsive celler, vev og organer. - Google Patents

Description

BESKYTTELSE, GJENOPPBYGGING OG STYRKING AV ERYTROPOIETINRESPONS1VE CELLER, VEV OG ORGANER

Prioritet av midlertidig søknad nr 60/259 245, arkivert 29 desember 2000, i sin helhet inkorporert hen ved referanse, er stilt krav om under 35 U S C § 119(e)(l)

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

I mange år har den eneste, klare fysiologiske rolle til erytropoietin vært dens kontroll av produksjon av røde blodceller I den senere tid antyder flere retninger for bevis at erytropoietin som et medlem av cytokinsuperfamilien, utfører andre viktige fysiologiske funksjoner som er formidlet gjennom interaksjoner med erytropoietmreseptoren (erytropoietin-R) Disse virkninger inkluderer mitogenese, modulering av kalsiuminfluks til glatte muskelceller og nerveceller og effekter av intermediert metabolisme Det er antatt at erytropoietin tilveiebringer kompensasjonsresponser som tjener til å forbedre hypoksisk cellulær mikroomgivelse så vel som å modulere programmert celledød forårsaket av metabolsk stress Selv om studier har bevist at erytropoietin injisert i kraniet beskytter nevroner mot hypoksisk neuronal skade, intrakramell administrasjon cr en upraktisk å uakseptabel vei for administrasjon for terapeutisk anvendelse, spesielt for normale individer Videre har tidligere studier av anemiske pasienter som er gitt erytropoietin, konkludert med at periferisk administrering av erytropoietin ikke er transportert inn i hjernen (Marti et al, 1997 Kidney Int 51 416-8,Juul et al, 1999, Pediatr Res 46 543-547, Buemi et al, 2000,Nephrol Dial Transplanl 15 422-433)

Ulike modifiserte former av erytropoietin har blitt beskrevet med aktiviteter rettet mot å forbedre den erytropoietiske aktivitet av molekylet, slik som dem med endrete aminosyrer ved den karboksyterminale ende, beskrevet i U S patent 5 457 089 og i U S patent 4 835 260, erytropoietimsoformer med ulike antall siahnsyrerester pr molekyl, slik som beskrevet i U S patent 5 856 292, polypeptider beskrevet i U S patent 4 703 008, agonister beskrevet i U S patent 5 767 078, peptider som binder til erytropoietmreseptoren, som beskrevet i U S patentene 5 773 569 5 830 851, og små molekylelterhknere, som beskrevet i U S patent 5 835 382

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot anvendelse av et erytropoietin for å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge erytropoietinresponsive celler og assosierte celler, vev og organer m situ så vel som ex vivo, og for å levere et erytropoietin gjennom en endotelcellebarriere for anvendelse av beskyttelse og styrking av erytropoietinresponsive celler og assosierte celler, vev og organer distale til vaskulaturen, eller for å bære assosierte molekyler

KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I et aspekt er den foreliggende oppfinnelse rettet mot anvendelsen av erytropoietiner for preparering av farmasøytiske sammensetninger for å gjenoppbygge funksjonen eller viabiliteten av erytropoietinresponsive pattedyrceller og deres assosierte celler, vev og organer I et bestemt aspekt er de erytropoietinresponsive pattedyrcellene og deres assosierte celler, vev og organer distalt for vaskulaturen, i kraft av en tett endotelcellebarriere I et annet bestemt aspekt er cellene, vevene, organene eller andre kroppsdeler isolert fra en pattedyrkropp, slik som dem ment for transplantasjon, ved å benytte ikke-begrensende eksempler, kan den erytropoietinresponsive cellen eller vevet være neuronale, retmale, muskulære, hjerte, lunge, lever, nyre, tynntarm, binyrebark, binyremarg, kappilærendotel, testikkel, ovane, pankreas eller endometriumceller eller -vev Disse eksemplene av erytropoietinresponsive celler er bare illustrative I et aspekt er den erytropoietinresponsive cellen eller dens assosierte celler, vev eller organer, ikke excitable celler, vev eller organer eller omfatter ikke hovedsakelig excitable celler eller vev 1 en bestemt utførclscsform er pattedyrcellen, vevet eller organet hvor et tidligere nevnt crytropoietindenvat er benyttet, dem som har benyttet eller vil benytte en periode av tid under minst én tilstand motvirkende viabiliteten Ul cellen, vevet eller organet Slike tilstander inkluderer traumatisk in situ hypoksi eller metabolsk dysfunksjon, kirurgisk indusert in situ hypoksi eller metabolsk dysfunksjon, eller in situ toksineksponenng, det sistnevnte kan være assosiert med kjemoterapi eller strålingsterapi I en utførelsesform er de motvirkende tilstander et resultat av kardipulmonal by-pass (hjerte-lunge maskin), som benyttes for enkelte kirurgiske prosedyrer

Erytropoietinene er nyttige for den terapeutiske eller profylaktiske behandlingen av humane sykdommer i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystemet, som primært har nevrologiske eller psykiatriske symptomer, så vel som øyesykdommer, kardiovaskulære sykdommer, kardiopulmonare sykdommer, respiratonske sykdommer, nyre, unnveis og reproduktive sykdommer, gastrointestinale sykdommer og endokrine og metabolske abnormiteter

Oppfinnelsen er også rettet mot farmasøytiske sammensetninger omfattende bestemte erytropoietindenvater for administrasjon til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske Slike farmasøytiske sammensetninger kan være formulert for oral, intranasal eller parcnteral administrasjon , eller i form av en pcrfusjonsløsmng for opprettholdelse av viabiliteten av celler, vev eller organer ex vivo

Erytropoietindenvater som er nyttige for de tidligere nevnte formål, kan være et hvert naturlig erytropoietin eller en erytropoi eti nanalog, en erytropoietinetterhkner og erytropoietinfragment, en hybrid erytropoietinmolekyl, et erytropoietin-reseptorbindende molekyl, en erytropoietinagonist, et renalt erytropoietin, et hjernc-erytropoietin, en ohgomer derav, en multimer derav, et mutein derav, en beslektet derav, en naturlig forekommende form derav, en syntetisk form derav, en rekombinant form derav, en glykosyleringsvanant derav, en deglykosylert variant derav eller en kombinasjon derav Enhver form for erytropoietin i stand til å være til fordel for erytropoietinresponsive celler, er innbefattet i dette aspektet av oppfinnelsen

Andre erytropoietinderivater som er nyttige for de tidligere nevnte formål og farmasøytiske sammensetninger, inkluderer både naturlige erytropoi eti ner, så vel som erytropoietiner som er endret ved minst én modifikasjon, sammenliknet med naturlig erytropoietin, og fortrinnsvis som sammenliknet med naturlig, humant erytropoietin Den minst ene modifikasjonen kan være en modifikasjon av minst én aminosyre av erytropoietinmolekylet, eller en modifikasjon av minst ett karbohydrat på erytropoietinmolekylet Selvfølgelig kan erytropoietinmolekyler som er nyttige for formåler her, ha en pluralitet av modifikasjoner sammenliknet med det naturlige molekylet, slik multiple modifikasjoner av aminosyredelcn av molekylet, multiple modifikasjoner av karbohydratdelen av molekylet eller minst én modifikasjon av amoinosyredelen av molekylet og minst én modifikasjon av karbohydratdelen av molekylet Det modifisert erytropoietinmolekylet beholder sin evne til å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge funksjonen eller viabiliteten av erytropoietinresponsive pattedyrceller, likevel kan andre egenskaper av erytropoietinmolekylet ikke relatert til den tidligere nevnte ønskelige egenskap, være fraværende, sammenliknet med det naturlige molekylet I en foretrukket utførelses form er erytropoietindenvatet ikke-erytropoietisk

I en utførelscsform har erytropoietinet av oppfinnelsen minst mgen sialmsyrehalvdeler I en foretrukket utførelsesform er det modifiserte erytropoietinet asialoerytropoietin, og mest foretrukket humant asialoerytropoietin 1 en annen utførelsesform har det modifiserte erytropoietinet 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 eller 13 sialmsyrehalvdeler

I en andre utførelsesform har det modifiserte erytropoietinet minst mgen N-forbundne eller ingen O-forbundne karbohydrater

1 en tredje utførelsesform har det modifiserte erytropoietinet minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av erytropoietin med dets naturlige karbohydrater med minst én glykosidase 1 en fjerde utførelsesform har karbohydratdelen av det modifiserte erytropoietinmolekylet minst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler I en foretrukket utførelsesform er de modifiserte erytropoietinene uttrykket i insektceller eller planteceller 1 en femte utførelsesform har det modifiserte erytropoietinet minst en eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte I en foretrukket utførelsesform er det modifiserte erytropoietinet penodatoksidert erytropoietin, i en annen utførelsesform er penodatoksidert erytropoietin kjemisk redusert med et borhydndsalt slik som natnumklorhydnd eller natnumcyanborhydnd

I en sjette utførelsesform har det modifiserte erytropoietinet for anvendelsen nevnt tidligere, minst én eller flere modifiserte argininrester I en utførelsesform omfatter det modifiserte erytropoietinet en glyoksalhalvdel på den ene eller flere argininrester, slik som en arylglyoksal- eller alkylglyoksalhalvdel I en annen utførelsesform er minst én argininrest modifisert ved reaksjon med el tilstøtende dikcton, slik som, men ikke begrenset til, 2,3-butandion eller sykloheksandion

1 en syvende utførelsesform omfatter det modifiserte erytropoietinet minst én eller flere modifiserte lysinrestcr eller en modifikasjon av den N-terminale aminogruppe av erytropoietinmolekylet, slike modifikasjoner cr de som er et resultat fra reaksjon av glysinresten eller den N-terminale aminogruppen med et aminogruppemodifiserende middel Den modifiserte lysinresten kan videre være kjemisk produsert I en foretrukket utførelsesform er et erytropoietin biotmylcrt eller karbamylert via én eller flere lysingrupper I en annen foretrukket utførelsesform er lysinet reagert med aldehyd eller reduserende sukker for å danne et mun som kan stabiliseres ved reduksjon med natnumcyanborhydnd for å danne et N-alkylert lysin, slik som glucitolyllysin eller som i tilfellet av reduserende sukkere kan stabiliseres ved Amadon eller Heyns omgruppering for dannelse av et alfa-deoksy alfa-amino sukker, slik som alfa-deoksy-alfa-fruktosyllysm 1 en annen foretrukket utførelsesform er lysingruppen karbamylert (karbamoylert), slik som i kraft av reaksjon med cyanation, alkyl-karbamylert, arylkarbamylert eller aryl-tiokarbamylert med et alkyl-isocyanat, aryl-isocyanat eller aryl-lsotiocyanat, eller den kan være acylert ved en reaktiv alkylkarboksylsyre eller arylkarboksylsyredenvat, slik som ved reaksjon med eddiksyreanhydnd, ravsyreanhydnd eller ftalsyreanhydnd Minst én lysingruppe kan også være tnnitrofenylmodifisert ved reaksjon med en tnnitrobenzensulfonsyre, eller fortnnnvis dens salter I en annen utførelsesform kan lysinrestene være modifisert ved reaksjon med et glyoksaldenvat, slik som reaksjon med glyoksal, metylglyoksal eller 3-dioksyglukoson for å danne de korresponderende alfa-karboksyalkyldenvatene

I en åttende utførelsesform kan minst én tyrosinrest av erytropoietin være modifisert i en aromatisk nngposisjon ved en eleklrofil reagens, slik som ved nitrenng eller jodinenng

I en niende utførelsesform kan minst en asparginsyre eller glutaminsyrerest av et erytropoietin være modifisert, slik som ved reaksjon med et karbodiimid fulgt av reaksjon med et amin slik som, men ikke begrenset til glysinamid

I en tiende utførelsesform er minst en tryptofanrest av et erytropoietin modifisert slik som ved reaksjon med n-bromsuksinimid eller n-klorsuksinimid

1 en ellevte utførelsesform er et modifisert erytropoietinmolekyl tilveiebrakt som minst har én erytropoietinamingruppe fjernet, slik som ved reaksjon med ninhydnn fulgt av reaksjon av den resulterende karbonylgruppe ved reaksjon med borhydnd

I en tolvte utførelsesform er et modifisert erytropoietin tilveiebrakt som mmst har en åpning av minst én av cysteinforbindclsene i erytropoietinmolekylet ved reaksjon med et reduserende middel slik som ditiotreitol fulgt avleaksjon av de påfølgende sulhydryllene med jodacetamin, jodeddiksyre eller en annen elektrofil, for å hindre reformasjon av disulfidforbindelsene

I en trettende utførelsesform er et modifisert erytropoietin tilveiebrakt som minst har én substitusjon av hvilke som helst av et antall aminosyrer, slik som en leusin med mmst én av lysin, arginin, tryptofan, tyrosm eller cysteinrester av erytropoietin, ved anvendelse av molekylærbiologiske teknikker

1 en fjortende utførelsesform er et modifisert erytropoietin utsatt for en begrenset kjemisk proleolysc som er målrettet til spesifikke rester, for eksempel for å spalte etter tryptofanrester Slike resulterende erytropoietinfragmentcr er omfattet heri

Som beskrevet ovenfor kan erytropoietin, nyttig for anvendelsene her, ha minst én av de tidligere nevnte modifikasjonene, men kan ha flere enn en av modifikasjonene ovenfor Ved eksempel av et modifisert erytropoietin med en modifikasjon på karbohydratdelen av molekylet og en modifikasjon på aminosyredelen, er et modifisert erytropoietin asialoerytropoietin og har sine lysinrester biotmylert eller karbamylert Den foreliggende oppfinnelse omfatter også sammensetninger som inkluderer farmasøytiske sammensetninger omfattende ett eller flere av de tidligere nevnte erytropoietinene

I et annet aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge funksjonen eller viabiliteten av erytropoietinresponsive pattedyrceller og deres assosierte celler, vev og organer, ved tilførsel av en effektiv mengde av en hvilken som helst eller flere av de ovenfor nevnte erytropoietinene I et bestemt aspekt av fremgangsmåten er de erytropoietinresponsive pattedyrcellene og deres assosierte celler, vev eller organer distale for vaskulaturen i kraft av en tett endotelcellebarnere 1 et annet bestemt aspekt er cellene, vevene, organene eller andre kroppsdeler isolert fra en pattcdyrkropp, slik som de ment for transplantasjon ved ikke-begrensende eksempler, kan de erytropoietinresponsive cellene eller vevene være neuronale, retinale, muskulære, hjerte, lunge, lever, nyre, tynntarm, binyrebark, binyremarg, kappilærendotel, testikkel, ovarie eller endometnumceller eller

-vev Disse eksemplene av erytropoietinresponsive celler er bare illustrative I en bestemt utførelsesform er den erytropoietinresponsive celle eller dens assosierte celler, vev eller organer ikke excitable celler, vev eller organer eller omfatter ikke hovedsakelig excitable celler eller vev I en annen bestemt utførelsesform kan pattedyrcellen, vevet eller organet som et tidligere nevnt erytropoietindenvat skal tilføres til, være den som har forbrukt eller vil forbruke en periode av tid under minst én tilstand motvirkende til viabiliteten av cellen, vevet eller organet Slike forhold kan inkludere traumatisk in situ hypoksi eller metabolsk dysfunksjon, kirurgisk indusert in situ hypoksi eller metabolsk dysfunksjon, eller in situ toksineksponering, det sistnevnte kan være assosiert med kjemoterapi eller strålingsterapi I en utførelsesform beskytter oppfinnelsen mot de motvirkende tilstander fra kardipulmonal by-pass

I et annet aspekt av oppfinnelsen kan ethvert av de foregående erytropoietinene, så vel som hvilke som helst andre erytropoietinmolekyler som inkluderer naturlig, humant erytropoietin benyttes i prepareringen av en farmasøytisk sammensetning for ex vivo behandling av celler, vev og organer for formålet å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge funksjonen eller viabiliteten av erytropoietinresponsive pattedyrceller og deres assosierte celler, vev og organer Slik ex vivo behandling er nyttig, for eksempel for oppbevaring av celler, vev eller organer for transplantasjon, enten autotransplantasjon eller xenotransplantasjon Cellene, vevet eller organet kan bades i en løsning som omfatter erytropoietin eller perfusat dryppet inn i organet gjennom vaskulaturen eller ved andre midler for opprettholdelse av cellulær funksjon under perioden hvor cellene, vevet eller organet ikke er integrert med vaskulaturen til donoren eller mottakeren Administrasjon av perfusatet kan gjøres til en donor før organhøstmgen, så vel som til det høstete organet og til mottakeren Videre er den tidligere nevnte anvendelse av ethvert erytropoietin nyttig når en celle, et vev eller organ er isolert fra vaskulaturen til individet og dermed hovedsakelig eksisterer ex vivo for en tidsperiode, betegnelsen isolert refererer til å begrense eller presse sammen vaskulaturen fra eller til cellen, vevet, organet eller kroppsdelen, slik som det kan utføres ved kirurgi, som nærmere bestemt inkluderer kardipulmonal by-pass kirurgi, by-pass av vaskulaturen til cellen, vevet, organet eller kroppsdelen, å fjerne cellen, vevet, organet eller kroppsdelen fra pattcdyrkroppen, som kan utføres før xenotransplantasjon eller før eller under autotransplantasjon, eller traumatisk amputasjon av en celle, vev, organ eller kroppsdel Dermed vedrører dette aspektet av oppfinnelsen både perfusjonen med et erytropoietin in situ og ex vivo Ex vivo kan erytropoietinet tilveiebringes i celle, vev eller organ i oppbevanngsløsning For begge aspekter kan eksponeringen være ved midler av kontinuerlig perfusjon, pulsatil perfusjon, infusjon, bading, injeksjon eller katetensenng

I et enda ytterligere aspekt er oppfinnelsen rettet til en fremgangsmåte for å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge viabiliteten av en pattedyrcelle, vev, organ eller kroppsdel som inkluderer en erytropoietinresponsiv celle eller vev, hvor cellen, vevet, organet eller kroppsdelen er isolert fra pattedyrkroppen fremgangsmåten inkluderer minst å eksponere den isolerte pattedyrcelle, vev, organ eller kroppsdel for en mengde av erytropoietin for en varighet som er effektiv for å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge den tidligere nevnte viabiliteten 1 ikke-begrensende eksempler refererer isolert til å begrense eller sammenpresse vaskulaturen fra eller til cellen, vevet, organet eller kroppsdelen, slik som kan bli utført under kirurgi, spesielt ved kardiopulmonal by-pass kirurgi, by-pass av vaskulaturen til cellen, vevet, organet eller kroppsdelen, å fjerne cellen, vevet, organet eller kroppsdelen fra pattedyrkroppen, som kan utføres før xenotransplantasjon eller før eller under autotransplantasjon, eller traumatisk amputasjon av en celle, vev, organ eller kroppsdel Derfor vedrører dette aspektet av oppfinnelsen både perfusjonen med et erytropoietin in situ og ex vivo Ex vivo kan erytropoietinet tilveiebringes i celle, vev eller organ i oppbevanngsløsning For begge aspekter kan eksponenngen være ved midler av kontinuerlig perfusjon, pulsatil perfusjon, infusjon, bading, injeksjon eller katetensenng

I den tidligere nevnte isolasjon eller ex vivo utførelsesformen, kan et nyttig erytropoietin være ethvert av de tidligere nevnte erytropoietinene, som inkluderer ethvert naturlig erytropoietin, eller en erytropoietinanalog, en erytropoietinetterlikner og erytropoietinfragmenl, et hybnderytropoietinmolekyl, et erytropoietinreseptorbindende molekyl, en erytropoietinagomst, el renalt erytropoietin, et hjerneerytropoietin, en oligomer derav, en multimer derav, et mutein derav, en beslektet derav, en naturlig forekommende form derav, en syntetisk form derav, en rekombinant form derav, en glykosylenngsvanant derav, en deglykosylert vanant derav eller en kombinasjon derav Enhver form av erytropoietin i stand til å være til fordel for erytropoietinresponsive celler er omfattet i dette aspektet av oppfinnelsen Andre erytropoietiner inkluderer, men er ikke begrenset til asialoerytropoietin, N-deglykosylert erytropoietin, 0-deglykosylert erytropoietin, erytropoietin med redusert karbohydratnuihold, erytropoietin med endret glykosylenngsmønster, erytropoietin med karbohydrater oksydert så redusert, arylglyoksal-modifisert erytropoietin, alkylglyoksal-modifisert erytropoietin, 2,3-butandion-modifisert erytropoietin, sykloheksandion-modifiscrt erytropoietin, biotinylert erytropoietin, N-alkylert-lysyl-erytropoietin, glusitolyllysm erytropoietin, alfa-deoksy-alfa-fruktosyllysin-crytropoietin, karbamylert erytropoietin, acetylert erytropoietin, suksinylert erytropoietin, alfa-karboksyalkyl erytropoietin, nitrert erytropoietin, jodert erytropoietin for å nevne noen representative likevel ikke begrensende eksempler basert på lærdommen her Et humant erytropoietin er foretrukket, naturlig humant erytropoietin er mest foretrukket 1 en annen utførelsesform er humant asialoerytropoietin foretrukket I en annen utførelsesform er humant fenylglyoksal erytropoietin foretrukket

Ved et ikke-begrensende eksempel kan den tidligere nevnte ex vivo erytropoietinresponsive celle eller vev, være eller omfatte neuronale, retinale, muskulære, hjerte, lunge, lever, nyre, tynntarm, binyrebark, binyremarg, kappilærendotel, testikkel, ovane eller endometnumceller eller -vev Disse eksemplene av erytropoietinresponsive celler er bare illustrative

Alle de foregående fremgangsmåtene og anvendelsene er fortrinnsvis anvendelige for mennesker, men er også nyttige for ethvert pattedyr, slik som, men ikke begrenset til, kjæledyr, husdyr, buskap og dyr i dyrehage Tilførselsruter av de tidligere nevnte farmasøytiske sammensetninger inkluderer oral, intravenøs, intranasal, topikal, intraluminal, inhalering eller parenteral tilførsel, sistnevnte inkluderer intravenøs, intraarteriell, subkutan, intramuskulær,lntrapentoneal, submukosal eller intradermal For ex vivo anvendelse er et perfusat eller en badeløsnmg foretrukket Dette inkluderer å perfusere en isolert del av vaskulaturen in situ

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er ethvert av de tidligere nevnte erytropoietinene nyttige i preparering av en farmasøytisk sammensetning for gjenoppbygging av en dys funksjonell celle, vev eller organ når det tilføres etter begynnelsen av sykdommen eller tilstanden som er ansvarlig for dysfunksjonen Ved ikke begrensende eksempler gjenoppbygger administrasjon av en farmasøytisk sammensetning som omfatter erytropoietin, kognitiv funksjon hos dyr som tidligere hadde hjernetraume, til og med når det administreres lenge etter (for eksempel 3 dager, 5 dager, 1 uke, 1 måned eller lengre) traumen har avtatt Erytropoietiner som er nyttige for slike anvendelser inkluderer ethvert av de bestemte tidligere nevnte erytropoietinene, eller ethvert naturlig erytropoietin, eller en erytropoietinanalog, en erytropoietinetterhkner og erytropoietinfragment, en hybrid erytropoietinmolekyl, et erytropoietin-reseptorbindcnde molekyl, en erytropoietinagonist, et renalt erytropoietin, et hjcrne-erytropoietin, en ohgomer derav, en multimer derav, et mutein derav, en beslektet form derav, en naturlig forekommende form derav, en syntetisk form derav, en rekombinant form derav, en glykosyleringsvanant derav, en deglykosylert variant derav eller en kombinasjon derav Enhver form for erytropoietin i stand til å være til fordel for erytropoietinresponsive celler, er innbefattet i dette aspektet av oppfinnelsen Andre erytropoietindenvater som er nyttige for de tidligere nevnte formål og farmasøytiske sammensetninger, inkluderer både naturlige erytropoietiner, så vel som erytropoietiner som er endret ved minst én modifikasjon, sammenliknet med naturlig erytropoietin, og fortrinnsvis når sammenliknet med naturlig, humant erytropoietin Den minst ene modifikasjonen kan være en modifikasjon av minst én aminosyre av erytropoietinmolekylet, eller en modifikasjon av minst ett karbohydrat av erytropoietinmolekylet Selvfølgelig kan erytropoietmmolekyler som er nyttige for formåler her, ha en pluralitet av modifikasjoner sammenliknet med det naturlige molekylet, slik som multiple modifikasjoner av aminosyredelen av molekylet, multiple modifikasjoner av karbohydratdelen av molekylet eller minst én modifikasjon av aminosyredelen av molekylet og minst én modifikasjon av karbohydratdelen av molekylet Det modifisert erytropoietinmolekylet beholder sin evne til å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge funksjonen eller viabiliteten av erytropoietinresponsive pattedyrceller, likevel kan andre egenskaper av erytropoietinmolekylet ikke relatert til den tidligere nevnte ønskelige egenskap, være fraværende, sammenliknet med det naturlige molekylet Et humant erytropoietin er foretrukket, naturlig humant erytropoietin er mest foretrukket I en annen utførelsesform er humant, asialoerytropoietin foretrukket

I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for anvendelse av det tidligere nevnte erytropoietinet for å gjenoppbygge en dysfunksjonen celle, vev eller organ når det administreres etter begynnelsen av sykdommen eller tilstanden som er ansvarlig for dysfunksjonen Vedlkke-begrenscndc eksempler gjenoppbygger fremgangsmåter for administrasjon av en farmasøytisk sammensetning, som omfatter erytropoietin, kognitiv funksjon hos dyr som tidligere hadde hjernetraume, til og med når det administreres lenge etter (for eksempel 3 dager, 5 dager, 1 uke, 1 måned eller lengre) traumen har avtatt Erytropoietiner som er nyttige for slike anvendelser inkluderer ethvert av de bestemte tidligere nevnte erytropoietinene, eller ethvert naturlig erytropoietin, eller en erytropoietmanalog, en erytropoietinetterlikner og erytropoietinfragment, en hybrid erytropoietinmolekyl, et erytropoietin-reseptorbindende molekyl, en erytropoietinagonist, et renalt erytropoietin, et hjerne-erytropoietin, en oligomer derav, en multimer derav, et mutein derav, en beslektet form derav, en naturlig forekommende form derav, en syntetisk form derav, en rekombinant form derav, en glykosyleringsvanant derav, en deglykosylert variant derav eller en kombinasjon derav Enhver form for erytropoietin i stand til å være til fordel for erytropoietinresponsive celler, er innbefattet i dette aspektet av oppfinnelsen Andre

erytropoietindenvater som er nyttige for de tidligere nevnte formål og farmasøytiske

sammensetninger, inkluderer både naturlige erytropoietiner, så vel som erytropoietiner som er endret ved minst én modifikasjon, sammenliknet med naturlig erytropoietin, og fortrinnsvis når sammenliknet med naturlig, humant erytropoietin Den minst ene modifikasjonen kan være en modifikasjon av minst én aminosyre av erytropoietinmolekylet, eller en modifikasjon av minst ett karbohydrat av erytropoietinmolekylet Selvfølgelig kan erytropoietinmolekyler som er nyttige for formåler her, ha en pluralitet av modifikasjoner sammenliknet med det naturlige molekylet, slik som multiple modifikasjoner av aminosyredelen av molekylet, multiple modifikasjoner av karbohydratdelen av molekylet eller minst én modifikasjon av aminosyredelen av molekylet og minst én modifikasjon av karbohydratdelen av molekylet Det modifisert erytropoietinmolekylet beholder sin evne til å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge funksjonen eller viabiliteten av erytropoietinresponsive pattedyrceller, likevel kan andre egenskaper av erytropoietinmolekylet ikke relatert til den tidligere nevnte ønskelige egenskap, være fraværende, sammenliknet med det naturlige molekylet Et humant erytropoietin er foretrukket, naturlig humant erytropoietin er mest foretrukket I en annen utførelsesform er humant, asialoerytropoietin foretrukket

1 et enda ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåter tilveiebrakt for å fremme transcytosen av molekyler over endolelcellebarneren i et pattedyr ved administrasjon av en sammensetning av et molekyl i assosiasjon med et erytropoietin slik som Et erytropoietin som har minst ingen sialmsyrehalvdeler, et erytropoietin som har minst ingen N-forbundne eller ingen O-forbundne karbohydrater, et erytropoietin som har minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med minst en glykosidase, et erytropoietin med en karbohydratdel av erytropoietinmolekylet, som har minst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, et erytropoietin har minst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være

kjemisk reduserte, et erytropoietin som har minst en eller flere modifiserte argininrester, et erytropoietin som har minst en eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-terminale aminogruppen av erytropoietinmolekylet, et erytropoietin som minst har én modifisert tyrosinrest, et erytropoietin som minst har en modifisert asparginsyre eller glutaminsyrerest, et erytropoietin som minst har en modifisert tryptofanrest, et erytropoietin som minst har en ammogruppe fjernet, et erytropoietin som minst har en åpning av minst en av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, et erytropoietin er tilveiebrakt som har minst en substitusjon av minst en aminosyre, eller et avkortet erytropoietin

Assosiasjonen mellom molekylet som skal bh transportert og erytropoietinet kan for eksempel være en ustabil, kovalent binding, en stabil kovalent binding, eller en ikke-kovalent assosiasjon med et bindingssete for molekylet Endotelcellebarnérer kan være blod-hjerne barriere, blod-øye barriere, blod-testikkel barriere, blod-ovane barriere og blod-placenta barriere Egnet molekyl for transport ved fremgangsmåten av den foreliggende oppfinnelse inkluderer hormoner, slik som veksthormon, antibiotika og anti-cancermidler

Det er ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en sammensetning for å fremme transcytose av et molekyl over en cndotelccllebamere i et pattedyr, nevnte sammensetning omfatter nevnte molekyl i assosiasjon med et erytropoietin, slik som et erytropoietin som minst har mgen sialmsyrehalvdeler, et erytropoietin som har minst ingen N-forbundne eller ingen O-forbundne karbohydrater, et erytropoietin som har minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med minst en glykosidase, et erytropoietin med en karbohydratdel av del modifiserte erytropoietinet som har minst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, et erytropoietin har minst én eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte, et erytropoietin som har minst en eller flere modifiserte argininrester, et erytropoietin som har minst en eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-termmale aminogruppen av erytropoietinmolekylet, et erytropoietin som minst har én modifisert tyrosinrest, et erytropoietin som minst har en modifisert asparginsyre eller glutaminsyrerest, et erytropoietin som minst har en modifisert tryptofanrest, et erytropoietin som minst har en ammogruppe fjernet, et erytropoietin som mmst har en åpning av minst en av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, et erytropoietin er tilveiebrakt som har minst en substitusjon av minst en aminosyre, eller et avkortet erytropoietin

Assosiasjonen kan for eksempel være en ustabil, kovalent binding, en stabil

kovalent binding, eller en ikke-kovalent assosiasjon med et bindingssete for molekylet Endotelcellebarnérer kan være blod-hjerne barrieren, blod-øye barrieren, blod-testikkel barneren, blod-ovane barneren og blod-placenta barrieren Egnet molekyl for transport ved fremgangsmåten av den foreliggende oppfinnelse inkluderer hormoner, slik som veksthormon, antibiotika og anti-cancermidler

1 et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse er ethvert av de tidligere nevnte erytropoietinene nyttige i prepareringen av en farmasøytisk sammensetning for å fremme transcytose av et molekyl over en endotelcellebarncre i et pattedyr, nevnte sammensetning omfatter nevnte molekyl i assosiasjon med et erytropoietin, slik som et erytropoietin som minst har mgen sialmsyrehalvdeler, et erytropoietin som har minst ingen N-forbundne eller ingen O-forbundne karbohydrater, et erytropoietin som har minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med minst en glykosidase, et erytropoietin med en karbohydratdel av det modifiserte erytropoietinmolekylet som har minst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, et erytropoietin har minst én eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være

kjemisk reduserte, et erytropoietin som har minst en eller flere modifiserte argininrester, et erytropoietin som har minst en eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-terminale aminogruppen av erytropoietinmolekylet, et erytropoietin som minst har én modifisert tyrosinrest, et erytropoietin som minst har en modifisert asparaginsyre eller glutaminsyrerest, et erytropoietin som minst har en modifisert tryptofanrest, et

erytropoietin som minst har en ammogruppe fjernet, et erytropoietin som minst har en åpning av minst en av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, et erytropoietin er tilveiebrakt som har minst en substitusjon av minst en aminosyre, eller et avkortet erytropoietin

Assosiasjonen kan for eksempel være en ustabil, kovalent binding, en stabil kovalent binding, eller en ikke-kovaicnt assosiasjon med et bindingssete for molekylet Endotelcellebarnérer kan være blod-hjeme barneren, blod-øye barneren, blod-testikkel barrieren, blod-ovane barrieren og blod-placenta barneren Egnet molekyl for transport ved fremgangsmåten av den foreliggende oppfinnelse inkluderer honnoner, slik som veksthormon, antibiotika og anti-cancermidler

Disse og andre aspekter av den foreliggende oppfinnelse vil bh bedre forstått ved referanse til etterfølgende figurer og detaljert beskrivelse

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 avbilder translokasjonen av parenteralt administrert erytropoietin til cerebrospinalvæsken Figur 2 viser beskyttelsen av myokardium fra ischemisk ødeleggelse ved erytropoietin etter kortvarig vaskulær okklusjon Figur 3 viser opprettholdelsen av funksjonen av et hjerte preparert for transplantasjon ved erytropoietin Figur 4 sammenlikner in vitro effektiviteten av erytropoietin og på viabiliteten av serum-sultede P19-cellcr Figur 5 er et annet eksperiment som sammenlikner m vitro effektiviteten av erytropoietin og asialoerytropoietin på viabiliteten av serum-sultede P19-celler Figur 6 sammenlikner in vitro effektiviteten av erytropoietin og fenylglyoksal-modifisert erytropoietin på viabiliteten av serum-sultede P19-celler Figur 7 viser beskyttelse av erytropoietin og asialoerytropoietin i en rotte fokal cerebral ischemi-modell Figur 8 viser en doserespons som sammenlikner effektiviteten av humant erytropoietin og humant asialoerytropoietin i midtre cerebral artcncokklusjon i en modell av ischemisk slag Figur 9 viser effekten av biotinylert erytropoietin og asialoerytropoietin i P19-testen

Figur 10 viser aktiviteten av jodert erytropoietin i P19-testen

Figur 11 avbilder effekten av erytropoietinbehandling i en rottcglaukommodell

Figur 12 viser omfanget av vedlikeholdet av retinalfunksjon ved erytropoietin i rotteglaukommodel 1 en Figur 13 avbilder gjenoppbyggingen av kognitiv funksjon etter hjcrnetraume ved tilførsel av erytropoietin som startet 5 dager etter traume Figur 14 avbilder gjenoppbyggingen av kognitiv funksjon etter hjernetraume ved tilførsel av erytropoietin som startet 30 dager etter traume Figur 15 avbilder effektiviteten av humant asialoerytropoietin i en kainatmodell av cerebral toksisitet

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

"Erytropoielinresponsiv celle" refererer til en pattedyrcelle der funksjonen eller viabilitet kan være opprettholdt, fremmet, styrket, regenerert eller på en hvilken som helst annen måte være til nytte ved eksponering for et erytropoietin Hcke-begrensende eksempler av slike celler inkluderer ncuronalc, retinale, muskulære hjerte, lunge, lever, nyre, tynntarm, binyrebark, binyremarg, kappilærendotel, testikkel, ovarie og endometnumceller Dessuten kan slike erytropoietinresponsive celler og fordelene tilveiebrakt ved et erytropoietin være utvidet til å tilveiebringe beskyttelse eller forsterking, indirekte til andre celler som ikke direkte er erytropoietinresponsive, eller av vev eller organer som inneholder slike ikke-erytropoietinresponsive celler Disse andre cellene, vevene eller organene som har nytte indirekte fra forsterkningen av erytropoietinresponsive celler, presenterer som del av cellene, vevet eller organet som "assosierte" celler, vev og organer Fordeler av et erytropoietin som beskrevet her kan således være tilveiebrakt som et resultat av tilstedeværelsen av et lite antall eller forhold av erytropoietinresponsive celler i et vev eller organ, for eksempel excitabelt eller neuronalt vev tilstede i slikt vev eller Leyding-celler i testiklene, som produserer testosteron I et aspekt er den erytropoietinresponsive cellen eller dens assosierte celler, vev eller organer ikke excitable celler, vev eller organer eller omfatter hovedsakelig ikke excitable celler eller vev

Oppfinnelsens fremgangsmåter tilveiebringer den lokale eller systemiske beskyttelse eller styrkingen av celler, vev og organer i en pattcdyrkropp, under et stort utvalg av normale og motvirkende tilstander eller beskyttelse av dem som er bestemt for omplassering til en annen pattedyrkropp I tillegg er gjenoppbygging eller regenerering av dysfunksjon også tilveiebrakt Som nevnt ovenfor har et erytropoietin evne til å krysse en tett endotelcellebarnere og utøve sme positive effekter på erytropoietinresponsive celler (så vel som andre celletyper) distalt for vaskulaturen, og har potensiale til å hindre så vel som å behandle et stort utvalg av tilstander og sykdommer som på annen måte forårsaker signifikant cellulær- og vevsskade hos et dyr inkludert menneske, og dessuten å tillate suksess for hittil ikke utprøvde kirurgiske prosedyrer hvor risiko tradisjonell sett oppveier for fordelene Varighet og grad av viktige motvirkende forhold indusert for maksimal fordel, slik som høy dose kjemoterapi, stråhngsterapi, forlenget ex vivo transplantasjonsoverlevelse og forlengete perioder av kirurgisk indusert ischemi, kan utføres ved å dra fordel av foreliggende oppfinnelse Imidlertid er oppfinnelsen ikke så begrenset, men inkluderer"som et aspekt fremgangsmåter eller sammensetninger hvor de målrettete erytropoietinresponsive cellene er distale for vaskulaturen i kraft av en endotelcellebarnerc eller tette endotelforbindelser Generelt er oppfinnelsen rettet mot hvilke som helst erytropoietinresponsive celler og assosierte celler, vev og organer som kan gagne eksponering for erytropoietin Videre kan cellulær-, vevs eller organdysfunksjon gjenoppbygges eller regenerert etter en akutt motvirkende hendelse (slik som traume) ved eksponering for et erytropoietin

Oppfinnelsen er derfor generelt rettet mot anvendelse av erytropoietiner for preparering av farmasøytiske sammensetninger for de tidligere nevnte formål hvor cellulær funksjon er opprettholdt, fremmet, styrket, regenerert eller på en hvilken som helst annen måte som kan være fordelaktig Oppfinnelsen er også rettet mot fremgangsmåter for å opprettholde, styrke, fremme eller regenere cellulær funksjon ved tilførsel til pattedyr en effektiv mengde av et erytropoietin som beskrevet her Oppfinnelsen er videre rettet mot fremgangsmåter for å opprettholde, styrke, fremme eller regenere cellulær funksjon ex vivo ved eksponering av celler, vev eller organ for et erytropoietin Oppfinnelsen er også rettet mot en perfusatsammensetmng omfattende et erytropoietin for anvendelse for organ- eller vevsoppbevanng

De ulike fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse benytter en farmasøytisk sammensetning som minst inkluderer et erytropoietin i en effektiv mengde for den bestemte rute og varighet av eksponenng for utøvelse av positive effekter eller fordeler på erytropoietinresponsive celler i eller fjernet fra en pattedyrkropp hvor den målrettete celle, vev eller organer for den påtenkte terapien har behov for erytropoietin for å krysse en endotel cellebarnere, inkluderer den farmasøytiske sammensetning en erytropoietinkonsentrasjon som er i stand til å utøve den ønskete effekt på de erytropoietinresponsive cellene etter å ha krysset endotelcellebarneren Molekyler som kan interagere med erytropoietmreseptoren og modulere rcseptoraktivitcten, her referert til som erytropoietin eller crytropoietinreseptoraktivitetsmodulatorer, er nyttige i sammenhengen for den foreliggende oppfinnelse Disse molekylene kan for eksempel være naturlig forekommende syntetiske eller rekombmante former av erytropoietinmolekylene, som beskrevet ovenfor, eller andre molekyler som kanskje nødvendigvis ikke likner erytropoietin på noen måte, med unntak av å modulere erytropoietinresponsiv celleaktivitet som beskrevet her

Erytropoietin er et glykoproteinhormon som i mennesker har en molekylvekt på omkring 34 kDa Det modne protein omfatter 165 aminosyrer, og glykosylrestene omfatter omkring 40% av molekylvekten Formene av erytropoietin som er nyttige o utførelsen av den foreliggende oppfinnelse omfatter naturlig forekommende, syntetisk og rekombinante former av de følgende humane og andre pattedyr erytropoietinrelaterte molekyler erytropoietin, asialoerytropoietin, deglykosylert erytropoietin, erytropoietmanaloger, erytropoietinctterliknere, erytropoietinfragmenter, hybriderytropoietinmolekyler, erytropoietinreseptorbindende molekyler, erytropoietinagonister, renalt erytropoietin, hjerne-erytropoietin, ohgomercr og multimerer derav, mutcincr derav og beslektete derav, i tillegg inkluderer erytropoietinformer, nyttige i fremgangsmåtene av den foreliggende oppfinnelse proteiner som representerer funksjonelt ekvivalente genprodukter Et slikt ekvivalent erylropoietingenprodukt inkluderer mutante erytropoietiner som kan inneholde delesjoner, som inkluderer indre delesjoner, tilføyelser som inkluderer tilføyelser som gir fusjonsproteiner eller konservative substitusjoner av aminosyrerester i og/eller nærliggende til aminosyresekvensen, men som resulterer i en "stille" endring, ved at endringen produserer el funksjonelt, ekvivalent erytropoietin Slike aminosyresubstitusjoner kan gjøres på basis av polaritetshkhet, ladning, oppløse!ighet, hydrofobisitet, hydrofihsitet og/eller den amfipatiske natur av restene involvert Ikkcpolare (hydrofobe) aminosyrer inkluderer for eksempel alanin, leusin, isoleusin, vahn, prohn, fenylalanin, tryptofan og metionin, polare, nøytrale aminosyrer inkluderer glysm, senn, treomn, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin, positivt ladete (basiske) aminosyrer inkluderer argimn, lysin, og histidin, og negativt ladete (sure) aminosyrer inkluderer asparginsyre og glutaminsyre Alternativt kan ikke-konservative aminosyreendnnger og større innsettinger og delesjoner benyttes for å skape funksjonelt endrete erytropoietinmutanter Slike mutanter benyttes for å endre erytropoietinegenskaper på ønskel måte 1 en utførelsesform kan for eksempel et erytropoietin nyttig for foreliggende oppfinnelses utførelse være et mutert erytropoietin, endret i en eller flere aminosyrer innenfor de fire funksjonelle domener av erytropoietin som påvirker reseptorbinding VLQRY og/eller TKVNFYAW og/eller SGLRSLTTL og/cller SNFLRG I en annen utførelsesform kan det anvendes erytropoietiner inneholdende mutasjoner i nærliggende områder av molekylet som påvirker kinetikk eller reseptorbindingsegenskaper av molekylet

Betegnelsen "erytropoietin", så vel som "et erytropoietin" anvendes vekslende eller nær forbundet, og de ulike analoger, fragmenter, hybndmolekyler, agomster, muteiner og andre fonner, som beskrevet ovenfor, omfatter vanantene i utstrekningene av og setene av glykosylenng av erytropoietin, som inkluderer naturlig, deglykosylert, asialylert og andre delvis glykosylerte former av erytropoietin Ikke-begrensendc eksempler på slike varianter er beskrevet i Tsuda et al, 1990, Eur J Biochem , 188 405-411, som er inkorporert hen ved referanse Baktener, gjær, insekt, plante, pattedyr, inkludert menneske I tillegg kan et stort utvalg av vertssystemer anvendes for ekspresjon og produksjon av rekombinant erytropoietin, som inkluderer, men ikke begrenset til, baktener, gjær, insekt, planter og pattedyr, som inkluderer humane cellesystemer Rekombinant erytropoietin produsert i baktener, som ikke glykosylerer eller sialerer produktet, kan for eksempel kan anvendes for produksjon avlkkc-glykosylerte former av erytropoietin Alternativt kan rekombinant erytropoietin produseres i andre systemer som glykosylerer, for eksempel planter inkludert humane celler

Som nevnt ovenfor omfatter den foreliggende oppfinnelse hvilke som helst og alle erylropoietinreseptoraktivitetsmodulatormolekyler i stand til å utøve positiv aktivitet på erytropoietinresponsive celler, uansett molekylets strukturelle slektskap med erytropoietin

I tillegg kan erytropoietin i seg selv modifiseres for skreddersydde dets aktiviteter for et spesifikt- eller spesifikke vev Flere ikke-begrensende strategier som kan utføres for oppnåelse av den ønskete vevsspesifisitet, inkluderer modifikasjoner som forkorter sirkulasjonshalvenngstidcn og dermed reduserer tiden erytropoietinet kan interagere med erytroidforløpere eller modifikasjon av pnmærstrukturen av erytropoietinmolekylet En måte å redusere sirkulasjonshalvenngstiden på, er å fjerne eller modifisere glykosyleringshalvdelene der erytropoietin har tre N-forbundne og O-forbundet Slike varianter av glykosylert erytropoietin kan produseres mange måter For eksempel kan siahnsyrene som avslutter sukkerkjedeendene fjernes ved spesifikke sialidascr avhengig av den kjemiske binding som forbinder siahnsyren til sukkerkjeden Alternativt kan den glykosylerte strukturen brytes ned på ulike måter ved anvendelse av andre enzymer som kløyver ved spesifikke bindinger Teknikker som modifiserer pnmærstrukturen er mangfoldige og inkluderer substitusjon av spesifikke aminosyrer, kjemisk modifikasjon av aminosyrer eller tilførsel av andre strukturer som interfererer med interaksjonen av erytropoietin med enhver av dens reseptorer Anvendelse av slike former av erytropoietin er fullstendig omfattet hen I en foretrukket utførelsesform er halvenngstiden for det ikke-erytropoietiske erytropoietin av oppfinnelsen redusert med omknng 90% fra det naturlige erytropoietin

Noen av disse molekylene vil ikke desto mindre etterlikne virkningene av erytropoietin i seg selv i andre vev eller organer For eksempel er en 17-mer som inneholder aminosyresekvensen av 31-47 til naturlig erytropoietin inaktiv for crytropoiese, men fullstendig aktiv for neurale celler in vitro (Campana & 0'Bnen, 1998 Tnt J Mol Med 1 235-41)

Dessuten kan deriverte erytropoietinmolekyler som er ønskelig for anvendelsene beskrevet her, genereres ved guanidinenng, amidinenng, karbamylenng (karbamylenng), tnnitrofenylering, acetylenng, suksmilenng, nitrenng eller modifikasjon av arginin, lysin, tyrosin, tryptofan eller cysteinrester eller karboksylgrupper, blant andre prosedyrer, slik som begrenset proteolyse, fjerning av aminogrupper og/eller mutasjonssubstitusjon av arginin, lysin, tyrosin, tryptofan eller cysteinrester ved molekylærbiologiske teknikker for produksjon av erytropoietiner som opprettholder et tilstrekkelig nivå av aktiviteter for spesifikke organer og vev, men ikke for andre, slik som erytrocytter (for eksempel (Satake et al, 1990, Biochim Biophys Acta 1038 125-9, inkorporert hen ved referanse i sin helhet) Et ikke-begrensende eksempel som beskrevet nedenfor, er modifikasjonen av erytropoietin argininrester ved reaksjon med et glyoksal slik som fenylglyoksal (i henhold til protokollen av Takahashi, 1977,7 Biochem 81 395-402) Som det sees nedenfor beholder et erytropoietinmolekyl sin neurotrofiske effekt fullstendig Slike erytropoietinmolekyler er fullstendig omfattet for de ulike anvendelsene og sammensetningene beskrevet hen

Syntetiske og rekombinante molekyler, slik som hjerneerytropoietin og renalt erytropoietin, rekombinante pattedyrsformer av erytropoietin, så vel som de naturlig forekommende tumordenverte og rekombinante isoformer, slik som rekombinant uttrykte molekyler, og de preparert ved homolog rckombinasjon, er tilveiebrakt hen Dessuten inkluderer den foreliggende oppfinnelse molekyler som inkluderer peptider som binder til erytropoietmreseptoren, så vel som rekombinante konstruksjoner eller andre molekyler som har delvis eller alle av de strukturelle og/eller biologiske egenskapene av erytropoietin, som inkluderer fragmenter og multimerer av erytropoietin eller dets fragmenter Erytropoietin omfatter her molekyler med endrete erytropoietinrcseptorbindingsaktiviteter, fortrinnsvis med øket reseptoraffinitet, nærmere bestemt som angår forsterket transport over endotelcellebarnerene Muteiner som omfatter molekyler som har ytterligere eller redusert antall av glykosylenngsseter er inkludert hen Som beskrevet ovenfor er betegnelsene "erytropoietin" og "etterliknere" så vel som andre betegnelser vekslende benyttet hen for å referere til de erytropoietinresponsive cellebeskyttende og styrkende molekyler relatert til erytropoietin så vel som de molekylene i stand til å krysse endotelcellebarnérer Molekyler produsert ved transgene dyr er dessuten også omfattet hen Det bør bemerkes at erytropoietinmolekyler som er omfattet hen, ikke nødvendigvis likner erytropoietin strukturelt eller på annen måte, med unntak av evnen til å interagere med erytropoietmreseptoren, modulere erytropoictinrescptoraklivitet eller aktivere erytropoietinaktiverte signahsenngskaskader, slik det er beskrevet heri

Ved ikke-begrensende eksempler inkluderer former av erytropoietin, nyttige for praktisering av den foreliggende oppfinnelse, erytropoietiner slik som dem med endrete aminosyrer ved den karboksyterminale ende, beskrevet i U S patentene 5 457 089 og 4 835 260, asialoerytropoietin og erytropoietinisoformer med ulike antall av siahnsyrerester pr molekyl, som beskrevet i U S patent 5 856 298, polypeptider beskrevet i U S patent 4 703 008, agomster beskrevet i U S patent 5 767 078, peptider som binder til erytropoietmreseptoren som beskrevet i U S patenter 5 773 569 og 5 830 851, små molekyletterliknerc som aktiverer erytropoietmreseptoren som beskrevet i U S patent 5 835 382, og crytropoietinanaloger beskrevet i WO 95/05465, WO 97/18318 og WO 98/181926 Alle av de ovenfor nevnte henvisningene er inkorporert hen i den utstrekning av at slike angivelser refererer til de ulike alternative former og prosesser for preparering av slike former av erytropoietinene av den foreliggende oppfinnelse

Erytropoietin kan oppnås kommersielt, for eksempel under varemerkene "PROCRIT", tilgjengelig fra Ortho Biotech Inc , Rantan, NJ, og "EPOGEN<T>, tilgjengelig fra Amgen, Inc , Thousand Oaks, CA

Aktiviteten (i enheter) av erytropoietin (erytropoietin) og erytropoietinhknende molekyler er tradisjonell definert basert på dets effektivitet i stimulering av rød blodcelleproduksjon i gnagcrmodcller (og som derivert ved internasjonale standarder av erytropoietin) En enhet (U) av alminnelig erytropoietin (MW av~34000) er~8 ng protem (1 mg protein er omtrentlig 125 000 U) Ettersom effekten av erytropoiese er tilfeldig for de ønskete aktivitetene hen og ikke nødvendigvis er en påvisbar egenskap for enkelte av erytropoietinene ifølge oppfinnelsen, er imidlertid definisjonen av aktivitet basert på erytropoietisk aktivitet ikke hensiktsmessig Som anvendt hen er derfor aktivitetsenheten av erytropoietin eller erytropoictinrelaterte molekyler definert som mengden protein nødvendig for å fremkalle den samme aktivitet i neuronale eller andre erytropoietinresponsive cellulære systemer som er fremkalt ved WHO internasjonal standard erytropoietin i det samme systemet Den øvete forskeren vil enkelt bestemme enhetene av et ikke-erytropoietisk erytropoietin eller relatert molekyl ved å følge veiledningen hen

I fortsettelsen av de ovenfor nevnte erytropoietinmodifikasjonene som er nyttige her, går den etterfølgende diskusjonen inn på de ulike erytropoietiner ifølge foreliggende oppfinnelse

Et erytropoietin ifølge oppfinnelsen, kan ha minst ingen sialmsyrehalvdeler, referert til som asialoerytropoietin Fortrinnsvis er et erytropoietin ifølge oppfinnelsen humant asialoerytropoietin 1 alternative utførelsesformer kan erytropoietinet ifølge oppfinnelsen ha minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12 eller 13 siahnsyrerester Det kan prepareres ved desialylering av erytropoietin ved anvendelse av en sialidase, slik som beskrevet i produsentens innpakning for Sialydase A fra ProZyme Inc, San Leandro, California Vanligvis er "PROZYME" "GLYCOPRO" sekvensenngsgrad "SIALYDASE A" (N-acetylneuraminat glycohydrolase, E coli 3 2 118) anvendt for spalting av alle ikke-reduserende terminale siahnsyrerester fra komplekse karbohydrater og glykoprotciner slik som erytropoietin Det vil så spalte forgrenetc siahnsyrer (forbundet til en intern rest) Sialydase A er isolert fra en klon av Arthrobacter ureafaciens

Et erytropoietin kan ha minst et redusert antall av N-forbundne karbohydrater For å fjerne N-forbundne karbohydrater kan erytropoietin behandles med hydrazin, i overensstemmelse med for eksempel fremgangsmåtene beskrevet av Hermentm et al, 1996, Glycobiology 6(2) 217-30 Som beskrevet ovenfor har erytropoietin tre N-forbundne karbohydrathalvdeler, den foreliggende oppfinnelsen omfatter de erytropoietinene med to, en eller ingen N-forbundne karbohydrater

Et erytropoietin ifølge oppfinnelsen kan ha minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med mmst én glykosidase For eksempel kan prosedyren til Chen og Evangelista, 1998, Electrophoresis 19(15) 2639-44 følges Videre kan fjerning av O-forbundne karbohydratet utføres ved å følge fremgangsmåtene beskrevet i Hokke et al, 1995, Eur J Biochem 228(3) 981-1008

Karbohydratdelen av et erytropoietmmolekyl kan ha minst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler Fortrinnsvis er erytropoietinene uttrykt i insekt- eller planteceller Ved et ikke-begrensende eksempel kan ekspresjon av erytropoietin i insektceller ved anvendelse av et baculovirus-ckspresjonssystem, utføres i henhold til Quelle et al, 1989, Blood 74(2) 652-657 En annen fremgangsmåte er beskrevet i U S patent 5 637 477 Ekspresjon i et plantesystem kan utføres i henhold til fremgangsmåten til Matsumotoe/fl/, 1993, Biosci Biotcch Biochem 57(8) 1249-1252. Alternativt vil ekspresjon i baktener resultere i ikke-glykosylertc former av erytropoietin Disse er bare eksempler på fremgangsmåter som er nyttig for produksjon av et erytropoietin ifølge oppfinnelsen, og er på ingen måte begrensende

Et erytropoietin ifølge oppfinnelsen kan ha minst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være reduserte For eksempel kan erytropoietinet være penodat-oksidert erytropoietin, det penodat-oksiderte erytropoietin kan også reduseres

kjemisk med et borhydndsalt, slik som nalriumborhydrid eller natnumcyanoborhydnd Pcnodatoksidermg av erytropoietin kan utføres ved for eksempel fremgangsmåtene beskrevet av Linsley et al, 1994, Anal Biochem 219(2) 207-17 Kjemisk reduksjon

etterfølgende penodatoksidering kan utføres ved å følge fremgangsmåtene til Tonelh og Meints, 1978, J Supramol Struct 8(1)67-78

Et erytropoietin for de tidligere nevnte anvendelser kan ha minst én eller flere modifiserte argininrester for eksempel kan det modifiserte erytropoietin omfatte en R-glyoksalhalvdel på det ene eller flere argininrester, hvor R kan være en aryl, heteroaryl, lavere alkyl, lavere alkoksy eller sykloalkylgruppe, eller en alfa-deoksyglycidylgruppe Som benyttet heri, betyr betegnelsen lavere "alkyl" en rett eller forgrenet kjede, mettet ahfatisk hydrokarbon gruppe som fortrinnsvis inneholder 1-6 karbonatomer Representative for slike grupper er metyl, etyl, isopropyl, isobutyl, butyl, penlyl, heksyl og liknende Betegnelsen "alkoksy" betyr en lavere alkylgruppe som definert ovenfor, festet til resten av molekylet ved oksygen Eksempler på alkoksy inkluderer metoksy, etoksy, propoksy, isopropoksy og liknende Betegnelsen "syktoalkyl" refererer til sykliske alkylgrupper med 3 opptil omkring 8 karbonatomer, som inkluderer for eksempel syklopropyl, syklobutyl, sykloheksyl og liknende Betegnelsen aryl referer til fenyl- og naftylgrupper Betegnelsen heteroaryl refererer til heterosykhske grupper som inneholder 4-10 nngmedlemmer og 1-3 heteroatomer valgt fra gruppen bestående av oksygen, nitrogen og svovel Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til isoksalyl, fenyhsoksazolyl, furyl, pyrimidinyl, kinolyl, tetrahydrokmolyl, pyndyl, imidazolyl, pyrrohdinyl, 1,2,4-tnazolyl, tiazolyl, tienyl og liknende R-gruppcn kan være substituert, som for eksempel 4-trihydroksybutylgruppen av 3-deoksyglukoson Typiske eksempler på R-glyoksalsammensetninger er glyoksal, metylglyoksal, 3-deoksyglukoson og fenylglyoksal Foretrukne R-glyoksalsammensetninger er metylglyoksal eller fenylglyoksal En eksemplansk fremgangsmåte for slik modifikasjon kan finnes i Werber et al, 1975, Isr J Med Sei 11(11) 1169-70, ved anvendelse av fenylglyoksal

I et ytterligere eksempel kan minst én argininrest modifiseres ved reaksjon med et tilstøtende diketon, slik som 2,3-butandion eller sykloheksandion, fortrinnsvis i omkring 50 milhmolar boratbuffer med pH 8-9 En prosedyre for den sistnevnte modifikasjon med 2,3-butandion kan utføres i henhold til Riordan, 1973, Biochemistry 12(20) 3915-3923, og den med sykloheksanon i henhold til Patthy et al, 1975, J Biol Chem 250(2) 565-9

Et erytropoietin ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte minst én eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-terminale aminogruppen av erytropoietinmolekylet, slike modifikasjoner er de som resulterer fra reaksjon av lysinrcsten med et aminogruppemodifiserende middel I en annen utførelsesform kan lysinrester modifiseres ved reaksjon med glyoksaldenvatcr, slik som reaksjon med glyoksal, metylglyoksal og 3-deoksyglukoson for å danne alfa-karboksyalkyldenvater Eksempler er reaksjon med glyoksal for å danne karboksymetyllysin som i Glomb og Monnier 1995, J Biol Chem 270(17) 10017-26, eller med metylglyoksal for å danne (1 -karboks<y>et<y>l)l<y>sm som i Degenhart et al, 1998, Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 44(7) 1139-45 Den modifiserte lysmresten kan ytterligere reduseres kjemisk For eksempel kan erytropoietin biotinyleres via lysingrupper, slik som i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5, hvor D-biotmyl-e-aminokaproinsyre-N-hydroksysuksinimidester ble reagert med erytropoietin, etterfulgt av fjerning av ureagert biotm ved gelfiltrenng på en Ccntricon-10-kolonne, som beskrevet i Wojchowski og Caslake, 1989, Blood 74(3) 952-8 I denne presentasjonen benytter forfatterne tre ulike fremgangsmåter for å biotinylere erytropoietin, der enhver av dem kan benyttes for preparering av erytropoietinene for anvendelse hen Biotin kan tilsettes Ul (1) siahnsyrehalvdelene (2) karboksylatgruppene eller (3) aminogruppene

I en annen foretrukket utførelsesform kan lysinet reageres med et aldehyd eller et reduserende sukker for dannelse av etlmin, som kan stabiliseres ved reaksjon som med natnum cyanoborhydnd for å danne et N-alkylcrt lysin, slik som glusitolyllysin, eller som i tilfelle av reduserende sukkcre kan stabiliseres ved Amadon eller Heyns omgruppenng for å danne et alfa-deoksy-alfa-aminosukker slik som alfa-deoksy-alfa-fruktosyllysin Som et eksempel er preparenng av et fruktosyllysinmodifisert protein ved inkubasjon med 0,5 M glukose i natnumfosfatbuffer med pH 7,4160 dager beskrevet av Makila et al, 1992, J Biol Chem 267 5133-5138 I et annet eksempel kan lysingruppen karbamylercs, slik som i kiaft av reaksjon med cyanat-ion eller alkyl- eller arylkarbamylert eller -Uokarbamylert med et alkyl- eller aryl-isocyanat eller

-isotiocyanat eller den kan acyleres ved et reaktivt alkyl- eller arylkarboksylsyredenvat, slik som ved reaksjon med eddiksyreanhydnd eller ravsyreanhydnd eller ftalsyreanhydnd Modifikasjon av lysingrupper med 4-sulfofenylisotiocyanat eller med eddiksyreanhydnd er eksemplariske, begge er beskrevet i Gao et al, 1994, Proe Nati Acad Sei USA 91(25) 12027-30 Lysingrupper kan også tnnitrofenylmodifisercs ved reaksjon med tnnitrobenzensulfonsyre eller fortnnnsvis med dets salter Slike fremgangsmåter er beskrevet nedenfor i eksempel 5

Minst én tyrosinrest av erytropoietin kan modifiseres i en aromatisk posisjon ved en elektrofil reagens, slik som ved nitrenng eller jodenng Ved anvendelse avlkke-begrensende eksempler, kan erytropoietin reageres med tetranitrometan (Nestler et al, 1985, J Biol Chem 260(12) 7316-21), eller jodert som beskrevet i eksempel 5

Minst en asparginsyre- eller en glutaminsyrerest av et erytropoietin kan modifiseres, slik som ved reaksjon med karbodnmid fulgt av reaksjon med el amin slik som, men ikke begrenset til glysinamid Eksempler på slike modifiseringer besknves i eksempel 5

I et annet eksempel kan en tryptofanrest av et erytropoietin modifiseres, slik som ved reaksjon med N-bromsuksinimid eller N-klorsuksinimid ved å følge fremgangsmåten slik som beskrevet i Josse et al, Chem Biol Interact, 1999 Mai 14, 119-120

I enda et annet eksempel kan et erytropoietinmolekyl prepareres ved fjerning av minst én ammogruppe, som kan oppnås ved reaksjon med ninhydnd fulgt av reduksjon av den påfølgende karbonylgruppe ved reaksjon med borhydnd

I enda et ytterligere eksempel er et erytropoietin tilveiebrakt som har minst en åpning av én cysteinforbindelse i erytropoietinmolekylet ved reaksjon med et reduserende middel, slik som ditiotreitol, fulgt av reaksjon av de påfølgende sulfhydrylene med jodacetamin, jodeddiksyre eller en annen elektrofil for å hindre gjendannelse av disulfidbindingene

Et erytropoietin er tilveiebrakt som har minst én substitusjon av hvilke som helst av et antall aminosyrer, slik som leusm med minst én av lysin-, arginm-, tryptofan-, tyrosin- eller cysteinrester av erytropoietin ved anvendelse av molekylærbiologiske teknikker

Et modifisert erytropoietin prepareres ved å utsette et erytropoietin for en begrenset kjemisk proteolyse som er målrettet mot spesifikke rester, for eksempel ved å kløve etter tryptofanrester Slike resulterende erytropoietinfragmenter er omfattet hen

Som bemerket ovenfor kan et erytropoietin nyttig for formålet hen, ha mmst én av de tidligere nevnte modifisenngene, men kan ha mer enn én av modifikasjonene ovenfor Ved eksempel av et modifisert erytropoietin med en modifikasjon ved karbohydratdelen av molekylet og en modifikasjon ved aminosyredelen, kan et modifisert erytropoietin være asialoerytropoietin og ha sine lysinrester biotinylert eller karbamylert

Ulike erytropoietinmolekyler og farmasøytiske sammensetninger som inneholder dem for anvendelsene beskrevet hen er således innbefattet Slike erytropoietinmolekyler inkluderer, men er ikke begrenset til asialoerytropoietin, N-deglykosylert erytropoietin, O-deglykosylert erytropoietin, erytropoietin med redusert karbohydratinnhold, erytropoietin med endrete glykosylenngsmønstrc, erytropoietin med karbohydrater oksidert, så redusert, arylglyoksalmodifisert erytropoietin, alkylglyoksalmodifisert erytropoietin, 2,3-butandionmodifiscrt erytropoietin, sykloheksandionmodifisert erytropoietin, biotinylert erytropoietin, N-alkylert lysyl-crytropoietin, glusitolyllysin-erytropoietin, alfa-dcoksy-alfa-fruktosyllysinerytropoietin, karbamylert erytropoietin, acetylert erytropoietin, suksinylert erytropoietin, alfa-karboksy-alkyl erytropoietin, nitrert erytropoietin, jodert erytropoietin, for å nevne noen representative, dog ikke-bcgrensende eksempler basert på lærdommen hen Foretrukket er de ovenfor nevnte modifiserte former basert på humant erytropoietin

Enkelte av de tidligere nevnte erytropoietinene er dessuten nye, og oppfinnelsen er rettet mot slike forbindelser, så vel som farmasøytiske sammensetninger som disse omfattes av Ved å benytte ikke-begrensende eksempler inkluderer slike nye er<y>tropoietiner penodatoksidert erytropoietin, glusitolyllysin erytropoietin, fruktosyllysin erytropoietin, 3-deoksyglukoson erytropoietin og karbamylert asialoerytropoietin

Et utvalg av verteksprcsjonsvcktorsystemer kan benyttes for produksjon av erytropoietinene og de erytropoietinrelaterte molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse Slike vertekspresjonssystemer representerer hjelpemidler der erytropoietinene av interesse kan produseres og deretter renset, men representerer også celler som kan, når de ei transformert eller transfektert med de hensiktsmessige nukleotidkodende sekvensene, oppnå det modifiserte erytropoietingenproduktet in situ Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, bakterier, insekt, plante, pattedyr, inkludert humane vertssystemer, slik som, men ikke begrenset til, insektcellesystemer infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (for eksempel bakulovirus) inneholdende de modifiserte erytropoictinproduktcne som koder sekvensene, planteccllesystemer infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (for eksempel blomkålmosaikkvirus, CaMV, tobakkmosaikkvirus, TMV) eller transformert med rekombinante plasmidekspresjonsvektorer (for eksempel Ti-plasmid) inneholdende erytropoietinrelaterte molekylkodende sekvenser, eller pattcdyrccllesystemer som inkludcier humane cellesystemer (for eksempel HT1080, COS, CHO, BHK, 293,3T3) inneholdende rekombinante ekspresjonskonstruksjoner inneholdende promotere utledet fra pattedyrgenomets celler (for eksempel metallotionein promoter) eller fra pattedyrvirus (for eksempel adcnovirus sen promoter, vacciniavirus 7 5K-promoter)

I tillegg kan en vertsccllestamme velges som modulerer ekspresjonen av de innsatte sekvenser, eller modifiserer og prosesserer genproduktet på den spesifikke måten ønsket Slike modifikasjoner (for eksempel glykocylcnng) og prosessering (for eksempel kløyving) av proteinprodukter kan være viktig for proteinets funksjon Mulige vertsceller har karaktenstika og spesifikke mekanismer for den post-translasjonelle prosessering og modifikasjon av proteiner og genprodukter Hensiktsmessige cellelinjer eller vertssystemer kan velges for å sikre den korrekte modifikasjonen og prosesseringen av det fremmede proteinet som er uttrykt 1 dette henseende kan eukaryote vertsceller med det cellulære maskinen for korrekt prosessering av det primære transknpt, glykocylenng og fosforylenng av genproduktet bh benyttet Slike pattedyrvertsceller som inkluderer humane vertsceller, inkluderer, men er ikke begrenset til, HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 og WI38

For langtids høyutbytteproduksjon av rekombinante proteiner er stabil ekspresjon foretrukket For eksempel kan cellelinjer som stabilt uttrykker det erytropoietinrelaterte molekylgenproduktet konstrueres 1 stedet for anvendelse av ekspresjonsvektorer inneholdende viral opprinnelse for replikasjon, kan celler transformeres med DNA, kontrollert ved hensiktsmessige ekspresjonskontrollelementer (for eksempel promoter, enhancer, sekvenser, transknpsjonsterminatorer, polyadenyleringsseter, osv) og en valgbar markør Etter infeksjon av det fremmede DNA, kan konstruerte celler tillates å vokse11-2 dager i et anriket medium, og skiftes så til el selektivt medium Den selekterbare markøren i del rekombinante plasmid konfererer resistens for utvelgelsen og tillater celler stabilt å integrere plasmidet i deres kromosomer og vokser for å danne foci som videre kan klones og ekspandere inn i cellelinjer Denne fremgangsmåte kan fordelaktig benyttes for konstruksjon av cellelinjer som uttrykker det erytropoietinrelaterte molekylgenproduktet Slike konstruerte cellelinjer er spesielt nyttige i screening og evaluering av forbindelser som påvirker den endogene aktivitet av det erytropoietinrelaterte molekylgenproduktet

Alternativt kan ekspresjonskaraktenslikken av et endogent erytropoietin-gen i en cellelinje eller mikroorganisme modifiseres ved innsetting av et heterologt DNA-regulerende element i en stabil cellelinjes genom eller en klonet mikroorganisme slik at del innsatte regulatonske elementet er operativt forbundet med det endogene erytropoictin-genet For eksempel kan et endogent erytropoietin-gen som normalt er "transkripsjonen stille", dvs et erytropoietin-gen som normalt ikke er uttrykt, eller som bare uttrykkes i svært lave nivå i en cellelinje, aktiveres ved innsetting av el regulatonsk element i stand til å fremme ekspresjon av et normalt uttrykt genprodukt i den cellelinjen eller mikroorganismen Alternativt kan et transknpsjonelt stille, endogent erytropoietin aktiveres ved innsetting av et promiskuøst regulatonsk element som fungerer på tvers av celletyper

Et heterologt, regulatonsk element kan innsettes i en stabil cellelinje eller i en klonet mikroorganisme, slik at det er operativt forbundet med el endogent erylropoietin-gen ved anvendelse av teknikker slik som målrettet, homolog rekombinasjon, som er velkjent for dem med dyktighet innen faget, og beskrevet for eksempel i fransk patent

2 646 438 til Pasteunnstituttet, U S patent 4 215 051 til Chappel, U S patent 5 578 461 til Sherwm et al, Internasjonal søknad PCT/US92/09627 (WO 93/09222) ved Seiden et al, og Internasjonal søknad PCT/US90/06436 (WO 91/06667) ved Skoultchi et al, der alle er inkorporert hen i sin helhet ved referanse

I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse kan et erytropoietinrelatert molekyl som delvis mangler sialrester, eller fullstendig mangler sialrester produseres i pattedyrceller, inkludert en human celle Slike celler kan konstrueres som mangelfulle i, eller mangle enzymene som tilføyer siahnsyre, dvs p-galaktosidase a 2,3 sialyltransferase ("a 2,3 sialyltransferase") og P-galaktosidase a 2,6 sialyltarnsferase ("a 2,6 sialyltransferase") aktivitet 1 en utførelsesform er en pattedyrcelle anvendt der et av eller begge a 2,3 sialyltransferasegenet og/eller a 2,6 sialyltransferasegenet er fjernet Slike delesjoner kan konstrueres ved anvendelse av gen-knockout-leknikker velkjent innen fagfeltet I en annen utførelsesform er dihydrofolatreduktase (DHFR) mangelfulle Chinese Hamster Ovary (CHO)-celler anvendt som vertscellen for produksjon av rekombinante erytropoietinrelaterte molekyler CHO-celler uttrykker ikke a-2,6-enzymet sialyltransferase og tilføyer derfor ikke siahnsyre12,6 forbindelsen til N-forbundne ohgosakkander av glykoproteiner produsert i disse cellene Som et resultat mangler rekombinante proteiner produsert i CHO-celler siahnsyre i 2,6 forbindelsen til galaktose (Sasaki et al (1987, Takeuchi et al supra, Mutsaeref a/ Eur J Biochem 156,651 (1986), Takeuchi et al J Chromotgr 400,207(1987) I en utførelsesform for produksjon av en vertscelle for produksjon av asialoerytropoietin, er genet som koder for a-2,3-sialyltransfcrase i CHO-celler fjernet Slike a-2,3-sialyltransferase knockout-CHO-celler mangler fullstendig sialyltransferaseaktivitet, og som et resultat er de nyttige for den rekombinante ekspresjonen og produksjonen av asialoerytropoietin

I en annen utførelsesform kan asialoerytropoietinet produseres vedlnterferermg med siahnsyretransport til golgi-apparatet for eksempel, (Eckhart et al, 1998, J Biol Chem 273 20189-95) Ved anvendelse av fremgangsmåter velkjent for dem øvet innen fagfeltet (for eksempel Oelmann et al, I Biol Chem 276 26291-300), kan mulagenese av nukleotidsukkeret CMP-siahnsyre transportøren gjennomføres for produksjon av mutanter av Chinese Hamster Ovarie-celler Disse cellene kan ikke tilføre siahnsyrerester til glykoproteiner slik som erytropoietin, og produserer bare asialoerytropoietin Transfekterte pattedyrceller som produserer erytropoietin produserer også cytosohsk siahdase som om den lekker ut i dyrkingsmediet degraderer asialoerytropoietin med høy effektivitet (for eksempel Gramer et al, 1995, Biotechnology 13 692-698) Ved anvendelse av fremgangsmåter velkjent for dem kunnskap innen fagfeltet (for eksempel fra informasjon tilveiebrakt i Ferrari et al, 1994, Glycobiology 4 367-373), kan cellelinjer transfekteres, muteres eller på annen måte drives til konstitutiv produksjon av siahdase På denne måte kan asialoerytropoietin produseres under fremstilling av asialoerytropoietin

I praktiseringen av el aspekt av den foreliggende oppfinnelse kan en farmasøytisk sammensetning, som beskrevet ovenfor inneholdende et erytropoietin, administreres til et pattedyr ved en hvilken som helst rute som tilveiebringer et tilstrekkelig nivå av et erytropoietin i vaskulaturen for å tillate translokasjon over en endotelcellebarnere og ha gunstige effekter på erytropoietinresponsive celler Når den benyttes for formålet å perfusere et vev eller et organ, er liknende resultater ønskelige I tilfellet hvor erytropoietinet er benyttet for ex vivo perfusjon, kan erytropoietinet være enhver form av erytropoietin, slik som de tidligere nevnte erytropoietinene, men ikke begrenset til disse, og kan inkludere naturlige erytropoietiner som inkluderer humant erytropoietin I tilfellet hvor cellene eller vevet er ikke-vaskulansert og/eller administrasjonen er ved bading av cellene eller vevet med sammensetningen av oppfinnelsen, tilveiebringer den farmasøytiske sammensetningen en effektiv erylropoietinresponsiv cellefordelaktig mengde av et erytropoietin Endotelcellebarnerene som et erytropoietin kan translokere over, inkluderer tette forbindelser, perforerte forbindelser, forbindelser med små vinduer og hvilke som helst andre typer av endotelbarrierer tilstede i et pattedyr En foretrukket barriere er en endotelcelletett forbindelse, men oppfinnelsen er ikke så begrensende

De tidligere nevnte erytropoietinene er nyttige generelt for den terapeutiske eller profylaktiske behandlingen av humane sykdommer i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystemet som primært har nevrologiske eller psykiatriske symptomer, øyesykdommer, kardiovaskulære sykdommer, kardiopulmonare sykdommer, respiratonske sykdommer, nyre, urinveis- og reproduktive sykdommer, gastrointestinale sykdommer og endokrine og metabolske abnormiteter Nærmere bestemt inkluderer slike tilstander og sykdommer hypoksiske tilstander, som ugunstig påvirker excitable vev, slik som excitable vev i sentralnervesystemvev, perifert nervesystemvev, hjertevev eller retinalt vev slik som for eksempel hjerne, hjerte eller retina/øye Derfor kan oppfinnelsen benyttes for behandling av eller hindre skade på cxcitabelt vev som resulterer fra hypoksiske tilstander i et utvalg av tilstander og omstendigheter Ikke-begrensende eksempler på slike tilstander og omstendigheter er tilveiebrakt i tabellen nedenfor

I eksemplet for beskyttelse av ncrvevevpatologier som kan behandles i samsvar med foreliggende oppfinnelse, inkluderer slike palologier, de som resulterer fra redusert oksygenenng av nervevev Enhver tilstand som reduserer tilgjengeligheten av oksygen til nervevev, som resulterer i stress, skade og tilslutt nervecclledød, kan behandles ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse Generelt referert til som hypoksi og/eller ischenn, oppstår disse tilstandene ifra eller inkluderer, men er ikke begrenset til, slag, vaskulær okklusjon, prenatalt eller postnatalt oksygentap, pustebesvær, kvelning, nær drukning, karbonmonooksidforgiftning, røykinhalasjon, traume som inkluderer kirurgi og radioterapi, asfyksi, epilepsi, hypoglykemi, kronisk obstruktiv pulmonar sykdom, emfysem, respiratonsk hdelsessyndrom hos voksne, hypotensivt sjokk, septisk sjokk, anafylaktisk sjokk,lnsulmsjokk, sigdcelleanemi, hjertestans, dysrytmi, nitrogennarkose og nevrologiske mangler forårsaket av hjerte-lunge-bypass-prosedyrer

i en utførelsesform kan for eksempel de spesifikke EPO-sammensetningene administreres for å hindre skade eller vevsødeleggelse som resulterer fra risiko for skade eller vevsødeleggelse under kirurgiske prosedyrer, slik som for eksempel tumorreseksjon eller aneunsmereparasjon Andre patologier forårsaket av eller som resulterer fra hypoglykemi som kan behandles ved fremgangsmåtene beskrevet hen, inkluderer insuhnoverdose, også referert til somlatrogen hyperinsuhnemi, insulmom, vcksthormonmangler, hypokortisohsme, legemiddeloverdose og enkelte tumorer

Andre patologier som resulterer fra eksitabel nervevevsskade, inkluderer anfallssykdommer, slik som epilepsi, krampetrekninger eller kroniske anfallssykdommer Andre tilstander og sykdommer som kan behandles inkluderer sykdommer som slag, multippel sklerose, lavt blodtrykk, hjertestans, Alzheimers sykdom, Parkinson's sykdom, cerebral palsi, hjerne- eller ryggmargstraume, AIDS-demens, aldersrelatert tap av kognitiv funksjon, hukommelsestap, amyotrofisk lateral sklerose, anfallssykdommer, alkoholisme, rctinal ischemi, optisk nerveødeleggelse som resulterer fra glaukom og nervetap

De spesifikke sammensetningene og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for behandling av tilstander av, og ødeleggelse på retmalt vev Slike forstyrrelser inkluderer, men er ikke begrenset til, retinal ischemi, makulær degenerering, retinal avsondring, retmitis pigmentosa, atenosklerotisk retinopati, hypertensiv retinopati, rctmal arteneblokkenng, retinal veneblokkenng, hypolensjon og diabetisk retinopati

I en annen utførelsesform kan fremgangsmåtenes prinsipper ifølge oppfinnelsen benyttes for beskyttelse eller behandling av skade som resulterer fra stråhngsødeleggelse på excitable vev En ytterligere anvendelse av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er i behandling av neurotoksinforgiflning, slik som domoinsyre skalldyrforgifining, neurolatynsme og Guam sykdom, amyotrofisk lateral sklerose og Parkinson's sykdom

Som nevnt ovenfor er den foreliggende oppfinnelse også rettet mot en fremgangsmåte for å styrke excitabel vevsfunksjon i et pattedyr ved penfer administrasjon av et erytropoietin som beskrevet ovenfor Ulike sykdommer og tilstander kan behandles ved anvendelse av denne fremgangsmåte, og videre er denne fremgangsmåten nyttig for å styrke kognitiv funksjon i fravær av enhver tilstand eller sykdom Disse anvendelsene av den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i ytterligere detalj nedenfor og inkluderer styrking av lænng og trening hos både humane og ikke-humane pattedyr

Tilstander og sykdommer som kan behandles ved fremgangsmåtene av dette aspektet av den foreliggende oppfinnelse rettet til sentralnervesystemet, inkluderer, men er ikke begrenset hl, humørforstyrrclser, angstforstyrrelser, depresjon, autisme, oppmerksomhetsmanglende hyperaktiv forstyrrelse og kognitiv dysfunksjon Disse tilstander har fordel av styrking av neuronal funksjon Andre forstyrrelser som kan behandles i samsvar med lærdommen av den foreliggende oppfinnelse inkluderer søvnforstyrrelse, for eksempel søvnapné og reiserelaterte forstyrrelser, sub arachniode og aneunsmale blødninger, hypotensivt sjokk, rystende skade, septisk sjokk, anafylaktisk sjokk og følgesykdom av ulike enccfahtter og meningittcr, for eksempel bindevcvsykdomsrelaterte ccrebnter slik som lupus Andre anvendelser inkluderer hindring av eller beskyttelse mot forgiftning av neurotoksiner, slik som domoinsyre skalldyrforgjftning, neurolatyrisme og Guam sykdom, amyotrofisk lateral sklerose og Parkinson's sykdom, postoperativ behandling for embohsk eller ischemisk skade, hel hjernestråhng, sigdcelleknse, og eclampsi

En ytterligere gruppe av tilstander som kan behandles ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer mitokondnell dysfunksjon av enten en arvelig eller av ervervet natur, som er årsak til et utvalg av neurologiske sykdommer representert ved neuronal skade og død For eksempel er Leigh's sykdom (subakutt nekrotiserende cncefalopati)karakterisert vedprogressivt synstap og encefalopati, på grunn av neuronalt tap og myopati I disse tilfeller svikter defekt mitokondnell metabolisme i å tilføre nødvendig høyt energisubstrat for å forsyne metabolismen hos excitable celler En erytropoietinreseptoraktivitetsmodulator optimaliserer sviktende funksjon i et utvalg av mitokondnelle sykdommer Som nevnt ovenfor har hypoksiske tilstander ugunstig innvirkning på excitable vev De excitable vevene inkluderer, men er ikke begrenset til sentralnervcsystemvev, perifert nervesystemvev og hjertcvev I tillegg til tilstandene beskrevet ovenfor er fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige i behandlingen avlnhalenngsforgifimng slik som av karbonmonooksid og røyk, alvorlig astma, respiratonsk hdelsessyndrom hos voksne, og kvelning og nær drukning Ytterligere tilstander som skaper hypoksiske tilstander eller på andre måter induserer skader på excitabelt vev inkluderer hypoglykemi som kan forekomme vev uheldig dosering av insulin eller ved insuhnproduserendc neoplasma (insuhnoma)

Ulike neurofysiologiske forstyrrelser som er antatt å stamme fra skade på excitabelt vev, kan behandles ved de umiddelbare fremgangsmåtene Kroniske forstyrrelser hvor nerveskade er involvert og hvor behandling ved den foreliggende oppfinnelsen er tilveiebrakt, inkluderer forstyrrelser relatert til sentralnervesystemet og/eller det perifere nervesystemet som inkluderer aldersrelatert tap av kognitiv funksjon og senil demens, kroniske anfallsforstyrrelser, Alzheimers sykdom, Parkinson's sykdom, demens, hukommelsestap, amyotrofisk lateral sklerose, multippel sklerose, tuberøs sklerose, Wilson's sykdom cerebral og progressiv supranukleær palsy, Guams sykdom, Lewy body demens, pnonsykdommer slik som spongiform encefalopatier, for eksempel Creutzfeldt-Jakobs sykdom, Huntington's sykdom, myotonisk dystrofi, Freidnch's ataksi og andre ataksier, så vel som Gilles de la Tourette's syndrom, anfallsforstyrrelser slik som epilepsi og kronisk anfallsforstyrrelse, slag, hjerne eller ryggmargstraume, AIDS demens, alkoholisme, autisme, retinal ischemi, glaukom, autonome funksjonsforstyrrelser, slik som høyt blodtrykk og søvnforstyrrelser og neuropsykiatnske forstyrrelser som inkluderer, men er ikke begrenset til schizofreni, schizoaffektiv forstyrrelse, oppmerksomhetsmanglende forstyrrelse, dystymisk forstyrrelse, hoveddepressiv forstyrrelse, mani, angstforstyrrelse, psykoaktiv subslansbruksforstyrrelse, angst, panikk forstyrrelser så vel som unipolare og bipolare affektive forstyrrelser Ytterligere neuropsykiatnske og neurodegenererende forstyrrelser inkluderer for eksempel de opplistet i Amencan Psychiatnc Association's Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders (DSM), den siste versjonen av denne er inkorporert hen ved referanse i sin helhet

I en annen utførelsesform kan rekombinante, kimære toksinmolekyler som omfatter erytropoietin benyttes for terapeutisk levering av toksiner for behandling av prohferative forstyrrelser, slik som cancer eller virale forstyrrelser, slik som subakutt forkalkende panencefahtt

Den etterfølgende tabellen opplister ytterligere eksempler, ikke-bcgrensende indikasjoner med hensyn til de ulike tilstander og sykdommer mottakelig for behandling ved de tidligere nevnte erytropoietinene

Som nevnt ovenfor er disse sykdommene, forstyrrelsene eller tilstandene bare illustrative for rekkevidden og fordelene tilveiebrakt ved erytropoietinene av foreliggende oppfinnelse Følgelig tilveiebringer denne oppfinnelsen generelt terapeutisk eller profylaktisk behandling av konsekvensene av mekanisk traume eller av humane sykdommer Terapeutisk eller profylaktisk behandling for sykdommer, forstyrrelser eller tilstander av CNS og/eller det perifere nervesystem er foretrukket Terapeutisk eller profylaktisk behandling for sykdommer, forstyrrelser eller tilstander som har en psykiatrisk komponent er tilveiebrakt Terapeutisk eller profylaktisk behandling for sykdommer, forstyrrelser eller tilstander som inkluderer, men ikke begrenset til de som har en oflalmisk-, kardiovaskulær-, kardiopulmonar-, respiratonsk-, nyre-, urinveis-, forplantnings-, gastromlestinal-, endokrin- eller metabolsk komponent er tilveiebrakt

I en utførelsesform kan en slik farmasøytisk sammensetning av et erytropoietin administreres systemisk for beskyttelse eller styrking av de målrettete cellene, vevet eller organet Slik administrasjon kan være parenteral via inhalering eller transmukosal, for eksempel oral, nasal, rektal, intravaginal, subhngual, submukosal eller transdermal Fortrinnsvis er administrasjon parenteral, for eksempel via intravenøs eller intraperitoneal injeksjon, og inkluderer også, men er ikke begrenset til intraartenell, intramuskulær, intradermal og subkutan administrasjon

For andre ruter av administrasjon, slik som ved anvendelse av et perfusat eller en injeksjon i et organ eller annet lokal administrasjon, vil en farmasøytisk sammensetning tilveiebringes som resulterer i liknende nivåer av et erytropoietin som beskrevet ovenfor Et nivå på omkring 15 pM-30 nM er foretrukket.

De farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan omfatte en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse og en farmasøytisk aksepterbar bærer I en spesifikk utførelsesform betyr betegnelsen "farmasøytisk akseptabel" godkjent ved et tilsynsorgan for forbunds- eller statsregjenngen eller opplistet i U S Pharmacopeia eller annet generell gjenkjent, fremmed apotekerbok for anvendelse i dyr, og mer spesielt i mennesker Betegnelsen 'Tjærer" refererer til fortynningsmiddel, adjuvans, bindemiddel eller transportmiddel som terapeutikumet er administrert med Slike farmasøytiske bærere kan være sterile væsker, slik som saltoppløsninger i vann og oljer, som inkluderer de av petroleum, animalsk, vegetabilsk eller syntetisk oppnnnelse, slik som pcanøttolje, soyabønneolje, mineralolje, sesamolje og liknende En saltoppløsning er en foretrukket bærer når den farmasøytiske sammensetningen er administrert intravenøst Saltoppløsninger og vandige dekstroser og glyserolløsmnger kan også benyttes som væskebærere, fortrinnsvis forlnjiserbare løsninger Egnete farmasøytiske bindemidler inkluderer stivelse, glukose, laktosc, sukrose, gelatin, malt, ns, mel, kalk, silicagel, natnumstearal, glyserolmonostearat, talkum, natriumklond, tørket skummet melk, glyserol, propylen, glykol, vann, metanol og liknende Sammensetningen kan om ønskelig også inneholde mindre mengder av fuktemidler eller emulgerende midler, eller pH-bufrende midler Disse sammensetningene kan ha form av løsninger, suspensjoner, emulsjoner, tabletter, piller, kapsler, pulvere, formuleringer med vedvarende frigivning og liknende Sammensetningen kan være formulert som en stikkpille med tradisjonelle bindere og bærere, slik som tnglysender Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan være formulert nøytral eller som saltformer Farmasøytisk akseptable salter inkluderer de som er formet med frie ammogruppcr, slik som de avledet fra hydroklor, fosfor, eddik, oksal, tartarsyrer osv , og de i form av frie karboksylgrupper, slik som de avledet fra natrium, kalium, ammonium, kalsium, jernhydroksider, isopropylamin, trietylamin, 2-elylaminoetanol, histidin, prokain osv Eksempler på egnete farmasøytiske bærere er beskrevet i "Remington's Pharmaceutical Sciences", ved E W Martin Slike sammensetninger vil inneholde en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen, fortrinnsvis i renset form, sammen med en passende mengde av en bærer for å tilveiebringe formen for passende administrasjon til pasienten Formuleringen skal passe admimstrasjonsmåten Farmasøytiske sammensetninger tilpasset for oral tilførsel, kan tilveiebringes som kapsler eller tabletter, pulvere eller granuler, løsninger, siruper eller suspensjoner (i vandige eller ikke-vandige væsker), spiselig skum eller kremer, eller som emulsjoner Tabletter eller harde gelatinkapsler kan omfatte laktose, stivelse eller derivater derav, magnesiumstearat, natriumsakkann, cellulose, magnesiumkarbonat, stcannsyre eller salter derav Bløte gelatinkapsler kan omfatte vegetabilske oljer, voks, fett, halvmassive stoffer eller væskepolyoler osv Løsninger og siruper kan omfatte vann, polyoler og sukkere

Et aktivt middel ment for oral tilførsel kan belegges med eller blandes med et materiale som forsinker oppløsningen og/eller absorpsjonen av det aktive middel i fordøyelseskanalen (for eksempel kan glyserylmonostearat eller glyseryldistearat benyttes) Derved kan den vedvarende frigjøringen av et aktivt middel oppnås over mange timer, og om nødvendig kan det aktive middelet beskyttes fra degradering i magesekken Farmasøytiske sammensetninger for oral tilførsel kan formuleres for å fremme frigjøring av et aktivt middel ved en bestemt gastrointestinal lokalisering pga spesifikk pH eller av enzymatiske forhold

Farmasøytiske sammensetninger tilpasset transdermal tilførsel, kan tilveiebringes i atskilte porsjoner, for å bli værende i nærkontakt med mottakerens epidermis over en lengre tidsperiode Farmasøytiske sammensetninger tilpasset topikal tilførsel, kan tilveiebringes som salve, krem, suspensjon, hudkrem, pulver, løsning, pasta, gele, spray, aerosol eller olje For topikal tilførsel til hud, munn, øye eller andre utvendige vev benyttes fortrinnsvis en topikal salve eller krem Når den formuleres i en salve kan den aktive ingrediensen benyttes med enten en parafin eller en vann-blandbar salvebase Alternativt kan den aktive ingrediens formuleres i en krem med en olje-i-vann base eller en vann-i-oljc base Farmasøytiske sammensetninger tilpasset topikal tilførsel til øye inkluderer øyedråper 1 disse sammensetningene kan den aktive ingrediensen oppløses i eller suspenderes i en egnet bærer, for eksempel i et vandig løsningsmiddel Farmasøytiske sammensetninger tilpasset topikal tilførsel i munnen inkluderer drops, pastiller og skyllemiddel for munnen

Farmasøytiske sammensetninger tilpasset nasal og pulmonar tilførsel, kan omfatte faste bærere slik som pulvere (fortrinnsvis med parlikkelstørrclse i området 20 til 500 mikron) Pulveret kan tilføres på samme måte som snus, dvs ved rask inhalering gjennom nesen fra en beholder med pulver holdt tett inntil nesen Sammensetninger tilpasset nasal tilførsel kan alternativt omfatte væskebærere, for eksempel nesespray eller nesedråper Inhalering direkte til lungene kan alternativt utføres ved dyp inhalering eller anbringelse gjennom et munnstykke inn i orofarynks Disse sammensetningene kan omfatte vandige- eller oljeløsmnger av den aktive ingrediens Sammensetninger for tilførsel ved inhalering kan leveres i spesielt tilpassete anordninger som inkluderer, men ikke begrenset til aerosol på trykkboks, forstøvere eller pusteanordninger, som konstrueres for å tilveiebringe forhåndsbestemte doseringer av den aktive ingrediens I en foretrukket utførelsesform tilføres farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen til neseborene direkte eller til lungene via nesebor eller orofarynks

Farmasøytiske sammensetninger tilpasset rektal tilførsel tilveiebringes som stikkpiller eller klyster Farmasøytiske sammensetninger tilpasset vaginal tilførsel tilveiebringes som pessar, tamponger, kremer, geléer, pasta, skum eller sprayformulennger

Farmasøytiske sammensetninger tilpasset parenteral tilførsel inkluderer vandige og ikke-vandige sterile, injiserbare løsninger eller suspensjoner, som kan inneholde antioksidanter, buffere, baktenostater og løsningsmidler som gjør sammensetningene hovedsakelig isotone med mottakerens blod Andre komponenter som kan være tilstede i slike sammensetninger, inkluderer for eksempel vann, alkoholer, polyoler, glysenn og vegetabilske oljer Sammensetninger tilpasset parenteral tilførsel kan presenteres i enhetsdose- eller multidosebeholdere, for eksempel forseglete ampuller og rør, og kan lagres i en frysetørket (lyofihsert) tilstand som kun krever tilsetting av en steril væskebærer, for eksempel steril saltoppløsning for injeksjoner umiddelbart før anvendelse Ekstemporerte injeksjonsløsninger og suspensjoner kan prepareres fra sterile pulvere, granuler og tabletter I en utførelsesform kan en autoinjektor omfattende en injiserbar løsning av et erytropoietin tilveiebringes for anvendelse ved nødssituasjon i ambulanse, skadestue og slagmarkssituasjoner, og til og med for selv-tilførsel i en hjemlig situasjon, spesielt når muligheten for traumatisk amputasjon kan forekomme, slik som ved uforsiktig bruk av gressklipper Sannsynligheten for at celler og vev i en skadet fot eller tå vil overleve etter reforbindelse kan øke ved å tilføre et erytropoietin til multiple steder i den skadete delen så rask som mulig, selv før ankomst av medisinsk personale til stedet, eller ankomst av det rammete individ med skadet tå til skadestuen

I en foretrukket utførelsesform er sammensetningene formulert i samsvar med rutineprosedyrer som en farmasøytisk sammensetning tilpasset intravenøs tilførsel til mennesker Vanligvis er sammensetninger for intravenøs tilførsel løsninger i steril, isoton, vandig buffer Når det er nødvendig kan sammensetningen også inkludere et oppløsende middel og et lokalt anastetikum, slik som hdokain for å redusere smerte på stedet for injeksjon Generelt er ingrediensene levert separat eller sammenblandet i enhetsdosenngsform, for eksempel som et tørt, lyofihsert pulver eller vannfntt konsentrat i en hermetisk forseglet beholder, slik som en ampulle eller pose som indikerer kvantiteten av aktivt middel Når sammensetningen skal tilføres ve infusjon, kan den utleveres med en infusjonsflaske inneholdende sterilt, farmasøytisk gradert vann, eller saltoppløsning Der sammensetningen skal tilføres ved injeksjon, kan en ampulle med steril saltoppløsning bringes tilveie, shk at ingrediensene kan blandes før tilførsel

Stikkpiller inneholder generelt aktiv ingrediens i området fra 0,5 til 10 vektprosent, orale formuleringer inneholder fortrinnsvis 10% til 95% aktiv ingrediens

En perfusat sammensetning kan tilveiebringes for anbringelse i transplanterte organbad for in situ perfusjon, eller for tilførsel til en organdonors vaskulatur før organhøstingen Slike farmasøytiske sammensetninger kan omfatte nivåer av et erytropoietin eller en form av et erytropoietin som ikke er egnet for akutt eller kronisk, lokal eller systemisk tilførsel til et individ, men vil tilføre funksjonene tilsiktet her i et kadaver, organbad, organperfusat eller in situ perfusat før fjerning eller redusering av nivåene av erytropoietinet som de inneholder før eksponering eller returnering av det behandlete organ eller vev til alminnelig sirkulasjon Erytropoietinet for dette aspekt av foreliggende oppfinnelse, kan være ethvert erytropoietin, slik som naturlig forekommende former, slik som humant erytropoietin, eller ethvert av erytropoietinene beskrevet ovenfor, slik som asialoerytropoietin og fenylglyoksal-erytropoietiner, somlkke-begrensende eksempler

Oppfinnelsen tilveiebringer også en farmasøytisk pakke eller et sett, omfattende en eller flere beholdere fylt med en eller flere av ingrediensene av de farmasøytiske sammensetningene til oppfinnelsen Eventuelt assosiert med slike beholder(e) kan være en melding i foreskrevet form av et statskontor som regulerer fremstilling, anvendelse eller salg av farmasøytiske eller biologiske produkter, hvor meldingen reflekterer godkjenning fra kontoret for fremstilling, anvendelse eller salg for human tilførsel

I en annen utførelsesform kan for eksempel et erytropoietin leveres i et kontrollert frigjøringssystem Polypeptidet kan for eksempel administreres ved anvendelse av intravenøs infusjon, en implanterbar, osmotisk pumpe, en transdermal del, hposomcr eller andre måter for administrasjon I en utførelsesform kan en pumpe benyttes (se Langer, supra, Seflon, 1987, CRC Cnt Ref Biomed Eng 14 201, Buchwalde/o/, 1980, Surgery 88 507, Saudeke/a/. 1989,N Engl J Med

321 574) I en annen utførelsesform kan forbindelsen leveres i en vesikkel, nærmere bestemt et hposom (se Langer, Science 249 1527-1533 (1990), Treat et al, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestem og Fidler (red ), Liss, New York, s 353-365 (1989), WO 91/04014, U S patent 4 704 355, Lopez-Berestein, ibid , s 317-327, se generelt ibid) I en annen utførelsesform kan polymere materialer benyttes [se Medical Applications of Controlled Release, Langer og Wise (red ), CRC Press Boca Raton, Florida, 1974, Controlled Drug Bioavailabihty, Drug Product Design and Performance, Smolen og Ball (red), Wiley New York

(1984), Ranger og Peppas, J Macromol Sei Rev Macromol Chem 23 61,1953, se også Levy et al, 1985, Science 228 190, During et al, 1989, Ann Neurol 25 351, Howard et al, 1989, J Neurosurg 71 105)

I en annen utfør kan et kontrollert fngivelsessystem plasseres i nærheten av det terapeutiske målet, dvs de målrettete cellene, vev eller organ, som derfor krever kun en fraksjon av den systemiske dose (se for eksempel Goodson, s 115-138 i Medical Applications of Controlled Release, vol 2, st/pro, 1984) Andre kontrollerte fngjønngssystemer er diskutert i gjennomgåelsen til Langer (1990, Science 249 1527-1533)

I en annen utførelsesform kan erytropoietin, passende formulert, tilføres ved nasal, oral, rektal eller vaginal tilførsel eller ved tilførsel under tungen

1 en spesifikk utførelsesform kan del være ønskelig å tilføre erytropoictinsammensetningene ifølge oppfinnelsen lokalt til områder med behov for behandling, dette kan oppnås ved for eksempel, uten begrensning, lokal infusjon under kirurgi, topikal påføring, for eksempel i konjunksjon med en sårbandasje etter kirurgi, ved injeksjon, ved midler av et kateter, en stikkpille, et implantat, der nevnte implantat kan være av porøst, ikke-porøst eller gelatinholdig materiale, som inkluderer membraner slik som silastiske membraner eller fibere

Valg av den foretrukne effektive dose bestemmes av en øvet i faget, basert på betraktning av flere faktorer som er kjente for dem med ordinær dyktighet innen faget Slike faktorer inkluderer den bestemte formen av erytropoietin, og dets farmakokinetiske parametre, shk som biotilgjengelighet, metabolisme, halveringstid osv , som etableres under de vanlige utvikhngsprosedyrene, vanligvis benyttet for oppnåelse av myndighetens godkjenning for en farmasøytisk sammensetning ytterligere faktorer, med hensyn til dosen, inkludcicr tilstanden eller sykdommen som skal behandles eller fordelene som skal oppnås i et normalt individ, pasientens kroppsmasse, tilførselsrute, hvorvidt tilførsel er akutt eller kronisk, ledsagende medisineringer og andre faktorer, velkjent for å påvirke effektiviteten av tilførte farmasøytiske midler Derfor skal den presise doseringen bestemmes i henhold til legens vurdering og hver pasients omstendighet, for eksempel avhengig av tilstanden og immunstatus til den enkelte pasient, i henhold til standard kliniske teknikker

I et annet aspekt av oppfinnelsen er et perfusat eller en perfusjonsløsning brakt tilveie for perfusjon og lagring av organer for transplantasjon, perfusjonsløsningcn inkluderer en mengde av et erytropoietin, effektiv til å beskytte erytropoietinresponsive celler og assosierte celler, vev eller organer Transplantasjon inkluderer, men er ikke begrenset til xenotransplantasjon, der et organ (som inkluderer celler, vev eller andre kroppsdelcr)er høstet fra en donor og transplantert til en uhk mottaker, og autotransplantasjon, hvor et organ er tatt fra en del av en kropp og satt tilbake ved en annen del av kroppen, inkluderer kirurgiske prosedyrer hvor et organ kan fjernes, og mens ex vivo operert bort, reparert eller på annen måte manipulert, slik som ved tumorfjerning, og deretter returnert til det opprinnelige sted I en utførelsesform er perfusjonsløsningen The Univeisity of Wisconsin (UW)-løsning (U S patent 4 798 824) som inneholder fra omkring 1 til omkring 25 U/ml erytropoietin, 5% hydroksyetylstivelse (med molekylvekt fra omkring 200 000 til om lag 300 000 og hovedsakelig fri for etylenglykol, etylenklorhydnn, natnumklond og aceton), 25 mM KH2PO4, 3 mM glutahon, 5 mM adenosin, 10 mM glukose, 10 mM HEPES-buffer, 5 mM magnesiumglukonat, 1,5 mM CaCb, 105 mM natriumglukonat, 200 000 enheter penicillin, 40 enheter insulin, 16 mg deksametason, 12 mg fenolrødt, og har en pH på 7,4-7,5 og en osmolahtet på omkring 320 mOSm/1 Løsningen er benyttet for opprettholdelse av kadavernyrer og pankreas før transplantasjon Ved anvendelse av denne løsningen kan oppbevaring forlenges utover den 30 timers begrensningen anbefalt for kadavernyreoppbevanng Dette bestemte perfusalet er bare illustrativt for et antall av slike løsninger som kan tilpasses for den foreliggende anvendelse ved inklusjon av en effektiv mengde av et erytropoietin I en ytterligere utførelsesform inneholder perfusatløsningen fra omkring 5 til omkring 35 U/ml erytropoietin, eller fra omkring 10 til omkring U/ml erytropoietin Som nevnt ovenfor kan enhver form av erytropoietin benyttes1dette aspektet av oppfinnelsen

Mens den foretrukne mottaker av et erytropoietin for formålene hen, hele veien er et menneske, kan fremgangsmåtene hen anvendes1samme grad på andre pattedyr, spesielt på husdyr, buskap, kjæledyr og dyr1dyrehage Oppfinnelsen er imidlertid ikke så begrensende og fordelene kan anvendes for ethvert pattedyr 1 ytterligere aspekter av ex v/vo-oppfinnelsen er ethvert erytropoietin, slik som, men ikke begrenset til erytropoietinet beskrevet ovenfor, så vel som naturlige erytropoietiner, så vel som en analog derav, en erylropoietinetterlikner, og erytropoietinfragment, et hybnd erytropoietinmolekyl, et erytropoietinreseptorbindende molekyl, en erytropoietinagonist, et renall erytropoietin, el hjerneerytropoietin og oligomer derav, en multimer derav, et mutein derav, en beslektet derav, en naturlig forekommende form derav, en syntetisk form derav, en rekombinant form derav, en glykosylcringsvanant derav, en deglykosylert variant derav eller en kombinasjon derav 1 et annet aspekt av oppfinnelsen er fremgangsmåter og sammensetninger for å styrke viabiliteten til celler, vev eller organer som ikke er isolert fra vaskulaturen, ved en endolelcellebarnere tilveiebrakt ved å eksponere cellene, vevet ellet organene dirkete for en farmasøytisk sammensetning omfattende et erytropoietin, eller å administrere til eller å bringe en erytropoietinholdig farmasøytisk sammensetning1kontakt med vaskulaturen1vevet eller organet Styrket aktivitet av erytropoietinresponsive celler1behandlet vev eller organ, er ansvarlig for de positive effekter som utfolder seg

Som beskrevet ovenfor, er oppfinnelsen delvis basert på oppdagelsen om at erytropoietinmolekyler kan transporteres fra den luminale overflate til basalmembranoverflaten hos endotelceller1kapillærene til organer med endotelcelletette forbindelser, som for eksempel inkluderer hjernen, retina og testikkel Dermed er erytropoietinresponsive celler på den andre siden av barrieren mottakelige mål for de fordelaktige effekter av erytropoietin, og andre celletyper eller vev eller organer, som inneholder og avhenger totalt eller delvis av erytropoietinresponsive celler, er mål for fremgangsmåtene av oppfinnelsen Selv om det ikke er ønskelig å være bundet til noen bestemt teori, kan erytropoietin etter transcytose skape interaksjoner med en erytropoietinreseptor på en erytropoietinresponsiv celle, for eksempel neuronal, retinal, muskel, hjerte, lunge, lever, nyre, tynntarm, binyrebark, bmyremarg, kapillær endotel, testikkel, ovane eller endometnumcelle, og reseptorbinding kan starte en signaltransduksjonskaskade som resulterer i aktivering av et genekspresjonsprogram i den erytropoietinresponsive celle eller vev, som resulterer i beskyttelse av cellen, vevet eller organet fra ødeleggelse, slik som ved toksiner, kjemoterapeutiske midler, strålingsterapi, hypoksi osv På denne måte er fremgangsmåter for beskyttelse av erytropoietinresponsiv celle-inneholdende vev fra skade eller hypoksisk stress, og styrking av funksjonen av slikt vev, beskrevet i detalj nedenfor

I fremgangsmåten av en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen ble det planlagt å høste ulike organer fra et offer for en trafikkulykke for transplantasjon til et antall mottakere, noen av dem krevde transport over en lengre distanse og tidsperiode Før organhøsting ble offeret infusert med en farmasøytisk sammensetning omfattende et erytropoietin som beskrevet her Høstede organer for forsendelse ble perfusert med et perfusat inneholdende erytropoietin som beskrevet hen, og lagret i et bad inneholdende erytropoietin Enkelte organer ble kontinuerlig perfusert med en pulserende perfusjonsanordning ved anvendelse av et perfusat som inneholdt et erytropoietin i samsvar med foreliggende oppfinnelse Minimal forringelse av organfunksjon oppsto under transport og under implantenng og reperfusjon av organene w situ

For å reparere en hjerteklaff, ifølge en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen, krevde en kirurgisk prosedyre midlertidig cardioplegi og arteneokklusjon Før kirurgi ble pasienten infusert med 500 U erytropoietin/kg kroppsvekt Slik behandling hindret cellulær skade fra hypoksisk ischemi, spesielt etter reperfusjon

l enhver kirurgisk prosedyre, ifølge en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen, slik som ved kardiopulmonar bypass-kirurgi, kan et naturlig forekommende erytropoietin eller ethvert erytropoietin ifølge oppfinnelsen benyttes I en utførelsesform er administrasjon av en farmasøytisk sammensetning omfattende et erytropoietin, som beskrevet ovenfor, utført før, under og/eller etter bypassprosedyren, for å beskytte funksjonen til hjerne, hjerte og andre organer

I de foregående eksemplene hvor erytropoietin ifølge oppfinnelsen inkluderer naturlig forekommende erytropoietin, er benyttet for ex vivo anvendelser, eller for behandling av erytropoietinresponsive celler, slik som nervevev, retinalvev, hjerte, lunge, lever, nyre, tynntarm, binyrebark, bmyremarg, kapillære endotel, testikkel, ovane eller endometnumceller eller -vev, tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning i dosermgenhetsform tilpasset for beskyttelse eller styrking av erytropoietinresponsive celler, vev eller organer, distalt for vaskulaturen som omfatter pr doseringsenhct en effektiv, ikke-toksisk mengde innenfor området fra omkring 50 000 til 500 000 enheter, 60 000 til 500 000 enheter, 70 000 til 500 000 enheter,

80 000 til 500 000 enheter, 90 000 til 500 000 enheter, 100 000 til 500 000 enheter, 150 000 til 500 000 enheter, 200 000 til 500 000 enheter, 250 000 til 500 000 enheter, 300 000 til 500 000 enheter, 350 000 til 500 000 enheter, 400 000 til 500 000 enheter eller 450 000 til 500 000 enheter av erytropoietin, en

erytropoietmreseptoraktivitetsmodulator eller en erytropoictinaktivert reseplormodulator og en farmasøytisk aksepterbar bærer I en foretrukket utførelsesform er den effektive ikke-toksiske mengde av erytropoietin innenfor området fra omkring 50 000 til 500 000 enheter I en foretrukket utførelsesform er erytropoietinet i den tidligere nevnte sammensetningen ikke-erytropoietisk

I et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen ble erytropoietinadmimstrasjon funnet å gjenoppbygge kognitiv funksjon hos dyr som hadde gjennomgått hjernetraume Etter en forsinkelse på enten 5 dager eller 30 dager var tilførsel av erytropoietin fortsatt i stand til å gjenoppbygge funksjon sammenliknet med proforma-behandlete dyr, som indikerer evne av erytropoietin til å regenerere eller gjenoppbygge hjerneaktivitet På denne måte er oppfinnelsen også rettet mot anvendelsen av et erytropoietin for preparering av en farmasøytisk sammensetning for behandling av hjernetraume og andre kognitive dysfunksjoner, som inkluderer behandling i lengre tid etter skade (for eksempel 3 dager, 5 dager, en uke, en måned eller lengre) Oppfinnelsen er også rettet mot en fremgangsmåte for behandling av kognitiv dysfunksjon etter skade ved tilførsel av en effektiv mengde av et erytropoietin Ethvert erytropoietin som beskrevet hen kan benyttes for dette aspekt av oppfinnelsen

Videre er dette styrkende aspekt ifølge oppfinnelsen rettet mot anvendelsen av et hvert av erytropoietinene hen for preparering av en farmasøytisk sammensetning for gjenoppbygging av cellulær, vev- eller organdysfunksjon, der behandling har startet elter, og lenge etter den opprinnelige hendelsen som er ansvarlig for dysfunksjonen Behandling ved å benytte erytropoietiner ifølge oppfinnelsen, kan videre strekke seg over forløpet av sykdommen eller tilstanden ved den akutte fase, så vel som ved en kronisk fase

I en foretrukket utførelsesform hvor et erytropoietin ifølge oppfinnelsen har erytropoietisk aktivitet, kan erytropoietin tilføres systemisk ved en dosenng mellom omknng 300 og omknng 10 000 enheter/kg kroppsvekt, fortnnnsvis omknng 500-5000 enhetcr/kg kroppsvekt, mest foretrukket er omknng 1 000 enheter/kg kroppsvekt/tilførsel Denne effektive dose burde være tilstrekkelig for å oppnå serumnivåer av erytropoietin større enn omkring 10 000,15 000 eller 20 000 mU/ml serum etter erytropoietmtilførsel Slike serumnivåer kan oppnås ved omknng 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9 eller 10 timer eller tilførsel Slike dosennger kan repeteres om nødvendig For eksempel kan tilførsel repeteres daglig, så lenge som klinisk nødvendig eller etter et passende intervall, for eksempel hver 1 til 12 uke, fortnnnsvis hver 1 til 3 uke len utførelsesform kan den effektive mengde av erytropoietin og en farmasøytisk aksepterbar bærer pakkes i en enkeldoseampulle eller annen beholder I en annen utførelsesform er et erytropoietin nyttig for anvendelse hen ikke-erytropoietisk, dvs det er i stand til å utøve aktiviteten beskrevet hen, men forårsaker ikke en økning i hemoglobinkonsentrasjon eller hematoknt En slik ikke-erytropoietisk form av erytropoietin er foretrukket i tilfeller der fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er ment å bh kronisk tilveiebrakt T en annen utførelsesform er et erytropoietin gitt ved en dose større enn den nødvendig for å maksimalt stimulere erytropoiese Som nevnt ovenfor har et erytropoietin ifølge oppfinnelsen ikke nødvendigvis erytropoietisk aktivitet, og derfor er dosenngene ovenfor uttrykt i hematopoietiske enheter bare eksempler på erytropoietiner som er erytropoietiske, ovenfor er molare ekvivalenter for dosennger tilveiebrakt som er gjeldende for ethvert erytropoietin

Den foreliggende oppfinnelse er videre rettet mot en fremgangsmåte for å forenkle transporten av et molekyl over en endotelcellebarnere i et pattedyr ved tilførsel av en sammensetning som omfatter det bestemte molekylet i assosiasjon med erytropoietin, som beskrevet ovenfor Som beskrevet ovenfor danner tette forbindelser mellom endotelceller i enkelte kroppsorganer en bannere for innfønng av enkelte molekyler For behandling av ulike tilstander innenfor lukkede organer er hjelpemidler for å fremme passasje av farmasøytiske midler ønskelig Et erytropoietin ifølge oppfinnelsen er nyttig som en bærer for levering av andre molekyler over blod-hjerne barneren og andre liknende barrierer En sammensetning som omfatter et molekyl som er ivng etter å krysse barneren med erytropoietin er preparert, og perifer tilførsel av sammensetningen resulterer i transcytose av sammensetningen over barneren Assosiasjonen mellom molekylet som skal transporteres over barneren og erytropoietin, kan være en labil kovalent binding, hvor i dette tilfellet molekylet er frigjort fra assosiasjon med erytropoietinet etter å ha krysset barneren Om den ønskete farmakologiske molekylaktiviteten er opprettholdt eller uberørt ved assosiasjon med erytropoietin, kan et slikt kompleks bh administrert

Den øvete forskeren vil være klar over ulike hjelpemidler for assosiasjon av molekyler med et erytropoietin ifølge oppfinnelsen og det andre middelet beskrevet ovenfor, ved kovalent, ikke-kovalent, og andre hjelpemidler, videre kan evaluering av effektiviteten av sammensetningen enkelt bestemmes i et eksperimentelt system Assosiasjon av molekyler med erytropoietin kan utføres ved et antall midler, som inkluderer labil, kovalent binding, kryssbinding osv Biotin/avidin interaksjoner kan benyttes Som nevnt ovenfor kan et hybndmolekyl prepareres ved rekombinante eller syntetiske midler, for eksempel som inkluderer både doméne av molekylet med ønsket farmakologisk aktivitet og doméne ansvarlig for

erytropoietinreseptoraktivitetsmodulenng

Et molekyl kan konjugeres til et erytropoietin gjennom et polyfunksjonelt molekyl, dvs en polyfunksjonell krysshnker Som benyttet her omfatter betegnelsen "polyfunksjonelt molekyl" molekyler som har en funksjonell gruppe som kan reagere mer enn en gang etter hverandre, slik som formaldehyd, så vel som molekyler med mer enn en reaktiv gruppe Som benyttet her refererer betegnelsen "reaktiv gruppe" til en funksjonell gruppe på krysshnkeren som reagerer med en funksjonell gruppe på et molekyl (for eksempel peptid, protein, karbohydrat, nukleinsyre, spesielt et hormon, antibiotika eller anti-cancermidler som skal leveres over en endotelcellebarnere) for å danne en kovalent binding mellom krysshnkeren og det molekylet Betegnelsen "funksjonell gruppe" beholder sin standard betydning i organisk kjemi De polyfunksjonelle som benyttes her er fortrinnsvis biokompatible hnkere, dvs de erlkke-karsinogene, ikke-toksiske og hovedsakelig ikke-immunogene in vivo Polyfunksjonelle krysshnkere slik som de som er kjent innen faget og beskrevet heri, kan enkelt testes i dyremodeller for bestemmelse av deres biokompatibihtel Det polyfunksjonelle molekylet er fortrinnsvis bi funksjonelt Som benyttet hen refererer betegnelsen "bifunksjonelt molekyl" til et molekyl med to reaktive grupper Det bifunksjonelle molekylet kan være heterobifunksjonelt eller homobifunksjonelt En heterobifunksjonell krysshnker tillater vektonell konjugenng Det er spesielt foretrukket at det polyfunksjonelle molekyl er tilstrekkelig løselig i vann til at kryssbindingsreaksjonene skal kunne foregå i vandige løsninger, slik som i vandige løsninger bufiret ved pH 6 til 8, og for at konjugatresultatet forblir vannløsehg for mer effektiv biodistnbusjon Vanligvis binder det polyfunksjonelle molekylet kovalent med en amino- eller en sulfidylfunksjonell gruppe Polyfunksjonelle molekyler er imidlertid reaktive med andre funksjonelle grupper, slik som karboksylsyrer eller hydroksylgrupper betraktet i foreliggende oppfinnelse

De homobifunksjoncllc molekylene har minst to like, reaktive funksjonelle grupper De reaktive funksjonelle gruppene på et homobifunksjonelt molekyl inkluderer for eksempel aldehydgruppcr og aktive estergrupper Homobifunksjonelle molekyler som har aldehydgrupper inkluderer for eksempel glutaraldehyd og subaraldehyd Anvendelsen av glutaraldehyd som et kryssbindende middel, ble angitt av Poznansky et al, Science 223,1304-1306 (1984) Homobi funksjonelle molekyler som har minst to aktive esterenheter inkluderer estere av dikarboksylsyrcr og N-hydroksysuksinimid Noen eksempler på slike N-suksinimidylestere inkluderer disuksimmidylsuberat og ditio-bis-(suksmimidylpropionat), og deres vannløsehge bis-sulfonsyre og bis-sulfonatsalter, slik som deres natrium- og kalsiumsalter Disse homobi funksjonelle reagenser er tilgjengelige fra Pierce, Rockford, Illinois

De heterobifunksjonelle molekyler har minst to ulike reaktive grupper De reaktive gruppene reagerer med ulike funksjonelle grupper, for eksempel til stede på erytropoietinet og molekylet Disse to ulike funksjonelle gruppene som reagerer med den reaktive gruppen på den heterobifunksjonelle krysshnkeren, er vanligvis en ammogruppe, for eksempel epsilon-aminogruppen hos lysin, en sulfidylgruppe, for eksempel tiolgruppen hos cystein, en karboksyl syre, for eksempel karboksylat hos asparginsyre, eller en hydroksylgruppe, for eksempel hydroksylgruppen hos senn

De ulike erytropoietmmolekylene ifølge oppfinnelsen kan selvfølgelig kanskje ikke ha passende reaktive grupper tilgjengelig for anvendelse med enkelte kryssbindende midler, en med dyktighet innen faget vil imidlertid være klar over valget av kryssbindende midler basert på de tilgjengelige grupper for kryssbinding i et erytropoietin ifølge foreliggende oppfinnelse

Når en reaktiv gruppe på et heterobi funksjonelt molekyl danner en kovalent binding med en ammogruppe, vil den kovalente bindingen vanligvis være en amid- ellerlmid-binding Den reaktive gruppen som danner en kovalent binding med en ammogruppe, kan for eksempel være en aktivert karboksylgruppe, en halokarbonylgruppe, eller en estergruppe Den foretrukne halokarbonylgruppen er en klorkarbonylgruppc Estergruppene er fortrinnsvis reaktive estcrgruppcr slik som for eksempel en N-hydroksysuksinmndestergruppe

Den andre funksjonelle gruppen er vanligvis enten en tiolgruppe, en gruppe som kan konverteres til en tiolgruppe, eller en gruppe som danner en kovalent binding med en tiolgruppe Den kovalente bindingen vil vanligvis være en tioeterbinding eller en disulfid Den reaktive gruppe som danner en kovalent binding med en tiolgruppe kan for eksempel være en dobbeltbinding som reagerer med tiolgrupper eller en aktivert disulfid En reaktiv gruppe inneholdende en dobbeltbinding som er i stand til å reagere med en tiolgruppe, er maleimidgruppen, selv om andre, slik som akrylnitnl også er mulig En reaktiv disulfidgruppe kan for eksempel være en 2-pyndylditiogruppe eller en 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzosyre)gruppe Noen eksempler på heterobifunksjonelle reagenser inneholdende reaktive disulfidbindinger inkluderer N-suksinimidyl 3-(2-pyndyl-dilio)propionat (Carlsson, et al , 1978, Biochem J , 173 723-737), natrium S-4- suksimmidyloksykarbonyl-alfa-metylbcnzyltiosulfat, og 4-suksinimidyloksykarbonyl-alfa-metyl-(2-pyndylditio)toluen N-suksinimidyl 3-(2-pyridylditio)propionat er foretrukket Noen eksempler på heterobifunksjonelle reagenser som omfatter reaktive grupper med en dobbeltbinding som reagerer med en tiolgruppe inkluderer suksmimidyl 4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-1 -karboksylat og

suksmimidyl m-maleimidobcnzoat Andre heterobifunksjonelle molekyler inkluderer suksmimidyl 3-(maleimid)propionat, sulfosuksmimidyl 4-(p-maleimid-fenyl)butyrat, sulfosuksimmidyl 4-(N-maleimidmetylsykloheksan)-l -karboksylat, maleimidobenzoyl-N-hydroksy-suksinimidester Natnumsulfonalsaltel av suksmimidyl m-maleimidobenzoat er foretrukket Mange av de ovenfor nevnte heterobifunksjonelle reagensene og deres sulfonatsalter er tilgjengelige fra Pierce Chemical Co , Rockford, Illinois, USA

Behovet for konjugatet ovenfor beskrevet til å være reversibelt eller labilt, kan enkelt bestemmes av den øvete forskeren Et konjugat kan testes in vitro for både erytropoietinet og for den ønskelig farmakologiske aktivitet Om konjugatet beholder begge egenskaper kan dets velegnethet videre testes in vivo Om konjugatmolekylet krever separasjon fra erytropoietinet for aktivitet, vil en labil binding eller reversibel assosiasjon med erytropoietin være ønskelig Labihtetsegenskapene kan også testes ved anvendelse av standard w vitro prosedyrer før in vivo testing

Ytterligere informasjon angående tillaging og anvendelse av disse, så vel som andre polyfunksjonelle reagenser, kan oppnås fra de følgende publikasjoner eller andre tilgjengelige i faget

Carlsson, J et al, 1978, Biochem J 173 723-737

Cumber, J A et al, 1985, Methods in Enzymology 112 207-224

Jue, R et al, 1978, Biochem 17 5399-5405

Sun, T T et al, 1974, Biochem 13 2334-2340

Blattler, W A et al, 1985, Biochem 24 1517-152

Liu, F T et al, 1979, Biochem 18 690-697

Youle, R J ogNeville.D M Jr, 1980, Proe Nati Acad Sei USA 77 5483-5486 Lerner, R A et al, 1981, Proe Nati Acad Sei U S A 78 3403-3407

Jung, S M og Moroi, M , 1983, Biochem Biophys Acta 761 162

Caulfield.M P et al, 1984, Biochem 81 7772-7776

Staros, J V , 1982, Biochem 21 3950-3955

Yoshitake, S et al, 1979, Eur J Biochem 101 395-399

Yoshitakc, S et al, 1982, J Biochem 92 1413-1424

Pilch,P F ogCzech,M P, 1979, J Biol Chem 254 3375-3381

Novick,D et al, 1987, J Biol Chem 262 8483-8487

Lomant, A J og Fairbanks, G, 1976, J Mol Biol 104 243-261

Hamada, H og Tsuruo, T , 1987, Anal Biochem 160 483-488

Hashida, S et al, 1984, J Applied Biochem 6 56-63

Fremgangsmåter for kryssbinding er i tillegg gjennomgått av Means og Fceney, 1990, Bioconjugate Chem 12-12

Barrierer som er krysset ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåter og sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderer, men er ikke begrenset til blod-hjerne barrieren, blod-øye barrieren, blod-testikkel barneren, blod-ovane barrieren og blod-livmor barrieren

Kandidatmolekyler for transport over en endotelcellebarnere inkluderer for eksempel honnoncr, slik som veksthormoner, neurotrofiske faktorer, antibiotika eller antisoppmidler slik som de normalt er ekskludert fra hjerne og andre innelukkete organer, peptid radiofarmasøytika, antisensmidlcr, antistoffer mot biologisk aktive midler, legemidler og anti-cancermidler Ikke-bcgrensende eksempler på slike molekyler inkluderer veksthormon, nervevekstfaktor (NGF), hjenie-avledet ncurotrofisk faktor (BDNF), siliær ncurotrofisk faktor (CNTF), basal fibroblast vekstfaktor (bFGF), transformerende vekstfaktor pl (TGF<p>l), transformerende vekstfaktor p2 (TGFp2), transformerende vekstfaktor p3 (TGFP3), interleukin 1, interleukin 2, interleukin 3 og interleukin 6, AZT, antistoffer mot tumornekrose faktor og immunundertrykkende midler slik som syklosponn

Den foreliggende oppfinnelsen er også rettet mot en sammensetning omfattende et molekyl som skal transporteres via transcytose over en endotelcelletett forbindelsesbarnere og et erytropoietin som beskrevet ovenfor Oppfinnelsen er videre rettet mot anvendelsen av et konjugat mellom el molekyl og erytropoietin, beskrevet ovenfor for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for levenng av molekylet over en barriere som beskrevet ovenfor

Den foreliggende oppfinnelsen kan bedre forstås ved referanse til de følgende ikke-begrensende eksempler, tilveiebrakt som eksempler ifølge oppfinnelsen De følgende eksemplene er presentert for en mer fullstendig illustrasjon av de foretrukne utførelsesformene ifølge foreliggende oppfinnelse De må imidlertid på ingen måte bh oppfattet som begrensende for rekkevidden av denne foreliggende oppfinnelsen

Eksempel 1

ERYTROPOIETIN KRYSSER BLOD-CEREBROSPINAL VÆSKETETT

BARRIERE

Voksne Sprague-Dawley hannrotter ble anestesert og tilført rekombinant humant erytropoietin intrapentonealt Cerebrospinalvæske ble samlet fra cisterna magna med 30 minutters intervall opptil 4 timer og erytropoietinkonsenlrasjonen ble bestemt ved anvendelse av en følsom og spesifikk enzymforbundet immuntest Som illustrert i figur 1, er basalhnje-erytropoietmkonsentrasjonen i CSF 8 mU/ml Etter et opphold på flere timer begynner nivåene av erytropoietin målt i CSF å øke, og ved 2,5 timer og senere er de signifikant forskjellige fra basalhnjekonsenlrasjonen ved p<0,01 nivået Toppnivået på ca 100 mU/ml er innenfor området som er kjent for å utøve beskyttende effekter in vitro (0,1 til 100 mU/ml) Tidspunktet for å nå loppen finner sted etter omkring 3,5 timer, som er signifikant forsinket fra toppnivåene i serum (mindre enn 1 time) Resultatene av dette eksperimentet illustrerer signifikante nivåer av erytropoietin oppnås over en tett, cellulær forbindelse ved bolus parenteral tilførsel av erytropoietin ved hensiktsmessige konsentrasjoner

Eksempel 2

OPPRETTHOLDELSE AV FUNKSJON I HJERTE KLARGJORT FOR

TRANSPLANTASJON

Wistar hannrotter med vekt 300 til 330 g ble tilført erytropoietin (5000 U/kg kroppsvekt) eller befordringsmiddel 24 timer før fjerning av hjertet for ex vivo studier, i samsvar med protokollen til Delcayre et al, 1992, Amer J Physiol 263 Hl 537-45 Dyrene ble avlivet med pentobarbital (0,3 ml), og intravenøst hepann (0,2 ml) Hjertene ble til å begynne med tillatt å ekvilhbrere115 minutter Den venstre ventnkulære ballongen ble så blåst opp til et volum som ga et diastolisk trykk på 8 mm Hg Den venstre ventnkulære trykk-volumkurven er konstruert ved økende innblåsning av ballongvolumet ved 0,02 ml ahkvoter Null-volumet er definert som det punktet der det venstre, ventnkulære sluttdiastohskc trykk er null Ved komplettering av trykk/volum-kurvcn er den venstre, ventnkulære ballongen redusert for å sette det sluttdiastohske trykket tilbake til 8 mm Hg, og kontrollpcnoden ble fulgt i 15 minutter etter kontroll av coronærstrømning Dei etter ble hjertet stanset med 50 ml Celsior<+>molekyl for å hvile ved 4 °C ved et trykk på 60 cm H2O Hjertet ble deretter fjernet og lagret15 timer ved 4 °C1en plastbeholder fylt med den samme løsningen og omkranset med knust is

Etter avsluttet lagnng ble hjertet overført til et Langendorff-apparat Ballongkateteret ble igjen innsatt1venstre ventnkkel og igjen blåst opp til det samme volum som under pre-ischemiske periode Hjertet reperfuseres i minst 2 timer ved 37 °C Reperfusjonstrykket er satt til 50 cm H20 i 15 minutter tilbakestrømning og så tilbake til 100 cm H20 i de neste 2 timene Hjerterytme (320 slag/minutt) gjenopprettes Isovolumetnske målinger av kontraktile indekser og diastolisk trykk er gjort i tnphkat ved 25,45, 60 og 120 minutter av re-perfusjon Ved dette tidspunkt utføres trykkvolumkurver, og koronar utstrømning i løpet av den 45 mn reperfusjonen samles for måling av keratinkinase-lekkasje De to behandlingsgruppene sammenliknes ved anvendelse av en uparet t-lest, og en lineær regresjon ved anvendelse av de sluttdiastohske trykkdata benyttes for å konstruere samsvarende kurver Som vist i figur 2 forekommer signifikant forbedring av venstre, ventnkulære trykk, utviklet etter behandling med erytropoietin, så vel som forbedret volum/trykk-kurve, reduksjon av venstre diastoliske, ventnkulære trykk og reduksjon av keratinkinase-lekkasje

Eksempel 3

ERYTROPOIETIN BESKYTTER MYOKARDIUM FRA ISCHEMISK SKADE

Voksne hannrotter ble tilført rekombinant, humant erytropoietin (5000 U/kg kroppsvekt) 24 timer tidligere, ble anestesert og klargjort for koronar arteneokklusjon En ytterligere dose av erytropoietin ble gitt ved starten på prosedyren og den venstre store koronarartene tilstoppet i 30 minutter og deretter frigjort Den samme dose erytropoietin ble gitt daglig i en uke etter behandling Dyrene ble så studert for hjertefunksjon Som illustrert i figur 3 demonstrerte dyr som mottok en proforma injeksjon (saltoppløsning) en større økning i det venstre sluttdiastohske trykk, som indikerer et dilatert, stivt hjerte til myokardialt infarkt I motsetning, dyrene som mottok erytropoietin lcd ikke av nedgang i hjertefunksjon, sammenliknet med proformaopererte kontroller (forskjell signifikant ved p<0,01 nivået)

Eksempel 4

ERYTROPOIETINMOLEKYLER

Naturlig erytropoietin kan modifiseres for å skreddersy dets aktiviteter for et spesifikt vev eller spesifikke vev Flere ikke-begrensende strategier kan utføres for oppnåelse av denne ønskelige vevsspesifisiteten som inkluderer modifikasjoner som fjerner eller modifiserer glykosylenngshalvdelene, hvor erytropoietin har tre N-forbundne og en O-forbundet Slike vananter av glykosylert erytropoietin kan produseres på mange måter Siahnsyrene som avslutter enden av sukkerkjedene kan for eksempel fjernes ved spesifikke siahdaser, avhengig av den kjemiske bindingen som kobler siahnsyren til sukkerkjeden Alternativt kan den glykosylerte strukturen demonteres på flere måter ved anvendelse av andre enzymer som kløver ved spesifikke bindinger For bekreftelse av disse prinsippene ble rekombinant, humant erytropoietin desialisert ved anvendelse av Siahdase A (Prozyme Inc) i samsvar til produsentens protokoll Vellykket kjemisk modifikasjon ble bekreftet ved å kjøre reaksjonsproduktet på en SDS-polyakrylamidgel og farge de resulterende båndene som viste at det kjemisk modifiserte erytropoietin hadde en tydelig molekylær vekt på~31 kD som forventet, sammenliknet med umodifisert erytropoietin som var~34 kD og ved måling av de resterende siahnsyrerester ved kjemiske midler til å være <0,1 mol/mol av erytropoietin

I en annen modifikasjon der aminosyrerestene til erytropoietin er modifisert, ble argininrester modifisert ved anvendelse av fenylglyoksal i henhold til protokollen til Takahashi (1977, J Biochem 81 395-402) utført ved varierende lengder av tid i området fra 0,5 til 3 timer ved romtemperatur Reaksjonen ble avsluttet ved dialyse av reaksjonsblandingen mot vann Anvendelse av slike modifiserte former av erytropoietin er fullstendig omfattet hen

Asialoerytropoietin og fenylglyoksalerytropoietin var like effektive som naturlig erytropoietin for nerveceller in vitro, som visl figurene 4-6 In vitro testing ble utført ved anvendelse av nerve-hknende embryonale karsinomceller (P19) som gjennomgår apoptose ved fjerning av serum 24 timer før fjerning av serum ble 1-1000 ng/ml erytropoietin eller et modifisert erytropoietin tilsatt til kulturene Påfølgende dag ble mediet fjernet, cellene vasket med friskt, ikke-serumholdig medium, og medium inneholdende testsubstansen (intet serum) tilbakeført til kulturene for ytterligere 48 timer For å bestemme antall levedyktige celler ble en tetrazolium reduksjonstest utført (CellTiter 96, Promega, Inc) Som illustrert i figur 4-5, viser asialoerytropoietin å være like effektivt som erytropoietin i å hindre celledød Det fenylglyoksalmodifiserte erytropoietinet ble testet ved anvendelse av den nerve-hknende P19-celletesten beskrevet ovenfor Som illustrert i figur 6 beholder dette kjemisk modifiserte erytropoietinet fullstendig sine neurobeskyttende effekter

Retensjon av neurobeskyttende aktivitet in vivo ble bekreftet ved anvendelse av en rottefokal ischemimodell der en reversibel lesjon i terntonet av den midtre, cerebrale arten er utført som beskrevet tidligere (Bnnes et al, 2000, Ptoc Nati Acad Set USA 97 10526-31) Voksne Sprague-Dawley hannrotter ble tilført asialoerytropoietin eller erytropoietin (5000 U/kg kroppsvekt intrapentonealt) eller befordringsmiddel ved starten av den artenelle okklusjonen 24 timer senere ble dyrene avlivet og hjernene fjernet for studie Seriesnitt ble kuttet og farget med tetrazohumsalter forldentifisenng av levende hjemeregioner Som vist i figur 7 var asialoerytropoietin like effektivt som naturlig erytropoietin i å oppvise neurobeskyttelse fra 1 time av ischemi Figur 8 viser resultatene av en annen fokal ischemimodell der en komparativ doserespons ble utført

med erytropoietin og asialoerytropoietin Ved den laveste dose på 250 U/kg, ga asialoerytropoietin beskyttelse, mens umodifisert erytropoietin ikke ga beskyttelse

Eksempel 5

MODIFIKASJON AV PRIMÆRSTRUKTUR AV ERYTROPOIETIN OG

EFFEKTIVITET VED NEURONAL BESKYTTELSE

Et antall av mutante erytropoietinmolekyler som ikke binder til erytrocytt-erytropoietinreseptoren er beskrevet, og som derved ikke støtter erytropoiese m vivo eller in vitro Noen av disse molekylene vil ikke desto mindre etterlikne virkningene av erytropoietin i andre vev eller organer For eksempel er en 17-mer inneholdende ammosyresekvensen fra 31-47 av naturlig erytropoietin inaktivt for erytropoiese, men fullstendig aktiv for nerveceller in vitro (Campana& 0'Bnen, 1998 Int J Mol Med 1 235-41)

Deriverte erytropoietiner som er ønskelig for anvendelsene beskrevet hen, kan produseres ved guanidinenng, amidmering, tnmtrofenylering, acetylering, suksinilenng, nitrenng eller modifikasjon av argininrester eller karboksyl grupper blant andre prosedyrer som nevnt ovenfor, for produksjon av erytropoietiner som opprettholder sine aktiviteter for spesifikke organer og vev, men ikke for andre, slik som erytrocytter Når erytropoietin er utsatt for reaksjonene ovenfor, har det generelt vært funnet at det resulterende molekylet mangler både in vivo og in vitro erylropoieltsk aktivitet (for eksempel Satake et al, 1990, Biochim Biophys Acta 1038 125-9) Noen eksempler på fremstilling av modifiserte erytropoietiner er beskrevet nedenfor

Biotinvlerine av frie aminoeruoDer av ervtroooietin

0,2 mg D-biotinyl-e-aminokaproinsyre-N-hydroksysuksinimidester (Boehringer Mannheim nr 1418165) ble oppløst1100 ul DMSO Denne løsningen ble kombinert med 400 pl PBS inneholdende ca 0,2 mg erytropoietin i et fohedekket rør Etter inkubasjon i 4timer ved romtemperatur ble det ureagerte biotinet separert ved gclfiltrenng på en Centncon 10 kolonne Som vist i figur 10, beskytter dette biotinylerte erytropoietinet P19-celler fra serumfjermng

I "Biolmylated recombmant human erythropoietins Bioaclivity and Utihty as a receplor ligand" av Wojchowski et al, Blood, 1989,74(3) 952-8, anvender forfatterne tre ulike fremgangsmåter for å biotinylere erytropoietin Biotin er tilsatt til (1) siahnsyrehalvdelene (2) karboksylatgruppene (3) aminogruppene Forfatterne benytter en musemiltcelleprohferasjonstest for å demonstrere at (1) tilsettingen av biotin til siahnsyrehalvdelene ikke inaktiverer den biologiske aktiviteten til erytropoietin (2) tilsettingen av biotin til karboksylatgruppene fører til vesentlig biologisk maktivenng av erytropoietin (3) tilsettingen av biotin til ammogruppene resulterte i fullstendig biologisk inaktivering av erytropoietin Disse fremgangsmåtene og modifikasjonene er fullstendig omfattet heri Figur 9 viser aktiviteten av biotinylert erytropoietin og asialoerytropoietin i serumsultetP19-test

Jodinenne av ervtrorjoietin

Fremgangsmåte 1 - Jodkuler Enjodkule (Pierce, Rockford, IL) ble inkubert1100 PBS (20 mM natnumfosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,5) inneholdende 1 mCi fn Na125I i 5 minutter 100 jig erytropoietin1100 ul PBS ble så tilsatt til blandingen Etter 10 minutters inkubasjonsperiode ved romtemperatur ble reaksjonen stanset ved fjerning av 200 pl løsning fra reaksjonsrøret (jodkulene forble i røret) Jodoverskuddet ble fjernet ved gelfiltrenng på en Centncon 10 kolonne Som vist i figur 11 er jod-erytropoietin produsert på denne måte effektiv for beskyttelse av P19-celler fra serumfjerning

Fremgangsmåte 2 - Kloramin T 100 ug erytropoietin1100 ul PBS ble tilsatt til 500 uO Na<125>J og blandet sammen i et eppendorfrør 25 ul klorammer T (2 mg/ml) ble så tilsatt og blandingen ble inkubert i ett minutt ved romtemperatur 50 ul kloramin T stoppbuffer (2,4 mg/ml natnummetabisulfit, 10 mg/ml tyrosin, 10% glyserol, 0,1% xylcn i PBS) ble så tilsatt Jodtyrosinet og jodert erytropoietin ble så separert ved gelfiltrenng på en Centncon 10 kolonne

Lysinmodiifkasjoner Karbamylenng Erytropoietin (100 ug) ble modifisert med kahumcyanat som beskrevet i Plapp et al, ("Activity of bovinc pancreatic deoxynbonuclease A with modified amino groups" 1971, J Biol Chem 246, 939-845).

Tnnitrofenylenng Erytropoietin (100 ug) ble modifisert med 2,4,6-tnnitrobcnzensulfonat som beskrevet i Plapp et al, ("Activity of bovine pancreatic deoxynbonuclease A with modified amino groups" 1971, J Biol Chem 246, 939-845).

Acetylenng Erytropoietin (100 ug) ble inkubert i 0,3 M fosfatbuffre (pH 7,2) inneholdende den samme mengde av eddiksyreanhydnd ved 0 °C i 1 time Reaksjonen ble stoppet ved dialyse mot destillert vann

Suksinylermg Erytropoietin (100 ug)10,15 M NaHC03(ph 8,0) ble inkubert et 15 molar overskudd av ravsyreanhydnd ved 15 DC i 1 time Reaksjonen ble stoppet ved dialyse mot destillert vann

Argimnmodifikasjoner Erytropoietin ble modifisert med 2,3-butandion som beskrevet i Riordan ("Functional arginyl residues in carboxypeptidase A Modification with butanedione" Riordan J F , Biochemistry 1973, 12(20) 3915-3923)

Erytropoietin ble modifisert med sykloheksanon som i Patthy et al, ("Identification of functional arginin residues in nbonuclease A and lysozome" Patthy, L, Smith E L J Biol Chem 1975 250(2) 565-9)

Erytropoietin ble modifisert med fenylglyoksal som beskrevet i Werber et al, ("Proceedmgs Carboxypeptidase B modification of functional arginyl residues" Werber, M M , Sokolovsky M , Isr J Med Sei 1975 11(11) 1169-70)

Tyrosin modifikasjoner Erytropoietin (100 ug) ble inkubert med tetranitrometan som tidligere beskrevet i Nestler et al, "Stimulation of rat ovanan cell steroidogenesis by high density hpoproteins modified with tetranitromethane" Nestler J E, Chacko G K, Strauss J F 3rd J Biol Chem 1985 Jun 25, 260(12) 7316-21)

Glutaminsyrc (og asparginsyre) modifikasjoner For å modifisere karboksylgrupper ble erytropoietin (100 ug) inkubert med 0,02 M EDC11 Mglysinamid med pH 4,5 ved romtemperatur i 60 minutter som beskrevet i Carraway et al "Carboxyl group modification in chymotrypsin and chymotrypsinogen" Carraway KL, Spoerl P, KoshlandDEJr JMol Biol 1969 May 28,42(1) 133-7

Tryptofan residumodiifkasjoner Erytropoietin (100 pg) ble inkubert med 20 uM n-bromosuksinimid i 20 mM kahumfosfatbuffer (pH 6,5) ved romtemperatur som beskrevet i Ah et al, J Biol Chem 1995 Mar 3, 270(9) 4570-4 Antallet av oksiderte tryprofanrester ble bestemt ved fremgangsmåten beskrevet i Korotchkina (Korotchkina, LG et al Protein Expr Punf 1995 Feb, 6(1) 79-90)

Fjerning av aminogrupper For å fjerne ammogrupper ble erytropoietin (100fig)

inkubert i PBS (pH 7,4) som inneholdt 20 mM ninhydnn (Pierce Chemical, Rockford, IL) ved 37 °C i 2 timer som beskrevet i Kokkmi et al (Kokkini, G , et al "Modification of hemoglobin by ninhydnn" Blood, Vol 556, No 4 1980 701-705) Reduksjon av det resulterende aldehydet ble utført ved reagere produktet med natnumborhydnd eller htiumaluminiumhydnd Spesifikt ble erytropoietin (100 ug) inkubert med 0,1 M natnumborhydnd i PBS i 30 minutter ved romtemperatur Reduksjonen ble stoppet ved avkjøling av prøvene på is i 10 minutter og ved dialyse mol PBS tre ganger over natten

(Kokkim, G., Blood, Vol 556, No 4 1980 701-705) Reduksjon ved anvendelse av htiumaluminiumhydrid ble utført ved å inkubere erytropoietin (100 pg) med 0,1 M litiumaluminiumhydnd i PBS i 30 minutter ved romtemperatur Reduksjonen ble stoppet ved å avkjøle prøvene på is i 10 minutter og ved dialyse mot PBS tre ganger over natten

Disulfidreduksjon og stabilisering Erytropoietin (100 pg) ble inkubert med 500 mM DTT115 minutter ved 60 °C 20 mM jodacetamid i vann ble så tilsatt til blandingen og inkubert125 minutter ved romtemperatur i mørke

Begrenset proteolyse Erytropoietin kan utsettes for en begrenset, kjemisk proteolyse som er målrettet til spesifikke rester Erytropoietin ble reagert med 2-(2-nitrofenylsulfcnyl)-3-metyl-3'-bromindolemn, som kløver spesifikt etter tryptofanrester i et 50 gangers overskudd i 50% eddiksyre ved 48 timer i mørke ved romtemperatur i rør satt under nitrogentrykk Reaksjonen ble stoppet ved undertrykking med tryptofan og avsalting

Eksempel 6

BESKYTTELSE AV RETINAL ISCHEMI VED PERIFERT ADMINISTRERT

ERYTROPOIETIN

Retinalceller er veldig følsomme for ischemi, sltk at mange vil dø etter 30 minutter med ischemisk stress Videre ligger subakutt eller kronisk ischemi bak forringelse av syn, som følger et antall av alminnelige humane sykdommer, slik som diabetes mclhtus, glaukom og makulær degenerering På det nåværende tidspunktet er det ingen effektive terapier for å beskytte celler mot ischemi En tett endotelbarncrc eksisterer mellom blodet og reima som ekskluderer de fleste store molekyler For å teste hvorvidt perifert administrert erytropoietin vil beskytte celler som er følsomme for ischemi, ble en akutt, reversibel glaukom rottemodell benyttet som beskrevet av Rosenbaum et al, (1997, Vis Res 37 3443-51) Spesifikt ble saltoppløsning injisert til det foranhggende kammeret i øyet på voksne hannrotter til et trykk over systemisk artenelt trykk og opprettholdt i 10 minutter Dyrene ble tilført saltoppløsning eller 5000 U erytropoielin/kg kroppsvektlntrapenlonealt 24 timer før induksjonen av ischemi, og fortsatte som en daglig dose i ytterligere 3 dager Elektroretinografi ble utført på mørke-tilpassete rotter en uke etter behandling Figur 11-12 illustrerer at administrasjonen av erytropoietin er assosiert med god konservering av elektroretinogrammet (ERG) (panel D), i motsetning til dyr behandlet med saltoppløsning alene (panel C), hvor veldig liten funksjon var igjen Figur 11 sammenlikner elektroretinogram a- og b-bølge amplitudene

for de erytropoietinbehandlete gruppene og de saltoppløsningsbehandlete gruppene, og viser signifikant beskyttelse tilveiebrakt ved erytropoietin

Eksempel 7

GJENOPPBYGGENDE EFFEKTER AV ERYTROPOIETIN PÅ REDUSERT

KOGNITIV FUNKSJON SOM OPPSTÅR FRA HJERNESKADE

I en studie for demonstrasjon av erytropoietins evne til å gjenoppbygge redusert kognitiv funksjon hos mus etter at de har fått hjernetraume, ble Balb/C-hunnmus utsatt for dempet hjernetraume, som beskrevet i Bnnes et al, PNAS 2000,97, 10295-10672, og 5 dager senere startet daglig intrapentoneal erytropoietinadministrasjon med 5000 U/kg kroppsvekt 12 dager etter skade ble dyr testet for kognitiv funksjon i Morns vannlabynnt, med fire forsøk pr dag Mens både behandlete og ikke-behandlete dyr gjorde det dårlig i testen (med svømme tider på omknng 80 sekunder av 90 mulige), viser figur 13 at erytropoietinbehandlete dyr gjorde det bedre (i denne presentasjonen er en negativ verdi bedre) Selv om starten på erytropoietinbehandhng er forsinket inntil 30 dager etter traume (figur 14), er gjenoppbygging av kognitiv funksjon også sett

Eksempel 8

KAIN AT MODELL

I kainat neurotoksisitetsmodellen ble asialoerytropoietin administrert i henhold til protokollen fra Bnnes et al, Proe Nati Acad Sei USA 2000, 97, 10295-10672 ved en dose på 5000 U/kg kroppsvekt tilført intraperitonealt 24 timer før tilførsel av 25 mg/kg kainat som viser seg å være like effektivt som erytropoietin, som vist ved tid til død (figur 15)

Oppfinnelsens område skal ikke begrenses ved de spesifikke utførelsesformene beskrevet, som er ment som enkle illustrasjoner av individuelle aspekter av oppfinnelsen, og funksjonelle, ekvivalente fremgangsmåter og komponenter er innefor oppfinnelsens rekkevidde Selvfølgelig vil ulike modifikasjoner av oppfinnelsen, i tillegg til dem vist og beskrevet hen, være tydelige for dem øvet innen faget, fra den tidligere nevnte beskrivelsen og vedlagte figurer Slike modifikasjoner er ment å ligge innenfor rammen av de vedlagte krav

Alle referanser sitert hen er inkorporert ved referanse i sin helhet hen for alle formål

Claims (1)

1 Anvendelse av et erytropoietin, valgt fra gruppen bestående av i) et erytropoietin med minst ingen sialmsyrehalvdeler,

11 ) et erytropoietin med minst ingen N-forbundne eller O-forbundne karbohydrater, ni) et erytropoietin med minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med mmst én glykosidase, iv) el erytropoietin med en karbohydratdel av erytropoietinmolekylet som har mmst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, v) et erytropoietin med minst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte, vi) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte argininrester, vu) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-terminale ammogruppe av erytropoietinmolekylet, vin)et erytropoietin med minst en modifisert tyrosinrest, ix) et erytropoietin med minst en modifisert asparginsyre- eller en glutaminsyrerest, x) et erytropoietin med minst en modifisert tryptofanrest, xi) et erytropoietin som har minst én aminognippe fjernet, xii) et erytropoietin med mmst en åpning ved minst én av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, xni)et erytropoietin tilveiebrakt som har minst én substitusjon av minst én aminosyre, og xiv) el avkortet erytropoietin, for fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge funksjonen eller viabiliteten av erytropoietinresponsive pattedyrceller og deres assosierte celler, vev og organer

2 Anvendelse ifølge krav l, der nevnte erytropoietin er asialoerytropoietin

3 Anvendelse ifølge krav 2, der nevnte asialoerytropoietin er humant asialoerytropoietin 4 Anvendelse ifølge krav 1, der nevnte erytropoietin ikke har N-forbundne karbohydrater

5 Anvendelse ifølge krav 1, der nevnte erytropoietin ikke har 0-forbundne karbohydrater

6 Anvendelse ifølge krav 1, der at nevnte erytropoietin er behandlet med minst én glykosidase

7 Anvendelse ifølge krav 1, der nevnte erytropoietin er uttrykt i en insekt- eller plantecelle

8 Anvendelse ifølge krav 1, der nevnte erytropoietin er penodatoksidert erytropoietin

9 Anvendelse ifølge krav 8, der nevnte penodatoksiderle erytropoietin er kjemisk redusert med natnumcyanoborhydnd

10 Anvendelse ifølge krav 1, der nevnte erytropoietin omfatter en R-glyoksal halvdel og den ene eller flere argininrester, hvor R er aryl eller alkylhalvdcl

11 Anvendelse ifølge krav 10, der nevnte erytropoietin er fenylglyoksal-erytropoietin

12 Anvendelse ifølge krav 1, der en argininrest av nevnte erytropoietin er modifisert ved reaksjon med et tilstøtende diketon, valgt fra gruppen bestående av 2,3-butandion og sykloheksandion

13 Anvendelse ifølge krav 1, der en argininrest av nevnte erytropoietin er reagert med 3-deoksyglukoson

14 Anvendelse ifølge krav 1, der nevnte erytropoietinmolekyl har minst ett biotinylert lysin eller N-terminal ammogruppe

15 Anvendelse ifølge krav 14, der nevnte erytropoietinmolekyl er biotinylert erytropoietin

16 Anvendelse ifølge krav 1, der nevnte erytropoietin er glusitolyllysinerytropoietin eller fruktosyllysinerytropoietin

17 Anvendelse ifølge krav 1, der en lysinrest av nevnte erytropoietin er karbamylert

18 Anvendelse ifølge krav 1, der en lysinrest av nevnte erytropoietin er acylert

19 Anvendelse ifølge krav 18, der en lysinrest av nevnte erytropoietin er acctylert

20 Anvendelse ifølge krav 1, der en lysinrest av nevnte erytropoietin er suksinylert

21 Anvendelse ifølge krav 1, der en lysinrest av nevnte erytropoietin er modifisert ved 2,4,6-tnnitrobenzensulfonatnatnum eller et annet salt derav

22 Anvendelse ifølge krav 1, der en tyrosinrest av nevnte erytropoietin er nitrert eller jodert

23 Anvendelse ifølge krav 1, der en asparginsyre- eller glutaminsyrerest av nevnte erytropoietin er reagert med et karbodumid etterfulgt av reaksjon med et amin

24 Anvendelse ifølge krav 21, karakterisert ved at nevnte amin er glysinamid 25 Anvendelse ifølge krav 1, der den erytropoietinresponsive celle eller vev er neuronale, retinale, muskel, hjerte, lunge, lever, nyre, tynntarm, binyrebark, bmyremarg, kapillære endotel, testikkel, ovane eller endometnumceller eller vev

26 Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en effektiv erytropoietinresponsiv cellebeskyttende, opprettholdende, styrkende, eller gjenoppbyggende mengde av et erytropoietin valgt fra gruppen bestående av i) et erytropoietin med minst ingen sialmsyrehalvdeler, ii) et erytropoietin med minst mgen N-forbundne eller O-forbundne karbohydrater, in) et erytropoietin med minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med minst 6n glykosidase, iv) et erytropoietin med en karbohydratdel av erytropoietinmolekylet som har mmst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, v) et erytropoietin med minst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte, vi) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte argininrester, vu) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-tcrminale ammogruppe av erytropoietinmolekylet, vin)et erytropoietin med minst en modifisert tyrosinrest, ix) et erytropoietin med minst en modifisert asparginsyre- eller en glutaminsyrerest, x) et erytropoietin med minst en modifisert tryptofanrest, xi) et erytropoietin som har minst én ammogruppe fjernet, xii) et erytropoietin med minst en åpning ved minst én av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, xin)et erytropoietin tilveiebrakt som har minst én substitusjon av minst én aminosyre, og xiv) et avkortet erytropoietin

27 Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte erytropoietin er asialoerytropoietin eller fenylglyoksalerytropoietm 28 Anvendelse av et erytropoietin, for fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for å beskytte, opprettholde, styrke eller gjenoppbygge funksjonen eller viabiliteten av en erytropoietinresponsiv celle eller dens assosierte celler, vev eller organer, hvor nevnte celler vev eller organer erl kke-eksiterbare celler, vev eller organer, eller omfatter hovedsakelig ikke-eksiterbarc celler eller vev

29 Anvendelse ifølge krav 28, der nevnte erytropoietin er et erytropoietin eller et naturlig erytropoietin, eller en erytropoietinanalog, en erytropoieunetterlikner og erylropojetinfragmcnt, et hybrid erytropoietinmolekyl, et erytropoietinresptorbindende molekyl, en erytropoietinagonist, et nyreerytropoietin, et hjemeerytropoietin, en ohgomer derav, en multimer derav, et mutein derav, en beslektet derav, en naturlig forekommende form derav, en syntetisk form derav, en rekombinant form derav, en glykosylenngsvariant derav, en deglykosylert variant derav eller en kombinasjon derav

30 Anvendelse ifølge krav 28, der nevnte erytropoietin er fenylglyoksalerytropoietin

31 Fremgangsmåte for beskyttelse, opprettholdelse eller styrking av viabiliteten av en celle, et vev eller et organ, isolert fra en pattedyrskropp, karakterisert ved at den omfatter å eksponere nevnte celle, vev eller organ for en farmasøytisk sammensetning omfattende et erytropoietin

32 Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at nevnte erytropoietin er et erytropoietin eller et naturlig erytropoietin, eller en erytropoietinanalog, en erytropoietinetterhkner og erytropoictinfragment, et hybrid erytropoietinmolekyl, et erytropoietinresptorbindende molekyl, en erytropoietinagonist, et nyreerytropoietin, et hjemeerytropoietin, en ohgomer derav, en multimer derav, et mutein derav, en beslektet derav, en naturlig forekommende form derav, en syntetisk form derav, en rekombinant form derav, en glykosylenngsvariant derav, en deglykosylert variant derav eller en kombinasjon derav

33 Fremgangsmåte ifølge krav 32, karakterisert ved at nevnte erytropoietin er i) et erytropoietin med minst mgen sialmsyrehalvdeler, II ) et erytropoietin med minst mgen N-forbundne eller O-forbundne karbohydrater, III ) et erytropoietin med minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med minst én glykosidase, iv) et erytropoietin med en karbohydratdel av erytropoietinmolekylet som har minst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, v) et erytropoietin med minst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte, vi) et erytropoietin med mmst én eller flere modifiserte argininrester, vu) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-terminale ammogruppe av erytropoietinmolekylet, vin)et erytropoietin med minst en modifisert tyrosinrest, ix) et erytropoietin med minst en modifisert asparginsyre- eller en glutaminsyrerest, x) et erytropoietin med minst en modifisert tryptofanrest, xi) et erytropoietin som har minst én ammogruppe fjernet, xn) et erytropoietin med mmst en åpning ved minst én av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, xiii) et erytropoietin tilveiebrakt som har minst én substitusjon av minst én aminosyre, eller xiv) et avkortet erytropoietin

34 Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at nevnte erytropoietin er humant erytropoietin

35 Fremgangsmåte i følge krav 31, karakterisert ved at nevnte erytropoietin er fenylglyoksalerytropoietin

36 Anvendelse av et erytropoietin valgt fra gruppen bestående av et erytropoietin eller naturlig erytropoietin, eller en erytropoietinanalog, en erytropoietinettcrlikncr og erytropoietinfragment, et hybnd erytropoietinmolekyl, et erytropoietinresptorbindende molekyl, en erytropoietinagonist, et nyreerytropoietin, et hjemeerytropoietin, en ohgomer derav, en multimer derav, et mutein derav, en beslektet derav, en naturlig forekommende form derav, en syntetisk form derav, en rekombinant form derav, en glykosylenngsvariant derav, en deglykosylert vanant derav eller en kombinasjon derav for fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for gjenoppbygging av kognitiv dysfunksjon i et pattedyr

37 Anvendelse ifølge krav 36, der den kognitive dysfunksjonen er et resultat av skade forårsaket ved anfallssykdom, multippel sklerose, slag, lavt blodtrykk, hjertestans, ischemi, myokardialt infarkt, inflammasjon, aldersrelatert tap av kognitiv funksjon, stråhngsskade, cerebral palsi, neurodegenererende sykdom, Alzheimer's sykdom, Parkinsons sykdom, Leigh's sykdom, AIDS-demens, hukommelsestap, amyotrofisk lateral sklerose, alkoholisme, humørforstyrrelser, angstforstyrrelser, forstyrrelse av manglende oppmerksomhet, autisme, Creutzfeld-Jakob's sykdom, hjerne- eller ryggmargstraume eller ischemi, hjerte-lunge bypass, kronisk hjertesvikt, makulær degenerenng, diabetisk neuropali, diabetisk retinopati, glaukom, retinal ischemi eller retinal traume

38 Anvendelse ifølge krav 36, der nevnte erytropoietin er et fenylglyoksalerytropoietin

39 Anvendelse ifølge krav 36, der nevnte erytropoietin er i) et erytropoietin med minst ingen sialmsyrehalvdeler, ii) et erytropoietin med minst ingen N-forbundne eller O-forbundne karbohydrater, ni) et erytropoietin med minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med minst én glykosidase, iv) et erytropoietin med en karbohydratdel av erytropoietinmolekylet som har minst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, v) et erytropoietin med minst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte, vi) et erytropoietin med mmst én eller flere modifiserte argininrester, vu) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-terminale ammogruppe av erytropoietinmolekylet, vin)et erytropoietin med minst en modifisert tyrosinrest, ix) et erytropoietin med minst en modifisert asparginsyre- eller en glutaminsyrerest, x) et erytropoietin med minst en modifisert tryptofanrest, xi) et erytropoietin som har minst én ammogruppe fjernet, xn) et erytropoietin med minst en åpning ved minst én av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, xm)et erytropoietin tilveiebrakt som har minst én substitusjon av minst én aminosyre, eller xiv) et avkortet erytropoietin

40 Fremgangsmåte for å fremme transcytosen av et molekyl over en endotelcellebarnere i et pattedyr, karakterisert ved at den omfatter å admini strere til nevnte pattedyr en sammensetning som omfatter nevnte molekyl i assosiasjon med et erytropoietin valgt fra gruppen bestående av i) et erytropoietin med minst ingen sialmsyrehalvdeler, II ) et erytropoietin med minst ingen N-forbundne eller O-forbundne karbohydrater, III ) et erytropoietin med minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med minst én glykosidase, iv) et erytropoietin med en karbohydratdel av erytropoietinmolekylet som har mmst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, v) et erytropoietin med minst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte, vi) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte argininrester, vu) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-terminale ammogruppe av erytropoietinmolekylet, vin)et erytropoietin med minst en modifisert tyrosinrest, ix) et erytropoietin med minst en modifisert asparginsyre- eller en glutaminsyrerest, x) et erytropoietin med minst en modifisert tryptofanrest, xi) et erytropoietin som har minst én ammogruppe fjernet, xu) et erytropoietin med minst en åpning ved minst én av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, xni)et erytropoietin tilveiebrakt som har minst én substitusjon av minst én aminosyre, og xiv) et avkortet erytropoietin

41 Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at nevnte assosiasjon er en labil, kovalent binding, en stabil, kovalent binding eller en ikke-kovalent assosiasjon med et bindingssete for nevnte molekyl

42 Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at nevnte endotelcellebarnere er valgt fra gruppen bestående av blod-hjerne barneren, blod-øye barneren, blod-testikkel barrieren, blod-ovane barneren og blod-placenta barneren

43 Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at nevnte molekyl er et reseptoragonisthormon eller reseptorantagonisthormon, en neurotrofisk faktor, et antimikrobielt middel, et radioaktivt legemiddel, et antisens ohgonukleotid, et antistoff, et immunforsvarsdempende middel eller ct anti-cancerlegemiddel

44 Sammensetmng for transport av et molekyl via transcytose over en endotelcellebarnere, karakterisert ved al den omfatter nevnte molekyl i assosiasjon med et erytropoietin valgt fra gruppen bestående av i) et erytropoietin med minst ingen sialmsyrehalvdeler, u) et erytropoietin med minst ingen N-forbundne eller O-forbundne karbohydrater, ni) et erytropoietin med minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av nalurhg erytropoietin med minsl én glykosidase, iv) et erytropoietin med en karbohydratdel av erytropoietinmolekylet som har minst ct ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, v) el erytropoietin med mmst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte, vi) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte argininrester, vu) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-terminale ammogruppe av erytropoietinmolekylet, viu)et erytropoietin med minst en modifisert tyrosinrest, ix) ct erytropoietin med minst en modifisert asparginsyre- eller en glutaminsyrerest, x) ct erytropoietin med minst en modi fisert tryptofanrest, xi) et erytropoietin som har minst én ammogruppe fjernet, xii) et erytropoietin med minst en åpning ved minst én av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, xm)et erytropoietin tilveiebrakt som har minst én substitusjon av minst én aminosyre, og xiv) et avkortet erytropoietin

45 Sammensetning ifølge krav 44, karakterisert ved at nevnte assosiasjon er en labil, kovalent binding, en stabil, kovalent binding eller en ikke-kovalent assosiasjon med et bindingssete for nevnte molekyl

46 Sammensetning ifølge krav 44, karakterisert ved at nevnte molekyl er ct reseptoragonisthormon eller reseptorantagonisthormon, en neurotrofisk faktor, et antimikrobiell middel, et radioaktivt legemiddel, et antisens ohgonukleotid, et antistoff, et immunforsvarsdempende middel eller et anti-cancerlegemiddel

47 Anvendelse av et erytropoietin valgt fra gruppen bestående av i) et erytropoietin med minst ingen sialmsyrehalvdeler, ii) et erytropoietin med minst ingen N-forbundne eller O-forbundne karbohydrater, ni) et erytropoietin med minst et redusert karbohydratinnhold i kraft av behandling av naturlig erytropoietin med minst 6n glykosidase, iv) et erytropoietin med en karbohydratdel av erytropoietinmolekylet som har minst et ikke-mammalsk glykosylenngsmønster i kraft av ekspresjonen av et rekombinant erytropoietin i ikke-mammalske celler, v) ct erytropoietin med minst ett eller flere oksiderte karbohydrater som også kan være kjemisk reduserte, vi) ct erytropoietin med minst én eller flere modifiserte argininrester, vu) et erytropoietin med minst én eller flere modifiserte lysinrester eller en modifikasjon av den N-tcrminale ammogruppe av erytropoietinmolekylet, vin) et erytropoietin med minst en modifisert tyrosinrest, ix) et erytropoietin med minst en modifisert asparginsyre- eller en glutaminsyrerest, x) el erytropoietin med minst en modifisert tryptofanrest, xi) et erytropoietin som har minst én ammogruppe fjernet, xn) et erytropoietin med minst en åpning ved minst én av cysteinforbindelsene i erytropoietinmolekylet, xui)et erytropoietin tilveiebrakt som har mmst én substitusjon av minst én aminosyre, og et avkortet erytropoietin assosiert med et molekyl for fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for transport av nevnte molekyl via transcytose over en endotelcellebarnere 48 Anvendelse ifølge krav 47, der nevnte assosiasjon er en labil, kovalent binding, en stabil, kovalent binding eller en ikke-kovalent assosiasjon med et bindingssete for nevnte molekyl

49 Anvendelse ifølge krav 47, der nevnte molekyl er et reseptoragonisthormon eller reseptorantagonisthormon, en neurotrofisk faktor, et antimikrobiell middel, et radioaktivt legemiddel, el antiscns ohgonukleolid, et antistoff, et immunforsvarsdempende middel eller et anti-cancerlegemiddel

50 Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter penodatoksidert erytropoietin

51 Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter glysitolyllysinerytropoietin

52 Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter fruktosyll ys i nery tropoi eli n

53 Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter 3-deoksyglukosonerytropoietin

54 Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter karbamylert asialoerytropoietin

55 Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter biotinylert asialoerytropoietin

56 Sammensetning, karakterisert ved at den om fatter suksinylert asialoerytropoietin

57 Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter acetylert asialoerytropoietin