CZ20013695A3 - Farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Farmaceutický prostředek

1. Oblast techniky *

Vynález se týká farmaceutického prostředku s obsahem erythropoetinu, určeného pro ovlivnění funkce excitovatelných tkání. Jde zejména o ochranu těchto tkání, například neuronů a srdeční tkáně před působením ^: neurotoxinů, nedostatečného zásobení kyslíkem a před dalšími nepříznivými 'podněty, čímž je možno usnadnit dobrou funkci těchto tkání, například při výuce a v případě paměti.

2. Dosavadní stav techniky

Řada akutních a chronických chorob a chorobných stavů má svůj původ v poškození excitovatelných tkání a v jejich dysfunkci, která je způsobena zevními a vnitřními podněty. Tyto podněty jsou například nedostatek přívodu kyslíku nebo glukózy, přítomnost neurotoxinů, důsledky stárnutí, infekční organismy a úrazy. Excitovatelná tkáň < může být například poškozena v důsledku různých záchvatů nebo chronických poruch, spojených se záchvaty křečí, ’ jako jsou epilepsie, mozková mrtvice, Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, poranění centrálního nervového systému, nedostatečné zásobení kyslíkem, poranění mozku nebo míchy, demence v případě AIDS a jiné formy demence, ztráta kognitivních funkcí v průběhu stárnutí, ztráta paměti, amyotrofická laterální skleróza, roztroušená skleróza, snížený krevní tlak, srdeční zástava, ztráta neuronů, inhalace kouře a otrava oxidem uhelnatým.

• ♦ · · ·· · · · · ·

Je všeobecně uznáváno, že snížení dodávky energie do mozku, například snížení množství glukózy nebo kyslíku, má za následek hluboký pokles mozkových funkcí včetně kognitivních funkcí. Řada neuronů v centrálním nervovém systému je snadno poškozena při práci za metabolicky omezených podmínek, například při nedostatečném zásobení kyslíkem nebo glukózou, při stresu a/nebo v případě prodloužené silné excitace. Za těchto podmínek může dojít ke kolapsu elektrochemických gradientů v těchto buňkách, ^x* což vede k nevratnému poškození neuronů a k uhynutí buněk. Podle současného názoru je tento mechanismus běžnou příčinou široké škály běžných degenerativních neurologických onemocnění, která vyvolávají demenci, jako jsou mozková mrtvice, epilepsie a Alzheimerova nemoc.

Přestože důsledky omezeného přívodu energie na mozkové funkce jsou dobře známy, účinky vyššího přívodu energie do jinak normálního mozku byly méně rozsáhle studovány. V poslední době se zdá, že při zlepšeném přívodu glukózy nebo kyslíku dochází k podstatnému zlepšení komplexních kognitivních funkcí na živočišném ‘ modelu i u pokusných osob, jak bylo popsáno například v publikacích Kopf a další, 1994, Behavioral and Neural Biology 62:237-243; Li a další, 1998, Neuroscience 85:785-794; Moss a další, Psychopharmacology 124:255-260. Mimo to se stále prodlužuje seznam neuropeptidů, produkovaných mozkovou tkání a přímo zlepšujících kognitivní funkce normálního mozku. Fyziologická baze tohoto zlepšení závisí na změnách spojení mezi neurony v důsledku změn na synapsích.

Konstrukce mozkové tkáně je velmi proměnlivá a může se měnit. Tyto pochody, které jsou zprostředkovány řadou ···· · · · · ···· ·· · · · trofických molekul, se objevují nejen v případě poškození, nýbrž hrají důležitou úlohu také v průběhu výukových, paměťových a kognitivních funkcí. Přestože prototypem neurotrofinu je růstový faktor nervové tkáně, NGF, byla v poslední době popsána řada cytokinů, které rovněž mají trofickou funkci v mozku, například podle publikace Hefti a další 1997, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:239-67.

V poslední době došla řada výzkumných pracovníků k závěru, že v nervové tkáni dochází k expresi vysokého množství erythropoetinu EPO a jeho receptoru EPO-R podle publikací Digicaylioglu a další, 1998, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:3717-20; Juul a další, Pediatr. Res. 43:40-9; Marti a další, 1997, Kidney Int. 51:416-8; Morishita a další, 1997, Neuroscience 76:105-16. Přestože EPO a jeho receptor jsou produkty jednotlivých genů, jsou tyto látky v CNS podstatně menší. Fyziologický význam tohoto pozorování nebyl dosud objasněn, je však pravděpodobné, že v případě rozdílů v molekulové mnotnosti dochází k modifikaci biologické účinnosti. Například při studiích na lidských dobrovolnících bylo možno dojít k závěru, že EPO není do mozku transportován z periferie, což je popsáno například ve svrchu uvedené publikaci Marti a další, 1997. Až dosud však tato možnost nebyla pro EPO vyhodnocena přímým testem. Přestože EPO z mozkové tkáně má přibližně o 15 % nižší molekulovou hmotnost než EPO z ledvin vzhledem k rozdílům v sialylaci, je EPO z mozkové tkáně účinnější při stimulací erythroidních kolonií při nižší koncentraci podle publikace Masuda a další, 1994,

J. Biol. Chem. 269:19488-93. Na druhé straně má receptor z CNS mnohem nižší afinitu pro deglykosylovaný EPO než o 30 % větší periferní receptor podle publikací Konishi a

další, 1993, Brain Res. 609:29-35; Masuda a další, 1993,

J. Biol. Chem. 268:11208-16.

Bylo prokázáno, že v mozkové tkáni dochází k expresi EPO v astrocytech, přičemž zvýšenou expresi EPO nebo zvýšené uvolnění této látky je možno vyvolat sníženým zásobením kyslíkem a dalšími látkami, které vyvolávají metabolický stres podle publikací Marti a další, 1996, Eur. J. Neurosci. 8:666-76; Masuda a další, 1993, J.

Biol. Chem. 268:11208-16; Masuda a další, 1994, J. Biol. Chem. 269:19488-93 nebo také obsazením jiných receptoru, například pro inzulínu podobný růstový faktor podle publikace Masuda a další 1997, Brain Res. 746:63-70. Neurony jsou jednou z cílových tkání pro takto uvolněný EPO vzhledem k tomu, že u nich dochází k expresi EPO-R vysoce specifickým způsobem podle publikace Morishita a další, 1997, Neurosceince 76:105-16. Na rozdíl od vlastního EPO se zdá, že hustota EPO-R není měněna v průběhu metabolického stresu podle publikace Digicaylíoglu a další, 1995, Proč. Nati. Acad. Scí. USA 92:3717-20.

Studie z poslední doby prokazují, že EPO může chránit neurony proti poškození nedostatkem kyslíku in vitro a také in vivo v případě přímého vstřiknutí do mozkových komor podle publikací Morishita a další, 1997, Neuroscience 76:105-16; Sadamo a další, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 253:26-32; Sakanaka a další, 1998, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95: 4635-40. Konishi a další 1993, Brain Res. 609:29-35 prokazují, že EPO podporuje in vivo přežívání cholinergních neuronů u dospělých krys v případě vstřiknutí přímo do mozkových komor. EPO, podaný centrálně do mozkových komor může také úspěšně zabránit • ·

všem důsledkům ischemického poškození, jak je možno prokázat zachováním výukových schopností u krys podle publikace Sadamoto a další 1998, Biochem. Bíophys. Res. Commun. 253:26-32. V publikaci Campana a další, 1998,

Int. J. Mol. Med. 1:235-41 se uvádí, že pro tento neurotrofní účinek na neuronových buňkách v kultuře je zapotřebí pouze přítomnosti 17-aminokyselinové části EPO.

Po řadu let bylo předpokládáno, že jedinou zřejmou fyziologickou úlohou erythropoetinu EPO bylo řízení produkce červených krvinek. V poslední době je zřejmé, že EPO jako látka, náležející do skupiny cytokinů, má ještě další důležité fyziologické funkce, které jsou zprostředkovány přes interakci s receptorem EPO-R. Z těchto účinků je možno uvést zejména mitogenezi, modulaci přívodu vápníku do hladkých svalů a nervových buněk a účinky na intermediární metabolismus. Je pravděpodobné, že EPO může zajistit kompenzační reakce, které zlepšují v případě nedostatečného zásobení kyslíkem buněčné prostředí. Přestože bylo prokázáno, že EPO při intrakraniální injekci chrání neurony proti hypoxickému poškození, je intrakraniální podání nepřijatelým způsobem léčebného podání, zvláště u normálních lidí. Mimo to však již předchozí studie u chudokrevných nemocných, jimž byl podáván EPO prokázaly, že nedochází k transportu periferně podaného EPO do mozkové tkáně, například podle publikace Marti a další, 1997, svrchu.

3. Podstata vynálezu

Vynález se týká farmaceutických prostředků a způsobů modulace funkce excitovatelných tkání u savců, jakož i přívodu těchto látek k uvedeným tkáním. Vynález je zčásti

založen na zjištění, že při systemickém podání ve vysokých dávkách dochází k příjmu EPO do mozku. Zejména bylo prokázáno, že EPO, podaný ve vysokých dávkách může procházet mozkovou bariérou a může tedy zlepšit kognitivní funkce a chránit nervovou tkáň před poškozením ze podmínek, vyvolávajících stres, například při hypoxii.

Modulátory receptorů, aktivovaného EPO, jsou látky, které při systematickém podání vně mozkomíšní bariéry mohou aktivovat receptory pro EPO v excitovatelných tkáních v důsledku toho chránit tyto tkáně před poškozením a uhynutím. To znamená, že název EPO se může týkat jakékoliv formy erythropoetinu, která může vyvolat modulaci excitovatelné tkáně, může jít o analogy nebo fragmenty EPO a o látky, EPO podobné. Ve výhodném provedení má erythropoetin zvýšenou specifičnost pro mozkový receptor pro EPO. V dalším možném provedení jde o erythropoetin, který nemá žádný vliv na tvorbu červených krvinek. Podle ještě dalšího provedení se tento erythropoetin podává v dávkách, které jsou vyšší než dávky, jichž je zapotřebí pro maximální stimulaci tvorby červených krvinek.

Podstatu vynálezu tvoří farmaceutický prostředek v lékové formě, upravené pro modulaci excitovatelné tkáně, zvýšení kognitivních funkcí nebo přesun sloučenin přes endotheliální spoje, tento prostředek obsahuje účinné netoxické množství v rozmezí 50 000 až 500 000 jednotek EPO, modulátoru účinnosti receptorů EPO, nebo kombinace těchto látek spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem. Podle jednoho z možných provedení obsahuje prostředek 50 000 až 500 000 jednotek EPO. Podle jiného provedení se podává dávka, pří jejímž podání je možno dosáhnout • ·· koncentrace EPO v krevním oběhu vyšší než 10 000 mjednotek/ml séra. Podle dalšího provedení se této koncetnrace EPO v krevním oběhu dosahuje za 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 hodin po podání EPO. Podle ještě dalšího provedení se vynález týká farmaceutického balení, které obsahuje účinné množství EPO pro modulaci excitovatelné tkáně, zlepšení kognitivních funkcí nebo přenos sloučenin přes endotheliální spoje, toto množství může balení obsahovat v jednom nebo ve větším počtu zásobníků.

Pomocí uvedeného farmaceutického prostředku je možno dosáhnout modulace funkce excitovatelné tkáně u savců při periferním podání účinného množství erythropoetinu. Excitovatelnou tkání může při tom být normální tkáň nebo chorobně změněná tkáň. Podle jednoho z možných provedeni je excitovatelnou tkáni neuronová tkáň centrálního nervového systému. Podle dalšího možného provedení je excitovatelnou tkání neuronová tkáň periferního nervového systému a srdeční tkáň.

Tímto způsobem je také možno zlepšit podmínky pro funkci excitovatelných tkání u savců, a to u normálních i chorobně změněných excitovatelných tkání periferním podáním účinného množství EPO nebo účinného množství modulátoru účinnosti receptorů pro EPO. Zvýšením funkce excitovatelné tkáně může být například zlepšení výukových schopností, popřípadě paměti. Jako příklady stavů nebo onemocnění, které je uvedeným způsobem možno zlepšit, je možno uvést poruchy nálady, úzkostné poruchy, deprese, autismus, poruchy pozornosti, poruchy ve smyslu hyperaktivity, Alzheimerovu nemoc, stáří a kognitivní dysfunkce.

- *· *· · · ·· • · © · 9 9 9 9 9 « 9

99 9999

Podle dalšího provedení může modulace funkce excitovatelné tkáně zajistit ochranu před patologickými stavy, vznikajícími v důsledku porušení excitovatelné tkáně, například neuronů centrálního nervového systému, neuronů periferního nervového systému nebo srdeční tkáně. Tyto patologické stavy mohou vznikat například v důsledku hypoxie, různých záchvatů, neurodegenerativních onemocnění, v důsledku přítomnosti neurotoxinů, při roztroušené skleróze, sníženém krevním tlaku, zástavě srdce, ozáření, při snížení hladině glukózy v krevním oběhu. Podle jednoho z možných provedení je patologickým stavem výsledek sníženého přívodu kyslíku, při čemž může jít o prenatální nebo postnatální snížený přívod kyslíku, o dušení, topení, dysfunkci po chirurgickém zákroku, otravu oxidem uhelnatým, inhalaci kouře, chronické obstruktivní plicní choroby, rozedmu, syndrom nedostatečnosti dýchacího ústrojí u dospělých, šok při sníženém krevním tlaku, septický šok, inzulínový šok, anafylaktický šok, krizi při anemii, například se srpkovitými buňkami, krizi při zástavě srdeční, změnách srdečního rytmu a narkóze rajským plynem. V případě, že patologickým stavem je stav po různých záchvatech, může jít o epilepsii, křeče nebo jiné záchvatovité choroby. V případě neurodegenerativního onemocnění může jít například o mozkovou mrtvici, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, poranění mozku nebo míchy, demenci v případě AIDS, ztrátu kognitivních funkcí v souvislosti s věkem, ztrátu paměti, amyotrofickou laterální sklerózu, alkoholismus, ischemii sítnice, stárnutí, glaukom nebo ztrátu neuronů. Podle dalšího možného provedení je možno podávat EPO k prevencí poškození tkáně při chirurgických zákrocích, například při operaci nádoru nebo úpravě

9 9

9

9999 « 99 99 ·* 9 9

9 9 9 ·

9 9 9 »· 999 999 aneurysmatu.

Podle ještě dalšího provedení je možno uvedeným způsobem usnadnit průnik molekul do buněk savců tak, že se podává molekula ve spojení s erythropoetinem. Spojení mezi molekulou, která má do buňky proniknout a mezi EPO může být například labilní kovalentní vazba, stabilní kovalentní vazba nebo může jít o nekovalentní spojení s vazným místem na molekule. Podle jednoho z možných provedení může být endotheliální bariérou pro prostup buněk, mozkomíšní bariéra, bariéra mezi krevním oběhem a vnitřním prostorem oka, bariéra mezi krevním oběhem a varlaty nebo vaječníky nebo mezi krevním oběhem a placentou.

Součást podstaty vynálezu tvoří také farmaceutický prostředek, určený pro transport molekuly přes endotheliální bariéru, prostředek obsahuje takovou molekulu ve spojení s EPO, modulátorem aktivity receptoru EPO nebo EPO-aktivovaným modulátorem receptoru. Podle jednoho z možných provedení obsahuje prostředek jako EPO erythropoetin, analog erythropoetinu, látku podobnou erythropoetinu, fragment této látky, hybridní molekulu erythropoetinu, molekulu, schopnou se vázat na receptor pro erythropoetin, agonistickou látku vzhledem k erythropoetinu, erythropoetin z ledvin nebo mozku, jeho oligomer, multimer, mutein, congener, přirozeně se vyskytující formu, syntetickou formu, rekombinantní formu nebo kombinaci těchto forem. Podle dalšího možného provedení je molekulou v takovém prostředku hormon, neurotrofní faktor, antimikrobiální látka, radiofarmaceutická látka, protiláka, imunosupresivní látka, toxin nebo látka s protinádorovým účinkem.

ochranně myší před křečemi a uhynutím po podání neurotoxinu kainátu. Hodnoty, uvedené v závorkách pod každým sloupcem uvádějí počet zvířat, jimž byl podán toxin. Na obr. 3B jsou znázorněny ochranné účinky periferně podaného EPO a je zřejmé, že tyto účinky se zvyšují při každodenním podání EPO. Z obr. 3 je zřejmé, že nástup účinku EPO je opožděný, což je charakteristické pro expresi genu.

Na obr. 4A a B jsou znázorněny ochranné účinky rhEPO na ischemické poškození mozku vyvoláním místního krvácení. Na obr. 4A jsou znázorněny výsledky po systemickém podání EPO v různých časech po vyvolání mozkové ischemie. Na obr. 4B je znázorněno srovnání účinku dvou forem EPO na ochranu mozku proti poškození ve stejném modelu. Při srovnání rekombinantního lidského rhEPO a derivátu EPO se 17 aminokyselinami (17-mer) je zřejmé, že některé analogy EPO jsou při ochraně nervové tkáně neúčinné.

Na obr. 5 je znázorněn ochranný účinek rhEPO proti následkům poranění mozkové kůry.

Na obr. 6A a 6B je znázorněn ochranný účinek EPO na ischemické poškození srdeční tkáně. Na obr. 6A je znázorněno množství kreatinkinázy CK, která je indikátorem poškození buněk srdečního svalu. Na obr. 6B je znázorněna účinnost myeloperoxidázy MPO, která je ukzatelem zánětu.

Z obr. 7 je zřejmé, že podáváním EPO u myší je možno oddálit a zmenšit neurologické příznaky, vyvolané • Φ ·« • · » .·.·· • · ···· ·« φ

• ·

	•	*·
	·· Φ	• · • Φ	• Φ
	•	• · ·
	•	Φ ·
♦ ·		tf Φ	• Φ

Vhodnými molekultami pro transport uvedeným způsobem jsou zejména hormony, například růstový hormon, antibiotika, protinádorové látky a toxiny.

Tyto a další znaky vynálezu budou lépe zřejmé v souvislosti s přiloženými výkresy.

4. Přehled obrázků na výkresech

Na obr. IA až B jsou uvedeny výsledky testu s vodním bludištěm podle Morrise. Test byl prováděn na myších, kterým byl podán EPO nebo fyziologický roztok chloridu sodného (SHAM) periferně každý den. Z obr. 1B ze zřejmé, že myši, jimž byl podáván EPO měly statisticky významně lepší výsledky než myši, jimž byl podáván pouze fyziologický roztok. Regresní křivka (R²=0,88) má sklon (0,68) statisticky významně odlišný od sklonu 1 ve prospěch skupiny, jíž byl podáván EPO.

Obr. 2A až C shrnují výsledky zkoušky s podmíněným odporem na základě chuti. Na obr. 2A je znázorněno srovnání příjmu vody u myší, jimž byl podáván EPO nebo roztok chloridu lithného. Příjem vody je vyjádřen v % objemu, spotřebovaného u kontroních myší, u nichž nebyl vyvolán chorobný stav chloridem lithným. Na obr. 2B a 2C je znázorněno, že v případě podávání EPO dochází ke zlepšeným výukových schopnostem, vzhledem k tomu, že myši, jimž byl podáván EPO snášejí lépe žízeň a tráví delší dobu při vyhledávání vody.

Na obr. 3A až C jsou znázorněny výsledky pokusu, které prokazují, že při předběžném podávání EPO periferně dochází ke snížení závažnosti křečových záchvatů a k

pokusnou alergickou encefalitidou, která je modelem pro roztroušenou sklerózu.

Na obr. 8A je uvedena nejnižší uvedená dávka EPO pro dosažení ochrany nervové tkáně na modelu místní mozkové mrtvice u krys. Na obr. 8B jsou znázorněny koncentrace EPO v průběhu času po podání 5000 jednotek rhEPO intraperitoneálně myším samicím kmene Balb/c.

Na obr. 9A je znázorněna imunologickou metodou lokalizace EPO-R kolem kapilár. Na obr. 9B je zřejmé, že biotinylovaná EPO, podaný intraperitoneálně myším, je možno nalézt po 5 hodinách v mozkové tkáni rovněž kolem kapilár. Z obr. 9C je zřejmé, že po 17 hodinách je možno biotinové značení nalézt ve specifických neuronech.

5. Podrobný popis vynálezu

Vynález se tedy týká farmaceutických prostředků s obsahem erythropoetinu, určených pro modulací funkce excitovatelné tkáně, například pro modulaci kognitivních funkcí a pro ochranu excitovatelných buněk před toxickými podněty. Vynález se zvláště týká prostředků s obsahem EPO, určených pro použití k preventivním i léčebným účelům. Excitovatelnou tkání se v tomto smyslu rozumí například neurony centrálního a periferního nervového systému a také srdeční tkáň.

Vynález také popisuje způsoby, kterými je možno modulovat funkcí excitovatelné tkáně periferním podáváním EPO, molekulami, které aktivují receptor EPO nebo molekulami, které mají EPO-aktivovanou účinnost pro tento receptor, může však jít o jakoukoliv molekulu, která » · · • · I • ·· napodobuje účinnost EPO svým působením přes jiné, neklasické receptory EPO. Aniž by bylo zapotřebí se vázat na jakýkoliv určitý mechanismus působení, může taková molekula vydávat signály přes receptor EPO, například může zahájit převod kaskády signálů, která na svém konci aktivuje expresi genu, jejímž důsledkem je ochrana nebo zlepšení funkce excitovatelné tkáně. Molekuly, které jsou schopné interakce s receptorem EPO a modulace účinnosti tohoto receptoru, se označují jako modulátory účinnosti receptoru EPO a jsou účinné pro ochranu a zlepšení funkce excitovatelné tkáně. Může jít například o přírodně se vyskytující, syntetické nebo rekombinantní formy molekul EPO, tak jak byly svrchu popsány, nebo o jiné molekuly, které nemusí nezbytně napodobovat EPO v žádném směru až na to, že modulují účinnost receptoru EPO tak, jak již bylo popsáno. Všechny tyto molekuly je možno použít v různých kombinacích k uvedenému účelu.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu je možno použít k ovlivnění a/nebo léčení normální tkáně i chorobně změněných tkání, například neuronů centrálního nervového systému, neuronů periferního nervového systému nebo srdeční tkáně. Zvláště v dále uvedeném odstavci 5.1 budou popsány prostředky s obsahem EPO pro praktické použití. V odstavci 5.2.1 jsou zejména popsány způsoby použití takových prostředků pro zlepšení funkce excitovatelných tkání, jako jsou výukové funkce, paměť a další kognitivní funkce, kdežto v odstavci 5.2.2 jsou zvláště popsány způsoby ochrany excitovatelné tkáně před poškozením nebo poraněním. Jak bude popsáno v odstavci 5.2.3, byla zjištěna neočekávaná schopnost EPO překonávat endotheliální buňky kapilár, takže je možno EPO použít pro přenos molekul přes tuto bariéru. Konečně v odstavci

5.3 jsou uvedeny způsoby zacílení uvedených prostředků a v odstavci 5.4 způsoby podávání účinných dávek těchto prostředků.

5.1 Farmaceutický prostředek s obsahem erythropoetinu

Farmaceutické prostředky pro svrchu uvedené použití obsahují jakoukoliv látku typu erythropoetinu, která při periferním podání může aktivovat receptory, aktivovatelné EPO a tím modulovat, například podporovat funkci excitovatelných tkání nebo chránit tyto tkáně před poškozením nebo také přivádět účinné látky k těmto tkáním. Erythropoetin je hormon typu glykoproteinů, který má u člověka molekulovou hmotnost 34 000 až 38 000. Zralý protein obsahuje 166 zbytků aminokyselin a glykosylový zbytek tvoří přibližně 40 % hmotnosti molekuly. Formy EPO, použitelné pro účely vynálezu zahrnují přírodně se vyskytující, syntetické a rekombinantní formy následujících molekul: erythropoetin, jeho analogy nebo fragmenty, látky, podobné erythropoetinu, hybridní molekuly erythropoetinu, molekuly, schopné se vázat na receptor pro erythropoetin, látky typu agonistů erythropoetinu, erythropoetin z ledvin a z mozku, oligomery a multimery a také muteiny a kongenery těchto látek. Pojmy erythropoetin a EPO znamenají totéž a budou užívány podle potřeby v průběhu přihlášky vynálezu.

Syntetické a rekombinantní molekuly, jako EPO z mozku nebo z ledvin, rekombinantní formy EPO savců a také přírodně se vyskytující isoformy, isoformy, odvozené od nádorů a rekombinantní formy, jako exprimované rekombinantní molekuly a molekuly připravené homologní rekombinací, jsou vhodné pro zařazení do farmaceutického prostředku podle vynálezu. Mimo to vynález zahrnuje molekuly včetně peptidů, schopných se vázat na receptor EPO a také rekombinantní konstrukce nebo jiné molekuly, které mají část strukturních a/nebo biologických vlastností EPO nebo všechny tyto vlastnosti včetně fragmentů a multimerů EPO. EPO tím zahrnuje molekuly s pozměněnou účinností vazby na receptor EPO, s výhodou se zvýšenou afinitou k tomuto receptoru, zejména pokud jde o usnadnění transportu přes endotheliální buněčné bariéry. Vynález zahrnuje také muteiny typu molekul, které mají větší nebo menší počet g.lykosylačních míst. Jak již bylo svrchu uvedeno, rozumí se pod pojmem erythropoetin, EPO, mimetické látky a pod dalšími pojmy molekuly, které jsou schopné chránit excitovatelné tkáně a podporovat jejich funkci a také molekuly, schopné překonávat endotheliální buněčné bariéry, takže je možno je využít jako transportní prostředky pro další molekuly. Mimo to jsou zahrnuty také molekuly, produkované transgenickými živočichy. Je nutno uvést, že molekuly EPO, zahrnuté' do rozsahu vynálezu nemusí nezbytně být strukturně příbuzné EPO až na schopnost interakce s receptorem EPO, schopnost modulace aktivity receptoru EPO nebo schopnost aktivace signálních kaskád, aktivovatelných působením EPO, jak již bylo svrchu uvedeno.

Jako neomezující příklad je možno uvést, že formy EPO, použitelné pro účely vynálezu zahrnují muteiny EPO, například látky s pozměněným řetězcem zbytku aminokyselin na karboxyterminálním konci, tak jak byly popsány v patentových spisech US 5457089 a US 4835260, dále isoformy EPO s různým počtem zbytků kyseliny sialové v molekule, tak jak byly popsány v US 5856292, polypeptidy podle US 4703008, látky typu agonistů, popsané v

US 5767078, peptidy, schopné se vázat na receptor EPO. a popsané v US 5773569 a US 5830851, malé mimetické molekuly, které aktivují receptor EPO a popsané v US 5835382 a také analogy EPO, popsané v mezinárodních přihláškách WO 9505465, WO 9718318 a WO 9818926. Všechny svrchu uvedené citace se tedy týkají různých forem nebo postupů pro výrobu různých forem erythropoetinu, použitelného pro účely vynálezu.

EPO se dodává běžným způsobem například pod obchodním názvem Procrit (Ortho Biotech) a Epogen (Amgen, lne., Thousand Oaks, CA).

Podle dalšího provedení vynálezu zahrnují molekuly EPO pro účely vynálezu hybridní molekuly EPO, které je možno připravit a které mají schopnost modulovat účinnost receptoru pro EPO a další účinky, například účinky, podobné růstovému hormonu. Takové hybridní molekuly jsou molekuly s větším počtem domén, které z tohoto důvodu mají schopnost interakce s receptorem EPO a také účinnost jiných molekul, například molekul hormonů. Způsoby výroby takových molekul s dvěma doménami jsou v oboru známé. Jak bude dále podrobněji popsáno, jednou z vlastností takových molekul je schopnost transportu přes endotheliální buněčné bariéry, která je zajištěna doménou pro modulaci účinnosti receptoru EPO a účinnost jiných molekul, která se projevuje v cílové tkáni.

Jakoukoliv ze svrchu uvedených sloučenin je možno podrobit zkouškám k identifikaci sloučenin typu EPO, schopných modulovat funkci excitovatelných tkání, to znamená podporovat jejich funkci nebo tyto tkáně chránit před poškozením nebo může jít o schopnost přivádět různé

44 • · · 4 • 44

444» 44 sloučeniny k těmto tkáním. Je například možné podrobit tyto látky zkouškám na schopnost podporovat funkci excitovatelných tkání, například výukovou schopnost, paměť a další kognitivní funkce při použití postupů, které budou dále uvedeny v odstavci 5.2.1. Jako příklad zkoušky na kognitivní funkce in vivo je možno uvést Morrisův test s vodním bludištěm, který je popsán například v odstavci 6 a podmíněnou zkoušku na odpor proti některým látkám, tak jak je popsána například v odstavci 7. Mimo to mohou být uvedené látky podrobeny zkouškám způsobem, uvedeným v odstavci 5.2.2 tak, aby bylo možno identifikovat látky, schopné chránit excitovatelné tkáně před poškozením. Příklady, popsané v odstavcích 8, 9, 10, 11 a 12, jsou specifickými příklady takových zkoušek. Sloučeniny typu EPO je rovněž možno podrobit zkouškám na jejich schopnost transportovat některé látky přes epíthelíální spojení, například přes mozkomíšní bariéru, zkoušky tohoto typu budou popsány v odstavci 5.2.3 a dále v odstavci 9. To znamená, že farmaceutický prostředek s obsahem látky typu EPO může obsahovat jakoukoliv z uvedených látek, která je při periferním podání schopná přes receptory, aktivované EPO modulovat funkce excitovatelných tkání, například podporovat tyto funkce nebo chránit uvedené tkáně před poškozením nebo přivádět k těmto tkáním určité účinné látky.

5.2 Způsoby preventivního a léčebného použití

Podle různých provedení vynálezu může být farmaceutický prostředek s obsahem EPO použit pro ochranu excitovatelných tkání před poškozením nebo hypoxickým stresem, pro zlepšení funkce excitovatelné tkáně nebo pro • 0 0 0 0 0 ·· · 0 0 0 0 0 0 · · 0 • ·♦ · 0 · » • 0 0 0 0 000 0

0 0 · 0 0 0 ••00 ·· 0·· 00· 00 » transport sloučenin přes endotheliální buněčnou bariéru excitovatelné tkáně. Jak již bylo svrchu uvedeno, je vynález zčásti založen na zjištění, že molekuly EPO mohou přecházet z vnitřního prostoru cév přes bazální membránu endotheliálních buněk kapilár v různých orgánech, například v mozku, sítnici nebo varlatech. I když není zapotřebí se vázat na jakékoliv určité teoretické vysvětlení, je zřejmé, že po transportu může dojít k interakci EPO s receptorem na excitovatelné tkáni, například na neuronech centrálního nervového systému, na neuronech periferního nervového systému nebo v srdeční tkáni a tato vazba na receptor může zahájit kaskádu přenosu signálu, jejímž výsledkem je aktivace exprese genů v excitovatelné tkáni a tím i ochrana buněk před poškozením, například působením neurotoxinů, při hypoxii a podobně. Dále budou podrobněji popsány také způsoby ochrany excitovatelné tkáně před poškozením nebo hypoxickým stresem pro zlepšení funkce excitovatelné tkáně a také transport sloučenin přes endotheliální bariéry excitovatelné tkáně.

5.2.1 Způsoby pro zlepšení funkce excitovatelné tkáně

V jednom provedení je vynález zaměřen na způsob zlepšení funkce excitovatelné tkáně podáváním molekuly EPO, schopné aktivovat expresi genu, který zlepšuje funkci excitovatelné tkáně. Zlepšení funkce excitovatelné tkáně může zahrnovat zlepšenou schopnost výuky nebo zlepšení paměti. Je zřejmé, že tímto způsobem by bylo možno zmírnit příznaky různých onemocnění a chorobných stavů a mimo to také zlepšit kognitivní funkce i v nepřítomnosti jakéhokoliv chorobného stavu. Toto použití ·* · 9 • · 9 · 99 99 9

99 9 9 φ

9 9 9 9 9

9999 99 999 999

bude dále podrobněji popsáno a je zřejmé, že zahrnuje, savce včetně člověka.

Onemocnění a chorobné stavy, které je možno léčit farmaceutickým prostředkem podle vynálezu jsou jakékoliv stavy, které je možno zmírnit zlepšením funkce nervových buněk. Jako příklady lze uvést poruchy centrálního nervového systému včetně poruch nálady, úzkostných poruch, deprese, autismu, nedostatku pozornosti, poruchy typu hyperaktiyity a kognitivní dysfunkce. Další příklady kognitivních funkcí, které je možno tímto způsobem zlepšit, budou uvedeny v odstavci 5.3.

V jednom provedení je například možno podávat molekuly typu EPO nemocným, kteří trpí poruchami v důsledku ztráty kognitivních funkcí, například nemocným s Alzheímerovou chorobou.

Schopnost EPO zlepšit kognitivní funkce je možno podrobit zkouškám na pokusných zvířatech při použití jakéhokoliv z běžně užívaných modelů. Jak bude dále popsáno v příkladech, uvedených v odstavcích 6 a 7, bylo prokázáno, že periferně podaný erythropoetin může zlepšit schopnost se učit a kognitivní funkce na několika běžně užívaných výukových modelech na zdravých pokusných zvířatech. Jako příklad takového modelu lze uvést Morrisův test s vodním bludištěm, který bude dále uveden v odstavci 6 a podmíněný test s averzí proti některým látkám, CTA, který bude dále uveden v odstavci 7. V jednom provedení byl například použit test CTA, který je velmi citlivý na zvířatech pro zjištění kognitivních funkcí po podání EPO. CTA se užívá k průkazu schopnosti zvířete se učit a přizpůsobit se novým podnětům,

♦ • «4 4

44 • 4 4

4 4

4444 44 například chuti, takže se zvíře brání nové chuti, která není příjemná po několika zkouškách, při nichž je látka s touto chutí podána. CTA se dotýká mozkových funkcí a také řady funkcí na úrovni mozkové kůry i na subkortikální úrovni. Asociace, které spojují ascendentní a descendentní informaci a vyvolávající aversivní chování, je možno zeslabit nebo zesílit změnami, které ovlivní spojovací pochody. Jako forma asociativní výuky je test CTA ovlivněn velkým množstvím proměnných podmínek, včetně novosti podnětu, to znamená, že podněty, které nejsou nové, nepodléhají averzi, nebo může mít značný vliv stupeň vyvolané „choroby, například toxicita, počet opakování, další důsledky averzivního chování, například žízeň a podobně. Přestože odpověď typu CTA může vyvolat široká škála chemických a fyzikálních látek v závislosti na dávce, často se užívá chlorid lithný, který vyvolává anorexii a pocit choroby. Stejně jako je tomu v případě přirozeně se vyskytujících onemocnění, vyvolává lithium CTA stimulací svrchu uvedených pochodů včetně uvolnění cytokinů.

Zlepšení funkce excitovatelných tkání, například kognitivní funkce, může přinášet jednotlivcům příznivé výsledky, zejména může zvyšovat výukovou schopnost u savců.

5.2.2 Ochrana excitovatelné tkáně proti poškození

Podle dalšího provedení je vynález zaměřen na ochranu savců před patologickými stavy, které jsou důsledkem poškození excitovatelné tkáně. Ochrany je možno docílit tak, že se savcům periferně podá množství erythropoetinu, které je schopné účinně ochránit ♦ · · · • * « • *· • · • ·9 · 9 9

excitovatelnou tkáň před poškozením. Jak bude podrobněji uvedeno například v odstavci 8, může EPO, podaný před podání toxinu kainátu chránit nervovou tkáň u myší, takže zvyšuje práh, při němž vznikají křeče a brání uhynutí. Neuroprotektivní účinek EPO je vysoký a dlouhotrvající.

Je nutno uvést, že pozitivní účinek, který se po podání EPO dostaví, je příliš rychlý na to, než aby mohl být výsledkem zvýšení hodnoty hematokritu v důsledku krvetvorného účinku EPO. Mimo to, jak již bylo svrchu uvedeno, podle jednoho provedení vynálezu obsahuje farmaceutický prostředek EPO, který nemá schopnost příznivě ovlivnit krvetvorbu.

Podle jednoho provedení je tedy možno farmaceutický prostředek podle vynálezu použít při akutní i chronické prevenci a při léčení neurologických poruch a ke zvýšení kognitivních funkcí na normálním i chorobně změněném mozku. Jak již bylo uvedeno svrchu, poškození nebo uhynutí neuronů v centrálním nervovém systému, je velmi závažné a často vede ke smrti, tyto poruchy jsou odpovědné ve vysokém stupni za nemocnost a úmrtnost celé populace. K akutnímu neurologickému poškození může dojít v průběhu různých záchvatovitých stavů, křečí, při epilepsii, mrtvici, krvácení, poškozeního centrálního nervového systému, při nedostatečném zásobení kyslíkem nebo glukózou, při sníženém krevním tlaku a při poranění mozku nebo míchy. Vynález se zejména týká podávání farmaceutického prostředku při léčení akutních onemocnění.

Podle jednoho z možných provedení je farmaceutický prostředek podle vynálezu možno použít také k ochraně savců před poškozením, které vzniká v důsledku ozáření

ΦΦΦΦ φ · φφ · • ΦΦΦ φφ φφ · φ φφ φ φφ φ φ φφφ φφφφ φ φφφφ φ φφφ φ φ φφφ • φφφ φφ φφφ φφφ φφ φφφ mozkové tkáně.

Podle dalšího možného provedení je možno farmaceutický prostředek použít k prevenci a léčení prenatálních hypoxických stavů, po narození pak k léčení nebo ochraně mozku před hypoxickým poškozením, dušením, topením a dalším stavům, při nichž vzniká riziko neurotoxického poškození centrálního nervového systému v důsledku sníženého zásobení kyslíkem nebo v důsledku jiných neurotoxických podnětů. Jak je dobře známé, mohou jednotlivci, u nichž došlo v průběhu porodu k nedostatečnému zásobení kyslíkem nebo u jednotlivců, kteří prošli hypoxickými poruchami, dojít k neurologickým poruchám, které trvají celý život. Hypoxie a/nebo snížení krevního průtoku mozkovou tkání, k nimž může dojít po poranění nebo v průběhu chirurgických zákroků, rovněž znamenají riziko dlouhodobého neurologického poškození.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu je možno využít také v případě pooperační kognitivní dysfunkce, například v případě použití mimotělního krevního oběhu. Mimo to je možno tento prostředek použít při léčení stavů po otravě oxidem uhelnatým nebo po vdechování kouře.

Podle dalšího možného provedení je možno farmaceutický prostředek, obsahující EPO použít k ochraně srdeční tkáně před poškozením v průběhu ischemie, infarktu, zánětu nebo poranění.

Byly uvedeny příklady poškození excitovatelných tkání, které je možno zlepšit podáváním farmaceutického prostředku podle vynálezu. Je zřejmé, že k časnému léčení takových poruch může docházet již při podávání lékařské • · . © · · • © © • *© © · • © · ·«·· ·© ·© • * © první pomoci, takže léčení je možno zahájit již v okamžiku podezření na neurologické poškození. Riziko neurologického poškození, vyvolaného v průběhu porodu, je možno snížit preventivním léčením plodu před porodem nebo v jeho průběhu.

5.2.3 Způsob transportu sloučenin

Vynález se dále týká usnadnění transportu molekul přes endotheliální buněčnou bariéru u savců podáním farmaceutického prostředku, který obsahuje uvedenou molekulu ve spojení s erythropoetinem. Jak již bylo svrchu uvedeno, je vynález založen na zcela neočekávané a překvapující účinnosti periferně podaného EPO na excitovatelné tkáně, například na nervovou tkáň v centrálním nervovém systému nebo periferním nervovém systému nebo na srdeční tkáň, přičemž molekula EPO je současně schopná překonat bariéry v excitovatelných tkáních, například mozkomíšní bariéru. Z tohoto důvodu může být EPO vhodným nosičem pro transport dalších molekul přes takové bariéry.

Podle jednoho z možných provedení je možno použít molekuly, schopné se vázat na receptor EPO pro transport dalších molekul, konjugovaných s takovou molekulou, přes mozkomíšní bariéru. Podle dalšího možného provedení je možno spojit protilátku nebo jinou látku s EPO nebo s modulátorem účinnosti receptoru EPO, například nekovalentní vazbou. Podle dalšího možného provedení jsou molekuly, schopné se vázat na receptor EPO, vhodné pro transport protilátek k receptoru EPO. Takové protilátky pak mohou představovat nosič, na který se mohou vázat další molekuly podobným způsobem jako v případě * · ·» « • · · * · φ·« • · · * · • · · e · · • · · » · <«· · ·· · · ·*· protilátek proti receptoru transferinu, procházejících mozkomíšní bariérou, jak je popsáno v publikaci Pardridge a další, 1991, Selective transport of an antitransferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J. Pharmacol. Exp. Therap. 27: 66.

Odborníkům budou zřejmé různé způsoby, jakými je možno spojovat molekuly s EPO nebo podobnými látkami.

Může jít o kovalentní vazbu, nekovalentní vazbu a další způsoby. Mimo to je možno účinnost výsledného prostředku snadno stanovit pomocí experimentálního systému. Spojení molekul s EPO a jeho analogy je možno dosáhnout různým způsobem, který zahrnuje labilní kovalentní vazbu, zesítění a podobně. Podle jednoho z možných provedení může tvořit spojení mezi transportovanou molekulou a erythropoetinem labilní kovalentní vazba, v tomto případě se molekula uvolní ze spojení s EPO po překonání uvedené bariéry. Podle jednoho z možných provedení je možno využít interakce mezi biotinem a avidinem. Podle dalšího možného provedení je možno připravit hybridní molekulu rekombinantními nebo syntetickými postupy, výsledná látka obsahuje jak doménu molekuly s požadovanou farmakologickou účinností, tak doménu, zodpovědnou za modulaci aktivity receptoru EPO.

Jakoukoliv molekulu je možno spojit s EPO nebo s modulátorem aktivity receptoru EPO přes polyfunkční molekulu, to znamená přes polyfunkční linker. Pod pojmem „polyfunkční molekula se rozumí molekuly s funkční skupinou, která může reagovat postupně více než jednou, může jít například o formaldehyd, a také molekuly, které mají více než jednu reaktivní skupinu. Reaktivní skupina znamená takovou funkční skupinu, která reaguje s funkční

9 99 9 9 99 • · « « ·· «· 9 9 99

99 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 999 99 999 skupinou na další molekule, například na peptidů, proteinu, sacharidu, nukleové kyselině, zvláště hormonu, antibiotiku nebo protinádorové látce, která má být transportována přes endotheliální buněčnou bariéru tak, že vzniká kovalentní vazba mezi linkerem a uvedenou molekulou. Polyfunkční molekuly, které je možno k tomuto účelu použít, jsou s výhodou biologicky kompatibilní linkery, to znamená, že musí být nekarcinogenní, netoxické a v podstatě neimunogenní in vivo. Polyfunkční linkery jsou v oboru známé, budou dále popsány a je možno je snadno podrobit zkouškám na živočišných modelech pro stanovení jejich biologické kompatibility. Polyfunkční' molekula je s výhodou bifunkční, to znamená, že má dvě reaktivní skupiny. Bifunkční molekula může být heretobifunkční nebo homobifunkční. Heterobifunkční linker může být konjugován jako vektor. Je zvláště výhodné, aby polyfunkční molekula byla dostatečně rozpusná ve vodě tak, aby reakce, při níž dochází k zesítšní probíhala ve vodném roztoku, například ve vodných roztocích, jejichž pH je pomocí pufru upraveno na 6 až 8, přičemž výsledný konjugát zůstává ve vodě rozpustný, což umožní jeho účinnější biologickou distribuci. V typických případech se polyfunkční molekula kovalentně váže na aminoskupiny nebo sulfhydrylové funkční skupiny. Je však možno použít i polyfunkční molekuly, které reagují s jinými funkčními skupinami, například se zbytkem karboxylové kyseliny nebo s hydroxylovými skupinami.

Homobifunkční molekuly mají alespoň dvě reaktivní funkční skupiny, které jsou stejné. Tyto reaktivní funkční skupiny v homobifunkční molekule mohou být například aldehydové skupiny nebo zbytky aktivního

	99 9	9 ·· ·
• ·	4 ·	··		« ·	··
•		•	«	• ·
•	• * ·	•	•	• * ·
•	• ·	•	•	• ·
····	··		»··		**

esteru. Homobifunkční molekuly s aldehydovými skupinami zahrnují například flutaraldehyd a subaraldehyd. Použití glutaraldehydu jako zesíťujícího činidla je uvedeno v publikaci Poznaňský a další, Science 223, 1304-1306,

1984. Homobifunkční molekuly, které obsahují alespoň dva zbytky aktivního esteru zahrnují estery dikarboxylových kyselin a N-hydroxysukcinimid. Jako příklad

N-sukcinimidylových esterů je možno uvést disukcinimidylsuberát a dithiobis-(sukcinimidylpropionát) a jejich rozpustné bis-sulfonátové soli a bis-sulfonové soli, například soli sodné a draselné. Tyto homobifunkční reaktivní látky jsou běžně dodávány (Pierce, Rockford, Illinois).

Heterobifunkční molekuly mají alespoň dvě od sebe odlišné reaktivní skupiny. Tyto reaktivní skupiny mohou reagovat s různými funkčními skupinami na EPO a na transportované molekule. Uvedené dvě od sebe odlišné funkční skupiny, které reagují s heterobifunkčním linkerem, jsou obvykle aminoskupiny, může jít například o epsilon-aminoskupinu lisinu, nebo může jít o sulfhydrylové skupiny, například thiolovou skupinu cysteinu, o zbytek karboxylové kyseliny, například kyseliny asparagové, nebo o hydroxylovou skupinu, například hydroxylovou skupinu šeřinu.

V případě, že reaktivní skupina heterobifunkční molekuly vytvoří kovalentní vazbu s aminoskupinou, vzniká obvykle amidová nebo imidová vazba. Reaktivní skupina, která vytváří kovalentní vazbu s aminoskupinou, může být například aktivovaná skupina typu karboxylátu, halogenkarbonylová skupina nebo esterová skupina.

Výhodnou halogenkarbonylovou skupinou je chlorkarbonylová skupina. Esterovou skupinou je s výhodou reaktivní esterová skupina, například N-hydroxysukcinimidová esterová skupina.

Druhou funkční skupinou je v typických případech thíolová skupina nebo skupina, kterou je možno převést na thiolovou skupinu nebo skupina, která vytváří s thiolovou skupinou kovalentní vazbu. Touto kovalentní vazbou bude obvykle thioetherová nebo disulfidová vazba. Reaktivní skupinou, která tvoří kovalentní vazbu s thiolovou skupinou, může být například dvojná vazba, která reaguje s thiolovými skupinami nebo aktivovaným disulfidem. Reaktivní skupina, obsahující dvojnou vazbu, schopnou reagovat s thiolovou skupinou, je například maleimidoskupina, přestože je možno použít i jiné skupiny, například akrylonitrilovou skupinu. Reaktivní disulfidová skupina může například být 2-pyridyldithioskupina nebo 5,5'-dithiobis-(2nitrobenzoová kyselina). Příkladem heterobifunkčních reakčních činidel, obsahujících reaktivní disulfidové vazby mohou být N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát podle publikace Carlsson a další, 1978, Biochem. J. 173: 723-737,

5,4-sukcinimidyloxykarbonyl-alfa-methylbenzylthiosulfát sodný a 4-sukcinimidyloxykarbonyl-alfa-methyl-(2-pyridyldithio)toluen. Výhodnou látkou je N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát. Jako příklad heterobifunkčních reakčních činidel, obsahujících reaktivní skupiny s dvojnou vazbou, reagující s thiolovou skupinou, je možno uvést sukcinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karoxylát a sukcinimidyl-m-maleímídobenzoát.

• ·

Další heterobifunkční molekuly zahrnují sukcinimidyl-3- (maleimido) propionát, sulf osukcinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrát, sulfosukcinimidyl-4- (N-maleimidomethylcyklohexan)-1-karboxylát, nebo maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester. Zvláště výhodná je sodná sůl sulfonátu sukcinimidyl-m-maleimidobenzoátu. Řada ze svrchu uvedených heterobifunkčních reakčních činidel a jejich sulfonátů se běžně dodává (Pierce).

Skutečnost, že svrchu uvedené konjugáty jsou reverzibilní nebo labilní, může ověřit každý odborník. Mimo to je možno konjugát podrobit in vitro zkouškám na schopnost modulovat aktivitu receptoru EPO a na požadovanou farmakologickou účinnost. V případě, že si konjugát udržel obě tyto vlastnosti, může být podroben zkouškám in vivo. V případě, že konjugovaná molekula má být oddělena od EPO k tomu, aby mohla vyvinout svoji účinnost, je výhodné její labilní spojení nebo reversibilní spojení s EPO. Také labilitu tohoto spojení je výhodné prokázat in vitro před prováděním zkoušek in vivo.

Další informace, týkající se získání a použití polyfunkčních reakčních činidel a dalších podobných látek, je možno získat z následujících publikací:

Carlsson a další, 1978, Biochem. J. 173:723-737; Cumber a další, 1985, Methods in Enzymology 112:207-224; Jue et al., 1978, Biochem. 17:5399-5405; Sun a další, 1974, Biochem. 13: 2334-2340; Balttler a další, 1985, Biochem. 24: 1517-152; Liu a další, 1979, Biochem. 18:690-697; Youle a Neville, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:5483-5486; Lerner a další, 1981, Proč. Nati. Acad.

• · · · ·· ·· « · ·· • ·· · · · · · ···· · ···· · ··· · · ··· ···· ·· ··· «·· ·« ···

Sci. USA 78:3403-3407; Jung a Moroí, 1983, Biochem. Biophys. Acta 761:162; Caulfield a další, 1984, Biochem. 81:7772-7776; Staros, J. V., 1982, Biochem. 21:3950-3955; Yoshitake a další, 1979, Eur. J. Biochem. 101:395-399; Yoshitake a další, 1982, J. Biochem. 92:1413-1424; Piích a Czech, 1979, J. Biol. Chem. 254:3375-3381; Novick a další, 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487; Lomant a Fairbanks, 1976, J. Mol. Biol. 104:243-261; Hamada and Tsuro, 1987, Anal. Biochem. 160: 483-488; a Hashida,

1984, J. /Applied Biochem. 6:56-63. Mimo to jsou způsoby zesítění shrnuty v publikaci Man a Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12. Bariéry, které je možno překonat při použití svrchu popsaných postupů a farmaceutických prostředků, jsou například mozkomíšní bariéra, bariéra mezi krevním oběhem a nitroočním prostředím, bariéra mezi krevním oběhem a varlaty nebo vaječníky a bariéra mezi krví a placentou.

Molekulami, které je možno svrchu uvedeným způsobem transportovat přes endotheliální buněčné bariéry, jsou například hormony, jako růstový hormon, neurotrofní faktory, antibiotika nebo antifungální látky, peptidy, radiofarmaceutické látky, protilátky proti biologicky účinným látkám, protinádorové látky a další farmaceuticky účinné látky. Jako neomezující příklady takových molekul lze uvést růstový hormon, faktor růstu nervové tkáně NGF, mozkový neurotrofní faktor BNF, ciliární neurotropní faktor CTF, bazický růstový faktor fibroblastu bFGF, transformační růstový faktor betal, TGFpl, transformační růstový faktor beta2, TGFP2, transformační růstový faktor beta3, TGFP3, interleukin 1, interleukin 2, interleukin 3 a interleukin 6, AZT, protilátky proti faktoru nádorové nekrózy a imunosupresivní látky, jako cyklosporin.

• · • · · · · ···· • · · · · · ·

Podle jiného provedení je možno použít k transportu toxinů pro léčbu virových nebo proliferativních poruch, například nádorových onemocnění, rekombinantní chimérní molekuly, obsahující toxin a EPO. Účinné látky je možno také kondenzovat s EPO za vzniku chimérního toxinu, k tomuto účelu je možno použít některé toxické látky, jako exotoxin, bakterií Pseudomonas, difterický toxin, ricin a podobně.

5.3 Stavy, které je možno příznivě ovlivnit

Jak již bylo popsáno svrchu, je možno farmaceutické prostředky s obsahem EPO použít k léčení a prevenci chorobných stavů, vznikajících v důsledku nedostatečného zásobení kyslíkem a nepříznivě ovlivňujících excitovatelné tkáně, například excitovatelné tkáně v centrálním nervovém systému, v periferním nervovém systému nebo srdeční tkáně, může jít například o mozek, srdce, nebo sítnici. Vynález je možno využít k léčení nebo prevenci poškození excitovatelné tkáně v důsledku hypoxických podmínek za různých okolností. Dále budou uvedeny neomezující příklady takových chorobných stavů.

Jako příklad ochrany neuronové tkáně před patologickými stavy je možno uvést stavy, při nichž dochází ke sníženému přívodu kyslíku k takové tkáni. Jakýkoliv stav, při němž je snížena dostupnost kyslíku pro nervovou tkáň a který vyvolává stres, poškození a nakonec uhynutí nervových buněk, je možno léčit při použití farmaceutického prostředku podle vynálezu. Obecně může jít o hypoxii a/nebo ischemii, která může vzniknout v důsledku mozkové mrtvice, cévního uzávěru, prenatální

nebo postnatální hypoxie, dušení, topení, otravy oxidem uhelnatým, inhalace kouře, traumatu včetně chirurgického zákroku a radiotherapie, v důsledku asfyxie, epilepsie, hypoglykemie, chronického obstruktivního plicního onemocnění, emfyzemu, syndromu nedostatečnosti dýchacího ústrojí u dospělých, hypotensivního šoku, septického šoku, anafylaktického šoku, inzulínového šoku, krize z přítomností srpkovitých krvinek, v důsledku srdeční zástavy nebo změny srdečního rytmu nebo v průběhu narkózy rajským plynem.

Podle jednoho z možných provedení je možno EPO podávat k prevenci poškození tkáně v důsledku poranění nebo chirurgických zákroků, například při operaci nádoru nebo při úpravě cévní výdutě.

Dalšími patologickými stavy, které mohou být vyvolány hypoglykemií nebo být jejím důsledkem a které je možno léčit s použitím farmaceutického prostředku podle vynálezu, jsou například předávkování inzulínu, insulinom, nedostatek růstového hormonu, hypokortisolismus, předávkování různými účinnými látkami a některé nádory.

Další patologické stavy, vznikající v důsledku poškození nervové tkáně mohou být různé záchvatovité stavy, jako epilepsie a jiné křeče nebo chronické záchvatovité stavy. Dalšími chorobnými stavy v tomto smyslu jsou mozková mrtvice, roztroušená skleróza, snížený krevní tlak, srdeční zástava, Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc, mozkové obrny, poranění mozku nebo míchy, demence v průběhu AIDS, ztráta kognitivní funkcí v souvislosti s věkem, ztráta paměti, amyotrofická laterální skleróza, alkoholismus, nedostatečné zásobení sítnice kyslíkem, poškození očního nervu při glaukomu a ztráta nervové tkáně.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu je tedy možno použít také k léčení chorobných stavů sítnice včetně jejího poškození. Může jít o makulární degeneraci, oddělení sítnice od podkladu, retinitis pigmentosa, arteriosklerotickou retinopathii, retinopathii při vysokém krevním tlaku, ucpání sítnicové tepny nebo žíly, snížený krevní tlak a diabetickou retinopatii.

V dalším provedení je možno farmaceutický prostředek podle vynálezu použít pro ochranu nebo k léčení poškození excitovatelné tkáně v důsledku ozařování.

Dalším použitím farmaceutického prostředku podle vynálezu je léčení otravy neurotoxiny, například v případě poškození toxiny z některých ústřic, v případě neurolathyrismu, Guamova onemocnění, amyotrofické laterální sklerózy a Parkinsonovy choroby.

Jak již bylo svrchu uvedeno, zaměřuje se vynález také na způsob zlepšení funkce excitovatelných tkání u savců periferním podáním erythropoetinu. Je zřejmé, že tímto způsobem bude možné zlepšit různá onemocnění a chorobné stavy a mimo to bude možno zlepšit kognitivní funkce i u zdravých jedinců. Tato použití farmaceutického prostředku podle vynálezu budou dále podrobněji popsána, zejména v případě výukových funkcí a tréninku u člověka i u savců, od člověka odlišných.

φφ

Onemocnění a chorobné stavy, které je možno léčit podáním farmaceutického prostředku podle vynálezu a které se přímo týkají centrálního nervového systému, jsou například poruchy nálady, úzkostné poruchy, deprese, autismus, nedostatek pozornosti a hyperaktivita a různé kognitivní dysfunkce. Všechny tyto stavy je možno zmírnit zlepšením funkce neuronů. Další stavy, které mohou být uvedeným způsobem zlepšeny, zahrnují přerušovaný spánek, například apnoe v průběhu spánku a poruchy, spojené s cestováním, subarachnoidální krvácení a krvácení z cévní výdutě, hypotenzivní šok, septický šok, anafylaktický šok a důsledky různých encefalitid a meningitid, například degenerativní onemocnění mozku na základě onemocnění pojivové tkáně, jako je lupus. Další použití zahrnuje prevenci nebo ochranu před působením neurotoxinů, například před toxiny z některých ústřic, v případě neurolathyrismu, Guamovy choroby, amyotrofické laterální sklerózy, Parkinsonovy choroby, při pooperačním léčení embolie nebo ischemického poškození, při ozáření celého mozku, při krizi z přítomnosti srpkovitých krvinek a v důsledku eklampsie.

Další skupinou stavů, léčitelných podle vynálezu, je dysfunkce mitochondrií, a to dědičná nebo získaná, která může být příčinou různých neurologických onemocnění až uhynutí neuronů. Jde například o Leighovu nemoc, subakutní nekrotizující encefalopatii, která je charakterizována postupnou ztrátou zraku a encefalopatii, vzhledem k uhynutí neuronů a také myopatií. V těchto případech dochází k tomu, že v důsledku defektního metabolismu v mitochondriích nedochází k dostatečnému energetickému zásobení buněk excitovatelných tkání. Při podání modulátoru aktivity receptoru EPO dochází z tohoto

důvodu k optimalizaci nedostatečné funkce u celé řady onemocněni mitochondrií.

Jak již bylo svrchu uvedeno, hypoxické stavy nepříznivě ovlivňují excitovatelné tkáně. Jde o tkáně jako centrální nervový systém, periferní nervový systém a srdeční tkáň. Kromě svrchu uvedených stavů je možno při podávání farmaceutického prostředku podle vynálezu zlepšit také například otravy vdechováním oxidu uhelnatého nebo kouře, závažné případy astmatu, syndrom nedostatečnosti dýchacího ústrojí u dospělých, dušení a topení. Další stavy, při nichž vznikají hypoxie nebo jiné poškození excitovatelné tkáně, jsou zejména hypoglykemické stavy k nimž může dojít při nesprávném dávkování insulinu nebo v případě nádorů, které produkuji insulin, například v případě insulinomu.

Také různé neuropsychologické poruchy, vznikající v důsledku poškození excitovatelné tkáně, je možno léčit farmaceutickým prostředkem podle vynálezu. Jde zejména o některé chronické poruchy, pří nichž dochází k poškození neuronu, a to neuronu centrálního nervového systému a/nebo periferního nervového systému a v důsledku toho ke ztrátě kognitivních funkcí, kde například o ztrátu kognitivních funkcí v souvislosti s věkem, senilní demencí, chronické záchvatovité stavy, Alheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc, demencí, ztrátu paměti, amyotrofickou laterální sklerózu, roztroušenou sklerózu, tuberosní sklerózu, Wilsonosu nemoc, mozkovou a progresivní supranukleární obrnu, Guamcvu nemoc, Lewyho demenci, onemocnění vyvolaná priony, jako je spondiformní encefalopatie, například Creutzfeld-Jakobsova nemoc, Huntingtonova nemoc, myotonická dystrofie, Friedrichova

I : , ataxie a další ataxie a také Gilles de la Tourettův syndrom, dále je farmaceutickým prostředkem podle vynálezu možno léčit různé záchvatovité stavy, jako epilepsie a další záchvatovité stavy, mozkovou mrtvici, poranění mozku nebo míchy, demenci v případě AIDS, alkoholismus, autismus, ischemiii sítnice, glaukom, poruchy autonomních funkcí, jako zvýšený krevní tlak a poruchy spánku a také některé neuropsychiatrické poruchy, jako jsou schizofrenie, schizoafektivní poruchy, poruchy s deficitem pozornost, dysthymické poruchy, depresivní poruchy, manická onemocnění, obsesivní a nutkavé poruchy, poruchy při zneužívání psychoaktivních látek, úzkostné stavy, panické poruchy, stejně jako unipolární a bipolární afektívní poruchy. Další neuropsychiatrické a neurodegenerativní poruchy, které je možno léčit s použitím farmaceutického prostředku podle vynálezu, jsou například poruchy, které jsou uvedeny v publikaci American Psychiatrie Association's Diagnostic and Statístical manual of Mental Disorders (DSM.

Podle dalšího možného provedení je možno použít rekombinantní chimérní molekuly toxinu s obsahem EPO pro transport toxinů k léčení proliferativních poruch, například nádorových onemocnění nebo virových onemocnění, jako je subakutní sklerozující panencefalitis.

5.4 Farmaceutický prostředek a jeho podávání

Podle vynálezu je možno podávat EPO a jeho analogy mimetické látky, fragmenty, hybridní molekuly erythropoetinu, molekuly, schopné se vázat na receptory erythropoetinu, látky typu agonistů erythropoetinu, erythropoetin z ledvin nebo mozku a jeho muteiny a

99 • · * ·

4«

4 4 •444 44

kongenery ve formě farmaceutického prostředku parenterálně přes sliznice, například ústní nebo nosní sliznicí, rektálně, do pochvy, pod jazyk, pod sliznici nebo transdermálně. Výhodným podáním je parenterální podání, například ve formě nitrožilní nebo intraperitoneální injekce a také intraarteriální podání, nitrosvalové, nítrokožní nebo podkožní podání. Výhodným způsobem podání malých mimetických molekul EPO je perorální podání.

Subjektem, u nějž je periferní podání EPO účinné, je s výhodou člověk, může však jít i o jiného živočicha, s výhodou savce. Je možno předpokládat, že farmaceutický prostředek podle vynálezu je vhodný pro podání jakémukoliv živočichu, zvláště hospodářských a domácích zvířat, jako jsou kočky, psi, skot, koně, kozy, ovce a vepři, předpokládá se však možnost podání i u divokých zvířat ve. volné přírodě nebo v zoologických zahradách, a také u pokusných zvířat, jako jsou myši, krysy, králíci, kozy, ovce, vepři, psi, kočky a podobně. Jak již bylo svrchu uvedeno, je u všech těchto živočichů možno dosáhnout neuroprotektivního účinku a zlepšení kognitivních funkcí. U uvedených živočichů je běžné neurologické poškození, vznikající z hypoxie a běžné jsou také akutní a chronické poruchy typu záchvatovitých onemocnění včetně epilepsie. Jak již bylo uvedeno svrchu, zvýšení kognitivních schopností u živočichů, od člověka odlišných, může zlepšit jejich schopnost se učit a zachovat si požadované chování. Tímto způsobem je možno snížit náklady na výuku a psychologický tlak na domácí zvířata, může být například zkrácen čas, nezbytný pro výuku psů. Mimo to u divokých zvířat, které se v typických případech nesnadno učí, může být tento ♦ · » • 999 9 ··

9 9 9 • 99 •999 99 9 nedostatek podáváním farmaceutického prostředku podle, vynálezu překonán.

5.4.1 Lékové formy a účinné dávky

Farmaceutické prostředky obsahující EPO a modulátory aktivity receptorů pro EPO je možno podávat v léčebně účinných dávkách k ochraně excitovatelných tkání před poškozením, ke zlepšení jejich funkce nebo k přívodu různých látek k těmto tkáním. Bylo prokázáno, že v tomto případě je možno užít s výhodou zvýšených dávek EPO.

Volba účinné dávky bude vždy provedena odborníkem v závislosti na obvyklých známých faktorech. Tyto faktory zahrnují použitou formu erythropoetinu a její farmakokinetické parametry, jako jsou biologická dostupnost, metabolismus, biologický poločas a podobně, tyto údaje jsou obvykle uvedeny na každém dodávaném prostředku. Dalšími faktory mohou být tělesná hmotnost nemocného, způsob podání, akutní nebo chronické podávání, současné podávání jiných léků nebo další známé faktory. Přesnou dávku musí určit podle konkrétních okolností ošetřující lékař, například v závislosti na stavu imunitního systému jednotlivého nemocného.

Podle jednoho z možných provedení se tedy vynález týká farmaceutického prostředku ve formě, upravené pro modulaci excitovatelné tkáně, pro zlepšení kognitivních funkcí nebo pro transport účinných látek přes endoteliální bariéry. Takový prostředek může obsahovat netoxické množství účinné látky, které se může pohybovat v rozmezí 50 000 až 500 000 jednotek, 60 000 až 500 000 jednotek, 70 000 až 500 000 jednotek, 80 000 až 500 000

j ednotek,	90	000	až	500	000	jednotek, 100	000	až	500	000
j ednotek,	150	000	až	500	000	jednotek, 200	000	až	500	000
j ednotek,	250	000	až	500	000	jednotek, 300	000	až	500	000
j ednotek,	350	000	až	500	000	jednotek, 400	000	až	500	000
j ednotek	nebo	450	000 až	500	000 jednotek	EPO,	modulátoru

aktivity receptoru pro EPO nebo modulátoru receptoru, aktivovatelného EPO spolu s farmaceutickým nosičem. Ve výhodném provedení se netoxické množství EPO volí v rozmezí 50 000 až 500 000 jednotek.

Podle jednoho z možných provedení se farmaceutický prostředek s obsahem EPO podává systemicky k ochraně excitovatelné tkáně před poškozením, ke zlepšení funkce excitovatelné tkáně nebo za účelem transportu účinných látek k excitovatelné tkáni. Může jít o podání parenterální, o podání sliznicí, například ústní sliznicí, nosní sliznicí, rektálně, do pochvy, pod jazyk, o podání pod sliznicí nebo o transdermální podání. S výhodou běží o parenterální podání, například nitrožilní nebo intraperitoneální injekcí, může však jít také o intraarteriální, nitrosvalové, intradermální nebo podkožní podání.

Ve výhodném provedení se farmaceutický prostředek s obsahem EPO podává systemicky v dávce 2000 až 10 000 jednotek/kg hmotnosti, s výhodou v rozmezí 2000 až 5000 jednotek/kg hmotnosti, a zvláště v množství 5000 jednotek/kg hmotnosti při jednotlivém podání. Tato účinná dávka by měla účinně zajistit dosažení koncentrace EPO v krevním séru vyšší než 10 000, 15 000 nebo 20 000 mjednotek/ml séra po podání EPO. Těchto koncentrací v krevním séru je možno dosáhnout v době 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 hodin po podání. V případě potřeby je • · ·· ©4 » © • · © ♦ ·© ♦ · 9 9 99 on · ♦ · 4 · « · jy * · · · · 4 ♦ « · · • · · · © © · © ·♦·· ·· ♦·· ··· «© ··© možno dávky opakovat. Je například možno podávat farmaceutický prostředek denně tak dlouho, dokud je to klinicky nezbytné, nebo je možno prostředek podávat v různých intervalech, například každých 1 až 12 týdnů, s výhodou vždy za 3 až 8 týdnů. Podle jednoho z možných provedení je možno účinné množství EPO spolu s farmaceutickým nosičem balit po jednotlivých dávkách do lahviček nebo jiného zásobníku. V jednom z možných provedení s k tomuto účelu užije EPO bez účinku na krvetvorbu, to. znamená EPO, který má svrchu uvedené účinky, avšak nezvyšuje koncentraci hemoglobinu ani hodnotu hematokritu. Podle dalšího možného provedení se podává EPO v dávce, která je vyšší než dávka, jíž je zapotřebí k maximální stimulaci krvetvorby.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu může obsahovat léčebně účinné množství účinné látky a farmaceuticky přijatelný nosič. Ve specifickém provedení se pod pojmem „farmaceuticky přijatelný rozumí látky, které jsou jako takové uvedeny v příslušných lékopisech, například v US lékopisu nebo jakémkoliv jiném lékopisu pro použití u živočichů a zvláště u člověka. Pod pojmem „nosič se rozumí jakákoliv pomocná látka, ředidlo nebo nosné prostředí, podávané spolu s účinnou látkou. Farmaceutickým nosičem může tedy být sterilní kapalina, například roztoky solí ve vodě a oleji, zvláště roztoky chloridu sodného ve vodě a oleji včetně živočišných, rostlinných nebo syntetických tuků, například v arašídovém oleji, sojovém oleji, minerálním oleji, sezamovém oleji a podobně. Fyziologický roztok chloridu sodného je výhodným nosičem v případě, že farmaceutický prostředek má být podáván nitrožilně. Roztoky chloridu sodného, vodného roztoky dextrózy a roztoky glycerolu lze • · f · ·· ♦ ♦· *

9 9 9 9

9 9 9

9999 99 9·9

9

9 99

9 9

9 9 9

9 9

9 99 9 použít jako kapalné nosiče zejména pro injekční roztoky. Dalšími farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami jsou škrob, glukóza, laktóza, sacharóza, želatina, slad, rýžová mouka, křída, silikagel, stearát sodný, glycerolmnostearát, mastek, chlorid sodný, sušené odstředěné mléko, glycerol, propylenglykol, voda, ethanol a podobně. Farmaceutický prostředek může popřípadě také obsahovat malá množství smáčedel nebo emulgačních činidel nebo pufrů pro udržení hodnoty pH. Farmaceutické prostředky mohou mít formu roztoku, suspenze, emulze, tablet, pilulek, prášků, kapslí, může také jít o lékové formy s prodlouženým uvolňováním účinné látky a podobně.

V případě čípků se užívá obvyklých nosičů a pojiv, jako jsou triglyceridy. Sloučeniny podle vynálezu je možno použít ve volné formě nebo ve formě solí. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují ty soli, které jsou vytvořeny s volnými aminoskupinami a jsou odvozeny od kyselin, jako jsou kyselina chlorovodíková, fosforečná, octová, šťavelová, vinná a podobně, další soli je možno vytvořit na volné karboxylové skupině, v tomto případě může jít o soli sodné, draselné, amonné, vápenaté, o soli s hydroxidem železitým, isopropylaminem, triethylaminem, 2-ethylaminoethanolem, histidinem, prokainem a podobně. Příklady vhodných farmaceutických nosičů je možno nalézt v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin. Prostředky podle vynálezu budou tedy obsahovat účinné množství účinné látky, s výhodou v čištěné formě a vhodné množství nosiče tak, aby vzniklá léková forma byla vhodná pro podání nemocnému. Lékové formy je vždy nutno přizpůsobit předpokládanému způsobu podání.

Farmaceutický prostředek, určený pro perorální podání, může mít formu kapslí, tablet, prášků, granulátů,

Φ · ♦ 9 99 9 • Φ» Φ

Φ Φ Φ · Φ

Φ Φ Φ φ φφφφ φφ »», * roztoků, sirupů nebo suspenzí ve vodném nebo nevodném. prostředí, může jít o poživatelné pěny nebo emulze. Tablety nebo kapsle z tvrdé želatiny mohou jako pomocné látky obsahovat laktózu, škrob nebo jeho deriváty, stearan hořečnatý, sodnou sůl sacharinu, celulózu, uhličitan hořečnatý, kyselinu stearovou nebo její soli. Kapsle z měkké želatiny mohou obsahovat rostlinné oleje, vosky, tuky, zejména polotuhé tuky nebo kapalné polyoly a podobně. Roztoky a sirupy mohou obsahovat vodu, polyoly a cukry.

Účinná složka, určená pro perorální podání, může být povlékána nebo míšena s materiálem, který prodlužuje dobu rozpadu a/nebo dobu vstřebávání účinné látky v zažívací soustavě. K tomuto účelu je možno použít například glycerylmonostearát nebo glyceryldistearát. Tímto způsobem je možno dosáhnout prodlouženého uvolňování účinné látky v průběhu mnoha hodin a v případě potřeby je také možno zabránit degradaci účinné látky v žaludku. Farmaceutické prostředky pro perorální podání je také možno zpracovávat tak, aby došlo k usnadněnému uvolnění účinné látky v určitém úseku zažívací soustavy s výhodným specifickým pH nebo s vhodnými enzymatickými podmínkami.

Farmaceutické prostředky, upravené pro transdermální podání, mohou být například náplasti, které mohou zůstávat na pokožce po dlouhou dobu. Farmaceutickými prostředky, upravenými pro místní podání mohou být mazání, krémy, suspenze, emulze, prášky, roztoky, pasty, gely, spreye, aerosoly nebo oleje. Na místní podání na pokožku, do úst, do oka a podobně se s výhodou užije mazání nebo krém. V případě mazání je možno účinnou složku použít spolu s parafinovým základem nebo se • · · φ · · · φ • φφφ φφ φφφ φφφ ·· φφφ základem, který je možno mísit s vodou. Je také možno, účinnou složku zpracovat na krém s emulzí typu olej ve vodě nebo voda v oleji. Farmaceutické prostředky pro místní podání do oka zahrnují také oční kapky. V těchto prostředcích může být účinná látka rozpuštěna nebo uvedena do suspenze ve vhodném nosiči, například ve vodném rozpouštědle. Farmaceutický prostředek pro místní podání ústní síiznicí zahrnuje tablety, určené pro podání pod jazyk, pastilky a ústní vody.

Farmaceutický prostředek pro podání nosní síiznicí může obsahovat pevný nosič, například nosič ve formě prášku, jehož částice mají s výhodou průměr 20 až 500 mikrometrů. Prášky je možno podávat jako šňupavé prášky, to znamená rychlou inhalací do nosu ze zásobníku, přidržovaného v blízkosti nosu. Prostředky pro podání nosní síiznicí však mohou také obsahovat kapalné nosiče a mohou mít formu spreye nebo nosních kapek. Tyto prostředky mohou obsahovat roztok účinné složky ve vodě nebo v oleji. Prostředky pro podání inhalací mohou být dodávány také v tlakových nádobkách, opatřených rozprašovačem, které mohou být zkonstruovány tak, aby byla vždy uvolněna předem určená dávka účinné složky. Ve výhodném provedení se tímto způsobem mohou podávat farmaceutické prostředky podle vynálezu nosní dutinou přímo do plic.

Farmaceutické prostředky, určené pro rektální podání, mohou být upraveny jako čípky nebo nálevy. Farmaceutické prostředky pro podání do pochvy jsou například pesary, tampony, krémy, gely, pasty, pěny nebo spreye.

* ·· · · · · · • · · · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · · · · ···· 99 999 999 99 999

Farmaceutické prostředky, určené pro parenterální podání, jsou zvláště vodné nebo nevodné sterilní roztoky nebo suspenze pro injekční podání, které mohou obsahovat další složky, jako antioxidační látky, pufry, bakteriostatické látky a další rozpuštěné složky, které zajišťují isotonicitu roztoku s krví příjemce. Mimo to mohou tyto prostředky obsahovat vodu, alkoholy, polyoly, glycerol a rostlinné oleje. Prostředky pro parenterální podání mohou být uloženy po jednotlivých dávkách například do zatavených ampulí nebo je možno uložit větší počet dávek do lahviček, prostředky je možno skladovat v lyofilizovaném stavu, takže je nutno je pouze doplnit sterilním kapalným nosičem, například sterilním fyziologickým roztokem chloridu sodného těsně před použitím. Injekční roztoky a suspenze je možno připravit v případě potřeby těsně před použitím také ze sterilních prášků, granulátů nebo tablet.

Ve výhodném provedení se farmaceutické prostředky zpracovávají běžnými postupy, které jsou v oboru známé. Prostředky, určené pro nitrožilní podání, jsou například roztoky ve sterilních isotonických vodných pufrech. V případě potřeby mohou tyto prostředky obsahovat ještě pomocné rozpouštědlo a místní anesthetickou látku, například lidokain k odstranění bolestivosti v místě injekce. Složky prostředku jsou dodávány odděleně nebo je možno dodávat již hotový prostředek, balený po jednotlivých dávkách, například ve formě lyofilizovaného prášku nebo bezvodého koncentrátu v hermeticky uzavřeném zásobníku, například v ampulí nebo sáčku z plastické hmoty, na těchto obalech je uvedeno množství účinné látky. V případě, že prostředek má být podáván infuzí, může být dodáván současně s infuzní lahví, která obsahuje • # · • »·· ·9 ·· · • · · · ·· sterilní nosič, například fyziologický roztok chloridu sodného ve vodě. V případě, že jde o injekční podání, může být současně dodávána ampule sterilní vody pro injekční podání nebo fyziologického roztoku, takže je možno jednotlivé složky výsledného prostředku snadno smísit těsně před podáním.

Čípky obvykle obsahují účinnou složku v množství 0,5 až 10 % hmotnostních. Prostředky pro perorální podání s výhodou obsahují 10 až 95 % hmotnostních účinné látky.

Vynález se rovněž týká farmaceutického balení, které obsahuje 1 nebo větší počet zásobníků, naplněných jednou nebo větším počtem složek farmaceutického prostředku podle vynálezu. Takové balení popřípadě také obsahuje informace, týkající se výroby, použití nebo prodeje farmaceutických prostředků obecně.

5.4.2 Způsob podání

Vynález se týká farmaceutických prostředků pro periferní podání EPO pro zlepšení funkce nebo pro ochranu excitovatelných tkání nebo pro transport různých látek k těmto tkáním. Jak již bylo uvedeno svrchu, vynález je zčásti založen na zjištění, že periferně podaný EPO má přímý neuroprotektivní účinek nebo přímo zlepšuje funkci nervových buněk v excitovatelné tkáni, může jít například o centrální nervový systém, periferní nervový systém nebo srdeční tkáň. Excitovatelná tkáň zahrnuje neurony v centrálním a periferním nervovém systému a v srdeční tkáni.

© © • * ©	·© • © ♦ a	• © © •	« © · •	• · Λ
• «	a •	© ·
©	• ·	•	•	«	•
···©	·©	• © ©	4 © ·	··		© ·

Vynález se tedy týká podávání EPO a modulátorů aktivity receptorů EPO tak, aby se tyto látky dostaly do centrálního nervového systému. Pojmy „periferní a „systemický označují tyto způsoby podání. Periferní podání zahrnuje perorální nebo parenterální podání, například podání nitrožilní, intraarteriální, podkožní, nitrosvalově, intraperitoneální, rektální, pod sliznici nebo podání intradermální. Je zahrnuto akutní i chronické podávání uvedených látek.

Podle jednoho z možných provedení je možno pro podávání EPO zvolit systém s řízeným uvolňováním účinných látek. Například polypeptidy je možno podávat při použití nitrožilní infuze, pomocí inmplantovatelného osmotického čerpadla, transdermální náplasti, liposomů nebo jinými způsoby podání. Podle jednoho z možných provedení je možno použít čerpadlo podle publikací Langer svrchu, Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201;

Buchwald a další, 1980, Surgery 88:507; Saudek a další, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574. Podle jiného provedení je možno sloučeniny podávat v zapouzdřeném stavu, zvláště v liposomech, jak bylo popsáno v publikacích Langer,

Science 249:1527-1533, 1990; Treat a další, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, LopezBerestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365, 1989; WO 91/04104; US patent č. 4704355. Podle dalšího provedení je možno použít také polymerní materiály, jak je zřejmé ze souhrnných publikací Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.) CRC Press:

Boča Raton, Florida, 1974; Controlled Drug

Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Balí (eds.), Wiley; New York 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, • 9 · 9 • ·« ·

9 9 ··«< 4»

999 Φ

Φ 9 ΦΦ

9 9

9 9 9 • 9 9

Φ· 499

1953 a také Levý a další, 1985, Science 228:190; During a další, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard a další 1989, J. Neurosurg. 71:105.

Podle ještě dalšího provedení je možno systém s řízeným uvolňováním účinných látek uložit do blízkosti cílové tkáně, to znamená do blízkosti mozku, v tomto případě je možno použít pouze zlomku dávky, jíž je zapotřebí při systemickém použití, jak je zřejmé z publikace Goodson, s. 115-138 v Medical Applications of Controlled Release, sv. 2, supra, 1984. Další systémy s řízeným uvolňováním účinné látky jsou uvedeny v souhrnné publikaci Langer 1990, Science 249:1527-1533.

Podle dalšího možného provedení je možno podávat EPO ve formě farmaceutického prostředku nosní sliznicí, perorálně, rektálně, do pochvy nebo pod jazyk.

Ve specifických provedením může být žádoucí podávat farmaceutické prostředky s obsahem EPO místně. Toho je možno dosáhnout například místní infuzí v průběhu chirurgického zákroku, místním podáním například v obvazu po chirurgickém zákroku, injekcí, pomocí cévky, čípku nebo implantátu, přičemž implantát může být porézní, neporézní nebo z želatinového materiálu včetně různých membrán nebo vláknitých materiálů.

Vynález bude podrobněji ilustrován v souvislosti s následujícími příklady. Tyto příklady mají sloužit k plnému objasnění výhodných provedení vynálezu, nikoliv však k omezení jeho rozsahu.

44

4 4 4 4

44 » 4 4 4

4 4

4444 44 4

	4 44	44 4 4	44
	4	4 4
	4	4 4 4
	4	4 4
44	444	44	44

kognitivní funkce

Příklady provedení vynálezu

6. Příklad 1:

Periferně podaný EPO zlepšuje

V tomto příkladu byl použit pokus, označovaný jako Morrisovo vodní bludiště. Tyto pokusy jsou modelovou zkouškou na kognitivní funkce. Pokus byl proveden na myších. Provádí se tak, že se malá průhledná destička uloží do jednoho kvadrantu bazénku se zakalenou vodou. Myš, vhozená do bazénu musí plavat tak dlouho, až dosáhne destičky. Měří se čas, který uplyne před tím, než zvíře destičky dosáhne, to znamená doba, kterou zvíře stráví plaváním. Při opakovaných pokusech se čas plavání bude snižovat jako funkce schopnosti zvířete se učit. Tento typ pokusu zahrnuje také mozkovou oblast hippocampus, takže při poškození této oblasti je zkouška neúspěšná.

Pokusy byly prováděny v kruhovém černém bazénu s průměrem 150 cm. Byly označeny 4 body: sever, jih, východ a západ. Tyto body byly označeny jako kvadranty viditelným způsobem, například světlem s měnící se intenzitou, jasnou páskou, použitou ve formě čtverců a podobně tak, aby se myši mohly orientovat. Destička byla náhodně uložena do jednoho kvadrantu. Pokus spočíval v tom, že zvíře bylo uloženo do jednoho z kvadrantů.

Celková doba pokusu byla 90 sekund. V případě, že zvíře nedosáhlo destičky, bylo na tuto destičku uloženo na dalších 15 sekund. Po další hodině bylo zvíře vloženo do jiného kvadrantu, v průběhu jednoho dne byly použity všechny čtyři kvadranty a zvířata byla k tomuto testu použita ve 12 po sobě následujících dnech, což znamná, že bylo provedeno celkem 48 pokusů.

Při vlastním pokusu bylo každé myši inekčně podáno 5000 jednotek rekombinantního lidského EPO/kg hmotnosti. Šlo o prostředek Procrit (Ortho-Biotech, lne.). Šlo o intraperitoneální injekční podání 4 hodiny před počátkem pokusu, tato dávka byla podávána každý den po 12 dnů, v nichž byly zkoušky prováděny. Kontrolním zvířatům byl vstřiknut pouze roztok chloridu sodného (sham).

Schopnost se učit byla měřena měřením délky doby, kterou každá myš strávila na destičce. Jak je zřejmé z obr. 1A, jsou výsledky vyneseny jako čas, strávený na destičce pro myši, jimž byl vstřiknut EPO a pro kontrolní myši. Jak je z výsledků zřejmé, zvířata dosáhla destičky rychleji v každém následujícím dnu, avšak u zvířat, jimž byl podáván EPO byl postup rychlejší. To znamená, že křivka pro živočichy, jimž byl podáván EPO byla příznivější. V případě, že výsledky byly vyjádřeny jako rozdíl mezi jednotlivými skupinami a pak byly srovnávány výsledky pro myši, jimž byl podán EPO, a pro kontrolní myši, vykazovala regresní křivka (R²=0,88) sklon (0,68), statisticky významně odlišný od sklonu 1 ve prospěch skupiny zvířat, jíž byl podáván EPO (obr. 1B).

7. Příklad 2:

Periferně podaný EPO zvýrazní averzi k látce s nepříjemnými účinky

Zkouška na averzi k látce s nepříjemnými účinky (OTA) prokazuje, že podání EPO může dramaticky ovlivnit schopnost myši zapamatovat si nepříjemný vjem po podání určité látky, v tomto případě šlo o látku, vyvolávající pocit choroby. V tomto příkladu byl při zkoušce použit chlorid lithný vzhledem k tomu, že vyvolává anorexii a pocit choroby v závislosti na podané dávce. Stejně jako je tomu v případě přirozeně se vyskytujících onemocnění, lithium vyvolává CTA stimulací svrchu uvedených pochodů včetně uvolnění cytokinu.

Myší samice kmene Balb/c byly trénovány tak, aby omezily svůj celkový denní příjem vody na jediné období pití, trvající 5 minut a naučily se vypít za tuto dobu dostatečné množství vody k tomu, aby bylo dosaženo rovnovážného stavu organismu. Zvířata byla rozdělena do skupin, kontrolní skupině byl podán fyziologický roztok chloridu sodného, pokusné skupině byl podán EPO v množství 5000 jednotek/kg intraperitoneálně IP 4 hodiny před podáním nového roztoku s vanilkovou příchutí, oslazeného sacharinem. Okamžitě po dopití sladkého nápoje byl zvířatům podán buď roztok chloridu sodného nebo dávka lithia, vyvolávající onemocnění (20 mg/kg 0,15 M roztoku chloridu lithného IP). Pak byly sledovány tři skupiny pokusných zvířat. První kontrolní skupině nebylo po napití podáno lithium. Druhá skupina obdržela lithium i EPO. Třetí skupině byl podán roztok chloridu sodného bez EPO a lithium.

Averze byla měřena měřením snížení množství vypitého nápoje po opakovaném podání roztoku, vyvolávajícího onemocnění. Po pěti dnech zotavení z podání lithia nebo po podání fyziologického roztoku chloridu sodného byla zvířatům po určitém období bez nápoje znovu podána tatáž tekutina s obsahem vanilkové příchuti a sacharinu. Výsledky pro skupiny 2 a 3 ve srovnání se skupinou 1 (kontrolní skupina) jsou znázorněny na obr. 2A. Den 2 znamená základní spotřebu vody po návyku na pokusnou klec. Ve dni 3 byla pokusným zvířatům podána intraperitoneálně injekce fyziologického roztoku nebo EPO v množství 5000 jednotek/kg 4 hodiny před podáním nové kapaliny s vanilkovou příchutí a sacharinem, načež následovalo podání lithia nebo v případě kontrolních skupin fyziologického roztoku (šipka). Toto podání mělo ve dni 3 za následek malý pokles spotřeby kapaliny u všech skupin, což je již dříve potvrzený nepříznivý účinek injekce a podání nové kapaliny. Po návyku na novou kapalinu již nebylo možno prokázat žádné snížení spoteřby kapaliny u kontrolních zvířat. Však zvířata, kterým bylo podáno lithium odmítala kapalinu přesto, že měla žízeň (den 4). V případě, že nebyla podávána jiná kapalina, došlo k opětnému přijímání kapaliny ve dnech 5 až 9, avšak daleko později k tomu docházelo u zvířat, kterým byl podán EPO, jak je zřejmé z obr. 2A, kde je křivka pro EPO znázorněna spojením plných kruhů.

Stupeň CTA, jehož bylo dosaženo tímto způsobem, je možno lépe ozřejmit zhodnocením vodního deficitu pro každý den, z těchto údajů je pak zřejmé, že zvířata, jimž byl podán EPO, tolerovala přibližně dvojnásobný deficit vody než kontrolní zvířata, jak je zřejmé z obr. 2B. Přestože zvířata, jímž byl podán EPO měla velkou averzi ke kapalině, rychleji se přiblížila ke zdroji kapaliny než kontrolní skupiny, jak je zřejmé z obr. 2C. Intenzita averze CTA byla prokazována podáním opakované injekce samotného lithia bez EPO, tímto způsobem došlo ke snížení reakce a averze byla vyšší u skupiny, jíž byl podáván EPO, zřejmě v důsledku jeho příznivého účinku, jak je zřejmé z obr. 2A, den 10. Tyto údaje prokazují, že při podávání EPO před pokusem je možno pozorovat potenciaci averze typu CTA po podání lithia.

8. Příklad 3:

Periferně podaný EPO chrání mozkovou tkáň před excitotoxinem

Tento příklad prokazuje, že EPO překonává mozkomíšní bariéru a má neuroprotektivní účinek u myší, jimž byl podán neurotoxin kainát. Existuje řada sloučenin, které mají přirozenou toxicitu specificky pro neurony. Tyto molekuly se typicky dostávají do interakce s endogenními receptory pro přenos glutamátu, čímž dochází k příliš vysoké stimulaci a k poškození neuronů. Jeden z těchto toxinů, kainát, je látka, široce používaná ke studiím poškození neuronů v důsledku příliš vysoké excitace, běží o analog glutamátu. Kainát je velmi účinný neurotoxin, který specificky poškozuje neurony, zvláště takové, které jsou uloženy v oblastech s vysokou hustotou receptorů pro kainát, jako je hippocampus', takže dochází k záchvatovitým křečím, poškození mozku a uhynutí zvířete.

Následující zkoušky na neurotoxicitu byly prováděny na myších s použitím kainátu. Tento model byl použit pro stanovení ochranných účinků u některých chorobných stavů, například v případě epilepsie z temporálního laloku. Parenterální injekcí se u pokusných zvířat, například krys nebo myší vyvolají částečné křeče (limbické) v závislosti na podané dávce, tyto křeče se pak mohou generalizovat a vyvolat uhynutí. Pokus byl proveden ke zjištění, zda periferně podaný EPO může procházet mozkomíšní bariérou a v případě, že tomu tak je, ke zjištění, zda má EPO účinek na energetickou rovnováhu nervových buněk a specificky ke zjištění, zda má neuroprotektivní účinky v případě podání kainátu.

• ·

Myší samice kmene Balb/c se střední hmotností 15 až 20 g byly předběžně chráněny podáním rekombinantního lidského erythropoetinu v dávce 5000 jednotek/kg (rhEPO, dodává se pod názvem Porcrit, Ortho-Biotech, lne.) nebo v kontrolní skupině byl intraperitoneálně podán fyziologický roztok chloridu sodného (sham), oba roztoky byly podány v určité.době před podáním nebo v okamžiku podání nebo po podání kainátu (Sigma Chemical), rovněž IP ve specifické hmotnostní koncentraci na kilogram tělesné hmotnosti. Pokusná zvířata pak byla sledována a byl hodnocen vznik záchvatovitých křečí 20 minut po podání kainátu. Každý pokus byl ukončen 60 minut po podání kainátu. Jak je zřejmé z obr. 3A, předběžné podání EPO dramaticky snižuje závažnost záchvatů a oddálí vznik status epilepticus u myší, jimž byl podán kainát.

Srovnání mezi zvířaty, jimž byl podán EPO a kontrolními zvířaty prokazuje statisticky významně nižší počet uhynulých zvířat při dávce kainátu 20 až 30 mg/kg, což je průkazem neuroprotektivního účinku EPO při jeho předběžném podání. Číslo v závorce pod každým ze sloupců znamená počet pokusných zvířat, použitých pro každou dávku kainátu.

Závislost neuroprotektivního účinku EPO v případě podání kainátu v závislosti na dávce EPO je znázorněna na obr. 3B. Pokus byl prováděn tak, že myším byl podán EPO v dávce 5000 jednotek/kg, denně IP po dobu až 5 dnů. Neuroprotektivní účinek těchto dávek EPO byl stanoven stanovením přežití po podání kainátu v dávce 20 mg/kg, tato dávka vyvolá u kontrolních zvířat bez EPO uhynutí přibližně 50 % zvířat, jak je zřejmé z obr. 3A. Sloupce znázorňují zlepšení přežívání u zvířat, jimž byl podán • ·« ·*· · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ···

EPO ve srovnání s kontrolními zvířaty. Jak je z obr. 3B zřejmé, neuroprotektivní účinek se zvyšuje s podáváním dalších dávek EPO v množství 5000 jednotek/kg.

Neuroprotektivní účinek po podání EPO je charakterizován opožděným nástupem, který je způsoben aktivací exprese příslušného genu. Na obr. 3C je znázorněno opoždění uhynutí (v minutách) při záchvatech po podání jediné dávky EPO současně s podáním kainátu v dávce 20 mg/kg, z výsledku je zřejmé, že jediná dávka EPO, podaná současně s podáním kainátu, nezajistí žádnou okamžitou ochranu, kdežto dávka EPO, podaná 24 hodin před podáním kainátu, zlepšuje dobu latence a snižuje závažnost záchvatů- křečí a také prodlužuje dobu do uhynutí zvířete. Tento účinek trvá až 7 dnů.

9. Příklad 4:

Periferně podaný EPO chrání mozkovou tkáň před ischemickým poškozením

Předchozí studie in vivo s celkovou reperfusí u gerbila prokázaly, že při zástavě přívodu krve k mozkové tkáni dochází k uhynutí mozkových buněk, přičemž EPO, vstřiknutý přímo do mozkových komor chrání mozkovou tkáň před uhynutím buněk podle publikace Sakanaka a další,

1998, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95: 4635. Pokusy, které budou dále uvedeny v tomto příkladu poprvé prokázaly, že EPO po periferním podání chrání nervové buňky před uhynutím in vivo na živočišném modelu po vyvolání ischemie mozkové tkáně.

Při následujícím pokusu byl proveden uzávěr střední mozkové tepny, jde o běžně přijímaný model pro ložiskovou ♦ · · ·

mozkovou mrtvici s následnou ischemií. Krysí samci s hmotností 250 g byli anestetizováni fenobarbitalem a jejich tělesná teplota byla udržována na 37 °C. Byly operativně uvolněny krkavíce a jedna z nich byla na trvalo uzavřena. Na této straně byla při svém začátku kauterizována střední mozková tepna MCA. Tepna na druhé straně byla uzavřena svorkou na jednu hodinu. Zvířata byla usmrcena po 24 hodinách, mozek byl vyjmut a rozdělen na sériové řezy s tloušťkou 1 mm. Životaschopná tkáň byla prokazována in šitu redukcí trifenyltetrazoliové barvy tak, aby bylo možno viditelně odlišit životaschopnou tkáň od mikrotických oblastí. Jádro ischemické poruchy s bezprostředním okolím vždy obsahuje uhynulé buňky.

Při použití tohoto modelu byl EPO podáván injekčně parenterálně různou dobu před poškozením tepen a bezprostředně po tomto poškození, načež byl rozsah poškození stanoven kvantitativně analýzou zobrazené tkáně pomocí počítače. Výsledky této analýzy, které jsou uvedeny na obr. 4A, prokazují účinky podávání EPO v následujících dobách po vyvolání uzávěru tepny: 24 hodin před uzávěrem, v době uzávěru a 3, 6 a 9 hodin po uzávěru tepny. Jak je znázorněno na obr. 4A, chrání EPO tkáň před míkrotíckým poškozením v případě podání až do 6 hodin po uzávěru tepny.

Je zajímavé, že 17-mer, odvozený od EPO, o němž se dříve uvádělo, že má neurotropní účinky, vyvolává růst neuritů in vitro a podporuje myelinizaci nervových buněk in vivo podle publikace Campana a další, 1998, Int. J. Mol. Med. 1:235-41, a US patent 5700909 z 23. prosince 1997 nemá žádný účinek proti poškození v tomto modelu, jak je zřejmé z obr. 4B z výsledku pro tuto látku. To

znamená, že uvedený model a další zkoušky je možno použít k identifikaci EPO a modulátorů aktivity receptorů EPO a prokazovat tak účinky těchto látek na modulaci funkce excitovatelné tkáně, například pokud jde o ochranu před poškozením nebo zlepšení výukových a kognitivních funkcí.

10. Příklad 5:

Periferně podávaný EPO chrání mozkovou tkáň před tupým poraněním

Při modelu mechanického traumatu mozkové kůry, je možno prokázat, že předběžné podání EPO systemicky chrání mozkovou tkáň myši před poraněním tupým předmětem. K vyvolání traumatu se užívá píst s pneumatickým pohonem (Clippard Valves) s průměrem 3 mm, kterým je možno zasadit do lebky tupý úder. Každá myš byla anestetizována a uložena do stereotaktického přístroje tak, aby nedocházelo k pohybům hlavy. Na lebce byl proveden zářez tak, aby bylo možno stanovit polohu bregmatu, který je referenčním bodem, na nějž je na začátku pokusu uložen píst. Píst se pak upraví tak, že se posune 2 mm kaudálně a 2 mm ventrálně od bregmatu, načež se vykoná úder přesně odměřeným množstvím dusíku. Tento přístroj dovoluje přesnou úpravu rychlosti pístu 4 m/s a posun lebky při nárazu o 2 mm.

hodin před pokusem, v době poranění, 3, 6 nebo 9 hodin po poranění byl myším podán EPO v dávce 5000 jednotek/kg, pak byl EPO ještě podáván každý den. 10 dnů po začátku pokusu byly myši usmrceny a mozková tkáň byla zkoumána na rozsah nekrózy. U myší kontrolních, jimž byl podán fyziologický roztok chloridu sodného, bylo možno pozorovat velkou oblast nekrózy, jak je zřejmé z obr. 5 a • φ » · • · « · • ·· • · · infiltraci mozkové tkáně mcnocyty. Na druhé straně u zvířat, jimž byl předběžně podán EPO nebo jim byl podán EPO alespoň do tří hodin po poranění, bylo možno pozorovat jenom malé množství mononukleárních buněk v oblasti poškození mozkové tkáně.

11. Příklad 6:

Periferně podávaný EPO chrání srdeční sval před ischemickým poškozením

Tento příklad prokazuje účinnost podávání EPO při ochraně srdeční tkáně před hypoxickým poškozením. K tomuto účelu byl krysám podáván EPO v množství 5000 jednotek/kg 24 hodin před pokusem, který byl proveden podle publikace Latini a další, 1999, J. Cardiovasc. Pharmacol. 31:601-8. Krysy byly anestetizovány, bylo jím zavedeno řízené dýchání a byla provedena thorakotomie.

Byl identifikován vnitřní oběh srdce a uložen odstranitelný steh na nejproximálnější část levé přední sestupné koronární tepny. Pak byla podána další dávka EPO v množství 5000 jednotek/kg a uzávěr byl udržován 30 minut. Po této době byl steh uvolněn, zvířata byla udržována ještě 6 hodin v hluboké anestezii a pak byla usmrcena. Okamžitě po usmrcení bylo srdce vyjmuto a část poškozené tkáně AAR a nepoškozená tkáň septum byly připraveny k biochemické analýze. Byly stanoveny dva parametry, a to množství kreatinkinázy CK jako známka přežívání srdečního svalu, to znamená, že čím nižší je množství CK, tím méně živoraschopná je tkáň, mimo to bylo stanoveno množství myeloperoxidázy, která je produktem infiltrátu mononukleárními buňkami. Výsledky těchto pokusů jsou shrnuty na obr. 6A a 6B. Jak je z těchto výkresů zřejmé, při předběžném podání EPO dochází k • 9 ···· ·· 999 999 ·· ·«« udržení účinnosti CK, to znamená ke zvýšení životaschopnosti tkáně a současně ke snížení účinnosti MPO relativně ke kontrolám, a to i v místě poškození infarktem AAR i na volné stěně perfundované levé komory LV, což znamená, že došlo k podstatně menší infiltraci zánětlivými buňkami.

12. Příklad 7:

Periferně podávaný EPO zmírní projevy experimentální alergické encefalitidy

Experimentální elergická nebo autoimunitní encefalomyelitis EAE u krys je všeobecně přijímaným živočišným modelem pro roztroušenou sklerózu MS. Byly vyvinuty různé živočišné modely s EAE při použití imunologických, virologických, toxických a traumatických parametrů tak, aby bylo možno pochopit podstatu MS.

Aby bylo možno prokázat, zda je možno podáním EPO chránit živočichy proti příznakům EAE, byl proveden následující pokus. Myší samice kmene Lewis ve stáří 6 až 8 týdnů (Charles River, Calco, Itálie) byly imunizovány v lehké étherové anestezii injekcí 50 μg bazického proteinu morčecího myelinu (MBP, Sigma, St. Louis, MO) ve vodě ve formě emulze v úplném Freunaově pomocném prostředku (CFA, Sigma) spolu s 7 mg/ml teplem usmrceného Mycobacterium tuberculosis v prostředí H37Ra (Difco, Detroit, MI) v konečném objemu 100 μΐ do každé zadní tlapky.

Pak byla zvířata denně pozorována a sledována na příznaky experimentální autoimunitní encefalomyelitidy EAE s následujícím hodnocením: 0 = bez příznaků, «·· · · . . .

···· ·· ··· «·· ·· ·· = neovladatelný ocas, 2 = ataxie, 3 = úplná obrna zadních končetin s inkontinencí moči. Byla také stanovena šlesná hmotnost. Krysám byl podán EPO jednou denně IP v dávce 5000 jednotek/kg od třetího dne po imunizaci a byl podáván až do dne 18. Kontrolním krysám bylo podáno pouze nosné prostředí. Jak je znázorněno na obr. 7, u krys, jimž byl podáván EPO bylo možno pozorovat zlepšení příznaků, to znamená nižší skóre a zkrácené trvání chorobného stavu. Mimo to bylo také možno pozorovat značné zpoždění nástupu chorobných příznaků.

13. Příklad 8:

Minimální účinná dávka a farmakokinetika EPO, jíž je zapotřebí pro ochranu excitovatelné tkáně

Optimální a účinné dávky EPO byly stanoveny při použití živočišného modelu pro fokální ischemii, vyvolanou mozkovou mrtvicí, tak jak bylo popsáno svrchu. Jak je zřejmé z obr. 8A, nebyla dávka EPO nižší než 450 jednotek/kg hmotnosti účinná při ochraně excitovatelné tkáně před nekrotickým poškozením. Jak je zřejmé z obr.

8B, při studíjích na živočišném modelu dávka přibližně 5000 jednotek/kg, podaná IP u čtyř myších samic, vedla k dosažení koncentrace EPO v krevním oběhu vyšší než 20 000 mjednotek/ml séra v průběhu 5 hodin po podání EPO, koncentrace vyšší než 10 000 mjednotek po 10 hodinách po podání, avšak nižší než 5 jednotek/ml 24 hodin po podání.

14. Příklad 9:

Transport účinných molekul do CNS, zprostředkovaný erythropoetinem ♦ * · ©

•ι •

9 99 • ♦

Dále uvedené pokusy prokazují úspěšný transport molekul, konjugovaných s EPO přes mozkomíšní bariéru a lokalizace v bazální membráně. Jak je znázorněno na obr. 9A, byly řezy mozkové tkáně barveny protilátkami proti receptoru EPO (EPO-R), takže je zřejmé, že v mozkových kapilárách dochází k vysoké úrovni exprese EPO-R. Aby bylo možno zjistit, zda EPO může být transportován přes mozkomíšní bariéru, byl EPO značen biotinem následujícím způsobem. Roztok s obsahem rhEPO byl koncentrován při použití filtru Centricon-10 (Millipore) a výtěžek byl prokazován odečítáním absorbance při vlnové délce 280 nm. Pak bylo 0,2 mg dlouhého řetězce biotinu (Vector Labs) rozpuštěno ve 100 μΐ DMSO, roztok byl přidán ke koncentrovanému roztoku rhEPO a okamžitě promíchán. Výsledná směs byla inkubována 4 hodiny při teplotě místnosti za opatrného míchání a za ochrany před přístupem světla. Nenavázaný biotin byl z roztoku odstraněn při použití sloupce Centricon-10. Biotinylovaný EPO pak byl podán živočichům IP a po 5 hodinách byla zvířata usmrcena. Řezy mozkové tkáně byly značeny avidinem, vázaným na peroxidázu a pak byl přidáván diaminobenzidin tak dlouho, až došlo ke vzniku dostatečného množství reakčního produktu tak, aby bylo možno pozorovat výsledek pomocí světelného mikroskopu. V tomto pokusu bylo možno prokázat EPO podél týchž kapilár, které byly pozitivní v případě EPO-R, jak je zřejmé z obr. 9B. Později došlo k lokalizaci biotinu na specifických neuronech přibližně po 17 hodinách, jak je zřejmé z obr. 9C. Na rozdíl od tohoto pokusu v případě, že byl samotný chladný EPO přidán v lOOOnásobném přebytku vzhledem ke značenému EPO, nedošlo ke specifickému barvení. Výsledky prokazují úspěčný transport sloučeniny, konjugované s EPO při systemickém podání konjugátu přes mozkomíšní bariéru.

Úspěšný transport systemicky podávaného konjugovaného EPO a biotinu přes mozkomíšní bariéru do mozkomíšní tkáně ukazuje, že také další účinné látky je možno transportovat obdobným způsobem přes mozkomíšní bariéru vytvořením konjugátu s EPO. Jako jeden z příkladů je možno uvést neurotrofní faktor, odvozený od mozkové * tkáně BNF, vázaný na EPO karbodiimidovou vazbou běžným způsobem. Po čištění je možno konjugát podat pokusným zvířatům intraperitoneální injekcí. Pozitivní účinky BNF na centrální nervový systém je možno měřit relativně ke kontrolním zvířatům a tak měřit úspěšný transport této molekuly na rozdíl od podání nekonjugovaného BNF, který nemá žádný příznivý účinek na činnost centrálního nervového systému.

Vynález byl popsán v souvislosti se specifickými provedeními, tato provedení byla uvedena k ilustraci smyslu vynálezu, je však zřejmé, že by bylo možno navrhnout další ekvivalentní postupy a složky farmaceutického prostředku, rovněž spadající do rozsahu vynálezu.

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek ve formě jednotlivé dávky, upravený pro modulaci excitovatelné tkáně, zlepšení kognitivních funkcí nebo transport účinných látek přes endoteliální spoje, vyznačující se tím, že v jednotkové dávce obsahuje účinné netoxické množství 50 000 až 500 000 jednotek EPO, modulátoru aktivity receptoru EPO, modulátoru receptoru, aktivovaného EPO nebo kombinace těchto látek spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje účinnou netoxickou dávku EPO 50 000 až 500 000 jednotek.
3. 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje účinnou netoxickou dávku EPO, po jejímž podání se dosahuje dávky EPO v krevním oběhu v koncentraci vyšší než

   10 000 mjednotek/ml séra.
4. 4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že se koncentrace EPO v krevním oběhu měří 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 hodin po podání EPO.
5. 5. Farmaceutické balení, vyznačující se tím, že obsahuje 1 nebo větší počet zásobníků s farmaceutickým prostředkem podle nároku 2.
6. 6. Způsob ochrany živočichů před patologickými stavy, které jsou důsledkem poškození excitovatelné tkáně, ♦ 4 4 ♦ • 494 9 • 94

   9 9 9

   4999 99 vyznačující se tím, že se periferně podává účinné množství EPO, modulátoru aktivity receptoru EPO nebo modulátoru receptoru, aktivovaného EPO pro ochranu excitovatelné tkáně v množství a v dávkách, dostatečných k dosažení ochranného účinku bez podstatnějšího zvýšení hematokritu.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedené poškození vzniká jako důsledek záchvatovitých poruch, roztroušené sklerózy, mozkové mrtvice, sníženého krevního tlaku, srdeční zástavy, ischemie, infarktu myokardu, zánětlivých stavů, ztráty kognitivních funkcí v souvislosti s věkem, poškození zářením, mozkové obrny, neurodegenerativního onemocnění, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby, Leighovy choroby, demence v souvislosti s AIDS, ztráty paměti, amyotrofické laterální sklerózy, alkoholismu, poruch nálady, úzkostných poruch, poruch pozornosti, autismu, Creutzfeld-Jakobovy choroby, poranění mozku nebo míchy, bypassu srdce-plíce, glaukcmu, ischemie sítnice nebo poranění sítnice.
8. 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že poškození je důsledkem hypoxie.
9. 9. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že hypoxií je prenatální nebo postnatální nedostatek kyslíku, dušení, stavy topení, kognitivní dysfunkce po chirurgickém zákroku, otrava oxidem uhelnatým, inhalace kouře, chronické obstruktivní plicní choroby, rozedma, syndrom nedostatečnosti dýchacího ústrojí u dospělých, hypotenzivní šok, septický šok, anafylaktický šok, inzulínový šok, krize z přítomnosti ·· ·· · φ φφ φ • · · · ·· φφ φφφφ * ♦· · φ · · · φφφφ · Φφφφ φ ··· · φ φφφ φφφφ φφ φφφ φφφ srpkovitých buněk, srdeční zástava, poruchy rytmu, narkóza dusíkem nebo místní hypoxie tkání.
10. 10. Způsob zlepšení funkce normální nebo narušené excitovatelné tkáně u savců, vyznačující se tím, že se periferně podává účinné množství EPO, modulátoru aktivity receptoru EPO nebo modulátoru receptoru, aktivovaného EPO pro ochranu excitovatelné tkáně v množství a v dávkách, dostatečných k dosažení požadovaného účinku bez podstatnějšího zvýšení hematokritu.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že zlepšením funkce excitovatelné tkáně je zlepšení schopnosti se učit nebo zlepšení paměti.
12. 12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že zlepšení funkce excitovatelné tkáně se využívá při léčení poruchy nálady, úzkostných poruch, deprese, autismu, poruchy pozornosti v souvislosti s hyperaktivitou, při léčení Alzheimerovy nemoci, při stárnutí nebo kognitivní dysfunkci.
13. 13. Způsob podle nároku 6 nebo 10, vyznačující se tím, že excitovatelnou tkání je tkáň centrálního nervového systému, periferního nervového systému nebo srdeční tkáň.
14. 14. Způsob podle nároku 6 nebo 10, vyznačující se tím, že účinná látka se podává perorálně, místně, intraluminálně, inhalací nebo parenterálně.

    • ♦ · · · 9 9

    9999 9* 999 999 ·«
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující s.e tím, že se účinná látka podává parenterálně, a to nitrožilně, intraarteriálně, podkožně, nitrosvalově, intraperitoneálně, pod sliznicí nebo intradermálně.
16. 16. Způsob podle nároku 6 nebo 10, vyznačující se tím, že se účinná látka podává akutně nebo chronicky.
17. 17. Způsob podle nároku 6 nebo 10, vyznačující se tím, že se podává EPO bez účinku na krvetvorbu.
18. 18. Způsob podle nároku 6 nebo 10, vyznačující se tím, že se podává EPO v dávce vyšší, než je maximální dávka, nezbytná pro stimulaci krvetvorby.
19. 19. Způsob usnadnění transportu molekuly přes endotheliální buněčnou bariéru u savce, vyznačující se tím, že se periferně podává účinné množství účinné látky v konjugaci s EPO, modulátorem aktivity receptorů EPO nebo modulátorem receptorů, aktivovaného EPO pro ochranu excitovatelné tkáně v množství a v dávkách, dostatečných k dosažení transportního účinku bez podstatnějšího zvýšení hematokritu.
20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že se molekula účinné látky na EPO váže pomocí labilní kovalentní vazby, stabilní kovalentní vazby nebo nekovalentním spojením s vazným místem molekuly.
21. 21. Způsob podle nároku 19, vyznačující s.e tím, že endotheliální buněčnou bariérou je mozkomíšní bariéra, bariéra mezi krevním oběhem a nitroočním prostředím, bariéra mezi krevním oběhem a varlaty nebo vaječníky, nebo bariéra mezi krví a placentou.
22. 22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že molekulou účinné látky je agonista receptoru nebo antagonista hormonu, neurotrofní faktor, antimikrobiální látka, radiofarmaceutická látka antimediátorová látka, protilátka, látka, potlačující imunitní systém, toxin nebo protinádorová látka.
23. 23. Způsob podle nároku 6, 10 nebo 19, vyznačující se tím, že použitým EPO je erythropoetin, jeho analog, látka, podobná erythropoetinu, fragment nebo hybrid erythropoetinu, molekula, schopná se vázat na receptor erythropoetinu, agonista erythropoetinu, erythropoetin z ledvin nebo z mozku, jeho oligomer, multimer, mutein nebo kongener, přírodně se vyskytující forma, syntetická forma, rekombinantní forma nebo kombinace těchto látek.
24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že molekulou, schopnou se vázat na receptor EPO je protilátka proti receptoru erythropoetinu.
25. 25. Farmaceutický prostředek pro transport molekuly pomocí transcytózy přes endotheliální buněčnou bariéru, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu účinné látky ve spojení s EPO, s modulátorem aktivity receptoru EPO nebo s modulátorem receptoru, aktivovaného EPO.

    * * · · ·· ·· · · ·· * ♦« · « · · · ♦ ··· · · · · » · • · · · « ··· ··*· ·· ·«» ··«
26. 26. Farmaceutický prostředek podle nároku 25, vyznačující se tím, že obsaženým EPO je erythropoetin, jeho analog, látka, podobná erythropoetinu, fragment nebo hybrid erythropoetinu, molekula, schopná se vázat na receptor erythropoetinu, agonista erythropoetinu, erythropoetin z ledvin nebo z mozku, jeho oligomer, multimer, mutein nebo kongener, přírodně se vyskytující forma, syntetická forma, rekombinantní forma nebo kombinace těchto látek.
27. 27. Farmaceutický prostředek podle nároku 25, vyznačující se tím, že účinnou molekulou je agonista receptoru, antagonista hormonu, neurotrofní faktor, antimikrobiální látka, radiofarmaceutická látka, antimediátorová látka, protilátka, látka potlačující imunitní systém, toxin nebo protinádorová látka.
28. 28. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že je upraven pro podávání k dosažení ochranného účinku na nervovou tkáň a obsahuje účinné množství neerythropoetického derivátu EPO spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
29. 29. Farmaceutický prostředek pro podání k dosažení příznivého účinku na funkci nervové tkáně, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství neerythropoetického derivátu EPO a farmaceuticky přijatelný nosič.
30. 30. Farmaceutický prostředek pro transport účinných látek přes endotheliální buněčné bariéry, vyznačující se tím, že obsahuje účinné • · · · · · · · ··♦· ·« ··· _u množství neerythropoetického derivátu EPO a farmaceuticky přijatelný nosič.
31. 31. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 28, 29 nebo 30, vyznačující se tím, že neerythropoetickým derivátem EPO je modulátor aktivity receptorů EPO nebo modulátor receptorů, aktivovaného EPO.
32. 32. Farmaceutické balení, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo větší počet zásobníků s farmaceutickým prostředkem podle některého z nároků 28,

    29 nebo 30.