BG65353B1

BG65353B1 - Фармацевтичен състав, съдържащ еритропротеин, и използването му за производство на медикаменти

Info

Publication number: BG65353B1
Application number: BG106058A
Authority: BG
Inventors: Michael Brines; Anthony Cerami; Carla Cerami
Original assignee: Kenneth S. Warren Laboratories
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2008-03-31
Also published as: EA200101073A1; CR6501A; NZ545478A; IS6104A; BG106058A; CN1607957A; JP2003520194A; IL145895A0; BR0009737A; NO20014991D0; EA004766B1; SK14412001A3; TR200103785T2; KR20070094997A; NO20014991L; MXPA01010177A; CA2383940A1; TR200402194T2; PL352223A1; HUP0201598A2

Abstract

Изобретението се отнася до методи и състави за защита и повишаване функцията на възбудимата тъкан убозайници чрез системно въвеждане на еритропоетинов рецепторен модулатор на активността, например еритропоетин, сигнализиращ чрез ЕРО-активирания рецептор за модулиране функцията на възбудимата тъкан. Възбудимите тъкани включват тъканите на централната нервна система, например мозъка, периферните нервни тъкани, ретината и сърдечната тъкан. Тяхнотопредпазване включва лечението на хипоксия, увреждания при припадъци, невродегенеративни заболявания, хипогликемия и невротоксично отравяне. Повишаването на функцията е полезно при дейности като заучаване и запаметяване. Изобретението се отнася също до състави и методи за улеснение транспорта на молекули през здравите бариерни връзки на ендотелнитеклетки, например на кръвно-мозъчната бариера, чрезасоцииране на молекули с еритропоетинов рецепторен модулатор на активността, като еритропоетин.

Description

Област на приложение

Настоящото изобретение се отнася до използването на периферно въведен еритропоетин и други модулатори на активността на еритропоетин рецептори, или модулатори на ЕРО-активиран рецептор за позитивно въздействие върху функцията на възбудими тъкани. Това включва предпазването на възбудимата тъкан, такава като невронна и сърдечна тъкан, от невротоксини, хипоксия и други неблагоприятни влияния, както и повишаването на функцията на възбудимата тъкан, например за улесняване на заучаването и паметта. Настоящото изобретение е освен това насочено към методи за транспорт на субстанции през ендотелните клетъчни бариери чрез асоцииране с еритропоетинова молекула, модулатор на активността на еритропоетинов рецептор или друг модулатор на ЕРО-активиран рецептор.

Предшестващо състояние на техниката

Различни остри и хронични състояния и болести произтичат от увреждане и дисфункциониране на възбудима тъкан, причинени в миналото от външни и вътрешни влияния. Такива влияния включват недостиг на адекватна оксигенация или глюкоза, невротоксини, възрастови изменения, инфекциозни агенти и травми. Така например възбудима тъкан може да бъде подложена на увреждане като последица при припадъци и хронични разстройства при припадъци, конвулсии, епилепсия, инсулт, болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон, увреждания на централната нервна система, хипоксия, церебрална парализа, мозъчна или гръбначно мозъчна травма, СПИН деменция или други форми на деменция, възрастово обусловена загуба на познавателната функция, загуба на паметта, амиотрофична латерална склероза, мултиплена склероза, хипотония, спиране на сърцето, невронна загуба, инхалация на пушек и отравяне с въглероден окис.

Напълно разбираемо е, че намаляването на доставката на достъпна за мозъка енергия, като например глюкоза или кислород, довежда до дълбоки увреждания на мозъчната функция, включително и познавателната способност. Много (но не всички) неврони в централната нервна система лесно са увредени през времето, когато работят в метаболитно ограничени условия, например хипоксия, хипогликемия, стрес, и/или продължително силно възбуждане. При тези обстоятелства електрохимичните градиенти на тези клетки често колабират, довеждайки до необратими невронни увреждания и клетъчна смърт. Общоприетото мнение приема този основен механизъм като обичаен краен завършек на широк кръг общи и начални невродегенеративни болести включително инсулт, епилепсия и болест на Алцхаймер.

Въпреки, че последствията от ограничен енергиен субстрат върху мозъчната функция са добре познати, ефектът от подобряване на енергийното предаване в иначе нормален мозък не е достатъчно проучен. Текущите данни внушават, че подобрено доставяне на едно от двете глюкоза или кислород подчертано подобрява комплексно познавателната функция както при животински модели, така и при нормални човешки индивиди. (Kopf et al., 1994, Behavioral and Neural Biology 62; 237-243; Li et al., 1998, Neuroscience 85:785-794; Moss et al., 1996, Psychopharmacology 124:255-260). Изследван е списък на невропептиди, продуцирани вътре в мозъка, за директно осигуряване на подобрение в познавателната функция в нормален мозък. Физиологичната основа на тези подобрения в основата си зависи от ремоделиране на връзките между невроните чрез симпатикови изменения.

Мозъчната тъканна архитектоника проявява екстремна пластичност и претърпява непрекъснато ремоделиране. Тези процеси, осъществени чрез много трофични молекули, настъпват не само като последствие на увреждане, но също така играят значителна роля в заучаването, паметта и познавателната функция. Въпреки, че прототипът невротрофин е растежен нервен фактор (NGF), беше признато, че увеличаващ се брой на цитокини извършва трофични функции в мозъка (Hefti et al., 1997, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37: 239-67).

Известно е, че нервната тъкан показва високи нива както на ЕРО, така и на неговия рецептор (EPO-R; Digicayloglu et al., 1998, Proc.,

65353 Bl

Natl. Acad. Sci. USA 92:3717-20; Juul et al., Pediatr. Res. 43:40-9; Marti et al., 1997, Kidney Int. 51:416-8; Morishita et al., 1997, Neuroscience 76:105-16). Въпреки, че изглежда, че ЕРО и неговия рецептор на протеини са всеки един продукт на единични гени, CNS версииите са значително по-малки. Физиологичното значение на това наблюдение не е изяснено, но голямото количество различия довеждат до промяна в биологичната активност. Например, при изследване на пациенти хора се вижда, че ЕРО не е транспортиран вътре в мозъка от периферията (Marti et al., 1997, supra). Тази възможност не е проучена за ЕРО посредством каквито и да било директни изследвания. Въпреки че мозъчният ЕРО е около 15% по-малък от реналния ЕРО (дължащо се на разлики в сиализацията), мозъчният ЕРО е по-активен в еритроидна колонна стимулация и ниско лигандни концентрации (Masuda et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:1948893). От друга страна, CNS рецепторът показва много по-нисък афинитет към деглюкозирания ЕРО отколкото 30% по-широкия периферен рецептор (Konishi et al., 1993, Brain Res. 609:29-35; Masuda et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:11208-16).

В мозъка ЕРО израз беше намерен в астроцити, а увеличена ЕРО изява и освобождаване могат да бъдат индуцирани от хипоксия и други метаболитни стресанти (Marti et al., 1996, Eur. J. Neurosci. 8:666-76; Masuda et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:11208-16; Masuda et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:19488-93) или дори чрез въвличане на други рецептори, като например фамилия инсулиноподобен фактор на растежа (Masuda et al., 1997, Brain Res. 746:63-70). Невроните са една бариера за този секретиран ЕРО, тъй като те изразяват ЕРО-R по специфичен начин силно зависещ от клетъчния тип (Morishita et al., 1997, Neuroscience 76:105-16). Противоположно на самия ЕРО, плътността на ЕРО-R не изглежда, че се модулира по време на метаболичен стрес (Digicaylioglu et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3717-20.

Проучване показва, че ЕРО решително предпазва срещу невронно увреждане при хипоксия in vitro, както и in vivo, когато се инжектира директно вътре в мозъчните вентрикули. (Morishita et al., 1997. Neuroscience 76:105-16; Sadamoto et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 253:26-32; Sakanaka et al. 1998. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 95:4635-40). Konishi et al., (1993, Brain Res. 609; 29-35) демонстрираха, че ЕРО подпомага in vivo оцеляването на холинергични неврони у възрастни плъхове когато се инжектира директно вътре в мозъчните вентрикули. Въведеният централно вътре в мозъчните вентрикули ЕРО също така успешно предпазва от свързани с увреждания исхемични дефицити в пространственото опознаване при плъхове. (Sadamoto et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Corranun. 253-26-32). Скорошна публикация подсказва, че само 17-амино киселинен фрагмент от ЕРО е необходим за тези невротрофични ефекти при култивирани нервни клетки (Сатрапа et al., 1998. Int. J. Mol. Med. 1:235-41).

Единствената ясна физиологична роля на еритропоетина (ЕРО) е неговият контрол върху продукцията на червени кръвни клетки. ЕРО, като част от цитокинетичната суперфамилия, изпълнява други важни физиологични функции, които се осъществяват чрез взаимодействие с еритропоетиновия рецептор (ЕРО-R). Тези действия включват митогенеза, промяна на калциевия инфлукс в гладкия мускул и нервните клетки, и ефект в интермедиерен метаболизъм. Вярва се, че ЕРО осигурява компенсаторни отговори, които служат за подобряване на хипоксични клетъчни микрообласти. Въпреки че проучвания установиха, че инжектиран интракраниално ЕРО предпазва невроните от хипоксични невронни увреждания, интракраниално въвеждане е неприложим и неприемлив начин за въвеждане за терапевтични цели, особено за нормални индивиди. Освен това, предишни изследвания на анемични пациенти, взимащи ЕРО, доведоха до заключение, че периферно въведен ЕРО, не е транспортиран до мозъка (Marti et al., 1997, supra).

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до състави и методи за модулиране функцията на възбудимата тъкан у бозайници, както и методи и състави за предаване на лекарствени средства във възбудимите тъкани. Изобретението е базирано отчасти върху откритието на заявителите, че еритропоетин (ЕРО) въвеждан систематично и във висока доза, е специфично натрупан в мозъка. В частност, ЕРО, предаден във високи дози може да премине кръвно-мозъчната бариера, къ

65353 Bl дето може да усили познавателната функция, и да предпази нервната тъкан от увреждане в резултат на стресови условия, такива като хипоксия.

Еритропоетин и ЕРО, използвани тук като взаимозаменяеми, и модулатори на активността на ЕРО рецептора, модулатори на ЕРО активиран рецептор, се отнасят към вещества, които, когато са въвеждани систематично (извън кръвно-мозъчната бариера,) са способни да активират ЕРО активирани рецептори в електрически възбудими тъкани, за да усилят и/или предпазят от увреждане и смърт. Така ЕРО може да се отнесе за всяка една форма на еритропоетин, която може да модулира възбудима тъкан, както и ЕРО аналози, фрагменти или техни миметици. В един предпочитан вариант за употреба в методите на настоящото изобретение, еритропоетинът проявява повишена специфичност за мозъчния ЕРО рецептор. В друг вариант еритропоетинът е нееритропоетичен. В един следващ друг вариант еритропоетинът е въведен в доза по-голяма от необходимата за максимално стимулиране на еритропоезата.

Настоящото изобретение разкрива фармацевтичен състав под формата на дозна единица адаптирана за модулиране на възбудима тъкан, повишаване на познавателната функция, или предаване на вещества през здрави ендотелни връзки, в дозна единица, ефективно нетоксично количество, вътре в интервала от около 50,000 до 500,000 единици от ЕРО, модулатор на активността на ЕРО рецептор, модулатор на ЕРОактивиран рецептор, или тяхна комбинация, и фармацевтично приемлив носител. В един вариант ефективното нетоксично количество от ЕРО в споменатия фармацевтичен състав включва 50,000 до 500,000Единици ЕРО. В друг вариант ефективното нетоксично количество ЕРО в споменатия фармацевтичен препарат е ефективна доза за достигане на циркулиращо ниво на ЕРО по-голямо от 10,000 mU/ml в серум. В друг вариант циркулиращото ниво на ЕРО е постигнато за около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 h след въвеждането на ЕРО. В друг вариант, изобретението разкрива фармацевтичен кит, съдържащ ефективно количество от ЕРО за модулиране на възбудима тъкан, повишаване на познавателната функция или доставяне на вещества през здравите ендотелни връзки, опаковани в един или повече контейнери.

Настоящото изобретение разкрива метод за модулиране функцията на възбудимата тъкан у бозайник, включващ периферно въвеждане у споменатия бозайник, на ефективно количество еритропоетин. Възбудимата тъкан може да бъде нормална или патологична заболяла тъкан. В един вариант възбудимата тъкан е невронна тъкан на централната нервна система. В друг вариант възбудимата тъкан е селектирана от група, състояща се от невронна тъкан на периферната нервна система и сърдечна тъкан.

В един вариант е предвиден метод за повишаване функцията на възбудимата тъкан у бозайник, в частност, както за нормална, така и за патологична възбудима тъкан, чрез периферно въвеждане на ефективно количество на ЕРО или на модулатор на активността на ЕРО рецептор. Повишаване на функцията на възбудимата тъкан предвижда повишаване на, например, заучаване, асоциативно заучаване или памет. Неограничен брой примери на състояния или заболявания лечими чрез този аспект на настоящото изобретение включват разстройства в настроението, безпокойство, депресия, аутизъм, дефицит на вниманието при хиперактивно разстройство, болест на Алцхаймер, Ю възрастова и познавателна дисфункция.

В друг вариант модулирането на възбудимата тъкан осигурява предпазване от настъпване на патология вследствие на увреждане на възбудимата тъкан, например, на неврони от централната нервна система, периферната нервна система или сърдечна тъкан. Такава патология може да настъпи вследствие на увреждания, включително, но не ограничено до, при хипоксия, разстройства при припадък, невродегенеративни заболявания, невротоксично отравяне, мултиплена склероза, хипотония, спиране на сърцето, облъчване или хипогликемия. В един вариант, патологията е в резултат на хипоксия и може би пренатална или постнатална кислородна недостатъчност, задушаване, шок, давене, постоперативна познавателна дисфункция, отравяне с въглероден окис, инхалиране на пушек, хронично обструктивно белодробно заболяване, емфизем, дихателен дистрес синдром у възрастни, хипотоничен шок, септичен шок, инсулинов шок, анафилактичен шок, сърповидно-клетъчна криза, спиране на сърцето, дисритмия или азотна наркоза. В случаи, където патолотията е раз

65353 Bl стройство при припадък, може да бъде като неограничаващ пример, епилепсия, конвулсии или хронично разстройство, свързани с припадък. В случаи, където патологията е нервно-дегенеративно заболяване, може да бъде например инсулт, болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон, церебрална парализа, мозъчна или гръбначно-мозъчна травма, СПИН - деменция, възрастово обусловена загуба на познавателната функция, загуба на памет, амиотрофична латерална склероза, разтройства при припадък, алкохолизъм, ретинна исхемия, остаряване, глаукома или невронна загуба. В друг вариант въвеждането на ЕРО може да бъде използвано за предпазване от поражение или тъканно увреждане по време на хирургични процедури, такива като например резекция на тумор или възстановяване при аневризма.

В един друг вариант са предвидени методи за улесняване на трансцитозата на молекулите през ендотелната клетъчна бариерау бозайник, чрез въвеждане на състав от молекула в асоциация с еритропоетин. Асоциацията между молекулата, която трябва да бъде транспортирана и ЕРО може да бъде например лабилна ковалентна връзка, стабилна ковалентна връзка, или нековалентна асоциация със свързващо място за молекулата. В един вариант ендотелните клетъчни бариери могат да бъдат кръвно-мозъчната бариера, кръвно-очната бариера, кръвно-тестисната бариера, кръвно-овариалната бариера, или кръвно-плацентарната бариера.

Изобретението освен това разкрива състав за транспортиране на молекула по пътя на трансцитозата през ендотелната клетъчна бариера, включващ споменатата молекула в асоциация с ЕРО, модулатор на активността на ЕРО рецептор, или модулатор на ЕРО-активиран рецептор. В един вариант ЕРО е еритропоетин, еритропоетинов аналог, еритропоетинов миметик, еритропоетинов фрагмент, хибридна еритропоетинова молекула, еротропоетин рецептор-свързваща молекула, еритропоетинов агонист, ренален еритропоетин, мозъчен еритропоетин, негов олигомер, негов мултимер, негов мутеин, негов конгенер, негова естествено появяваща се форма, негова синтетична форма, негова рекомбинантна форма, или негова комбинация. В друг вариант, молекулата на споменатия състав е хормон, невротропичен фактор, антимикробен агент, радиофармацевтик, вещество антисенс, антитяло, имуносупресант, токсин, или противоракови средства. Подходящи молекули за транспорт по метода на настоящото изобретение включват, но не са ограничени до хормони, такива като растежен хормон, антибиотици, противоракови средства и токсини.

Тези и други аспекти на настоящото изобретение, ще бъдат по-добре оценени чрез отпратките към следващите фигури и детайлно описание.

Кратко описание на приложените фигури

Фигура 1А-В. Moriss Water Maze test A. Резултатите от Moris Water Maze теста, извършени при мишки, получаваща или ЕРО или салинен разтвор (SHAM), въвеждан периферно всеки ден. В. Пациенти, получаващи ЕРО, се представят значително по-добре отколкото пациенти, третирани със SHAM. Регресивната линия (R²=0.88) показва наклон (0.68) значително поразличен от наклон 1, отбелязан в полза на ЕРО групата.

Фигура 2А-С. Тест за постигане на вкусово отвращение при определени условия А. Сравнение на периферния SHAM и ЕРО лечение при водна консумация у мишки, подложени на тестване за постигане на вкусово отвращение при определени условия. Водната консумация е изразена в процент на консумирано количество от контролна мишки, която не е заболяла в резултат на третиране с литиев хлорид. В и С показват, че усиленото чрез ЕРО заучаване е стабилно, тъй като ЕРО пациентите понасят много по-голяма жажда при избягване на вода, съдържаща болестно свързан примес, отколкото контролите, прекарали повече време в търсене на вода.

Фигура ЗА-В А. Резултатите от експеримент, който демонстрира, че периферно въведен ЕРО като премедикация, намалява тежестта на припадъка и предпазва мишките от конвулсии и смърт, чрез кайнат невротоксин. Числата в скоби под всяка колона показват броя на животните, получаващи всяка кайнатна доза. В показва, че защитните ефекти от периферно въведения ЕРО нараства при ежедневно въвеждане на ЕРО. С илюстрира, че началното действие на ЕРО е забавено, характерно за индуцирането на генетично изразна програма.

65353 Bl

Фигура 4A-B описва протективния ефект на rhEPO срещу исхемичните мозъчни увреждания (огнищен инсулт). А. Систематично въвеждане на ЕРО, приеман по различно време след настъпване на мозъчна исхемия, намалява големината на инфаркта. В. Сравнение надве форми на ЕРО в защитения от увреждания мозък в този модел: рекомбинантен човешки (rhEPO) и 17 аминокиселинни ЕРО производни (17-mer) илюстрират, че някои ЕРО аналози са неефективни за невропротекция.

Фигура 5 описва протективния ефект на rhEPO срещу мека травма, настъпила в мозъчната кора.

Фигура 6А-В описва протективния ефект на ЕРО от исхемично увреждане на сърцето. А. Креатин киназна активност (СК), индикатор за увреждане на миокардните клетки. В. Миелопероксидазната (МРО) активност е мярка за възпаление.

Фигура 7 показва, че лечението на мишки с ЕРО забавя и редуцира неврологичните симптоми възникнали чрез експериментален алергичен енцефалит, модел намултиплена склероза.

Фигура 8А-В А. Минималната ефективна доза от ЕРО за предвиждане на невропротекция при огнищен инсултен модел създаден у плъхове.

В. Серумни нива на ЕРО в различни времеви точки след 5000 U от rhEPO, въведени интраперитонеално на женска Balb/c мишки.

Фигура 9А-С А. Имунна локализация на ЕРО-R в и около капилярите. В. Биотинизиран ЕРО въведен интраперитонеално на мишки е намерен до 5 h вътре в мозъка непосредствено около капилярите. С. След 17 h белязаният биотин може да бъде намерен вътре в специфичните неврони.

Детайлно описание на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до състави и методи за използване на еритропоетин (ЕРО) за модулиране функцията на възбудимата тъкан, като например повишаване на познавателната функция и предпазване на възбудимите клетки от токсични причинители. В частност изобретението разкрива състави, съдържащи ЕРО, както и методи за тяхната употреба при профилактика и терапевтично третиране, включително и използване на медикаменти. Както е използ вана тук, възбудима тъкан включва, но не е ограничена до, невронна тъкан на централната и периферната нервни системи и сърдечната тъкан.

Изобретението, описано тук разкрива методи за модулиране функцията на възбудима тъкан чрез периферно въвеждане на ЕРО, или активираща ЕРО-рецептор молекула, или молекула, проявяваща активността на ЕРО-активиран рецептор, както и всяка молекула, която миметира активността на ЕРО чрез действие през други, некласически ЕРОрецептори. Без да бъде обвързана с какъвто и да е особен механизъм на действие, такава молекула може да сигнализира чрез ЕРО рецептора, например, да възбуди сигнал на каскадна трансдукция, на края активираща генна изразяваща програма, резултираща в предпазването или повишаването на функцията на възбудима тъкан. Молекули способни за взаимодействие с ЕРО рецептор и модулиращи активността на рецептора, тук споменавани като ЕРО или модулатори на активността на ЕРО рецептор, са от полза в контекста на настоящото изобретение за предпазването или повишаването на функцията на възбудимата тъкан. Тези молекули могат да бъдат, например, естествено срещащи се, синтетични, или рекомбинантни форми на описаните по-горе ЕРО молекули, или други молекули, които не е необходимо да наподобяват на ЕРО по какъвто и да е начин, с изключение да модулира активност на ЕРО рецептор, описано тук. Тези молекули могат да бъдат използвани в комбинации с различно предназначение.

Описаните тук състави и методи могат да бъдат използвани за лечение и/или предпазване както на нормални, така и на патологични тъкани, например, неврони на централната нервна система, неврони на периферната нервна система, или сърдечната тъкан. По-долу са описани полезни за практиката на изобретението ЕРО състави, както и методи за използването на тези ЕРО състави за повишаване функцията на възбудимата тъкан, такава като на заучаване, памет, и други аспекти на познавателната функция. Описани са методи за предпазване на възбудима тъкан от поражение и увреждания. Описано е също по-долу разкриването на неочакваното свойство на ЕРО да преминава през здравите връзки на капилярните ендотелни клетки разкрива методи за предаване на вещества през по

65353 Bl добни бариери. Накрая, са описани състоянията, които могат да бъдат достигнати, използвайки методите на изобретението, и методи за въвеждане и ефективни дози на такива ЕРО състави.

Състави, включващи еритропоетин

ЕРО състави, подходящи за използване в изобретението включват което и да е еритропоетиново вещество, което, когато е въведено периферно, е в състояние да активира ЕРО-активирани рецептори, за да модулират, т.е. да усилват функцията на, да предпазват от увреждания или наранявания, или да предават вещества на, възбудима тъкан. Еритропоетинът е глюкопротеинен хормон, който при хората има молекулно тегло от 34 до 38 kD. Зрелият протеин включва 166 амино киселини, а гликозилните остатъци включват около 40% от теглото на молекулата. Формите на ЕРО полезни за практиката на настоящото изобретение обхващат естествено срещани, синтетични и рекомбинантни форми на следните молекули: еритропоетин, еритропоетинови аналози, еритропоетинови миметици, еритропоетинови фрагменти, хибридни еритропоетинови молекули, еритропоетинови рецептор-свързващи молекули, еритропоетинови агонисти, ренален еритропоетин, мозъчен еритропоетин, негови олигомери и мултимери, негови мутеини, негови родственици. Терминът “еритропоетин” и “ЕРО” може да бъде използван взаимозаменяемо или свързано.

Тук са разкрити синтетични и рекомбинантни молекули, такива като мозъчен ЕРО и ренален ЕРО, рекомбинантните бозайнически форми на ЕРО, както и неговите естествено срещани, туморно производни и рекомбинантни изоформи, такива като рекомбинантно изявени молекули и тези приготвени чрез хомоложни рекомбинации. Освен това, настоящото изобретение включва молекули, включващи пептиди, които свързват ЕРО рецептора, както и рекомбинантни структури или други молекули притежаващи част или всички структурни и/или биологични свойства на ЕРО, включително фрагменти и мултимери на ЕРО или негови фрагменти. Тук ЕРО обхваща молекули с променен ЕРО рецептор свързващ активности, за предпочитане с увеличен рецепторен афинитет, в частност отнасящ се към повишаване транспорта през ендотелно-клетъчните бариери. Тук са включени и мутеини, включващи молекули, които имат допълнителен и на мален брой глюкозилни места. Както беше споменато по-горе термините “еритропоетин”, “ЕРО” и “миметици”, както и другите термини, тук са използвани взаимозаменяемо, за да се отнесат към протективните и усилващи молекули на възбудимата тъкан, отнасящи се до ЕРО, така добре, както и молекулите, които са способни да преминат здравите ендотелни връзки, и като такива те са полезни като предаващи средства за други молекули. Освен това тук също са включени и молекули, получени чрез трансгенетични животни. Би трябвало да се отбележи, че не е необходимо обхванатите тук ЕРО молекули да приличат структурно на ЕРО, или по какъвто и да е друг начин, с изключение на способността да взаимодействат с ЕРО рецептора, или да модулират активността на ЕРО рецептор, или да активират ЕРО активираните сигнализиращи каскади, както е описано тук.

Чрез неограничаващи примери, форми на ЕРО полезни за използването на настоящото изобретение, включват ЕРО мутеини, такива като тези с променени аминокиселини в карбокси окончанието, описано в US 5,457,089 и в US 4,835,260; ЕРО изоформи с различен брой на сиало киселинен остатък за молекула, така както са описани в US 5,856,292; полипептиди, описани в US 4,703,008; агонисти, описани в US 5,767,078; пептиди, които са свързани с ЕРО рецептор така както са описани в US 5,773,569 и US 5,830,851; малки молекули миметици, които активират ЕРО рецептора, така както са описани в US 5,835,382; и ЕРО аналози, описани във WO 1995/005465, WO 1997/018318, и WO 1998/018926. Всички от гореспоменатите цитирания са обединени тук до такава степен, че такива разкрития се отнасят до различни алтернативни форми или процеси за приготовление на такива форми на еритропоетин според настоящото изобретение.

ЕРО може да бъде намерен в търговската мрежа (под търговските марки Procrit, доставян от Ortho Biotech, както и Epogen, доставян от Amgen, Inc., Thousand Oaks, СА).

В следващ вариант на настоящото изобретение, ЕРО молекулите, обхванати тук, включват хибридни ЕРО молекули, които могат да бъдат подготвени да съдържат ЕРО рецептор модулираща активност, както и друга активност, например тази на растежния хормон. Такива хибридни молекули с многочислени обхвати по то7

65353 Bl зи начин притежават свойството да взаимодействат с ЕРО рецептора, както и да притежават активността на други молекули, като например хормон. Методи за приготовление на такива молекули с два обхвата са познати всред специалистите в областта. Както ще бъде описано подетайлно в раздел 5.2.3 по-долу, едно свойство на такива молекули е транспорт през ендотелни клетъчни бариери, осигурени чрез областта, модулираща ЕРО рецепторната активност, както и активността на друга молекула на планирано место.

Всяко от веществата, описани по-горе може да бъде тествано за идентифициране на ЕРО вещества, способни да модулират възбудимата тъкан, т.е. да усилват функцията на, да предпазват от увреждания или наранявания, или да предават вещества там, използвайки изследванията описани тук. Например, ЕРО вещества могат да бъдат тествани за тяхната способност да усилват функцията на възбудимата тъкан, такава като заучаване, памет, и други аспекти на познавателната функция, използвайки описаните методи. Примери за in vivo изследване на познавателната функция включват Morris Water Maze Теста, пример от който е описан, и Теста за постигане на вкусово отвращение при определени условия, пример от който е описан по-долу. В допълнение, ЕРО веществата, описани по-горе, могат да бъдат тествани използвайки изследванията описани в раздел 5.2.2 за идентифициране на ЕРО вещества способни да предпазват възбудимата тъкан от увреждания и наранявания. Примерите, описани по-долу осигуряват специфични примери от такива изследвания. ЕРО веществата могат да бъдат изследвани също за тяхната възможност да предават вещества през здравите ендотелни връзки, такива като кръвно-мозъчната бариера, използвайки опити като тези описани по-долу. По такъв начин ЕРО веществата, подходящи за използване в изобретението включват някои и всички вещества, които, когато са въведени периферно, са способни сигнализирайки през ЕРО активирани рецептори да модулират възбудимата тъкан, т.е. повишаване на функцията на, предпазване от увреждания и наранявания, или да предат на вещества там.

Методи за профилактика и терапевтично използване на изобретението

В различни варианти на изобретението

ЕРО съставите могат да бъдат използвани за предпазване на възбудимата тъкан от увреждане или хипоксичен стрес, усилвайки функцията на възбудимата тъкан, или за предаване на вещества през здравите ендотелни връзки на възбудимата тъкан. Както е описано по-горе, изобретението е базирано, отчасти, на откритието, че ЕРО молекулите могат да бъдат транспортирани от светлата повърхност към повърхността на базалната мембранна повърхност на ендотелните клетки на капилярите на органи със здрави ендотелно клетъчни връзки, включително, например, мозъка, ретината и тестисите. Когато не е желателно да бъде обвързано с някоя специална теория, след трансцитозата на ЕРО, ЕРО може да взаимодейства с ЕРО-рецептор на възбудима тъкан, като например, невроние в централната нервна система, периферната нервна система, или сърдечната тъкан и рецепторното свързване може да отключи сигнална каскадна трансдукция, резултираща в активиране на генетичния израз на програмата вътре във възбудимата тъкан, резултираща в предпазване на клетките от увреждане, като невротоксини, хипоксия и др. По този начин тук по-долу са описани в по-големи подробности методи за предпазване на възбудимата тъкан от увреждане или хипоксичен стрес, усилвайки функцията на възбудима тъкан и предавайки на вещества през здравите връзки на възбудимата тъкан.

Методи за повишаване функцията на възбудимата тъкан

В един аспект настоящото изобретение е насочено към метод за повишаване функцията на възбудимата тъкан чрез въвеждане на ЕРО молекула, способна да активира генетично изразната програма, която повишава функцията на възбудимата тъкан. Повишаването на функцията на възбудимата тъкан води до подобряване на заучаването, асоциативното заучаване и паметта. Различни заболявания и състояния са податливи на лечение по този метод, и освен това този метод е полезен за повишаване на познавателната функция, при отсъствие на каквото и да е състояние или заболяване. Тези приложения на настоящото изобретение тук по-долу са описани подетайлно и включват подобряване на заучаването и обучението, както при човешки, така и при нечовешки бозайници.

Състоянията и заболяванията лечими по

65353 Bl методите в този аспект на настоящото изобретение, включват всякакви състояния и заболявания, които могат да се повлияят при повишаване на невронната функция. Примери за такива разстройства, включват разстройства на централната нервна система, включително, но не ограничено до, разстройства в настроението, чувство на, депресия, аутизъм, дефицит на вниманието при хиперактивни разстройства, и познавателна дисфункция. Други неограничаващи примери на познавателните функции, които могат да бъдат повишени при използване на методите от изобретението, са описани.

В един вариант, например, ЕРО молекулата може да бъде въведена на индивид или пациент, който страда от разстройства резултиращи в загуба на познавателните функции, като, например, болестта на Алцхаймер.

Способността на ЕРО да повишава познавателните функции може да бъде тествано у експериментални животни, използвайки който и да е от описаните тук методи, или каквото и да е друго познание, прието в тази област, или модел на познавателна функция. Както е описано в примерите, периферно въведеният еритропоетин е намерено, че повишава заучаването и познавателната функция, както е демонстрирано чрез няколко утвърдени модела на заучаване у нормални експериментални животни. Примери за такива модели на заучаване са Morris water maze теста, пример от който е даден в раздел 6 и в Теста за постигане на вкусово отвращение при определени условия (СТА), пример, който е описан. В един вариант, например, Теста за постигане на вкусово отвращение при определени условия (СТА), който е един много чувствителен и добре известен стандартен тест, е използван за тестване на познавателната функция у животни след въвеждането на ЕРО. СТА е използван за тестване способността на животни за заучаване да свързват болест с нови влияния, такива като вкус, така че животните да избягват новия вкус като последствие от повторно подлагане на новото влияние. СТА въвлича мозъка на различни кортикални и субкортикални нива. Асоциацията, която свързва асцендентната и десцендентна информация една към друга, предизвиквайки поведение на неохота, може да бъде атенюирана или усилена чрез промени афектиращи която и да било от взаимносвързващите единици. Като форма на асоциативно заучаване, силата на СТА е детерминирана чрез голям брой от променливи, включващи новост на орален стимул (т.е. познат стимул не може да бъдат възприеман с неохота), степен на причиняване на “заболяване” (токсичност), брой на повторенията (обучение), отблъскващи инстинкти (такива като жаждата), като тук са назовани малко. Въпреки, че голямо разнообразие на химични и физични агенти може да продуцира СТА по начин, зависещ от дозата, литиевият хлорид със сигурност предизвиква прилошаване и анорексия. Също както естествено проявяващите се заболявания, литиума причинява СТА чрез стимулиране на пътищата описани по-горе, включително и чрез освобождаване на цитокин.

Повишаването на функцията на възбудимите клетки, например познавателната функция, предлага много предимства за индивидите в сферата на възпитателната и работната дейност, както и за засилване способността за трениране и обучение на нечовешки бозайници.

Методи за предпазване на възбудимата тъкан от увреждане

В друг вариант, настоящото изобретение е насочено към метод за предпазване на бозайник от патология, получена в резултат на увреждане на възбудимата тъкан. Предвижда се предпазване чрез въвеждане у бозайник по периферен път на въвеждане на такова количество отхеритропоетин, което е ефективно, за да предпази възбудимата тъкан от увреждане. Така както е показано подробно по-долу, ЕРО въведен преди токсичен кайнат, е подчертано невропротективен у мишки, повишавайки прага на припадъка и предпазвайки от смърт. Невропротективният ЕРО ефект е широк и траен. За отбелязване е, че тук забелязаните позитивни ефекти настъпват в рамките на твърде кратко време свързано с въвеждането на ЕРО, за да бъдат в резултат от нарастване в хематокрита като следствие на еритропоетинната активност на ЕРО. Освен това, както е посочено по-горе, вариант на настоящото изобретение обхваща ЕРО, който губи свойството да увеличава хематокрита.

В един вариант, настоящото изобретение може да бъде използвано предимно за профилактика и лечение на остри и хронични неврологични разстройства, както са описани тук, така и за усилена познавателна функция на нор

65353 Bl малния или увредения мозък. Както е отбелязано по-горе, увреждане и смърт на невроните в централната нервна система е сериозно и често пъти с летален изход явление, отговорно за висока степен на заболеваемост и смъртност у населението. Остро неврологично увреждане може да настъпи по време на или като резултат на припадъци, конвулсии, епилепсия, инсулт, хеморагия, увреждане на централната нервна система, хипоксия, хипогликемия, хипотония и мозъчна или гръбначно-мозъчна травма. Настоящото изобретение е предвидено и за спешно въвеждане при лечение наакутни състояния.

В един вариант, например, методите на изобретението могат да бъдат използвани за предпазване на бозайници от поражение, получено от лъчево увреждане на мозъка.

В друг вариант сериозно състояние, лечимо и предотвратимо в съответствие с настоящото изобретение, е профилактиката и лечението in utero на състоянията на пренатапна хипоксия, послеродово лечение за предпазване на мозъка от хипоксично увреждане настъпило по време на раждането, както и при задушаване, давене и други състояния, при които централната нервна система е в риск от невротоксично увреждане като резултат от липса на кислород или излагане на други невротоксични влияния. Както е добре известно, индивидите, които страдат от хипоксия по време на раждане, или като последствие от нефатални хипоксични злополуки или инциденти, могат да страдат дълго време от неврологичен дефицит. Хипоксия и/или прекратяване на мозъчното кръвообръщение, което може да настъпи след травма или по време на хирургични процедури, носи също риск от причиняване на продължителен неврологичен дефицит.

Постоперативната познавателна дисфункция, включително дефицити вследствие на използване на апарат сърце-бял дроб, са също лечими по методите предвидени тук. Освен това, настоящите методи могат да бъдат приложени за лечение на хипоксия получена като резултат от отравяне с въглероден окис или инхалиране на пушек.

В друг вариант ЕРО е използван за предпазване на сърдечната тъкан от увреждане, настъпило по време на исхемия, инфаркт, възпаление или травма.

Това са неограничаващи примери на ув реждане на възбудима тъкан, лечима в съответствие с настоящото изобретение. Спешно и ранно лечение на тези разстройства може да бъде осигурено от подвижна спешна медицинска помощ осъществена от професионалисти, така че такова лечение може да започне много скоро след като подозрението за потенциално неврологично увреждане е потвърдено. Рискът от неврологично увреждане, получено при раждане може да бъде намален чрез профилактично лечение на фетуса, преди или по време на раждането. Тези и други ползи и ситуации ще бъдат оценени от специалистите в областта.

Методи за предаване на вещества

Настоящото изобретение е насочено освен това и към метод за улесняване на транспорта на молекули през ендотелно клетъчната бариера у бозайници чрез въвеждане на състав, който включва определена молекула в асоциация с еритропоетин. Както беше отбелязано по-горе, изобретателите разкриват неочакваната и изненадваща до този момент активност на периферно въведен ЕРО във възбудима тъкан, такава като нервна тъкан в централната нервна система, периферната нервна система или сърдечна тъкан, идентифицирайки ЕРО като молекула, способна да преминава здравите връзки на такава възбудима тъкан, такава като кръвно-мозъчната бариера. Като такъв ЕРО е полезен като носител за пренасяне на други молекули през кръвномозъчната и други подобни бариери.

В един вариант, ЕРО рецептор свързаните молекули, включващи молекули конюгирани към ЕРО молекулата, могат да бъдат използвани за транспортиране на тези молекули през кръвномозъчната бариера. Такива молекули могат по този начин да бъдат пренасяни върху ЕРО при преминаване през кръвно-мозъчната бариера. В друг вариант, антитялото или друг свързан към молекулата партньор, могат да бъдат асоциирани с ЕРО, или с модулатор на активността на ЕРО рецептора, по такъв начин асоциирайки молекулата, която трябва да бъде транспортирана, чрез нековалентна връзка към свързващия партньор, който по-нататък е асоцииран с транспортираща ЕРО молекула. В друг вариант ЕРО рецептор-свързващите молекули, включващи антитела в ЕРО рецептор, са полезни за метода, описан тук. Такива антитела осигуряват транспортен носител, върху който други молекули мо

65353 Bl гат да се прикачат, по същия начин, по който антителата на трансферин рецептора са използвани, за да се получи достъп през кръвно-мозъчната бариера. (Pardridge et al., 1991, Selective transport of an antitransferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J. Pharmacol. Exp. Therap. 27:66).

Специалистът в областта има ясна представа за различни средства за асоцииране на молекулите с ЕРО и задругите агенти описани погоре, чрез ковалентни, нековалентни и други средства; освен това преценяването на ефикасността на състава може да бъде лесно детерминирано, в експериментална система. Асоциирането на молекули с ЕРО и аналози може да бъде постигнато чрез всякакъв брой средства, включително лабилно ковалентно свързване, прекръстосано свързване и др. В един вариант, например, асоциацията между молекулата, която трябва да бъде транспортирана през бариерата и еритропоетина може да бъде лабилна ковалентна връзка, в който случай молекулата е освободена от асоциирането с ЕРО след преминаване на бариерата. В един вариант може да бъде използвано взаимодействие биотин/авидин. В друг вариант, както беше споменато по-горе, хибридна молекула може да бъде приготвена чрез рекомбинантни или синтетични средства, например, които включват и двете области на молекулата, тази с желана фармакологична активност и тази, която е отговорна за модулирането на активността на ЕРО рецептора.

Молекулата може да бъде конюгирана към ЕРО или модулатор на активността на ЕРО рецептор посредством полифункционална молекула, т. е. полифункционална прекръстосана връзка. Използваният тук термин “полифункционална молекула” обхваща молекули, притежаващи една функционална група, която може да реагира повече от един път последователно, такива като формалдехида, както и молекули с повече от една реактивна група. Използваният тук термин “реактивна група” се отнася към функционална група на прекръстосана връзка, която взаимодейства с функционална група на молекула (например пептид, протеин, въглехидрат, нуклеинова киселина, в частност хормон, антибиотик или противораков агент, за да бъде предаден през ендотелно клетъчната бариера), така че да се формира ковалентна връзка между пре кръстосаната връзка и тази молекула. Терминът “функционална група” запазва стандартното си значение от органичната химия. Полифункционалните молекули, които могат да бъдат използвани, са за предпочитане биосъвместими връзки, т.е. те са некарциногенни, нетоксични и субстратно неимуногенни in vivo. Полифункционалните прекръстосани връзки, като тези познати в областта и описани тук, могат да бъдат лесно тествани у животински модели, за да се определи тяхната биосъвместимост. Полифункционалната молекула е за предпочитане биофункционална. Използваният тук термин “бифункционална молекула” се отнася към молекула с две реактивни групи. Бифункционалната молекула може да бъде хетеробифункционална или хомобифункционална. Хетерофункционалната прекръстосана връзка се има предвид при свързване с носител. Особено е за предпочитане полифункционалната молекула да бъде достатъчно разтворима във вода, за да се проявят реакциите на прекръстосани връзки във водни разтвори, като например във водни разтвори, буферирани на pH 6 до 8, и след полученото конюгиране да остане водно разтворима за по-ефективна биодистрибуция. Обикновено полифункционалната молекула прави ковалентни връзки с амино или сулфхидрилна функционална група. Обаче, в настоящото изобретение са мислени полифункционални молекули, реагиращи с други функционални групи, като например карбоксилни киселини или хидроксилни групи.

Хомобифункционалните молекули имат поне две реактивни функционални групи, които са еднакви. Реактивните функционални групи в хомобифункционалната молекула включват, например, алдехидни групи и активни естерни групи. Хомобифункционални молекули, имащи алдехидни групи включват, например глутаралдехида и субаралдехида. Използването на глутаралдехида като прекръстосващ връзки агент беше разкрито от Poznansky et al., Science 223, 1304-1306 (1984). Хомобифункционални групи, имащи поне до две активни естерни единици, включват естери на дикарбоксилните киселини и N-хидроксисуксинимид. Някои примери на такива N-суксинимидил естери включват дисукцинимидил суберат и дитиоби(суксинимидил пропионат), и тяхната разтворима бисулфонна киселина и бисулфонатни соли, като например те

65353 Bl зи на натриевите и калиеви соли. Тези хомобифункционални реагенти могат да се намерят от Pierce, Rockford, Illinois.

Хетеробифункционалните молекули имат най-малко две различни реактивни групи. Реактивните групи реагират с различни функционални групи, например присъстващи в ЕРО и в молекулата. Тези две различни функционални групи, които реагират с реактивната група в хетеробифункционалния прекръстосваща връзка, са обикновено амино група, например епсилон амино групата на лизин; сулфхидрилна група, например тиолната група на цистеина; карбоксилна киселина, например карбоксилата в аспартиновата киселина; или хидроксилна група, например хидроксилната група на серина.

Когато реактивна група на хетеробифункционална молекула формира ковалентна връзка с аминогрупа, обикновено ковалентната връзка ще бъде амидо или имидо връзка. Реактивната група, която формира ковалентна връзка с аминогрупи, може например да бъде активирана карбоксилна група, халокарбонилна група, или естерна група. Предпочитаната халокарбонилна група е хлорокарбонилна група. Естерните групи са за предпочитане реактивни естерни групи, като например N-хидроксисуксинимидна естерна група.

Другата функционална група обикновено е или тиолна група, група способна да бъде конвертирана в тиолна група, или е група, която формира ковалентна връзка с тиолна група. Ковалентната връзка ще бъде обикновено тиоетерна връзка или дисулфид. Реактивната група, която формира ковалентна връзка с тиолова група, може, например, да бъде двойна връзка, която реагира с тиолови групи или активиран дисулфид. Реактивна група, съдържаща двойна връзка, способна на реагиране с тиолова група, е малеймидовата група, въпреки, че и други, като тези на акрилонитрила, са също възможни. Реактивна дисулфидна група може, например, да бъде 2-пиридилдитио група или 5,5'-дитио-би-(2нитробензоева киселина) група. Някои примери на хетеробифункционални реагенти, съдържащи реактивни дисулфидни връзки включват N-суксинимидил 3-(2-пиридилдитио) пропионат (Carlsson et al., 1978, Biochem J., 173:723-737), натриев 5-4-суксинимидилоксикарбонил-алфаметилбензилтиосулфат, и 4-суксинимидилокси карбонил-алфа-метил(2-пиридилдитио)толуин. N-суксинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат е за предпочитане. Някои примери на хетеробифункционални реагенти, включващи реактивни групи, имащи двойна връзка, която реагира с тиолова група включват суксинимидил 4-(1Ч-малеймидометил)циклохексан-1-карбоксилат и суксинимидил т-малеймидобензоат.

Други хетеробифункционални молекули включват суксинимидил 3-(малеймидо)пропионат, сулфосуксинимидил 4-(р-малеймидофенил)бутират, сулфосуксинимидил 4-(N-Maлеймидометил-циклохексан)-1 -карбоксилат малеймидобензоил-М-хидроксисуксинимид естер. Натриево сулфонатната сол на суксинимидил тмалеймидобензоата е предпочитана. Много от цитираните по-горе хетеробифункционални реагенти и техните сулфонатни соли са налични при Pierce.

Нуждата от описаните по-горе конюгирани да бъдат обратими или лабилни, може да бъде лесно определена от специалиста в областта. Конюгацията може да бъде тествана in vitro както за активността на модулацията на ЕРО рецепторната активност, така и за желаната фармаколотична активност. Ако конюгацията притежава и двете свойства, нейната пригодност може да бъде тогава тествана in vivo. Ако конюгираната молекула се нуждае от отделяне от ЕРО за активност, лабилна връзка или обратимото асоцииране с ЕРО ще бъдат предпочетени. Характеристиките за лабилност могат също да бъдат тествани, използвайки стандартните in vitro процедури, преди in vivo тестването.

Допълнителна информация по отношение това как да се направят и използват тези, както и други полифункционални реагенти, могат да бъдат получени от следните публикации или други налични в областта: Carlsson et al., 1978, Biochem. J. 173:723-737; Cumber et al., 1985, Methods in Enzymology 112;207-224; Jue et al., 1978, Biochem., 17:5399-5405; Sun et al., 1974, Biochem. 13:2334-2340; Blattler et al., 1985, Biochem. 24:1517-152; Liuetal., 1979, Biochem. 18:690-697; Youle and Neville., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:5483-5486; Lerner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3403-3407; Jung and Moroi, 1983, Biochem. Biophys. Acta. 761-162; Caulfield et al., 1984, 81:7772-7776; Staros, J.V., 1982, Biochem. 21:3950-3955;

65353 Bl

Yoshitaki et al., 1979, Eur. J. Biochem. 101:395399; Yoshitaki et al., 1982,92:1413-1424; Pilch and Czech, 1979, J. Biol. Chem. 254:3375-3381; Novick et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487; Lomant and Fairbanks, 1976, J. Mol. Biol. 104:243261; Hamada and Tsuruo, 1987, Anal. Biochem. 160:483-488; and Hashida, 1984, J. Applied Biochem. 6:56-63. В допълнение методите за прекръстосване на връзки са разгледани от Means и Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1:2-

12. Бариерите, които се преминават чрез описаните по-горе методи и състави на настоящото изобретение включват, но не са ограничени до кръвно-мозъчната бариера, кръвно-очната бариера, кръвно-тестисната бариера, кръвно-овариалната бариера, и кръвно-плацентната бариера.

Кандидат молекули за транспорт през ендотелно-клетъчната бариера включват, например, хормони, като растежния хормон, невротрофични фактори, антибиотици или противогъбични средства, като например тези, които нормално се изключват от мозъка и други бариерни органи, пептидни радиофармацевтици, обезболяващи лекарства, антитела срещу биологично активни агенти, фармацевтици, и противоракови агенти. Неограничен брой примери от такива молекули включват растежен хормон, нервен растежен фактор (NGF), мозъчно-извлечен невротрофичен фактор (BNF), цилиарен невротрофичен фактор (CTF), базален фибробластен растежен фактор (bFGF), трансформиран растежен фактор бета1 (TGF6eral), трансформиран растежен фактор бета2 (TGF6eTa2), трансформиран растежен фактор бетаЗ (TGF6eTa3), интерлевкин 1, интерлевкин 2, интерлевкин 3, и интерлевкин 6, AZT, антителен против туморна некроза фактор, и имуносупресивни агенти като например циклоспорин.

В друг вариант рекомбинантни химерен токсин молекули, включващи ЕРО могат да бъдат използвани за терапевтично предаване на токсини за лечение на вирусни разстройства или пролиферативни разстройства, като например рака. Вещества, които биха могли да бъдат съединени към ЕРО за създаване на химерен токсин, подходящи за това изпълнение на изобретението, включват, между другите, но не са ограничени до, токсични субстанции, като например псевдомонас екзотоксин, дифтериен токсин, и рицин.

Прицелни условия

Както беше описано по-горе, ЕРО състави и методи за тяхната употреба, разкрити тук, могат да бъдат използвани за лечение и предпазване на състояния, възникващи при хипоксични условия, които по обратен ред повлияват на възбудимите тъкани, като например възбудимите тъкани в тъканта на централната нервна система, тъканта на периферната нервна система, или сърдечната тъкан, като например мозък, сърце или ретина.

Затова изобретението може да бъде използвано за лечение или предпазване от увреждане на възбудимата тъкан, получени в резултат на хипоксични условия при разнообразие от условия и обстоятелства. Неограничаващи примери от такива условия и обстоятелства са разкрити тук по-долу.

Като примера за предпазване от невронно тъканни патологии, лечими в съответствие с настоящото изобретение, такива патологии включват тези, които са в резултат на намалена оксигенация на нервните тъкани. Всяко условие, което намалява наличността на кислород към невронната тъкан, в резултат на стрес, увреждане, и на края невронна клетъчна смърт, може да бъде лекувано по методите на настоящото изобретение. Обикновено отнасящи се до хипоксия и/или исхемия, тези състояния възникват от или включват, но не са ограничени до инсулт, васкуларно запушване, пренатална или постнатална липса на кислород, задушаване, шок, състояние преди удавяне, отравяне с въглероден окис, инхапиране на дим, травма, включително хирургична и лъчетерапия, асфиксия, епилепсия, хипогликемия, хронична обструктивна белодробна болест, емфизема, ихателен дистрес синдром у възрастни, хипотоничен шок, септичен шок, анафилактичен шок, инсулинов шок, сърповидно-клетъчна криза, сърдечен стоп, дисритмия и азотна наркоза.

В един вариант, например, ЕРО може да бъде въведен за предпазване от поражение, или тъканно увреждане като резултат при риск от поражение, или тъканно увреждане по време на хирургични процедури, такива като например резекция на тумор или възстановяване при аневризма.

Други патологии причинени или в резултат на хипогликемия, които сатретируеми по ме

65353 Bl тодите описани тук, включват свръхдоза инсулин, също споменавана като ятрогенната хиперинсулинемия, инсулинома, дефицит на растежен хормон,хипокортицизъм, медикаментна свръхдоза и някои тумори.

Други патологии в резултат на увреждане на възбудимата невронна тъкан включват разстройства при припадъци, като епилепсия, конвулсии, или хронични разстройства при припадъци. Други лечими състояния и заболявания включват такива заболявания като например инсулт, мултиплена склероза, хипотония, сърдечен стоп, болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон, церебрална парализа, мозъчна или гръбначна-мозъчна травма, деменция при СПИН, загуба на познавателната функция свързана със възрастта, загуба на паметта, амиотрофична латерална склероза, разстройства при припадъци, алкохолизъм, ретинална исхемаия, увреждане на очния нерв в резултат на глаукома и загуба на неврони.

Методите на изобретението могат да бъдат използвани за лечение на състояния и увреждания на тъканите на ретината. Такива разстройства включват, но не са неограничени до макуларна дегенерация, отлепване на ретината, пигментозен ретинит, атеросклеротична ретинопатия, хипертонична ретинопатия, блокаж на ретиналната артерия, блокаж на ретиналната вена, хипотония, и диабетична ретинопатия.

В друг вариант методите на изобретението могат да бъдат използвани за предпазване или лечение на поражения в резултат на радиационно увреждане на възбудимата тъкан.

Следваща полезност на методите от настоящото изобретение е при лечение на невротоксично отравяне, като например при отравяне с домоична киселина от ракообразни, невролатиризъм, и болест на Guam, амиотрофична латерална склероза и болест на Паркинсон.

Както беше споменато по-горе, настоящото изобретение е насочено също към метод за повишаване функцията на възбудимата тъкан у бозайници чрез периферно въвеждане на еритропоетин. Различни болести и състояния са податливи на лечение, използвайки този метод, и освен това този метод е от полза за повишаване познавателната функция в отсъствие на каквито и да е състояния и заболявания. Тези използвания на настоящото изобретение са описани в по големи подробности по-долу, и включват подобряване на заучаването и обучаването както при човешки, така и при нечовешки бозайници.

Състояния и заболявания лечими чрез методите в този аспект на настоящото изобретение насочени към централната нервна система, включват, но не са ограничени до, разстройства в настроението, страхови разстройства, депресия, аутизъм, разстройства, свързани с дефицит на вниманието при хиперактивност, и познавателна дисфункция. Тези състояния се благоприятстват при усилването на невронната функция.

Други разстройства, лечими в съответствие с доктрината на настоящото изобретение, включват прекъсвания на съня, например апнеа при сън и разстройства, свързани с пътувания; субарахноидални или аневризмални кръвоизливи, хипотоничен шок, контузионни увреждания, септичен шок, анафилактичен шок, и усложнения от различни енцефалити и менингити, например съединително-тъканно заболяване, свързано с церебрит както при лупус. Други използвания включват предпазване от отравяне с невротоксини, като например отравяне с домоична киселина от ракообразни, невролатеризъм, и болест на Guan, амиотрофична латерална склероза, болест на Паркинсон; постоперативно лечение на увреждания при емболия и исхемия; цялостно мозъчно облъчване; сърповидно-клетъчна криза; и еклампсия.

Следваща група от състояния, лечими чрез методите на настоящото изобретение, включва митохондриална дисфункция от наследствено или от придобито естество, които са причина за множество неврологични заболявания свързани невронно увреждане и смърт. Например, болест на Leigh (субакутна некротична енцефалопатия) се характеризира с прогресивна загуба на зрение и енцефалопатия, дължащи се на невронен спад и миопатия. В тези случаи дефектният митохондриален метаболизъм намалява снабдяването с достатъчно високи енергийни субстрати за зареждане на метаболизма на възбудимите клетки. Модулатор на активността на ЕРО рецептора оптимизира липсващата функция в множество митохондриални заболявания.

Както беше споменато по-горе, хипоксични състояния засягат неблагоприятно възбудимите тъкани. Възбудимите тъкани включват, но не са лимитирани до, тъкани на централната нер

65353 Bl вна система, тъкани на периферната нервна система, и сърдечната тъкан. В допълнение към условията, описани по-горе, методите от настоящото изобретение са полезни при лечението на инхалирани отравяния, като например въглероден окис и инхалиране на пушек, остра астма, дихателен дистрес синдром у възрастни, шок и състояние преди удавяне. Следващи условия, които създават хипоксични състояния, или чрез други средства причиняват увреждане на възбудимата тъкан, включват хипогликемия, която може да настъпи при неправилно дозиране на инсулин, или при инсулин-произвеждащите неоплазми (инсулином).

Множество невропсихологични разстройства, които са приемани, че произлизат при увреждане на възбудимата тъкан, са лечими чрез спешни методи. Хронични разстройства, при които може да се достигне до невронно увреждане, и чието лечение е разкрито в настоящото изобретение, включват разстройства свързани с централната нервна система и/или периферната нервна система, включително възрастово обусловена загуба на познавателната функция и сенилна деменция, разстройства при хронични припадъци, болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон, деменция, загуба на паметта, амиотрофична латерална склероза, мултиплена склероза, туберозна склероза, болест на Wilson, церебрална и прогресивна супрануклеарна парализа, болест на Guam, Lewy телесна деменция, прион заболявания като например спонгиформени енцефалопатии, например болест на Creutzfeldt Jakob, болест на Huntington, миотонична дистрофия, атаксия на Freidrich и други атаксии, както и синдрома на Gilles de la Tourette, разстройства при припадъци, такива като епилепсия и хронични припадъчни разстройства, инсулт, мозъчна или гръбначно-мозъчна травма, СПИН деменция, алкохолизъм, аутизъм, исхемия на ретината, глаукома, автономни функционални разстройства като хипертония и разстройства на съня, както и нервнопсихиатрични разстройства, които включват, но не се ограничават до, шизофрения, шизоафективни разстройства, разстройство при дефицит на вниманието, дистимно разстройство, голямо депресивно разстройство, мания, разстройства при обземаща натрапчивост, разстройства при употреба на психоактивни вещества, безпокойство, паническо разстройство, както и униполарни и биполарни афективни разстройства. Допълнителни невропсихиатрични и невродегенеративни разстройства включват, например, тези включени в American Psychiatric Association’s Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders (DSM), найобщоприетата версия от които е интегрирана тук чрез цялостното им споменаване.

В друг вариант рекомбинантни химерно токсични молекули, обхващащи ЕРО могат да бъдат използвани за терапевтично предаване на токсини за лечение на пролиферативни разстройства, такова като рака или вирусни разстройства, какъвто е субакутния склерозиращ паненцефалит.

Фармацевтични препарати и въвеждане

Съгласно изобретението, ЕРО, неговите аналози, миметици, еритропоетинови фрагменти, хибридни еритропоетинови молекули, еритропоетин рецептор свързващи молекули, еритропоетин агонисти, ренален еритропоетин, мозъчен еритропоетин, негови мутеини, негови конгенери могат да бъдат въведени парентерално, трансмукозно, например през устата, през носа, ректално, интравагинално, сублингвално, субмукозно или трансдермално. За предпочитане въвеждането е парентерално, например чрез интравенозно или интраперитонеално инжектиране, а също включително, но не ограничено до, интраартериално, интрамускулно, интрадермално и субкутанно въвеждане. Предпочитаният начин за въвеждане на малки молекули ЕРО миметици е оралния път.

Субектът, у когото периферното въвеждане на ЕРО е ефективно терапевтичен режимент, е за предпочитане човек, но може да бъде което и да е животно, за предпочитане бозайник. По такъв начин, както може да бъде лесно оценено от някой обикновен специалист в областта, методите и фармацевтичните състави в настоящото изобретение са по-специално подходящи за въвеждане у всяко животно, по-специално у бозайници, и включително, но не ограничени до, домашни животни, като котки или кучета, животни от ферми, такива като, но не ограничено до, говеда, коне, кози, пилета и свине, диви животни (от дивата природа или от зоологическа градина), опитни животни, като мишки, плъхове, зайци, кози, овце, прасета, кучета, котки и др. Както беше отбелязано по-горе, домашни

65353 Bl животни, включително домашни любимци и работни животни, са кандидати за невропротективните предимства на настоящото изобретение, както и за повишаването на познавателната функция. Неврологично увреждане, възникнало при хипоксия, и както и остри и хронични разстройства, включително епилепсия, са разпространени сред такива животни и така са кандидати за лечение. Също така както беше отбелязано по-горе, познавателното подобрение у животни, е предимството на настоящото изобретение, състоящо се в това, че заучаването, упражнението, и задържането на заученото поведение може да се усили, подсили отново, и да се задържи, използвайки наученото от настоящото изобретение. Като такива разходи и психологичното напрежение у собствениците на домашни любимци са намалени. Например, необходимото време за обучение на кучета и други домашни животни е намалено. Освен това, дивите животни, обикновено трудно поддаващи се на обучение, могат да се подлагат на обучение чрез методите на настоящото изобретение.

Формулировка и ефективна доза

Настоящото изобретение разкрива също фармацевтични състави. Фармацевтични състави, включващи ЕРО и модулатори на активността на ЕРО рецептор могат да бъдат въведени на пациент в терапевтично ефективни дози за предпазване на възбудимата тъкан от увреждане, за усилване функцията на възбудимата тъкан, или за доставяне на вещество на възбудимата тъкан. Заявителите са открили, че повишена доза на ЕРО е предпочитана при модулиране на възбудима тъкан, и освен това при предпазване против увреждане.

Селекцията на предпочитаната ефективна доза ще бъде определена от специалист в областта на базата на взети предвид няколко фактора, които ще бъдат известни на един обикновен специалист в областта. Такива фактори включват специалната форма на еритропоетин и нейните фармакокинетични параметри като бионаличност, метаболизъм, полуживот, и др., които биха били установени по време на обичайните процедури обикновено прилагани при получаване на регулаторно одобряване на фармацевтично съединение. Следващи фактори по отношение на дозата включват състоянието или заболяването, които трябва да се лекуват, или подобрението, което трябва да се постигне у нормален индивид, телесната маса на пациента, пътя на въвеждане, дали въвеждането е акутно или хронично, съпътстващи медикации, и други фактори, добре известни по отношение ефикасността на въведените фармацевтични агенти. По такъв начин прецизното дозиране би било решено в съответствие с преценката на практикуващия и всички обстоятелства, касаещи пациента, например свързани със състоянието и имунния статус на отделния пациент, в съответствие със стандартните клинични техники.

В един вариант изобретението разкрива фармацевтичен състав във форма на единица за дозиране, адаптирана за модулиране на възбудимата тъкан, за повишаване на познавателната функция или за пренасяне на вещества през здравите ендотелни връзки, който включва, на единица за дозиране, ефективно не токсично количество в интервала от около 50,000 до 500,000 Единици, 60,000 до 500,000 Единици, 70,000 до 500,000 Единици, 80,000 до 500,000 Единици, 90,000 до 500,000 Единици, 100,000 до 500,000 Единици, 150,000 до 500,000 единици, 2000,000 до 500,000 Единици, 250,000 до 500,000 Единици, 300,000 до 500,000 Единици, 350,000 до 500,000 Единици, 400,000 до 500,000 Единици, 450,000 до 500,000 Единици от модулатор на активността на ЕРО рецептор, или модулатор на ЕРО-активиран рецептор и фармацевтично приемлив носител. В предпочитан вариант ефективното нетоксично количество от ЕРО е в интервала от около 50,000 до 500,000 Единици.

В един вариант такъв фармацевтичен състав на ЕРО може да бъде въвеждан систематично за предпазване на възбудимата тъкан от увреждане, за повишаване функцията на възбудимата тъкан, или за пренасяне на вещество до възбудимата тъкан. Такова въвеждане може да бъде парентерално, трансмукозно, например през устата, през носа, ректално, интравагинално, сублингвално, субмукозно, или трансдермално. Предпочитаното въвеждане е парентерално, например чрез интравенозно или интраперитонеално инжектиране, и включително също, но неограничено до, интраартериално, интрамускуларно, интрадермално и субкутанно въвеждане.

В предпочитан вариант ЕРО може да бъде въвеждан систематично в дозиране между 2000 10,000 Единици/kg телесно тегло, за предпочи

65353 Bl тане около 2,000 - 5,000 Единици/kg телесно тегло, най-много предпочитано 5,000 Единици/ kg телесно тегло, на въвеждане. Тази ефективна доза би била достатъчна да осигури серумно ниво на ЕРО, по-голямо от около 10,000, 15,000 или 20,000 mU/ml в серума след въвеждането на ЕРО. Такива серумни нива могат да бъдат достигнати за около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 h след въвеждането. При необходимост такива дозирания могат да бъдат повторени. Например, въвеждането може да бъде повтаряно ежедневно, толкова дълго, колкото е клинически необходимо, или след подходящ интервал, например всяка 1 до 12 седмици, за предпочитане всеки 3 до 8 седмици. В един вариант ефективното количество от ЕРО и фармацевтично приемлив носител могат да бъдат опаковани в ампула за една доза или друг контейнер. В един вариант ЕРО е нееритропоетичен, т.е. той е способен на упражняване активностите, описани тук, но не причинява повишаване в хемоглобинната концентрация или хематокрита. В друг вариант ЕРО е взет в доза по-голяма от необходимото за да се стимулира максимално еритропоезата.

Фармацевтичните състави в изобретението могат да включат терапевтично ефективно количество от вещество и фармацевтично приемлив носител. В специфично изпълнение терминът “фармацевтично приемлив” означава одобрение от контролиращата агенция на федералния или щатското правителство, или включено във Фармакопеята на Съединените щати, или друга принципно призната фармакопея за употреба при животни, и по-специално при хора. Терминът “носител” се отнася за разтворител, адювант, добавка, или вехикулс, с които терапевтикът е въведен. Такива фармацевтични носители могат да бъдат стерилни течности, такива като салинни разтвори във вода или масла, включително тези с петролен, животински, растителен или от синтетичен произход, такова като фъстъчено олио, соево олио, минерално олио, сусамово олио и други подобни. Салинният разтвор е предпочитан носител, когато фармацевтичният състав е въведен интравенозно. Салинни разтвори, разтвори на водна декстроза и глицеролни разтвори могат също да бъдат използвани като течни носители, по-специално като разтвори за инжектиране. Подходящи фармацевтични добавки включват нишесте, глюкоза, лактоза, сукроза, желатин, малц, ориз, брашно, тебешир, силикагел, натриев стеарат, глицеролмоностеарат, талк, натриев хлорид, сухо обезмаслено мляко, глицерол, пропилен, гликол, вода, етанол и подобните. Ако е необходимо, съставите могат да съдържат също малки количества от овлажняващи или емулгиращи агенти, или pH буферни агенти. Тези състави могат да бъдат под формата на разтвори, суспенсии, емулсии, таблетки, пилули, капсули, пудри, поддържащосвързани формулировки или подобни. Съставът може да се формулира като супозитория, с традиционни свързващи вещества и носители като триглицеридите. Веществата в изобретението могат да се формулират като неутрални или солеви форми. Фармацевтично приемливи соли включват тези формирани със свободни амино групи, като тези извлечени от хидрохлорната, фосфорната, оцетната, оксаловата, тартаровата киселини и др., и тези формирани със свободни карбоксилни групи, като тези извлечени от натрия, калия, амония, калция, железен хидроксид, изопропиламин, триетиламин, 2-етиламино етанол, хистидин, прокаин и др. Примери за подходящи фармацевтични носители са описани в “Remington’s Pharmaceutical sciences” от E.W. Martin. Такива състави ще съдържат терапевтично ефективно количество от веществото, за предпочитане в пречистена форма, заедно е подходящо количество от носител, така че да се осигури формата за директно въвеждане на пациент. Формулировката трябва да бъде съобразена с метода на въвеждане.

Фармацевтични състави, адаптирани за въвеждане през устата могат да бъдат представени като капсули или таблетки; като пудри или гранули; като разтвори, сиропи или суспенсии (във водни или неводни течности); като годни за ядене пени или разбитки; или като емулсии. Таблетки или твърди желатинови капсули могат да включват лактоза, нишесте или негови деривати, магнезиев стеарат, натриев захарин, целулоза, магнезиев карбонат, стеаринова киселина или нейни соли. Меки желатинови капсули могат да включат растителни масла, восъци, мазнини, полутвърди или течни полиоли и др. Разтвори и сиропи могат да включат вода, полиоли и захари.

Активен агент, предназначен за въвеждане през устата, може да бъде покрит или смесен

65353 Bl c материал, който забавя дезинтеграцията и/или абсорбцията на активния агент в гастроинтестиналния тракт (например могат да бъдат използвани глицерил моностеарат или глицерил дистеарат). Така претърпяното освобождаване на активния агент може да бъде постигнато в течение на много часове и, ако е необходимо, активният агент може да бъде предпазен от деградирало състояние в стомаха. Фармацевтични състави за въвеждане през устата могат да бъдат формулирани за улесняване освобождаването на активен агент в определена гастроинтестинална локализация, дължащо се на специфично pH или на ензимни условия.

Фармацевтични състави, адаптирани за трансдермално въвеждане могат да бъдат предвидени като дискретни петна, предназначени да стоят в интимен контакт с епидермиса на приемателя за продължителен период от време. Фармацевтични състави, адаптирани затопично въвеждане могат да бъдат предвидени като мазила, кремове, суспенсии, лосиони, пудри, разтвори, пасти, гелове, спрейове, аерозоли или масла. За топично въвеждане в кожата, устата, окото, или други външни тъкани, за предпочитане е да се употребяватопично мазило или крем. Когато е формулиран като мазило, активният ингредиент, може да бъде употребен или като парафинова, или като водно-смесимаоинментнабаза. Алтернативно, активният ингредиент може да бъде формулиран като крем на база масло-във-вода, или на база вода-в-масло. Фармацевтични състави, адаптирани затопично въвеждане в окото включват очни капки. В тези състави активният ингредиент може да бъде разтворен или суспенсиран в желания носител, например във воден разтворител. Фармацевтични състави, адаптирани затопично въвеждане през устата включват бонбончета, пастили и такива за изплакване на устата. Фармацевтични състави, адаптирани за назално въвеждане могат да включват твърди носители като пудри (за предпочитане да имат големина на партикула в интервала от 20 до 500 микрона). Пудрите могат да се въвеждат по начина, по който се взимат праховете за смъркане, т.е. чрез бърза инхалация през носа от контейнер с пудра, държан близо до носа. Алтернативно, състави адаптирани за назално въвеждане могат да включат течни носители, например назални спрейове или кап ки за нос. Тези състави могат да включват водни или маслени разтвори на активния ингредиент. Състави за инхалаторно въвеждане могат да бъдат предлагани в специално адаптирани приспособления, включително, но не ограничено до, аерозоли под налягане, небулизери или инсуфлатори, които могат да бъдат конструирани така, че да осигуряват предварително определените дозирания на активния ингредиент. В предпочитан вариант, фармацевтичните състави според изобретението се въвеждат през носната кухина в белите дробове.

Фармацевтични състави, адаптирани за ректално въвеждане могат да бъдат предвидени като супозитории или клизми. Фармацевтични състави, адаптирани за вагинално въвеждане могат да бъдат предвидени като формулировки на песари, тампони, кремове, гелове, пасти, пяна, или спрейове.

Фармацевтични състави, адаптирани за парентерално въвеждане включват водни и неводни стерилни инжектабилни разтвори или суспенсии, които могат да съдържат антиоксиданти, буфери, бактериостатици и разтвори, които превръщат съставите в субстантно изотонични с кръвта на предназначения реципиент. Други компоненти, които могат да бъдат налични в такива състави включват например вода, алкохоли, полиоли, глицерин и растителни масла. Състави, адаптирани за парентерално въвеждане, могат да бъдат представени в контейнери за единична доза или за мултидоза, например запечатани ампули и флакони, и могат да бъдат съхранявани в замразено-изсушено (лиофилизирано) състояние, нуждаещо се единствено от добавка на стерилен течен носител, например стерилен салинен разтвор за инжектиране, непосредствено преди използване. Разтвори и суспенсии за инжектиране екстемпоре могат да бъдат приготвени от стерилни пудри, гранули и таблети.

В предпочитан вариант съставът е формулиран в съответствие с рутинните процедури като фармацевтичен състав, адаптиран за интравенозно въвеждане на човешки същества. Обикновено състави за интравенозно въвеждане са разтвори в стерилен изотоничен воден буфер. Където е необходимо съставът може да включи също разтварящ агент и локален анестетик, като например лидокаин, за намаляване на болката на мястото на инжекцията. Обикновено ингре

65353 Bl диентите се доставят или отделено, или смесени заедно под формата на единица за дозиране, например, като суха лиофилизирана пудра или несъдържащ вода концентрат в херметично затворен контейнер, такъв като ампула или саше, обозначавайки количеството на активния агент. Където съставът ще бъде въвеждан чрез инфузия, той може да бъде раздаван в инфузионна бутилка, съдържаща стерилна фармацевтична вода или салинен разтвор. Където съставът е въвеждан чрез инжекция, ампулата със стерилна вода за инжектиране или салинния разтвор могат да бъдат предвидени така, че ингредиентите да могат да се смесват непосредствено преди въвеждането.

Супозиториите съдържат основно активен ингредиент в интервала от 0.5 до 10 тегл. %/ формулировките за въвеждане през устата за предпочитане съдържат 10% до 95% активен ингредиент.

Изобретението разкрива също фармацевтична опаковка или кит, включващи един или повече пломбирани контейнери, напълнени с един или повече от ингредиентите на фармацевтичните състави според изобретението. По избор към такъв контейнер(и) може да бъде поставена листовка под формата на предписание от държавната агенция, контролираща производството, употребата или продажбата на фармацевтични или биологични продукти, която листовка отразява разрешението от агенцията по производство, употреба или продажба за въвеждане при хора.

Методи за въвеждане

Настоящото изобретение разкрива състави и методи за периферно въвеждане на ЕРО, за да усили функцията или предпази възбудимите тъкани, и дадостави вещества на такива тъкани. Както беше отбелязано по-горе, настоящото изобретение е базирано, частично, на откритието, че периферното въвеждане на ЕРО има директно невропротективни или нервноусилващи свойства във възбудимите тъкани, като например тъканите на централната нервна система, периферната нервна система или сърдечната тъкан. Възбудимата тъкан, както е използувана тук, включва, но не е ограничена до, невронна тъкан на централната и периферна нервни системи и сърдечна тъкан. Този раздел описва такива вещества и методите за тяхното въвеждане.

Настоящото изобретение разкрива въвеж дане на ЕРО и модулатори на активността на ЕРО рецептор, по различни от директния начини на въвеждане в централната нервна система, а термините “периферен” и “системен” се отнасят до тези различни начини. Периферно въвеждане включва орално или парентерално въвеждане, като например интравенозно, интраартериално, субкутанно, интрамускуларно, интраперитонеално, ректално, субмукозно или интрадермално въвеждане. И други начини са полезни за въвеждането на описаните тук агенти. Тук са предвидени и двете, както остро, така и хронично въвеждане.

В един вариант, например ЕРО може да бъде предадено на контролирана освобождаваща система. Например полипептида може да бъде въведен използвайки интравенозна инфузия, имплантируемаосмотична помпа, трансдермално петно, липозоми, или други начини на въвеждане. В един вариант може да бъде използвана помпа (виж Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Grit. Ref. Biomed.Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В друг вариант, веществото може да бъде предадено на мехура, по-специално липозома (виж Langer, Science 249:15271533 (1990); Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); WO 1991/004014; U.S. Patent No. 4,704,355; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; see generally ibid], В друг вариант могат да бъдат използвани полимерни материали [виж Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controled drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953; виж също Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105).

В още един друг вариант контролираната освобождаваща система може да бъде разположена в близост до терапевтичния прицел, например мозъка, по този начин изисквайки само фракция на системна доза (виж например Goodson, рр. 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, supra, 1984). Други контролирани освобождаващи системи, садис

65353 Bl кутирани в списанието от Langer (1990, Science 249:1527-1533).

В друг вариант, ЕРО, както подходящо е формулиран, може да бъде въведен чрез назално, орално, ректално, вагинално или сублингвално въвеждане.

В един специфичен вариант може да бъде желателно да се въведат ЕРО съставите от изобретението локално в полето, нуждаещо се от лечение; това, може да бъде постигнато чрез, например, и не по пътя на ограничението, локална инфузия по време на операция, топична апликация, например при съединяване с превързване на рани след операция, чрез инжектиране, с помощта на катетър, с помощта на супозитория, или с помощта на имплант, казаният имплант е порозен, непорозен, или желатинов материал, включително мембрани, такива като сиаластични мембрани или фибри.

Примери за изпълнение на изобретението

Настоящото изобретение може да бъде подобре разбрано чрез справка в следващите примери, които илюстрират по-пълно предпочитаните изпълнения на изобретението, без да ограничават неговия обхват.

Така както са описани тук по-долу, изследванията съгласно изобретението, са стандартни, универсално приети тестове у животински модели, доказващи профилактична или терапевтична полза.

Пример 1. Периферно въведеният ЕРО усилва познавателната функция

В този пример пространственият навигаторен експеримент, известен като Morris Water Maze тест, демонстрира ЕРО индуцирано повишаване на познавателната функция у мишки. В този тест малка прозрачна платформа е поставена в един квадрант на плувен басейн с непрозрачна вода. Мишки, поставени в този басейн, трябва да плуват докато достигнат останалата под повърхността платформа, която е невидима за плуващите мишки. Тестът се заключава в измерване времето на животните необходимо да достигнат до платформата (т.е. продължителността на времето, което те губя, плувайки). В последователни опити, времето, което всяка мишка използва за да достигне платформата, ще намалява като функция на заучаването от тях на тяхно то местоположение. Този тип на експериментално заучаване въвлича хипокампуса, като хипокампусните лезии пречат на заучаването в този тест.

Експерименти бяха извършени в кръгъл черен басейн, 150 cm в диаметър. Бяха произволно определени четири точки: север, юг, изток и запад. Отличителни визуални знаци бяха приложени за всеки от тези четири квадранта: например пробляскващи светлини, блестяща лента приложена на квадрати и др. За да ориентират мишките в басейна. Платформа е поставена произволно в един квадрант. Опитът се състои в поставяне на животното с главата напред в един квадрант на басейна и освобождаването му. Продължителността на опита е общо 90 s. Обектите бяха оставяни за 1 h, след което поставяни в друг квадрант за тестване. Всичките 4 квадранта бяха използвани в продължение на опитите за деня, и животните бяха тествани в 12 последователни дни (т.е. общо 48 опита).

Експериментът сам за себе си се състоеше от инжектиране на всяка мишки с 5000 U/ kg рекомбиниран човешки ЕРО (продаван под търговското име PROCRIT, Ortho-Biotech, Inc.) чрез интраперитонеална инжекция, 4 h преди началото на дневните тестувания, всеки ден за 12те дена на изследването. Контролните животни бяха фалшиво инжектирани със салинен разтвор.

Заучаването беше измерено чрез измерване продължителността на времето, която всяка мишки губи на платформата. На фигура 1А са показани резултатите като изразходвано време от ЕРО третираната група и фалшивата група. Както показват резултатите, двете групи животни губят повече време на платформата, т.е. те се научават да достигнат платформата по-бързо във всеки последователен опитен ден, но ЕРО третираните животни бяха по-бързи, отколкото фалшивата група. Така ЕРО третираните животни, имат много по-бърза “крива на заучаването”, отколкото фалшивата група. Когато резултатите бяха изразени като разлика между ЕРО третираните и фалшиво третираните групи, и резултатите от ЕРО третираната и фалшиво третираната група бяха сравнени, линията на регресия (R²=0.88) показва наклон (0.68) значително различаващ се от наклона в 1, подчертано в полза на ЕРО групата (фиг. 1В).

Пример 2. Периферно въведен ЕРО засил

65353 Bl ващ заучаването Conditioned taste aversion

Тестът за постигане на вкусово отвращение при определени условия (СТА), изпълнен в този пример, демонстрира, че ЕРО въздейства драматично върху способността за запомняне у мишки и учи да се избяга неприятно вкусово усещане, в този случай на болестно-провокираща субстанция. В този пример е използван литиев хлорид за предизвикване на СТА, защото литиевият хлорид предизвиква сигурно прилошаване и анорексия по зависим от дозата начин. Подобно на естествено настъпващите заболявания, литиум предизвиква СТА чрез стимулиране на пътищата, описани по-горе, включително освобождаване на цитокин.

Женска Balb/c мишки бяха упражнявани да ограничават техния целодневен прием на вода до единствен петминутен период за пиене на ден, и бяха научени да пият достатъчно вода по време на този период до оставяне в равновесие. Животните бяха разделени в групи и беше въвеждано едно от двете, фалшив контрол (салинен разтвор) или ЕРО (5000 U/kg) инжектирани интраперитонеално (IP) 4 h преди презентацията на нова захарин-ванилова течност. Непосредствено след свършване пиенето на сладката течност животните получаваха едно от двете, салинен разтвор или болестно предизвикваща доза от литий (20 mg/kg от 0.15 М LiCl, доставен IP). След това бяха проследени три групи от животни. Първата група (контролна) не беше получила литий след пиене. Втората група получи и двете, както литий, така и ЕРО. Третата група (фалшива) получи салинен разтвор (без ЕРО) и литий.

Вкусовото отвращение при определени условия беше измерено чрез измерване намаляването на пиенето при последващо подлагане на болестно причиняващ разтвор, нова захарин-ванилова течност. След петдневно възстановяване от литий или фалшиво лечение, лишаваните от вода животни бяха почерпени отново със същата нова захарин-ванилова течност. Резултатите, разпределени за групи 2 и 3, сравнени с 1 (контролна) са показани на фиг. 2А. Ден 2 представя основната консумация на вода след привикване към ограниченията на теста. В ден 3 животните получиха интраперитонеално инжектиране на едно от двете - салинен разтвор или ЕРО (5000 U/kg) 4 h преди даването на новата захарин-ванилова течност, последвано от лечение с литий или фалшиво със салинен разтвор (стрелка). Това лечение имаше като резултат малко намаляване на консумацията на течност във всички групи през ден 3, предварително документиран ефект на отвращение от инжекцията и новата течност. След възстановяване, първият тест за установяване на СТА не показа намаляване в консумацията за контролите. Обаче, животните получили литий демонстрираха фактически пълно отвращение към течността, въпреки съществуващото лишаване от вода (ден 4). Продължителното лишаване от вода предизвиква накрая потушаване на СТА (ден 5 до 9), но беше характеризирано чрез подчертано забавено възстановяване на животните, които бяха получили ЕРО, както е показано чрез плътни кръгчета на фиг. 2А.

Силата на СТА установена тук може подобре да се прецени вземайки предвид степента на воден дефицит, присъстващ във всеки ден на теста, като ЕРО-третираните животни понасят водния дефицит приблизително два пъти по-добре от фалшиво инжектираните обекти (фиг. 2В). Въпреки, че в подчертано акцентираното СТА, демонстрирано от ЕРО групата, животните в тази група много по-охотно доближават питейната вана, отколкото фалшивата група, както е показано на фиг. 2С. Силата на СТА беше демонстрирана с повторно инжектиране единствено на литий (без ЕРО), което предизвика отслабено СТА, което беше по-голямо в ЕРО групата (фиг.2А, ден 10). Тези данни показват, че ЕРО премедикация е свързана с подчертано потенциран СТА, предизвикан отлитай.

Пример 3. Периферно въведен ЕРО предпазва мозъка от токсинвъзбуждане

Този пример демонстрира, че ЕРО преминава кръвно-мозъчната бариера и има невропротективен ефект у мишки, третирани с кайнат невротоксин. В природата съществуват много вещества, които проявяват токсичност, подчертано към невроните. Тези молекули, взаимодействат обикновено с ендогенни рецептори за амино киселинни глутамат трансмитори, причинявайки впоследствие ексесивно стимулиране и невронно увреждане. Една от тях, кайнат, субстанция широко използвана за изучаване на невронното увреждане, дължащо се на токсиковъзбудимост, е аналог на глутамата. Кайнатът е силен невротоксин, който специфично разрушава

65353 Bl невроните, по-специално тези локализирани в области с висока плътност на кайнат рецептори, такива като хипокампуса, и провокират припадъци, мозъчно увреждане, и смърт.

Следващите изследвания на невротоксичността бяха извършени с мишки, използвайки кайнат. Този модел е използван за преценка на протективната полза от леченията на състояния като при темпорална епилепсия. Парентералното инжектиране в експериментални животни, като плъхове и мишки, предизвиква парциални (лимбични) припадъци по дозно-зависим начин, което след това може да генерализира и да причини смърт. Експериментите, представени в този раздел бяха извършени за тестване дали периферно въведеният ЕРО преминава кръвно-мозъчната бариера, и ако е така, дали ЕРО има ефект в енергийния невронен баланс, и по-специално, дали той има невропротективен ефект срещу кайната.

До този край, женски Lalb/c мишки (тежащи около 15-20 g), бяха претествани с 5000 U/kg рекомбинантен човешки еритропоетин (rhEPO; продаван под марка PROCRIT, Ortho-Biotech, Inc.), или салинен разтвор (фалшив) взети интраперитонеално в специфично пик време, преди или след получаване на кайнат (Sigma Chemical), също IP, при специфични концентрации (количество/kg телесно тегло). Тогава обектите бяха наблюдавани и степенувани според развитието на припадъчна активност до 20 min след получаване на кайнат. Всеки опит беше приключен 60 min след кайнатната доза. Както е показано на фиг. ЗА, ЕРО премедикацията намалява драматично тежестта на припадъка и забавя атаката на статус епилептикус у мишки, третирани с кайнат. Сравнението между ЕРО и фалшиво третираните животни, демонстрира значително по-ниска степен на смърт у животни, получаващи кайнат в доза от порядъка на 20-30 mg/kg, индицирайки невропредпазване, получено чрез премедикация с ЕРО. Числата в скоби под всяка колона указват броя на животните, подложени на всяка кайнатна доза.

Дозната зависимост от ЕРО, в предвиденото невропредпазване с кайнат е показана на фиг. ЗВ. В мишки беше въвеждан ЕРО (5000 U/kg; IP дневно до 5 дни). Невропротективният ефект на всяка доза от ЕРО беше преценен чрез определяне преживелите след въвеждането на кайнат (20 mg/kg), което предизвиква приблизително 50% смъртност за контролни животни (без ЕРО; виж фиг. ЗА). Колоните показват подобрение в преживяването наЕРО-третирани обекти, в сравнение с фалшиво инжектирани животни. Както е показано на фиг. ЗВ, невропредпазването се увеличава с допълнителни дозирания на 5000 U/kg от ЕРО.

Осигуреното невропредпазване чрез ЕРО се характеризира чрез забавено начало, характерно за активиране на генно изразна програма, фиг. ЗС показва забавянето, свързвано с ЕРО (в min) на смъртта от припадъци, с единична доза от ЕРО, взета във времето на кайнатно въвеждане (20 mg/kg), неосигуряващо някаква непосредствена защита, независимо, че ЕРО, взет 24 h преди кайната, подобрява латентността и тежестта на припадъците и времето за смърт. Този ефект продължава до 7 дни.

Пример 4. Периферно въведен ЕРО предпазва мозъка от увреждане, дължащо се на исхемия

Предишни in vivo проучвания, използващи модела на глобална реперфузия в жербил, показа, че спирането на мозъчното кръвообръщение причинява клетъчна смърт в мозъка, и че ЕРО инжектиран директно в мозъчните вентрикули предпазва мозъка от такава клетъчна смърт (Sakanaka et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:4635). Експериментите представени в този пример, за първи път показват, че ЕРО, доставен периферно предпазва нервноклетъчната смърт in vivo в животинска моделна исхемия.

Следващият експеримент беше осъществен, използвайки модел на запушване на средно-мозъчната артерия, приет в областта модел наогнищен исхемичен инсулт. В протокола, мъжки плъхове (250 g телесно тегло) бяха анестезирани с фенобарбитал и държани при 37°С. Бяха визуализирани каротидните артерии и перманентно запушената ипсилатерална каротидна артерия. Ипсилатералната средномозъчна артерия (МСА) беше визуализирана и обгорена в нейното начало. Контралатералната артерия беше запушена чрез клампиране за 1 h Животните бяха умъртвени 24 h по-късно и мозъкът отстранен и сециран в серийни срезове с 1 mm. Беше визуализирана жива тъкан чрез ин сито намаляване на трифенилтетразолин, за визуализиране на жива тъкан от некротични области. Исхемичната сър

65353 Bl цевина и заобикалящата сянка са претърпели клетъчна смърт.

Използвайки този МСА модел, ЕРО беше въведен чрез парентерално инжектиране в различни времена преди и непосредствено след увреждането, и обема на увреждането беше окачествен с компютърно получен образен анализ. Резултатите от този анализ, показани на фиг. 4А, посочват ефектът от лечението с ЕРО в следните времена след инсулта: 24 h преди инсулта, до времето на инсулта, и 3, 6 и 9 h след инсулта. Както е показано на фиг. 4А, ЕРО предпазва тъканта от некротично увреждане, когато е въведен до 6 h след инсулта.

По интересен начин и в контраст, 17-мер извлечени от ЕРО, който беше предварително съобщено, че има невротропична активност произвеждайки неврит, създаден in vitro и нервно клетъчна миелинизация ex vivo (Сатрапа et al., 1998, Int. J. Mol. Med. 1:235 - 41; U.S. Patent 5,700,909 issued Dec.23, 1997), няма ефект на предпазване против увреждане в тази система (фиг. 4В “17-mer”). Така, този модел, както и други методи за изследване на ефекта от ЕРО върху функцията на възбудимата тъкан, предвидени чрез настоящото изобретение, могат да бъдат използвани за идентифициране ЕРО и модулатори на активността на ЕРО рецептор, които могат да бъдат използвани за модулиране на функцията на възбудимата тъкан, както и за предпазване от увреждане, или повишаване на заучаването и познавателната способност.

Пример 5. Периферно въведен ЕРО предпазва мозъка от мека травма

В модел с механична травма, моделът на кортикално въздействие, премедикация със систематично въвеждан ЕРО предпазва мишия мозък от мека травма. За да се предизвика травма беше използвано пневматично задвижено бутало (Clippard Valves), 3 mm в диаметър, което може точно да предаде удар в черепа. Всяка мишка беше анестезирана и поставена предпазно в стереотаксично положение, за да се предпази главата от движение. Скалпелна инцизия беше направена с оглед да се детерминира местонахождението на брегмата, която е препоръчителна точка, към която буталото е насочено първоначално. Тогава буталото беше нагласено чрез движение до 2 mm каудално и 2 mm вентрално към брегмата и удара беше направен с точ ни пулсации от азот. Това устройство позволява точна селекция на скоростта на буталото (4 m/s) и изместване на удара (2 mm).

Мишките бяха третирани с ЕРО (5000 U/kg) 24 h преди, по време на увреждане, 3, 6 или 9 h по-късно и продължени с дневни дозирания. Мишките бяха умъртвени 10 дена след процедурата, и мозъкът беше в последствие изследван и беше определен обема на мозъчната некроза. При фалшиво третираните мишки беше наблюдавано широко поле на некроза (фиг. 5) и с обилно инфилтриране намоноцити. Противоположно, животните бяха предпазени от такова увреждане и в полето на увреждането бяха установени малко мононуклеарни клетки, когато животните са премедицирани с ЕРО или взимат ЕРО до 3 h след увреждането.

Пример 6. Периферно въведеният ЕРО предпазва миокарда от исхемично увреждане

Този пример демонстрира ефекта на ЕРО при предпазване на сърдечната тъкан от хипоксично увреждане. За извършване на това, плъхове бяха претествани с ЕРО (5000 U/kg) 24 h преди процедурата, изпълнена така от Latini et al., (1999, J. Cardiovasc. Pharmacol. 31: 601-8). По-късно субектите бяха анестезирани, поставени на командна вентилация и беше извършена торакотомия. Сърцето и неговата вътрешна циркулация бяха идентифицирани и беше поставен подвижен шев, около най-проксималната част на лявата предна десцендираща коронарна артерия и тогава лигирана. Тогава беше взета добавъчна доза от ЕРО (5000 U/kg) и оклузията поддържана за 30 min. До това време лигатурата беше изпусната и животното беше поддържано под обща анестезия задопълнително 6 h, и впоследствие умъртвено. Непосредствено след смъртта сърцето беше отстранено и частта от засегнатата област (AAR), както и незасегнатата област (септум), беше отстранена и приготвена за биохимични анализи. Бяха оценени два параметъра, креатин киназа (СК) като мярка за преживелите в миокарда (ниският СК, по-малкото живи тъкани) и миелопероксидаза, която е продукт на мононуклеарно клетъчен инфилтрат. Резултатите са показани на фиг. 6А и фиг. 6В. Както е показано на тези фигури, третирането с ЕРО, дава резултат в поддържането на СК активност, последвано от увеличаване виабилността в тъканта, и намаляването на МРО активност,

65353 Bl релативно на контролата, както в инфарктната област (AAR), така и в перфузираната левокамерна (LV) свободна стена, показвайки, че това е значително по-ниско инфилтриране с възпалителни клетки.

Пример 7. Периферно въведен ЕРО атенюира експериментални алергични енцефалити

Експериментални алергични (или автоимунни) енцефалити (ЕАЕ) у плъхове е приет животински модел за мултиплена склероза (MS) в областта. Бяха разработени различни животински модели с ЕАЕ, прилагайки имунологични, вирусологични,токсични и травматични параметри, с оглед да се разберат особеностите на MS.

За да се тества дали ЕРО предпазва против симптоми на ЕАЕ, беше извършен следващият експеримент. Женски Lewis плъхове, на възраст 6-8 седмици (Charles river, Calco, Italy), бяха имунизирани с лека етерова анестезия чрез инжектиране в двете задни лапи 50 mg миелин базичен протеин от гвинейско свинче (МВР; Sigma, St. Louis, МО) във вода, емулгирана в равни обеми на пълен Freund’s адювант (CFA, Sigma) със 7 mg/ml със топлинно умъртвен Mycobacterium tuberculosis прибавен към Н37 Ra (Difco, Detroit, MI) в краен обем от 100 ml.

След третиранията плъховете бяха изследвани ежедневно за белези на експериментален автоимунен енцефаломиелит (ЕАЕ) и отбелязани както следва: 0, няма увреждане; 1, вяла опашка; 2, атаксия; 3, пълна лимбична парализа на лапите с инконтиненция на урината. Бяха монитурирани също телесните тегла. У плъховете беше въвеждано ЕРО (5000 U/kg, IP, веднаж дневно), стартирайки в ден 3 след имунизацията и продължавайки до ден 18. Контролните плъхове получават само вехикулум. Както е показано на фиг. 7, плъховете третирани с ЕРО показват подобрение в броя (т.е. по-нисък брой) и в продължителността на заболяването. В допълнение, беше забелязано забавяне в началото на симптомите у плъхове третирани с ЕРО.

Пример 8. Минимум ефективна доза от ЕРО, необходимо за предпазване на възбудимата тъкан

Оптимум и ефективни дозирания на ЕРО бяха изследвани, използвайки животинския модел на огнищен исхемичен инсулт, описан погоре. Както е показано на фиг. 8А, ЕРО дозира не по-малко от 450 единици/kg телесно тегло не беше надеждно ефективно за предпазване на възбудимата тъкан от некротично увреждане. Както е показано на фиг. 8В, в изследвания с животни, доза от приблизително 5000 единици/kg телесно тегло доставена IP на четири женски миши субекта дава резултат в циркулиращото ниво на ЕРО, по-голямо от 20,000 m/Units/ml от серум в рамките на 5 h след неговото въвеждане, по-голямо от 10,000 m/Units/ml след 10 h след въвеждането, но по-малко от 5 Units/ml, 24 h след въвеждането.

Пример 9. CNS, предаване осъществено чрез еритропоетин

Експериментите представени тук по-долу посочват успешния транспорт на молекула конюгирана към ЕРО през кръвно-мозъчната бариера и нейната локализация вътре в базалната мембрана. Както е показано на фиг. 9А, мозъчните срезове бяха боядисани с антитела за ЕРО рецептор (ЕРО-R), които показват, че мозъчните капиляри повишават бързо нива от ЕРО-R. За да се изследва дали ЕРО може да бъде транспортиран през кръвно мозъчната бариера, ЕРО беше белязан с биотин както следва. Обемът, съдържащ rhEPO беше концентриран, използвайки Centricon-10 филтър (Милипор), и възстановително измерен чрез тълкуване на абсорбцията, тълкувайки до дължина на вълната от 280 nm. Следващ, 0.2 mg от дълголинеен биотин (Vector Labs) беше разтворен в 100 microl на DMSO, прибавен към концентрирания rhEPO разтвор и разклатен незабавно. Тази микстура тогава беше инкубирана до стайна температура за 4 h, докато се възбуди внимателно, като и се пазеше от светлина. Несвързаният биотин беше отстранен от течността, използвайки Centricon-10 колона. Биотинилираният ЕРО тогава беше въведен на животни IP, и 5 h по-късно животните бяха умъртвени. Мозъчните срезове бяха белязани с авидин куплиран към пероксидаза, и диаминобензидин беше добавен до развиване на достатъчна реакция от продукта за изследване чрез светлинна микроскопия. ЕРО беше намерен по продължение на същите капиляри, които са оцветени позитивно за ЕРО-R (фиг. 9В). В по-късни моменти от време маркираният биотин се появи локализиран вътре в невроните (например 17 h, фиг. 9С). Обратно, ако студен ЕРО беше добавян в 1000 пъти повече за маркиране на ЕРО,

65353 Bl всички специфични оцветявания бяха елиминирани. Резултатите демонстрират последователното предаване на систематично въвежданото конюгирано ЕРО съединение, преминаващо кръвно мозъчната бариера.

Успешното предаване на систематично въвеждан ЕРО-биотин, конюгиран през кръвно мозъчната бариера вътре в мозъка демонстрираха, че други терапевтични вещества могат да бъдат предадени през кръвно мозъчната бариера по подобен начин чрез комплексиране на ЕРО към разглеждано вещество. Като един пример, мозъчно извлечен невротрофичен фактор (BNF) може да бъде ковалентно куплиран към ЕРО чрез въглеродоимидно куплиране, използвайки стандартни процедури. След пречистване конюгатът може да бъде въведен на животни чрез интраперитонеално инжектиране. Позитивните ефекти на BNF в централната нервна система могат да бъдат измерени по отношение на контролни животни, като се измери успешният транспорт на тази молекула в асоциация с ЕРО в контраст на липсата на активност на централната нервна система от неконюгирания BNF.

Изобретението не трябва да бъде ограничавано в обсега на описаните специфични изпълнения, които са дадени само като единични илюстрации на отделните аспекти на изобретението, и функционално еквивалентни методи и вещества са вътре в обсега на изобретението. В действителност, различни модификации на изобретението, прибавени към тези показани и описани тук, ще станат очевидни за специалистите в областта от предшестващото описание и придружаващите чертежи. Такива модификации са предназначени да бъдат в обхвата на добавените претенции.

Всички препоръки, цитирани тук са включени чрез споменаването им в тяхната цялост за всички предназначения.

Claims

Патентни претенции

1. Фармацевтичен състав под формата на единица за дозиране, адаптиран за модулиране на възбудима тъкан, за повишаване на познавателната функция или за предаване на вещества през здравите ендотелиални връзки, характеризиращ се с това, че включва за единица доза, ефективно нетоксично количество в интервала от около 50,000 до 500,000 единици от еритропоетин, модулатор на активността на еритропоетин рецептор, модулатор на еритропоетин активиран рецептор, или тяхна комбинация и фармацевтично приемлив носител.
2. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ефективното нетоксично количество от еритропоетин включва 50,000 до 500,000 единици на еритропоетин.
3. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ефективното нетоксично количество на еритропоетин е ефективна доза, за да се достигне циркулиращо ниво на еритропоетин, по-голямо от 10,000 mU/ml в серум.
4. Фармацевтичен състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че циркулиращото ниво на еритропоетин е нивото, измерено на около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 h след въвеждането на еритропоетин.
5. Фармацевтичен кит с един или повече контейнери, характеризиращ се с това, че включва фармацевтичния състав от претенция 2.
6. Използване на ефективно количество на еритропоетин, на модулатор на активността на еритропоетин рецептор, или на модулатор на еритропоетин - активиран рецептор за производство на фармацевтичен състав за използване при метод за предпазване на бозайник от патология в резултат на увреждане на възбудима тъкан, включващ периферно въвеждане в споменатия бозайник за предпазване на възбудима тъкан в количество и в дозен режим, достатъчен за достигане споменатия предпазен ефект без значително хематокритно повишаване.
7. Използване съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че споменатото увреждане е в резултат на разстройства при припадъци, мултиплена склероза, инсулт, хипотония, сърдечен стоп, исхемия, инфаркт на миокарда, възпаление, свързана с възрастта загуба на познавателната функция, радиационно увреждане, церебрална парализа, невродегенеративно заболяване, болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон, болест на Leigh, СПИН деменция, загуба на памет, амиотрофична латерална склероза, алкохолизъм, разстройство в настроението,безпокойство, дефицит на вниманието, аутизъм, болест на Creutzfeld-Jacob, мозъчна или гръбначно-мозъч

65353 Bl на травма, сърдечно-белодробен байпас, глаукома, ретинна исхемия или ретинна травма.
8. Използване съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че споменатото увреждане е резултат от хипоксия.
9. Използване съгласно претенция 8, характеризиращо се с това, че споменатата хипоксия е пренатална или постнатална кислородна недостатъчност, задушаване, шок, състояние преди удавяне, след хирургична познавателна дисфункция, отравяне с въглероден окис, инхалиране на пушек, хронично обструктивно белодробно заболяване, емфизема, дихателен дистрес синдром у възрастни, хипотоничен шок, септичен шок, анафилактичен шок, сърповидно клетъчна криза, сърдечен стоп, дисритмия, азотна наркоза, или локализирана тъканна хипоксия.
10. Използване на еритропоетин, модулатор на активността на еритропоетин рецептор, модулатор на еритропоетин активиран рецептор, или тяхна комбинация за производство на фармацевтичен състав за използване при метод за повишаване функцията на нормална или патологична възбудима тъкан у бозайник, включващ периферно въвеждане в споменатия бозайник на периферно ефективно усилващо възбудимата тъкан количество от състава, в количество и дозен режим, достатъчни да се достигне споменатия усилващ ефект без значително хематокритно повишаване.
11. Използване съгласно претенция 10, характеризиращо се с това, че споменатото повишаване функцията на възбудимата тъкан дава резултат в повишаването на асоциативното заучаване или памет.
12. Използване съгласно претенция 10, характеризиращо се с това, че споменатото повишаване функцията на възбудимата тъкан е използвано при лечение на разстройства в настроението, безпокойство, депресия, аутизъм, хиперактивно разстройство с дефицит на внимание, болест на Алцхаймер, възрастова или познавателна дисфункция.
13. Използване съгласно претенция 6 или 10, характеризиращо се с това, че споменатата възбудима тъкан е тъкан на централна нервна система, тъкан на периферна нервна система, или сърдечна тъкан.
14. Използване съгласно претенция 6 или 10, характеризиращо се с това, че споменатото въвеждане включва орално, топично, интралуминално или чрез инхалация или парентерално въвеждане.
15. Използване съгласно претенция 14, характеризиращо се с това, че споменатото парентерално въвеждане е интравенозно, интраартериално, субкутанно, интраперитонеално, субмукозно или интрадермално.
16. Използване съгласно претенция 6 или 10, характеризиращо се с това, че споменатото въвеждане е остро или хронично.
17. Използване съгласно претенция 6 или 10, характеризиращо се с това, че споменатият еритропоетин е нееритропоетичен.
18. Използване съгласно претенция 6 или 10, характеризиращо се с това, че споменатият еритропоетин е въведен в доза, по-голяма от дозата, необходима за максимално стимулиране на еритропоезата.
19. Използване на молекула в асоциация с еритропоетин, модулатор на активността на еритропоетин рецептор, модулатор на еритропоетин активиран рецептор, или тяхна комбинация, за производство на фармацевтичен състав за използване при метод за улеснение на трансцитозата на молекули през ендотелно клетъчна бариера у бозайник, включващ въвеждане в споменатия бозайник на състава в количество и дозен режим, достатъчни да се достигне споменатият трансцитозен ефект без значително хематокритно повишаване.
20. Използване съгласно претенция 19, характеризиращо се с това, че споменатото асоцииране е лабилна ковалентна връзка, стабилна ковалентна връзка, или нековалентно асоцииране със свързващо място за споменатата молекула.
21. Използване съгласно претенция 19, характеризиращо се с това, че споменатата ендотелно клетъчна бариера е кръвно-мозъчната бариера, кръвно-очната бариера, кръвно-тестисната бариера, кръвно-яйчниковата бариера или кръвно-плацентната бариера.
22. Използване съгласно претенция 19, характеризиращо се с това, че споменатата молекула е рецепторен агонист или антагонист хормон, невротропичен фактор, антимикробен агент, радиофармацевтик, намаляващо чувствителността съединение, антитяло, имуносупресант, токсин, или противораков агент.

65353 Bl
23. Използване съгласно претенция 6, 10 или 19, където споменатият еритропоетин е еритропоетин, еритропоетин аналог, еритропоетин миметик, еритропоетин фрагмент, хибридна еритропоетин молекула, еритропоетин рецептор свързваща молекула, еритропоетин агонист, ренален еритропоетин, мозъчен еритропоетин, негов олигомер, негов мултимер, негов мутеин, негов конгенер, негова естествено появяваща се форма, негова синтетична форма, негова рекомбинантна форма, или тяхна комбинация.
24. Използване съгласно претенция 23, където споменатият еритропоетин рецептор-свързващата молекула е антитяло в еритропоетиновия рецептор.
25. Състав за транспортиране на молекула чрез трансцитоза през ендотелно клетъчна бариера, характеризиращ се с това, че включва споменатата молекула в асоциация с еритропоетин, модулатор на активността на еритропоетин рецептор или модулатор на еритропоетин активиран рецептор.
26. Състав съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че споменатият еритропоетин е еритропоетин, еритропоетин аналог, еритропоетин миметик, еритропоетин фрагмент, хибридна еритропоетин молекула, еритропоетин рецептор-свързваща молекула, еритропоетин агонист, ренален еритропоетин, мозъчен еритропоетин, негов олигомер, негов мултимер, негов мутеин, негов конгенер, негова естествено появяваща се форма, негова синтетична форма, негова рекомбинантна форма, или тяхна комбинация.
27. Състав съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че споменатата молекула е рецептор агонист или антагонист хормон, невротрофичен фактор, антимикробен агент, радиофармацевтик, вещество, намаляващо чувствителността, антитяло, имуносупресант, токсин, или противораков агент.
28. Фармацевтичен препарат, формулиран за въвеждане, за да се получи невропротективен ефект, характеризиращ се с това, че включва терапевтично количество на нееритропоетичен еритропоетин дериват и фармацевтично приемлив носител.
29. Фармацевтичен препарат, формулиран за въвеждане, за да се получи невроусилващ ефект, характеризиращ се с това, че включва терапевтично количество на нееритропоетичен еритропоетин дериват и фармацевтично приемлив носител.
30. Фармацевтичен препарат, формулиран за въвеждане, за да се предават вещества през ендотелните здрави връзки, характеризиращ се с това, че включва терапевтично количество на нееритропоетичен еритропоетин дериват и фармацевтично приемлив носител.
31. Фармацевтичен препарат съгласно претенция 28,29 или 30, характеризиращ се с това, че нееритропоетичният еритропоетин дериват е модулатор на активността на еритропоетин рецептор, модулатор на еритропоетин активиран рецептор.
32. Фармацевтичен кит с един или повече контейнери, характеризиращ се с това, че включва фармацевтичния препарат съгласно претенция 28, 29 или 30.