CN1607957A - 外周给药的红细胞生成素对应激组织功能的调制 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过全身性给药红细胞生成素受体活性调制剂，诸如经由EPO－活化受体发出信号来调制应激组织功能的红细胞生成素，来保护或增强哺乳动物的应激组织功能的方法和组合物。应激组织包括中枢神经元组织，诸如脑，外周神经元组织，视网膜，和心脏组织。保护应激组织可治疗低氧症、癫痫发作、神经变性疾病、低血糖和神经毒素中毒。功能的增强在学习和记忆中是有用的。本发明还涉及用于通过将分子与红细胞生成素受体活性调制剂诸如红细胞生成素结合来促进分子转运穿过内皮细胞紧密接点屏障诸如血脑屏障的组合物和方法。

Description

外周给药的红细胞生成素对应激组织功能的调制

1.发明领域

本发明涉及用外周给药的红细胞生成素和其他红细胞生成素受体活性调制剂或EPO-活化受体调制剂来正向影响应激组织的功能。这包括保护应激组织诸如神经元和心脏组织免受神经毒素、氧不足和其他不利刺激的伤害，以及增强应激组织的功能，诸如用于帮助学习和记忆。本发明还涉及通过与红细胞生成素分子、红细胞生成素受体活性调制剂或其他EPO-活化受体调制剂缔合将物质转运通过内皮细胞屏障的方法。

2.发明背景

许多种急性和慢性病况和疾病来源于外部和内部刺激引起的应激组织损害和机能障碍。这类刺激包括缺乏足够的氧合作用或葡萄糖、神经毒素、衰老的结果、感染性试剂、和外伤。例如，应激组织受到损害可能是癫痫发作和慢性癫痫发作、惊厥、癫痫、中风、早老性痴呆、帕金森氏病、中枢神经系统损伤、低氧症、大脑性麻痹、脑或脊髓创伤、AIDS痴呆和其他形式的痴呆、与年龄有关的认知功能丧失、记忆力丧失、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、低血压、心搏停止、神经元损失、烟雾吸入和一氧化碳中毒等的结果。

众所周知：脑可获得的能量供给诸如葡萄糖或氧的减少会导致对脑功能的深度损伤，包括认知力损伤。中枢神经系统中的许多(但不是全部)神经元在例如氧不足、低血糖、紧张状态和/或长时间的强烈兴奋等代谢有限条件下工作时极易受损。在这些情况下，这些细胞的电化学梯度常常崩溃，导致不可逆的神经元损伤和细胞死亡。现行的观点认为这种一般机理是大量常见且致虚弱的神经病学变性疾病包括中风、癫痫和早老性痴呆的共同最终途径。

尽管有限的能量底物对脑功能影响的后果是众所周知的，但对于提高在否则就是正常的脑中的能量释放的作用只进行了很少的研究。目前的资料有力地提示：在动物模型和正常的人受治疗者中，无论是葡萄糖还是氧的释放提高都显著改善了复杂认知功能(Kopf等，1994，《行为与神经生物学》62：237-243；Li等，1998，《神经科学》85：785-794；Moss等，1996，《精神药理学》124：255-260)。此外，已证明在脑中产生的越来越多的神经肽类直接提供了对正常脑认知功能的改善。这些增强作用的生理学基础最终都取决于通过突触变化的神经元互连的重塑。

脑组织的细胞结构显示出极大的可塑性并经历连续不断的重塑。由许多营养分子介导的这些过程不仅发生在损害后，而且在学习、记忆和认知功能中起着突出的作用。尽管原型神经营养蛋白是神经生长因子(NGF)，但数量逐渐增加的细胞因子已公认在脑中发挥营养功能(Hefti等，1997，《药理学与毒理学年评》37：239-67)。

近来，许多独立的研究者都认识到神经组织表达高浓度的EPO及其受体(EPO-R；Digicaylioglu等，1998，《美国国家科学院院报》92：3717-20；Juul等，《儿科研究》43：40-9；Marti等，1997，《国际肾脏学》51：416-8；Morishita等，1997，《神经科学》76：105-16)。尽管似乎EPO及其受体蛋白各自是单基因的产物，但CNS变型明显更小。这种观察结果的生理学含义尚不清楚，但质量差异似乎确实改变了生物活性。例如，在对病人的研究中，研究者已得出结论，认为EPO没有被从外周转运到脑中(Marti等，1997，同上)。但是，迄今为止，尚未利用任何直接研究对EPO的这种可能性加以评估。尽管脑EPO比肾EPO少约15％(应归于唾液酰化作用的不同)，但脑EPO在低配体浓度下的红细胞集落刺激中更具活性(Masuda等，1994，《生物化学杂志》269：19488-93)。另一方面，CNS受体显示出比外周受体低得多的对去糖基化EPO的亲和力，外周受体的这种亲和力要高出30％(Konishi等，1993，《脑研究》609：29-35；Masuda等，1993，《生物化学杂志》268：11208-16)。

在脑中，已在星形细胞中发现EPO的表达，且EPO表达和释放的增加可由氧不足和其他代谢紧张性刺激诱导(Marti等，1996，《欧洲神经科学杂志》8：666-76；Masuda等，1993，《生物化学杂志》268：11208-16；Masuda等，1994，《生物化学杂志》269：19488-93)，或者甚至由其他受体诸如胰岛素样生长因子家族的占据诱导(Masuda等，1997，《脑研究》746：63-70)。神经元是这种分泌EPO的一个目标，因为它们以高度细胞类型特异性方式表达EPO-R(Morishita等，1997，《神经科学》76：105-16)。与EPO本身形成对照，EPO-R密度似乎在代谢应激反应过程中未被调制(Digicaylioglu等，1995，《美国国家科学院院报》92：3717-20)。

最近的研究证明，EPO令人印象深刻地在体外以及在体内当直接注射到脑室中时可保护对抗低氧性神经元损伤(Morishita等，1997，《神经科学》76：105-16；Sadamoto等，1998，《生物化学与生物物理学研究通讯》253：26-32；Sakanaka等，1998，《美国国家科学院院报》95：4635-40)。Konishi等(1993，《脑研究》609：29-35)已证明EPO当直接注射到成年大鼠脑室中时促进了胆碱能神经元在体内的存活。中枢给药到脑室中的EPO还成功地防止了大鼠的与局部缺血损伤有关的空间学习障碍(Sadamoto等，1998，《生物化学与生物物理学研究通讯》253：26-32)。一份近期的出版物提出：只有EPO的17-氨基酸部分是培养的神经细胞中这些神经营养作用所需要的(Campana等，1998，《国际分子医学杂志》1：235-41)。

许多年来，红细胞生成素(EPO)的唯一清楚的生理学作用是其控制红细胞的产生。近来，有一些证据表明，EPO作为细胞因子超家族的成员发挥着其他重要的生理学功能，这些功能是通过与红细胞生成素受体(EPO-R)的相互作用介导的。这些作用包括致有丝分裂、调制流入到平滑肌和神经细胞中的钙、以及对中间代谢的作用。据信EPO提供了可改善低氧性细胞微环境的补偿性应答。尽管研究已确定EPO颅内注射可保护神经元对抗低氧性神经元损伤，但颅内给药对于医疗应用来说是一种不切实际且难以接受的给药途径，特别是对于正常的个体。另外，早先对给药EPO的贫血病人的研究已得出结论：外周给药的EPO没有被转运到脑中(Marti等，1997，同上)。

在此处引用或讨论的参考文献将不理解为是本发明的在先技术。

3.本发明的简要概述

本发明涉及用于调制哺乳动物应激组织功能的组合物和方法，以及用于将药物释放到应激组织的方法和组合物。本发明部分是基于申请人的发现：全身性并以高剂量给药的红细胞生成素(EPO)被脑特定吸收。特别是，申请人发现：以高剂量释放的EPO可以穿过血脑屏障，此时它能增强认知功能，并保护神经组织免受应激性状态诸如氧不足的损害。

红细胞生成素和EPO(在本文中可互换使用)、EPO受体活性调制剂、和EPO-活化受体调制剂指的是当全身性给药(在血脑屏障外部)时能激活电应激组织的EPO-活化受体来增强和/或保护使免受损伤和死亡的化合物。因此，EPO可以指能调制应激组织的任何形式的红细胞生成素，以及EPO类似物、其片段和模拟物。在优选的实施方案中，对于在本发明方法中的使用，红细胞生成素表现出对脑EPO受体的增加的特异性。在另一个实施方案中，红细胞生成素是非红细胞生成性的。在又一个实施方案中，红细胞生成素以比最大地刺激红细胞生成所必需的剂量更大的剂量给药。

本发明提供了适于调制应激组织、增强认知功能或运送化合物穿过内皮紧密接点的剂量单位形式的药物组合物，每剂量单位包含有效无毒量的约50,000至500,000单位范围内的EPO、EPO受体活性调制剂、EPO-活化受体调制剂、或其联合形式，以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，在所述药物组合物中的有效无毒量的EPO包含50,000至500,000单位的EPO。在另一个实施方案中，所述药物制剂的EPO的有效无毒量是能有效地达到大于10,000mU/ml血清的EPO循环浓度的剂量。在另一个实施方案中，EPO的循环浓度在EPO给药后约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时达到。在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物试剂盒，它包括分装在一个或多个容器中的用于调制应激组织、增强认知功能或运送化合物穿过内皮紧密接点的有效量的EPO。

本发明提供了调制哺乳动物应激组织功能的方法，包括对所述哺乳动物外周给药有效量的红细胞生成素。应激组织可以是正常组织或异常的患病组织。在一个实施方案中，应激组织是中枢神经系统的神经元组织。在其他实施方案中，应激组织选自外周神经系统的神经元组织和心脏组织。

在一个实施方案中，提供了通过外周给药有效量的EPO或EPO受体活性调制剂来增强哺乳动物应激组织、特别是正常和异常应激组织功能的方法。应激组织功能的增强使得例如学习、联想学习或记忆增强。可用本发明的这个方面治疗的病况或疾病的非限制性实例包括心境障碍、焦虑症、抑郁、孤独癖、注意涣散多动症、早老性痴呆、衰老和认知机能障碍。

在另一个实施方案中，对应激组织的调制提供了使免受由对应激组织例如对中枢神经细胞、外周神经细胞或心脏组织的神经元的损伤产生的病变的保护作用。可产生这种病变的损伤包括但不限于低氧症、癫痫发作、神经变性疾病、神经毒素中毒、多发性硬化、低血压、心搏停止、放射或低血糖。在一个实施方案中，病变是低氧症的结果，并且可能是产前或产后缺氧、窒息、壅塞、几乎淹溺、手术后认知机能障碍、一氧化碳中毒、烟雾吸入、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、成人呼吸窘迫综合征、低血压休克、脓毒性休克、胰岛素休克、过敏性休克、镰状细胞危象、心搏停止、节律障碍或氮麻醉。在其中病变为癫痫发作的情况下，它的非限制性实例可以是癫痫、惊厥或慢性癫痫发作。在其中病变为神经变性疾病的情况下，它可以是例如中风、早老性痴呆、帕金森氏病、大脑性麻痹、脑或脊髓创伤、AIDS痴呆、与年龄有关的认知功能丧失、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化、癫痫发作、醇中毒、视网膜局部缺血、衰老、青光眼或神经元损失。在另一个实施方案中，给药EPO可以用于在手术操作诸如象肿瘤切除或动脉瘤修复过程中预防损伤或组织损害。

在又一个实施方案中，提供了通过给药与红细胞生成素结合的分子的组合物来促进分子穿过哺乳动物内皮细胞屏障的转胞吞作用的方法。要转运的分子和EPO之间的结合可以是例如与分子结合位点的不稳定共价键、稳定共价键或者非共价结合。在一个实施方案中，内皮细胞屏障可以是血脑屏障、血眼屏障、血睾丸屏障、血卵巢屏障或血胎盘屏障。

本发明还提供了用于经由转胞吞作用转运分子穿过内皮细胞屏障的组合物，它包含与EPO、EPO受体活性调制剂或EPO-活化受体调制剂结合的所述分子。在一个实施方案中，EPO是红细胞生成素、红细胞生成素类似物、红细胞生成素模拟物、红细胞生成素片段、杂合红细胞生成素分子、红细胞生成素受体结合分子、红细胞生成素激动剂、肾红细胞生成素、脑红细胞生成素、其寡聚体、其多聚体、其突变蛋白质、其同类物、其天然存在形式、其合成形式、其重组形式、或其联合形式。在另一个实施方案中，所述组合物的分子是激素、神经营养因子、抗微生物剂、放射药物、反义化合物、抗体、免疫抑制剂、毒素或抗癌剂。用于利用本发明的方法转运的合适的分子包括但不限于激素，诸如生长激素，抗生素，抗癌剂，和毒素。

参照以下附图和详细说明将更好地领会本发明的这些以及其他方面。

4.附图的简要描述

图1A-B.Morris水迷路试验。A、用每天接受外周给药的EPO或盐水(SHAM)的小鼠进行的Morris水迷路试验的结果。B、接受EPO的受验者的表现显著优于用SHAM治疗的受验者。回归线(R²＝0.88)显示显著不同于斜率1的斜率(0.68)，明显有利于EPO组。

图2A-C.条件性味觉移转试验。A、比较外周假物和EPO治疗对正经历条件性味觉移转试验的小鼠的水消耗量的影响。水消耗量表示为没有用氯化锂导致生病的对照小鼠消耗的体积百分数。B和C说明EPO-增强的学习是健康的，因为在避开含有与疾病相联的线索的水继续花更多的时间寻找水这方面，EPO受验者可比对照忍受大得多的渴感。

图3A-B.A、证明了外周给药的EPO预处理降低了癫痫发作的严重性并保护小鼠免受红藻氨酸神经毒素引起的惊厥和死亡的实验结果。每个条柱下面在圆括号中的数字指示接受每种红藻氨酸盐剂量的动物数。B显示了外周给药的EPO的保护作用随着EPO的每日给药而增加。C说明了EPO作用的开始被延迟，特征在于基因表达程序的诱导。

图4A-B描述了rhEPO对抗缺血性脑损伤(局灶性中风)的保护作用。A、在诱导脑局部缺血后的不同时间全身性给药EPO减小了梗塞的尺寸。B、以这种模型比较两种形式的EPO在保护脑免受损伤方面的作用：重组人EPO(rhEPO)和17氨基酸EPO衍生物(17聚体)，结果说明有些EPO类似物对神经保护是无效的。

图5描述了rhEPO对抗递送到大脑皮质中的钝器外伤的保护作用。

图6A-B描述了EPO对缺血性心脏损伤的保护作用。A、肌酸激酶(CK)活性，心肌细胞损害的指示剂。B、髓过氧化物酶(MPO)活性，炎症的量度。

图7显示小鼠用EPO治疗延迟并减少了由实验性变应性脑炎产生的神经病学症状，这是多发性硬化的一种模型。

图8A-B.A、在大鼠局灶性中风模型中提供神经保护的EPO的最小有效剂量。B、对雌性Balb/c小鼠腹膜内给药5000U rhEPO后不同时间点的EPO血清浓度。

图9A-C.A、EPO-R在毛细血管上及其周围的免疫定位。B、对小鼠IP给药的生物素化EPO在5小时的时候发现于离脑极近的周围毛细血管中。C、17小时后，可以在特异性神经元中发现生物素标记。

5.发明详述

本发明提供了用于使用红细胞生成素(EPO)来调制应激组织功能、诸如象增强认知功能和保护应激细胞免受毒性刺激的组合物和方法。特别是，本发明提供了包含EPO的组合物，以及将它们用于预防和治疗性处理包括药物释放的方法。本文中所用的应激组织包括但不限于中枢和外周神经系统的神经元组织以及心脏组织。

此处描述的发明提供了通过外周给药EPO、或EPO受体活化分子或显示EPO-活化受体活性的分子、以及利用通过其他非经典EPO受体起作用来摹拟EPO活性的任何分子来调制应激组织功能的方法。不受任何特定作用机理的束缚，这样的分子可以经由EPO受体发信号，例如，引发最终激活导致对应激组织功能的保护或增强的基因表达程序的信号转导级联。能与EPO受体相互作用并调制受体活性的分子，在本文中称作EPO或EPO受体活性调制剂，可在本发明范围内用于保护或增强应激组织功能。这些分子可以是例如天然存在的、合成的、或重组形式的EPO分子，如上所述，或是除了调制EPO受体活性以外不必然以任何方式类似于EPO的其他分子，如本文中所述。这些分子可以联合用于本文中描述的各种目的。

本文中描述的组合物和方法可以用于治疗和/或保护正常组织或异常组织，例如中枢神经系统的神经元、外周神经系统的神经元、或心脏组织。特别是，在下面的5.1部分中，描述了用于实施本发明的EPO组合物。在5.2.1部分中，描述了使用这类EPO组合物来增强应激组织的功能诸如学习、记忆和其他方面的认知功能的方法，而在5.2.2部分中，描述了保护应激组织免受损害和损伤的方法。在下面的5.2.3部分中还描述了EPO的意外的可通过毛细血管内皮细胞紧密接点的能力，这一发现提供了运送化合物穿过这类屏障的方法。最后，在5.3部分中描述了可以使用本发明的方法定向的疾病，而在5.4部分中描述了这类EPO组合物的给药方法和有效剂量。

5.1包含红细胞生成素的组合物

适合用于本发明的EPO组合物包括当外周给药时能激活EPO-活化受体来调制、即增强应激组织的功能、保护应激组织免受损害或损伤、或运送化合物到应激组织的任何红细胞生成素化合物。红细胞生成素是一种糖蛋白激素，它在人体内的分子量为34至38kD。成熟蛋白质包含166个氨基酸，而糖基残基占该分子重量的约40％。用于实施本发明的EPO形式包括天然存在的、合成和重组形式的下列分子：红细胞生成素、红细胞生成素类似物、红细胞生成素模拟物、红细胞生成素片段、杂合红细胞生成素分子、红细胞生成素受体结合分子、红细胞生成素激动剂、肾红细胞生成素、脑红细胞生成素、其寡聚体和多聚体、其突变蛋白质、以及其同类物。术语“红细胞生成素”和“EPO”可以互换或结合使用。

本文中提供了合成和重组分子，诸如脑EPO和肾EPO，EPO的重组哺乳动物形式，以及其天然存在的、来自于肿瘤的、和重组同种型，诸如重组表达的分子和通过同源重组制备的那些分子。此外，本发明包括包含结合EPO受体的肽的分子，以及重组构建物或具有EPO的部分或全部结构和/或生物学特性的其他分子，包括EPO的片段和多聚体或其片段。本文中EPO包含具有改变的EPO受体结合活性的分子，优选具有增加的受体亲和力，特别是当用于增强穿过内皮细胞屏障的转运时。本文中还包括包含具有另外或减少数目的糖基化位点的分子的突变蛋白质。如上所述，术语“红细胞生成素”、“EPO”和“模拟物”以及其他术语在本文中可互换使用来指与EPO有关的应激组织保护和增强分子以及能够穿过内皮紧密接点并如此用作其他分子的释放方式的分子。另外，本文中也包括利用转基因动物生产的分子。应当注意：包括在本文中的EPO分子除了与EPO受体相互作用或调制EPO受体活性或激活EPO-活化信号级联放大等能力外，并不必然在结构上或以任何其他方式与EPO相似，如上所述。

作为非限制性的实例，用于实施本发明的EPO的形式包括EPO突变蛋白质，诸如美国专利5,457,089和美国专利4,835,260中所述的在羧基端带有改变的氨基酸的那些；每个分子中带有不同数量的唾液酸残基的EPO同种型，诸如美国专利5,856,292中所述的；美国专利4,703,008中所述的多肽；美国专利5,767,078中所述的激动剂；如美国专利5,773,569和5,830,851中所述的结合EPO受体的肽；如美国专利5,835,382中所述的激活EPO受体的小分子模拟物；以及WO 9505465、WO 9718318和WO 9818926中所述的EPO类似物。上述所有引用文献都结合在此，就好象这类公开文献提到的是用于制备这类形式的本发明的红细胞生成素的各种交替形式或方法。

EPO可以从商业上获得(以商标PROCRIT从Ortho Biotech购得，和以商标EPOGEN从Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA购得)。

在本发明的另一个实施方案中，包含在本文中的EPO分子包括杂合EPO分子，可以制备成包含EPO受体调制活性以及另一种活性，例如生长激素的活性。具有多结构域的这类杂合分子因此具有与EPO受体相互作用的能力-也具有另一种分子诸如激素的活性。有两个结构域的这类分子的制备方法是本领域技术人员已知的。正如将在下面的5.2.3部分更详细地描述的那样，这类分子的一个特性是由EPO受体活性调制结构域提供的穿过内皮细胞屏障的转运，和靶位点上另一种分子的活性。

可以使用本文中所述的测定法来检验上述任何一种化合物，以确定能够调制应激组织，即增强其功能、保护其免受损害或损伤、或运送化合物至其中的EPO化合物。例如，可以使用5.2.1部分中描述的方法来检验EPO化合物增强应激组织功能、诸如学习、记忆和其他方面的认知功能的能力。有关认知功能的体内测定法的实例包括Morris水迷路试验，第6部分中描述了其的一个例子，和条件性味觉移转试验，第7部分中详细描述了其的一个例子。此外，可以使用5.2.2部分中描述的测定法来检验上述EPO化合物，以鉴别能保护应激组织免受损害和损伤的EPO化合物。在第8、9、10、11和12部分中描述的例子提供了这些测定法的具体实例。还可以使用诸如在下文中的5.2.3和第9部分中描述的那些测定法来鉴定EPO化合物运送化合物穿过内皮紧密接点诸如血脑屏障的能力。因此，适合用于本发明的EPO组合物包括当外周给药时能够通过EPO-活化受体发信号来调制应激组织、即增强其功能、保护其免受损害或损伤、或运送化合物至其中的任一和所有化合物。

5.2 本发明的预防和治疗性应用的方法

在本发明的各种实施方案中，EPO组合物可以用于保护应激组织免受损伤或低氧压力，增强应激组织的功能，或用于运送化合物穿过应激组织的内皮紧密接点。如上所述，本发明部分是基于这样的发现：EPO分子可以被从腔表面转运到有内皮细胞紧密接点的器官包括例如脑、视网膜和睾丸的毛细血管内皮细胞的基膜表面上。不希望受到任何特定理论的束缚，EPO转胞吞后，EPO可以与应激组织诸如象中枢神经系统的神经元、外周神经系统、或心脏组织上的EPO受体相互作用，而受体的结合可以引发导致应激组织中的基因表达程度激活的信号转导级联，产生对细胞的保护作用，使其免受诸如神经毒素、低氧症等的损害。因此，下文中详细描述了保护应激组织免受损伤或低氧压力、增强应激组织功能、和运送化合物穿过应激组织的紧密接点的方法。

5.2.1增强应激组织功能的方法

在一个方面，本发明涉及通过给药能够激活增强应激组织功能的基因表达程序的EPO分子来增强应激组织功能的方法。应激组织功能的增强增进了学习、联想学习和记忆能力。许多疾病和病况可以使用这种方法进行治疗，并且，该方法可在没有任何病况或疾病的情况下用于增强认知功能。本发明的这些应用在下文中作了更详细的描述，包括增强人和非人哺乳动物的学习和训练。

可以用本发明这个方面的方法进行治疗的病况和疾病包括能从神经元功能的增强中获益的任何病况或疾病。这类病患的实例包括中枢神经系统病患，包括但不限于心境障碍、焦虑症、抑郁、孤独癖、注意涣散多动症和认知机能障碍。可以用本发明的方法增强的认知功能的其他非限制性实例记载在第5.3部分中。

在一个实施方案中，例如，EPO分子可以对患有导致认知功能丧失的病症诸如象早老性痴呆的受验者或病人给药。

EPO增强认知功能的能力可以用实验动物使用本文中所述的任何一种方法或其他任何一种本领域公认的学习或认知功能模型进行检验。如第6和7部分中记载的实施例中所述，用正常实验动物通过数种充分确定的学习模型证明了外周给药的红细胞生成素增强了学习和认知功能。这类学习模型的例子是在第6部分中给出实例的Morris水迷路试验和在第7部分中给出实例的条件性味觉移转(CTA)实验。在一个实施方案中，例如，使用非常灵敏的、众所周知的标准试验-条件性味觉移转(CTA)试验来检验动物给药EPO后的认知功能。用CTA来检验动物学习将疾病与一种新颖刺激诸如味觉联系起来，使得动物在后来再次接受该新颖刺激时避开这种新颖味觉的能力。CTA在各种皮质和皮质下水平上累及脑。将产生厌恶行为的递增和递减的信息联合在一起的联想可以通过影响任何一种互连单元的改变来减弱或加强。作为联想学习的形式，CTA的强度决定于多种变量，包括口头刺激的新奇性(例如，非新颖刺激不能加以厌恶调节)，产生的“疾病”的程度(毒性)，重复次数(训练)，相反的动力(诸如渴感)等，这只是几个例子。尽管有许多化学和物理试剂可以剂量依赖方式产生CTA，但氯化锂能可靠地产生不适和厌食。象一种自然发生的疾病，锂通过刺激上述途径，包括细胞因子释放，来产生CTA。

应激细胞功能例如认知功能的增强为教育和工作环境中的个体提供了许多益处，并能提高训练和教育非人哺乳动物的能力。

5.2.2保护应激组织免受损伤的方法

在另一个实施方案中，本发明涉及保护哺乳动物使之免受应激组织损伤产生的病变的方法。保护作用是通过利用外周给药途径对哺乳动物给药适量的能有效地保护应激组织免受损伤的红细胞生成素实现的。正如在下面的第8部分的实施例中详细显示的那样，在红藻氨酸毒素之前给药的EPO对小鼠是显著的神经保护剂，提高了癫痫发作阈值并防止了死亡。EPO的神经保护作用强而持久。值得注意的是：在本文中见到的积极作用出现于相对给药EPO使达到血细胞比容增加来说太短的时间内，这是EPO的红细胞生成活性的结果。另外，如上面已经看到的那样，本发明的实施方案包括缺乏增加血细胞比容能力的EPO。

在一个实施方案中，本发明可以有利地用于如上所述的神经病学病患的急性和慢性预防和治疗，和用于增强正常或患病的脑的认知功能。上面已经看到，中枢神经系统中神经元的损害和死亡是严重的，常常导致死亡，使人群的发病率和死亡率都很高。急性神经病学损害可能发生在癫痫发作、惊厥、癫痫、中风、出血、中枢神经系统损伤、低氧症、低血糖、低血压和脑或脊髓外伤过程中或者这些疾病的结果。本发明提供了用于治疗急性事件的急性给药方案。

在一个实施方案中，例如，本发明的方法可以用于保护哺乳动物免受由脑的辐射损害导致的损伤。

在另一个实施方案中，可以按照本发明治疗或预防的严重病况是预防和治疗产前低氧状况下的子宫，在出生后进行治疗以保护脑免受生产过程中持续的低氧损伤，以及预防和治疗窒息、淹溺和其中中枢神经系统存在因缺氧或接受其他神经毒性刺激而产生神经毒性损害危险的其他病况。众所周知，在分娩过程中遭受氧不足的个体，或者作为非致命的低氧事故或事件的结果，可能导致终身的神经病学缺陷。外伤后或在手术操作过程中可能出现的低氧症和/或大脑血流中断也带来引起终身神经病学缺陷的危险。

手术后认知机能障碍，包括使用心-肺机后的短缺，也可以用本文中提供的方法进行治疗。另外，本发明方法可以用于治疗一氧化碳中毒或吸入烟雾引起的低氧症。

在另一个实施方案中，用EPO来保护心脏组织使其免受局部缺血、梗塞形成、炎症或外伤过程中持续的损伤。

这些是可以按照本发明进行治疗的应激组织损害的非限制性实例。对这些病患的及时和早期治疗可以由可移动医疗紧急健康护理专业人员进行，以便一旦在对神经病学损害的可能性确定后就尽快开始治疗。由分娩诱导的神经病学损害的危险可以通过在分娩前或分娩过程中对胎儿进行预防性治疗而得以减少。这些以及其他功用和情况将由技术人员识别。

5.2.3化合物的运送方法

本发明还涉及通过给药包含与红细胞生成素联合的特定分子的组合物来帮助将分子转运穿过哺乳动物体内的内皮细胞屏障的方法。上面已经看到，发明人在此处发现了迄今未料想到的且令人惊讶的外周给药的EPO对应激组织、诸如中枢神经系统、外周神经系统、或心脏组织中的神经元组织的活性，确定EPO是能够穿过这类应激组织的紧密接点诸如血脑屏障的分子。这样，EPO就可用作运送其他分子穿过血脑屏障和其他类似屏障的载体。

在一个实施方案中，包含与EPO分子缀合的分子的EPO受体结合分子可以用于转运那些分子穿过血脑屏障。这类分子可由此携带在用于穿过BBB释放的EPO上。在另一个实施方案中，抗体或分子的其他结合配偶体可以与EPO联合，或与EPO受体活性调制剂联合，由此通过非共价结合将要转运的分子与结合配偶体结合起来，其再进一步与可转运的EPO分子结合。在另一个实施方案中，包含EPO受体的抗体的EPO受体结合分子可用于此处描述的方法。这类抗体提供了可以携载其他分子的转运载体，大多以相同的方式：一直以来都使用转铁蛋白受体的抗体来获得穿过血脑屏障的能力(Pardridge等，1991，“抗转铁蛋白受体抗体在体内通过血脑屏障的选择性转运”，《药理学与实验治疗学杂志》27：66)。

技术人员会知道将分子与EPO和上述其他试剂通过共价、非共价和其他方式结合起来的各种方式；另外，对组合物效能的评估可以容易地用实验系统确定。分子与EPO和类似物的结合可以周许多方式实现，包括不稳定的共价结合、交联等等。在一个实施方案中，例如，要转运穿过屏障的分子与红细胞生成素之间的结合可以是不稳定的共价键，在这种情况下，分子穿过屏障后从与EPO的结合物中释放。在一个实施方案中，可以使用生物素/抗生物素蛋白相互作用。在另一个实施方案中，如上文中提到的，可以通过重组或合成方式制备杂合分子，例如，它包括分子的具有所需药理学活性的结构域和能引起EPO受体活性调制的结构域。

分子可以通过多功能分子、即多功能交联剂与EPO或EPO受体活性调制剂缀合。本文中所用的术语“多功能分子”包括具有一个能不止一次连续反应的官能团的分子，诸如甲醛，以及具有一个以上活性基的分子。本文中所用的术语“活性基”指的是交联剂上的与分子(例如要运送穿过内皮细胞屏障的肽、蛋白质、糖类、核酸、特定激素、抗生素、或抗癌剂)上的官能团反应的官能团，以便在交联剂和该分子之间形成共价键。术语“官能团”保持其在有机化学中的标准含义。可以使用的多功能分子优选生物相容性接头，即它们在体内是非致癌的、非毒性的、和基本上非致免疫的。多功能交联剂诸如本领域中已知的那些和本文中描述的那些可以容易地用动物模型加以检验以确定它们的生物相容性。多功能分子优选为双功能分子。本文中所用的术语“双功能分子”指的是具有两个活性基的分子。双功能分子可以是异双功能分子或同双功能分子。异双功能交联剂允许向量缀合。对于多功能分子来说特别优选的是能充分溶于水，使交联反应在水溶液中发生，诸如在pH6-8的缓冲水溶液中，并使所得缀合物保持水溶性以更有效地生物分布。一般说来，多功能分子与氨基或巯基官能团共价键合。不过，本发明中也包括带有其他官能团、诸如羧酸或羟基的活性多功能分子。

同双功能分子有至少两个活性官能团，它们是相同的。同双功能分子上的活性官能团包括例如醛基和活性酯基。具有醛基的同双功能分子包括例如戊二醛和辛二醛。Poznansky等在《科学》223，1304-1306(1984)中公开了将戊二醛用作交联剂。具有至少两个活性酯单元的同双功能分子包括二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺的酯。这类N-琥珀酰亚胺基酯的一些实例包括辛二酸二琥珀酰亚胺基酯和二硫-双-(丙酸琥珀酰亚胺基酯)，以及它们的可溶性双磺酸和双磺酸酯盐，诸如它们的钠盐和钾盐。这些同双功能试剂可以从Pierce，Rockford，Illinois购得。

异双功能分子具有至少两个不同的活性基。活性基与例如存在于EPO和分子上的不同官能团反应。与异双功能交联剂上的活性基反应的两个不同官能团通常是氨基，例如赖氨酸的ε氨基；巯基，例如半胱氨酸的巯基；羧酸，例如天门冬氨酸上的羧酸酯；或羟基，例如丝氨酸上的羟基。

当异双功能分子的活性基与氨基形成共价键时，该共价键通常将是酰氨基或亚氨基键。与氨基形成共价键的活性基可以是，例如活化羧酸酯基、卤代羰基或酯基。优选的卤代羰基是氯羰基。酯基优选活性酯基，诸如象N-羟基-琥珀酰亚胺酯基。

其他官能团一般是巯基、能够转化为巯基的基团、或者是与硫基形成共价键的基团。该共价键通常将是硫醚键或二硫键。与巯基形成共价键的活性基可以是例如与巯基或活化二硫键反应的双键。含有能够与巯基反应的双键的活性基是马来酰亚胺基，不过也有可能是其他的，诸如丙烯腈。活性二硫化物基可以是，例如2-吡啶基二硫基或5，5′-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)基。含有活性二硫键的异双功能试剂的一些实例包括N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基-二硫基)丙酸酯(Carlsson等，1978，《生物化学杂志》173：723-737)，5-4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基苄基硫代硫酸钠，和4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基(2-吡啶基二硫基)甲苯。优选N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯。包含具有与巯基反应的双键的活性基的异双功能试剂的一些实例包括琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯和琥珀酰亚胺基间马来酰亚胺基苯甲酸酯。

其他异双功能分子包括琥珀酰亚胺基3-(马来酰亚胺基)丙酸酯，磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基-苯基)丁酸酯，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基-环己烷)-1-羧酸酯，马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯。优选琥珀酰亚胺基间马来酰亚胺基苯甲酸酯的磺酸钠盐。上述异双功能试剂和它们的磺酸盐中许多可以从Pierce购得。

技术人员可以容易地确定对上述将是可逆或不稳定的缀合的需要。可以在体外检验缀合物的EPO受体活性调制活性，以及期望的药理学活性。如果缀合物保留了这两种性能，就可接着检验其在体内的适应性。如果缀合分子需要与EPO分离的活性，将优选与EPO不稳定键合或可逆结合。不稳定性特征也可以在进行体内测试前使用标准体外操作加以检验。

有关如何制备和使用这些以及其他多功能试剂的其他信息可以从下列出版物或本领域中可获得的其他途径得到：Carlsson等，1978，《生物化学杂志》173：723-737；Cumber等，1985，《酶学方法学》112：207-224；Jue等，1978，《生物化学》17：5399-5405；Sun等，1974，《生物化学》13：2334-2340；Blattler等，1985，《生物化学》24：1517-152；Liu等，1979，《生物化学》18：690-697；Youle和Neville，1980，《美国国家科学院院报》77：5483-5486；Lerner等，1981，《美国国家科学院院报》78：3403-3407；Jung和Moroi，1983，《生物化学与生物物理学学报》761：162；Caulfield等，1984，《生物化学》81：7772-7776；Staros，J.V.，1982，《生物化学》21：3950-3955；Yoshitake等，1979，《欧洲生物化学杂志》101：395-399；Yoshitake等，1982，《生物化学杂志》92：1413-1424；Pilch和Czech，1979，《生物化学杂志》254：3375-3381；Novick等，1987，《生物化学杂志》262：8483-8487；Lomant和Fairbanks，1976，《分子生物学杂志》104：243-261；Hamada和Tsuruo，1987，《分析生物化学》160：483-488；和Hashida，1984，《应用生物化学杂志》6：56-63。另外，Means和Feeney，1990，《生物缀合物化学》1：2-12中回顾了交联的方法。利用本发明的上述方法和组合物穿过的屏障包括但不限于血脑屏障、血眼屏障、血睾丸屏障、血卵巢屏障和血胎盘屏障。

用于转运穿过内皮细胞屏障的候选分子包括，例如：激素诸如生长激素，神经营养因子，抗生素或抗真菌剂诸如通常受到脑和其他屏障器官排斥的那些，肽类放射药物，反义药物，生物学活性试剂的抗体，药物，和抗癌剂。这类分子的非限制性实例包括生长激素，神经生长因子(NGF)，脑衍生神经营养因子(BNF)，睫状神经营养因子(CTF.)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，转化生长因子β1(TGFβ1)，转化生长因子β2(TGFβ2)，转化生长因子β3(TGFβ3)，白介素1，白介素2，白介素3和白介素6，AZT，针对肿瘤坏死因子的抗体，和免疫抑制剂诸如环孢菌素。

在另一个实施方案中，包含EPO的重组嵌合毒素分子可以用于毒素的治疗性释放，以治疗病毒性疾病或增殖性疾病，诸如癌症。可以与EPO稠合来构建适于此实施方案的嵌合毒素的化合物包括但不限于毒性物质，诸如假单胞菌外毒素、白喉毒素、和蓖麻毒蛋白，等等。

5.3目标病况

如上所述，本文中提供的EPO组合物和它们的使用方法可以用于治疗和预防由低氧状况引起的疾病，这些疾病会不利地影响应激组织，诸如中枢神经系统组织、外周神经系统组织或心脏组织中的应激组织，诸如象脑、心脏或视网膜。因此，本发明可以用于治疗或预防在各种各样的病况和事件中由低氧状况引起的对应激组织的损害。下文中提供了这类病况和事件的非限制性实例。

在可按照本发明进行治疗的神经元组织病变的保护的实例中，这类病变包括由神经元组织的氧合作用减少而产生的那些。会减少神经元组织对氧的利用性、导致压力、损害和最终神经元细胞死亡的任何病况都可用本发明的方法进行治疗。统称为低氧症和/或局部缺血的这些病况来自于或者包括但不限于中风、血管闭塞、产前或产后缺氧、窒息、壅塞、几乎淹溺、一氧化碳中毒、吸入烟雾、外伤、包括手术和放射治疗、无脉、癫痫、低血糖、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、成人呼吸窘迫综合征、低血压休克、脓毒性休克、过敏性休克、胰岛素休克、镰状细胞危象、心搏停止、节律障碍、和氮麻醉。

在一个实施方案中，例如，可以给药EPO来预防由在手术操作诸如象肿瘤切除或动脉瘤修复过程中的损伤或组织损害危险引起的损伤或组织损害。

可以用本文中描述的方法治疗的由低血糖引起或产生的其他病变包括胰岛素配药过量，也称作医原性高胰岛素血，胰岛瘤，生长激素缺乏，肾上腺皮质机能减退，药物配药过量，和某些肿瘤。

由应激神经元组织损害产生的其他病变包括癫痫发作，诸如癫痫、惊厥或慢性癫痫发作。其他可治疗的病况和疾病包括这类疾病：诸如中风、多发性硬化、低血压、心搏停止、早老性痴呆、帕金森氏病、大脑性麻痹、脑或脊索外伤、AIDS痴呆、与年龄有关的认知功能丧失、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化、癫痫发作、醇中毒、视网膜局部缺血、青光眼产生的视神经损害、和神经元损失。

本发明的方法可以用于治疗视网膜组织的疾病和对其的损害。这类病患包括但不限于黄斑变性、视网膜脱离、色素性视网膜炎、动脉硬化性视网膜病、高血压性视网膜病、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、低血压、和糖尿病性视网膜病。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以用于保护或治疗由对应激组织的放射损害产生的损伤。

本发明方法的其他功用是治疗神经毒素中毒，诸如软骨藻酸牡蛎中毒、神经山黧豆中毒和关岛病，肌萎缩性侧索硬化，和帕金森氏病。

如上文中提到的，本发明还涉及通过外周给药红细胞生成素来增强哺乳动物应激组织功能的方法。许多疾病和病况可以使用该方法进行治疗，并且，该方法可在没有任何病况或疾病的情况下用于增强认知功能。本发明的这些应用在下文中作了更详细的描述，包括增强人和非人哺乳动物的学习和训练。

可以用本发明这个方面的方法治疗的涉及中枢神经系统的病况和疾病包括但不限于心境障碍、焦虑症、抑郁、孤独癖、注意涣散多动症和认知机能障碍。这些病况可从神经元功能的增强中获益。

可按照本发明的教导进行治疗的其他病患包括睡眠分裂，例如睡眠呼吸暂停和与履行有关的病患；蛛网膜下和动脉瘤出血，低血压休克，震荡性损伤，脓毒性休克，过敏性休克，和各种脑炎和脑膜炎的后遗症，例如与结缔组织疾病有关的大脑炎诸如狼疮。其他用途包括预防或保护使免受神经毒素中毒，诸如软骨藻酸牡蛎中毒、神经山黧豆中毒和关岛病，肌萎缩性侧索硬化，帕金森氏病；对栓塞或缺血性损伤的手术后治疗；全脑照射；镰状细胞危象；和惊厥。

另一组可用本发明方法治疗的病况包括遗传或获得性的线粒体机能障碍，它们是多种以神经元损伤和死亡为象征的神经病学疾病的原因。例如，利氏病(亚急性坏死性脑脊髓病)的特征在于进行性视觉丧失和脑脊髓病，是由神经元掉离和肌病导致的。在这些情况下，有缺陷的线粒体代谢不能提供足够的高能量底物来供给应激细胞代谢的燃料。EPO受体活性调制剂优化了各种线粒体疾病中失败的功能。

如上文中提到的，低氧状况会不利地影响应激组织。应激组织包括但不限于中枢神经系统组织、外周神经系统组织和心脏组织。除了上述病况以外，本发明的方法还可用于治疗吸入性中毒诸如吸入一氧化碳和烟雾，严重哮喘，成人呼吸窘迫综合征，以及壅塞和几乎淹溺。会造成低氧状况或通过其他方式诱导应激组织损害的其他病况包括可能在不适当给药胰岛素中出现的低血糖，或带有产生胰岛素的赘生物(胰岛瘤)的低血糖。

据信来源于应激组织损害的各种神经心理学病患可以用本方法进行治疗。其中可能涉及神经元损害并可用本发明治疗的慢性病患包括涉及中枢神经系统和/或外周神经系统的病患包括与年龄有关的认知功能丧失和老年性痴呆，慢性癫痫发作，早老性痴呆，帕金森氏病，痴呆，记忆丧失，肌萎缩性侧索硬化，多发性硬化，结节性硬化，肝豆状核变性，大脑和进行性核上性麻痹，关岛病，雷维小体性痴呆，朊病毒性疾病，诸如海绵状脑脊髓病，例如克罗伊茨费尔特-雅各布疾病，杭廷顿氏舞蹈病，肌强直性营养不良，Freidrich共济失调和其他共济失调，以及图雷特综合征，癫痫发作疾病诸如癫痫和慢性癫痫发作，中风，脑或脊髓外伤，AIDS痴呆，醇中毒，孤独癖，视网膜局部缺陷，青光眼，自主功能疾病诸如高血压和睡眠疾病，以及神经精神病学病患，包括但不限于精神分裂症，分裂情感性精神障碍，注意力涣散症，精神抑郁症，重性抑郁症，躁狂，着迷-强迫性精神障碍，应用精神作用物质所致精神障碍，焦虑，惊恐性障碍，以及单相性和双相性精神障碍。其他神经精神病学和神经变性疾病包括，例如在美国精神病学协会的精神病诊断和统计手册(DSM)中列出的那些，其最流行的版本整个结合在此作为参考。

在另一个实施方案中，包含EPO的重组嵌合毒素分子可以用于毒素的治疗性释放来治疗增殖性病患，诸如癌症，或病毒性病患，诸如亚急性硬化性全脑炎。

5.4药物制剂和给药

按照本发明，EPO、其类似物、模拟物、红细胞生成素片段、杂合红细胞生成素分子、红细胞生成素受体结合分子、红细胞生成素激动剂、肾红细胞生成素、脑红细胞生成素、其突变蛋白质、以及其同类物可以胃肠外给药，经粘膜给药，例如口服、经鼻、直肠、阴道内、舌下、粘膜下层或经皮给药。优选胃肠外给药，例如通过静脉内或腹膜内注射，并且还包括但不限于动脉内、肌内、真皮内和皮下给药。小分子EPO模拟物的优选给药途径是利用口服途径。

以外周给药EPO为有效治疗方案的受治疗者优选人，但也可以是任何动物，优选哺乳动物。因此，正如本领域普通技术人员可轻易领会到的那样，本发明的方法和药物组合物特别适于对任何动物、特别是哺乳动物给药，包括但决不限于家养动物，诸如猫科或犬科动物受治疗者，农场动物，诸如但不限于牛、马、山羊、绵羊和猪受治疗者，野生动物(无论是在野外还是在动物园中的)，研究动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、猪、狗、猫等等。如上面已经看到的那样，驯养的动物，包括宠物和劳作的动物，既是本发明的神经保护益处的候选者，也是认知功能增强的候选者。由低氧症以及急性和慢性病患包括癫痫引起的神经病学损害在这类动物中是常见的，因此是治疗的候选者。在上文中还看到，非人动物的认知增强是本发明的一个益处，于是学习、训练和学会行为的保持可以使用本发明的教导得以增强、补充和维持。这样，宠物拥有者的开支和心理压力就减少了。例如，训练狗和其他家庭动物所需的时间减少了。此外，一般很难训练的野生动物也可以更好地利用本发明的方法进行训练。

5.4.1制剂和有效剂量

本发明还提供了药物组合物。包含EPO和EPO受体活性调制剂的药物组合物可以治疗有效剂量对患者给药来保护应激组织免受损害、增强应激组织的功能、或将化合物运送至应激组织。申请人发现抬高剂量的EPO对调制应激组织和保护其免受损伤来说是优选的。

优选有效剂量的选择将由技术人员在考虑了若干因素的基础上确定，这些因素将是本领域普通技术人员已知的。这些因素包括红细胞生成素的特定形式及其药动学参数诸如生物利用度、代谢、半衰期等，它们将是在一般用于获得对药物化合物的管理批准时通常的研制过程中就已确定的。就剂量来说要考虑的其他因素包括要治疗的病况或疾病或要在正常个体中实现的好处、患者的身体状况、给药途径、给药是急性的还是慢性的、并行的药物治疗、以及众所周知的影响所给药剂功效的其他因素。因此精确的剂量应当根据医师的判断和每位患者的具体情况来定，例如根据按照标准临床技术确定的患者个体的病情和免疫状态。

在一个实施方案中，本发明提供了适于调制应激组织、增强认知功能或运送化合物穿过内皮紧密接点的剂量单位形式的药物组合物，每剂量单位包含有效无毒量的约50,000至500,000单位、60,000至500,000单位、70,000至500,000单位、80,000至500,000单位、90,000至500,000单位、100,000至500,000单位、150,000至500,000单位、200,000至500,000单位、250,000至500,000单位、300,000至500,000单位、350,000至500,000单位、400,000至500,000单位或450,000至500,000单位范围内的EPO、EPO受体活性调制剂、或EPO-活化受体调制剂和药学上可接受的载体。在优选的实施方案中，EPO的有效无毒量在约50,000至500,000单位范围内。

在一个实施方案中，EPO的这种药物组合物可以全身性给药来保护应激组织免受损害、增强应激组织的功能、或运送化合物至应激组织。这种给药可以是胃肠外的，经粘膜的，例如口服、经鼻、直肠、阴道内、舌下、粘膜下层或经皮给药、优选胃肠外给药，例如通过静脉内或腹膜内注射，并且还包括但不限于动脉内、肌内、真皮内和皮下给药。

在一个优选的实施方案中，EPO可以每次给药2000-10000单位/kg体重、优选约2000-5000单位/kg体重、首选5000单位/kg体重的剂量全身性给药。这种有效剂量应当在EPO给药后足以使EPO的血清浓度大于约10,000、15,000或20,000mU/ml血清。这种血清浓度可以在给药后约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时达到。根据需要可以反复给予这些剂量。例如，只要临床上需要，可以每天重复给药，或者在适当的间隔后给药，例如每1到12周给药一次，优选每3到8周给药一次。在一个实施方案中，有效量的EPO和药学上可接受的载体可以包装在单剂小瓶或其他容器中。在一个实施方案中，EPO是非红细胞生成性的，即它能产生本文中描述的活性但不会引起血红蛋白浓度或血细胞比容的增加。在另一个实施方案中，EPO以比最大地刺激红细胞生成所需的剂量更大的剂量给药。

本发明的药物组合物可以包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”是指被联邦或州政府的管理机构批准的或者列在美国药典或其他普遍承认的药典中用于动物、更特别是用于人的。术语“载体”指的是与治疗剂一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这类药物载体可以是无菌液体，诸如盐水的水和油溶液，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物静脉给药时，盐水溶液是优选的载体。盐水溶液和含水葡萄糖以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、一硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、缓释制剂等形式。组合物可以配制成栓剂，带有传统的粘合剂和载体诸如甘油三酯。本发明化合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的那些，诸如从盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等得到的那些，和与游离羧基形成的那些，诸如从氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等得到的那些。合适的药物载体的实例是在E.W.Martin的“Remington药物科学”中记载的。这类组合物将含有治疗有效量的化合物，优选为纯化形式，再加上适宜量的载体，以便为患者提供合适的给药形式。制剂应当与给药方式相适应。

适于口服给药的药物组合物可以制成胶囊或片剂；制成粉末或颗粒；制成溶液、糖浆或悬浮液(在含水或非含水液体中)；制成可食用泡沫或打散泡沫剂(whips)；或者制成乳剂。片剂或硬明胶胶囊剂可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软明胶胶囊剂可以包含植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。溶液和糖浆剂可以包含水、多元醇和糖。

打算口服给药的活性药剂可以用能延迟活性药剂在胃肠道中的崩解和/或吸收的物质包衣或与之混合(例如可以使用一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)。因此，活性药剂的持续释放可以经过数小时达到，并且如果需要，可以保护活性药剂使其不在胃中被降解。用于口服给药的药物组合物可以进行配制后用于帮助将活性药剂根据特定pH或酶条件释放在特定胃肠部位。

适于经皮给药的药物组合物可以制成打算与接受者的表皮保持长时间紧密接触的离散贴敷片剂。适于局部给药的药物组合物可以制成软膏剂、膏霜剂、悬浮液、洗液、粉末剂、溶液剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油剂。至于对皮肤、口腔、眼睛或其他外部组织的局部给药，优选使用局部软膏剂或膏霜剂。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。另一方面，活性成分可以与水包油型基质或油包水型基质一起配制成膏霜剂。适于对眼睛局部给药的药物组合物包括滴眼剂。在这些组合物中，活性成分可以溶解或悬浮于合适的载体例如含水溶剂中。适于在口腔中局部给药的药物组合物包括锭剂、软锭剂和漱口剂。

适于鼻部给药的药物组合物可包含固体载体诸如粉末(优选粒径在20至500微米范围内)。粉末剂可以用鼻吸药的方式给药，即从放在鼻子近处的粉末容器中通过鼻子迅速吸入给药。另一方面，适于鼻部给药的组合物可以包含液体载体，例如鼻喷雾剂或滴鼻剂。这些组合物可以包含活性成分的水或油溶液。用于通过吸入给药的组合物可以装在专门配套的设备中，包括但不限于加压气溶胶、喷雾器或吹入器，它们可以装配成能提供预定剂量的活性成分。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物经由鼻腔给药到肺部。

适于直肠给药的药物组合物可以配制成栓剂或灌肠剂。适于阴道给药的药物组合物可以配制成阴道栓、阴道塞、膏霜、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。

适于胃肠外给药的药物组合物包括含水和不含水的无菌注射溶液或悬浮液，它们可以含有抗氧剂、缓冲剂、制菌剂和使得组合物基本上与预期接受者的血液等渗的溶质。这类组合物中可以存在的其他成分包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。适于胃肠外给药的组合物可以装在单剂或多剂容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并可以冷冻干燥(冻干)状态储存，只需要在即刻使用前加入无菌液体载体例如注射用无菌盐水溶液即可。当时配制用的注射溶液和悬浮液可以用无菌粉末、颗粒和片剂制备。

在优选实施方案中，组合物按照常规操作配制成适于对人类静脉内给药的药物组合物。一般说来，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。需要时，该组合物还可包括增溶剂和局麻剂诸如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。通常，各成分分离或混合在一起地制成单位剂型，例如制成干燥的冻干粉末或无水浓缩物装在密封容器诸如指示出活性药剂量的安瓿或药囊中。当组合物打算通过输液给药时，它可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶调剂。当组合物通过注射给药时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便各成分可以在给药前混合。

栓剂通常含有0.5％至10重量％范围内的活性成分；口服制剂通常含有10％至95％的活性成分。

本发明还提供了包含填充了一种或多种本发明药物组合物各成分的一个或多个容器的药包或试剂盒。这些容器可选地伴随有为由调控药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的说明书，该说明书反映了管理机构批准其出于对人给药的目的制造、使用或销售。

5.4.2给药方法

本发明提供了外周给药EPO来增强功能或保护应激组织和运送化合物至这类组织的组合物和方法。如上面所看到的那样，本发明部分地基于这样的发现：外周给药的EPO在应激组织、诸如中枢神经系统组织、外周神经系统组织或心脏组织中具有直接的神经保护或神经增强性能。本文中所用的“应激组织”包括但不限于中枢和外周神经系统的神经元组织以及心脏组织。本部分描述了这类化合物以及它们的给药方法。

本发明提供了利用不同于直接给药到中枢神经系统的给药途径来给药EPO和EPO受体活性调制剂的方法，这些不同途径统一用术语“外周”和“全身”途径表示。外周给药包括口服或胃肠外给药，诸如静脉内、动脉内、皮下、肌内、腹膜内、直肠、粘膜下层或真皮内给药。也可使用其他途径给药本文中所述的药剂。本文中提供了急性和慢性给药。

在一个实施方案中，例如，EPO可以用控释系统释放。例如，多肽可以使用静脉内输液、可植入渗透泵、经皮贴敷片、脂质体或其他给药方式给药。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton，1987，《CRC Crit.Ref.Biomed.Eng》14：201；Buchwald等，1980，《外科学》88：507；Saudek等，1989，《新英格兰医学杂志》321：574)。在另一个实施方案中，化合物可以用载体、特别是脂质体释放(参见Langer，《科学》249：1527-1533(1990)；Treat等，载于《传染病和癌症治疗中的脂质体》，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，New York，353-365页(1989)；WO 91/04014；美国专利No.4,704,355；Lopez-Berestein，出处同上，317-327页；普遍地参见上述文献)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料[参见《控释的医学应用》，Langer和Wise(编辑)，CRC Press：Boca Raton，Florida，1974；《可控的药物生物利用度：药品的设计和表现》，Smolen和Ball(编辑)，Wiley：NewYork(1984)；Ranger和Peppas，《大分子科学评论与大分子化学杂志》23：61，1953；还参见Levy等，1985，《科学》228：190；During等，1989，《神经病学纪事》25：351；Howard等，1989，《神经外科学杂志》71：105)。

在又一个实施方案中，可以将控释系统置于治疗目标、即脑附近，因此只需要一小部分全身剂量(参见，例如：Goodson，115-138页，载于《控释的医学应用》，第2卷，同上，1984)。在Langer(1990，《科学》249：1527-1533)的回顾中讨论了其他控释系统。

在另一个实施方案中，经过适当制剂的EPO可以通过鼻、口腔、直肠、阴道或舌下途径给药。

在一个具体的实施方案中，可以预期将本发明的EPO组合物局部给药到需要治疗的区域；这可以通过这样一些方式实现：例如但不限于手术过程中局部输注，局部应用，例如与手术后的伤口敷料结合，通过注射，借助导管，借助栓剂，或借助植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状物质，包括膜，诸如硅橡胶膜，或纤维。

参照以下非限制性实施例可以更好地理解本发明，这些实施例只是作为本发明的示范。给出以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方案。但是，它们决不应当理解为是对本发明宽范围的限制。

正如下文中描述的那样，在此处发明人进行的研究都是在能预示预防和治疗益处的动物模型上进行的标准的、全世界公认的试验。

6.实施例1：外周给药的EPO增强了认知功能

在该实施例中，一种称作Morris水迷路试验的空间定位实验显示了EPO诱导的小鼠认知功能的增强。在该试验中，将一个小的透明平台置于四分之一的带有不透明水的游泳池中。放到该游泳池中的小鼠必须游泳，直到它们到达表面下的休息平台上，该平台是游泳的小鼠看不到的。试验包括测量动物到达平台所用的时间(即它们游泳所花费的时间长度)。在连续试验中，每只小鼠到达平台所用的时间将作为学习其定位的它们的函数减少。这种学习实验类型涉及海马，因为海马损害在该试验中妨碍学习。

实验在一个直径为150cm的圆形黑池子中进行。任意指派四个点为北、南、东和西。每四分之一部分赋予一些可视的区别线索：例如，闪光、四方形布置的明亮的带子等等，以确定小鼠在池中的方向。平台任意放置在一个四分之一圆中。试验包括将动物头向前地放到池子的一个四分之一圆中并松开它。试验长度总共为90秒。如果动物没能到达平台，就将它置于平台上再呆15秒。让受验动物休息1小时，然后放到另一个四分之一圆中进行测试。在1天的试验中所有4个四分之一圆都要使用，且动物连续试验12天(即，总共48次试验)。

实验本身包括在12天试验的每一天中，在开始当天的试验之前4小时给每只小鼠腹膜内注射5000U/kg的重组人EPO(Ortho-Biotech公司以商品名PROCRIT出售的)。对照动物用盐水假注射。

通过测量每只小鼠在平台上的时间长度来估量学习情况。如图1A中所示，根据EPO治疗组和假物组在平台上的时间将结果绘图。结果显示，在连续的每个试验日子里，这两组动物都花了更多的时间在平台上，即它们学会了更快地到达平台，但EPO治疗动物确实比假物组更快地做到这一点。因此EPO治疗动物具有比假物组更快的“学习曲线”。当结果表示为EPO治疗组与假物治疗组之间的差异，并对EPO和假物治疗组的结果进行对比时，回归线(R²＝0.88)显示显著不同于斜率1的斜率(0.68)，明显有利于EPO组(图1B)。

7.实施例2：外周给药的EPO加强了学会的条件性味觉移转

本实施例中进行的条件性味觉移转(CTA)试验证明：EPO显著地影响了小鼠记忆并学会避开讨厌的味觉感受的能力，讨厌的味觉感受在本实验的情况下是导致疾病的物质。在本实施例中，用氯化锂来产生CTA，因为氯化锂能以剂量依赖方式可靠地产生不适和厌食。象一种自然发生的疾病，锂通过刺激上文中所述的途径，包括细胞因子释放，来产生CTA。

训练雌性Balb/c小鼠，将它们每天的总摄水量限制到一天饮用一次5分钟，并学会在此期间饮够足量的水来保持平衡。将动物分成几组并给药假物对照(盐水)或EPO(5000U/kg)，腹膜内注射(IP)，在给予新奇的糖精-香草液体之前4小时给药。饮用完甜的液体后，动物立即接受盐水或致病剂量的锂(20mg/kg，0.15M LiCl，IP注射)。之后，动物分成三组进行处理。第一组(对照)饮水后不注射锂。第二组注射锂和EPO。第三组(假物)注射盐水(没有EPO)和锂。

通过测量在其后接着接触致病溶液-新奇的糖精-香草液体的饮水的减少来估量条件性味觉移转。从锂或假物治疗中恢复5天后，对缺水的动物再次给予相同的新奇的糖精-香草液体。图2A中显示了与组1(对照)相对比的组2和组3结果的绘图。第2天代表动物习惯试验笼后水消耗的基线。在第3天，动物腹膜内注射盐水或EPO(5000U/kg)，4小时后给予新奇的糖精-香草液体，接着用锂或假物盐水处理(箭头)。在第3天时，这种处理导致所有组中的液体消耗少量减少，这是注射和新奇的液体先前已证明过的副作用。对于对照组，恢复后，用于确定CTA的第一次试验显示水消耗没有减少。但是，接受了锂的动物显示事实上完全厌恶该液体，尽管它缺水(第4天)。连续缺水最终使CTA消失(第5-9天)，但特征是接受了EPO的动物恢复得显著更迟，如图2A中的实心圆所示。

通过考虑每个试验日子里的缺水程度可更好地领会此处确立的CTA的稳健性，因为忍受缺水的EPO治疗动物大约是假物注射受验动物的两倍(图2B)。尽管EPO组显示了明显强烈的CTA，但该组中的动物与假物组相比更迅速地接近饮水管，如图2C中所示。CTA的强度通过重复注射单独的锂(没有EPO)来显示，这产生了减弱的CTA，在EPO组中减弱得更多(图2A，第10天)。这些数据显示EPO预处理与用锂产生的CTA的显著加强有关。

8.实施例3：外周给药的EPO保护脑免受兴奋毒素的伤害

本实施例证明EPO穿过了血脑屏障并对用红藻氨酸神经毒素处理的小鼠有神经保护作用。大自然中存在许多对神经元显示特异性毒性的化合物。这些分子一般与氨基酸递质谷氨酸盐的内源性受体相互作用，随后引起过度刺激和神经元损伤。这些中的一点：广泛用于研究因兴奋毒性导致的神经元损伤的物质红藻氨酸盐，是一种谷氨酸盐类似物。红藻氨酸盐是特异性破坏神经元的一种强神经毒素，特别是位于有高密度红藻氨酸盐受体的区域诸如海马中的那些，它诱导癫痫发作、脑损伤和死亡。

以下神经毒性研究使用红藻氨酸盐用小鼠进行。这种模型用于评定治疗对疾病诸如精神运动性癫痫的保护益处。对实验动物诸如大鼠和小鼠进行胃肠外注射，以剂量依赖方式引起部分(缘)癫痫发作，然后其可能扩散并引起死亡。进行该部分中记载的实验来测试外周给药的EPO是否穿过血脑屏障，如果是，EPO对神经元能量平衡是否有作用，特别是它是否具有对抗红藻氨酸盐的神经保护作用。

为此，对雌性Balb/c小鼠(平均重15-20gm)进行预测，在接受红藻氨酸盐(Sigma Chemical)之前、之时或之后的特定时间点腹膜内注射5000U/kg的重组人红细胞生成素(rhEPO；由Ortho-Biotech公司以商标PROCRIT出售的)或盐水(假物)，还以特定浓度IP注射(物质/kg体重)。然后对受验动物进行监测并对接受红藻氨酸盐后20分钟时的癫痫发作活性的发展加以评分。每次试验在红藻氨酸盐给药后60分钟终止。如图3A中所示，EPO预处理显著降低了用红藻氨酸盐处理的小鼠的癫痫发作的严重性并延迟了癫痫发作状态的开始。EPO-和假物-治疗动物之间的比较显示接受剂量为20-30mg/kg范围内的红藻氨酸盐的动物的死亡率显著降低，表明了用EPO预处理所产生的神经保护作用。每个条柱下圆括号中的数字指示接受每种红藻氨酸盐剂量的动物数。

图3B中显示了EPO在提供抗红藻氨酸盐的神经保护作用中的剂量依赖性。对小鼠给药EPO(5000U/kg；每天IP注射，最多5天)。通过测定红藻氨酸盐给药(20mg/kg)后的存活来评定每剂EPO的神经保护作用，对于对照动物(未给EPO；参见图3A)，给药红藻氨酸盐产生了大约50％的死亡率。条柱指示了与假物注射动物相比EPO治疗动物存活率的提高。如图3B中所示，随着另一剂5000U/kg的EPO，神经保护作用增加了。

EPO所提供的神经保护的特征在于发病延迟，特点是基因表达程序的激活。图3C显示了在红藻氨酸盐给药(20mg/kg)时给予的单剂EPO对于由癫痫发作引起的死亡的与EPO有关的延迟(以分钟计)没有提供任何立即的保护作用，而在红藻氨酸盐之前24小时给予的EPO改善了癫痫发作的潜伏期和严重性以及死亡的时间。这种作用持续最多7天。

9.实施例4：外周给药的EPO保护脑免受因局部缺血导致的损害

先前使用沙土鼠球形再灌注模型进行的体内研究已表明阻塞流向脑部的血流导致脑中细胞死亡，且直接注射到大脑皮质中的EPO保护脑使其免受了这种细胞死亡(Sakanaka等，1998，《美国国家科学院院报》95：4635)。在本实施例中记载的实验第一次显示了在局部缺血的动物模型中外周释放的EPO防卫了体内神经细胞的死亡。

以下实验使用大脑中动脉闭塞模型进行，这是一种本领域公认的缺血性局灶性中风模型。在实验方案中，雄性大鼠(体重250gm)用苯巴比妥麻醉并维持在37℃。目测检验颈动脉，并将同侧颈动脉永久性闭合。目测检验同侧大脑中动脉(MCA)并在其起点处进行烧灼。对侧动脉用钳子夹住使闭合1小时。24小时后将动物处死，取出脑并切成1mm系列切片。通过原位三苯基四唑鎓还原使活组织从坏死区域中显现来目测检验能活的组织。局部缺血的中心和周围的边缘部分都产生了细胞死亡。

使用这种MCA模型，EPO在损伤之前的不同时间和损伤后立即通过外周注射给药，损伤的体积利用计算机辅助图像分析加以定量。图4A中显示的该分析的结果表明了在中风后的以下时间用EPO治疗的效果：中风前24小时、在中风时、以及在中风后第3、6和9小时。如图4A中所示，EPO当在中风后最多6小时给药时保护组织免受了坏死损伤。

有趣而形成对照的是，先前已报道有向神经活性、在体外促进轴突的生长和来自体内的神经细胞髓鞘形成的从EPO衍生的17聚体(Campana等，1998，《国际分子医学杂志》1：235-41；1997年12月23日公布的美国专利5,700,909)在该系统中没有保护对抗损伤的作用(图4B，“17聚体”)。因此，这种模型，以及本发明提供的用于测定EPO对应激组织功能的影响的其他方法可以用于鉴别能用于调制应激组织功能、诸如保护其免受损害或增强学习和认知的EPO和EPO受体活性调制剂。

10.实施例5：外周给药的EPO保护脑免受钝性外伤

在一种机械外伤模型-皮质撞击模型中，通过全身性给药EPO的预治疗保护小鼠脑部免受了钝伤。为了产生外伤，采用能精确地释放打击到头颅的直径3mm的充气驱动的活塞(Clippard Valves)。将每只小鼠麻醉并安全地置于立体定位设备中以防止头移动。切开头皮以确定前囟的位置，这是最初用活塞打击位置的参考点。然后通过将活塞移动至距前囟尾侧2mm和前侧2mm来调节活塞的位置并通过使用精确的氮气脉冲进行撞击。这种设备允许精确地选择活塞速度(4m/s)和撞击移位(2mm)。

小鼠在损伤24小时前、损伤时和损伤3、6或9小时后用EPO(5000U/kg)治疗并继续每天给药。10天后将小鼠处死，随后对脑进行检验并确定脑坏死的体积。在假物治疗小鼠中，观察到大面积的坏死(图5)，且有大量的单核细胞浸润。与此相对照，当动物用EPO预治疗或在损伤后不超过3小时给药EPO时，动物被保护而没有受到这种损害，并且在损伤面积中只检测到很少的单核细胞。

11.实施例6：外周给药的EPO保护心肌免受局部缺血损伤

本实施例示范了EPO在保护心脏组织对抗低氧损伤中的作用。为此，大鼠在按照Latini等(1999，《心血管药理学杂志》31：601-8)进行操作前24小时用EPO(5000U/kg)进行预测。随后，将受验动物麻醉，置于辅助通气上并进行胸廓切开术。确定心脏及其内部循环，将可除去的缝线置于左前下行冠状动脉最邻近部分周围，然后结扎。然后给药另一剂EPO(5000U/kg)，并使闭塞保持30分钟。此时，松开结扎线，使动物再维持深度麻醉6小时，随后处死。死亡后立即取出心脏并取出受影响区域部分(AAR)以及未受影响区域部分(小隔)并制备用于生物化学分析。评定两个参数：作为心肌存活量度的肌酸激酶(CK)(CK越低，组织活力越小)和髓过氧化物酶，这是单核细胞浸润的产物。结果显示在图6A和图6B中。如这些图中所示，用EPO治疗产生了维持的CK活性，这与组织活力增加一致，和相对于对照的降低的MPO活性，无论是在梗死面积(AAR)还是在灌注的左心室(LV)自由内壁中，表明被炎性细胞的浸润显著减少。

12.实施例7：外周给药的EPO减少了实验性变应性脑炎

大鼠的实验性变应性(或自身免疫性)脑脊髓炎(EAE)是本领域公认的多发性硬化(MS)的动物模型。已开发了用于免疫学、病毒学、毒性和外伤参数的多种EAE动物模型，以便了解MS的特征。

为了测试EPO是否能保护对抗EAE的症状，进行以下实验。6-8周龄的雌性Lewis大鼠(Charles River，Calco，Italy)在醚浅麻醉下通过向两个后足垫中注射50μg豚鼠髓磷脂碱性蛋白(MBP；Sigma，St.Louis，MO)的水溶液进行免疫，所述蛋白用等体积的带有加入到H37Ra(Difco，Detroit，MI)中的7mg/ml热杀死的结核分支杆菌的完全弗氏佐剂(CFA，Sigma)乳化，终体积为100μl。

治疗后，每天评定大鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的征兆并如下计分：0，没有疾病；1，尾巴无力；2，共济失调；3，后肢完全麻痹且尿失禁。同时还监测体重。大鼠在免疫后第3天开始给药EPO(5000U/kg，IP，每天一次)，持续到第18天。对照大鼠只接受单独的载体。如图7所示，用EPO治疗的大鼠显示出得分改善(即得分较低)和疾病持续时间的改善。另外，在用EPO治疗的大鼠中注意到了症状开始的显著延迟。

13.实施例8：保护应激组织所需的EPO的最小有效剂量和药动学

使用上述局灶性缺血性中风动物模型评定EPO的最佳和有效剂量。如图8A所示，小于450单位/kg体重的EPO剂量在保护应激组织免受坏死损伤中的有效性是不可靠的。如图8B所示，在动物研究中，对四只雌性受验小鼠IP注射给药的大约为5000单位/kg体重的剂量在给药后5小时内产生了大于20,000mU/ml血清的EPO循环浓度，在给药后10小时产生了大于10,000mU的循环浓度，但给药24小时后浓度小于5单位/ml。

14.实施例9：红细胞生成素介导的CNS释放

下文中记载的实验显示与EPO缀合的分子成功地转运穿过了血脑屏障以及其在基膜内的定位。如图9A所示，脑切片用EPO受体(EPO-R)的抗体染色，其显示脑毛细血管表达高水平的EPO-R。为了研究EPO是否能被转运穿过血脑屏障，EPO如下所述用生物素标记。含有rhEPO的物质使用Centricon-10滤器(Millipore)浓缩并通过读取280nm波长下的吸光度读数测量回收率。接着，将0.2mg长臂生物素(Vector Labs)溶于100μl DMSO，将其加入到浓缩rhEPO溶液中并立即涡旋搅拌。该混合物然后在室温下温育4小时，同时轻微搅拌并避光。通过使用Centricon-10层析柱从溶液中除去未结合的生物素。然后生物素化EPO对动物IP给药，5小时后，将动物处死。脑切片用与过氧化物酶偶合的抗生物素蛋白标记，加入二氨基联苯胺直到生成可用于利用光显微镜检查进行观测的足够反应产物。在对EPO-R阳性染色的相同毛细血管中同时并存EPO(图9B)。在以后的时间点，生物素标记看来在特定神经元中定位(例如17小时的时候，图9C)。与此对照，如果将冷的EPO以100倍过量加入到标记过的EPO中，所有特异性染色就都消除了。结果证明全身性给药的缀合EPO化合物成功地被运送穿过了血脑屏障。

全身给药的EPO-生物素缀合物成功地穿过血脑屏障运送到脑中证明其他治疗化合物可以用类似的方式通过将EPO与所需化合物复合而运送穿过血脑屏障。作为一个例子，脑衍生神经营养因子(BNF)可以使用标准操作通过碳二亚胺偶联共价偶合到EPO上。纯化后，该缀合物可以经腹膜内注射对动物给药。BNF对中枢神经系统的积极作用可以相对对照动物加以测量，以估量与EPO结合的该分子的成功转运，而非缀合BNF没有中枢神经系统活性。

本发明不限于所述具体实施方案描述的范围，这些具体实施方案只是对本发明各个方面的个别说明，功能上等价的方法和组分也在本发明的范围内。的确除了本文中所显示和描述的之外，对本发明的各种改进对于本领域技术人员来说将从前面的说明和附图变得显而易见。这些改进也有意落入所附权利要求书的范围内。

本文中提及的所有参考文献都全文引用在此作为参考。

Claims (27)

1、一种适于调制应激组织、增强认知功能或运送化合物穿过内皮紧密接点的剂量单位形式的药物组合物，每剂量单位包含有效无毒量的约50,000至500,000单位范围内的EPO、EPO受体活性调制剂、EPO-活化受体调制剂、或其联合形式，以及药学上可接受的载体。

2、权利要求1的药物组合物，其中有效无毒量的EPO包含50,000至500,000单位的EPO。

3、权利要求1的药物组合物，其中EPO的有效无毒量是能有效地达到大于10,000mU/ml血清的EPO循环浓度的剂量。

4、权利要求3的药物组合物，其中EPO的循环浓度在EPO给药约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时后测量。

5、一种药物试剂盒，它带有包含权利要求2所述药物组合物的一个或多个容器。

6、一种保护哺乳动物免受由应激组织损伤产生的病变的方法，包括对所述哺乳动物外周给药有效量的EPO、EPO受体活性调制剂或EPO-活化受体调制剂来保护应激组织。

7、权利要求6的方法，其中所述损伤是以下疾病的结果：癫痫发作、多发性硬化、中风、低血压、心搏停止、局部缺血、心肌梗死、炎症、与年龄有关的认知功能丧失、放射损害、大脑性麻痹、神经变性疾病、早老性痴呆、帕金森氏病、利氏病、AIDS痴呆、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化、醇中毒、心境障碍、焦虑症、注意力涣散症、孤独癖、克罗伊茨费尔特-雅各布疾病、脑或脊索外伤、心-肺旁路、青光眼、视网膜局部缺血或视网膜外伤。

8、权利要求6的方法，其中所述损伤是低氧症的结果。

9、权利要求8的方法，其中所述低氧症是产前或产后缺氧、窒息、壅塞、几乎淹溺、手术后认知机能障碍、一氧化碳中毒、烟雾吸入、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、成人呼吸窘迫综合征、低血压休克、脓毒性休克、过敏性休克、胰岛素休克、镰状细胞危象、心搏停止、节律障碍、氮麻醉或局部组织低氧症。

10、一种增强哺乳动物正常或异常应激组织功能的方法，包括对所述哺乳动物外周给药外周有效应激组织增强量的EPO、EPO受体活性调制剂、EPO-活化受体调制剂或其联合形式。

11、权利要求10的方法，其中所述增强应激组织的功能增强了联想学习或记忆。

12、权利要求10的方法，其中所述增强应激组织的功能可用于治疗心境障碍、焦虑症、抑郁、孤独癖、注意涣散多动症、早老性痴呆、衰老或认知机能障碍。

13、权利要求6或10的方法，其中所述应激组织是中枢神经系统组织、外周神经系统组织或心脏组织。

14、权利要求6或10的方法，其中所述给药包括口服、局部、管腔内给药或通过吸入或胃肠外给药。

15、权利要求14的方法，其中所述胃肠外给药是静脉内、动脉内、皮下、肌内、腹膜内、粘膜下层或真皮内给药。

16、权利要求6或10的方法，其中所述给药是急性或慢性的。

17、权利要求6或10的方法，其中所述EPO是非红细胞生成性的。

18、权利要求6或10的方法，其中所述EPO以比最大地刺激红细胞生成所需剂量更大的剂量给药。

19、一种促进哺乳动物体内分子转胞吞穿过内皮细胞屏障的方法，包括对所述哺乳动物给药包含与EPO、EPO受体活性调制剂、EPO-活化受体调制剂或其联合形式结合的所述分子的组合物。

20、权利要求19的方法，其中所述结合是不稳定共价键、稳定共价键、或与所述分子的结合位点非共价结合。

21、权利要求19的方法，其中所述内皮细胞屏障是血脑屏障、血眼屏障、血睾丸屏障、血卵巢屏障或血胎盘屏障。

22、权利要求19的方法，其中所述分子是受体激动剂或拮抗剂激素、神经营养因子、抗微生物剂、放射药物、反义化合物、抗体、免疫抑制剂、毒素或抗癌剂。

23、权利要求6、10或19的方法，其中所述EPO是红细胞生成素、红细胞生成素类似物、红细胞生成素模拟物、红细胞生成素片段、杂合红细胞生成素分子、红细胞生成素受体结合分子、红细胞生成素激动剂、肾红细胞生成素、脑红细胞生成素、其寡聚体、其多聚体、其突变蛋白质、其同类物、其天然存在形式、其合成形式、其重组形式、或其联合形式。

24、权利要求23的方法，其中所述EPO受体结合分子是红细胞生成素受体的抗体。

25、一种用于经由转胞吞作用转运分子穿过内皮细胞屏障的组合物，它包含与EPO、EPO受体活性调制剂或EPO-活化受体调制剂结合的所述分子。

26、权利要求25的组合物，其中所述EPO是红细胞生成素、红细胞生成素类似物、红细胞生成素模拟物、红细胞生成素片段、杂合红细胞生成素分子、红细胞生成素受体结合分子、红细胞生成素激动剂、肾红细胞生成素、脑红细胞生成素、其寡聚体、其多聚体、其突变蛋白质、其同类物、其天然存在形式、其合成形式、其重组形式、或其联合形式。

27、权利要求25的组合物，其中所述分子是受体激动剂或拮抗剂激素、神经营养因子、抗微生物剂、放射药物、反义化合物、抗体、免疫抑制剂、毒素或抗癌剂。

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