KR100883232B1 - 말초 투여된 에리트로포에틴에 의한 흥분조직의 기능 조절법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에리트로포에틴(EPO)-활성화된 수용체를 통해 흥분조직의 기능을 조절하는 신호를 보내는 에리트로포에틴과 같은 에리트로포에틴 수용체 활성 조절자를 전신투여함으로써 포유동물에서 흥분조직의 기능을 보호하거나 향상시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 흥분조직은 뇌와 같은 중추신경계 조직, 말초신경계 조직, 망막 및 심장조직을 포함한다. 흥분조직을 보호함으로써 저산소증, 졸중성 발작 장애, 신경퇴행성 질환, 저혈당증 및 신경독소 중독을 치료할 수 있다. 흥분조직의 기능을 향상시키면 학습력 및 기억력 향상에 유용하다. 본 발명은 또한 에리트로포에틴과 같은 에리트로포에틴 수용체 활성 조절자와 임의의 분자를 결합시킴으로써 혈액-뇌 장벽과 같은 내피 세포 폐쇄막 장벽을 통한 분자의 수송을 촉진시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

말초 투여된 에리트로포에틴에 의한 흥분조직의 기능 조절법{MODULATION OF EXCITABLE TISSUE FUNCTION BY PERIPHERALLY ADMINISTERED ERYTHROPOIETIN}

본 발명은 흥분조직의 기능에 바람직한 영향을 미치기 위한, 말초 투여된 에리트로포에틴(EPO) 및 기타 에리트로포에틴 수용체 활성 조절자 또는 EPO-활성화된 수용체 조절자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 흥분조직, 예를 들어 신경세포조직 및 심장조직을 신경독소, 저산소증 및 기타 불리한 자극으로부터 보호하고, 흥분조직의 기능, 예를 들어 학습력 및 기억력을 증진시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 에리트로포에틴 분자, 에리트로포에틴 수용체 활성 조절자 또는 기타 EPO-활성화된 수용체 조절자와 회합시킴으로써 물질을 내피 세포 장벽을 통해 수송하는 방법에 관한 것이다.

각종 급성 및 만성 증상들과 질환들이 외부 자극 및 내부 자극에 의해 흥분조직이 손상 및 기능부전됨에 따라 발생한다. 이러한 자극으로는 적절한 산소 또는 글루코스의 부족, 신경독소, 노화에 따른 결과, 감염원 및 외상을 들 수 있다. 예를 들어, 흥분조직은 졸중성 발작 및 만성 졸중성 발작 장애, 경련, 간질, 발작, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 중추신경계 손상, 저산소증, 뇌성마비, 뇌 또는 척수 손상, 후천성면역결핍증(AIDS)성 치매 및 기타 유형의 치매, 노화에 따른 인지력 상실, 기억력 상실, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 저혈압, 심박 정지, 신경세포 손상, 연기 흡입 및 일산화탄소 중독의 결과로 손상될 수 있다.

뇌에서 이용가능한 에너지원(예를 들어, 글루코스 또는 산소)의 공급이 감소함에 따라, 인지 기능과 같은 뇌기능이 심각하게 손상된다는 사실이 널리 알려져 있다. 중추신경계의 수많은 신경세포(그러나, 모든 신경세포는 아니다)는 대사제한 상태, 예를 들어 저산소증, 저혈당증, 스트레스 및/또는 지속적인 강한 흥분 상태에 노출되는 동안 쉽게 손상된다. 이러한 환경하에서는 이들 신경세포의 전기화학적 구배가 종종 붕괴되어 비가역적인 신경세포의 손상 및 세포사가 유발된다. 이러한 일반적인 기작을 발작, 간질 및 알츠하이머병을 비롯한 통상적이고 쇠약성인 다양한 퇴행성 신경학적 질환들이 유발되는 통상적인 최종 경로로서 보는 견해가 현재 추세이다.

뇌기능에 대한 제한된 에너지원 물질의 공급 결과는 널리 알려져 있지만, 정상뇌에서 에너지원의 전달을 개선시킴에 따른 효과는 그다지 폭넓게 연구된 바 없다. 현재 알려져 있는 자료에 의하면, 글루코스 또는 산소 전달능을 개선시킴으로써 동물 모델 및 정상 인간 개체 모두에서 복잡한 인지 기능을 크게 향상시킬 수 있음이 제시되었다(코프(Kopf) 등의 문헌[Behavioral and Neural Biology, 62:237-243, 1994] 및 리(Li) 등의 문헌[Neuroscience, 85:785-794, 1998] 및 모스(Moss) 등의 문헌[Psychopharmacology, 124:255-260, 1996] 참조). 또한, 뇌에서 생산되는 뉴로펩티드들이 증가함에 따라 정상뇌에서의 인지 기능이 직접적으로 향상됨이 입증되었다. 이러한 인지 기능 향상의 생리학적 기초는 궁극적으로 시냅스의 변화를 통한 신경세포간 상호접속의 리모델링(remodeling)에 의존한다.

뇌조직의 세포구축은 극심한 유연성을 나타내며, 연속적으로 리모델링을 겪는다. 수많은 영양 분자들에 의해서 매개되는 이러한 공정들은 상해를 입은 후에 나타날 뿐만 아니라, 학습 기능, 기억 기능 및 인지 기능에 중요한 역할도 담당한다. 원형 뉴로트로핀(neurotrophin)은 신경성장인자(NGF)이지만, 다수의 사이토킨들이 뇌에서 영양 기능을 수행함이 알려져 있다(헤프티(Hefti) 등의 문헌[Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 37:239-267, 1997] 참조).

최근, 신경조직이 EPO 뿐만 아니라 그의 수용체(EPO-R)를 다량으로 발현시킨다는 사실이 다수의 독립된 연구자들로부터 인정되었다(디지카일리오글루(Digicaylioglu) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:3717-3720, 1998], 줄(Juul) 등의 문헌[Pediatr. Res., 43:40-49], 마르티(Marti) 등의 문헌[Kidney Int., 51:416-418, 1997] 및 모리시타(Morishita) 등의 문헌[Neuroscience, 76:105-116, 1997] 참조). EPO 및 그의 수용체 단백질은 각각 단일 유전자의 산물인 것 같지만, 중추신경계(CNS)에서 생산되는 EPO 및 그의 수용체는 크기가 상당히 더 작다. 이러한 관찰 결과가 나타내는 생리학적 의미는 분명히 밝혀지지는 않았으나, 상기 질량 차이는 생물학적 활성을 변형시키는 것 같다. 예를 들어, 인간 환자를 대상으로 한 연구에서, 연구자들은 EPO가 말초부로부 터 뇌로 수송되지 않는다고 결론지었다(마르티 등의 상기 문헌[1997] 참조). 그러나, 현재까지 어떠한 직접적인 실험을 통해 EPO에 대한 이러한 가능성이 조사된 적은 없었다. 뇌의 EPO는 신장의 EPO보다 약 15% 더 작지만(시알릴레이션(sialylation)에 따른 차이로 인해), 뇌의 EPO는 낮은 리간드 농도에서도 적혈구 콜로니(colony)를 자극시키는데 더욱 활성을 나타낸다(마스다(Masuda) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 269:19488-19493, 1994] 참조). 다른 한편으로, CNS 수용체는 30% 더 큰 말초 수용체보다 탈글리코실화된 EPO에 대해 더욱 낮은 활성을 나타낸다(코니시(Konishi) 등의 문헌[Brain Res., 609:29-35, 1993] 및 마스다 등의 문헌[J. Biol. Chem., 268:11208-11216, 1993] 참조).

뇌에서, EPO는 성상세포에서 발현되는 것으로 밝혀져 있으며, EPO의 발현 및 방출은 저산소증 및 기타 대사성 스트레스 인자들에 의해 증가되거나(마르티 등의 문헌[Eur. J. Neurosci., 8:666-676, 1996], 마스다 등의 문헌[J. Biol. Chem., 268:11208-11216, 1993] 및 마스다 등의 문헌[J. Biol. Chem., 269:19488-19493, 1994] 참조), 또는 심지어는 인슐린형 성장인자 계열과 같은 기타 수용체의 존재에 의해 증가될 수 있다(마스다 등의 문헌[Brain Res., 746:63-70, 1997] 참조). 신경세포는 고도의 세포형-특이적 방식으로 EPO-R을 발현시키기 때문에, 이와 같이 분비된 EPO의 한 가지 목표가 된다(모리시타 등의 문헌[Neuroscience, 76:105-116, 1997] 참조). EPO 자체와는 달리, EPO-R의 밀도는 대사적 스트레스 동안에 조절되지 않는 것 같다(디지카일리오글루 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:3717-3720, 1995] 참조).

최근의 연구에서, EPO가 뇌실에 직접 주사된 경우 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서도 신경세포를 저산소성 신경세포 손상으로부터 탁월하게 보호함이 입증되었다(모리시타 등의 문헌[Neuroscience, 76:105-116, 1997], 사다모토(Sadamoto) 등의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Commun., 253:26-32, 1998] 및 사카나카(Sakanaka) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4635-4640, 1998] 참조). 코니시 등의 문헌[Brain Res., 609:29-35, 1993]으로부터는 EPO가 뇌실에 직접 주사된 경우 다 자란 래트에서 콜린성 신경세포의 생체내 생존을 촉진시킴이 입증되었다. 뇌실에 중추적으로 투여된 EPO는 또한 래트에서 허혈성 손상에 따른 공간 학습력의 부족을 성공적으로 예방한다(사다모토 등의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Commun., 253:26-32, 1998] 참조). 최근의 공개문헌들은 배양된 신경세포에서 이러한 신경영양 효과를 나타내기 위해 EPO의 단지 17개의 아미노산으로 구성된 부분이 필요함을 제시하고 있다(캄파나(Campana) 등의 문헌[Int. J. Mol. Med., 1:235-241, 1998] 참조).

수년간, 에리트로포에틴(EPO)의 유일하게 밝혀진 분명한 생리학적 역할은 적혈구 세포의 생산 제어 기능이었다. 최근, 일련의 증거들로부터 EPO가 사이토킨 계열의 일원으로서 에리트로포에틴 수용체(EPO-R)와의 상호작용을 통해 매개되는 기타 중요한 생리학적 기능을 수행함이 제안되었다. 이러한 작용들은 유사분열촉진 작용(mitogenesis), 평활근 및 신경세포로의 칼슘 유입의 조절, 및 중간대사에 대한 영향을 포함한다. EPO는 저산소성 세포내 미세환경을 개선시키는 작용을 하는 대상성 반응을 제공하는 것으로 여겨진다. 두개내(intracranially) 주사된 EPO가 신경세포를 저산소성 신경세포 손상으로부터 보호한다는 사실이 수많은 연구들로부터 확립되어 있지만, 두개내 투여는 치료 용도, 특히 정상 개개인에게 투여하기에는 비현실적이고 비허용적인 경로이다. 또한, EPO가 투여된 빈혈성 환자들을 대상으로 한 이전의 연구는 말초 투여된 EPO는 뇌로 수송되지 않는다고 결론내린 바 있다(마르티 등의 상기 문헌[1997] 참조).

본원에서 인용되거나 논의된 참고문헌들은 본 발명에서 선행 기술로서 허용되지 않을 것이다.

발명의 요약

본 발명은 포유동물에서 흥분조직의 기능을 조절하기 위한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 흥분조직에 약물을 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 높은 투여량으로 전신투여된 에리트로포에틴(EPO)이 뇌에 의해서 특이적으로 흡수된다는 본 출원인들의 발견에 부분적으로 기초한다. 특히, 본 출원인들은 높은 투여량으로 전달된 EPO가 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있으며, 그에 따라 인지 능력을 향상시키고 저산소증과 같은 스트레스성 증상으로부터 유발된 손상으로부터 신경조직을 보호할 수 있음을 발견하였다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 에리트로포에틴과 EPO, 및 EPO 수용체의 활성 조절자, 및 EPO-활성화된 수용체 조절자는, 전신투여되는 경우(혈액-뇌 장벽 외부에서 투여되는 경우), 전기적 흥분조직의 EPO-활성화된 수용체를 활성화시켜 이들 조직을 증강시키고/시키거나 손상 및 세포사로부터 보호할 수 있는 화합물을 지칭한다. 즉, EPO는 EPO 유사체, 그의 단편 및 유사 작용체 뿐만 아니라 흥분조직을 조절할 수 있는 임의의 형태의 에리트로포에틴을 지칭할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 바람직한 양태에서, 본 발명의 에리트로포에틴은 뇌의 EPO 수용체에 대해 증가된 특이성을 나타낸다. 다른 양태에서, 에리트로포에틴은 비-적혈구 조혈성이다. 또다른 양태에서, 에리트로포에틴은 적혈구 조혈을 최대로 자극하는데 필요한 투여량보다 더 많은 투여량으로 투여된다.

본 발명은 투여 단위당 약 50,000 내지 500,000 유니트(unit) 범위의 무독성 효과량의 EPO, EPO 수용체 활성 조절자, EPO-활성화된 수용체 조절자 또는 이들의 혼합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 흥분조직을 조절하거나 인지 기능을 향상시키거나 또는 내피 폐쇄막을 통해 화합물을 전달하기에 적합한 투여 단위 형태의 약학 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 상기 약학 조성물에서의 무독성 효과량의 EPO는 50,000 내지 500,000 유니트의 EPO를 포함한다. 또다른 양태에서, 상기 약학 조성물에서의 무독성 효과량의 EPO는 혈청 1ml중 10,000 밀리유니트보다 많은 순환량의 EPO를 달성하기에 효과적인 투여량이다. 또다른 양태에서, 이러한 순환량의 EPO는 EPO를 투여한지 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10시간 후에 달성된다. 또다른 양태에서, 본 발명은 흥분조직을 조절하거나 인지 기능을 향상시키거나 내피 폐쇄막을 통해 화합물을 전달하기에 효과적인 양의 EPO를 하나 이상의 용기에 포장한 약학 키트(kit)를 제공한다.

본 발명은 효과량의 에리트로포에틴을 포유동물에게 말초 투여함을 포함하는, 포유동물에서 흥분조직의 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 흥분조직은 정상조직이거나 또는 비정상적으로 병에 걸린 조직일 수 있다. 한 양태에서, 흥분조직은 중추신경계의 신경세포조직이다. 다른 양태에서, 흥분조직은 말초신경계의 신경세포조직 및 심장조직으로 구성된 군에서 선택된다.

한 양태에서, 효과량의 EPO 또는 EPO 수용체 활성 조절자를 말초 투여함으로써 포유동물의 흥분조직, 특히 정상 흥분조직 및 비정상 흥분조직 둘다에서 흥분조직의 기능을 향상시키는 방법을 제공한다. 흥분조직의 기능이 향상되면, 예를 들어 학습력, 연상 학습력 또는 기억력이 향상된다. 본 발명의 이러한 양태에 의해 치료될 수 있는 증상들 또는 질환들의 비제한적인 예는 기분 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주의력결핍 과다활동 장애, 알츠하이머병, 노화 및 인지 기능부전을 포함한다.

또다른 양태에서, 흥분조직의 조절화는 흥분조직, 예를 들어 중추신경계의 신경세포, 말초신경계의 신경세포 또는 심장조직의 손상에 의해 유발된 병변으로부터의 보호 효과를 제공한다. 이러한 병변은 저산소증, 졸중성 발작 장애, 신경퇴행성 질환, 신경독소 중독, 다발성 경화증, 저혈압, 심박 정지, 방사선 또는 저혈당증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상해들로부터 유발될 수 있다. 한 양태에서, 상기 병변은 저산소증으로부터 야기되며, 산전 또는 산후 산소결핍증, 질식, 기도폐색, 근익사, 외과 수술후 인지 기능부전, 일산화탄소 중독, 연기 흡입, 만성 폐색성 폐질환, 폐기종, 성인 호흡곤란 증후군, 저혈압 쇼크, 패혈성 쇼크, 인슐린 쇼크, 과민성 쇼크, 겸형적혈구 발증, 심박 정지, 부정맥 또는 질소 마취일 수 있다. 병변이 졸중성 발작 장애인 경우, 비제한적인 예를 들면 상기 병변은 경련 또는 만성 졸중성 발작 장애일 수 있다. 병변이 신경퇴행성 질환인 경우, 예를 들면 상기 병변은 발작, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌성마비, 뇌 또는 척수 외상, AIDS성 치매, 노화에 따른 인지력 상실, 기억력 상질, 근위축성 측삭 경화증, 졸중성 발작 장애, 알콜중독, 망막 허혈증, 노화, 녹내장 또는 신경세포 손상일 수 있다. 또다른 양태에서, EPO를 투여함으로써 수술 과정 동안, 예를 들어 종양 절제 수술 또는 동맥류 회복 수술 동안 조직의 상해나 손상을 예방할 수 있다.

또다른 양태에서, 임의의 분자의 조성물을 에리트로포에틴과 결합시켜 투여함으로써 포유동물에서 상기 분자의 내피 세포 장벽을 통한 트랜스사이토시스(transcytosis)를 촉진시키는 방법을 제공한다. 수송될 분자와 EPO 사이의 결합은, 예를 들어 불안정한 공유결합, 안정한 공유결합 또는 분자의 결합 부위와의 비공유 회합일 수 있다. 한 양태에서, 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-안구 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 또는 혈액-태반 장벽일 수 있다.

본 발명은 또한 EPO, EPO 수용체 활성 조절자 또는 EPO-활성화된 수용체 조절자와 결합된 분자를 포함하는, 내피 세포 장벽을 통한 트랜스사이토시스에 의해 상기 분자를 수송하기 위한 조성물을 제공한다. 한 양태에서, EPO는 에리트로포에틴, 에리트로포에틴 유사체, 에리트로포에틴 유사 작용체, 에리트로포에틴 단편, 혼성 에리트로포에틴 분자, 에리트로포에틴 수용체-결합 분자, 에리트로포에틴 작용제, 신장 에리트로포에틴, 뇌 에리트로포에틴, 이들의 올리고머, 이들의 멀티머, 이들의 뮤테인(mutein), 이들의 동류물, 이들의 천연 형태, 이들의 합성 형태, 이들의 재조합 형태, 또는 이들의 혼합물이다. 또다른 양태에서, 상기 조성물의 상기 분자는 호르몬, 신경영양 인자, 항균제, 방사성약물, 안티센스(antisense) 화합물, 항체, 면역억제제, 독소 또는 항암제이다. 본 발명의 방법에 의해 수송하기에 적합한 분자는 호르몬(예를 들어, 성장호르몬), 항생물질, 항암제 및 독소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 이들 양태 및 기타 양태는 이하의 도면 및 기술내용으로부터 더욱 잘 이해될 것이다.

도 1a 및 1b는 모리스 워터 메이즈(Morris Water Maze) 시험을 도시한 것으로, 도 1a는 1일마다 말초 투여된 EPO 또는 식염수(샴(Sham))를 투여받은 마우스에서 수행된 모리스 워터 메이즈 시험의 결과를 나타낸 것이고, 도 1b는 EPO를 투여받은 개체가 샴 처리된 개체보다 상당히 더욱 양호한 결과를 제공함을 나타낸 것이다. 회귀 곡선(R²=0.88)으로부터 1에서 크게 벗어난 기울기(0.68)가 확인되었으며, 이는 EPO 군이 크게 유리함을 나타낸다.

도 2a 내지 2c는 조건부 맛 기피(conditioned taste aversion) 시험을 도시한 것으로, 도 2a는 조건부 맛 기피 시험을 받은 마우스에서 물 섭취량에 대한 말초 처리된 샴 군과 말초 처리된 EPO 군을 비교한 것이다. 물 섭취량은 염화리튬에 의해 아픔을 느낀 적 없는 대조용 마우스에 의해 섭취된 체적의 백분율로서 표현된다. 도 2b 및 2c는 EPO 개체가 대조군보다 아픔-관련 신호를 포함하는 물을 회피하여 갈증에 대해 더욱 잘 참으며, 더욱 오랫동안 물을 찾음에 따라, EPO-향상된 학습력이 강건함을 나타낸다.

도 3a는 말초 투여된 EPO 전처리가 졸중성 발작의 중증도를 감소시키고 신경독소 카이네이트(kainate)에 의한 경련 및 사망으로부터 마우스를 보호함을 입증하는 실험 결과를 도시한 것이다. 각 칼럼 아래의 괄호안의 수는 각각의 카이네이트 투여량을 투여받은 동물들의 수를 의미한다. 도 3b는 말초 투여된 EPO의 보호 효과가 매일 투여되는 EPO에 의해 증가됨을 도시한 것이다. 도 3c는 EPO의 작용 개시가 유전자 발현 프로그램의 유도 특성에 따라 지연됨을 도시한 것이다.

도 4a 및 4b는 허혈성 뇌손상(국소 발작)에 대한 재조합 인간 EPO(rhEPO)의 보호 효과를 도시한 것이다. 도 4a는 뇌 허혈증을 유도한 후 다양한 시간에 EPO를 전신투여함으로써 경색 크기를 줄일 수 있음을 나타낸다. 도 4b는 상기 모델에서 상해로부터 뇌를 보호하는데 있어서의 2가지 형태의 EPO, 즉 재조합 인간 EPO(rhEPO) 및 17개의 아미노산 EPO 유도체(17량체)를 비교한 것으로, 일부 EPO 유사체는 신경보호에 효과적이지 않음을 나타낸다.

도 5는 대뇌피질에 전달된 둔상에 대한 rhEPO의 보호 효과를 도시한 것이다.

도 6a 및 6b는 허혈성 심장 상해로부터의 EPO의 보호 효과를 도시한 것으로, 도 6a는 심근세포의 손상을 나타내는 크레아틴 키나제(CK) 활성을 나타내고, 도 6b는 염증을 나타내는 미엘로퍼옥시다제(MPO) 활성을 나타낸다.

도 7은 EPO로 마우스를 처리함으로써 다발성 경화증의 모델인 실험적 알레르기성 뇌염에 의해 생산된 신경학적 증후군들을 지연시키고 경감시킴을 도시한 것이다.

도 8a는 래트에서 수행된 국소 발작 모델에서 신경보호 효과를 제공하기 위한 EPO의 최소 효과량을 도시한 것이다. 도 8b는 5,000U의 rhEPO를 암컷 Balb/c 마우스에 복강내 투여한 후 다양한 시간대에서의 EPO의 혈청 농도를 도시한 것이다.

도 9a는 모세관상에서 그리고 모세관 주위에서의 EPO-R의 면역국소화(immunolocalization)를 도시한 것이다. 도 9b는 마우스에서 복강내 투여된 바이오틴화된 EPO가 5시간 후에 뇌를 직접 둘러싼 주위 모세관에서 확인됨을 도시한 것이다. 도 9c는 17시간 후, 바이오틴 표지가 특정 신경세포에서 확인될 수 있음을 도시한 것이다.

본 발명은 예를 들면, 인지 기능을 향상시키고 유독한 자극으로부터 흥분세포를 보호하는 것과 같은 흥분조직 기능을 조절하기 위한 에리트로포에틴(EPO)의 사용을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 EPO를 포함하는 조성물 뿐만 아니라 약물 전달을 포함하는 예방 및 치료 요법에서의 이들의 사용 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바대로, 흥분조직은 중추 및 말초신경계의 신경세포성 조직, 및 심장조직을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기술된 본 발명은 EPO, 또는 EPO 수용체 활성 분자 또는 EPO-활성화된 수용체 활성을 나타내는 분자 뿐만 아니라 기타 비전형적인 EPO 수용체를 통해 작용함으로써 EPO 활성을 모방하는 임의의 분자를 말초적으로 투여함으로써 흥분조직 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 특정한 작용 기작에 얽매이려는 것은 아니지만, EPO 수용체를 통해 신호를 전달할 수 있는 이러한 분자는, 예를 들면, 흥분조직 기능을 보호하거나 또는 향상시키는 결과를 나타내는 유전자 발현 프로그램을 최종적으로 활성화시키는 신호 형질 도입 케스케이드(cascade)를 개시한다. EPO 수용체와 상호작용하고 본원에서 EPO 또는 EPO 수용체 활성 조절자로 지칭되는 수용체의 활성을 조절할 수 있는 분자가 흥분조직 기능을 보호하거나 또는 향상시키기 위한 본 발명의 정황에서 유용하다. 이들 분자는, 예를 들면, 상기 기술된 바대로 천연적으로 생성되거나 합성적이거나 또는 재조합 형태의 EPO 분자일 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바대로 EPO 수용체 활성을 조절하는 것을 제외하고는 임의 의 방식으로 EPO를 반드시 모방할 필요가 없는 다른 분자일 수 있다. 이들 분자는 본원에 기술된 다양한 목적을 위해 조합하여 사용될 수 있다.

본원에 기술된 조성물 및 방법이, 예를 들면, 중추신경계의 뉴론, 말초신경계의 뉴론, 또는 심장조직과 같은 정상적인 조직 또는 비정상적인 조직 둘다를 치료하고/치료하거나 보호하는데 사용될 수 있다. 특히, 하기 5.1 단락에 본 발명의 수행에 있어 유용한 EPO 조성물이 기술되어 있다. 5.2.1 단락에 학습, 기억과 같은 흥분조직의 기능, 및 인지 기능의 다른 양태를 향상시키기 위한 상기 EPO 조성물의 용도가 기술되어 있고, 5.2.2 단락에 흥분조직을 피해 또는 손상으로부터 보호하는 방법이 기술되어 있다. 하기 5.2.3 단락에서의 모세관 내피 세포 융합막에 대한 EPO의 예상치 못한 능력의 발견은 상기 차단막을 가로질러 화합물을 전달하는 방법을 제공한다. 최종적으로, 5.3 단락에 본 발명의 방법을 사용하여 표적으로 할 수 있는 증상이 기술되어 있고, 5.4 단락에 상기 EPO 조성물의 효과적인 투여량 및 투여 방법이 기술되어 있다.

5.1 에리트로포에틴을 포함하는 조성물

본 발명에 사용하기에 적합한 EPO 조성물로는 말초적으로 투여되는 경우 흥분조직을 조절(즉, 흥분조직의 기능을 향상시키거나 피해 또는 손상으로부터 보호하거나 또는 화합물을 흥분조직으로 전달)하기 위해 EPO-활성화된 수용체를 활성화시킬 수 있는 임의의 에리트로포에틴 화합물이 포함된다. 에리트로포에틴은 인간에서 34 내지 38kD의 분자량을 갖는 당단백질 호르몬이다. 성숙한 단백질은 166개의 아미노산을 포함하고, 당 잔기가 분자 중량의 약 40%를 구성한다. 본 발명의 수행에 있어 유용한 EPO 형태로는 천연적으로 생성되거나 합성적이거나 재조합 형태인 하기 분자가 포함된다: 에리트로포에틴, 에리트로포에틴 유사체, 에리트로포에틴 유사물, 에리트로포에틴 단편, 혼성 에리트로포에틴 분자, 에리트로포에틴 수용체-결합 분자, 에리트로포에틴 작용제, 신장 에리트로포에틴, 뇌 에리트로포에틴, 올리고머 및 이의 멀티머, 이의 뮤테인, 및 이의 동류물. "에리트로포에틴" 및 "EPO"란 용어는 교대로 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

합성된 재조합 분자, 예를 들면, 뇌 EPO 및 신장 EPO, 재조합 포유동물 형태의 EPO 뿐만 아니라 이의 천연적으로 생성되고 종양을 유도하는 재조합 동질체, 예 를 들면 재조합적으로 발현되는 분자 및 동종 재조합에 의해 생성되는 분자가 본원에서 제공된다. 더욱이, 본 발명은 EPO 수용체에 결합하는 펩티드 뿐만 아니라 EPO의 단편 및 멀티머 또는 이들의 단편을 포함하는 EPO의 구조적 및/또는 생물학적 특정의 일부 또는 모두를 포함하는 재조합 구조물 또는 다른 분자를 포함한다. 본원의 EPO는 특히 내피 세포 차단막에 대한 전달능의 향상에 적합한, 바람직하게는 증가된 수용체 친화성을 포함하는 개질된 EPO 수용체 결합 활성을 갖는 분자를 포함한다. 추가적이거나 또는 감소된 수의 당화 부위를 갖는 분자를 포함하는 뮤테인이 본원에 포함된다. 상기 주지된 바대로, "에리트로포에틴", "EPO" 및 "유사물"이란 용어 뿐만 아니라 기타 용어가 본원에서 교대로 사용되어 EPO와 관련된 흥분조직 보호성 및 증진성 분자 뿐만 아니라 내피 융합막을 투과할 수 있고, 이로써 다른 분자에 대한 전달 수단으로 유용한 분자를 지칭한다. 더욱이, 유전자변이 동물에 의해 생성되는 분자가 이에 포함된다. 본원에 포함된 바와 같은 EPO 분자는 본원에 기술된 바와 같이 EPO 수용체와 상호작용하거나 또는 EPO 수용체 활성을 조절하거나 또는 EPO-활성화된 신호 형질 도입 케스케이드를 활성화시키는 능력을 제외하고는 EPO와 구조적으로 또는 임의의 다른 방식으로 반드시 동일할 필요가 없음을 알아야 한다.

비제한적인 예를 통해서, 본 발명의 수행에 유용한 EPO의 형태로는 예를 들면, 미국 특허 제 5,457,089 호 및 제 4,835,260 호에 기술된 카복시 말단에서 개질된 아미노산을 갖는 화합물과 같은 EPO 뮤테인; 미국 특허 제 5,856,292 호에 기술된 바와 같이 분자당 다양한 수의 시알린산 잔기를 갖는 EPO 동질체; 미국 특허 제 4,703,008 호에 기술된 폴리펩티드; 미국 특허 제 5,767,078 호에 기술된 작용제; 미국 특허 제 5,773,569 호 및 제 5,830,851 호에 기술된 바와 같이 EPO 수용체에 결합된 펩티드; 미국 특허 제 5,835,382 호에 기술된 바와 같이 EPO 수용체를 활성화시키는 소분자 유사물; 및 국제 특허 공개 공보 제 WO 9505465 호, 제 WO 9718318 호, 및 제 WO 9818926 호에 기술된 EPO 유사체가 포함된다. 상기 언급된 인용 문헌 모두는, 이 기술내용이 이러한 형태의 본 발명의 에리트로포에틴을 제조하기 위한 다양한 교대 형태 또는 방법을 언급하는 정도로 본원에 인용되어 있다.

EPO는 시중에서 구입할 수 있다[미국 캘리포니아주 싸우전드 오크스 소재의 오르토 바이오텍(Ortho Biotech)에서 구입가능한 프로크리트(PROCRIT; 등록상표) 및 암젠 인코포레이티드(Amgen, Inc.)에서 구입가능한 에포겐(EPOGEN; 등록상표)].

본 발명의 또다른 양태에서, 본원에 포함된 EPO 분자로는 EPO 수용체 조절 활성 뿐만 아니라 또다른 활성, 예를 들면, 성장 호르몬 활성을 포함하도록 제조될 수 있는 혼성 EPO 분자가 포함된다. 다중 도메인을 갖는 상기 혼성 분자는 이런 방식으로 EPO 수용체와 상호작용하는 능력을 포함할 뿐만 아니라 호르몬과 같은 또다른 분자의 활성을 가질 수도 있다. 2개의 도메인을 갖는 상기 분자의 제조 방법이 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 하기 5.2.3 단락에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 상기 분자의 하나의 특성은 EPO 수용체 활성 조절 도메인에 의해 제공된 내피 세포 차단막에 대한 전달능, 및 표적 부위에서의 다른 분자의 활성이다.

상기 기술된 임의의 화합물은 본원에 기술된 검정법을 사용하여 흥분조직을 조절(즉, 흥분조직의 기능을 향상시키거나 피해 또는 손상으로부터 보호하거나 또 는 화합물을 흥분조직으로 전달)할 수 있는 EPO 화합물을 확인하기 위해 시험할 수 있다. 예를 들면, EPO 화합물은 5.2.1 단락에 기술된 방법을 사용하여 학습, 기억과 같은 흥분조직의 기능, 및 인지 기능의 다른 양태를 시험할 수 있다. 인지 기능을 위한 생체내 검정법의 예로는 6 단락에 기술된 모리스 워터 메이즈 시험의 예, 및 7 단락에 상세히 기술된 조건부 맛 기피 시험이 포함된다. 또한, 상기 기술된 EPO 화합물은 5.2.2 단락에 기술된 검정법을 사용하여 시험하여 피해 또는 손상으로부터 흥분조직을 보호할 수 있는 EPO 화합물을 확인할 수 있다. 8, 9, 10, 11 및 12 단락에 기술된 예는 상기 검정법의 특정한 예를 제공한다. 또한, EPO 화합물은 하기 5.2.3 단락 및 9 단락에 기술된 바와 같은 검정법을 사용하여 뇌혈관 차단막과 같은 내피 융합막에 대해 화합물을 전달하는 이들의 능력을 검정할 수 있다. 이런 방식으로, 본 발명에 사용하기에 적합한 EPO 조성물로는 말초적으로 투여되는 경우 EPO-활성화된 수용체를 통해서 신호 전달되어 흥분조직을 조절(즉, 흥분조직의 기능을 향상시키고 피해 또는 손상으로부터 보호하거나 또는 화합물을 흥분조직으로 전달)할 수 있는 임의의 모든 화합물이 포함된다.

5.2 본 발명의 예방 및 치료상 사용 방법

본 발명의 다양한 양태에서, EPO 조성물을 피해 또는 저산소 스트레스로부터 흥분조직을 보호하거나 흥분조직의 기능을 향상시키거나 또는 흥분조직의 내피 융합막에 대해 화합물을 전달하는데 사용할 수 있다. 상기 기술된 바대로, 본 발명은 부분적으로 EPO 분자가, 예를 들면, 뇌, 망막, 및 고환을 포함한 내피 세포 융합막을 갖는 기관의 모세 혈관의 내피 세포의 관강내 표면으로부터 기저막 표면으로 전달될 수 있다는 발견에 기초한다. 특정한 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, EPO의 트랜스사이토시스 후, EPO는, 예를 들면, 중추신경계, 말초신경계, 또는 심장조직의 뉴론과 같은 흥분조직상에서 EPO 수용체와 상호작용할 수 있고, 수용체 결합은 신호 형질 도입 케스케이드를 개시하여 흥분조직내에서 유전자 발현 프로그램을 활성화시키고, 신경독, 저산소증 등과 같은 피해로부터 세포를 보호할 수 있다. 이런 방식으로, 흥분조직을 손상 또는 저산소 스트레스로부터 보호하고 흥분조직의 기능을 향상시키고 화합물을 흥분조직의 융합막에 대해 전달하는 방법이 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.

5.2.1 흥분조직 기능을 향상시키는 방법

한 양태에서, 본 발명은 흥분조직 기능을 향상시키는 유전자 발현 프로그램을 활성화시킬 수 있는 EPO 분자를 투여함에 의해 흥분조직의 기능을 향상시키는 방법을 지시하고 있다. 흥분조직 기능의 향상은 학습, 연상 학습, 및 기억의 향상을 제공한다. 상기 방법을 사용하여 다양한 질환 및 증상을 치료할 수 있으며, 또한, 이 방법이 임의의 증상 또는 질환이 없는 경우에도 인지 기능을 향상시키는데 유용하다. 본 발명의 이들 용도가 하기에 보다 상세히 기술되어 있고 인간 및 인간이 아닌 포유동물 둘다에서 학습 및 연습의 향상을 포함한다.

본 발명의 이러한 양태의 방법에 의해 치료가능한 증상 및 질환은 신경세포

성 기능을 향상시킴으로써 이로울 수 있는 임의의 증상 또는 질환을 포함한다. 상기 질환의 예로는 기분 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주위력 결핍 과다활동 장애, 및 인지 기능 장애를 포함한 중추신경계 질환이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법을 사용하여 향상될 수 있는 인지 기능의 다른 비제한적인 예가 5.3 단락에 기술되어 있다.

한 양태에서, 예를 들면, EPO 분자를, 알츠하이머병과 같은 인지 기능의 손실을 나타내는 질환으로 고생하는 대상자 또는 환자에게 투여할 수 있다.

인지 기능을 향상시키기 위한 EPO의 능력을 본원에 기술된 임의의 방법, 또는 다른 분야에서 허용된 학습 또는 인지 기능 모델을 사용하여 실험 동물내에서 시험할 수 있다. 6 단락 및 7 단락에 제시된 실시예에서 기술된 바와 같이, 말초적으로 투여된 에리트로포에틴이 정상적인 실험 동물에서 잘 확립된 수개의 학습 모델에 의해 설명된 바대로 학습 및 인지 기능을 향상시키는 것으로 발견되었다. 상기 학습 모델의 예로는 6 단락에 주어진 모리스 워터 메이즈 시험, 및 7 단락에 주어진 조건부 맛 기피(CTA) 시험이 포함된다. 한 양태에서, 예를 들면, 매우 감도가 뛰어나고 잘 알려져 있는 표준 시험인 조건부 맛 기피(CTA) 시험이 EPO 투여 후 동물의 인지 기능을 시험하는데 사용된다. CTA는 맛과 같은 새로운 자극을 갖는 질병과 연관되어 학습을 위한 동물의 능력을 시험하는데 사용되는데, 새로운 자극에 후속적으로 재노출되는 경우 동물은 새로운 맛을 피하게 된다. CTA는 다양한 피질 및 피질하 수준에서의 뇌를 포함한다. 고통을 피하려는 양태를 나타내는 상승 및 하강 정보를 연결하는 연관성이 서로 연결된 유니트에 영향을 미치는 변화에 의해 약화되거나 또는 강화될 수 있다. 연상 학습의 형태로 CTA 강도는 경구 자극(예컨대, 새롭지 않은 자극은 회피하려는 조건이 될 수 없다), 생성되는 "질병"의 정도(유독성), 반복 회수(연습), 소수만이 밝혀진 대향 욕구(예컨대, 갈증) 를 포함한 다양한 변수에 의해 결정된다. 광범위하게 다양한 화학적 및 물리적 약제가 투여 의존성 방식으로 CTA를 나타낼 수 있음에도 불구하고 염화리튬은 불쾌감 및 식욕감퇴를 나타낸다. 자연적으로 생성되는 질병과 같이, 리튬은 사이토카인 방출을 포함한 상기 기술된 경로를 자극함으로써 CTA를 생성한다.

흥분세포 기능, 예를 들면, 인지 기능의 향상은 개인에게 교육 환경 및 작업 환경에서 다양한 잇점을 제공하고 인간이 아닌 포유동물을 연습시키고 교육시키는 능력을 향상시킨다.

5.2.2 손상으로부터 흥분조직을 보호하는 방법

또다른 양태에서, 본 발명은 흥분조직에 대한 손상을 나타내는 병리 현상으로부터 포유동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 흥분조직을 손상으로부터 보호하는데 효과적인 양의 에리트로포에틴을 말초 경로로 포유동물에 투여함으로써 보호를 제공한다. 하기 8 단락의 실시예에서 상세히 제시된 바대로, 카이네이트 독소에 앞서 투여된 EPO는 마우스에서 현저히 신경보호성을 나타내어 발병을 일으키고 사망을 방지한다. EPO의 신경보호성 효과는 크면서도 지속적이다. 본원에서 나타난 긍정적인 효과는 EPO 투여에 비해 매우 짧은 시간 동안에 일어나 EPO의 에리트로포에틴 활성의 결과로 적혈구 용적율을 증가시키는 경과를 나타낸다. 더욱이, 상기 주지된 바대로, 본 발명의 양태는 적혈구 용적율을 증가시키기 위한 능력이 결여된 EPO를 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바대로 신경학상 질환의 급성 및 만성적인 예방 및 치료 및 정상적이거나 또는 사망한 뇌의 인지 기능을 향상시키는데 유리하게 사용될 수 있다. 상기 주지된 바대로 중추신경계내 뉴론의 손상 및 괴사가 종종 집단내에서 높은 정도의 질병률 및 사망률을 나타내는 심각하고도 치명적인 발병율을 나타낸다. 급성 신경학상 손상이 졸중성 발작, 경련, 간질, 발작, 출혈, 중추신경계 손상, 저산소증, 저혈당증, 저혈압증 및 뇌 또는 척추 외상이 나타나는 동안 또는 그 결과로 나타날 수 있다. 본 발명은 급성의 경우 치료를 위해 급성 투여를 제공한다.

한 양태에서, 예를 들면, 본 발명은 뇌에 대한 조사 피해의 결과로 나타나는 손상으로부터 포유동물을 보호하기 위해 사용될 수 있다.

또다른 양태에서, 본 발명에 따라 치료가능하거나 보호가능한 심각한 증상은 자궁내에서의 산전 저산소성 증상, 출산시 지속되는 저산소증 손상에서 뇌를 보호하기 위한 산후 치료 뿐만 아니라 질식, 혼란, 및 중추신경계가 산소 결핍 또는 다른 신경독소 자극에 노출된 결과로 나타나는 신경독소 손상의 위험에 있는 다른 증상에 대한 예방 및 치료이다. 공지된 바대로, 분만 도중 저산소증, 또는 치명적이지 않은 저산소증 사건 또는 사고로 고통받는 개인이 일생에 걸쳐 신경학상 결손으로 고생할 수 있다. 또한, 외상 후 또는 외과적 수술 동안에 일어날 수 있는 저산소증 및/또는 뇌혈관 흐름의 중지가 일생에 걸쳐 신경학상 결손을 일으키는 위험성을 동반한다.

심폐기를 사용한 후 나타나는 결손을 포함한 수술 후 인지 기능 장애가 또한 본원에 제공된 방법에 의해 치료가능하다. 더욱이, 본 발명은 일산화탄소 중독증 또는 연기 흡입으로 나타날 수 있는 저산소증의 치료에 적용될 수 있다.

또다른 양태에서, EPO는 국소 빈혈, 경색, 염증, 또는 외상시 지속되는 손상으로부터 심장조직을 보호하는데 사용된다.

이들은 본 발명에 따라 치료가능한 흥분조직에 대한 피해의 예이다. 이들 질환의 빠른 조기 치료가 이동 응급 의학 보건 전문가들에 의해 수행되어 신경학상 손상에 대한 잠재성이 의심되자마자 치료가 개시될 수 있다. 분만에 의해 유도되는 신경학상 손상의 위험성은 분만 전 또는 분만 동안에 태아를 예방적으로 치료함에 의해 감소될 수 있다. 이들 및 다른 설비 및 환경이 당분야의 숙련가에 의해 인식될 것이다.

5.2.3 화합물의 전달 방법

본 발명은 추가로 에리트로포에틴과 결합하는 특정한 분자를 포함하는 조성물을 투여함으로써, 표유동물에서 내피 세포에 장벽을 거쳐 분자의 전달을 용이하게 하는 방법에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 중추신경계, 말초신경계에서의 신경조직 또는 심장조직과 같은 흥분조직에 말초 투여된 EPO의 지금까지 예상치 못했던 놀라운 활성을 발견하고, 혈액-뇌 장벽과 같은 흥분조직의 폐쇄막을 건널 수 있는 분자로서 EPO를 확인하였다. 이로써, EPO는 혈액-뇌 장벽 및 기타 유사한 장벽을 거쳐 다른 분자를 전달하는 담체로서 유용하다.

한 양태에서, EPO 분자에 결합된 분자를 포함하는 EPO 수용체 결합 분자는 혈액-뇌 장벽을 거쳐 이들 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 분자는 BBB를 걸쳐 전달하기 위해서 EPO 상에 피기백(piggyback) 방식으로 수송될 수 있다. 다른 양태에서, 상기 분자에 대한 항체 또는 다른 결합 파트너는 EPO 또는 EPO 수 용체 활성 조절자와 결합되어, 결합 파트너와의 비공유 회합에 의해 전달된 분자와 결합될 수 있고, 추가로 전달가능한 EPO 분자와 결합된다. 다른 양태에서, EPO 수용체에 대한 항체를 포함하는 EPO 수용체 결합 분자는 전술한 방법에 사용하기에 유용하다. 이러한 항체는, 트란스페린 수용체에 대한 항체가 사용되어 혈뇌를 걸쳐 접근하는 방식과 유사한 방식(파드리지(Pardridge) 등의 문헌[1991, Selective transport of an antitransferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J. Pharmacol. Exp. Therap. 27: 66] 참조)으로, 다른 분자가 편승할 수 있는 전달 담체를 제공한다.

당업자들은 EPO 및 전술한 기타 제제와 분자들을 공유, 비공유 및 기타 방법에 의해 결합시키는 다양한 방법을 알 것이다. 또한, 조성물의 효율에 대한 평가는 실험 방식으로 용이하게 측정될 수 있다. 분자와 EPO 및 유사체의 결합은 불안정 공유 결합, 가교 결합 등을 포함하는 수많은 방법에 의해 달성될 수 있다. 한 양태에서, 예를 들어 장벽을 거쳐 전달된 분자 및 에리트로포에틴 사이의 결합은 불안정 공유 결합일 수 있는데, 이 경우, 분자는 상기 장벽을 건넌 후 EPO와의 결합으로부터 유리된다. 한 양태에서, 바이오틴/아비딘 상호작용을 이용할 수 있다. 다른 양태에서, 전술한 바와 같이, 예를 들어 목적하는 약리학적 활성을 갖는 분자의 영역 및 EPO 수용체 활성 조절할 수 있는 영역 둘다를 포함하는 조합 또는 합성 방법에 의해 혼성 분자를 제조할 수 있다.

분자는 다기능성 분자, 즉, 다기능성 가교제를 통해서 EPO 또는 EPO 수용체 활성 조절자와 결합될 수 있다. 본원에 사용된 "다기능성 분자"라는 용어는 포름 알데히드와 같이 연속해서 1회 이상 반응할 수 있는 하나의 작용기뿐만 아니라 하나 이상의 반응기를 갖는 분자를 포함한다. 본원에 사용된 "반응기"라는 용어는 분자(예를 들어, 내피 세포 장벽을 거쳐 전달되는 펩티드, 단백질, 카보하이드레이트, 핵산, 특히 호르몬, 항생물질 또는 항암제) 상의 작용기와 반응하여 가교제 및 상기 분자 사이의 공유결합을 형성하는 가교제 상의 작용기를 말한다. "작용기"라는 용어는 유기 화학에서 사용되는 통상적인 의미를 말한다. 사용될 수 있는 다기능성 분자는 바람직하게는 생혼용성(biocompatible) 가교제로서, 생체내에서 비발암성, 무독성 및 실질적으로 비면역원성 가교제이다. 당해 기술분야에 공지되고 본원에 기술된 가교제와 같은 다기능성 가교제는 동물 모델에서 용이하게 시험되어 이들의 생혼용성을 측정할 수 있다. 다기능성 분자는 바람직하게 이작용성이다. 본원에 사용된 "이작용성 분자"라는 용어는 2개의 반응기를 갖는 분자를 말한다. 이작용성 분자는 헤테로이작용성 또는 호모이작용성일 수 있다. 헤테로이작용성 가교제는 벡터 결합을 가능하게 한다. 가교제 반응이 pH 6 내지 8로 완충된 수용액과 같은 수성 용액에서 일어나게 하고, 생성된 결합체가 더욱 효과적인 생-분포를 위해 물에 용해가능한 상태로 남아 있도록 하기 위해서 다기능성 분자는 물에서 충분히 용해가능한 것이 특히 바람직하다. 전형적으로, 다기능성 분자는 아미노 또는 설프하이드릴 작용기와 공유결합한다. 그러나, 기타 작용기, 예를 들어 카복실산 또는 하이드록실기와 반응하는 다기능성 분자가 본 발명에서 고려된다.

호모이작용성 분자는 동일한 2개 이상의 작용기를 갖는다. 호모이작용성 분자 상의 반응성 작용기는, 예를 들어 알데히드기 및 활성 에스테르기를 포함한다. 알데히드기를 갖는 호모이작용성 분자는, 예를 들어 글루타알데히드 및 수바르알데히드를 포함한다. 가교제로서 글루타알데히드의 용도는 포즈난스키(Poznansky) 등의 문헌[Science 223, 1304-1306 (1984)]에 개시되어 있다. 2개 이상의 활성 에스테르 단위를 갖는 호모이작용성 분자는 디카복실산 및 N-하이드록시숙신이미드의 에스테르를 포함한다. 상기 N-숙신이미딜 에스테르의 몇몇 예로는 디숙신이미딜 수베레이트 및 디티오-비스-(숙신이미딜 프로피오네이트), 및 이들의 용해성 비스-설폰산 및 비스-설포네이트 염, 예를 들어 나트륨 염 및 칼륨 염을 포함한다. 이러한 호모이작용성 제제는 미국 일리노이스 록포드 소재의 피어스(Pierce)로부터 구입가능하다.

헤테로이작용성 분자는 2개 이상의 반응기를 갖는다. 반응기는, 예를 들어 EPO 및 분자에 존재하는 상이한 작용기와 반응한다. 헤테로이작용성 가교제 상의 반응기와 반응하는 상기 2개의 상이한 작용기는 통상적으로 아미노기, 예를 들어 리신의 엡실론 아미노기; 설프하이드릴기, 예를 들어 시스테인의 티올기; 카복실산, 예를 들어 아스파르트산 상의 카복실레이트; 또는 하이드록실기, 예를 들어 세린 상의 하이드록실기이다.

헤테로이작용성 분자의 반응성 기가 아미노 기와 공유 결합을 형성하는 경우, 상기 공유 결합은 일반적으로 아미도 또는 이미도 결합일 것이다. 아미노 기와 공유 결합을 형성하는 반응성 기는, 예를 들어, 활성화된 카복실레이트 기, 할로카보닐 기 또는 에스테르 기일 수 있다. 바람직한 할로카보닐 기는 클로로카보닐 기이다. 에스테르 기는 바람직하게는 반응성 에스테르 기, 예를 들어 N-하이드 록시-숙신이미드 에스테르 기이다.

기타 작용기는 전형적으로 티올 기, 티올 기로 전환될 수 있는 기, 또는 티올 기와 공유 결합을 형성하는 기이다. 상기 공유 결합은 일반적으로 티오에테르 결합 또는 디설파이드일 것이다. 티올 기와 공유 결합을 형성하는 반응성 기는, 예를 들어, 티올 기 또는 활성화된 디설파이드와 반응하는 이중 결합일 수 있다. 티올 기와 반응할 수 있는 이중 결합을 함유하는 반응성 기는 말레이미도 기이지만, 아크릴로니트릴과 같은 다른 반응성 기도 또한 가능하다. 반응성 디설파이드 기는, 예를 들어, 2-피리딜디티오 기 또는 5,5'-디티오-비스-(2-니트로벤조산) 기일 수 있다. 반응성 디설파이드 결합을 함유하는 헤테로이작용성 시약의 몇몇 예로는 N-숙신이미딜 3-(2-피디딜디티오)프로피오네이트(문헌[Carlsson et al., 1978, Biochem J., 173:723-737]), 나트륨 5-4-숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸벤질티오설페이트 및 4-숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸(2-피리딜디티오)톨루엔을 들 수 있다. N-숙신이미딜 3-(2-피디딜디티오)프로피오네이트가 바람직하다. 티올 기와 반응하는 이중 결합을 갖는 반응성 기를 포함하는 헤테로이작용성 시약의 몇몇 예로는 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 및 숙신이미딜 m-말레이미도벤조에이트를 들 수 있다.

기타 헤테로이작용성 분자로는 숙신이미딜 3-(말레이미도)프로피오네이트, 설포숙신이미딜 4-(p-말레이미도-페닐)부티레이트, 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸-사이클로헥산)-1-카복실레이트, 말레이미도벤조일-N-하이드록시-숙신이미드 에스테르를 들 수 있다. 숙신이미딜 m-말레이미도벤조에이트의 나트륨 설포네이트 염이 바람직하다. 전술한 헤테로이작용성 시약 및 그의 설포네이트 염중 다수는 피어스(Pierce)로부터 구입가능하다.

상기한 콘주게이트(conjugate)가 가역적이거나 불안정해야 할 필요성이 있는지는 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 콘주게이트는 EPO 수용 활성 조절 활성 및 바람직한 약리 활성 둘다에 대해 시험관내에서 시험될 수 있다. 콘주게이트가 두가지 특성 모두를 보유하는 경우에는 이어서 그 적합성이 생체내에서 시험될 수 있다. 콘주게이트된 분자가 활성을 위해 EPO로부터 분리될 필요가 있는 경우에는, EPO와의 불안정 결합 또는 가역적 회합이 바람직하다. 불안정 특성은 또한 생체내 시험전에 표준 시험관내 방법을 사용하여 시험될 수도 있다.

이들 및 기타 다작용성 시약의 제조 및 사용 방법에 관한 추가 정보는 다음 간행물, 또는 당해 기술분야에서 입구가능한 다른 간행물로부터 입수할 수 있다: Carlsson et al., 1978, Biochem. J. 173:723-737; Cumber et al., 1985, Methods in Enzymology 112:207-224; Jue et al., 1978, Biochem. 17:5399-5405; Sun et al., 1974, Biochem. 13:2334-2340; Blattler et al., 1985, Biochem. 24:1517-152; Liu et al., 1979, Biochem. 18:690-697; Youle and Neville, 1980, Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:5483-5486; Lerner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3403-3407; Jung and Moroi, 1983, Biochem. Biophys. Acta 761-162; Caulfield et al., 1984, Biochem. 81:7772-7776; Staros, J.V., 1982, Biochem. 21:3950-3955; Yoshitake et al., 1979, Eur. J. Biochem. 101:395-399; Yoshitake et al., 1982, J. Biochem. 92:1413-1424; Pilch and Czech, 1979, J. Biol. Chem. 254:3375-3381; Novick et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487; Lomant and Fairbanks, 1976, J. Mol. Biol. 104:243-261; Hamada and Tsuruo, 1987, Anal. Biochem. 160:483-488; 및 Hashida, 1984, J. Applied Biochem. 6:56-63. 또한, 가교결합 방법은 문헌[Means and Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12]에 설명되어 있다. 본 발명의 상기 방법 및 조성물에 의해 횡단되는 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-안구 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-태반 장벽을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

내피 세포 장벽에 대해 전달하기 위한 후보 분자로는, 예를 들어, 성장 호르몬과 같은 호르몬, 신경향성 인자, 뇌 및 다른 장벽있는 기관으로부터 통상적으로 배제되는 항생물질 또는 항진균물질, 펩티드 방사선 약물, 안티센스 약물, 생물학적 활성제에 대한 항체, 약물, 및 항암제가 포함된다. 이러한 분자의 제한적 예로는 성장 호르몬, 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 신경향성 인자(BNF), 모양체 신경향성 인자(CTF), 기본 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 전환 성장 인자 β1(TGFβ1), 전환 성장 인자 β2(TGFβ2), 전환 성장 인자 β3(TGFβ3), 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3 및 인터루킨 6, AZT, 종양괴사 인자에 대한 항체, 및 면역억제제(예: 사이클로스포린)가 포함된다.

또 다른 양태에서는, EPO를 포함하는 재조합 키메라 독소 분자가 바이러스 질환 또는 증식성 질환(예: 암)을 치료하기 위해 독소의 치료적 전달에 사용될 수 있다. EPO에 융합되어 이 양태에 적합한 키메라 독소를 구성할 수 있는 화합물로는 특히 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소 및 리신과 같은 독소 물질이 포함되 지만 이에 한정되지는 않는다.

5.3 표적 질병

상기한 바와 같이, 본원에 제공된 EPO 조성물 및 그의 사용 방법은 예를 들어 뇌, 심장 및 망막과 같은 중추신경계 조직, 말초신경계 조직 또는 심장조직내 흥분조직과 같은 흥분조직에 악영향을 미치는, 저산소 질병에 기인하는 질병을 치료 및 예방하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 질병 및 상황에서 저산소 질병에 기인하는 흥분조직 손상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 질병 및 상황의 비제한적 예는 이하에 제공되어 있다.

본 발명에 따라 치료가능한 신경조직 병변을 보호하는 예에 있어서 그러한 병변으로는 신경조직의 산소화 감소에 기인하는 것들이 포함된다. 신경조직에 대한 산소의 이용률을 감소시켜 스트레스, 손상 및 최종적으로는 신경세포 사멸을 초래하는 어떤 질병이든지 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 저산소증 및/또는 허혈로 일반적으로 지칭되는 이러한 질병은 뇌졸중, 혈관 폐색, 산전 또는 산후 산소결핍, 질식, 기도 폐색, 근익사(near drowning), 일산화탄소 중독, 연기 흡입, 외상(수술 및 방사선 치료를 포함함), 가사, 간질, 저혈당증, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 성인성 호흡곤란 증후군, 저혈압 쇼크, 패혈성 쇼크, 과민성 쇼크, 인슐린 쇼크, 겸형적혈구 발증, 심박 정지, 부정맥, 및 질소마취에 기인하거나 이들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

한 양태에서는, 예를 들어, 종양 절제 또는 동맥류 복구와 같은 수술 과정 중의 상해 또는 조직 손상 위험에 기인하는 상해 또는 조직 손상을 예방하기 위해 EPO가 투여될 수 있다.

저혈당증에 의해 야기되거나 이에 기인하는 다른 병변으로서 본원에 기술된 방법에 의해 치료가능한 병변으로는 인슐린 과다복용(의인성 고인슐린혈증으로도 지칭됨), 인슐린종, 성장 호르몬 결핍, 코르티솔저하증, 약물 과다복용 및 특정 종양이 포함된다.

흥분신경 조직의 손상에 기인하는 다른 병변으로는 졸중성 발작 장애, 예를 들어, 간질, 경련 또는 만성 졸중성 발작 장애가 포함된다. 다른 치료가능한 질병 및 질환으로는 뇌졸중, 다발성 경화증, 저혈압, 심박 정지, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌성 마비, 뇌 또는 척수 외상, AIDS성 치매, 연령 관련 인지 기능 상실, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 졸중성 발작 장애, 알콜중독, 망막 허혈, 녹내장에 기인한 시신경 손상, 및 신경 소실이 포함된다.

본 발명의 방법은 망막조직의 질병 및 손상을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질병으로는 황반 변성, 망막 박리, 망막색소변성, 동맥경화성 망막병증, 고혈압 망막병증, 망막 동맥 차단, 망막 정맥 차단, 저혈압, 및 당뇨병 망막병증이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 흥분조직에 대한 방사선 손상에 기인하는 상해를 보호 또는 치료하는데 사용될 수도 있다.

본 발명 방법의 추가적 유용성은 신경독소 중독, 예를 들어 도모산 패류 중독, 신경라티리즘(neurolathyrism) 및 괌(Guam)병, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨병의 치료에 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 에리트로포에틴을 말초에 투여함으로써 포유동물에서 흥분조직 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 다양한 질환 및 질병이 이 방법을 사용하여 쉽게 치료될 수 있고, 또한 이 방법은 어떤 질병 또는 질환 없이 인지 기능을 향상시키는데 유용하다. 본 발명의 이러한 용도는 이하에 더 상세히 설명되어 있고, 인간 및 비인간 포유동물 둘다에서의 학습 및 훈련 기능의 향상을 포함한다.

중추신경계에 관한 본 발명의 이러한 양태의 방법에 의해 치료가능한 질병 및 질환은 기분 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주의력결핍 과다활동장애, 및 인지 기능 장애를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이들 질병은 신경 기능의 향상으로 치료된다.

본 발명의 교시에 따라 치료가능한 다른 장애로는 수면 장애, 예를 들어 수면 무호흡증 및 여행 관련 장애, 거미막하 및 동맥류 출혈, 저혈압 쇼크, 진탕성 손상, 패혈성 쇼크, 과민성 쇼크, 및 다양한 뇌염 및 수막염, 예를 들어 결합조직 질환 관련 뇌염의 후유증(예: 루푸스)이 포함된다. 다른 용도로는 신경독소 중독, 예를 들어 도모산 패류 중독, 신경라티리즘 및 괌병, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨병; 색전성 또는 허혈성 손상의 수술후 치료; 전뇌 조사; 겸형적혈구 발증; 및 자간증의 예방 또는 이들로부터의 보호가 포함된다.

본 발명의 방법에 의해 치료가능한 질병의 추가 군으로는, 신경 손상 및 사멸에 의해 대표되는 다양한 신경학적 질환이 원인인 유전성 또는 후천성의 미토콘드리아 기능장애가 포함된다. 예를 들어, 라이 병(Leigh disease)(아급성 괴사성 뇌병증)은 신경 탈락으로 인한 진행성 실명 및 뇌병증, 및 근병증에 의해 특징지어진다. 이들 경우, 결손 미토콘드리아 대사는 흥분 세포의 대사를 가속화시키기에 충분한 고에너지 기질을 공급하지 못한다. EPO 수용 활성 조절자는 다양한 미토콘드리아 질환에서 부전 기능을 최적화시킨다.

전술한 바와 같이, 저산소 질병은 흥분조직에 악영향을 미친다. 흥분조직으로는 중추신경계 조직, 말초신경계 조직 및 심장조직이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 전술한 질병 이외에, 본 발명의 방법은 일산화탄소 및 연기 흡입과 같은 흡입 중독, 중증 천식, 성인성 호흡곤란 증후군, 기도폐색 및 근익사의 치료에 유용하다. 저산소 질병을 일으키거나 또는 다른 수단에 의해 흥분조직 손상을 유발하는 추가의 질병로는 인슐린의 부적절한 투여시 발생할 수 있는 저혈당증, 또는 인슐린-생성 신생물(인슐린종)이 포함된다.

흥분조직 손상으로부터 비롯되는 것으로 여겨지는 다양한 신경심리학적 장애가 본 발명의 방법에 의해 치료가능하다. 신경 손상이 수반될 수 있고 본 발명에 의한 치료가 적용될 수 있는 만성 장애는 중추신경계 및/또는 말초신경계에 관한 장애, 예를 들면, 노화 관련 인지 기능 상실 및 노인성 치매, 만성 졸중성 발작 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 결절성 경화증, 윌슨병, 뇌성 마비 및 진행성 핵상 마비, 괌병, 루이 소체 치매, 프리온 질환, 예를 들어 해면상 뇌병증(예: 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅톤병, 근긴장성 이영양증, 프리이드라이히 운동실조 및 다른 운동실조뿐만 아니라 질 드 라 투렛(Gilles de la Tourette) 증후군), 간질과 같은 졸중성 발작 장애 및 만성 졸중성 발작 장애, 뇌졸중, 뇌 또는 척수 외상, AIDS성 치매, 알콜중독, 자폐증, 망막 허혈, 녹내장, 자율신경기능 장애(예: 고혈압 및 수면 장애), 및 신경정신의학적 장애(정신분열증, 정신분열정동 장애, 주의력 결핍 장애, 기분저하 장애, 주요 우울 장애, 조증, 강박성 장애, 정신활성 물질 사용 장애, 불안증, 공황 장애, 및 단극성 및 양극성 정동 장애를 포함하지만 이에 한정되지는 않음)가 포함된다. 추가의 신경정신의학적 및 신경퇴행성 장애로는 예를 들어 미국 정신의학협회(American Psychiatric Association)의 정신 장애에 관한 진단 및 통계 편람(Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders; DSM)에 열거된 것들이 포함되는데, 이것의 가장 최근판은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.

또 다른 양태에서는, EPO를 포함하는 재조합 키메라 독소 분자가 암과 같은 증식성 질환, 또는 아급성 경화성 범뇌염과 같은 바이러스 질환을 치료하기 위해 독소의 치료적 전달에 사용될 수 있다.

5.4 약학 제제 및 투여

본 발명에 따르면, EPO, 그의 유사체, 유사 작용체, 에리트로포에틴 분절, 혼성 에리트로포에틴 분자, 에리트로포에틴 수용체 결합 분자, 에리트로포에틴 작용제, 신장 에리트로포에틴, 뇌 에리트로포에틴 및 그의 뮤테인, 및 그의 동류물이 비경구, 경점막, 예를 들어 경구, 코, 직장, 질내, 설하, 점막하 또는 경피로 주입될 수 있다. 바람직하게는 투여는 비경구, 예를 들어 정맥내 또는 복강내 주사를 통해 이루어지고, 또한 동맥내, 근육내, 피내 및 피하 투여도 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

EPO의 말초 투여가 효과적인 치료 섭생(regimen)이 되는 피험체는 바람직하게는 인간이지만, 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물일 수 있다. 따라서, 당해 기술분야의 숙련자라면 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법 및 약학 조성물은 임의의 동물, 특히 포유동물에 투여하기에 적합하고, 그러한 동물로는 가축(예: 고양잇과 및 갯과), 농장 동물(예: 소, 말, 염소, 양 및 돼지를 포함하지만 이에 한정되지 않음), 야생 동물(야생에 있는 것이든 동물원에 있는 것이든), 연구용 동물(예: 마우스, 쥐, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등) 등이 포함되지만 이에 전혀 한정되지 않는다. 전술한 바와 같이, 애완 동물 및 작업용 동물을 포함하는 길들여진 동물은 본 발명의 신경보호적 이점 및 인지 기능 향상 둘다를 위한 후보자이다. 저산소증에 기인한 신경학적 손상뿐만 아니라 간질을 포함한 급성 및 만성 장애는 이러한 동물에서 통상적인 것이고, 따라서 치료 대상이다. 또한, 전술한 바와 같이, 학습, 훈련 및 학습 행동의 보유가 본 발명의 교시내용을 이용하여 향상, 보강 및 유지될 수 있다는 점에서 비인간 동물에서의 인지 기능 향상은 본 발명의 이점이 된다. 이로써, 애완 동물 소유자의 지출 및 심리적 부담이 감소된다. 예를 들어, 개 및 다른 가축을 훈련시키는데 필요한 시간이 감소된다. 또한, 전형적으로는 훈련시키기 어려운 야생 동물도 본 발명의 방법에 의해 훈련시키기 위한 우수한 후보자일 수 있다.

5.4.1 제형 및 효과적 투여량

본 발명은 또한 약학 조성물에 관한 것이다. EPO 및 EPO 수용 활성 조절자를 포함하는 약학 조성물은 흥분조직을 손상으로부터 보호하거나, 흥분조직의 기능 을 향상시키거나, 화합물을 흥분조직에 전달하기 위해 치료 효과적 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 본 출원인들은 고 투여량의 EPO가 흥분조직을 조절하고 흥분조직 손상을 보호하는데 바람직함을 발견하였다.

바람직한 효과 투여량의 선택은 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 다수의 요인을 고려함으로써 숙련자에 의해서 결정될 것이다. 이러한 요인으로는 에리트로포에틴의 특정 형태 및 이들의 약동학적 파라미터, 예를 들어 생체이용률, 물질대사, 반감기 등을 들 수 있으며, 이들은 약학 화합물에 대한 법률적인 승인을 얻는데 전형적으로 사용되는 일반적인 개발 공정 동안 확립된다. 추가로, 투여량을 고려하는데 있어서의 인자로는 치료될 질환 또는 상태 또는 정상인에게 달성될 수 있는 이점, 환자의 체중, 투여 경로, 투여가 단기간 수행되는지 장기간 수행되는지 여부, 함께 사용되는 약제 및 투여된 약제의 효과에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있는 다른 인자를 들 수 있다. 따라서 정확한 투여량은 의료진의 판단 및 각각의 환자의 상황, 예를 들어 개인 환자의 상태 및 면역 상태에 따라, 표준 임상 기법에 따라 결정되어야 한다.

한가지 양태에서, 본 발명은 감수성 조직의 조절, 인지 기능의 향상 또는 내피성 페쇄막을 통한 이동에 적합하도록 개질되되, 단위 투여당 약 50,000 내지 500,000 유니트, 60,000 내지 500,000 유니트, 70,000 내지 500,000 유니트, 80,000 내지 500,000 유니트, 90,000 내지 500,000 유니트, 100,000 내지 500,000 유니트, 150,000 내지 500,000 유니트, 200,000 내지 500,000 유니트, 250,000 내지 500,000 유니트, 300,000 내지 500,000 유니트, 350,000 내지 500,000 유니트, 400,000 내지 500,000 유니트 또는 450,000 내지 500,000 유니트의 무독성 효과량의 EPO, EPO 수용체 활성 조절자 또는 EPO-활성화 수용체 조절자 및 이들의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 투여 단위 형태의 약학 조성물을 제공한다.

한가지 양태에서, 이러한 EPO의 약학 조성물은 전신으로 투여되어 감수성 조직이 손상되는 것을 방지하거나 감수성 조직의 기능을 개선하거나 화합물을 감수성 조직으로 이송할 수 있다. 이러한 투여는 비경구, 점막, 예를 들어 경구, 비강, 직장, 질, 설하, 점막하 또는 내피 투여할 수도 있다. 바람직한 투여는 비경구 투여, 예를 들어 정맥 주사 또는 복강내 주사이고, 이로서 한정하는 것은 아니지만 동맥내, 근육내, 내피 및 피하 투여를 들 수 있다.

바람직한 양태에서, EPO는 1회 투여당 2000 내지 10000 유니트/체중(kg), 바람직하게는 약 2000 내지 5000 유니트/체중(kg), 가장 바람직하게는 5000 유니트/체중(kg)의 투여량으로 전신 투여될 수도 있다. 이러한 효과 투여량은, EPO 투여후 약 10,000, 15,000 또는 20,000 밀리유니트/ml의 혈청량보다 과량의 혈청 수준을 달성하기에 충분해야 한다. 이러한 혈청 수준은 투여후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 시간 후에 달성될 수도 있다. 이러한 투여는 필요에 따라 반복될 수도 있다. 예를 들어, 임상적으로 필요한 경우 매일 반복하여 투여할 수 있거나, 적당한 시간 간격이 지난 후, 예를 들어 매 1 내지 12 주, 바람직하게는 매 3 내지 8 주마다 투여할 수도 있다. 한가지 양태에서, 효과량의 EPO 및 이들의 약학적으로 허용가능한 담체는 단일 투여 바이알 또는 다른 용기에 포장될 수도 있다. 한가지 양태에서, EPO는 적혈구 조혈을 촉진하지 않을 수도 있다. 즉, 이것은 전술한 활성을 발휘할 수 있지만 헤모글로빈의 농도 또는 적혈구 용적율의 증가를 유발하지 않을 수 있다. 다른 양태에서, EPO는 적혈구 조혈을 최대한 자극하는데 필요한 것에 비해 보다 과량의 투여량으로 제공된다.

본 발명의 약학 조성물은 치료 효과량의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수도 있다. 구체적인 양태에서, "약학적으로 허용가능한"이라는 용어는 연방 정부의 법률 대리인에 의해 승인되었거나, 동물내 사용 및 보다 구체적으로 인간내 사용에 대해 미국 약전 또는 그 밖의 일반적으로 승인된 약전에 기술되어 있음을 의미한다. "담체"라는 용어는, 치료약을 투여하는 희석제, 야쥬반트, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학 담체는 살균 용액, 예를 들어 석유계, 동물계, 식물계 또는 합성 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 비롯한 물 및 오일내 염수 용액과 같은 살균 액체일 수 있다. 염수 용액은 약학 조성물이 정맥내 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액은 구체적으로 주사용 용액에 있어서 액체 담체로서 사용될 수도 있다. 적당한 약학 부형제로는 전분, 글루코즈, 락토즈, 수크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 스킴 밀크, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 들 수 있다. 바람직한 경우, 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태일 수 있다. 조성물은 트리글리세라이드와 같은 통상적인 결합제 및 담체와 함께 좌제로서 제형화될 수도 있다. 본 발명 의 화합물은 중성 형태 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같이 유리 아미노기와 함께 형성된 염 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제1철의 수산화물, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 카복실기와 함께 형성된 염을 들 수 있다. 적당한 약학 담체의 예는 마틴(E. W. Martin)의 문헌["Remington's Pharmaceutical Science"]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적당하게 투여하기 위한 형태를 제공하기 위해서 치료 효과량의 화합물을 바람직하게는 정제 형태로, 적당량의 담체와 함께 함유할 것이다. 제형화는 투여 방식에 적합해야만 한다.

경구 투여용으로 개조된 약학 조성물은 캡슐 또는 정제; 분말 또는 과립; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비수성계 용액); 식용 발포체 또는 휘프(whips); 또는 유화액으로서 제공될 수도 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐은 락토즈, 전분 또는 이들의 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 마그네슘 카보네이트, 스테아르 산 또는 이들의 염을 포함할 수도 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 식물유, 왁스, 지방, 반고형 또는 액체 폴리올 등을 포함할 수도 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올 및 당을 포함할 수도 있다.

경구 투여용으로 의도된 활성제는 위장관에서의 활성제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질로 코팅되거나 혼합될 수도 있다(예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 사용할 수도 있다). 따라서, 활성제의 지속적인 방출이 수 시간 동안 유지될 수 있거나, 필요한 경우 활성제가 위장내에 분해되는 것을 피할 수도 있다. 경구 투여를 위한 약학 조성물은 특정 pH 또는 효소 조건으로 인해서 위장관의 특정 위치에서 활성제를 용이하게 방출할 수 있도록 제형화될 수도 있다.

경피 투여용으로 개조된 약학 조성물은 장시간 동안 수용자의 표피와 밀접하게 접촉되도록 하는 개별적인 패치로서 제공될 수도 있다. 국소 투여용으로 개조된 약학 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어졸 또는 오일로서 제공될 수도 있다. 피부, 입, 눈 또는 다른 외부 조직에 대한 국소 투여를 위해서, 국소용 연고 또는 크림이 바람직하게 사용된다. 연고로 제형화되는 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 수-혼화성 연고 기제와 함께 제형화될 수도 있다. 선택적으로, 활성 성분은 수중유 기제 또는 유중수 기제와 함께 크림으로 제형화될 수도 있다. 눈으로의 국소 투여를 위해 개조된 약학 조성물은 점안약을 들 수 있다. 이러한 조성물에서 활성 성분은 적당한 담체, 예를 들어 용매내에 용해되거나 현탁될 수 있다. 구강내의 국소 투여용으로 개조된 약학 조성물은 로젠, 파스틸 및 양치질약을 들 수 있다.

비강 투여용으로 개조된 약학 조성물은 분말과 같은 고형 담체(바람직하게는 직경이 20 내지 500㎛임)를 포함할 수도 있다. 분말은 코로 들여마실 수 있는 방식으로 투여될 수 있고, 즉 코에 밀접하게 놓여 있는 분말 용기로부터 코를 통해 빠르게 흡입함으로써 투여될 수도 있다. 선택적으로 비강 투여용으로 개조된 조성물은 액체 담체, 예를 들어 비강 스프레이 또는 비강 적제를 포함할 수도 있다. 이러한 조성물은 활성 성분의 수성 또는 오일 용액을 포함할 수도 있다. 흡입에 의해 투여하기 위한 조성물은 활성 성분의 예정된 투여량을 제공할 수 있도록 고안될 수 있는, 이로서 한정하는 것은 아니지만 가압 에어로졸, 분무기 또는 취입기를 포함하는 구체적으로 기재된 장치로 공급될 수도 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 비강을 통해 폐로 투여된다.

직장 투여용으로 개조된 약학 조성물은 좌제 또는 관장제로서 제공될 수도 있다. 질을 통한 투여를 위한 약학 조성물은 질좌제, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 발포체 또는 스프레인 제제로서 제공될 수도 있다.

비경구 투여용으로 개조된 약학 조성물로는 산화방지제, 완충액, 제균제 및 조성물을 의도된 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성으로 유지시키는 용질을 함유할 수 있는, 수성 및 비수성 살균 주사용 용액 또는 현탁액을 들 수 있다. 이러한 조성물내에 존재할 수도 있는 다른 성분은 예를 들어 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물유이다. 비경구 투여용으로 개질된 조성물은, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단일 투여용 또는 다중 투여용 용기에 존재할 수도 있고, 단지 살균 액체 담체의 첨가(예를 들어 사용하기 직전에서 주사용 살균 염수 용액의 첨가)만이 필요한 동결 건조된 상태로 저장될 수도 있다. 임기용 주사 용액 및 현탁액은 살균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수도 있다.

바람직한 양태에서, 조성물은 인간에서 정맥내 투여를 위해 개조된 약학 조성물로서의 통상적인 방법에 따라 제형화될 수 있다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 살균 등장성 수용액 완충액내 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위의 고통을 경감시키기 위한 국부 마취제, 예를 들어 리도카인 을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 단위 투여 형태로, 예를 들어 건조된 동결건조된 분말 또는 일정량의 활성제를 나타내는 앰플 또는 샤셋과 같은 밀폐되도록 밀봉된 용기내의 수분이 제거된 농축물로서 공급된다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 이것은 살균 약학용 물 또는 염수를 포함하는 주사용 병으로 조제될 수도 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사 또는 염수용 살균수의 앰플은, 성분이 투여하기 전에 혼합되도록 제공될 수 있다.

좌제는 일반적으로 0.5 중량% 내지 10 중량%의 활성 성분을 함유하고, 경구형 제제는 바람직하게는 10 내지 95 중량%의 활성 성분을 함유한다.

본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물의 1종 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학용 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 약학 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매와 관련된 정부 기관에 의해 규정된 형태로서 인간 투여 용품에 관한 제조, 용도 또는 판매를 상기 기관이 승인함을 반영하는 통지가 이러한 용기와 관련될 수 있다.

5.4.2 투여 방법

본 발명은 감수성 조직의 작용을 개선시키거나 보호하고 화합물을 이러한 조직에 이송하기 위해서 EPO의 말초 투여를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, 본 발명은 부분적으로 말초 투여된 EPO가 중추신경계, 말초신경계 또는 심장조직과 같은 감수성 조직에서 직접적인 신경보호 특성 또는 신경개선 특성을 나타낸다는 발견에 기초한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 감수성 조직은, 이로서 한정하는 것은 아니지만 중추신경계 및 말초신경계의 신경조직 및 심장 조식을 들 수 있다. 본 항에서는 이러한 화합물 및 이들의 투여를 위한 방법을 설명할 것이다.

본 발명은 중추신경계로의 직접 투여 이외의 투여 경로에 의한 EPO 및 EPO 수용체 활성 조절자를 투여하고, "말초" 및 "전신"이라는 용어는 이러한 다양한 경로를 포괄한다. 말초 투여로는 경구 또는 비경구 투여, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 피하내, 근육내, 복강내, 직장내, 점막하 또는 경피 투여를 포함한다. 다른 경로도 본원에서 기술한 약제의 투여를 위해 유용하다. 본원에서는 단기간 및 장기간 투여가 제공된다.

한가지 양태에서, 예를 들어 EPO는 조절된 방출 시스템으로 이송될 수 있다. 예를 들어 폴리펩타이드는 정맥 주자, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피용 패치, 리포좀 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 다른 양태에서, 펌프가 사용될 수도 있다(문헌[Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Boimed. End. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574] 참고). 다른 양태에서, 화합물은 소포, 구체적으로 리포좀으로 이송될 수도 있다(문헌[Langer, Science 249: 1527-1533(1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp. 353-365(1989); WO 91/04014; 미국 특허 제 4,704,355 호; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 일반적으로 ibid 참조] 참고). 다른 양태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley: New York(1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953; Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참고).

다른 양태에서, 조절된 방출 시스템은 치료 목표물의 부근, 즉 뇌에 위치하여 전신계 투여량의 일부만을 요구할 수도 있다(문헌[Goodson, pp. 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, supra, 1984] 참고). 다른 조절된 방출 시스템은 랭거의 검토 부분에서 논의되어 있다(문헌[1990, Science 249: 1527-1533] 참고).

다른 양태에서, 적당하게 제형화되는 경우 EPO는 비강, 경구, 직장, 질 또는 설하 투여될 수도 있다.

구체적인 양태에서, 본 발명의 EPO 조성물을 치료가 필요한 부분에 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있고, 이것은 이로서 한정하는 것은 아니지만 주사에 의해, 카테테르의 수단에 의해, 좌제의 수단에 의해, 또는 이식물(여기서, 이식물은 다공성, 비다공성 또는 젤라틴계 물질일 수 있으며, 시알래스틱 막과 같은 막 또는 섬유를 들 수 있음)의 수단에 의해 수술 이후의 상처 드레싱과 함께 수술 후 국부 주사, 국소 투여에 의해 달성될 수도 있다.

본 발명은 예로서 제시되는 하기 비제한적인 실시예를 참고로 함으로써 더욱 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 보다 충분히 예시 하기 위해 제시된 것이다. 그러나, 하기 실시예가 본 발명의 광범위한 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.

하기 기술되는 바와 같이, 본 발명자들에 의해 수행된 연구는 예방 및 치료학적 이점의 근거가 되는 동 모델에 대해 보편적으로 허용가능한 표준 시험이다.

6. 실시예 1: 말초 투여된 EPO는 인지 기능을 향상시킨다

본 실시예에서는, 모리스 워터 메이즈 시험으로 공지되어 있는 공간 탐색 실험(spatial navigation experiment)을 수행하여 EPO에 의해 마우스의 인지 기능이 향상됨을 증명하고자 한다. 상기 시험에서, 작은 투명한 플랫폼을 불투명한 물을 갖는 수영장의 1/4 구역에 위치시킨다. 상기 수영장에 위치시킨 마우스는 수영하고 있는 마우스 자신에게는 보이지 않는 표면 아래에 놓인 휴식용 플랫폼에 도달할 때까지 수영해야 한다. 이러한 시험은 상기 동물이 플랫폼에 도달하기까지 소요되는 시간(즉, 상기 동물이 수영하는데 소요되는 시간)을 측정하는 구성으로 이루어져 있다. 연속적으로 시도하는 경우, 각각의 마우스가 플랫폼에 도달하기까지 소요되는 시간은 플랫폼의 위치를 학습하는 상기 동물의 기능에 따라 감소될 것이다. 이러한 유형의 학습 실험은, 해마가 손상되면 상기 시험에서의 학습이 억제되므로, 해마를 포함한다.

직경이 150㎝인 원형의 흑색 수영장에서 실험을 수행하였다. 네 방향, 즉 동서남북을 임의로 지정하였다. 구별되는 시각적 신호, 예컨대 섬광등, 정방형으 로 적용된 밝은색 테이프 등을 상기 네 개의 구역에 각각 적용하여 수영장에서 마우스를 일정 방향으로 향하게 하였다. 플랫폼을 임의로 1/4 구역에 위치시켰다. 이러한 시험은 수용장의 1/4 구역에 상기 동물을 머리가 시작이 되도록 위치시켜 풀어주는 구성으로 이루어져 있다. 상기 시험 시간은 총 90초였다. 상기 동물이 플랫폼에 도달하지 못하는 경우, 추가로 15초 동안 플랫폼에 위치시켰다. 상기 동물을 1시간 동안 휴식시킨 다음 시험을 위해 다른 1/4 구역에 위치시켰다. 4개의 1/4 구역을 모두 1일 시험 과정에 걸쳐 사용하고, 상기 동물을 연속 12일간(즉, 총 48번의 시도) 시험하였다.

상기 실험은 12일간의 시험 기간 동안 매일, 당일 시험 시작 4시간 전에 각각의 마우스에게 재조합 인간 EPO(오르토-바이오테크 인코포레이티드(Ortho-Biotech, Inc.)에서 상품명 PROCRIT로 시판중임)를 5000U/㎏ 복강내 주사로 주입하는 구성으로 이루어졌다. 대조용 동물에 대해서는 식염수로 가장 주입하였다.

각각의 마우스가 플랫폼에서 소비하는 시간을 측정함으로써 학습을 측정하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, EPO 처리된 그룹과 가장 처리된 그룹이 플랫폼에서 소비하는 시간으로서 실험 결과를 작도한다. 결과가 지시하는 바와 같이, 상기 동물 그룹은 둘다 플랫폼에서 점점 더 많은 시간을 소비하였다. 즉, 상기 동물 그룹은 둘다 매일의 연속적인 시험에서 플랫폼에 보다 신속하게 도달하는 방법을 학습하지만, EPO 처리된 동물이 가장 처리된 그룹보다 더욱 신속하게 학습하였다. 따라서, EPO 처리된 동물이 가장 처리된 그룹보다 훨씬 신속한 "학습 곡선"을 갖는다. 상기 결과를 EPO 처리된 그룹과 가장 처리된 그룹간의 차이로서 나타내고, EPO 처리된 그룹과 가장 처리된 그룹의 결과를 비교하는 경우, 회귀선(R²=0.88)은 기울기 1과 상당히 상이한 기울기(0.68)를 나타내는데, 이는 EPO 처리된 그룹에 매우 유리하다(도 1b).

7. 실시예 2: 말초 투여된 EPO는 조건부 맛 기피 행동 학습을 강화시킨다

본 실시예에서 수행되는 조건부 맛 기피(CTA) 시험은, EPO가 마우스의 기억력에 급격하게 작용하여, 불쾌한 맛(이 경우, 질병을 유발시키는 물질)을 기피하는 학습에 영향을 끼친다는 사실을 증명한다. 본 실시예에서, 염화리튬이 복용량에 따라 불쾌감 및 식용 감퇴를 확실히 일으킨다는 이유로, CTA를 발생시키는데 사용한다. 자연적으로 발생되는 질병과 같이, 리튬은 시토카인 방출을 비롯한 전술한 경로를 자극함으로써 CTA를 발생시킨다.

암컷 Balb/c 마우스를 매일의 총 물 섭취가 1일당 1회 5분간의 드링킹으로 제한되도록 훈련시키고, 상기 5분 동안 충분한 물을 드링킹하여 평형상태를 유지하도록 학습시켰다. 상기 동물을 그룹으로 나누어, 복강내(IP) 주입되는 가상 대조군(식염수) 또는 EPO(5000U/㎏)를 투여한 다음, 4시간 후 신규 사카린-바닐라 액체를 제공하였다. 상기 달콤한 액체의 드링킹 완료 후 바로, 상기 동물에게 식염수 또는 질병을 유발시키는 리튬량(0.15M의 LiCl 20㎎/㎏, IP로 주입)을 투여하였다. 따라서, 세그룹의 동물은 하기와 같다. 제 1 그룹(대조군)은 드링킹 후 리튬을 투여하지 않았다. 제 2 그룹은 리튬과 EPO를 둘다 투여하였다. 제 3 그룹(가상 처리)은 식염수(EPO가 없음)와 리튬을 투여하였다.

조건부 맛 기피 행동 측정은 질병 유발성 용액인 신규 사카린-바닐라 액체에 계속 노출시키는 경우의 드링킹 감소를 측정함으로써 실시하였다. 리튬 또는 가상 처리로부터 5일 회복 후, 물을 섭취시키지 않은 동물에게 상기 신규 사카린-바닐라 액체를 다시 제공하였다. 그룹 2 및 3과 그룹 1(대조군)을 비교한 결과를 도 2a에 나타낸다. 2일째 되는 날, 시험 케이지로의 습관화 작용 후 물의 베이스라인 소비를 나타낸다. 3일째 되는 날 상기 동물은, 식염수 또는 EPO(5000U/㎏)를 복강내 주입한지 4시간 후에 신규 사카린-바닐라 액체를 제공한 다음, 리튬 또는 가장 식염수 처리(화살표)하였다. 상기 처리 결과 3일째, 모든 그룹에서 유체 소비가 다소 감소되었다(이는 유체의 주입 및 신규에 대한 전술한 반대 작용임). 회복 후, CTA 달성을 위한 제 1 시험 결과, 대조군에서는 이러한 감소가 나타나지 않았다. 그러나, 리튬을 투여한 동물은 물이 부재함에도 불구하고(4일째) 유체에 대해 시각적으로 완벽한 기피 행동을 나타냈다. 계속해서 물을 섭취시키지 않은 결과 CTA가 소멸되었지만(5일부터 9일), 도 2a에 흑색 원으로 나타낸 바와 같이, EPO를 투여한 동물의 회복이 현저히 느린 것을 특징으로 하였다.

EPO 처리된 동물의 물 부족에 대한 내성은 가상 주입된 동물의 대략 2배이므로(도 2b), 본원에서 달성된 CTA의 강도는 시험일마다 나타나는 물 부족 정도를 고려함으로써 보다 잘 평가된다. EPO 처리된 그룹에 의해 증명되는 현저히 증강된 CTA에도 불구하고, EPO 처리된 그룹의 동물이 도 2c에 나타낸 바와 같이 가상 그룹보다 드링킹에 보다 용이하게 접근하였다. CTA의 강도는 EPO 처리된 그룹에서 더욱 우세한(도 2a, 10일째) 감쇠된 CTA를 발생시키는 리튬만(EPO가 없음)을 반복 주 입함으로써 증명하였다. 이러한 데이터는 EPO 전처리가 리튬에 의해 발생되는 현저히 강화된 CTA와 연관이 있음을 보여준다.

8. 실시예 3: 말초 투여된 EPO는 흥분독소로부터 뇌를 보호한다

본 실시예에서는 EPO가 혈액-뇌 장벽을 횡단하고 신경독소인 카이네이트(kainate)로 처리된 마우스에게 신경보호 작용을 갖는다는 것을 증명하고자 한다. 다수의 화합물은 사실상 특히 뉴론에 대해 독성을 나타내며 존재한다. 이러한 분자는 전형적으로 아미노산 전달물질인 글루타메이트를 위한 내생적 수용체와 상호작용한 후, 과도한 자극 및 뉴론의 손상을 유발시킨다. 이들중 하나인 카이네이트는 흥분독성에 기인된 뉴론의 손상을 연구하는데 광범위하게 사용되는 물질로서 글루타메이트의 유사체이다. 카이네이트는 뉴론, 특히 고밀도 카이네이트 수용체를 갖는 영역에 위치하는 뉴론, 예컨대 해마를 파괴시키고, 발작, 뇌 손상 및 사망을 유발시키는 강력한 신경독소이다.

하기 신경독성에 관한 연구를 카이네이트를 사용한 마우스로 수행하였다. 상기 모델은 측두엽 간질과 같은 상태를 치료하는 보호적 이점을 평가하는데 사용된다. 래트 및 마우스와 같은 실험용 동물에게 비경구적으로 주입하면 복용량에 따라 부분(변연) 발작이 유발되어, 사망에 이르게 할 수 있다. 본 단락에 제시된 실험은 말초 투여된 EPO가 혈액-뇌 장벽을 횡단하는지, 그렇다면 EPO가 뉴론의 에너지 균형에 영향을 주고 특히 카이네이트에 대해 신경보호 작용을 갖는지에 대한 시험으로 수행하였다.

결국에는, 암컷 Balb/c 마우스(평균 15 내지 20g의 무게가 나감)에 특정 농 도의 케이네이트(시그마 케미칼, sigma chemical)를 복강내로 투여하기 전, 직후 또는 후의 특정 시각에, 5000U/kg의 유전자 재조합 휴먼 에리트로포에틴(rhEPO; 오르토-바이오텍, 인코포레이티드(ortho-biotech, Inc.)에서 PROCRIT라는 상표명으로 시판된다) 또는 염수(sham)를 복강내로 주입시켜 예비 시험하였다. 이어서, 마우스에 케이네이트를 투여하고 20분후에 발작 활성도(seizure activity)의 현상을 관찰하기 위해 마우스를 모니터링하고 등급화하였다. 각각의 시험을 케이네이트 투여하고 60분 후에 종료하였다. 도 3A에 나타내어진 바와 같이, 케이네이트로 처리된 마우스에서, EPO로 예비처리함은 발작 가혹도(seizure severity)를 급격히 감소시키고, 경련중첩증(status epilepticus)의 발병을 지연시킨다. EPO-처리된 동물과 염수-처리된 동물간의 비교를 통해, 20mg/kg 내지 30mg/kg의 케이네이트 투여량을 수용한 동물에서, EPO를 처리한 경우의 치사율이 매우 낮음을 증명하고, EPO를 예비 처리함으로써 신경 보호가 가능해짐을 나타낸다. 각각의 컬럼내 괄호의 수치는 각각의 케이네이트 투여량에 노출된 동물의 수를 나타낸다.

케이네이트로부터의 신경 보호를 제공하는데 있어서의 EPO의 투여량-의존도를 도 3B에 나타낸다. 마우스에 EPO를 복용시켰다(5000U/kg; 5일까지 날마다 복강투여). 각각의 EPO 투여량에 대한 신경 보호 효과를, 대조 동물(epo를 처리하지 않음; 도 3A에서 나타냄)에 대해 약 50%의 치사율을 보이는 케이네이트(20mg/kg) 복용후의 생존율을 측정함으로써 평가하였다. 컬럼은 염수-처리된 동물에 비하여, EPO-처리된 동물의 생존율이 증가하였음을 나타낸다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, 신경 보호는 EPO 5000mg/kg을 추가로 투여함으로써 증가한다.

EPO에 의해 제공된 신경 보호는 발명의 지연으로 특징지어지며, 유전자 발현 프로그램의 활성화를 특징으로 한다. 도 3C는 케이네이트 투여(20mg/kg)직후에 주어진 EPO의 1회 투여량으로 인한 EPO-관련된 죽음의 지연은 임의의 즉각적인 보호를 제공하지는 않으나, 케이네이트를 투여하기 24시간 전에 EPO를 투여하였을 경우 발작의 잠복기 및 가혹도 및 죽음에 이르기까지의 시간을 증가시킨다. 상기 효과는 7일까지 지속된다.

9. 실시예 4: 말초 투여된 EPO는 국소 빈혈로 인한 뇌의 손상을 막는다

구면 관류 모델(global reperfusion model)을 이용한, 종래의 생체안에서의(in vivo) 연구는 뇌로의 혈액의 흐름을 정지시켜 뇌세포 사멸을 초래하고, 대뇌실로 EPO를 직접 주입함으로써 상기 뇌세포의 사멸을 막을 수 있다는 것을 나타내었다[Sakanaka et al., 1998, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 95:4635]. 본 발명의 실시예에 나타낸 시험은 우선적으로, 말초로 전달된 EPO는 국소 빈혈을 갖는 동물 모델의 생체안에서 신경세포 사멸을 막음을 보여준다.

다음의 시험은 중뇌정맥폐색 모델, 당해 분야에 수용된 국소 빈혈 병소의 발작 모델을 이용하여 수행되었다. 프로토콜에서, 수컷 쥐(몸무게가 250g)를 페노바비탈(phenobarbital)로 마취시키고, 37℃로 유지시켰다. 경동맥(carotid arteries)을 투시하고, 동측성 경동맥을 영구적으로 폐색시켰다. 동측성 중뇌 동맥(MAC)을 투시하고 오리진(origin)에서 파괴시켰다. 대측성 동맥을 1시간동안 클램핑(clamping)시켜 폐색시켰다. 동물을 24시간후에 희생시켜 뇌를 제거하고 1mm의 연속 섹션으로 절단시켰다. 생존가능한 조직을 인 시츄 트리페닐테트라졸리 움 환원(in situ triphenyltetrasolium reduction)을 이용하여 시각화하여 괴사 조직으로부터 살아있는 조직을 볼 수 있었다. 국소 빈혈의 중심 및 주위의 경계부분은 세포 사멸을 겪는다.

상기의 MCA 모델을 이용하여, 상해전의 다양한 시간들 및 상해 직후에 비경구 주입을 통해 EPO를 투여하였고, 상해 용적을 컴퓨터-보조 이미지 분석을 통해 측량하였다. 상기 분석의 결과는 도 4B에 보여지며, 발작 전후의 하기에 기재된 시간에서의 EPO 처리 효과를 나타내었다: 발작 24시간 전, 발작 직후 및, 발작 3,6 및 9시간후. 도 4A에서 보여진 바와 같이 EPO가 발작 후 6시간내로 투여되었을 경우 조직의 괴사 상해를 막는다.

유익하게 및 반대로, EPO로부터 유도된 17-mer는, 종래에 생체 밖에서의 신경염(neurite)의 성장 및 탈체(ex vivo) 신경세포의 수초화(myelination)을 촉진시키며(Campana et al., 1998, Int.J.Mol.Med. 1:235-41;1997년 12월 23일자로 허여된 미국 특허 제 5,700,909), 향신경성 활성(neurotropic activity)를 가진다고 보고되었으며, 상기 시스템(도 4B, "17-mer)에서 상해로부터의 보호에 대해 아무런 효과가 없다. 따라서, 상기 모델뿐만 아니라, 본 발명에 의해 제공된 흥분조직의 작용에 대한 EPO의 효과를 평가하는 기타 다른 모델은, 흥분조직 작용, 예를 들면 상해에 대한 보호 또는 학습 및 인지의 향상을 조절하는데 사용될 수 있는 EPO 및 EPO 수용체 활성 조절체를 규명하기 위해 사용될 수 있다.

10. 실시예 5: 말초 투여된 EPO는 뇌의 둔상(blunt trauma)을 막는다

기계적 외상의 모델, 피질 충격 모델에서, 전신-투여 EPO로 예비처리함은 마우스 뇌의 둔상을 막는다. 손상을 유도하기 위해, 직경이 3mm이고 정확하게 공기를 두개골로 전달할 수 있는, 공기-유도 피스톤(Clippard valves)을 사용하였다. 각각의 마우스를 마비시켜 안전하게 스테로택식(sterotaxic) 장치에 배치하여 머리의 움직임을 막았다. 피스톤이 초기에 배치된 브레그마(bregma)의 위치를 측정하기 위해 머리가죽 절재를 시행하였다. 다음에, 피스톤을 꼬리쪽으로 2mm, 복부쪽으로 2mm 이동시켜 브레그마로 조정하고 질소의 정확한 펄스을 이용함으로써 충격을 만들었다. 이러한 장치는 피스톤 속도(4m/s)의 정확한 선택 및 충격 이동(2mm)을 가능케한다.

마우스를 상해 24시간전, 직후, 상해시간으로부터 3,6 또는 9시간 후에 EPO(5000U/kg)를 처리하였고 날마다 계속적으로 투여하였다. 이러한 절차로부터 10일후에 마우스를 희생시키고, 이어서 뇌를 조사하고 뇌의 괴사 용적을 측정하였다. 염수-처리된 마우스에서, 넒은 부위의 괴사가 관찰되었고(도 5), 다량의 단핵세포의 침윤을 동반하였다. 반대로, 동물을 EPO로 예비처리하거나, 상해 후 3시간내로 EPO를 주었을 때, 동물은 상기 손상으로부터 보호되었으며, 상해 부위에서는 단핵세포가 거의 검출되지 않았다.

11. 실시예 6: 말초 투여된 EPO는 심근의 국소 빈혈 손상을 방지한다

본 실시예는 심장조직의 저산소성 손상을 방지하는 EPO의 효능을 입증한다. 이를 이루기 위해, 문헌[Latini et al.,(1999, J. Cardiovasc. Pharmacol. 31:601-8)]에 따라 수행되는 과정 24시간 이전에 EPO(5000U/kg)로 쥐를 예비시험하였다. 이어서, 대상을 마취시키고, 보조 환기에 위치시키고 개흉술을 수행하였다. 심장 및 그 내부 순환을 확인하고 좌전하행 관상 동맥의 최근접부 주위에 제거가능한 봉합을 위치시킨 후 결찰하였다. 이후, EPO를 추가로 투여(5000 유니트/kg)하고 30분 동안 폐색을 유지시켰다. 30분 후, 봉합을 느슨하게 하고 동물을 추가로 6시간 동안 깊은 마취로 유지시킨 후 희생시켰다. 사망 직후, 심장을 제거하고 영향받은 국부의 일부(AAR) 뿐만 아니라 영향받지 않은 국부(격막)을 제거하여 생화학적인 분석을 준비하였다. 두 파라미터, 즉 심근의 생존도의 척도인 크레아틴 키나제(CK)(CK가 낮을수록 조직 생존률이 낮아진다), 및 단핵세포 침윤물의 생성물인 미엘로페록시다제를 평가하였다. 결과를 도 6A 및 도 6B에 나타내었다. 이들 도면에 나타나는 바와 같이, EPO로 처리함으로써 경색 영역(AAR) 및 살포되지 않은 좌심실(LV) 벽 둘 다에서 CK 활성이 유지되고, 따라서 대조군에 비해 조직 생존률이 높아지며, MPO 활성이 낮아지는데, 이는 염증세포에 의한 침윤이 상당히 적다는 것을 나타낸다.

12. 실시예 7: 말초 투여된 EP는 실험적인 알레르기성 뇌염의 독소를 약화시킨다

쥐의 실험적인 알레르기성(또는 자가면역성) 뇌척수염(EAE)은 당해 분야에 인정된 다발성 경화증(MS)의 동물 모델이다. MS의 특징을 이해하기 위해 면역성, 바이러스성, 독소성 및 외상성 파라미터를 적용하는, EAE를 갖는 여러 동물 모델이 개발되었다.

EPO가 EAE 증후를 방지하는지를 시험하기 위해, 다음의 실험을 수행하였다. 열-살균된 미코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 7mg/ml와 함께 동일 부피의 프로인트 완전 면역보강제(CFA, Sigma)에서 유화시키고 H37Ra(Difco, Detroit, MI)에 첨가하여 최종 부피 100μl가 되도록 한 수중의 기니아 피그 미엘린 염기성 단백질(MBP; Sigma, St.Louis, MO) 50μg을 가벼운 에테르 마취하에 양 뒷발바닥에 주사함으로써 6 내지 8주 나이의 암컷 루이스(Lewis) 쥐(Charles River, Calco, Italy)를 면역시켰다.

처리 후에, 쥐의 실험적인 자가면역성 뇌척수염(EAE)의 징후를 매일 평가하고 다음과 같이 점수를 매겼다: 0, 질병 없음; 1, 연약한 꼬리; 2, 운동실조; 3, 요실금을 수반한 완전한 뒷다리 마비. 또한 체중을 관찰 기록하였다. 쥐에게 EPO(5000U/kg, IP, 하루에 한번)를 면역화 3일 후에 투여하기 시작하여 18일까지 계속하였다. 대조군 쥐에게는 부형제만을 투여하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, EPO로 처리된 쥐는 점수가 향상(즉, 수가 작아짐)되고 질병에 대한 내구성이 개선됨을 입증하였다. 또한, EPO로 처리된 쥐에서는 증후의 개시가 현저히 지연됨이 밝혀졌다.

13. 실시예 8: 흥분조직의 보호를 위해 요구되는 EPO의 최소 유효 투여량 및 약물 동력학

상기 초점성 국소빈혈 발작의 동물 모델을 사용하여 EPO의 최적 유효 투여량을 평가하였다. 도 8A에 도시된 바와 같이, 450 유니트/kg 체중의 EPO 투여량은 흥분조직의 회저성 손상을 방지하는데 확실하게 효과적이지 않았다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 동물 연구에서, 약 5000 유니트/kg-체중의 투여량으로 IP를 4마리의 암컷 생쥐 대상에 전달시킨 결과, EPO의 혈중 함량이 투여 후 5시간 내에는 혈청의 20,000 밀리유니트/ml보다 크고, 투여 후 10시간 후에는 10,000 밀리유니트/ml보다 컸지만, 투여 24시간 후에는 5 유니트/ml 미만이 되었다.

14. 실시예 9: 에리트로포에틴에 의해 매개되는 CNS 전달

다음부터 제공되는 실험은 EPO에 결합된 분자의 혈액-뇌 장벽에 대한 성공적인 전달 및 기저막 내의 국소화를 나타내는 것이다. 도 9A에 도시된 바와 같이, 뇌 모세혈관이 높은 함량의 EPO-R을 나타낸다는 것을 보여주는 EPO 수용체(EPO-R)에 대한 항체로 뇌 단면을 염색하였다. EPO가 혈액-뇌 장벽을 가로질러 이동될 수 있는지를 연구하기 위해, EPO를 다음과 같이 바이오틴으로 라벨링하였다. rhEPO를 함유하는 용량을 센트리콘-10 필터(Centricon-10 filter)(Millipore)를 사용하여 농축시키고, 280nm의 파장에서 흡수도 눈금을 읽음으로써 회수분을 측정하였다. 다음에, 장완(long arm) 바이오틴(Vector Labs) 0.2mg을 DMSO 100μl에 용해시켜, 농축 rhEPO 용액에 첨가하여 즉시 와동시켰다. 이후 이 혼합물을 서서히 교반하고 빛을 차단하면서 4시간 동안 실온에서 배양시켰다. 센트리콘-10 칼럼을 사용하여 결합되지 않은 바이오틴을 용액으로부터 제거하였다. 이후 비오티닐화된 EPO를 동물 IP에 투여하고, 5시간 후에 동물을 희생시켰다. 뇌 단면을 페록시다제와 결합된 아비딘으로 라벨링하고, 광학 현미경으로 관찰하기 위해 충분한 반응 생성물이 발생될 때까지 디아미노벤지딘을 첨가하였다. EPO는 EPO-R 양성으로 염색된 동일한 모세혈관을 따라 발견되었다(도 9B). 이후 시점에서, 바이오틴 함량은 특정한 뉴론 내에 국소화된 것으로 나타났다(예: 도 9C, 17시간). 대조적으로, 차가운 EPO를 라벨링된 EPO의 1000배 과량으로 첨가한 경우, 모든 특정한 염색은 제거되었다. 상기 결과는 전신 투여된 결합 EPO 화합물이 혈액-뇌 장벽을 가로질러 성공적으로 전달됨을 입증한다.

전신 투여된 EPO-바이오틴 결합물이 혈액-뇌 장벽을 가로질러 뇌로 성공적으로 전달되었다는 것은 다른 치료용 화합물도 목적하는 화합물에 EPO를 착화시킴으로써 유사한 방식으로 혈액-뇌 장벽을 가로질러 전달될 수 있다는 것을 입증한다. 한 예로서, 뇌-유도된 신경성 인자(BNF)는 표준적인 과정을 사용하여 카보디이미드에 의해 EPO에 공유적으로 결합될 수 있다. 정제 후에, 결합물을 복강내 주사를 통해 동물에게 투여할 수 있다. BNF의 중추신경계에 대한 긍정적인 효과는 결합되지 않은 BNF에 의한 중추신경계 활성의 결여와는 대조적인, EPO과 결합된 이 분자의 성공적인 이동을 측정하여 대조군 동물과 관련하여 측정될 수 있다.

본 발명의 범주는 본 발명의 개별적인 양태의 하나의 예로서 기술된 특정한 양태에 의해 한정되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 조성물이 본 발명의 범주 내에 있다. 사실 당해 분야의 숙련자에게는 본원에 도시되고 기술된 것뿐만이 아닌 본 발명의 여러 변형이 앞의 기술 및 수반된 도면으로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구의 범위의 범주 내에 들어가도록 의도되었다.

본원에 인용된 모든 참고문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로서 인용되었다.

Claims (33)

1. 분자와 회합되어 있는 무독성 범위량의 에리트로포에틴(EPO)을 포함하는, 내피 폐쇄막을 가로지른 분자의 전달을 위한 조성물로서, 상기 내피 폐쇄막은 EPO 수용체를 발현하고, 상기 분자는 스스로 상기 내피 폐쇄막을 유효하게 통과하지 않는 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   무독성 범위량의 EPO가 50,000 내지 500,000 유니트의 EPO를 포함하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,

   무독성 범위량의 EPO가 10,000 밀리유니트/ml(혈청) 초과의 순환하는 수준의 EPO를 달성하기에 효과적인 용량인 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,

   EPO의 순환 수준이 EPO 투여 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간 또는 10시간 경과시에 측정되는 조성물.
5. 제 2 항에 따르는 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기를 갖는 약학 키트(kit).
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19. 분자와 회합되어 있는 무독성 범위량의 EPO를 포함하는, 포유동물에서 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 전달을 촉진시키기 위한 조성물로서, 상기 내피 세포 장벽은 EPO 수용체를 발현하고, 상기 분자는 스스로 상기 내피 세포 장벽을 유효하게 통과하지 않는 조성물.
20. 제 19 항에 있어서,

    회합이 불안정한 공유결합, 안정한 공유결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비공유 회합인 조성물.
21. 제 19 항에 있어서,

    내피 세포 장벽이 혈액-뇌 장벽, 혈액-안구 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 또는 혈액-태반 장벽인 조성물.
22. 제 19 항에 있어서,

    분자가 수용체 작용제 또는 길항제 호르몬, 신경향성 인자, 항균제, 방사선 약물, 안티센스(antisense) 화합물, 항체, 면역 억제제, 독소 또는 항암제인 조성물.
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30. 제 1 항 또는 제 19 항에 있어서,

    상기 EPO가 비-적혈구 조혈성인 조성물.
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32. 제 30 항에 따르는 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기를 갖는 약학 키트.
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