JP5542064B2 - 組織の損傷に関連した疾患及び障害を予防及び治療する、組織保護ペプチド及びペプチド類似体 - Google Patents

組織の損傷に関連した疾患及び障害を予防及び治療する、組織保護ペプチド及びペプチド類似体 Download PDF

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Description

本出願は、2008年1月22日に出願の米国仮出願番号第61/062,012号、2008年1月22日に出願の第61/062,022号、2008年1月22日に出願の第61/062,045号、2008年7月3日に出願の第61/133,912号、及び2008年12月30日に出願の第61/203,890号の優先権の利益を主張する。これらの内容は本明細書中に引用により取り込まれている。
(1. 導入)
本発明は、癌、炎症及び毒剤への曝露を含むがこれらに限定されない、組織の損傷に関連した疾患又は障害、及び/又はそれらのダメージ、影響又は症状を予防又は治療するための、組織保護ペプチド及びペプチド類似体を提供する。特に、本発明は、コンセンサス配列を、該完全長リガンドの潜在的に望ましくない血液生成作用をほとんど又は全く有しないI型サイトカイン受容体リガンドの断片と共有する、組織保護ペプチド及びペプチド類似体を提供する。
これらのペプチドは、断片、キメラ、並びに、例えばEPOなどの組織保護受容体リガンド内の重要アミノ酸残基の空間位置を模倣するように設計されたペプチドも含む。本発明は、更に、該疾患又は障害を治療、予防又は改善するために、組織の損傷に関連した疾患又は障害から生じる対象の反応及び/又は症状を調整するための、これらのペプチドの方法及び使用を提供する。
加えて、本発明は、癌、炎症及び毒剤への曝露を含むがこれらに限定されない、組織の損傷に関連した疾患又は障害、又はそれらのダメージ、影響又は症状を、その必要がある対象において治療するための、ペプチド及び医薬として許容し得る担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
(2. 本発明の背景)
組織の損傷は、組織内の細胞がアポトーシス又は壊死により破壊される、虚血性、外傷性、毒性、又は炎症性の損傷により、組織の実質的な損失によって生じ得る。組織の損傷は、多くの急性及び慢性疾患及び状態で生じ得る。組織の損傷が生じる程度は、疾患又は損傷の種類、疾患又は損傷に関連した炎症又は外傷のレベル又は重症度、組織の損傷の位置、及び組織の血管量を含む、多くの要因により媒介される。
また、最近の証拠は、ヘマトクリットの維持に一般に関連した、1型サイトカイン系統の一員であるエリスロポエチン(EPO)が、そのレセプターEPORとの相互作用により、組織の損傷を軽減する重要な役割を果たし得ることを示唆している(Brinesらの文献, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(41):14907-12)。EPOが、低酸素細胞環境を改善し、代謝ストレスによって生じるプログラムされた細胞死を調整するのに役立つ代償性反応を提供し得るという仮説があるが、その根底にある分子機序はまだ明確に理解されていない。
この観察に基づいて、研究者らは、様々な徴候におけるEPOの使用を探査している。例えば、研究者らは、腫瘍患者の貧血症を治療するために用いられるEPOが、腫瘍患者の貧血症の調整だけでなく、健康の改善をも生じるという観察に基づき、潜在的癌治療としてEPOの使用を探査した(米国特許第6,579,525号及びBlau C.A., 2007, Stem Cells 25(8):2094-7を参照されたい)。Haran-Gheraらの米国特許第6,579,525号は、多発性骨髄腫の治療のための組換えEPOの使用に関し、かつEPOが該腫瘍に免疫応答を誘発するという仮説を立てている。加えて、米国特許出願番号第11/093177号、公開番号第US 2005/0267027号は、該腫瘍のHIF-1α及び/又はVEGF発現の減少により、腫瘍の血管形成を阻害するEPOの使用を開示している。
しかし、潜在的組織保護剤としてのEPOは、その赤血球新生作用のために深刻な不利益を被る。特に、癌及び炎症などの徴候において想像される慢性的投与において、治療投与量のEPOの頻繁な適用は、対象のヘマトクリットを著しく増加させることがあり、それは高血圧症、発作及び血管内血栓症もたらす可能性がある。
さらに、癌に関して、治療薬としてのEPOの潜在性は分かっていない。乳癌などの数種の癌が、エリスロポエチンレセプターを発現させ、過剰発現させる傾向があることが確定されている。これは、癌を治療するためのEPOの治療的使用が、腫瘍の発症の後退と対照的に腫瘍の更なる成長に至るという懸念に至った(上記Blau, 2007、及びUS2005/0260580として公表された米国特許出願番号第10/432,899号を参照されたい）。この懸念は、様々な癌徴候の範囲内のEPOの幾つかの試験が腫瘍成長による死亡率の増加により中断されたように、診療所において確認された。これらの不利な臨床結果を考慮して、FDAは、承認EPO製品に、未承認の癌徴候におけるそれらの使用に対して警告するブラックボックス警告を取り付けた。
加えて、成熟したヒトEPOタンパク質は、質量分析で測定される約30.4kDaの分子量を有する165のアミノ酸タンパク質である。組換えタンパク質は、高度に調整される、高価かつ苦労する方法で、チャイニーズハムスター卵巣細胞において生成されることができる。更に、EPOは、その活性を維持するために、ストリンジェント条件下で保管されなければならない。これらの限界を考えると、EPOは、広い分布のために治療薬の迅速な大量生産を必要とする工場災害又はテロリズム若しくは戦争行為を介する、放射線又は化学薬品などの毒剤の放出などの公衆の非常事態に対処するための望ましい候補ではない。
従って、潜在的に有害な作用をほとんど又は全く有さず、容易に市民が利用できる組織保護治療が必要である。
(3. 要旨)
本発明は、応答性細胞、組織又は器官において組織保護活性を有する単離ペプチド及びペプチド類似体を提供する。ある種の実施態様において、ペプチド及びペプチド類似体は、潜在的に望ましくない血液生成作用をほとんど又は全く有しない。特に、本発明は、コンセンサス配列を、EPO及びI型サイトカイン受容体リガンドの部分と共有する組織保護ペプチド及びペプチド類似体を提供する。ある種の実施態様において、単離ペプチド又はペプチド類似体は、(1)2つの負荷電アミノ酸及び(2)1つの正荷電アミノ酸と1つの負荷電アミノ酸から選択される、コア構造モチーフを特徴とする9〜29残基のアミノ酸配列を含む。コア荷電アミノ酸は、本明細書中に記載されている、7〜27アミノ酸に挟まれる。特定の実施態様において、コア荷電アミノ酸は、互いに直接隣接している。ある種の実施態様において、荷電アミノ酸は、1〜5個のアミノ酸によって、又は単一極性アミノ酸によって分離される。
特定の態様において、本発明は、少なくとも一つの組織保護活性を有する単離ペプチド及びペプチド類似体を提供する。典型的な組織保護活性は、応答する哺乳動物細胞、組織又は器官の機能又は生存を保護、維持、向上、及び回復することを含むが、これらに限定されるものではない。従って、一態様において、本発明は、応答する哺乳動物細胞及びそれらの関連細胞、組織及び器官の機能又は生存を保護、維持、向上又は回復する医薬組成物の調製のための、本発明の単離ペプチド及びペプチド類似体の使用を提供する。関連した実施態様において、該組成物は、その必要がある対象に投与するためのものである。
他の態様において、本発明の単離ペプチド及びペプチド類似体は、ほとんど又は全く赤血球新生作用活性も有さず。例えば、それらは、対象のヘモグロビン又はヘマトクリットを著しく増加させず、又はより一般的には、ほとんど又は全く血液生成活性を有さず、例えば、それらは、赤血球、リンパ及び脊髄細胞などの血液細胞成分を著しく増加させない。特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、血管作動性の作用(例えば、血管収縮)、血小板過剰活性化、凝血促進性活性、及び刺激的増殖又は血小板若しくは赤血球生成依存性細胞(erythropoietic-dependent cells)から選択される活性をほとんど又は全く有しない(Colemanらの論文, 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:5965-5970を参照されたい。)。
また本発明は、このような組織保護ペプチド及びペプチド類似体、及び医薬として許容し得る担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物、並びに組織の損傷に関連した疾患及び障害を治療する前記組成物の製造方法、及びそれらの使用を提供する。他の態様として、本発明は、応答性組織損傷に対する保護用又はその予防用医薬組成物の調製のため、又はその必要がある対象の応答性組織若しくは応答性組織機能の修復若しくは再生のための、本明細書中に記載した単離ペプチド又はペプチド類似体の使用方法を提供する。1つの特定の態様において、応答性哺乳動物細胞及びそれらの付随する細胞、組織又は器官は、堅固な内皮細胞障壁の効力によって、脈管構造に対して遠位にある。別の特定の態様において、細胞、組織、器官又は他の体部位は、移植を対象としたものなど、哺乳動物の体から単離される。本発明の特定の態様において、興奮組織は、中枢神経系組織、末梢神経系組織、心臓組織又は網膜組織である。別の態様において、応答性細胞又はその関連する細胞、組織又は器官は、興奮細胞、組織又は器官ではなく、それらは興奮細胞又は組織を主に含まない。
別の実施態様において、本発明は、ペプチドの有効量を投与することによって、その必要がある患者の炎症、癌又は腫瘍性障害又は毒剤への曝露を予防、治療、改善又は管理する方法に引かれる。
ある実施態様において、本発明は、癌の媒介物の活性、毒剤に対する身体の反応、及び炎症を調整する方法に関する。特に、本発明は、炎症媒介物の活性を調整することに関する。好ましくは、本発明のペプチドは、一つ以上の炎症媒介物の作用を調整できる。
別の実施態様において、本発明は、成長抑留を必要とする細胞を有効量のペプチドと接触させることを含む、細胞の成長を抑える方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、癌又は新生物細胞を有効量のペプチドと接触させることを含む、癌又は腫瘍細胞死を生じる方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、癌又は新生物細胞への血管生成を阻害する、又は有糸分裂又は血管形成を生じる分子の産生を減らす方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、化学療法又は放射線療法に関連した副作用を治療又は予防する方法であって、前記治療又は予防を必要とする患者に、有効量のペプチドを投与することを含む方法に関する。化学療法又は放射線療法に関連した副作用は、悪液質、低血球数、嘔気、下痢、口腔病変及び脱毛症を含む。
別の実施態様において、本発明は、癌又は腫瘍細胞をペプチドの有効量と接触させることを含む患者の癌又は腫瘍性疾患を治療するか又は予防する方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、患者の癌又は腫瘍性疾患を治療又は予防する方法であって、前記治療又は予防を必要とする患者に有効量のペプチドを投与することを含む方法に関する。
ある実施態様において、本発明は、その必要がある対象の癌又は腫瘍性障害の予防、治療、改善又は管理のための医薬組成物の調製のためのペプチドの使用に関する。
別の実施態様において、本発明は、炎症又は炎症性状態に関連した症状を治療又は予防する方法に関する。さらなる実施態様において、本発明は、その必要がある患者の炎症又は炎症性状態を治療又は予防する方法に関する。現在の方法によって治療可能な炎症性状態には、アレルギー及びアレルギー疾患、リウマチ性疾患、及び運動関連損傷がある。
別の実施態様において、本発明は、治療を必要とする人の毒剤への曝露の影響を治療、、予防、改善又は管理する方法に関する。考慮される毒剤には、生物学的、化学的及び放射性薬剤がある。
ある種の実施態様において、本発明は、その必要がある対象への投与のために上述した単離ペプチドを含む、医薬組成物も目的とする。この実施態様に従う特定の態様において、本発明の医薬組成物は、医薬として許容し得る担体を更に含む。前記医薬組成物は、経口的、鼻腔内、眼、吸入、経皮、直腸、舌下、膣、又は非経口投与のために、或いは、生体外での細胞、組織又は器官の生存度を維持するための灌流液の形態で製剤化され得る。本発明の関連した実施態様において、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
本発明のこれらの及び他の特徴、態様及び利点は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲を参照してより理解されるであろう。
(4. 略語及び専門用語)
(4.1 略語)
本明細書中で用いられる、遺伝的にコード化されたL-鏡像異性的アミノ酸の略語は、以下の通りである。
Figure 0005542064
(4.2 専門用語)
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての専門的及び科学的な用語は、本発明が属する当業者によって、共通に理解される意味を有する。本明細書中で用いられる、以下の用語は、特に明記しない限りそれらのものとされる意味を有する。
(i)本明細書中で用いられる、用語「約」又は「ほぼ」は、数値と組み合わせて使用される場合、参照された数の1、5、10、15又は20%内の任意の数を指す。
(ii)本発明の方法との関連で、用語「と組合せて投与される」は、疾患、障害、又は状態の発症の前、同時、及び/又は後に化合物を投与することを意味する。
(iii)用語「アレルゲン」は、即時型過敏症(アレルギー)を生じる抗原性物質を指す。一般のアレルゲンは、細菌、ウイルス、動物寄生虫、昆虫及び昆虫針、化学物質(ラテックス)、塵、塵ダニ、カビ、動物の鱗屑、薬剤(例えば抗生物質、血清、サルファ剤、抗痙攣剤、インシュリン製剤、局所麻酔薬、ヨウ素及びアスピリン)、食品(例えば牛乳、チョコレート、イチゴ、卵子、大豆、ナッツ、魚、甲殻類、小麦)、香水、植物、花粉及び煙を含むが、これに限定されるものではない。
(iv)用語「アレルギー疾患」は、アレルギーによって、又は、それに関して生じる状態又は疾患を指す。アレルギー疾患は、喘息、過敏性肺疾患、鼻炎、鼻副鼻腔炎、アトピー性湿疹、接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎(断続的及び持続的)、春季カタル(花粉症)、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、蕁麻疹(発疹)、血管浮腫、過敏性肺炎、好酸球性気管支炎、脈管炎、過敏性血管炎、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連脈管炎、ウェーグナーの肉芽腫症、チャーグストラウス脈管炎、顕微鏡的多発性血管炎、側頭動脈炎、小児脂肪便症、肥満細胞症及びアナフィラキシーを含むが、これらに限定されない。
(v)用語「アレルギー症」又は「アレルギー反応」は、アレルゲンに対する身体の反応を指す。アレルギー反応は、1つの領域(アレルゲンと接触した皮膚)に局在又は一般化することができる。アレルギー反応は、皮疹、そう痒、発疹、腫脹、呼吸困難、喘鳴、血管浮腫、嚥下困難、鼻汁、鼻水、息切れ、嘔気、胃痙攣、腹痛、嘔吐及び/又は低血圧を含むことができるが、これらに限定されない。
(vi)用語「アレルギー」は、曝露後に有害な免疫学的反応を生じる、特定の抗原アレルゲンへの曝露により生じる過敏症の状態を指す。
(vii)用語「アミノ酸」又は特定のアミノ酸の任意の言及は、天然のタンパク質起源アミノ酸、並びにアミノ酸類似体などの非天然のアミノ酸を含むことを意味する。当業者は、特に強調されない限り、この定義は、天然のタンパク質起源(L)-アミノ酸、これらの光学(D)-異性体、ペニシラミン(3-メルカプト-D-バリン)などのアミノ酸類似体を含む化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどの天然非タンパク質起源アミノ酸、及びアミノ酸の特徴を示す技術的に公知の特徴を有する化学的に合成されたアミノ酸を含むことは理解するであろう。加えて、用語「アミノ酸等価物」は、天然アミノ酸の構造から外れるが、実質的にアミノ酸の構造を有する化合物を指す。それらは、ペプチド内で置換されることができ、置換にもかかわらずその生物活性を保持する。従って、例えば、アミノ酸等価物は、側鎖修飾又は置換を有するアミノ酸を含むことができ、更に関連した有機酸、又はアミド等を含むことができる。用語「アミノ酸」は、アミノ酸等価物を含むことを意図する。用語「残基」は、アミノ酸及びアミノ酸等価物を指す。また、一般に公知技術であるように、アミノ酸は以下の基に分類されることができる：(1)酸性= Asp、Glu；(2)塩基性= Lys、Arg、His；(3)無極性(疎水性) = Cys、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp、Gly、Tyr；及び(4)非荷電極性= Asn、Gln、Ser、Thr。非極性は、以下に細分されることができる：強疎水性= Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe；及び中程度疎水性= Gly、Pro、Cys、Tyr、Trp。代わりの方法において、アミノ酸レパートリーは、(1)酸性= Asp、Glu；(2)塩基性= Lys、Arg、His、(3)脂肪族= Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、任意にSer及びThrは脂肪族ヒドロキシルとして別に分類される；(4)芳香族= Phe、Tyr、Trp；(5)アミド= Asp、Glu；及び(6)硫黄含有= Cys及びMetとして分類されることができる。(例えば、Biochemistry, 第4版, L. Stryer編集, WH Freeman and Co., 1995を参照されたい。本文献は本明細書中に引用により取り込まれている。)。
(viii)本明細書で用いられる用語「生物剤」は、ヒト、動物又は植物の疾患若しくは有害の原因となる、又は物質の劣化を生じる、生体又はそれから誘導される物質(細菌、ウイルス、真菌及び毒素など)を指す。これらの生物剤は、事実上遍在しており、戦争又はテロリズム(バイオテロリズム)用に設計され又は最適化され得る。これらの生物剤は、プリオン、ウイルス、微生物(細菌及び真菌)、及び一部の単細胞及び多細胞真核生物(すなわち、寄生虫)から構成され得る。特に、生物剤(利用可能な、それらの慣用名、生物学的名称、及びNATO標準参照文字記号(NATO Standard Reference letter code)により同定される)は、制限されないが、以下を含む：真菌薬(コクシジオイデス・ミコシス(Coccidioides mycosis), OC, コクシジオイデス・ポサダシル(Coccidioides posadasil)、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis))、細菌剤(炭疽菌(皮膚、吸入、胃腸)(炭疽菌(Bacillus anthracis), N及びTR)、 疫病(鼠蹊腺腫、肺炎)(ペスト菌(Yersinia pestis), LE)、野兎病(野兎病菌(Francisella tularensis), UL(schu S4), TT(含水型), ZZ(乾式型)、及びSR及びJT(425))、コレラ(コレラ菌(Vibrio cholerae), HO)、ウシブルセラ病(AB)、ブタブルセラ病(US及びNX)、ヤギブルセラ病(AM及びBX)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、マルタ熱菌(Brucella melitenis)、ブタ流産菌(Brucella suis)、細菌赤痢(細菌性赤痢、カンピロバクター感染症、サルモネラ症)(Y)、鼻疽(鼻疽菌(Burkholderia mallei), LA)、類鼻疽(類鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei), HI)、ジフテリア(ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae), DK)、リステリア症(リステリア菌(Listeria monocytogenes), TQ)、クラミジア剤(オウム病「オウム熱」(クラミドフィリア・プシティッシ(Chlamydophilia psittici), SI)、リケッチア薬(ロッキー山発疹熱(ロッキー山紅斑熱リケッチア(Rickettsia rickettsii), RI及びUY)、Q熱(コクシエラ・ブルネッティ(Coxiella burnetti), OU, MN(含水型), 及びNT(乾式))、ヒト発疹チフス(発疹チフス・リケッチア(Rickettsia prowazekii), YE)、発疹熱(リケッチア・チフス(Rickettsia typhi), AV))、ウィルス薬(黄熱(アルボウイルス・フラビビルダエ(Arbovirus flavivirdae), OJ, UT, 及びLU)、リフトバレー熱(RVFフレボウイルス・ブニアビリダエ(Phlebovirus bunyaviridae), FA)、アルファ・ウイルス(例えば：東部ウマ脳炎(ZX)、西部ウマ脳炎、ベネズエラウマ脳炎(NU、TD及びFX))、天然痘(ZL)、日本B脳炎(AN)、オナガザルヘルペスウイルス1型(ヘルペスBウイルス)、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、ウィルス性出血熱(フィロウイルス科(エボラ及びマールブルグ病ウイルス)、及びアレナウイルス科(ラッサ及びマチュポ))、サルポックスウイルス、再配列1918インフルエンザウイルス、南米出血熱ウイルス(フレクサル、グアナリト、フニン、マチュポ、サビア)、ダニ媒介性髄膜脳炎(TEBV)ウイルス(中央ヨーロッパダニ媒介性脳炎、極東ダニ媒介性脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、ロシア春及び夏のウイルス)、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス(韓国出血熱)、アフリカウマ病ウイルス、最適化されたブタ熱ウイルス、アカバネウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ブルータングウイルス、ラクダポックスウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヤギポックスウイルス、ランピースキン病ウイルス、悪性カタル熱ウイルス(アルセラフィン・ヘルペスウイルス1型)、メナングルウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、小反芻動物病ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、羊ポックスウイルス、豚水胞症ウイルス、水疱性口内炎ウイルス)、毒素(ボツリヌス毒素(クロストリジウム属、X及びXR)、リシン(トウゴマ(Ricinus communis), W及びWA)、ブドウ球菌エンテロトキシンB(UC及びPG)、サキシトキシン(麻痺性甲殻類中毒)(TZ及びSS)、テトロドトキシン(PP)、コノトキシン、クロストリジウムイプシロン毒素、トリコテセンマイコトキシン(T-2毒素)、志賀毒素)、及びシムアント（simuants)(モラシスレジジウム(molasis residium)(MR)、バチルス・グロビギイ(Bacillus globigii)(BG、BS及びU)、セラチア菌(Serratia marescens)(SM及びP)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)変異体C-2(AF)、E.コリ(EC)、バチルス・スルシジウス(Bacillus thursidius)(BT)、エルウィニアヘルビコラ(EH)、蛍光粒子(FP))、麦角、ハンセン病、狂犬病、腸チフス、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)(ガス壊疸)、アフラトキシン、ネズミチフス菌、エンテロトキシン、アルゼンチン出血熱、多剤耐性結核(MTB)、ボリビア出血熱、レジオネラ・ニューモフィラ(legionella pneumophilia)、海洋毒素、脚気、マラリア、ペラグラ、デング熱、菌核ロリホイル(sclerotium rolfoil)、神経組織栄養脳炎、赤痢菌(Y)、SEB(UC)、及びマイコトキシン、ジアアセトキシシルペノール、コウドリア・ルミナンチウム(Cowdria ruminantium)、マイコプラズマ・カプリコルム(Mycoplasma capricolum) M.F38/M、マイコイデス・カプリ(Mycoides Capri)、マイコプラズマ・マイコイデス・マイコイデス(Mycoplasma mycoides mycoides)、アブリンである。生物剤は、ヒト(例えば、天然痘、エボラウイルス、再配列1918インフルエンザウイルス、リシンなど)、家畜などの動物(例えば、アフリカウマ病ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、口蹄病など)、又は両方(東部ウマ脳炎ウイルスなど)に対して標的とされ得る。さらに、非致死的な生物剤でさえ、もしそれらが生物兵器としての使用のために高い致死性を目的として再設計されるなら、脅威を有し得る。従って、風邪に対して応答するウイルスさえ、危険を有する可能性がある。
(ix)本明細書で用いられる用語「癌」は、悪性特性を示す任意の異常増殖を指す：(1)通常の限度を考慮せずに成長して分裂する能力、(2)隣接組織に侵入して、破壊する能力、及び(3)いくつかの例において、身体の他の位置に拡散する能力。癌は、中枢神経系、末梢神経系、胃腸/消化系、泌尿器生殖器系、婦人科学的、頭部及び頚部、血液学的/血液、筋骨格/軟組織、呼吸器、及び胸部の癌又は腫瘍性障害を含む。癌又は腫瘍性障害の更なる例は、制限されないが、以下を含む：脳(星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫)、脊髄、下垂体、胸部(浸潤性、浸潤前、炎症性癌、パジェット病、転移性、及び再発性乳癌)、血液(ホジキン病、白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫)、リンパ節癌、肺(腺癌、燕麦細胞、非小細胞、小細胞、扁平上皮細胞、中皮腫)、皮膚(黒色腫、基底細胞、鱗片状の細胞、カポジ肉腫)、骨癌(ユーイング肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫)、頭頸部(喉頭、咽頭(鼻腔及び洞腔)、及び食道癌)、口腔(顎、唾液腺、喉頭、甲状腺、舌及び扁桃腺癌)、目、婦人科医学(頸部、子宮内膜、卵管、卵巣、子宮、膣、及び外陰)、泌尿生殖器(膀胱、腎臓、陰茎、前立腺、精巣及び尿路癌)、副腎(皮質腺腫、皮質癌腫、クロム親和細胞腫)、及び胃腸(虫垂、胆管(肝外胆管)結腸、胆嚢、胃、腸、結腸、肝臓、膵性、直腸、及び胃癌)、並びに下記のリストしたもの：(この種の障害のレビューに関して、Fishmanらの文献, 1985, Medicine, 第二版, J.B. Lippincott Co., Philadelphiaを参照されたい。)：白血病:急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球、骨髄球、骨髄単球性、単球性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病、真性赤血球増加、胃癌、リンパ腫(悪性及び非悪性)：ホジキン病、非ホジキンの疾患、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症.、重鎖病、固形腫瘍肉腫、及び癌腫：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨性肉腫、骨原性肉種、脊索腫、血管肉腫、皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、口腔扁平上皮癌、肝臓癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌：嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、頸部腺癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、悪性神経膠腫、グリア芽細胞腫、多形性星状細胞神経膠腫(multiforme astrocytic gliomas)、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、又は網膜芽腫である。
(x)本明細書で用いられる用語「化学薬品」は、危険な死又は危害をヒト又は動物に生じる化学物質を指す。化学薬品が軍用品又は分散装置を用いて輸送されるように最適化された範囲内において、該薬品は化学兵器である。一般に、武器として使用する化学薬品は、例えば、血液剤、糜爛剤、神経剤、肺剤及び無能力化剤などの作用のそれらの方法により分類されることができる。下記化学薬品の各々は、利用可能な、それらのNATO標準参照文字記号により同定される。
(xi)「血液剤」は、細胞が酸素を使用するのを阻止するそれらの化学薬品を指す。このカテゴリの範囲内の化学薬品は、制限されないが、以下を含む：アルシン(アダムサイト(ジフェニルアミンクロロアルシン)、クラークI(ジフェニルクロロアルシン)、クラークII(ジフェニルシアノアルシン))、及びシアニド(クロロシアン(CK)、シアン化水素(AC)など)化合物である。アルシン化合物は、腎不全に至る血管内溶血を起こす。シアニド化合物は、細胞が酸素を使用するのを阻止し、その後、該細胞は、代謝性アシドーシスに至る過剰の乳酸を生成する嫌気的呼吸を用いる。血液剤の犠牲者は、頭痛、めまい、嘔気、嘔吐、粘膜刺激、ジスポネア(dysponea)、意識障害、昏睡、痙攣、急速及び緩慢律動異常、低血圧、心血管虚脱、及びアシアノシス(acyanosis)を含むが、これらに限定されない症状を示し得る。
(A) 「神経剤」は、酵素アセチルコリンエステラーゼを不活性化するそれらの化学薬品を指す。犠牲者のシナプシスにおける神経伝達物質アセチルコリンの結果として生じる増加は、ムスカリン様及びニコチン性作用につながる。このカテゴリの範囲内の化合物は、制限されないが、以下を含む：シクロサリン (シクロへキシルメチルホスホフルオリダート, GF)、サリン (イソプロピルメチルホスファノフルオリダート, GB)、チオサリン、ソマン (ピナコリルメチルホスファノフルオリダート, GC)、タブン (エチル N,N-ジメチルホスホルアミドシアニダート, GA)、VX (O-エチル-[s]-[2-ジイソプロピルアミノエチル-メチルホスホノチオラート)、VR (N,N-ジエチル-2-(メチル-(2-メチルプロポキシ)ホスホリル)スルファニルエタンアミン)、VE (O-エチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]ホスホノチオアート)、VG (O,O-ジエチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]ホスホロチオアート)、VM (O-エチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]メチルホスホノチオアート)、エチル サリン (イソプロピルエチルホスホノフルオリダート, GE)、EDMP (エチル-2-ジイソプロピルアミノエチルメチルホスホナート)、DF (メチルホスホニル ジフルオリド)、ノビチョク剤(Novichok Agents)、GV (P-[2-(ジメチルアミノ)エチル]-N,N-ジメチルホスホンアミド酸 フルオリド)、Gd42、Gd83、タメリン エステル、フルオロホスホクロリン、ホスホチオコラート、DFP、及び殺虫剤(insecticides) (フェノチアジン, 有機ホスファート(ジコロウス(dichorous)、マラチオン、パラチオン、フェンチオン、アミドン、パラオクソン、クロロピリホス、シストックス、ピロリン酸塩、TOCP))である。神経剤の犠牲者は、制限されないが、徐脈、縮瞳、過剰な唾液分泌、嘔吐、下痢、尿失禁、筋攣縮、初期脱分極性弛緩性麻痺、スパイク放電及び痙攣、中間の症候群、神経毒エステラーゼ抑制、及び有機ホスフェートにより誘発された後発性ニューロパチーを含む症状を示し得る。
(B)「糜爛剤」は、熱傷及び呼吸困難を生じる、犠牲者の皮膚及び呼吸器系に損傷を与える酸形成化合物である薬剤を指す。このカテゴリの範囲内の化合物は、制限されないが、以下を含む：硫黄マスタード (1,2 ビス(2-クロロエチルチオ)エタン (セスキマスタード、Q)、1,3 ビス(2-クロロエチルチオ)-n-プロパン、1,4-ビス(2-クロロエチルチオ)-n-ブタン、1,5-ビス(2-クロロエチルチオ)-n-ペンタン、2-クロロエチルクロロメチルスルフィド、ビス(2-クロロエチル)スルフィド (HD)、ビス(2-クロロエチルチオ)メタン、ビス(2-クロロエチルチオメチル) エーテル、ビス(2-クロロエチルチオエチル)エーテル、ジ-2'-クロロエチルスルフィド及びそれらの組合せ(HT、HL、HQ))、ナイトロジェンマスタード (ビス(2-クロロエチル)エチルアミン (HN1)、ビス(2-クロロエチル)メチルアミン (HN2)、トリス(2-クロロエチル)アミン (HN3)、2-クロロ-N-(2-クロロエチル)-N-メチルエタンアミン-N-オキシド 塩酸塩、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン)、ルイサイト (2-クロロビニルジクロロアルシン、ビス(2-クロロビニル)クロロアルシン、トリス(2-クロロビニル)アルシン、ジクロロ(2-クロロビニル)アルシン)、エチルジクロロアルシン、メチルジクロロアルシン、フェニルジクロロアルシン、及びホスゲンオキシム(ジクロロホルムオキシム)である。糜爛剤の犠牲者は、制限されないが、紅斑、水腫、壊死及び小水疱、黒皮症、気管気管支炎、気管支痙攣、気管支閉塞、出血性肺水腫、呼吸不全、細菌性肺炎、目紅斑、流涕、目の不快、目の激痛、眼瞼痙攣、虹彩炎、失明、嘔気、嘔吐、骨髄抑制、ルイサイトショック、肝臓壊死及び低循環に続く腎不全を含む症状を示し得る。
(D)「肺剤」は、糜爛剤と類似するが、呼吸器系が含水及び犠牲者窒息を生じる、呼吸器系により顕著な作用を有する薬剤を指す。このカテゴリの範囲内の化合物は、アダムサイト、アクロレイン、ビス(クロロメチル)エーテル、塩素、クロロピクリン、ジホスホゲン、メチルクロロ硫酸塩、塩化第二スズ、塩化水素、酸化窒素及びホスゲンを含むが、これらに限定されない。肺剤の犠牲者は、灼熱感(目、鼻咽頭、中咽頭)、大量の涙、鼻漏、嗄声、呼吸困難、嚥下痛、結膜炎、角膜損傷、鼻口腔咽頭損傷/水腫、声門構造の炎症、分泌、及び/又は喉頭痙攣による呼吸困難、急性呼吸症候群、及び反応気道機能不全症候群を含むがこれらに限定されない症状を示し得る。
(E)「無能力化剤」は、致命的でなく、主に、生理的又は精神的作用又は両方を介して無能力にすることを目的とする薬剤を指す。無能力化剤の一般の種類は、催涙剤、涙、苦痛及び一時的な失明を起こす目を刺激する化学薬品である。催涙剤は、制限されないが、以下を含む：a-クロロトルエン、臭化ベンジル、ブロモアセトン(BA)、ブロモベンジルシアニド(CA)、ブロモメチルエチルケトン、カプサイシン(OC)、クロルアセトフェノン(CN)、クロロメチルクロロホルマート、ジベンゾキサゼピン(CR)、エチルヨードアセタート、オルト-クロロベンジリデンマロニトリル(CS)、トリクロロメチルクロロホルマート及び臭化キシリルである。さらなる無能力化剤は、以下を含むが、これらに限定されない：3-キヌクリジニルベンジルアート (幻覚剤；BZ)、シアン化水素(麻痺剤)、ジフェニルクロロアルシン(くしゃみ誘発剤、DA)、ジフェニルシアノアルシン(DC)、KOLOKOL-1(フェンタニル誘導体)、チョウセン朝顔、ヘルボルネ(Hellborne)、ベラドンナ、ヒオシアムスファレズレズ(Hyoscyamus falezlez)、インドール(リゼルギン酸ジエチルアミド(LSD-25))、マリファナ誘導体(DMHP)、アンフェタミン、コカイン、カフェイン、ニコチン、ストリキニーネ、メトラゾール、バルビツラート(メトヘキシタール)、オピオイド、抗精神病薬(ハロペリドール)、ベンゾジアゼピン、フェンタニル同属種、シロシビン、イボガイン、ハルミン、エクタシー(ectasy)、PCP、アトロピン、スコポラミン、オキシブチニン、ジトロパン(ditropan)、コリン抑制性抗ヒスタミン剤、ベナクチジン及び精神安定剤である。
上記の化学物質の多くが、武器としてそれらの使用を越えた使用を有し、製造の範囲内で用いられる。従って、製造又は化学プラントからこれらの化学薬品の偶然又は意図的な放出は、プラントの従業員、これらのプラント周辺に住む人々に対して危険を有するであろう。毒性の工業的製造化学物質の例を挙げると、制限されないが、以下を含む：アンモニア、アルシン、三塩化ホウ素、三フッ化ホウ素、二硫化炭素、塩素、ジボラン、エチレンオキシド、フッ素、ホルムアルデヒド、臭化水素、塩化水素、シアン化水素、フッ化水素、硫化水素、硝酸、ホスゲン、三塩化リン、二酸化硫黄、硫酸、タングステン ヘキサフルオリド、アセトン シアノヒドリン、アクロレイン、アクリロトリル、アリルアルコール、アリルアミン、アリルクロロカルボナート、三臭化ホウ素、一酸化炭素、硫化カルボニル、クロロアセトン、クロロアセチルニトリル、クロロスルホン酸、ジケトン、1,2-ジメチルヒドラジン、エチレンジブロミド、セレン化水素、メタン塩化スルホニル、メチルブロミド、メチルクロロホルマート、メチルクロロシラン、メチルヒドラジン、メチルイソシアナート、メチルメルカパタン、二酸化窒素、ホスフィン、リンオキシクロリド、五フッ化リン、六フッ化セレン、シリコーンテトラフルオリド、スチロイン（stiloine)、三酸化硫黄、塩化スルフリル、フッ化スルフリル、六フッ化テルル、n-オクチルメルカプタン、四塩化チタン、トリクロロアセチルクロリド、トリフルオロアセチルクロリド、イソチオシアン酸アリル、三塩化ヒ素、臭素、塩化臭素、五フッ化臭素、三フッ化臭素、フッ化カルボニル、五フッ化塩素、三フッ化塩素、クロロアセチルアルデヒド、クロロアセチルクロリド、クロトンアルデヒド、塩化シアン、硫酸ジメチル、ジフェニルメタン4,4'-ジイソシアナート、エチルクロロホルマート、エチルクロロチオホルマート、エチル ホスホノチオ酸ジクロリド、エチルホスホン酸ジクロリド、エチレンイミン、ヘキサクロロシクロペンタジエン、ヨウ化水素、鉄ペンタカルボニル、イソブチルクロロホルマート、イソプロピルクロロホルマート、イソプロピルイソシアナート、n-ブチルクロロホルマート、n-ブチルイソシアナート、一酸化窒素、n-プロピルクロロホルマート、パラチオン、ペルクロロメチルメルカプタン、sec-ブチルイソシアナート、tert-ブチルイソシアナート、テトラエチル鉛、ピロリン酸テトラエチル、テトラメチル鉛、トルエン2,4-ジイソシアナート、及びトルエン2,6-ジイソシアナートである。
(xi)本明細書中で用いられる「有効量」は、組織の損傷又はダメージ、影響又はそれらの症状に関連した任意の疾患又は障害を調整するのに十分なペプチドのその量であって、好ましくは、癌、炎症又は毒剤への曝露に対する身体の反応を含むがこれらに限定されない、組織の損傷に関連した疾患又は障害に対する身体の反応の有害作用を阻害、抑制又は緩和するのに十分なペプチドのその量を含む。加えて、「有効量」は、組織の損傷に関連した任意の疾患又は障害を緩和、改善、減弱又は予防するのに十分なペプチドの量、又は組織の損傷に関連した疾患又は障害に悩む患者の治療的な利益を提供するのに十分なペプチドの量を含む。
(xii)本明細書中で用いられる「赤血球新生作用活性」は、対象におけるヘモグロビン又はヘマトクリット濃度の任意の有意な増加を意味する。「ほとんど又は全く赤血球新生作用活性でない」は、対象のヘモグロビン又はヘマトクリットの増加した濃度が、従来技術において、対象の悪影響が生じる不適当な増加として受け入れられる基準を満たすことを意味する。「著しく増加した赤血球新生作用活性」は、コントロールと比較した対象のヘモグロビン又はヘマトクリット濃度の相違が、有意と認められる基準を満たすことを意味し、とりわけ、高血圧症、発作及び脈管血栓症の可能性を増加させ得る。
(xiii)「興奮組織」は、興奮細胞を含む組織を意味する。興奮細胞は、能動的に電気刺激に反応し、それらの細胞膜全体の荷電差を有する細胞である。興奮細胞は、通常、活動電位を受けることができる。この種の細胞は、通常、電位作動型、リガンド依存型、及び伸縮性チャネルなどのチャネルを発現し、膜全体を通してイオン(カリウム、ナトリウム、カルシウム、塩化物など)の流れを可能にする。興奮組織は、ニューロン組織、筋組織及び腺組織を含む。興奮組織は、制限されないが、以下を含む：末梢神経系(耳及び網膜)及び中枢神経系(脳及び脊髄)の組織などの神経組織；心臓及び関連する神経の細胞などの心血管組織；及び細胞間ギャップ結合に沿って、T-型カルシウムチャネルがインシュリンの分泌に参加する膵臓などの腺組織である。興奮組織の典型的なリストは、神経、骨格筋、平滑筋、心筋、子宮、中枢神経系、脊髄、脳、網膜、嗅覚系、聴覚系などを含む器官及び組織を含む。
(xiv)用語「血液生成活性」は、赤血球、リンパ及び脊髄細胞などの血液細胞成分の任意の有意な増加を意味する。更に血液生成活性は、単離ペプチドかペプチド類似体が、血小板過剰活性化、凝血促進性活性、及び刺激的増殖又は血小板若しくは赤血球生成依存性細胞から選択される活性を有するかどうかを指す。
(xv)本明細書で用いられる用語「宿主細胞」は、核酸分子とトランスフェクトされた特定の対象細胞又はこのような細胞の子孫又は潜在的な子孫を指す。この種の細胞の子孫は、後世又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組込みを起こすことができる、突然変異又は環境の影響により核酸分子とトランスフェクトされた親細胞と同一ではなくてもよい。
(xvi)本明細書で用いられる用語「炎症性状態」は、機械的又は化学的に誘発されたかどうかに関係なく、炎症性成分を有する、様々な疾患又は外傷を指す。それは、脳、脊髄、結合組織、心臓、肺、腎臓、尿路、膵臓、目及び前立腺を含むがこれらに限定されない1つ以上の器官又は組織の炎症を引き起こしている状態を含む。このような状態の非限定的な例を挙げると、制限されないが、以下を含む：虫垂炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液嚢炎、子宮頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、絨毛羊膜炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、心内膜炎、子宮内膜炎、上顆炎、精巣上体炎、結合組織炎、胃炎、歯肉炎、舌炎、汗腺膿瘍、虹彩炎、喉頭炎、乳腺炎、心筋炎、筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺臓炎(肺炎)、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、扁桃炎、ブドウ膜炎、尿道炎、腟炎、外陰炎、喘息、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、腱炎、脈管炎、慢性気管支炎、膵炎、骨髄炎、関節炎(リウマトイド及び乾癬)、糸球体腎炎、視神経炎、側頭動脈炎、脳炎、髄膜炎、横断性脊髄炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎、肝炎、壊死性腸炎、骨盤内炎症性疾患、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病、回腸炎及び腸炎)、直腸炎、脈管炎、血管狭窄、再狭窄、低血圧、1型糖尿病、川崎病、デクム(Decum's)病、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、アテローム性動脈硬化症、強皮症、シェーグレン症候群、混合結合組織疾患、酒さ、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、アルツハイマー病、成人発症スティル病、急性網膜色素上皮炎、ティーツェ症候群、ベーチェット病、白点症候群(急性後部多発性斑状色素上皮症、匐行性脈絡膜炎、散弾網脈絡膜炎、汎ブドウ膜炎を有する多病巣性脈絡膜炎、びまん性網膜下線維症、点状内部脈絡膜症、多発一過性白点症候群、及びびまん性片側性亜急性神経網膜炎)、環状肉芽腫、過敏性大腸症候群、胃腸炎、グレーブス病、多発性硬化症、デュピュイトラン拘縮、移植片拒絶疾患(同種移植片拒絶、及び移植片対宿主病)、例えば、皮膚移植拒否、固形臓器移植拒絶、骨髄移植拒絶、炎症性皮膚疾患、ヒト乳頭腫ウイルスから誘導されるものなどのウイルス性皮膚病、HIV又はRLV感染症、細菌性、真菌性、及び又は他の寄生性皮膚病、皮膚エリテマトーデス、及び高IgG4疾患である。更なる「炎症性状態」は、制限されないが、以下を含む虚血性又は非虚血性状態から生じる炎症を指すことができる：鈍的外傷、挫傷、アレルギー及びアレルギー疾患、リウマチ性疾患(小児関節炎、関節リュウマチ、チャーグ−ストラウス症候群、線維筋痛、巨細胞(側頭部)動脈炎、痛風、ヘノッホシェ−ライン(Henoch-Schoenlin)紫斑病、過敏性血管炎、強直性脊椎炎、被膜炎、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発性筋痛、骨関節炎(手、臀部、膝、その他)、結節性多発性動脈炎、ライター症候群)、スポーツ関連の損傷(ひざの軟骨軟化症、テニス肘、五十肩、アキレス腱炎、足底筋膜炎、滑液嚢炎、オスグッド・シュラッター病)、反復運動過多損傷(蓄積外傷疾患、フォーカルジストニア、手根管症候群、交差症候群、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、狭窄性腱鞘炎(ド・ケルヴァン症候群、バネ指/トリガー親指)、胸郭出口症候群、腱炎、腱滑膜炎、橈骨神経管症候群、レイノー病、神経節、ゲーマーの親指、ウィーアイティス(Wii-itis)、その他)、ウィルス、菌類及び細菌などの感染症である。「炎症性状態」は、急性又は慢性でもよい。
(xvii)「単離」又は「精製」ペプチドは、タンパク質又はペプチドが誘導される細胞若しくは組織源由来の細胞物質若しくは他の不純タンパク質を実質的に含まない、又は化学的に合成されるときに化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。言語「細胞物質を実質的に含まない」は、ペプチドが、細胞の細胞成分から分離され、単離又は組換え的に産生される、ペプチドの調製物を含む。従って、細胞物質を実質的に含まないペプチドは、約30%、20%、10%又は5%未満(乾燥重量)の異種タンパク質(本明細書において、「不純タンパク質」とも称される。)を有するペプチドの調製物を含む。ペプチドが組換え的に産生されるとき、培地を実質的に含まないことが好ましい。すなわち、培地がタンパク質調製物の量の約20%、10%又は5%未満を表す。ペプチドが化学合成によって生成されるとき、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないことが好ましい。すなわち、タンパク質の合成に関与している化学前駆体又は他の化学物質から分離される。従って、このようなペプチドの調製物は、対象とするペプチド以外の化学前駆体又は化合物を約30%、20%、10%、5%未満を有する。好ましい実施態様において、本発明のペプチドは、単離又は精製される。
(xviii)「単離」核酸分子は、該核酸分子の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されるものである。さらに、cDNA分子などの「単離」核酸分子は、組換え技術によって生成される場合に他の細胞物質又は培地を実質的に含まない、又は化学的に合成される場合に化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。特定の実施態様において、本発明のペプチドをコード化している核酸分子は、分離又は精製される。
(xix)本明細書中で用いられる用語「管理」は、患者が、一実施態様において、組織の損傷に関連した疾患又は障害のダメージ、影響、又は症状を逆転しないペプチドから派生する一つ以上の有益な副作用の提供を含む。ある実施態様において、患者は、症状の進行又は悪化を予防するために、組織の損傷に関連した疾患又は障害の症状を「管理する」ためのペプチドを投与される。
(xx)用語「調整する」、「調整」などは、調節性の活性の転写及び/又はタンパク質結合などの、組織の損傷に関連した疾患又は障害に対する身体の反応の媒介物の機能及び/又は発現を増減する化合物の能力を指す。本明細書中に記載されているように、調整は、該媒介物と直接的若しくは間接的に関連した機能若しくは特徴の、及び/又は該媒介物の上方制御若しくは下方制御の、抑制、拮抗作用、部分的な拮抗作用、活性化、アゴニズム又は部分的なアゴニズムを含む。好ましい実施態様において、調整は、直接的であり、より好ましくは、調整は、部分的又は全体的に、刺激をブロックし、活性を減少、抑制、阻害、遅延し、シグナル伝達を不活性化、除感作、又は下方制御するように結合する化合物である、媒介物の抑制又は拮抗を介して生じる。媒介物の機能を阻害する本発明の方法に有用な特定のペプチドの能力は、生化学的アッセイ、例えば、結合アッセイ、細胞系アッセイ、例えば、過渡的トランスフェクションアッセイ、又はインビボアッセイ、例えば、ラット又はマウスモデルなどのニューロン損傷、癌、炎症、又は化学的もしくは放射線損傷の動物モデルにおいて、示されることができる。
(xxi)本明細書中で使用されるように、ペプチド内の構造に関して、用語「モチーフ」は、ペプチド鎖のアミノ酸配列中の連続的なアミノ酸のセット、及び/又は前記ペプチドの二次及び/又は三次構造内の線形又は空間的に隣接するアミノ酸のセットを指す。該モチーフは、タンパク質フォールディングの結果として、全て又は部分的に形成されることができるため、記載されているモチーフにおいて隣接するアミノ酸は、ペプチドの線形アミノ酸配列中で、0、1以上、5以上、10以上、15以上又は20以上のアミノ酸により分離されることができる。
(xxii)本明細書中で用いられる用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義的に及びこれらの最も広い意味において使用され、束縛されたアミノ酸配列(すなわち、例えばβターン又はβプリーツシートを起こす、又は例えばジスルフィド結合されたCys残基の存在によって環化される)、又は束縛されていないアミノ酸(例えば線形)を指す。ある実施態様において、本発明のペプチドは、30未満のアミノ酸から構成される。しかし、本開示の解釈において、当業者は、それが特定のペプチドの長さではなく、組織保護レセプター複合体を結合し、かつ/又は本発明の方法に有用なペプチドを区別する本明細書中に記載されているペプチドの結合と競合する能力であることを認識するであろう。また、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸等価物又は他の非アミノ酸基を含み、一方で、ペプチド又はタンパク質の所望の機能活性をさらに保持する化合物も意味する。ペプチド等価物は、1以上のアミノ酸を、関連した有機酸(PABAなど)若しくはアミノ酸等価物などと置換、又は側鎖若しくは官能基の置換若しくは修飾によって、従来のペプチドとは異なり得る。
(xxiii)用語「組織の損傷に関連した疾患又は障害のダメージ、影響又は症状の予防」は、そのようなダメージ、影響又は症状の発症を遅延し、進行を妨げ、出現を妨げ、発生に対する保護、抑制し、若しくは排除し、又は発生率を低減することを意味する。用語「予防」の使用は、予防的療法を投与された患者集団の全ての患者が、予防のために標的とされる組織の損傷に関連した疾患又は障害に応答して、症状の影響を受け又は症状を発症するというわけではないが、むしろ患者集団が、該疾患又は障害のダメージ、影響又は症状の低減を示すことをほのめかすように意味されない。例えば、多くのインフルエンザワクチンは、該ワクチンを投与されたヒトにおいて、インフルエンザを予防することに100%効果的でない。当業者は、制限されないが、様々な毒剤又は外傷に曝露され得る活動に係わろうとしている個人(例えば、軍事作戦に係わる兵士、化学若しくは食品加工労働者、救急隊員、又は初動対応者など)、又は毒剤への曝露を受け得る個人(例えば、化学、原子力若しくは製造施設の近くに住む個人又は軍事若しくはテロリスト攻撃の脅威下の個人)など、予防療法が有益である患者及び状況を容易に確認できる。
(xxiv)本明細書中で用いられる「予防的有効量」は、組織の損傷に関連した疾患又は障害から生じるダメージ、影響又は症状の予防となるのに十分なペプチドの量を指す。予防的有効量は、組織の損傷に関連した疾患又は障害から生じるダメージ、影響又は症状を予防するのに十分なペプチドの量を意味することができる。更に、別の予防剤に関して、予防的有効量は、組織の損傷に関連した疾患又は障害から生じるダメージ、影響又は症状の予防において予防的利益を提供する、ペプチドと組み合わせたその予防剤の量を意味する。ペプチドの量に関連して使用される用語「予防的有効量」は、全体の予防を改善する量、又は別の予防剤との相乗的影響の予防的有効性を向上する量若しくは別の予防剤との相乗的影響を提供する量を包含することができる。
(xxv)用語「新生物」は、癌腫瘍の悪性特性を欠き、一般に軽度かつ非進行性の腫瘍である異常成長を指す。新生物は、あざ、子宮筋腫、甲状腺アデノーマ、副腎皮質アデノーマ、下垂体アデノーマ及びテラトーマを含むが、これらに限定されない。
(xxvi)本明細書で用いられる用語「放射線剤」は、対象を死傷させることができ、都市又は国の破壊を起こすように使用することができる任意の放射性物質を意味する。放射線剤への曝露は、武器の配備(核爆弾(核分裂、核融合、中性子、ブースト型核分裂又は加塩された爆弾(salted bomb))、劣化ウランを含むシェル)、テロリストの装置(「汚い爆弾」)、又は核兵器の爆轟又は原子炉設備の故障から生じる放射性降下物によって発生する場合がある。放射性剤は、制限されないが、以下を含む：137Cs、60Co、241Am、252Cf、192Ir、238Pu、90Sr、226Ra、91Sr、92Sr、95Zr、99Mo、106Ru、131Sb、132Te、139Te、140Ba、141La、144Ce、233U、235U、238U、228P、229P、230P、231P、232P、233P、234P、235P、236P、237P、238P、239P、240P、241P、242P、243P、244P、245P、246P、247P、及び131Iである。放射性剤への曝露は、発癌、殺菌、白内障形成、放射線皮膚障害、ベータやけど、ガンマやけど、細胞(特に、骨髄、消化管細胞)の喪失、血液、胃腸、中枢神経、心血管、皮膚及び/又は生殖系へのダメージ、急性放射線症候群、慢性放射線症候群、及び皮膚放射線症候群を生じ得る。急性放射線症候群は、一般に、短い期間で起こる対象の身体への大量の放射から生じる。該症候群は、吐き気、嘔吐、一般の病気及び疲労、免疫系うつ病、毛髪の喪失、制御不能の出血(口、皮膚下、腎臓)、広範囲に及ぶ下痢、譫妄、昏睡及び死をはじめとする、予測可能な経過を有する。皮膚放射線症候群は、急性放射線症候群の一部であり、制限されないが、炎症、紅斑、乾燥若しくは湿性剥離、脱毛、水疱、発赤、潰瘍形成、皮脂様及び汗腺へのダメージ、萎縮症、線維症、皮膚色素沈着の減少又は増加、及び壊死を含む、皮膚に対する放射線影響を指す。
(xxvii) 本明細書中で用いられる用語「対象」、「患者」及び「犠牲者」は、互換的に使用される。本明細書中で用いられる用語「対象」及び「対象(複数)」は、動物、好ましくは非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット及びマウス)及び霊長類(例えば、サル、類人猿又はヒト)などの哺乳動物を意味し、好ましくは、ヒトを意味する。
(xxviii)本明細書中で用いられる用語「新生物又は癌に関連した症候群」は、「質量効果(mass effect)」(腫瘍による重要臓器の圧迫)、又は「機能性腫瘍」(腫瘍に悩む器官によるホルモンの過剰産生)を介して、腫瘍の直接作用から生じる症候群を指す。この種の症候群は、制限されないが、以下を含む：ベックウィズ-ヴィードマン症候群、SBLA症候群、リー-フラウメニ癌症候群、家族性大腸腺腫症(ガードナー症候群)、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、ターコット症候群、コーデン症候群、カーニートリアド症候群(Carney Triad syndrome)、多発性内分泌腫瘍症候群(ウェルマー(MEN-1)、シップル(MEN-2a、MEN-2b)、フォン・ヒッペル・リンドウ病、クッシング症候群、アディソン症候群、ヴェルナー・モリソン症候群、ゾリンジャー-エリソン症候群、WDHA症候群、膵性コレラ、アイザック症候群、波打つ筋肉症候群(Rippling muscle syndrome)、スティッフマン症候群、腫瘍随伴運動失調(Paraneoplastic Ataxia)、Yo症候群、Tr症候群、Hu症候群、CV-2症候群、CRMP-5症候群、眼球クローヌス/ミオクローヌス、Ma症候群、モルヴァン繊維舞踏病(Morvan's fibrillary chorea)、バナヤン-ライリー-ルナルカバ症候群(Bannayan-Riley-Runalcaba syndrome)、ポイツ-ジェガース症候群、ミュア-トール症候群、ヒルシュスプルング病、リンチ症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、重症筋無力症、神経筋緊張症、傍腫瘍性小脳変性症、傍腫瘍性辺縁系脳炎、スウィーツ症候群(Sweets syndrome)、バート-ホッジ-デューブ症候群、母斑様基底細胞癌症候群、全身類基底濾胞性症候群(Generalized Basaloid Follicular syndrome)、過誤腫症候群、バゼックス症候群、ブルックスピーグラー症候群(Brooke Spiegler syndrome)、家族性円柱腫症、多発性家族性毛包上皮腫(Multiple Familial Trichoepitheliomas)、アンドロゲン剥奪症候群療法に関連した骨髄異形成症候群、嗜眠症候群、湾岸戦争症候群、及びソマトスタチン産生腫瘍である。
(xxvix)本明細書中で用いられる用語「組織保護活性」又は「組織保護」は、細胞、組織又は器官のダメージ又は死を阻害するか又は遅延させる効果を指す。特に明記しない限り、細胞、組織又は器官のダメージ又は死の「遅延」は、本発明のペプチドの非存在下で、コントロール条件に対して評価される。組織保護活性は、制限されないが中枢神経系の組織などの、組織保護レセプター複合体(すなわち、それぞれ応答性組織細胞及び/又は器官)を発現している組織、細胞及び/又は器官に特有である。特定の実施態様において、応答性細胞は、赤血球原種細胞ではない。
(xxx)本明細書で用いられる用語「組織保護レセプター複合体」は、少なくとも1つのエリスロポエチンレセプターサブユニット及び少なくとも1つのβ共通レセプターサブユニットを含む複合体を意味する。組織保護レセプター複合体は、複数のエリスロポエチンレセプターサブユニット及び/又はβ共通レセプターサブユニット、並びに他の種類のレセプター又はタンパク質を含むことができる。本明細書中にその全体において引用により取り込まれているWO 2004/096148を参照されたい。
(xxxi)本明細書で用いられる用語「毒剤」は、生物剤、化学剤及び放射線剤を指す。
(xxxii)2つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適比較目的のために整列配置される。その後、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。第1の配列の位置が第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められる場合、該分子はその位置で同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である(すなわち、％同一性 = 同一の重なり合う位置の数 x 100 / 位置の総数)。一実施態様において、2つの配列は、同じ長さである。別の実施態様において、該配列は、異なる長さであり、従って、パーセント同一性は、より長い配列の部分に対してより短い配列の比較を指す。そこにおいて、前記部分は、前記より短い配列と同じ長さである。
(xxxiii)本明細書中で用いられる、用語「治療」は、組織の損傷又はそれらのダメージ、影響又は症状に関連した疾患又は障害から生じるダメージ、影響又は症状の排除、低減、管理又は制御を含む。
(5. 図面の簡単な説明)
図１は、EPO又はペプチドID(配列番号282)の存在下での、UT-7 EPO細胞の増殖に関する図である。グラフに示すように、EPOは、UT-7 EPO細胞の増殖を導いたが、ペプチドIDは全ての投与量で細胞の増殖を生じなかった。ペプチドIDが赤血球生成性でないことを示している。 図２は、28日間に渡って1日2回ペプチドIDを静脈内投与したスピローグドーリーラット(Sprague Dawley rats)のヘモグロビン濃度を示している図である。グラフに示すように、ペプチドを受けなかったラットのヘモグロビン濃度は、ペプチドIDを受けたものと同様であった。それによって、ペプチドIDが非赤血球生成性であることを証明した。 図３は、28日間1日2回ペプチドIDを様々な投与量で静脈内投与したニュージーランドホワイトラビットから採取した血液試料の(a)ヘモグロビン濃度、(b)ヘマトクリット値、及び(c)血小板数を示している一連の棒グラフである。グラフに示すように、ペプチドIDの投与は、全ての投与量で、動物のヘモグロビン濃度、ヘマトクリット値又は血小板数に対する影響を有しなかった。 図４は、カイニン酸による運動ニューロンの相対的生存を示している棒グラフである。グラフに示されているように、ペプチドB(配列番号3)又はEPOで前処理したそれらの細胞は、生存率の改善を示した。 図５は、中大脳動脈閉塞及び生理食塩水又はペプチドID若しくはペプチドIX(配列番号：301)での処置に続いて、フットフォールト試験を受けたラットのDe Ryckスコアを示しているチャートである。チャートに示すように、ペプチドIDは、生理食塩水処置ラット(20.2±0.8フットフォールト)及びペプチドIX処置ラット(20.1±2.1フットフォールト)と比較して、フットフォールトプロトコル(11.2±1.1フットフォールト)におけるラットパフォーマンスを有意に向上させた。 図６は、30分の両側腎虚血に続いて24時間の再灌流を受けさせ、かつコントロール(PBS)、再灌流の1分で1μg/kgのペプチドID、再灌流の30分で1μg/kgのペプチドID、再灌流の6時間で1μg/kgのペプチドID、又は再灌流の6時間で10μg/kgのペプチドIDを投与したマウスの血清中における、クレアチニン(グラフA)、尿素(グラフB)及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)(グラフC)の濃度に関する一連のグラフである。各グラフに示すように、再灌流の6時間で1μg/kgのペプチドID又は再灌流の6時間で10μg/kgのペプチドIDは、腎臓機能不全のこれらの生化学的マーカーの減少を生じた。 図７は、30分の両側腎虚血に続いて24時間の再灌流を受けさせ、かつ再灌流の1分、6時間、及び12時間でコントロール(PBS)、0.1μg/kgのペプチドID、1μg/kgのペプチドID、又は10μg/kgのペプチドIDを複数回投与で投与したマウスの血清中における、クレアチニン(グラフA)、尿素(グラフB)及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)(グラフC)の濃度に関する一連のグラフである。各グラフに示すように、1μg/kgのペプチドID又は10μg/kgのペプチドIDは、腎臓機能不全のこれらの生化学的マーカーの減少を生じた。 図８は、ペプチドID(24nmol/kg体重)を毎日皮下投与したラットの、全層パンチ生検創アッセイ(full thickness punch biopsy wound assay)における、処置期間中の創傷領域の減少を示しているチャートである。チャートに示すように、ペプチドIDを投与したラットの創傷は、より急速に治癒した。 図９は、様々な時点において、生理食塩水、ポジティブコントロールのガランタミン(3mg/kg体重)、又はペプチドID(24nmol/kg体重)を投与した成熟ウィスターラットに行った、新規物体認識試験からの結果を示している棒グラフである。グラフに示すように、ガランタミン及びペプチドIDは、新規物体のラット認識を増加させた。 図１０は、シスプラチン、シスプラチン及びペプチドIC(配列番号：281)又はコントロール(PBS)で処置したラットにより、製造された尿量を比較しているグラフである。グラフは、シスプラチン及びペプチドIC処置ラットの尿量が、実質的にコントロール(PBS)群のものと同様であったことを示している。従って、グラフは、ペプチドICを5週間に渡って0.4μg/kgの投与量で週3回投与したラットのシスプラチン誘発腎症のモデルにおいて、シスプラチンによる腎障害に対する処置ラットを保護したことを示している。 図１１は、シスプラチン、ペプチドICとシスプラチン、又はコントロール(PBS)で処置したラットのホットプレートから足を引っ込めるためにラットが要した時間を比較しているグラフである。グラフは、シスプラチン及びペプチドICで処置したラットが、ホットプレートからそれらの足を引っ込めるために要した時間は、コントロール群(PBS)と実質的に類似していたことを示している。従って、グラフは、ペプチドICを5週間に渡って0.4μg/kgの投与量で週3回投与したラットのシスプラチン誘発腎症のモデルにおいて、シスプラチンによる腎障害に対する処置ラットを保護したことを示している。 図１２は、Lampson L.A.らの文献, 193, Cancer Res. 53(1):176-82のプロトコルに従って、25日後にラットの脳に移植した皮質腫瘍の相対量を比較しているグラフである。グラフは、生理食塩水で処置したラットの腫瘍の相対量は、0.4 cm2よりも有意に大きい量まで増加したが、一方、移植後にペプチドIDで処置したラットは、腫瘍の相対量の増加を示さなかったことを示している。 図１３は、Lampson L.A.らの文献, 193, Cancer Res. 53(1):176-82のプロトコルに従って、25日後にラットの脳に移植した皮質腫瘍の相対量を比較しているグラフである。グラフは、移植後2週間で開始する生理食塩水で処置したラットの腫瘍の相対量は、約300 mm2であるが、一方、移植後2週間で開始するペプチドID及びペプチドIW(延長された半減期ペプチド、配列番号：298)で処置したラットは、両ケースにおいて、腫瘍のサイズを減少したことを示している。2週のペプチドIWの投与は、ペプチドIDを用いた即座の処置により達成されたものと等しい腫瘍のサイズの減少を生じた。 図１４は、毎日の生理食塩水、ペプチドID又は2週間遅延後のペプチドIWで処置したラットの皮質腫瘍サイズの比較である。写真上の暗い領域は、腫瘍の存在を示す。比較写真は、2週後のペプチドIWの投与が、腫瘍移植直後のペプチドIDの投与と類似する、腫瘍のサイズの減少をもたらしたことを明確に示している。 皮内にヒスタミン二リン酸を注射したスピローグドーリーラットの耳の耳厚の違い。ラットは、ペプチドIDで静脈注射、又は生理食塩水で処置した。ペプチドIDで処置したラットの耳は、ヒスタミン投与に応答して、生理食塩水で処置したラットの耳より少ない炎症を示した。 図１６は、生理食塩水で前処理したそれらのラット及びペプチドIDで前処理したそれらのラットの、皮内投与したヒスタミンに応答するラット腹部上の膨疹(発疹)サイズの違いを示しているチャートである。チャートは、ヒスタミン注射後24時間までに、ペプチドIDの抗炎症効果を示している。 図１７は、EPOで処置したそれらのラット及び生理食塩水で処置したそれらのラットの、ラットのヒスタミン投与に応答する膨疹(発疹)領域の違いを示しているチャートである。15分後の膨疹領域は、EPOで処理したラットにおいて、生理食塩水で処理したそれらのラットより少なかった。 図１８は、ヒスタミンで投与したラット、及び生理食塩水、ペプチドIY(配列番号：304)、ペプチドID、及びペプチドIWで処置したラットの膨疹(発疹)サイズ(病変領域)の違いを比較しているチャートである。ペプチドID又はペプチドIWで処置した動物は、生理食塩水及びペプチドIY処置動物の病変(約.6cm2)のほぼ半分の病変領域(それぞれ約.35cm2及び.3cm2)を示した。 図１９は、ヒスタミンで投与したラット、及び生理食塩水、ペプチドJA (配列番号：301)、ペプチドIW、ペプチドIZ(配列番号：300)、及びペプチドIDで処置したラットの膨疹(発疹)サイズ(病変領域)の違いを比較しているチャートである。ペプチドIW、IZ又はIDで処置した動物は、生理食塩水及びペプチドJA処置動物(両方とも約.6cm2)と比較して、より小さい病変領域(それぞれ.3cm2、.352及び.4cm2)を示した。 図２０は、褥瘡を受け、かつ生理食塩水、2回投与されたペプチドID、毎日投与されたペプチドID、又は毎日投与されたEPOを用いて処置されたラットの創傷(潰瘍)サイズ(領域)の違いを比較しているチャートである。チャートは、ペプチドID及びEPO処置ラットが、生理食塩水処置ラットより良好な創傷治癒を示したことを証明している。ペプチドIDで毎日処置された動物が、最も少ない創傷サイズを有した。 図２１は、796cGy(A)又は831cGy(B)で照射し、その後、皮下にペプチドIDで29日間毎日処置されたマウス、又は皮下にPBSで29日間処置したマウスについての、カプラン・マイヤー生存曲線を示す。両方の放射線量で、ペプチドIDは、マウスの30日目での全生存時間を有意に増加した(796cGyで30日の生存45%、831cGyで30日の生存20%)。 図２２は、15Gyの部分的身体照射を受け、その後、1日目及びその後に毎日ペプチドIDで処置、又は1日目及びその後に毎日PBSで処置したマウスの生存率を示しているチャートである。チャートが示すように、20日目まで生存しているマウスの数は、PBSを投与したマウスと比較して、ペプチドIDを投与したマウスの間で実質的により大きかった(6匹のペプチド処置マウス対1匹のPBS処置マウス)。
(6. 発明の詳細な説明)
(6.1 単離ポリペプチド)
本発明は、組織の損傷に関連した疾患又は障害に対する身体の応答の影響を調整する方法を提供する。更に、本発明は、エリスロポエチン又は別の1型サイトカインから誘導されるペプチドを投与することによって、組織の損傷に関連した疾患又は障害に悩む患者のダメージ、影響又は症状を予防、治療、改善又は管理する方法を提供する。好ましくは、本方法で使用されるペプチドは組織保護性、神経保護性、神経突起生成性、又は抗アポトーシス性である。
EPOなどの1型サイトカインから誘導される幾つかのペプチドは、以下などの従来技術において、開示されている：(a)及び(b) Brinesらの文献PCT/US2006/031061、WO 2007/019545として公開、及び米国特許出願：「組織の損傷に関連した疾患及び障害を予防及び治療するための組織保護ペプチド及びペプチド類似体(Tissue Protective Peptides and Peptide Analogs for Preventing and Treating Diseases and Disorders Associated with Tissue Damage)」、2008年1月22日に出願のシリアル番号第61/062,012号；「組織の損傷に関連した障害を予防及び治療するためのEPO誘導組織保護ペプチド及びペプチド類似体(EPO-derived Tissue Protective Peptides and Peptide Analogs for Preventing and Treating Disorders Associated with Tissue Damage)」、2008年1月22日に出願のシリアル番号第61/062,022号；及び「炎症又は炎症性状態及びその症状を治療するための、ペプチドを用いた方法(Method of Treating Inflammation or Inflammatory Conditions and Symptoms Thereof with Peptides)」、2008年7月3日に出願のシリアル番号第61/133,912号(「Brines」)；(c) Bockらの文献、PCT出願番号DK2006/000246、WO 2006/119767として公開及びWO 2007/071248(「Bock」)；(d) O'Brienらの文献、米国特許番号第5,571,787号、第5,700,909号、第5,696,080号、第5,714,459号、第6,590,074号、第6,559,124号、第6,271,196号、第6,268,347号及び第6,849,602号(「O'Brien」)；(e) Smith-Swintowskyらの文献、米国特許番号第7,259,146号及び米国公開番号第20030130197号(「Smith-Swintowsky」)、及び(f) Yuanらの文献、PCT/IB2006/003581、WO/2007/052154として公開(「Yuan」)、これらの発明の各々は、全体において本明細書中に引用により取り込まれている。
上記モチーフを議論するために、EPOの三次元構造は、本明細書中にその全体において引用により取り込まれているCheethamらの文献, 1998, Nat. Struct. Biol. 5; 861-866に記載され、配列番号：1に説明されているように認められる(エントリー「1BUY」として、国立バイオテクノロジー情報センター(the National Center for Biotechnology Information)のタンパク質データバンクに寄託されているデータとしても利用可能である。)。
上記のように、組織の損傷に関連した疾患又は障害に対する身体の応答の調整に有用なペプチド、及び/又は組織の損傷に関連した疾患又は障害に悩む対象のダメージ、影響又は症状の予防、治療、改善及び管理に有用なペプチドは、一実施態様において、EPOのアミノ酸配列の断片に基づくモチーフ、EPOタンパク質の三次元構造に由来するモチーフ、特に、リガンド結合部位及び/又はEPORホモダイマーの内部分から外方に向くEPOのそれらの領域に由来したモチーフを有する。これらの断片は、以下のEPO構造に由来する：(1) ループAB及びへリックスBのN末端部分(ペプチドA：
Figure 0005542064
 配列番号：1のアミノ酸38-57に相当する)；(2) へリックスBのC末端部分(ペプチドB：
Figure 0005542064
 配列番号：1のアミノ酸58-82に相当する)、及び(3) 小さいシステインループ及びβ-プリーツシートから構成されるA-Bループの部分(ペプチドC：
Figure 0005542064
 配列番号：1のアミノ酸28-47に相当する)。具体的には、これらのモチーフは以下であり得る：
(a) 構造モチーフA
この構造モチーフにおいて、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善若しくは管理に有用なペプチドは、2つの負荷電アミノ酸を有し、最高5アミノ酸によって離され、疎水性アミノ酸が側面に並ぶことができる。構造的に、これは、H1-N1-(X)n-N2-H1(式中、nは0-5である。配列番号：5)として、又は以下のように描写することができる：
Figure 0005542064
式中、Hは、疎水性アミノ酸(例えば、中程度疎水性のアミノ酸：Gly(G)、Pro(P)、Cys(C)、Tyr(Y)及びTrp(W)、及び好ましくは高疎水性のアミノ酸：Ala(A)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Leu(L)、Phe(F))を表し、Nは、Glu(E)又はAsp(D)などの負荷電アミノ酸を表し、Xは任意のアミノ酸を表すが、親水性のものであることが好ましい。
構造的にH1-N1-(X)n-N2-L1(nは0〜5である、配列番号：12)又はL1-N1-(X)n-N2-H1(nは0〜5である、配列番号：13)として表されるこの構造モチーフのバリエーションを開示する。隣接の疎水性アミノ酸のうちの1つは、極性アミノ酸(例えばSer(S)、Thr(T)、Asn(N)又はGln(Q))で置き換えられている。
このモチーフの例は、以下の通りである：
Figure 0005542064
構造モチーフAの特定の実施態様において、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、管理に有用な単離ペプチド及びペプチド類似体の種類は、構造式I(配列番号：15)を有することができる：
Figure 0005542064
式中:
X1は、Cys(C)又はPro(P)であり；
X2は、Asp(D)又はPro(P)であり；
X3は、Ser(S)又はArg(R)であり；
X4は、Arg(R)又はLeu(L)であり；
X5は、Val(V)又はIle(I)であり；
X6は、Leu(L)又はCys(C)であり；
X7は、Glu(E)又はAsp(D)であり；
X8は、Arg(R)又はSer(S)であり；
X9は、Tyr(Y)又はArg(R)であり；
X10は、Leu(L)又はVal(V)であり；
X11は、Leu(L)又はAla(A)であり；
X12は、負荷電アミノ酸であり；
(Z)nは、アミノ酸であり、nは1〜5である；
X13は、負荷電アミノ酸であり；
X14は、Ala(A)又はLeu(L)であり；
X15は、Glu(E)又はLys(K)であり；
X16は、Asn(N)、Glu(E)又はLys(K)であり；
X17は、Ile(I)又はAla(A)であり；
X18は、Thr(T)、Glu(E)又はGly(G)であり；
X19は、Thr(T)、Asn(N)又はAla(A)であり；
X20は、Gly(G)又はIle(I)であり；
X21は、Cys(C)又はThr(T)であり；
X22は、Ala(A)又はThr(T)であり；
X23は、Glu(E)又はGly(G)であり；
X24は、His(H)又はCys(C)である。
ある実施態様において、式Iの単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下を含まない：
Figure 0005542064
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、24未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10のアミノ酸残基を含む構造式Iの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、式Iの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
構造式Iの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X11、X12、X13及びX14は、欠失されない。
式Iの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上さえする、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、25、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式Iのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式Iのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式Iの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大8つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、保存的に置換される。
特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下のアミノ酸配列から構成される：
Figure 0005542064
(b) 構造モチーフＢ
この構造モチーフにおいて、ペプチドは負のアミノ酸の次に正のアミノ酸を有し、双方の荷電アミノ酸は、単一疎水性アミノ酸が側面に並んでいる。構造的に、これは、以下として描写されることができる:
Figure 0005542064
 式中、Pはアルギニン、リシン又はヒスチジンなどの正荷電アミノ酸を表し、Nはグルタミン酸塩又はアスパラギン酸塩の負荷電アミノ酸を表す。
この特定のモチーフのバリエーションにおいて、負及び正のアミノ酸は、極性アミノ酸により分離されることができる。例えば、
Figure 0005542064
 式中、Lはセリン、トレオニン、アスパラギン又はグルタミンなどの極性アミノ酸を表す。あるいは、上記の構造モチーフは、H1-N1-(L)n-P1-H2（式中、nは0〜1である）、配列番号：23として表され、又は同様にH1-P1-(L)n-N1-H2（式中、nは0〜1である）、配列番号：23として表され得る。このモチーフの例は、ペプチドC
Figure 0005542064
 である。
ある実施態様において、式II-IVにおいて以下に開示されている構造モチーフBの特定実施態様の単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下を含み得ない。
Figure 0005542064
構造モチーフBの特定実施態様において、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、管理に有用な単離ペプチド及びペプチド類似体の種類は、構造式II(配列番号：25)を有する10〜28の連続的なアミノ酸残基を含むことができる。
Figure 0005542064
 式中：
X1は、Ser(S)であり；
X2は、Arg(R)であり；
X3は、Val(V)であり；
X4は、Leu(L)であり；
X5は、Glu(E)であり；
X6は、Arg(R)であり；
X7は、Tyr(Y)であり；
X8は、Leu(L)であり；
X9は、Leu(L)であり；
X10は、Glu(E)であり；
X11は、Ala(A)であり；
X12は、正荷電アミノ酸であり；
X13は、負荷電アミノ酸であり；
X14は、Ala(A)であり；
X15は、Glu(E)であり；
X16は、Asn(N)であり；
X17は、IIe(I)であり；
X18は、Thr(T)であり；
X19は、Thr(T)であり；
X20は、Gly(G)であり；
X21は、Cys(C)であり；
X22は、Ala(A)であり；
X23は、Glu(E)であり；
X24は、His(H)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、24未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10のアミノ酸残基を含む構造式IIの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、式IIの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
構造式IIの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X11、X12、X13及びX14は欠失されない。
また、式IIの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上さえする、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、25、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式IIのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式IIのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式IIの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大8つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、保存的に置換される。
特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下のアミノ酸配列から構成される：
Figure 0005542064
構造モチーフBの更なる実施態様において、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、管理に有用な単離ペプチド及びペプチド類似体の種類は、構造式III(配列番号：27)を有する。
Figure 0005542064
 式中:
X1は、Pro(P)、Lys(K)又はSer(S)であり；
X2は、Pro(P)、Glu(E)又はGln(Q)であり；
X3は、Arg(R)、Ala(A)又はPro(P)であり；
X4は、Leu(L)、Glu(E)又はTrp(W)であり；
X5は、Ile(I)、Asn(N)又はGlu(E)であり；
X6は、Cys(C)、Ile(I)又はPro(P)であり；
X7は、Asp(D)、Thr(T)、Leu(L)又はAla(A)であり；
X8は、Ser(S)、Thr(T)、Gln(Q)又はAsp(D)であり；
X9は、Arg(R)、Gly(G)又はLeu(L)であり；
X10は、Val(V)、Cys(C)、His(H)又はGlu(E)であり；
X11は、Leu(L)、Ala(A)、Val(V)であり；
X12は、負荷電アミノ酸であり；
X13は、正荷電アミノ酸であり；
X14は、Tyr(Y)、Cys(C)、Ala(A)又はIle(I)であり；
X15は、Leu(L)、Ser(S)、Val(V)又はGly(G)であり；
X16は、Leu(L)、Ser(S)又はAla(A)であり；
X17は、Glu(E)、Asn(N)又はGly(G)であり；
X18は、Ala(A)、Glu(E)又はLeu(L)であり；
X19は、Lys(K)、Asn(N)又はArg(R)であり；
X20は、Glu(E)、Ile(I)又はSer(S)であり；
X21は、Ala(A)、Thr(T)又はLeu(L)であり；
X22は、Glu(E)、Val(V)又はThr(T)であり；
X23は、Asn(N)、Pro(P)又はThr(T)であり；
X24は、Ile(I)、Asp(D)又はLeu(L)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、24未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10のアミノ酸残基を含む構造式IIIの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、式IIIの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
構造式IIIの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X11、X12、X13及びX14は欠失されない。また、式IIIの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上する、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、25、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式IIIのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式IIIのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式IIIの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大8つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、保存的に置換される。
特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下に述べるペプチドの群から選択される。
Figure 0005542064
構造モチーフBの更なる実施態様において、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、管理に有用な単離ペプチド及びペプチド類似体の種類は、構造式III(配列番号：31)を有する。
Figure 0005542064
 式中、
X1は、His(H)であり；
X2は、Cys(C)であり；
X3は、Ser(S)であり；
X4は、Leu(L)であり；
X5は、Ala(A)又はAsn(N)であり；
X6は、Pro(P)又はGlu(E)であり；
X7は、Pro(P)又はAsn(N)であり；
X8は、Arg(R)又はIle(I)であり；
X9は、Leu(L)又はThr(T)であり；
X10は、Ile(I)又はVal(V)であり；
X11は、Cys(C)又はPro(P)であり；
X12は、負荷電アミノ酸であり；
X13は、極性アミノ酸であり；
X14は、正荷電アミノ酸であり；
X15は、Val(V)であり；
X16は、Leu(L)又はAsn(N)であり；
X17は、Glu(E)又はPhe(F)であり；
X18は、Arg(R)又はTyr(Y)であり；
X19は、Tyr(Y)又はAla(A)であり；
X20は、Leu(L)又はTrp(W)であり；
X21は、Leu(L)又はLys(K)であり；
X22は、Glu(E)又はArg(R)であり；
X23は、Ala(A)又はMet(M)であり；
X24は、Lys(K)又はGlu(E)であり；
X25は、Glu(E)又はVal(V)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、25未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10のアミノ酸残基を含む構造式IVの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、式IVの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
構造式IVの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X11、X12、X13、X14及びX15は、欠失されない。
また、式IVの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上さえする、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式IVのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式IVのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式IVの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大8つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、保存的に置換される。
特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下に述べるペプチドの群から選択される。
Figure 0005542064
当業者は、本発明にとって重要であるのは上記の構造モチーフA及びBであると認識するであろう。従って、当業者は、該単離ペプチドが、配列番号：１において示される成熟ヒトEPOのアミノ酸配列の任意の一部と90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、又は20％未満の配列同一性を有することができることを認識するであろう。EPOの前記一部は、前記ペプチドと同数のアミノ酸残基を含む。
出願人は、更に、構造モチーフA及びBの組織保護活性が、該モチーフによって生じる適切な空間的に粗密な電荷配置に起因することを提案する。これらの電荷の近接性は、ペプチド結合により与えられる線形構造を介して生じ得る。すなわち、該構造は、ポリペプチド鎖の連続的アミノ酸により形成され得る。あるいは、近接性は、また、タンパク質の二次及び/又は三次構造により与えられるEPO分子(又は他の関連した1型サイトカイン分子)の異なる部分間の空間的関係、すなわち三次元構造を介して生じ得る。任意の特定の理論に縛られていることを望まないが、出願人は、この要求は、一般に、組織保護ペプチドが荷電アミノ酸対(すなわち、2つの負荷電アミノ酸及び/又は正及び負荷電アミノ酸)の必須の空間位置を提供する別の三次構造(例えば、へリックス又はプリーツシート)を有するであろうことに影響すると考える。単純な例外は、アミノ酸対が互いに直接隣接し、ペプチド骨格によって与えられる必須の剛性を有する、線形ペプチドである。したがって、構造モチーフAは、アミノ酸残基の線形配列、例えば
Figure 0005542064
 によって、又はN1及びN2が1、2、3、4、5、又は6以上の介在残基、例えば
Figure 0005542064
 により分離されるアミノ酸残基の線形配列によって包含される。
任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、出願人は、組織保護のため、カルバミル炭素が約3オングストローム(Å)〜約5Å離れ、好ましくは約4Å〜約5Å離れ、より好ましくは約4.4Å〜約4.8Å離れるように、ペプチド内の荷電アミノ酸対が空間的に配列されなければならないと考える。これは、多くの方法、例えば、単純な線形ペプチドの隣接する荷電アミノ酸によって、又は介在アミノ酸残基によって分離されたアルファヘリックス荷電アミノ酸を形成できるペプチドについて、達成されることができる。ペプチドが特定の微小環境内、例えば、細胞外細胞膜界面(その全体において引用により本明細書中に取り込まれているSegrest, 1990, Proteins 8:103-117を参照されたい。)に存在する場合、三次構造(例えば、両親媒性ペプチドのアルファヘリックス)が与えられることもできる点に留意する必要がある。
更に、組織保護活性は、荷電側鎖(正若しくは負又は2つの負)が互いに約6.5Å〜約9Åの範囲内で空間的に拘束されるように、荷電アミノ酸の対を含むペプチドについて予測される。これは、１又は２つのアミノ酸によって分離されている荷電対によるアルファヘリックスにより提供されることができ、それは、要求される約6.5Å〜約9Åの分離を有するへリックスの大体同じ側にある電荷を提供するであろう。当業者は、荷電アミノ酸の適当な三次元位置を得るように一般に要求されるペプチドの三次構造、並びにペプチド内で電荷分離を模倣する小分子の設計を考え出すことができる。
任意の２つのアミノ酸のカルバミル炭素間の空間距離、又は任意の２つのアミノ酸の側鎖間の空間距離は、任意の公知技術又は本明細書中に記載の方法により推定することができる。例えば、タンパク質の三次元構造が公知である場合、2つの側鎖の電荷分離又は前記タンパク質の対象部分範囲内の2つのカルバミル炭素間の空間距離は、その発表により、又は前記対象部分のアミノ酸残基の、技術的に認められる3次元座標に基づいて算出され得る。タンパク質の三次元構造、及び従って、対象部分が公知でない場合、又は完全合成ペプチドが本明細書中の教示に基づいて構築され、その三次元構造が公知でない場合、2つの側鎖の電荷分離又は前記ペプチド内の2つのカルバミル炭素間の空間距離は、公知技術のタンパク質モデリングソフトウェアにより予測される三次元構造を用いて推定され得る。このようなソフトウェアの非限定的な例は、Chemical Computing Group(ケベック、カナダ)及びModeler by Accelrys(サンディエゴ、カリフォルニア)によるMOE(商標)がある。同様に、このような上記の会社からも入手可能な予測フトウェアは、小分子の設計のための技術においても公知であり、したがって、当業者は、本明細書中に教示に基づいて、開示された構造モチーフを模倣する小分子を製造することが可能である。
(c. 構造モチーフC)
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、及び管理に有用なペプチドにより示される別の構造モチーフは、以下の通りである：
Figure 0005542064
 式中、X1は荷電アミノ酸残基であり、X6は疎水性アミノ酸残基又はAであり、X2、X3、X4及びX5は任意のアミノ酸残基である。
該モチーフのX1位置の荷電残基、好ましくは負荷電残基の存在、及びX6位置の疎水アミノ酸残基、好ましくはLeu(L)、Val(V)又はTyr(Y)の存在の他に、該配列は、該モチーフのi) X2位置にSer(S)及び/又はii) X2位置に疎水性残基及び/又はX3位置に疎水性残基を含むことができる。この種の好ましいモチーフの例は、配列
Figure 0005542064
 であってもよい。また、幾つかの場合において、Ser(S)又はThr(T)は、X2及び/又はX3位置の疎水性残基の存在とは独立して、X4位置に存在することが好ましい。
構造モチーフCを示す、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、又は管理に有用なペプチドの群は、以下である。
Figure 0005542064
(d. 構造モチーフD)
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、又は管理に有用なペプチドの更なるモチーフは、両方の神経突起伸長を刺激し、かつプロサポシンの活性を模倣する多くの神経栄養性及び造血性サイトカインに見い出される神経栄養性ペプチドコンセンサス配列に基づく。このコンセンサス配列は、
Figure 0005542064
 に示されるアミノ酸配列を有するサポシンCから誘導される活性22-merペプチド及び
Figure 0005542064
 に示されるアミノ酸配列を有する20-mer CNTF ペプチドと、EPOに類似する配列を示す様々なサイトカイン及び成長因子との比較から誘導される。
コンセンサス配列は、以下の通りである：
Figure 0005542064
 式中、NはAsn(N)であり、AはLeu(L)又はIle(I)であり、Xは独立に任意のアミノ酸であり、nは2-3であり、oは0-1であり、pは1-7であり、Bは一つ以上の荷電アミノ酸(Asp(D)、Lys(K)、Glu(E)又はArg(R))であり、qは4-7であり、Cは一つ以上の疎水性アミノ酸(Ala(A)、Leu(L)、Ile(I)又はVal(V))である。そこにおいて、Cは第2のアスパラギン残基からの6-10のアミノ酸である。構造モチーフDを示すペプチドの例は、EPO AB-ループから誘導される、ペプチドU：
Figure 0005542064
 である。構造モチーフDに従う更なる配列は、
Figure 0005542064
 である。式中、X1は任意のアミノ酸であり、X2はLeu(L)又はArg(R)以外の任意のアミノ酸であり、X3は荷電アミノ酸であり、X4は存在する場合、荷電アミノ酸である。
(e. 構造モチーフE)
更に、ペプチドは、
Figure 0005542064
 のコアアミノ酸配列を含む。式中、X3はCys(C)、Glu(E)、Ala(A)、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸又はHocであり得る（ここで、Hocはホモシステインである）；X4はArg(R)、His(H)、Tyr(Y)、Leu(L)又はTrp(W)であり得るか、又はX4は結合であり；X5は、Met(M)、Phe(F)又はIle(I)であり得る；X6は独立に、20の遺伝的にコードされたL-アミノ酸の任意の１つ又は立体異性D-アミノ酸あり；X7は、Asp(D)、Glu(E)、Ile(I)、Leu(L)又はVal(V)であり得る；X8は、Cys(C)、Lys(K)、Ala(A)、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸又はHocであり得る（ここでHocはホモシステインである；但し、X3又はX8のいずれかはCys(C)であるか、又はHocは本発明に従って、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、又は管理に有用である。二量体又は多量体の単量体ペプチド単位が以下のコア配列を含む、モチーフの変異体を開示する：
Figure 0005542064
 式中、各X 2 及びX 6 は、20の遺伝的にコードされたL-アミノ酸から、独立に選択されX3は、Cys(C)、Glu(E)、Ala(A)、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸又はHoc(ここで、Hocはホモシステインである)であり得る；X4はArg(R)、His(H)、Tyr(Y)、Leu(L)又はTrp(W)であり得るか、又はX4は結合である；X5は、Met(M)、Phe(F)又はIle(I)であり得る；X7は、Asp(D)、Glu(E)、Ile(I)、Leu(L)又はVal(V)であり得る；X8は、Cys(C)、Lys(K)、Ala(A)、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸又はHoc(ここで、Hocがホモシステインである)であり得る。より好ましくは、X3又はX8は、Cys(C)又はHocである。二量体又は多量体の単量体ペプチド単位が以下のアミノ酸のコア配列を含む、さらなるモチーフの変異体を開示する：
Figure 0005542064
 式中、X2及びX6の各々は独立に、20の遺伝的にコードされたL-アミノ酸の任意の1つであり；X3は、Cys(C)であり；X 8 は、Cys(C)である。二量体の単量体ペプチド単位が以下のアミノ酸のコア配列を含む、モチーフの別の変異体を開示する：
Figure 0005542064
 式中、X1、X2、X6、X9、X10及びX11の各々は、独立に20の遺伝的にコードされたL-アミノ酸から選択される。特に、X3は、Cys(C)、Glu(E)、Ala(A)であり得る；X4はArg(R)、His(H)又はTyr(Y)であり得るか、又はX4は結合である；X5は、Met(M)、Phe(F)又はIle(I)であり得る；X7は、Asp(D)又はVal(V)であり得る；X8は、Cys(C)、Lys(K)又はAla(A)であり得る。モチーフの別の変異体において、X3及びX8はCys(C)であり、従って、二量体の単量体ペプチド単位は、以下のアミノ酸のコア配列を含む。
Figure 0005542064
 また、モチーフは以下のアミノ酸のコア配列であってもよい。
Figure 0005542064
 式中、X4はArg(R)又はHis(H)であり得る；X5は、Phe(F)又はMet(M)であり得る；X6は、Ile(I)、Leu(L)、Thr(T)、Met(M)又はVal(V)であり得る；X7は、Asp(D)又はVal(V)であり；X9は、Gly(G)、Lys(K)、Leu(L)、Gln(Q)、Arg(R)、Ser(S)又はThr(T)であり得る；X10は、Ala(A)、Gly(G),Pro(P)、Arg(R)又はTyr(Y)であり得る。あるいは、モチーフは、以下のアミノ酸のコア配列を含むことができる。
Figure 0005542064
 式中、X1はAsp(D)、Glu(E)、Leu(L)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)又はVal(V)であり得る；X2は、Ala(A)、His(H)、Lys(K)、Leu(L)、Met(M)、Ser(S)又はThr(T)であり得る；X4は、Arg(R)又はHis(H)であり；X9は、Lys(K)、Arg(R)、Ser(S)又はThr(T)であり得る；X10は、Pro(P)である。あるいは、モチーフは、以下のアミノ酸のコア配列を含むであろう。
Figure 0005542064
 式中、X1はAsp(D)、Glu(E)、Leu(L)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)又はVal(V)であり得る；X2は、Ala(A)、His(H)、Lys(K)、Leu(L)、Met(M)、Ser(S)又はThr(T)であり得る；X4は、Arg(R)又はHis(H)であり；X9は、Lys(K)、Arg(R)、Ser(S)又はThr(T)であり得る；X10は、Pro(P)である。
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、及び管理に有用な構造モチーフEに従う特定のペプチドは、以下である：
Figure 0005542064
Figure 0005542064
(f. 構造モチーフF)
EPOのABループから誘導される更なるペプチドが、同様に意図される。このABループペプチドは、小さい二環式分子を、ペプチドのアミノ酸配列のN端又はC端の少なくとも1つに化学的に加えることによって安定化され得る。
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、及び管理に有用な構造モチーフFに従う特定のペプチドは、以下である：
Figure 0005542064
さらに、該ペプチドは、第1アミノ酸残基のスルフヒドラル基とペプチド配列に沿った第2アミノ酸残基のスルフヒドラル基との間に形成されるジスルフィド結合によって安定化され得る。該ペプチドの具体例は、以下のペプチド配列を有する少なくとも6つのアミノ酸を有する：
Figure 0005542064
 式中、Xはスルフヒドラル基を含む第1アミノ酸残基であり、Yはスルフヒドラル基を含む第2アミノ酸残基であり、第1アミノ酸残基のスルフヒドラル基は、第2アミノ酸残基のスルフヒドラル基から適当な距離にあり、該ペプチド配列中の第2アミノ酸残基のスルフヒドラル基とジスルフィド結合を形成し、該ペプチド(式I)を安定化させる。
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、及び管理に有用な構造モチーフF(式I)に従う特定のペプチドは、以下である：
Figure 0005542064
別の実施態様において、ジスルフィド結合で安定化された単離EPO誘導ペプチドは、小さい二環式分子を、該ペプチドのアミノ酸配列のN端又はC端の少なくとも1つに化学的に加えることによってさらに安定化される。
また、該ペプチドは、下記のペプチド配列を有する、少なくとも7つのアミノ酸の下記モチーフを示すことができる。
Figure 0005542064
 式中、Xはスルフヒドラル基を含む第1アミノ酸残基であり、Yはスルフヒドラル基を含む第2アミノ酸残基であり、第1アミノ酸残基のスルフヒドラル基は、第2アミノ酸残基のスルフヒドラル基から適当な距離にあり、ペプチド配列中の第2アミノ酸残基のスルフヒドラル基によりジスルフィド結合を形成し、従って、ペプチド(式II)を安定させる。
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、及び管理に有用な構造モチーフF(式II)に従う特定のペプチドは、以下である：
Figure 0005542064
(G. 他のEPO誘導化EPOペプチド）
上記のEPOペプチド及びEPO誘導モチーフに加えて、以下の文献に開示されているEPOペプチド、断片又は模倣体も、本発明の疾患又は障害に対する身体の応答の影響を調節する方法に有用であり得る：米国特許番号第5,106,954号、第5,952,293号、第6,004,758号、第6,346,390号、第6,932,968号、第5,835,382号、第7,037,902号、第7,084,245号及び第7,272,508号；米国特許出願番号第20050191301号；WO2005/021579；Skeltonらの文献「ファージディスプレイライブラリーからのエリスロポエチン受容体アゴニストにおけるベータヘアピン構造のアミノ酸決定基(Amino Acid Determinants of Beta-hairpin Confirmation in Erythropoietin Receptor Agonist Peptides Derived From A Phage Display Library)」、Molecular Biology Vol. 316, Issue 8, 2002, pages 1111-1125；Livnahらの文献、「ペプチドアゴニストによるタンパク質ホルモンの機能的模倣：2ÅでのEPOレセプター複合体(Functional Mimcry of a Protein Hormone by a Peptide Agonist: the EPO Receptor Complex at 2k)」Science 26, July 1996 vol. 273, no. 5274, pp. 464-471： Johnson及びJoliffeの文献、「エリスロポエチン模倣ペプチド及びその特徴(Erythropoietin Mimetic Peptides and the Future)」、Nephrol. Dial. Transplant (2000) 15:1274-1277, Wrightonらの文献. (1996) Science 273: 458-463；Johnsonらの文献(1998) Biochemistry, 37:3699-3710。
(6.2 1型サイトカイン断片)
上記のモチーフは、EPO誘導ペプチド又はEPOアゴニスト断片の同定に有用であるばかりでなく、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の抑制又は遅延の能力も示す1型サイトカインの同定にも有用であり、したがって、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、又は維持の点で治療的に有効である。1型サイトカインファミリーは、制限されないが、インターロイキン(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10又はIL-11、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、レプチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、白血病阻害因子(LIF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、トロンボポエチン(TPO)、成長ホルモン、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、エリスロポエチン(EPO)、及びプロラクチンを含む。
EPOの二次構造の考慮は、他の1型サイトカイン受容体リガンド中の相同的二次構造内に位置する相同的アミノ酸から誘導されるアミノ酸の空間的配置を介して、候補ペプチドの調製のための指針を提供する：例えば、GM-CSF及びIL-3(Kannan、2000、Neuroimmunomod 8:132-141(その全体において、本明細書中に引用により取り込まれている)は、とりわけ、強い神経栄養性及び神経保護活性を有することが示されている。これは、主に組織保護レセプターを刺激することに起因すると出願人は考えている。例えば、これらのI型サイトカインのへリックスBを考慮して：トロンボポエチンの相同的アミノ酸(TPO；タンパク質データバンク(PDB)アクセッション1V7M)は、D62、G65、T68、L69、E72、A76及びQ80を含み、これらのアミノ酸は、線形配置で互いに空間的に隣接している；白血病阻害因子の相同的アミノ酸(LIF；PDBアクセッション1EMR)は、E61、R64、Y68、S72、N75及びD79を含む；毛様体神経栄養因子の相同的アミノ酸(CNTF；PDBアクセッション1CNT)は、E71、E75を含む。これらの全ては、下線を引いたアミノ酸が負に荷電する、上記構造モチーフAの例である。
式V〜VIとして下記に開示される構造モチーフAの特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、次のものを含み得ない。
Figure 0005542064
構造モチーフAの実施態様において、1型サイトカイン誘導ペプチド及びペプチド類似体は、構造式(V)(配列番号：119)を有する：
Figure 0005542064
 式中：
X1は、Trp(W)、Val(V)、Ala(A)、Ile(I)、Pro(P)、Leu(L)、Ser(S)、Asp(D)又はThr(T)であり；
X2は、任意のアミノ酸であり；
X3は、任意のアミノ酸であり；
X4は、任意のアミノ酸であり；
X5は、任意のアミノ酸であり；
X6は、任意のアミノ酸であり；
X7は、任意のアミノ酸であり；
X8は、Ile(I)、Phe(F)、Leu(L)、Val(V)、Pro(P)、Tyr(Y)又はGly(G)であり；
X9は、負荷電アミノ酸であり；
X10は、負荷電アミノ酸であり；
X11は、Ile(I)、Leu(L)、Ala(A)、Gly(G)、Phe(F)、Val(V)又はPro(P)であり；
X12は、Ile(I)、Met(M)、Tyr(Y)、Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Lys(K)、Leu(L)、Glu(E)又はAsp(D)であり；
X13は、任意のアミノ酸であり；
X14は、His(H)、Leu(L)、Pro(P)、Thr(T)、Arg(R)、Cys(C)、Ile(I)、Tyr(Y)、Gln(Q)又はAla(A)であり；
X15は、Leu(L)、Lys(K)、Thr(T)、Val(V)、Phe(F)、Ala(A)又はGln(Q)であり；
X16は、Lys(K)、Glu(E)、Met(M)、Gly(G)、Asn(N)、Gln(Q)、Thr(T)又はVal(V)であり；
X17は、任意のアミノ酸であり；
X18は、Pro(P)、Lys(K)、Arg(R)、Ile(I)、Asn(N)、Ser(S)、Gln(Q)又はPhe(F)であり；
X19は、Pro(P)、Ile(I)、Tyr(Y)、Leu(L)、Phe(F)、Ser(S)、Ala(A)、Asp(D)、Asn(N)又はLys(K)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、19未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか18、17、16、15、14、13、12、11又は10のアミノ酸残基を含む構造式Vの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、式Vの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
組織保護活性において式(V)の単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X8、X9、X10、及びX11は、欠失されない。
また、式Vの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上さえする、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、20、21、22、23、24、25、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式Vのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式Vのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式Vの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大8つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、保存的に置換される。
特定の実施態様において、式Vの単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下に述べるペプチド群から選択される：
Figure 0005542064
構造モチーフAの別の実施態様において、1型サイトカインをベースとし、かつ本発明の方法に有用な単離ペプチド及びペプチド類似体は、構造式VI(配列番号：137)を有する：
Figure 0005542064
 式中：
X1は、Phe(F)、Val(V)、Ala(A)、Gly(G)、Pro(P)、Leu(L)、Tyr(Y)、Ile(I)、Cys(C)又はMet(M)であり；
X2は、負荷電アミノ酸であり；
(Z)nは、アミノ酸であり、nは、1-5であり；
X3は、負荷電アミノ酸であり；
X4は、Pro(P)、Met(M)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)、Gly(G)、Leu(L)、Ala(A)、Tyr(Y)及びTrp(W)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、9未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか8、7、6、又は5のアミノ酸残基を含む構造式VIの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、式VIの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
式VIの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X1、X2、X3及びX4は、欠失されない。
また、式VIの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上さえする、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式VIのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式VIのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式VIの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大5つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、4、3、2又は1つのアミノ酸は、保存的に置換される。
特定の実施態様において、式VIの単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下に述べるペプチド群から選択される：
Figure 0005542064
Figure 0005542064
本明細書中の上記に記載され、PCT/US2006/031061に開示されている構造モチーフBを例示する、1型サイトカインから誘導される本発明の治療方法に有用な組織保護ペプチドの更なる例を挙げると、GM-CSFへリックスA断片、ペプチドBV：
Figure 0005542064
 ；TPOへリックスA断片、ペプチドBW：
Figure 0005542064
 ；TPOへリックスB断片：E56、K59；CNTFへリックスA断片、ペプチドBX：
Figure 0005542064
 ；CNTFへリックスB断片：R89、E92；LIFへリックスB断片、ペプチドBY：
Figure 0005542064
 ；及びインターロイキン3(IL-3)へリックスA断片、ペプチドBZ：
Figure 0005542064
 を含むが、これらに限定されない。
式VII-Xとして下記に開示される構造モチーフBの特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下を含み得ない。
Figure 0005542064
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、及び管理の本方法に有用な構造モチーフBを示す、さらなる1型サイトカイン誘導ペプチドは、構造式VII：(配列番号：184)を示すものである：
Figure 0005542064
 式中：
X1は、Leu(L)、Ile(I)、Gly(G)、Val(V)、Phe(F)、Pro(P)又はAla(A)であり；
X2は、正荷電アミノ酸であり；
X3は、負荷電アミノ酸であり；
X4は、Phe(F)、Gly(G)、Val(V)、Leu(L)、Ala(A)又はTyr(Y)である。
本発明の一実施態様において、I型サイトカイン誘導ペプチドは、構造式VII(a)を有する：
(配列番号：302)：
Figure 0005542064
 式中：
X1は、Leu(L)、Ile(I)、Gly(G)、Val(V)、Phe(F)、Pro(P)又はAla(A)であり；
X2は、正荷電アミノ酸であり；
X3は、負荷電アミノ酸であり；
X4は、Phe(F)、Gly(G)、Val(V)、Leu(L)、Ala(A)又はTyr(Y)であり；
X5は、Arg(R)、Asp(D)、Glu(E)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)、Phe(F)、Val(V)又はTyr(Y)であり；
X6は、His(H)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、Ser(S)、Leu(L)、Trp(W)又はPhe(F)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、5又は4未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか6又は5のアミノ酸残基を含む構造式VII又はVIIaの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
構造式VII又はVIIaの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X1、X2、X3及びX4は、欠失されない。
また、式VII又は式VIIaの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上する、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式VII又は式VIIaのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式VII又は式VIIaのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式VIIの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大2つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。
特定の実施態様において、式VII又は式VIIaの単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下に述べるペプチドの群から選択される：
Figure 0005542064
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、又は管理に有用なペプチドのさらに別の実施態様において、1型サイトカインから誘導され、構造モチーフBを示す、単離ペプチド又はペプチド類似体は、構造式(VII)(配列番号：209)を有する：
Figure 0005542064
 式中：
X1は、Ala(A)、Thr(T)、Ser(S)、Tyr(Y)、Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)又はGlu(E)であり；
X2は、任意のアミノ酸であり；
X3は、Ser(S)、Gln(Q)、Asp(D)、Leu(L)、Glu(E)、Cys(C)、Asn(N)、Arg(R)又はAla(A)であり；
X4は、Pro(P)、Gly(G)、Gln(Q)、Leu(L)、Thr(T)、Asn(N)、Ser(S)、Phe(F)又はIle(I)であり；
X5は、任意のアミノ酸であり；
X6は、Pro(P)、Ser(S)、Cys(C)、Val(V)、Lys(K)、Thr(T)、Leu(L)、Ile(I)又はGln(Q)であり；
X7は、任意のアミノ酸であり；
X8は、Thr(T)、Pro(P)、Leu(L)、Arg(R)、Gly(G)、Tyr(Y)、Gln(Q)、Glu(E)、Ile(I)又はAla(A)であり；
X9は、任意のアミノ酸であり；
X10は、Pro(P)、Asn(N)、Glu(E)、Asp(D)、Thr(T)、Leu(L)、Ile(I)、Gln(Q)、Phe(F)又はTrp(W)であり；
X11は、Trp(W)、Leu(L)、Ala(A)、Met(M)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)又はTyr(Y)であり；
X12は、負荷電アミノ酸であり；
X13は、正荷電アミノ酸であり；
X14は、Val(V)、Leu(L)又はAla(A)であり；
X15は、任意のアミノ酸であり；
X16は、任意のアミノ酸であり；
X17は、任意のアミノ酸であり；
X18は、任意のアミノ酸であり；
X19は、任意のアミノ酸であり；
X20は、任意のアミノ酸であり；
X21は、Arg(R)、Asp(D)、Tyr(Y)、Val(V)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Ser(S)又はThr(T) であり；
X22は、任意のアミノ酸であり；
X23は、任意のアミノ酸であり；
X24は、Leu(L)、Pro(P)、Phe(F)、Arg(R)、Tyr(Y)、Cys(C)、Gly(G)、Val(V)又はLys(K)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、24未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10のアミノ酸残基を含む構造式VIIIの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、構造式VIIIの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
組織保護活性において式VIIIの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X11、X12、X13、及びX14は、欠失されない。
また、式VIIIの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上さえする、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、25、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式VIIIのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式VIIIのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式VIIの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大8つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、保存的に置換される。
特定の実施態様において、式VIIIの単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下に述べるペプチドの群から選択される：
Figure 0005542064
本発明の他の実施態様において、構造モチーフBを示す1型サイトカインに基づく単離ペプチド及びペプチド類似体は、構造式IX(配列番号：228)を有する：
Figure 0005542064
 式中:
X1は、Cys(C)、Tyr(Y)又はAla(A)であり；
X2は、Ser(S)、Leu(L)又はGlu(E)であり；
X3は、Arg(R)、Gln(Q)又はAsn(N)であり；
X4は、Ser(S)又はLeu(L)であり；
X5は、Ile(I)、Leu(L)又はLys(K)であり；
X6は、Trp(W)、Leu(L)又はLys(K)であり；
X7は、Leu(L)、Phe(F)又はTyr(Y)であり；
X8は、Ala(A)、Asn(N)又はPhe(F)であり；
X9は、Arg(R)、Pro(P)又はAsn(N)であり；
X10は、Lys(K)、Leu(L)又はAla(A)であり；
X11は、Ile(I)、Val(V)5又はGly(G)であり；
X12は、正荷電アミノ酸であり；
X13は、極性アミノ酸であり；
X14は、負荷電アミノ酸であり；
X15は、Leu(L)、Gly(G)又はVal(V)であり；
X16は、Thr(T)、Ile(I)又はAla(A)であり；
X17は、Ala(A)、Cys(C)又はAsp(D)であり；
X18は、Leu(L)、Arg(R)又はAsn(N)であり；
X19は、Thr(T)、Asn(N)又はGly(G)であり；
X20は、Glu(E)、Arg(R)又はThr(T)であり；
X21は、Ser(S)、Val(V)又はLeu(L)であり；
X22は、Tyr(Y)、Thr(T)、Phe(F)であり；
X23は、Asn(N)又はLeu(L)であり；
X24は、Asn(N)又はGly(G)であり；
X25は、Val(V)又はIle(I)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、25未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10のアミノ酸残基を含む構造式IXの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、構造式IXの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
組織保護活性において式IXの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X11、X12、X13、X14及びX15は、欠失されない。
また、式IXの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上さえする、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式XIのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式XIのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式XIの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大8つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、保存的に置換される。
特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、以下に述べるペプチドの群から選択される：
Figure 0005542064
本発明の他の実施態様において、構造モチーフBを示す1型サイトカインの単離ペプチド及びペプチド類似体は、構造式X(配列番号：233)を有する：
Figure 0005542064
 式中：
X1は、Leu(L)であり；
X2は、Gly(G)であり；
X3は、Cys(C)であり；
X4は、Val(V)であり；
X5は、Leu(L)であり；
X6は、His(H)であり；
X7は、Arg(R)であり；
X8は、Leu(L)であり；
X9は、Ala(A)であり；
X10は、Asp(D)であり；
X11は、Leu(L)であり；
X12は、負荷電アミノ酸であり；
X13は、極性アミノ酸であり；
X14は、正荷電アミノ酸であり；
X15は、Leu(L)であり；
X16は、Pro(P)であり；
X17は、Lys(K)であり；
X18は、Ala(A)であり；
X19は、Gln(Q)であり；
X20は、Asp(D)であり；
X21は、Leu(L)であり；
X22は、Glu(E)であり；
X23は、Arg(R)であり；
X24は、Ser(S)であり；
X25は、Gly(G)である。
ある実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、25未満のアミノ酸残基を含むことができる。実際、わずか24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10のアミノ酸残基を含む構造式Xの不完全又は内部的に欠失した形態は、実質的に、構造式Xの単離ペプチド及びペプチド類似体の全特性及び組織保護特性を保持する。
組織保護活性において式Xの単離ペプチド及びペプチド類似体の内部残基の空間的に緻密な電荷配置の重要性が推測されるため、本発明の特定の実施態様において、負及び正荷電及び直接隣接したアミノ酸を含む残基は欠失されない。従って、特定の実施態様において、残基X11、X12、X13、X14及びX15は、欠失されない。
また、式Xの単離ペプチド及びペプチド類似体は、一方若しくは両方の末端で又は内部で、該ペプチド又はペプチド類似体の構造及び/又は機能特性を実質的に干渉せず、一実施態様において向上さえする、追加のアミノ酸残基により延長されることもできる。実際、26、27、28、又は29ほどのアミノ酸残基を含む延長されたコアペプチド及びペプチド類似体は、本発明の範囲内であるとみなされる。好ましくは、このような延長ペプチドは、式Xのペプチド類似体の組織保護特性を実質的に保持するであろう。
式Xのコアペプチド及びペプチド類似体の特定のアミノ酸残基は、ペプチド及びペプチド類似体の活性に著しく有害な影響を及ぼさず、かつ多くの場合、向上さえする、他のアミノ酸残基と置き換えることができる。従って、本発明により意図されるものは、式Xの単離ペプチド及びペプチド類似体の変更又は変異形態であって、該式の少なくとも1つ及び最大8つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって保存的に置換されるものである。ある実施態様において、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、保存的に置換される。
特定の実施態様において、単離ペプチド及びペプチド類似体は、下記アミノ酸配列から構成される：
Figure 0005542064
本明細書中の上記に記載されている構造モチーフCを例示する、1型サイトカインから誘導されるペプチドの更なる例は、制限されないが、以下を含む：
Figure 0005542064
本明細書中の上記に記載される構造モチーフDを例示する、1型サイトカインから誘導されるペプチドの更なる例は、制限されないが、以下を含む：
Figure 0005542064
本明細書中の上記に記載される構造モチーフFを例示する、1型サイトカインから誘導されるペプチドの更なる例は、制限されないが、hCNTF誘導、ペプチドIA：
Figure 0005542064
 及びhIL-3誘導ペプチドIB：
Figure 0005542064
 を含む。
これらの上述したアミノ酸は、単に、1型サイトカイン受容体を通して信号を送るサイトカインスーパーファミリーの一部のメンバーからの例示にすぎず、サイトカインスーパーファミリーの他のメンバーの相同領域は、当業者により容易に同定されるであろう。
(6.3 キメラ)
「キメラ」ペプチド−上記構造モチーフを示すEPO分子又は他のI型サイトカインの外部面のアミノ酸の非線形構造要素を組み込む線形アミノ酸配列−は、また、本発明により意図される。本発明に有用なキメラペプチドは、個別のアミノ酸配列の構造要素を単一ペプチドに結合することから構成され得る。換言すれば、キメラペプチドは、非線形であるが、へリックスCのC末端部及びループC-DのN末端部の構造要素を許容する、ループC-Dにおけるβ-プリーツシート、及び単一ペプチドに含まれるEPOのC末端を許容する、配列番号：1のアミノ酸配列110-115、133-136及び160-165に由来する断片などの隣接する構造要素から誘導されるアミノ酸配列から構成され得る。加えて、キメラペプチドは、特定の構造、例えば特定の三次構造の外部面のアミノ酸の重要な特徴以外を選択するように用いることができる。従って、本発明の方法に有用なキメラペプチドは、へリックスBアミノ酸58、62、65、69、72、76、79、80、83、84、及び85からなる断片(例えば、ペプチドIC
Figure 0005542064
 )又は換言すると、PCT/US2006/031061に開示されるようにEPOのへリックスBの外部に存在するアミノ酸の全てから構成され得る。第1のグルタミンが、ピログルタミン酸と置き換えられる、さらなるキメラペプチド(例えばペプチドID
Figure 0005542064
 は、同様に本発明により意図される。
非天然又はキメラペプチドは、任意の2つのアミノ酸のカルバミル炭素間、又はエリスロポエチン又はアミノ酸の線形配列を介して本明細書中の上記に記載された別の1型サイトカインの任意の2つのアミノ酸の側鎖間の重要な空間近傍を模倣するように設計されることができ、他のタンパク質から誘導される潜在的な組織保護性キメラを評価することにおいて指針を提供することができる。従って、本発明は、これらの構造モチーフ及び組織保護を誘発する重要な空間近傍を示すものと含む、新規キメラ組織保護ペプチドを対象とする。
さらにまた、本ペプチドの効力は、両親媒性ペプチドへリックスを結合することによって増加することができる。両親媒性のペプチドへリックスは、例えば、クラスB Gタンパク質結合レセプター(例えば、その全体において本明細書中に引用により取り込まれているSegrestらの文献, 1990, Proteins 8:103)を介してシグナル伝達するペプチドから、技術的に周知であり、細胞膜にペプチドリガンドを局在するのに役立つ。このようなへリックスの例を挙げると、以下からの高度に疎水性の領域があるが、これらに限定されない：カルシトニン(ペプチドIE：
Figure 0005542064
 )；副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(ペプチドIF：
Figure 0005542064
 )；βエンドルフィン(ペプチドIG：
Figure 0005542064
 )；グルカゴン(ペプチドIH：
Figure 0005542064
 )；セクレチン(ペプチドII：
Figure 0005542064
 )；血管作用性ペプチド(ペプチドIJ：
Figure 0005542064
 )；神経ペプチドY(ペプチドIK：
Figure 0005542064
 )；生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(ペプチドIL：
Figure 0005542064
 )；副甲状腺ホルモン(ペプチドIM：
Figure 0005542064
 )；膵ポリペプチド(ペプチドIN：
Figure 0005542064
 )；及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド(ペプチドIO：
Figure 0005542064
 )(その全体において引用により本明細書中に取り込まれているGraceらの文献, 2004, PNAS 101:12836において開示されている)。例えば、本発明の方法に有用なキメラペプチドは、PCT/US2006/031061に開示されているように、キメラペプチド(ペプチドIP：
Figure 0005542064
 )のための膵ポリペプチド(ペプチドIN：
Figure 0005542064
 )の両親媒性ヘリックスにカルボキシ末端で結合された、EPO(ペプチドIC：
Figure 0005542064
 )のへリックスBの表面電荷モチーフを有するペプチドから製造され得る。更なる修飾は、その組織保護性に影響を及ぼすことなく、両親媒性ヘリックスのカルボキシ末端に製造され得る。従って、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の治療に有用なペプチドの更なる例は、配列TR(ペプチドIQ
Figure 0005542064
 を有する上記キメラペプチドの末端Proを置き換えることにより生じるものである。
さらに、上記のへリックスの代わりに、他の三次構造を該ペプチドに結合することができる。例えば、へリックスBの外側に存在するアミノ酸を、EPOのABループ内に見い出されるベータプリーツシート(ペプチドIR：
Figure 0005542064
 )に結合し、配列ペプチドIS：
Figure 0005542064
 を有するキメラペプチドを形成することができる。さらに、へリックスC(ペプチドIT:
Figure 0005542064
 配列番号：1のアミノ酸111、112、113、116及び118に相当する)の末端部の存在するアミノ酸を、ループCD部(配列番号：1のアミノ酸112-133に相当するペプチドIU：
Figure 0005542064
 )の全て又は一部と結合し、ペプチドIV：
Figure 0005542064
 を形成することができる。
さらに、上記に開示した様々なモチーフ−構造モチーフA(式I〜IVを含む)、構造モチーフB(式V〜Xを含む)、構造モチーフC、構造モチーフD、構造モチーフE及び構造モチーフF−を示す単離ペプチドを結合し、同様に様々なキメラを形成することができる。ある実施態様において、キメラは、以下のペプチドを除外するであろう：
Figure 0005542064
好ましくは、結合腕は、融合ペプチド間に存在し、結合されるペプチドが組織保護レセプター複合体と結合する適切な構造配向を想定することができるように、柔軟性を提供するであろう。このような融合ペプチドは、相乗効果を有することができ、おそらく個々に組織保護レセプター複合体との強化された結合又は増加された生物学的半減期を介するのとは対照的に、共同でより大きな組織保護効果を得る。
当業者は、本発明に従って、毒剤の曝露から生じるダメージ、影響又は症状を予防、治療、改善又は管理する方法において、このような化合物の効果を最大限にするために、単一ペプチドに様々な所望の構造要素を組み合わせる利点を認識するであろう。このようなキメラは、リンカー又は架橋原子又は部分などのアミノ酸ペプチド及び非アミノ酸要素を含むことができる。
(6.4 融合ペプチド)
本発明は、さらに、上記のペプチド、誘導断片、又はキメラの2つ以上を、エリスロポエチン、アルブミンなどの関連又は非関連タンパク質に結合することができる。そのような融合ペプチドは、相乗的利点を達成するために生成することができ、該ペプチドの循環半減期を増加させ、又は血液脳関門、血液網膜障壁などの内皮障壁を透過するペプチドの能力、又は逆もまた同様、すなわち、全体において引用により本明細書中に取り込まれているWO2002/053580として公表されたPCT/US01/49479に開示されているものと類似の運搬機構として作用するペプチドの能力を増加させることができる。
(6.5 ペプチドの製造)
本発明の方法に有用なペプチドの製造は、周知技術の組換え又は合成技術を用いて行うことができる。特に、固相タンパク質合成は、ペプチドの比較的短い長さによく適し、一貫性のある結果でより大きな収率を提供できる。さらに、固相タンパク質合成は、ペプチドの製造に関して、付加的な柔軟性を提供できる。例えば、所望の化学修飾は、合成段階でペプチドに組み込まれることができる：ホモシトルリンを、リジンと対照的にペプチドの合成に使用することができ、それによって、合成後のペプチド又は保護官能基を有するアミノ酸をカルバミル化する必要性を未然に取り除くことにより、合成時に該ペプチドを残すことができる。
(合成)
本発明の方法に有用な単離ペプチド及びペプチド類似体は、従来の段階的溶液又は固相合成法を用いて調製することができる(例えば、Merrifield, R.B., 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154；「ペプチド及びタンパク質合成への化学的アプローチ(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins)」, Williamsらの文献, Eds., 1997, CRC Press, Boca Raton Fla.、及びそこに引用されている参考文献；「固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach)」, Atherton & Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, England、及びそこに引用されている参考文献を参照されたい)。
あるいは、本発明に有用な該ペプチド及びペプチド類似体は、下記文献に記載されているセグメント縮合の方法により調製することができる：例えば、Liuらの文献, 1996, Tetrahedron Lett. 37(7):933-936; Bacaらの文献, 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887；Tarnらの文献, 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216；Schnolzer及びKent, 1992, Science 256:221-225；Liu及びTarn, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(10):4149-4153；Liu及びTarn, 1994, Proc. Natl. Acad. ScL USA 9 1:6584-6588；Yamashiro及びLi, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334。これは、特にペプチドを含むGly(G)を有するケースである。本発明のペプチド及びペプチド類似体の合成に有用な他の方法は、Nakagawaらの文献., 1985, J Am. Chem. Soc. 107:7087-7092.に記載されている。
(組換え技術)
様々な宿主発現ベクター系を利用して、該ペプチド及びペプチド類似体を産生することができる。このような宿主発現ベクター系は、対象のペプチドを産生し続いて精製できるベシクルを意味するが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換及びトランスフェクトする場合、改質エリスロポエチン遺伝子産物をその場で示すことができる細胞を意味する。これらは、制限されないが、細菌、昆虫、植物、ヒト宿主系などの哺乳動物を含み、制限されないが、該ペプチドコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系；エリスロポエチン関連分子コード配列を含む、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウィルス、CaMV；タバコモザイク病ウイルス、TMV)で感染され又は組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された、植物細胞系；又はヒト細胞系などの哺乳動物細胞系、例えば、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター、例えばメタロチオネインプロモーター、又は哺乳動物ウイルスから誘導されるプロモーター、例えばアデノウィルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kのプロモータを含む、組換え発現構築物を収容しているHT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3、PERC6がある。
さらに、挿入された配列の発現を調整、又は所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングするように、宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾及びプロセシングは、タンパク質の機能にとって重要であってもよい。当業者に公知である様に、異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシング及びタンパク質及び遺伝子産物の修飾のための特定の機構を有する。適当な細胞系又は宿主系は、発現される異種タンパク質の正しい修飾及びプロセシングが確実に生じるように選択されることができる。この目的のため、遺伝子産物の転写一次産物、グリコシル化及びリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用することができる。ヒト宿主細胞などのこのような哺乳動物宿主細胞は、HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3及びWI38を含むが、これらに限定されない。
組換えペプチドの長期の高い収率産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、組換え組織保護サイトカイン-関連分子遺伝子産物を安定に発現する細胞系を設計することができる。ウィルス複製開始点を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞は、適当な発現制御領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)、及び選択可能な標識により制御されるDNAで形質転換され得る。異種DNA導入後、設計された細胞を、富栄養培地中で1〜2日間成長させることができ、その後、選択的培地に切り替える。組換えプラスミドの選択可能な標識は、選択に対する耐性を与え、細胞が安定してプラスミドをそれらの染色体に組み込み、次々にクローン化及び細胞系に拡大され得る中心を形成するように成長できる。この方法は、組織保護産物を発現する細胞系を設計するために、有利に用いることができる。このような設計された細胞系は、特に、EPO関連分子遺伝子産物の内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング及び評価に有用であり得る。
(さらなる修飾)
さらなる修飾を伴うペプチドを、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療、改善、又は管理をするための本発明の方法に使用することができる。例えば、上記の構造モチーフのペプチドは、一つ以上の(D)-アミノ酸により合成されることができる。(L)-又は(D)-アミノ酸を本発明のペプチドに含む選択は、ペプチドの所望の特徴に部分的に依存する。例えば、一つ以上の(D)-アミノ酸の組み込みは、インビトロ又はインビボでのペプチドの安定性の増加を与えることができる。例えば、一つ以上の(D)-アミノ酸の組み込みは、本明細書中に記載されているバイオアッセイ又は公知技術の他の方法を用いて決定されるように、ペプチドの結合活性を増減することもできる。
(L)-アミノ酸の配列の全部又は一部の、鏡像異性的(D)-アミノ酸のそれぞれの配列による置換は、ペプチド鎖のそれぞれの部分の光学異性体構造を示す。(L)-アミノ酸の配列の全部又は一部の配列の逆転は、ペプチドのレトロ類似体を示す。鏡像異性的(Dに対するL又はLに対するD)置換及び配列の逆転の組合せは、ペプチドのレトロ-インベルソ-類似体を示す。鏡像異性的ペプチド、それらのレトロ類似体及びそれらのレトロ-インベルソ-類似体が、親ペプチドとの有意なトポロジー関係を維持し、特に、類似の高い程度が、多くの場合、親及びそのレトロ-インベルソ-類似体のために得られることは当業者に公知であり、。この関係及び類似性は、ペプチド、特に、それぞれのペプチド及び類似体を受容体タンパク質に結合する高い程度の生化学的特徴において反映され得る。ペプチドのレトロ-インベルソ類似体の特徴の合成は、例えば、「有機化学の方法(Methods of Organic Chemistry (Houben-Weyl))」、「ペプチド及びペプチド模倣体の合成(Synthesis of Peptides and Peptidomimetics)」-Workbench Edition Volume E22c (Editor-in-chief Goodman M.) 2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York)、及びそれらに引用されている参考文献に記載されている。それらの全ては、全体において本明細書中に引用により取り込まれている。
アミノ酸「修飾」は、非天然アミノ酸を生じるために、天然アミノ酸の変更を指す。非天然アミノ酸を有する本発明のペプチドの誘導体は、その全体において本明細書中に取り込まれているChristopher J. Noren, Spencer J.Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, 1989 Science, 244:182-188に記載されているように化学合成によって、又は生合成の間に非天然アミノ酸をペプチドに部位特異的に組み込むことによって作成することができる。
治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣体を、等価な治療的又は予防的効果を生じるために用いることができる。通常、ペプチド模倣体は、模範ポリペプチド(すなわち、生化学的性質又は薬理活性を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、任意に、公知技術の方法及びさらに下記文献に記載されている方法によって、--CH2-NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH-(シス及びトランス)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--、及び-CH2SO--からなる群から選択される結合と置き換えられる一つ以上のペプチド結合を有する：Spatola, A.F. 「アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の化学及び生化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins)」 B. Weinstein, 編集., Marcel Dekker, New York, p 267 (1983)；Spatola, A.F., Vega Data (3月 1983), Vol. 1. Issue 3, 「ペプチド骨格修飾(Peptide Backbone Modifications)」(一般的総則)；Morely, J.S., Trends Pharma Sci (1980) pp. 463-468 (一般的総則)；Hudson, D.らの文献, (1979) Int J Pept Prot Re 14: 177-185 (--CH2-NH--、--CH2-CH2--)；Spatola, A.F.らの文献, (1986) Life Sci 38:1243-1249 (--CH2-S--)；Hann, M. M., (1982) J Chem Soc Perkin Trans I 307-314 (--CH=CH--, シス及びトランス)；Almquist, R. G. らの文献, (1980) J Med Chem 23: 1392 (--COCH2--)；Jennings-White, Cらの文献, (1982) Tetrahedron Lett 23:2533 (--COCH2--)；Szelke, Mらの文献, European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (--CH(OH)CH2--)；Holladay, M. W. らの文献, (1983) Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (--C(OH)CH2--)；及びHruby, V.J., (1982) Life Sci 31:189-199 (--CH2-S--)；その各々は引用により本明細書中に取り込まれている。
別の実施態様において、特に好ましい非ペプチド結合は、--CH2NH--である。このようなペプチド模倣体は、例えば、以下を含むペプチド実施態様を超えて有意な効果を有することができる：より経済的な製造、より大きな化学安定性、薬理特性増強(半減期、吸収、作用強度、有効性など)、特異性の変更(例えば、生物活性の広域スペクトル)、抗原性低下、及びその他。
ペプチド模倣体のための様々な設計が可能である。例えば、必要な構造が非ペプチドによって安定化される環状ペプチドは、特に意図されるものである。Loblらの米国特許第5,192,746号、Aversaらの米国特許第5,576,423号、Shashouaの米国特許第5,051,448号、及びGaetaらの米国特許第5,559,103号。全ては全体において本明細書中に引用により取り込まれている。ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物の合成も、従来技術において公知である。Eldredらの文献, J. Med. Chem. 37:3882 (1994)(その全体において本明細書中に引用により取り込まれている)は、ペプチド配列を模倣する非ペプチドアンタゴニストを記載する。同様に、Kuらの文献, J. Med. Chem 38:9 (1995)(その全体において本明細書中に引用により取り込まれている)は、前記化合物の一連の合成を明らかにしている。
合成後の更なる修飾を行うことができる。例えば、ペプチドは更に、2003年4月17日に20030072737-A1として公開され、化学修飾EPOを開示する米国特許出願番号第10/188,905号に従って、及び2003年7月1日に出願の米国特許出願番号第10/612,665号、及び2000年12月29日に出願の米国特許出願番号第09/753132号(それらの全部において、本明細書中に引用により取り込まれている。)に従って、化学修飾、すなわちカルバミル化、アセチル化、スクシニル化、グアニジン化、ニトロ化、トリニトロフェニル化、アミジン化などをされてもよい。
さらに、ペプチドは、組換えペプチド--突然変異タンパク質から構成されることができる。開示される突然変異は、内部欠失を含む欠失、融合タンパク質をもたらす付加を含む付加、又は「サイレント」変化を生じるアミノ酸配列内及び/又は該配列に隣接するアミノ酸残基の保存的置換、及び非保存的アミノ酸の変化及び大きな挿入及び欠失を含むことができる。これらは、以前に表題「応答性細胞、組織及び器官の保護、修復、及び増強のための組換え組織保護サイトカイン及びそのコード核酸(Recombinant Tissue Protective Cytokines and Encoding Nucleic Acids Thereof for Protection, Restoration, and Enhancement of Responsive Cells, Tissues, and Organs)」のPCT/US03/20964に開示されている(その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。
保存的又は非保存的アミノ酸置換のいずれかを、1つ以上のアミノ酸残基で行うことができる。保守的及び非保守的な置換の両方を行うことができる。保存的置換は、アミノ酸の側鎖に関連するアミノ酸のファミリーの範囲内で行うものである。遺伝的にコード化されたアミノ酸は、4つのファミリーに分けることができる：(1)酸性 = Asp(D)、Glu(G)、(2)塩基性 = Lys(K)、Arg(R)、His(H)、(3)無極性(疎水性) = Cys(C)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Met(M)、Trp(W)、Gly(G)、Tyr(Y)、及び(4)非荷電極性= Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)。非極性は、以下に再分割することができる：強疎水性 = Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Met(M)、Phe(F)、及び中程度疎水性 = Gly(G)、Pro(P)、Cys(C)、Tyr(Y)、Trp(W)。代わりの方法において、アミノ酸レパートリーは、(1)酸性 = Asp(D)、Glu(G)；(2)塩基性 = Lys(K)、Arg(R)、His(H)、(3)脂肪族 = Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、任意にSer(S)及びThr(T)は脂肪族ヒドロキシルとして別に分類される；(4)芳香族 = Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)；(5)アミド = Asn(N)、Glu(Q)；及び(6)硫黄含有 = Cys(C)及びMet(M)として分類されることができる。(例えば、Biochemistry, 第4版, L. Stryer編集, WH Freeman, 1995を参照されたい。本文献は本明細書中に引用により取り込まれている。)。
あるいは、突然変異は、飽和突然変異誘発によるなどの、ペプチドのコード配列の全部又は一部に沿ってランダムに導入されることができ、結果として生じる突然変異体は、活性を保持する突然変異体を同定するために、生物活性についてスクリーニングされることができる。突然変異誘発の後、コード化されたペプチドは、組換え的に発現されることができ、組換えペプチドの活性を決定することができる。
別の実施態様において、ペプチドは、ペプチドの半減期を延長又はペプチドの組織保護効果を強化する目的において、ポリマー(ポリエチレングリコールなど)、糖又はさらなるタンパク質(融合構造物など)の付加を介して更に修飾されることができる。このような修飾の例は、WO/04022577 A3及びWO/05025606 A1に開示されている。それらは本明細書に引用により取り込まれている。例えば、ポリエチレングリコールポリマーをペプチドICに結合させ、ペプチドIW
Figure 0005542064
 を生じることができる。
選択される共役化学、及びペプチドに既に存在するか又は作成される反応部位の数に応じて、1種、２種又は選択された数のポリマーを、再現可能な方法で付加することができる。PEG及びその誘導体のヘプチドへの結合の主要な様式は、ペプチドアミノ酸残基による非特異的結合である(例えば、米国特許第4,088,538号、米国特許第4,496,689号、米国特許第4,414,147号、米国特許第4,055,635号、及びPCT WO 87/00056を参照されたい。)。PEGをペプチドに結合する別の様式は、グリコペプチド上のグリコシル残基の非特異的酸化による(例えば、WO 94/05332を参照されたい。)。これらの非特異的方法において、PEGは、ペプチド骨格上の反応性残基に、ランダムな非特異的方法で加えられる。
(7. ペプチドの試験アッセイ)
様々なアッセイを用いて、本発明の治療方法に使用するための上記のペプチドの有用性を決定することができる。ペプチド組織保護活性は、公知の様々なアッセイを用いて確認されるであろう。それは、米国特許出願番号第10/554,517号、第10/612,665号及び第11/997,898号に開示されている。更に、赤血球新生作用活性を欠く又は赤血球新生作用活性の減少したペプチドは、EPO依存性細胞系(UT-7)、マウス脾臓バイオアッセイ(フェニルヒドラジン処置マウスの脾臓細胞内への3H-チミジン取り込みに基づく、エリスロポエチンについての単純なマイクロアッセイ)、又はクローナルアッセイ(Spivak, J.L., Seiber, F. (1983). Erythropoietin. Horm. Norm. Abnorm. Hum. Tissues 3, 63-96)などの様々なインビトロアッセイ、及び外低酸素多血症マウスアッセイ(ex hypoxic polycythemic mouse assay)(Cotes PM, Bangham DR, 「減圧下で空気に曝露されることにより多血症となったマウスにおけるエリスロポエチンのバイオアッセイ(Bio-assay of erythropoietin in mice made polycythaemic by exposure to air at a reduced pressure)」, Nature. 1961 Sep 9;191: 1065-7)などのインビボアッセイを用いて確認されるであろう。さらに、当業者は、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、緩和、又は治療をするペプチドの能力が、インビトロ及びインビボの双方の様々なアッセイを介して確認されることができるが、特定の実施態様においては、インビボアッセイが好まれ得ることを認識するであろう。
(7.1 組織保護アッセイ及びモデル)
本方法に利用されるペプチドは、組織保護特性、すなわち抗アポトーシス、神経突起生成。神経保護などを示す。本発明のペプチドは、組織保護活性、例えば、細胞、組織又は器官の保護について試験することができる。保護活性は、インビトロ及びインビボアッセイを用いて更に試験することができる。組織保護活性を示すインビトロ試験は、例えば、細胞増殖アッセイ、細胞分化アッセイ、又は組織保護レセプター複合体、例えば、組織保護サイトカインレセプター複合体、活性、例えば、ヌクレオリン、ニューログロビン、サイトグロビン又はフラタキシンによって上方制御されたタンパク質又は核酸の存在を検出することを含む。ニューログロビンは、例えば、酸素の輸送又は短期間貯蔵の促進に関与し得る。従って、酸素輸送又は貯蔵アッセイは、組織保護活性を調整する化合物を同定又はスクリーニングするためのアッセイとして用いることできる。
ニューログロビンは、低酸素症又は虚血に応答して中枢神経系の細胞及び組織中で発現され、損傷からの保護を提供することができる(Sunらの文献 2001, PNAS 98:15306-1531 1; Schmidらの文献, 2003, J. Biol. Chem. 276:1932-1935、その各々は全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。サイトグロビンは、保護において類似の役割を果たすことができるが、様々な組織において様々なレベルで発現される(Pesceらの文献, 2002, EMBO 3:1146-1151、それはその全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。本発明の一実施態様において、細胞の上方制御されたタンパク質のレベルは、ペプチドを細胞に接触させる前後で測定することができる。ある実施態様において、細胞の組織保護活性に関連した上方制御されたタンパク質の存在は、ペプチドの組織保護活性を確認するために用いることができる。
ヌクレオリンは、細胞をダメージから保護することができる。それは、転写プロセス、配列特異的RNA-結合タンパク質、細胞質分裂、核形成、シグナル伝達、T細胞によるアポトーシス、クロマチンリモデリング又は複製の調整などの、細胞において多くの役割を果たす。また、それは、細胞表面レセプターDNA/RNAヘリカーゼ、DNA依存性ATPアーゼ、タンパク質シャトル、転写因子成分、又は転写リプレッサーとして機能することもできる(Srivastava及びPollard, 1999, FASEBJ , 13:1911-1922；及びGinistyらの文献, 1999, J. Cell Sci., 112:761-772、その各々は全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。
フラタキシンは、ミトコンドリア鉄代謝と関係しているタンパク質であり、EPOによって強く上方制御されることが、インビボ及びインビトロにおいて以前に示されている(Sturmらの文献. (2005) Eur J Clin Invest 35: 711、それは全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。
上方制御されたタンパク質の発現は、細胞内のタンパク質に相当するmRNAレベルを検出することにより検出することができる。mRNAは、上方制御されたタンパク質をコードする核酸を特異的に結合するプローブにハイブリダイズすることができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、ノーザンブロット、サザンブロット、配列ハイブリダイゼーション、アフィニティークロマトグラフィー又は原位置ハイブリッド形成から構成され得る。
また、本発明のペプチドの組織保護活性は、インビトロ神経保護アッセイを用いて検出することもできる。例えば、一次神経細胞培養液を、トリプシン処理によって、新しく生まれたラット海馬から調製し、公知技術の任意の方法によって及び/又は本明細書中に記載されている任意の方法によって、例えば、MEM-II成長培地(Invitrogen)、20mM D-グルコース、2mM L-グルタミン、10% Nu-血清(ウシ；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、2% B27補充物(Invitrogen)、26.2mM NaHCO3、100U/mlペニシリン、及び1mg/mlストレプトアビジン(例えば、全体において本明細書中に引用により取り込まれているLeistらの文献, 2004, Science 305:239-242を参照されたい。)中で、培養することができる。播種1日後に、1μMシトシンアラビノフラノシドを加える。その後、13日経った培養液を、対象のペプチドの増加する投与量(3〜3000pM)で24時間、前保温する。14日目に培地を除去し、培養液を室温(RT)で、PBS中の300μM NMDAを用いて投与する。5分後に、予め調整した培地を該培養液に戻し、その後、24時間、保温器に戻す。細胞を、パラホルムアルデヒドに固定し、Hoechst 33342(Molecular Probes, Eugene, OR)により染色し、凝縮したアポトーシス核を計数することができる。NGF(50ng/ml)及びMK801(1μM)を、ポジティブコントロールとして含ませる。
動物モデル系を使用して、化合物の組織保護活性を示すか又は上記の本発明のスクリーニング方法により同定される化合物の安全性及び有効性を示すことができる。その後、アッセイにおいて同定される化合物は、対象のある種類の組織の損傷、疾患、状態又は症候群のための動物モデルを用いて、生物活性を試験することができる。これらは、機能的読み出しシステムに結合した組織保護レセプター複合体を含むように操作された動物、トランスジェニックマウスなどを含む。
細胞の有効性又は同定された化合物の組織保護活性を試験するために用いることができる動物モデルは公知技術であり、例えば、ルイスラットの急性実験的アレルギー性脳脊髄炎の発症に対する保護、興奮性毒により刺激された脳外傷、脳虚血(「脳卒中」)又は発作を受けた後のマウスの減弱した認知機能からの回復又は保護(Brinesらの文献, 2000, PNAS, 97:10295-10672、その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)、誘発された網膜虚血からの保護((Rosenbaumらの文献, 1997, Vis. Res. 37:3443-51、その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)、坐骨神経に対する損傷からの保護、及び心臓に対する虚血-再灌流傷害からの保護(インビトロにおける心筋細胞の研究及びインビボにおける虚血-再灌流傷害、例えば、Calvilloらの文献, 2003, PNAS 100:4802-4806、及びFiordalisoらの文献, 2005, PNAS 102:2046-2051を参照されたい。各々の文献は全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)を含む。このようなアッセイは、Grassoらの文献. (2004) Med Sci Monit 10: BR1-3、PCT公開番号WO02/053580、又はPCT出願番号PCT/US2006/031061にさらに詳細に記載されている。各々の文献は、全体において本明細書中に引用により取り込まれている。しかし、それらに記載されているインビボ方法は、EPOの投与を対象とし、EPOの代わりに投与される組織保護タンパク質は、類似の生物活性も示すことが同定されている。例えば、Leistらの文献. (2004) Science 305: 239-242、その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。ペプチドは、同様に、試験のために置換されることもできる。ペプチドの組織保護活性を決定するための他のアッセイは、当業者にとって周知である。
あるいは、細胞結合アッセイは、本発明のペプチドの評価のためにあることができる。例えば、対象のペプチドを、検出を容易にするための蛍光又は放射性標識などの生物学的標識に結合させ、EPOR及び/又はβcレセプターを発現するトランスフェクトBaF3細胞への結合を試験することができる。96ウェルプレートにおいて、成長培地(RPMI 1640、10%ウシ胎児血清、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン)中で、8つの1:2系列希釈の対象のペプチドを、各々のウェルの最終量が約100μlとなるように播種する。EPOR及び/又はβcレセプターでトランスフェクトしたBaF3親株及びBaF3細胞を、成長培地(上記参照)で3回洗浄し、ペレットを成長培地で再懸濁させ、細胞を計数し、成長培地において5,000細胞/100μlに希釈することができる。その後、アッセイプレートを、3〜4日間、37℃保温器中でインキュベートする。続いて、プレート/細胞を洗浄し、該プレートを蛍光プレートリーダー又は他の適切な方法によって読み込ませ、対象のペプチドの生物活性に関連したバイオマーカーのレベルを検出する。
同様に、競合アッセイを、ペプチドが組織保護性であるかどうか決定するために利用することができる。競合アッセイにおいて、制限されないが、米国特許出願番号第10/188,905号及び第10/185,841号(それぞれは、全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)に開示されるものなどの組織保護サイトカインを含む、保護組織性であることが公知の化合物を、適切なバイオマーカーに結合することができる。
96ウェルプレートにおいて、適切な成長培地中の8つの1:2系列希釈の公知の組織保護化合物/バイオマーカー、及び同じ系列希釈の公知の組織保護化合物/バイオマーカー及び過剰な対象のペプチドを播種する。各希釈の最終容量は約100μlとすべきである。また、上記開示のようにBaF3細胞をプレートに播種し、インキュベートする。適当な時間の後、細胞を洗浄し、プレートを、蛍光プレートリーダー又はバイオマーカの検出に公知技術の任意の他の適切な方法によって読み込む。公知の組織保護化合物/バイオマーカー及び対象のペプチドを含むプレート及び/又はウェルの読み出しが、公知の組織保護化合物/バイオマーカーのみを含むプレートの読み出しより少ない場合、対象のペプチドは保護組織性である。
すべての公知のサイトカインなどの、現在までに発見された多くのタンパク質因子は、一つ以上の因子依存的細胞増殖アッセイにおいて活性を示した。従って、これらのアッセイがサイトカイン活性の便利な確認法として役立つ。ペプチドの活性は、制限されないが、32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e及びCMKなどの、細胞系のための多くのルーチン的な因子依存的細胞増殖アッセイのいずれか一つにより明らかにすることができる。これらの細胞は、ペプチドの存在又は非存在で培養され、細胞増殖を、例えば、トリチウム化チミジンの組み込みを測定すること、又は3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)の代謝分解に基づく比色アッセイにより検出することができる(Mosman, 1983, J. Immunol. Meth. 65:55-63、その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。
ペプチドが組織保護活性を示す場合、当業者は、制限されないがP-19及びPC-12細胞アッセイなどの当業者に公知の神経保護及び組織保護アッセイのうちの1つを用いて、結果を検証することが有益であると認識するであろう。さらに、脊髄損傷、虚血性脳卒中、末梢神経損傷、創傷、又は心臓、目、腎臓などへのダメージに関連した動物モデルなどの様々なインビボモデルは、ペプチドを更に特徴付けするのに有効である。適切なインビトロ及びインビボアッセイは、米国特許出願番号第10/188,905号及び第10/185,841号に開示されている。その各々は全体において本明細書中に引用により取り込まれている。
(7.2 特定の指標のためのアッセイ)
(A. 毒剤)
本発明の方法の範囲内で用いられる単離ペプチドは、公知技術の様々なアッセイ又は本明細書中に記載されているアッセイを用いてインビトロ又はインビボで毒剤への曝露から生じるダメージ、影響又は症状を阻害することを示すことができる。
本発明の方法の範囲内で使用される更なるペプチドは、毒剤への曝露から生じるダメージ、影響又は症状を予防、治療、改善又は管理するそれらの能力を決定するために、従来技術において、様々なインビトロアッセイにおいて試験され得る。一般に、これは、適当な細胞系を選択し、その細胞を対象の毒剤に曝露し、かつ細胞の一部分を対象のペプチドで処置し、かつ毒剤の存在下、及び毒剤及び対象のペプチドの存在下、細胞生存又は反応を決定することにより達成される。細胞がペプチドの存在下で改善された生存又はダメージ、影響若しくは症状の減少を示す場合、該ペプチドは、毒性曝露に対して潜在的な治療薬であるとみなすことができる。さらに、当業者は、保護剤としてのペプチド能力を、毒剤投与前に細胞を該ペプチドで処理することにより評価することができると認識するであろう。
例えば、毒剤のための適切なアッセイは、以下を含むが、これらに限定されない：化学薬品：a) J-774(マウスマクロファージ誘導細胞系)、CHO-K1(チャイニーズハムスター卵巣細胞から誘導される上皮細胞系の系統)、及びHeLa(ヒト頸部癌)などの皮膚細胞系(Sawyer, T.らの文献、「発疱薬により誘発された皮膚損傷の付属物としての低体温(Hypothermia as an adjunct to vesicant-induced skin injury)」, Eplasty 2008; 8:e25)；b) 発疱薬のための角膜細胞系(Amir, A.らの文献、「硫黄マスタード眼性損傷の角膜上皮−インビトロ及びエクスビボ研究(The corneal epithelium in Sulfur mustard ocular injury - In vitro and ex vivo studies)」Proceedings of the U.S. Army Medical Defense Bioscience Review, Aberdeen Proving Ground, MD (2004))；c) マクロファージ(Amir A.らの文献、「マクロファージの硫黄マスタード毒性：デキサメタゾンの影響(Sulfur mustard toxicity in macrophages: effect of dexamethasone)」, J Appl Toxicol, 20 Suppl 1:S51-8 (2000))；d) 上気道細胞系(Andrew, DJ及びCD. Lindsay,「グルチオンエステルによる、硫黄マスタード毒性に対するヒトの上気道細胞系の保護(Protection of human upper respiratory tract cell lines against sulphur mustard toxicity by gluthione esters)」Hum Exp Toxicol 17(7):387-95 (1998)；Calvetらの文献、「硫黄マスタード曝露後の気道上皮のダメージ及びヒト肺実質の炎症性媒介物の放出(Airway epithelial damage and release of inflammatory mediators in human lung parenchyma after sulfur mustard exposure)」, Hum Exp Toxicol 18(2):77-81(1999)；Langford, A. M.らの文献、「ラット肺切片のグルタチオンレベルにおける硫黄マスタードの影響及びアリールチオール及びシステインエステルでの処置の影響(The effect of sulfur mustard on glutathione levels in rat lung slices and the influence of treatment with arylthiols and cysteine esters)」Hum Exp Toxicol 15(8):619-24)；e) 皮膚モデル(Blahaらの文献、「2つの皮膚モデルの炎症性媒介物、熱ショックタンパク質70A、組織学及び超微細構造におけるCEESの効果(Effects of CEES on inflammatory mediators, heat shock protein 70A, histology and ultrastructure in two skin models)」、JAppl Toxicol 20 Suppl 1:S 101-8(2000)；Henemyre-Harrisらの文献、「皮膚硫黄マスタード損傷の有効な治療のための薬理学的干渉をスクリーニングするためのインビトロ創傷治癒モデル(An in vitro wound healing model to screen pharmacological interventions for the effective treatment of cutaneous sulfur mustard injuries)」Proceedings of the U.S. Army Medical Defense Bioscience Review, Aberdeen Proving Ground, MD (2004)(一般に、適切なインビトロにおける追加の研究についてwww.counteract.rutgers.edu/invitro.htmlを参照されたい。)；放射線剤：a) 内皮細胞(Abderrahmani, R.らの文献、「放射線により誘発された内皮細胞アポトーシスのプラスミノーゲン活性阻害剤1型の役割(Role of plasminogen activator inhibitor type-1 in radiation-induced endothelial cell apoptosis)」)、神経免疫細胞(求心性神経、消化器官感覚神経、肥満細胞)(Wang, J.らの文献, 「神経免疫相互作用：腸の放射線傷害の緩和又は治療のための潜在的標的(Neuroimmune interactions: potential target for mitigating or treating intestinal radiation injury)」, British Journal of Radiology (2007) 80, S41-S48)、c) 血液又はリンパ球培養液(Lloyd DCらの文献, Phys Med Biol 18(3):421-31 (1973); Lloyd DCらの文献, Mutat. Res. 179(2): 197-208 (1987)；Blakely WFらの文献, Stem Cells 13 (Suppl 1):223-30 (1995)；Gotoh Eらの文献, Int. J Radiation. Biol. 81(l):33-40 (2005))；生物剤：(a) 末梢血単核細胞(Rasha、H.らの文献、「インビトロ反応をインビボ反応に相関させるための、SEBにより誘発されたホスト遺伝子発現のモデリング：生物防衛及び環境用途のためのマイクロアレイ(Modeling of SEB-induced host gene expression to correlate in vitro to in vivo responses: Microarrays for biodefense and environmental applications)」, Biosensors and Bioelectrics (2004) vol. 20, no. 4, 719-727)。
更なる、毒剤曝露における治療薬の影響を評価するための適切なインビボアッセイは、公知技術である。ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、フェレット、イヌ及び非ヒト霊長類を用いる動物モデルは、毒剤(CD46マウス)に特に影響されやすいトランスジェニック動物と同様に意図される。特に、公知技術のアッセイは、以下を含むが、これらに限定されない：化学薬品：(1) Reid, F.M.、「臨床的及び組織病理学的に評価される離乳児ブタの硫黄マスタードにより誘発された皮膚熱傷(Sulfur mustard induced skin burns in weanling swine evaluated clinically and histopathologically)」, Journal of applied toxicology, vol. 20 (S1), ページS153-S160 (2001)；(2) Isidore, M. A.らの文献、「c57bl/6マウスを使用する、皮膚発疱薬損傷2-クロロエチルエチルスルフィドの背部モデル(A dorsal model for cutaneous vesicant injury 2-chloroethyl ethyl sulfide using c57bl/6 mice)」, Cutaneous and ocular toxicology, Vol. 26 (3), 265-276 (2007)；(3) 一般にwww.counteract.rutgers.edu/animal.htmlを参照；(4) Kassa J.らの文献、「選択：神経薬に対するHI-6、パラドキシム、又はオビドキシム？(The Choice: HI-6, pradoxime or Obidoxime against Nerve Agents?)」, www.asanlte.com/ASANews-97/Antidot-Choice.html、(5) Shih, TMらの文献、「有機リン神経薬により誘導される発作、及び抗痙攣薬としてのアトロピン硫酸塩の有効性」, Pharmacol-Biochem-Behav. 1999 Sep, 64(1), 147-53、(6) Luo, Cらの文献、「オキシム再活性化の比較及び神経薬抑制サル及びヒトアセチルコリンエステラーゼ(Comparison of oxime reactivation and aging of the nerve agent-inhibited monkey and human acetylcholineterases)」, Chemico-Biological Interactions, 175(1-3), 261-266 (2008)；放射線剤：(1) W.F. Blakelyらの文献、「部分的身体線量曝露のインビトロ及び動物モデル：不均一線量曝露及び放射線損傷の評価のための細胞発生及び分子バーオマーカーの使用(In Vitro and Animal Models of Partial-Body Dose Exposure: Use of Cytogenic and Molecular Biomarkers for Assesment of Inhomogeneous Dose Exposures and Radiation Injury)」, PB-Rad-Injury 2008 Workshop, May 5-6, 2008 AFRRI, Bethesda, Maryland；(2) Augustine, Aらの文献、「会議報告：放射線損傷、保護及び療法の動物モデル(Meeting Report: Animal Models of Radiation Injury, Protection and Therapy)」, Radiation Research 164: 100-109 (2005)；(3) Houchen, Cらの文献、「放射線傷害のPGE2の前生存及び抗アポトーシスの影響は、腸のEP2レセプターにより媒介される(Prosurvival and antiapoptotic effects of PGE2 in radiation injury are mediated by EP2 receptor in intestine)」, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 284: G490-G498, 2003；(4) Jichun Chen、「後天的骨髄機能不全症候群のための動物モデル(Animal Models for Acquired Bone Marrow Failure Syndromes)」, Clinical Medicine & Research 3(2): 102-108：生物剤：(1) 「生物防御：研究方法論及び動物モデル(Biodefense: Research Methodology and Animal Models)」, James R. Swearengen (編集) 2006 CRC Press.。
(B. 炎症)
加えて、炎症のさまざまなインビトロモデルは、身体上の炎症のダメージ、症状又は影響を保護又は治療するペプチド能力を評価するために用いることができる。最初に、炎症性媒介物を調整するペプチドの能力は、制限されないがELISA、血球計算ビーズアレイ分析、高感度及び免疫ネフェロ分析などの公知方法によって、ペプチドを用いた治療後に、炎症性アッセイにおいて炎症性媒介物のレベルを測定することによって確認することができる。例えば、ペプチドがTNF-α又はIL-1を調整するかどうかを決定するために、LPS媒介サイトカイン産生のマウスモデルを行うであろう。マウスモデルの幾つかのマウスは、対象のペプチドで前処理し、その後LPSにより投与され、他方は生理食塩水処置される。その後、血液を回収し、血液中のTNF-α及びIL-1レベルをELISAキットで測定することができる(OPT-EIAマウスTNF-α及びIL-1 ELISAキット(BD Biosciences))。処置動物のTNF-αレベルが、生理食塩水処置動物のTNF-αレベルより低い場合、該ペプチドは、TNF-αを調整すると考えられ得る。好ましくは、ペプチドは、2以上の炎症性媒介物を調整するその能力のために試験され、より好ましくは、それは、TNF-α以外又は追加の媒介物であり、好ましくは、それは、ヒスタミンであろう。同様に、ペプチドは、限定されないが、以下の開示されているものなどのインビトロアッセイにおいてさらに試験することができる：Lopata, Andreas L.「過敏症の評価における特殊インビトロ診断方法(Specialized in vitro Diagnostic Methods In The Evaluation Of Hypersensitivity -An Overview)」, March 2006, Vol. 19, No.1, (ヒスタミン及びトリプターゼアッセイ)、及びArulmozhiらの文献, 「炎症の様々なインビトロ及びインビボモデルにおける、サピンヅストリホリアツス(Sapindus trifoliatus)の薬理学的調査(Pharmacological Investigations of Sapindus trifoliatus in various in vitro and in vivo models of inflammation)」, Indian Journal of Pharmacology, vol. 37:2, 96-102 (2005) (5-リポキシゲナーゼ(5-LO)、シクロ-オキシゲナーゼ(COX)、ロイコトリンB4 (LTB4)、一酸化窒素シンターゼ(NOS))。
更に、炎症のインビボアッセイは、毒剤に対する治療薬としてのペプチド有用性を評価することに役立ち得る。制限されないが、以下を含むインビボアッセイ：ラットEAEモデル、重度大腸炎MDBiosciences DSS IBDラットモデル、炎症性腸疾患のMDBioscience TNBS IBDラットモデル、米国特許第6,437,216号に開示されるIL-1ノックアウトマウスを含むモデル、又は以下の文献に開示されるTNF-αを含むトランスジェニックマウスのモデル：Probertらの文献「腫瘍壊死因子αのCNS特異的発現を示すトランスジェニックマウスの自然炎症性脱髄性疾患(Spontaneous inflammatory demyelinating disease in transgenic mice showing CNS-specific expression of tumor necrosis factor α)」. Proc. Natl Acad. Sci 1995 USA 92, 11294-11298, Kontoyiannisらの文献「TNF AU豊富要素を欠くマウスのTNF生合成の障害性のオン/オフ調節：共同及び消化管関連免疫病理学に対する意味(Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies.)」Immunity 10:387-398, 1999、Kefferらの文献「ヒト腫瘍壊死因子を発現するトランスジェニックマウス：関節炎の前兆となる遺伝子のモデル(Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis.)」EMBO J. 1991 Dec;10(13):4025-31、又はJPET 307:373-385, 2003に開示される喘息及び慢性閉塞性肺疾患のモデルなどの炎症を誘発する化学的及び合成的課題を用いるモデル、EP 1 777 234に開示される補助関節炎モデル：マウスLPSショックモデル、マウスLPS肺モデル、急性足炎症モデル、又は下記に詳細に開示されるヒスチジン投与腫れ形成モデル(histidine challenge wheal formation model)などのトランスジェニックマウスを利用するもの。
更に、Ravensbergらの文献「塵ダニを喘息に収容する気道応答の確認された安全予測(Validated safety predictions of airway responses to house dust mites in asthma)」 Clinical and Experimental Allergy, 37:100-107 (2007)に開示される皮膚プリックテスト及び気管支誘因試験；Diamantらの文献「新規抗喘息療法の臨床開発において使用する方法(Methods used in clinical development of novel anti-asthma therapies)」 Respiratory Medicine (2008) 102, 332-338に開示される喘息研究；又はBootらの文献「鼻一酸化窒素：アレルギー性鼻炎患者の長期再現性及び鼻アレルギー問題の影響(Nasal Nitric oxide: longitudinal reproducibility and the effects of a nasal allergen challenge in patients with allergic rhinitis)」 Allergy 2007:62:378-384などの周知の臨床研究を用いる、ヒトにおける化合物の有効性。
(C. 癌)
本発明の方法の範囲内で用いられる単離ペプチドは、公知技術の又は本明細書中に記載された様々なアッセイを用いて、インビトロ又はインビボで、腫瘍細胞増殖、細胞形質転換、及び腫瘍形成を阻害することを示すことができる。このようなアッセイは、癌細胞系又は患者からの細胞を使用することができる。周知技術の多くのアッセイは、このような生存及び/又は増加を評価するために用いることができる；例えば、細胞増殖は、3H-チミジン取り込みを測定することによって、直接細胞数を数えることによって、プロトオンコジーン(例えば、fos、myc)又は細胞周期標識(Rb、cdc2、サイクリンA、D1、D2、D3又はE)などの公知の遺伝子の転写、翻訳又は活性の変化を検出することによって、評価することができる。このようなタンパク質及びmRNA及び活性のレベルは、周知技術の任意の方法により測定することができる。例えば、タンパク質は、市販の抗体を用いて、ウエスタンブロッティング又は免疫沈降などの公知の免疫診断方法によって、定量化することができる(例えば、多くの細胞周期標識抗体は、Santa Cruz, Inc.から提供されている。)。mRNAは、技術的に周知かつルーチン的な方法によって、例えば、ノーザン分析、RNアーゼ保護、逆転写に関連したポリメラーゼ連鎖反応などによって、定量化することができる。細胞生存度は、公知技術のトリパンブルー染色又は他の細胞死若しくは生存度標識を用いて評価することができる。分化は、形態学的変化などに基づいて、視覚的に評価することができる。
本発明は、制限されないが以下を含む、公知技術の様々な技術による、細胞周期及び細胞増殖分析を提供する：
一つの例として、ブロモデオキシウリジン(「BRDU」)組み込みは、増殖細胞を同定するための分析として使用することができる。BRDUアッセイは、新しく合成されたDNAへのBRDUの組み込みによって、DNA合成を行う細胞集団を同定する。その後、新しく合成されたDNAを、抗BRDU抗体を用いて検出することができる(Hoshinoらの文献, 1986, Int. J. Cancer 38, 369; Campanaらの文献, 1988, J. Immunol. Meth. 107, 79を参照されたい。)。
細胞増殖は、(3H)-チミジン取り込みを用いて検討することもできる(例えば、Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395 403; Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367 73を参照されたい。)。このアッセイは、S期DNA合成の定量的特徴付けを考慮する。このアッセイにおいて、DNAを合成する細胞は、3H-チミジンを新しく合成されたDNAに取り込むであろう。その後、取り込みを、シンチレーションカウンター(例えば、Beckman LS 3800 Liquid Scintillation Counter)において放射性同位体を計数するなどの標準技術によって測定することができる。
増殖性細胞核抗原(PCNA)の検出を、細胞増殖を測定するために用いることもできる。PCNAは36キロダルトンのタンパク質であり、その発現は増殖細胞において、特に、細胞周期のG1初期及びS期において上昇し、従って、増殖細胞の標識として役立ち得る。陽性細胞は、抗PCNA抗体を用いて免疫染色することにより同定される(Liらの文献, 1996, Curr. Biol. 6:189 199; Vassilevらの文献, 1995, J Cell Sci. 108: 1205 15を参照されたい。)。
細胞増殖は、時間とともに、細胞集団のサンプルを計数することにより(例えば、1日の細胞数)、測定することができる。細胞は、血球計及び光学顕微鏡(例えば、HyLite血球計、Hausser Scientific)を用いて計数することができる。細胞数は、対象の集団の成長曲線を得るために、時間に対してプロットすることができる。好ましい実施態様において、この方法により計数される細胞は、生細胞が色素を排除し、細胞集団の生存可能なメンバーとして計数されるように、色素トリパンブルー(Sigma)で最初に混合される。
例えば、DNA含有量及び/又は細胞の分裂指数を、例えば、細胞のDNA倍数値に基づいて、測定することができる。例えば、細胞周期のGl期の細胞は、一般に、2N DNA倍数値を含む。DNAは複製されたが、細胞分裂を経て進行しなかった細胞(例えば、S期の細胞)は、2Nよりも高い倍数値、及び最大4N DNA含有量を示すであろう。倍数値及び細胞周期速度論は、ヨウ化プロピジウムアッセイ(例えば、Turner, T.らの文献, 1998, Prostate 34:175 81)を用いて、更に測定することができる。あるいは、DNA倍数は、コンピューター制御されたマイクロデンシトメトリー染色システムにおけるDNAフォイルゲン染色(それは、化学量論的様式でDNAと結合する)の定量化によって測定することができる(例えば、Bacus, S., 1989, Am. J. Pathol. 135:783 92を参照されたい。)。別の実施態様において、DNA含有量は、染色体スプレッドの調製により分析することができる(Zabalou, S., 1994, Hereditas. 120:127 40; Pardue, 1994, Meth. Cell Biol. 44:333 351)。
細胞周期タンパク質の発現(例えば、CycA、CycB、CycE、CycD、cdc2、Cdk4/6、Rb、p21又はp27)は、細胞又は細胞の集団の増殖状態に関する重要な情報を提供する。例えば、抗増殖情報伝達経路の同定は、p21cip1の誘導により示すことができる。細胞におけるp21発現の増加したレベルは、細胞周期のGlへの遅れた参加を生じる(Harperらの文献, 1993, Cell 75:805 816; Liらの文献, 1996, Curr. Biol 6:189 199)。p21誘導は、商業的に利用可能な特異的抗p21抗体(例えば、Santa Cruz, Inc.提供)を用いて免疫染色されることによって、同定することができる。同様に、細胞周期タンパク質は、市販の抗体を用いて、ウエスタンブロット分析により検討されることができる。別の実施態様において、細胞集団は、細胞周期タンパク質の検出の前に同期化される。また、細胞周期タンパク質は、対象のタンパク質に対して抗体を用いて、FACS(蛍光細胞分析分離装置)分析により検出することもできる。
細胞周期の長さの変化の検出又は細胞周期の速度は、本発明のペプチドによる細胞増殖の抑制を測定するために用いることもできる。一実施態様において、細胞周期の長さは、細胞の集団の倍加時間で測定される(例えば、本発明の一つ以上のペプチドと接触又は非接触の細胞を用いる)。別の実施態様において、FACS分析は、細胞周期進行期、又はG1、S及びG2/M部分を除いて分析するように使用される(例えば、Delia, D.らの文献, 1997, Oncogene 14:2137 47を参照されたい。)。
細胞周期チェックポイントの経過、及び/又は細胞周期チェックポイントの誘導は、本明細書中に記載されている方法によって、又は公知技術の任意の方法によって、試験することができる。限定されるものではないが、細胞周期チェックポイントは、特定の細胞事象が特定の命令で生じることを確実にする仕組みである。チェックポイント遺伝子は、後の事象が初期の事象の終了前に生じる突然変異により定義される(Weinert, T.及びHartwell, L., 1993, Genetics, 134:63 80)。細胞周期チェックポイント遺伝子の誘導又は抑制は、例えば、ウエスタンブロット分析又は免疫染色などによって、評価することができる。細胞周期チェックポイントの経過は、特定の事象が生じることなく、該チェックポイントを経る細胞の進行によりさらに評価することができる(例えば、ゲノムDNAの完全な複製なく、細胞分裂の進行)。
特定の細胞周期タンパク質の発現の影響に加えて、細胞周期に関係するタンパク質の活性及び翻訳後修飾は、細胞の制御及び増殖状態において統合された役割を果たすことができる。本発明は、公知技術の任意の方法によって、検出された翻訳後修飾(例えば、リン酸化)に関係するアッセイを提供する。例えば、リン酸化されたチロシン残基を検出する抗体は市販されており、ウエスタンブロット分析に用いて、このような修飾を伴うタンパク質を検出することができる。別の例において、ミリスチル化などの修飾は、薄層クロマトグラフィ又は逆相h.p.l.cにおいて検出することができる(例えば、Glover, C, 1988, Biochem. J. 250:485 91; Paige, L., 1988, Biochem J; 250:485 91を参照されたい。)。
情報伝達及び細胞周期タンパク質及び/又はタンパク質複合体の活性は、多くの場合、キナーゼ活性により媒介される。本発明は、ヒストンH1アッセイなどのアッセイによる、キナーゼ活性の分析を提供する(例えば、Delia, D.らの文献, 1997, Oncogene 14:213747を参照されたい。)。
また、本発明の方法の範囲内で使用されるペプチドは、周知技術の方法を用いて、インビトロで、培養細胞の細胞増殖を変更することを示すことができる。細胞培養モデルの具体例は、制限されないが、以下を含む：肺癌に関して、始原ラット肺腫瘍細胞(Swaffordらの文献, 1997, Mol Cell Biol, 17:1366 1374)及び大細胞未分化癌細胞系(Mabryらの文献, 1991, Cancer Cells, 3:53 58)；大腸癌のための結腸直腸細胞系(Park及びGazdar, 1996, J Cell Biochem. Suppl. 24:131 141)；乳癌のための複数の樹立細胞系(Hamblyらの文献, 1997, Breast Cancer Res. Treat. 43:247 258; Gierthyらの文献, 1997, Chemosphere 34:1495 1505; Prasad及びChurch, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:14 19)；前立腺癌のための多くの特徴付けされた細胞モデル(Webberらの文献, 1996, Prostate, Part 1, 29:386 394; Part 2, 30:58 64; 及びPart 3, 30:136 142; Boulikas, 1997, Anticancer Res. 17:1471 1505)；尿生殖器癌に関して、持続的ヒト膀胱癌細胞系(Ribeiroらの文献, 1997, Int. J. Radiat. Biol. 72:1 1 20)；移行上皮癌の器官培養物(Boothらの文献, 1997, Lab Invest. 76:843 857)、及びラット進行モデル(Vetらの文献, 1997, Biochim. Biophys Acta 1360:39 44)；及び白血病及びリンパ腫のための確立した細胞系(Drexler, 1994, Leuk. Res. 18:919 927, Tohyama, 1997, Int. J. Hematol 65:309 317)。
また、本発明のペプチドは、インビトロで細胞形質転換(又は悪性表現型に対する進行)を抑制することを示すことができる。この実施態様において、形質転換された細胞表現型を有する細胞を、本発明の一つ以上のペプチドと接触させ、形質転換された表現型に関連する特徴(インビボ腫瘍形成能に関連した一連のインビトロ特徴)の変化、例えば、制限されないが、軟寒天培地のコロニー形成、より丸い細胞形態、よりゆるい基層接着、接触抑制の損失、足場依存の損失、プラスミノーゲン活性化因子などのプロテアーゼの放出、糖輸送の増加、血清必要量の減少、又は胎児性抗原の発現などについて試験する(Luriaらの文献, 1978, General Virology, 3d Ed., John Wiley & Sons, New York, pp. 436446を参照されたい。)。
侵襲性の損失又は接着の減少は、本発明の方法で使用されるペプチドの抗癌作用を示すために用いることもできる。例えば、転移性癌の形成の重大な局面は、疾患の始原部位から分離し、二次部位で成長する新規コロニーを構築する前癌細胞又は癌細胞の能力である。周辺部位に侵入する細胞の能力は、癌状態の可能性を反映する。侵襲性の損失は、例えば、Eカドヘリンにより媒介される細胞-細胞接着の誘導を含む、公知技術の様々な技術により測定することができる。このようなEカドヘリン媒介接着は、表現型復帰及び侵襲性の損失を生じ得る(Hordijkらの文献, 1997, Science 278:1464 66)。
侵襲性の損失は、細胞移動の抑制によって、更に検査することができる。様々な二次元及び三次元細胞マトリックスは、商業的に入手可能である(Calbiochem-Novabiochem Corp. San Diego, Calif.)。マトリックスを横切る又はマトリックス内への細胞移動は、顕微鏡、時間経過フォトグラフィー、又はビデオグラフィーによって、又は細胞移動の測定が可能な技術における任意の方法により検査することができる。関連した実施態様において、侵襲性の損失は、肝細胞増殖因子(HGF)への応答により検査される。HGFにより誘発された細胞分散は、メイディン-ダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞などの、細胞の侵襲性と関係している。このアッセイは、HGFに応答して細胞の分散活性を損失した細胞集団を同定する(Hordijkらの文献, 1997, Science 278:1464 66)。
あるいは、侵襲性の損失は、ケモタキシスチャンバー(Neuroprobe/Precision Biochemicals Inc. Vancouver, BC)を介して、細胞移動により測定することができる。このようなアッセイにおいて、化学誘引剤は、チャンバー(例えば、下部チャンバー)の片側においてインキュベートされ、細胞は、反対側(例えば、上部チャンバー)を分離しているフィルターに播種される。細胞が上部チャンバーから下部チャンバーへと通過するために、該細胞はフィルターの小さい孔を通って能動的に移動しなければならない。その後、移動した細胞数のチェッカーボード分析(Checkerboard analysis)は、侵襲性と関係し得る(例えば、Ohnishi, T., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 193:518 25を参照されたい。)。
本発明の方法で使用されるペプチドは、インビボにおいて、腫瘍形成を阻害することを示すこともできる。高増殖性障害の膨大な数の動物モデルは、腫瘍形成及び転移拡散など、当該技術分野において公知である(「新生組織形成の原理(Principles of Neoplasia)」, Harrison's Principles of Internal Medicine, 第13版, Isselbacherら, 編集, McGraw-Hill, N.Y., p. 1814の表317-1、チャプター317、及びLovejoyらの文献, 1997, J. Pathol. 181 :130 135を参照されたい。)。具体例は、以下を含む：肺癌に関して、ラットへの腫瘍根粒の移植(Wangらの文献, 1997, Ann. Thorac. Surg. 64:216 219)、又はNK細胞の減少したSCIDマウスの肺癌転移の確立(Yono及びSone, 1997, Gan To Kagaku Ryoho 24:489 494)；大腸癌に関して、ヌードマウスへのヒト大腸癌細胞の大腸癌移植(Gutman及びFidler, 1995, World J. Surg. 19:226 234)、ヒト潰瘍性大腸炎のワタボウシタマリンモデル(Warren, 1996, Aliment. Pharmacol Ther. 10 Supp 12:45 47)、及び腺腫ポリポーシス腫瘍サプレッサーの突然変異を有するマウスモデル(Polakis, 1997, Biochim. Biophys. Acta 1332:F127 F147)；乳癌に関して、乳癌のトランスジェニックモデル(Dankort及びMuller, 1996, Cancer Treat. Res. 83:71 88; Amundadittirらの文献, 1996, Breast Cancer Res. Treat. 39:119 135)、及びラットにおける腫瘍の化学誘導(Russo及びRusso, 1996, Breast Cancer Res. Treat. 39:7-20)；前立腺癌に関して、化学誘発及びトランスジェニック齧歯目モデル及びヒト異種移植モデル(Royaiらの文献, 1996, Semin. Oncol. 23:35 40)；尿生殖器癌に関して、ラット及びマウスにおける誘発された膀胱新生物(Oyasu, 1995, Food Chem. Toxicol 33:747 755)、及びヌードラットへのヒト移行上皮癌の異種移植(Jarrettらの文献, 1995, J . Endourol. 9:1 7)；及び血液癌に関して、動物における移植された同種異系髄(Appelbaum, 1997, Leukemia 11 (Suppl. 4):S15 S17)。さらに、制限されないが以下を含む、多くの種類の癌に適用できる一般的動物モデルが開示されている：p53不足マウスモデル(Donehower, 1996, Semin. Cancer Biol. 7:269 278)、Minマウス(Shoemakerらの文献, 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332:F25 F48)、及びラットの腫瘍に対する免疫応答(Frey, 1997, Methods, 12:173 188)。
例えば、本発明の方法で使用されるペプチドを、試験動物、一実施態様において、ある種の腫瘍を発症しやすくした試験動物に投与し、その後、本発明のペプチドを投与していない動物と比較して、腫瘍形成の減少した発生率について検査することができる。あるいは、本発明のペプチドを、腫瘍を有する試験動物(例えば、悪性、新生物、又は形質転換された細胞の導入によって又は発癌物質の投与によって、腫瘍が誘発された動物)に投与し、続いて、本発明のペプチドを投与していない動物と比較して、腫瘍後退について該試験動物の腫瘍を検査することができる。
(8. 治療的使用)
(A. 身体の反応の媒介物の調整)
当業者は、本発明のペプチドが組織の損傷に関連した疾患又は障害に対して身体の反応の影響を調整するために用いることができると認識するであろう。特に、上記のペプチドが調整するために用いることができる媒介物の1つの例は、制限されないが以下を含む炎症性媒介物である：血漿誘導炎症性媒介物、例えば、ブラジキニン、C3、C5a、Factor XII、膜攻撃複合体、ハーゲマン因子、プラスミン、トロンビン、リンホカイン(マクロファージ活性化因子(MAF)、マクロファージ遊走阻止因子(MMIF)、マクロファージ走化因子(MCF)、白血球遊走阻止因子(LMIF)、ヒスタミン放出因子(HRF)、及びトランスファーファクタ(TF)など；インターロイキン(IL-I、IL-2、IL-3、IL-4... IL-15)；腫瘍壊死因子(TNF-α(カケクチン)、TNF-β(リンフォトキシン))；インターフェロン(IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IFN-τ)；コロニー刺激因子(顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、及び複数コロニー刺激因子(IL-3))；ポリペプチド成長因子(酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、上皮成長因子(EGF)；神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、及び血管内皮成長因子(VEGF))；トランスフォーミング成長因子(TGF-α及びTGF-β)、α-ケモカイン(IL-8、好中球活性化タンパク質2(NAP-2)、血小板因子-4(PF-4)、及びβ-トロンボグロブリン(βTG))；β-ケモカイン(単球化学誘引物質タンパク質-1(MCP-1)、MCP-3、MIP-1α、マクロファージ炎症性タンパク質1β(MIP-1β)、正常なT細胞が発現した活性化に応じて調整されて分泌されるケモカイン(RANTES))、及びストレスタンパク質(熱ショックタンパク質(HSP)、グルコース関連タンパク質(GSP)、ユビキチン及びスーパーオキシドジスムターゼ(Mn))、白血病阻害因子(LIF)、オンコスタチン(OSM)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、血小板塩基性タンパク質(PBP)、リソソーム顆粒、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエンB4、一酸化窒素及び/又はプロスタグランジン。好ましい実施態様において、ペプチドは、媒介物の活性を阻害し又は抑制し、より好ましくはTNF-α、ヒスタミン、一酸化窒素及びインターロイキンの活性を阻害する。最も好ましくは、ペプチドは、2以上の炎症性媒介物の活性を阻害する。
(B. 様々な疾患、障害、及び状態の治療又は予防)
本発明の組織防護物ペプチド及びペプチド類似体は、様々な疾患、障害及び状態の予防又は治療のための治療薬としても有用である。当業者は、このようなペプチド及びペプチド類似体が、組織保護レセプター複合体、例えば、組織保護サイトカイン複合体の調整を達成するために用いることができることも認識するであろう。例えば、上記の開示される本発明のアッセイにより同定される化合物の治療的適用を評価するために用いることができるインビトロ及びインビボ技術の双方は、PCT出願番号PCT/US01/49479、米国特許出願番号第10/188,905号及び第10/185,841号において、開示されている。
上述した本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、主に神経学的又は精神医学的な症状、眼の疾患、心血管疾患、心肺疾患、呼吸器疾患、腎臓、尿及び生殖疾患、骨疾患、皮膚疾患、結合組織疾患、胃腸疾患及び内分泌及び代謝異常を有する中枢神経系又は末梢神経系のヒト疾患又は障害の予防、治療的処置又は予防的処置に一般に役立ち得る。使用の例を挙げると、制限されないが、外傷から生じる損傷、及び脳(虚血性脳卒中、鈍的外傷、くも膜下出血)、脊髄(虚血、鈍器殴傷)、末梢神経(座骨神経損傷、糖尿病性ニューロパチー、手根管症候群)、網膜(黄斑水腫、糖尿病性網膜症、緑内障)、及び心臓(心筋梗塞症、慢性心不全)への炎症を生じる損傷に対する保護及びそれらの修復がある。特に、このような疾患、障害及び状態は、応答性組織、例えば、制限されないが、第4.2節(xiii)の上記のもの、又はそれらの応答性細胞組織又は器官、適当な1型サイトカインレセプターを発現するもの、例えば、EPO-Rレセプター、又は組織保護レセプター複合体を含む興奮組織などに悪影響を与える、低酸素状態を含む。従って、本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、様々な状態及び状況の低酸素状態から生じる応答性組織へのダメージを治療又は予防するために用いることができる。このような状態及び状況の非限定的な例は、本明細書中に下記の表に提供される。
組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、幹細胞活性の調整においても興味深い。組織保護活性(例えば、EPO)を示すサイトカインが、損傷の領域への移動を刺激し、かつ修復プロセス、例えば、再生役割を補助して、幹細胞を起動させることができることが確認されている。例えば、実験的な脳卒中において、EPOは、虚血性傷害の領域への神経芽細胞の移動を媒介し、回復時期の間に、神経単位を再生する(Tsaiらの文献, J. Neurosci (2006) 26:1269-74)。別の例として、EPO及びカルバミル化EPO(CEPO)は、骨髄から血液循環へと、内皮原種細胞を起動させる。その後、これらの細胞は、距離領域が存在し、かつ新しい血管の形成に関与する(EPOの効果に関して、Bahlmannらの文献, 2003, Kidney Int. 64:1648-1652を参照されたい。)。任意の特定の理論に縛られていることを望まないが、本明細書中に開示される単離ペプチド及びペプチド類似体は、幹細胞の移動において、類似の影響を及ぼすと考えられている。
本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を用いて治療可能及び予防可能なニューロン組織病状の保護の例において、このような病状は、ニューロン組織の減少した酸素化から生じるものを含む。ストレス、ダメージ、及び最終的にニューロン細胞死を生じる、ニューロン組織への酸素の有効性を低下させる任意の状態は、本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を用いて治療することができる。低酸素症及び/又は虚血と一般に呼ばれる、これらの状態は、制限されないが、以下から生じる：脳卒中、血管閉塞、出生前又は出産後の酸素欠乏、窒息、チョーキング、溺水、一酸化炭素ガス中毒、煙吸入、手術及び放射線療法を含む外傷、窒息、癲癇、低血糖、慢性閉塞性肺疾患、気腫、成人呼吸窮迫症候群、低血圧ショック、感染性ショック、アナフィラキシーショック、インスリンショック、鎌状赤血球発症、心停止、律動不整、窒素麻酔、低酸素血症低酸素症(高所病、高地肺水腫、高地脳浮腫、睡眠無呼吸、呼吸低下、呼吸停止、シャント)、メタエモグロビン血症(methaemoglobinaemia)、組織毒性低酸素症、子宮内低酸素症、及び心肺バイパス手術手順により生じる神経学的欠損。
一実施態様において、例えば、上記のアッセイを用いて同定された本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、損傷、又は損傷の危険から生じる組織の損傷、又は外科手術又は医学的手技の前、間若しくは後の組織の損傷を予防する組成物を単独で又はその一部として投与されることができる。例えば、外科手術は、腫瘍切除又は動脈瘤修復を含むことができ、医学的手技は、分娩又は出産を含むことができる。本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を用いて治療可能である低血糖から引き起こされ又は生じる他の病状は、医原性高インスリン血症とも呼ばれるインシュリン過量、インスリノーマ、成長ホルモン欠乏、低コルチソリズム、薬剤過量、及び特定の腫瘍を含む。
興奮性ニューロン組織の損傷から生じる他の病状は、癲癇、痙攣又は慢性発作疾患などの発作疾患を含む。他の治療可能な状態及び疾患は、脳卒中、多発性硬化症、低血圧、心停止、慢性心不全、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性麻痺、脳又は脊髄外傷、エイズ痴呆、認識機能の年齢関連性の損失、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、発作疾患、アルコール中毒、網膜虚血、緑内障から生じている視束損傷及びニューロン損失などの疾患を含むが、これらに限定されない。
本発明の特定の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、物理的又は化学的に誘発された炎症などの、疾患状態又は様々な外傷から生じる炎症を治療又は予防するために用いることができる。組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、制限されないが、脳、脊髄、結合組織、心臓、肺、腎臓及び尿路、膵臓、目及び前立腺を含む一つ以上の器官又は組織の炎症性状態の治療及び予防についても意図される。このような外傷の非限定的な例は、第4.2節(xvi)にリストされるものを含むが、これらに限定されない。さらに、組織保護ペプチドは、以下を含む虚血性及び非虚血性状態から生じる炎症を治療又は予防するために用いることができる：制限されないが、アレルギー、アレルギー疾患、アレルギー性症状、リウマチ性疾患、スポーツ関連の損傷、毒剤への曝露、ウィルス、真菌及び細菌などの感染症、このような状態の更なる例は、第4.2節(iv)、(v)及び(xvi)において上記に開示される。炎症は、急性又は慢性であってもよい。さらに、炎症の分野における応用は、2004年9月29日に出願されたPCT/US2004/031789で強調され、WO 2005/032467として公表されている。
本発明の特定の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、ミエリン鞘の脱髄又は障害から生じる中枢神経及び末梢性神経系疾患を治療するために用いることができる。これらの疾患は、ロイコジストロフィーなどのミエリン形成欠乏性疾患、及び明らかな原因による疾患を除いて、原因不明の炎症性ミエリン鞘病変に主に関与するように定義される。多発性硬化症(MS)は、脱髄性疾患の中の典型的疾患であり、病理学的に、変化、主に炎症性脱髄及びグリオーシスによって特徴付けされる。その病因が未知であるので、その診断は、その臨床特徴、すなわち、中枢神経系病変の時間に渡って空間多様性及び多様性に基づいて行われる。さらに、急性播種性脳脊髄炎(ADEM)、炎症性拡散硬化症、急性及び亜急性壊死性出血性脳脊髄炎、及び横断性脊髄炎は、脱髄性疾患に含まれる。また、末梢神経組織は、ミエリン鞘を維持するためにシュワン細胞に依存し、これらの細胞が損なわれる場合、脱髄性疾患が生じる。
本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、以下を含む心臓及び/又は関連組織(例えば、心膜、大動脈及び他の関連する血管)を伴う任意の慢性又は急性病理学的事象などの心臓の状態及び心臓へのダメージを治療又は予防するために用いることができる：虚血-再灌流損傷；鬱血性心不全；心停止；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化症、僧帽弁漏出、心房粗動、薬剤(例えば、ドキソルビシン、ハーセプチン、チオリダジン及びシサプリド)などの化合物によって生じる心毒性；寄生性感染症(細菌、菌類、リケッチア及びウイルス、例えば、梅毒、慢性クルーズトリパノソーマ感染症)による心臓損傷；急速に進行する心臓アミロイド症；心臓手術；心臓移植；血管形成術、腹腔鏡手術、外傷性心臓損傷(例えば、鋭的又は鈍的心損傷、及び大動脈弁破裂)、胸部の大動脈瘤の外科的修復；副腎大動脈瘤；心筋梗塞又は心不全による心臓性ショック；神経性ショック及びアナフィラキシー。本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、心不全(すなわち、心臓が、新陳代謝する組織によって必要とされる速度で血液を汲み出すことができない場合、又は心臓が、高い充填圧力だけによって振舞う場合)などの心臓疾患の危険があるそれらの個人を治療するために用いることもできる。そのような危険がある患者は、心筋梗塞、冠状動脈疾患、心筋炎、化学療法、心筋症、高血圧症、心臓弁膜症(多くの場合、僧帽弁閉鎖不全及び大動脈弁狭窄)、及び毒素により誘発された心筋症(例えばエタノール、コカインなど)の危険を有する又は危険となる患者を含むであろう。
本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、目(例えば、網膜組織)の状態及び目へのダメージを治療又は予防するために用いることができる。このような障害は、網膜虚血、黄斑変性、網膜剥離、色素性網膜炎、動脈硬化症網膜症、高血圧の網膜症、網膜動脈妨害物、網膜静脈妨害物、網膜水腫、低血圧及び糖尿病性網膜症を含むが、これらに限定されない。
別の実施態様において、本発明及び本発明の原理の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、毒剤への曝露から生じる損傷(すなわち、応答する組織への放射線又は化学的損傷)を予防又は治療するために用いることができる。本発明の一実施態様において、上記ペプチドは、毒剤への身体の反応の媒介物を調整する、好ましくは、このような媒介物の活性を抑制又は阻害する、治療薬として有用である。さらに、上記ペプチドは、毒剤への曝露のダメージ、影響又は症状の治療、予防、改善又は管理のための治療薬として有用である。該ペプチドは、生物、化学又は放射線剤を含む様々な毒剤への曝露を治療するために用いることができる。
これらのペプチドは、プリオン、ウイルス、微生物(細菌及び菌類)、及び一部の単細胞及び多細胞真核生物(すなわち、寄生虫)などの生物剤によるダメージ、、影響又は症状を治療するために用いることができる。第4.2節(viii)において上記のそれらの生物学的毒素を含むが、これらに限定されない。更に、本発明のペプチドは、化学薬品によるダメージ、影響又は症状を予防、治療、改善又は管理するために用いることができる。このような薬剤は、血液剤、糜爛剤、神経剤、肺剤及び無能力化剤を含むが、これらに限定されない。さらに、本発明のペプチドは、制限されないが、第4.2節(x)にリストされるものを含む化成物への毒性曝露によるダメージ、影響又は症状を予防、治療、改善又は管理するために用いることができる。放射線剤への暴露によるダメージ、影響又は症状は、本発明のペプチドを用いて予防可能、治療可能、又は管理可能である。該ペプチドは、アルファ、ベータ、又はガンマ放射線を含み、好ましくは以下を含む放射線剤によるダメージ、影響又は症状を予防、治療、改善、又は管理することができる：制限されないが、137Cs、60Co、241Am、252Cf、192Ir、238Pu、90Sr、226Ra、91Sr、92Sr、95Zr、99Mo、106Ru、131Sb、132Te、139Te、140Ba、141La、144Ce、233U、235U、238U、228P、229P、230P、231P、232P、233P、234P、235P、236P、237P、238P、239P、240P、241P、242P、243P、244P、245P、246P、247P、及び131I。さらに、当業者は、これらの毒剤の累積的又は相乗的使用(すなわち、犠牲者が生物剤により影響されくなるように生物剤を分散させる前の放射性剤の使用、犠牲者が避難又は援助を事実上求めることができないように神経ガスと組み合わせて発疱薬を投与すること、治癒方法などを阻害又は複雑にするために生物剤又は放射性剤で弾丸又は破片を汚染することなど)によるダメージ、影響又は症状を予防、媒介、治療、又は改善するために使用することができることを認識するであろう。好ましくは、本発明のペプチドは、幾つかの異なる型の細胞、器官又は組織、例えば、2以上の下記の中枢神経、末梢神経、眼、心血管、心肺、呼吸、腎臓、泌尿器、生殖器、筋骨格、皮膚、結合組織、胃腸、血液生成、内分泌、及び代謝において、毒性作用を治療、媒介、改善又は予防することができる。更に、本発明のペプチドは、同じクラスの2以上の毒剤(すなわち、化学剤、生物剤又は放射性剤の2以上の種類に対する ― 例えば、発疱薬及び神経剤に対する予防)、又は異なるクラスの毒剤(すなわち、放射性剤及び化学薬品への暴露に対する治療薬)に対する治療薬又は予防薬として有効である。組織保護ペプチド及びペプチド類似体の更なる有用性は、以下などの中毒の治療である：放射線曝露の化学療法剤の結果として、ニューロトキシン中毒(例えば、ドウモイ酸貝毒)、毒素(エタノール、コカイン、その他)；神経ラチリズム；グアム病；筋萎縮性側索硬化症；及びパーキンソン病。
上記したように、本発明は、上記の組織保護ペプチドの末梢投与によって、哺乳動物の応答性細胞、組織及び器官の組織機能の強化に使用するための、本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を提供する。様々な疾患及び状態は、この方法を使用する治療に従う。例えば、この方法は、任意の状態又は疾患のない場合でさえ、認知機能の増加を生じる興奮組織の機能を強化することに役立つ。更に、組織保護サイトカインは、損傷治癒の質を改善し、治癒に必要な時間を減らし、治癒された組織の質を改善し、かつ損傷から生じる接着の発生率を低下させることに役立つ。2004年9月29日に出願され、WO 2005/032467として公開されたのPCT/US2004/031789を参照されたい。更に、本発明の組織保護ペプチドは、疱疹又は発疱薬又は化成物などの化学薬品により誘導される皮膚上の病変又は呼吸経路に沿った病変を治療、予防又は管理するのに役立ち得る。
本発明のペプチドのこれらの使用は、以下にさらに詳細に記載され、ヒト及び非ヒト哺乳動物、双方の学習及び訓練の強化を含む。
別の実施態様において、本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、中枢神経系、末梢神経系、胃腸/消化系、尿生殖器系、副腎、婦人科学的、頭頸部、血液学的/血液、筋骨格/柔組織、呼吸器及び胸部の様々な癌又は腫瘍性障害の予防、治療的処置、予防的処置又は管理に一般に役立ち得る。使用の例を挙げると、制限されないが、第4.2節(ix)及び(xxv)にリストされる癌又は腫瘍性障害から生じる損傷に対する予防及びそれらの修復がある。更に、本発明のペプチドは、制限されないが、第4.2節(xxviii)の上記のリストされたものを含む、新生物又は癌に関連した様々な症候群の予防、治療的処置、予防的処置又は管理のために使用することができる。該ペプチドは、上記の症候群に対処するために、本発明の方法に従って使用することができる。例えば、該ペプチドは、Li Fraumeni、遺伝非ポリポーシス結腸直腸癌、家族性大腸ポリープ症、及びフォンヒッペルリンドウ病などの遺伝症候群を、該疾患の新生物態様の発症の遅延、、該症候群に関連した新生物腫瘍の数の減少、又は一般にこれらの状態に悩むそれらの患者の生活の質又は寿命を向上させることにより、対処するために投与することができる。また、該ペプチドは、脊髄形成異常症候群又は傾眠症候群を関連したアンドロゲン剥奪症候群療法などの、腫瘍性障害又は癌の特定の治療、化学療法又は放射線療法に関連した症候群を、症候群を予防する又は症候群の重症度を減らすことを希望して、対処するために予防的に投与することができる。
更に、該ペプチドは、悪液質及び悪液質に関連した疾患を治療又は予防するために用いることができる。このような疾患は、癌悪液質、摂食障害、無力症、貧血、結核、エイズ、鬱血性心不全、腎不全、肝不全、慢性閉塞性肺疾患、気腫、筋収縮症、糖尿病及びエンドトキシン血症を含むが、これらに限定されない。
本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を用いて治療可能又は予防可能な状態及び疾患は、制限されないが、気分障害、不安障害、うつ病、自閉症、注意欠陥多動障害及び認知機能障害を含む中枢神経系を提供する。これらの状態は、ニューロン機能の強化から利益を得る。本発明の教示によって治療可能な他の障害は、睡眠障害、例えば、睡眠無呼吸及び移動関連の障害；くも膜下及び動脈瘤ブリード、低血圧ショック、震盪性損傷、感染性ショック、アナフィラキシーショック及び様々な脳炎及び髄膜炎の後遺症、例えば、ループスなどの結合組織疾患関連脳炎を含む。他の使用は、以下を含む：ドウモイ酸貝毒、神経ラチリズム及びグアム病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病などのニューロトキシンによる中毒の予防又はそれからの保護；塞栓又は虚血性損傷のための術後治療；全脳照射；鎌状赤血球危機；及び子癇。
本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を用いて治療可能又は予防可能な状態の更なるグループは、ニューロン損傷及び死により代表される様々な神経系疾患の原因である、遺伝又は後天的のミトコンドリア機能不全を含む。例えば、リー病(亜急性壊死性脳症)は、ニューロン脱落及びミオパシーによる、進行性視力喪失及び脳症によって特徴付けされる。これらの場合において、不完全なミトコンドリア代謝は、興奮細胞の代謝を刺激するのに十分な高エネルギー基質を供給することができない。組織保護ペプチド又はペプチド類似体は、様々なミトコンドリア疾患における機能不足を最適化する。上記したように、低酸素状態は、興奮組織に悪影響を与える。興奮組織は、以下を含むが、これらに限定されない：末梢神経系(耳及び網膜)及び中枢神経系(脳及び脊髄)の組織などのニューロン組織；心臓及び関連する神経の細胞などの心血管組織；及び細胞間ギャップジャンクションとともにT-型カルシウムチャネルがインシュリンの分泌に参加する膵臓などの腺組織。興奮組織の典型的なリストは、神経、骨格筋、平滑筋、心筋、子宮、中枢神経系、脊髄、脳、網膜、嗅覚系及び聴覚系を含む器官及び組織を含むが、これらに限定されない。上記の状態に加えて、本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、一酸化炭素及び煙吸入、重度の喘息、成人呼吸窮迫症候群及びチョーキング及び溺水などの吸入中毒の治療に役立つ。低酸素状態を引き起こすか又は他の手段によって興奮組織の損傷などの応答性組織を誘導する更なる状態は、インシュリンの不適当な投与、又はインシュリン産生性新生物(インスリノーマ)で生じ得る低血糖を含む。
興奮組織の損傷から生じると記載される様々な神経心理学的障害は、本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を用いて治療可能である。ニューロン損傷を伴い、本発明による治療又は予防可能性な慢性的障害は、以下を含む：中枢神経系及び/又は末梢神経系に関する障害、例えば、認知機能の年齢関連的損失及び老人性痴呆症など、慢性発作疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、結節状硬化症、ウィルソン病、脳性及び進行性核上麻痺、グアム病、レヴィー小体痴呆、プリオン疾患、例えば、クロイツフェルト-ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、筋強直性ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症及び他の運動失調症、並びに、ジルドラトゥーレット症候群、癲癇及び慢性発作疾患などの発作疾患、脳卒中、脳又は脊髄外傷、エイズ痴呆、アルコール中毒、自閉症、網膜虚血、緑内障、高血圧症及び睡眠障害などの自律機能障害、及び神経精神病学的障害、これは制限されないが、精神分裂病、分裂情動障害、注意欠陥障害、胸腺異常症、大きなうつ病性障害、躁病、強迫性障害、精神活性物質使用障害、不安、パニック障害、並びに単極及び双極感情障害を含む。更なる神経精神病学的及び神経変性障害は、例えば、アメリカ精神医学会の精神疾患診断統計マニュアル(American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)(DSM)にリストされるものを含む。
本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を用いて治療可能又は予防可能な状態の更なる群は、腎不全、急性及び慢性などの腎臓病を含む。腎臓への血液供給は、血流(敗血症)を襲う感染症によるショック、内部又は外部の大量出血、重度の下痢又は熱傷の結果としての身体からの流体の損失、輸血に対する反応、心停止又はアリトミアス(arythmias)、外科的外傷及び腎移植などの幾つかの原因のために、中断され得る。上記の状態から生じる腎臓に対する血流低下は、急性腎不全の発症を引き起こすのに十分に大きな時間、危険な低レベルへと血流を低下させ得る。また、抑制された血流は、腎臓において、壊死又は組織死を生じ、腎尿細管細胞に損傷を与える。腎不全は、疾患(間質性及び糖尿病)ネフローゼ症候群、感染症、損傷(CPB誘発)、毒素(造影剤誘発、化学療法誘発、シクロスポリン)、自己免疫炎症(例えばループス、赤血球増加症など)からも生じ得る。本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、この損傷の修復又は予防に役立ち、急性腎不全を改善するのを助ける。更に、本発明のペプチドは、制限されないが、尿路感染症、過敏膀胱、及び膀胱に対する外傷又は放射線傷害などの尿路の疾患又は障害を治療、予防又は改善するために用いることができる。
以下の表は、上述した組織保護ペプチド及びペプチド類似体による治療に従う、様々な状態及び疾患に関して更なる典型的な非限定的な徴候を示す。
表１
保護組織ペプチド及びペプチド類似体による治療に従う疾患及び障害
Figure 0005542064
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上記したように、これらの疾患、障害又は状態は、本発明の組織保護ペプチド及びペプチド類似体により提供される利点の範囲を単に例示するだけである。したがって、本発明は、一般に、機械的外傷の結果の又はヒト疾患の予防的治療薬、又は予防的処置を提供する。CNS及び/又は末梢神経系の疾患、障害又は状態のための予防又は治療的若しくは予防的処置が、意図される。精神医学的な成分を有する疾患、障害又は状態のための予防又は治療的若しくは予防的処置を提供する。制限されないが、眼、心血管、心肺、呼吸器、腎臓、泌尿器、生殖器、胃腸、内分泌器、又は代謝成分を有するものを含む、疾患、障害又は状態のための予防又は治療的若しくは予防的処置を提供する。該ペプチドは、脳、脊髄、結合組織、皮膚、消化管、生殖器、肝臓、心臓、肺、腎臓、尿路、膵臓、目及び前立腺を含むがこれらに限定されない1つ以上好ましくは少なくとも2つの器官又は組織において、組織の損傷に関連した疾患又は障害、並びに、それらのダメージ、影響又は症状の予防、治療的処置、予防的処置、又は管理に有用であり得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、本発明のペプチド又は特定の指標のペプチドを除外できる。例えば、構造モチーフCに従うペプチドは、以下を含む、WO2006/119767及びWO2007/071248に開示される指標において、本発明の方法において除外され得る：術後神経の損傷；外傷性神経の損傷；脊髄損傷、神経繊維の障害性のミエリン形成；虚血後の損傷；脳卒中；パーキンソン病；アルツハイマー病；ハンチントン舞踏病；精神分裂病、痴呆；多発性硬化症、多発脳梗塞性認知症；糖尿病に関連した神経退化；神経-筋肉の退化、体内時計又は神経-筋肉接続に影響を及ぼす障害；臓器移植；遺伝的又は外傷性萎縮性筋肉疾患；性腺、膵臓、腎臓、心臓、肝臓及び腸の変性状態；糖尿病型I又はII型；ネフローゼ；精神病；神経病；人格障害；性的逸脱及び障害；精神障害；神経系及び感覚器の疾患；認識異常；中枢神経系の炎症性疾患；脳変性；短期又は長期記憶の刺激；錐体外路系疾患及び異常な運動障害；運動ニューロン疾患；脊髄の病気；自律神経系の障害、末梢神経系の疾患；ニューロパチー；目の多重構造に影響を及ぼす障害；耳及び乳様突起の疾患；新生児の器官及び軟部組織の異常；麻酔の投与又は分娩及び出産における他の鎮静状態の合併症；皮膚及びの病気損傷；神経及び脊髄の損傷；薬剤による中毒；医薬及び生物学的物質；代謝性障害；内分泌腺の障害；プリン及びピリミジン代謝の障害；骨疾患；新生物；癌；脳のウイルス感染；ギランバレー症候群；疼痛症候群；自閉症及び学習能力の刺激。また、例えば、構造モチーフDに従うペプチドは、以下を含む、米国特許第5,571,787号、第5,700,909号、第5,696,080号、第5,714,459号、第6,590,074号、第6559,124号、第6,271,196号、第6,268,347号及び第6,849,602号に開示される指標において、本発明の方法において除外され得る：神経腫(切断、神経処理)、神経圧迫(エントラップメントニューロパチー又は腫瘍圧迫)、神経外傷(クラッシュ、伸張又は不完全横断面)による神経障害疼痛；糖尿病；照射、虚血、脈管炎、ポリオ後症候群、アルコール、アミロイド、毒素、HIV、甲状腺機能低下症、尿毒症、ビタミン欠乏症、化学療法、ddC(ザルシタビン)、ファブリー病、圧迫(ディスク、腫瘍、瘢痕組織)、神経根引き抜き損傷、炎症(帯状疱疹後神経痛)、脊髄挫傷、脊髄腫瘍、脊髄片側切断、及び脳幹、視床又は皮質の梗塞、腫瘍又は外傷；及び多発性硬化症、急性播種性白血球脳炎、進行性多病巣性白血球脳炎、異染性白質萎縮症、及び副腎白質萎縮症などの脱髄疾患。別の例に関して、構造モチーフEに従うペプチドは、以下を含む、米国特許第7,259,146号及び米国特許公開番号20030130197号に開示される指標において、本発明の方法において除外され得る：急性神経変性障害；塞栓性閉塞及び血栓性閉塞などの脳虚血又は梗塞；急性虚血後の再灌流；周生期低酸素性虚血性傷害；心停止；頭蓋内出血；頭蓋内及び内部椎骨病変；及び打撲振動乳児症候群(whiplash shake infant syndrome)；慢性神経変性障害：アルツハイマー病、ピック病、広範性レヴィー小体疾患、進行性核上麻痺、多システム変性、慢性癲癇状態、運動ニューロン疾患、プリオン疾患、EPO欠乏、失血、腎不全、末期腎疾患、腎臓及び血液学的及び非血液学的悪性腫瘍/腫瘍を含む貧血に関連した他の疾患を含む、末梢性疾患に関連した神経学的及び精神医学的兆候、化学療法及びその他薬剤に関連した合併症、血液疾患、炎症性及び伝染性障害、慢性全身性自己免疫疾患、ヘノッホシェーライン紫斑病、容血性尿毒症症候群、神経系の化学的、毒性、伝染性、及び放射性傷害、及び脳症；プレクソパシー（plexopathies）；ニューロパチー；シャルコ・マリー・ツース病；フリートライヒの運動失調；異染性白質萎縮症；レフサム病；副腎脊髄神経障害；毛細血管拡張性運動失調；デジュリーヌ・ソッタニューロパチー；ランバート-イートン症候群；及び脳神経の障害。更なる例として、構造モチーフFに従うペプチドは、以下を含む、WO/2007/052154に開示される指標において、本発明の方法において除外され得る：免疫介在性炎症；橋本病などの自己免疫疾患、インシュリン依存性真性糖尿病、全身ループスエリテマトーデス；多発性硬化症、横断性脊髄炎、ギラン-バレー候群群、及び進行性多焦点白質脳症などの脱髄疾患、及び有機リン酸エステル曝露から生じる脊髄炎；関節炎；急性脳血管損傷；急性脊髄損傷；急性脳損傷；急性心血管損傷；脳卒中；外傷；移植片拒絶反応；及び移植片拒絶。
(C. 疾患、症状、又は状態のダメージ、影響、又は症状の予防、治療、改善、又は管理)
本発明のさらなる実施態様において、本発明の治療方法は、上記の疾患及び傷害のダメージ、影響又は症状を予防、治療、改善又は管理することに役立つ。特に、治療の現在の方法は、制限されないが、以下を含む症状に対処するために使用することができる：悪液質、発癌、不妊、白内障形成、放射線皮膚障害、ベータ熱傷、ガンマ熱傷、細胞の喪失(特に骨髄、消化管細胞)、血液生成、胃腸、中枢神経、心血管、皮膚、及び/又は生殖系への損傷、急性放射線症候群(吐き気、嘔吐、全身疾患及び疲労、免疫系うつ病、毛髪の喪失、制御不能の出血(口、皮膚下、腎臓)、大量の下痢、譫妄、昏睡及び死)、慢性放射線症候群、皮膚放射線症候群(炎症、紅斑、乾性又は湿性剥脱、脱毛、疱疹、発赤、潰瘍化、皮脂様及び汗腺への損傷、萎縮、線維症、減少又は増加皮膚染色及び壊死)、頭痛、めまい、嘔気、嘔吐、粘膜刺激、ジスポネア(dysponea)、意識障害、昏睡、痙攣、急速及び緩慢律動異常、低血圧、心血管虚脱、アシアノシス、徐脈、筋炎、過剰な唾液分泌、下痢、尿失禁、筋攣縮、初期脱分極性弛緩性麻痺、スパイク放電及び痙攣、中間の症候群、神経毒エステラーゼ抑制、有機ホスフェートにより誘発された後発性ニューロパチー、紅斑、水腫、壊死及び小水疱、黒皮症、気管気管支炎、気管支痙攣、気管支閉塞、出血性肺水腫、呼吸不全、細菌性肺炎、目紅斑、流涕、目の不快、目の激痛、眼瞼痙攣、虹彩炎、失明、嘔気、嘔吐、骨髄抑制、ルイサイトショック、肝臓壊死及び低循環に続く腎不全、灼熱感(目、鼻咽頭、中咽頭)、大量の涙、鼻漏、嗄声、呼吸困難、嚥下痛、結膜炎、角膜損傷、鼻口腔咽頭損傷/水腫、声門構造の炎症、分泌、及び/又は喉頭痙攣による呼吸困難、急性呼吸症候群、見当識障害、行動修正、及び反応気道機能不全症候群。
上記したように、組織の損傷に関連したこれらの疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状は、本発明に使用されるペプチドにより対処されることができる障害の範囲の単なる例示である。従って、本発明は、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状の予防、治療的、又は予防的処置を提供する。
組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状は、本発明のペプチドの有効量の投与により治療又は予防することができる。ある実施態様において、本発明は、本明細書中に記載の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、該疾患又は障害を有する対象に本発明のペプチドの有効量を投与し、該疾患又は障害を治療又は予防する工程を含む、前記方法を提供する。一実施態様において、本発明の1以上のペプチド又はその医薬として許容し得る塩の有効量を含む組成物を投与する。
(D. 累積的又は相乗効果のための他の治療法と併用した治療)
ある実施態様において、本発明は、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状を治療、媒介、改善又は予防する方法であって、その必要がある患者に、ペプチド及び別の適切な治療薬の有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。これは、ペプチド及び治療薬の効果の付加的、相乗的、又は相殺的(治療薬の副作用を中和する)利点を達成することができる。これは、ペプチド及び適切な治療薬の同時、実質的同時、又は非同時の投与を含む。ペプチド及び適切な治療薬の非同時の投与は、ペプチド及び適切な治療薬の経時的、交互、及び急性対慢性的投与を含む。また、ペプチド及び適切な治療薬は、同一又は別々の医薬組成物で投与することができ、別々に投与される場合、それらは、同一経路又は異なる経路を介して投与することができる。適切な治療方法及び薬剤は、制限されないが、以下を含む：カルバマート(ピリドスチグミン、フィゾスチグミン、アミノスチグミン、ネオスチグミン、シノスチグミン(synostigmine)、エパスチグミン（Epastigmine）、モバム(Mobam)、デカルボフラン)、アンチコリンゲリクス(anticholingerics)( トリヘキシフェニジル、ベナクチジン、ビペリデン、スコポラミン、アプロフェン、アトロピン、ヒオスシン、アジフェニン、カラミフェン、ペントメトニウム（pentmethonium）、メカミラミン、トリヘキシフェニジル) PANPAL、アミノフェノール(エセロリン)、有機リン酸(TEPP、パラキソン(Paraxon)、エチル-4-ニトロフェニルリン酸)、タクリン、7-MEO-TA、ヒューペルジンA、コリンエステラーゼ(BuChE、AChE、トリエステラーゼ、パラオキソナーゼ)、オキシム/再賦活薬(HI-6、PAM、オビドキシム、トリメドキシム、メトキシム、Hlo-7、BI-6、K048、K033、塩化プラリドキシム(2-PAM Cl)、P2S、TMB4、2-PAMI)、スラミン、ベンゾジアゼピン、ツボクリン(tubocurine)、メマンチン、プロシクリジン、ニモジピン、クロニジン、プラリドキシム、ジアゼパム、エンケファリン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、重炭酸ナトリウム、ビタミンE類似体(コハク酸α-トコフェロール、γ-トコトリエノール)、スーパーオキシドジスムターゼ/カタラーゼ模倣体(EUK189)、セレン、ベンジルスチリルスルホン、先端を切ったフラゲリン(truncated flagellin)、スタチン、ゲニステイン、ガランタミン、ヒポテルミア、5-アンドロステンジオール、CpG-オリゴデオキシヌクレオチド、抗菌物質、幹細胞移植片、アミホスチン、テンポール、イソフラボン、ベンジルスルホン類似体、GM-CSF、G-CSF、ヨウ化カリウム、水酸化アルミニウム、プルシアンブルー、キレート化剤(ジエチレントリアミンペンタアセタート(Ca-DTPA)、亜鉛ジエチレントリアミンペンタアセタート(Zn-DTPA))、ケラチノサイト成長因子、腸ペプチドホルモン、ベータグルカン、オクトレオチド、ペントキシフィリン、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、アンギオテンシンII受容体遮断薬、メトヘモグロビン形成体(亜硝酸アミル、亜硝酸ナトリウム)、チオ硫酸ナトリウム、コバルト化合物(ヒドロキシコバラミン(ビタミンB12a)、トキソイド、抗毒素、ワクチン、受動的抗体、制限されないがメトトレキサート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン（procarbizine）、エトポシド、カンパセシン(campathecins)、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル及びドセタキセルを含む化学療法剤；放射線：γ-放射線；アルキル化剤；ナイトロジェンマスタード：シクロホスファミド、イホスファミド トロフォスファミド、クロラムブシル；ニトロソ尿素：カルマスティン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、アルキルスルホナートブスルファン、トレオスルファン；トリアゼン：ダカルバジン；プラチナ含有化合物：シスプラチンカルボプラチン、植物アルカロイド；ビンカアルカロイド：ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン；タキソイド：パクリタキセル、ドセタキソール；DNAトポイソメラーゼ阻害剤エピポドフィリン：エトポシド、テニポシド、トポテカン、9-アミノカンプトセシンイリノテカン(Campto (登録商標))、クリスナトール；マイトマイシン：マイトマイシンC、マイトマイシンC；抗代謝剤、抗-葉酸：DHFR阻害剤：メトトレキサート、トリメトレキサート、IMPデヒドロゲナーゼ阻害剤：ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリンEICAR；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤：ヒドロキシ尿素；デフェロキサミン；ピリミジン類似体：ウラシル類似体、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラチトレキセド(Ratitrexed)；シトシン類似体：シタラビン(ara C) シトシンアラビノシドフルダラビン；プリン類似体：メルカプトプリン、チオグアニン；ホルモン療法：受容体アンタゴニスト：抗エストロゲン、タモキシフェン、ラロキシフェンメゲストロール；LHRHアゴニスト：ゴセレリン、酢酸リュープロリド；抗アンドロゲン：フルタミド、ビカルタミド；レチノイド/デルトイドビタミンD3類似体：EB 1089、CB 1093、KH 1060；光力学療法：ベルトポルフィン(BPD-MA)、フタロシアニン光増感剤、Pc4デメトキシ-ヒポクレリンA(2BA-2-DMHA) サイトカイン：インターフェロン-α、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子；イソプレニル化阻害剤：ロバスタチン；ドーパミン作動性ニューロトキシン：1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン；細胞周期阻害剤：スタウロスポリン、アクチノミセス：アクチノマイシンD、Dアクチノマイシン；ブレオマイシン：ブレオマイシンA2、ブレオマイシン B2、ペプロマイシン； アントラサイクリン：ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン；MDR阻害剤：ベラパミル；Ca.sup.2+ ATPアーゼ阻害剤：タプシガルジン；TNF-a阻害剤/サリドマイド脈管形成阻害剤3-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-プロピオンアミド(SelCIDs(商標)) ImiDs(商標)、Revlimid(商標)、Actimid(商標)。本発明の別の態様において、本発明による医薬組成物は、組織保護機能性を示す少なくとも1つの小分子とともに構築されたペプチドを含むことができる。適切な小分子は、制限されないが、以下を含む：ステロイド(例えば、ラザロイド及びグルココルチコイド)、抗酸化剤(例えば、コエンザイムQ10、アルファリポ酸及びNADH)、抗異化作用酵素(例えば、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキサイドジムターゼ、カタラーゼ、合成触媒捕捉剤、並びに模倣体)、インドール誘導体(例えば、インドールアミン、カルバゾール及びカルボリン)、硝酸中和剤、アデノシン/アデノシンアゴニスト、植物化学物質(フラバノイド)、ハーブ抽出物(ギンコビロバ及びウコン)、ビタミン(ビタミンA、E及びC)、オキシダーゼ電子受容体阻害剤(例えば、キサンチンオキシダーゼ電子阻害剤)、ミネラル(例えば、銅、亜鉛及びマグネシウム)、非ステロイド抗炎症剤(例えば、アスピリン、ナプロキセン及びイブプロフェン)、及びそれらの組み合わせ。制限されないが以下を含むさらなる薬剤は、本医薬組成物と併用して用いることができる：抗炎症剤(例えば、コルチコステロイド、プレドニゾン及びヒドロコルチゾン)、グルココルチコイド、ステロイド、非ステロイド抗炎症剤(例えば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク及びCOX-2阻害剤)、ベータ-アゴニスト、抗コリン作用薬及びメチルキサンチン)、免疫調節剤(例えば、小有機分子、T細胞受容体モジュレーター、サイトカイン受容体モジュレーター、T細胞減少剤、サイトカイン拮抗剤、モノカイン拮抗剤、リンパ球阻害剤又は抗癌剤)、金注射薬、スルファサラジン、ペニシラミン、抗血管新生剤(例えば、アンギオスタチン)、TNF-α拮抗剤(例えば、抗TNFα抗体)、及びエンドスタチン)、ダプソン、ソラレン(例えば、メトキサレン及びトリオキサレン)、抗マラリア薬(例えば、ヒドロキシクロロキン)、抗ウイルス薬、抗ヒスタミン及び抗生物質(例えば、エリスロマイシン及びペニシリン)。
他の実施態様において、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又はそれから生じるダメージ、影響若しくは症状を治療、媒介、改善又は予防する本方法は、化学療法、放射線療法(X線放射線、高エネルギーメガ電圧(1MeVより大きいエネルギーの放射線)、電子ビーム、常用電圧X線放射線、ガンマ線放射ラジオアイソトープ(ラジウム、コバルト及び他の元素の放射性同位元素))、高圧酸素室、心臓バイパス機械、血管形成術、低体温、手術、血管形成術などの治療方法と組み合わせた、該ペプチドの投与を含み、連動してペプチド及び治療方法の効果の付加的、相乗的、又は相殺的(治療方法の副作用を中和する)利点を達成することができる。例えば、特定の実施態様において、ペプチドは、化学療法又は放射線療法と並行して、癌治療として手術を受けた患者に投与することができる。別の特定実施態様において、化学療法剤又は放射線療法は、ペプチド投与前又は後、好ましくは、少なくとも1時間、5時間、12時間、1日、1週、1月、より好ましくは、数カ月(例えば、最高3ヵ月)で投与される。加えて、化学療法又は放射線療法があまりに有毒であると判明又は判明の可能性がある場合、例えば、治療される患者にとって容認できない又は耐え難い副作用を生じる場合、本発明は、該化学療法又は放射線療法の代わりとして、ペプチドを用いた癌又は腫瘍性疾患の治療方法を提供する。あるいは、本発明は、該ペプチドが、治療方法の毒性副作用を予防又は改善するための試みにおいて、化学療法又は放射線を用いた治療の前、同時、又は後に投与される治療方法を提供する。実施例2に示すように、本方法に従って投与されるペプチドは、シスプラチナム、公知の化学療法薬の副作用を改善することが可能である。上記の例は癌の治療に関するが、該ペプチドは、炎症又は毒剤への暴露などの組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、及びそれから生じるダメージ、影響若しくは症状に関して、技術的に他の治療方法と組み合わせて投与され、相乗的、付加的、又は相殺的結果を達成することができる。
(E. ペプチドの製剤化及び投与)
一実施態様において、本発明の方法は、ペプチドを含む医薬組成物が全身的に投与され、標的とされた細胞、組織又は器官を保護又は処置することを提供する。このような投与は、吸入又は経粘膜的、例えば、経口、頬内、経鼻、直腸、膣内、舌下、眼、粘膜下、又は経皮を介して、非経口的であってもよい。好ましくは、投与は、例えば、静脈内又は腹膜内注射を介して、更には制限されないが動脈内、筋肉内、皮内及び皮下投与を含む、非経口的である。
灌流液、器官への注入、又は他の局所投与の使用などの他の投与経路に関して、上記のペプチドの同レベルの結果をもたらす医薬組成物が提供されるであろう。約15pM-30nMのレベルが好ましい。
本発明の医薬組成物は、治療的有効量の化合物及び医薬として許容し得る担体を含むことができる。特定の実施態様において、用語「医薬として許容し得る」は、連邦又は州政府の監督官庁により承認されていること、又は米国薬局方若しくは動物及び特にヒトへの使用に関して、一般に認められている外国の薬局方においてリストされていることを意味する。用語「担体」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又は媒体をいう。このような薬剤担体は、滅菌液体、生理食塩水溶液、及びピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、野菜又は合成起源のものを含む油であり得る。生理食塩水溶液は、医薬組成物が静脈内注射で投与される場合に好ましい担体である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース溶液及びグリセロール溶液も、液体担体、特に注射用溶液として使用することができる。適切な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアリン酸、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。また、該組成物は、所望の場合、微量の湿潤剤若しくは乳化剤又はpH緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。該組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体と共に坐薬として処方できる。本発明の化合物は、中性又は塩形態として製剤化できる。医薬として許容し得る塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの遊離アミノ基とともに形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの遊離カルボキシル基とともに形成されるものを含む。適切な医薬担体の例は、E.W. Martin「レミントンの医科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。該文献はその全体において本明細書中に引用により取り込まれている。このような組成物は、患者への適当な投与の形態を提供するように、担体の適切な量と共に、好ましくは精製された形態において、治療的有効量の化合物を含む。製剤は、投与様式に合わせるべきである。
また、長期間作用性ペプチドなどのペプチドの経粘膜吸着を増加させるための製剤も、本発明によって意図される。経口投与に適合する医薬組成物は、カプセル又は錠剤として；粉末又は顆粒として；溶液、シロップ又は懸濁液(水性であるか非水溶液体)として；食用発泡剤又はホイップとして；又はエマルジョンとして提供されることができる。錠剤又は硬ゼラチンカプセルは、ラクトース、デンプン又はその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸又はそれらの塩を含むことができる。軟ゼラチンカプセル剤は、植物油、ワックス、脂肪、半固体又は液体ポリオールなどを含むことができる。溶液及びシロップは、水、ポリオール及び糖を含むことができる。
経口投与を意図する活性薬剤は、消化管における活性薬剤の分解及び/又は吸収を遅延させる物質(例えば、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリルを使用することができる)で被覆又は混合することができる。従って、活性薬剤の徐放性は、多くの時間に渡って達成することができる。必要に応じて、活性薬剤は、胃内での分解から保護されることができる。経口投与のための医薬組成物は、特定のpH又は酵素条件のため、特定の胃腸位置で活性薬剤の放出を促進するように製剤化されることができる。
経皮投与に適合する医薬組成物は、長期間の受容者の表皮と密接な接触を維持することを意図する個々のパッチとして提供され得る。局所投与に適合する医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション剤、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾール又は油として提供され得る。皮膚、口、目又は他の外部の組織に対する局所投与のために、好ましくは、局所用軟膏剤又はクリームが使用される。軟膏で製剤化される場合、活性成分は、パラフィン又は水混和性軟膏基剤とともに使用され得る。あるいは、活性成分は、水中油ベース又は油中水ベースのクリームで製剤化され得る。眼への局所投与に適合する医薬組成物は点眼を含む。これらの組成物において、活性成分は、適切な担体、例えば、水性溶媒中に溶解又は懸濁化され得る。口の局所投与に適合する医薬組成物は、トローチ剤、香錠及びうがい薬を含む。
鼻及び肺投与に適合する医薬組成物は、粉末(好ましくは、20〜500ミクロンの範囲の粒径を有する)などの固体担体を含むことができる。粉末は、嗅ぎタバコが、すなわち、鼻の近くに保持される粉末の容器から鼻による迅速な吸入によって受け入れられる方法で投与され得る。あるいは、鼻投与に採用される組成物は、液体担体(例えば、点鼻スプレー又は点鼻薬)を含むことができる。あるいは、肺への化合物の直接吸入は、中咽頭へのマウスピースを介して、深い吸入又は装置により達成されることができる。これらの組成物は、活性成分の水溶液又は油溶液を含むことができる。吸入による投与のための組成物は、制限されないが、活性成分の予め定められた投与量を提供するように構築され得る加圧エアロゾル、噴霧器又は通気器を含む特別に構成された装置で供給されることができる。好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物は、直接鼻腔に、又は鼻腔若しくは中咽頭を経て肺に投与される。
直腸投与に適合する医薬組成物は、坐薬又は浣腸として提供され得る。膣内投与に適合する医薬組成物は、膣座薬、タンポン、クリーム、ゲル類、ペースト、発泡体又はスプレー製剤として提供され得る。
非経口投与に適合する医薬組成物は、水性及び非水溶無菌注射溶液、又は懸濁液を含み、意図される受容者の血液と実質的に等張性である組成物を与える抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び溶質を含むことができる。このような組成物に存在することができる他の成分は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油を含む。非経口投与に適合する組成物は、単回用量又は複数回用量の容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアルに存在することができ、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用滅菌生理食塩水溶液の添加のみを必要とする、冷凍乾燥(凍結乾燥)させた状態で保存することができる。即座の注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。一実施態様において、ペプチドの注射可能な溶液を含む自動インジェクターは、救急車、緊急治療室、及び戦場による緊急使用のために、更には、家庭内の環境、特に外傷性切断の可能性が、例えば、芝刈り機の軽率な使用などにより生じ得る場合おける自己投与のために提供され得る。切断された足又は足指の細胞及び組織が再接着後に生存する可能性は、現場で、医療関係者の到着前に、又は緊急治療室で、牽引されている切断された足指に苦しむ個人の到着前に、可能な限り早く、切断部分の複数部位にペプチドを投与することにより増加し得る。
好ましい実施態様において、該組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合する医薬組成物として、ルーチン的手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、該組成物は、可溶化剤及び注射部位における疼痛を緩和するリドカインなどの局所麻酔薬を含んでいてもよい。通常、該成分は、別々に供給されるか、又は単位剤形において、例えば、活性薬剤の量を示すアンプル又は小袋(sachette)などの密封容器内に凍結乾燥粉末又は非含水濃縮物として、ともに混合される。該組成物を注入により投与する場合、無菌医薬品等級の水又は生理食塩水を含む輸液ボトルと共に供給される。該組成物が注入により投与される場合、該成分が投与の前に混合されることができるように、無菌生理食塩水のアンプルを提供することができる。
坐薬は、一般に、0.5重量％〜10重量％の範囲の活性成分を含む；経口製剤は、好ましくは10％〜95％の活性成分を含む。
灌流液組成物は、その場灌流の使用のために提供され得る。このような医薬組成物は、急性若しくは慢性、局所的、又は全身的な個人への投与に不適切なペプチドのレベル又はペプチドの形態を含むが、処置器官又は組織を規則的循環に曝露又は戻す前のそこに含まれるペプチドのレベルを除去又は減少する前に、器官浴、器官灌流液又はその場灌流液として本明細書中で意図される機能を果たすであろう。
また、本発明は、本発明の医薬組成物の成分の1種以上を充填した1つ以上の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。このような容器に任意に付随するものは、医薬又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を管理する政府機関によって定められる形式の提示である。その提示は、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の機関による承認を反映する。
別の実施態様において、例えば、ペプチドを、徐放システムにおいて送達することができる。例えば、該ペプチドは、静脈内点滴、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、又は他の投与様式を用いて投与されることができる。一実施態様において、ポンプを用いることができる(上記Langer; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwaldらの文献, 1980, Surgery 88:507; Saudekらの文献, 1989, N. Engl. J. Med. 321 :574を参照されたい。その各々は、全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。別の実施態様において、該化合物は、ベシクルにおいて送達されることができる(Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treatらの文献, 「感染症疾患及び癌の療法におけるリポソーム(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)」, Lopez-Berestein及びFidler (編集), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); WO 91/04014; 米国特許第4,704,355号; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327を参照されたい。;一般にibid.を参照されたい。)。別の実施態様において、ポリマー材料を使用することができる (「徐放性の医薬応用(Medical Applications of Controlled Release)」, Langer及びWise (編集), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; 「制御された薬剤の生物学的利用可能性、薬剤製品設計、及び振る舞い(Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance)」, Smolen及びBall (編集), Wiley: New York (1984); Ranger及びPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953を参照されたい；また、Levyらの文献, 1985, Science 228:190; Duringらの文献, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardらの文献 , 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照されたい(その各々は全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。
さらに別の実施態様において、徐放システムは、治療的な標的(すなわち、標的細胞、組織又は器官)の近くに配置することができ、従って、全身投与の分画のみを必要とする(例えば、Goodson, pp. 115-138 「徐放の医薬応用(Medical Applications of Controlled Release)」, vol. 2, supra, 1984を参照されたい。それは全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。他の徐放システムは、Langerによる総説において述べられている(11990, Science 249:1527-1533。その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。
別の実施態様において、適切に製剤化されるように、ペプチドは、鼻、頬、経口、直腸、膣、眼、経皮、非経口、吸入又は舌下で投与され得る。
特定の実施態様において、治療を必要とする領域に本発明のペプチドを局所的に投与することが所望されてもよい；これは、例えば、制限されないが、手術時の局所点滴、局所適用、例えば、手術後の創傷包帯とともに、注射により、カテーテルの手段により、坐薬の手段により、又は移植の手段により、達成され得る。前記移植は、シラスティック膜又はファイバーなどの多孔性、非多孔性、又はゼラチン性材料のものである。このような実施態様の非限定的な例は、脈管構造、管路などの部分に移植される本発明のペプチドで覆われたステント又は他の足場であろう。
好ましい効果投与量の選択は、当業者に公知の幾つかの要因の考慮に基づいて当業者により容易に決定可能であろう。このような要因は、ペプチドの特定の形態及び生物学的利用能、代謝、半減期などのその薬物動態学的パラメータを含む。それらは、医薬化合物についての規制認可を得る際に、典型的に使用される通常の開発手順の間に確立されているであろう。投与量を考慮する際の更なる要因は、治療される状態又は疾患、又は通常の個人において達成される利益、患者の体重、投与経路、投与が急性か慢性か否か、併用薬、及び投与される医薬品の有効性に影響を与えることが周知の他の要因を含む。従って、正確な投与量は、熟練者の判断及び各患者の状況に従って、例えば、個々の患者の状態及び免疫状態に応じて、及び標準的臨床技術に従って決定されるべきである。
本発明の別の態様において、潅水又は灌流溶液は、移植のための器官の灌流及び貯蔵のために提供され、該灌流溶液は、応答性細胞、関連細胞、組織又は器官を保護するのに効果的なペプチド又はペプチド類似体の量を含む。移植は、制限されないが、以下を含む：異物移植(allotransplantation)、ここで、器官(細胞、組織又は他の身体の部分を含む)は1人のドナーから収集され、異なる受容者に移植され、両者は同じ種である；自己移植、ここで、器官は身体の一部から採取され、他と置き換わり、器官を除去できるが生体外で切除され、修復され、又は他に操作される作業台外科手術を含み、例えば、腫瘍除去、その後、元の位置に戻される；又は異物移植(xenotransplantation)、ここで、組織又は器官又は種の間で移植される。一実施態様において、灌流溶液は、5%ヒドロキシエチルデンプン(約200,000〜約300,000の分子量を有し、エチレングリコール、エチレンクロロヒドリン、塩化ナトリウム及びアセトンを実質的に含まない)；25mM KH2PO4、3mMグルタチオン；5mMアデノシン；10mMグルコース；10mM HEPES緩衝液；5mMグルコン酸マグネシウム；1.5mM CaCl2；105mMのグルコン酸ナトリウム；200,000ユニットのペニシリン；40ユニットのインシュリン；16mgデキサメタゾン；12mgフェノールレッド；を含み、7.4-7.5のpH及び本発明のペプチドの適当な量で補充された約320mOsm/lの重量オスモル濃度を有する、ウィスコンシン大学(UW)溶液である(米国特許第4,798,824号、その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)。この特定の灌流液は、ペプチドの有効量の包含によって、現在の使用に適合することができる多くのこのような溶液の単なる例示にすぎない。さらなる態様において、灌流液溶液は、約1〜約500ng/mlのペプチド、又は約40〜約320ng/mlのペプチドを含む。上述したように、ペプチドの任意の形態を、本発明のこの態様において使用することができる。
全体にわたって本明細書中のこの目的に対するペプチドの好ましい受容者はヒトであるが、本明細書中の方法は、他の哺乳動物、特に家庭的動物、家畜、コンパニオン、及び動物園の動物に等しく当てはまる。しかし、本発明は制限せず、利点を任意の哺乳動物に適用することができる。.
エキソビボにおける本発明の更なる態様において、限定的ではないが上記のもののような任意のペプチドを使用することができる。
本発明の別の態様において、組織の損傷に関連した疾患若しくは障害、又は内皮細胞障壁によって脈管構造から分離されない細胞、組織若しくは器官においてそれから生じるダメージ、影響若しくは症状を予防、治療、又は管理する方法及び組成物は、ペプチドを含む医薬組成物に直接的に細胞、組織又は器官を曝露することによって、又はペプチドを含む医薬組成物を組織又は器官の脈管構造に投与若しくは接触させることによって提供される。
エリスロポエチンに基づく他の組織保護化合物と同様に、本発明のペプチドは、表層から例えば、脳、網膜及び精巣を含む、内皮細胞密着結合を有する器官の毛細管の内皮細胞の基底膜表面まで輸送される可能性がある。従って、組織の損傷に関連した疾患又は障害、又は障壁全体にわたる細胞においてそれから生じるダメージ、影響又は症状を治療することができる任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、ペプチドの経細胞輸送後に、例えば、ニューロン、目(例えば、網膜)、脂肪、結合性細胞、毛髪、歯、粘膜、膵臓、内分泌、耳、上皮、皮膚、筋肉、心臓、肺、肝臓、腎臓、小腸、副腎(例えば副腎皮質、副腎髄質)、毛細管、内皮、精巣、卵巣、幹細胞、又は子宮内膜細胞などの細胞上の組織保護レセプターと相互作用することができ、受容体結合は、応答性細胞又は組織内の遺伝子発現プログラムの活性化を生じるシグナル伝達カスケードを始動し、毒剤への曝露、炎症、低酸素症などのダメージから細胞又は組織又は器官の保護を生じる。別の実施態様において、該ペプチドは、本明細書中に引用により取り込まれているPCT出願番号PCT/US01/49479、米国特許出願第10/188,905号、及び第10/185,841号の教示に従って、障壁全体にわたって輸送されるCEPOなどの障壁を横断することができる化合物に架橋結合することができる。
従って、組織の損傷に関連した疾患又は障害又はそれから生じるダメージ、影響又は症状から組織を保護する方法は、本明細書中に下で詳述する。
本発明の一実施態様の実施において、哺乳動物の患者は、例えば、神経、肺、心臓、卵巣、睾丸損傷などの悪影響を共通に有する放射線療法を含む、癌治療のための全身的化学療法を受けている。上記の保護ペプチド又はペプチド類似体を含む医薬組成物の投与は、様々な組織及び器官を化学療法剤による損傷から保護するために、例えば、精巣を保護するために、化学療法及び/又は放射線療法前及び間に行われる。化学療法剤の循環値が哺乳動物の身体に対する潜在的脅威レベル以下に落ちるまで、治療を続けることができる。
本発明の別の実施態様の実施において、様々な器官は、多くの受容者への移植のために、自動車事故の犠牲者から集められることが計画され、その一部は、広範な距離及び期間の輸送を必要とした。器官収穫の前に、本明細書中に記載されているように、ドナーは組織保護ペプチド及びペプチド類似体を含む医薬組成物を吹き込まれる。輸送のための収集された臓器は、本明細書中に記載されている組織保護ペプチド又はペプチド類似体を含む灌流液に浸透され、組織保護ペプチド又はペプチド類似体を含む浴内に保管される。特定の器官は、拍動性灌流装置で連続的に灌流され、本発明による組織保護ペプチド及びペプチド類似体を含む灌流液を利用する。器官機能の最小の悪化は、その場で、該器官の輸送の間、及び移植及び再灌流時に生じる。
本発明の他の実施態様において、個人を毒剤に曝す危険な活動の関係者で、ある人は、毒剤への曝露の影響を予防(すなわち、発症の遅延、阻害、又は阻止)、それに対する保護、又は緩和に十分なペプチドを含む医薬組成物を摂取することができる。特に、この治療方法は、毒剤との接触を伴う様々な職業、例えば、鉱員、化学製造業者、軍人(兵士、落下傘降下兵)、救急人員(警察、消防士、EMS、及び災害救助人員)、建築作業員、食品加工業者及び動力炉での従業員などにおいて、応用を有し得る。
本発明の他の一実施態様において、心臓弁を修復する外科手術は、一時的な心臓麻痺及び動脈閉塞を必要とする。手術の前に、患者は、組織保護ペプチド又はペプチド類似体を注入される。このような治療は、特に再灌流の後、低酸素性虚血性細胞損傷を予防する。加えて、本発明の医薬組成物を予防的に使用して、個人を、外科手術に関連する外傷を制限しようとする手術、又は外科手術から個人の回復における援助のために準備することができる。組織保護ペプチド及びペプチド類似体を含む医薬組成物を用いる本治療方法は、外科手術のための予防的使用を提供するが、それは、制限されないが、バイパス手順(冠状動脈バイパス)、血管形成術、切断及び移植を含む一時的な虚血事象を誘発する手順、並びに脳及び脊髄手術及び心臓切開手順などの応答性細胞、組織又は器官に直接に行われるものにおいて特に有用であり得る。このような手順は、心肺(cardiopulmonary)(心肺(heart lung))バイパスの使用を伴うことができる。
本発明の他の実施態様において、心肺バイパス手術などの任意の外科手術において、本発明の組織保護ペプチド又はペプチド類似体を用いることができる。一実施態様において、上記の組織保護ペプチド及びペプチド類似体を含む医薬組成物の投与は、バイパス手順の前、間、及び/又は後に行われ、脳、心臓及び他の器官の機能を保護する。
ペプチドが、組織の損傷に関連した疾患又は障害、又はそれから生じるダメージ、影響又は症状を治療するためのエキソビボ用途、又はインビボ用途に使用される前述の例において、本発明は、毒剤への曝露に対するダメージ及び影響又はその症状の予防、治療、又は管理に適合する単位剤形の医薬組成物であって、約.01pg〜30mg、.5pg〜25mg、1pg〜20mg、500pg〜10mg、1ng〜10mg、500ng〜10mg、1μg〜10mg、500μg〜10 mg、又は1mg〜10mgの範囲内の量のペプチド及び医薬として許容し得る担体を含む前記医薬組成物を提供する。好ましい実施態様において、ペプチドの量は、約.5pgから1mgの範囲内である。好ましい実施態様において、製剤は、非赤血球生成性ペプチドを含む。
さらに、本発明のこの回復態様は、細胞、組織又は器官機能不全の回復用医薬組成物を調製するための本明細書中の任意のペプチドの使用に対応する。治療は、該機能不全に関与する初期損傷後及びかなり後に開始される。さらに、本発明のペプチドを用いる治療は、急性期並びに慢性期の間の疾患又は状態の過程に及ぶことができる。
本発明のペプチドは、1回投与あたり、約1ng〜約300μg/kg体重、好ましくは約5〜150μg/kg-体重、最も好ましくは、約10〜100μg/kg-体重の投与量で全身投与することができる。例えば、投与は、１時間毎、毎日、臨床的に必要である限り、又は適当な間隔後、例えば、1〜12時間毎、好ましくは6〜12時間毎；2〜６日毎、好ましくは2〜4日毎；1〜12週毎、好ましくは1〜3週毎に、繰り返すことができる。一実施態様において、有効量のペプチド及び医薬として許容し得る担体は、単一用量バイアル又は他の容器で包装することができる。別の実施態様において、本明細書中に記載されている活性を与えることができるが、ヘモグロビン濃度又はヘマトクリットの増加を生じない該ペプチドを使用する。このようなペプチドは、本発明の方法が慢性的に提供されることを意図する例において好まれる。
(実施例1)
(ペプチド合成方法)
ペプチドA(配列番号：2、EPOアミノ酸配列38-57に相当)及びペプチドB(配列番号：3、EPOアミノ酸配列58-82に相当)の合成。
ペプチドA、配列番号：2及びペプチドB、配列番号：3、EPOの断片を、Band, D., Chopra, N and Kent, S., 「クランビンの全合成(Total Synthesis of Crambin)」 J.AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 1377-1383(その全体において本明細書中に引用により取り込まれている)に記載されている「その場中和(in situ neutralization)」Boc化学段階的固相ペプチド合成を用いて合成した。簡潔にいうと、EPOアミノ酸配列38-57(ペプチドA、
Figure 0005542064
 )及びEPOアミノ酸配列58-82(ペプチドB、
Figure 0005542064
 )に対応する2つの断片を、-OCH2-Pam-樹脂(遊離αカルボキシペプチド)、又はHSCH2CH2CO-Leu-OCH2-Pam-樹脂(αチオエステルペプチド)で合成した。合成の間、様々なアミノ酸の側鎖を、以下のように保護した：Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(4-CH3Bzl)又はCys(ACM)、Glu(OcHex)、Lys(2-Cl-Z)、セリン(Bzl)、Thr(Bzl)、Tyr(Br-Z)。ペプチド鎖が組み立てられた後、ペプチドを脱保護し、無水HF含有p-クレゾール(90:10, v/v)で1時間、0℃で処置することによって、樹脂支持体から同時に開裂させた。減圧下でのHFの留去後に、粗生成物を沈殿させ、冷却ジエチルエーテルで倍散し、該ペプチドを0.1%TFAを含む50％水性アセトニトリルに溶解させ、分取HPLC系により精製した。ペプチド組成物は、LC-MSを用いて確認された。
ペプチドID(
Figure 0005542064
 は、保護N末端基(ピログルタミン酸の5員環構造によって)及びC末端の遊離カルボキシル基を有する11-アミノ酸線形ペプチドである。その分子量は、1257ダルトンである。それを、Wang樹脂上の標準Fmoc固相ペプチド合成を用いて合成し、分取HPLC及びイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥した。酢酸塩及びアンモニウムは、混合塩を形成するペプチド分子の塩基及び酸性基にイオン形態で結合される。
(実施例2)
(組織保護ペプチド及びペプチド類似体は、非赤血球生成性である。)
(A. インビトロ評価)
UT-7epo、ヒトエリスロポエチン依存性白血病細胞系を、ペプチドの赤血球生成性効力の判定のために使用した。UT-7epo細胞(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Cat. No. ACC 363)を、10%FBS及び5ng/mlエリスロポエチンを有する完全RPMI-1640培地中で成長させた。エリスロポエチンに曝露される細胞の増殖/生存(=生存度増加)反応は、古典的赤血球-型エリスロポエチンレセプターにより媒介され、古典的エリスロポエチンレセプターを刺激するエリスロポエチン変異体の能力の定量的基準である。
UT-7epo細胞を、10%ドナー子牛血清、4mM L-グルタミンを含み、5ng/ml組換えヒトエリスロポエチンで補充された、新鮮な完全RPMI 1640に移した。該細胞は、48時間37℃で、5%CO2を有する湿性インキュベーター中、20ml培地/フラスコを有する75cm2フラスコに維持した。分析の2日目に、すなわち、48hで、該細胞を、フラスコから50mlコニカルチューブに移し、室温で、5分間、1,000rpmで遠心分離した。上清を廃棄し、該細胞を10ml飢餓培地(3%ドナー子牛血清、4mM L-グルタミン)で2回洗浄した。該細胞を、その後、上下ピペット作用を用いて飢餓培地で再懸濁し、単一細胞懸濁液を得た。再懸濁された細胞を、4×105細胞/mlの密度を得るように飢餓培地で希釈し、25cm2フラスコ当たり総培地容量10mlで播種した。4時間の培養後、該細胞を50mlコニカルチューブに再び移した。コントロール細胞は、5ng/mlのrhu-エリスロポエチンによって、全体にわたって維持した。
細胞を、飢餓培地中200,000細胞/mlに希釈し、96ウェルプレートに100μl/ウェルで播種し、エリスロポエチン及びペプチドID、配列番号：282の異なる濃度に曝露した。3%血清を含むRPMI1640培地の一連の10倍希釈液は、5pM〜50nMの試験化合物の濃度をもたらすために用いた。更なる48時間の培養後に、15mlのWST-I細胞増殖試薬(Roche)の溶液を各ウェルに加え、1時間37℃で、CO2中、インキュベートした。1分間の混合後に、該プレートを、プレートリーダー(650nmでのバックグラウンド吸収から減算した450nmでの吸収)で読み込んだ。図1に示すように、ペプチドIDは、EPOの強い赤血球生成作用と比較して、投与量範囲に渡って、赤血球生成活性を有しなかった。これは、非赤血球生成性ペプチド又はペプチド類似体が、1μg/ml未満の投与量、好ましくは10μg/ml未満の投与量に対して赤血球新生作用活性を有しないという予想よりも下回った。
(B. インビボ評価)
組織保護ペプチド及びペプチド類似体の評価のために、ペプチドIDを、スプラーグドーリーラットに28日間、1日に2回静脈内投与した。9匹のオス及び9匹のメスのラットを、1回投与あたり0、60、180、及び600μg/kgのPBS中ペプチドIDをボーラス静脈内投与により1〜28日受ける1〜4のグループに割り当て、血液学的変量を評価するため、血液試料を29日目に収集した。ヘモグロビン濃度は、自動化分析器(Keska社)を用いて決定した。図2に示すように、いずれのグループにおいてもヘモグロビン濃度の違いはなかった。
更に、ペプチドIDの赤血球生成性及び血液生成作用を、ウサギにおいて評価した。研究開始前に、全てのウサギの血液試料を採取し、その動物の血液学的ベースラインを確立した。ペプチドIDを、ニュージーランドホワイトウサギに、1日2回静脈内注射で28日間投与した。この研究のために、6匹のオス及びメスをグループ1及び4に割り当て、4匹のオス及び4匹のメスをグループ2及び3に割り当てた。PBS中ペプチドIDの1回投与あたり、ボーラス静脈内投与により、グループ1は0、グループ2は30μg(24 nmol/kg bw)を受けさせ、グループ3は90μg(72 nmol/kg bw)を受けさせ、グループ4は300μg/kg(240 nmol/kg bw)を受けさせた。血液学的変量の分析のための血液試料は、29日目に収集した。ベースライン対29日目の血液学的パラメータの比較は、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット又は血小板数の違いを示さなかった(図3、a. b.及びc)。
(実施例3)
(ペプチド又はペプチド類似体は、インビトロアッセイにおいて組織保護性である。)
ペプチド及びペプチド類似体は、任意の数のインビトロアッセイを用いて、組織保護性について容易に評価することができる。例えば、エキサイトキシティー(excitoxicity)からの保護は、マウス運動ニューロンのカイナイト誘発死を用いて決定することができる。脊髄は、前述したように、15日齢のスプラーグドーリーラット胚から得た(Sirenらの文献, 2001, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 98:4044)。前角をトリプシン処理し、300Xgで10分間、4%BSAクッションによって遠心分離した。細胞(混合ニューロン-グリア培養液を表す)を、2,000細胞/cmの密度で、ポリ-DLオルニチン及びラミニンでプレコートした24mmウェルプレートに播種した。運動ニューロンを、イムノパニング(immunopanning)によって更に精製し、該細胞を、ポリ-DL-オルニチン及びラミニンでプレコートされ、かつ完全な培地[Neurobasal/B27 (2%)；0.5mM L-グルタミン；2%ウマ血清；25mM 2 メルカプトエタノール；25mMグルタミン酸；1%ペニシリン及びストレプトマイシン；1ng/ml BDNF]を含む24mmウェルプレートに低密度(20,000細胞/cm2)で播種した。培地(グルタミン酸非存在)を、4日及び6日目の培養組織に再び加えた。細胞死は、カイニン酸を用いて48時間のインキュベーションによって、培養の6日目に誘発した(5mMの混合ニューロン-グリア培養組織；50mMの精製された培養組織)。ペプチドB(5ng/mL、1.8nM)、EPO(3.3nM)又はビヒクルを、細胞死誘導の72時間前に培養組織に加え、48時間処置した。その後、培地を廃棄し、該細胞を、40分間、PBS中の4%(vol/vol)パラホルムアルデヒドで固定し、0.2%トリトンX-100により透過させ、PBS中の10%(vol/vol)FCSでブロックし、非リン酸化ニューロフィラメント(SMI-32; 1:9,000)に対する抗体を用いて一晩インキュベートし、ジアミノベンジジンを用いるアビジン-ビオチン法を用いて視覚化した。運動ニューロンの生存度は、カバースリップの4側面全体にわたってSMI-32陽性細胞を計数することによって形態学的に評価し、アポトーシス体についての染色をH33258を用いて行った。図4に示すように、ペプチドBは、細胞をグルタミン酸レセプターアゴニストカイニン酸の神経毒性作用から保護した。
(実施例４)
(中大脳動脈閉塞モデル)
スプラーグドーリーラット(1グループあたり8匹)を、以下のMCAOプロトコルに受けさせた。手術は、Brines らの文献, 2000, PNAS USA 97:10526-10531(その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)の教示に従って行った。簡潔にいうと、ラットを、抱水クロラール(400mg/kg-bw、i.p)により麻酔し、頸動脈を摘出し、右の頸動脈を2つの縫合により閉塞して、切断した。右眼窩に隣接及び頬側の頭蓋骨孔は、中大脳動脈(「MCA」)の可視化を可能にした。それを、鼻腔の動脈に遠位性で焼灼した。この固定されたMCA病変を囲む半影部(境界域)を生じるために、対側の頸動脈を、微細鉗子により提供される牽引を用いて1時間閉塞し、その後、再開した。
ラットに、生理食塩水、単一静脈内投与量(2μg/kg bw)としてのペプチドID、又は単一静脈内投与量(2μg/kg bw)としてのペプチドIX、
Figure 0005542064
 ペプチドIC、配列番号：281の乱雑バージョンを再灌流時に投与し、その後、2時間間隔で3回のさらなる注射を行った。損傷の評価のために、ラットを行動試験にさらし、病変量を、前述のプロトコルに従って24時間の手術を行った後に、脳断面のテトラゾリウム染色で測定した。
(a) 病変の量
その後、病変量を、手術24時間後に行った脳断面のテトラゾリウム染色によって測定した。ペプチドIDは、生理食塩水処置ラット(291±23 mm3)と比較して、24時間で梗塞部容積の有意な減少を示した(225±20 mm3)。
(b) 行動試験
ラットを、フットフォールト行動プロトコルにおいても試験した。ラットを、Markgrafらの文献, 1992, Brain Research 575:238-246(その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)のプロトコルに従って、30mmのグリッドサイズを有する高度ステンレス鋼グリッド床30cm×30cm上で試験した。グリッドに配置されるときに、ラットは周りを移動し、時々、グリッド上よりはむしろ、グリッド開口部を通して足を配置することを試みる(「フットフォールト」)。フットフォールト数は、1分間で測定した。
フットフォールト数は、MCAOのためにラットの認知障害を表し、より少ないフットフォールト数は、より小さい認知障害となる。図5に示すように、ペプチドIDは、生理食塩水処置ラット(20.2±0.8フットフォールト)及びペプチドIX処置ラット(20.1±2.1フットフォールト)と比較して、フットフォールトプロトコルのラット行動を大幅に向上させた(11.2±1.1フットフォールト)。
(実施例5)
(両側腎臓虚血アッセイ)
60匹のオスのC57/BL6マウス(〜25g；Charles River Laboratories)を、ケタミン(150mg/kg)及びキシラジン(15mg/kg)の腹腔内投与によって、麻酔をかけた。各動物を、37℃に設定された恒温動物の毛布に配置し、正中開腹の後、腎茎を非外傷性脈管クランプを用いて30分間固定した。ペプチドIDを、腹腔内を介して示された投与量で投与した。再灌流の1分、6時間及び12時間後の注入。単回用量研究において、マウスは、コントロール(PBS)、1分で1μg/kgペプチドIG、30分で1μg/kgペプチドIG、6時間で1μg/kgペプチドID、又は6時間で10μg/kgペプチドIDを受けた(1グループあたり12匹のマウス)。複数回用量研究において、マウスは、再灌流の1分、6時間、及び12時間で、コントロール(PBS)、0.1μg/kgペプチドID、1μg/kgペプチドID、又は10μg/kgペプチドIDを受けた。
24時間後に、マウスを再麻酔し、血液を心臓穴により採取した。血漿尿素及びクレアチンを腎臓機能不全の指標として用い、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを腎臓損傷の指標として用いた。データは、ANOVA、続くダネットのポストホックテスト(Dunnett's post hoc test)比較を用いて分析された。
図6及び図7に示すように、各グラフに示すように、1μg/kgペプチドID又は10μg/kgペプチドIDは、腎臓機能不全のこれらの生化学的マーカーの減少を生じた。
(実施例6)
(創傷治癒)
全層穿孔生検モデルを、ペプチドIDの評価のために用いた。この実験において、3.5mm-直径全層皮膚創傷を、スプラーグドーリーラットの、剃って、脱毛された肩甲部上に幅3cm平方の角に配置した。ペプチドID(24nmol/kg bw、9匹のラット)又はPBS(9匹のラット)を、10日間毎日皮下に投与した。開いた創傷の領域を、連続デジタル写真から盲検方式で測定し、図8に示すようにペプチドIDを受けた動物のより速い治癒を示した。
(実施例7)
(認知の向上)
ラットの新規対象認知パラダイムを用いて、前に試験した対象のそれらの想起を評価した。具体的には、成熟ウィスターラットを、新規試験対称に曝露し、24時間後に、それらに再曝露した。動物は、以下のいずれかを受けた5グループに分けた：(1)ビヒクル、(2)ガランタミン(3mg/kg i.p)ポジティブコントロールとしての試験1時間前、(3)ペプチドID(24nmol/kg bw i.p)新規対象への最初の曝露3時間後、(4)ペプチドID(24nmol/kg bw i.p) 訓練前の5日間毎日2回、及び訓練直後の日にわたって継続、及び(5)ペプチドID(24nmol/kg bw i.p)新規対象への最初の曝露1時間前。
図9に示すように、グループ2〜4のラットは、グループ1及び5のラットと比較して、試験の新規対象の改善された認知を示した。これらの結果は、ペプチドIDが、記憶獲得の強化相に影響できることを示唆している。
(実施例8)
(シスプラチン誘発腎症)
癌化学療法剤は、他の毒性の中で、腎臓損傷を誘発することは公知である。シスプラチン誘発腎症からラットを保護するペプチドICの能力を、5週間、週に2回、腹膜内に2mg/kgのCDDTを投与して評価した。ペプチドICを、5週間、週に3回、0.4μg/kgの投与量で同時に投与した。腎機能は、尿生産量を計量することにより評価した。図10に示すように、ペプチドICを用いた同時処置は、CDDTによる腎臓機能不全から保護した。
また、CDDTが、他の毒性の中で、末梢ニューロパチーを誘発することは公知である。腎機能についての上記の実験計画の後、末梢ニューロパチーに対して保護するペプチドICの能力も評価した。2mg/kgのCDDTを、腹膜内に投与した(5週間、週2回)。ペプチドICを、5週間、週3回、0.4μg/kgの投与量で同時に投与した。ニューロパチーは、ホットプレート潜伏期(hotplate latency)、暖表面に対するラットの足の接触の間の遅延期間、及び足の収縮により評価した。図11に示すように、同時処置は、末梢ニューロパチーの体裁を予防した。
(実施例9)
(皮質腫瘍移植)
皮質腫瘍移植研究は、Lampsonらの文献 Cancer Res. 53:176-82:1993のプロトコルに従って行い、腫瘍の成長におけるペプチドIDの効果を決定した。
プロトコルに従って、オスのCDフィッシャーラットを麻酔し、それらの右の頭皮を、消毒薬を用いて剃り、洗浄した。その後、小さい切り傷を、右側頭大脳皮質の上にある頭皮につけた。硬膜物質に穴をあけることなく、1mm穴を、頭蓋冠を通して穿孔した。無菌状態下、5μlの生きた50,000 9L/LacZ神経膠肉腫細胞を、精密なハミルトンシリンジに取り付けた22本のゲージ針によってゆっくり注入した。その後、骨蝋を、穿孔部位に塗布し、皮膚を縫合し、予防的用量の抗生物質を静脈内投与した。コントロールラットは、毎日、整理食塩水を静脈内注射して準備した。ペプチドIDで処置したラットは、25日の期間、毎日、30μg/kgの静脈内注射を受けた。移植25日後に、動物を麻酔し、脳を2%パラホルムアルデヒドによって、灌流-固定した。その後、脳を取り出し、脳マトリックス装置で厚さ1mmの冠状切断に切り、腫瘍質量の範囲を、測面法で測定した。
図12は、ペプチドIDが、このモデルの皮質腫瘍の更なる成長を阻害したことを証明している。生理食塩水処置ラットの相対的腫瘍量は、0.4cm2を超えて成長したのに対して、ペプチドID処置ラットの腫瘍は、腫瘍量の成長を受けなかった。
(実施例10)
(9L神経膠肉腫移植モデル)
上記のLampsonらの文献 Cancer Res. 53:176-82:1993のプロトコルに従って、CDフィッシャーラットに、ハミルトンシリンジの使用によりLacZ遺伝子でトランスフェクトした9L神経膠肉腫を移植した。10マイクロリットル中の100,000細胞を、右尾に注入した。
移植2週後に、動物を、毎日の腹腔内注射のための3つのグループに分けた：一方は短い血漿半減期でペプチドIDを受け、他方はペプチドIW(ペプチドICのペグ化形態)を受け、第3グループは生理食塩水を受けた。ペプチドは、25nmole/kg体重の投与量で与えた。3週後に、動物を犠牲にし、連続する1mm厚さの冠状切断は、脳を介して切り取って、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-[ベータ]-D-ガラクトピラノシド(Xgal)とともにインキュベートした。腫瘍細胞(LacZ遺伝子を含む)は、Xgalを暗青染色に新陳代謝させ、腫瘍の範囲を局在化した。高分解能デジタル画像を得て、青色染色領域を、測面法を用いて決定した。データは、腫瘍浸潤の全面積として表現される。
図13に示されるように、結果は、長い半減期を有するペプチド(ペプチドIW)で処置したグループの腫瘍サイズは、動物を移植の日に開始し、犠牲にするまで毎日続けた短い半減期を有するペプチド(ペプチドID)で毎日処置した場合に得られたものと等しい全領域に対して、顕著な減少を示した。対照的に、移植2週間後により短い作用ペプチド(ペプチドID)を受けたグループの平均領域は、生理食塩水グループよりも小さいが、それは有意な相違ではなかった。
更に、図14は、生理食塩水、ペプチドID及びペプチドIW処置ラットの脳の比較の写真を示す。明らかに示されているように、最も大きい腫瘍(暗い領域)は、生理食塩水処置ラットにおいて存在する。毎日ペプチドIDで処置されたラットは、実質的により小さい腫瘍を有したが、2週後にペプチドIWで処置されたラットが、最善の結果を示した。
これらの見解は、9L神経膠腫肉腫細胞系の後退を生じるペプチドの能力と整合している。
(実施例11)
(予言的)(癌悪液質の処置)
癌を示す悪液質に対処するペプチドの能力は、以下のプロトコルにより検査することができる。
体重約200gのラットを、108AH-130肝臓癌細胞で腹腔内に接種する。同時に、ラットの1グループを、対象のペプチド、例えば、ペプチドID又はペプチドIWで、約.10〜2.0μg/kd/日の治療的有効な範囲内であろう投与量で処置する。第2グループを、プラセボで処置する。16日目に、ラットを屠殺にする。対象ラットの食物摂取及び自発運動を、接種前、及び11日目に評価する。体重及び身体組成を、屠殺後0日目及び16日目にNMR-走査により評価する。
プラセボ処置ラットと比較して、より少ない脂肪及び乏しい物質移動を示す、本発明の方法に従ってペプチドで処置したものを予測する。加えて、ペプチド処置ラットの食物摂取及び自発運動は、改善される。
(実施例12)
(ヒスタミン誘発耳炎症)
ヒスタミンの炎症誘発性影響に対抗する本治療方法に役立つペプチドの能力は、Brandらの文献 「ティーツリー油はマウス耳のヒスタミン誘発水腫を減少する(Tea tree oil reduces histamine induced oedema in murine ears)」 Inflamm. Res. 51 (2002) 283-289に開示されるヒスタミン誘発水腫のマウスモデルで評価した。簡潔にいうと、24匹のスプラーグドーリーラット(オス、250gm)を研究に使用した。ヒスタミン投与の前に、各ラットを麻酔し、ラットの耳の厚さを、ばね仕掛けのマイクロメーターを用いて測定した。ヒスタミン二リン酸塩の60mg/ml溶液の20ulを、ラットの耳に皮内注射し、30秒後に、ラットは、(1) 30μg/kgペプチドID IV(12匹のラット)、又は(2) 生理食塩水 IV(12匹のラット)のいずれかを受けた。その後、ヒスタミン二リン酸塩の60mg/ml溶液の20ulを、ラットの他の耳に皮内注入した。その後、ラット耳の厚さを、ヒスタミン投与後15、30、45及び60分でカリパスを用いて測定した。
図15で見られるように、ペプチドIDは、生理食塩水と比較して、ヒスタミン投与に関連した水腫の量を減少した。
(実施例13)
(ヒスタミン誘発膨疹形成)
皮内ヒスタミン投与により誘発される血漿溢出(膨疹)を減少するペプチドIDの能力を、ラットにおいて評価した。脈管漏れの視覚標識を提供するために、動物に、エバンスブルー色素(強くアルブミンと結合する)を予め投与した。ペプチドIG活性の持続性を決定するために、ペプチドID投与(30μg/kg静脈内投与)後の様々な時間で、皮内投与量の0.12μgヒスタミンを投与し、色素漏れの程度を、ヒスタミン配置15分後(この時間が膨疹表面積がもっとも大きくなる)のデジタル写真上で行った面積測定により定量化した。各動物は、次の反応上のヒスタミン投与の影響を回避するために、単一時点だけで試験した。単回用量ペプチドID投与は膨疹形成を抑制することが見出され、生理食塩水対ペプチドID処置動物の面積の違いを示す図16に示されるように、抑制効果は、単回投与の24時間後まで検出可能であった。
(実施例14)
(ヒスタミン誘発膨疹形成)
イソフルラン麻酔下、12匹のスプラーグドーリーラットの腹部を剃り、脱毛した。その後、各ラットに、エバンスブルーの希薄溶液(生理食塩水中30mg/ml、1ml/kg bw)を、(内部頸静脈を経て)静脈内注射した。5分後に、各ラットの腹部の方形波パターンにおいて、ヒスタミンの6回の小用量(ヒスタミン二リン酸塩、20マイクロリットルを皮内投与)。15分後に、膨疹がその最大サイズに達するときに、膨疹を撮影し、水疱域をデジタル面積測定法で測定した。様々なペプチドの有効性を試験するために、対象のペプチドを、ヒスタミン注入直後にラットに静脈内投与した。試験されるペプチド及び結果は、以下に示す。
A. エリスロポエチン
ラットは、ヒスタミン投与時に、生理食塩水又は10μgm/kgのEPOを受けた。図17は、EPO処置ラット(約.4cm2)の膨疹領域(病変域)が、生理食塩水処置動物(約.8cm2)の半分の病変領域であったラットを示す。
B. ペプチドID、ペプチドIW及び乱雑ペプチドID(ペプチドIY、配列番号：304、GLpLSEARNQSEL)
ラットは、ヒスタミン投与時に、生理食塩水、ペプチドIY(30μg/kg)、ペプチドID(30μg/kg)、又はペプチドIW(30μg/kg)を受けた。図18は、ペプチドID及びペプチドIW処置ラット(それぞれ約.35cm2及び.3cm2)の膨疹領域(病変域)が、生理食塩水及びペプチドIY処置動物(それぞれ約.6cm2)の半分の病変領域であったことを示す。これは、ヒスタミンを調整する際のペプチドID及びIWの有効性、及びヒスタミンに関連した炎症性の反応を示すだけでなく、ペプチドIYが抗炎症性活性を示さなかったことを考慮すると、ペプチドの有効性に対して上記開示したモチーフの重要性を示す。
C. ペプチドIW、レトロ-インベルソペプチドIC(ペプチドIZ、
Figure 0005542064
 、ここで配列番号300のアミノ酸は(D)-アミノ酸である)、ペプチドID及び乱雑ペプチドIC(ペプチドJA、
Figure 0005542064
 )
ラットは、ヒスタミン投与時に、生理食塩水、ペプチドJA(30μg/kg)、ペプチドIZ(30μg/kg)、ペプチドIW(30μg/kg)、又はペプチドID(30μg/kg)のいずれかを受けた。図19は、ペプチドIW、ID及びIZ処置ラットの膨疹領域(病変領域)(それぞれ約.3cm2、.35cm2及び.4cm2)が、生理食塩水及びペプチドJA処置ラットの病変領域(それぞれ約.6cm2)より小さかったことを示す。
(実施例15)
(褥瘡性潰瘍アッセイ)
褥瘡性潰瘍(床ずれ)アッセイは、Pierceらの文献, 「選択的A2Aアデノシンレセプター活性は、皮膚加圧潰瘍形成及び炎症を減少する(Selective A2A adenosine receptor activation reduces skin pressure ulcer formation and inflammation)」, Am J Physiol Heart Circ Physiol 281:67-74, 2001の開示に従って、24匹の成熟スプラーグドーリーラットで行った。簡潔にいうと、強磁性鋼プレートを、ラット皮膚の背面領域の下に移植した。長方形永久磁石を、プレートと磁石との間で皮膚を圧縮するのためにプレートを移植した皮膚の領域に適用した。この圧縮は、皮膚に対して血液の流れを減少させ、虚血を生じた。ラットを、72時間、虚血-再灌流のサイクル(2時間の虚血、.5時間の再灌流)のサイクルにさらした。各ラットの創傷の領域を測定し、その後、ラットを、生理食塩水、2回の皮下投与される30μg/kgペプチドID：1回目は最初の虚血の開始時及び2回目は24時間後、毎日皮下投与される30μg/kgペプチドID、又は毎日のEPOのいずれかで処置した。各ラットの創傷の領域を12日間毎日測定した。図20は、ペプチドID及びEPOが創傷のサイズを減少し、ペプチドIGの毎日投与が最も小さい創傷サイズを生じたことを示している。
(実施例16)
(予言的実施例)(皮膚プリックテスト)
最初のヒスタミン皮膚プリックテストを、ベースラインを決定するために行う。皮膚プリックテストは、両前腕の手掌方向上(手首の遠位皮膚しわより5cm以上上部)の半仰臥位の患者で行う。前腕を、アルコールで洗浄し、乾燥する。ペンを用いて、予想される皮膚試験部分を、ヒスタミン及びネガティブコントロールのためにマークし、互いから少なくとも2cm離してラベルを付ける。少量のヒスタミン二塩酸塩(10mg/ml)又はネガティブコントロールを、適切なマークで配置し、無菌ランセットを、90°角度で各滴下によって導入し、引き出す。その後、該部位を、投与15分後の紅斑及び膨疹形成の存在について観察する。膨疹の写真をとり、膨疹のサイズを、デジタル面積測定法を用いて決定する。
皮膚プリックテストを、上記のプロトコルを用いて少なくとも3時間後の期間で、再び行う。上記ペプチドの1つを、ヒスタミン投与の15分〜2時間前、ヒスタミン投与時、又はヒスタミン投与の1〜60分後に患者に投与し、それぞれ、ヒスタミン誘発炎症を予防、管理/改善、又は治療するペプチドの能力を決定することができる。例えば、ヒスタミンプリック時に、患者に、ペプチドIDをIV又は皮下注射により投与することができる。膨疹領域が、ペプチドIDで処置後、約50%より少ないことが予測される。
(実施例17)
(血液生成性スクリーニングアッセイにおける放射線緩和活性)
血液生成系における放射性剤の影響を緩和する現在の治療法に役立つペプチドの能力を、放射線傷害のマウスモデルで評価した。簡潔にいうと、80匹のC57BL/6マウス(50%のメス及び50%のオス、15〜28gm)を研究に用いて、2つのグループに分けた。
両方のグループにおいて、放射線を、65-69cGy/分 +/-2.5cGyの曝露速度で、137Cs放射線源からγ線の単一同一総体内吸収量として、マウスに投与した(GammaCell 40；Nordion International, Kanata, Ontario, Canada)。
グループAは、放射線(796cGy)のLD70/30線量を受け、その後、マウスのうちの20匹に、照射後24時間で、及びその後29日間、1日1回で、ペプチドID(30ug/kg皮下)を投与した。残りの20匹のマウス(コントロール群)は、照射後24時間で、及びその後29日間、1日1回で、PBS(皮下)を受けた。
グループBは、放射線(831cGy)のLD90/30線量を受け、その後、マウスのうちの20匹に、照射24時間後で、及びその後29日間、1日1回で、ペプチドID(30ug/kg皮下)を投与した。残りの20匹のマウス(コントロール群)は、照射24時間後で、及びその後29日間、1日1回で、PBS(皮下)を受けた。
マウスを、早期安楽死の兆候が現れるまで、1日1回、生存についてモニターし、その後30日まで1日2回モニターした。
図21に示すように、皮下投与されたペプチドIDを受けたマウスの30日の生存及び全体的な生存時間は、PBSを受けたマウスと比較して、著しく増加した。特に、796cGyでは、処置マウスは、コントロール群の10%の生存率と比較して、45%の生存率を示し、831cGyでは、処置マウスは、コントロール群の5%の生存率と比較して、20%の生存率を示した。
(実施例18)
(胃腸スクリーニングアッセイにおける放射線緩和活性)
胃腸系上の放射性剤の影響を緩和する現在の治療法に役立つペプチドの能力を、放射線傷害のマウスモデルで評価した。簡潔にいうと、30匹のC57BL/6マウス(オス、20〜30gm)を研究に用いた。
放射線は、Pantak HF320X線(Agfa NDT Ltd., Reading, UK)を用いて、300kV、10mAで操作して、マウスに投与した。X線チューブは、2.3mm Cu半価層(HVL)の放射性質を与えるために、付加的なフィルターを有する。マウスは、それらの骨髄を保護し、かつGI反応について選択するために遮断された頭部、胸郭及び前肢を有した。マウスは、ジグに拘束され、X線チューブ焦点から700mm焦点離れたところに配置した。照射は、マウスを15Gyの放射線にさらすのに十分な時間、75.5cGy/分(非遮蔽)及び70.0cGy/分(遮蔽)の線量速度で送達した。
放射24時間後に、マウスのうちの15匹に、ペプチドID(30ug/kg皮下)を投与し、その後、研究期間の間1日1回投与し、及び残りの15匹(コントロール群)に、PBS(皮下)を投与し、その後、研究期間の間1日1回投与した。
マウスの重量を測り、下痢及び早期安楽死の兆候が現れるまで1日1回モニターし、その後、1日2回モニターした。
図22に示すように、皮下投与されたペプチドIDを受けたマウスの20日の生存は、PBSを受けたマウスより著しく大きかった(処置グループの6匹のマウスに対してコントロール群の1匹のマウス)。
本発明は、記載されている特定実施態様によって範囲が制限されるものではなく、本発明の個々の態様の一つの説明として意図され、かつ機能的に等価な方法及び成分は、本発明の範囲内である。実際、本発明の多様な変更は、本明細書中に示され、記載されたものに加えて、前述の説明及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の請求の範囲内であることを意図する。
すべての引例は、全体として本明細書中に本明細書中に引用したものとする。

Claims (15)

  1. 精製ペプチド及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物であって、前記精製ペプチドが、アミノ酸配列UEQLERALNSS(配列番号：282)からなる、前記医薬組成物。
  2. 前記精製ペプチドが、化学合成によって生成され、かつ前記精製ペプチド以外の化学前駆体又は化合物が5％未満である、請求項1記載の医薬組成物。
  3. 前記ペプチドが、ポリエチレングリコールの付加により修飾されている、請求項1又は2記載の医薬組成物。
  4. 組織の損傷に関連した疾患を罹患している対象の治療のための医薬の製造のための、請求項1〜3のいずれか一項記載の医薬組成物の使用。
  5. 前記組織の損傷に関連した疾患が、癌、虚血性障害、低酸素障害、外傷、中毒性損傷、又は炎症性損傷によって生じる、請求項4記載の使用。
  6. 前記組織の損傷に関連した疾患が、心血管疾患、心肺疾患、呼吸器疾患、腎臓病、泌尿器系の疾患、生殖系の疾患、骨疾患、皮膚疾患、胃腸疾患、内分泌異常、代謝異常、認知機能障害、又は中枢若しくは末梢神経系の疾患若しくは障害である、請求項4記載の使用。
  7. 前記組織の損傷に関連した疾患が、中枢神経系の疾患若しくは障害である、請求項4記載の使用。
  8. 前記組織の損傷に関連した疾患が、末梢神経系の疾患若しくは障害である、請求項4記載の使用。
  9. 前記組織の損傷に関連した疾患が、認知機能障害である、請求項4記載の使用。
  10. 前記組織の損傷に関連した疾患が、炎症性損傷によって生じる、請求項4記載の使用。
  11. 前記炎症性損傷が、サルコイドーシス由来である、請求項10記載の使用。
  12. 前記炎症性損傷が、関節リュウマチ由来である、請求項10記載の使用。
  13. 前記組織の損傷に関連した疾患が、虚血性障害によって生じる、請求項4記載の使用。
  14. 前記組織の損傷に関連した疾患が、低酸素障害によって生じる、請求項4記載の使用。
  15. その必要のある対象における癌、腫瘍性障害、炎症又は毒剤曝露を予防、治療、改善、又は管理するための医薬の製造のための、請求項１〜３のいずれか一項記載の医薬組成物の使用。
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