EA010371B1 - Тканевые протективные цитокины для защиты, восстановления и стимуляции реактивных клеток, тканей и органов - Google Patents

Тканевые протективные цитокины для защиты, восстановления и стимуляции реактивных клеток, тканей и органов Download PDF

Info

Publication number
EA010371B1
EA010371B1 EA200500149A EA200500149A EA010371B1 EA 010371 B1 EA010371 B1 EA 010371B1 EA 200500149 A EA200500149 A EA 200500149A EA 200500149 A EA200500149 A EA 200500149A EA 010371 B1 EA010371 B1 EA 010371B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
erythropoietin
tissue protective
protective cytokine
alpha
Prior art date
Application number
EA200500149A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200500149A1 (ru
Inventor
Майкл Брайнс
Энтони Серами
Карла Серами
Original Assignee
Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк. filed Critical Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк.
Publication of EA200500149A1 publication Critical patent/EA200500149A1/ru
Publication of EA010371B1 publication Critical patent/EA010371B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/65—Tetracyclines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

Обеспечиваются способы и композиции для лечения млекопитающего с воспалением защитой или стимуляцией реактивной клетки, ткани, органа или части тела, имеющих или связанных с воспалением, системным или местным введением композиции, содержащей тканевой протективный цитокин. Изобретение также включает комбинированное лечение, включающее введение композиции, содержащей тканевой протективный цитокин по изобретению, и введение по меньшей мере одного противовоспалительного средства или по меньшей мере одного иммуномодулирующего средства.

Description

Настоящее изобретение относится к тканевым протективным цитокинам, полученным химической модификацией эритропоэтина, и их применениям для защиты, поддержания, стимуляции или восстановления реактивных на эритропоэтин клеток и связанных клеток, тканей и органов ίη ыШ. а также в условиях ех νίνο и для доставки тканевого протективного цитокина через эндотелиальный клеточный барьер в целях защиты и стимуляции реактивных на эритропоэтин клеток и связанных клеток, тканей и органов, отделенных от сосудистой сети, или для переноса связанных молекул через эндотелиальный клеточный барьер.
Сущность изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению тканевых протективных цитокинов, химически модифицированных эритропоэтинов, у которых отсутствует один или более аспектов воздействия эритропоэтинов на костный мозг, для получения фармацевтических композиций для защиты, поддержания, стимуляции или восстановления функции или жизнеспособности реактивных клеток млекопитающих и связанных с ними клеток, тканей или органов. В одном конкретном аспекте реактивные клетки млекопитающих и связанные с ними клетки, ткани или органы отделены от сосудистой сети посредством плотного эндотелиального клеточного барьера. В другом конкретном аспекте клетки, ткани или органы или другие части организма выделены из организма млекопитающего, такие, как предназначенные для трансплантации или реплантации. В качестве неограничивающих примеров реактивной клеткой или тканью могут быть клетки или ткань органов нервной системы, сетчатки, мышц, сердца, легких, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров, семенников, яичников, поджелудочной железы, кости, кожи или эндометрия. Кроме того, неограничивающие примеры реактивных клеток включают клетки фоторецепторов (палочек и конусов), клетки ганглия, биполярные, горизонтальные, амакриновые клетки, клетки Мюллера, миокарда, водителя ритма, синусно-предсердного узла, синусного узла, соединительной ткани, атриовентрикулярного узла, пучка Гиса, гепатоциты, звездчатые клетки, купферовы клетки, мезангиальные клетки, клетки почечного эпителия, интерстициальные клетки почечных канальцев, бокаловидные клетки, клетки кишечных желез (крипт), энтеральные, эндокринные, клетки клубочковой зоны, пучков, ретикулярные клетки, хромаффинные клетки, перициты, клетки Лейдига, Сертоли, сперматозоиды, фолликулярные клетки Граффиана, клетки примордиальных фолликулов, клетки островков Лангерганса, α-клетки, β-клетки, γ-клетки, Е-клетки, преостесбласты, остеокласты, остеобласты, клетки стромы эндометрия, эндометриальные клетки, стволовые и эндотелиальные клетки. Данные примеры реактивных клеток являются только иллюстративными. В одном аспекте реактивные клетки или связанные с ними клетки, ткани или органы не являются возбудимыми клетками, тканями или органами или, в основном, не включают возбудимые клетки или ткани. В конкретном воплощении клеткой, тканью или органом, для которых применяются вышеуказанные тканевые протективные цитокины, являются таковые, которые размножаются или будут размножаться по меньшей мере при одном условии, неблагоприятно влияющем на жизнеспособность клетки, ткани или органа. Подобные условия включают гипоксию или метаболическое нарушение функций ίη δίΐιι в результате травмы, индуцированную хирургической операцией гипоксию или метаболическое на
- 1 010371 рушение функции ίη Ши или воздействие ίη Ши токсина; последнее может быть связано с химиотерапией или лучевой терапией. В одном воплощении неблагоприятные условия являются результатом проведения экстракорпорального кровообращения (сердечно-легочный аппарат), которое применяется при некоторых хирургических вмешательствах.
Тканевые протективные цитокины пригодны для терапевтического или профилактического лечения заболеваний центральной или периферической нервной системы у человека, которые, в основном, проявляются в виде неврологических или психических симптомов, а также заболеваний глаз, сердечно-сосудистых заболеваний, кардиопульмональных заболеваний, респираторных заболеваний, заболеваний почек, органов мочеполовой системы, желудочно-кишечных заболеваний, эндокринных метаболических нарушений и воспаления.
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим конкретные тканевые протективные цитокины для введения млекопитающему, предпочтительно человеку. Подобные фармацевтические композиции можно получить для перорального, интраназального или парентерального введения или в виде перфузионного раствора для поддержания жизнеспособности клеток, тканей или органов в условиях ех νίνο.
Тканевые протективные цитокины, пригодные для вышеуказанных целей, и фармацевтические композиции включают эритропоэтины, измененные по меньшей мере одной модификацией по сравнению с природным эритропоэтином и предпочтительно по сравнению с природным человеческим эритропоэтином. По меньшей мере одна модификация может представлять собой модификацию по меньшей мере одной аминокислоты в молекуле эритропоэтина или модификацию по меньшей мере одного углевода в молекуле эритропоэтина. Конечно, молекулы тканевых протективных цитокинов могут включать множество модификаций по сравнению с природной молекулой, например множественные модификации аминокислотной части молекулы, множественные модификации углеводной части молекулы или по меньшей мере одну модификацию аминокислотной части молекулы и по меньшей мере одну модификацию углеводной части молекулы. Молекула тканевого протективного цитокина сохраняет ее способность к защите, поддержанию, стимуляции или восстановлению функции или жизнеспособности реактивных клеток млекопитающих, хотя бы одно или более свойств молекулы эритропоэтина, не относящихся к вышеуказанному, желаемое свойство может отсутствовать по сравнению с природной молекулой. В предпочтительном воплощении тканевой протективный цитокин не обладает способностью оказывать влияние на костный мозг, т.е. повышать гематокрит (эритропоэз), сужать сосуды (высокое кровяное давление), повышать кровяное давление, гиперактивировать тромбоциты, способствовать свертываемости крови и повышать продукцию тромбоцитов. Более предпочтительно, когда у тканевого протективного цитокина отсутствует способность оказывать влияние на эритропоэз; наиболее предпочтительно, когда у тканевых протективных цитокинов отсутствует способность ко всем эффектам эритропоэтинов на костный мозг.
В качестве примера тканевой протективный цитокин по изобретению может представлять собой асиалоэритропоэтин. В другом примере тканевой протективный цитокин по изобретению может представлять эритропоэтин или асиалоэритропоэтин после взаимодействия с одним или более реагентом, который модифицирует одну или более аминогруппу аминокислотных остатков природного эритропоэтина или асиалоэритропоэтина. В предпочтительном воплощении тканевой протективный цитокин по изобретению не оказывает влияния на эритропоэз.
В одном воплощении тканевой протективный цитокин представляет собой эритропоэтин, в котором отсутствуют остатки сиаловой кислоты. В предпочтительном воплощении тканевой протективный цитокин представляет собой асиалоэритропоэтин и наиболее предпочтительно человеческий асиалоэритропоэтин. В другом воплощении тканевой протективный цитокин содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков сиаловой кислоты. Подобные частично десиалилтированные эритропоэтины относятся здесь к гипосиалоэритропоэтинам. Их можно получить химической или ферментативной модификацией природного эритропоэтина, или их можно получить экспрессией в системе, которая либо совсем не сиалилтирует молекулу, либо только частично сиалилтирует эритропоэтин. Асиалоэритропоэтин и гипосиалоэритропоэтин входят в объем изобретения независимо от способов, с помощью которых получены молекулы.
В другом предпочтительном воплощении тканевой протективный цитокин содержит по меньшей мере один или более модифицированный остаток лизина или модификацию Ν-концевой аминогруппы в молекуле эритропоэтина, подобные модификации получены в результате взаимодействия эпсилонаминогруппы лизина или Ν-концевой аминогруппы с модифицирующим аминогруппу агентом или агентами. Модифицированный остаток лизина или модифицированную Ν-концевую аминогруппу можно дополнительно химическим способом восстановить. В одном предпочтительном воплощении эритропоэтин биотинилируют, карбамилируют, сукцинилируют или ацетилируют по одному и более остатков лизина или в Ν-конце. В другом предпочтительном воплощении лизин подвергают взаимодействию с альдегидом или восстанавливающим сахаром с образованием имина, который затем необязательно стабилизируют химическим восстановлением, например, с использованием цианоборгидрида натрия с получением остатка Ν-алкилированного лизина, такого как глюцитолиллизин, или в случае восстанавливающих сахаров их можно стабилизировать посредством перегруппировки Амадори или Хейнса с полу
- 2 010371 чением альфа-дезокси-альфа-аминосахара, такого как альфа-дезокси-альфа-фруктозиллизин. В другом предпочтительном воплощении лизин или Ν-концевую аминогруппу карбамилируют (карбамоилируют), например, посредством взаимодействия с ионом цианата, алкилкарбамилируют, арилкарбамилируют или арилтиокарбамилируют, соответственно, с помощью алкилизоцианата, арилизоцианата или арилизотиоцианата, или их можно ацилировать с помощью реакционноспособного производного алкилкарбоновой или арилкарбоновой кислоты, например взаимодействием с уксусным ангидридом, янтарным ангидридом или фталевым ангидридом. По меньшей мере одну группу лизина или Ν-концевую аминогруппу также можно тринитрофенилировать взаимодействием с тринитробензолсульфоновой кислотой или предпочтительно с одной из ее солей. В другом воплощении остатки лизина можно модифицировать взаимодействием с глиоксалем, например взаимодействием с глиоксалем, метилглиоксалем или 3-дезоксиглюкозоном, с получением соответствующих альфа-карбоксиалкилпроизводных.
В другом воплощении тканевой протективный цитокин можно получить модификацией по меньшей мере одного остатка тирозина в молекуле эритропоэтина с использованием электрофильного реагента, например, включая, но не ограничиваясь модификацией нитрованием или йодированием, для модификации положения в ароматическом кольце.
Как уже отмечалось выше, тканевой протективный цитокин для данных целей может содержать по меньшей мере одну из вышеуказанных модификаций, но может включать более чем одну из вышеуказанных модификаций. В качестве примера тканевых протективных цитокинов с одной модификацией аминокислотной части молекулы и необязательной модификацией углеводной части молекулы тканевой протективный цитокин представляет собой карбамилэритропоэтин, карбамиласиалоэритропоэтин, карбамилгипосиалоэритропоэтин, ацетилэритропоэтин, ацетиласиалоэритропоэтин, ацетилгипосиалоэритропоэтин, сукцинилэритропоэтин, сукциниласиалоэритропоэтин, сукцинилгипосиалоэритропоэтин, биотинилэритропоэтин, биотиниласиалоэритропоэтин, биотинилгипосиалоэритропоэтин, йодэритропоэтин, йодасиалоэритропоэтин, йодгипосиалоэритропоэтин, Ν-эпсилон-карбоксиметилэритропоэтин, Ν-эпсилон-карбоксиметиласиалоэритропоэтин, Ν-эпсилон-карбоксиметилгипосиалоэритропоэтин и глюцитолилэритропоэтин, глюцитолиласиалоэритропоэтин, глюцитолиласиалогипоэритропоэтин. Данные соединения представляют только примеры модифицированных эритропоэтинов по изобретению. Вышеупомянутые тривиальные названия представляют только модификации молекулы природных эритропоэтинов и описанных здесь выше, модификация аминогруппы может быть по одной или более эпсилонаминогруппе остатков лизина или Ν-концевой аминогруппе или, например, в случае нитро- или йодмодифицированных эритропоэтинов в одном или более остатке тирозина. Любая комбинация вышепредставленного находится в объеме изобретения. Настоящее изобретение также включает композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие один или более из вышеуказанных тканевых протективных цитокинов. Любая из данных композиций может также включать природный эритропоэтин.
В другом аспекте изобретения обеспечивается способ защиты, поддержания, стимуляции или восстановления функции или жизнеспособности реактивных клеток млекопитающих и связанных с ними клеток, тканей и органов введением эффективного количества одного или более вышеуказанных тканевых протективных цитокинов. В одном конкретном аспекте способа реактивные клетки млекопитающих и связанные с ними клетки, органы и ткани отделены от сосудистой сети посредством плотного эндотелиального клеточного барьера. В другом конкретном аспекте клетки, ткани или органы или другие части организма выделены из организма млекопитающего, например предназначенные для трансплантации или ретрансплантации. В качестве неограничивающих примеров реактивная клетка или ткань может представлять собой клетки или ткань органов нервной системы, сетчатки, мышц, сердца, легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров, семенников, яичников, поджелудочной железы, кожи, костей или эндометрия. Данные примеры реактивных клеток являются только иллюстративными. В конкретном воплощении реактивные клетки или связанные с ними клетки, ткани или органы не являются возбудимыми клетками, тканями или органами или, в основном, не включают возбудимые клетки или ткани. В другом конкретном воплощении клетка, ткань или орган млекопитающего, для которых возможно применение вышеуказанного тканевого протективного цитокина, представляют таковые, которые размножаются или будут размножаться в течение периода времени по меньшей мере при одном условии, оказывающем неблагоприятное действие на жизнеспособность клетки, ткани или органа. Подобные условия включают гипоксию или метаболическое нарушение функции ίη δίΐιι в результате травмы, индуцированную хирургической операцией гипоксию или метаболическое нарушение функции ίη δίΐιι или воздействие ίη δίΐιι токсина; последнее может быть связано с химиотерапией или лучевой терапией. В одном воплощении изобретение защищает от неблагоприятных условий, явившихся результатом проведения экстракорпорального кровообращения.
Еще в одном аспекте изобретения любой из вышеуказанных тканевых протективных цитокинов можно использовать для получения фармацевтической композиции для обработки клеток, тканей или органов в условиях ех νίνο в целях защиты, поддержания, стимуляции или восстановления функции или жизнеспособности реактивных клеток млекопитающих и связанных с ними клеток, тканей и органов. Подобная обработка в условиях ех νίνο пригодна, например, для консервации клеток, тканей или органов, предназначенных для трансплантации, независимо от того, является ли она аутотрансплантацией
- 3 010371 или ксенотрансплантацией. Клетки, ткань или орган можно поместить в баню с раствором, содержащим тканевые протективные цитокины, или перфузировать его в орган через сосудистую сеть, или применить иначе для поддержания функционирования клеток в периоде, когда клетки, ткань или орган отделены от сосудистой сети донора или реципиента. Введение перфузата можно проводить донору до извлечения органа, а также в извлеченный орган или реципиенту. Кроме того, вышеуказанное применение любого тканевого протективного цитокина пригодно в тех случаях, когда клетка, ткань или орган изолированы от сосудистой системы индивидуума и, таким образом, находятся в условиях ех νίνο в течение периода времени, где термин «изолированы» относится к отключению или пережатию сосудистой сети от или к клетке, ткани или органу или другим частям организма, например при проведении операции, включая, в частности, операцию с экстракорпоральным кровообращением; шунтирование сосудистой сети клетки, ткани, органа или другой части организма; удаление клетки, ткани, органа или другой части из организма млекопитающего, что, например, проводят при ксенотрансплантации или перед или во время аутотрансплантации; или ампутацию в результате травмы клетки, ткани, органа или другой части организма. Таким образом, данный аспект изобретения относится к перфузии тканевого протективного цитокина в условиях ίη 8Йи и ех νίνο. В условиях ех νίνο эритропоэтин может быть обеспечен в виде раствора для консервации клеток, ткани или органа. В другом аспекте воздействие может быть в виде постоянной перфузии, прерывистой перфузии, инфузии, бани, инъекции или катетеризации.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу защиты, поддержания, стимуляции или восстановления жизнеспособности клеток, тканей и органов или других частей организма у млекопитающего, которые включают реактивную клетку или ткань, где клетка, ткань, орган или их часть выделены из организма млекопитающего. Данный способ включает, по меньшей мере, воздействие на изолированную клетку, ткань, орган млекопитающего или их часть количества тканевого протективного цитокина, указанного выше, в течение периода времени, который эффективен для защиты, поддержания, стимуляции или восстановления вышеуказанной жизнеспособности. В неограничивающих примерах термин «изолированы» относится к отключению или пережатию сосудистой сети от или к клетке, ткани или органу или их части, например, при проведении операции, включая, в частности, операцию с экстракорпоральным кровообращением; шунтирование сосудистой сети клетки, ткани, органа или другой части организма; удаление клетки, ткани, органа или другой части из организма млекопитающего, что, например, проводят при ксенотрансплантации или перед или во время аутотрансплантации; или ампутацию в результате травмы клетки, ткани, органа или их части. Таким образом, данный аспект изобретения относится к перфузии с тканевым защитным цитокином как ίη мш, так и в условиях ех νίνο. В условиях ех νίνο тканевой протективный цитокин может быть обеспечен в виде раствора для консервации клеток, ткани или органа. В другом аспекте воздействие может быть в виде постоянной перфузии, прерывистой перфузии, инфузии, бани, инъекции или катетеризации.
В качестве неограничивающих примеров реактивная клетка или ткань в условиях ех νίνο может представлять собой клетки или ткань органов нервной системы, сетчатки, мышц, сердца, легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров, семенников, яичников, поджелудочной железы, кожи, костей, костного мозга, пупочного канатика или эндометрия. Данные примеры реактивных клеток являются только иллюстративными.
Все вышеуказанные способы и применения предпочтительно применимы для людей, но также применимы для любого млекопитающего, включая, но не ограничиваясь собаками и кошками, домашними животными, сельскохозяйственными животными и зоопарковыми животными. Пути введения вышеуказанных фармацевтических композиций включают пероральный, внутривенный, интраназальный, местный, внутриполостной, ингаляционный или парентеральный путь введения, последний включает внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, под слизистую или внутрикожное введение. Для условий ех νίνο предпочтительным является перфузат или раствор для бани. Это включает перфузирование изолированного участка сосудистой сети в условиях ίη δίΐιι.
Еще в одном аспекте изобретения любой из вышеуказанных тканевых протективных цитокинов пригоден для получения фармацевтической композиции для восстановления нарушенной функции клетки, ткани или органа при введении после начала развития заболевания или патологического состояния, ответственного за нарушение функции. В качестве неограничивающего примера введение фармацевтической композиции, содержащей тканевые протективные цитокины, приводит к восстановлению познавательной функции у животных, имевших ранее травму мозга, даже при введении спустя длительный период времени (например, спустя 3 суток, 5 суток, неделю, месяц или более) после получения травмы.
Еще в одном воплощении изобретение обеспечивает способы применения вышеуказанного тканевого протективного цитокина для восстановления нарушенной функции клетки, ткани или органа при введении после начала развития заболевания или патологического состояния, ответственного за нарушение функции. В качестве неограничивающего примера способы введения фармацевтической композиции, содержащей тканевые протективные цитокины, приводят к восстановлению познавательной функции у животных, имевших ранее травму мозга, даже при введении спустя длительный период времени (например, спустя 3 суток, 5 суток, неделю, месяц или более) после получения травмы. Тканевые протективные цитокины, пригодные для данных способов, включают любой из конкретных вышеуказанных
- 4 010371 модифицированных эритропоэтинов.
Еще в одном дополнительном аспекте настоящего изобретения обеспечиваются способы облегчения прохождения молекулы через эндотелиальный клеточный барьер у млекопитающего введением композиции молекулы в связи с тканевым защитным цитокином, описанным выше. Связь между молекулой, предназначенной для переноса, и тканевым протективным цитокином может представлять собой, например, лабильную ковалентную связь, стабильную ковалентную связь или нековалентную связь со связывающим сайтом молекулы. Эндотелиальные клеточные барьеры могут представлять собой гематоэнцефалический барьер, гематоглазной барьер, гематосеменниковый барьер, гематояичниковый барьер и гематоплацентарный барьер. Подходящие молекулы для транспорта способами по настоящему изобретению включают гормоны, такие как гормон роста, фактор роста нервов (ΝΟΕ), нейротрофический фактор из мозга (ΒΌΝΕ), цилиарный нейротрофический фактор (ΟΝΤΕ), основной фактор роста фибробластов (ЬЕСЕ), трансформирующий фактор роста β1 (ΤΟΕβΙ), трансформирующий фактор роста β2 (Τ0Εβ2), трансформирующий фактор роста β3 (Τ0Εβ3), интерлейкин 1, интерлейкин 2, интерлейкин 3 и интерлейкин 6, ΑΖΤ, антитела против фактора некроза опухоли, противовирусные средства и иммуносупрессоры, такие как циклоспорин. Кроме того, к эритропоэтину или одному из тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению можно присоединить красители или маркеры для визуализации клеток, тканей или органов в мозге и других органах, имеющих барьер, для диагностических целей.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает композицию для облегчения прохождения молекулы через эндотелиальный клеточный барьер у млекопитающего, композицию, содержащую молекулу в связи с тканевым защитным цитокином, описанным выше. Связь между молекулой, предназначенной для транспорта, и тканевым протективным цитокином может представлять собой, например, лабильную ковалентную связь, стабильную ковалентную связь или нековалентную связь со связывающим сайтом молекулы. Эндотелиальные клеточные барьеры могут представлять собой гематоэнцефалический барьер, гематоглазной барьер, гематосеменниковый барьер, гематояичниковый барьер и гематоплацентарный барьер. Подходящие молекулы для транспорта способами по настоящему изобретению включают гормоны, такие как гормон роста, фактор роста нервов (ΝΟΕ), нейротрофический фактор из мозга (ΒΌΝΕ), цилиарный нейротрофический фактор (ΟΝΤΕ), основной фактор роста фибробластов (ЬЕСЕ), трансформирующий фактор роста β1 (ΤΟΕβΙ), трансформирующий фактор роста β2 (Τ0Εβ2), трансформирующий фактор роста β3 (Τ0Εβ3), интерлейкин 1, интерлейкин 2, интерлейкин 3 и интерлейкин 6, ΑΖΤ, антитела против фактора некроза опухоли, противовирусные средства и иммуносупрессоры, такие как циклоспорин. Кроме того, к эритропоэтину или одному из тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению можно присоединить красители или маркеры для визуализации клеток, тканей или органов в мозге и других органах, имеющих барьер, для диагностических целей.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения любой из вышеуказанных тканевых протективных цитокинов пригоден для получения фармацевтической композиции для облегчения прохождения молекулы через эндотелиальный клеточный барьер у млекопитающего. Связь может быть, например, лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной связью со связывающим сайтом молекулы. Эндотелиальные клеточные барьеры могут представлять собой гематоэнцефалический барьер, гематоглазной барьер, гематосеменниковый барьер, гематояичниковый барьер и гематоплацентарный барьер. Подходящие молекулы для транспорта способом по настоящему изобретению включают гормоны, такие как гормон роста, антибиотики, противовирусные препараты, краски, маркеры и противоопухолевые средства, в качестве некоторых неограничивающих примеров.
В одном воплощении фармацевтическая композиция по изобретению содержит терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина, по меньшей мере одно противовоспалительное средство и фармацевтически приемлемый носитель. В близком воплощении противовоспалительное средство выбрано из группы, состоящей из кортикостероидов, глюкокортикоидов, стероидов, нестероидных противовоспалительных препаратов, бета-агонистов, антихолинергических средств, метилксантинов, инъекционных препаратов на основе золота, сульфасалазина, пеницилламина, противоангиогенных средств, дапзона, псораленов, противомалярийных препаратов, противовирусных средств и антибиотиков.
В одном воплощении изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию по изобретению, содержащую терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина, по меньшей мере одно противовоспалительное средство и/или по меньшей мере одно иммуномодулирующее средство и фармацевтически приемлемый носитель, при условии, что противовоспалительное средство или иммуномодулирующее средство не являются αΜδΗ или анти-ΤΝΕ. В близком воплощении противовоспалительное средство или иммуномодулирующее средство не являются антителом.
В одном воплощении изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию по изобретению, состоящую, в основном, из терапевтически эффективного количества тканевого протективного цитокина и содержащую по меньшей мере одно противовоспалительное средство и/или по меньшей мере одно иммуномодулирующее средство и фармацевтически приемлемый носитель.
Изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, которая содержит терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина, по меньшей мере одно иммуномодулирующее
- 5 010371 средство и фармацевтически приемлемый носитель. В близком воплощении противовоспалительное средство выбрано из группы, состоящей из метотрексата, лефлуномида, циклофосфамида, цитоксана, иммурана, циклоспорина А, миноциклина, азатиоприна, антибиотиков, метилпреднизолона, кортикостероидов, стероидов, микофенолата мофетила, рапамицина, мизорибина, дезоксиспергуалина, бреквинара, малононитриламидов, модуляторов рецепторов Т-клеток и модуляторов рецепторов цитокинов.
Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, описанную выше, где указанный тканевой протективный цитокин выбран из группы, состоящей из: ί) эритропоэтина, в котором отсутствуют остатки сиаловой кислоты; ίί) эритропоэтина, в котором отсутствуют Ν-связанные или О-связанные углеводы; ίίί) эритропоэтина, имеющего пониженное содержание углеводов, в результате обработки природного эритропоэтина по меньшей мере одной гликозидазой; ίν) эритропоэтина, имеющего по меньшей мере один или более окисленных углеводов; ν) эритропоэтина, содержащего по меньшей мере один или более окисленных углеводов, которые восстановлены химическим способом; νί) эритропоэтина, содержащего по меньшей мере один или более модифицированных остатков аргинина; νίί) эритропоэтина, содержащего по меньшей мере один или более модифицированных остатков лизина или модификацию Ν-концевой аминогруппы в молекуле эритропоэтина; νίίί) эритропоэтина, содержащего по меньшей мере модифицированный остаток тирозина; ίχ) эритропоэтина, содержащего модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты; х) эритропоэтина, содержащего, по меньшей мере, модифицированный остаток триптофана; χί) эритропоэтина, имеющего по меньшей мере одну удаленную аминогруппу; χίί) эритропоэтина, содержащего, по меньшей мере, разрыв по меньшей мере одной цистиновой связи в молекуле эритропоэтина; и χίίί) усеченного эритропоэтина.
В одном воплощении способ лечения воспаления у млекопитающего, имеющего реактивные клетки, ткани и/или органы, включает введение млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина и фармацевтически приемлемый носитель. В близком воплощении у тканевого протективного цитокина отсутствует по меньшей мере одна активность, выбранная из группы, состоящей из повышения гематокрита, сужения сосудов, гиперактивации тромбоцитов, способствования коагулянтной активности крови и повышения продукции тромбоцитов.
Еще в одном воплощении способ лечения воспаления у млекопитающего, имеющего реактивные клетки, ткани и/или органы, включает введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей профилактически или терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина и фармацевтически приемлемый носитель, и введение млекопитающему профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более противовоспалительных или иммуномодулирующих средств. В одном воплощении противовоспалительное средство выбрано из группы, состоящей из кортикостероида, глюкокортикоида, стероида, нестероидного противовоспалительного препарата, бета-агониста, антихолинергического средства, метилксантина, инъекционного препарата на основе золота, сульфасалазина, пеницилламина, противоангиогенного средства, дапзона, псоралена, противомалярийного препарата, противовирусного средства и антибиотика.
В одном воплощении изобретение обеспечивает способ лечения воспаления у млекопитающего, имеющего реактивные клетки, ткани и/или органы, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей профилактически или терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина и фармацевтически приемлемый носитель, и введение млекопитающему профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более противовоспалительных или иммуномодулирующих средств, при условии, что противовоспалительное средство или иммуномодулирующее средство не является αΜ8Η или анти-ТНЕ. В близком воплощении противовоспалительное средство или иммуномодулирующее средство не является антителом.
Еще в одном воплощении иммуномодулирующее средство выбрано из группы, состоящей из белкового соединения, пептидного миметика, антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, малой молекулы, органического соединения, неорганического соединения, метотрексата, лефлуномида, циклофосфамида, цитоксана, иммурана, циклоспорина А, миноциклина, азатиоприна, антибиотика, метилпреднизолона (МР), кортикостероида, стероида, микофенолата мофетила, рапамицина, мизорибина, дезоксиспергуалина, бреквинара, малононитрилоамида, модулятора рецепторов Т-клеток и модулятора рецепторов цитокинов.
Изобретение обеспечивает способ, описанный выше, где указанный тканевой защитный цитокин является: ί) эритропоэтином, в котором отсутствуют остатки сиаловой кислоты; ίί) эритропоэтином, в котором отсутствуют Ν-связанные или О-связанные углеводы; ίίί) эритропоэтином, имеющим пониженное содержание углеводов, в результате обработки природного эритропоэтина по меньшей мере одной гликозидазой; ίν) эритропоэтином, имеющим по меньшей мере один или более окисленных углеводов; ν) эритропоэтином, содержащим по меньшей мере один или более окисленных углеводов, которые восстановлены химическим способом; νί) эритропоэтином, содержащим по меньшей мере один или более модифицированных остатков аргинина; νίί) эритропоэтином, содержащим по меньшей мере один или более модифицированных остатков лизина или модификацию Ν-концевой аминогруппы в молекуле эритропоэтина; νίίί) эритропоэтином, содержащим, по меньшей мере, модифицированный остаток тирозина; ίχ) эритропоэтином, содержащим модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
- 6 010371
х) эритропоэтином, содержащим, по меньшей мере, модифицированный остаток триптофана; χί) эритропоэтином, имеющим по меньшей мере одну удаленную аминогруппу; χίί) эритропоэтином, содержащим, по меньшей мере, разрыв по меньшей мере одной цистиновой связи в молекуле эритропоэтина; и χίίί) усеченным эритропоэтином.
В одном воплощении тканевой протективный цитокин в композициях и способах, описанных выше, представляет собой асиалоэритропоэтин или фенилглоксальэритропоэтин. В другом воплощении тканевой протективный цитокин способен проходить через эндотелиальный клеточный барьер. Эндотелиальный клеточный барьер выбран из группы, состоящей из гематоэнцефалического барьера, гематоглазного барьера, гематосеменникового барьера, гематояичникового барьера и гематоматочного барьера.
В одном воплощении реактивные клетки, ткани и/или органы у млекопитающего, которые являются мишенями для фармацевтических композиций и способов по изобретению, выбраны из группы, состоящей из нейронов, клеток сетчатки, мышц, сердца, легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, клеток капилляров, эндотеллальных клеток, клеток семенников, яичников, эндометрия и стволовых клеток. В другом воплощении реактивные клетки млекопитающих дополнительно включают клетки, выбранные из группы, состоящей из клеток фоторецептора, клеток ганглия, биполярных клеток, горизонтальных клеток, амакриновых клеток, клеток Мюллера, клеток миокарда, клеток водителя ритма, клеток синусно-предсердного узла, клеток синусного узла, клеток атриовентрикулярного узла, клеток пучка Гиса, гепатоцитов, звездчатых клеток, купферовых клеток, мезангиальных клеток, бокаловидных клеток, клеток кишечных желез, энтеральных эндокринных клеток, клеток клубочковой зоны, клеток пучков, ретикулярных клеток, хромаффинных клеток, перицитов, клеток Лейдига, клеток Сертоли, сперматозоидов, фолликулярных клеток Граффиана, клеток примордиальных фолликулов, клеток стромы эндометрия и клеток эндометрия.
Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию и способы лечения воспаления у млекопитающего, описанные выше, где указанный тканевой протективный цитокин представляет собой асиалоэритропоэтин. В предпочтительных воплощениях асиалоэритропоэтин является человеческим асиалоэритропоэтином. Тканевой протективный цитокин предпочтительно представляет собой эритропоэтин без О-связанных углеводов. В одном воплощении тканевой протективный цитокин является эритропоэтином, обработанным по меньшей мере одной гликозидазой. В другом воплощении тканевой протективный цитокин представляет собой окисленный периодатом эритропоэтин. Предпочтительно окисленный периодатом эритропоэтин восстановлен химически с использованием цианоборгидрида натрия. В одном воплощении тканевой протективный цитокин является эритропоэтином, содержащим Я-глиоксальную группу в одном или более остатках аргинина, где Я представляет арил или алкил. Предпочтительно эритропоэтин представляет собой фенилглиоксальэритропоэтин. В другом воплощении тканевой протективный цитокин является эритропоэтином, в котором по меньшей мере один остаток аргинина модифицирован взаимодействием со смежным дикетоном, выбранным из группы, состоящей из 2,3-бутандиона и циклогександиона. Еще в одном воплощении тканевой протективный цитокин по изобретению представляет собой эритропоэтин, в котором по меньшей мере один остаток аргинина взаимодействует с 3-дезоксиглюкозоном. Еще в одном воплощении тканевой протективный цитокин является молекулой эритропоэтина, содержащей по меньшей мере один биотинилированный лизин или Ν-концевую аминогруппу. Молекула эритропоэтина может быть биотинилированным эритропоэтином.
Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию и способы лечения воспаления у млекопитающего, включающие тканевой протективный цитокин, который является глюцитолиллизинэритропоэтином или фруктозиллизинэритропоэтином.
В одном воплощении тканевой протективный цитокин в фармацевтических композициях и способах по изобретению представляет собой эритропоэтин, содержащий по меньшей мере один остаток карбамилированного лизина. В другом воплощении карбамилированный эритропоэтин выбран из группы, состоящей из альфа-№карбамоилэритропоэтина; Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтина; альфа-№карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтина; альфа-№карбамоиласиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-карбамоиласиалоэритропоэтина; альфа-Ы-карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоиласиалоэритропоэтина; альфа-Ы-карбамоилгипосиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-карбамоилгипосиалоэритропоэтина и альфа-Л-карбамоил, Ν-элсилон-карбамоилгипосиалоэритропоэтина.
В одном воплощении тканевой протективный цитокин в фармацевтических композициях и способах по изобретению представляет эритропоэтин, в котором по меньшей мере один остаток лизина ацилирован. В другом воплощении остаток лизина указанного эритропоэтина ацетилирован. Еще в одном воплощении ацетилированный эритропоэтин выбран из группы, состоящей из альфа-М-ацетилэритропоэтина; Ν-эпсилон-ацетилэритропоэтина; альфа-К-ацетил, Ν-эпсилон-ацетилэритропоэтина; альфа-И-ацетиласиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-ацетиласиалоэритропоэтина; альфа-Н-ацетил, Ν-эпсилон-ацетиласиалоэритропоэтина; альфа-N-ацетилгипосиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-ацетилгипосиалоэритропоэтина и альфа-П-ацетил, Ν-эпсилон-ацетилгипосиалоэритропоэтина.
В одном воплощении тканевой протективный цитокин в фармацевтических композициях и способах по изобретению представляет собой эритропоэтин, содержащий сукцинилированный остаток лизина. В одном воплощении эритропоэтин выбран из группы, состоящей из альфа-N-сукцинилэритропоэтина;
- 7 010371
Ы-эпсилон-сукцинилэритропоэтина; альфа-Ы-сукцинил, Ы-эпсилон-сукцинилэритропоэтина; альфа-Ы-сукциниласиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-сукциниласиалоэритропоэтина; альфа-Ы-сукцинил, Ν-эпсилонсукциниласиалоэритропоэтина; альфа-Ы-сукцинилгипосиалоэритропоэтина; Ы-эпсилон-сукцинилгипосиалоэритропоэтина и альфа-Ы-сукцинил, Ы-эпсилон-сукцинилгипосиалоэритропоэтина.
В одном воплощении тканевой протективный цитокин в фармацевтических композициях и способах по изобретению представляет собой эритропоэтин по меньшей мере с одним остатком лизина, модифицированным с помощью соли 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты. В одном аспекте соль представляет 2,4,6-тринитробензолсульфонат натрия.
Еще в одном воплощении тканевой протективный цитокин в фармацевтических композициях и способах по изобретению представляет эритропоэтин, в котором по меньшей мере один остаток тирозина нитрирован и/или йодирован.
Еще в одном воплощении тканевой протективный цитокин в фармацевтических композициях и способах по изобретению представляет эритропоэтин, в котором остаток аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты взаимодействует с карбодиимидом с последующим взаимодействием с амином. В одном аспекте изобретения амин представляет собой глицинамид.
В одном воплощении тканевой протективный цитокин в фармацевтических композициях и способах по изобретению, описанных выше, используется для лечения воспаления, развившегося в результате болезненного состояния или травмы. В одном воплощении травма выбрана из группы, состоящей из ангиита, хронического бронхита, панкреатита, остеомиелита, ревматоидного артрита, гломерулонефрита, неврита оптического нерва, временного артрита, энцефалита, менингита, поперечного миелита, дерматомиозита, полимиозита, некротизирующего фасцита, гепатита и некротизирующего энтероколита.
В одном воплощении тканевой протективный цитокин в фармацевтических композициях и способах по изобретению подавляет воспаление, возникшее в результате цитокинов, продуцированных глиальными клетками. Еще в одном воплощении воспаление «запускается» апоптозом.
По одному аспекту изобретения тканевой протективный цитокин можно использовать для получения фармацевтической композиции для лечения воспаления у млекопитающего, имеющего реактивные клетки, ткани и/или органы. По некоторым аспектам у тканевого протективного цитокина отсутствует по меньшей мере одна активность, выбранная из группы, состоящей из повышения гематокрита, сужения сосудов, гиперактивации тромбоцитов, способствования коагулянтной активности и повышения продукции тромбоцитов. В одном воплощении воспаление возникает в результате болезненного состояния или травмы.
Еще в одном воплощении травма вызвана припадком, рассеянным склерозом, кровоизлиянием, гипотензией, остановкой сердца, ишемией, инфарктом миокарда, возрастным снижением познавательной функции, повреждениями в результате облучения, церебральным параличом, нейродегенеративным заболеванием, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Лейдига, деменцией при СПИДе, потерей памяти, амиотрофическим боковым склерозом, алкоголизмом, эмоциональным расстройством, тревогой, дефицитом внимания, аутизмом, болезнью Крейтцфельда-Якоба, травмой головного мозга, травмой спинного мозга, ишемией мозга, ишемией спинного мозга, сердечно-легочным анастомозом, хронической сердечной недостаточностью, дегенерацией желтого пятна, диабетической невропатией, диабетической ретинопатией, глаукомой, ишемией сетчатки или травмой сетчатки.
Изобретение обеспечивает применение тканевого протективного цитокина для получения фармацевтической композиции для лечения воспаления у млекопитающего, имеющего реактивные клетки, ткани и/или органы, где фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина, по меньшей мере одно противовоспалительное средство или иммуномодулирующее средство и фармацевтически приемлемый носитель. В одном воплощении тканевой протективный цитокин представляет собой: ί) эритропоэтин, в котором отсутствуют остатки сиаловой кислоты; ίί) эритропоэтин, в котором отсутствуют Ы-связанные или О-связанные углеводы; ίίί) эритропоэтин, имеющий пониженное содержание углеводов, в результате обработки природного эритропоэтина по меньшей мере одной гликозидазой; ίν) эритропоэтин, имеющий по меньшей мере один или более окисленных углеводов; ν) эритропоэтин, содержащий по меньшей мере один или более окисленных углеводов, которые восстановлены химическим способом; νί) эритропоэтин, содержащий по меньшей мере один или более модифицированных остатков аргинина; νίί) эритропоэтин, содержащий по меньшей мере один или более модифицированных остатков лизина или модификацию Ы-концевой аминогруппы в молекуле эритропоэтина; νίίί) эритропоэтин, содержащий, по меньшей мере, модифицированный остаток тирозина; ίχ) эритропоэтин, содержащий модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты; х) эритропоэтин, содержащий, по меньшей мере, модифицированный остаток триптофана; χί) эритропоэтин, имеющий по меньшей мере одну удаленную аминогруппу; χίί) эритропоэтин, содержащий, по меньшей мере, разрыв по меньшей мере одной цистиновой связи в молекуле эритропоэтина; и χίίί) усеченный эритропоэтин.
Данные и другие аспекты настоящего изобретения станут более понятными при обращении к последующим фигурам и подробному описанию.
- 8 010371
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлено распределение рецепторов эритропоэтина в мозге здорового человека, в тонких срезах, окрашенных антителами против эритропоэтина.
Фиг. 2 представляет сильное увеличение снимка на фиг. 1.
На фиг. 3 показано ультраструктурное распределение рецепторов эритропоэтина с использованием меченных золотом вторичных антител.
На фиг. 4, полученной аналогично фиг. 3, показана высокая плотность рецепторов эритропоэтина в просвете и с противоположной просвету поверхностях капилляров мозга человека.
На фиг. 5 проводится сравнение эффективности эритропоэтина и асиалоэритропоэтина в отношении жизнеспособности клеток Р19 при истощении сыворотки крови.
На фиг. 6 представлены данные другого опыта, в котором сравнивается эффективность эритропоэтина и асиалоэритропоэтина в условиях ίη νίίτο на жизнеспособность клеток Р19 при истощении сыворотки крови.
На фиг. 7 показано защитное действие эритропоэтина и асиалоэритропоэтина на модели очаговой ишемии мозга на крысах.
На фиг. 8 показано сравнение зависимости доза-ответная реакция по эффективности человеческого эритропоэтина и человеческого асиалоэритропоэтина при окклюзии средней церебральной артерии на модели ишемического инсульта.
На фиг. 9 показана активность йодированного эритропоэтина в тесте на клетках Р19.
На фиг. 10 показана активность биотинилированного эритропоэтин и асиалоэритропоэтина в тесте на клетках Р19.
На фиг. 11 представлено сравнение эффективности эритропоэтина и фенилглиоксальмодифицированного эритропоэтина на жизнеспособность клеток Р19 при истощении сыворотки крови.
На фиг. 12 показано влияние тканевых протективных цитокинов в тесте интоксикации водой.
На фиг. 13 представлено проникновение парентерально введенного эритропоэтина в спинно-мозговую жидкость.
На фиг. 14 показано поддержание функции сердца, приготовленного для трансплантации, под действием эритропоэтина.
На фиг. 15 представлено защитное действие эритропоэтина на миокард от ишемического повреждения после временной окклюзии сосудов.
На фиг. 16 представлено влияние обработки эритропоэтином на модели глаукомы на крысах.
На фиг. 17 показана степень сохранения функции сетчатки под действием эритропоэтина на модели глаукомы на крысах.
На фиг. 18 показано восстановление познавательной функции после травмы мозга введением эритропоэтина, начиная через 5 суток после травмы.
На фиг. 19 показано восстановление познавательной функции после травмы мозга введением эритропоэтина, начиная через 30 суток после травмы.
На фиг. 20 показана эффективность человеческого асиалоэритропоэтина на модели церебральной токсичности с каинатом.
На фиг. 21 показана эффективность тканевых протективных цитокинов на модели повреждения спинного мозга на крысах.
На фиг. 22 показана эффективность тканевых протективных цитокинов на модели повреждения спинного мозга на кроликах.
На фиг. 23 представлен венечный срез кортикального слоя мозга, окрашенный гематоксилинэозином.
На фиг. 24 представлены венечные срезы лобной коры, смежной с областью инфаркта, окрашенные антителами СРЛР.
На фиг. 25 представлены венечные срезы кортикального слоя мозга, окрашенные антителами ОХ-42.
На фиг. 26 представлены венечные срезы кортикального слоя мозга, смежного области инфаркта, окрашенные антителами ОХ-42.
На фиг. 27 показана эффективность эритропоэтина против воспаления на модели ЕАЕ.
На фиг. 28 приводится сравнение действия дексаметазона и эритропоэтина при воспалении на модели ЕАЕ.
На фиг. 29 показано, что эритропоэтин подавляет воспаление, связанное с гибелью нейронов.
Подробное описание изобретения
Способы по изобретению обеспечивают местное или системное защитное действие или стимуляцию клеток, тканей или органов в организме млекопитающего в самых различных нормальных и неблагоприятных условиях или защитное действие для таковых, предназначенных для трансплантации в организм другого млекопитающего. Кроме того, также обеспечивается восстановление или регенерация нарушенной функции. Как уже отмечалось выше, способность эритропоэтина проходить через плотный эндотелиальный клеточный барьер и оказывать его положительное действие на реактивные клетки (а также другие типы клеток), отделенные от сосудистой сети, представляет потенциальную возможность для профилактики, а также лечения самых разнообразных патологических состояний и заболеваний, кото
- 9 010371 рые, в противном случае, являются причиной значительного повреждения клеток и тканей у животного, включая человека, и, кроме того, позволяет успешно проводить представленные выше трудновыполнимые хирургические вмешательства, при которых традиционно риск превышает положительный эффект.
Эритропоэтин представляет гликопротеидный гормон, который у людей имеет молекулярную массу, равную 34 кДа. Зрелый белок содержит 165 аминокислот, и гликозильные остатки составляют примерно 40% от массы молекулы. Имеется промышленно доступный эритропоэтин, например, под торговыми названиями РК.ОСК1Т производства Оййо Вю1сс11 1пс., Яагйаи, N1 и ΕΡΘΟΕΝ производства Людей, 1пс., Тйоикапб Оакк, СА. Кроме того, можно использовать разнообразные системы хозяев для экспрессии и продукции рекомбинантного эритропоэтина, включая, но не ограничиваясь клеточными системами бактерий, дрожжей, насекомых, растений и млекопитающих, включая человека. Например, рекомбинантный эритропоэтин, продуцированный бактериями, которые не гликозилируют или сиалилтируют продукт, можно использовать для получения негликозилированных форм эритропоэтина. Альтернативно рекомбинантный эритропоэтин можно получить в других системах, которые осуществляют гликозилирование, например, с использованием растений, включая человеческие клетки. Формы эритропоэтина, пригодные для практики настоящего изобретения, включают химические модификации и/или модификации с опосредуемым экспрессирующими системами гликозилированием природных, синтетических и рекомбинантных форм человеческого эритропоэтина и других млекопитающих.
«Реактивные клетки» относятся к клеткам млекопитающих, функционирование или жизнеспособность которых может поддерживаться, усиливаться, стимулироваться, регенерироваться или положительно изменяться иначе, под действием эритропоэтина. Неограничивающие примеры подобных клеток включают нейроны, клетки сетчатки, мышц, сердца, легких, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров, семенников, яичников, поджелудочной железы, кости, кожи или эндометрия. В частности, реактивные клетки включают, без ограничения, нейроны; клетки сетчатки: фоторецептора (палочек и конусов), клетки ганглия, биполярные, горизонтальные, амакриновые клетки и клетки Мюллера; мышечные клетки; сердечные клетки: миокарда, водителя ритма, синусно-предсердного узла, синусного узла и соединительной ткани (атриовентрикулярного узла и пучка Гиса); легочные клетки; клетки печени: гепатоциты, звездчатые клетки, купферовы клетки; почечные клетки: мезангиальные клетки, клетки почечного эпителия, интерстициальные клетки почечных канальцев; клетки тонкого кишечника: бокаловидные клетки, клетки кишечных желез (крипт) и энтеральные, эндокринные клетки; клетки коры надпочечников: клетки клубочковой зоны, пучков и ретикулярные клетки; клетки мозгового вещества надпочечников: хромаффинные клетки; капиллярные клетки: перициты; клетки семенников: клетки Лейдига, Сертоли и сперматозоиды и их предшественники; клетки яичника: фолликулярные клетки Граффиана, клетки примордиальных фолликулов; эндометриальные клетки: клетки стромы эндометрия и эндометрия; клетки поджелудочной железы: островков Лангерганса, α-клетки, β-клетки, γ-клетки, Е-клетки; клетки кожи; костные клетки: преостеобласты, остеокласты, остеобласты; а также стволовые и эндотелиальные клетки, имеющиеся в вышеуказанных органах. Кроме того, такие реактивные клетки и положительные эффекты, обеспеченные для них эритропоэтином, можно распространить, с обеспечением протективного действия или стимуляции, опосредованно на другие клетки, которые сами не являются реактивными, или ткани, или органы, содержащие такие нереактивные клетки. Данные другие клетки, или ткани, или органы, для которых обеспечивается опосредованное положительное действие в результате стимуляции реактивных клеток, находятся в виде части клеток, ткани или органа в виде «связанных» клеток, тканей или органов. Таким образом, положительное действие эритропоэтина, описанное здесь, можно обеспечить в результате наличия небольшого количества реактивных клеток в ткани или органе, например возбудимая или нервная ткань присутствует в такой ткани, или клетки Лейдига в семенниках, которые продуцируют тестостерон. В одном аспекте реактивные клетки или связанные с ними клетки, ткани или органы не являются возбудимыми клетками, тканями или органами или преимущественно не включают возбудимые клетки или ткани.
Продолжительность или степень целенаправленных неблагоприятных условий, индуцированных для получения конечного положительного действия, таких как химиотерапия в высоких дозах, лучевая терапия, пролонгированное поддержание трансплантата в условиях ех νίνο и длительные периоды индуцированной хирургическим вмешательством ишемии, можно проводить с использованием преимуществ настоящего изобретения. Однако изобретение не ограничивается таким образом и включает в одном аспекте способы или композиции, где реактивные клетки-мишени отделены от сосудистой сети посредством эндотелиального клеточного барьера или эндотелиальных плотных соединений. В основном, изобретение относится к любым реактивным клеткам и связанным с ними клеткам, тканям и органам, для которых обеспечивается преимущество в результате воздействия эритропоэтина. Кроме того, нарушение функции клетки, ткани или органа можно восстановить или регенерировать после короткого неблагоприятного события (например, травмы) воздействием эритропоэтина.
Изобретение, в основном, относится к применению эритропоэтина для получения фармацевтических композиций, предназначенных для вышеуказанных целей, где функция клетки поддерживается, усиливается, стимулируется, регенерируется или любым другим путем улучшается. Изобретение также относится к способам поддержания, стимуляции, усиления или регенерации функции клеток введением
- 10 010371 млекопитающему эффективного количества эритропоэтина, описанного здесь. Изобретение дополнительно относится к способам поддержания, усиления, стимуляции или регенерации функции клеток в условиях ех νίνο воздействием на клетки, ткань или орган эритропоэтином. Изобретение также относится к перфузату, содержащему эритропоэтин, для применения при консервации органа или ткани.
В различных способах по изобретению применяется фармацевтическая композиция, которая содержит, по меньшей мере, эритропоэтин в эффективном количестве для конкретного пути и продолжительности воздействия для проявления положительных эффектов или преимущественного действия на реактивные клетки, находящиеся в или удаленные из организма млекопитающего. В тех случаях, когда для мишеневых клеток, тканей или органов, предназначенных для лечения, требуется, чтобы эритропоэтин проходил через эндотелиальный клеточный барьер, то фармацевтическая композиция содержит эритропоэтин в концентрации, которая способна, после прохождения через барьер из эндотелиальных клеток, оказывать желательное действие на реактивные клетки. Молекулы, способные взаимодействовать с рецептором эритропоэтина или модулировать активность рецептора, относящиеся здесь к модуляторам активности эритропоэтина или рецептора эритропоэтина, являются пригодными в контексте настоящего изобретения. Такие молекулы могут представлять собой, например, природные, синтетические или рекомбинантные формы молекул эритропоэтина, описанные выше, или другие молекулы, которые необязательно каким-то образом схожи с эритропоэтином, за исключением модуляции активности эритропоэтина в отношении реактивных клеток, описанных здесь.
В дополнении к вышеуказанным тканевым протективным свойствам, эритропоэтин чаще ассоциируется с его воздействием на костный мозг, например со способностью повышать гематокрит (эритропоэз), сужать сосуды (высокое кровяное давление), гиперактивировать тромбоциты, способствовать коагулянтной активности и повышать продукцию тромбоцитов. Однако данные эффекты на костный мозг могут представлять определенный риск при длительном или кратковременном введении эритропоэтина для лечения нарушенных функций клеток, ткани или органа, обсужденных выше. Следовательно, изобретение, в основном, относится к применению тканевых протективных цитокинов, которые представляют химически модифицированный эритропоэтин, у которого предпочтительно отсутствует один или более эффектов эритропоэтина на костный мозг. Более предпочтительно, когда тканевые протективные цитокины не влияют на эритропоэз; наиболее предпочтительно, если у тканевых протективных цитокинов отсутствуют все эффекты эритропоэтина в отношении костного мозга. В других воплощениях у тканевого протективного цитокина отсутствуют два из вышеуказанных эффектов или любые три из вышеуказанных эффектов.
Кроме того, тканевые протективные цитокины, желательные для применений, описанных здесь, можно получить гуанидированием, амидированием, карбамилированием (карбамоилированием), тринитрофенилированием, ацетилированием, сукцинилированием, нитрованием или модификацией остатков аргинина, лизина, тирозина, триптофана или цистеина или карбоксильных групп, среди прочих методов, таких как ограниченный протеолиз, удаление аминогрупп и/или замена в результате мутации остатков аргинина, лизина, тирозина, триптофана или цистеина в молекуле эритропоэтина с использованием методов молекулярной биологии. Предпочтительно, если данные химические модификации затрагивают четыре известных рецепторных области - ΥΕ-ΟΒΥ (БЕО ΙΌ N0: 1), ΤΕΥΝΕΥΑΧν (БЕО ΙΌ N0: 2), БОЖБЕТТЬ (БЕО ΙΌ N0: 3) или Б№ЬК.О (БЕО ΙΌ N0: 4). Более предпочтительно, если данные рецепторные области, которые являются основными по своей природе, модифицируют с помощью химической модификации основных аминокислот, аргинина и лизина, в данных областях. Кроме того, можно также химически модифицировать участки молекулы, окружающие данные рецепторные области, для изменения кинетики или связывающих свойств рецептора молекулы. В результате этого можно получить тканевые протективные цитокины, которые сохраняют адекватный уровень активности в отношении конкретных органов и тканей, но не для других, например эритроцитов (например, Ба1аке е1 а1., 1990, ВюсЫш. Βίορίινδ. Ас1а 1038: 125-9; полностью включено здесь для ссылки). Одним неограничивающим примером, описанным ниже, является модификация остатков аргинина в молекуле эритропоэтина взаимодействием с глиоксалем, таким как фенилглиоксаль (по способу ТакайакЫ, 1977, 1. ВюсЬет. 81: 395-402). Как станет очевидным ниже, такая молекула тканевого протективного цитокина полностью сохраняет ее нейротрофическое действие. Такие молекулы тканевых протективных цитокинов полностью включаются для различных применений и композиций, описанных здесь.
Традиционно активность (в единицах) эритропоэтина или эритропоэтинподобных молекул определяется на основе их эффективности стимулировать продукцию эритроцитов на моделях на грызунах (и она выражается в международных стандартах эритропоэтина). Одна единица (Е) обычного эритропоэтина (молекулярная масса -34000) равняется приблизительно 8 нг белка (1 мг белка соответствует примерно 125000 Е). Однако поскольку воздействие на эритропоэз является побочным по отношению к желаемым здесь активностям и необязательно является детектируемым свойством некоторых тканевых протективных цитокинов по изобретению, то определение активности определенных тканевых протективных цитокинов по изобретению на основе эритропоэтической активности является неподходящим. Таким образом, в том смысле, в котором она здесь используется, единица активности эритропоэтина или тканевых протективных цитокинов определяется как количество белка, необходимое для проявления
- 11 010371 аналогичной активности на нейронах или других реактивных клеточных системах, какая проявляется международным стандартом эритропоэтина ВОЗ в той же системе. Специалисты в данной области легко определят единицы не влияющего на эритропоэз эритропоэтина или молекулы близкого тканевого протективного цитокина, следуя представленным здесь указаниям.
В дополнении к вышеуказанным тканевым протективным цитокинам, последующее обсуждение касается различных тканевых протективных цитокинов по изобретению.
Тканевой протективный цитокин по изобретению может включать эритропоэтин, не содержащий, по меньшей мере, остатков сиаловой кислоты, относящийся к асиалоэритропоэтину. Предпочтительно тканевой протективный цитокин по изобретению представляет собой человеческий асиалоэритропоэтин. Его можно получить десиалилтированием эритропоэтина с использованием сиалидазы, такой как описана на упаковке производителя для сиалидазы А производства Рго2уте 1пс., 8ап Ьеапйго, Калифорния. Как правило, ΡΚΌΖΥΜΕ® ОЬУСОРКО® сиалидаза А™ для секвенирования (Ν-ацетилнейраминат гликогидролазы, ЕС 3.2.1.18) используется для отщепления всех невосстанавливающих концевых остатков сиаловой кислоты от комплекса углеводов и гликопротеинов, такого как эритропоэтин. Она также будет отщеплять разветвленные сиаловые кислоты (связанные с внутренним остатком). Сиалидазу А выделяют из клона Лг111гоЬас1ег игеакааепк.
В неограничивающем примере вышепредставленного способа эритропоэтин можно подвергнуть десиалилтированию под действием сиалидазы (0,025 Е/мг ЕРО) при 37°С в течение 3 ч, после чего эритропоэтин можно обессолить и сконцентрировать. После пропускания через ионообменную колонку с использованием системы АКТАРВ1МЕ™ (Лтегкйат Рйагтааа Вю1ес11) и элюирования выбранными буферами отбирают фракции, включающие только две верхние полосы, идентифицированные иммуноэлектрофорезом (мигрирующие при р1 »8,5 и »7,9 на геле ΙΕΕ). Не должно детектироваться значительного количества сиаловой кислоты в данном препарате тканевого протективного цитокина.
В альтернативных воплощениях тканевой протективный цитокин по изобретению может представлять эритропоэтин, содержащий по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков сиаловой кислоты, полученный частичным десиалилтированием вышеуказанным способом. Данные тканевые протективные цитокины, полученные в результате частичного десиалилтирования эритропоэтина, также можно отнести к гипосиалоэритропоэтинам, и они могут представлять собой гомогенную композицию, например, только с 2 остатками сиаловой кислоты на молекулу эритропоэтина, или они могут быть гетерогенной смесью эритропоэтинов с самой различной степенью сиалилтирования, или, например, они могут иметь низкое количество, например, в среднем, примерно от 1 до примерно 4 молекул сиаловой кислоты на эритропоэтин или в другом примере большее количество, например, в среднем, примерно от 10 до примерно 13 остатков сиаловой кислоты на молекулу эритропоэтина. Такие смеси могут включать асиалоэритропоэтин или эритропоэтин.
Эритропоэтин, предназначенный для вышеуказанных применений, содержит по меньшей мере один или более остатков модифицированного аргинина. Например, модифицированный эритропоэтин может содержать В-глиоксальную группу в одном или более остатков аргинина, где В может быть арилом, гетероарилом, низшим алкилом, низшим алкокси, или циклоалкилом, или альфа-дезоксиглицитолилом. В том смысле, в котором он здесь используется, термин низший «алкил» означает нормальную или разветвленную насыщенную алифатическую углеводородную группу, предпочтительно содержащую 1-6 атомов углерода. Представителями таких групп являются метил, этил, изопропил, изобутил, бутил, пентил, гексил и т.п. Термин «алкокси» означает низший алкил, имеющий значения, определенные выше, соединенный с остальной частью молекулы через кислород. Примеры алкокси включают метокси, этокси, пропокси, изопропокси и т.п. Термин «циклоалкил» относится к циклическому алкилу, содержащему от 3 до примерно 8 атомов углерода, включая, например, циклопропил, циклобутил, циклогексил и т.п. Термин «арил» относится к фенилу и нафтилу. Термин «гетероарил» относится к гетероциклическим группам, содержащим 4-10 членов в кольце и 1-3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из атома кислорода, азота и серы. Примеры включают, но не ограничиваются изоксазолилом, фенилизоксазолилом, фурилом, пиримидинилом, хинолилом, тетрагидрохинолилом, пиридилом, имидазолилом, пирролидинилом, 1,2,4-триазолилом, тиазолилом, тиенилом и т.п. Группа В может быть замещена, как, например, 2,3,4-тригидроксибутил в 3-дезоксиглюкозоне. Типичными примерами В-глиоксальных соединений являются глиоксаль, метилглиоксаль, 3-дезоксиглюкозон и фенилглиоксаль. Предпочтительными В-глиоксальными соединениями являются метилглиоксаль или фенилглиоксаль. Примерный способ такой модификации можно найти у УегЬег е! а1., 1975, Нг. Е Меб. 8с1. 11 (11): 1169-70 с использованием фенилглиоксаля.
В дополнительном примере по меньшей мере один остаток аргинина можно модифицировать взаимодействием со смежным дикетоном, таким как 2,3-бутандион или циклогександион, предпочтительно примерно в 50 мМ боратном буфере при рН 8-9. Методику последней модификации с использованием 2,3-бутандиона можно провести согласно методу Вюгйап, 1973, Вюсйетщйу 12 (20): 3915-3923 и с циклогексаноном по методу Раййу е! а1., 1975, Е Вю1. Сйет. 250 (2): 565-9.
Тканевой протективный цитокин по изобретению может содержать по меньшей мере один или более
- 12 010371 остатков модифицированного лизина или модификацию Ν-концевой аминогруппы в молекуле эритропоэтина, такие модификации получают взаимодействием остатка лизина с модифицирующим аминогруппу агентом. Например, эритропоэтин или вышеуказанные асиалоэритропоэтин или гипосиалоэритропоэтин можно модифицировать ацетилированием, карбаминилированием, сукцинилированием, окислением или последующим карбоксиметиллизинированием, среди прочих способов, для модификации аминогрупп.
В неограничивающем примере тканевой протективный цитокин можно получить карбамилированием эритропоэтина или десиалилтированного эритропоэтина, такого как асиалоэритропоэтин, с помощью перекристаллизованного цианата калия в боратном буфере, после чего проводят тщательный диализ.
Аналогичным образом вышеуказанный эритропоэтин можно сукцинилировать взаимодействием с янтарным ангидридом с последующим диализом с получением тканевого протективного цитокина по настоящему изобретению.
Еще в одном воплощении тканевой протективный цитокин можно получить взаимодействием эритропоэтина с уксусным ангидридом в фосфатном буфере с ацетилированием эритропоэтина. Данную реакцию можно остановить диализом против воды. Способ описан 8а1аке е! а1. (1990). СЬет1са1 шобШсайои οί сгу111горо1сйп: ап шсгеаке ίη ίη-νίίτο ас1М1у Ьу диашбшабоп. ВюсЫшка е! ВюрЬущса Ас1а. 1038: 125-129.
В другом воплощении тканевые протективные цитокины представляют собой аддукты №е-(карбоксиметил)лизина (СМЬ) из эритропоэтина или асиалоэритропоэтина, полученные взаимодействием с глиоксиловой кислотой и NаВΗ3СN в натриевом фосфатном буфере с последующим диализом. АкЬ!аг е! а1., (1999). СопГотта1юпа1 йибу оГ №-(сагЬохуте1Ьу1)1у8ше аббиск оГ гесошЬшап! а-стуйаШпк. Сштеп! Еуе КекеатсЬ, 18: 270-276.
Еще в одном воплощении тканевой протективный цитокин получают модификацией остатков лизина эритропоэтина взаимодействием с производными глиоксаля, например взаимодействием с глиоксалем, метилглиоксалем и 3-дезоксиглюкозоном с образованием альфа-карбоксиалкильных производных. Примеры включают взаимодействие с глиоксалем с образованием остатка карбоксиметиллизина, как описано С1ошЬ апб Мопшет, 1995, 1. Вю1. СЬеш. 270 (17): 10017-26, или с метилглиоксалем с образованием остатка (1-карбоксиэтил)лизина, как описано ЭедепЬагб! е! а1., 1998, Се11. Мо1. Вю1. (№ощу-1е-дтапб) 44 (7): 1139-45. Остаток модифицированного лизина можно дополнительно химическим способом восстановить. Например, эритропоэтин можно биотинилировать по лизину, например, как описано в способе в примере 2, в котором Ν-гидроксисукцинимидовый эфир П-биотиноил-е-аминокапроновой кислоты подвергали взаимодействию с эритропоэтином с последующим удалением непрореагировавшего биотина гель-фильтрацией на колонке с Сеп1псоп 10, как описано \Уо)с1ю\\ък| апб СаДаке, 1989, В1ооб 74 (3): 952-8. В данной работе авторы применяют три различных способа биотинилирования эритропоэтина, любой из которых можно использовать для получения тканевых протективных цитокинов для применений по изобретению. Биотин можно добавить к: (1) остаткам сиаловой кислоты, (2) карбоксилатным группам или (3) аминогруппам.
В другом предпочтительном воплощении лизин можно подвергнуть взаимодействию с альдегидом или восстанавливающим сахаром с образованием имина, который можно стабилизировать восстановлением цианоборгидридом натрия с получением остатка Ν-алкилированного лизина, такого как глуцитолиллизин, или в случае применения восстанавливающих сахаров их можно стабилизировать перегруппировкой Амадори или Хейнса с получением альфа-дезокси-альфа-аминосахара, такого как остаток альфадезокси-альфа-фруктозиллизина в молекуле эритропоэтина. В качестве примера получение фруктозиллизинмодифицированного белка при инкубации с 0,5М раствором глюкозы в натриевом фосфатном буфере при рН 7,4 в течение 60 суток описано Макйа е! а1., 1992, 1. Вю1. СЬет. 267: 5133-5138. В другом примере группу лизина можно карбамилировать, например, взаимодействием с ионом цианата, или алкил- или арилкарбамилировать, или тиокарбамилировать взаимодействием с алкил- или арилизоцианатом, или ее можно ацилировать с помощью реакционноспособного производного алкил- или арилкарбоновой кислоты, например взаимодействием с уксусным ангидридом, или янтарным ангидридом, или фталевым ангидридом. Примером является модификация групп лизина 4-сульфофенилизотиоцианатом или уксусным ангидридом, как в обоих случаях описано Сао е! а1., 1994, Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 91 (25): 12027-30. Группы лизина можно также тринитрофенилировать взаимодействием с тринитробензолсульфоновой кислотой или предпочтительно с ее солями. Такие способы описаны ниже в примере 2.
По меньшей мере, остаток тирозина в молекуле эритропоэтина может быть модифицирован в положении ароматического кольца электрофильным реагентом, например, нитрованием или йодированием с получением тканевого протективного цитокина. В качестве неограничивающего примера эритропоэтин можно подвергнуть взаимодействию с тетранитрометаном (№с811сг е! а1., 1985, 1. Вю1. СЬет. 260 (12): 7316-21) или йодировать, как описано в примере 3. Например, йодирование с использованием №11 и предварительно покрытой пробирки для йодирования 1ОЭО-СЕ№ (Р1егсе, 28601) можно провести с эритропоэтином или асиалоэритропоэтином в натриевом фосфатном буфере.
Можно модифицировать, по меньшей мере, остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты, например, взаимодействием с карбодиимидом с последующим взаимодействием с амином, таким как, но не ограничиваясь глицинамидом.
- 13 010371
В другом примере остаток триптофана эритропоэтина можно модифицировать, например, взаимодействием с н-бромсукцинимидом или н-хлорсукцинимидом, следуя способам, таким как описаны 1о88е е! а1., Сйет. Βίο1. 1п1етас1., 1999, Мау 14; 119-120.
Еще в одном примере тканевой протективный цитокин можно получить удалением по меньшей мере одной аминогруппы природного эритропоэтина, например, взаимодействием с нингидрином с последующим восстановлением полученной карбонильной группы боргидридом.
Еще в одном примере тканевой протективный цитокин обеспечивается таким образом, что он имеет, по меньшей мере, разрыв по меньшей мере одной из цистиновых связей в молекуле эритропоэтина взаимодействием с восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол, с последующим взаимодействием полученных сульфгидрилов с йодацетамидом, йодуксусной кислотой или другим электрофилом для предупреждения преобразования дисульфидных связей. Как уже указывалось выше, альтернативно или в комбинации дисульфидные связи можно удалить при изменении молекулы цистеина, которая принимает участие в образовании реальной поперечной связи или по меньшей мере одного другого остатка аминокислоты, что приводит к неспособности эритропоэтина образовывать по меньшей мере одну из дисульфидных связей, находящихся в природной молекуле.
Тканевой протективный цитокин можно получить, подвергнув эритропоэтин ограниченному химическому протеолизу, который направлен на определенные остатки-мишени, например, с последующим отщеплением остатков триптофана. Такие полученные фрагменты эритропоэтина включаются в объем изобретения.
Как уже указывалось выше, тканевой протективный цитокин, пригодный для настоящих целей, может включать по меньшей мере одну из вышеуказанных модификаций, но может иметь более чем одну из вышеуказанных модификаций. В качестве примера тканевого протективного цитокина с одной модификацией в углеводной части молекулы и с одной модификацией в аминокислотной части тканевой протективный цитокин может представлять собой асиалоэритропоэтин и иметь биотинилированные или карбамилированные остатки лизина.
Кроме того, химически модифицированный эритропоэтин можно дополнительно модифицировать мутацией по меньшей мере одной аминокислоты эритропоэтина. Подобные мутации могут включать замены, делеции, включая внутренние делеции, добавления, включая добавления, дающие гибридные белки, или консервативные замены аминокислотных остатков в и/или смежной аминокислотной последовательности, но результатом которых является «молчащая» замена, в результате чего получается функционально эквивалентный эритропоэтин. Консервативные аминокислотные замены можно провести, основываясь на аналогии в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфотерной природы участвующих в этом остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Альтернативно неконсервативные аминокислотные замены и более крупные вставки и делеции можно использовать для получения функционально измененного эритропоэтина. Такие мутанты можно использовать для изменения свойств эритропоэтина желаемыми путями. Например, в одном воплощении эритропоэтин, пригодный для практики изобретения, может быть изменен по одной или более аминокислот в четырех функциональных доменах эритропоэтина, что оказывает влияние на связывание с рецепторами: \Е('Ж¥ (8ЕЕ) ΙΌ N0: 1), и/или ТКУЛЕУАУ (8ЕЕ) ГО N0: 2), и/или 8СЕН8ЕТТЕ (8ЕЕ) ГО N0: 3), и/или 8ΝΕΈΚ.Ο (8Е0 ΙΌ N0: 4). В другом воплощении можно использовать эритропоэтины, включающие мутации в окружающих участках молекулы, которые оказывают влияние на кинетику и свойства связывания с рецептором молекулы.
Данные дополнительные модификации можно использовать для повышения тканевого протективного действия, подавления воздействия на костный мозг или изменения физических свойств, таких как заряд, тканевого протективного цитокина.
Вышепредставленные в качестве примеров способы получения тканевых протективных цитокинов по изобретению являются только иллюстративными и неограничивающими, и для получения соединений по изобретению можно использовать данные или другие способы. Вышеуказанные названия, в которые включен способ получения, например «ацетилированный» или «биотинилированный», приводятся здесь только в качестве указания того, каким образом получено соединение, поскольку настоящее изобретение относится к соединениям, которые представляют собой продукты вышеуказанных реакций. Специалисты в данной области, очевидно, понимают, что выше приводятся соединения, которые являются продуктами вышеуказанных реакций. Кроме того, соединения по изобретению имеют информационные и тривиальные названия для определения объема модификаций по изобретению и того факта, что они могут иметь место в одном или более мест в молекуле эритропоэтина или модифицированного эритропоэтина. В качестве неограничивающих примеров последующие соединения представляют собой члены групп соединений, включенных в объем изобретения.
- 14 010371
1. Карбамилированные эритропоэтины.
Последующие соединения представляют карбамоильные группы в Ν-концевой аминокислоте в молекуле эритропоэтина («альфа-№карбамоил-») или в одной (или более) эпсилон-аминогруппе остатков лизила эритропоэтина («Ν-эпсилон-карбамоил-»). Конечно, могут иметь место множественные Ν-эпсилон-модификации с или без альфа-№модификации.
ί. Альфа-№карбамоилэритропоэтин;
ίί. Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтин;
ίίί. альфа-И-карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтин;
ίν. альфа-Ы-карбамоиласиалоэритропоэтин;
ν. Ν-эпсилон-карбамоиласиалоэритропоэтин;
νί. альфа-Л-карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоиласиалоэритропоэтин;
νίί. альфа-Ν-карбамоилгипосиалоэритропоэтин;
νίίί. Ν-эпсилон-карбамоилгипосиалоэритропоэтин и ίχ. альфа-Н-карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилгипосиалоэритропоэтин.
2. Сукцинилированные эритропоэтины.
Последующие соединения представляют сукцинильные группы в Ν-концевой аминокислоте в молекуле эритропоэтина («альфа-М-сукцинил-») или в одной (или более) эпсилон-аминогруппе остатков лизила в эритропоэтине («Ν-эпсилон-сукцинил-»). Конечно, могут иметь место множественные Ν-эпсилонмодификации с или без альфа-К-модификации.
ί. Альфа-N-сукцинилэритропоэтин;
ίί. Ν-эпсилон-сукцинилэритропоэтин;
ίίί. альфа-П-сукцинил, Ν-эпсилон-сукцинилэритропоэтин;
ίν. альфа-N-сукциниласиалоэритропоэтин;
ν. Ν-эпсилон-сукциниласиалоэритропоэтин;
νί. альфа-N-сукцинил, Ν-эпсилон-сукциниласиалоэритропоэтин;
νίί. альфа-Ν-сукцинилгипосиалоэритропоэтин;
νίίί. Ν-эпсилон-сукцинилгипосиалоэритропоэтин и ίχ. альфа-N-сукцинил, Ν-эпсилон-сукцинилгипосиалоэритропоэтин.
3. Ацетилированные эритропоэтины.
Последующие соединения содержат ацетильные группы в Ν-концевой аминокислоте в молекуле эритропоэтина («альфа-N-ацетил-») или в одной (или более) эпсилон-аминогруппе остатков лизила в эритропоэтине («Ν-эпсилон-ацетил-»). Конечно, могут иметь место множественные Ν-эпсилон-модификации с или без альфа-N-модификации.
ί. Альфа-N-ацетилэритропоэтин;
ίί. Ν-эпсилон-ацетилэритропоэтин;
ίίί. альфа-N-ацетил, Ν-эпсилон-ацетилэритропоэтин;
ίν. альфа-N-ацетиласиалоэритропоэтин;
ν. Ν-эпсилон-ацетиласиалоэритропоэтин;
νί. альфа-N-ацетил, Ν-эпсилон-ацетиласиалоэритропоэтин;
νίί. альфа-Ν-ацетилгипосиалоэритропоэтин;
νίίί. Ν-эпсилон-ацетилгипосиалоэритропоэтин и ίχ. альфа-N-ацетил, Ν-эпсилон-ацетилгипосиалоэритропоэтин.
4. Биотинилированные эритропоэтины.
Последующие соединения содержат биотинильные группы в Ν-концевой аминокислоте в молекуле эритропоэтина («альфа-N-биотинил-») или в одной (или более) эпсилон-аминогруппе остатков лизила в эритропоэтине («Ν-эпсилон-биотинил-»). Конечно, могут иметь место множественные Ν-эпсилон-модификации с или без альфа-N-модификации.
ί. Альфа-N-биотинилэритропоэтин;
ίί. Ν-эпсилон-биотинилэритропоэтин;
ίίί. альфа^-биотинил, Ν-эпсилон-биотинилэритропоэтин;
ίν. альфа-N-биотиниласиалоэритропоэтин;
ν. Ν-эпсилон-биотиниласиалоэритропоэтин;
νί. альфа^-биотинил, Ν-эпсилон-биотиниласиалоэритропоэтин;
νίί. альфа-Ν-биотинилгипосиалоэритропоэтин;
νίίί. Ν-эпсилон-биотинилгипосиалоэритропоэтин и ίχ. альфа^-биотинил, Ν-эпсилон-биотинилгипосиалоэритропоэтин.
5. Йодированные эритропоэтины.
Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что несколько различных остатков тирозина, а также комбинации остатков тирозина могут быть йодированы и последующие соединения приводятся только в целях иллюстрации.
ί. Йодэритропоэтин;
ίί. йодасиалоэритропоэтин и
- 15 010371 ίίί. йодгипосиалоэритропоэтин.
6. Карбоксиметиллизилэритропоэтины.
Последующие соединения содержат карбоксиметильные группы в одной (или более) эпсилон-аминогруппе остатков лизила в эритропоэтине («Ν-эпсилон-карбоксиметил-»). Конечно, могут иметь место множественные Ν-эпсилон-модификации.
ί. Ν-Эпсилон-карбоксиметилэритропоэтин;
ίί. Ν-эпсилон-карбоксиметиласиалоэритропоэтин и ίίί. Ν-эпсилон-карбоксиметилгипосиалоэритропоэтин.
Для получения эритропоэтинов и близких к эритропоэтинам молекул по изобретению можно использовать самые различные системы экспрессирующих векторных хозяев. Такие системы экспрессирующих хозяев представляют собой носители, с помощью которых можно получить и затем выделить интересующие эритропоэтины, но также они представляют клетки, которые могут при трансформации или трансфекции соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями продуцировать модифицированный продукт гена эритропоэтина ίη 8Йи. Они включают, но не ограничиваются системами хозяев в ряду бактерий, насекомых, растений, млекопитающих, включая человека, но не ограничиваются клеточными системами насекомых, инфицированных рекомбинантными экспрессирующими вирусными векторами (например, бакуловирусом), включающими кодирующие последовательности модифицированных эритропоэтинов; растительными клеточными системами, инфицированными рекомбинантными экспрессирующими вирусными векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом табачной мозаики, ТМУ) или трансформированными рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Τί-плазмидой), содержащими кодирующие последовательности близких к эритропоэтинам молекул; или системами клеток млекопитающих, включая системы человеческих клеток (например, НТ1080, СО8, СНО, ВНК, 293, 3Т3), включающих рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовирусов; промотор вакцинного вируса 7.5К).
В дополнение, можно выбрать штамм клеток-хозяев, который модулирует экспрессию вставленных последовательностей, или модифицирует, или процессирует продукт гена желаемым определенным образом. Подобные модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, отщепление) белковых продуктов могут иметь значение для функционирования белка. Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфическими механизмами посттрансляционного процессинга и модификации белков и продуктов гена. Можно выбрать подходящие клеточные линии или системы хозяев для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродных экспрессируемых белков. Наконец, можно использовать эукариотные клетки-хозяева, которые обладают клеточным механизмом правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих, в том числе человеческие клетки-хозяева, включают, но не ограничиваются НТ1080, СНО, УЕВО, ВНК, НеЬа, СО8, МОСК, 293, 3Т3 и ΑΙ38.
Для обеспечения длительной с высоким выходом продукции рекомбинантных белков предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, можно получить генно-инженерные клеточные линии, которые стабильно экспрессируют продукт гена близких к эритропоэтину молекул. В большей степени, чем с использованием экспрессирующих векторов, которые включают вирусные репликаторы, клетки-хозяева можно трансформировать с ДНК, контролируемой подходящими регулирующими экспрессию элементами (например, промотором, энхансером, последовательностями, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.д.), и использовать селективный маркер. После вставки чужеродной ДНК сконструированные клетки культивируют в течение 1-2 суток в обогащенных средах и затем переносят на селективные среды. Селективный маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к селекции и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в их хромосомы и размножаться с образованием очага, который, в свою очередь, можно клонировать и превратить в клеточные линии. Данный способ можно преимущественно использовать для создания клеточных линий, экспрессирующих продукт гена близких к эритропоэтину молекул. Такие генно-инженерные клеточные линии могут быть особенно пригодными для скрининга и оценки соединений, влияющих на эндогенную активность продукта гена близких к эритропоэтину молекул.
Альтернативно экспрессирующие свойства гена эндогенного эритропоэтина в клеточной линии или микроорганизме можно модифицировать вставкой гетерологичного регуляторного элемента ДНК в геном стабильной клеточной линии или клонированного микроорганизма так, чтобы в результате вставленный регуляторный элемент был оперативно связан с геном эндогенного эритропоэтина. Например, ген эндогенного эритропоэтина, который в норме является «транскрипционно молчащим», т.е. в норме ген эритропоэтина не экспрессируется или экспрессируется на очень низком уровне в клеточной линии, можно активировать вставкой регуляторного элемента, который способен повышать экспрессию в норме экспрессируемого гена продукта в такой клеточной линии или микроорганизме. Альтернативно, «транскрипционно молчащий» ген эндогенного эритропоэтина можно активировать вставкой произвольного регуляторного элемента, который «работает» во всех типах клеток.
- 16 010371
Гетерологичный регуляторный элемент можно вставить в стабильную клеточную линию или клонированный микроорганизм таким образом, чтобы он был оперативно связан с геном эндогенного эритропоэтина с использованием методов, таких как направленная гомологичная рекомбинация, которые хорошо известны специалистам в данной области и описаны в патенте Франции № 2646438, институт Пастера, патенте США № 4215051, СНарре1; патенте США № 5578461, 5>Нег\\Ы е! а1.; международной заявке № РСТ/и892/09627 (^093/09222), 8е16еи е! а1. и международной заявке № РСТ/и890/06436 (^091/06667) 8кои1!сЫ е! а1., которые все полностью включены здесь для ссылки.
В одном воплощении изобретения тканевой протективный цитокин представляет собой молекулу химически модифицированного эритропоэтина с недостатком остатков сиаловой кислоты или полным отсутствием остатков сиаловой кислоты, и ее можно получить в клетках млекопитающих, включая человеческие клетки. Такие клетки можно сконструировать с недостатком или отсутствием ферментов, которые принимают участие в добавлении сиаловых кислот, т.е. β-галактозидаза а2,3-сиалилтрансфераза (Аа2,3-сиалилтрансфераза@) и β-галактозидаза а2,6-сиалилтрансфераза (Аа2,6-сиалилтрансфераза@). В одном воплощении используют клетки млекопитающих, в которых делецированы один или оба гена а2,3-сиалилтрансферазы и/или ген а2,6-сиалилтрансферазы. Такие делеции можно сконструировать с использованием методов «вышибания» генов, известных в данной области. В другом воплощении используют клетки яичников китайского хомячка (СНО) с недостатком дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ) в качестве клетки-хозяина для получения молекул близких рекомбинантных эритропоэтинов. Клетки СНО не экспрессируют фермент а2,6-сиалилтрансферазу, и, следовательно, в них не происходит добавления сиаловой кислоты по 2,6-связи к Ν-связанным олигосахаридам гликопротеинов, продуцированных в данных клетках. В результате в рекомбинантных белках, продуцированных клетками СНО, отсутствует сиаловая кислота по 2,6-связи с галактозой (8акак1 е! а1. (1987); ТакеисЫ е! а1., выше; Мийаега е! а1., Еиг. 1. ВюсНет. 156, 651 (1986); ТакеиеЫ е! а1., 1. СЫошо!дг. 400, 207 (1987)). В одном воплощении для получения клетки-хозяина в целях продукции асиалоэритропоэтина подвергается делеции ген, кодирующий а2,3-сиалилтрансферазу в клетках СНО. У подобных клеток СНО после «вышибания» гена а2,3-сиалилтрансферазы полностью отсутствует активность сиалилтрансферазы, и в результате они пригодны для рекомбинантной экспрессии и продукции тканевого протективного цитокина, представляющего собой асиалоэритропоэтин.
В другом воплощении асиалогликопротеины можно получить, нарушив транспорт сиаловой кислоты в аппарат Гольджи, например, см. Ескйагб! е! а1., 1998, 1. Вю1. СНет. 273: 20189-95. С использованием хорошо известных специалистам в данной области методов (например, 0е1тапп е! а1., 2001, 1. Вю1. СНет. 276: 26291-300) можно провести мутагенез нуклеотидного сахарного транспортера СМР-сиаловой кислоты с получением мутантов клеток яичников китайского хомячка. В данных клетках не происходит добавления остатков сиаловой кислоты к гликопротеинам, таким как эритропоэтин, и продуцируется только асиалоэритропоэтин.
Трансфектированные клетки млекопитающих, синтезирующие эритропоэтин, также продуцируют цитозольную сиалидазу, которая при высвобождении в культуральную среду очень эффективно разрушает сиалоэритропоэтин (например, Огатег е! а1., 1995, Вю1ес1шо1оду 13: 692-698). С использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области (например, информации, представленной Ееггап е! а1., 1994, О1усоЫо1оду 4: 367-373), клеточные линии можно трансфектировать, мутировать или вызвать иначе конститутивную продукцию сиалидазы. Таким образом, можно получить асиалоэритропоэтин во время продукции асиалоэритропоэтина.
Тканевой протективный цитокин по изобретению имеет по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка в эритропоэтине, независимо от состояния гликозилирования молекул. Как уже указывалось выше, химическая модификация может представлять собой модификацию по меньшей мере одной аминогруппы по меньшей мере одной аминокислоты, например остатка лизина, или Ν-концевой аминогруппы или йодирование по меньшей мере одного остатка тирозина.
После получения рекомбинантных тканевых протективных цитокинов и химически модифицированных рекомбинантных тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению специалист в данной области может подтвердить наличие тканевых протективных цитокинов и отсутствие влияния на костный мозг с использованием известных методов.
Например, отсутствие эритропоэтического действия рекомбинантного тканевого протективного цитокина можно подтвердить при использовании теста на клетках ТР-1. В данном тесте клетки ТЕ-1 культивируют в полной среде КРМ1 с добавлением ОМ-С8Е в концентрации 5 нг/мл и 10% ЕС8 в течение суток при 37°С в СО2-инкубаторе. Затем клетки отмывают и суспендируют с титром 106 клеток/мл в течение 16 ч в минимальной среде (5% ЕС8 без ОМ-С8Е). 96-луночный планшет готовят: 1) добавлением 100 мкл стерильной воды во внешние лунки для поддержания влаги; 2) добавлением только среды (10% ЕС8 без клеток или ОМ-С8Е) в 5 лунок и 3) посевом 25000 клеток/лунку в среде, содержащей 10% ЕС8 и рекомбинантные тканевые протективные цитокины, в оставшиеся лунки (5 лунок на каждый тестируемый цитокин). Если клетки размножаются, то рекомбинантный тканевой протективный цитокин может обладать гематопоэтическим действием. Затем следует оценить действие соединения в условиях ίη угуо в
- 17 010371 тесте ίη νίνο по определению повышения гематокрита в результате воздействия рекомбинантного тканевого протективного цитокина. Отрицательный результат означает отсутствие пролиферации клеток ТЕ-1 в условиях ίη νίΐτο, и отсутствие повышения гематокрита в тесте ίη νίνο означает, что рекомбинантный тканевой протективный цитокин не обладает эритропоэтическим действием.
Тканевые протективные свойства рекомбинантного тканевого протективного цитокина можно подтвердить при использовании теста на клетках Р19 или в тесте интоксикации водой ίη νίνο на крысах, которые оба подробно описаны ниже. Вышеуказанные тесты приводятся только в качестве примеров, и предполагается использование в настоящем изобретении других подходящих тестов для определения воздействия цитокинов на костный мозг и защитного действия для тканей, известных специалистам в данной области.
В практике одного аспекта настоящего изобретения фармацевтическую композицию, описанную выше, содержащую тканевой протективный цитокин, можно вводить млекопитающему любым путем, который обеспечивает достаточную концентрацию тканевого протективного цитокина в сосудистой сети при прохождении через эндотелиальный клеточный барьер и проявления положительного действия на реактивные клетки. При ее использовании для перфузии ткани или органа желательно получение аналогичных результатов. Например, в случаях, когда тканевой протективный цитокин применяется для перфузии в условиях ех νίνο, тканевой протективный цитокин может представлять любой из вышеуказанных химически модифицированных эритропоэтинов. В случаях, когда клетки или ткань не имеют сосудистой сети, и/или при применении инкубации на бане клеток или ткани с композицией по изобретению фармацевтическая композиция обеспечивает эффективное в отношении проявления положительного действия на реактивные клетки количество тканевого протективного цитокина. Эндотелиальные клеточные барьеры, через которые может пройти тканевой протективный цитокин, включают плотные соединения, перфорированные соединения, фенестрированные соединения и любые другие типы эндотелиальных барьеров, имеющихся у млекопитающих. Предпочтительным барьером является плотное соединение из эндотелиальных клеток, но изобретение не ограничивается этим.
Вышеуказанные тканевые протективные цитокины, в основном, пригодны для терапевтического или профилактического лечения у человека заболеваний центральной нервной системы или периферической нервной системы, которые, в основном, проявляются в виде неврологических или психических симптомов, глазных болезней, сердечно-сосудистых заболеваний, кардиопульмональных заболеваний, респираторных заболеваний, заболеваний почек, органов мочевой и половой системы, заболеваний костей, заболеваний кожи, желудочно-кишечных заболеваний и эндокринных и метаболических нарушений. В частности, данные состояния и заболевания включают гипоксию, которая отрицательно влияет на возбудимые ткани, такие как возбудимые ткани в центральной нервной системе, ткани периферической нервной системы или сердечной ткани или ткани сетчатки, например в мозге, сердце или сетчатке/глазе. Следовательно, изобретение можно использовать для лечения и профилактики повреждения возбудимой ткани, возникающего в результате гипоксии в различных условиях и обстоятельствах. Неограничивающие примеры таких условий и обстоятельств приведены в таблице ниже.
В примере протективного действия при патологиях нервной ткани, поддающихся лечению по настоящему изобретению, такие патологии включают таковые, возникающие в результате пониженной оксигенации нервных тканей. Любое состояние, снижающее доступность кислорода для нервной ткани, приводящее к стрессу, повреждению и в конечном итоге к гибели нервных клеток, можно лечить способами по настоящему изобретению. В основном, относящиеся к гипоксии и/или ишемии данные состояния возникают или включают, но не ограничиваются кровоизлиянием, окклюзией сосудов, недостатком кислорода в пренатальном или постнатальном периоде развития, удушением, удушьем, низким погружением, отравлением окисью углерода, вдыханием табачного дыма, травмой, включая операцию и лучевую терапию, асфиксией, эпилепсией, гипогликемией, хроническим обструктивным заболеванием легких, эмфиземой, дистресс-синдромом дыхания у взрослых, гипотензивным шоком, септическим шоком, анафилактическим шоком, инсулиновым шоком, кризисом у больных с серповидно-клеточной анемией, остановкой сердца, нарушением ритма, азотным наркозом и неврологическими расстройствами в результате применения экстракорпорального кровообращения.
В одном воплощении, например, определенные композиции на основе тканевых протективных цитокинов можно вводить для профилактики травмирования или повреждения ткани при наличии риска травмирования или повреждения ткани во время проведения хирургических вмешательств, таких как, например, резекция опухоли или восстановление аневризмы. Другие патологии, вызываемые или возникающие в результате гипогликемии, которые поддаются лечению способами, описанными здесь, включают передозировку инсулина, также относящуюся к ятрогенной гиперинсулинемии, инсулиному, недостаток гормона роста, гипокортицизм, передозировку лекарственных препаратов и некоторые опухоли.
Другие патологии, возникающие в результате повреждения нервной ткани, включают приступообразные расстройства, такие как эпилепсия, судороги или хронические припадки. Другие поддающиеся лечению состояния или заболевания включают такие заболевания, как кровоизлияние, рассеянный склероз, гипотензия, остановка сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, церебральный паралич, травма головного или спинного мозга, деменция при СПИДе, возрастная потеря познавательной функ
- 18 010371 ции, потеря памяти, амиотрофический боковой склероз, припадки, алкоголизм, ишемия сетчатки, повреждение зрительного нерва в результате развития глаукомы и потери нервных клеток.
Определенную композицию и способы по настоящему изобретению можно использовать для лечения воспаления, возникающего в результате болезненных состояний или различных травм, таких как физически или химически индуцированное воспаление. Такие заболевания могут включать ангиит, хронический бронхит, панкреатит, остеомиелит, ревматоидный артрит, гломерулонефрит, оптический неврит, височный артериит, энцефалит, менингит, поперечный миелит, дерматомиозит, полимиозит, некротизирующий фасцит, гепатит и некротизирующий энтероколит.
Имеются доказательства того, что активированные астроциты могут играть цитотоксическую роль в отношении нейронов, продуцируя нейротоксины. Окись азота, реактивные формы кислорода и цитокины высвобождаются из глиальных клеток в ответ на церебральную ишемию (см. Вескег К.Т. 2001. Тагдебпд (Не сеп!га1 пеггоик кук1ет шйашшаЛгу гекропке ίη ксйетю кйоке. Сигг. Θρίηίοη №иго1. 14: 34 9-353 апб Майкоп М.Р., Си1ткее С. апб Уи Ζ.Ε., 2000. ЛрорЮбс апб ЛпбарорШбс тескашктк ίη к!гоке. Се11 Тккие Век. 301: 173-187). Позднее в результате проведенных исследований было показано на моделях нейродегенерации, что активирование глии и последующая продукция цитокинов воспаления зависит от первичного повреждения нейронов (см. УМаш В., Согаш Е., СаШ С.Ь., Работаю А., Сшкаш Е. апб Маппогю11 М., 2000. Оутд пеига1 се11к асбга1е д11а ΙΙιΐΌΐίβΙι 1Пе ге1еаке ок а ргсИеаке ргобиск С11а 32: 84-90 апб ИаЬиПсШ М., 8сюгаШ С., Тагоххо С., Оешепб Е., МапПгеб1 А.А. апб ВеИгашо М., 2000. 1пЬ1Ьбюп оП сакраке-1-11ке ас11т11у Ьу Ас-Туг-Уа1-Л1а-Акр-сЫоготе1ку1 кеЮпе тс1ибек 1опд 1ак11пц пеигоргсИесбоп ίη сегеЬга1 1кскеш1а 111гоид11 арорЮкк гебисбоп апб бесгеаке оП рготПаттаЮгу суЮктек. ί. №игокск 20: 4398-4404). Воспаление и активирование глии являются общими признаками различных форм нейродегенеративных нарушений, включая церебральную ишемию, травму мозга и экспериментальный аллергический энцефаломиелит, нарушения, при которых эритропоэтин проявляет защитное действие в отношении нервной ткани. Подавление продукции цитокинов под действием эритропоэтина может, по меньшей мере, частично опосредовать его защитное действие. Однако оказалось, что, в отличие от «классических» противовоспалительных цитокинов, таких как 16-10 и 1Ь-13, которые непосредственно подавляют продукцию фактора некроза опухолей, эритропоэтин активен только при наличии гибели нейронов.
Не желая связываться какой-либо теорией, выяснили, что данную противовоспалительную активность гипотетически можно объяснить несколькими неограничивающими теоретическими предположениями. Первое, поскольку эритропоэтин предупреждает апоптоз, то будут предупреждаться воспалительные «события», индуцируемые апоптозом. Кроме того, эритропоэтин может предупреждать высвобождение сигнальных молекул из погибающих нейронов, которые стимулируют глиальные клетки и могут непосредственно воздействовать на глиальные клетки, снижая их реакцию на данные продукты. Другой возможностью является то, что действие эритропоэтина направлено на более удаленные члены каскада развития воспаления (например, каспазу 1, реактивный кислород или азотсодержащие промежуточные соединения), которые «индуцируют» как апоптоз, так и воспаление.
Кроме того, оказалось, что эритропоэтин обеспечивает защиту от воспаления, не оказывая побочного действия, обычно характерного для других противовоспалительных средств, таких как дексаметазон. Вновь повторяясь, не желая связываться какой-либо конкретной теорией, выяснили, что это может быть в результате влияния эритропоэтина на многоцелевые нейротоксины, такие как окись азота (N0). Несмотря на то, что активированные астроциты и микроглия продуцируют нейротоксические количества N0 в ответ на различные травмы, N0 играет многоцелевую роль в организме, включая модуляцию основных физиологических функций. Таким образом, несмотря на то, что применение противовоспалительного средства может ослабить воспаление посредством подавления продукции N0 и других нейротоксинов, если противовоспалительное действие является слишком длительным, то оно будет мешать процессу восстановления тканей в результате травмы, вызывающей воспаление. Гипотетически можно предположить, что тканевые протективные цитокины по настоящему изобретению способны ослаблять воспаление, не нарушая восстановительную функцию нейротоксинов, таких как N0.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции, содержащие один или более тканевых протективных цитокинов и одно или более профилактических или терапевтических средств (т.е. активных средств), иных, чем тканевые протективные цитокины, и способы профилактики, лечения или ослабления одного или более симптомов, характерных для воспаления реактивных клеток млекопитающих и связанных с ними клеток, тканей и органов, у млекопитающего, включающих введение указанному млекопитающему одной или более указанных композиций. Настоящее изобретение также обеспечивает композиции, содержащие один или более тканевых протективных цитокинов, и способы профилактики, лечения или ослабления одного или более симптомов, связанных с воспалением реактивных клеток млекопитающих и связанных с ними клеток, тканей и органов у млекопитающего, включающие введение указанному млекопитающему одной или более указанных композиций, где композиции вводят в комбинации с одним или более профилактическим или терапевтическим средством, иным, чем тканевые протективные цитокины. Воспаление может быть вызвано травмой или заболеванием, таким, но не ограничиваясь этим, как астма, энцефалит, воспалительное заболевание кишечника, хроническое обструктивное заболевание легких (С0РО), артрит или аллергическое расстройство. Терапевтические или профилакти
- 19 010371 ческие средства включают, но не ограничиваются пептидами, полипептидами, гибридными белками, молекулами нуклеиновых кислот, небольшими молекулами, миметическими средствами, синтетическими лекарственными препаратами, неорганическими молекулами и органическими молекулами. Любое средство, о котором известно, что оно является полезным, или которое использовалось или используется в настоящее время для профилактики, лечения или ослабления одного или более симптомов, связанных с воспалением, можно использовать в комбинации с тканевым защитным цитокином по изобретению, описанным здесь. Примеры таких средств включают, но не ограничиваются дерматологическими средствами для лечения высыпаний и отеков (например, фототерапией (т.е. ультрафиолетовое облучение В), фотохимиотерапией (например, РИУА) и средствами для местного применения, такими как смягчающие вещества, салициловая кислота, каменно-угольная смола, стероиды для местного применения, кортикостероиды для местного применения, аналоги витамина Ό3 для местного применения (например, кальципотриен), тазаротен и ретиноиды для местного применения), противовоспалительными средствами, например кортикостероидами (например, преднизоном и гидрокортизоном), глюкокортикоидами, стероидами, нестероидными противовоспалительными средствами (например, аспирином, ибупрофеном, диклофенаком и ингибиторами СОХ-2), бета-агонистами, антихолинергическими препаратами и метилксантинами, иммуномодулирующими средствами (например, небольшими органическими молекулами, модуляторами рецепторов Т-клеток, модуляторами рецепторов цитокинов, элиминирующими Т-клетки средствами, антагонистами цитокинов, антагонистами монокинов, ингибиторами лимфоцитов или противоопухолевыми средствами), инъекционными препаратами на основе золота, сульфазалазином, пеницилламином, противоангиогенными средствами (например, ангиостатином, антагонистами ΤΝΡ-α (например, антителами против ΤΝΡ-α) и эндостатином), дапсоном, псораленами (например, метоксиленом и триоксаленом), антималярийными средствами (например, гидроксихлорквином), противовирусными средствами и антибиотиками (например, эритромицином и пенициллином).
В способах и композициях по изобретению можно использовать любое иммуномодулирующее средство, хорошо известное специалистам в данной области. Иммуномодулирующее средство может оказывать воздействие на один или более или все аспекты иммунного ответа у субъекта. Аспекты иммунного ответа включают, но не ограничиваются воспалительной ответной реакцией. В предпочтительном воплощении изобретения введение иммуномодулирующего средства субъекту приводит к подавлению или снижению одного или более аспектов способности субъекта к иммунному ответу. В конкретном воплощении изобретения иммуномодулирующее средство ингибирует или подавляет воспалительную ответную реакцию у субъекта. В одном воплощении тканевой протективный цитокин по изобретению вводят в комбинации с одним или более иммуномодулирующих средств для лечения, т.е. ослабления симптомов, или для профилактики воспаления.
Примеры иммуномодулирующих средств включают, но не ограничиваются белковыми средствами, такими как цитокины, пептидные миметики и антителами (например, человеческими, гуманизированными, химерными, моноклональными, поликлональными, фрагментами Ρν§, δοΡνκ, РаЬ или Р(аЬ)2 или фрагментами связывающих эпитопов), молекулами нуклеиновых кислот (например, молекулами антисмысловой нуклеиновой кислоты и тройными спиралями), малыми молекулами, органическими соединениями и неорганическими соединениями. В частности, иммуномодулирующие средства включают, но не ограничиваются метотрексатом, лефлуномидом, циклофосфамидом, цитоксаном, иммураном, циклоспорином А, миноциклином, азатиоприном, антибиотиками (например, ΡΚ506 (такролимусом)), метилпреднизолоном (МР), кортикостероидами, стероидами, микофенолатом мофетилом, рапамицином (сиролимусом), мизорибином, дезоксиспергуалином, бреквинаром, малононитрилоамидами (например, лефлунамидом), модуляторами рецепторов Т-клеток и модуляторами рецепторов цитокинов. Примеры модуляторов рецепторов Т-клеток включают, но не ограничиваются антителами против рецепторов Т-клеток (например, антиСЭ4-антителами (например, сМ-Т412 (Воеппдег), ГОЕС-СЕ9.1® (ГОЕС и 8КВ), тАВ4162^94, Ог11юс1опе и ОКТсйг4а (1ап88еп-С11ад)), анти-СИЗ-антителами, анти-СП5-антителами (например, связанный с рицином иммуноконъюгат против СИ5), анти-СО7-антителами (например, СНН-380 (ХоуатОк анти-СИ8антителами, моноклональными антителами против лиганда СЭ40, анти-СО52-антителами (например, САМРАТН 1Н (11ех)), анти-СЭ2-моноклональными антителами) и СТЬЛ4-иммуноглобулином.
Примеры модуляторов рецепторов цитокинов включают, но не ограничиваются растворимыми рецепторами цитокинов (например, внеклеточным доменом ΤΝΡ-α-рецепторов или его фрагментами, внеклеточным доменом 1Ь-1в-рецепторов или его фрагментами и внеклеточным доменом 1Ь-6-рецепторов или его фрагментами), цитокинами или их фрагментами (например, интерлейкином (1Ь)-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-15, ΤΝΡ-α, ΤΝΡ-β, интерфероном, (ΙΡΝ)-α, ΙΡΝ-β, ΙΡΝ-γ и ОМ-С8Е), антителами против рецепторов цитокинов (например, антителами против рецептора 1Ь-2, антителами против рецептора 1Ь-4, антителами против рецептора 1Ь-6, антителами против рецептора 1Ь-10, антителами против рецептора 1Ь-12), антителами против цитокинов (например, антителами против рецептора ΙΡΝ, анти-ΤNΕ-α-антителами, анти-1Е-1в-антителами, анти-1Е-6-антителами и анти-1Ь-12-антителами). В конкретном воплощении модулятор рецепторов цитокинов представляет 1Ь-4, 1Ь-10 или их фрагменты. В другом воплощении модулятор рецепторов цитокинов представляет анти-1Е-1в-антитело,
- 20 010371 анти-1Ь-6-антитело, антитело против рецептора 1Б-12, анти-ΤNΕ-антитело. В другом воплощении модулятор рецепторов цитокинов представляет внеклеточный домен рецептора ΤΝΕ-α или его фрагмент. В некоторых воплощениях модулятор рецепторов цитокинов не является антагонистом ΤΝΕ-α.
В предпочтительном воплощении белки, полипептиды или пептиды (включая антитела), которые применяются в качестве иммуномодулирующих средств, получены от того же вида, к какому относится реципиент белков, полипептидов или пептидов для снижения вероятности проявления иммунного ответа на данные белки, полипептиды или пептиды. В другом предпочтительном воплощении в тех случаях, когда субъект является человеком, то белки, полипептиды или пептиды, которые используются в качестве иммуномодулирующих средств, являются человеческими или гуманизированными.
По изобретению одно или более иммуномодулирующих средств вводят субъекту с воспалением до, после или одновременно с терапевтическими и/или профилактическими средствами по изобретению. Предпочтительно один или более иммуномодулирующих средств вводят субъекту с воспалением для снижения или подавления одного или более аспектов иммунного ответа, если это необходимо. Можно использовать любую методику, хорошо известную специалистам в данной области, для определения одного или более аспектов иммунного ответа у конкретного субъекта и при этом установить, когда необходимо вводить иммуномодулирующее средство указанному субъекту.
В предпочтительном воплощении одно или более иммуномодулирующих средств вводят субъекту с воспалением таким образом, чтобы временно уменьшить или подавить один или более аспектов иммунного ответа. Такое временное подавление или уменьшение одного или более аспектов иммунной системы может продлиться в течение часов, суток, недель или месяцев. Предпочтительно, чтобы временное подавление или уменьшение иммунного ответа продолжалось в течение нескольких часов (например, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 24, 36 или 48 ч), нескольких суток (например, 3, 4, 5, 6, 7 или 14 суток) или нескольких недель (например, 3, 4, 5, 6 недель). Временное снижение или подавление одного или более аспектов иммунного ответа повышает профилактическую и/или терапевтическую эффективность тканевого протективного цитокина.
В одном воплощении изобретения иммуномодулирующее средство, которое уменьшает или истощает количество Т-клеток, предпочтительно Т-клеток памяти, вводят субъекту с воспалением согласно способам по изобретению. См., например, патент США № 4658019. В другом воплощении иммуномодулирующее средство, которое инактивирует СЭ8' Т-клетки, вводят субъекту с воспалением согласно способам по изобретению. В конкретном воплощении анти-СО8-антитела используют для снижения или истощения количества СЭ8' Т-клеток.
Взаимодействие ί.Ό40 лиганда (ί.Ό40Ρ)-ί.Ό40 является желательной точкой для блокирования иммунного ответа за счет его широкого спектра активности для активации и функционирования хелперных Т-клеток, а также отсутствия избыточности в его сигнальном пути. Таким образом, в конкретном воплощении изобретения взаимодействие СО40Б с СЭ40 временно блокируется во время введения одного или более иммуномодулирующих средств. Это можно осуществить обработкой средством, которое блокирует лиганд ί.Ό40 на клетках ТН и нарушает нормальное связывание лиганда СЭ40 на хелперных Т-клетках с антигеном СЭ40 на В-клетках. Антитело против лиганда СЭ40 (анти-СП40Ь) (производства Вп51о1-Муег5 8с.|шЬЬ Со.; см., например, заявку на европейский патент 555880, опубликованную 18 августа 1993 года) или молекулу растворимого ί.Ό40 можно выбрать и использовать в качестве иммуномодулирующего средства в способах по изобретению.
Другие примеры иммуномодулирующих средств, которые можно использовать по изобретению включают, но не ограничиваются кортикостероидами, азатиоприном, микофенолатом мофетилом, циклоспорином А, гидрокортизоном, ΕΚ506, метотрексатом, лефлуномидом и циклофосфамидом. Было показано, что короткий курс циклофосфамида приводит к эффективному прерыванию активирования ί.Ό4' и ί.Ό8' Т-клеток на аденовирусный капсидный белок (1оо55 с1 а1., 1996, Нит. Сепе ΤΙιογ. 7: 1555-1566). Обработка гидрокортизоном или циклоспорином А успешно применяется для снижения индукции цитокинов, некоторые из которых могут участвовать в элиминации бактериальных инфекций и воспаления.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих белки, полипептиды или пептиды с иммуномодулирующей активностью, или белки, полипептиды или пептиды с иммуномодулирующей активностью можно вводить субъекту с воспалением по способам по настоящему изобретению. Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих производные, аналоги, фрагменты или варианты белков, полипептидов или пептидов с иммуномодулирующей активностью, или производные, аналоги, фрагменты или варианты белков, полипептидов или пептидов с иммуномодулирующей активностью можно вводить субъекту с воспалением по способам по изобретению. Предпочтительно такие производные, аналоги, фрагменты или варианты сохраняют иммуномодулирующую активность полноразмерного белка, полипептида или пептида дикого типа.
Белки, полипептиды или пептиды, которые можно использовать в качестве иммуномодулирующего средства, можно получить любой методикой, хорошо известной в данной области или описанной здесь. См., например, СНар1ег 16 Аи5иЬе1 е1 а1. (еб§.), 1999, 81юг1 РгоФсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, РоиПй ЕбШоп, 1о11п ^МПеу & §оп5, ΝΥ, где описаны способы получения белков, полипептидов или пептидов и которая
- 21 010371 полностью включена здесь для ссылки. Антитела, которые могут быть использованы в качестве иммуномодулирующего средства, можно получить, например, с использованием способов, описанных в патенте США № 6245527 и в Наг1о\у апб Ьапе АпбЬоб1е5: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Со1б 8ргтд НагЬог, ΝΥ, 1988, которые включены здесь полностью для ссылки. Предпочтительно в композициях и способах по изобретению используют промышленно доступные и известные в качестве иммуномодулирующих средства. Иммуномодулирующую активность средства можно определить в условиях 1п ν 11го и/или 1п νί\Ό при использовании любой методики, хорошо известной в данной области, включая, например, тесты СТЬ, анализ пролиферации и иммуноанализ (например, ЕЬ18А), для экспрессии конкретных белков, таких как состимулирующие молекулы или цитокины.
Определенные композиции и способы по изобретению можно использовать для лечения состояний и повреждений ткани сетчатки. Такие нарушения включают, но не ограничиваются ишемией сетчатки, дегенерацией желтого пятна, отслоением сетчатки, пигментным ретинитом, атеросклеротической ретинопатией, гипертензивной ретинопатией, блокадой артерий сетчатки, блокадой вен сетчатки, гипотензией и диабетической ретинопатией.
В другом воплощении способы и принципы по изобретению можно использовать для защиты от или лечения повреждения, возникшего в результате облучения возбудимой ткани. Дополнительной применимостью способов по настоящему изобретению является лечение отравления нейротоксинами, такими как домоковая кислота из ракообразных, нейролатиризм и болезнь Гуама, амиотрофического бокового склероза и болезни Паркинсона.
Как уже указывалось выше, настоящее изобретение также относится к способу стимуляции функциональной активности возбудимой ткани у млекопитающего периферическим введением тканевого протективного цитокина, описанного выше. Различные заболевания и состояния поддаются лечению с использованием данного способа, и дополнительно данный способ пригоден для повышения познавательной функции при отсутствии какого-либо состояния или заболевания. Данные применения настоящего изобретения описаны подробно ниже и включают стимуляцию усвоения и обучаемости как у человека, так и не относящихся к человеку млекопитающих.
Состояния и заболевания, поддающиеся лечению способами по данному аспекту настоящего изобретения, относящиеся к центральной нервной системе, включают, но не ограничиваются эмоциональными расстройствами, тревогой, депрессией, аутизмом, дефицитом внимания, гиперактивными расстройствами и нарушениями познавательной функции. На данные состояния положительное действие оказывает стимуляция функциональной активности нейронов. Другие состояния, поддающиеся лечению согласно принципам настоящего изобретения, включают нарушение сна, например апноэ во сне и связанные с поездками расстройства; субарахноидальные и связанные с аневризмами кровотечения, гипотензивный шок, сотрясение мозга, септический шок, анафилактический шок и осложнения после различных видов энцефалита и менингита, например церебрит, связанный с заболеваниями соединительной ткани, например волчанка. Другие применения включают профилактику или защиту от отравления нейротоксинами, такого как отравление домоковой кислотой из ракообразных и болезнь Гуана, амиотрофического бокового склероза; болезни Паркинсона; послеоперационного лечения эмболических или ишемических повреждений; полного облучения мозга; кризиса у больных с серповидно-клеточной анемией и эклампсии.
Дополнительная группа состояний, поддающихся лечению способами по настоящему изобретению, включает нарушение функций митохондрий, наследственной или приобретенной природы, что является причиной различных неврологических заболеваний, для которых характерны повреждение и гибель нейронов. Например, заболевание Лейдига (подострая некротизирующая энцефалопатия) характеризуется прогрессирующей потерей зрения и энцефалопатией за счет снижения количества нейронов и миопатией. В таких случаях нарушенный метаболизм митохондрий не способен поставлять высокоэнергетические субстраты в качестве источников энергии для метаболизма возбудимых клеток. Модулятор активности рецепторов эритропоэтина оптимизирует нарушенную функциональную активность при различных заболеваниях, опосредуемых митохондриями. Как уже указывалось выше, гипоксия оказывает отрицательное влияние на возбудимые ткани. Возбудимые ткани включают, но не ограничиваются тканью центральной нервной системы, тканью периферической нервной системы и тканью сердца. В дополнение к состояниям, описанным выше, способы по настоящему изобретению пригодны для лечения ингаляционных отравлений, таких как отравление окисью углерода и табачным дымом, тяжелая астма, дыхательный дистресс-синдром у взрослых, удушье и глубокое погружение. Дополнительные состояния, которые приводят к развитию гипоксии или иначе индуцируют повреждение возбудимых тканей, включают гипогликемию, которая может иметь место при несоответствующем дозировании инсулина или при развитии продуцирующих инсулин новообразований (инсулиномы).
Полагается, что различные невропсихические расстройства, возникающие в результате повреждения возбудимых тканей, поддаются лечению настоящими способами. Хронические нарушения, при которых имеется повреждение нейронов и для которых обеспечивается лечение по настоящему изобретению, включают расстройства, относящиеся к центральной нервной системе и/или периферической нервной системе, в том числе возрастное снижение познавательной функции и старческую деменцию, хронические припадки, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, деменцию, потерю памяти, амиотрофиче
- 22 010371 ский боковой склероз, рассеянный склероз, туберозный склероз, болезнь Вилсона, церебральный и прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Гуама, деменцию Леви, прионные заболевания, такие как спонгиозные энцефалопатии, например болезнь Крейцфельда-Якоба, болезнь Хантингтона, миотоническую дистрофию, атаксию Фрейдриха и другие виды атаксии, а также синдром Жиль де ля Туррета, припадки, такие как эпилепсия и хронические припадки, кровоизлияние, травму головного и спинного мозга, деменцию при СПИДе, алкоголизм, аутизм, ишемию сетчатки, глаукому, расстройства автономной функции, такие как гипертензия и нарушения сна, и невропсихические расстройства, которые включают, но не ограничиваются шизофренией, шизоаффективным расстройством, дефицитом внимания, дистимическим расстройством, основным депрессивным нарушением, манией, обсессивно-компульсивным расстройством, нарушениями в результате применения психотропных препаратов, тревогой, паническим расстройством, а также униполярными и биполярными аффективными расстройствами. Дополнительные невропсихические и нейродегенеративные заболевания включают, например, перечисленные в справочнике Американской ассоциации психиатров по диагностике и статистике психических заболеваний (Ό8Μ), самом последнем издании, которое включено здесь для ссылки.
В другом воплощении можно использовать молекулы рекомбинантных химерных токсинов, содержащих эритропоэтин, для терапевтической доставки токсинов для лечения нарушения пролиферации, такого как опухоль, или вирусных заболеваний, таких как подострый склерозирующий панэнцефалит.
В последующей таблице приведены в качестве примеров неограничивающие указания различных состояний или заболеваний, поддающихся лечению вышеуказанными тканевыми протективными цитокинами.
Клетка, ткань или орган Нарушение функции или патология Состояние или заболевание Тип
сердце ишемия заболевание коронарных артерий острое, хроническое, стабильное, нестабильное
инфаркт миокарда синдром Дресслера
стенокардия
застойное заболевание сердца вальвулярное, кардиомиопатия
стенокардия Принцметала
перфорация сердца в результате аневризмы, септическая перфорация
ангиит
аритмия тахи-, брадиаритмия, суправентрикулярная, вентрикулярная, нарушения проводимости стабильный, нестабильный, гиперчувствительный сонный синузный узел
- 23 010371
застойная сердечная НеДОСТЗТОЧНОСТЬ левая, правая, бивентрик уляркая кардиомиопатии такие, как идиопатическая семейная, инфекционная, метаболическая, болезнь накопления недостаточности, нарушение соединительной ткани, инфильтрация и грануломатоз, нейроваскулярная
миокардит аутоиммунный, инфекционный, идиопатический
легочное сердце
тупая или проникающая травма
токсины кокаин
сосуды гипертензия первичная, вторичная
декомпрессионная болезнь
фибромышечная гиперплазмия
аневризма расслаивающаяся, перфорированная и увеличивающаяся
легкий обструктивное астма, хронический бронхит, эмфизема и обструкция дыхательных путей
ишемическое заболевание легких эмболия легких, тромбоз легких, жировая эмболия
заболевание легких, возникающее в результате воздействия окружающей среды
ишемическое заболевание легких эмболия легких, тромбоз легких
интерстициальное заболевание легких идиопатический фиброз легких
застойное кистозный фиброз
легочное сердце
травма
- 24 010371
пневмония и пневмонит инфекционная, паразитарная, токсическая, травматическая, ожоговая, аспирационная
саркоидоз
поджелудочная железа эндокринное экзокринное сахарный диабет типа I и II отсутствие функции других эндокринных клеток поджелудочной железы отсутствие экзокринной функции поджелудочной железы отсутствие функции, нарушение функции бетаклеток, диабетическая нейропатия панкреатит
кости остеопения первичная, вторичная гипогонадизм, иммобилизация, в период менопаузы, связанная с возрастом, гиперпаратиреоидизм, гипертиреоидизм, недостаток кальция, магния, фосфора и/или витамина Э
остеомиелит
аваскулярный некроз
травма
болезнь Педжита
кожа алопеция локальная, общая первичный, вторичный, облысение по типу у мужчин
витилиго локализованное, генерализованное первичный, вторичный
изъязвление при диабете
заболевание периферических сосудов
ожоговые травмы
- 25 010371
аутоиммунные заболевания красная волчанка, заболевание Шергена, ревматоидный артрит, гломерулонеофит, ангиит
гистиоцитоз Лангерганса
глаза оптический неврит
тупые и проникающие травмы, инфекции, саркоидоз, серповидноклеточная болезнь, отслоение сетчатки, временный артрит
ишемия сетчатки, дегенерация желтого пятна, отслоение сетчатки, пигментный ренитит, атеросклеротическая ретинопатия, гипертензивная ретинопатия, блокада артерий сетчатки, блокада вен сетчатки, гипотензия и диабетическая ретинопатия
нарушения эмбрионов и плодов асфиксия
ишемия
ЦНС синдром хронической усталости, острый и хронический гипоосмолярный и гиперосмолярный синдромы, деменция при СПИДе, воздействие электрического тока
энцефалит бешенство, герпес
менингит
субдуральная гематома
привыкание к никотину
привыкание и синдром отмены лекарственных препаратов кокаин, героин, крэк, марихуана, Ъ5б, РСР, привыкание ко многим лекарственным препаратам, экстазия, опиоиды, успокаивающие гипнотические средства, амфетамины, кофеин
обсессивно-компульсивные расстройства
стеноз спинного мозга, поперечный миелит, болезнь Гуиллиана-Барре, травма, компрессия основания нерва, опухолевая компрессия, тепловой удар
ΕΝΤ ощущение шума, синдром Меньера, потеря слуха
травматическое повреждение, баротравма
почки поперечнополосатые мышцы почечная недостаточность острая, хроническая васкулярный/ишемический, интерстициальное заболевание, заболевание почек при диабете, нефротические синдромы, инфекции
пурпура Хейноха-Шейнлейна аутоиммунные заболевания
тяжелая, псевдопаралическая миастения, дерматомиозит, полимиозит
- 26 010371
миопатии наследственные обменные, эндокринные и токсические
тепловой удар
травма в результате компрессии
рабдомилоз
заболевание, опосредуемое митохондриями
инфекция некротизирующий фасцит
нарушение функции органов половой системы центральные и периферические импотенция, вторичная лечению препаратами
печень гепатит вирусный, бактериальный, паразитарный
ишемическое заболевание
цирроз, жировое перерождение печени
инфильтративные/обменные заболевания
желудочно- кишечный тракт ишемическое заболевание кишечника, воспалительное заболевание кишечника
некротизирующий энтероколит
трансплантация органов лечение донора и реципиента
репродуктивная система бесплодие сосудистое, аутоиммунное, аномалии матки, нарушения имплантации
эндокринная система гипер- и гипофункция желез
Как уже указывалось выше, данные заболевания, расстройства и состояния являются только иллюстративными для демонстрации пределов полезного действия, оказываемого тканевыми протективными цитокинами по изобретению. Следовательно, в общем, данное изобретение обеспечивает терапевтическое или профилактическое лечение последствий механической травмы или заболеваний человека. Терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний ЦНС и/или периферической нервной системы является предпочтительным. Обеспечивается терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний, которые имеют психический компонент. Обеспечивается терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний, включая, но не ограничиваясь таковыми, имеющими офтальмологический, сердечно-сосудистый, кардиопульмональный, респираторный, почечный, мочевой, репродуктивный, желудочно-кишечный, эндокринный или обменный компонент.
Специалисты в данной области, очевидно, понимают, что фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получить из смеси тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению, а также эритропоэтина.
В одном воплощении такую фармацевтическую композицию эритропоэтина или тканевого протективного цитокина можно вводить системно для защиты или стимуляции мишеневых клеток, ткани или органа. Такое введение может быть парентеральным, ингаляционным или через слизистую, например пероральным, интраназальным, ректальным, интравагинальным, сублингвальным, под слизистую и трансдермальным. Предпочтительным путем введения является парентеральный, например посредством внутривенной или внутрибрюшинной инъекции, и также включая, но не ограничиваясь внутриартериальным, внутримышечным или подкожным введением.
Для других путей введения, например при применении перфузата, инъекции в орган или при дру
- 27 010371 гом местном применении, можно обеспечить фармацевтическую композицию, которая будет обеспечивать аналогичные концентрации тканевого протективного цитокина, описанного выше. Предпочтительной является концентрация примерно 15 пМ-30 нМ.
Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать терапевтически эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном воплощении термин «фармацевтически приемлемый» означает разрешенный официальным государственным управлением или правительством штата или имеющийся в Фармакопее США или других общепринятых иностранных фармакопеях для применения на животных, и конкретнее на людях. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или растворителю, с которыми можно вводить лекарственное средство. Также фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как солевые растворы на воде и маслах, включая вазелин, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Физиологический раствор является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерилмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т. п. Композиция, если желательно, может содержать небольшие количества смачивающих веществ, или эмульгаторов, или буферных веществ, регулирующих рН. Данные композиции могут быть в виде растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций для длительного введения и т. п. Композицию можно получить в виде суппозитория с традиционно применяемыми связующими веществами и наполнителями, такими как триглицериды. Соединения по изобретению можно формулировать в виде нейтральных веществ или солей. Фармацевтически приемлемые соли включают таковые, образованные свободными аминогруппами, производные соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д. и таковые, образованные свободными карбоксильными группами, производные натрия, калия, аммония, кальция, гидроокиси железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т. д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в «Ветшдкоп'к Рйагтасеийса1 8с1епсек», Е.У. Майш. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество соединения, предпочтительно в очищенной форме, вместе с соответствующим количеством носителя для обеспечения формы для правильного введения пациенту. Композиция должна соответствовать способу введения.
Фармацевтические композиции, адаптированные для перорального введения, могут быть обеспечены в виде капсул, или таблеток, или порошков, или гранул; в виде растворов, сиропов и суспензий (в водных и неводных жидкостях); в виде пищевых пенок, или взбитых продуктов, или эмульсий. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут содержать лактозу, крахмал или их производные, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислоту или ее соли. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать растительные масла, воска, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Растворы и сиропы могут включать воду, полиолы и сахара.
Активный ингредиент, предназначенный для перорального введения, можно покрыть или смешать с веществом, которое замедляет распадаемость и/или всасывание активного вещества в желудочно-кишечном тракте (например, можно использовать глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат). Так, можно достичь длительного высвобождения активного вещества в течение многих часов, и, если необходимо, активное вещество можно защитить от разложения в желудке. Фармацевтические композиции для перорального введения можно формулировать для облегчения высвобождения активного вещества в определенном участке желудочно-кишечного тракта за счет определенного значения рН или ферментативных условий.
Фармацевтические композиции, адаптированные для трансдермального введения, могут быть обеспечены в виде отдельных пластырей, предназначенных для тесного контакта с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени.
Фармацевтические композиции, адаптированные для местного применения, могут быть обеспечены в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Для местного применения на кожу, ротовую полость, глаза или другие наружные ткани предпочтительно использовать мазь или крем для местного применения. При получении мази активный ингредиент можно использовать с парафиновой или смешивающейся с водой основой для мази. Альтернативно активный ингредиент можно формулировать в виде крема с основой масло-в-воде или вода-в-масле. Фармацевтические композиции, адаптированные для местного применения в глаза, включают глазные капли. В данных композициях активный ингредиент можно растворить или суспендировать в подходящем носителе, например водном растворителе. Фармацевтические композиции, адаптированные для местного применения в ротовой полости, включают лозенджис, пастилки и жидкости для полоскания ротовой полости.
Фармацевтические композиции, адаптированные для интраназального и пульмонального введения, могут включать твердые носители, такие как порошки (предпочтительно с размером частиц в пределах от 20 до 500 мкм). Порошки можно вводить таким же образом, как принимают порошок для вдыхания,
- 28 010371
т.е. быстрым вдыханием через нос из контейнера с порошком, держа его близко к носу. Альтернативно, композиции, предназначенные для интраназального введения, могут содержать жидкие носители, например они могут находиться в виде назальных спреев или капель для носа. Альтернативно, можно проводить ингаляцию соединений непосредственно в легкие при глубоком вдыхании или вдувании через ротовое отверстие в ротоглотку. Данные композиции могут представлять собой водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции для введения ингаляцией могут поставляться в специально адаптированных устройствах, включая, но не ограничиваясь аэрозолями под давлением, распылителями или инсуффляторами, которые можно сконструировать таким образом, что они обеспечивают заранее определенные дозы активного ингредиента. В предпочтительном воплощении фармацевтические композиции по изобретению вводят в носовую полость непосредственно или в легкие через носовую полость или ротоглотку.
Фармацевтические композиции, адаптированные для ректального введения, можно обеспечить в виде суппозиториев или клизм. Фармацевтические композиции, адаптированные для интравагинального введения, можно обеспечить в виде вагинальных суппозиториев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев.
Фармацевтические композиции, адаптированные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы или суспензии, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают композиции, в основном, изотоническими по отношению к крови предполагаемого реципиента. Другие компоненты, которые могут находиться в таких композициях, включают, например, воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Композиции, адаптированные для парентерального введения, могут находиться в контейнерах с одной или многими дозами, например в запаянных ампулах или флаконах, и они могут храниться в высушенном замораживанием (лиофилизованном) состоянии, для которых требуется только добавление стерильного жидкого носителя, например стерильного физиологического раствора для инъекций, непосредственно перед применением. Приготовленные экстемпоро инъекционные растворы и суспензии можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток. В одном воплощении автоматический инъектор, включающий инъекционный раствор эритропоэтина, можно обеспечить для неотложного введения в амбулаторных условиях, отделениях неотложной помощи и в военных условиях и даже для самостоятельного введения в домашних условиях, особенно в тех случаях, когда имеется вероятность ампутации в результате травмы, например при неосторожном обращении с газонокосилкой. Вероятность того, что клетки и ткани пострадавшей ступни или пальцев ноги приживутся после ретрансплантации, можно повысить введением эритропоэтина или тканевого протективного цитокина в несколько мест пострадавшего органа, как только возможно быстро, даже до появления медицинского персонала на месте или доставки пострадавшего с поврежденным пальцем ноги в отделение неотложной помощи.
В предпочтительном воплощении композицию получают с использованием обычных методов в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Там, где это требуется, композиция может включать солюбилизирующее вещество и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно ингредиенты вводят либо по отдельности, либо их смешивают в разовой лекарственной форме, например в виде сухого лиофилизованного порошка или не содержащего воду концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного ингредиента. В случаях, когда композицию вводят инфузией, ее можно разлить в бутыли для инфузий, содержащих стерильную воду или физиологический раствор для фармацевтического применения. Если композицию вводят инъекционно, то ампулу со стерильным раствором можно обеспечить таким образом, чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.
Суппозитории, как правило, содержат активный ингредиент в пределах от 0,5 до 10 мас.%; композиции для перорального введения содержат от 10 до 95% активного ингредиента.
Можно обеспечить перфузат для применения в банях для органов, при перфузии ίη Ши или для введения в сосудистую сеть донора органа до извлечения органа. Такие фармацевтические композиции могут содержать количества эритропоэтина, тканевых протективных цитокинов или форму эритропоэтина или тканевых протективных цитокинов, не подходящих для кратковременного или длительного, местного или системного введения индивидууму, но они должны отвечать функциям, предназначенным в данном случае для трупа, для бани для органов, для перфузата для органов или перфузата ίη Ши перед удалением или при снижении количества эритропоэтина, содержащегося там, перед или после возвращения обрабатываемого органа или ткани к постоянному кровотоку. Эритропоэтин для данного аспекта изобретения может представлять собой любой эритропоэтин, например природный, например человеческий эритропоэтин, или любой из тканевых протективных цитокинов, описанных выше, например асиалоэритропоэтин и фенилглиоксальэритропоэтин, в качестве неограничивающих примеров.
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции для лечения, профилактики и ослабления одного или более симптомов, связанных с воспалением. В конкретном воплощении композиция содержит один или более тканевых протективных цитокинов. В другом воплощении композиция
- 29 010371 содержит один или более тканевых протективных цитокинов и одно или более профилактических или терапевтических средств, иных, чем тканевые протективные цитокины, где известно, что указанные профилактические или терапевтические средства пригодны, или использовались ранее, или используются в настоящее время для профилактики, лечения или ослабления одного или более симптомов, связанных с воспалением.
В предпочтительном воплощении композиция по изобретению представляет собой фармацевтическую композицию. Такие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более профилактических или терапевтических средств (например, тканевого протективного цитокина или другого профилактического или терапевтического средства) и фармацевтически приемлемый носитель. В одном воплощении «терапевтически эффективное количество» означает количество средства, которое необязательно является эффективным, когда средство вводят самостоятельно, но оно становится эффективным, когда его вводят совместно с другим средством.
Изобретение также обеспечивает фармацевтическую упаковку или набор, содержащий один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами, входящими в состав фармацевтических композиций по изобретению. Необязательно связанным с контейнером(ами) может быть указание с информацией в форме, предписанной государственным управлением, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, где указание отражает разрешение агентства на производство, применение и продажу для введения человеку.
В частности, изобретение обеспечивает, что одно или более профилактических или терапевтических средств или фармацевтические композиции по изобретению упакованы в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества средства. В одном воплощении одно или более профилактических или терапевтических средств или фармацевтические композиции по изобретению поставляются в виде сухого, стерильного, лиофилизованного порошка или не содержащего воду концентрата в герметично закрытом контейнере, и они могут быть восстановлены, например, с помощью воды или физиологического раствора до соответствующей концентрации для введения субъекту. Предпочтительно одно или более профилактических или терапевтических средств или фармацевтические композиции по изобретению поставляются в виде сухого, стерильного, лиофилизованного порошка в герметично закрытом контейнере с разовой лекарственной формой в количестве по меньшей мере 5 мг, более предпочтительно по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг, по меньшей мере 75 мг или по меньшей мере 100 мг. Лиофилизованные профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по изобретению следует хранить при температуре в пределах 2-8°С в исходном контейнере, и профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по изобретению следует вводить в течение 1 недели, предпочтительно 5 суток, в течение 72 ч, в течение 48 ч, в течение 24 ч, в течение 12 ч, в течение 6 ч, в течение 5 ч, в течение 3 ч или в течение 1 ч после восстановления. В альтернативном воплощении одно или более профилактических или терапевтических средств или фармацевтические композиции по изобретению поставляются в жидкой форме в герметично закрытом контейнере с указанием количества и концентрации средства. Предпочтительно жидкую форму композиции для введения поставляют в герметично закрытом контейнере в концентрации по меньшей мере 0,25 мг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 0,5 мг/мл, по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл или по меньшей мере 100 мг/мл. Жидкую форму следует хранить при температуре в пределах 2-8°С в ее исходном контейнере.
Композиция может, если желательно, находиться в упаковке или распределительном устройстве, которое может содержать одну или более разовых лекарственных форм, включающих активный ингредиент. Упаковка может быть, например, из металлической или пластиковой фольги, такой как блистер. К упаковке или распределительному устройству могут прилагаться инструкции для применения.
В основном, ингредиенты композиции по изобретению получают от субъекта того же вида или видовой реактивности, что и реципиент таких композиций. Так, в предпочтительном воплощении человеческие или гуманизированные антитела вводят человеку для лечения или профилактики.
В другом воплощении, например, тканевой протективный цитокин можно вводить в системе с контролируемым высвобождением. Например, полипептид можно вводить с использованием внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В одном воплощении можно использовать насос (см. Еаидег, выше; Ε^Ποη, 1987, СЯС Сп1. РеГ. Вютеб. Εη§. 14: 201; Βι.ιο1ι\ν;·ι1ά е1 а1., 1980, 8игдегу 88: 507; 8аибек е1 а1., 1989, N. Εη§1. I. Меб. 321: 574). В другом воплощении соединение можно вводить в везикуле, в частности липосоме (см. Εαη^Γ, 8с1ег1се 249: 1527-1533 (1990); Тгеа1 е1 а1., ίη ^^рο8οте8 ίη Иге ТНегару ο£ Ιηίεοΐίοπδ Экеахе ηηά ^οреζ-Ве^е8ΐе^η ηηά Е1б1ег (еб§.), Ыкк, №\ν ΥοιΈ рр.353-365 (1989); заявку ΑΘ91/04014; патент США № 4704355; ^οреζ-Ве^е8ΐе^η, там же, рр.317-327; см., в основном, там же). В другом воплощении можно использовать полимерные материалы (см. Меб1са1 АррИстю^ ο£ 0οηίΓο1Β6 Ве1еа8е, ^аηде^ ηηά Агсе (еб§.), СЯС Ргекк: Вοса Κπΐοη, Е1ο^^ба, 1974; 0οηίτο1^6 Эгид ВюауаПаЫШу, Эгид Ргобис) ^е8^дη аЫ
- 30 010371
РегГогшапсе. 8то1еп апб Ва11 (ебк.), \УПеу: №\ν Уогк (1984); Вапдег апб Реррак, 1. Масгото1. 8с1. Вес. Масгото1. СНет. 23: 61, 1953; см. также Ьеуу еГ а1., 1985, 8с1епсе 228: 190; Оигтд еГ а1., 1989, Апп. №иго1. 25: 351; Но\\'агб еГ а1., 1989, 1. №игокигд. 71: 105).
Еще в одном воплощении систему с контролируемым высвобождением можно поместить вблизи мишени лечения, т.е. мишеневых клеток, тканей или органов, обеспечивая таким образом только часть системной дозы (см., например, Сообкоп, рр.115-138 т Меб1са1 Аррйсабопк оГ Соп1го11еб Ве1еаке, уо1.2, выше, 1984). Другие системы с контролируемым высвобождением описаны в обзоре Ьапдег (1990, 8аепсе 249: 1527-1533).
В другом воплощении тканевой протективный цитокин в соответствующей лекарственной форме можно вводить интраназально, перорально, ректально, интравагинально или сублингвально.
В конкретном воплощении может быть желательным вводить эритропоэтин и/или тканевой протективный цитокин по изобретению местно в область, требующую лечения; этого можно достичь, например, и без ограничения, местной инфузией во время операции, местной аппликацией, например при перевязке раны после операции, инъекцией, с помощью катетера, посредством суппозитория, с помощью имплантата, где указанный имплантат представляет собой пористый, непористый или гелеобразный материал, включая мембраны, например мембраны или волокна из силастика.
Специалисты в данной области могут легко определить предпочтительную эффективную дозу с учетом нескольких факторов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Такие факторы включают конкретную форму эритропоэтина или тканевого протективного цитокина и его фармакокинетические параметры, такие как биодоступность, метаболизм, период полувыведения и т. д., которые определены на стадиях обычной разработки препарата, обычно используемых в целях получения официального разрешения на применение фармацевтического препарата. Дополнительные факторы, которые должны учитываться при определении дозы, включают состояние или заболевание, которое подвергается лечению, или положительное действие, которое должно достигаться у нормального индивидуума, массу тела пациента, путь введения, является введение кратковременным или продолжительным, применение сопутствующих видов лечения и другие факторы, хорошо известные как оказывающие влияние на эффективность вводимых фармацевтических средств. Таким образом, точная доза должна определяться решением врача и на основе обстоятельств, присущих каждому пациенту, например в зависимости от состояния и иммунного статуса отдельного пациента и согласно стандартным клиническим методам.
В другом аспекте изобретения обеспечивается перфузат или перфузионный раствор для перфузии и хранения органов, предназначенных для трансплантации, где перфузионный раствор содержит количество эритропоэтина или тканевого протективного цитокина, эффективное для защиты реактивных клеток и связанных с ними клеток, тканей или органов. Трансплантация включает, но не ограничивается ксенотрансплантацией, где орган (включая клетки, ткани или другие части организма) отбирают от одного донора и трансплантируют другому реципиенту, и аутотрансплантацию, где орган отбирают из одной части тела и переносят в другую, включая хирургические вмешательства, при которых орган можно удалить и при его нахождении в условиях ех νί\Ό подвергнуть резекции, восстановлению или иным манипуляциям, например удалить опухоль, и затем вернуть в исходное положение. В одном воплощении перфузионный раствор представляет собой раствор Университета Висконсина (И^) (патент США № 4798824), который содержит от примерно 1 до примерно 25 Е/мл эритропоэтина, 5% гидроксиэтилированного крахмала (имеющего молекулярную массу от примерно 200000 до примерно 300000 и не содержащего этиленгликоля, этиленхлоргидрина, хлорида натрия и ацетона); 25 мМ КН2РО4; 3 мМ глутатиона; 5 мМ аденозина; 10 мМ глюкозы; 10 мМ НЕРЕ8-буфера; 5 мМ глюконата магния; 1,5 мМ СаС12; 105 мМ глюконата натрия; 200000 Е пенициллина; 40 Е инсулина; 16 мг дексаметазона; 12 мг фенолового красного, и имеет значение рН, равное 7,4-7,5 и осмомолярность примерно 320 мосм/л. Раствор применяется для хранения почек и поджелудочной железы от трупа перед трансплантацией. При использовании раствора продолжительность консервации не должна превышать 30-часового периода, рекомендованного для консервации трупных почек. Данный конкретный перфузат является только иллюстративным из ряда таких растворов, которые можно адаптировать для настоящего применения включением эффективного количества эритропоэтина и/или тканевого протективного цитокина. В дополнительном воплощении перфузионный раствор содержит от примерно 1 до примерно 500 нг/мл эритропоэтина или от примерно 40 до примерно 320 нг/мл эритропоэтина. Как уже указывалось выше, можно использовать любую форму эритропоэтина или тканевых протективных цитокинов в данном аспекте изобретения.
Несмотря на то, что предпочтительным реципиентом тканевого протективного цитокина для всех настоящих целей по изобретению является человек, настоящие способы в равной степени можно использовать для других млекопитающих, в частности домашних животных, сельскохозяйственных животных, собак и кошек и зоопарковых животных. Однако изобретение не ограничивается этим, и его положительные эффекты можно применить для любого млекопитающего.
В дополнительных аспектах изобретения в условиях ех νί\Ό можно использовать эритропоэтин и любой тканевой протективный цитокин, например, включая, но не ограничиваясь описанными выше.
Еще в одном аспекте изобретения обеспечиваются способы и композиции для стимуляции жизнеспособности клеток, тканей и органов, которые не отделены от сосудистой сети эндотелиальным клеточ
- 31 010371 ным барьером непосредственным воздействием на клетки, ткани или органы фармацевтической композиции, содержащей эритропоэтин или тканевой протективный цитокин, или введением или контактированием фармацевтической композиции, содержащей эритропоэтин или тканевой протективный цитокин, в сосудистую сеть ткани или органа. Повышение активности реактивных клеток в обработанной ткани или органе ответственно за проявляемые положительные эффекты.
Как описано выше, изобретение основано частично на обнаружении того, что молекулы эритропоэтина могут проникать с поверхности просвета сосудов на поверхность базальной мембраны эндотелиальных клеток капилляров в органах с плотными соединениями из эндотелиальных клеток, например, включая мозг, сетчатку и семенники. Таким образом, реактивные клетки за барьером являются чувствительными мишенями для положительных эффектов эритропоэтина или тканевого протективного цитокина, и другие типы клеток, или тканей, или органов, которые включают или зависят в целом или частично от реактивных клеток, являются мишенями для способов по изобретению. Не желая связываться какойлибо конкретной теорией, определили, что после прохождения эритропоэтина или тканевого протективного цитокина в клетку эритропоэтин или тканевой протективный цитокин могут взаимодействовать с рецептором эритропоэтина на реактивной клетке, например нейроне, клетке сетчатки, мышечной, сердечной, легочной клетке, клетке печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров, семенников, яичников или эндометрия, и связывание с рецептором может «запустить» каскад передачи сигналов, приводя к активации программы экспрессии гена в реактивной клетке или ткани, результатом чего является обеспечение защиты клетки, или ткани, или органа от повреждения, такого как воздействие токсинов, химиотерапевтических средств, лучевая терапия, гипоксия и т.д. Так, способы защиты тканей, включающих реактивные клетки, от стресса в результате повреждения или гипоксии и стимуляции повышения функциональной активности таких тканей подробно описаны выше.
В практике одного воплощения изобретения пациент-млекопитающее подвергается системной химиотерапии для лечения опухолей, включая лучевую терапию, которая обычно оказывает побочные эффекты, такие как повреждение нервов, легких, сердца, яичников или семенников. Введение фармацевтической композиции, содержащей эритропоэтин и/или тканевой протективный цитокин, описанные выше, проводят до и во время химиотерапии и/или лучевой терапии для защиты различных тканей и органов от повреждения под воздействием химиотерапевтических средств, например для защиты семенников. Лечение можно продолжать до тех пор, пока концентрация химиотерапевтического средства в крови снижается ниже уровня, представляющего потенциальную опасность для организма млекопитающего.
В практике другого воплощения изобретения планируется отобрать различные органы из организма жертвы автокатастрофы для пересадки ряду реципиентов, некоторые из которых необходимо транспортировать далеко и в течение продолжительного периода времени. Перед взятием органов жертве проводят инфузию фармацевтической композиции, содержащей эритропоэтин или тканевые протективные цитокины, описанные здесь. Отобранные для отправки органы перфузируют раствором для перфузии, содержащим эритропоэтин и/или тканевой протективный цитокин, и хранят в бане, содержащей эритропоэтин и/или тканевые протективные цитокины. Некоторые органы постоянно перфузируют с помощью пульсирующего устройства для перфузии с использованием перфузата, содержащего эритропоэтин или тканевые протективные цитокины по настоящему изобретению. Во время транспортировки и при имплантации и реперфузии органов ίη δίΐιι происходит минимальное снижение функции органа.
В другом воплощении изобретения необходимо было проведение хирургического вмешательства для восстановления сердечного клапана, для которого требовалась временная кардиоплегия и окклюзия артерий. Перед операцией пациенту инфузировали тканевой протективный цитокин, 4 мкг карбамилированного асиалоэритропоэтина на кг массы тела. Такая обработка предупреждала ишемическое повреждение клеток в результате гипоксии, в частности, после реперфузии.
Еще в одном воплощении изобретения при любом хирургическом вмешательстве, например экстракорпоральном кровообращении, можно использовать природный эритропоэтин или тканевой протективный цитокин по изобретению. В одном воплощении проводят введение фармацевтической композиции, содержащей эритропоэтин и/или тканевой протективный цитокин, описанные выше до, во время и/или после проведения экстракорпорального кровообращения для защиты функциональной активности мозга, сердца и других органов.
В последующих примерах, в которых природный эритропоэтин и/или тканевой протективный цитокин по изобретению использовали для применений ех νίνο или для обработки реактивных клеток, таких как нейроны, клетки сетчатки, сердца, легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров, семенников, яичников или эндометрия, изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию в лекарственной форме, адаптированной для защиты или стимуляции реактивных клеток, тканей или органов, отделенных от сосудистой сети, которая содержит количество тканевого протективного цитокина в пределах примерно от 1 пг до 5 мг, от 500 пг до 5 мг, от 1 нг до 5 мг, от 500 нг до 5 мг, от 1 мкг до 5 мг, от 500 мкг до 5 мг или от 1 до 5 мг и фармацевтически приемлемый носитель. В предпочтительном воплощении количество тканевого протективного цитокина находится в пределах примерно от 1 пг до 1 мг. В предпочтительном воплощении компози
- 32 010371 ция содержит тканевые протективные цитокины, которые не обладают эритропоэтическим действием.
В дополнительном аспекте изобретения было установлено, что введение тканевых протективных цитокинов восстанавливает познавательную функцию у животных, подвергшихся травме мозга. Через 5 или 30 суток после травмы введение эритропоэтина обеспечивало восстановление функции по сравнению с контрольными животными, указывая на способность эритропоэтина регенерировать или восстанавливать активность мозга. Таким образом, изобретение также относится к применению эритропоэтина и/или тканевых протективных цитокинов для получения фармацевтической композиции для лечения травмы мозга и других нарушений познавательной функции, включая также лечение после травмы (например, через 3 суток, 5 суток, неделю, месяц или более). Изобретение также относится к способу лечения нарушения познавательной функции после травмы введением эффективного количества эритропоэтина и/или тканевых протективных цитокинов. Для данного аспекта изобретения можно использовать любой эритропоэтин и/или тканевой протективный цитокин.
Кроме того, восстановительный аспект изобретения относится к применению любых эритропоэтинов и/или тканевых протективных цитокинов для получения фармацевтической композиции, предназначенной для восстановления нарушенной функции клеток, тканей или органов, где обработку проводят после и значительно после первоначального инсульта, ответственного за нарушение функций. Кроме того, лечение с использованием эритропоэтина и/или тканевых протективных цитокинов по изобретению может ослабить тяжесть протекания заболевания или состояния во время острой фазы, а также хронической фазы.
В тех случаях, когда эритропоэтин по изобретению обладает эритропоэтической активностью, в предпочтительном воплощении эритропоэтин можно вводить системно в дозе примерно в пределах от 1 до примерно 100 мкг/кг массы тела, предпочтительно примерно в пределах 5-50 мкг/кг массы тела, наиболее предпочтительно примерно в пределах 10-30 мкг/кг массы тела на введение. Данная эффективная доза должна быть достаточной для обеспечения в сыворотке крови концентрации эритропоэтина выше чем примерно 10000, 15000 или 20000 мЕ/мл (80, 120 или 160 нг/мл) сыворотки крови после введения эритропоэтина. Такие концентрации в сыворотке крови можно обеспечить примерно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ч после введения. Такие дозы можно по необходимости повторять. Например, введение можно проводить ежедневно, так длительно, как это требуется по клиническим показаниям, или через определенный интервал времени, например каждую 1 неделю до 12 недель, предпочтительно каждую 1 неделю до 3 недель. В одном воплощении эффективное количество эритропоэтина и фармацевтически приемлемый носитель могут быть упакованы во флаконе с одной дозой или разных контейнерах. В другом воплощении используются тканевые протективные цитокины, которые способны проявлять описанные здесь эффекты, но не приводя к повышению гемоглобина или гематокрита. Такие тканевые протективные цитокины являются предпочтительными в случаях, когда способы по настоящему изобретению предназначены для длительного проведения. В другом воплощении эритропоэтин вводят в дозе, превышающей необходимую для максимальной стимуляции эритропоэза. Как уже отмечалось выше, тканевой протективный цитокин по изобретению необязательно должен обладать эритропоэтической активностью, и, следовательно, вышеуказанные дозы, выраженные в гематопоэтических единицах, являются только примерными для эритропоэтинов, которые оказывают влияние на эритропоэз; выше приводятся весовые эквиваленты для доз, которые применимы для тканевых протективных цитокинов.
В одном воплощении количество композиции по изобретению, которое будет эффективным для лечения, профилактики или ослабления одного или более симптомов, связанных с воспалением, можно определить обычными клиническими методами. Точная доза, используемая в композиции, будет также зависеть от пути введения и тяжести состояния, и решение будет приниматься с учетом мнения врача и обстоятельств для каждого млекопитающего. Эффективные дозы можно экстраполировать с использованием графиков зависимости доза-ответная реакция, полученных в условиях ίη νίΐτο и на тест-моделях на животных.
В конкретном воплощении доза композиции по изобретению или профилактического или терапевтического средства, вводимого для профилактики, лечения или ослабления одного или более симптомов, связанных с воспалительным заболеванием, составляет для млекопитающего 150 мкг/кг или ниже, предпочтительно 125 мкг/кг или ниже, 100 мкг/кг или ниже, 95 мкг/кг или ниже, 90 мкг/кг или ниже, 85 мкг/кг или ниже, 80 мкг/кг или ниже, 75 мкг/кг или ниже, 70 мкг/кг или ниже, 65 мкг/кг или ниже, 60 мкг/кг или ниже, 55 мкг/кг или ниже, 50 мкг/кг или ниже, 45 мкг/кг или ниже, 40 мкг/кг или ниже, 35 мкг/кг или ниже, 30 мкг/кг или ниже, 25 мкг/кг или ниже, 20 мкг/кг или ниже, 15 мкг/кг или ниже, 10 мкг/кг или ниже, 5 мкг/кг или ниже, 2,5 мкг/кг или ниже, 2 мкг/кг или ниже, 1,5 мкг/кг или ниже, 1 мкг/кг или ниже, 0,5 мкг/кг или ниже массы тела млекопитающего. В другом воплощении доза композиции по изобретению или профилактического или терапевтического средства, вводимого для профилактики, лечения или ослабления одного или более симптомов, связанных с воспалением у млекопитающего, представляет единичную дозу от 0,1 до 20 мг, от 0,1 до 15 мг; от 0,1 до 12 мг; от 0,1 до 10 мг; от 0,1 до 8 мг; от 0,1 до 7 мг; от 0,1 до 5 мг; от 0,1 до 2,5 мг; от 0,25 до 20 мг; от 0,25 до 15 мг; от 0,25 до 12 мг; от 0,25 до 10 мг; от 0,25 до 8 мг; от 0,25 до 7 мг; от 0,25 до 5 мг; от 0,5 до 2,5 мг; от 1 до 20 мг; от 1 до 15 мг; от 1 до 12 мг; от 1 до 10 мг; от 1 до 8 мг; от 1 до 7 мг; от 1 до 5 мг; от 1 до 2,5 мг.
- 33 010371
Еще в одном воплощении субъекту вводят одну или более доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более иммуномодулирующих средств, где доза профилактически или терапевтически эффективного количества указанного средства(в), вводимая указанному субъекту, обеспечивает у указанного субъекта среднее абсолютное количество лимфоцитов, составляющее от примерно 500 до ниже 1500 клеток/мм3, предпочтительно ниже 1400, ниже 1300, ниже 1250, ниже 1200, ниже 1100 или ниже 1000 клеток/мм3.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу облегчения транспорта молекулы через эндотелиальный клеточный барьер у млекопитающего введением композиции, которая содержит конкретную молекулу в сочетании с эритропоэтином или тканевым протективным цитокином, описанными выше. Как описано выше, плотные соединения между эндотелиальными клетками в некоторых органах в организме создают барьер для проникновения определенных молекул. Для лечения различных состояний в органе, имеющем барьер, желателен способ облегчения прохождения фармацевтических средств через него. Эритропоэтин или тканевые протективные цитокины по изобретению являются пригодными в качестве носителей для доставки других молекул через гематоэнцефалический барьер и другие аналогичные барьеры. Готовят композицию, содержащую молекулу, желаемую для переноса через барьер с эритропоэтином или тканевым протективным цитокином, и периферическое введение композиции приводит к прохождению композиции через барьер. Связь между молекулой, которая переносится через барьер, и эритропоэтином или тканевым протективным цитокином может представлять собой лабильную ковалентную связь, при которой молекула высвобождается из комплекса с эритропоэтином или тканевым протективным цитокином после прохождения через барьер. Если желательная фармакологическая активность молекулы сохраняется и связь с эритропоэтином или тканевым протективным цитокином не оказывает на нее влияния, то можно вводить такой комплекс.
Специалистам в данной области известны различные способы связывания молекул с эритропоэтином или тканевым протективным цитокином по изобретению и другими средствами, описанными выше, ковалентной, нековалентной и другими связями. Кроме того, можно легко оценить эффективность композиции на экспериментальной системе. Соединения молекул с эритропоэтином или тканевым протективным цитокином можно достичь с помощью ряда способов, включая лабильное, ковалентное связывание, поперечное сшивание и т. п. Можно использовать взаимодействия биотин/авидин; например, биотинилированный эритропоэтин по изобретению можно комплексовать с лабильным конъюгатом авидина и, как желательно, транспортировать молекулу. Как уже отмечалось выше, гибридную молекулу можно получить с помощью рекомбинантных или синтетических способов, например гибридный или химерный полипептид, включающий домен молекулы с желаемой фармакологической активностью, и домен, ответственный за модуляцию активности рецептора эритропоэтина. В молекулу можно включить сайты расщепления протеазой.
Молекулу можно конъюгировать с эритропоэтином или тканевым протективным цитокином по изобретению с помощью полифункциональной молекулы, т.е. полифункционального поперечно-сшивающего линкера. В том смысле, в котором он здесь используется, термин «полифункциональная молекула» включает молекулы, имеющие одну функциональную группу, которая может взаимодействовать более чем 1 раз последовательно, например формальдегид, а также молекулы, имеющие более чем одну реакционноспособную группу. В том смысле, в котором он здесь используется, термин «реакционноспособная группа» относится к функциональной группе в поперечно-сшивающем линкере, которая взаимодействует с функциональной группой в молекуле (например, пептиде, белке, углеводе, нуклеиновой кислоте, в частности гормоне или противоопухолевом средстве, которое требуется перенести через эндотелиальный клеточный барьер) с образованием ковалентной связи между поперечно-сшивающим линкером и молекулой. Термин «функциональная группа» сохраняет свое обычное значение, принятое в органической химии. Полифункциональные молекулы, которые можно использовать, предпочтительно представляют собой биосовместимые линкеры, т.е. они являются неканцерогенными, нетоксичными и, в основном, неиммуногенными в условиях ίη νίνο. Полифункциональные поперечно-сшивающие линкеры, известные в данной области и описанные здесь, можно легко тестировать на моделях на животных в целях установления их биосовместимости. Полифункциональная молекула предпочтительно является бифункциональной. В том смысле, в котором он здесь используется, термин «бифункциональная молекула» относится к молекуле с двумя реакционноспособными группами. Бифункциональная молекула может представлять собой гетеробифункциональную или гомобифункциональную молекулу. Гетеробифункциональный поперечно-сшивающий линкер позволяет иметь место векторной конъюгации. Особенно предпочтительно, если полифункциональная молекула обладает достаточной растворимостью в воде для протекания поперечно-сшивающих реакций в водных растворах, таких как забуференные водные растворы при значении рН в пределах от 6 до 8, и если полученный конъюгат остается водорастворимым для более эффективного распределения в тканях. Как правило, полифункциональная молекула ковалентно связывается с аминогруппой или сульфгидрильной функциональной группой. Однако полифункциональные молекулы, взаимодействующие с другими функциональными группами, такими как карбоксильные группы или гидроксильные группы, входят в объем настоящего изобретения.
Гомобифункциональные молекулы имеют по меньшей мере две реакционноспособные функцио
- 34 010371 нальные группы, которые являются одинаковыми. Реакционноспособные группы в гомобифункциональной молекуле включают, например, альдегидные группы и активные эфирные группы. Гомобифункциональные молекулы, имеющие альдегидные группы, включают, например, глутаральдегид и субаральдегид. Применение глутаральдегида в качестве поперечно-сшивающего агента раскрыто Рохпапкку е1 а1., 8с1епсе 223, 1304-1306 (1984). Гомобифункциональные молекулы, имеющие по меньшей мере две активные эфирные группы, включают эфиры дикарбоновых кислот и Ν-гидроксисукцинимид. Некоторые примеры таких Ν-сукцинимидовых эфиров включают дисукцинимидилсуберат и дитио-бис-(сукцинимидилпропионат) и их растворимые соли бис-сульфоновой кислоты и бис-сульфонат в виде их солей натрия и калия. Данные гомобифункциональные реагенты являются промышленно доступными от Р1егсе, РоскГогб. 1Шпо15.
Гетеробифункциональные молекулы имеют по меньшей мере две различные реакционноспособные группы. Реакционноспособные группы взаимодействуют с различными функциональными группами, например имеющимися у эритропоэтина и молекулы. Данные две различные функциональные группы, которые взаимодействуют с реакционноспособной группой в гетеробифункциональном поперечно-сшивающем линкере, как правило, представляют собой аминогруппу, например эпсилон-аминогруппу лизина; сульфгидрильную группу, например тиол в цистеине; карбоксильную группу, например карбоксилат в аспарагиновой кислоте; или гидроксильную группу, например гидроксильную группу в серине.
Конечно, некоторые из различных тканевых протективных цитокинов по изобретению и эритропоэтин могут не иметь подходящих реакционноспособных групп, доступных для взаимодействия с поперечно-сшивающим агентом, однако, специалисты в данной области вполне способны выбрать поперечно-сшивающие агенты, основываясь на доступных для поперечного сшивания группах в молекуле эритропоэтина или тканевых протективных цитокинов по изобретению.
Когда реакционноспособная группа гетеробифункциональной молекулы образует ковалентную связь с аминогруппой, то ковалентная связь, как правило, будет представлять собой амидную или имидную связь. Реакционноспособная группа, которая образует ковалентную связь с аминогруппой, может быть, например, активированным карбоксилатом, галогенкарбонилом или эфирной группой. Предпочтительной галогенкарбонильной группой является хлоркарбонильная группа. Эфирные группы предпочтительно представляют собой реакционноспособные эфирные группы, такие как, например, Ν-гидроксисукцинимидная эфирная группа.
Другой функциональной группой, как правило, является тиольная группа, группа, способная превращаться в тиол, или группа, которая образует ковалентную связь с тиолом. Ковалентная связь обычно является тиоэфирной связью или дисульфидной связью. Реакционноспособная группа, которая образует ковалентную связь с тиолом, может иметь, например, двойную связь, по которой происходит взаимодействие с тиолом или активированным дисульфидом. Реакционноспособная группа, содержащая двойную связь, способна взаимодействовать с тиолом, представляет собой малеимидогруппу, хотя также возможны другие группы, такие как акрилонитрил. Реакционноспособная дисульфидная группа может быть, например, 2-пиридилдитиогруппой или 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой). Некоторые примеры гетеробифункциональных реагентов, содержащих реакционноспособные дисульфидные связи, включают №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (Сагккоп е1 а1., 1978; ВюсНеш. I., 173: 723-737), натрий 8-4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метилбензилтиосульфат и 4-сукцинимидилоксикарбонил-альфаметил(2-пиридилдитио)толуол. №Сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат является предпочтительным. Некоторые примеры гетеробифункциональных реагентов, содержащих реакционноспособные группы с двойной связью, по которой происходит взаимодействие с тиолом, включают сукцинимидил-4(№малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилат и сукцинимидил-м-малеимидобензоат.
Другие гетеробифункциональные молекулы включают сукцинимидил-3-(малеимидо)пропионат, сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират, сульфосукцинимидил-4-(№малеимидометилциклогексан)-1-карбоксилат, малеимидобензоил-№гидроксисукцинимидовый эфир. Сульфонат натрия сукцинимидил-м-малеимидобензоата является предпочтительным. Многие из вышеуказанных гетеробифункциональных реагентов и их сульфонаты являются промышленно доступными от Р1егсе Сйетюа1 Со., ЯоскГогб, 1Шпо15, США.
Специалисты в данной области могут легко определить необходимость того, чтобы вышеуказанные конъюгаты были обратимыми или лабильными. Конъюгат можно тестировать в условиях ш νίΙΐΌ как на присутствие эритропоэтинов, так и на желаемую фармакологическую активность. Если конъюгат сохраняет оба свойства, то затем можно тестировать его применимость в условиях ш νί\Ό. Если необходимо, чтобы конъюгированная молекула отщеплялась от эритропоэтина или тканевого протективного цитокина для проявления активности, то предпочтительной будет лабильная связь или обратимое соединение с эритропоэтином или тканевым протективным цитокином. Свойства лабильности также можно тестировать с использованием обычных методов в условиях ш νίΙΐΌ перед тестированием в условиях ш νί\Ό.
Дополнительную информацию относительно того, как можно получить и применять данные, а также другие полифункциональные реагенты, можно получить из последующих публикаций или других имеющихся в данной области источников.
- 35 010371
1. Сатккоп, 1. е! а1., 1978, ВюсЬет. 1. 173: 723-737.
2. СитЬег, ТА. е! а1., 1985, Ме1йобк ш Епхуто1оду 112: 207-224.
3. 1ие, К. е! а1., 1978, ВюсЬет. 17: 5399-5405.
4. 8ип, Т.Т. е! а1., 1974, ВюсЬет. 13: 2334-2340.
5. В1ай1ег, №.А. е! а1., 1985, ВюсЬет. 24: 1517-152.
6. Ни, Е.Т. е! а1., 1979, ВюсЬет. 18: 690-697.
7. Уои1е, К.1. апб №ем11е, Ό.Μ. 1г., 1980, Ргос. №а!1. Асаб. 8с1 И.8.А. 77: 5483-5486.
8. Ьетег, К.А. е! а1., 1981, Ргос. №а!1. Асаб. 8с1 И.8.А. 78: 3403-3407.
9. 1ипд, 8.М. апб Мого1, М., 1983, ВюсЬет. ВюрЬук. Ас!а 761: 162.
10. СаиШе1б, М.Р. е! а1., 1984, ВюсЬет. 81: 7772-7776.
11. 81агок, IV., 1982, ВюсЬет. 21: 3950-3955.
12. УокЬйаке, 8. е! а1., 1979, Еиг. 1. ВюсЬет. 101: 395-399.
13. УокЬйаке, 8. е! а1., 1982, 1. ВюсЬет. 92: 1413-1424.
14. РИсЬ, Р.Е. апб С/еск М.Р., 1979, 1. Вю1. СЬет. 254: 3375-3381.
15. №оИск, Ό. е! а1., 1987, 1. Вю1. СЬет. 262: 8483-8487.
16. Ьотап!, А.1 апб ЕапЬапкк, С., 1976, 1. Мо1. Вю1. 104: 243-261.
17. Натаба, Н. апб Ткигио, Т., 1987, Апа1. ВюсЬет. 160: 483-488.
18. НакЫба, 8. е! а1., 1984, 1. Аррйеб ВюсЬет. 6: 56-63.
Дополнительно способы поперечного сшивания приведены в обзоре Меапк апб Ееепеу, 1990, Вюсопщда!е СЬет. 1: 2-12.
Барьеры, через которые проходят с использованием вышеуказанных способов и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются гематоэнцефалическим барьером, гематоглазным барьером, гематосеменниковым барьером, гематояичниковым барьером и гематоматочным барьером.
Молекулы-кандидаты для переноса через эндотелиальный клеточный барьер включают, например, гормоны, такие как гормон роста, нейротрофические факторы, антибиотики, противовирусные или противогрибковые средства, которые обычно не попадают в мозг и другие органы с барьером, пептидные радиоизотопные препараты, антисмысловые препараты, антитела и антитела против биологически активных веществ, лекарственные препараты и противоопухолевые средства. Неограничивающие примеры таких молекул включают гормоны, например гормон роста, фактор роста нервов (№СЕ), нейротрофические факторы из мозга (ВЭ№1). цилиарный нейротрофический фактор (С№ТЕ), основной фактор роста фибробластов (ЬЕСЕ), трансформирующий фактор β1 (ТС?в1), трансформирующий фактор роста β2 (ТС?в2), трансформирующий фактор β3 (ТСЕв3), интерлейкин 1, интерлейкин 2, интерлейкин 3 и интерлейкин 6, А2Т, антитела против фактора некроза опухолей и иммуносупрессоры, такие как циклоспорин. Кроме того, к эритропоэтину и одному из тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению можно присоединить красители или маркеры для визуализации клеток, тканей или органов в мозге и других органов с барьером для диагностических целей. В качестве примера маркер, используемый для визуализации бляшек в мозге, можно присоединить к эритропоэтину или тканевому протективному цитокину для определения прогрессирования болезни Альцгеймера у пациента.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей молекулу для переноса посредством трансцитоза через плотный соединительный эндотелиальный клеточный барьер и эритропоэтин или тканевой протективный цитокин, описанные здесь. Изобретение дополнительно относится к применению конъюгата молекулы и эритропоэтина или тканевого протективного цитокина, описанных выше, для получения фармацевтической композиции для переноса молекулы через барьер, как описано выше.
В последующих примерах приводятся различные модели на животных и опыты ш ν Иго по защите нервной ткани и трансцитозу для демонстрации эффективности тканевых протективных цитокинов по изобретению. Такие модели включают модели в условиях ш νίΙΐΌ с использованием клеток Р19 для определения нейропротективного действия тканевых протективных цитокинов и в условиях ш νί\Ό на модели интоксикации водой на мышах для определения нейропротективного действия тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению. Для демонстрации трансцитоза оцениваются модельные белки, конъюгированные с эритропоэтинами по изобретению по их проникновению в мозг после парентерального введения. Данные тесты на моделях в условиях ш νίΙΐΌ и на моделях на животных предсказывают эффективность настоящих соединений на других видах млекопитающих, включая людей. Кроме того, в примере 1 показано, что мозг человека имеет большое количество рецепторов эритропоэтина, что обеспечивает механизм трансцитоза эритропоэтинов, а также тканевых протективных цитокинов.
Настоящее изобретение лучше понять при обращении к последующим неограничивающим примерам, которые приводятся в качестве примеров воплощения изобретения. Последующие примеры представлены для более полной иллюстрации предпочтительных воплощений изобретения. Однако они никоим образом не ограничивают большой объем изобретения.
Пример 1. Распределение рецепторов эритропоэтина в мозге человека.
Образцы мозга здоровых людей, удаленные во время проведения операций (например, для получения не содержащих опухоль образцов во время резекции опухоли) сразу же фиксировали в 5% акролеине
- 36 010371 на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 3 ч. Делали срезы толщиной 40 мкм с помощью вибрирующего микротома.
Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием свободно плавающих срезов и опосредованным методом с антителами, меченными пероксидазой-антипероксидазой в разведении антисыворотки против рецепторов эритропоэтина 1:500 (производства 8ап1а Сгих Вю1ес1то1оду). Эндогенную активность пероксидазы гасили предварительной обработкой тканевых срезов перекисью водорода (3% в метаноле в течение 30 мин). Ставили контроли на ткань без добавления первичных антител и при использовании соответствующего блокирующего пептида (производства 8ап1а Сгих Вю1ес11.) для подтверждения специфичности окрашивания на рецепторы эритропоэтина (ЕРО).
На фиг. 1 показано, что капилляры мозга человека экспрессируют высокие концентрации рецептора ЕРО по данным иммуногистохимического анализа с использованием специфических антител против рецептора ЕРО. Это обеспечивает механизм для проникновения ЕРО в мозг из кровотока, несмотря на наличие гематоэнцефалического барьера.
На фиг. 2 показано, что рецептор ЕРО густо распределен внутри и вокруг капилляров, образующих гематоэнцефалический барьер в мозге человека.
Аналогичную методику, что для фиг. 1 и 2, проводили для фиг. 3, за исключением того, что делали из парафина срезы толщиной 10 мкм, залитые срезы фиксировали погружением в 4% параформальдегид. На фиг. 3 показано, что имеется высокая плотность рецептора ЕРО на просветных и противоположных просвету поверхностях капилляров мозга человека, образуя анатомическую основу для прохождения ЕРО из кровотока в мозг.
Данные на фиг. 4 получали с использованием аналогичного метода, что для фиг. 3, за исключением того, что срезы ткани делали на ультрамикротоме для электронной микроскопии, и вторичные антитела метили частицами коллоидного золота. На данной фигуре показано, что рецептор ЕРО обнаружен на эндотелиальной поверхности (*), внутри цитоплазматических везикул (стрелки) и на глиальной ножке (+) в мозге человека, обеспечивая анатомическую основу для прохождения ЕРО из кровотока в мозг.
Пример 2. Тканевые протективные цитокины.
Тканевые протективные цитокины, желательные для применений, описанных здесь, можно получить гуанидированием, карбамилированием, амидированием, тринитрофенилированием, ацетилированием, сукцинилированием, нитрованием или модификацией остатков аргинина или лизина или карбоксильных групп эритропоэтина, среди прочих методов, упомянутых выше. В результате данных модификаций получают тканевые протективные цитокины, которые сохраняют свою активность в отношении определенных органов и тканей, но не обладают для других, например для эритроцитов. Когда эритропоэтин подвергали вышеуказанным реакциям, то было установлено, что, в целом, у полученной молекулы отсутствует эритропоэтическая активность в условиях ίη νίνο и ίη νίΐτο (например, 8а!аке е! а1., 1990, ВюсЫт. ВюрНуы Лс1а 1038: 125-9). Некоторые примеры получения тканевых протективных цитокинов представлены ниже. Несмотря на то, что в представленных ниже примерах в качестве исходного вещества используется эритропоэтин, специалистам в данной области, очевидно, понятно, что также можно использовать производные эритропоэтина, такие как десиалилтированный, гуанидированный, карбамилированный, амидированный, тринитрофенилированный, ацетилированный, сукцинилированный и нитрированный эритропоэтин.
А. Получение тканевых протективных цитокинов десиалилтированием эритропоэтина.
Эритропоэтин можно десиалилтировать с использованием последующей методики в качестве примера. Сиалидазу (выделенную из 8!гер!ососси§ §р 6646К.) получают от 8Е1КАСЛКи АМЕВ1СА (шифр № 120050). Эритропоэтин подвергают десиалилтированию под действием сиалидазы (0,05 Е/мг ЕРО) при 37°С в течение 3 ч. Реакционную смесь обессоливают и концентрируют с использованием центрифужного устройства для фильтрации иИгайее. Затем пробу наносят на ионообменную колонку в системе ЛКТАрпте™. Белок элюируют выбранными буферами. Элюированные фракции, содержащие значительное количество белка, затем подвергают электрофорезу в геле ΙΕΕ. Объединяют фракции, содержащие только две верхние полосы (мигрирующие при р1 »8,5 и 7,9 на геле ΙΕΕ). Определяли содержание белка в объединенных фракциях и добавляли 1/9 объема солевого раствора 10х(1М №С1, 0,2М цитрата натрия, 3 мМ лимонной кислоты). Затем определяли содержание сиаловой кислоты в растворе. Не должно обнаруживаться значительного количества сиаловой кислоты.
Асиалоэритропоэтин и фенилглиоксальэритропоэтин были эффективными наравне с природным эритропоэтином для нейронов в условиях ίη νίΐτο, как показано на фиг. 5-6. Тестирование в условиях ίη νίΐτο проводили с использованием нейроноподобных эмбриональных клеток карциномы (Р19), которые претерпевают апоптоз при удалении сыворотки крови. За 24 ч до удаления сыворотки крови в культуры добавляли эритропоэтин или модифицированный эритропоэтин из расчета 1-1000 нг/мл. На следующий день среду удаляли, клетки промывали свежей, не содержащей сыворотку крови средой и среду, содержащую тестируемое соединение (без сыворотки крови), вносили обратно в культуру еще на 48 ч. Для определения количества жизнеспособных клеток ставили анализ на восстановление тетразолия (Се11Тйег 96; Рготеда, 1пс.). Как показано на фиг. 5-6, оказалось, что асиалоэритропоэтин обладает аналогичной
- 37 010371 активностью с самим эритропоэтином в отношении предупреждения гибели клеток.
Сохранение протективного действия для нервной ткани в условиях ίη νίνο подтверждали с использованием модели очаговой ишемии на крысах, когда воспроизводили обратимое поражение в области средней церебральной артерии, как описано ранее (Вппек с1 а1., 2000, Ргос. Ыа1. Асаб. 8сЕ, И.8.А. 97: 10526-31). Взрослым крысам-самцам Спрегью-Даули вводили асиалоэритропоэтин или эритропоэтин (5000 Е (40 мкг)/кг массы тела внутрибрюшинно) или растворитель в начале окклюзии артерии. Через 24 ч животных убивали и извлекали мозг для исследований. Готовили серию срезов и окрашивали солью тетразолия для идентификации живых участков мозга. Как показано на фиг. 7, асиалоэритропоэтин был эффективен наравне с природным эритропоэтином в отношении обеспечения защиты нервной ткани от последствий 1-часовой ишемии. На фиг. 8 представлены результаты опыта на другой модели очаговой ишемии, где проводили сравнительную оценку зависимости доза-ответная реакция для эритропоэтина и асиалоэритропоэтина. При использовании в самой низкой дозе 250 Е (2 мкг)/кг асиалоэритропоэтин обеспечивал защитное действие, в то время как немодифицированный эритропоэтин - нет.
B. Получение тканевых протективных цитокинов карбамилированием эритропоэтина.
Природный эритропоэтин можно использовать для получения соответствующих карбамилированных молекул согласно последующему методу, описанному ίίη 2епд (1991). Ьукше шоШПсаНоп оГ те1а11о11попет Ьу сагЬату1аЬоп апб диашЬтаЬоп. МеЬюбк ίη Епхугао1оду 205: 433-437. Вначале перекристаллизовывали цианат калия. Готовили 1М боратный буфер (рН 8,8). Раствор эритропоэтина смешивали с равным объемом боратного буфера. Цианат калия непосредственно вносили в реакционную пробирку до конечной концентрации 0,5М. Раствор хорошо перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 6 ч. Затем раствор тщательно диализовали с использованием дистиллированной воды. Продукт удаляли из трубки для диализа и переносили в чистую пробирку. Определяли объем и к раствору добавляли 1/9 объема солевого раствора 10х(1М ЫаС1, 0,2М цитрата натрия, 3 мМ лимонной кислоты). Определяли содержание белка и рассчитывали выход продукта. Продукты анализировали в геле ГЕЕ с последующей постановкой теста в условиях ίη νίΙΐΌ на клетках ТЕ-1.
C. Получение тканевых протективных цитокинов сукцинилированием эритропоэтина.
Природный эритропоэтин можно использовать для получения соответствующих сукцинилированных молекул согласно последующему методу, описанному А1са1бе е1 а1. (2001). оГ сус1обех1гт
ДусокуИгамкГегаке Ггот ТЬе^тοаηае^οЬасΐе^ кр. 501 еηЬаηсек Ьк (гамкГегаке асЕхПу иктд ЧагсЬ ак 6опог. ί. ВШесЬгюкду 86: 71-80. Эритропоэтин (100 мкг) в 0,5М растворе ЫаНСО3 (рН 8,0) инкубировали с 15молярным избытком янтарного ангидрида при 15°С в течение 1 ч. Реакцию останавливали диализом против дистиллированной воды.
Другой способ сукцинилирования эритропоэтина включает растворение янтарного ангидрида в сухом ацетоне в концентрации 27 мг/мл. Реакцию проводили в пробирке Эппендорфа в 10 мМ натриевом фосфатном буфере (рН 8,0). В пробирку вносили эритропоэтин и 50-кратное молярное количество янтарного ангидрида. Раствор хорошо перемешивали и пробирку вращали при 4°С в течение 1 ч. Реакцию останавливали диализом против 10 мМ натриевого фосфатного буфера с использованием кассеты для диализа (81|бе-А-Еахе 7К, Р1егсе 66373). Продукт извлекали из кассеты для диализа и переносили в чистую пробирку. Определяли объем и к раствору добавляли 1/9 объема солевого раствора 10х(1М ЫаС1, 0,2М цитрата натрия, 3 мМ лимонной кислоты). Определяли содержание белка и рассчитывали выход продукта. Продукты анализировали в геле 1ЕЕ с последующей постановкой теста в условиях ίη ν 11го на клетках ТЕ-1.
Ό. Получение тканевых протективных цитокинов ацетилированием эритропоэтина.
Природный эритропоэтин можно использовать для получения соответствующих ацетилированных молекул согласно последующему методу, описанному 8а1аке е1 а1. (1990). СЬетка1 тοб^Πсаι^οп оГ егу111горо1е1т: ан тсгеаке ίη ίη-νίΐΐΌ асЬхПу Ьу ^ла^бта!^. ВюсЫтка е1 ВкрЬуЦса Ас1а. 1038: 125-129.
Реакцию проводили в пробирке Эппендорфа в 80 мМ натриевом фосфатном буфере (рН 7,2). Эритропоэтин и равное молярное количество уксусного ангидрида вносили в пробирку. После тщательного перемешивания раствор инкубировали на льду в течение 1 ч. Реакцию останавливали диализом против воды с использованием кассеты для диализа (ЗЕбе-А-Бахе 7К, Ркгсе 66373). Продукт извлекали из кассеты для диализа и переносили в чистую пробирку. После определения объема продукта добавляли 1/9 объема солевого раствора 10х(1М ЫаС1, 0,2М цитрата натрия, 3 мМ лимонной кислоты). Определяли содержание белка и рассчитывали выход продукта. Продукты анализировали в геле 1ЕЕ с последующей постановкой теста в условиях ίη νίΐΐΌ на клетках ТЕ-1.
Е. Получение тканевых протективных цитокинов карбоксиметилированием лизина эритропоэтина.
Природный эритропоэтин можно использовать для получения соответствующих №-(карбоксиметил)лизин (СМЬ) модифицированных молекул, в которых один или более остатков лизина в молекуле эритропоэтина модифицированы согласно последующему методу, описанному АкЬ1аг е1 а1. (1999). СоиГоппаНогШ Чибу оГ №-(сагЬохуте1Ъу1)1укте аббис1к оГ гесотЬтаШ а-сгуЧаЛтк. СштеШ Еуе РекеагсЬ. 18: 270-276.
Глиоксиловую кислоту (200 мМ) и ЫаВН3СЫ (120 мМ) растворяли в натриевом фосфатном буфере
- 38 010371 (50 мМ, рН 7,5). В пробирку Эппендорфа вносили эритропоэтин (в фосфатном буфере). Затем рассчитывали эквивалентное количество лизина в растворе (примерно 8 остатков лизина/моль). Затем в пробирку вносили 3-кратное количество NаВΗзСN и 5- или 10-кратное количество глиоксиловой кислоты. Каждую пробирку вращали и инкубировали при 37°С в течение 5 ч. Пробы диализовали против фосфатного буфера в течение ночи при 4°С. Определяли объем каждого продукта после диализа. Определяли содержание белка и рассчитывали выход продукта. Продукты анализировали в геле ΙΕΡ с последующей постановкой теста в условиях ш νίΐΓο на клетках ТР-1.
Р. Получение тканевых протективных цитокинов йодированием эритропоэтина.
Природный эритропоэтин можно использовать для получения соответствующих йодированных молекул согласно последующему методу, описанному в инструкции, представленной Р1егсе СНет1са1 Сотрапу (ВоскРогб, 1Ь) для предварительно покрытых пробирок для йодирования ΙΟΌΟ-Сеп (продукт #28601).
1. Вначале готовили 0,1М раствор NаI и йодирование проводили в предварительно покрытых пробирках для йодирования ΙΟΌΟ-Сеп (Р1егсе, 28601) при общем объеме реакционной смеси, равном 0,1 мл/пробирку в натриевом фосфатном буфере (40 мМ, рН 7,4). Белковый субстрат (эритропоэтин) смешивали с натриевым фосфатным буфером и затем переносили в предварительно покрытые пробирки для йодирования ΙΟΌΟ-Сеп. Добавляли ΝιΙ до конечной концентрации 1-2 мМ, делая молярное соотношение NаI/белок равным 14-20. Затем раствор тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин при осторожном встряхивании. Реакцию останавливали удалением реакционной смеси и добавлением к ней пробирки, содержащей 3,9 мл натриевого фосфатного буфера (т.е. 40-кратное разведение). Продукт концентрировали в предварительно увлажненном центрифужном устройстве для фильтрования иШаРгее. Определяли объем и к раствору добавляли 1/9 объема солевого раствора 10х(1М №С1, 0,2М цитрата натрия, 3 мМ лимонной кислоты). Определяли содержание белка и рассчитывали выход продукта. Продукты анализировали в геле ΙΕΡ с последующей постановкой теста в условиях ш νίΙΐΌ на клетках ТР-1.
2. Другой способ йодирования эритропоэтина включает инкубирование одного шарика ΙΟΌΟ (Р1егсе, ВоскРогб, Ι1) в 100 мкл РВ8 (20 мМ фосфата натрия, 0,15М №С1, рН 7,5), содержащем 1 мКи свободного Νι125Ι. в течение 5 мин. Затем к смеси добавляли эритропоэтин (100 мкг) в 100 мкл РВ8. После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре реакцию останавливали удалением 200 мкл раствора из реакционного резервуара (оставляя там шарик ΙΟΌΟ). Затем удаляли избыток йода гельфильтрацией на колонке с СеШпсоп 10. Как представлено на фиг. 9, полученный таким образом йодоэритропоэтин эффективно защищает клетки Р19 от последствий удаления сыворотки крови.
3. Эритропоэтин также можно йодировать с использованием хлорамина Т. Эритропоэтин (100 мкг) в 100 мкл РВ8 добавляли к 500 мКи ΝηΙ2Ί и затем смесь перемешивали в пробирке Эппендорфа. Затем добавляли 25 мкл хлорамина Т (2 мг/мл) и смесь инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 50 мкл хлорамин Т стоп-буфера (2,4 мг/мл метабисульфита натрия, 10 мг/мл тирозина, 10% глицерина, 0,1% ксилола в РВ8). Затем йодтирозин и йодированный эритропоэтин разделяли гель-фильтрацией на колонке с СепйРсоп 10.
С. Получение тканевых протективных цитокинов биотинилированием эритропоэтина.
1. В работе «Вюйпу1а!еб гесотЫпап! йитап егу!йгоро1ейпк: В1оас!шйу апб Ий1йу ак а гесерЮг йдапб» Ьу \Уо)с1ю\\'8к| е! а1. В1ооб, 1989, 74 (3): 952-8, использовали три различных способа биотинилирования эритропоэтина. Биотин добавляют к (1) остаткам сиаловой кислоты, (2) карбоксилатным группам и (3) аминогруппам. Авторы используют анализ пролиферации мышиных спленоцитов для демонстрации того, что (1) добавление биотина к остаткам сиаловой кислоты не повышает биологическую активность эритропоэтина, (2) добавление биотина к карбоксилатным группам приводит к существенной биологической инактивации эритропоэтина, (3) добавление биотина к аминогруппам приводит к полной инактивации эритропоэтина. Данные способы и модификации полностью включены здесь. На фиг. 10 показана активность биотинилированного эритропоэтина и асиалоэритропоэтина в тесте истощения сыворотки крови на клетках Р19.
2. Дополнительно природный эритропоэтин можно использовать для получения соответствующих биотинилированных молекул согласно последующему методу, описанному в инструкции, предоставленной Р1егсе Сйет1са1 Сотрапу (ВоскРогб, Ы) для ΕΖ-Ыпк NΗ§-^С-В^ο!^η (продукт #21336).
Непосредственно перед реакцией ΕΖ-Ыпк NΗ§-^С-В^ο!^η (Р1егсе, 21336) растворяли в ДМСО в концентрации 2 мг/мл. Реакцию проводили в пробирке (17x100 мм) при общем объеме 1 мл, содержащем 50 мМ бикарбоната натрия (рН 8,3). Добавляли эритропоэтин и <10% ΕΖ-Ыпк NΗ§-^С-В^ο!^η с получением раствора с молярным соотношением биотин/белок, равным примерно 20. Раствор перемешивали и инкубировали на льду в течение 2 ч. Раствор обессоливали и концентрировали с использованием центрифужного устройства для фильтрования и1!гаРгее. Затем продукт переносили в чистую пробирку. Определяли объем и к раствору добавляли 1/9 объема солевого раствора 10х(1М №С1, 0,2М цитрата натрия, 3 мМ лимонной кислоты). Определяли содержание белка и рассчитывали выход продукта. Продукты анализировали в геле ΙΕΡ с последующей постановкой теста в условиях ш νίΙΐΌ на клетках ТР-1.
3. Свободные аминогруппы эритропоэтина также можно биотинилировать с использованием сле
- 39 010371 дующего способа. Вначале 0,2 мг Ν-гидроксиянтарного эфира Ό-биотиноил-е-аминокапроновой кислоты (ВоеБппдег МаппБе1т #1418165) растворяли в 100 мкл ДМСО. Затем данный раствор объединяли с 400 мкл РВ8, содержащих примерно 0,2 мг эритропоэтина в обернутой фольгой пробирке. После инкубации данного раствора в течение 4 ч при комнатной температуре непрореагировавший биотин отделяли гельфильтрованием на колонке с СеЩпсоп 10.
Предусматривается, что несколько данных модификаций можно проводить с эритропоэтином или производным эритропоэтина для получения тканевого протективного цитокина. Например, эритропоэтин можно десиалилтировать согласно методу, представленному выше в примере 2 (А), и карбамилировать согласно методу, представленному выше в примере 2 (В), с получением асиалокарбамоилэритропоэтина.
Пример 3. Получение тканевых протективных цитокинов другими способами.
1. Тринитрофенилирование: эритропоэтин (100 мкг) модифицировали 2,4,6-тринитробензолсульфонатом, как описано Р1арр е! а1. («АсБуИу оГ Ьоуше рапсгеабс беохупЬопискаке Α \νίΐΗ тобШеб атто дгоирк», 1971, I. Вю1. СБет. 246, 939-845).
2. Модификации аргинина: эритропоэтин модифицировали 2,3-бутандионом, как описано Кгогбап («Рипс11опа1 агдшу1 геыбиек ш сагЬохурерБбаке А. МобШсабоп \νίΐΗ ЬШапебюпе» Кгогбап Ι.Ε., ВюсБетйБу, 1973, 12 (20): 3915-3923) .
3. Эритропоэтин модифицировали циклогексаноном, как описано РайБу е! а1. («1бепБйсайоп оГ ГипсБопа1 агдште геыбиек ш йЬопискаке А апб Бъохуте» РайБу Ь., 8тББ Е.Ь., I. Вю1. СБет., 1975, 250 (2): 565-9).
4. Эритропоэтин модифицировали фенилглиоксалем, как описано УегЬег е! а1. («Ргосеебшдк: СагЬохурерйбаке В: тобШсабоп оп Гипсйопа1 агдту1 гембиек» ХУегЬег М.М., 8око1оу§ку М. 1§г. I. Меб. 8ск, 1975, 11 (11): 1169-70). Модифицированный фенилглиоксалем эритропоэтин тестировали с использованием нейроподобных клеток Р19. Как показано на фиг. 11, данный химически модифицированный эритропоэтин полностью сохраняет нейрозащитное действие.
5. Модификации тирозина: эритропоэтин (100 мкг) инкубировали с тетранитрометаном, как ранее описано Йе511ег е! а1. («8бти1аБоп оГ га! огапап се11 йего1бодепе8щ Ьу Б1дБ бепкБу Брорго1ет§ тобШеб \νί11ι 1е1гапБготе1Бапе» №Шег БЕ., СБаско С.К., 81гаи55 Ι.Ε., 3гб I. Вю1. СБет., 1985, 1ип. 25; 260 (12): 7316-21).
6. Модификации глутаминовой кислоты (и аспарагиновой кислоты): для модификации карбоксильных групп эритропоэтин (100 мкг) инкубировали с 0,02М ЕЭС в 1М растворе глицинамида при рН 4,5 при комнатной температуре в течение 60 мин, как описано Саггамау е! а1. («СагЬоху1 дгоир тобШсаБоп т сБутойурып апб сБутойурыподеп» Саггамау К.Ь., 8роег1 Р., КокБ1апб О.Е. 1г., I. Мо1. Вю1., 1969, Мау 28; 42 (1): 133-7).
7. Модификации остатков триптофана: эритропоэтин (100 мкг) инкубировали с 20 мкМ н-бромсукцинимида в 20 мМ калиевом фосфатном буфере (рН 6,5) при комнатной температуре, как описано АБ е! а1., I. В1о1. СБет., 1995, Маг. 3; 270 (9): 4570-4. Определяли число окисленных остатков триптофана методом, описанным КогойБкша (КогойБкша Б.С. е! а1., Рго1еш Ехрг. РийГ., 1995, ΕеЬ: 6 (1): 79-90).
8. Удаление аминогрупп: для удаления аминогрупп эритропоэтин (100 мкг) инкубировали с РВ8 (рН 7,4), содержащим 20 мМ нингидрина (Р1егсе СБет1са1, ИоскГогб, 11) при 37°С в течение 2 ч, как описано Кокйш е! а1. (Кокк1ш С. е! а1. «МобШсаБоп оГ Бетод1оЬш Ьу шпБубйп» В1ооб, Уо1. 556, № 4, 1980: 701-705). Восстановление полученного альдегида проводили взаимодействием продукта с боргидридом натрия или алюмогидридом лития. Конкретно, эритропоэтин (100 мкг) инкубировали с 0,1М боргидридом натрия в РВ8 в течение 30 мин при комнатной температуре. Восстановление заканчивали охлаждением проб на льду в течение 10 мин и диализом против РВ8 3 раза в течение ночи (КокИш С., В1ооб, Уо1. 556, № 4, 1980: 701-705). Восстановление с использованием алюмогидрида лития проводили при инкубации эритропоэтина (100 мкг) с 0,1М алюмогидрида лития в РВ8 в течение 30 мин при комнатной температуре. Восстановление заканчивали охлаждением проб на льду в течение 10 мин и диализом проб против РВ8 3 раза в течение ночи.
9. Восстановление и стабилизация дисульфидных связей: эритропоэтин (100 мкг) инкубировали с 500 мМ ΌΤΤ в течение 15 мин при 60°С. Затем к смеси добавляли 20 мМ йодацетамида в воде и инкубировали в течение 25 мин при комнатной температуре в темноте.
10. Ограниченный протеолиз: эритропоэтин можно подвергнуть ограниченному химическому протеолизу, направленному на определенные остатки. Эритропоэтин подвергали взаимодействию с 2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3'-броминдоленином, который специфически расщепляет после остатков триптофана в 50-кратном избытке 50% уксусной кислоты в течение 48 ч в темноте при комнатной температуре в закрытых пробирках в атмосфере азота. Реакцию гасили триптофаном и обессоливанием.
Как уже отмечалось выше, эритропоэтин или асиалоэритропоэтин можно модифицировать, также можно проводить множественные модификации, а также дополнительные модификации молекулы эритропоэтина, не отступая от сущности настоящего изобретения. Можно провести любой из выше представленных примеров с частичным десиалилтированным эритропоэтином, который можно получить, как описано ниже. Например, любой из вышеуказанных модифицированных эритропоэтинов можно модифицировать по одному или более остаткам аргинина при использовании, например, фенилглиоксаля по методу ΤакаБа8Б^ (1977, I. ВюсБет. 81: 395-402), который можно провести в течение различных перио
- 40 010371 дов времени в пределах от 0,5 до 3 ч при комнатной температуре. Реакцию заканчивают диализом реакционной смеси против воды. Применение подобных модифицированных форм эритропоэтина полностью здесь включается.
Пример 4. Тканевые протективные цитокины обладают нейрозащитным действием.
Нейрозащитное действие тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению оценивали с использованием теста интоксикации водой по методу Мап1еу с! а1., 2000, Лс.|иаропп-4 6с1с0оп ίη шюе гс6исс5 Ьгат сбета айсг аси!с \\Щсг ίπίοχίοαίίοπ апб 18сйсш1с 81гокс, Ναι. Меб., 2000, Рек.; 6 (2): 159-63. Использовали мышей-самок СЗН/ΗΕΝ. Мышам вводили внутрибрюшинно воду в количестве, составляющем 20% от массы тела внутрибрюшинно с 400 нг/кг массы тела ΌΌΑνΡ (десмопрессин). Мышам вводили эритропоэтин (А) или тканевой протективный цитокин: асиалоэритропоэтин (В), карбамилированный асиалоэритропоэтин (С), сукцинилированный асиалоэритропоэтин (Ό), ацетилированный асиалоэритропоэтин (Е), йодированный асиалоэритропоэтин (Р), карбоксиметилированный асиалоэритропоэтин (С), карбамилированный эритропоэтин (Н), ацетилированный эритропоэтин (I), йодированный эритропоэтин (1) и №-карбоксиметилэритропоэтин (К). Мышам вводили 100 мкг/кг эритропоэтина или тканевого протективного цитокина внутрибрюшинно за 24 ч до введения воды и повторно во время введения воды. Для оценки мышей использовали шкалу Мап1су с! а1. в модификации. Модифицированная шкала представлена ниже.
1. Исследование клетки/стола.
Да - 0
Нет - 1
2. Визуальное выслеживание объектов.
Да - 0
Нет - 1
3. Движение вибрисс.
Да - 0
Нет - 1
4. Движения конечности/хвоста.
Норма - 0
Ригидные - 1
Парализованы - 2
5. Болевое отдергивание (касание булавкой).
Да - 0
Нет - 1
6. Координация движения.
Норма - 0
Аномальная - 1
7. Остановки в углу стола.
Да - 0
Нет - 1
Общее возможное число баллов: 8.
Мышей оценивали в баллах в следующие временные точки: 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180 мин. Число баллов на графике представляет площадь под кривой общего времени в виде процента от числа баллов у животных, которым вводили только физиологический раствор. На фиг. 12 представлено количество баллов для мышей, получивших эритропоэтин или один из тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению в виде процента от количества баллов, полученных для контрольных мышей. У мышей, получивших тканевые протективные цитокины по настоящему изобретению, в меньшей степени отмечали неврологические расстройства, и, следовательно, они оценивались в баллах выше по модифицированной шкале. На фиг. 12 показано, что тканевые протективные цитокины по настоящему изобретению оказывают нейрозащитное действие.
Пример 5. Эритропоэтин проходит через плотный барьер в спинно-мозговую жидкость.
Взрослых крыс-самцов Спрегью-Даули усыпляли и вводили внутрибрюшинно рекомбинантный человеческий эритропоэтин. Пробу спинно-мозговой жидкости отбирали из айсгпа тадпа с интервалом 30 мин в течение 4 ч и концентрацию эритропоэтина определяли с использованием чувствительного и специфичного иммуноферментного метода. Как представлено на фиг. 13, фоновая концентрация эритропоэтина в СМЖ составляет 8 мЕ/мл. Через несколько часов концентрация эритропоэтина в СМЖ начинает повышаться, и через 2,5 ч и в последующие сроки она достоверно отличается от фонового значения при р<0,01. Максимальная концентрация, составляющая примерно 100 мЕ/мл, находится в пределах, известных как обладающие защитным действием в условиях ш νίίτο (0,1-100 мЕ/мл). Время достижения максимальной концентрации составляет 3,5 ч, которая достоверно снижалась (менее чем через 1 ч). Результаты опыта показывают, что эритропоэтин в значительных концентрациях проходит через плотный клеточный барьер в результате болюсного парентерального введения эритропоэтина в соответствующих концентрациях. Специалисты в данной области, очевидно, понимают, что следует ожидать аналогичных результа
- 41 010371 тов от тканевых протективных цитокинов по настоящему изобретению.
Пример 6. Поддержание функции сердца, приготовленного для трансплантации.
Крысам-самцам Вистар массой 300-330 г вводили эритропоэтин (5000 Е/кг массы тела) или растворитель за 24 ч до извлечения сердца для исследований в условиях ех угуо согласно методу Ое1сауге е! а1., 1992, Атег. 1. РНу8ю1. 263: Η1537-45. Животных усыпляли пентобарбиталом (0,3 мл) и внутривенно вводили гепарин (0,2 мл). Сердцу первоначально давали возможность уравновеситься в течение 15 мин. Затем баллон левого желудочка раздували до объема, обеспечивающего конечное диастолическое давление, равное 8 мм рт.ст. Строили график зависимости давления в левом желудочке - объем при постепенном увеличении объема баллона на 0,02 мл. За нулевой объем принимали точку, при которой конечное диастолическое давление в левом желудочке равняется 0. По окончании построения графика баллон в левом желудочке спускали обратно до конечного диастолического давления, равного 8 мм рт.ст., и выдерживали контрольный период продолжительностью 15 мин после проверки коронарного потока. Затем сердце останавливали с помощью 50 мл Секюг + молекула для поддержания при 4°С под давлением 60 см Н2О. Затем сердце удаляли и хранили в течение 5 ч при 4°С в пластиковом контейнере, заполненном тем же раствором и в окружении размолотого льда.
После завершения периода хранения сердце переносили в аппарат Лангендорффа. Баллонный катетер вновь вставляли в левый желудочек и раздували до того же объема, который имел место во время периода до ишемии. Сердце реперфузировали по меньшей мере в течение 2 ч при 37°С. Давление при реперфузии поддерживали на 50 см Н2О в течение 15 мин потока и затем возвращали обратно к значению 100 см Н2О еще в течение 2 последующих часов. Вновь помещали водитель ритма (320 сокращений в мин). Проводили изохорные определения сократимости и диастолического давления в трех параллелях через 25, 45, 60, 120 мин реперфузии. На данной временной точке строили графики зависимости давление-объем и собирали выходящий из коронарной артерии поток в течение 45 мин реперфузии для определения выхода креатинкиназы. Результаты по двум опытным группам сравнивали с использованием непарного !-теста и для построения кривых использовали линейную регрессию для данных по конечному диастолическому давлению. Как представлено на фиг. 14, имели место достоверное повышение давления в левом желудочке после обработки эритропоэтином, а также улучшенная кривая зависимости объемдавление, снижение диастолического давления в левом желудочке и снижение выхода креатинкиназы. Аналогичные результаты следует ожидать от обработки тканевыми протективными цитокинами по изобретению.
Пример 7. Эритропоэтин защищает миокард от повреждения в результате ишемии.
Взрослым-крысам самцам вводили рекомбинантный человеческий эритропоэтин (5000 Е (40 мкг)/кг массы тела) за 24 ч до проведения анестезии и подготовки к окклюзии коронарной артерии. Дополнительную дозу эритропоэтина вводили в начале проведения теста и на 30 мин перекрывали левую главную коронарную артерию и затем освобождали. Эритропоэтин вводили в той же дозе 1 раз в день в течение недели после обработки. У животных оценивали функцию сердца. Как представлено на фиг. 15, у животных, получивших инъекцию контрольного вещества (физиологического раствора), наблюдали значительное повышение диастолического давления в левом желудочке, что указывает на наличие расширенного, ригидного состояния сердца, вторичного инфаркту миокарда. В противоположность, у животных, получивших эритропоэтин, не наблюдали ухудшения сердечной функции по сравнению с контрольными оперированными животными (уровень достоверности р<0,01). Аналогичные результаты следует ожидать от обработки тканевыми протективными цитокинами по настоящему изобретению.
Пример 8. Защита от ишемии сетчатки при периферическом введении эритропоэтина.
Клетки сетчатки очень чувствительны к ишемии, например большинство из них погибает спустя 30 мин после ишемического стресса. Кроме того, подострая или хроническая ишемия является причиной ухудшения зрения, что имеет место при ряде распространенных заболеваний человека, таких как сахарный диабет, глаукома и дегенерация желтого пятна. В настоящее время отсутствуют эффективные виды лечения для защиты клеток от ишемии. Имеется плотный эндотелиальный барьер между кровью и сетчаткой, который не пропускает наиболее крупные молекулы. Для исследования возможности защиты клеток, чувствительных к ишемии, при периферическом введении эритропоэтина использовали модель острой, обратимой глаукомы на крысах, описанную ВокепЬаит е! а1. (1997; Υίκ. Век. 37: 3443-51). Конкретно, физиологический раствор вводили в переднюю камеру глаза взрослых крыс-самцов до давления выше системного артериального давления и поддерживали в течение 60 мин. Животным вводили физиологический раствор или эритропоэтин в дозе 5000 Е (40 мкг) на кг массы тела внутрибрюшинно за 24 ч до индукции ишемии и введение продолжали раз в день в течение еще 3 дней. Через неделю после обработки проводили электроретинографию у адаптированных к темноте крыс. На фиг. 16-17 показано, что введение эритропоэтина сопровождалось хорошим сохранением электроретинограммы (ЕВО) (снимок Ό), в противоположность результатам на животных, обработанных одним физиологическим раствором (снимок С), у которых сохранялась только очень незначительная функция сетчатки. На фиг. 16 проводится сравнение а- и Ь-волновых амплитуд на электроретинограммах от обработанных эритропоэтином и физиологическим раствором групп животных, и было показано, что при воздействии эритропоэтина достигалось достоверное защитное действие. Аналогичные результаты можно получить с тканевыми протек
- 42 010371 тивными цитокинами по настоящему изобретению.
Пример 9. Восстановительное действие эритропоэтина на сниженную познавательную функцию в результате травмы мозга.
В исследовании, проведенном с целью демонстрации способности эритропоэтина восстанавливать пониженную познавательную функцию у мышей после травмы мозга, мышей-самок Ва1Ь/с подвергали тупой травме мозга, описанной Вппек е! а1. ΡΝΑ8 2000, 97; 10295-10672, и через 5 суток начинали ежедневное введение эритропоэтина в дозе 5000 Е (40 мкг) массы тела внутрибрюшинно. Через 12 суток после травмы у животных оценивали познавательную функцию в водном лабиринте Морриса при проведении 4 опытов в день. Несмотря на то, что как у обработанных, так и необработанных животных активность в тесте была низкой (со временем плавания, составляющем примерно 80 с из 90 с возможных), на фиг. 18 показано, что у обработанных эритропоэтином животных активность была выше (в данной презентации отрицательное значение рассматривается как лучшее).
Даже если начало обработки эритропоэтином проводили через 30 суток после травмы (фиг. 19), то также наблюдали восстановление познавательной функции. Аналогичные результаты можно ожидать после обработки тканевыми протективными цитокинами по настоящему изобретению.
Пример 10. Модель с каинатом.
На модели нейротоксичности с каинатом асиалоэритропоэтин вводили согласно методу Вппек е! а1., Ргос. №11. Асай. 8с1. , И.8.А., 2000, 97; 10295-10672 в дозе 5000 Е (40 мкг) /кг массы тела внутрибрюшинно за 24 ч до введения каината в дозе 25 мг/кг, и было показано, что он эффективен аналогично эритропоэтину, по данным времени гибели (фиг. 20). Аналогичные результаты можно получить с тканевыми протективными цитокинами по настоящему изобретению.
Пример 11. Модели травмы спинного мозга.
1. Тестирование эритропоэтина и тканевых протективных цитокинов при компрессии спинного мозга у крыс.
В данном исследовании использовали крыс (самок) Вистар массой 180-300 г. Животных выдерживали голодными в течение 12 ч перед операцией, гуманно фиксировали и анестезировали внутрибрюшинной инъекцией тиопентала натрия (40 мг/кг массы тела). После инфильтрации кожи (бупивакаин 0,25%) проводили полную одноуровневую ламинэктомию (Т-3) через разрез размером 2 см с помощью препаративной лупы. Травматическое повреждение спинного мозга индуцировали при экстрадуральном наложении зажима для временной аневризмы, обеспечивающем давление 0,6 Н (65 г) на спинной мозг в течение 1 мин. После удаления зажима зашивали кожный разрез, и животным давали возможность полностью восстановиться от анестезии, и пересаживали их в клетки. Крыс постоянно обследовали пальпацией мочевого пузыря по меньшей мере дважды в день до тех пор, пока не восстанавливалось спонтанное опорожнение.
животных произвольно разделяли на пять групп. Животным контрольной группы (I) (п=8) вводили физиологический раствор (посредством внутривенной инъекции) сразу же после зашивания разреза. Животным группы (II; п=8) вводили гЬЕРО@ в дозе 16 мкг/кг массы тела; крысы (III) группы получали асиало тканевой протективный цитокин по настоящему изобретению (асиалоэритропоэтин)@ в дозе 16 мкг/кг массы тела в/в; крысам (IV) группы вводили асиало тканевой протективный цитокин @ в дозе 30 мкг/кг массы тела в/в; и животные группы (V) получали асиало тканевой протективный цитокин по настоящему изобретению (асиалоэритропоэтин)@ в дозе 30 мкг/кг массы тела; все введения проводили в виде внутривенной болюс-инъекции сразу же после удаления зажима для создания аневризмы.
Моторную неврологическую функцию крыс оценивали при использовании локомоторной оценочной шкалы Ва§8о е! а1. По данной шкале животных оценивали в баллах в пределах от 0 (отсутствие наблюдаемых движений задних конечностей) до 21 (нормальное движение). Крыс оценивал на наличие функционального нарушения через 1, 12, 24, 48, 72 ч и затем через неделю после травмы один и тот же исследователь «вслепую» в отношении того, какой обработке подвергалось каждое животное.
На фиг. 21 представлен график, показывающий оценочные баллы локомоторной подвижности у крыс, восстановившихся после травмы спинного мозга в течение 3 суток. Как следует из данных, представленных на графике, крысы, которым вводили эритропоэтин (группа 2) или тканевые протективные цитокины (группы Ш-ν), быстрее восстанавливались после травмы, и у них отмечалось лучшее восстановление, в целом, от травмы по сравнению с контрольными крысами. Аналогичные результаты следует ожидать от терапевтического лечения тканевыми протективными цитокинами по настоящему изобретению.
2. Тестирование эритропоэтина и тканевых протективных цитокинов при ишемии спинного мозга у кроликов.
В данном исследовании использовали 36 новозеландских белых кроликов (в возрасте 8-12 месяцев, самцов) с массой тела 1,5-2,5 кг. Животных выдерживали голодными в течение 12 ч и гуманно фиксировали. Анестезию начинали 3% галотаном в 100% кислороде и поддерживали 0,5-1,5% галотаном в смеси 50% кислорода и 50% воздуха. Внутривенный катетер (номер 22) вводили в левую ушную вену. Раствор Рингера лактата инфузировали со скоростью 4 мл/кг массы тела (м.т.) в час во время операции. Перед операцией для профилактики развития инфекции внутривенно вводили цефазолин в дозе 10 мг/кг массы тела. Животных помещали в правое боковое положение, кожу обрабатывали повидоном-йодом, инфильтри
- 43 010371 ровали бупивакаином (0,25%) и делали боковой разрез кожи параллельно позвоночнику на уровне 12 ребра. После надреза кожи и подкожной тораколюмбарной фасции оттягивали длиннейшую поясничную мышцу и повздошно-поясничную мышцу. Обнажали брюшную аорту посредством левого ретроперитонеального доступа и мобилизовали непосредственно впереди левой почечной артерии. Делали петлю из кусочка трубки из РЕ-60 вокруг аорты сразу же за левой почечной артерией и оба конца пропускали через большую резиновую трубку. При нажатии на трубку из РЕ аорта нетравматично окклюдировалась на 20 мин. Перед окклюзией аорты вводили гепарин в виде болюс-инъекции (400 МЕ). Через 20 мин окклюзии трубку и катетер удаляли, разрез закрывали, и проводили наблюдение за животными до полного восстановления, и затем последовательно оценивали на неврологическую функцию.
животных произвольно разделяли на шесть групп. В контрольной группе (I) животным (η=6) вводили обычный физиологический раствор внутривенно сразу же после снятия окклюзии аорты. Крысы группы (II) получали гНЕР0@ в дозе 6,5 мкг/кг массы тела; крысы группы (III) получали тканевой протективный цитокин (карбамилированный эритропоэтин)@ в дозе 6,5 мкг/кг массы тела; крысам группы (IV) вводили другой тканевой протективный цитокин (асиалоэритропоэтин)@ в дозе 6,5 мкг/кг массы тела; крысам группы (V) вводили тот же тканевой протективный цитокин, что и крысам группы (IV), но @ в дозе 20 мкг/кг массы тела; и крысам группы (VI) вводили еще один тканевой протективный цитокин (асиалокарбамилированный эритропоэтин)@ в дозе 20 мкг/кг массы тела во всех случаях внутривенно сразу же после реперфузии (η=6 в каждой группе).
Моторную функцию оценивали по критерию Друммонда и Мура наблюдателем «вслепую» по отношению к обработке через 1, 24 и 48 ч после реперфузии. Каждое животное оценивалось в баллах от 0 до 4 следующим образом: 0 = параплегия без видимой моторной функции нижних конечностей; 1 = слабая моторная функция нижних конечностей, слабое антигравитационное движение; 2 = средняя функция нижних конечностей с хорошей антигравитационной подвижностью, но при отсутствии способности подтянуть конечности под туловище; 3 = хорошая моторная функция с наличием способности подтянуть конечности под туловище и подпрыгивать, но при отсутствии нормы; 4 = нормальная моторная функция. Животным с параплегией дважды в день вручную освобождали мочевой пузырь.
На фиг. 22 представлен график моторной функции выздоравливающих кроликов. График показывает, что уже даже в течение 2 суток эритропоэтин и тканевые протективные цитокины по настоящему изобретению позволяли кроликам восстановиться лучше от травмы спинного мозга. Аналогичные результаты следует ожидать от терапевтического лечения тканевыми протективными цитокинами по настоящему изобретению.
Пример 12. Противовоспалительное действие эритропоэтина.
Исследования в условиях ίη νίνο.
1. Опыты с окклюзией средней церебральной артерией (МСАО) на крысах.
Крыс-самцов Сг1:СБ(ББ)ВК с массой тела 250-280 г получали из питомника СНаг1е8 ККег, Са^, Италия. Операцию проводили на крысах согласно указаниям Вгтек М.Б., СНе/ζί Р., Кеепап Б., АдпеШ Ό., бе ЬапегоПе КС., Сегат1 С., Йл Ь.М. апб Сегаш1 А., 2000, Е^уίй^ορο^еΐ^η сгоккек !Не 61οο6-όπιίη Ьалтег ΐο рго1ес1 адаиъ! ехрелтеШа1 Ьгат 1и)игу |Ίη Ргосекк Οΐη1ίοη| Ргас. №111. Асаб. Бс1., ИБА, 97: 10526-10531. Кратко крыс усыпляли хлоралгидратом (в дозе 400 мг/кг массы тела); обнажали сонные артерии и правую сонную артерию пережимали наложением двух швов и отрезали. Отверстие смежное и ростральное к правой глазнице позволяло видеть МСА, в которую вводили катетер дистальнее носовой артерии. Для получения пенубры (бордерзона) вокруг данного фиксированного участка МСА пережимали контралатеральную сонную артерию на 1 ч с использованием вытягивания с помощью маленького пинцета, затем вновь открывали. РВБ или гНЕР0 (5000 Е/кг массы тела, в/б; ранее было показано, что эта доза является защитной на данной модели (1)) вводили сразу же после проведения МСАО. В указанные сроки проводили количественное определение 'Т№ и ГБ-6 в гомогенатах коры головного мозга, как описано ранее (8). МСР-1 определяли в гомогенатах с использованием промышленно доступного набора для постановки ЕЫБА (Вютоигсе, СатаиШ, СА).
Через 24 ч после проведения МСАО крыс усыпляли, как описано выше, и перфузировали через сердце 100 мл физиологического раствора с последующей перфузией 250 мл 4% раствора параформальдегида на натриевом фосфатном буфере. Быстро извлекали мозг, фиксировали в 4% растворе параформальдегида на натриевом фосфатном буфере в течение 2 ч, переносили в 20% раствор сахарозы на РВБ на ночь, затем в 30% раствор сахарозы, пока они не погружались, и затем замораживали в 2-метилбутане при -45°С. Делали срезы (толщиной 30 мкм) на криостате (НМ 500 ОМ, Мюгош) при -20°С в поперечной плоскости через мозг и отбирали каждый пятый срез для гистохимического окрашивания против различных антигенов или гематоксилин-эозином. Свободно плавающие срезы обрабатывали на иммунореактивность с использованием мышиных моноклональных антител против фибриллярного кислого белка глии (СЕАР) (1:250, ВοеЬ^^ηдйе^ МаииНет!, Мοηζа, Италия) и мышиных моноклональных антител против сб11Ь (МВС ОХ-42) (1:50, Бего1ес, Великобритания), соответственно, по методу Ηοιι^Γ е! а1. и согласно инструкциям производителя. Все срезы готовили для световой микроскопии в физиологическом растворе на покрытых предметных стеклах, обезвоживали пропусканием через ряд спиртов, фиксировали в ксилоле и накрывали покровными стеклами с использованием среды для заключения гистологических препа
- 44 010371 ратов ИРХ (ΒΌΗ, Роо1е, ИК). Смежные срезы окрашивали гематоксилин-эозином, как описано (10).
На фиг. 23 представлен венечный срез кортикального слоя мозга, окрашенного гематоксилин-эозином. Контрольные крысы (А), крысы с ишемией, обработанные ΡΒ8 (В), крысы с ишемией, обработанные 1Ί1ΕΡ0 (5000 Е/кг массы тела сразу же после проведения МСАО) (С). На срезе В видно заметное снижение окрашивания ткани адекватное воспалению, сопровождающееся гибелью нейронов по сравнению с контролем (А). Системное введение г1ЕР0 значительно снижало повреждение в результате ишемии, ограничивая гибель или повреждение клеток в ограниченном участке (С). (Увеличение 2,5х. Размер полоски=800 мкм.)
На фиг. 24 представлены венечные срезы лобной коры, смежной области инфаркта, окрашенные антителами СТАР. Контрольные крысы (А), крысы с ишемией, обработанные ΡΒ8 (В), крысы с ишемией, обработанные гйЕР0 (С). Активированные астроциты визуализировали с помощью СРАР-положительных антител (снимок В). Отмечали заметное снижение количества, а также интенсивности окрашивания активированных астроцитов у обработанных гйЕР0 животных (снимок С). (Увеличение 10х. Размер полоски=200 мкм.)
На фиг. 25 представлены венечные срезы кортикального слоя мозга, окрашенные антителом ОХ-42. Крысы с ишемией, обработанные РБ8 (А), крысы с ишемией, обработанные гйЕР0 (В). В полушарии мозга с ишемией окрашивание клеток особенно выражено вокруг инфарктной ткани у животных в обеих опытных группах, но оно было интенсивнее и обширнее у крыс, обработанных физиологическим раствором. (Увеличение 20х. Размер полоски=100 мкм.)
На фиг. 26 представлены венечные срезы кортикального среза, смежного области инфаркта, окрашенные антителом ОХ-42. Более высокую плотность одноядерных клеток воспаления наблюдали в ткани от крыс с ишемией, обработанных ΡΒ8 (А), по сравнению с крысами с ишемией, обработанными гйЕР0 (В). Инфильтрующие лейкоциты типичной округлой формы потенциально будут заполнять объем инфарктного участка. (Увеличение 10х. Размер полоски=200 мкм.)
Аналогичные результаты следует ожидать от терапевтической обработки тканевыми протективными цитокинами по настоящему изобретению.
2. Острый экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ) на крысах Левиса.
Крыс-самок Левиса в возрасте 6-8 недель получали из питомника Сйаг1е8 Жег (Са1со, Италия). ЕАЕ индуцировали у крыс введением 50 мкг МБР от морских свинок (81дта, 8ΐ. Ьошк, МО) в воде, эмульгированном в равном объеме полного адъюванта Фрейнда (СРА, 81дта) с добавлением 7 мг/мл убитых тепловой обработкой М. 1иЬегси1о515 Н37Ка (И1Рсо, Ие1гой, ΜΙ) в конечном объеме 100 мкл под легкой анестезией эфиром в обе подушечки задних конечностей. Крыс обследовали «вслепую» на появление признаков ЕАЕ и оценивали в баллах: 0 - отсутствие заболевания; 1 - атония хвоста; 2 - атаксия; 3 полный паралич задних конечностей с недержанием мочи. Начиная с 3 суток после иммунизации, крысам вводили г-Ни-ЕР0 (ЕР0ейп а1Еа, Ргосгй, 0г11ю Β^οΐесй, Кагйап, N1) внутрибрюшинно (в/б) раз в сутки в указанных дозах на ΡΒ8. Поскольку ЕРО для клинических целей содержал человеческий сывороточный альбумин, контрольным крысам всегда вводили ΡΒ8, содержащий аналогичное количество человеческого сывороточного альбумина. Ежедневное введение ЕРО в дозе 5000 Е/кг массы тела повышало гематокрит на 30% (данные не представлены). Там, где указано, крысам вводили подкожно раз в сутки, начиная с 3 суток, до 18 суток, дексаметазонфосфатдинатриевую соль (ИЕХ) (81дта) в дозе 1,3 мг/кг массы тела, что соответствует дозе ИЕХ, равной 1 мг/кг массы тела, растворенную в ΡΒ8. Так, где указано, проводили количественное определение Т№Р и 1Ь-6 в гомогенатах головного и спинного мозга, как описано ранее [Адпе11о, 2000 #10].
На фиг. 27 показано защитное действие в отношении проявления клинических признаков ЕАЕ от введения ЕРО в различных дозах, начиная с 3 суток после иммунизации МБР, до 18 суток. ЕРО в зависимости от дозы отдалял начало заболевания и снижал тяжесть протекания заболевания. Но ЕРО не отдалял период наибольшей выраженности заболевания.
В опытах, где обработку ЕРО прерывали после регрессии заболевания и за крысами проводили наблюдение еще в течение 2 месяцев, не наблюдали рецидива, в противоположность ИЕХ, при котором имело место обострение заболевания после прекращения его введения (фиг. 28). Аналогичные результаты следует ожидать от терапевтической обработки тканевыми протективными цитокинами по настоящему изобретению.
Опыты в условиях ίη νίΡΌ
Готовили первичные культуры глиальных клеток от новорожденных крысят Спрегью-Даули в возрасте 1-2 дней. Полушария мозга освобождали от оболочек и механически измельчали. Клетки диспергировали в растворе из 2,5% трипсина и 1% ДНКазы, фильтровали через нейлоновое сито с размером пор 100 мкм и высевали (140000 клеток на чашку диаметром 35 мм) в минимальной основной среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,6% глюкозы, стрептомицина (0,1 мг/мл) и пенициллина (100 Е/мл). Культуры глии подкармливали дважды в неделю и культивировали при 37°С во влажном инкубаторе с 5% СО2. Все опыты проводили на 2-3-недельных клеточных культурах глии, состоящих из 97% астроцитов и 3% микроглии, что определяли иммунохимическим анализом с помощью
- 45 010371
СЕАР и изолектина СпГГоша ытрНсгГоНа В4. Культуры нейронов получали из гиппокампуса 18-дневных крысиных плодов. Извлекали мозг и освобождали от оболочек и выделяли гиппокампус. Клетки диспергировали инкубацией в течение 15-20 мин при 37°С в растворе трипсина с последующим растиранием. Клеточную суспензию разбавляли средой, использованной для глиальных клеток, и высевали на покровные стекла, покрытые полиорнитином с плотностью 160000 клеток на покровное стекло. Через день после посева покровные стекла переносили на чашки, содержащие монослой глиальных клеток в поддерживающей нейроны среде (среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко, и питательная смесь Хэмса Е12 с добавлением 5 мкг/мл инсулина, 100 мкг/мл трансферина, 100 мкг/мл путресцина, 30 нМ селенита Να, 20 нМ прогестерона и пенициллина 100 Е/мл), с добавлением 5 мкМ арабинозида цитозина. Покровные стекла инвертировали таким образом, чтобы нейроны гиппокампуса оказывались лицом к монослою глии. Комочки парафина, прилипшие к покровным стеклам, поддерживали их над глией, создавая узкий промежуток, который предотвращал контактирование двух типов клеток друг с другом, но обеспечивал диффузию растворимых веществ. Данные условия культивирования обеспечивали рост культур дифференцированных нейронов с >98% гомогенностью, что определяли иммунохимическим анализом на связанный с микротубулами белок 2 и СЕЛР. Затем клетки обрабатывали в течение 24 ч 1 мкМ триметилолова (ТМТ) в присутствии или при отсутствии гНЕРО (10 Е (80 нг)/мл), супернатанты использовали для анализа ΤΝΕ и жизнеспособность клеток оценивали, как описано ниже. Там, где указано, глиальные клетки культивировали в присутствии ЬР8 в течение 24 ч с или без гНЕРО, и в культивированных супернатантах определяли ΤΝΕ. Жизнеспособность клеток оценивали при постановке теста с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолием бромидом (МТТ). Όβηίζοΐ Е. апб Ьапд К., 1986. Кар1б со1опте1пс аккау Гог се11 дго\\1Н апб 8игу1уа1. МобШсаНопк 1о (Не 1е1пио1цпп буе ргосебиге дМпд ппргоусб κοηδίΐίνίΐν апб гебаЬббу. 1. 1ттипо1. Мебюбк 89: 271-277. Кратко соль тетразолия МТТ растворяли в несодержащей сыворотку среде до конечной концентрации 0,75 мг/мл и добавляли к клеткам в конце обработки на 3 ч при 37°С. Затем среду удаляли и экстрагировали формазан смесью 1Н НС1:изопропанол (1:24). Поглощение определяли при 560 нм на ридере для микропланшетов.
На фиг. 29 показано, что гНЕРО предупреждает индуцированную гибелью нейронов продукцию ΤΝΕ в смешанной культуре нейронов-глии. Снимок А: процент гибели нейронов, индуцированной 1 мкм ТМТ без и с обработкой гНЕРО (10 Е/мл). Снимок В: высвобождение ΤΝΕ из глиальных клеток, подвергшихся воздействию 1 мкм ТМТ в присутствии (заштрихованные столбцы) или в отсутствие (сплошные столбцы) нейронов, с или без гНЕРО (10 Е/мл). Аналогичные результаты следует ожидать от терапевтической обработки тканевыми протективными цитокинами по настоящему изобретению.
Изобретение не ограничивается объемом конкретных описанных воплощений, которые предназначены только для иллюстрации отдельных аспектов изобретения, и функционально эквивалентные способы и компоненты находятся в объеме изобретения.
Действительно, различные модификации изобретения в дополнении к представленным и описанным здесь будут очевидными для специалистов в данной области из представленного выше описания и сопровождающих фигур. Предполагается, что такие модификации попадут в объем прилагаемой формулы изобретения.
Все источники, цитированные здесь, включены полностью для ссылки для всех целей.

Claims (49)

1. Фармацевтическая композиция, содержащая:
(ί) терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина; и (ίί) терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного противовоспалительного средства и/или по меньшей мере одного иммуномодуляторного компонента и (ίίί) фармацевтически приемлемый носитель, где терапевтически эффективное количество достаточно для профилактики, лечения или снижения воспаления и/или иммунного ответа.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, где у указанного тканевого протективного цитокина отсутствует по меньшей мере один из эффектов, которые природный эритропоэтин оказывает на костный мозг.
3. Фармацевтическая композиция, состоящая из:
(ί) терапевтически эффективного количества тканевого протективного цитокина; и (ίί) терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного противовоспалительного средства и/или по меньшей мере одного иммуномодуляторного компонента; и (ίίί) фармацевтически приемлемого носителя, где терапевтически эффективное количество достаточно для профилактики, лечения или снижения воспаления и/или иммунного ответа.
4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1, 2 или 3, где противовоспалительное средство выбрано из группы, состоящей из кортикостероидов, глюкокортикоидов, стероидов, нестероидных противовоспалительных средств, бета-агонистов, антихолинергических средств, метилксантинов, инъекци
- 46 010371 онных препаратов на основе золота, сульфасалазина, пеницилламина, противоангиогенных средств, дапсона, псораленов, антималярийных средств, противовирусных средств и антибиотиков.
5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1, 2 или 3, где противовоспалительное средство выбрано из группы, состоящей из метотрексата, лефлуномида, циклофосфамида, цитоксана, иммурана, циклоспорина А, миноциклина, азатиоприна, антибиотиков, метилпреднизолона, кортикостероидов, стероидов, микофенолата мофетила, рапамицина, мизорибина, дезоксиспергуалина, бреквинара, малононитриламидов, модуляторов рецепторов Т-клеток и модуляторов рецепторов цитокинов.
6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1, 2 или 3, где указанный тканевой протективный цитокин обладает по меньшей мере одной из следующих модификаций по сравнению с природным эритропоэтином:
ί) имеет 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 групп сиаловой кислоты;
ίί) имеет пониженное количество или не имеет Ν-связанных углеводов;
ίίί) обладает пониженным содержанием углеводов;
ίν) имеет один или несколько окисленных углеводов;
ν) имеет один или несколько окисленных углеводов, и где тканевой протективный цитокин химически восстановлен;
νί) имеет один или несколько модифицированных остатков аргинина;
νίί) имеет один или несколько модифицированных остатков лизина или имеет модификацию Νконцевой аминогруппы;
νίίί) имеет один или несколько модифицированных остатков тирозина;
ίχ) имеет один или несколько модифицированных остатков аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
х) имеет один или несколько модифицированных остатков триптофана;
χί) удалена одна или несколько аминогрупп;
χίί) имеет разрыв по меньшей мере одной цистиновой связи;
χίίί) является укороченным и χίν) имеет пониженное количество или не имеет О-связанных углеводов.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1, 2 или 3, где указанный тканевой протективный цитокин является эритропоэтином по меньшей мере с одним карбамилированным остатком лизина.
8. Фармацевтическая композиция по п.7, где все остатки лизина указанного эритропоэтина карбамилированы.
9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1, 2 или 3, где указанный тканевой протективный цитокин является алкилированным эритропоэтином.
10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1, 2 или 3, где указанный тканевой протективный цитокин представляет собой альфа-N-карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтин.
11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1, 2 или 3, где указанный тканевой протективный цитокин является асиалоэритропоэтином.
12. Способ лечения воспаления легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, клеток капилляров, эндотелиальных клеток, яичек, яичников, клеток эндометрия или стволовых клеток у млекопитающего, где указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества тканевого протективного цитокина и фармацевтически приемлемого носителя млекопитающему при необходимости лечения воспаления легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, клеток капилляров, эндотелиальных клеток, яичек, яичников, клеток эндометрия или стволовых клеток.
13. Способ лечения ангиита, хронического бронхита, панкреатита, остеомиелита, гломерулонефрита, неврита зрительного нерва, височного артериита, поперечного миелита, дерматомиозита, полимиозита, некротизирующего фасцита, гепатита и некротизирующего энтероколита у млекопитающего или воспаления в результате судорожных нарушений, инсульта, гипотензии, остановки сердца, ишемии, инфаркта миокарда, возрастного снижения когнитивных функций, повреждения при облучении, церебрального паралича, нейродегенеративного заболевания, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Лейга, деменции при СПИДе, потери памяти, амиотрофического бокового склероза, алкоголизма, расстройства настроения, тревожного расстройства, дефицита внимания, аутизма, болезни КрейтцфельдаЯкоба, травмы головного мозга, травмы спинного мозга, ишемии мозга, ишемии спинного мозга, сердечно-легочного анастомоза, хронической сердечной недостаточности, дегенерации желтого пятна, диабетической невропатии, диабетической ретинопатии, глаукомы, ишемии сетчатки или травмы сетчатки у млекопитающего, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина и фармацевтически приемлемый носитель, млекопитающему при необходимости лечения.
14. Способ лечения атаксии Фрейдриха, рассеянного склероза или синдрома Жиль де ля Туррета у млекопитающего, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина и фармацевтически приемлемый носитель, млекопитающему при необходимости лечения.
- 47 010371
15. Способ по пп.12, 13 или 14, где у тканевого протективного цитокина отсутствует по меньшей мере одна активность, выбранная из группы, состоящей из повышенного гематокрита, сужения сосудов, гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтной активности и повышенной продукции тромбоцитов.
16. Способ лечения ревматоидного артрита у млекопитающего, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей: (ί) терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина, у которого отсутствует по меньшей мере одна активность, выбранная из группы, состоящей из повышенного гематокрита, сужения сосудов, гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтной активности и повышенной продукции тромбоцитов, и (ίί) фармацевтически приемлемый носитель, млекопитающему для лечения ревматоидного артрита.
17. Способ лечения воспаления реактивных клеток или связанных клеток, тканей или органов у млекопитающего, где указанный способ включает введение указанному млекопитающему при необходимости такого лечения:
(ί) фармацевтической композиции, содержащей профилактически или терапевтически эффективное количество тканевого протективного цитокина и фармацевтически приемлемый носитель, (ίί) введение млекопитающему профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких противовоспалительных или иммуномодулирующих средств.
18. Способ по п.17, где у указанного тканевого протективного цитокина отсутствует по меньшей мере одна активность, выбранная из группы, состоящей из повышенного гематокрита, сужения сосудов, гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтной активности и повышенной продукции тромбоцитов.
19. Способ по п.17 или 18, где противовоспалительное средство выбрано из группы, состоящей из кортикостероида, глюкокортикоида, стероида, нестероидного противовоспалительного препарата, бетаагониста, антихолинергического препарата, метилксантина, инъекционного препарата на основе золота, сульфасалазина, пеницилламина, противоангиогенного средства, дапсона, псоралена, антималярийного средства, противовирусного средства и антибиотика.
20. Способ по п.17 или 18, где иммуномодулирующее средство выбрано из группы, состоящей из белкового средства, пептидного миметика, антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, малой молекулы, органического соединения, неорганического соединения, метотрексата, лефлуномида, циклофосфамида, цитоксана, иммурана, циклоспорина А, миноциклина, азатиоприна, антибиотика, метилпреднизолона (МР), кортикостероида, стероида, микофенолата мофетила, рапамицина, мизорибина, дезоксиспергуалина, бреквинара, малононитрилоамида, модулятора рецепторов Т-клеток и модулятора рецепторов цитокинов.
21. Способ по п.17 или 18, где реактивные клетки выбраны из группы, состоящей из нейронов, мышечных клеток, клеток сердца, миокардиальных клеток, легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, капиллярных клеток, эндотелиальных клеток, клеток семенников, яичников, эндометриальных и стволовых клеток.
22. Способ по п.17 или 18, где воспаление выбрано из группы, состоящей из ангиита, хронического бронхита, панкреатита, остеомиелита, ревматоидного артрита, гломерулонефрита, неврита зрительного нерва, височного артериита, энцефалита, менингита, поперечного миелита, дерматомиозита, полимиозита, некротизирующего фасцита и некротизирующего энтероколита.
23. Способ по п.18, где воспалением, при котором эффективно применение указанного тканевого протективного цитокина, является гепатит.
24. Способ лечения воспаления реактивных клеток или связанных клеток, тканей или органов у млекопитающих, где указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества тканевого протективного цитокина и фармацевтически приемлемого носителя, где указанный тканевой протективный цитокин имеет по меньшей мере одну из следующих модификаций по сравнению с природной молекулой эритропоэтина:
ί) имеет 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 групп сиаловой кислоты;
ίί) имеет пониженное количество или не имеет ^связанных углеводов;
ϊϊΐ) обладает пониженным содержанием углеводов;
ίν) имеет один или несколько окисленных углеводов;
ν) имеет один или несколько окисленных углеводов, и где тканевой протективный цитокин химически восстановлен;
νί) имеет один или несколько модифицированных остатков аргинина;
νίί) имеет один или несколько модифицированных остатков лизина или имеет модификацию N концевой аминогруппы;
νίίί) имеет один или несколько модифицированных остатков тирозина;
ίχ) имеет один или несколько модифицированных остатков аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;
х) имеет один или несколько модифицированных остатков триптофана;
χί) удалена одна или несколько аминогрупп;
χίί) имеет разрыв по меньшей мере одной цистиновой связи;
χίίί) является укороченным и
- 48 010371 \ίν) имеет пониженное количество или не имеет О-связанных углеводов.
25. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где реактивные клетки включают клетки, выбранные из группы, состоящей из клеток фоторецептора, ганглиональных клеток, биполярных клеток, горизонтальных клеток, амакриновых клеток, клеток Мюллера, клеток водителя ритма, клеток синоатриального узла, клеток синусного узла, клеток атриовентрикулярного узла, клеток пучка Гиса, гепатоцитов, звездчатых клеток, купферовых клеток, мезангиальных клеток, бокаловидных клеток, железистных клеток кишечника, энтеральных эндокринных клеток, клеток клубочковой зоны, клеток пучков, ретикулярных клеток, хромаффинных клеток, перицитов, клеток Лейдига, клеток Сертоли, сперматозоидов, фолликулярных клеток Граффиана, клеток примордиальных фолликулов, стромальных клеток эндометрия и эндометриальных клеток.
26. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин имеет по меньшей мере один остаток карбамилированного лизина.
27. Способ по п.26, где все остатки лизина указанного тканевого протективного цитокина являются карбамилированными.
28. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин является эритропоэтином, выбранным из группы, состоящей из альфа-№карбамоилэритропоэтина; Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтина; альфа-№карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтина; альфа-Νкарбамоиласиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-карбамоиласиалоэритропоэтина; альфа-№карбамоил, Νэпсилон-карбамоиласиалоэритропоэтина; альфа-№карбамоилгипосиалоэритропоэтина; Ν-эпсилонкарбамоилгипосиалоэритропоэтина и альфа-№карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилгипосиалоэритропоэтина.
29. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин представляет собой альфа-№карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтин.
30. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин является асиалоэритропоэтином.
31. Способ по п.30, где указанный асиалоэритропоэтин является асиалоэритропоэтином человека.
32. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин представляет собой алкилированный эритропоэтин.
33. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин является эритропоэтином с уменьшенным числом или без Ν-связанных углеводов.
34. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин является эритропоэтином с уменьшенным числом или без О-связанных углеводов.
35. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин является эритропоэтином, обработанным по меньшей мере одной гликозидазой.
36. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин биотинилирован.
37. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где указанный тканевой протективный цитокин ингибирует воспаление, возникшее в результате продукции цитокинов глиальными клетками.
38. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где воспаление запускается апоптозом.
39. Способ по любому из пп.12, 13, 14, 16, 17 или 24, где тканевой протективный цитокин способен проходить через эндотелиальный клеточный барьер.
40. Способ по п.39, где эндотелиальный клеточный барьер выбран из группы, состоящей из гематоэнцефалического барьера, гематоглазного барьера, гематосеменникового барьера, гематояичникового барьера и гематоматочного барьера.
41. Способ по п.24, где указанный тканевой протективный цитокин имеет дополнительную модификацию, выбранную из группы, состоящей из:
ί) периодатного окисления;
ίί) Я-глиоксальной молекулы на одном или нескольких остатках аргинина, где Я представляет собой арильную или алкильную молекулу;
ϊϊΐ) по меньшей мере одного остатка аргинина, модифицированного реакцией с вицинальным дикетоном, выбранным из группы, состоящей из 2,3-бутандиона и циклогександиона;
ίν) по меньшей мере одного остатка аргинина, провзаимодействовавшего с 3-деоксигликозоном;
ν) по меньшей мере одного биотинилированного лизина или биотинилированной Ν-концевой аминогруппы;
νί) по меньшей мере одного глюцитолиллизина или фруктозиллизина;
νίί) по меньшей мере одного ацилированного остатка лизина;
νίίί) по меньшей мере одного сукцинилированного остатка лизина;
1х) по меньшей мере одного остатка лизина, модифицированного солью 2,4,6тринитробензолсульфоновой кислоты;
х) по меньшей мере одного нитрированного и/или йодинированного остатка тирозина и х1) по меньшей мере одного остатка аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты, провзаимодействовавшего с карбодиимидом с последующей реакций с амином.
- 49 010371
42. Способ по п.41, где указанный окисленный периодатом эритропоэтин химически восстановлен цианоборгидридом натрия.
43. Способ по п.41, где указанный тканевой протективный цитокин является фенилглиоксальэритропоэтином.
44. Способ по п.41, где по меньшей мере один ацилированный остаток лизина ацетилирован.
45. Способ по п.44, где указанный ацетилированный эритропоэтин выбран из группы, состоящей из альфа-^ацетилэритропоэтина; Ν-эпсилон-ацетилэритропоэтина; альфа-Ν-ацетил, Ν-эпсилонацетилэритропоэтина; альфа-№ацетиласиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-ацетиласиалоэритропоэтина; альфа-Ν-ацетил, Ν-эпсилон-ацетиласиалоэритропоэтина; альфа-^ацетилгипосиалоэритропоэтина; Νэпсилон-ацетилгипосиалоэритропоэтина и альфа^-ацетил, Ν-эпсилон-ацетилгипосиалоэритропоэтина.
46. Способ по п.41, где указанный суцинилированный эритропоэтин выбран из группы, состоящей из альфа^-сукцинилэритропоэтина; Ν-эпсилон-сукцинилэритропоэтина; альфа-^сукцинил, Ν-эпсилонсукцинилэритропоэтина; альфа-№сукциниласиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-сукциниласиалоэритропоэтина; альфа-^сукцинил, Ν-эпсилон-сукциниласиалоэритропоэтина; альфа^-сукцинилгипосиалоэритропоэтина; Ν-эпсилон-сукцинилгипосиалоэритропоэтина и альфа-№сукцинил, Ν-эпсилонсукцинилгипосиалоэритропоэтина.
47. Способ по п.41, где соль 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты представляет собой 2,4,6тринитробензолсульфонат натрия.
48. Способ по п.41, где указанный амин является глицинамидом.
49. Способ по любому из пп.15, 16 или 18, где указанный тканевой протективный цитокин не является эритропоэтическим.
EA200500149A 2002-07-03 2003-07-03 Тканевые протективные цитокины для защиты, восстановления и стимуляции реактивных клеток, тканей и органов EA010371B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/188,905 US20030072737A1 (en) 2000-12-29 2002-07-03 Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
PCT/US2003/021350 WO2004004656A2 (en) 2002-07-03 2003-07-03 Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200500149A1 EA200500149A1 (ru) 2006-08-25
EA010371B1 true EA010371B1 (ru) 2008-08-29

Family

ID=30114016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200500149A EA010371B1 (ru) 2002-07-03 2003-07-03 Тканевые протективные цитокины для защиты, восстановления и стимуляции реактивных клеток, тканей и органов

Country Status (17)

Country Link
US (3) US20030072737A1 (ru)
EP (1) EP1575528A4 (ru)
JP (1) JP2006515268A (ru)
KR (1) KR20050049467A (ru)
CN (1) CN1852731A (ru)
AR (1) AR040396A1 (ru)
AU (1) AU2003247934A1 (ru)
BR (1) BR0311939A (ru)
CA (1) CA2491406A1 (ru)
EA (1) EA010371B1 (ru)
IL (1) IL166067A0 (ru)
IS (1) IS7619A (ru)
MX (1) MXPA05000060A (ru)
NO (1) NO20050550L (ru)
PL (1) PL377146A1 (ru)
WO (1) WO2004004656A2 (ru)
ZA (1) ZA200500131B (ru)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
US7767643B2 (en) * 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
PL374580A1 (en) * 2002-07-01 2005-10-31 The Kenneth S.Warren Institute, Inc. Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
US20060216757A1 (en) * 2003-04-25 2006-09-28 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex, assays for identifying tissue protective compounds and uses thereof
US7718363B2 (en) 2003-04-25 2010-05-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex and assays for identifying tissue protective compounds
CN1946416A (zh) * 2003-05-19 2007-04-11 肯尼思S·沃伦协会有限公司 用于保护、恢复和增强效应细胞、组织和器官具有延迟的治疗窗口的组织保护性细胞因子
CN1897959A (zh) * 2003-09-29 2007-01-17 沃伦药品公司 用于治疗和预防脓毒病和粘连形成的组织保护细胞因子
US7101679B2 (en) 2003-11-25 2006-09-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Marker for neuromyelitis optica
RS50851B (sr) * 2004-07-07 2010-08-31 H. Lundbeck A/S. Novi karbamilovani epo i postupak za njegovu proizvodnju
DK1781697T3 (da) * 2004-07-07 2009-07-06 Lundbeck & Co As H Nyt carbamyleret erythropoietinprotein samt fremstillingsmetode
AT500929B1 (de) 2004-11-09 2007-03-15 Medizinische Uni Wien Muw Pharmazeutische zubereitung die erythropoietin enthält
WO2006129755A1 (ja) * 2005-06-01 2006-12-07 Niigata Tlo Corporation Epo誘導体含有血液関連疾患治療剤
US8071554B2 (en) 2005-08-05 2011-12-06 Araim Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective peptides and uses thereof
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
EP1996179A2 (en) * 2006-02-22 2008-12-03 Valorisation-Recherche, Limited Partnership Compositions for disorders associated with metachromatic cell activation
GR1005808B (el) * 2006-11-27 2008-02-06 Bionature E.A. Limited Επιταση της δρασεως της ερυθροποιητινης με αγωνιστες των μεμβρανικων στεροειδων υποδοχεων
WO2008065372A2 (en) 2006-11-28 2008-06-05 Nautilus Biotech, S.A. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
AR060424A1 (es) * 2007-04-11 2008-06-18 Consejo Nac Invest Cient Tec Lineas celulares , composiciones para el tratamiento de melanomas que las comprenden procedimientos para preparar las composiciones y metodos de tratamiento
US20110123481A1 (en) 2007-08-16 2011-05-26 Remedor Biomed Ltd. Erythropoietin and fibronectin compositions for therapeutic and cosmetic applications
CN101918019B (zh) 2007-10-08 2014-11-26 奥里尼亚制药有限公司 包含钙调神经磷酸酶抑制剂或mTOR抑制剂的眼科组合物
KR101768792B1 (ko) 2008-01-22 2017-08-16 아라임 파마슈티칼즈, 인크. 조직 손상 관련 질환 및 장애를 예방 및 치료하기 위한 조직 보호 펩티드 및 펩티드 유사체
EP2268301B1 (en) * 2008-01-24 2020-02-26 Remedor Biomed Ltd. Erythropoietin and fibronectin compositions for bone regeneration
WO2009102021A1 (ja) * 2008-02-14 2009-08-20 Kyoto University 骨髄由来幹細胞、前駆細胞機能賦活による網膜疾患治療
CA2723621A1 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 Edison Pharmaceuticals, Inc Treatment of hearing and balance impairments using compounds having erythropoietin activity
KR101647164B1 (ko) 2008-09-26 2016-08-09 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도
AU2010259184B2 (en) * 2009-06-09 2015-08-13 Aurinia Pharmaceuticals Inc. Topical drug delivery systems for ophthalmic use
US20130005822A1 (en) * 2010-03-15 2013-01-03 Rubin Bruce K Aerosolized dapsone as a therapy for inflammation of the airway and abnormal mucociliary transport
ES2632164T3 (es) * 2010-07-06 2017-09-11 Augustinus Bader Aplicación tópica de eritropoyetina para uso en el tratamiento de lesiones de la córnea
WO2012069474A2 (en) 2010-11-24 2012-05-31 H. Lundbeck A/S A method for reducing potential virus burden in a sample by cyanate treatment
CA2843014C (en) * 2011-07-27 2020-01-21 Neumedicines, Inc. Use of il-12 to generate endogenous erythropoietin
CN104349804B (zh) * 2012-03-01 2017-06-06 医疗设备工程公司 用于监视和控制器官血液灌注的系统
JP2012193207A (ja) * 2012-07-13 2012-10-11 New York Univ インターフェロンを用いる肺疾患の処置方法
GB201214007D0 (en) * 2012-08-07 2012-09-19 Scancell Ltd Anti-tumour immune responses to modified self-epitopes
PL2956056T3 (pl) 2013-03-14 2020-01-31 UNIVERSITé LAVAL Układ elektroretinograficzny (ERG) do oceny zaburzeń psychicznych
CN104232571B (zh) * 2014-01-29 2018-01-12 中国人民解放军第二军医大学 一种组织工程化搏动组织的构建方法
CN109310741A (zh) 2016-04-29 2019-02-05 阿拉伊姆药品公司 用于预防和治疗与组织损伤相关的疾病和障碍的组织保护肽
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US20190224275A1 (en) 2017-05-12 2019-07-25 Aurinia Pharmaceuticals Inc. Protocol for treatment of lupus nephritis
KR20200116130A (ko) * 2018-02-01 2020-10-08 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 인간 인슐린 유사체의 아실화된 유도체를 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법
CN113648418B (zh) * 2021-05-08 2022-08-05 南方医科大学 Apelin-APJ抑制剂在制备治疗血睾屏障损伤药物中的应用

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4343782A (en) * 1978-04-20 1982-08-10 Shapiro Howard M Cytological assay procedure
US4658019A (en) * 1979-04-26 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
JPS6045849B2 (ja) * 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
JPS6197229A (ja) * 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
DE3729863A1 (de) * 1987-09-05 1989-03-16 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierte erythropoietin-lyophilisate
WO1990008822A1 (en) * 1989-02-03 1990-08-09 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin receptor
DE3923963A1 (de) * 1989-07-20 1991-01-31 Behringwerke Ag Muteine des menschlichen erythropoetins, ihre herstellung und ihre verwendung
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5856298A (en) * 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
KR100263845B1 (ko) 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
US5292654A (en) * 1990-12-13 1994-03-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Mutant EPO receptor and uses therefor
DE69127462T2 (de) * 1990-12-17 1998-04-02 Cardiovascular Imaging Systems, Inc., Sunnyvale, Calif. Vaskularer katheter mit einem ein niedriges profil aufweisenden distalen ende
US5416071A (en) * 1991-03-12 1995-05-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Water-soluble composition for sustained-release containing epo and hyaluronic acid
US5750376A (en) * 1991-07-08 1998-05-12 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
US5625035A (en) * 1992-06-05 1997-04-29 The Regents, University Of California Erythropoietin binding protein from mammalian serum
US6153407A (en) 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US5661125A (en) * 1992-08-06 1997-08-26 Amgen, Inc. Stable and preserved erythropoietin compositions
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
US5354934A (en) * 1993-02-04 1994-10-11 Amgen Inc. Pulmonary administration of erythropoietin
US6071970A (en) * 1993-02-08 2000-06-06 Nps Pharmaceuticals, Inc. Compounds active at a novel site on receptor-operated calcium channels useful for treatment of neurological disorders and diseases
AU697453B2 (en) * 1993-04-29 1998-10-08 Abbott Laboratories Erythropoietin analog compositions and methods
US5571787A (en) * 1993-07-30 1996-11-05 Myelos Corporation Prosaposin as a neurotrophic factor
US5700909A (en) * 1993-07-30 1997-12-23 The Regents Of The University Of California Prosaposin and cytokine-derived peptides
CA2169629C (en) * 1993-08-16 2002-06-11 Jong Y. Lee Human erythropoietin receptor fragment and antibodies thereto
IL110669A (en) 1993-08-17 2008-11-26 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5859001A (en) * 1996-01-11 1999-01-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Neuroprotective effects of polycyclic phenolic compounds
US5773569A (en) * 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5830851A (en) * 1993-11-19 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US5604198A (en) * 1994-05-12 1997-02-18 Poduslo; Joseph F. Method to enhance permeability of the blood/brain blood/nerve barriers to therapeutic agents
US5763198A (en) * 1994-07-22 1998-06-09 Sugen, Inc. Screening assays for compounds
US5767078A (en) * 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US6121246A (en) 1995-10-20 2000-09-19 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for treating ischemic tissue
AUPN780096A0 (en) * 1996-01-30 1996-02-22 Medvet Science Pty. Ltd. Cytokine antagonists and agonists
US5835382A (en) * 1996-04-26 1998-11-10 The Scripps Research Institute Small molecule mimetics of erythropoietin
US20020052309A1 (en) * 1996-09-11 2002-05-02 Athanasius A. Anagnostou Method of treating endothelial injury
NZ336780A (en) * 1997-01-16 2000-12-22 Neose Technologies Inc In vitro sialylation of glycoproteins
EP0885613A1 (de) 1997-06-21 1998-12-23 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin
US6242570B1 (en) * 1997-07-10 2001-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Production and use of recombinant protein multimers with increased biological activity
US6548296B1 (en) * 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
US6165783A (en) * 1997-10-24 2000-12-26 Neuro Spheres Holdings Ltd. Erythropoietin-mediated neurogenesis
DE59813187D1 (de) * 1997-12-03 2005-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur herstellung von polypeptiden mit geeigneter glykosilierung
US6274158B1 (en) * 1998-02-04 2001-08-14 Veronica L. Zaharia Czeizler Treatment with recombinant human erythropoietin of bleeding in patients with normal and abnormal hemostasis
DE69825137T2 (de) 1998-02-23 2005-07-21 Cilag Ag International Liposomale Erythropoietin-Dispersion
US6291661B1 (en) * 1998-07-02 2001-09-18 Immunex Corporation flt3-L mutants and method of use
US6103526A (en) * 1998-10-08 2000-08-15 Protein Sciences Corporation Spodoptera frugiperda single cell suspension cell line in serum-free media, methods of producing and using
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
US6368453B1 (en) * 1999-03-18 2002-04-09 Andritz Inc. Chip feeding to a comminuted cellulosic fibrous material treatment vessel
HUP0201598A3 (en) * 1999-04-13 2002-10-28 Kenneth S Warren Inst Ossining Pharmaceutical composition comprising erythropoietin for modulation of excitable tissue function and their use
US7309687B1 (en) 1999-04-13 2007-12-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Methods for treatment and prevention of neuromuscular and muscular conditions by peripherally administered erythropoietin
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
US20060099685A1 (en) * 1999-04-15 2006-05-11 Yallop Christopher A Recombinant expression of factor VIII in human cells
US20050170463A1 (en) * 1999-04-15 2005-08-04 Abraham Bout Recombinant protein production in permanent amniocytic cells that comprise nucleic acid encoding adenovirus E1A and E1B proteins
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US20050164386A1 (en) * 1999-04-15 2005-07-28 Uytdehaag Alphonsus G. Overexpression of enzymes involved in post-translational protein modifications in human cells
US8236561B2 (en) * 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
US7504248B2 (en) * 2001-12-07 2009-03-17 Crucell Holland B.V. Production of viruses viral isolates and vaccines
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US6747002B2 (en) * 1999-05-11 2004-06-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Pharmacokinetic and pharmacodynamic modeling of erythropoietin administration
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
PE20010288A1 (es) * 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
US20030118547A1 (en) * 2000-01-27 2003-06-26 Vandenberg Grant William Composition for intestinal delivery
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US20020061849A1 (en) * 2000-05-02 2002-05-23 Soren Nielsen Methods for treatment of diseases associated with inflammation under non-ischemic conditions
HUP0302299A2 (hu) * 2000-05-12 2003-10-28 Neose Technologies, Inc. Rekombináns glikopeptidek glikozilezési mintázatának in vitro módosítása
US7087224B2 (en) * 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
KR100401296B1 (ko) * 2000-12-27 2003-10-11 드림바이오젠 주식회사 수식물질에 의해 수식된 단백질 변이체 및 이것의 제조방법
US7767643B2 (en) * 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US6531121B2 (en) * 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
PA8536201A1 (es) * 2000-12-29 2002-08-29 Kenneth S Warren Inst Inc Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
US7300916B2 (en) 2001-02-27 2007-11-27 Yoshiko Yasuda Preventives/remedies for thickened scar, keloid or chronic arthritic diseases
FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
AU2002319142B2 (en) * 2001-04-04 2008-02-21 Genodyssee New polynucleotides and polypeptides of the erythropoietin gene
US6930086B2 (en) * 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
DK1440157T3 (da) 2001-10-29 2012-05-07 Crucell Holland Bv Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
KR100467750B1 (ko) * 2001-11-29 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
KR100467751B1 (ko) * 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
AU2003232122A1 (en) * 2002-05-13 2003-11-11 Technion Entrepreneurial Incubator Company Ltd. Ctp-extended erythropoietin
US20060135854A9 (en) * 2002-05-16 2006-06-22 Sleepex Systems, Inc. Sleep study software architecture
US7300915B2 (en) 2002-06-05 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Use of erythropoietin and erythropoietin mimetics for the treatment of neuropathic pain
PL374580A1 (en) * 2002-07-01 2005-10-31 The Kenneth S.Warren Institute, Inc. Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs
US20050176627A1 (en) * 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
US20040091961A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
BRPI0408829A (pt) 2003-03-27 2006-04-04 Janssen Pharmaceutica Nv uso de eritropoietina em recuperação de acidente vascular cerebral
US20060216757A1 (en) * 2003-04-25 2006-09-28 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex, assays for identifying tissue protective compounds and uses thereof
US7718363B2 (en) * 2003-04-25 2010-05-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex and assays for identifying tissue protective compounds
CN1946416A (zh) * 2003-05-19 2007-04-11 肯尼思S·沃伦协会有限公司 用于保护、恢复和增强效应细胞、组织和器官具有延迟的治疗窗口的组织保护性细胞因子
CN1897959A (zh) * 2003-09-29 2007-01-17 沃伦药品公司 用于治疗和预防脓毒病和粘连形成的组织保护细胞因子
EP1771190A4 (en) 2004-07-02 2009-07-22 Kenneth S Warren Inst Inc METHOD FOR THE PRODUCTION OF COMPLETELY CARBAMYLATED ERYTHROPOIETIN
RS50851B (sr) 2004-07-07 2010-08-31 H. Lundbeck A/S. Novi karbamilovani epo i postupak za njegovu proizvodnju
WO2006129755A1 (ja) 2005-06-01 2006-12-07 Niigata Tlo Corporation Epo誘導体含有血液関連疾患治療剤
US8071554B2 (en) * 2005-08-05 2011-12-06 Araim Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective peptides and uses thereof
KR100753979B1 (ko) * 2005-09-07 2007-08-31 삼성전자주식회사 Ｄｎａ 검출 장치
US7642078B2 (en) 2005-12-28 2010-01-05 Crucell Holland B.V. Methods to obtain recombinant proteins with increased sialylation from cells that express adenovirus E1A protein, and proteins obtained thereby

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONG et al. Receptor Binding of Asialoerythropoietin. Journal of Cellular Biochemistry. March 1992. Vol. 48, No. 3, pages 269-276 *
IMAI et al. Physiochemical and Biological Characterization of Asialoerythropoietin Suppressive Effects of Sialic Acid in the Expression of Biological Activity of Human Erythropoietin in Vitro. European Journal of Biochemistry. December 1990. Vol. 194, No. 2, pages 457-462 *
Yang et al. Effects of Ammonia and Glucoseamine on the Heterogeneity of Erythropoietin Glycoforms. Biotechnology Progress. January 2002, Vol. 18, No. 1, pages 129-138 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20030072737A1 (en) 2003-04-17
PL377146A1 (pl) 2006-01-23
BR0311939A (pt) 2007-05-08
JP2006515268A (ja) 2006-05-25
AU2003247934A1 (en) 2004-01-23
EP1575528A2 (en) 2005-09-21
ZA200500131B (en) 2008-02-27
IS7619A (is) 2004-12-29
US8404226B2 (en) 2013-03-26
EA200500149A1 (ru) 2006-08-25
EP1575528A4 (en) 2009-06-24
NO20050550L (no) 2005-03-22
CN1852731A (zh) 2006-10-25
AR040396A1 (es) 2005-03-30
WO2004004656A3 (en) 2006-06-01
WO2004004656A2 (en) 2004-01-15
US20120142589A1 (en) 2012-06-07
MXPA05000060A (es) 2005-04-08
KR20050049467A (ko) 2005-05-25
US20060034799A1 (en) 2006-02-16
IL166067A0 (en) 2006-01-15
CA2491406A1 (en) 2004-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010371B1 (ru) Тканевые протективные цитокины для защиты, восстановления и стимуляции реактивных клеток, тканей и органов
EA010200B1 (ru) Рекомбинантные тканезащитные цитокины и кодирующие их нуклеиновые кислоты для защиты, восстановления и усиления чувствительных клеток, тканей и органов
JP6114099B2 (ja) エリスロポエチン応答性細胞、組織及び器官の保護、回復ならびに増強
JP6491621B2 (ja) 組織保護ペプチド及びその使用
MXPA06014742A (es) Nueva epo carbamilada y metodo para su produccion.
BG107214A (bg) Пептид, модулиращ тромбопоетиновия рецептор
EA007812B1 (ru) Эритропоэтины длительного действия, которые сохраняют тканезащитную активность эндогенного эритропоэтина

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU