CN109069581A - 锁环螺旋肽及合成方法 - Google Patents

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Abstract

设计和生成了干扰蛋白‑蛋白相互作用(PPI)的锁环螺旋肽。制备锁环肽的方法包括提供具有第一氨基酸和第二氨基酸的肽，所述第一氨基酸用水杨醛酯侧基官能化，和所述第二氨基酸用1,2‑羟胺侧基官能化；使第一和第二氨基酸反应生成N,O‑亚苄基缩醛部分；并进行生成的N,O‑亚苄基缩醛部分的酸解以生成锁环肽。在许多形式中，锁环螺旋肽不是疏水性的。

Description

锁环螺旋肽及合成方法
相关申请的交叉参照
本申请要求2015年12月1日提交的美国临时申请号62/261,395的权益。2015年12月1日提交的申请号62/261,395通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本公开的发明总体上在官能化肽的领域内且特别是在锁环螺旋肽的领域内。
发明背景
肽是靶向细胞外受体的有价值和有效的药物。它们在调节细胞内过程中的应用受到其无法进入细胞，其不稳定性，以及对蛋白酶的敏感性的阻碍。稳定肽的一个有效策略涉及把它们锁定在特定的耐蛋白酶形状中。α-螺旋是蛋白质的主要结构成分之一，且通常在蛋白质接触的界面处发现，参与各种分子间生物识别事件。然而，α-螺旋肽具有散开和形成无规卷曲的倾向，其在大多数情况下是生物学活性较低的，或甚至是无活性的，且对蛋白水解的降解高度易感。
"肽锁环"是一个为合成方法创造的术语，所述合成方法使用烯烃复分解反应，用来将存在于肽链中的两个含烯烃的侧链共价连接(J. Org. Chem. (2001) 66(16);Blackwell等, Angew. Chem. Int. Ed. (1994) 37:3281)。利用从烯烃复分解反应生成的烃交联接头将肽锁环，已被证明有助于维持肽的天然构象，尤其是在生理条件下(美国专利号7,192,713; Schafineister等, J. Am. Chem. Soc. (2000) 122:5891-5892;Walensky等, Science (2004) 305:1466-1470)。锁环将肽稳定在与蛋白靶的结合位点匹配的构型，它保护肽避免蛋白水解的作用，并且它使肽能渗透膜(Sun等, Biophys. J. 104(9):1923-1932 (2013))。小分子也是细胞可渗透的，但它们较受限于它们可结合的靶类型。锁环肽比小分子表现出更高的特异性和亲和力，靶向当前疗法无法调节的细胞内控制点。
蛋白-蛋白相互作用(PPI)参与了许多生物过程，因此，干扰PPI的分子的发现在药物发现方面产生一些有吸引力的方法。包括一种经常出现的1-4个螺旋转角(4-15个氨基酸)的蛋白α-螺旋的PPI是很有希望的靶标，因为人们可以设计和制备合成的α-螺旋肽配体作为受体拮抗剂。为提高这些短合成肽在水中的α-螺旋结构稳定性，已经开发了各种共价侧链-侧链连接策略以稳定α-螺旋结构，包括KD内酰胺接头、烃接头、“点击”三唑接头、间-二甲苯硫醚接头、全氟苄基硫醚接头和烷基硫醚接头(图5A-5C和5E-5G)。
这些接头的每一个在某种程度上已显示了成功的应用。例如，KD内酰胺-型肽已被用作HIV和RSV PPI抑制剂，烃-型肽已被开发以促进Bcl2细胞凋亡并抑制HIV-1衣壳组装或NOTCH转录，三唑-型肽已被应用于PTH和β-连环蛋白/Bcl9。
存在各种用于生成锁环肽的策略。主要策略涉及利用半胱氨酸侧链形成二硫桥和硫醚形成(图5D和5H)。其它方法包括闭环复分解；涉及硼化苯丙氨酸衍生物的官能化合成的氨基酸的联芳基连键；或“点击化学(click chemistry)”，藉此叠氮化物和末端或内部炔之间的环加成产生1,2,3-三唑(图5C)。这些合成既昂贵又费力。由于对锁环肽和其它构象受限结构的越来越大的兴趣，已作出许多努力以便为了它们的生成开发可行和通用的备选制备方法。总的说来，上述接头是疏水性的，其通常引起溶解性问题。因此，用于制备锁环肽的改进组成和策略是非常需要的。
本发明的目的是提供具有改进性质，例如较高的亲水性和/或在水溶液中更大溶解度的锁环螺旋肽。
本发明的进一步的目的是提供制备锁环螺旋肽的改进方法。
本发明的进一步的目的是提供使用锁环螺旋肽的治疗方法。
发明简述
本文描述了用于将肽、特别是柔性肽、和最特别是短的柔性肽稳定成为充分限定的构象的策略。充分限定的构象对获得生物活性构象是特别有价值和有用的。构象限制的生物活性肽一般具有增强的与蛋白质和其它重要生物分子相互作用的能力。本文公开的锁环肽可增强肽抑制剂的结合亲和力、蛋白水解稳定性和/或细胞活性。
提供具有改进的干扰蛋白-蛋白相互作用(PPI)的特性的锁环螺旋肽及其合成方法。锁环肽通过连接两个结构优化的氨基酸来产生。
如上所述，肽锁环可以用疏水的接头制备，其通常引起溶解性问题。本文提供了用于合成锁环螺旋肽的基于分子内丝氨酸/苏氨酸连接的方法。生成的锁环肽具有β-OH内酰胺接头，其在结构上具有手性羟基官能团，是功能上亲水性的，并可参与结合事件。这种肽锁环化学对于生成生物活性肽治疗剂是有效的。
公开了锁环、锁环肽、制备锁环肽的方法、使用锁环肽的方法，以及用于制备和使用锁环肽的锁环、肽、化合物和组合物。公开了其中锁环根据式(a)或式(b)定义的锁环肽：
其中R是H或C1-C30烷基，X是-(CH2)a-或-C(O)NH- (a是1-6的整数)，m是0-6的整数，和n是0-6的整数。
一般地，锁环肽包含肽骨架和至少一个如本文描述的锁环。在某些形式中，锁环肽可根据式(I)或式(II)定义：
其中- 锁环 -是所述锁环，[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸，x是2-10的整数，y是2-10的整数，和z是2-10的整数。
在某些形式中，锁环肽是水溶性的。在锁环肽的某些形式中，锁环是亲水性的。在根据式(a)的锁环的某些形式中，R是H。在根据式(a)的锁环的某些形式中，X是-(CH2)a-。在根据式(a)的锁环的某些形式中，X是-C(O)NH-。锁环肽的某些形式中具有螺旋结构。
在某些形式中，锁环肽具有以下结构之一：
。
在锁环肽的某些形式中，[Xaa]y包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在锁环肽的某些形式中，所述肽的线性序列包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
制备锁环肽的方法也被公开。在某些形式中，方法包括(a) 用水杨醛酯侧基官能化的第一氨基酸与用1,2-羟胺侧基官能化的第二氨基酸反应，生成N,O-亚苄基缩醛部分，其中所述第一氨基酸和第二氨基酸包含在肽中；和(b) 进行生成的N,O-亚苄基缩醛部分的酸解以生成锁环肽。
在某些形式中，具有官能化氨基酸的肽根据式(III)或(IV)定义：
其中R是H或C1-C30烷基，X是-(CH2)a-或-C(O)NH- (a是1-6的整数)，m是0-6的整数，n是0-6的整数，[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸，x是2-10的整数，y是2-10的整数，和z是2-10的整数。
在根据式(III)或式(IV)的肽(和生成的锁环肽)的某些形式中，R是H。在根据式(III)或式(IV)的肽(和生成的锁环肽)的某些形式中，X是-(CH2)a-。在根据式(III)或式(IV)的肽(和生成的锁环肽)的某些形式中，X是-C(O)NH-。在某些形式中，生成的锁环肽具有螺旋结构。
用本公开的锁环肽治疗有需要的受试者的方法也被公开。在某些形式中，该方法包括向受试者施用有效量的如本文公开的锁环肽。
在某些形式中，所述受试者患有病毒性感染。在某些形式中，所述感染是HIV感染。在某些形式中，所述感染是RSV感染。在某些形式中，锁环肽干扰蛋白-蛋白相互作用。
在某些形式中，锁环肽具有根据式(I)或式(II)的肽骨架和锁环：
其中[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸，x是2-10的整数，y是2-10的整数，和z是2-10的整数。在某些形式中，式(I)或式(II)的锁环根据式(a)或(b)定义：
其中R是H或C1-C30烷基，X是-(CH2)a-和a是1-6的整数或X是-C(O)NH-，m是1-6的整数，和n是1-6的整数。
在某些形式中，锁环肽可具有以下结构之一：
。
在某些形式中，制备锁环肽的方法可包括(1) 提供一种具有用水杨醛酯侧基官能化的第一氨基酸和用1,2-羟胺侧基官能化的第二氨基酸的肽；(2) 使第一和第二氨基酸反应生成N,O-亚苄基缩醛部分；和(3) 使生成的N,O-亚苄基缩醛部分进行酸解以生成锁环肽。在某些形式中，步骤(1)的肽可根据式(III)或(IV)定义：
其中R是H或C1-C30烷基，X是-(CH2)n-和a是1-6的整数或X是-CONH-，m是1-6的整数，n是1-6的整数，[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸，x是2-10的整数，y是2-10的整数，和z是2-10的整数。
本文描述的锁环螺旋肽可用例如，药学上可接受的载体和任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂配制，以供施用于有需要的受试者。
附图简述
附图，其结合到本说明书中并构成本说明书的一部分，说明了本公开的方法和组合物的几种形式并与描述一起，用来解释本公开的方法和组合物的原理。
图1是描述使用示例性肽锁环策略生成的示例性锁环肽的图解说明。
图2A是说明在i和i+4位置系链的肽的示例性肽锁环策略的流程图。图2B和2C是描述5-羟基赖氨酸的对映体的图解说明，其可用作在图2A中的肽的i和i+4位置的结构模块。
图3A是说明在i和i+7位置系链的肽的示例性肽锁环策略的流程图。图3B和3C是描述赖氨酸-丝氨酸(3B)和赖氨酸-5-羟基赖氨酸(3C)的图解说明，其可用作在图3A中的肽的i和i+7位置的结构模块。
图4A和4B是显示烃连接的锁环肽(4A)和K(OH)D内酰胺-型锁环肽(4B)的图解说明。
图5A-5H是描述已知的肽锁环接头的图解说明。显示了KD内酰胺(5A)、烃(5B)、“点击”三唑(5C)、二-硫醚(5D)、间-二甲苯硫醚(5E)、全氟苄基硫醚(5F)、烷基硫醚(5G)和二-硫醚(5H)接头。
图6A-6C是在实施例1 (6A)、3和4 (6B)，和5和6 (6C)中讨论的锁环肽的CD谱。
发明详述
通过参考以下特定形式的详细描述和其中包括的实施例以及附图及其先前和以下的描述，可更容易地理解本公开的方法和组合物。
I. 定义
本文所用的术语“活性”指生物学活性。
本文所用的术语"施用"、"给予"或"给药"指植入、施用、吸收、摄取、注射或吸入肽或化合物。
本文所用的术语“醛”由式-C(O)H表示。
本文所用的术语“烷基”是1-30个碳原子的分支或未分支饱和烃基，如甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、叔-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等。“低级烷基”基团是含1-6个碳原子的烷基。
本文所用的术语"氨基酸"指含氨基和羧基二者的分子。氨基酸包括α-氨基酸和β-氨基酸，其结构在下文描述。在某些形式中，氨基酸是α氨基酸。氨基酸可以是天然或合成的。氨基酸包括，但不限于，20个标准或规定氨基酸：丙氨酸(Ala, A)、精氨酸(Arg, R)、天冬酰胺(Asn, N)、天冬氨酸(Asp, D)、半胱氨酸(Cys, C)、谷氨酰胺(Gln, Q)、谷氨酸(Glu,E)、甘氨酸(Gly, G)、组氨酸(His, H)、异亮氨酸(Ile, I)、亮氨酸(Leu, L)、赖氨酸(Lys,K)、甲硫氨酸(Met, M)、苯丙氨酸(Phe, F)、脯氨酸(Pro, P)、丝氨酸(Ser, S)、苏氨酸(Thr, T)、色氨酸(Trp, W)、酪氨酸(Tyr, Y)和缬氨酸(Val, V)。常见的非-标准或非-规定氨基酸包括，但不限于，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸和N-甲酰基甲硫氨酸。
本文所用的术语“羰基”由式C=O表示。
本文所用的术语“羧酸”由式-C(O)OH表示。
本文所用的术语“酯”由式-C(O)OA表示，其中A可以是上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文所用的术语“碳酸酯基团”由式-OC(O)OR表示，其中R可以是上述的氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、卤代烷基或杂环烷基。
本文所用的术语“醚”由式AOA1表示，其中A和A1可独立地为上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文所用的术语“亲水性”指对水具有强烈亲和力的特性；易溶于水、吸收水、与水混合或被水浸湿。
本文所用的术语“需要治疗”指护理提供者(如在人类的情况下为医师、护士、护理工作者或个体；在动物包括非-人哺乳动物的情况下为兽医)做出的受试者需要治疗或将从治疗受益的判断。这种判断基于多种因素作出，所述因素在护理提供者的专业领域内，但包括因为通过本发明的化合物可治疗的病况导致受试者患病或将要患病的知识。
本文所用的术语"异构体"包括任何和所有几何异构体和立体异构体。例如，"异构体"包括落入本发明范围内的顺式-和反式-异构体、E-和Z-异构体、R-和S-对映体、非对映体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物，及其其它混合物。例如，在某些形式中，可提供基本上不含相应的对映体的异构体/对映体，也可称为"旋光富集的"。本文所用的"旋光富集的"意指所述化合物由明显更大比例的一种对映体组成。在某些形式中，本发明的化合物由至少约90%重量的优选的对映体组成。在其它形式中，所述化合物由至少约95%、98%或99%重量的优选的对映体组成。优选的对映体可通过本领域技术人员已知的任何方法，包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶从外消旋混合物分离，或通过不对称合成方法制备。见例如，Jacques等, Enantiomers, Racemates and Resolutions (WileyInterscience, New York, 1981); Wilen, S. H.等, Tetrahedron 33:2725 (1977);Eliel, E. L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, N.Y., 1962);Wilen, S. H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E. L.Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, Ind. 1972)。
本文所用的术语“接头”或“锁环”指锁环肽中的交联接头。
本文所用的术语“天然氨基酸”指肽中发现的20种常见的天然存在的氨基酸(如，A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V (如通过单字母缩写已知的))的D-和L-异构体二者。
本文所用的术语“肽”指一类由化学上结合在一起的氨基酸组成的化合物。一般说来，氨基酸经由酰胺键(CONH)在化学上结合在一起；然而，氨基酸可通过本领域已知的其它化学键结合在一起。例如，氨基酸可通过胺键结合。本文所用的肽包括氨基酸的寡聚体及小肽和大肽，包括多肽。
本文所用的术语"锁环肽”指一种具有选择数量的标准或非-标准氨基酸，并且还具有至少两个能够经历反应以促进碳-碳键形成的部分的肽，其已与试剂接触以在所述至少两个部分之间生成至少一个交联接头，其例如调节肽稳定性。
本文所用的术语"锁环"在肽中引入至少两个能够经历反应以促进碳-碳键形成的部分，其可与试剂接触以在所述至少两个部分之间生成至少一个交联接头。锁环提供了对二级结构，如α-螺旋结构的约束。可优化交联接头的长度和几何形状，以提高所需二级结构含量的产率。提供的约束可例如，防止二级结构展开和/或能强化二级结构的形状。例如，防止展开的二级结构是更稳定的。
本文所用的术语"受试者"指任何动物。在某些形式中，受试者是哺乳动物。在某些形式中，本文所用的术语"受试者"指在任何发育阶段的任一性别的人(如，男人、女人，或儿童)。
本文所用的术语“合成的氨基酸”或“非-天然氨基酸”指具有类似于天然氨基酸的结构，以致它模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。当合成的氨基酸代替天然氨基酸或者结合到肽中时，本文定义的合成的氨基酸一般地增加或提高肽的特性(如，选择性、稳定性)。
本文所用的术语“治疗(treatment或treating)”意思是意欲治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症的受试者的医学管理。该术语包括积极治疗，即是说，特别涉及疾病、病理状态或病症的改善的治疗，并且还包括病因治疗，即是说，涉及消除相关疾病、病理状态或病症的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即是说，为缓解症状而不是治愈疾病、病理状态或病症而设计的治疗；预防性治疗，即是说，涉及尽可能减少或部分地或完全地抑制相关疾病、病理状态或病症的发展的治疗；和支持治疗，即是说，用来补充涉及相关疾病、病理状态或病症的改善的另一种特定疗法的治疗。要理解，治疗，虽然意欲治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症，但不必在实际上导致治愈、改善、稳定或预防。治疗效果可按本文所述和按本领域已知的，如适合于所涉及的疾病、病理状态或病症的，进行测量和评价。这样的测量和评价可在定性和/或定量条件下进行。因此，例如，疾病、病理状态或病症，和/或疾病、病理状态或病症的症状的特征或特点可减少到任何效果或任何量。
本申请公开的任何类型的数值范围独立地公开这一范围可合理涵盖的每个可能的数字，以及其中涵盖的任何子范围和子范围的组合。碳范围(即，C1-C10)意欲单独公开每一个可能的碳值和/或其中涵盖的子范围。例如，C1-C10的碳长度范围公开C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9和C10，以及公开其中涵盖的子范围，如C2-C9、C3-C8、C1-C5等等。
II. 锁环肽
本文提供了锁环肽、包含或由锁环肽组成的蛋白和肽，及其药学上可接受的形式。在最优选的实施方案中，锁环肽是锁环螺旋肽。在某些形式中，锁环肽是非-螺旋肽。包含一种或多种锁环肽的药物组合物是包含锁环肽的蛋白和药学上可接受的赋形剂。这样的药物组合物可任选地包含一种或多种另外的生物活性物质。为了本公开内容的目的，短语"活性成分"一般地指锁环肽，或包含如本文描述的锁环肽的蛋白或肽。锁环肽优选地具有连接肽骨架的两个或更多个部分的锁环。
药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将根据治疗的受试者的特性、大小和/或病况并进一步根据要施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可含有0.1%和100% (w/w)之间的活性成分。
在某些形式中，锁环肽具有根据式(I)或(II)的肽骨架和锁环：
其中[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸，x是2-10的整数，y是2-10的整数，和z是2-10的整数。
A. 肽骨架
锁环肽的合成首先包括选择氨基酸和氨基酸类似物的所需序列和数目。本领域普通技术人员将认识到，选择的氨基酸结构(天然或非-天然)的数目、立体化学和类型将取决于要制备的肽的大小，特定氨基酸生成所需的结构基序(如，α-螺旋)的能力，和模拟有效地结合靶标或效应生物分子的蛋白结构域所需的任何特定基序。在某些形式中，肽是螺旋的。在某些形式中，肽是非-螺旋的。因此锁环肽序列可类似于已知的肽或蛋白的序列或子序列，并提高其中已有的α-螺旋或其它氨基酸基序的稳定性或其它特征。另外地或可供选择地，锁环肽序列可加入到已知的肽或蛋白中，以添加以前不存在于其中的α-螺旋或其它氨基酸基序。在一些实施方案中，活性剂是锁环肽。在一些实施方案中，所述肽具有两个或更多个锁环。锁环的序列可以是相同或不同的。
在优选的实施方案中，锁环肽包括螺旋基序(即锁环螺旋肽)。不同的氨基酸具有形成不同的二级结构的不同倾向。例如，甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)全部具有特别高的α-螺旋形成倾向。因此在一些实施方案中，锁环肽序列，特别是[Xaa]y序列，包括或由甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)组成。相比之下，脯氨酸(P)和甘氨酸(G)是α-螺旋的破坏者。因此在一些实施方案中，锁环肽序列，特别是[Xaa]y，不包括甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)。
在特别的示例性实施方案中，[Xaa]y包括或由Ala-Arg-Arg；Glu-Tyr-Leu；Ala-Ile-Gln；Ala-Ala-Ala；Gln-Ser-Gln-Gln-Thr-Phe (SEQ ID NO:1)；Asn-Leu-His-Arg-LeuLeu (SEQ ID NO:2)；Gln-Asn；Glu-Asn-Pro-Glu (SEQ ID NO:3)；Ile-Leu-Asp；或His-Val-Gln-Arg-Val-Leu (SEQ ID NO:4)组成。
在示例性实施方案中，锁环肽包括或由以下线性肽序列组成：Ala-Arg-Arg-Asp(水杨醛酯)-Glu-Tyr-Leu-Lys(5-OH)-Ala-Ile-Gln (SEQ ID NO:5)；Asp(水杨醛酯)Ala-Ala-Ala-Lys(Ser) (SEQ ID NO:6)；Asp(水杨醛酯)Ala-Ala-Ala-Lys(5-OH) (SEQ ID NO:7)；Gln-Ser-Gln-Gln-Thr-Phe-Asp(水杨醛酯)-Asn-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Lys(Ser)-Ala-Ala-Ala-Lys(Ser)-Gln-Asn (SEQ ID NO:8)；或Glu-Asn-Pro-Glu-Asp(水杨醛酯)-Ile-Leu-Asp-Lys(Ser)-His-Val-Gln-Arg-Val-Leu (SEQ ID NO:9)。在某些形式中，肽骨架根据式III或IV定义：
其中R是H或C1-C30烷基，X是-(CH2)a-和a是1-6的整数或X是-CONH-，m是0-6的整数，n是0-6的整数，[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸，x是2-10的整数，y是2-10的整数，和z是2-10的整数。
然而，要理解肽骨架结构并不限于以上确定的结构式，因此，可能有变化。
要理解有许多可结合到本公开的肽和锁环肽中的氨基酸类似物。例如，有许多可采用的D氨基酸或其它非-天然氨基酸。公开了天然存在的肽的相对的立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。通过化学合成或通过给tRNA分子添加选择的氨基酸和工程改造基因构建体(其利用例如，琥珀密码子将类似物氨基酸以位点特异性方式插入肽链)，这些氨基酸可容易地结合到多肽链中(Thorson等, Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991),Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba,Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill等,TIBS, 14(10): 400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba和Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)，至少对于氨基酸类似物相关的材料，其全部通过引用并入本文)。
肽骨架可包括因出现在锁环肽中或随锁环肽出现而受益的任何肽或氨基酸序列。例如，肽药物和治疗剂可以是肽骨架的部分或偶联于肽骨架。为此目的的有用的肽的实例包括但不限于FORTEO®、FUZEON®、BYETTA®、促肾上腺皮质激素释放激素(corticoliberin)、比伐卢定(bivalirudin)、亮丙立德(leuprolide)、肠促胰液素(secretin)、胸腺法新(thymalfasin)、舍莫瑞林(sermorelin)。
B. 锁环
在某些形式中，所述肽用赋予肽整体相对于另一个锁环接头降低的疏水性的接头或锁环，或其组合，进行锁环。优选地，生成的锁环肽具有β-OH内酰胺接头，其在结构上具有手性羟基官能团，是功能上亲水性的并可参与结合事件(见图1)。
要意识到交联部分(即接头或锁环)的数目不限于一个或两个，相反，所使用的交联部分的数目可在需要时随着靶向和/或效应结构域的长度而变化，并且与要生成的所需结构和活性相容。
在某些形式中，连键是N-末端至N-末端。在某些形式中，连键是C-末端至N-末端。在某些形式中，连键是C-末端至C-末端。在另外的其它形式中，连键可通过一个或两个肽的内部氨基酸。如将为本领域技术人员意识到的，连键通常以避免干扰肽的结合活性的这样一种方式定位。连键也可以避免干扰肽的锁环的这样一种方式定位。
有各种策略用于生成锁环螺旋肽。主要策略包括使用半胱氨酸侧链以供形成二硫桥和硫醚形成(图5D和5H)。其它方法包括闭环复分解；涉及硼化苯丙氨酸衍生物的官能化合成氨基酸的联芳基键；或“点击化学”，藉此叠氮化物和末端或内部炔之间的环加成产生1,2,3-三唑(图5C)。这些合成既昂贵又费力。所公开的策略和组合物提供超过先前的肽锁环技术的改进。
本文提供对疏水性烃接头的替代方案。例如，锁环或接头可包括醚、硫醚、酯、胺或酰胺部分的一种或多种。在一些情况下，天然存在的氨基酸侧链可结合到接头中。例如锁环或接头可与包含存在于丝氨酸上的手性羟基部分、半胱氨酸中的硫醇、赖氨酸中的伯胺、天冬氨酸或谷氨酸中的酸、或天冬酰胺或谷氨酰胺中的酰胺的官能团偶联。因此，有可能使用天然存在的氨基酸创建锁环，代替使用通过偶联两个非-天然存在的氨基酸制得的锁环。使用单一非-天然存在的氨基酸与天然存在的氨基酸，也是可能的。
在某些形式中，肽使用亲水性接头连接。一些研究已经揭示五肽中的Lys-Asp(KD)内酰胺接头赋予与烃接头、“点击”三唑接头、间-二甲苯硫醚接头、全氟苄基硫醚接头或烷基硫醚比较在水中更大的α-螺旋度。具有KD内酰胺接头的锁环肽的合成包括在i和i +4位置的赖氨酸侧链和天冬氨酸侧链之间的酰胺键形成。当其它赖氨酸或天冬氨酸/谷氨酸残基存在于肽序列中时，需要正交保护策略，这可使得合成相当费力。为解决这个问题，5-羟基赖氨酸(或其等价物)被用来替换赖氨酸，且化学选择性反应被用来合成K(OH)D内酰胺-型锁环肽，其合成可适应存在于肽序列中的侧链未保护的赖氨酸和天冬氨酸/谷氨酸残基(图2A)。优选地，K(OH)D内酰胺-型接头具有手性羟基，其增加肽的溶解性并且在一些情况下也促进参与结合事件。
在某些形式中，锁环可根据式(a)或(b)定义：
其中R是H或C1-C30烷基，X是-(CH2)a-和a是1-6的整数或X是-C(O)NH-，m是0-6的整数，和n是0-6的整数。
然而要理解，所述锁环或接头不限于上面确定的结构式，因此，可能有变化。
III. 药物组合物
本公开的锁环肽可被用来治疗有需要的受试者。为此目的，在药物组合物中配制锁环肽是有用的。这样的药物组合物包含一种或多种本公开的锁环肽和药学上可接受的赋形剂。
A. 赋形剂
本发明的药物制剂还可包含药学上可接受的赋形剂，本文所用的赋形剂包括任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等等，其适合于所需的特定剂型。Remington的TheScience and Practice of Pharmacy, 第21补充版, A. R. Gennaro, (Lippincott,Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂及其已知的制备技术。除非任何常规的赋形剂介质与一种物质或其衍生物不相容，如通过产生任何不合需要的生物学作用，或另外以有害的方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，它的使用预期在本发明的范围内。
在某些形式中，药学上可接受的赋形剂是至少95%、96%、97%、98%、99%或100%纯的。在某些形式中，赋形剂被批准用于人和兽医用途。在某些形式中，赋形剂被美国食品和药物管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在某些形式中，赋形剂具有药物级。在某些形式中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂，和/或油。这样的赋形剂可任选地包括在制剂中。赋形剂如可可酯和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和增香剂可根据配方设计师的判断而存在于组合物中。
示例性的稀释剂包括，但不限于，碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等等，及其组合。
示例性的造粒剂和/或分散剂包括，但不限于，马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘浆、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸铝镁(Veegum)、十二烷基硫酸钠、季铵化合物等等，及其组合。
示例性的表面活性剂和/或乳化剂包括，但不限于，天然乳化剂{如阿拉伯树胶、琼脂、海藻酸、藻酸钠、黄蓍胶、chondrux、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶体粘土{如膨润土[硅酸铝]和Veegum [硅酸铝镁])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇{如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三醋精单硬脂酸酯(triacetinmonostearate)、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆{如，羧基聚甲撑、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物{如，羧甲基纤维素钠、粉末纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨醇脂肪酸酯{如，聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯[吐温20]、聚氧乙烯脱水山梨醇[吐温60]、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯[吐温80]、脱水山梨醇单棕榈酸酯[司盘40]、脱水山梨醇单硬脂酸酯[司盘60]、脱水山梨醇三硬脂酸酯[司盘65]、甘油单油酸酯、脱水山梨醇单油酸酯[司盘80])、聚氧乙烯酯(如，聚氧乙烯单硬脂酸酯[Myrj 45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧亚甲基硬脂酸酯和Solutol)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(如，克列莫佛(Cremophor))、聚氧乙烯醚(如，聚氧乙烯月桂基醚[Brij30])、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、十二烷基硫酸钠、普流罗尼克F 68、泊洛沙姆188、西曲溴铵、西吡氯铵、苯扎氯铵、多库酯钠等等和/或其组合。
粘合剂的实例包括，但不限于，淀粉(如，玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、拉克替醇、甘露醇)；天然和合成的树胶(如，阿拉伯树胶、藻酸钠、爱尔兰藓提取物、panwar gum、印度树胶(ghatti gum)、isapol husks粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)、硅酸铝镁(Veegum)和落叶松阿拉伯半乳聚糖(larch arabogalactan))；藻酸盐；聚氧化乙烯；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇等等；及其组合。
示例性的防腐剂可包括抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂，和其它防腐剂。示例性的抗氧化剂包括，但不限于，α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、一硫代甘油、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和亚硫酸钠。示例性的螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和依地酸三钠。示例性的抗微生物防腐剂包括，但不限于，苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、溴硝丙二醇、西曲溴铵、西吡氯铵、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、对氯间二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和硫柳汞。示例性的抗真菌防腐剂包括，但不限于，对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和山梨酸。示例性的醇防腐剂包括，但不限于，乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚型化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和苯乙醇。示例性的酸性防腐剂包括，但不限于，维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和植酸。其它防腐剂包括，但不限于，生育酚、醋酸生育酚、deteroxime甲磺酸盐、西曲溴铵、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、乙二胺、十二烷基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏亚硫酸氢钾、Glydant Plus、Phenonip、对羟基苯甲酸甲酯、Germall 115、Germaben II、Neolone、Kathon和Euxyl。在某些形式中，防腐剂是抗氧化剂。在其它形式中，防腐剂是螯合剂。
示例性的缓冲剂包括，但不限于，柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢二钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇等等，及其组合。
示例性的润滑剂包括，但不限于，硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、甘油山嵛酸酯(glyceryl behanate)、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠等等，及其组合。
示例性的油包括，但不限于，杏仁(almond)、杏仁(apricot kernel)、鳄梨、巴巴苏(babassu)、香柠檬(bergamot)、黑加仑籽、琉璃苣、刺桧、甘菊、芥花、香菜、巴西棕榈(carnauba)、蓖麻、桂皮、可可脂、椰子、鳕鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、emu、桉树、月见草、鱼、亚麻籽、香叶醇、葫芦、葡萄籽、榛子坚果、牛膝草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴果、kukui坚果、杂熏衣草、薰衣草、柠檬、山苍子、澳洲坚果、锦葵、芒果籽、池花籽、貂、肉豆蔻、橄榄、橙、橙粗皮、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香、sasquana、香薄荷、沙棘、芝麻、牛油树脂、硅树脂、大豆、向日葵、茶树、蓟、tsubaki、香根草、核桃和麦芽油。示例性的油包括，但不限于，硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、肉豆蔻酸异丙基酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油及其组合。
用于口服和胃肠外施用的液体剂型包括，但不限于，药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分，液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是，棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，及其混合物。除了惰性稀释剂，口服组合物还可包括辅助剂如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和增香剂。在用于胃肠外施用的某些形式中，本发明的缀合物与增溶剂如克列莫佛、醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物及其组合混合。
注射制剂，例如，无菌注射水性或油性混悬剂可根据已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂配制。无菌注射制剂可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液剂、混悬剂或乳剂，例如，作为在1,3-丁二醇中的溶液剂。在可使用的可接受溶媒和溶剂中有水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何混合的固定油，包括合成的单或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸被用于制备注射剂。
注射制剂可例如，通过细菌-截留过滤器过滤，或通过将杀菌剂掺入可在使用前溶于或分散于无菌水或其它无菌可注射介质的无菌固体组合物的形式中灭菌。
为了延长药物的作用，减慢药物从皮下或肌内注射的吸收往往是合乎需要的。这可通过使用水溶性差的结晶或非结晶物质的液体混悬剂实现。药物的吸收速率则取决于其溶解的速率，其进而可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外施用的药物形式的延迟吸收通过使药物溶于或悬浮于油媒介中实现。
用于直肠或阴道施用的组合物通常为栓剂，其可通过混合本发明的缀合物与合适的非-刺激性赋形剂，如可可酯、聚乙二醇或栓剂蜡(其在环境温度下为固体，但在体温下为液体，因而在直肠或阴道腔内熔化并释放活性成分)制备。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性成分与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂如柠檬酸钠或磷酸氢二钙和/或以下物质混合：a) 填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b) 粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c) 湿润剂如甘油，d) 崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e) 溶解阻滞剂如石蜡，f) 吸收加速剂如季铵化合物，g) 湿润剂，例如，鲸蜡醇和甘油一硬脂酸酯，h) 吸收剂如高岭土和膨润土，和i) 润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可含有缓冲剂。
类似类型的固体组合物可用作在软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，所述胶囊使用赋形剂例如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等等。片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可用包衣和壳如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其它包衣料制备。它们可任选地包含遮光剂并可具有它们仅或优先在肠道的某一部分，任选地以延迟的方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物可用作在软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，所述胶囊使用赋形剂例如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等等。
活性成分可以呈具有一种或多种如上所述的赋形剂的微囊形式。片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可用包衣和壳如肠溶包衣、控释包衣和药物配制领域熟知的其它包衣料制备。在这样的固体剂型中，活性成分可与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。在通常实践中，这样的剂型可含有惰性稀释剂以外的额外物质，如压片润滑剂和其它压片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可含有缓冲剂。它们可任选地包含遮光剂并可具有它们仅或优先在肠道的某一部分，任选地以延迟的方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
局部和/或经皮施用本发明的缀合物的剂型可包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、散剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂和/或贴剂。一般地，活性组分在无菌条件下与药学上可接受的赋形剂和/或任何需要的防腐剂和/或缓冲剂(按可能需要的)混合。另外地，本发明设想使用经皮贴剂，其通常具有提供控制递送活性成分至身体的额外优点。这样的剂型可例如通过将活性成分溶解和/或分散在适当的介质中制备。可供选择地或另外地，速率可通过提供速率控制膜和/或通过将活性成分分散于聚合物基质和/或凝胶中控制。
本文描述的化合物、蛋白或肽(如，氨基酸，和未锁环、部分锁环和锁环肽和蛋白)可以特定的几何或立体异构形式存在。它们可具有一或多个手性中心，因而作为一种或多种立体异构体存在。本公开内容涵盖的这样的立体异构体可作为单一对映体、非对映体的混合物或外消旋混合物存在。本文所用的术语"立体异构体"指由具有相同键序但具有不同的三维原子排列(不可互换)的相同原子组成的化合物。三维结构被称为构型。在本公开内容中，所示的化学结构可在其中包含一个或多个波浪键，其表示在描述的每个手性中心的可能的所有对映体。本文所用的化学结构中所示的波浪键意欲描述通常用断续或楔状键描述的手性构型的任一个，和在含一个以上的波浪键的肽中可能的立体化学的任何组合被公开。本文所用的术语"对映体"指彼此为不能重叠的镜像的两个立体异构体。本文所用的术语"光学异构体"等同于术语"对映体"。本文所用的术语"非对映体"指不为镜像，且也不能重叠的两个立体异构体。术语"外消旋体"、"外消旋混合物"或"外消旋修饰"指相等部分的对映体的混合物。术语"手性中心"指4个不同的基团连接的碳原子。进行对映体对的分离所必需的适宜手性柱、洗脱剂和条件的选择是使用标准技术的本领域普通技术人员熟知的(见如Jacques, J.等, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley andSons, Inc. 1981)。本发明涵盖所有这样的化合物，包括顺式-和反式-异构体、R-和S-对映体、非对映体、(D)-和(L)-异构体，其外消旋混合物，及其其它混合物，它们落入本发明的范围内。
将意识到，本文描述的化合物，可用任何数目的取代基或官能部分取代。一般说来，术语"取代的"，无论在前面是否有术语"任选地"，和包含在本发明的结构式中的取代基，指给定结构中的氢基团用指定取代基的基团替换。当任何给定的结构中的一个以上的位置可用一个以上选自指定基团的取代基取代时，在每个位置的取代基可以是相同或不同的。本文所用的术语"取代的"预期包括用导致形成稳定部分的有机化合物的所有可允许的取代基、本文描述的任何取代基(例如，脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、thiooxo、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫羟基、卤代等等)及其任何组合(例如，脂族氨基、杂脂族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷基芳基、芳基烷基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷基氧基、杂烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、脂族硫氧基、杂脂族硫氧基、烷基硫氧基、杂烷基硫氧基、芳基硫氧基、杂芳基硫氧基、酰氧基等等)取代。本发明构思了任何和所有这样的组合以达到稳定的取代基/部分。一般可适用的取代基的另外的实例通过在本文描述的实施例中所示的特定形式举例说明。为了本发明的目的，杂原子如氮可具有氢取代基和/或如本文描述的任何合适的取代基，其满足杂原子的价位并导致形成稳定的部分。
IV. 制备方法
在某些形式中，锁环肽的合成首先包括选择氨基酸和氨基酸类似物的所需的序列和数目。本领域普通技术人员将认识到，选择的氨基酸结构(天然或非-天然)的数目、立体化学和类型将取决于要制备的肽的大小，特定氨基酸生成所需的结构基序(如，α-螺旋)的能力，和模拟有效地结合靶标或效应生物分子的蛋白结构域所需的任何特定基序。
一旦选择氨基酸，肽的合成可使用标准去保护和偶联反应实现。肽键形成和多肽合成是本领域技术人员熟知的技术，并涵盖固相和液相两种方法；一般见，Bodanszky和Bodanszky，The Practice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag, Berlin, 1984;Atherton和Sheppard，Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRLPress at Oxford University Press Oxford, England, 1989，和Stewart和Young,Solid phase Peptide Synthesis, 第2版, Pierce Chemical Company, Rockford,1984，其每一篇的全部内容通过引用并入本文。在液相和固相两种技术中，必须考虑保护基团的选择，以及要采用的特定偶联技术。对于液相和固相反应的肽合成技术的详细讨论，见Bioorganic chemistry: Peptides and Proteins, Hecht, Oxford University Press,New York: 1998，其全部内容通过引用并入本文。
本文描述的肽，其至少包含第一氨基酸(其中其用侧基如水杨醛酯侧基官能化)和第二氨基酸(其中其用1,2-羟胺侧链官能化)，可通过本领域技术人员已知的任何技术或通过此后开发的技术制备。例如，肽可使用固相合成技术(Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,15:2149-2154 (1963); M. Bodanszky等, (1976) Peptide Synthesis, John Wiley &Sons, 第2版；Kent和Clark-Lewis，Synthetic Peptides in Biology and Medicine, p.295-358, eds. Alitalo, K.,等Science Publishers, (Amsterdam, 1985)制备。也可采用通过溶液方法合成肽，如在The Proteins, Vol. II, 第3版, p. 105-237, Neurath,H.,等, Eds., Academic Press, New York, N.Y. (1976)中所述。合成的肽可通过制备型高效液相色谱或本领域可利用的其它可比较技术充分纯化。合成的肽的组成可通过用于氨基酸组成分析的任何技术证实。
在一些实施方案中，保护化学部分，如羟基可能是必要的。合适的羟基保护基团是本领域熟知的并包括在Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene和P.G. M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, 1999中详细描述的那些，其全文通过引用并入本文。合适的羟基保护基团包括甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫基甲基(MTM)、叔-丁硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对-甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔-丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基(POM)、硅氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴代四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯代-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二氧杂环己烷-2-基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯代乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟代乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基硒基)乙基、叔-丁基、烯丙基、对-氯代苯基、对-甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、对-甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻-硝基苄基、对-硝基苄基、对-卤代苄基、2,6-二氯苄基、对-氰基苄基、对-苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧化物、二苯基甲基、p,p'-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、a-萘基二苯基甲基、对-甲氧基苯基二苯基甲基、二(对-甲氧基苯基)苯基甲基、三(对-甲氧基苯基)甲基、4-(4'-溴代苯酰氧基苯基)二苯基甲基、4,4',4''-三(4,5-二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4,4',4''-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4',4''-三(苯甲酰氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4',4''-二甲氧基苯基)甲基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1'-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫戊环-2-基、苯并异噻唑基S,S-二氧化物、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基叔己基(thexyl)甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔-丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三-对-二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔-丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯代乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对-氯代苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫代乙缩醛)、特戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对-苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(mesitoate)、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基膦基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对-硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对-甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻-硝基苄基碳酸酯、烷基对-硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄硫基碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯、2-碘代苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰苯磺酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-双(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯代二苯基乙酸酯、异丁酸酯、一琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻-(甲氧羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N',N'-四甲基二氨基磷酸酯、烷基N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2,4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)、苄基磺酸酯和甲苯磺酸酯(Ts)。对于保护1,2-或1,3-二醇，保护基团包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔-丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2-三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、环亚戊基缩酮、环亚己基缩酮、环亚庚基缩酮、亚苄基缩醛、对-甲氧基亚苄基缩醛、2,4-二甲氧基亚苄基缩酮、3,4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1,2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(N,N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N,N'-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂环亚戊基原酸酯、二-叔-丁基亚甲硅烷基(DTBS)、1,3-(1,1,3,3-四异丙基二亚硅烷氧基)衍生物(TIPDS)、四-叔-丁氧基二硅氧烷-1,3-二亚基衍生物(TBDS)、环碳酸酯、环硼酸酯、硼酸乙酯和硼酸苯酯。
在某些形式中，该方法包括肽的液相合成。如上提及的液相合成是构建肽的熟知的技术。在肽合成的过程中，各种参数可以是变化的，包括，但不限于替换含末端不饱和侧链的氨基酸、氨基酸的立体化学、末端不饱和侧链长度和官能度，和所用的氨基酸残基。
优选地，本文公开的制备锁环肽的方法包括(1) 提供一种含有其中用水杨醛酯侧基官能化的第一氨基酸和其中用1,2-羟胺侧基官能化的第二氨基酸的肽；(2) 使第一和第二氨基酸反应生成N,O-亚苄基缩醛部分；和(3) 进行生成的N,O-亚苄基缩醛部分的酸解以生成锁环肽。
优选地，步骤(1)的肽根据式(III)或(IV)定义：
其中R是H或C1-C30烷基，X是-(CH2)a-和a是1-6的整数或X是-CONH-，m是0-6的整数，n是0-6的整数，[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸，x是2-10的整数，y是2-10的整数，和z是2-10的整数。
在某些形式中，在步骤(3)期间或之后，在酸解时形成的锁环根据式(a)或(b)定义：
其中R是H或C1-C30烷基，X是-(CH2)a-和a是1-6的整数或X是-C(O)NH-，m是0-6的整数，和n是0-6的整数。
在某些形式中，锁环肽具有根据式I或II的肽骨架和锁环：
其中[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸，x是2-10的整数，y是2-10的整数，和z是2-10的整数。
优选地，锁环螺旋肽具有以下结构之一：
。
然而，要理解所述锁环螺旋肽结构不限于以上鉴定的结构式，因此，可能会有变化。
不同的氨基酸具有形成不同二级结构的不同倾向。例如，甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)都具有特别高的α-螺旋形成倾向。相比之下，脯氨酸(P)和甘氨酸(G)是α-螺旋的破坏剂。
在某些形式中，一个或多个反应步骤还包括使用偶联试剂。示例性的偶联试剂包括，但不限于，苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)-磷鎓六氟代磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-磷鎓六氟代磷酸盐(PyBOP)、溴代-三-吡咯烷子基磷鎓六氟代磷酸盐(PyBroP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N,N'-羰基二咪唑(CDI)、3-(二乙氧基磷酰基氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、1-羟基-7-苯并三唑(HOBt)、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟代磷酸盐(HATU)、2-(6-氯代-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟代磷酸盐(HCTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟代磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、N,N,N',N'-四甲基-O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)脲鎓四氟硼酸盐(TDBTU)和O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU))。
在某些形式中，以上反应可能进一步需要合适的碱。合适的碱包括，但不限于，碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、四丁基氢氧化铵、苄基三甲基氢氧化铵、三乙基苄基氢氧化铵、1,1,3,3-四甲基胍、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、N-甲基吗啉、二异丙基乙基胺(DIPEA)、四甲基乙二胺(TMEDA)、吡啶(Py)、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)或三乙基胺(NEt3)。
在某些形式中，一个或多个反应步骤在合适的介质中进行。合适的介质是溶剂或溶剂混合物，其与结合反应伴侣和试剂组合，促进之间的反应进展。合适的溶剂可溶解一种或多种反应组分，或者，合适的溶剂可促进一种或多种反应组分的悬浮；一般地见，March'sAdvanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, M. B. Smith和J. March, 第5补充版, John Wiley & Sons, 2001，和Comprehensive OrganicTransformations, R. C. Larock, 第2补充版, John Wiley & Sons, 1999，其每一篇的全部内容通过引用并入本文。合适的溶剂包括醚、卤代烃、芳族溶剂、极性非质子溶剂或其混合物。在其它形式中，溶剂是乙醚、二氧杂环六烷、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、乙腈(ACN)、氯仿、甲苯、苯、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或其混合物。
在某些形式中，一个或多个反应步骤在合适的温度，例如在约0℃和约100℃之间执行。
在某些形式中，合成方法生成一种缝合产物作为优选的产物。本文所用的"优选的产物"指作为异构体混合物中的主要组成部分而存在的一种组成异构体。在某些形式中，"优选的产物"指作为异构体混合物中至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的组分存在的一种组成异构体。
在某些形式中，锁环肽使用基于分子内的连接方法合成。这种方法包括使C-末端水杨醛酯与1,2-羟胺基团反应生成步骤(2)的N,O-亚苄基缩醛中间体。随后酸解显露了连接位点的天然肽连键。酸解反应条件是本领域已知的，例如但不限于使用三氟乙酸(TFA)或氟化氢(HF)的溶液。在一些其它实施方案中，溶剂分解的其它方法，例如水解或醇解可被用来从N,O-亚苄基缩醛部分形成最终的锁环。
在某些形式中，5-羟基赖氨酸(HOLys)和水杨醛的天冬氨酸酯在i和i + 4位置被结合到肽中作为结构模块(见图2A)。或者，可使用含有1,2-羟胺基团的其它氨基酸代替HOLys。肽环化成侧链-侧链HOLys1-Asp5内酰胺可通过分子内Ser/Thr连接-样反应完成。
在其它形式中，肽可在i和i+7位置交联。为适应在i和i+7位置的交联所需的较长接头，Lys-Ser和Lys-5-HOLys结构模块被用来替换用于(i, i+4)锁环的5-羟基赖氨酸。相同连接化学适合于侧链-侧链内酰胺化(见图3A)。
在另外的其它形式中，可生成在i和i+2位置、i和i+3位置、i和i+5位置、i和i+6位置、i和i+8位置以及i和i+9位置交联的锁环肽。
通过在水中，于25℃测定锁环肽的远UV圆二色性(CD)谱，可检查锁环对肽二级结构的影响。一般地，K(OH)D内酰胺-型锁环肽与根据图5A-5H的一个或多个锁环的相同或类似的肽比较，表现出更高的亲水性和/或在水性溶液中更大的溶解性。
V. 使用方法
A. 条件
提供通过施用给经诊断罹患疾病、病症或病况或具有对疾病、病症或病况的易感性的受试者治疗有效量的锁环肽，治疗所述疾病、病症或病况的方法。如本文描述的锁环肽可例如，作为治疗剂或研究工具，用于这样的交联二级结构基序(特别是，交联的α-螺旋)是有利的任何地方。锁环肽可作为蛋白-蛋白、蛋白-配体，或蛋白-受体结合相互作用的调节剂发挥作用。在某些形式中，这些锁环肽可用于治疗贫血、哮喘、增生性疾病、糖尿病、神经学、自身免疫性疾病、免疫学、内分泌学、心血管、血液学和/或炎性疾病、病症和/或病况，以过早或不需要的细胞死亡为特征的病况，和由感染因子引起的病况。
本文所用的增生性疾病、病况或病症包括，但不限于癌症、造血肿瘤病症、增生性乳腺疾病、肺增生性病症、结肠增生性病症、肝增生性病症、糖尿病性视网膜病和卵巢增生性病症。
广泛种类的神经学疾病以特定神经元组的逐渐丧失为特征，抗凋亡肽可用于治疗这些病症。这样的病症包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、视网膜色素变性、脊柱肌肉萎缩和各种形式的小脑退化。这些疾病的细胞损失不诱导炎性反应，细胞凋亡似乎是细胞死亡的机制。此外，许多血液病与血细胞的产生减少有关。这些病症包括与慢性疾病、再生障碍性贫血、慢性中性粒细胞减少和骨髓增生异常综合征有关的贫血。血细胞产生的病症，如骨髓增生异常综合征和一些形式的再生障碍性贫血，与骨髓内增加的凋亡细胞死亡有关。这些病症可因促进细胞凋亡的基因激活、基质细胞或造血存活因子的获得性缺陷、或毒素和免疫反应介质的直接影响而发生。两种与细胞死亡有关的常见病症是心肌梗塞和中风。在两种病症中，在急性血流损失的事件中发生的缺血的中央区内的细胞，似乎因坏死而迅速死亡。然而，在中央缺血区以外，细胞在更长的时间内死亡，从形态上看，似乎是细胞凋亡导致死亡。在某些形式中，抗-细胞凋亡肽可被用来治疗与不需要的细胞死亡有关的所有此类病症。
可用本文描述的锁环肽治疗的神经学病症的一些实例包括但不限于阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、荷兰型遗传性脑出血淀粉样变性、活性淀粉样变性、伴有荨麻疹和耳聋的家族性淀粉样蛋白肾病、Muckle-Wells综合征、特发性骨髓瘤；巨球蛋白血症相关骨髓瘤、家族性淀粉样蛋白多神经病、家族性淀粉样蛋白心肌病、孤立性心脏淀粉样、系统性老年性淀粉样变性、成人发病性糖尿病、胰岛素瘤、孤立性心房淀粉样、甲状腺髓性癌，家族性淀粉样变性、遗传性脑出血伴淀粉样变性、家族性淀粉样变性多神经病、绵羊疯痒病、克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jacob disease)、Gerstmann Straussler-Scheinker综合征、牛海绵状脑炎、朊病毒-介导的疾病、亨廷顿氏病、皮克病、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、帕金森氏病和路易斯体病。
可用本文描述的锁环肽治疗的自身免疫性疾病的一些实例包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠道疾病、多发性硬化症和牛皮癣。
可用本文描述的肽治疗的免疫学病症的一些实例包括但不限于器官移植排斥反应、关节炎、狼疮、IBD、克罗恩氏病、哮喘、多发性硬化、糖尿病、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、牛皮癣、类风湿性关节炎等等。
可用本文描述的锁环螺旋肽治疗的内分泌病症的一些实例包括但不限于糖尿病、甲状腺功能减退、垂体机能减退、甲状旁腺功能减退、性腺机能减退、生育障碍等等。
可用本文公开的肽治疗或预防的心血管病症的实例包括，但不限于，动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、血栓形成、动脉瘤、心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛、心脏性猝死、高血压心脏病；非-冠状血管疾病，如小动脉硬化、小血管疾病、肾病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高脂血症、黄瘤病、哮喘、高血压、肺气肿和慢性肺病；或与介入手术有关的心血管病症("手术性血管创伤")，如血管成形术、放置分流器、支架、人造或自然切除移植物、留置导管、瓣膜或其它植入式设备后的再狭窄。
可用本文描述的锁环肽治疗的由感染因子所致的病况可以是皮肤感染、GI感染、尿道感染、生殖泌尿感染、系统感染或病毒性感染。在某些形式中，病毒性感染是HIV感染。在某些形式中，病毒性感染是RSV感染。
在某些形式中，锁环螺旋肽可被用来改变靶标的一种或多种特征。在某些形式中，靶标的特征以这样一种方式改变，即这种改变影响细胞命运和/或细胞行为。在某些形式中，因靶标的一种或多种特征的变化导致细胞命运或细胞行为的改变影响受试者，如哺乳动物，例如人的疾病状况。在某些形式中，锁环螺旋肽可被用来治疗疾病。在某些形式中，锁环螺旋肽可被用来在研究中探测或阐明生物学途径。探测生物学途径可在体外如在细胞或组织培养物中，或在体内如在动物，例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、鱼或灵长类动物中进行。
B. 剂量
本文描述的化合物的剂量或量大到足以在递药发生的方法中产生所需的作用。剂量不应大到引起不利的副作用，如不希望的交叉-反应、过敏反应等等。一般地，剂量将随着受试者的年龄、病况、性别和疾病程度而变化，并可由本领域技术人员确定。剂量可由各个医师基于涉及的受试者的临床病况调整。剂量、给药进度和施用途径可以变化。
所需的精确量将在不同的受试者之间变化，取决于受试者的物种、年龄和一般状况，特定蛋白、其施用模式、其作用模式等等。本发明的蛋白为便于施用和剂量均匀，优选地以剂量单位形式配制。然而，应该理解的是，本发明的蛋白和组合物的总日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内确定。对于任何特定患者或生物体的特定的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括要治疗的病症和病症的严重性；所用的特定蛋白的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用的特定化合物的施用次数、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所用的特定蛋白质联合或同时使用的药物等等医学领域熟知的因素。
在某些形式中，本发明的锁环肽可以每天足以递送从约0.001 mg/kg至约100 mg/kg、从约0.01 mg/kg至约50 mg/kg、从约0.1 mg/kg至约40 mg/kg、从约0.5 mg/kg至约30mg/kg、从约0.01 mg/kg至约10 mg/kg、从约0.1 mg/kg至约10 mg/kg，或从约1 mg/kg至约25 mg/kg受试者体重的剂量水平施用，每日一或多次，以获得所需的治疗作用。所需的剂量可以一日3次、一日2次、一日1次、每隔一天、每隔两天、每周、每两周、每三周或每四周递送。在某些形式中，所需的剂量可使用多次施用(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多次施用)递送。
C. 施用途径
本发明的药物组合物可经任何途径施用。在某些形式中，本发明的药物组合物以各种途径施用，包括口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、经皮、皮内、直肠、阴道内、腹膜内、局部(通过散剂、软膏剂、霜剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、肠内、舌下；经气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和/或作为口腔喷雾剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂。特别是，考虑的途径是全身性静脉内注射，经由血和/或淋巴供应的局部施用，和/或直接施用于受影响的部位。一般说来，最适宜的施用途径将取决于多种因素，包括药剂的性质(如，其在胃肠道环境中的稳定性)，受试者的状况(如，该受试者是否能耐受口服施用)等等。目前，口腔和/或鼻喷雾剂和/或气雾剂途径最常用来直接递送治疗剂至肺和/或呼吸系统。然而，考虑到药物递送科学的可能进步，本发明涵盖通过任何适宜途径递送药物组合物。
本公开的肽和药物组合物可施用于动物，优选哺乳动物(如，驯养动物、猫、狗、小鼠、大鼠)，且更优选人。
用于口服和胃肠外施用的液体剂型包括，但不限于，药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物，液体剂型还可含有本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，及其混合物。除了惰性稀释剂，口服组合物还可包括辅助剂如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和增香剂。在用于胃肠外施用的某些形式中，本发明的蛋白与增溶剂例如克列莫佛、醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物及其组合混合。
注射制剂，例如，无菌注射水性或油性混悬剂可根据已知技术，使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液剂、混悬剂或乳剂，例如，作为在1,3-丁二醇中的溶液剂。在可以使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油被常规地用作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何混合的固定油，包括合成的单或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸用于注射剂的制备。
注射制剂可例如，通过细菌截留过滤器过滤，或通过将杀菌剂掺入可在使用前溶于或分散于无菌水或其它无菌可注射介质的无菌固体组合物的形式中灭菌。
为了延长药物的作用，减慢自皮下或肌内注射的药物吸收往往是合乎需要的。这可通过使用水溶性差的结晶或非结晶物质的液体混悬液实现。药物的吸收速率则取决于其溶解的速率，后者进而可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外施用的药物形式的延迟吸收通过使药物溶于或悬浮于油媒介中实现。通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微囊基质，制备可注射的贮库形式。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，药物释放的速率可受控制。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。贮库注射制剂还通过使药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中制备。
还应意识到，本发明的蛋白和药物组合物可用于组合疗法，即是说，化合物和药物组合物可与一种或多种其它所需的治疗剂或医学程序同时、在其之前或之后施用。用于组合方案的疗法(治疗剂或程序)的特定组合将考虑所需的治疗剂和/或程序的相容性以及要实现的所需治疗效果。还应意识到，所用的疗法可对相同的病症实现所需的效果(例如，化合物可与另一种抗癌剂同时施用)，或它们可实现不同的效果(如，控制任何不利作用)。
在某些形式中，组合物可与切除肿瘤的手术组合施用。由于在对患者身体的其余部分有最小损害或没有损害的情况下完全除去肿瘤通常是癌症治疗的目标，通常执行手术以物理除去部分或全部肿瘤。如果手术不能完全除去肿瘤，可采用另外的疗法(如，化学疗法、辐射疗法、激素疗法、免疫疗法、补充或替代疗法)。
在某些形式中，组合物可与幅射疗法组合施用。辐射疗法(也称为放射疗法、X-线疗法或照射)是使用电离幅射杀死癌细胞和缩小肿瘤。幅射疗法可被用来治疗几乎任何类型的实体瘤，包括脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌或软组织肉瘤。辐射可被用来治疗白血病和淋巴瘤。幅射疗法可经由外部束放射疗法(EBRT)在外部施用，或经由近距离放射疗法在内部施用。通常地，幅射疗法的作用是局部的并被限制于要治疗的区域。幅射疗法通过损害要治疗区域(如靶器官、组织和/或细胞)的肿瘤细胞的遗传材料，损伤或破坏肿瘤细胞，防止肿瘤细胞生长和分裂。一般说来，幅射疗法试图损害尽可能多的肿瘤细胞，同时限制对附近健康组织的伤害。因此，通常以多个剂量施用，允许在各部分之间健康组织恢复。
在某些形式中，组合物可与免疫疗法组合施用。免疫疗法是使用对抗肿瘤的免疫机制，其可用于各种类型的癌症，如乳腺癌(如，曲妥珠单抗/HERCEPTIN®)、白血病(如，吉姆单抗奥唑米星/MYLOTARG®)和非-霍奇金淋巴瘤(如，利妥昔单抗/RITUXAN®)。在某些形式中，免疫治疗剂是针对所提及癌症细胞的特征性蛋白质的单克隆抗体。在某些形式中，免疫治疗剂是调节免疫系统反应的细胞因子。在某些形式中，免疫治疗剂可以是疫苗。
要理解，除非另外指明，本公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定的试剂，因而可能变化。还要理解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案的目的，并不打算进行限制。
实施例
实施例1：Ala-Arg-Arg-Asp(水杨醛酯)-Glu-Tyr-Leu-Lys(5-OH)-Ala-Ile-Gln锁环肽的合成
按照标准9H-芴-9-基-甲氧基羰基(Fmoc)固相肽合成方案，在Rink-amide树脂上合成线性肽Ala-Arg-Arg-Asp(水杨醛酯)-Glu-Tyr-Leu-Lys(5-OH)-Ala-Ile-Gln (SEQ ID NO:5)。简言之，3个当量的HATU、3个当量的氨基酸和6个当量的DIEA在DMF中被用于每个偶联反应。允许偶联反应进行40分钟。通过用20%哌啶/DMF (2×，各10 min)处理树脂-结合的肽实现Fmoc去保护。通过用含95% TFA和2.5%水的裂解合剂处理树脂1小时，从Rink amide树脂裂解肽。浓缩滤液。于室温下，使粗制肽以5 mM的估计浓度(基于树脂载荷)溶于在烧瓶中的吡啶/乙酸缓冲液(摩尔:摩尔，1:2)中1小时。浓缩溶液，然后用含95% TFA和2.5%水的合剂处理10 min。粗制产物通过制备型RP-HPLC纯化以得到i,i+4锁环肽(6 mg，35%，基于树脂载荷)。
实施例2：溶解性评价
为检查与通常使用的烃连接的锁环肽比较，这种锁环肽的溶解性性能，评价化合物1(Ala-Arg-Arg-S5-Glu-Tyr-Leu-S5-Ala-Ile-Gln (SEQ ID NO:10)和K(OH)D内酰胺-型锁环肽(2)的溶解性。烃连接的锁环肽具有非常差的水溶性，其导致对MAGUK GK结构域没有结合亲和力。K(OH)D内酰胺-型锁环肽显示出极好的溶解性，且根据ITC研究，与GK结构域的结合亲和力是5.9 μM。
实施例3：Asp(水杨醛酯)Ala-Ala-Ala-Lys(Ser)锁环肽的合成
按照标准9H-芴-9-基-甲氧基羰基(Fmoc)固相肽合成方案，在Rink-amide树脂上合成线性肽Asp(水杨醛酯)Ala-Ala-Ala-Lys(Ser) (SEQ ID NO:6)。简言之，3个当量的HATU、3个当量的氨基酸和6个当量的DIEA在DMF中被用于每个偶联反应。使偶联反应进行40分钟。通过用20%哌啶/DMF (2×，各10 min)处理树脂-结合的肽实现Fmoc去保护。通过用含95%TFA和2.5%水的裂解合剂处理树脂1小时，从Rink amide树脂裂解肽。浓缩滤液。于室温下，使粗制肽以5 mM的估计浓度(基于树脂载荷)溶于烧瓶中的吡啶/乙酸缓冲液(摩尔:摩尔，1:2)，持续1小时。浓缩溶液，然后用含95% TFA和2.5%水的合剂处理10 min。粗制产物通过制备型RP-HPLC纯化，得到i,i+4锁环肽(12 mg, 42%，基于树脂载荷)。
实施例4：Asp(水杨醛酯)Ala-Ala-Ala-Lys(5-OH)锁环肽的合成
按照标准9H-芴-9-基-甲氧基羰基(Fmoc)固相肽合成方案，在Rink-amide树脂上合成线性肽Asp(水杨醛酯)Ala-Ala-Ala-Lys(5-OH) (SEQ ID NO:7)。简言之，3个当量的HATU、3个当量的氨基酸和6个当量的DIEA在DMF中被用于每个偶联反应。使偶联反应进行40分钟。通过用20%哌啶/DMF (2×，各10 min)处理树脂-结合的肽实现Fmoc去保护。通过用含95%TFA和2.5%水的裂解合剂处理树脂1小时，从Rink amide树脂裂解肽。浓缩滤液。于室温下，使粗制肽以5 mM的估计浓度(基于树脂载荷)溶于烧瓶中的吡啶/乙酸缓冲液(摩尔:摩尔，1:2)，持续1小时。浓缩溶液，然后用含95% TFA和2.5%水的合剂处理10 min。粗制产物通过制备型RP-HPLC纯化，得到i,i+4锁环肽(5 mg, 30%，基于树脂载荷)。
实施例5：Gln-Ser-Gln-Gln-Thr-Phe-Asp(水杨醛酯)-Asn-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Lys(Ser)-Ala-Ala-Ala-Lys(Ser)-Gln-Asn锁环肽的合成
按照标准9H-芴-9-基-甲氧基羰基(Fmoc)固相肽合成方案，在Rink-amide树脂上合成线性肽Gln-Ser-Gln-Gln-Thr-Phe-Asp(水杨醛酯)-Asn-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Lys(Ser)-Ala-Ala-Ala-Lys(Ser)-Gln-Asn (SEQ ID NO:8)。简言之，3个当量的HATU、3个当量的氨基酸和6个当量的DIEA在DMF中被用于每个偶联反应。使偶联反应进行40分钟。通过用20%哌啶/DMF (2×，各10 min)处理树脂-结合的肽实现Fmoc去保护。通过用含95% TFA和2.5%水的裂解合剂处理树脂1小时，从Rink amide树脂裂解肽。浓缩滤液。于室温下，使粗制肽以5mM的估计浓度(基于树脂载荷)溶于烧瓶中的吡啶/乙酸缓冲液(摩尔:摩尔, 1:2)，持续1小时。浓缩溶液，然后用含95% TFA和2.5%水的合剂处理10 min。粗制产物通过制备型RP-HPLC纯化，得到i,i+7锁环肽(10 mg, 40%，基于树脂载荷)。
实施例6：Glu-Asn-Pro-Glu-Asp(水杨醛酯)-Ile-Leu-Asp-Lys(Ser)-His-Val-Gln-Arg-Val-Leu锁环肽的合成
按照标准9H-芴-9-基-甲氧基羰基(Fmoc)固相肽合成方案，在Rink-amide树脂上合成线性肽Glu-Asn-Pro-Glu-Asp(水杨醛酯)-Ile-Leu-Asp-Lys(Ser)-His-Val-Gln-Arg-Val-Leu (SEQ ID NO:9)。简言之，3个当量的HATU、3个当量的氨基酸和6个当量的DIEA在DMF中被用于每个偶联反应。使偶联反应进行40分钟。通过用20%哌啶/DMF (2×，各10 min)处理树脂-结合的肽实现Fmoc去保护。通过用含95% TFA和2.5%水的裂解合剂处理树脂1小时，从Rink amide树脂裂解肽。浓缩滤液。于室温下，使粗制肽以5 mM的估计浓度(基于树脂载荷)溶于烧瓶中的吡啶/乙酸缓冲液(摩尔:摩尔, 1:2)，持续1小时。浓缩溶液，然后用含95%TFA和2.5%水的合剂处理10 min。粗制产物通过制备型RP-HPLC纯化，得到i,i+4锁环肽(13mg, 45%，基于树脂载荷)。
本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规的实验确定，本文描述的特定形式的方法和组合物的许多等效方案。这样的等效方案意欲由以下权利要求书涵盖。

Claims (20)

1.一种锁环肽，其中所述锁环肽包含肽骨架和至少一个锁环，其中所述锁环肽根据式(I)或式(II)定义：
其中：
[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸；
x是2-10的整数；
y是2-10的整数；和
z是2-10的整数，
其中：
所述锁环根据式(a)或式(b)定义：
其中：
R是H或C1-C30烷基；
X是-(CH2)a-或-C(O)NH-，其中a是1-6的整数；
m是0-6的整数；和
n是0-6的整数。
2.权利要求1的锁环肽，其中所述锁环是亲水性的。
3.权利要求1的锁环肽，其中对于根据式(a)的锁环，R是H。
4.权利要求1的锁环肽，其中对于根据式(a)的锁环，X是-(CH2)a-。
5.权利要求1的锁环肽，其中对于根据式(a)的锁环，X是-C(O)NH-。
6.权利要求1的锁环肽，其中所述锁环肽具有螺旋结构。
7.权利要求1的锁环肽，其中所述锁环肽具有以下结构之一：
。
8.权利要求1的锁环肽，其中所述锁环肽是水溶性的。
9. 一种制备锁环肽的方法，该方法包括：
(a) 用水杨醛酯侧基官能化的第一氨基酸与用1,2-羟胺侧基官能化的第二氨基酸反应，生成N,O-亚苄基缩醛部分，其中第一氨基酸和第二氨基酸包含在肽中；和
(b) 进行生成的N,O-亚苄基缩醛部分的酸解以生成锁环肽。
10.权利要求9的方法，其中所述肽根据式(III)或(IV)定义：
其中：
R是H或C1-C30烷基；
X是-(CH2)a-或-C(O)NH-，其中a是1-6的整数；
m是0-6的整数：
n是0-6的整数：
[Xaa]是任何天然或合成的氨基酸；
x是2-10的整数；
y是2-10的整数；和
z是2-10的整数。
11.权利要求10的方法，其中对于根据式(III)或式(IV)的肽，R是H。
12.权利要求10的方法，其中对于根据式(III)或式(IV)的肽，X是-(CH2)a-。
13.权利要求10的方法，其中对于根据式(III)或式(IV)的肽，X是-C(O)NH-。
14.权利要求10的方法，其中所述锁环肽具有螺旋结构。
15.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1的锁环肽。
16.权利要求15的方法，其中所述受试者表现有病毒性感染。
17.权利要求16的方法，其中所述感染是HIV感染。
18.权利要求16的方法，其中所述感染是RSV感染。
19.权利要求16的方法，其中所述锁环肽干扰蛋白-蛋白相互作用。
20. 权利要求16的方法，其中(a) [Xaa]y包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列；或(b) 所述肽的线性序列包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
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