CN107850590A - 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途 - Google Patents

靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN107850590A
CN107850590A CN201680040650.6A CN201680040650A CN107850590A CN 107850590 A CN107850590 A CN 107850590A CN 201680040650 A CN201680040650 A CN 201680040650A CN 107850590 A CN107850590 A CN 107850590A
Authority
CN
China
Prior art keywords
contrast agent
albumen
albumen contrast
agent according
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680040650.6A
Other languages
English (en)
Inventor
詹妮·杰·杨
朴凡
薛胜辉
乔景娟
谭珊珊
马尼·赛拉睿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Georgia State University Research Foundation Inc
Original Assignee
Georgia State University Research Foundation Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Georgia State University Research Foundation Inc filed Critical Georgia State University Research Foundation Inc
Priority to CN202410395852.9A priority Critical patent/CN118576733A/zh
Publication of CN107850590A publication Critical patent/CN107850590A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/143—Peptides, e.g. proteins the protein being an albumin, e.g. HSA, BSA, ovalbumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A61K49/126—Linear polymers, e.g. dextran, inulin, PEG
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
    • C01G99/006—Compounds containing, besides a metal not provided for elsewhere in this subclass, two or more other elements other than oxygen or hydrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)

Abstract

本文提供了蛋白造影剂和靶向蛋白造影剂、其制剂和使用方法，包括但不限于作为磁共振成像造影剂。

Description

靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年5月11日提交的标题为“TARGETED PROTEIN CONTRASTAGENTS,METHODS OF MAKING,AND USES THEREOF”的共同待决的美国临时专利申请第62/159,685号的权益和优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
背景
磁共振成像(MRI)为一种用于研究和临床应用两者的强大和高度利用的成像技术。因此，存在对用于与MRI一起使用的改进的造影剂的需求。
概述
本文提供了蛋白造影剂，所述蛋白造影剂具有修饰的小清蛋白多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的小清蛋白多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的小清蛋白多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的小清蛋白多肽或其片段。修饰的小清蛋白多肽或其片段具有根据SEQ ID NO.10的序列。靶向部分选自以下的组：PSMA结合肽、V1肽或其变体、促胃液素释放肽、HER2特异性亲和体(affibody)、EGFR特异性亲和体、VEGFR结合肽、纤连蛋白、整联蛋白、胶原蛋白及其组合。靶向部分可以具有根据SEQ ID NO.:14-66中任一个的序列。靶向部分可以被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至修饰的小清蛋白多肽或其片段的C-末端、N-末端或C-末端和N-末端两者。靶向部分可以被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至修饰的小清蛋白多肽或其片段的C末端与N末端之间的一个或更多个氨基酸。蛋白造影剂还可以包含顺磁性离子，其中所述顺磁性离子与修饰的小清蛋白多肽或其片段的至少一个氨基酸直接结合。顺磁性离子可以是Gd3+。蛋白造影剂可以是PEG化的。蛋白造影剂的疏水性可以经由蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代来改变。蛋白造影剂的亲水性可以经由蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代来改变。修饰的小清蛋白多肽或其片段包含S56D和F103W突变或其结构等同物。
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物具有蛋白造影剂，所述蛋白造影剂具有修饰的小清蛋白多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的小清蛋白多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的小清蛋白多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的小清蛋白多肽或其片段。
本文还提供了将蛋白造影剂施用至受试者并且使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像的方法，所述蛋白造影剂具有修饰的小清蛋白多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的小清蛋白多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的小清蛋白多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的小清蛋白多肽或其片段。
本文还提供了蛋白造影剂，所述蛋白造影剂具有修饰的钙调蛋白多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段。修饰的钙调蛋白多肽或其片段具有根据SEQ ID NO.13的序列。靶向部分可以选自以下的组：PSMA结合肽、V1肽或其变体、促胃液素释放肽、HER2特异性亲和体、EGFR特异性亲和体、VEGFR结合肽、纤连蛋白、整联蛋白、胶原蛋白及其组合。靶向部分可以具有根据SEQ ID NO.:14-66中任一个的序列。靶向部分可以被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至修饰的钙调蛋白多肽或其片段的C-末端、N-末端或C-末端和N-末端两者。靶向部分可以被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至修饰的钙调蛋白多肽或其片段的C末端与N末端之间的一个或更多个氨基酸。蛋白造影剂还可以具有顺磁性离子，其中所述顺磁性离子与修饰的钙调蛋白多肽或其片段的至少一个氨基酸直接结合。顺磁性离子可以是Gd3+。蛋白造影剂可以是PEG化的。蛋白造影剂或其部分的疏水性可以经由蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代来改变。蛋白造影剂的亲水性经由蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代来改变。蛋白造影剂具有根据SEQ ID NO.:70的序列。
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物具有蛋白造影剂和药学上可接受的载体，所述蛋白造影剂具有修饰的钙调蛋白多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段。
本文还提供了将蛋白造影剂施用至受试者并且使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像的方法，所述蛋白造影剂具有修饰的钙调蛋白多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段。
本文还提供了蛋白造影剂，所述蛋白造影剂具有修饰的CD2多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的CD2多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的CD2多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的CD2多肽或其片段。修饰的CD2多肽或其片段可以具有根据SEQID NO.:1-3、7-9、或12中任一个的序列。靶向部分选自由以下组成的组：PSMA结合肽、V1肽或其变体、促胃液素释放肽、HER2特异性亲和体、EGFR特异性亲和体、VEGFR结合肽、纤连蛋白、整联蛋白、胶原蛋白及其组合。靶向部分可以具有根据SEQ ID NO.:14-66中任一个的序列。靶向部分可以被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至修饰的CD2多肽或其片段的C-末端、N-末端或C-末端和N-末端两者。靶向部分可以被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至修饰的CD2多肽或其片段的C末端与N末端之间的一个或更多个氨基酸。蛋白造影剂还可以具有顺磁性离子，其中所述顺磁性离子与修饰的CD2多肽或其片段的至少一个氨基酸直接结合。顺磁性离子可以是Gd3+。蛋白造影剂可以是PEG化的。蛋白造影剂或其部分的疏水性经由蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代来改变。蛋白造影剂的亲水性经由蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代来改变。与野生型D2的结构域1相比，修饰的CD2多肽或其片段包含N15E、D17N、L60D、T64D和K66D突变。蛋白造影剂可以具有根据SEQ ID NO.:1-3中任一个的序列。
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物包含蛋白造影剂和药学上可接受的载体，所述蛋白造影剂具有修饰的CD2多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的CD2多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的CD2多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的CD2多肽或其片段。
本文还提供了将蛋白造影剂施用至受试者并且使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像的方法，所述蛋白造影剂具有修饰的CD2多肽或其片段和靶向部分，其中所述修饰的CD2多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的CD2多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的CD2多肽或其片段。
附图简述
当结合附图回顾以下描述的本公开内容的多种实施方案的详细描述后，本公开内容的另外的方面将被容易地理解。
图1A和1B示出了具有与蛋白造影剂(ProCA)直接地(图1A)或间接地(图1B)连接的靶向部分的靶向蛋白造影剂的一些实施方案的示意图。
图2A和2B显示了ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的表达(图2A)和纯化(图2B)。
图3A和3B示出了显示ProCA32.562.PSMA(图3A)和ProCA32.564.PSMA(图3B)在pH7.2的10mM HEPES中由Bruker Minispec在60M Hz在约37℃的弛豫率测量(r1和r2)的图。
图4A-4D示出了显示使用Tb3+-DTPA缓冲液系统，ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的Tb3+结合亲和力的图。
图5A-5D示出了显示使用Tb3+竞争测定，ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的Gd3+结合亲和力的图。
图6显示了LNCaP和PC3细胞中的PSMA蛋白的表达。
图7示出了显示ProCA1.WP.PSMA与LNCaP细胞相互作用的荧光显微图像。
图8A-8B示出了显示ProCA32.562.PSMA(图8A)或ProCA32.564.PSMA(图8B)之间的探针相互作用的图，如通过各向异性(anisotropy)确定的。
图9示出了显示通过间接ELISA，LNCaP细胞裂解物中的ProCA32.wp.PSMA与ProCA32.564.PSMA之间的结合能力的比较的图。
图10示出了显示ProCA32.564.PSMA的靶向亲和力的图。
图11示出了显示ProCA32.562.PSMA、ProCA32.564.PSMA、和ProCA32.WP.PSMA的弛豫率和金属结合亲和力的概要的表。
图12A-12B示出了显示通过各向异性，ProCA32.564.PSMA(图12A)或ProCA32(图12B)与PSMA之间的相互作用的图。
图13A-13B示出了显示ProCA32.WP.PSMA的弛豫率(r1，图13A和r2，图13B)的图。
图14A-14B示出了显示使用希尔方程(Hill Equation)，ProCA32.564的Ca2+滴定的图。
图15A-15B示出了显示Fluozin-1和ProCA32.564对锌的竞争的图。
图16A-16B显示了ProCA32.WP Tb3+滴定的结果。
图17A-17B示出了显示使用希尔方程，ProCA32.WP的Ca2+滴定的结果的图(图17A)和表。
图18A-18B示出了显示ProCA32.WP的Ca2+滴定的图。
图19示出了显示Gd3+与Tb3+竞争ProCA32.WP的图。
图20A-20B显示了Tb3+和Gd3+对ProCA32.WP的竞争。
图21示出了显示Fluozin-1和ProCA32.564对锌的竞争的图。
图22A-22B显示了Fluozin-1和ProCA32.WP对锌的竞争。
图23示出了显示ProCA32.562的Ca2+滴定的图。
图24示出了显示ProCA32.562的EGTA滴定的图。
图25A-25B显示了使用希尔方程，ProCA32.562的Ca2+滴定的结果。平均Kd＝1.4X10-8M。
图26示出了显示Fluozin-1和ProCA32.562对锌的竞争的图。图27A-27B显示了Fluozin-1和ProCA32.562对锌的竞争。
图28示出了显示ProCA32.564的Ca2+滴定的图。
图29示出了显示ProCA32.564的EGDTA滴定的图。
图30A-30B显示了使用希尔方程，ProCA32.564的Ca2+滴定的结果。平均Kd＝1.7X10-8M。
图31示出了显示Fluozin-1和ProCA32.564对锌的竞争的图。
图32A-32B显示了Fluozin-1和ProCA32.564对锌的竞争。
图33示出了显示多种靶向蛋白造影剂的弛豫率和金属结合亲和力的概要的表。
图34示出了显示不同靶向蛋白造影剂对Ca2+的缔合常数的表。
图35示出了显示VEGFR结合肽的Kd值的表。
图36A-36B示出了显示Ga3+(图36A)和Tb3+(图36B)对ProCA32.VEGFR的结合亲和力的图。
图37示出了显示ProCA32.VEGFR在约37℃的弛豫率的图。
图38示出了使用ProCA32.VEGFR，血管的MRI造影成像。
图39A和39B示出了使用ProCA32.VEGFR2使肿瘤中的VEGFR2表达成像。
图40A-40B示出了显示肿瘤中VEGFR2表达的图，如通过使用ProCA32.VEGFR2成像测量的。
图41示出了显示多种V1和V1变体肽的表。
图42为显示CXCR4靶向ProCA的血清稳定性的蛋白凝胶的图像。
图43A-43B示出了显示Gd3+亲和力的图。
图44A-44B示出了显示ProCA32.V1.CXCR4的r1(图44A)和r2(图44B)弛豫率的图。
图45A-45B示出了显示体外由ProCA32.V1.CXCR4靶向CXCR4的荧光显微图像。
图46A-46D示出了显示DAPI复染(图46A)、ProCA32.CXCR4的荧光素复染(图46B)和CXCR4表达(图46C)的荧光显微图像。CXCR4的表达由针对CXCR4的第二山羊抗兔荧光标记的抗体生成的红色荧光表示。图46A-46C的合成图像示于图46D中。
图48示出了Mel290小鼠在ProCA32.CXCR4注射之后的梯度回波成像的结果。
图47A-47B显示了ProCA32.V1.CXCR4与CXCR4阳性细胞的结合，其中解离常数为1843nM。
图49示出了Mel290小鼠在ProCA32注射之后的梯度回波成像的结果。
图50A-50B示出了显示用ProCA32(图50A)或ProCA32.CXCR4(图50B)注射的小鼠中肿瘤的强度(SNR)增加百分比(梯度回波)的图和图像。
图51A-51B示出了用SKOV-3卵巢癌细胞向右侧卵巢皮下注射和原位注射之后小鼠中的肿瘤(图51A)和器官(图51B)的照片。
图52示出了SKOV3小鼠模型在ProCA32.V1.CXCR4注射之后的T1加权成像(梯度回波)的结果。
图53示出了SKOV3小鼠模型在ProCA32.V1.CXCR4注射之后的T2加权成像(梯度回波)的结果。
图54示出了显示在注射ProCA32.CXCR4之前(之前(pre))和之后，肿瘤转移至肝的强度增加百分比(快速自旋回波)的图。
图55示出了其中靶向部分为亲和体，特别是可以靶向HER2的亲和体的ProCA的一个实施方案的示意图。
图56A-56D示出了具有HER2阳性和阴性肿瘤的小鼠在注射靶向ProCA之后的快速自旋回波MRI图像，所述靶向ProCA包含可以结合HER2的亲和体。图56A示出了小鼠在注射HER-2靶向ProCA1之前的MRI图像。图56B示出了小鼠在注射HER-2靶向ProCA1之后3小时时的MRI图像。图56C示出了小鼠在注射HER-2靶向ProCA1之后24小时时的MRI图像。HER-2阳性肿瘤显示出增强得多的MRI信号。图56D示出了小鼠在注射HER-2靶向ProCA1之后52小时时的MRI图像。
图57A-57D示出了具有HER2阳性和阴性肿瘤的小鼠在注射靶向ProCA之后的梯度回波MRI图像，所述靶向ProCA包含可以结合HER2的亲和体。图57A示出了小鼠在注射HER-2靶向ProCA1之前的MRI图像。图57B示出了小鼠在注射HER-2靶向ProCA1之后3小时时的MRI图像。图57C示出了小鼠在注射HER-2靶向ProCA1之后24小时时的MRI图像。HER-2阳性肿瘤显示出增强得多的MRI信号。图57D.小鼠在注射HER-2靶向ProCA1之后52小时时的MRI图像。
图58A-58B示出了显示小鼠SKOV-3转移模型中HER2阳性和HER2阴性肿瘤中的信号强度的图。
图59示出了显示大鼠ProCA1表达的蛋白凝胶。白色框突出显示与GST融合的ProCA1的条带。大肠杆菌(E.coli)在IPTG诱导之前未表现出表达，并且在IPTG诱导1-4小时之后ProCA1的蛋白条带增加。可以在收获的细菌沉淀物(pellets)中检测到ProCA1条带。
图60示出了显示在不同时间点的大肠杆菌细菌生长曲线的图。红色环指示通过IPTG诱导ProCA1表达的时间点。
图61示出了显示大鼠ProCA1的纯化的凝胶的图像。
图62示出了显示通过FPLC纯化大鼠ProCA1的吸光度光谱。图62显示了通过配有SP柱的FPLC纯化大鼠ProCA1的步骤。
图63示出了显示纯化的大鼠ProCA1(rProCA1)具有11kDa正确分子量的质谱。
图64示出了显示大鼠ProCA1的纯化的UV光谱，如通过在280nm处的吸光度所显示的。
图65A-65D示出了显示小鼠在施用大鼠ProCA1-Affi之前及在之后不同时间点时的SKOV-3肿瘤中的HER2阳性和阴性肿瘤的成像的MRI扫描。
图66示出了显示小鼠在施用大鼠ProCA1-Affi之前及在之后不同时间点时的HER2阳性和阴性SKOV-3肿瘤的信号强度的图。
图67A-67D示出了显示小鼠在施用大鼠ProCA1-Affi之前及在之后不同时间点时的HER2阳性和阴性MFS-MB-231肿瘤的成像的MRI扫描。
图68示出了显示小鼠在施用大鼠ProCA1-Affi之前及在之后不同时间点时的HER2阳性和阴性MFS-MB-231肿瘤的信号强度的图。
图69示出了显示通过使用8M尿素解折叠纯化ProCA1的多种变体的蛋白凝胶的图像。在通过去垢剂洗涤之后，将细菌沉淀物溶解于8M尿素中。该溶液中的上清液(SP)和沉淀物(CP)通过离心分开。ProCA1.B14(B14)、ProCA1.B10(B10)和ProCA1.G10(G10)的分布通过SDS PAGE来可视化。框指示这些蛋白的条带。
图70示出了显示通过解折叠方法纯化的ProCA1的多种变体的蛋白凝胶的图像。
图71示出了显示纯化的ProCA1(7E15)和ProCA1.G10和ProCA1.B10变体的浓度的表。
图72示出了显示ProCA1变体在约25℃的弛豫率的图。
图73示出了显示ProCA1变体在约37℃的弛豫率的图。
图74示出了显示大鼠和人类ProCA32的r1弛豫率的图。
图75示出了显示大鼠和人类ProCA32的r2弛豫率的图。
图76示出了显示hCA32Zn2+结合滴定的图。
图77示出了显示hCA32-FluoZn-1竞争测定的结果的图。
图78示出了显示hCA32EGTATb3+滴定测定的结果的图。
图79示出了显示hCA32EGTA-Tb3+平均值的图。
图80示出了显示hCA32-Tb3+DTPA缓冲液系统的图。
图81示出了显示来自hProCA32:Gd3+-Tb3+竞争测定的结果的图。
图82示出了显示ProCA32和hCA32的多种金属结合亲和力的表。
图83示出了小鼠在施用hProCA32之前及之后的肝和肾的T1加权图像。
图84示出了小鼠在施用hProCA32之前及之后的肝和肾的T2加权图像。
图85A-85D示出了在注射hProCA32或大鼠ProCA32之前及之后的T1(图85C和85D)和T2(图85A和85B)加权的肝的SNR。
图86示出了人类CD2结构域1(SEQ ID NO.:1)和修饰的人类CD2结构域1(SEQ IDNO.:3)以及大鼠CD2结构域1(SEQ ID NO.:2)的序列，其包含突变以包括金属结合位点。加下划线的残基为突变的用于金属结合的那些残基。除了6个加下划线并加粗的氨基酸以外，58E和62N也可以有助于金属结合袋(binding pocket)。
图87A-87B示出了显示了在注射rProCA32.胶原蛋白之后的肿瘤增强的图像(图87A和87C-87H)和图(图87B)，其中在注射之后使用倒置恢复，T1和T2-加权序列在相对造影方面具有6倍增强(图87A-87B)，至肝的II期结节性转移性黑素瘤三色伴随相关的蓝色胶原蛋白斑块(图87C)，至肝的II期浸润性模式的黑素瘤转移(图87D)，(胶原蛋白以围绕黑素瘤岛的蓝色突出显示)，肝组织中被天狼猩红(picrosirius red)染色的胶原蛋白显示出具有不同胶原蛋白水平的不同的生长模式，通过胶原蛋白比例区域(CPA)显示(图87E和87F)，植入到肝中的葡萄膜黑素瘤(图87F)，以及具有rProCA32.胶原蛋白(红色)的肿瘤的肝组织的IHC染色显示造影剂在具有肿瘤的肝中的异质分布(图87F)。
图88A-88H显示在注射rProCA32.胶原蛋白之前及在之后(24小时)和在注射Eovist之前及在之后(30min)的纤维化和正常肝的R1图(图88A)，在注射rProCA32.胶原蛋白之前及在之后24小时的纤维化和正常肝的R1值(图88B)，在注射rProCA32.胶原蛋白之前及在之后(24小时)的和在注射Eovist之前及在之后(30min和24小时)的正常和纤维化肝的R1的增加比率百分比(图88C)，纤维化和正常肝的Eovist(在注射之后30min和24h)和rProCA32.胶原蛋白(在注射之后24小时)的ΔR1图88E。正常(图88D)和纤维化肝组织(图88F)的代表性天狼猩红组织学，以及纤维化肝组织用rProCA32.胶原蛋白和rProCA32(红色)以及I型胶原蛋白(绿色)连同细胞核(蓝色)的免疫荧光染色(图88G和88H)。
图89A-89B示出了显示ProCA32.胶原蛋白的注射剂量/克组织的图。
图90A-90F示出了显示通过ProCA32.CXCR4靶向的图像。
图91示出了显示ProCA32.CXCR4的组织分布的图。
详细说明
在更详细的描述本公开内容之前，应当理解该公开内容并不局限于描述的特定实施方案，并且当然本身可变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅为了描述特定的实施方案的目的并且不被意图是限制性的。
在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另外清楚地规定，该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限的单位的十分之一，和在该陈述的范围中的任何其他陈述的或中间的值被包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可独立地被包括于所述较小的范围，并且还被包括于本公开内容内，隶属于陈述的范围的任何特定的排除性限制。在陈述的范围包括上限和下限之一或两者的情况下，排除这些包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本公开内容的实践或测试中还可以使用与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文，其程度如同每一单独出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入本文，并且在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文以公开和描述与被引用的出版物有关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是为了其在提交日之前的公开内容，并且不应被理解为承认本发明由于之前的公开内容而无权先于此类出版物。此外，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立地确认。
如本领域技术人员阅读该公开内容之后将清楚的，本文描述并例证的个体实施方案中的每个具有离散的组成部分和特征，其可容易地与其他若干实施方案中的任一个的特征分开或组合而不偏离本公开内容的范围或精神。任何所提及的方法可以以事件提及的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。
除非另外指示，本公开内容的实施方案将采用分子生物学、微生物学、纳米技术、有机化学、生物化学、植物学等的技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中被充分地解释。
定义
如本文使用的，“对照”为用于比较目的的实验中使用的可选受试者或样品，并且被包括以最小化或区分除了独立变量以外的变量的影响。
如本文使用的，当与数值变量结合使用时，“约”、“大约”等通常指变量的值以及变量的在实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在指示值的+-10％内的所有值，以较大者为准。
如本文使用的，“有效量”为足以实现有益的或期望的结果的量。有效量可以以一个或更多个施用、应用或剂量来施用。
如本文使用的，“施用”可以指以下的施用：为口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、肠胃外、动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过导管、支架或经由植入的储存器(reservoir)或主动地或被动地(例如通过扩散)将组合物施用至血管周隙(perivascular space)和外膜(adventitia)的其他装置。例如，医学装置诸如支架可以包含被布置在其表面上的组合物或制剂，所述组合物或制剂然后可以溶解或以其他方式分布至周围组织和细胞。术语“肠胃外”可以包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。
如本文使用的，“预防”指在疾病或状况发生之前或当疾病或状况仍处于亚临床阶段时阻止或停止疾病或状况。
如本文使用的，“治疗性”可以指治疗或治愈疾病或状况。
如本文可互换使用的，“受试者”、“个体”或“患者”指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人类。哺乳动物包括，但不限于，鼠(murines)、猴(simians)、人类、农场动物、运动动物和宠物。术语“宠物”包括犬、猫、豚鼠、小鼠、大鼠、兔、雪貂(ferret)等。术语农场动物包括马、绵羊、山羊、鸡、猪、牛、驴、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、火鸡等。
如本文使用的术语“可操作地连接”或“可操作地偶联”可以指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个的功能受到另一个的调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时，其与该编码序列可操作地连接(即，该编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以以有义方向或反义方向可操作地连接至调节序列。在一个实例中，互补RNA区域可以直接地或间接地与靶mRNA在5'或与靶mRNA在3'或在靶mRNA内可操作地连接，或者第一互补区域与靶mRNA在5’且其互补序列与靶mRNA在3’。如本文使用的术语“可操作地连接”还可以指任何两个核酸序列在单个核酸片段上的直接或间接连接，使得它们在相同的核酸片段上被间接地或直接地物理连接。如本文使用的术语“可操作地连接”还可以指核酸在另一个核酸的5'和3'末端内的插入或者核酸与另一个核酸的5'或3'末端的直接偶联。术语“可操作地连接”等可以指一个或更多个功能性多肽单元(例如ProCA或靶向部分)与一个或更多个其他功能性多肽直接经由在两个或更多个功能性多肽之间的肽键的偶联。术语“可操作地连接”还可以指一个或更多个功能性多肽通过接头诸如肽接头的间接偶联。
如本文使用的，“特异性结合(specific binding)”、“特异性结合(specificallybind)”等指在可以通过共价或非共价相互作用或者共价和非共价相互作用的组合介导此类配对的物类(species)如酶/底物、受体/激动剂、抗体/抗原和凝集素/碳水化合物之间发生的结合。当两种物类的相互作用产生非共价地结合的复合物时，发生的结合通常为静电的、氢-键合或亲脂性相互作用的结果。因此，“特异性结合”在产生具有抗体/抗原或酶/底物相互作用特征的结合复合物的两者之间存在相互作用的配对物类之间发生。特别地，特异性结合的特征在于，一对成员中的一个成员与特定物类，而不与结合成员的对应成员所属的化合物家族内的其他物类的结合。因此，例如，抗体优选地与单个表位而不与蛋白家族内的其他表位结合。作为另一个非限制性实例，miRNA可以优选地特异性与miRNA靶而不与非特异性核酸序列结合，或者如果与非特异性核酸序列结合发生，则非特异性核酸序列的表达或功能的改变可以未被观察到或检测到。
如本文使用的，“多肽”或“蛋白”为氨基酸残基序列。这些序列从左至右以从氨基末端至羧基末端方向书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列通过如下指示的三字母或单字母代码命名：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、和缬氨酸(Val，V)。
如本文使用的，“基因”可以指对应于在染色体上占据特定位置并且包含生物体中的特征或性状的遗传指令的DNA序列的遗传单位。“基因”还指被转录为可以被翻译为多肽或者为催化性RNA分子(包括但不限于tRNA、siRNA、piRNA、miRNA、长非编码RNA和shRNA)的RNA转录物的特定DNA序列。
如本文使用的，“脱氧核糖核酸(DNA)”和“核糖核酸(RNA)”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。RNA可以呈非编码RNA的形式，诸如tRNA(转移RNA)、snRNA(核小RNA)、rRNA(核糖体RNA)、反义RNA、RNAi(RNA干扰构建体)、siRNA(短干扰RNA)、微小RNA(miRNA)或核酶、适体或者编码mRNA(信使RNA)。
如本文使用的，“核酸序列”和“寡核苷酸”还包括如本文别处定义的核酸和多核苷酸。
如本文使用的，“DNA分子”包括由DNA组成的核酸/多核苷酸。
如本文使用的，“核酸”和“多核苷酸”通常指至少两个碱基-糖-磷酸组合的串，并且除其他以外指单链DNA和双链DNA、为单链和双链区域的混合物的DNA、单链RNA和双链RNA、以及为单链和双链区域的混合物的RNA，包含可以是单链或更通常地是双链或单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，如本文使用的多核苷酸指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。此类区域中的链可以来自相同的分子或来自不同的分子。该区域可以包括一个或更多个分子的所有，但更通常地仅涉及一些分子的一个区域。三螺旋区域的分子中的一个通常为寡核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还包括多核苷酸的此类化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(除其他以外，包括简单细胞和复杂细胞)的特征性DNA和RNA的化学形式。例如，术语多核苷酸包括如以上描述的包含一个或更多个修饰的碱基的DNA或RNA。因此，包含不常见的碱基(诸如肌苷)或修饰的碱基(诸如三苯甲基化(tritylated)的碱基)(仅举两个实例)的DNA或RNA为如本文使用术语的多核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸的磷酸骨架的其他变体。天然核酸具有磷酸骨架，人工核酸可以包含其他类型的骨架，但包含相同的碱基。因此，具有为了稳定性或出于其他原因而修饰的骨架的DNA或RNA为如本文所期望术语的“核酸”或“多核苷酸”。
如本文使用的，“药学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、调味剂、着色剂和赋形剂”指可用于制备药物制剂的通常为安全的、无毒的且既非生物学上也非其他方面不希望的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、调味剂、着色剂或赋形剂，并且包括对于兽医使用以及人类药物使用是可接受的载体或赋形剂。
如本文使用的，术语“治疗”可以包括抑制疾病、紊乱或状况，例如，阻止其进展；和减轻疾病、紊乱或状况，例如，引起疾病、紊乱和/或状况的消退。治疗疾病、紊乱或状况可以包括改善特定疾病、紊乱或状况的至少一种症状，即使潜在病理生理学不受影响，诸如通过施用止痛剂来治疗受试者的疼痛，即使此类剂不治疗疼痛的起因。如本文使用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等可以指治疗性治疗和预防性或预防措施两者。需要治疗的那些包括已经患有紊乱的那些，以及其中紊乱待预防的那些。
如本文使用的，“表达”指多核苷酸藉以被转录为RNA转录物的过程。在mRNA和其他翻译的RNA物类的情况下，“表达”还指转录的RNA随后藉以被翻译为肽、多肽或蛋白的一个或更多个过程。
如本文提及DNA、cDNA、cRNA、RNA与蛋白/肽之间的关系使用的，“对应于”或“编码”可以指这些不同分子之间的潜在生物学关系。因此，本领域技术人员将理解，考虑到与其他分子具有类似的生物学关系的任何其他分子的序列，可操作地“对应于”可以指导他们确定这些分子的可能潜在的和/或所得的序列。例如，由DNA序列可以确定RNA序列，并且由RNA序列可以确定cDNA序列。
如本文使用的，“同一性”可以指两个或更多个多肽序列之间的关系，如通过比较序列确定的。在本领域中，“同一性”还指多肽之间的序列相关性程度，如通过此类序列的字符串之间的匹配来确定的。“同一性”可以通过已知的方法容易地计算，所述已知的方法包括但不限于以下中描述的那些：(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编著,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,编著,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编著,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编著,MStockton Press,New York,1991；以及Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J.AppliedMath.1988,48:1073。确定同一性的优选的方法被设计为提供测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法被编成公开可得的计算机程序。两个序列之间的同一性百分比可以通过使用分析软件来确定(例如，the Genetics Computer Group,Madison Wis.的序列分析软件包)，所述分析软件掺入Needelman和Wunsch，(J.Mol.Biol.,1970,48:443-453,)算法(例如，NBLAST、和XBLAST)。缺省参数用于确定本公开内容的多肽的同一性。
如本文使用的，术语“分子量”通常指材料的质量或平均质量。如果为聚合物或低聚物，分子量可以指本体聚合物(bulk polymer)的相对平均链长度或相对链质量。在实践中，聚合物和低聚物的分子量可以以多种方式来估计或表征，所述多种方式包括凝胶渗透色谱法(GPC)或毛细管测粘法。GPC分子量相对于数均分子量(Mn)被报告为重均分子量(Mw)。毛细管测粘法提供分子量估计，作为使用特定组的浓度、温度和溶剂条件由稀的聚合物溶液确定的比浓对数粘度(inherent viscosity)。
如本文使用的，术语“亲水性的”指具有与水容易地相互作用的强极性基团的物质。
如本文使用的术语“疏水性的”指对水缺乏亲和力；倾向于排斥且不吸水也不溶于水或与水混合的物质。
如本文使用的，术语“亲脂性的”指对脂质具有亲和力的化合物。
如本文使用的，术语“两亲性的”指组合亲水性和亲脂性(疏水性)特性的分子。
如本文可互换使用的术语“足够的”和“有效的”可以指达到一种或更多种期望结果所需的量(例如质量、体积、剂量、浓度和/或时间段)。例如，治疗有效量指达到一种或更多种治疗性作用所需的量。
如本文使用的，“活性剂”或“活性成分”可以指为生物学活性的或以其他方式对它被施用至的受试者诱导生物学或生理学作用的物质、化合物或分子。换言之，“活性剂”或“活性成分”指组合物的一个或更多个组分，该组合物的全部或部分作用归因于该组分。
如本文使用的，“生物体”、“宿主”和“受试者”可以指包含至少一个细胞的任何活的实体。活的生物体可以简单到例如单个分离的真核细胞或培养的细胞或细胞系，或者复杂到哺乳动物(包括人类)和动物(例如，脊椎动物、两栖动物、鱼类、哺乳动物，例如，猫、犬、马、猪、牛、绵羊、啮齿动物、兔、松鼠、熊、灵长类动物(例如，黑猩猩、大猩猩和人类)。“受试者”还可以是细胞、细胞群体、组织、器官或生物体，优选地人类及其组成部分。
如本文使用的，“患者”可以指需要诊断、预后、治疗和/或预防的生物体、宿主或受试者。
如本文使用的，“肽”可以指相对于蛋白或多肽为短的至少2个氨基酸的链。
如本文使用的，“蛋白造影剂(ProCA)”可以指包含顺磁性或超顺磁性结合位点的多肽，其中结合位点由多肽内的一个或更多个氨基酸组成。组成结合位点的一个或更多个氨基酸在多肽内可以是连续的或不连续的。
讨论
磁共振成像(MRI)为一种强大的成像技术，其使用磁场和无线电波创建身体的器官和组织的高分辨率图像。在操作中，由MRI机器产生的磁场重新排列体内的氢原子。无线电波引起对齐的原子产生非常微弱的信号，然后所述信号被用于创建横截面MRI图像。MRI机器也可以用于产生器官及其他组织的3-D图像。MRI提供了一种无创检查工具，广泛用于诊断多种问题，并且已被证明是医学领域的一个强大的研究工具。
MRI造影剂为可以被施用至受试者以当使用MRI时增加体内结构的可见度的化合物和组合物。大多数MRI造影剂通过缩短组织内质子的T1弛豫时间起作用，所述缩短是经由与造影剂的相互作用。常规造影剂为顺磁性金属，诸如钆(Gd)和锰(Mn)，或超顺磁性金属(氧化铁和铁铂(iron platinum))。尽管开发常规造影剂取得显著进展，能够以高灵敏度和特异性进行分子成像的MRI造影剂仍然难以市场化。
已经存在许多努力以通过将Gd-螯合物与纳米载体诸如树状聚合物、脂质体、纳米颗粒乳剂、病毒衣壳和纳米管共价连接来改进MRI造影剂的弛豫率。Gd螯合剂与蛋白(诸如MS-325)之间的非共价结合显示弛豫率增加。尽管如此，在使用蛋白残基作为配体起作用结合顺磁性或超顺磁性金属方面几乎未做出任何努力。
最近已经描述了基于蛋白的MRI造影剂(ProCA)(例如Xue等2013.InterdiscipRev Nanomed nanobiotechnol.5(2):163-179)。ProCA可以具有用于在MRI中使用的几种期望的能力，并且可以具有使受试者的疾病和紊乱成像的足够的灵敏度和特异性。ProCA可以表现出比常规造影剂高的弛豫率和剂量效率。尽管这些第一代ProCA具有用作造影剂的潜力，但对具有改进的弛豫率谱(relaxivity profiles)的ProCA仍存在需求。此外，在一些情况下，还希望蛋白造影剂靶向特定的组织或细胞，以便无创地提供关于受试者的另外的信息，诸如肿瘤类型。
如上所述(With that said)，本文描述了可以被配置为结合顺磁性金属的ProCA及其制剂。ProCA可以与靶向部分可操作地连接。本文还描述了在有相应需要的受试者中使用ProCA作为造影剂的方法。本公开内容的其他组合物、化合物、方法、特征和优势对于本领域普通技术人员在检查以下附图、详细描述和实施例后将会清楚或变得清楚。意图所有此类另外的组合物、化合物、方法、特征和优势被包括于该说明书中，并且在本公开内容的范围内。
基于蛋白的造影剂(ProCA)
本文描述的ProCA包括可以被配置为结合顺磁性或超顺磁性离子的多肽而不是小螯合剂。示例性顺磁性或超顺磁性离子包括，但不限于，Gd、Fe、Mn、Li、O、Na、Mg、Al、Mo、Sn、Ca、Co、Ni、Sr、Ru、Rh、Pd、Ba、Ce、Nd、Sm、Eu、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、W、Os、In和Pt的顺磁性或超顺磁性离子。合成蛋白可以被工程化以包含一个或更多个金属结合位点。工程化金属结合位点的此类方法可以如在以下中描述的：Yang等，(2008)JACS.130:92670-9267；Yang等，(2003)JACS.125:6165-6171；Ye等，(2005)JACS.127:3743-3750,Li等(2008)FEBS.275:5048-5061；Xue等，2014Medicinal Res.Rev.34:1070-1099；以及本文别处。ProCA可以被配置为使得它们以比生理离子诸如Ca或Zn大的亲和力结合顺磁性或超顺磁性离子。
ProCA可以用聚乙二醇(PEG)进一步修饰以改进生物相容性、血清稳定性、溶解度、循环时间、免疫原性(即降低免疫原性)、调节疏水性/亲水性和弛豫率(参见，例如，Li等，2012.J.Inorg.Biochem.107(1)111-118)。用于PEG化蛋白的技术将被本领域普通技术人员所理解。在实施方案中，ProCA可以使用分子量范围为从0.25kDa至30kDa的PEG进行PEG化。用于PEG化使用的PEG分子可以是直链、支链或两种类型的组合。PEG化可以在ProCA上的一个或更多个位点在ProCA的赖氨酸残基和/或Cys残基处发生。ProCA可以是包含一个或更多个EF-1手基序(hand motifs)的蛋白。在一些实施方案中，ProCA可以使用可以包含一个或更多个EF-1手结构域的金属蛋白来生成(参见，例如，Xue等2014.Med Res.Rev.34(5):1070-1099和Xue等2013.Interdiscip.Rev.Nanomed.Nanobiotechnol.2013.5(2):163-179)。在一些实施方案中，ProCA可以是基于钙调蛋白蛋白、小清蛋白蛋白、CD2蛋白或其任何片段。ProCA的非限制性示例多肽序列可以见于表1中。
ProCA的氨基酸残基可以被修饰以调节ProCA的疏水性/亲水性。ProCA可以使用亲水性修饰进行赖氨酸修饰。其他氨基酸可以被添加、缺失和/或取代以调节ProCA的亲水性/疏水性。在一些实施方案中，本文描述的ProCA(包括但不限于ProCA)可以被疏水性修饰。在一些实施方案中，ProCA的疏水性残基(包括但不限于，Val、Ile、Leu和Met)可以被改变、取代或以其他方式修饰以减少不希望的相互作用，改进溶解度、稳定性和/或维持单体或低聚物的状态。
ProCA1及其变体
ProCA可以是CD2蛋白或包括或基本上完全包含其片段(在本文也被称为ProCA1)。在一些实施方案中，ProCA可以是修饰的CD2蛋白或其片段，其中所述修饰可以是CD2的结构域1中的一个或更多个突变。在一些实施方案中，ProCA可以包含被修饰以结合顺磁性或超顺磁性离子的CD2蛋白的结构域1。在实施方案中，ProCA可以包含具有由一组羧基侧链(E15、D56、D58、D62和D64)形成的结合袋的CD2蛋白的突变的结构域1。该ProCA在本文也被称为ProCA1或ProCA1 7E15。与当前临床使用的造影剂诸如Gd-DTPA相比，ProCA1可以具有14-20倍改进的r1和r2弛豫率两者。
在一些实施方案中，ProCA可以是本文描述的ProCA的变体，包括但不限于ProCA1。ProCA1可以使用亲水性修饰进行赖氨酸修饰。其他氨基酸可以被添加、缺失和/或取代以调节ProCA1的亲水性/疏水性。在一些实施方案中，本文描述的ProCA(包括但不限于ProCA1)可以被疏水性修饰。在一些实施方案中，ProCA的疏水性残基(包括但不限于，Val、Ile、Leu和Met)可以被改变、取代或以其他方式修饰以减少不希望的相互作用，改进溶解度、稳定性和/或维持单体或低聚物的状态。ProCA中疏水性相互作用的改变可以通过缺失一个或更多个疏水性残基来修饰。ProCA中疏水性相互作用的改变可以通过将非疏水性残基插入到ProCA中来完成，使得ProCA的一个或更多个区域中的疏水性被改变。疏水性相互作用的改变也可以通过用非疏水性残基取代一个或更多个疏水性残基来完成。疏水性和非疏水性残基将被本领域普通技术人员所理解。在其中ProCA为ProCA1的实施方案中，几个残基可以形成二聚体(参见，例如，Pfuhl等，1999.J.Biomol.NMR 14(4):307-320；Davis等，1998.PNAS95(10):5490-5494；Evans等，2006.J.Biol.Chem.281(39):29309-29320)。
在其他实施方案中，ProCA1可以被突变以形成ProCA1的变体。在一些实施方案中，与ProCA1和/或当前临床使用的造影剂相比，变体可以具有增加的r1和/或r2弛豫率。在实施方案中，ProCA1变体可以包含在ProCA1的S52与A53之间的靶向部分和/或一个或更多个柔性肽接头(参见表1)。此类ProCA1变体的实施方案如下(序列中的斜体指示柔性肽接头，下划线指示靶向部分)。在其他实施方案中，ProCA1可以包括一个或更多个靶向部分，所述靶向部分被直接融合至ProCA1的C末端和/或N末端或在ProCA1的C末端和/或N末端经由柔性肽接头间接地连接。这些实施方案在下文更详细地讨论。
(ProCA1.B14)SEQ ID NO.：4：
MRDSGTVWGALGHGIELNIPNFQMTDDIDEVRWERGSTLVAEFKRKMKPFLKSGGSGGEQRLGNQWAVG HLMGGSGGAFEIDANGDLDIKNLTRDDSGTYNVTVYSTNGTRILNKALDLRILE
(ProCA1.B10)SEQ ID NO.：5：
MRDSGTVWGALGHGIELNIPNFQMTDDIDEVRWERGSTLVAEFKRKMKPFLKSGGSGGGNQWAVGHLMGGSGGAFEIDANGDLDIKNLTRDDSGTYNVTVYSTNGTRILNKALDLRILE
(ProCA1.G10)SEQ ID NO.：6：
MRDSGTVWGALGHGIELNIPNFQMTDDIDEVRWERGSTLVAEFKRKMKPFLKSGGSGGGNHWAVGHLMGGSGGAFEIDANGDLDIKNLTRDDSGTYNVTVYSTNGTRILNKALDLRILE
在实施方案中，ProCA1或其变体可以被PEG化(Li等(2012)J.Inorg.Biochem.107：111-118)。用于PEG化蛋白的技术将被本领域技术人员所理解。ProCA1或其变体可以用聚乙二醇(PEG)进一步修饰以改进生物相容性、血清稳定性、溶解度、循环时间、免疫原性(即降低免疫原性)、和弛豫率(参见，例如，Li等，2012.J.Inorg.Biochem.107(1)111-118)和/或ProCA1的疏水性和/或亲水性。用于PEG化蛋白的技术将被本领域普通技术人员所理解。在实施方案中，ProCA1或其变体可以使用分子量范围为从0.25kDa至30kDa的PEG进行PEG化。用于PEG化使用的PEG分子可以是直链、支链或两种类型的组合。PEG化可以在ProCA1或变体上的一个或更多个位点在ProCA1的赖氨酸残基和/或Cys残基处发生。
ProCA32及其变体
在其他实施方案中，ProCA可以是、包括或完全包含小清蛋白或其片段。(在本文也被称为ProCA32)。ProCA32可以在α-小清蛋白多肽中包含S56D和F103W突变。天然α-小清蛋白多肽序列通常是本领域已知的。例如，大鼠α-小清蛋白GenBank登录号为AAI26091.1，且人类α-小清蛋白GenBank登录号为CAA44792.1。在实施方案中，ProCA32可以被PEG化。PEG化蛋白的方法通常是本领域已知的，并且将被本领域普通技术人员立即理解。在实施方案中，ProCA32可以使用分子量范围为从0.5kDa至20kDa的PEG进行PEG化。在实施方案中，ProCA32或其变体可以被PEG化(Li等(2012)J.Inorg.Biochem.107:111-118)。用于PEG化蛋白的技术将被本领域技术人员所理解。ProCA32或其变体可以用聚乙二醇(PEG)进一步修饰以改进生物相容性、血清稳定性、溶解度、循环时间、免疫原性(即降低免疫原性)、和弛豫率(参见，例如，Li等，2012.J.Inorg.Biochem.107(1)111-118)和/或修饰ProCA32或其片段的疏水性和/或亲水性。用于PEG化蛋白的技术将被本领域普通技术人员所理解。在实施方案中，ProCA32或变体可以使用分子量范围为从0.25kDa至30kDa的PEG进行PEG化。用于PEG化使用的PEG分子可以是直链、支链或两种类型的组合。PEG化可以在ProCA32或变体上的一个或更多个位点在ProCA32的赖氨酸残基和/或Cys残基处发生。
ProCA2及其变体
在其他实施方案中，ProCA可以是、包括或完全包含钙调蛋白或其片段，诸如EF-1结构域。在一些实施方案中，钙调蛋白或其片段如表1中示出的。在一些实施方案中，钙调蛋白或其片段被修饰以结合顺磁性或超顺磁性离子。
ProCA2可以使用亲水性修饰进行赖氨酸修饰。其他氨基酸可以被添加、缺失和/或取代以调节ProCA2的亲水性/疏水性。在一些实施方案中，本文描述的ProCA(包括但不限于ProCA2)可以被疏水性修饰。在一些实施方案中，疏水性残基(包括但不限于，Val、Ile、Leu和Met)可以被改变、取代或以其他方式修饰以减少不希望的相互作用，改进溶解度、稳定性和/或维持单体或低聚物的状态。ProCA2中疏水性相互作用的改变可以通过缺失一个或更多个疏水性残基来修饰。ProCA2中疏水性相互作用的改变可以通过将非疏水性残基插入到ProCA2中来完成，使得ProCA2的一个或更多个区域中的疏水性被改变。疏水性相互作用的改变也可以通过用非疏水性残基取代一个或更多个疏水性残基来完成。疏水性和非疏水性残基将被本领域普通技术人员所理解。
ProCA2中，诸如钙调蛋白蛋白的中央螺旋区域中的疏水性相互作用的改变可以通过缺失一个或更多个疏水性残基来修饰。ProCA2中，诸如钙调蛋白蛋白的中央螺旋区域中疏水性相互作用的改变可以通过将非疏水性残基插入到ProCA2中来完成，使得ProCA2的一个或更多个区域中的疏水性被改变。疏水性相互作用的改变也可以通过用非疏水性残基取代一个或更多个疏水性残基来完成。疏水性和非疏水性残基将被本领域普通技术人员所理解。
在实施方案中，ProCA2可以被PEG化。PEG化蛋白的方法通常是本领域已知的，并且将被本领域普通技术人员立即理解。在实施方案中，ProCA2可以使用分子量范围为从0.5kDa至20kDa的PEG进行PEG化。在实施方案中，ProCA2或其变体可以被PEG化(Li等(2012)J.Inorg.Biochem.107:111-118)。用于PEG化蛋白的技术将被本领域技术人员所理解。ProCA2或其变体可以用聚乙二醇(PEG)进一步修饰以改进生物相容性、血清稳定性、溶解度、循环时间、免疫原性(即降低免疫原性)、和弛豫率(参见，例如，Li等，2012.J.Inorg.Biochem.107(1)111-118)和/或修饰ProCA2或其片段的疏水性和/或亲水性。用于PEG化蛋白的技术将被本领域普通技术人员所理解。在实施方案中，ProCA2或变体可以使用分子量范围为从0.25kDa至30kDa的PEG进行PEG化。用于PEG化使用的PEG分子可以是直链、支链或两种类型的组合。PEG化可以在ProCA2或变体上的一个或更多个位点在ProCA2的赖氨酸残基和/或Cys残基处发生。
靶向ProCA
ProCA可以被修饰，使得它可以靶向特定的细胞或组织。例如，ProCA多肽可以包含改变该多肽或其区域的疏水性和/或亲水性的氨基酸残基缺失、添加或修饰。
在其他实施方案中，ProCA(包括但不限于ProCA1、ProCA32及其变体)还可以包含直接与ProCA的N-末端和/或C-末端融合的肽或多肽靶向部分。(参见，例如，图1A)在一些实施方案中，ProCA还可以包含可以被插入在ProCA的任何两个氨基酸之间的肽或多肽靶向部分和/或一个或更多个柔性肽接头，使得ProCA仍然可以结合金属。在一些实施方案中，肽或多肽靶向部分和/或一个或更多个柔性接头可以被插入在ProCA骨架中的S52与A53之间或等同位置。合适的靶向部分可以包括但不限于：PSMA结合肽(可以靶向PSMA)、V1肽或其变体(可以靶向CXCR4)、促胃液素释放肽(GRP)、铃蟾肽(例如14个氨基酸铃蟾肽和10个氨基酸铃蟾肽)、亲和体(包括，但不限于，HER2和EGFR特异性亲和体)、VEGFR结合肽(靶向VEGFR)、胶原蛋白、整联蛋白、纤连蛋白及其组合。
在另外的实施方案中，ProCA可以在其N-末端和/或C-末端与靶向部分经由合适的接头间接地连接(参见，例如，图1B)。接头可以是柔性的。接头可以是可逆的。接头可以是肽或多肽。非限制性接头示于表3中。
ProCA制剂
本文还提供了药物制剂，所述药物制剂包含一定量的如本文描述的ProCA和/或靶向ProCA。该量可以是有效量。药物制剂可以被配制用于经由多种途径递送，并且可以包含药学上可接受的载体。技术和制剂通常可以见于Remmington's PharmaceuticalSciences,Meade Publishing Co.,Easton,Pa.(第20版，2000)，其的整体公开内容通过引用并入本文。对于全身施用，注射是有用的，包括肌内、静脉内、腹膜内和皮下。对于注射，本发明的治疗性组合物可以在液体溶液中，例如在生理学上相容的缓冲液诸如Hank氏溶液或林格氏溶液中来配制。另外，治疗性组合物可以以固体形式配制并在使用之前立即重新溶解或悬浮。冻干形式也被包括。本发明的药物组合物的特征在于至少无菌且无热原。这些药物制剂包括用于人类和兽医使用的制剂。
合适的药学上可接受的载体包括，但不限于，水、盐溶液、醇类、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘稠的石蜡、芳香油(perfume oil)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮，它们不会与活性组分有害地反应。
药物制剂可以被灭菌且如果期望的话，可与辅助剂相混合，所述辅助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味物质和/或芳香物质等，其不与活性组分有害地反应。
药物制剂可以被施用至有相应需要的受试者。有相应需要的受试者可能患有疾病、紊乱或其症状，或疑似患有疾病、紊乱或其症状。示例疾病或紊乱可以包括但不限于，心血管疾病、肺部疾病、脑部疾病、肾疾病、肝疾病、血液疾病、神经系统疾病、肠疾病、眼部疾病、和癌症。药物制剂可以被布置于医学装置上，或者以其他方式偶联至医学装置或与医学装置整合，所述医学装置诸如但不限于，导管或支架，使得药物制剂在一定时间段内从医学装置洗脱。因此，药物制剂可以在程序诸如血管成形术、静脉抽引(vein draft)或器官移植期间和/或之后递送至有相应需要的受试者。其中此类医学装置将是有用的其他程序将被本领域技术人员所理解。
药物制剂可以被配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用使用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂诸如氯化钠或右旋糖(dextrose)。pH可以用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠来调节。胃肠外制剂可以包封在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。本文描述的构建体、生物学分子及其药物制剂可以被布置在医学装置上或者以其他方式与医学装置整合或偶联至医学装置，所述医学装置诸如，但不限于，导管或支架，使得构建体、生物学分子可以在插入或植入到有相应需要的受试者中之后在一定时间段内释放至周围局部区域或全身地释放。这些也可以被称为药物洗脱医学装置。
适于可注射使用的药物制剂可以包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌的可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体可以包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EMTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可注射药物制剂可以是无菌的，并且可以是流动的至存在易于注射性的程度。可注射药物制剂在制造和储存条件下可以是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、药学上可接受的多元醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如，通过使用包衣诸如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持要求的粒径和通过使用表面活性剂来维持。通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠可以是有用的。可注射组合物的延长吸收可以通过掺入延迟吸收的剂例如单硬脂酸铝和明胶引起。
无菌可注射溶液可以通过以下来制备：将如本文描述的组合物或重组多肽的任一种根据需要以一定量与本文列举的成分中的一种或组合一起掺入适当的溶剂中，随后过滤灭菌。通常，分散体可以通过将核酸载体掺入到无菌赋形物中来制备，所述无菌赋形物包含基本分散介质和所需的来自本文列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，有用的制备方法的实例为真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分的粉末。
全身施用也可以是通过经粘膜或透皮手段。对于经粘膜或透皮施用，可以在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如，对于经粘膜施用，去垢剂、胆盐和流体酸(fluidic acid)衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾或栓剂来完成。对于透皮，本文描述的组合物或重组多肽可以被配制为如本领域通常已知的软膏、油膏(salves)、凝胶或乳膏。在一些实施方案中，组合物或重组多肽可以经由透皮递送系统来施加，所述透皮递送系统可以缓慢地释放组合物或重组多肽用于经皮吸收。渗透增强剂可以用于促进活性因子在条件介质中的透皮渗透。透皮贴剂在以下中被描述：例如，美国专利第5,407,713号；美国专利第5,352,456号；美国专利第5,332,213号；美国专利第5,336,168号；美国专利第5,290,561号；美国专利第5,254,346号；美国专利第5,164,189号；美国专利第5,163,899号；美国专利第5,088,977号；美国专利第5,087,240号；美国专利第5,008,110号；以及美国专利第4,921,475号。
本文描述的组合物或重组多肽的施用不限于单一途径，而是可以包括通过多种途径施用。例如，通过多种途径的示例性施用，除其他以外，包括皮内和肌内施用、或皮内和皮下施用的组合。多种施用可以是顺序的或同时的。通过多种途径的其他应用模式对本领域技术人员将是明显的。
药物制剂可以通过允许剂在体内对受试者发挥其作用的任何合适方法施用至受试者。例如，本文描述的制剂或其他组合物可以通过已知的程序施用至受试者，所述已知的程序包括但不限于，通过口服施用、舌下或含服施用、肠胃外施用、经皮施用，经由吸入、经由鼻递送、经阴道、经直肠和经肌内。本文描述的制剂或其他组合物可以通过筋膜(epifascial)、囊内、皮内、皮下、透皮、鞘内、肌内、腹膜内、胸骨内、血管内、静脉内、实质性(parenchymatous)和/或舌下递送来肠胃外施用。递送可以通过注射、输注、导管递送或一些其他手段，诸如通过片剂或喷雾。
对于口服施用，如本文描述的制剂可以被呈现为胶囊、片剂、粉末、颗粒或作为悬浮液或溶液。制剂可以包含常规添加剂，诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉、粘合剂、结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、崩解剂、马铃薯淀粉、羧甲基纤维素钠、磷酸氢钙、羟基乙酸淀粉钠、润滑剂和/硬脂酸镁。
对于胃肠外施用(即，通过除了消化道以外的途径施用)，本文描述的制剂可以与与受试者的血液等渗的无菌水性溶液组合。此类制剂可以通过以下来制备：将活性成分溶解于包含生理学上相容物质诸如氯化钠、甘氨酸等并具有与生理学条件相容的缓冲pH的水中以产生水性溶液，然后使溶液无菌。制剂可以呈现于单位或多剂量容器中，诸如密封的安瓿瓶或小瓶。制剂可以通过注射、输注或本领域已知的其他手段来递送。
对于透皮施用，本文描述的制剂可以与皮肤渗透增强剂，诸如丙二醇、聚乙二醇、异丙醇、乙醇、油酸、N-甲基吡咯烷酮等组合，这增加皮肤对本发明的核酸载体的渗透性并允许核酸载体渗透通过皮肤并进入血流。本文描述的制剂和/或组合物还可以与聚合物质诸如乙基纤维素、羟丙基纤维素、乙烯/乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮等组合，以提供凝胶形式的组合物，其可以溶解于溶剂诸如二氯甲烷，蒸发至所期望的粘度，并且然后应用于衬垫材料以提供贴剂。
剂型
本文描述的药物制剂或组合物可以以单位剂型提供，诸如片剂、胶囊或单剂量注射或输注小瓶。在适当的情况下，本文描述的剂型可以被微胶囊化。剂型也可以被制备为延长或维持任何成分的释放。在一些实施方案中，复合的活性剂可以是其释放被延迟的成分。在其他实施方案中，辅助成分的释放被延迟。用于延迟成分释放的合适方法包括但不限于，将成分包衣或包埋于聚合物、蜡、凝胶等的材料中。延迟释放剂量制剂可以如标准参考文献中描述进行制备，标准参考文献诸如“Pharmaceutical dosage form tablets,”编著Liberman等(New York,Marcel Dekker,Inc.,1989)，“Remington–The science andpractice of pharmacy”，第20版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000,以及“Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems”,第6版,Ansel等,(Media,PA:Williams和Wilkins,1995)。这些参考文献提供了关于用于制备片剂和胶囊以及片剂和丸剂(pellets)、胶囊和颗粒的延迟释放剂型的赋形剂、材料、设备和方法的信息。延迟释放可以是从约1小时至约3个月或更长的任何时间。
包衣可以用不同比率的水溶性聚合物、水不溶性聚合物和/或pH依赖性聚合物(具有或不具有水不溶性/水溶性非聚合物赋形剂)形成，以产生所期望的释放谱。包衣对剂型(基质或简单)进行，所述剂型包括，但不限于，片剂(用或不用包衣珠压制)、胶囊(有或没有包衣珠)、珠、颗粒组合物，“成分原态”配制为，但不限于，悬浮液形式或为喷洒剂型。
合适的包衣材料的实例包括但不限于，纤维素聚合物，诸如邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、和乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯；聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及以商品名(Roth Pharma,Westerstadt,Germany)商购可得的甲基丙烯酸树脂、玉米醇溶蛋白、虫胶和多糖。
在一些实施方案中，诸如对于处理植物，本文描述的组合物或药物制剂的局部制剂还可以被配制为喷雾，并且可以包括合适的表面活性剂、湿润剂、佐剂/表面活性剂(粘着剂(stickers)、增量剂、植物渗透剂、相容剂、缓冲液、漂移控制添加剂(drift controladditives)和消泡剂)或其任何组合以配制为喷雾。化合物、任何任选的辅助活性成分、合适的表面活性剂、湿润剂、佐剂或其任何组合可以被配制为溶液、悬浮液或乳液。喷雾剂型可以通过喷雾装置施用。在一些实施方案中，喷雾装置可以被构造为当液体溶液与复合的活性剂化合物或其制剂接触时生成可喷雾制剂。在其他实施方案中，可喷雾剂型在喷雾之前预制。因此，喷雾装置可以仅充当这些实施方案的施加器(applicator)。
在另外的实施方案中，诸如对于处理植物(例如诸如除草剂)，本文描述的组合物或药物制剂的剂型还可以被配制为粉剂(dust)，并且可以包含合适的干燥惰性载体(例如滑石粉、粘土、坚果壳、火山灰或其任何组合)，以便被配制为粉剂。粉剂可以包含不同大小的粉尘颗粒。在一些实施方案中，粒径可以是基本上同质的。在其他实施方案中，粒径可以是异质的。适合作为粉剂的剂型可以包含一种或更多种佐剂/表面活性剂(粘着剂、增量剂、植物渗透剂、相容剂、缓冲液、漂移控制添加剂和消泡剂)。
在一些实施方案中，剂型可以被配制为诱饵(bait)。在这些实施方案中，复合的活性剂化合物或其的其他制剂还可以被配制为包含食物或可以吸引一种或更多种昆虫或其他害虫的其他有吸引力的物质。诱饵剂型可以被配制为粉剂、糊剂、凝胶或颗粒。适合作为诱饵的剂型可以包含一种或更多种佐剂/表面活性剂(粘着剂、增量剂、植物渗透剂、相容剂、缓冲液、漂移控制添加剂和消泡剂)。
在另外的实施方案中，剂型可以被配制为可以施加至环境的颗粒或丸剂。这些剂量制剂类似于粉剂制剂，但颗粒更大更重。颗粒可以应用于土壤或其他环境区域。适合作为颗粒或丸剂的剂型可以包含一种或更多种佐剂/表面活性剂(粘着剂、增量剂、植物渗透剂、相容剂、缓冲液、漂移控制添加剂和消泡剂)。
本文描述的粉剂、颗粒和丸剂可以被配制为可湿性粉剂、颗粒和丸剂，可溶性粉剂、颗粒和丸剂，和/或水可分散性颗粒和/或干燥的可流动剂。
剂型可以适于浸渍(浸透)物体或装置，然后该物体或装置可被携带、穿戴或以其他方式偶联至有相应需要的生物体。在一些实施方案中，剂型可以被浸渍到衣领、手镯、贴剂、胶带、家畜耳标(livestock ear tags)、衣服、毯子、塑料、网和油漆上。组合物或其药物制剂可以被配制和浸渍于物体或装置中，使得组合物或药物制剂随时间蒸发，这将组合物和/或药物制剂释放到生物体周围的空气和/或环境中和/或释放到生物体上。
剂型可以适合作为熏蒸剂，熏蒸剂为在利用或应用时形成气体的制剂。在一些实施方案中，组合物和/或其药物制剂可以作为在压力下包装的液体供应，并且当它们被释放时变为气体。在其他实施方案中，组合物和/或其药物制剂可以当封闭于容器中(不在压力下)时作为挥发性液体供应。其他可以被配制为当在高湿度条件下或高水蒸汽的存在下施加时释放气体的固体。适合作为熏蒸剂的剂型可以包含一种或更多种佐剂/表面活性剂(粘着剂、增量剂、植物渗透剂、相容剂、缓冲液、漂移控制添加剂和消泡剂)。
有效量
药物制剂可以包含有效量的本文描述的ProCA和/或靶向ProCA和/或有效量的辅助剂。在一些实施方案中，有效量范围为本文描述的组合物的从约0.001pg至约1,000g或更多。在一些实施方案中，本文描述的组合物的有效量范围可以从约0.001mg/kg体重至约1,000mg/kg体重。在又其他实施方案中，组合物的有效量范围可以为总药物制剂的从约1％w/w至约99％或更多w/w、w/v、或v/v。本文描述的ProCA的有效量范围可以从约0.5μM至20mM。本文描述的ProCA的有效量范围可以从约0.5umol/kg至约0.3mmol/kg。
组合疗法
本文描述的药物制剂或其他组合物可以作为单一剂或与一种或更多种其他剂组合施用至受试者。另外的剂包括但不限于DNA、RNA、氨基酸、肽、多肽、抗体、适体、核酶、抑制必需肿瘤蛋白和基因的翻译或转录的核酶的指导序列、激素、免疫调节剂、解热药(antipyretics)、抗焦虑药、抗精神病药、镇痛药、解痉药、抗炎药、抗组胺药、抗感染药和化学治疗剂。
合适的解热药包括但不限于，非甾体抗炎药(例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、酮洛芬(ketoprofen)和尼美舒利(nimesulide))、阿司匹林及相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、扑热息痛(paracetamol)/对乙酰氨基酚(acetaminophen)、安乃近(metamizole)、萘丁美酮(nabumetone)、安替比林(phenazone)和奎宁(quinine)。
合适的抗焦虑药包括但不限于，苯二氮卓类(benzodiazepines)(例如阿普唑仑(alprazolam)、溴西泮(bromazepam)、氯氮卓(chlordiazepoxide)、氯硝西泮(clonazepam)、氯拉卓酸(clorazepate)、地西泮(diazepam)、氟西泮(flurazepam)、劳拉西泮(lorazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、替马西泮(temazepam)、三唑仑(triazolam)、和托非索泮(tofisopam))、5-羟色胺能抗抑郁药(例如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、三环类抗抑郁药、和单胺氧化酶抑制剂)、mebicar、afobazole、selank、bromantane、emoxypine、阿扎哌隆(azapirones)、巴比妥酸盐(barbituates)、羟嗪(hydroxyzine)、普瑞巴林(pregabalin)、伐力多(validol)、和β阻断剂。
合适的抗精神病药包括但不限于，苯哌利多(benperidol)、溴哌利多(bromoperidol)、氟哌利多(droperidol)、氟哌啶醇(haloperidol)、莫哌隆(moperone)、匹泮哌隆(pipamperone)、替米哌隆(timiperone)、氟司必林(fluspirilene)、五氟利多(penfluridol)、匹莫齐特(pimozide)、乙酰丙嗪(acepromazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、氰美马嗪(cyamemazine)、dizyrazine、氟奋乃静(fluphenazine)、左美丙嗪(levomepromazine)、美索达嗪(mesoridazine)、培拉嗪(perazine)、哌氰嗪(pericyazine)、奋乃静(perphenazine)、哌泊噻嗪(pipotiazine)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、普马嗪(promazine)、异丙嗪(promethazine)、丙硫喷地(prothipendyl)、硫丙拉嗪(thioproperazine)、硫利达嗪(thioridazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、三氟丙嗪(triflupromazine)、氯普噻吨(chlorprothixene)、氯哌噻吨(clopenthixol)、氟哌噻吨(flupentixol)、替沃噻吨(tiotixene)、珠氯噻醇(zuclopenthixol)、氯噻平(clotiapine)、洛沙平(loxapine)、丙硫喷地(prothipendyl)、卡匹帕明(carpipramine)、氯卡帕明(clocapramine)、吗茚酮(molindone)、莫沙帕明(mosapramine)、舒必利(sulpiride)、维拉必利(veralipride)、氨磺必利(amisulpride)、阿莫沙平(amoxapine)、阿立哌唑(aripiprazole)、阿塞那平(asenapine)、氯氮平(clozapine)、布南色林(blonanserin)、伊潘立酮(iloperidone)、鲁拉西酮(lurasidone)、美哌隆(melperone)、奈莫必利(nemonapride)、奥氮平(olanzapine)、帕潘立酮(paliperidone)、哌罗匹隆(perospirone)、喹硫平(quetiapine)、瑞莫必利(remoxipride)、利培酮(risperidone)、舍吲哚(sertindole)、曲米帕明(trimipramine)、齐拉西酮(ziprasidone)、佐替平(zotepine)、alstonie、比氟诺西(bifeprunox)、bitopertin、依匹哌唑(brexpiprazole)、大麻二醇(cannabidiol)、卡利拉嗪(cariprazine)、匹莫范色林(pimavanserin)、pomaglumetad methionil、戊卡色林(vabicaserin)、呫诺美林(xanomeline)、和zicronapine。
合适的镇痛药包括但不限于，扑热息痛(paracetamol)/对乙酰氨基酚(acetaminophen)、非甾体抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔(rofecoxib)、塞来考昔(celecoxib)、和依托考昔(etoricoxib))、阿片样物质(例如吗啡、可待因、羟考酮(oxycodone)、氢可酮(hydrocodone)、双氢吗啡、哌替啶(pethidine)、丁丙诺啡(buprenorphine))、曲马多(tramadol)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、氟吡丁(flupirtine)、奈福泮(nefopam)、奥芬那君(orphenadrine)、普瑞巴林、加巴喷丁(gabapentin)、环苯扎林(cyclobenzaprine)、东莨菪碱(scopolamine)、美沙酮(methadone)、凯托米酮(ketobemidone)、哌腈米特(piritramide)、和阿司匹林及相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)。
合适的解痉药包括但不限于，美贝维林(mebeverine)、罂粟碱(papaverine)、环苯扎林(cyclobenzaprine)、卡立普多(carisoprodol)、奥芬那君(orphenadrine)、替扎尼定(tizanidine)、美他沙酮(metaxalone)、美索巴莫(methocarbamol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、巴氯芬(baclofen)、丹曲林(dantrolene)、巴氯芬(baclofen)、替扎尼定(tizanidine)、和丹曲林(dantrolene)。
合适的抗炎药包括但不限于，泼尼松(prednisone)、非甾体抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔、和依托考昔)和免疫选择性抗炎衍生物(例如下颌下腺肽-T及其衍生物)。
合适的抗组胺剂包括但不限于，H1-受体拮抗剂(例如阿伐斯汀(acrivastine)、氮卓斯汀(azelastine)、比拉斯汀(bilastine)、溴苯那敏(brompheniramine)、布克力嗪(buclizine)、溴苯海拉明(bromodiphenhydramine)、卡比沙明(carbinoxamine)、西替利嗪(cetirizine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、赛克利嗪(cyclizine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、克立马丁(clemastine)、赛庚啶(cyproheptadine)、地氯雷他定(desloratadine)、右溴苯那敏(dexbrompheniramine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、二甲茚定(dimetindene)、苯海拉明(diphenhydramine)、多西拉敏(doxylamine)、依巴斯汀(ebastine)、恩布拉敏(embramine)、非索非那定(fexofenadine)、羟嗪(hydroxyzine)、左西替利嗪(levocetirizine)、氯雷他定(loratadine)、美克洛嗪(meclozine)、米氮平(mirtazapine)、奥洛他定(olopatadine)、奥芬那君(orphenadrine)、苯茚胺(phenindamine)、非尼拉敏(pheniramine)、苯托沙敏(phenyltoloxamine)、异丙嗪(promethazine)、美吡拉敏(pyrilamine)、喹硫平(quetiapine)、卢帕他定(rupatadine)、曲吡那敏(tripelennamine)、和曲普利啶(triprolidine))、H2-受体拮抗剂(例如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁(famotidine)、拉呋替丁(lafutidine)、尼扎替丁(nizatidine)、雷尼替丁(ranitidine)、和罗沙替丁(roxatidine))、曲托喹啉(tritoqualine)、儿茶素(catechin)、色甘酸盐(cromoglicate)、奈多罗米(nedocromil)、和β2-肾上腺素能激动剂。
合适的抗感染药包括但不限于，抗阿米巴药(amebicides)(例如硝唑尼特(nitazoxanide)、巴龙霉素(paromomycin)、甲硝唑(metronidazole)、替硝唑(tinidazole)、氯喹(chloroquine)、和双碘喹啉(iodoquinol))、氨基糖甙类(例如巴龙霉素、妥布霉素(tobramycin)、庆大霉素(gentamicin)、阿米卡星(amikacin)、卡那霉素、和新霉素(neomycin))、驱肠虫药(anthelmintics)(例如噻嘧啶(pyrantel)、甲苯达唑(mebendazole)、伊维菌素(ivermectin)、吡喹酮(praziquantel)、阿苯达唑(albendazole)、米替福新(miltefosine)、噻苯达唑(thiabendazole)、奥沙尼喹(oxamniquine))、抗真菌药(例如(氮唑类抗真菌药(例如伊曲康唑(itraconazole)、氟康唑(fluconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、酮康唑(ketoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、咪康唑(miconazole)、和伏立康唑(voriconazole))、棘白菌素类(echinocandins)(例如卡泊芬净(caspofungin)、阿尼芬净(anidulafungin)、和米卡芬净(micafungin))、灰黄霉素(griseofulvin)、特比萘芬(terbinafine)、氟胞嘧啶(flucytosine)、和多烯类(polyenes)(例如制霉菌素(nystatin)、和两性霉素b(amphotericin b))、抗疟剂(例如(乙胺嘧啶(pyrimethamine)/磺胺多辛(sulfadoxine)、蒿甲醚(artemether)/苯芴醇(lumefantrine)、阿托伐醌(atovaquone)/氯胍(proguanil)、(奎宁、羟化氯喹(hydroxychloroquine)、甲氟喹(mefloquine)、氯喹、多西环素(doxycycline)、乙胺嘧啶、和卤泛群(halofantrine))、抗结核剂(例如(氨基水杨酸类(aminosalicylates)(例如氨基水杨酸(aminosalicylic acid))、异烟肼(isoniazid)/利福平(rifampin)、(异烟肼/吡嗪酰胺(pyrazinamide)/利福平)、贝达喹啉(bedaquiline)、异烟肼、乙胺丁醇(ethambutol)、利福平、利福布丁(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)、卷曲霉素(capreomycin)、和环丝氨酸(cycloserine))、抗病毒药(antivirals)(例如金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、阿巴卡韦(abacavir)/拉米夫定(lamivudine)、恩曲他滨(emtricitabine)/泰诺福韦(tenofovir)、可比西他(cobicistat)/埃替格韦(elvitegravir)/恩曲他滨(emtricitabine)/泰诺福韦(tenofovir)、依法韦仑(efavirenz)/恩曲他滨/泰诺福韦、阿巴卡韦(abacavir)/拉米夫定/齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定/齐多夫定、恩曲他滨/泰诺福韦、恩曲他滨/洛匹那韦(lopinavir)/利托那韦(ritonavir)/泰诺福韦、干扰素α-2v/利巴韦林(ribavirin)、聚乙二醇干扰素α-2b(peginterferon alfa-2b)、马拉维若(maraviroc)、拉替拉韦(raltegravir)、度鲁特韦(dolutegravir)、恩夫韦地(enfuvirtide)、膦甲酸钠(foscarnet)、福米韦生(fomivirsen)、奥司他韦(oseltamivir)、扎那米韦(zanamivir)、奈韦拉平(nevirapine)、依法韦仑(efavirenz)、依曲韦林(etravirine)、利匹韦林(rilpivirine)、地拉韦啶(delavirdine)、奈韦拉平、恩替卡韦(entecavir)、拉米夫定、阿德福韦(adefovir)、索菲布韦(sofosbuvir)、地达诺新(didanosine)、替诺福韦(tenofovir)、avacivr、齐多夫定(zidovudine)、司他夫定(stavudine)、恩曲他滨、扎西他滨(zalcitabine)、替比夫定(telbivudine)、司美匹韦(simeprevir)、博赛泼维(boceprevir)、特拉匹韦(telaprevir)、洛匹那韦(lopinavir)/利托那韦、福沙那韦(fosamprenavir)、地瑞那韦(darunavir)、利托那韦、替拉那韦(tipranavir)、阿扎那韦(atazanavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)、茚地那韦(indinavir)、沙奎那韦(saquinavir)、利巴韦林、伐昔洛韦(valacyclovir)、阿昔洛韦(acyclovir)、泛昔洛韦(famciclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、和缬更昔洛韦(valganciclovir))、碳青霉烯类(carbapenems)(例如多尼培南(doripenem)、美罗培南(meropenem)、厄他培南(ertapenem)、和西司他丁(cilastatin)/亚胺培南(imipenem))、头孢菌素类(cephalosporins)(例如头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢拉定(cephradine)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢吡肟(cefepime)、头孢洛林(ceftaroline)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢替坦(cefotetan)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢丙烯(cefprozil)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢地尼(cefdinir)、头孢克肟(cefixime)、头孢托仑(cefditoren)、头孢唑肟(ceftizoxime)、和头孢他啶(ceftazidime))、糖肽类抗生素(例如万古霉素(vancomycin)、达巴万星(dalbavancin)、奥利万星(oritavancin)、和替拉万星(telavancin))、甘氨环素类(例如替加环素(tigecycline))、抗麻风病药(例如氯法齐明(clofazimine)和沙利度胺(thalidomide))、林可霉素(lincomycin)及其衍生物(例如克林霉素(clindamycin)和林可霉素(lincomycin))、大环内酯类及其衍生物(例如泰利霉素(telithromycin)、非达霉素(fidaxomicin)、红霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、和醋竹桃霉素(troleandomycin))、利奈唑胺(linezolid)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)/甲氧苄啶(trimethoprim)、利福昔明(rifaximin)、氯霉素(chloramphenicol)、磷霉素(fosfomycin)、甲硝唑(metronidazole)、氨曲南(aztreonam)、杆菌肽(bacitracin)、青霉素类(penicillins)(阿莫西林(amoxicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)、巴氨西林(bacampicillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、阿莫西林(amoxicillin)/克拉维酸(clavulanate)、氨苄青霉素(ampicillin)/舒巴坦(sulbactam)、哌拉西林(piperacillin)/三唑巴坦(tazobactam)、克拉维酸/替卡西林、青霉素、普鲁卡因青霉素(procaine penicillin)、苯唑西林(oxacillin)、双氯青霉素(dicloxacillin)、和萘夫西林(nafcillin))、喹诺酮类(quinolones)(例如洛美沙星(lomefloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、西诺沙星(cinoxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、依诺沙星(enoxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、和司帕沙星(sparfloxacin))、磺胺类(sulfonamides)(例如磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、和磺胺异噁唑(sulfisoxazole))、四环素类(tetracyclines)(例如多西环素(doxycycline)、地美环素(demeclocycline)、米诺环素(minocycline)、多西环素/水杨酸、多西环素/ω-3多不饱和脂肪酸、和四环素(tetracycline))、和泌尿道抗感染药(例如呋喃妥因(nitrofurantoin)、乌洛托品(methenamine)、磷霉素、西诺沙星、萘啶酸、甲氧苄啶、和亚甲蓝(methylene blue))。
合适的化学治疗剂包括但不限于，紫杉醇(paclitaxel)、布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、多柔比星(doxorubicin)、5-FU(氟尿嘧啶)、依维莫司(everolimus)、培美曲塞(pemetrexed)、美法仑(melphalan)、帕米磷酸二钠(pamidronate)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、奈拉滨(nelarabine)、奥法木单抗(ofatumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝利司他(belinostat)、托西莫单抗(tositumomab)、卡莫司汀(carmustine)、博来霉素(bleomycin)、博舒替尼(bosutinib)、白消安(busulfan)、阿仑单抗(alemtuzumab)、伊立替康(irinotecan)、凡德他尼(vandetanib)、比卡鲁胺(bicalutamide)、洛莫司汀(lomustine)、道诺霉素(daunorubicin)、氯法拉滨(clofarabine)、卡博替尼(cabozantinib)、更生霉素(dactinomycin)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、阿糖胞苷(cytarabine)、癌得星(cytoxan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、地西他滨(decitabine)、地塞米松(dexamethasone)、多西他赛(docetaxel)、羟基脲(hydroxyurea)、氨烯咪胺(decarbazine)、亮丙瑞林(leuprolide)、表柔比星(epirubicin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、天冬酰胺酶(asparaginase)、雌莫司汀(estramustine)、西妥昔单抗(cetuximab)、维莫德吉(vismodegib)、菊欧文菌天冬酰胺酶(asparaginase erwinia chrysanthemi)、氨磷汀(amifostine)、依托泊苷(etoposide)、氟他胺(flutamide)、托瑞米芬(toremifene)、氟维司群(fulvestrant)、来曲唑(letrozole)、地加瑞克(degarelix)、普拉曲沙(pralatrexate)、氨甲蝶呤(methotrexate)、氟尿苷(floxuridine)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、吉西他滨(gemcitabine)、阿法替尼(afatinib)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、卡莫司汀、艾日布林(eribulin)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、六甲蜜胺(altretamine)、拓扑替康(topotecan)、帕纳替尼(ponatinib)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、依鲁替尼(ibrutinib)、阿西替尼(axitinib)、干扰素α-2a、吉非替尼(gefitinib)、罗咪酯肽(romidepsin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、鲁索利替尼(ruxolitinib)、卡巴他赛(cabazitaxel)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumabemtansine)、卡非佐米(carfilzomib)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、沙格司亭(sargramostim)、克拉屈滨(cladribine)、米托坦(mitotane)、长春新碱(vincristine)、丙卡巴肼(procarbazine)、甲地孕酮(megestrol)、曲美替尼(trametinib)、美司钠(mesna)、锶-89氯化物(strontium-89chloride)、氮芥(mechlorethamine)、丝裂霉素(mitomycin)、白消安、吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、长春瑞滨(vinorelbine)、非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)、索拉非尼(sorafenib)、尼鲁米特(nilutamide)、喷司他丁(pentostatin)、他莫昔芬(tamoxifen)、米托蒽醌(mitoxantrone)、培门冬酶(pegaspargase)、地尼白介素-毒素连接物(denileukindiftitox)、阿利维A酸(alitretinoin)、卡铂(carboplatin)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、顺铂(cisplatin)、泊马度胺(pomalidomide)、泼尼松(prednisone)、阿地白介素(aldesleukin)、巯嘌呤(mercaptopurine)、唑来膦酸(zoledronic acid)、来那度胺(lenalidomide)、利妥昔单抗、奥曲肽(octretide)、达沙替尼(dasatinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、组氨瑞林(histrelin)、舒尼替尼(sunitinib)、司妥昔单抗(siltuximab)、omacetaxine、硫鸟嘌呤(thioguanine)(硫鸟嘌呤(tioguanine))、达拉菲尼(dabrafenib)、埃罗替尼(erlotinib)、蓓萨罗丁(bexarotene)、替莫唑胺(temozolomide)、替莫唑胺(thiotepa)、沙利度胺、BCG、替西罗莫司(temsirolimus)、盐酸苯达莫司汀(bendamustinehydrochloride)、曲普瑞林(triptorelin)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、拉帕替尼(lapatinib)、戊柔比星(valrubicin)、帕尼单抗(panitumumab)、长春碱(vinblastine)、硼替佐米(bortezomib)、维A酸(tretinoin)、阿扎胞苷(azacitidine)、帕唑帕尼(pazopanib)、替尼泊苷(teniposide)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、克唑替尼(crizotinib)、卡培他滨(capecitabine)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、易普利姆玛(ipilimumab)、戈舍瑞林(goserelin)、伏立诺他(vorinostat)、艾代拉里(idelalisib)、色瑞替尼(ceritinib)、阿比特龙(abiraterone)、埃博霉素(epothilone)、tafluposide、硫唑嘌呤(azathioprine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、长春地辛(vindesine)、以及全反式维甲酸。
使用ProCA的方法
如本文描述的ProCA和靶向ProCA可以用于成像方法，包括但不限于MRI。在实施方案中，ProCA、靶向ProCA或其制剂可以被施用至受试者。在施用之后，可以使用MRI或其他成像技术使受试者成像。成像可以在施用之后立即、同时或在某个其他时间(例如，5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、90分钟、120分钟、240分钟、360分钟或更多分钟)进行。以这种方式，本文提供的ProCA和靶向ProCA可以用于诊断、治疗和/或预防疾病和紊乱，诸如癌症，包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、脑癌、和肺癌以及肝纤维化。
实施例
现在已大体上描述了本公开内容的实施方案，以下实施例描述本公开内容的一些另外的实施方案。尽管本公开内容的实施方案结合以下实施例以及对应的文字和附图进行描述，但不意图限制本公开内容的实施方案至本说明书。相反，意图覆盖在本公开内容的实施方案的精神和范围内包括的所有的替换、修改、以及等同物。
实施例1.PSMA靶向ProCA
图2A和2B显示了ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的表达(图2A)和纯化(图2B)。大肠杆菌感受态细胞株BL21(DE3)plysS用ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的质粒来转化。当细菌生长达到指数期时，通过0.5mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。在IPTG诱导之后，将培养温度维持在37℃持续3h，并且然后降低至25℃过夜。将细胞沉淀物重悬于补充有benzonuclease和苯甲基磺酰氟的PBS缓冲液中，并且通过超声波仪和细胞破碎仪完全破碎。将细菌裂解物的上清液在90℃-95℃煮沸10min。将在沸腾之后的沉淀物通过离心去除。将上清液与3％硫酸链霉素混合，并且置于4℃过夜以使溶液中的DNA沉淀。第二天，将沉淀物DNA通过离心去除，并且将上清液在4℃在10mM HEPES缓冲液(pH 8.0)中透析过夜。在透析之后，将蛋白溶液过滤通过0.45μm过滤器，并且通过配备有HiTrap Q HP柱的快速蛋白液相层析(FPLC)进一步纯化。通过FPLC纯化的蛋白MRI造影剂通过SDS-PAGE和UV光谱来证实。将Gd3+以2:1比率装载这些蛋白MRI造影剂。
评价ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的r1和r2弛豫率。将不同浓度的ProCA(ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA)与GdCl3以1:2的比率混合。在ProCA的存在或不存在下水的T1和T2弛豫时间分别通过使用1.4T Bruker Minispec使用饱和恢复和CPMG序列在37℃进行测量。Gd-DTPA和ProCA32.562的T1和T2也通过使用7T-Agilent扫描仪使用饱和恢复和自旋回波序列进行测量。图3A和3B示出了显示ProCA32.562.PSMA(图3A)和ProCA32.564.PSMA(图3B)在pH 7.2的10mM HEPES中由Bruker Minispec在60M Hz在约37℃的弛豫率测量(r1和r2)的图。
使用Tb3+-DTPA缓冲液系统，ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的Tb3+结合亲和力。ProCA32变体与Tb3+的Kd使用Gd-DTPA缓冲液来确定，所述Gd-DTPA缓冲液包含在pH7.0的50mM HEPES、100mM NaCl、5mM DTPA和30μM的ProCA32变体(562和564)。在该程序中，将5mM TbCl3滴定到系统中以生成范围为从10-23M至10-18M的游离Gd3+浓度。ProCA32变体与Tb3+的Kd通过希尔方程来确定。
ProCA的Tb3+结合亲和力的确定是基于Tb3+发光共振能量转移(LRET)实验。简而言之，将30μM ProCA在pH 7.2的5mM DTPA、50mM HEPES、150mM NaCl中进行制备。Tb-DTPA浓度([Tb-DTPA])和游离DTPA浓度([DTPA]游离)的比率通过在系统中滴定TbCl3来控制。蛋白-Tb3+LRET发射光谱使用280nm的激发波长在520nm与580nm之间进行收集。在每一个滴定点的游离Tb3+浓度([Tb]游离)通过方程1(Eq.1)来计算
其中KdTb,DTPA为基于美国国家标准与技术研究所(National Institute ofStandards and Technology)标准参考数据库46的Tb3+与DTPA之间的解离常数。Tb3+与ProCA之间的解离常数(KdTbProCA)由希尔方程(Eq.2)来计算。
其中f为在每一个滴定点处的LRET信号的改变分数(fractional change)，并且n为希尔系数(hill number)。
对ProCA的Gd3+结合亲和力通过LRET竞争方法来测量。简言之，将10μM ProCA和20μM Tb3+与0μM至200μM GdCl3在室温一起孵育过夜。Tb3+LRET光谱使用280nm的激发波长在520nm与580nm之间进行收集。表观解离常数(Kdapp)通过拟合在不同浓度的Gd3+的LRET峰值强度的曲线(方程3，Eq.3)来计算并且Gd3+与ProCA的解离常数(KdGd,ProCA)通过方程4(Eq.4)来计算
其中，f为LRET信号的改变分数，[Tb]T为总Tb3+浓度，[Gd]T为在每一个滴定点的总Gd3+浓度，并且KdGd,ProCA为通过方程(2)确定的Gd3+与ProCA之间的解离常数。图4A-4D示出了显示使用Tb3+-DTPA缓冲液系统，ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的Tb3+结合亲和力的图。图4A示出了没有蛋白的缓冲液中Tb3+的信号。图4B显示了在蛋白的存在下的Tb3+。图4C和4D示出了每一种ProCA.32变体的归一化数据。荧光光谱在280nm的激发波长和500-600nm之间的发射波长进行收集。该结果指示，ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA可以在体外和体内应用中具有强的Gd3+亲和力。
ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的Gd3+结合亲和力使用Tb3+竞争测定来评价。该实验通过将在50mM HEPES、100mM NaCl中的不同浓度的Gd3+、10μM ProCA变体和20μMTb3+一起孵育，在PTI中使用280nm的激发波长进行。由于Gd3+变体可以竞争使Tb3+退出(compete Tb3+out of)ProCA变体中的金属结合袋，因此当Gd3+浓度增加时，Tb3+显示出降低的荧光信号。图5A-5B显示了在每一种ProCA变体中Tb3+信号的降低，并且图5C和5D显示了在添加不同量的Gd3+之后归一化的Tb3+信号。在280nm的激发波长下，以及对于ProCA32.562.PSMA在500-600nm与对于ProCA32.564.PSMA在510-580nm之间的发射波长收集荧光光谱。图5A-5D示出了显示使用Tb3+竞争测定，ProCA32.562.PSMA和ProCA32.564.PSMA的Gd3+结合亲和力的图。
图6显示了LNCaP和PC3细胞中的PSMA蛋白的表达。为了检测LnCaP细胞中的PSMA表达，将蛋白在15％SDS-PAGE中分离，并且然后转移到膜上。在用5％脱脂乳封闭之后，PSMA通过单克隆PSMA抗体(ABCaM 1:1000稀释)和HRP缀合的山羊抗兔抗体(BioRad 1:10,000)来可视化。PC3细胞裂解物被用作阴性对照，其没有任何条带，表明PC3细胞不具有PSMA表达。
ProCA1PSMAwp与PSMA之间的相互作用通过使用Zeiss荧光显微镜的荧光成像来证实。首先将ProCA1PSMAwp与LNCAP细胞一起孵育，并且然后取出。然后将这些细胞通过荧光抗体染色并且固定然后成像。在与10nM或100nM ProCA1PSMAwp一起孵育之后，LNCaP显示出增强的绿色荧光。100nM ProCA1PSMAwp显示出最高荧光强度。图7示出了显示ProCA1.WP.PSMA与LNCaP细胞相互作用的荧光显微图像。不受理论束缚，这些结果表明ProCA1PSMAwp与PSMA阳性细胞结合。
ProCA32.562.PSMA或ProCA32.564.PSMA与PSMA之间的探针相互作用使用各向异性来检查。将ProCA32变体用荧光素来标记。荧光各向异性的基本机制是基于当荧光素标记的ProCA32与PSMA结合时旋转运动降低。最初，分别选择1％BSA和兔抗小鼠ProCA32抗体(自制)作为阴性或阳性对照，其中ProCA32的浓度为在15μM。然后，在荧光比色皿中将不同浓度的抗体或BSA滴定至ProCA32。ProCA32与抗体或BSA相互作用的各向异性信号通过荧光计来收集。图8A-8B示出了显示ProCA32.562.PSMA(图8A)或ProCA32.564.PSMA(图8B)与PSMA之间的探针相互作用的图，如通过各向异性确定的。不受理论束缚，这些结果进一步表明PSMA靶向造影剂结合PSMA阳性细胞。
ProCA32.wp.PSMA和ProCA32.564.PSMA和ProCA32的结合能力使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检查。简言之，将LNCaP细胞裂解物包被于96孔板中，并且5％BSA被用作封闭剂。然后，添加0-100μM ProCA32、ProCA32.564.PSMA和ProCA32wp以与包被的细胞裂解物中的PSMA相互作用。ProCA32变体与细胞裂解物中PSMA之间的相互作用使用HRP缀合的山羊抗兔第二抗体和一步ELISA试剂盒通过ELISA来定量。图9示出了显示通过间接ELISA，LNCaP细胞裂解物中的ProCA32.wp.PSMA与ProCA32.564.PSMA之间的结合能力的比较的图。不受理论束缚，这些结果进一步表明PSMA靶向造影剂结合PSMA阳性细胞。
检查了PSMA的靶向亲和力。简言之，将LNCaP细胞裂解物包被于96孔板中，并且5％BSA被用作封闭剂。然后，添加10-9-10-4M ProCA32.564.PSMA(黑点)以与包被的细胞裂解物中的PSMA相互作用。ProCA32.564.PSMA与细胞裂解物中PSMA之间的相互作用使用HRP缀合的山羊抗兔第二抗体和一步ELISA试剂盒通过ELISA来定量。ProCA32.564.PSMA与PSMA的Kd通过希尔方程来确定。ProCA32(蓝点)使用相同实验条件也在该实验中进行测试。在增加ProCA32浓度之后未观察到吸光度增强，表明没有靶向部分的ProCA32本身不能与PSMA和LNCaP细胞裂解物结合。图10示出了显示ProCA32.564.PSMA的靶向亲和力的图。不受理论束缚，这些结果进一步表明PSMA靶向造影剂结合PSMA阳性细胞。
ProCA32.562.PSMA、ProCA32.564.PSMA、和ProCA32.WP.PSMA的弛豫率和金属结合亲和力的概要示于图11中。
ProCA32或ProCA32.564.PSMA与PSMA之间的探针相互作用使用各向异性来检查。10nM荧光素标记的ProCA32.564.PSMA(左侧)和ProCA32(右侧)的各向异性在pH 7.2的10mMHEPES缓冲液中使用PTI荧光计使用495nm的激发波长和518nm的发射波长来收集。与非靶向ProCA32相比，荧光素标记的ProCA32.564.PSMA具有高得多的各向异性改变，表明ProCA32.564.PSMA与LNCaP细胞裂解物中的PSMA之间的相互作用。图12A-12B示出了显示通过各向异性，ProCA32.564.PSMA(图12A)或ProCA32(图12B)与PSMA之间的相互作用的图。
检查了ProCA32.WP.PSMA的r1和r2弛豫率。蛋白的弛豫率(r1和r2)使用弛豫计(relaxometer)使用不同浓度的Gd3+和蛋白(2:1)来确定。T1和T2两者的弛豫率使用方程5(Eq.5)来测量。曲线的斜率为纵向(r1)和横向(r2)弛豫率。
用于检查以上ProCA32.WP.PSMA的弛豫率的方法如以上描述。图13A-13B示出了显示ProCA32.WP.PSMA的弛豫率(r1，图13A和r2，图13B)的图。不受理论束缚，这些结果显示ProCA32.WP.PSMA具有高弛豫率，表明其对体外和体内MRI应用是灵敏的。
进行ProCA32.564的Ca2+滴定。将10μM ProCA添加到包含在pH 7.2的50mM HEPES、100mM NaCl、5mM EGTA的钙缓冲液系统中。将该系统用不同浓度的CaCl2滴定以改变Ca-EGTA([Ca-EGTA])与游离EGTA([EGTA]游离)之间的浓度比率。色氨酸(Trp)荧光改变在280nm处激发的在300nm与390nm之间的发射光谱下进行监测。计算在每一个滴定点处的游离钙浓度。图14A-14B示出了显示使用希尔方程((Eq.2)，ProCA32.564的Ca2+滴定的图。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.PMSA对Ca2+具有较低的亲和力。
用ProCA32.564进行fluozin-1锌竞争测定。Zn2+与PSMA靶向ProCA之间的解离常数通过具有一些修改的荧光竞争方法来确定。2μM Fluozin-1的荧光在495nm处激发，并且发射光谱在2μM Zn2+和不同浓度的PSMA靶向ProCA的存在下在500nm与600nm之间来收集。计算表观解离常数(Kdapp)。图15A-15B示出了显示Fluozin-1和ProCA32.564对锌的竞争的图。不受理论束缚，结果表明与Gd3+相比，ProCA32.PMSA对Zn2+具有较低的亲和力。
如先前描述的，用ProCA32.WP进行Tb3+滴定测定以检查Tb3+结合。图16A-16B显示了ProCA32.WP Tb3+滴定的结果。不受理论束缚，这些结果显示观察到ProCA32.WP具有强的Tb3+亲和力
ProCA32.WP的Ca2+滴定使用希尔方程(Eq.2)来进行，如先前描述的。图17A-17B示出了显示使用希尔方程，ProCA32.WP的Ca2+滴定的结果的图(图17A)和表。平均Kd＝1.2X10-8M。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.WP.PMSA对Ca2+具有较低的亲和力。
如先前描述进行ProCA32.WP的Ca2+滴定。图18A-18B示出了显示ProCA32.WP的Ca2+滴定的图。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.WP.PMSA对Zn2+具有较低的亲和力。
进行Gd3+和Tb3+对ProCA32.WP的竞争测定。Kd使用Eq.4来计算。对于ProCA32.562，KdGd 3+＝2.53x10-22M。对于ProCA32.WP，Kdapp＝8.7x0-6M。对于ProCA32.WP,KdGd 3+＝2.42x10-22M。不受理论束缚，这些结果表明ProCA32.WP和ProCA32.562对Gd3+具有高亲和力，允许其在体外和体内应用具有高稳定性。
用ProCA32.WP进行fluozin-1锌竞争测定，如先前描述的。图21-22B示出了显示Fluozin-1和ProCA32.WP对锌的竞争的图。对于ProCA32.WP，KdZn 2+＝1.4x10-6M。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.WP.对Zn2+具有较低的亲和力。
ProCA32.562的Ca2+滴定。将10μM ProCA添加到包含在pH 7.2的50mM HEPES、100mMNaCl、5mM EGTA的钙缓冲液系统中。将该系统用不同浓度的CaCl2滴定以改变Ca-EGTA([Ca-EGTA])与游离EGTA([EGTA]游离)之间的浓度比率。色氨酸(Trp)荧光改变在280nm处激发的在300nm与390nm之间的发射光谱下进行监测。计算在每一个滴定点处的游离钙浓度。图23示出了显示ProCA32.562的Ca2+滴定的图。图24示出了显示ProCA32.562的EGTA滴定的图。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.562对Ca2+具有较低的亲和力。
ProCA32.562的Ca2+滴定使用希尔方程(Eq.2)，如先前描述的。图25A-25B显示了使用希尔方程，ProCA32.562的Ca2+滴定的结果。平均Kd＝1.4X10-8M。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.562对Ca2+具有较低的亲和力。
用ProCA32.WP进行fluozin-1锌竞争测定，如先前描述的。图26示出了显示Fluozin-1和ProCA32.562对锌的竞争的图。图27A-27B显示了Fluozin-1和ProCA32.562对锌的竞争。对于ProCA32.WP，KdZn 2+＝2.5x10-6M。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.562对Zn2+具有较低的亲和力。
如先前描述进行ProCA32.564的Ca2+滴定。图28示出了显示ProCA32.564的Ca2+滴定的图。图29示出了显示ProCA32.564的EGDTA滴定的图。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.564对Ca2+具有较低的亲和力。
如先前描述使用希尔方程(Eq 2.)进行ProCA32.564的Ca2+滴定。图30A-30B显示了使用希尔方程，ProCA32.564的Ca2+滴定的结果。平均Kd＝1.7X10-8M。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.564对Ca2+具有较低的亲和力。
用ProCA32.564进行fluozin-1锌竞争测定，如先前描述的。图31示出了显示Fluozin-1和ProCA32.564对锌的竞争的图。对于ProCA32.WP，KdZn 2+＝1.6x10-6M。不受理论束缚，这些结果表明与Gd3+相比，ProCA32.562对Zn2+具有较低的亲和力。
用ProCA32.564进行fluozin-1锌竞争测定，如先前描述的。图32A-32B显示了Fluozin-1和ProCA32.564对锌的竞争。不受理论束缚，结果表明与Gd3+相比，ProCA32.562对Zn2+具有较低的亲和力。
图33示出了显示多种靶向蛋白造影剂的弛豫率和金属结合亲和力的概要的表。图34示出了显示不同PSMA靶向蛋白造影剂对Ca2+的缔合常数的表。
总之，该实施例可以证明基于蛋白的PSMA靶向MRI造影剂在ProCA中具有可以与顺磁性金属离子直接结合的至少一个氨基酸。与非靶向的基础蛋白(例如没有靶向部分的ProCA32)相比，PSMA靶向ProCA可以维持高的弛豫率和金属结合亲和力。PSMA靶向MRI造影剂的结合能力通过细胞成像、荧光偏振和ELISA来证明。在所评价的基于蛋白的造影剂之中，ProCA32.564.PSMA具有与PSMA最好的结合亲和力(EC50-0.52±0.04μM)，并且可以为前列腺癌预后和诊断提供基于分子的成像剂。
实施例2.VEGFR2靶向ProCA
VEGF及其受体(VEGFR)可以在血管生成(包括肿瘤血管生成)中发挥作用。通过VEGFR，诸如VEGFR2的信号传导，可以影响细胞粘附、存活、迁移和血管通透性。能够靶向VEGFR的造影剂可以用于评价血管，并且特别是肿瘤血管的形成和状态。该实施例可以证明ProCA可以靶向VEGFR2并且可以包含VEGFR2结合肽。图35示出了显示VEGFR结合肽的Kd值的表。
生成在其C端与VEGFR2结合肽直接融合的包含ProCA的ProCA.32。ProCA32的C-末端与VEGFR2靶向肽用GGG柔性肽接头融合。
评价ProCA32.VEGFR的Gd3+和Tb3+结合亲和力。确定Gd3+亲和力的方法类似于以上描述的PSMA靶向ProCA的。图36A-36B示出了显示Gd3+(图36A)和Tb3+(图36B)对ProCA32.VEGFR的结合亲和力的图。不受理论束缚，这些结果表明ProCA32.VEGFR对Gd3+具有高亲和力，允许其在体外和体内应用具有高稳定性。
使用对PSMA靶向ProCA32描述的方法检查ProCA32.VEGFR的弛豫率。图37示出了显示ProCA32.VEGFR在约37℃的弛豫率的图。不受理论束缚，这些结果显示ProCA32.VEGFR具有高弛豫率，允许其具有灵敏能力以在MRI下可视化受试者。
在B16LS9葡萄膜黑素瘤植入小鼠模型中检查了ProCA32.VEGFR的体内成像能力。将B16LS9植入小鼠的肝中。在注射ProCA32.VEGFR之前和之后收集MRI图像。图38示出了使用ProCA32.VEGFR，血管的MRI造影成像。不受理论束缚，这些结果显示ProCA32.VEGFR能够通过MRI可视化小鼠的血管。图39A和39B示出了使用ProCA32.VEGFR2使肿瘤中的VEGFR2表达成像。图40A-40B示出了显示肿瘤中VEGFR2表达的图，如通过使用ProCA32.VEGFR2成像测量的。不受理论束缚，图39-40中显示的数据表明ProCA32.VEGFR可以使用MRI非侵入性地使小鼠肿瘤中的VEGFR2表达成像。
总之，该实施例可以证明VEGFR靶向ProCA的开发。观察到ProCA32.VEGFR具有高r1和r2弛豫率。在植入的葡萄膜黑素瘤模型中注射ProCA32.VEGFR在T1加权的MRI中显示增强的信号，并且在T2加权的MRI中显示降低的信号。ProCA32.VEGFR可以作为VEGFR2分子成像的T1w和T2w双重试剂起作用。
实施例3.CXCR4靶向ProCA
CXCR4(4型趋化因子受体)为基质来源因子1(SDF-1或CXCL12)的趋化因子受体。CXCR4可以在癌细胞中异常表达。已经证明CXCR4在超过23种类型的癌症中表达，包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤和前列腺癌。这种受体在癌细胞中的表达已经与向包含高浓度CXCL12的组织(诸如肺、肝和骨髓)的转移相关。CXCR4存在于在胚胎发生期间和成人生命的新生神经元中，在那里CXCR4在神经指导中发挥作用。随着神经元成熟，该受体水平降低。CXCR4突变小鼠具有异常的神经元分布。这已经牵涉在紊乱诸如癫痫中。
V1肽为来源于vMIP-II的N-末端的合成肽，并且为CXCR4的有效拮抗剂。Zhou等(2000)Biochem.39:13545-13550。V1肽的N-末端为CXCR4识别的主要决定因素。已经开发了V1肽的合成变体，并显示出对CXCR4的不同亲和力。图41示出了显示多种V1和V1变体肽的表。
CXCR4靶向ProCA通过将V1肽或其变体经由肽接头间接连接至ProCA32的C-末端来生成。该ProCA在本文也被称为ProCA32.V1.CXCR4。V1肽为来源于vMIPII的N末端的21个氨基酸的序列，其对CXCR4具有强的结合亲和力。通过将V1肽附接至ProCA32的C末端，并且使用BL21(DE3)pLysS感受态细胞表达ProCA32.V1.CXCR4，可以生成基于CXCR4特异性靶向蛋白的造影剂ProCA32.V1.CXCR4。
检查了ProCA32.V1.CXCR4的血清稳定性。简言之，将500μM ProCA32.V1.CXCR4与等体积的小鼠血清一起孵育。将混合物溶液在37℃孵育，并且取出一定体积的孵育不同时间的混合物溶液用于SDS-PAGE分析以及也用于蛋白印迹分析。图42为显示CXCR4靶向ProCA的血清稳定性的蛋白凝胶的图像。ProCA32.V1.CXCR4在37℃小鼠血清中稳定多达4天孵育时间。不受理论束缚，该体外数据显示ProCA32.V1.CXCR4作为ProCA可以是足够稳定的以用于体内使用，诸如用于静脉内施用和应用中。
检查ProCA32.V1.CXCR4对Gd3+的亲和力。简言之，位于ProCA32结合袋附近的色氨酸残基使得能够使用荧光共振能量转移(FRET)测定来测量ProCA32对铽的Kd值。在280nm处激发之后，如果铽在其中空间上足够接近色氨酸残基以用于能量转移的ProCA32结合袋中，则色氨酸会将能量传递至接受体铽。在545nm处的荧光强度增加反映了ProCA32和铽结合过程，通过测量该波长的增加，我们可以计算ProCA32与铽结合的Kd值。钆可以与预先装载至ProCA32结合袋的铽竞争。由于钆不具有铽所具有的荧光特性，因此通过测量荧光信号的降低作为钆与ProCA32的结合袋中存在的预装载的铽的竞争的结果，可以确定钆与ProCA32结合的Kd值。图43A-43B示出了显示Gd3+亲和力的图。观察到铽和钆两者对ProCA32的结合亲和力在10-22M范围内，这与小螯合物诸如DTPA和EGTA的钆结合亲和力相当。
检查了ProCA32.V1.CXCR4的r1和r2弛豫率。简言之，在1.5T和7T磁场下测量r1和r2弛豫率两者。1.5T弛豫计用于ProCA32.V1.CXCR4弛豫率测量，并且使用MR扫描仪进行幻像实验以测量7特斯拉磁场下的蛋白弛豫率。观察到ProCA32.V1.CXCR4以及该蛋白的赖氨酸和半胱氨酸PEG化形式两者均具有相似的弛豫率。在较高磁场中观察到T1弛豫率降低，并且观察到T2弛豫率在7T中比在1.5T中更大。图44A-44B示出了显示ProCA32.V1.CXCR4的r1(图44A)和r2(图44B)弛豫率的图。观察到ProCA32.V1.CXCR4与基于小螯合剂的造影剂相比在弛豫率方面有显著的改进，并且该蛋白的PEG化不影响弛豫率。不受理论束缚，观察到ProCA32.V1.CXCR4具有优异的T1和T2弛豫率，并且因此适用于与依赖于弛豫率增加的分子的新MR脉冲序列技术一起使用。另外，在较高磁场中改进的T2弛豫率可以允许ProCA32.V1.CXCR4在较高磁场下用作T2加权造影剂。
检查ProCA32.V1.CXCR4靶向细胞中CXCR4的能力。简言之，进行ProCA32.V1.CXCR4孵育的黑素瘤290细胞(CXCR4高表达细胞系)的荧光染色以检查ProCA32.V1.CXCR4的CXCR4靶向能力。将ProCA32.V1.CXCR4与Mel290细胞一起孵育，并且使用可以特异性结合ProCA32.V1.CXCR4的第一抗体来评价ProCA32.V1.CXCR4与表达CXCR4的Mel290细胞的结合。接下来将细胞与特异性结合第一抗体的荧光素标记的第二抗体一起孵育。ProCA32.V1.CXCR4通过测量荧光素来测量。图45A-45B示出了显示体外由ProCA32.V1.CXCR4靶向CXCR4的荧光显微图像。图46A-46D示出了显示DAPI复染(图46A)、ProCA32.CXCR4的荧光素复染(图46B)和CXCR4表达(图46C)的荧光显微图像。CXCR4的表达由针对CXCR4的第二山羊抗兔荧光标记的抗体生成的红色荧光表示。图46A-46C的合成图像示于图46D中。图47A-47B显示了ProCA32.V1.CXCR4的体外结合亲和力。
在Mel290小鼠中检查作为造影剂的ProCA32.V1.CXCR4。简言之，进行注射前扫描和在注射之后多达48小时的不同时间点的注射后MR扫描，并且收集图像数据用于分析。图48示出了Mel290小鼠在ProCA32.CXCR4注射之后的梯度回波成像的结果。图49示出了Mel290在ProCA32注射之后的梯度回波成像的结果。图50A-50B示出了显示用ProCA32(图50A)或ProCA32.CXCR4(图50B)注射的Mel290小鼠中肿瘤的强度(SNR)增加百分比(梯度回波)的图和图像。
还在SKOV-3卵巢癌转移小鼠模型中评价ProCA32.CXCR4。以与先前描述相似的方式在注射前和注射后的不同时间点扫描小鼠。图51A-51B示出了用SKOV-3卵巢癌细胞向右侧卵巢皮下注射和原位注射之后小鼠中的肿瘤(图51A)和器官(图51B)的照片。在SKOV3模型小鼠中评价作为造影剂的ProCA32.CXCR4。图52示出了SKOV3小鼠模型在ProCA32.V1.CXCR4注射之后的T1加权成像(梯度回波)的结果。图53示出了SKOV3小鼠模型在ProCA32.V1.CXCR4注射之后的T2加权成像(梯度回波)的结果。图54示出了显示肿瘤的强度增加百分比(快速自旋回波)的图。
图90A-90F示出了显示通过ProCA32.CXCR4靶向的图像。
图91示出了显示ProCA32.CXCR4的组织分布的图。
实施例4.HER2和EGFR靶向ProCA
HER2和EGFR靶向ProCA通过将HER2或EGFR特异性亲和体与ProCA1的C-末端经由肽接头间接连接来制备，如在Qiao等，2014February；J.Biol.Inorg.Chem.19(2):259-270中描述的。图55示出了其中靶向部分为亲和体，特别是可以靶向HER2的亲和体的ProCA的一个实施方案的示意图。
评价HER特异性ProCA作为造影剂的能力。将HER2阳性和阴性肿瘤细胞两者均接种于裸小鼠中，作为异种移植皮下模型。在注射ProCA1-affi之后，仅HER2阳性肿瘤在MRI下显示增强。图56A-56D快速自旋回波示出了具有HER2阳性和阴性肿瘤的小鼠在注射靶向ProCA之后的图像，所述靶向ProCA包含可以结合HER2的亲和体。在由图56A-56D显示的实验中，图像使用快速自旋回波成像来生成，其中阳性肿瘤在注射之后24小时时显示出最高的增强。
图57A-57D示出了具有HER2阳性和阴性肿瘤的小鼠在注射靶向ProCA之后的梯度回波图像，所述靶向ProCA包含可以结合HER2的亲和体。图58A-58B示出了显示小鼠SKOV-3转移模型中HER2阳性和HER2阴性肿瘤中的信号强度的图。图57A-57D示出了梯度回波的图像，其中肿瘤的异质结构可以被可视化。为了定量分析MRI结果，我们使用Image J软件圈出感兴趣的区域(诸如肿瘤或肝)。然后测量该区域的平均强度。我们对于一个特定的器官或肿瘤选择了数个相邻的投影片，以获得平均强度与标准差。该统计分析使得结果可靠和较少的假阳性。
实施例5.亲水性和疏水性ProCA
没有固有靶向能力的ProCA1可以被亲水性或疏水性修饰以增加靶向功能。ProCA1用赖氨酸使用亲水修饰来修饰。ProCA用PEG进一步修饰。
在体外表达大鼠ProCA1。图59示出了显示大鼠ProCA1表达的蛋白凝胶。蛋白随着细菌细胞的生长而表达。当细胞数目增加时，光密度增加。当光密度达到0.6-0.8时此时细胞是有活力的，添加IPTG诱导蛋白表达。在诱导之后光密度将继续增加。图60示出了显示大鼠ProCA1表达趋势的图。
大鼠ProCA1经由细菌裂解随后层析分离来从体外培养物纯化。图61示出了显示大鼠ProCA1的纯化的凝胶的图像。图62示出了显示纯化大鼠ProCA1的吸光度光谱。FPLC仪器用于监测蛋白纯化。蛋白在UV280处具有吸光度，因此UV检测仪用于测量来自柱的流出物(flow out)的UV吸光度。在UV增加并形成峰值后，蛋白被洗脱出来并与其他杂质分离。图63示出了显示大鼠ProCA1(rProCA1)双峰(doublet)和rProCA1的光谱。图63示出了ProCA1的质谱(MS)以证实ProCA1的纯度。MS的机制为触发蛋白分子的一个电子，然后MS机器将检测分子量和电荷。如果分子为纯的，则将仅有等于蛋白的分子量的一个峰。有时，在一些分子中两个电子被触发，所以读出的将是分子量的一半，并且它被称为双峰。图64示出了显示大鼠ProCA1的纯化的光谱，如通过在280nm处的吸光度所显示的。蛋白会在UV280处具有UV吸光度。因此对蛋白样品进行包括在UV280处的吸光度的UV扫描，并且然后计算蛋白浓度。
实施例6.人源化大鼠ProCA1和人类ProCA1.亲和体
ProCA1最初是基于CD2结构域1。为了将蛋白应用于人类，CD2序列用于生成人类ProCA1(hProCA1)。人类ProCA1通过将人类CD2修饰为包括顺磁性金属(例如，Gd3+)结合位点来产生。该结合位点通过将人类CD2序列突变为包含N15E、D17N、L60D、T64D和K66D突变来生成。
在SKOV-3模型小鼠中进一步检查人类ProCA1-Affi造影剂。简言之，将人类ProCA1-affi注射到具有SKOV-3肿瘤的小鼠中。MRI用于扫描以使肿瘤区域中的任何增强成像。图65A-65D示出了显示小鼠在施用人类ProCA1-Affi之前及在之后不同时间点时的SKOV-3肿瘤中的HER2阳性和阴性肿瘤的成像的MRI扫描。图66示出了显示小鼠在施用人源化ProCA1-Affi之前及在之后不同时间点时的HER2阳性和阴性SKOV-3肿瘤的信号强度的图。
在小鼠的MDA-MB-231肿瘤中进一步检查人源化ProCA1-Affi造影剂。简言之，将修饰的ProCA1-affi注射到具有MDA-MB-231肿瘤的小鼠中。进行MRI扫描，观察到具有较少HER2表达的肿瘤中的较少增强。图67A-67D示出了显示小鼠在施用人源化ProCA1-Affi之前及在之后不同时间点时的HER2阳性和阴性MFS-MB-231肿瘤的成像的MRI扫描。图68示出了显示小鼠在施用人源化ProCA1-Affi之前及在之后不同时间点时的HER2阳性和阴性MFS-MB-231肿瘤的信号强度的图。
实施例7.ProCA1的变体
ProCA1被修饰以生成ProCA1变体。ProCA1.B10、ProCA1.G10、和ProCA1.B14通过将14个氨基酸铃蟾肽(B14)、10个氨基酸铃蟾肽(B10)和促胃液素释放肽(GRP)肽(G10)通过柔性肽接头插入到ProCA1的中部来生成。图69示出了显示通过使用8M尿素解折叠纯化的ProCA1的多种变体的蛋白印迹的图像。图70示出了显示通过使用8M尿素解折叠纯化ProCA1的多种变体的蛋白凝胶的图像。图71示出了显示纯化的ProCA(7E15)和ProCA1.G10和ProCA1.B10变体的浓度的表。
如先前针对PSMA靶向ProCA描述的分析ProCA1变体的弛豫率。图72示出了显示ProCA1变体在约25℃的弛豫率的图。图73示出了显示ProCA1变体在约37℃的弛豫率的图。不受理论束缚，ProCA具有高弛豫率，允许其能够通过MRI在体外和体内使受试者可视化。
实施例8.ProCA32
α-小清蛋白用S56D和F103W突变来修饰以制备ProCA，其在本文被称为ProCA32。ProCA32如先前对PSMA靶向ProCA描述的进行纯化。如先前对PSMA靶向ProCA描述的检查ProCA32的弛豫率。图74示出了显示大鼠和人类ProCA32的r1弛豫率的图。图75示出了显示大鼠和人类ProCA32的r2弛豫率的图。大鼠和人类ProCA32的弛豫率为相似的。
ProCA32的金属结合能力使用如先前对PSMA靶向ProCA描述的方法来检查。图76示出了显示hCA32Zn2+结合滴定的图。图77示出了显示hCA32-FluoZn-1竞争测定的结果的图。图78示出了显示hCA32EGTATb3+滴定测定的结果的图。图79示出了显示hCA32EGTA-Tb3+平均值的图。图80示出了显示hCA32-Tb3+DTPA缓冲液系统的图。图81示出了显示来自hProCA32:Gd3+-Tb3+竞争测定的结果的图。图82示出了显示ProCA32和hCA32的多种金属结合亲和力的表。不受理论束缚，这些结果表明ProCA32对于体外和体内应用是稳定的。
体内检查了ProCA32作为造影剂起作用的能力。将人类ProCA32IV注射到小鼠中以评价其体内能力。在注射之前和在注射之后不同时间点收集MRI。图83示出了小鼠在施用hProCA32之前及之后的肝和肾的T1加权图像。图84示出了小鼠在施用hProCA32之前及之后的肝和肾的T2加权图像。图85A-85D示出了在注射hProCA32之前及之后的T1(图85C和85D)和T2(图85A和85B)加权的肝的SNR。不受理论束缚，这些结果表明人类ProCA32具有在T1加权和T2加权MRI两者中改变MRI信号的能力。它也能够可视化小鼠肝中的尺寸小于1mm的转移性活肿瘤。hProCA32也可以用于鉴别和评价肝中的其他疾病。
实施例9.
靶向ProCA可以具有与以下SEQ ID NO50％-100％(或之内的任何范围)相同的序列：
CaMBom：SEQ ID NO：70
ADQLTEEQIAEFKKEAFSLFDKDGDGTITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMINEVDADGDGTIDFPEFLTMMARKMKDTGGNQWAVGHLMGGDSEEEIREAFRVFDKDGDGYISAAELRHVMTNLGEKLTDEEVDEMIREADIDGDGQVNYEEFVQMMTAK
实施例10.胶原蛋白、肝纤维化和肝癌靶向ProCA
胶原蛋白为细胞外基质(ECM)和结缔组织中主要的纤维状蛋白，并且它为体内最丰富的单种蛋白。存在至少16种胶原蛋白，但体内胶原蛋白的80％-90％由I型、II型和III型组成。
I型胶原蛋白为用于许多慢性疾病包括慢性肝病(例如肝纤维化)、不同类型的癌症和转移、心力衰竭和肺纤维化的主要诊断生物标志物和治疗靶之一。肝纤维化的早期诊断将导致有效的治疗，并且可以阻止其进一步进展为主要的临床后果，包括影响全球大量人群的肝硬化和肝细胞癌(HCC)。葡萄膜黑素瘤为最常见的原发性眼内肿瘤，具有转移至肝的风险为40％。95％的具有葡萄膜黑素瘤转移的患者发生肝转移，几乎所有病例均会导致死亡。迄今，不存在用于以高灵敏度和特异性早期检测和分期纤维化以及原发性肝癌和肝转移的可靠的非侵入性成像方法。MRI具有用于以高分辨率监测缓慢进展和检测纤维化和转移而不使用辐射的几个独特的优势，然而，对开发具有克服高异质肝背景的期望的灵敏度和胶原蛋白特异性以及适当的体内特性和减少的毒性的MRI造影剂存在迫切的未满足的医学需求。
设计一种基于蛋白的MRI造影剂，大鼠ProCA32.胶原蛋白(rProCA32.胶原蛋白)，其可以在大鼠ProCA32的C-末端具有I型胶原蛋白靶向能力(表2中的亲本靶向肽)，以三个甘氨酸作为柔性接头，以诊断和分期肝纤维化和肝中葡萄膜黑素瘤肿瘤的转移。rProCA32.胶原蛋白在1.5T和7.0T磁场强度两者处表现出r1和r2/Gd3+的最高弛豫率值，并且是临床使用的造影剂的14-20倍高。高r1和r2弛豫率值两者的独特性使得我们能够在单次注射rProCA32.胶原蛋白之后实现T1和T2成像两者。更重要的是，利用弛豫特性和成像方法两者，我们可以大大改进检测的动态范围，对于在小鼠中植入的肝葡萄膜黑素瘤肿瘤的相对对比度方面增强6倍。图87A-87H总结了结果。图87A-87H.图87A和87B示出了在注射rProCA32.胶原蛋白之后的肿瘤增强，其中在注射之后使用倒置恢复，T1和T2-加权序列在相对造影方面具有6倍增强。图87C.向肝的II期结节性转移性黑素瘤三色伴随相关的蓝色胶原蛋白斑块。图87D.向肝的II期浸润性模式的黑素瘤转移。胶原蛋白在黑素瘤岛周围以蓝色突出显示。图87E和87F.肝组织中被天狼猩红染色的胶原蛋白显示出具有不同胶原蛋白水平的不同的生长模式，通过胶原蛋白比例区域(CPA)显示。G.植入到肝中的葡萄膜黑素瘤肿瘤。图87H.具有rProCA32.胶原蛋白(红色)的肿瘤的肝组织的IHC染色显示造影剂在具有肿瘤的肝中的异质分布。
另外，rProCA32.胶原蛋白可以检测早期小鼠肝纤维化，其中与使用临床造影剂尚未实现的Eovist相比，在7.0T处弛豫率的改变(ΔR1)增加了6倍。肝转移和早期肝纤维化两者均通过组织学分析来验证。进一步证明了，与Eovist相比，添加I型胶原蛋白靶向部分不降低其对Gd3+的强金属结合亲和力，并且相比于Zn2+对Gd3+的选择性高1011倍，这对减少金属毒性非常重要。预期胶原蛋白靶向造影剂的开发在慢性疾病纤维化和来自多种癌症的肝转移的检测和分期以及在疾病进展和治疗后探测异质微环境改变方面具有广泛的应用。图88A-88H示出了对rProCA32.胶原蛋白收集的结果的概要。图88A.显示在注射rProCA32.胶原蛋白之前及在之后(24小时)和在注射Eovist之前及在之后(30min)的纤维化和正常肝的R1图。图88B.在注射rProCA32.胶原蛋白之前及在之后24小时的纤维化和正常肝的R1值。图88C.显示在注射rProCA32.胶原蛋白之前及在之后(24小时)的和在注射Eovist之前及在之后(30min和24小时)的正常和纤维化肝的R1的增加比率百分比。图88D.纤维化和正常肝的Eovist(在注射之后30min和24h)和rProCA32.胶原蛋白(在注射之后24小时)的ΔR1。图88E.正常肝组织的代表性天狼猩红组织学，以及图88F.纤维化肝组织的代表性天狼猩红组织学。基于NASH/CRN分期系统：图88E为0-正常，且图88F为1A-轻度，区域3，窦周(perisinusoidal)。图88E和88F中示出的两者被注射了rProCA32.胶原蛋白。用Eovist注射的纤维化肝显示相同的时期(基于Ishak，1A-轻度或3)。基于胶原蛋白比例区域(CPA)分析，时期为在Ishak系统中的3。图88G和88H.纤维化肝组织用rProCA32.胶原蛋白和rProCA32(红色)以及I型胶原蛋白(绿色)连同细胞核(蓝色)的免疫荧光染色。rProCA32.胶原蛋白与I型胶原蛋白的相互作用仅可以在图88G中以黄色被观察到。
为了测试rProCA32.胶原蛋白在检测早期肝纤维化中的能力，将BALB/c小鼠每周两次注射硫代乙酰胺(TAA)持续12周(i.p.注射)以诱导肝纤维化，然后将TAA浓度从100mg/kg逐渐增加至200mg/kg。将Balb/c小鼠用饮用水中10％酒精饲养12周。在TAA处理12周之后，将小鼠安乐死并解剖肝用于分析。
对于详细的MRI扫描，在将rProCA32.胶原蛋白(100μL,5mM)注射到每一只小鼠的尾静脉中之后，选择四个不同时间点来扫描整个纤维化和正常肝。T1映射MRI(T1mappingMRI)用于使纤维化和正常肝成像以定量肝纤维化检测的T1弛豫时间和R1弛豫率。在注射rProCA32.胶原蛋白之后三小时，与纤维化肝相比，观察到正常肝的R1显著增强(T1降低)。当MRI扫描继续24小时时，对于纤维化肝R1进一步增加，而正常肝显著降低，这表明靶向造影剂正在被从正常肝冲走，但仍停留在纤维化肝中，因此，24小时可以被选择作为最佳时间点，以检测纤维化肝与正常肝。随着扫描继续进行，造影剂被进一步冲走，这导致在72小时时R1降低。
在24小时的时间点，观察到rProCA32.胶原蛋白表现出对于纤维化肝的检测的最大的靶向能力。图88B示出了造影剂在T1减少和随后R1增加中的作用。还测试了非靶向大鼠ProCA32(rProCA32)和广泛使用的临床造影剂Eovist检测肝纤维化。在注射rProCA32之后3小时之后，纤维化肝显示出显著的R1增强，这与rProCA32.胶原蛋白不同。由于rProCA32为一种非靶向剂，它的功能与具有I型胶原蛋白靶向能力的rProCA32.胶原蛋白不同。rProCA32.胶原蛋白需要较长的时间(24小时)来显示其对纤维化肝的作用，并且rProCA32具有更短的作用(3小时)。另外，基于在3小时和24小时的时间点的R1增加，靶向造影剂比非靶向剂具有更多的灵敏度。以相同体积和浓度的Eovist用于使肝纤维化成像，然而，其未显示相同的肝增强，因此可以得出结论：Eovist对检测早期纤维化不够灵敏。
在所报道的剂中，在高磁场7.0T处观察到rProCA32.胶原蛋白具有最高的r1(21mM-1s-1)和r2(108mM-1s-1)。因此，所开发的造影剂可以用于医疗相关的低磁场强度和高磁场强度两者。首先，对于3期纤维化小鼠肝，rProCA32.胶原蛋白以较低剂量导致在7.0TMRI处的R1图的显著增加，而Eovist未导致任何显著的R1增加。大鼠rProCA32.胶原蛋白表现出比临床造影剂Eovist大约3-10倍高的ΔR1(在注射之后3-24小时)。更重要的是，rProCA32.胶原蛋白未导致正常小鼠的R1和ΔR1的任何显著增加，这表明我们的造影剂对I型胶原蛋白具有强的靶向能力。由Emory University的病理学家Brad Farris博士使用天狼猩红染色和胶原蛋白比例区域(CPA)的定量分析的详细的组织学分析，确认了基于NASH/CRN评分系统的肝纤维化早期时期(轻度-1A)，和3期(Ishak评分系统)。
为了进一步证实rProCA32.胶原蛋白的靶向能力，将每一只小鼠解剖并将每一个器官分离并溶解于高浓度的硝酸中。然后ICP-OES用于借助于Gd3+标准测量Gd3+浓度。用仪器测量脾、心脏、肾和肝中的Gd3+浓度。基于测量结果，在注射rProCA32.胶原蛋白72小时之后纤维化肝显示出在其他器官中最高的Gd3+浓度，这证明了rProCA32.胶原蛋白对纤维化肝中I型胶原蛋白的靶向能力。此外，在注射rProCA32(非靶向)之后的纤维化肝也显示出与其他器官相比较高的Gd3+量，然而，它比rProCA32.胶原蛋白低得多。总之，具有ProCA32.胶原蛋白的纤维化肝中每克组织的Gd3+注射剂量是rProCA32的大约2倍高，这表明rProCA32.胶原蛋白的靶向能力(图89A-89B)。

Claims (46)

1.一种蛋白造影剂，所述蛋白造影剂包含：
修饰的小清蛋白多肽或其片段，其中所述修饰的小清蛋白多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的小清蛋白多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；和
靶向部分，其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的小清蛋白多肽或其片段。
2.根据权利要求1所述的蛋白造影剂，其中所述修饰的小清蛋白多肽或其片段具有根据SEQ ID NO.10中任一个的序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分选自由以下组成的组：PSMA结合肽、V1肽或其变体、促胃液素释放肽、HER2特异性亲和体、EGFR特异性亲和体、VEGFR结合肽、纤连蛋白、整联蛋白、胶原蛋白及其组合。
4.根据权利要求3所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够具有根据SEQ ID NO.:14-66中任一个的序列。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至所述修饰的小清蛋白多肽或其片段的C-末端、N-末端或C-末端和N-末端两者。
6.根据权利要求1或2中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至所述修饰的小清蛋白多肽或其片段的C末端与N末端之间的一个或更多个氨基酸。
7.根据权利要求1或2中任一项所述的蛋白造影剂，所述蛋白造影剂还包含顺磁性离子，其中所述顺磁性离子与所述修饰的小清蛋白多肽或其片段的至少一个氨基酸直接结合。
8.根据权利要求7所述的蛋白造影剂，其中所述顺磁性离子为Gd3+。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂为PEG化的。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂的疏水性经由所述蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代被改变。
11.根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂的亲水性经由所述蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代被改变。
12.根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述修饰的小清蛋白多肽或其片段包含S56D和F103W突变或其结构等同物。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
根据权利要求1所述的蛋白造影剂；和
药学上可接受的载体。
14.一种方法，所述方法包括：
将一定量的根据权利要求1所述的蛋白造影剂施用至受试者；以及
使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像。
15.一种方法，所述方法包括：
将一定量的根据权利要求12所述的蛋白造影剂施用至受试者；以及
使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像。
16.一种蛋白造影剂，所述蛋白造影剂包含：
修饰的钙调蛋白多肽或其片段，其中所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；和
靶向部分，其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段。
17.根据权利要求16所述的蛋白造影剂，其中所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段具有根据SEQ ID NO.:13的序列。
18.根据权利要求16-17中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分选自由以下组成的组：PSMA结合肽、V1肽或其变体、促胃液素释放肽、HER2特异性亲和体、EGFR特异性亲和体、VEGFR结合肽、纤连蛋白、整联蛋白、胶原蛋白及其组合。
19.根据权利要求16所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够具有根据SEQ ID NO.:14-66中任一个的序列。
20.根据权利要求16-17中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段的C-末端、N-末端或C-末端和N-末端两者。
21.根据权利要求16-17中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段的C末端与N末端之间的一个或更多个氨基酸。
22.根据权利要求16-17中任一项所述的蛋白造影剂，所述蛋白造影剂还包含顺磁性离子，其中所述顺磁性离子与所述修饰的钙调蛋白多肽或其片段的至少一个氨基酸直接结合。
23.根据权利要求22所述的蛋白造影剂，其中所述顺磁性离子为Gd3+。
24.根据权利要求16-17中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂为PEG化的。
25.根据权利要求16-17中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂或其部分的疏水性经由所述蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代被改变。
26.根据权利要求16-17中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂的亲水性经由所述蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代被改变。
27.根据权利要求16-17中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂具有根据SEQ ID NO.:70的序列。
28.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
根据权利要求16所述的蛋白造影剂；和
药学上可接受的载体。
29.一种方法，所述方法包括：
将一定量的根据权利要求16所述的蛋白造影剂施用至受试者；以及
使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像。
30.一种方法，所述方法包括：
将一定量的根据权利要求27所述的蛋白造影剂施用至受试者；以及
使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像。
31.一种蛋白造影剂，所述蛋白造影剂包含：
修饰的CD2多肽或其片段，其中所述修饰的CD2多肽或其片段包含顺磁性金属结合位点，所述顺磁性金属结合位点由所述修饰的CD2多肽或其片段的一个或更多个氨基酸残基组成；和
靶向部分，其中所述靶向部分被可操作地连接至所述修饰的CD2多肽或其片段。
32.根据权利要求31所述的蛋白造影剂，其中所述修饰的CD2多肽或其片段具有根据SEQ ID NO.:1-3、7-9、或12中任一个的序列。
33.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分选自由以下组成的组：PSMA结合肽、V1肽或其变体、促胃液素释放肽、HER2特异性亲和体、EGFR特异性亲和体、VEGFR结合肽、纤连蛋白、整联蛋白、胶原蛋白及其组合。
34.根据权利要求33所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够具有根据SEQ ID NO.:14-66中任一个的序列。
35.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至所述修饰的CD2多肽或其片段的C-末端、N-末端或C-末端和N-末端两者。
36.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述靶向部分能够被直接地融合或者经由柔性肽接头被间接地连接至所述修饰的CD2多肽或其片段的C末端与N末端之间的一个或更多个氨基酸。
37.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，所述蛋白造影剂还包含顺磁性离子，其中所述顺磁性离子与所述修饰的CD2多肽或其片段的至少一个氨基酸直接结合。
38.根据权利要求37所述的蛋白造影剂，其中所述顺磁性离子为Gd3+。
39.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂为PEG化的。
40.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂或其部分的疏水性经由所述蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代被改变。
41.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂的亲水性经由所述蛋白造影剂中氨基酸的插入、缺失或取代被改变。
42.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，其中与野生型D2的结构域1相比，所述修饰的CD2多肽或其片段包含N15E、D17N、L60D、T64D和K66D突变。
43.根据权利要求31或32中任一项所述的蛋白造影剂，其中所述蛋白造影剂具有根据SEQ ID NO.:1-3中任一个的序列。
44.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
根据权利要求31所述的蛋白造影剂；和
药学上可接受的载体。
45.一种方法，所述方法包括：
将一定量的根据权利要求31所述的蛋白造影剂施用至受试者；以及
使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像。
46.一种方法，所述方法包括：
将一定量的根据权利要求42所述的蛋白造影剂施用至受试者；以及
使用磁共振成像使受试者的至少一部分成像。
CN201680040650.6A 2015-05-11 2016-05-11 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途 Pending CN107850590A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410395852.9A CN118576733A (zh) 2015-05-11 2016-05-11 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562159685P 2015-05-11 2015-05-11
US62/159,685 2015-05-11
PCT/US2016/031900 WO2016183223A2 (en) 2015-05-11 2016-05-11 Targeted protein contrast agents, methods of making, and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410395852.9A Division CN118576733A (zh) 2015-05-11 2016-05-11 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107850590A true CN107850590A (zh) 2018-03-27

Family

ID=57249507

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680040650.6A Pending CN107850590A (zh) 2015-05-11 2016-05-11 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途
CN202410395852.9A Pending CN118576733A (zh) 2015-05-11 2016-05-11 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410395852.9A Pending CN118576733A (zh) 2015-05-11 2016-05-11 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途

Country Status (6)

Country Link
US (4) US10814020B2 (zh)
EP (1) EP3295175A4 (zh)
CN (2) CN107850590A (zh)
CA (1) CA2985075A1 (zh)
HK (1) HK1251512A1 (zh)
WO (1) WO2016183223A2 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3295175A4 (en) * 2015-05-11 2018-12-26 Georgia State University Research Foundation, Inc. Targeted protein contrast agents, methods of making, and uses thereof
CN107952084A (zh) * 2017-12-21 2018-04-24 同济大学 一种以人体内源性蛋白为螯合剂的磁共振造影剂及其制备
WO2020030954A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Integrative Medicine Clinic, Sia Theranostics-like protein sanps conjugated to integrin and pmsa targeting peptides and therapy of prostate cancer
WO2020039410A1 (en) * 2018-08-24 2020-02-27 Symthera Canada Ltd. Calcium regulated binding agents

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030220482A1 (en) * 2000-02-03 2003-11-27 Ziwei Huang Novel peptide antagonist of CXCR4 derived from the N-terminus of the viral chemokine vMIP-II
US20050250700A1 (en) * 2002-03-01 2005-11-10 Sato Aaron K KDR and VEGF/KDR binding peptides
CN1824332A (zh) * 2004-12-20 2006-08-30 西门子公司 选择成像检查中造影剂的方法及对造影剂中配合体的使用
WO2007081751A2 (en) * 2006-01-05 2007-07-19 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the treatment of cancer
CN101222878A (zh) * 2005-07-13 2008-07-16 佐治亚州立大学研究基金会 显像剂及其制备方法
CN101304767A (zh) * 2005-09-09 2008-11-12 佐治亚州立大学研究基金会 靶向显像剂及显像剂靶向定位的方法
WO2009146099A2 (en) * 2008-04-02 2009-12-03 Georgia State University Research Foundation, Inc. Contrast agents, methods for preparing contrast agents, and methods of imaging
CN101636108A (zh) * 2006-11-02 2010-01-27 维里德克斯有限责任公司 用免疫磁性mri造影剂对活化的血管内皮进行成像
CN102026671A (zh) * 2008-03-14 2011-04-20 Visen医药公司 整联蛋白靶向试剂及使用其的体内和体外成像方法
WO2013184786A2 (en) * 2012-06-05 2013-12-12 Georgia State University Research Foundation, Inc. Contrast agents, methods for preparing contrast agents, and methods of imaging

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3295175A4 (en) * 2015-05-11 2018-12-26 Georgia State University Research Foundation, Inc. Targeted protein contrast agents, methods of making, and uses thereof

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030220482A1 (en) * 2000-02-03 2003-11-27 Ziwei Huang Novel peptide antagonist of CXCR4 derived from the N-terminus of the viral chemokine vMIP-II
US20050250700A1 (en) * 2002-03-01 2005-11-10 Sato Aaron K KDR and VEGF/KDR binding peptides
CN1824332A (zh) * 2004-12-20 2006-08-30 西门子公司 选择成像检查中造影剂的方法及对造影剂中配合体的使用
CN101222878A (zh) * 2005-07-13 2008-07-16 佐治亚州立大学研究基金会 显像剂及其制备方法
CN101304767A (zh) * 2005-09-09 2008-11-12 佐治亚州立大学研究基金会 靶向显像剂及显像剂靶向定位的方法
WO2007081751A2 (en) * 2006-01-05 2007-07-19 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the treatment of cancer
CN101636108A (zh) * 2006-11-02 2010-01-27 维里德克斯有限责任公司 用免疫磁性mri造影剂对活化的血管内皮进行成像
CN102026671A (zh) * 2008-03-14 2011-04-20 Visen医药公司 整联蛋白靶向试剂及使用其的体内和体外成像方法
WO2009146099A2 (en) * 2008-04-02 2009-12-03 Georgia State University Research Foundation, Inc. Contrast agents, methods for preparing contrast agents, and methods of imaging
WO2013184786A2 (en) * 2012-06-05 2013-12-12 Georgia State University Research Foundation, Inc. Contrast agents, methods for preparing contrast agents, and methods of imaging

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUANWEN SHEN ET AL.: "Evaluation of phage display discovered peptides as ligands for prostate-specific membrane antigen (PSMA)", 《PLOS ONE》 *
JINGJUAN QIAO ET AL.: "Molecular imaging of EGFR/HER2 cancer biomarkers by protein MRI contrast agents", 《J BIOL INORG CHEM.》 *
SHENGHUI XUE ET AL.: "Design of a novel class of protein-based magnetic resonance imaging contrast agents for the molecular imaging of cancer biomarkers", 《WILEY INTERDISCIP REV NANOMED NANOBIOTECHNOL.》 *
SHENGHUI XUE ET AL.: "Protein MRI contrast agent with unprecedented metal selectivity and sensitivity for liver cancer imaging", 《PROC NATL ACAD SCI U S A.》 *
ZHAOWEN LUO ET AL.: "Structure-Function Study and Anti-HIV Activity of Synthetic Peptide Analogues Derived from Viral Chemokine vMIP-II", 《BIOCHEMISTRY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20230057249A1 (en) 2023-02-23
CN118576733A (zh) 2024-09-03
US20180280544A1 (en) 2018-10-04
US20210038746A1 (en) 2021-02-11
WO2016183223A3 (en) 2016-12-29
CA2985075A1 (en) 2016-11-17
HK1251512A1 (zh) 2019-02-01
US11426471B2 (en) 2022-08-30
EP3295175A4 (en) 2018-12-26
US20200397925A1 (en) 2020-12-24
WO2016183223A2 (en) 2016-11-17
US11419954B2 (en) 2022-08-23
EP3295175A2 (en) 2018-03-21
US10814020B2 (en) 2020-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6267735B2 (ja) グルタチオンをベースとする薬物送達システム
US11419954B2 (en) Targeted protein contrast agents, methods of making, and uses thereof
JP5860698B2 (ja) パクリタキセル、パクリタキセル類似体またはパクリタキセルコンジュゲートの医薬組成物ならびに関連する調製方法および使用方法
CN101815724B (zh) 用于将轭合至其的试剂递送至组织的抑肽酶样多肽
Kang et al. A brain tumor-homing tetra-peptide delivers a nano-therapeutic for more effective treatment of a mouse model of glioblastoma
CN103080125A (zh) 用于治疗性结合物的短且含d氨基酸的多肽及其使用
US20170189343A1 (en) Drug carrier for tumor-specific targeted drug delivery and use thereof
US11976092B2 (en) RNA nanostructures, methods of making, and uses thereof
ES2711669A1 (es) Sistemas de liberacion de farmacos de acido polisialico y metodos
JP2017507655A5 (zh)
US20050112061A1 (en) Use of a VEGF antagonist in combination with radiation therapy
US20220008513A1 (en) Combined treatment of primary central nervous system lymphoma
US20230212228A1 (en) Fibronectin-Binding Peptides for Use in Tumor or Fibrosis Diagnosis and Therapy
CN109069581A (zh) 锁环螺旋肽及合成方法
CN1921891B (zh) 连接到杯芳烃上的生长因子结合化合物
US20120207681A1 (en) Chemical compositions to detect and treat amyloid in a patients brain and retina
JP2005508875A5 (zh)
US20200397873A1 (en) Compositions, systems, and methods for scar tissue modification
CN113244245A (zh) 包含一氧化氮供体的用于提升血脑屏障渗透性的组合物及其用途
Yi Protein modification by pluronic block copolymer for brain delivery
CN104774248A (zh) 用于将轭合至其的试剂递送至组织的抑肽酶样多肽

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1251512

Country of ref document: HK

RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180327

RJ01 Rejection of invention patent application after publication