CN101222878A - 显像剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有骨架蛋白的显像剂包括至少一个可操作的一体化金属离子的结合位点。
Description
相关申请声明
该专利合作条约(PCT)申请要求申请日为2005年7月13号、申请号为60699409、名为“显像剂及其制备方法”的美国临时专利申请以及申请日为2006年7月13号、申请号为11/457370、名为“显像剂及其制备方法”的美国专利申请的优先权,上述两份申请整体内容以参考的方式结合在本文中。
技术领域
本发明涉及诊断显像领域,特别涉及新型显像剂配制品及其在诊断显像中的应用,例如应用于组织观察中。
背景技术
显像技术,包括磁共振成像(MRI)、X-射线、正电子发射断层显像术、磁显像、以及计算机体层显像(CT)扫描,在癌症病变以及其它疾病的检测和治疗中扮演了举足轻重的角色。例如,MRI技术为描绘和探索软组织结构与功能提供了功能强大的无创工具。实际上,MRI通过采用高强度磁场和射频信号可以产生三维组织图像。机械显像系统的使用使得对肿瘤病变进行检测成为可能;而对早期肿瘤病变以及肿瘤转移的检测仍是一大挑战。
显像剂已经被用于提高显像技术中图像的本征对比度。该方法依靠显像剂给药的方法放大图像中的病理组织和正常组织之间的对比度来进行。使用最为广泛的MRI显像剂类型是以钆离子(Gd3+)、锰离子(Mn2+)以及铁离子(Fe3+)螯合物为基础的,这些螯合物完全是具有T1反应性的细胞外小分子化合物,例如二乙烯三胺五醋酸(DTPA)。最后,显像剂的性能依赖于图像内在性能的改善以及药代动力学。
例如,被核准用于临床的基于Gd3+的显像剂主要是非特异性小分子。该Gd3+显像剂通常具有小于10mM-1s-1的弛豫率,其比预期值低20-50倍。弛豫率主要受到分子旋转相关时间的限制。使用最广泛的显像剂,DTPA,具有5mM-1s-1的R1弛豫率。根据该弛豫率,鲁棒的临床检测方法通常需要大剂量(>0.1mM的局部浓度)以便达到充分显像或者产生可接受的图像。此外,这种类型显像剂的循环时间很短,这就限制了数据收集时间窗口。改善这种显像剂的方法包括把小Gd试剂共价或非共价地连接到诸如树状大分子或共聚物等大分子物质上。
因此,始终都需要经改善的具备较高性能的显像剂来强化显像信号。同样需要可广泛用于各种组织、肿瘤、癌症以及多种疾病分子显像的基于蛋白的新型MRI显像试剂。还需要可以较长时间保留在组织和血管中,尤其是保留在动物和人类身上的显像剂。还需要将显像剂应用于特定的螯合位点以用于特定用途和显像技术。除了别的以外,本发明所涉及的正是众多需求中的这些需求。
发明内容
首先,本发明涉及具备调谐性质的用于诊断显像的一种新型显像剂。特别地,本发明涉及一种可在组织中累积的磁共振显像显像剂。这种新型显像剂包括诸如蛋白之类有机聚合物的骨架蛋白(scaffold protein),以及至少一个可螯合顺磁性重金属离子的经剪接的位点。所述至少一个经剪接金属离子结合位点在骨架蛋白中可结合到所选的折叠袋中。在大多数情况下,可结合到骨架蛋白上的位点不止一个。
该新型显像剂的研制可以通过设计剪接结合位点并把这些位点结合到骨架蛋白中的方法来实现。这些结合位点可以通过设计或接枝(grafting)的方法来开发。此外,其它方法,已知的或此后所研发的,都可以被用于设计适合于本发明的结合位点。在开发出位点之后,一个或多个位点可以以可操作的方式结合到骨架蛋白中的选择区域。该显像剂随后可以通过已知的输送方法施加到动物或人身上。
通过结合附图阅读下列优选实施方式的具体描述后,本领域技术人员可以更明确地认识到本发明的这些以及其它特点和优点,其中在所述附图的几个视图中,相同的附图标记代表相同的成分。
附图说明
图1A显示了根据本发明所制备的示例性显像剂。
图1B显示了根据本发明所制备的另一种示例性显像剂。
图1C显示了根据本发明所制备的又一种示例性显像剂。
图1D显示了根据本发明所制备的又一种示例性显像剂。
图1E显示了根据本发明所制备的再一种示例性显像剂。
图2为根据本发明阐述性实施方式所述的显像剂的示意图。
图3A显示了用各种显像剂以及DTPA所获得的磁共振图。
图3B显示了不同显像剂相对于DTPA的质子弛豫度。
图4A显示了工程化的具有不连续配体残基的金属结合蛋白的动力学性质。
图4B显示了具有连续金属结合位点的CA1-CD2的动力学性质(T1时间)。
图5A显示了在对鼠施用本发明所述的示例性显像剂之前诊断图像。
图5B显示了对鼠施用本发明所述的示例性显像剂之后另一诊断图像。
图5C显示了对鼠施用本发明所述的示例性显像剂之后又一诊断图像。
图5D显示了对鼠施用本发明所述的示例性显像剂之后再一诊断图像。
图6显示了根据本发明所述的各种显像剂在人血清中的活力。
图7显示了本发明示例性的含有白蛋白的显像剂的氨基酸序列(人工序列),其中白蛋白用作骨架蛋白。
图8-21显示了本发明示例性的含有CD2的显像剂的氨基酸序列(人工序列),其中CD2用作骨架蛋白。
图22-25显示了本发明示例性的含有GFP的显像剂的氨基酸序列(人工序列),其中GFP用作骨架蛋白。
定义
除非有其它特殊说明,本文中所有的技术和科学术语都具有和本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为了本发明的目的,对下列词汇作了限定。
词语“核酸分子”或者“多聚核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链形式的聚合体,并且,除非有其它特殊说明,包括了含有已知与天然核苷酸类似的多聚核苷酸,该类似物可以和天然形成的核苷酸以相同的方式起作用。例如,该词可以指单链和双链形式的DNA或RNA。核苷酸序列容易区别于。
词语“重组核酸分子”指非天然生成的含有两个或更多链接的多聚核苷酸序列的多聚核苷酸。重组核酸分子可以通过重组方法来生产,尤其是利用基因工程技术,或者可以利用化学合成方法来生产。重组核苷酸分子可以编码融合蛋白,例如和目标多肽相连的荧光蛋白。术语“重组宿主细胞”指含有或能够表达重组核酸分子的细胞。
术语“编码”在文中述及多肽时是指多聚核苷酸的转录和由其所产生的mRNA的翻译。编码多聚核苷酸被认为是包括了编码核苷酸序列与mRNA一致的链及其互补链。可以认识到编码核苷酸被认为是包括了变性的核苷酸序列,其编码相同的氨基酸残基。编码多肽的核苷酸序列包括含基因内含子和外显子的多聚核苷酸。核酸序列容易从氨基酸序列中读出,反之亦然。
术语“控制序列”是指影响编码和非编码序列表达所必需的多聚核苷酸序列。该控制序列包括启动子,核糖体结合位点,以及转录终止序列。词语“控制序列”意味着包括,在最小程度上,它的存在能够影响表达的成分,而且也包括它的存在会产生有利作用的额外成分。例如,引导序列和融合伴侣序列就是控制序列。
术语“可操作地结合”或其类似词语意指以物理或功能上相互关联的方式安置的多肽序列。在一个最优选的实施方式中,嵌合分子的多肽成分的功能相对于隔离部分的功能作用而言是不变的。例如,荧光蛋白可以和感兴趣的多肽融合并且在融合状态下保留其荧光,而感兴趣的多肽则保留其原始生物活性。
按照本文所使用的,涉及荧光蛋白术语“亮度”,作为给定波长下的消光系数(EC)以及荧光光子产率(QY)的结果被进行测量。
术语“探针”表示特异性结合到另一基质(“靶”)上物质。探针包括,例如,抗体、多聚核苷酸、受体和它们的配体,并且通常可以被标记以便提供识别或分离被探针特异性结合的分子的工具。
术语“多肽”或“蛋白”是指两个或多个氨基酸残基的聚合物。“多肽聚合物”(polypeptides)或“蛋白聚合物”(proteins)为通过酰胺键连接的氨基酸残基的聚合物(polymers)。按照本文定义,肽是天然氨基酸和非天然氨基酸(例如,β-丙胺酸、苯基甘氨酸和高精氨酸)的总合。而氨基酸是α-氨基酸,其既可以是L型光学异构体也可以是D型光学异构体,优选L型光学异构体。虽然,优选的氨基酸是那些可编码的氨基酸,但这些常常会遇到那些非基因编码的氨基酸。
术语“经分离的”或“经纯化的”指一种物质完全或基本上从那些在天然的原始状态下正常伴随该物质的成分中分离出来。纯度可以采用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱等分析化学技术进行检测。如果多聚核苷酸或多肽在制备物中是所存在的最少且主要的种类,则它们应被认为是经分离的。
术语“天然产生的”是指自然界所产生的蛋白、核酸分子、细胞或其它物质。天然产生的物质可以以天然形式存在,也可以用人工方法进行修饰,例如处于分离形式的状态。
如果氨基酸序列之间或核苷酸序列之间至少有80%的序列相同,或者和参考序列的共有序列大于给定的对比窗口,则这两种或者多种氨基酸序列或两种或多种核苷酸序列被认为是“基本相同”或“基本相似”的。因此,基本相似的序列包括那些具有,例如至少85%的序列一致性,至少90%的序列一致性,至少95%序列一致性,或者至少99%的序列一致性。
如果氨基酸序列之间或核苷酸序列之间至少有50%的序列相同,或者和参考序列的共有序列大于给定的对比窗口,则这两种或者多种氨基酸序列或两种或多种核苷酸序列被认为是“相似”的。因而,基本类似的序列包括被认为是“基本相同”或“基本相似”的核酸序列。
术语“荧光性质”是指在合适激发波长条件下摩尔消光系数、荧光量子效率、激发或发射光谱形状、最大激发波长和最大发射波长、在两个不同波长下激发光振幅比率、在两个不同波长下发射光振幅比率、激发状态寿命、或者荧光的各向异性。
术语“荧光蛋白”是指任何在用合适电磁能量激发时能够发射光波的蛋白。荧光蛋白包括具有天然或工程化的氨基酸序列,例如从Aequoreavictoria荧光蛋白种衍生而来的荧光蛋白。
术语“突变体”或“变种”也被用在本文中,其代表含有相对于野生型荧光蛋白而言的突变的荧光蛋白。此外,在本文中其含义涵盖荧光蛋白的“光学变种”或“光学突变体”,以便表示相对于相应野生型荧光蛋白具有不同荧光特性的突变荧光蛋白。
具体实施方式
本发明实施方式包括能够通过影响水分子质子弛豫速率的方式强化图像对比度的显像剂。该显像剂对磁共振显像来说是有效的,部分由于目的组织中的水弛豫速率受到的影响和周围组织中的水质子所受的影响不同。本文所公开的显像剂是顺磁的,与金属离子形成复合物,从而能使邻近核苷酸的弛豫速率发生改变。
特别地,本发明涉及一种具有调谐性质的新类型诊断显像剂,更加特别地,涉及一类可以在组织中累积的磁共振显像剂。该新型显像剂包括(a)可以是诸如蛋白之类的有机聚合物的骨架蛋白和(b)至少一个能够经剪接的金属离子结合位点,其中该至少一个经剪接的金属离子结合位点被结合到骨架蛋白的所选折叠袋中。
该新型显像剂可以通过涉及一种新型的经剪接的结合位点和可操作地把这些位点结合到骨架蛋白中的方式进行开发。按照后面更为详细的描述,该结合位点可以用设计或接枝的方法来开发。在开发出位点之后,一个或多个位点可以操作地结合到骨架蛋白的所选区域中。然后可以用已知的输送方法把该显像剂施加到动物或人身上。
在阐述性实施方式中,至少一种金属螯合位点嵌入到骨架蛋白中。在该实施方式中,金属螯合位点可以设置在骨架蛋白中以便该金属螯合位点处于显像剂的内部。优选地,通过以骨架蛋白的氨基酸作为配基来嵌入至少一个金属螯合位点从而螯合金属离子。更优选地,该至少一种金属结合位点被嵌入到蛋白中以使该骨架蛋白与其自身相似蛋白至少部分具有相关性。
在阐述性实施方式中,用于MRI的骨架蛋白是可以容纳经剪接的金属离子结合位点的蛋白,并具有下列特性:
(a)具有在生理环境中对抗细胞裂解和变性的稳定性;
(b)适合于金属离子位点结合的拓扑结构;
(c)对磁场而言是优选的旋转相关时间(例如,在1.3-3T的磁场中约100毫秒),例如,可以通过改变蛋白位点的方法来应用较高磁场;以及
(d)水交换率以便蛋白的弛豫度不会受到水交换率的限制。
骨架蛋白的优选性质包括水溶性,和其它细胞金属离子的低的相互作用性以及低毒性。如果对所有这些性质都不作要求,该骨架蛋白的最佳性质可以并且确实依赖于显像应用的特定参数。
骨架蛋白的一个重要性质是它可以接受金属离子位点被引入其中。优选地,该骨架蛋白具有折叠构造,三维结构或者与那些结构已经被至少部分地得到解析的蛋白具有一定同源性的氨基酸序列。例如,可以筛选骨架蛋白来确定其是否可以忍受各种结合位点的结合而不会有额外的变性。例如,把金属离子结合位点结合到骨架蛋白不会使蛋白变性或解折叠。因而,金属结合位点不应当设置在会使疏水核心突变或会导致基本结构混乱的位置。这可以通过相同家族的蛋白的序列比对来检测。优选地,具有在结构折叠中或功能中具有重要角色的氨基酸在相同类型蛋白的不同种之中是保守的。
在另一个实施方式中,骨架蛋白可以是螯合金属离子的天然蛋白。在该实施方式中,可以对天然金属结合位点进行修饰以便螯合重金属或顺磁金属或其它可用于诊断显像的金属。例如,可以通过修饰其中所含的氮或氧分子的方法对通常情况下结合Ca2+的骨架蛋白的氨基酸序列进行剪接以使其能够结合Gd3+。
优选地,金属离子结合位点被设置在骨架蛋白中以便金属能够和蛋白混合在一起。更佳的是寻找到不与蛋白体一样灵活或和蛋白体具有相同灵活性的位置以便和校正时间相匹配。在这种情况下,优选在蛋白中设计或创建结合袋。虽然插入也可以起作用,但是优选在相对不太灵活的位置上插入。通常,蛋白可以用观察pdb(蛋白数据库)结构文件中的B因子(X射线的温度因子)或S2因子(NMR的动态柔性系数)的方法来对蛋白进行检查。
多于一种金属结合位点可以被用于结合到骨架蛋白中。多于一种结合位点的包涵物可以改善显像剂的灵敏度。此外,在超过一种结合位点被结合到蛋白中的情况下,该位点对所选的金属具有不同的亲和性但仍具有足够强的亲和性从而避免生理性金属离子间的竞争。把两个金属离子嵌入到具有优选旋转相关性时间和水交换率的宿主蛋白中以提供灵敏度有所提高的MRI对比度。
在优选实施方式中,显像剂对金属离子具有高亲和性并能够优先选择特定的金属离子(例如Gd3+、Mn2+或Fe3+)。在一个实施例中,示例性的显像剂显示在具有生理性金属离子的环境中Gd3+的解离常数Kd小于108[M],并可以防止那些金属离子在生理条件下发生沉淀。因此,本发明可以被用于创建对于特定金属离子而言具有最佳选择性的显像剂。
本发明提供了一种用于提高显像剂弛豫度的新机制。其通过设计金属离子结合位点,例如Gd3+,在蛋白中,它可以消除现有显像剂中所伴随的螯合部分的易变性和灵活性。更特别地,通过剪接结合位点使得制备较高弛豫度的显像剂成为可能。显像剂的高质子弛豫度可以进一步强化显像。
本发明的一个优点在于其提供了可以优先螯合特定金属离子的显像剂。例如,优选的具有Gd3+结合位点(或多个结合位点)的显像剂可以优先于其它诸如Mg2+或Ca2 +金属离子而先螯合Gd3+。由于重金属对细胞或动物往往具有毒性,而能与金属离子形成更强结合物的显像剂的毒性则较小。基于此,优先螯合特定金属离子的能力可以提高显像剂的特异性并可以较小显像剂的细胞毒性。
在另一实施方式中,融合蛋白或非降解性颗粒部分可以和连接物一起加到蛋白显像剂以便为了最佳对比敏感度、定标(亚细胞、细胞、组织和器官选择性)、生物分布以及生物消除而对相关时间进行调整。本领域技术人员无需过多的实验就可以确定这种连接物。
在另一实施方式中,本发明可以被用于生产低密度显像剂微球。这种微球具有占微球总体积至少约75%的内部空间体积。微球可以具有不同的尺寸,并被设置成低密度。合适尺寸的微球包括那些外部直径大约在1-1000微米之间的微球。
本发明的显像剂可以用常规的药用或兽用方法和材料来配制。本发明所述的显像剂组合物可以采用诸如粉剂、溶液、悬浮液、分散剂之类的常规药物施用方式;然而,一般而言优选溶解在诸如注射液之类的生理上可接受载体媒介中的溶液、悬浮液和分散剂。例如,这些物质包括乳化剂、脂肪酸酯、胶凝剂、稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲液、防腐剂、抗菌剂、以及pH调节剂。因此,可以采用生理上可接受的载体或赋形剂按照完全属于本领域的方式来对本发明所述组合物进行配制以便于施用。
本发明的显像剂的施用可以通过多种途径实现,包括但不限于口服、皮下注射、静脉注射、鼻腔给药、透皮吸收、腹膜给药、肌注、肺部给药、阴道给药、直肠给药、或者眼部给药。优选地,输送机制包括非肠道施用(直接注射或输入)。依赖于介入方式,化合物可以用各种方式进行配制。制剂中活性成分的浓度约占0.01-100wt.%。
本发明显像剂的生物消除途径之一是肾脏。宏观结构最终可以通过RES来提炼并且优选可以通过可生物降解的键来螯合固定,该键的裂解会释放出能够经肾脏排泄的片段,例如分子量小于60KDa,优选小于10KDa,尤其是200-5000Da。为了改变生物消除途径,可以往蛋白显像剂中加入融合蛋白或非降解颗粒部分。
为了克服免疫性,本领域技术人员可以对显像剂进行修饰以便用于特定生物体。例如,对于用于鼠的显像剂,可以用结合鼠自身序列的方法来对显像剂进行修饰。此外,可以预知的是该显像剂可以包括人的序列。本发明所述基于蛋白的显像剂的另一个优点是它可以相对于容易地靶向特异性组织并对组织或诸如癌组织生长的分子图像进行生物标记。可以通过把脂质结合到特异性针对肿瘤相关抗原、粘附其上的凝集素或肽的单克隆抗体或抗体片段上的方法来实现显像剂有效靶向特定器官或组织。
骨架蛋白
适合本发明的骨架蛋白包括蛋白质或含氨基酸的有机聚合物。这种骨架蛋白包括天然氨基酸和非天然氨基酸(例如,β-丙胺酸、苯基甘氨酸以及高精氨酸)。如果氨基酸是α-氨基酸,而氨基酸是α-氨基酸,其既可以是L型光学异构体也可以是D型光学异构体,优选L型光学异构体。虽然,优选的氨基酸是那些可编码的氨基酸,但常常会遇到那些非基因编码的氨基酸。
本发明可以采用多种骨架蛋白,但一般而言它们都是蛋白、末端修饰蛋白以及有机聚合物。更特别的,可以根据诊断应用所使用的性质的来选择合适的骨架蛋白。用于本发明的骨架蛋白可以是单一结构的(微粒、多聚螯合物或分支状聚合物)。适用于本发明的骨架蛋白的选择无需过多的实验。
该骨架蛋白也可以是一般可以和金属离子结合的天然蛋白。在该实施方式中,对天然金属结合位点进行修饰以螯合重金属或顺磁性金属或其它可用于诊断显像的金属是可能的。例如,通过对其所含的氨基酸配基残基进行修饰的方法可以对一般结合Ca2+的骨架蛋白的氨基酸序列进行剪接以使其可以结合Gd3+。例如,技术人员可以修饰α-乳清蛋白的结合位点以使其结合Gd3+(例如,如图3所示)。在另一实施例中,可以对诸如钙调蛋白之类蛋白的EF-手相钙结合位点进行修饰以使其可以结合Gd3+(如CA9.CD2)。
在阐述性实施方式中,骨架蛋白可以依照下列标准选择:
1)表现出对pH变性以及蛋白水解裂解有较强的抵抗性。
2)蛋白的结构信息的可知性。如果可知的结构信息较少,其允许对金属结合位点进行合理的设计使其具有最佳的内部、次级和外部球状弛豫性以及金属结合性质,随后允许为对蛋白修饰进行结构预测。
3)可以经受不牺牲天然构象和折叠的突变。
4)适合于特殊应用的分子大小。优选的尺寸取决于特殊的诊断应用。例如,紧凑结构,例如11-30KDa的分子量以及10-30ns的旋转相关时间。此外,分子尺寸可以改善循环保留时间和组织穿透性。例如,较强的体内肾显像和延长的保留时间可以允许对诊断诸如肾癌之类的肾脏疾病作出更具体的肾脏显像系统,并可以允许对血流和体积作出更精确的测量。进一步地,蛋白框架具有合适尺寸就可以具备更好的组织穿透性,这会对某些大尺寸分枝状、纳米颗粒以及超顺磁颗粒造成限制。
5)可选地,骨架蛋白也可以具有固有的性质,其可以允许构建多功能探针结构并采用荧光作为工具以辅助设计分子显像的MRI显像剂而无需其它荧光素。
合适的蛋白包括诸如CD2蛋白(细胞粘合蛋白)之类来自免疫球蛋白G(IgG)超家族的蛋白,其表现出对蛋白水解、热环境(Tm67℃),pH(2-10)以及盐(0-4MNacl)变性有较高的稳定性。由于CD2蛋白在生理环境中较稳定、具有适合于至少一个或多个金属离子螯合位点结合的拓扑结构、以及一般具有大于10mM-1s-1的(它们中的一部分到达约50mM-1s-1)的弛豫度,因此这种蛋白适用于本发明。此外,CD2可以经受多个表面突变而不会造成蛋白解折叠。其它研究已经表明可以把CD2用作宿主蛋白来设计钙结合位点。下文会对采用了CD2的实施例作出描述。
荧光蛋白是本发明另一类优选的骨架蛋白,因为这些蛋白在生理环境中是稳定的,其可以对抗蛋白水解性降解以及pH变性(pH5-10)。这种荧光蛋白包括一系列包括那些与Aequorea相关的荧光蛋白。合适的荧光蛋白应当具有有用的激发和发射光谱并且可以从天然产生的Aequoreavictoria绿色荧光蛋白(GFPs)中产生。这种经修饰的GFPs可以修饰核酸和蛋白序列并包括来自其它蛋白的组件。GFPs的cDNA可以用那些编码多种其它蛋白的DNA进行连接——结果是嵌合体通常具有荧光并保留伴侣蛋白的生物化学特性。黄色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白以及红色荧光蛋白也可作为骨架蛋白应用于显像剂中。这种蛋白也包括在本发明中。
已知包括细胞外受体和生长因子的其它合适蛋白具有蛋白裂解的稳定性。此外,来自四螺旋束结构家族(例如Rop)的蛋白、麦芽糖结合蛋白家族以及硫氧还蛋白家族也表现出接受突变和金属结合位点。然而本发明的发明人并没有对每种适用于骨架蛋白的蛋白质一一作测试,大批不同的经检测的蛋白显示本发明包括符合本文所述标准的所有蛋白。可以预见本领域技术人员可以利用普通研究技术和本文所述的标准作为为基础来开发并选择合适的骨架蛋白。
使用荧光蛋白的优点在于用这种蛋白构建的显像剂是多功能的探针。在本实施方式中,用荧光蛋白构建的显像剂可以利用荧光和MR显像进行筛选。由于这种蛋白给显像剂配备了荧光检测法所需的荧光和用MRI进行深层组织检测所需的灵敏度,因此这是其尤为突出的优点。这种显像剂是一种多功能的显像剂。
其它蛋白也可用作本发明的骨架蛋白。优选地,骨架蛋白能够经受增加金属离子结合位点而基本不会对其结构造成破坏。本领域技术人员不用作过多的实验就可以选择出优选的骨架蛋白。
金属离子结合位点
金属离子结合位点的亲和性会改变显像剂对金属的亲和性。特别地,由于金属离子结合位点的亲和性和灵敏度可以进行修饰,因此显像剂的弛豫度和金属亲和性也可以进行修饰。优选地,金属结合位点具有最佳的显像性质,包括金属亲和性、选择性、弛豫度、核磁弛豫消散(NMRD)图谱、和水交换率。
本领域技术人员可以采用本领域已知方法或以后开发出的方法来开发具有最佳性质的金属位点。例如,本发明的金属离子结合位点至少可以通过这些方法来构建:
(1)计算机设计方法,其中基于金属离子和其它基团的最佳结合性质,对金属离子具有选择性和亲和性的金属结合位点重新进行制备和合理的设计;
(2)接技方法,其中通过改变确定的结合位点的一级、二级、三级和/或四级结构来制备和构建对金属离子具有选择性和亲和性的金属结合位点;以及
(3)已知或以后开发的其它方法,以及已知或以后开发的方法的组合。
1.计算机设计法
计算机设计法着重于重头设计金属离子结合位点。该设计法注重使用算法来构建和制备最佳的结合位点。优选地,计算机设计法通过例如,改变位点的配位几何构型、配位层中的水分子数目、配基类型以及电荷的方式而被用于重建优选结合位点。
计算机设计法包括如下步骤:
(1)登录一个或多个包含金属离子结合位点结构、配位、和/或三维结构或模式的数据库,或者创建基于和其它金属结合位点同源序列的模式结构;
(2)从结构数据部分生成一个或多个初级金属离子结合位点;
(3)基于配位几何构型从所生成的初级结合位点中合理地选择一个或多个合适的金属离子;以及
(4)通过剪接和调谐所选金属离子结合位点来创建金属离子结合位点。
该金属离子结合位点可以结合到骨架蛋白中,例如荧光或CD2蛋白。进一步地,该方法可以用于改变蛋白的金属离子结合性质并生成具有各种离子结合亲和性的新材料。
更加特别地,该方法包括为了获取金属离子结合位点的优选要素而搜寻和登陆公共和或私有数据库。这些用于搜寻标准或要素的数据库包括公共领域的数据库(例如生物技术信息国家中心(NBCI))或美国国家健康研究所的PubMed或者诸如蛋白模拟结构数据库(例如剑桥或RCSB蛋白数据库和BioMagResBank数据库)之类的知识库或者其它生物技术数据库。此外,数据库包括金属离子结合蛋白的结构数据,这些蛋白的结构特征已经在之前被确定了。本领域技术人员能够确定出适合于本发明的数据库以及数据库的物质来源。采用具有因特网和内联网能力的计算机可明显地大大加快搜索,这种计算机也是优选的。
这些数据库可以用于对一千到几千个能和蛋白结合的不同小分子或金属离子的进行结构分析。该分析包括局部配位性质,通常可用于结合期望金属离子的残基或微粒的类型、化学性质(例如pKa或电荷)、位点中带电残基的数量、以及已知结合位点的范围和偏离。该分析进一步包括环境,例如微粒类型、残基、疏水性、可溶性、金属结合位点形状、电迁移势以及动力学性质(例如蛋白的B因子或秩序因子)等。该分析也包括该结合位点相对于特定的金属离子而言是连续的结合位点或是不连续的结合位点。
一旦采用结构数据并经分析从而发现了初级金属离子结合位点,就可以基于合理参数而生成一个或多个合适的金属离子结合位点。特别地,基于除了例如构型描述符之外的其它关键特征,可以采用不同搜索算法来生成潜在的金属离子结合位点。这些关键特征包括骨架蛋白中的原始残基、对折叠所必需的配基位置、带电残基的数目以及它们的设置和配位外形中的水分子。氢键网和对所设计配体残基的静电作用也可以被估算。而且,还可以根据溶解性、电荷分布、骨干柔性以及骨架蛋白的特性来分析金属离子结合位点的蛋白环境。由此,本领域技术人员可以基于期望的参数来合理地选择结合位点。
一旦金属结合位点生成了,可以采用两种互补的计算机设计和接技(见下文)方法来对位点进行剪接。首先,按照上面所述,可以采用接枝法来剪接金属离子结合位点,其中一级、二级、三级和/或四级结构是调谐的。然后,采用计算机设计法来剪接金属离子结合位点。可以理解的是这两种方法中的一个或全部是可以用于剪接结合位点。
计算机设计法包括通过修饰骨架中的金属结合位点残基的方法来修饰金属离子结合位点。在一个实施方式中,可以通过计算机,围绕金属离子的对配体进行的构型或统计性描述、蛋白骨干的三维结构、以及氨基酸(或来自主链的微粒)的文库边缘链旋转异构体可以识别一系列潜在的金属结合位点。采用对特定计算离子位点的几何构型和图形的描述,关键配体的残基可以被仔细地按放在氨基酸序列中从而形成金属(金属离子)结合袋。该结合袋可以通过根据配位描述和使用者优选的亲和性而设计的计算机算法而自动得以创建。
可以对所创建的潜在金属离子结合位点进行最优化并调谐至规格。可以根据金属结合位点的需要或灵活性来使用具有不同柔韧程度的金属离子结合位点的骨干结构。所设计的金属离子结合位点可以基于局部因素而进一步的评分、筛选,其中包括金属结合位点的形状、位置、电荷数、动力学性质、所需的突变数、溶解性以及边缘链碰撞。在配位外形中水分子的具有一个或两个氧微粒而又不会减小所需的结合亲和性和选择性,这对实现最大的弛豫度而言是重要的。
可以基于几个对有助于金属离子亲和性的模式因子来开发设计位点的较强金属结合亲和性。例如,配体残基的数目是与特定金属直接进行螯合的因素。在一些情况下,为了具备较强的金属离子亲和性Kd,其对测量金属离子浓度来说是必须的,有必要包括来自用于最佳金属离子结合的蛋白框架的残基。在其它情况下,残基的电荷数能够改变金属离子的亲和性。在又一其它情况下,由于螯合物的结合优选性依赖于特定配体类型,因此配体类型是一个影响因素。其它因素,例如负电环境,有助于金属离子结合蛋白的结合亲和性并且可以由本领域技术人员考虑到而无需过多的实验。这些带电残基可以提高水交换率以避免其对所选弛豫度的限制。
该计算机方法的阐述性描述为采用所选的关于金属离子结合位点的标准来查询一个或多个包括金属结合蛋白位点的结构数据的数据库,从而生成至少一个基于采用了所选标准的最佳兼容性的初始金属离子结合位点。一旦选择了合适的金属离子结合位点,便能对所选金属离子结合位点的核酸序列进行获取、剪接并可操作地连接到骨架蛋白序列,其中对所选金属离子结合位点的核酸序列进行剪接以便获得对金属离子具有期望特异性的金属离子结合位点。此外,编码一级结合位点的核酸序列可以从结构或模式数据中生成。计算机方法也可用于产生金属结合位点。
计算机方法可以用包含至少一个数据库的系统来实现,其中所述数据库具有金属离子结合位点的结构数据,从采用了与金属离子结合位点相关标准的部分结构或模式数据中生成一级金属结合位点以及对基于所选金属离子特异性的一级金属结合位点进行鉴定的算法,和用于执行算法的计算机以便查询数据库以生成一级金属离子结合位点。该算法总体上是相对简单的搜索算法,它可以基于所输入的标准来查询数据库。
2.接枝法
接枝法集中于通过对确定的结合位点的一级、二级、三级和/或四级结构进行修饰来制备和构建金属结合位点。通过选择性地操作结合位点的结构,使得能够获取可以植入骨架蛋白中的金属离子结合位点,例如CD2或荧光蛋白,而不会明显地造成蛋白变性。采用接枝法,可以获得对某种金属离子比对另一种金属离子具有更强优选性的结合位点。这种修饰可以提高对比效果。
首先,采用了接枝法的经识别的结合位点可以是对金属离子具有一定亲和性的连续的序列位点。该结合位点既可以是源于诸如独立EF-手相的已知结合肽也可以源自显示出结合特定金属能力的短片段,例如α乳清蛋白。这种肽在自然界中非常保守,且遍布在自然界中或者可以是非天然的但是已知对特定金属离子具有亲和性。本领域技术人员能够确定对金属离子具有亲和性的结合位点而无需过多的实验。一旦确定了结合位点,该金属结合位点的一级结构可以被替换并调谐以获取具有较好结合性能的金属结合位点。例如,诸如门冬氨酸和谷氨酸等具有更多带电配体的残基,可以通过往金属离子结合位点中插入密码子(多个密码子)的方法植入其中从而调谐该位点或骨架蛋白的响应度。额外的带电配体的包涵物允许显像剂实现对所选顺磁金属离子的亲和性以及具有期望的选择性。此外,也可以通过对配体残基和其环境进行移除或修饰的方法把一个或两个水分子引入配位层。此外,其它一级结构的突变包括去除或增加氨基酸以改变诸如柔性或刚性等位点性质。从结合位点中加入或移除氨基酸可以改变结合位点的一级结构。
金属离子结合位点的二级结构,也就是,在线型序列中相互靠近的氨基酸残基的空间排布,可以被修饰以便对金属离子结合位点的灵敏度和响应度进行调谐。位点本身的残基,诸如螺旋、β链或转角之类的两侧或邻接的结构可以通过改变诸如疏水性、盐桥、二级结构倾向(例如螺旋,和β片)以及与不同氨基酸的相互作用而得到改变,其中上述性质本身都可以改变二级结构。
金属离子结合位点的三级结构可以被修饰以便进一步调谐金属结合位点的灵敏度和响应度。金属离子结合位点对金属离子的亲和性可以根据选择性地操纵和加入螺旋、环、桥和/或衔接物的不同以及诸如氢键、静电作用和疏水作用之类的化学性质的不同而有所不同。实际上,这些三级结构的改变可以通过提升二级机构的倾向性,加入边缘链的电荷作用以及通过稳定金属离子结合配位化学从而增加稳定性和亲和性。因此,通过调谐金属离子结合位点的三级结构来提高或降低连续结合位点的结合亲和性是可能的。此外,动力学性质可以通过提高蛋白的包装以及用氨基酸或具有更强刚性(例如Pro)或柔性(例如Gly)的其它基团来替换残基,或者添加二硫键的方法修饰动力学特性。
直接改变金属离子结合位点的一级、二级、和/或三级结构的一种方法是通过改变位点的电荷。由于任何结合位点的电荷在位点结构中具有重要作用,因此电荷的改变或电荷比率的变化对位点的结构具有重要影响。更重要的是,由于带电的侧链即便不直接被用作配体其也对金属离子结构亲和性展现出较强的影响力,因此,这些各种不同的链会导致金属离子结合亲和性和选择性的差异。通过设计或修饰位点,例如改变带电配体残基的数目来形成金属离子结合袋,金属离子结构位点对所期望的金属离子可以比竞争性金属离子具备更强的亲和性和选择性,例如,金属结合位点的金属离子结合亲和性可以随金属离子结合位点和/或邻近环境中带电侧链的不同而不同。用例如丙氨酸等残基来替换诸如门冬氨酸或谷氨酸之类的带电残基可以出乎意料地使金属离子结合亲和力减少高达100倍。
就多功能显像剂来说,例如如果显像剂使荧光蛋白时,需要诱导金属结合位点但不能显著改变发色团的环境因为这样会减小荧光/光信号。这些金属结合位点可以添加到远离发色团的位置或者简单地融合到荧光团中。这种位置可以明显地从序列或蛋白折叠中找到。
在其它实施方式中,接枝方法可以和设计法一起使用以便创建最佳的金属结合位点。例如,金属结合位点可以通过使用由计算机设计所获得的部分连续结合位点和部分配体残基来创建。蛋白的环或任何序列可以移除或修饰以便获得最佳的所学结合亲和性、金属选择性、弛豫度和稳定性。因此,通过改变金属结合位点的一级、二级和/或三级结构,使得获取具有所期望特异性的和亲和性以及更多重要显像性能的金属离子结合位点成为可能。
3.其它方法
金属离子的螯合或结合可以采用已知或以后发明的方法来进行研发。这些方法包括现有技术中容易获得的蛋白质工程法,其包括通过修饰已有的金属结合位点来改变金属结合特异性和动力学性质。这些方法也包括用蛋白质配体残基来修饰已有结合位点或将其融合到具有其它分子的蛋白显像剂中。其包括用其它含非天然氨基酸或碳水化合物或磷酸盐等其它分子/辅基的金属结合位点构象。用于蛋白质制备或设计合适方式的示例性方法在Barondeau D.P和GetzoffE.D.,蛋白-金属离子结合关系的结构探索(Structural Insights into Protein-metal Ion Partnerships),CurrentOpinon in chemical Biology,2004,14:7;和Lu,Y,含非天然氨基酸或非原始的金属辅助因子的蛋白质的设计和制备(Design and Engineeringof Metalloproteins Containing Unnatural Amino Acids or Non-NativeMetal-Containing Cofactors),Current Opinon in chemical Biology,2005。这两篇文献的全部内容以参考的方式的结合在本文中。
此外,可以对方法进行组合来制备期望的金属离子鳌合位点。
在骨架蛋白中选择合适的金属离子结合位点
金属结合位点可以选择性地引入多个骨架蛋白位点中而基本不损害二级结构。现有技术已知有许多用于确定诸如CD2蛋白、荧光蛋白(例如GFP、YFP、CFP和RFP)等蛋白质上结合位点的方法,包括例如控制位点的定向突变、插入突变以及缺失突变。其它方法,包括下面所举的和实施例中的例子,都是已知的或者是本领域技术人员容易理解的。
能够经受金属结合位点插入的荧光蛋白的位点也是可以通过基因操纵和筛选所确定和识别的。通过生成突变蛋白以及操纵DNA序列,可以得到多种不同的插入,随后可以对其进行筛选以确定该蛋白是否维持了其固有的活性。优选地,移除或损害荧光蛋白内在荧光性的位点不是最佳的,应当筛除。照这样方式所识别的变异体中暴露出可以经受插入却依旧保持其荧光性的位点。
用于骨架蛋白的优选金属离子结合位点可以通过考虑五项标准来优化金属结合位点、荧光蛋白和蛋白质环境的局部性质,第一,金属离子结合位点的构型相对于所期望的配位构型应当具有相对较小的异化。第二,根据对金属离子所期望的亲和性(Kd),负电荷残基的变化应当不多于3-5个电荷。第三,金属离子螯合位点的水配位层应当能够和至少1-2水分子发生配位。第四,蛋白折叠和显像剂所需的快速动力学希望获取来自二级结构之间的环的具有良好溶解性的残基。
金属离子结合位点的突变或引入应当基本上不会妨碍蛋白的合成和折叠。更别地,金属离子结合位点的引入不应当妨碍翻译后的发色团构象或者稳定发色团和蛋白框架折叠所需的分子间作用力。此外,所引入的侧链不应当被第二层包装并且不应当和骨架蛋白(例如,荧光蛋白)的蛋白质框架发生碰撞。虽然直接将发色团残基用作螯合位点并不是优选的,但是其也属于本发明的范围之内。
金属离子
金属离子是微粒和离子,包括各自的同位素以及放射性同位素,其可以结合到蛋白或肽上。金属离子可以进行可逆或不可逆地结合,并且这种键可以是共价的也可以是非共价的。如果本发明优选实施方式中使用Gd3+作为MRI显像剂的示例性金属离子,可以理解适用于本发明的金属离子包括但不限于这些金属离子,其包括顺磁性金属离子、过渡金属离子以及镧系离子。示例性金属离子包括但不限于,镁、钙、钪、钛、锰、铁、硼、铬、钴、镍、铜、锌、镓、锶、钇、锶、锝、钌、铟、铪、钨、铼、锇以及铋的离子及其同位素、和/或放射性同位素形式。在本发明中也可以采用金属的放射性同位素。本发明优选使用顺磁性金属离子。
显像剂螯合离子的选择部分取决于离子在诊断中的角色。可以通过例如螯合的方法进行结合的金属包括镧系和其它金属离子,其包括它们的同位素和放射性同位素。在MR显像应用中,优选的金属离子是钆等顺磁性金属离子。本领域技术人员可以基于预期的诊断应用来选择螯合用的金属离子,而无需过多的实验。
如上所述,本发明中处于显像剂形成的螯合复合物中的金属离子的选择有赖于采用该试剂的诊断技术。对于MRI或MRS或EPR应用,金属离子应当是顺磁性的(具有不成对电子的离子),并且优选是非放射性的。对于X射线和超声显像,应当采用例如至少30个、优选50个微粒数的重金属离子,更优选是非放射性的。对于闪烁扫描法而言,该金属离子应当是放射性同位素离子。对于MR、X射线、EIT或磁力显像而言,技术人员可以使用螯合基团来结合重金属簇(例如,多金属氧酸盐以及全部或部分硫似物)或者结合氧化铁或者其它超顺磁多微粒物质。
用螯合剂和多聚螯合剂结合金属离子的方法对本领域技术人员来说是已知的。金属可以通过直接结合、模板合成以及转甲基作用而结合到显像剂中,也就是经剪接的结合位点上。优选地,金属离子可以通过直接结合法与显像剂螯合,其包括用亚化学计量溶液进行滴定直至达到完全结合的水平。
实施例
在下列实施例中,发明人集中于完全不同的蛋白质,即免疫球蛋白超家族蛋白质以及荧光蛋白。例如,出于几个原因,选用细胞粘附蛋白CD2的结构域1和绿色荧光蛋白作为连接所制备的多种不同金属(例如Gd3+)结合位点的骨架蛋白(例如附图1A和1B)。进一步地,CD2变异体的6D79的三维模型结构根据设计金属结合位点(球)的不同而有所不同,而6D79和7E15的模型结构则基于鼠CD2(1hng)的结构域1。GFP(1b9c)的3D结构具有设计的Gd3+位点和突出的发色团。Gd3+结合残基和邻近的残基已经被显示出来了。该接近于链B的残基也在图中显示。例如,图1A显示了具有设计金属结合位点的CD2的三维结构。动力学性质经历了相对较大变化的回环被显示成红色。在连续几个残基都被染色的情况下,只对一个残基作了标记。
第一,这些蛋白在对抗pH变性和蛋白水解性裂解方面具有较强的稳定性。例如,已知GFP是特别稳定的并且不会被诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶。此外,之前的研究已经表明CD2的结构域1在pH2-11之间可以维持其天然构象。
第二,CD2和GFP的各种结构信息是可以获知的,其允许设计合理地设计具有优化的内部、次级和外部球形弛豫以及金属结合性质的金属结合位点。
第三,这些蛋白经受突变而不至于损害它们的天然构象和折叠。
第四,这些蛋白具有紧密结构,分子量在11-30KDa之间,其旋转相关时间为10-30ns。这些蛋白已经匹配于目前临床所允许的磁场强度的优化弛豫度。
第五,分子尺寸适用于良好的循环和组织穿透。
第六,对GFP而言,固有的荧光允许构建多功能探针,并且其荧光被用作设计分子显像用的MRI显像剂的辅助工具,而无需其它荧光团。
图2显示了这种方法的离子,其中几个Gd3+结合位点被设计在CD2的不同位置上。Gd3+、Tb3+、La3+和其它镧系金属离子具有与Ca2+相似的配位性质。在示意性的具有一个被大量水分子包围的内部球形水分子的Gd3+螯合剂中,τR表示分子的旋转相关时间,Kex表示水/质子交换率或者是等同配位水τm驻留寿命的倒数,而1/T1,2e表示Gd3+电子旋转的弛豫率。他们都强烈地优先选择来自Asp、Glu、Asn和Gln中羧基侧链的氧微粒。小的螯合剂螯合物相对于Gd3+和Ca2+通常各自具有8个和7个配位氧微粒。
对于诸如蛋白质之类的大分子而言,可能是由于空间位阻效应其配位数目要稍稍小一些。Gd3+和Ca2+各自的平均值是7.2和6.5。五角双锥体构型和潜在的金属结合配体残基被用于采用计算机算法来创建CD2中的金属结合位点当中,其参数基于发明人的选择。由于Gd3+是高度带正电荷的,因此在配位层上设置了更多带负电的残基以便提高对Gd3+的亲和性并超过Ca2+。具有不同数量配位水(q=1和2)的金属结合位点已经被设计到CD2之中(用CA.CD2表示)。例如,CA1.CD2(见下文),该金属结合配体残基来自蛋白的不同位置从而形成金属结合袋(不连续的),同时CA9.CD2(见下文)含有通过来自柔性甘氨酸连接物钙调素的连续EF-手相回环所形成的金属结合位点。对该位点进行设计从而对之前所报道的结合有大分子的高弹性显像剂进行模拟并验证我们的假设。
如图7-25所示,示例性显像剂的氨基酸序列分别显示在序列号(Sequence Id.Nos.)为1-19的序列中。
用于重头(de novo)设计蛋白质中结合位点的计算机方法
计算机方法被用于把金属结合位点设计到骨架蛋白中去。例如,本发明人之前所公开的研究公开了已经确定的参数,例如最普通的具有诸如D、N、E、Q羧基和/或主链羧基氧微粒的潜在配体残基的Ca2+结合位点所具有的五角双锥体构型。这样所获得的蛋白在生理条件形优先结合Ca2+而不是结合Mg2+(10mM)和K+(150mM)。
这些实验导致可以设计出具有把高配位数(7)金属位点构建到β折叠片蛋白中的金属蛋白。Gd3+和Ca2+具有类似的配位构型和性质。为了把新的Gd3+结合位点设计到蛋白中,发明人通过对小螯合剂和蛋白中的Gd3+结合位点进行具体的结构分析来开始研究。
如图1A、1B和1C(CD2衍生物)所示,发明人已经对所设计的金属结合蛋白中的一种作出了NMR结构解析。结构研究表明所设计的蛋白中配位构型和所设计的结构是相同的。该结构轮廓可以有助于Gd3+结合蛋白的进一步设计。Gd3+结合蛋白也可以采用发达的计算机法来进行设计。
利用Ca2+结合蛋白的信息来设计Gd3+结合蛋白
可以采用发达的计算机法来设计Gd3+结合蛋白。因为Gd3+结合蛋白具有较多的正电荷数,配位层中更多的带电残基可以提高对Gd3+的选择性,其比Ca2+要高。为了系统地评价金属选择性的关键因素,创建了在金属配位层中具有不同数目的带电配体残基(2-5)的CD变异体。负电荷残基的数量越多,对Gd3+和Tb3+的亲和性越强,且其亲和性比钙要高。所获得的蛋白质在生理条件下可以选择性地结合Gd3+而不结合Ca2+,Gd3+和Tb3+的Kd值<0.01μM而钙Kd值则>50μM。
发明人采用已经建立的计算机算法已经在GFP中设计出具有五角双锥体构型并具有7个配体的Gd3+结合位点。图1C显示了设计位点中的其中几个,它们处于不同位置。具有所设计的金属结合位点的GFP变异体对Gd3+的类似物Tb3+展现出较强的金属结合亲和性。这表明已经开发出用于设计金属结合位点的一般方法。
金属结合的亲和性和选择性
由于Tb3+和Gd3+具有类似的离子大小。先进的Tb3+敏感荧光振动能转换(FRET)方法可以用于测量Gd3+的结合。参见Ye Y.等,骨架蛋白的金属结合亲和性和其独立EF-回环的结构性质(Metal BindingAffinity and Structural Properties of an Isolated EF-Loop in a ScaffoldProtein),Protein Eng,14,1001-13(2001)。用本方法可以获得金属结合亲和性的较低限制。加入Gd3+来竞争结合Tb3+结合袋,并显示Tb3+FRET增强的降低。因此,便可以测定Gd3+的结合亲和性了。为了以已知的乙二醇双(2-氨乙基醚)四乙酸(EGTA)稳定性常数为比较对金属亲和性进行准确测定,本发明人已经采用Tb3+TRET法获取了相同条件下Tb3+相对于EGTA的相对结合常数。从而可以准确获知所设计的显像剂的稳定性。
所设计的显像剂显示出高的MRI质子弛豫度
在优选显像剂的设计中,应当考虑下列因素:
1)为了获取更好的图象,需要高的弛豫度,尤其是对T1而言。
2)为所期望的组织的分子显像提供特定的体内分布。
3)由于游离的Gd3+是有毒的,因而结合了金属的显像剂的毒性(可以忽略或低的)是个先决条件。显像剂在热力学和动力学上是稳定的,例如高结合亲和性和非常低的分离率,其可以使有毒的游离Gd3+的释放达到最小化。显像剂应具有较高弛豫度以及靶向特定组织和器官的能力或可以极大地减小其显像所需浓度和毒性。此外,结合了Gd3+的显像剂不会和蛋白竞争地结合金属。
4)为允许显像和较小毒性所需的机体中试剂的溶解性和消除时间。蛋白质配体残基直接配位Gd3+离子可以消除聚合物和蛋白结合物中顺磁部分的高内在迁移率。
在3特斯拉(Tesla)磁场中测定弛豫时间T1和T2。采用反转恢复来测定T1,并用多回波(multi-echo)Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列测定T2。在以1∶1的摩尔比加入Gd3+并在Gd3+结合之前计算弛豫参数并对样品进行显像。如表1所示(见下文),所设计的显像剂CA1.CD2表现出的T1弛豫度高达48mM-1s-1,和DTPA相比灵敏度提高约10倍。浓度为50uM的显像剂CA1.CD2能够产生桥状图像,同时Gd-DTPA则不会产生可见的图象。这暗示明显较低的局部浓度(~10μM)对顺利显像而言是足够的。此外,其它几个所设计的CD2变异体,例如CA3.CD2-6D79和EEDDN也表现出>30mM-1s-1的弛豫度值。另一方面,来自钙调节素(CA9.CD2)的具有接枝EF回环III的CD2和DTPA具有相似的弛豫度,这可能是由于金属结合位点存在内在迁移率。
表1
不同类型显像剂的T1质子弛豫度
类型 | 化合物 | T1弛豫度(mM-1s-1) | 金属数目 | 磁场Bo(T) | 分子量(MW)(KDa) |
*小化合物 | GdDTPA | 4.5 | 1 | 1.5 | 0.743 |
所设计的显像剂 | |||||
序列1 | CA0.1ac | 4.2 | 1 | 3 | 14.5 |
序列2 | CA1.CD2** | 48 | 1 | 3 | 12 |
序列3 | CA1.CD2-EEDDE | 37 | 1 | 3 | 12 |
序列4 | CA1.CD2-EEDDN | 36 | 1 | 3 | 12 |
序列5 | CA1.CD2-EEDDQ | 14 | 1 | 3 | 12 |
序列6 | CA1.CD2-NENDN | 9 | 1 | 3 | 12 |
序列7 | CA1.CD2-EENDN | 34 | 1 | 3 | 12 |
序列8 | CA2.CD2-6D31 | 34 | 1 | 3 | 12 |
序列9 | CA2.CD2-R31K | 37 | 1 | 3 | 12 |
序列10 | CA3.CD2-6D79 | 35 | 1 | 3 | 12 |
序列11 | CA9.CD2 | 5 | 1 | 3 | 12 |
*来自参考文献
所设计蛋白的质子弛豫在存在过量Ca2+的情况下也不会改变,并且较强的天然Ca2+结合蛋白不具有加强的质子弛豫度。为了评价模拟细胞外环境中Gd3+结合的稳定性以及评价其它处于所设计Gd3+结合蛋白的弛豫上的生物金属离子,在Ca2+和Gd3+的比例为1∶1或100∶1(直至10mM Ca2+)的情况下测定T1参数。表1中的结果显示常规开发的显像剂的弛豫在100倍过量Ca2+存在的情况下并不会受到明显的影响。
用源自不同器官的组织和鼠血清来进一步测定这些所设计的显像剂的弛豫度,测定时间超过两天。没有观察到明显的弛豫度值的改变,这进一步表明那些经过纯设计而得的显像剂具有体内稳定性。
在以1∶1的摩尔比加入Gd3+之前和之后对样品进行显像并对弛豫参数进行计算。图3A示出了样品顺序,从最上面一行的左边到右边,然后到第二行,从左到右,随后第三行从左到右分别是:1)dH2O,2)Tris,3)Gd-DTPA的水溶液,0.10mM Gd3+,4)Gd-DTPA的Tris溶液,0.10mM Gd3+,5)0.092mM Gd3+-w.t.CD2,6)0.077mM Gd3+-CA4.CD2,7)0.10mM Gd3+-CA2.6D31,8)0.10mM Gd3+-CA9.CD2,9)0.020mM Gd3+-CA1.CD2-GST,以及10)0.050mM Gd3+-CA1.CD2。图3B显示采用旋转回声序列所产生的MR图像,在3T的磁场中TR6000ms,TI960ms,TE7.6ms。这些结果表明在骨架蛋白中创建结合位点获得了成功,其可以优先选择与Gd3+进行结合。
所设计金属结合蛋白的相关时间
发明人也把高分辨率核磁共振(NMR)用于探测所设计金属结合蛋白的动力学性质。图4A显示了两种制备的金属结合蛋白的动力学性质。图4B显示了具有不连续配体残基的CA1-CD2的顺序因子,这些在骨架蛋白中具有相同的动力学性质。具有由柔性Gly连接物所连接的连续金属结合位点的CA9.CD2的T1值。该金属结合位点比基于柔性连接物的骨架蛋白具有明显更高的柔性。
所设计的金属结合蛋白的整体相关时间为9.2ns,其于类似大小的蛋白一致。配体残基的顺序因子S2与蛋白的平均值相似。因此,所测得的蛋白相关时间直接反映金属结合位点的τR。另一方面,具有钙调节素接枝EF-回环III的CD2显示出比宿主蛋白更好的柔性。综上,这些结果显示蛋白中所设计的迁移率最小化的金属结合位点可以提高质子弛豫度。
所设计的显像剂的血清稳定性
通过把与等摩尔GdCl3复合的设计蛋白与人血清进行孵育的方法来研究所设计的显像剂的血清稳定性。示例性显像剂的弛豫度在人血清中没有变化并且在100倍过量Ca2+存在的情况下也没有受到明显的影响。此外,这些所设计的显像剂在人血清中孵育超过48小时。
通过设计开发基于蛋白的显像剂
根据Blombergen、Solomon和其它人所建立的理论以及这些结果,配位层中的水q、τR旋转相关时间以及水交换率是质子弛豫度的关键因素。所建立的用于在CD2的结构域1和GFP中设计额外Gd3+的设计方法可以对下列因素进行优化以实现更高的MRI弛豫信号。
1)不同的配位构型:Gd3+被期望比Ca2+多具有一个或两个配位氧配体。已经表明所设计的具有五角六锥体构型以及4-5个带负电荷的配体残基能够牢固地结合Gd3+,并且对Ca2+和Mg2+具有良好的选择性。为了测试增加配体微粒是否能够增加金属结合的亲和性和选择性,通过改变表2所示的总共具有6-8个配体残基的骨架蛋白的配位构型,可以对骨架蛋白中的金属结合位点进行设计。
表2
通过蛋白和水的不同配位数来设计金属结合位点
总的配体数 | 1H2O | 2H2O | 3H2O |
7 | 6p | 5p | 4p |
8 | 7p | 6p | 5p |
9 | 8p | 7p | 6p |
2)改变配位层中的水数目q:增加配位层中的水分子数可以提高弛豫度,而金属结合亲和性和选择性则可以折中。已经设计了配位层中具有1-3个含水的结合水(hydraed water)氧微粒金属结合位点(表3),其中配位层中的总配位数为7-9,来测试用两个配位水微粒又不牺牲结合亲和性和选择性的方式是否可以实现最大的质子弛豫度。
3)改变配体类型和带电配体残基的数目:由于Gd3+比Ca2+更优先选择具有负电荷的配体,因此通过改变图3所示的作为位点7E15配体残基的Asp和Glu的数量设计了总共带2-6个负电荷的配体残基。更多的负电荷有望加强Gd3+的结合亲和性和稳定性。通过方便内部和外部水交换也可以提高弛豫度。
4)改变金属结合位点的位置:选择合适的金属结合位点不仅对蛋白折叠和稳定性来说是必要的,而且对质子弛豫度而言也是必要的,因为蛋白环境会对二级和外部球形水交换性质的产生影响。表3列出了CD2中不同位置上所设计的金属结合位点。
表3
在CD2上设计的金属结合位点
所设计的位点 | 配体残基 |
CD2-6D15(CA4.CD2) | N15D,N17D,N60,D62 |
CD2-7E15(CA1.CD2) | N15E,L58E,K64D,E56,D62 |
CD2-6D79(CA3.CD2) | A92E,T79D,N77,E33,N90 |
CD2-6D31(CA2.CD2) | R31D,K43D,E29,E41 |
基于下列考虑(图1A-1E)对CD2和GFP中几个位点进行了选择。首先,这些蛋白变异体展现了天然状的结构以及折叠性质。此外,GFP的荧光性质并没有改变。进一步地,通过突变移除结合到CD48上所涉及的关键残基并不会改变蛋白质的结构。消除了CD2的细胞粘附功能以允许仅仅起到蛋白显像剂的作用。其次,由于被Tb3+荧光能量转换所展现出来,所有的这些金属结合位点都结合到Gd3+的类似物Tb3+上。第三,这些金属结合位点具有不同的二级结构和溶解性,其允许测试二级和外部球形环境是否会影响水弛豫和金属结合亲和性。按照图1A、1B和1C所示,通过β链B和3个来自β链B回环区域的配体残基形成了金属结合位点例如(CA1.CD27E15),而所有的6D79蛋白配体残基都来自β链。
5)改变Gd3+结合位点的数目:由于MR显像的质量涉及到显像剂的弛豫度和浓度,为了提高局部Gd3+浓度同时不改变蛋白浓度把多个位点植入单个多肽中。可以先对所设计的利用了不交迭配基的Gd3+结合位点各自进行检测,随后植入到单个蛋白中。例如,可以用全部3个Gd3 +结合位点7E15(CA1.CD2),6D79(CA2.CD2)以及6D31(CA2.CD2)来创建CD2。类似的方法可以用于GFP。其它金属结合位点可以通过串联重复连接具有多个金属结合位点的CD2和GFP来实现。如图1E所示,具有高有效荷载的多功能显像剂可以创建成带有多个Gd3+结合位点的CD2-GFP融合蛋白。
6)改变蛋白的大小:所开发的蛋白的大小对显像剂的性质有几个影响。根据本发明以及Lauffer所指出的,为获取在现有临床磁场强度下优化弛豫度的相关时间是10-50ns,其与具有10-30KDa紧凑结构蛋白相关。具有不同结构域的蛋白在其域之间具有额外的内部运动。此外,显像剂的生物分布和循环也有赖于蛋白的大小,已知分子量在10-60KDa之间的蛋白在蛋白识别和快速血液扩散以及通过肾脏消除方面是理想的。
采用本文所公开的方法,本发明的发明人在诸如分子量各不相同的CD2(11KDa)的结构域1、CD2-CD2串联融合蛋白、GFP(28KDa)、CD-GST融合蛋白(38KDa)、CD2和GFP的融合蛋白(40KDa)中设计了金属结合位点。这些设计允许开发具有为磁场强度、生物分布和生物消除而具有经优化的高弛豫度的显像剂。此外,嵌入稳定蛋白中的Gd3+结合位点消除了顺磁性基团的内部迁移并优化了总相关时间和水交换率。
此外,这些含有多金属结合位点的串联重复的CD2和GFP获得了具有高灵敏度的高有效荷载试剂并减小了显像剂的使用量,并由此明显减小了毒性。
多功能靶向的显像剂
已经创建了具有MR显像能力和荧光光学显像能力的多功能显像剂。参见,例如图1D,由于荧光的高灵敏度因此可以利用荧光显像。参见,例如,序列16-19。具有顺磁结合位点和荧光性质的蛋白已经通过直接处于GFP中的Gd3+结合位点来产生。研究允许对来自闪烁图和PET的结果作直接对比,它们为癌症的病因以及治疗的进步提供了空间信息。
活体显像
采用Gd的ICP-MS和利用了宿主蛋白CD2抗体的免疫学方法对Gd3+在不同CD-1鼠的器官中的分布进行了分析。收集了关键器官并对其进行了分析。如图5A-D所示,这是按时间顺序排列的图,免疫组织化学染色研究进一步揭示了所设计的蛋白主要停留在肾脏的皮层,这和施用所制备的显像剂后相对加强后较强的MR图像是一致。在注射显像剂后,在>5天的时间里动物仍旧有生机活力并表现出正常的行为。分别参见图5B和图5D。蛋白显像剂的器官分布被进一步用肾脏、肝和肺组织的免疫组织化学染色验证了。
Gd-CA1.CD2在肾脏中的体内T1和T2弛豫度值是49和56.8mM-1s-1kg组织,这比那些报道中的肾脏中Gd-DTPA的值(分别是1.0和10.8mM-1s-1kg组织)明显要高。该结果和采用纯化蛋白所测定的体内弛豫度一致。肾脏中体内R2弛豫度约比R1弛豫度高11.6倍。
毒性
首先,测试细胞(1×104细胞/孔,每孔100μl培养基)和所设计的蛋白在存在或不存在Gd3+(到达50μM)的情况下温育48小时。通过MTT检测进行细胞生存能力分析。用浓度高达50μM的示例性显像剂(例如,CA1.CD2)处理的任何测试细胞中都没有观测到毒性。例如,如图6所示,在用浓度高达50μM所设计的蛋白处理的所有测试细胞中都没有发现毒性。此外,发现显像剂对来自注射显像剂48小时后的鼠的肝脏酶(ALT、ALP、AST、LDH)、尿素态氮、胆红素以及总蛋白的作用相对于控制组而言是可以忽略不计的。进一步地,在注射显像剂后没有发现突发毒性,这暗示本发明的显像剂有可能维持了金属复合物的稳定性以及体内对Gd3+强亲和性。
上文中对优选实施方式以及附图的具体描述仅仅作为阐述性和说明的目的。它们并不意味着是穷尽性的并且也不意图限制本发明的范围和实质。对实施方式的选择和描述是为了最佳地解释本发明的原理及其实际应用。本领域技术人员可以认识到在不脱离本发明范围和实质的情况下对说明书所公开的发明作出多种变型。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>佐治亚州立大学研究基金会(Georgia State University ResearchFoundation,Inc.)
<120>显像剂及其制备方法
<130>FP08US505
<140>200680025549.X
<141>2008-01-14
<150>US 60/699,409
<151>2005-07-13
<160>19
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>123
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified Albumin Sequence
<400>1
Glu Gln Leu Thr Lys Cys Glu Val Phe Arg Glu Leu Lys Asp Leu Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr Thr Phe His
20 25 30
Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Gln Asn Asn Asp Ser Thr
35 40 45
Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp Cys Lys Asp Asp
50 55 60
Gln Asn Pro His Ser Ser Asn Ile Cys Asn Ile Ser Cys Asp Lys Phe
65 70 75 80
Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Ile Met Cys Val Lys Lys Ile Leu
85 90 95
Asp Lys Val Gly Ile Asn Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala Leu Cys Ser
100 105 110
Glu Lys Leu Asp Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu
115 120
<210>2
<211>99
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 protein
<400>2
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Ile Arg
85 90 95
Ile Leu Glu
<210>3
<211>288
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 with metal binding site(N15E,E56,L58D,D62,and
K64D,(EEDDD))
<400>3
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
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225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
245 250 255
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile Val Leu Leu Glu
260 265 270
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275 280 285
<210>4
<211>99
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 protein with with metal binding site(s):N15E,E56,
L58D,D62,and K64N
<400>4
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Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
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Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asn
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Ile Arg
85 90 95
Ile Leu Glu
<210>5
<211>99
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 Protein with metal binding site(s):N15E,E56,
L58D,D62,and K64Q
<400>5
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Gln
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Ile Leu Glu
<210>6
<211>99
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 Protein with metal binding site(s):N15,E56,L58N,
D62,and K64N
<400>6
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Asn Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
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Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
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Ile Leu Glu
<210>7
<211>288
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 Protein with metal binding sites:N15E,E56,L58N,
D62,and K64N
<400>7
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<210>8
<211>99
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 protein with metal binding site(s):E29,R31D,E41,
and K43D
<400>8
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1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Asp Trp
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Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asn Ala Asn Gly Asp Leu Lys
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Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
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Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Ile Arg
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Ile Leu Glu
<210>9
<211>99
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 with metal binding site(s):E29,R31K,E41,and
K43D
<400>9
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Asn Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Lys Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Asp Arg Lys Met Lys Pro
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Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu lle Asn Ala Asn Gly Asp Leu Lys
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Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
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Ile Leu Glu
<210>10
<211>288
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modifed GFP with metal binding site(s):N77,T79D,N90,and A92E
<400>10
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
65 70 75 80
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
85 90 95
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
100 105 110
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
130 135 140
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
165 170 175
Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Glu
180 185 190
Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
195 200 205
Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Asp Gly
210 215 220
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
245 250 255
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile Val Leu Leu Glu
260 265 270
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275 280 285
<210>11
<211>288
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 with metal binding loop III of calmodulin flanked by
5 glycine residues(3 and 2 at both ends)grafted at position 52
<400>11
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
65 70 75 80
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
85 90 95
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
100 105 110
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
130 135 140
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
165 170 175
Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Glu
180 185 190
Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
195 200 205
Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Asp Gly
210 215 220
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
245 250 255
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile Val Leu Leu Glu
260 265 270
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275 280 285
<210>12
<211>99
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 with metal binding site(s):E29,R31K,E41,and
K43D
<400>12
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Asn Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Lys Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Asn Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asn Ala Asn Gly Asp Leu Lys
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Ile Arg
85 90 95
Ile Leu Glu
<210>13
<211>99
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 with metal binding site(s):N15D,N17D,N60,and D62
<400>13
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Asn Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Lys Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Asn Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asn Ala Asn Gly Asp Leu Lys
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Ile Arg
85 90 95
Ile Leu Glu
<210>14
<211>116
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 with with metal binding loop III of calmodulin
flanked by 5glycine residues(3 and 2 at both ends)grafted at
position 52
<400>14
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Asn Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Gly Gly Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser
50 55 60
Ala Ala Glu Gly Gly Gly Ala Phe Glu Ile Leu Ala Asn Gly Asp Leu
65 70 75 80
Lys Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr
85 90 95
Val Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Ile
100 105 110
Arg Ile Leu Glu
115
<210>15
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified CD2 with metal binding site EF-hand III from calmodulin
grafted at position 52
<400>15
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Asn Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys
50 55 60
Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Phe Glu Ile Leu Ala Asn Gly Asp Leu Lys Ile Lys Asn
85 90 95
Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val Tyr Ser Thr
100 105 110
Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Ile Arg Ile Leu Glu
115 120 125
<210>16
<211>288
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified Fluorescent protein
<400>16
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
65 70 75 80
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
85 90 95
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
100 105 110
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
130 135 140
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
165 170 175
Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn
180 185 190
Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Lys
195 200 205
Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly
210 215 220
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
245 250 255
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile Val Leu Leu Glu
260 265 270
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275 280 285
<210>17
<211>288
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified GFP with metal binding site EF-hand III from calmodulin
grafted at position 157
<400>17
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
65 70 75 80
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
85 90 95
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
100 105 110
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
130 135 140
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
165 170 175
Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn
180 185 190
Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Lys
195 200 205
Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly
210 215 220
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
245 250 255
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile Val Leu Leu Glu
260 265 270
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275 280 285
<210>18
<211>288
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modifed GFP-the Metal binding site is the EF hand III from
Calmodulin and is grafted at positon 172
<400>18
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
65 70 75 80
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
85 90 95
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
100 105 110
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
130 135 140
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
165 170 175
Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Glu
180 185 190
Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
195 200 205
Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Asp Gly
210 215 220
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
245 250 255
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile Val Leu Leu Glu
260 265 270
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275 280 285
<210>19
<211>308
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Modified GFP
<400>19
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Gly Pro Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr
35 40 45
Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His
50 55 60
Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys
65 70 75 80
Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp
85 90 95
Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg
100 105 110
Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro
115 120 125
Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn
130 135 140
Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn
145 150 155 160
Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu
165 170 175
Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met
180 185 190
Ala Asp Lys Gln Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp
195 200 205
Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met
210 215 220
Thr Asn Leu Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn
225 230 235 240
Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr
245 250 255
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
260 265 270
Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile
275 280 285
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
290 295 300
Glu Leu Tyr Lys
305
Claims (24)
1.一种显像剂,包含
a)骨架蛋白;以及
b)至少一个经剪接的金属离子螯合位点,
其特征在于,所述至少一个金属离子鳌合位点被结合到骨架蛋白中。
2.根据权利要求1所述的显像剂,其特征在于,所述至少一种金属离子螯合位点嵌入骨架蛋白中。
3.根据权利要求1所述的显像剂,其特征在于,所述至少一种金属离子螯合位点被完全嵌入到骨架蛋白中。
4.根据权利要求1所述的显像剂,其特征在于,该显像剂的驰豫度比骨架蛋白要强。
5.根据权利要求1所述的显像剂,其特征在于,金属结合位点优先选择结合选择自下列组中的顺磁性金属离子,所述组包括Gd(III),Mn(II),Fe(III),Co(II),Co(III),Ni(III),Mo(V)以及V(IV)。
6.根据权利要求1所述的显像剂,其特征在于,金属结合位点优先选择结合选自由镧系金属构成的组中的金属离子。
7.根据权利要求1所述的显像剂,其特征在于,骨架蛋白是其本身可以结合金属离子的蛋白。
8.根据权利要求1所述的显像剂,其特征在于,骨架蛋白是具有发色团的荧光蛋白。
9.一种用于观察细胞、组织、有机体或动物的方法,包括施用权利要求1所述的显像剂。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,观察通过核磁共振实现。
11.根据权利要求1所述的显像剂,其特征在于,观察通过光学分析实现。
12.一种用于制备显像剂的方法包括如下步骤:
a)选择骨架蛋白
b)构建至少一种金属离子螯合位点;以及
c)可操作地把金属离子嵌入到蛋白中,
其特征在于,步骤c)把显像剂的性质赋予骨架蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,该显像剂比骨架蛋白具有更强的驰豫度。
14.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,该骨架蛋白根据以下进行选择:
a)对pH变性的抵抗性;
b)对蛋白水解裂解的抵抗性;
c)可以耐受突变;以及
d)分子大小。
15.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,基于骨架固有的荧光来选择骨架蛋白。
16.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述至少一种金属结合位点按照以下构建:
a)识别可以特异性结合金属离子的分析物结合肽,其中所述分析物是金属离子;
b)确定至少一部分编码金属结合肽的氨基酸序列;以及
c)把编码分析物结合肽的氨基酸序列剪接成金属结合位点。
17.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,骨架蛋白从免疫球蛋白中选择。
18.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,骨架蛋白从源自具有发色团的荧光蛋白的蛋白质中进行选择。
19.一种多功能探针包括:
a)具有光学特性的荧光蛋白;以及
b)至少一种能可操作地结合到荧光蛋白中的至少一种金属螯合位点,
其特征在于,该探针用作显像应用中的显像剂。
20.根据权利要求19所述的探针,其特征在于,金属结合位点优先选择结合选自下列组中的顺磁性金属离子,所述组包括Gd(III),Mn(II),Fe(III),Co(II),Co(III),Ni(III),Mo(V)以及V(IV)。
21.根据权利要求19所述的探针,其特征在于,金属结合位点优先选择结合选自由镧系金属构成的组中的金属离子。
22.一种产生对象的强化图像的方法:
a)施加具有至少一种可操作地嵌入骨架蛋白中的金属离子螯合位点的显像剂;以及
b)产生对象的一个或多个图像。
23.根据权利要求22所述的方法,其特征在于,所述一种或多种图像由核磁共振产生。
24.一种显像剂以及用于制备本文所公开的显像剂的方法。
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