CN101304767A - 靶向显像剂及显像剂靶向定位的方法 - Google Patents
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Abstract
具有造影蛋白的显像剂具有造影性质和至少一个导向部分，其中至少一个导向部分可操作地连接到或合并入造影蛋白内。显像剂靶向定位的方法和制备所包括该剂的方法。
Description
本申请要求于2005年9月9日提交的现未决的美国临时申请号60/715493，于2006年9月8日提交的现未决的美国专利申请号11/530398的优先权，并且是于2006年7月13日提交的现未决的美国专利申请号11/457370的部分继续案申请，上述申请整体内容以参考方式结合在本文中。
技术领域
本发明大体涉及诊断显像领域和新型显像剂的制备以及它们在诊断显像方面的应用，尤其有关于靶向显像剂和使显像剂命中细胞和组织，用于在磁共振术中选择性的累积和滞留，例如，应用于使组织可见中。
背景技术
成像技术，包括磁共振成像(MRI)，在检测和处理癌症损害和其它疾病中起到重要作用。例如，MRI技术为绘图和探查软组织的结构和功能提供了有力的无损工具。事实上，MRI通过使用高强度磁体和射频信号能够提供组织的三维图像。随着机械成像系统的改进，使探测肿瘤损伤成为可能。然而，早期肿瘤损伤和转移的检测仍然存在挑战性。
MRI显像剂已用于改进影像技术学中图像的内在对比。该方法依赖于施加显像剂以放大病理组织和正常组织之间成像的对比。最广泛用于MRI显像剂的类型比如是钆离子(Gd3+)、锰离子(Mn2+)和铁离子(Fe3+)的二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)螯合物，其具有T1反应性的细胞外小分子化合物。最终，显像剂的性能取决于图像内在性能的改善以及药代动力学。
例如，被核准用于临床的基于Gd3+的显像剂主要是非特异性小分子。该Gd3+显像剂通常具有小于10mM-1s-1的弛豫率，其比预期值低20-50倍。弛豫率主要受到分子旋转相关时间的限制。使用最广泛的显像剂，DTPA，具有5mM-1s-1的R1弛豫率。根据该弛豫率，鲁棒的临床检测方法通常需要大剂量(＞0.1mM的局部浓度)以便达到充分显像或者产生可接受的图像。此外，这种类型显像剂的循环时间很短，这就限制了数据收集时间窗口。改善这样的显像剂的努力包括把小Gd3+试剂共价或非共价键地连接到诸如树状大分子或共聚物等大分子物质上。
尽管在显像剂的领域已经有了相当的发展，显像剂能够有效地定位于特定的细胞和组织的能力仍然缺乏。当显像剂的传递成为更重要的关注点之一时，缺乏能够瞄准特异性分子标记的MRI显像剂。当许多组织特异性显像剂显示良好的驰豫特性，这样的显像剂不易于设计成识别特异性分子标记。
因此，始终需要改良的能靶向定位于特定组织的显像剂。同样需要以蛋白质为基础的能够被定位的显像剂，广泛地适用于不同组织、肿瘤、癌症和疾病的分子成像。还需要更安全的显像剂。本发明所涉及的正是众多需求中的这些需求。
发明内容
简言之，本发明旨在提供一类能够用于诊断性成像且具有改良的定位特异性细胞特性的新型显像剂。更特别地，本发明旨在提供一类可在组织和细胞中累积的磁共振显像剂。新型显像剂可以包括任何肽或蛋白质或小分子的导向部分并且造影蛋白可以是显像剂，也可以是有机聚合物的造影蛋白，其有机聚合物例如具有至少一个金属结合位点的蛋白质，能够螯合顺磁性重金属离子。
显像剂可通过可操作的结合或加入显影蛋白和导向部分或分子而能够显影。作为适用于本发明的显影蛋白经常固有地发挥显像剂的功能，优选的显影蛋白和导向部分或分子以不使造影蛋白变性的方式连结或合并，例如通过在以蛋白为基础的显像剂的C-或N-末端连接导向部分或分子。在一个实施方式中，合成蛋白是结合特异性细胞表面，且可被那些特异性细胞内吞的显像剂。
靶向显像剂的一个优势是它们可提供一种更安全的传递显像剂的方法。尤其是，被靶细胞或组织更有效寻靶和摄取的显像剂可以使显像剂更少地暴露给正常细胞。作为造影蛋白，部分的由于重金属通常具有毒性，最佳的是减少正常细胞暴露于重金属。在一个实施方式中，显像剂可结合靶细胞并被靶细胞内吞。这样，通过仅向特异性细胞和组织传递显像剂，就有可能减少正常细胞暴露于显像剂和重金属。
通过结合附图阅读下列优选实施方式的具体描述后，本领域技术人员可以更明确地认识到本发明的这些以及其它特点和优点，其中在所述附图的几个视图中，相同的附图标记代表相同的成分。
附图说明
图1显示根据本发明一个实施例的靶向显像剂的示意图。
图2显示适用于本发明的导向部分的表。
图3显示通过ELISA，CA1.CD2-Bom结合和定位到PC-3细胞(GRPP表达细胞)和HCT-116细胞(少量表达GRPP的细胞)的作用。
图4A-4F是免疫荧光染色法获得的共焦显微镜图像，其显示显像剂靶向作用于细胞并随时间内化。
图5显示这些显像剂随时间是稳定和有活力的。
图6显示MR图像通过Gd-CA1.CD2-Bom到PC-3细胞的靶向作用而增强，在PC-3细胞中的影像增强高于HCT-116细胞。
图7显示EGFP-CA1.CD2-a-Bom10的EGFP融合到CA1.CD2N-末端，bom靶向序列融合到显像剂CA1.CD2C-末端。
定义
除非另有特殊说明，在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域的那些普通技术人员知晓的意义相同。为了本发明的目的，对下列词汇作了限定。
术语“核苷酸分子”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸或核糖核苷酸单链或双链形式的聚合物，并且，除非有其它特别说明，还包括了与已知天然存在的核苷酸的类似物的聚核苷酸，与天然存在的核苷酸以相同的方式起作用。例如，该术语可指单链和双链形式的DNA或RNA。核苷酸序列很容易从氨基酸序列读出来。
术语“重组核酸分子”是指包含两个或更多连接的聚核苷酸序列的非天然存在多核苷酸。重组核酸分子可由重组方法产生，尤其是利用基因工程技术，或可由化学合成方法生成。重组核苷酸分子可编码融合蛋白，例如，连接感兴趣多肽的荧光蛋白。术语“重组宿主细胞”是指包含或可表达重组核苷酸分子的细胞。
术语“编码”在文中述及多肽时是指多核苷酸的转录和从而引起的mRNA的翻译。编码多聚核苷酸被认为是包括了编码核苷酸序列与mRNA一致的链及其互补链。可以认识到编码核苷酸被认为是包括了变性的核苷酸序列，其编码相同的氨基酸残基。编码多肽的核苷酸序列包括含基因内含子和外显子的多聚核苷酸。核酸序列容易从氨基酸序列中读出，反之亦然。
术语“控制序列”是指影响编码序列和非编码序列的表达所必需的多聚核苷酸序列。这样的控制序列可包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列。术语“控制序列”意味着包括，在最小程度上，它的存在能够影响表达的元件，还可包括它的存在会产生有利作用的额外元件。例如，引导序列和融合伴侣序列就是控制序列。
术语“可操作地结合”或其类似词语意指以物理或功能上相互关联的方式安置的多肽序列。在一个最优选的实施方式中，嵌合分子的多肽元件的功能相对于隔离部分的功能作用而言是不变的。例如，荧光蛋白可以和感兴趣的多肽融合并且在融合状态下保留其荧光，而感兴趣的多肽则保留其原始生物活性。
术语“可操作地连接”或其类似词语意指其元件如所描述的连接关系时准许它们发挥预期方式的功能的并列连接。可操作地连接编码序列的控制序列以这样的方式连接，也就是编码序列的表达在与控制序列相容的情况下可以实现。
涉及荧光蛋白的术语“亮度”作为给定波长下的消光系数(EC)的产物以及荧光光子产率(QY)的结果被进行测量。
术语“探针”意指特异性结合另一物质(“靶”)的物质。探针包括，例如，抗体，多聚核苷酸，受体和它们的配体，并且通常可被标记以提供一种识别或分离被探针特异性结合的分子的方法。
术语“多肽”或“蛋白质”意指两个或更多氨基酸基的聚合物。“多肽”或“蛋白质”是通过酰胺基连接的氨基酸残基的聚合物。按照本文定义，肽是天然氨基酸和非天然氨基酸(例如，β-丙胺酸、苯基甘氨酸和高精氨酸)的总合。而氨基酸是α-氨基酸，其既可以是L型光学异构体也可以是D型光学异构体，优选L型光学异构体。即使优选的氨基酸是那些可编码的氨基酸，但这些常常会遇到那些非基因编码的氨基酸。
术语“经分离的”或“经纯化的”指一种物质完全或本质上从在自然的原始状态下正常伴随该材料的成分中分离出来。纯度通常可以用比如聚丙烯酰胺凝胶电泳法，高效液相色谱法等等分析化学技术测定。当多聚核苷酸或多肽在制备物中是所存在的最少且主要的种类，则它们应被认为是需分离的。
术语“天然产生的”是指自然界所产生的蛋白质、核酸分子、细胞或其它物质。天然产生的物质可以以天然形式存在，也可以用人工方法进行修饰，例如处于分离形式的状态。
如果氨基酸序列之间或核苷酸序列之间至少有80％的序列相同，或者和参考序列的共有序列大于给定的对比窗口，则这两种或者多种氨基酸序列或两种或多种核苷酸序列被认为是“基本相同”或“基本相似”的。因此，基本相似的序列包括那些具有，例如至少85％的序列一致性，至少90％的序列一致性，至少95％序列一致性，或者至少99％的序列一致性。
如果氨基酸序列之间或核苷酸序列之间至少有50％的序列相同，或者和参考序列的共有序列大于给定的对比窗口，则这两种或者多种氨基酸序列或两种或多种核苷酸序列被认为是“相似”的。因而，基本相似的序列包括被认为是“基本相同”或“基本相似”的核酸序列。
术语“荧光性质”是指在合适激发波长条件下摩尔消光系数、荧光量子效率、激发光谱或发射光谱的形状、最大激发波长和最大发射波长、在两个不同波长下激发光振幅比率、在两个不同波长下发射光振幅比率、激发状态寿命、或者荧光的各向异性。
术语“荧光蛋白”是指在用合适电磁能量激发时能够发射光波的任何蛋白。荧光蛋白包括具有天然或工程化的氨基酸序列，例如从Aequoreavictoria荧光蛋白种衍生而来的荧光蛋白。
术语“突变体”或“变种”也被用在本文中，其包含关于对应的野生型荧光蛋白的突变的荧光蛋白。此外，在本文中其含义涵盖荧光蛋白的“光学变种”或“光学突变体”，以便表示相对于相应野生型荧光蛋白具有不同荧光特性的突变荧光蛋白。
具体实施方式
本发明实施方式包括能够通过影响水分子质子弛豫速率的方式强化图像对比度的显像剂。该显像剂对磁共振显像来说是有效的，部分由于靶组织中的水质子弛豫速率受到的影响和周围组织中的水质子所受的影响不同。本文所公开的显像剂是顺磁的，与金属离子形成复合物，从而能使邻近核苷酸的弛豫速率发生改变。
更特别地，本发明的实施方式是能够靶向定位于和累积在特异性细胞内，如肿瘤或生成血管的细胞的诊断性显像剂的新类型。本发明优选的实施方式是一种能够累积在特异性细胞和组织中的磁共振显像剂。
如图1所示的，这些新的显像剂包括(a)可以任何肽或蛋白质或小分子作为导向部分，能够靶向定位显像剂于特异性细胞或组织，(b)造影蛋白是显像剂本身和有机聚合物，有机聚合物比如具有至少一个重金属离子结合位点，能够螯合顺磁性重金属离子的蛋白质，和(c)在造影蛋白和导向部分之间的任意连接部分。
更特别地，在本发明中有用的导向部分包括允许显像剂结合蛋白质或其它靶物质的序列，其增加在成像位点的显像剂浓度。在一个实施例中，导向部分可以是适于靶向定位于给定的受体或细胞的分子或序列。而且，这些靶向序列可包括疾病细胞的序列。例如，作GRP受体的蛙皮素(Bombesin)/GRP可适用于将显像剂靶向定位于癌症细胞。适用于本发明中的特殊的导向部分可以是依赖于靶和特异性需求之间的结合的性质。
而且，造影蛋白可具有内在的造影性质。在一个实施方式中，本发明中的新型的诊断性显像剂具有可调的性质因而非常有用，甚至更特别地，这类磁共振显像剂累积在组织中，这些新的显像剂包括(a)骨架蛋白，可以是如蛋白质的有机聚合物，和(b)至少一个特定的能够螯合顺磁性重金属离子的金属离子结合位点，其至少一个金属离子结合位点可结合入骨架蛋白的所选的折叠袋中。然而，可以了解基于显像剂的任何蛋白可用于本发明中。
而且，给定的实施例中显像剂可以包括任意连接部分，通过其将导向部分连接到骨架蛋白中。优选的任意连接部分具有可塑性，从而造影部分和导向部分都具有功能性质。这些连接部分的长度可变，例如，可包括不同的长度和氨基酸序列。实施例中的连接部分包括包含通过单链或多链共价连接的1到30个碳原子的小亚基。
在一个实施例中，本发明中公开的显像剂可以通过可操作地连接造影蛋白和导向部分或分子而显影。更特别的是，造影蛋白和导向部分或分子以并列形式的关系连接，准许它们发挥它们预期方式的功能。适用于本发明的造影蛋白通常发挥如显像剂的固有功能，优选的造影蛋白和导向部分以不使造影蛋白变性的方式连接。合成蛋白是累积在特异性细胞中的显像剂。
优选地，造影蛋白和靶部分通过肽键可操作地连接。在一个实施例中，导向部分和造影蛋白通过肽键将导向部分连接或融合在显像剂的C-或N-末端。通过在末端连接或融合导向部分，在保持造影蛋白的功能性和导向部分结构完整性的同时，造影蛋白可靶向定位于特异性细胞。在这个实施方式中，显像剂可被表达为单一蛋白质。此外，氨基酸，例如甘氨酸可被加到末端有助于确保更为稳定的结构。
而且，造影蛋白和导向部分通过其它类型的共价键可操作得连接到残基上，以允许另外具有更好的结合特异性和亲和力的修饰比如磷酸化作用，糖基化作用和甲基化作用。
此外，导向部分可操作地连接到或结合到造影蛋白内的残基上。在这个实施方式中，导向部分可结合造影蛋白，从而造影蛋白继续发挥造影蛋白的功能。例如导向部分可植入造影蛋白的环形区域。这个实施方式由于N-和C-未端附件具有更少的结构影响，致使显像剂具有更有活性的结合构型。另外，这个导向部分可植入蛋白质造影部分的环形区域以确保更好的构型。在这种情况下，优选两个可变的连接键侧面连接导向部分的两端。另外，植入的靶向序列通过氨基肽酶或羧肽酶可更稳定和更不断裂或降解。
在一个实施方式中，可选择能与在特定类型细胞或组织上表达并诱导内吞作用的受体相结合的导向部分。例如，这样的细胞在其表面以特定密度表达特异性受体，其可靶向定位于细胞生物标记或癌生物标记。而且，这些受体或生物标记在文章中表示，并在其之后一直被解释和报导。一个本领域普通技术人员可通过阅读文献去找寻可结合和诱导细胞种型的肽，可选择没有不适当实验的靶向肽。
在一个实施例中，导向部分可以是能结合特异型细胞表面受体的胃泌素释放肽(GRP)，其在癌细胞或组织，如GRP受体中高度表达。当GRP受体是癌生物标记并在许多神经内分泌瘤中表达，GRP受体在正常组织并不是大量表达。更尤其是，在前列腺和乳腺组织中转变的瘤中表达的GRP受体可选为显像剂到转变的前列腺和乳腺组织中的靶。同样的，具有造影蛋白和GRP靶序列的显像剂可结合到这样的癌细胞并诱导细胞内吞作用，导致癌细胞中更多的显像剂以增强MR图像。
其它适当的导向部分是能够结合特定类型的细胞或肿瘤的肽或蛋白质，并诱导细胞内的内吞作用。这样导向部分可以是靶向定位于特定肿瘤上受体的配体，可包括缩胆囊肽、生长激素释放肽、泌乳素、细胞因子、神经递质、神经调节物质、EGF受体和TNF受体(参见，例如，附图2)。例如，导向部分可以是生长激素抑制素，其可以靶向定位于在人类神经内分泌肿瘤和其它淋巴瘤中找到的生长激素抑制素受体亚型sstl-5。其它合适的导向部分可以是如叶酸或糖、磷酸化肽和糖蛋白或肽的小分子。合适的配体和它们各自的受体如图1中所示。典型的定向显像剂可如序列ID第14-26中所示的相应得产生。
可操作地连接或结合多个导向部分到造影蛋白上是可能的。通过可操作地连接多个靶向序列到造影蛋白，通过为特异性细胞或癌细胞的识别提供多种类型的分子作用，可能产生对特异性细胞或癌细胞具有更强特异性的显像剂。此外，亲和力和显影效果可通过加上多个靶肽(可为串联重复)增加，从而增强局部有效浓度。
显像剂的靶专一性通过显像剂的特性触发了受体介导的细胞内吞作用而增加。受体的导向部分的结合可以触发受体介导的细胞内吞作用，其始于细胞膜特定区域的内陷，称为内陷小窝。笼形蛋白接着形成围绕内陷小窝的格栅而形成小囊泡，其与食物泡融合。显像剂接着释放入细胞形成食物泡。显像剂在靶细胞和靶组织中累积。
在此披露的显像剂的显影特性部分源于独立于导向部分的造影蛋白，发挥如显像剂的功能。优选的，造影蛋白是有机聚合物，它是具有至少一个能够螯合顺磁性重金属离子的金属结合位点，发挥如显像剂般的功能的蛋白质。这样的造影蛋白可以是经构造的或经修饰的现有技术显像剂或者可以是新构造的显像剂。典型的蛋白质显像剂可与本发明包括CD2的结构域1和绿色荧光蛋白(GFP)一起使用。如以下详细讨论的，新型显像剂在许多情况下是已知的通过使用导向部分定位于特异性细胞的显像剂。
本发明的显像剂按传统配方或兽医机理和材料配制。本发明的显像剂成分可以是传统的给药形式，比如粉末，溶液，悬浮液，分散剂等等；然而，通常优选溶液，悬浮液和分散体在生理学可接受的载体介质中，例如注射用水。例如，这样的材料包括乳化剂，脂肪酸酯，凝胶剂，稳定剂，抗氧化剂，等渗调节剂，缓冲剂，防腐剂，抗微生物剂，和pH调节剂。而且给药机制包括肠胃外投药(直接注射或输液)。根据本发明的成分可以因而完全在所属领域的技术水平范围内使用生理上可接受的载体或辅料的方式制造用于给药。
在使用和操作中，显像剂可定向的或累积在特定细胞或组织内。导向部分，作为显像剂的部分可以与在细胞上(或其表面)的受体联合并诱导其中的细胞内吞作用。特别的，显像剂的结合，尤其是导向部分结合到细胞膜上的受体或运输蛋白，可诱导受体与显像剂的内吞作用。细胞的内吞过程有效地纳入许多显像剂。作为任何不结合和并不随后内吞的显像剂有可能被分泌，显像剂可与特异性受体或运输蛋白在细胞或组织内累积。
显像剂可以有效剂量给药以达到理想的效果。这样的剂量可广泛变化，取决于采用的显像剂，成像的器官或组织，使用的成像设备等等。本发明的诊断组分可使用传统的方式。该组分给药予以病人，特别是温血动物，系统或局部得对成像的器官或组织，并且病人接着接受成像过程。
为了克服免疫原性，显像剂由所属技术领域的普通技术人员可修饰成使用于特定的生物体。例如，当显像剂用于鼠中，显像剂可通过结合鼠自身的序列而修饰成。
显像剂的输注率与细胞的摄取速率相配，从而优化在组织或细胞中显像剂的细胞累积作用。显像剂传递到细胞的靶的效率可通常取决于血管外渗的速率和血浆内显像剂的药物代谢动力学。
本发明的显像剂的一个生物消除途径之一是肾脏的。最终由RES提取出宏观结构，优选得螯合附件是通过生物可降解键断裂后释放的片断是肾脏排泄的，如分子量小于60KD，优选小于10KD，特别是200到5000D。为改变生物消除路线，融合蛋白或非可降解粒子部分可用柔性连接部分加入到蛋白质显像剂上。
本发明中的一个优势是其可提供递送显像剂更安全的方法。特别地，显像剂由靶细胞或组织更有效力的靶向定位和吸收可使正常细胞更少地暴露于显像剂。作为造影蛋白，部分由于金属离子，通常有毒性，最佳的是减少显像剂对正常细胞的暴露。
I蛋白质为基础的显像剂
本发明可以提供有用的具有可调性质的诊断性显像剂的新类型，更特别地，在组织中累积的磁共振显像剂的一类。这些新的显像剂包括(a)可以是诸如蛋白之类的有机聚合物的骨架蛋白和(b)至少一个能经剪接的能够螯合顺磁性离子的金属离子结合位点，其中至少一个经剪接的金属离子结合位点被结合到骨架蛋白所选的折叠袋中。
该新型显像剂可以通过设计剪接的结合位点和可操作地把这些位点结合到骨架蛋白中的方式进行开发。按照后面更为详细的描述，该结合位点可以用设计或接枝的方法来开发。在开发出位点之后，一个或多个位点可以操作地结合到骨架蛋白的所选区域中。然后可以用已知的输送方法把该显像剂施加到动物或人身上。
在阐述性实施方式中，至少一种金属螯合位点嵌入到骨架蛋白中。在该实施方式中，金属螯合位点可以设置在骨架蛋白中以便该金属螯合位点处于显像剂的内部。优选地，通过用骨架蛋白的氨基酸作为配基来嵌入至少一个金属螯合位点从而螯合金属离子。更优选地，该至少一种金属螯合位点被嵌入到蛋白中以使该骨架蛋白与其自身相似蛋白至少部分具有相关性。
在阐述性实施方式中，用于MRI的骨架蛋白是可以容纳经剪接的金属离子结合位点的蛋白，并具有下列特性：
(a)具有在生理环境中对抗细胞裂解和变性的稳定性；
(b)适合于金属离子位点结合的拓扑结构；
(c)对磁场而言是优选的旋转相关时间(例如，在1.3-3T的磁场中约100毫秒)，例如，可以通过改变蛋白位点的方法来应用于较高磁场；以及
(d)水交换率以便蛋白的弛豫度不会受到水交换率的限制。
骨架蛋白的优选性质还包括水溶性，和其它细胞金属离子的低的相互作用性以及低毒性。如果对所有这些性质都不作要求，骨架蛋白的最佳性质可以并且确实依赖于显像应用的特定参数。
骨架蛋白的一个重要性质是它可以接受金属离子位点被引入其中。优选地，该骨架蛋白具有折叠构造，三维结构或者与其结构已至少部分得到解析的蛋白具有一定同源性的氨基酸序列。例如，可以筛选骨架蛋白来确定其是否可以忍受各种结合位点的结合而不会有额外的变性。例如，把金属离子结合位点结合到骨架蛋白不会使蛋白变性或解折叠。因而，金属结合位点不应当设置在会使疏水核心突变或会导致基本结构混乱的位置。这可以通过相同家族的蛋白的序列对比来检测。优选地，具有在结构折叠中或功能中具有重要角色的氨基酸在相同类型蛋白的不同种之中是保守的。
在另一个实施方式中，骨架蛋白可以是螯合金属离子的天然蛋白。在该实施方式中，可以对天然金属结合位点进行修饰以便螯合重金属或顺磁金属或其它可用于诊断显像的金属。例如，可以通过修饰其中所含的氮或氧分子的方法对通常情况下结合Ca2+的骨架蛋白的氨基酸序列进行剪接以使其能够结合Gd3+。
优选地，金属离子结合位点被设置在骨架蛋白中以便金属能够和蛋白折转在一起。更佳的是找到不与蛋白颗粒一样灵活或和蛋白颗粒具有相同灵活性的位置以便和校正时间相匹配。在这种情况下，优选在蛋白中设计或创建结合袋。虽然插入也可以起作用，但是优选在相对不太灵活的区域上插入。蛋白通常可以通过观察pdb(蛋白数据库)结构文件中的B因子(X射线的温度因子)或S2因子(NMR的动态柔性系数)的方法来进行检查。
多于一种金属结合位点可以被用于结合到骨架蛋白中。多于一种结合位点的包涵物可以改善显像剂的灵敏度。此外，当多于一种结合位点被结合到蛋白中的情况下，该位点对所选的金属具有不同的亲和性但仍对于所选金属具有足够强的亲和性从而避免生理性金属离子间的竞争。把两个金属离子嵌入到具有优选旋转相关性时间和水交换率的宿主蛋白中以提供灵敏度有所提高的MRI对比度。
在优选实施方式中，显像剂对特定的金属离子具有高亲和性并能够优先选择特定的金属离子(例如Gd3+、Mn2+或Fe3+)。在一个实施例中，示例性的显像剂显示在具有生理性金属离子的环境中解离常数Kd小于Gd3+的108[M]，并可以防止那些金属离子在生理条件下发生沉淀。因此，本发明可以被用于创建对于特定金属离子而言具有最佳选择性的显像剂。
本发明提供了一种提高显像剂弛豫度的新机制。其通过设计金属离子结合位点，例如Gd3+，在蛋白中，它可以消除目前有效的显像剂中所伴随的螯合部分的易变性和灵活性。更特别地，通过剪接结合位点使得制备较高弛豫度的显像剂成为可能。显像剂的高质子弛豫度可以进一步强化显像。
骨架蛋白
适合本发明的骨架蛋白包括蛋白质或含氨基酸的有机聚合物。这种骨架蛋白包括天然氨基酸和非天然氨基酸(例如，β-丙氨酸、苯基甘氨酸以及高精氨酸)。当氨基酸是α-氨基酸时，其可以是L型光学异构体也可以是D型光学异构体，优选D型光学异构体，这样的异构体更不易被蛋白水解的降解。虽然优选的氨基酸是那些可编码的氨基酸，但这样的氨基酸通常对抗非基因编码的氨基酸。
本发明可以采用多种骨架蛋白，但一般而言它们都是蛋白，末端修饰的蛋白质，和有机聚合物。更特别的，根据诊断应用所使用的性质来选择合适的骨架蛋白。本发明中使用的骨架蛋白可以是单一结构(颗粒，聚螯合掩蔽剂或分支状聚合物)。适用于本发明的骨架蛋白的选择无需过多的实验。
该骨架蛋白也可以是通常结合金属离子的天然蛋白。在这样的实施方式中，修饰天然金属结合位点以螯合重金属或顺磁性金属或其它可用于诊断显像的金属是可能的。例如，通过对其中所含的氨基酸配基残基进行修饰的方法可以对一般结合Ca2+的骨架蛋白的氨基酸序列进行剪接以使其可以结合Gd3+。例如，技术人员可以修饰α-乳清蛋白的结合位点以使其结合Gd3+。在另一实施例中，可以修饰如钙调蛋白之类蛋白的EF-手相钙结合位点以使其可以结合Gd3+(如CA9.CD2)。
在阐述性实施方式中，骨架蛋白可以依照下列标准选择：
1)表现出对pH变性以及蛋白水解裂解有较强的抵抗性。
2)蛋白的结构信息的可知性。如果结构信息较少有效，其允许对金属结合位点进行合理的设计使其具有最佳的内部、次级和外部球状弛豫性以及金属结合性质，随后允许为对蛋白修饰进行结构预测。
3)不牺牲天然构象和折叠的突变耐受。
4)适合于特殊应用的分子大小。优选的尺寸取决于特殊的诊断应用。例如，如11-30KDa的分子量以及10-30ns的旋转相关时间的紧凑结构可作为特殊诊断应用的优化尺寸。此外，分子尺寸可以改善循环保留时间和组织渗透性。例如，较强的体内肾显像和延长的保留时间可以考虑到对诊断诸如肾癌之类的肾脏疾病作出更具体的肾脏系统的显像，并可考虑对血流和血容量作出更精确的测量。进一步地，蛋白框架的合适尺寸可提供改良的组织渗透性和分子寻靶作用，其会对某些大尺寸的分枝状分子、纳米颗粒以及超顺磁颗粒造成限制。
5)可选地，骨架蛋白也可以具有固有的性质，其可以考虑到多功能探针的结构和采用荧光作为工具以辅助设计分子显像的MRI显像剂而无需其它荧光素。
合适的蛋白包括诸如CD2蛋白(细胞粘合蛋白)之类来自免疫球蛋白G(IgG)超家族的蛋白，其表现出对蛋白水解、热环境(Tm67℃)，pH(2-10)以及盐(0-4M NaCl)变性有较高的稳定性。由于CD2蛋白在生理环境中较稳定、具有适合于至少一个或多个金属离子螯合位点结合的拓扑结构、以及典型地具有大于10mM-1s-1的(它们中的一部分到达约50mM-1s-1)的弛豫度，因此这种蛋白适用于本发明。此外，CD2可以经受多个表面突变而不会造成蛋白解折叠。其它研究已经表明可以把CD2用作宿主蛋白来设计钙结合位点。下文会对采用了CD2的实施例作出描述。
荧光蛋白是本发明另一类优选的骨架蛋白，因为这些蛋白在生理环境中是稳定的，其可以对抗蛋白水解性降解以及pH变性(pH5-10)。这种荧光蛋白包括一系列包括那些与Aequorea相关的荧光蛋白。合适的荧光蛋白应当具有有用的激发和发射光谱并且可以从天然产生的Aequorea victoria绿色荧光蛋白(GFPs)中产生。这种经修饰的GFPs可包括经修饰的核酸和蛋白序列并可包括来自其它蛋白的组件。GFPs的cDNA可以与那些编码多种其它蛋白的DNA进行连接-结果是嵌合体通常具有荧光并保留伴侣蛋白的生物化学特性。黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白和红色荧光蛋白也可作为骨架蛋白应用于显像剂中。这样的蛋白也包括在本发明中。
已知包括细胞外受体和生长因子的其它合适的蛋白具有抗蛋白裂解的稳定性。此外，来自四螺旋束结构家族(例如Rop)的蛋白、麦芽糖结合蛋白家族以及硫氧还蛋白家族也显示出可接受突变和金属结合位点。然而本发明的发明人并没有对每种适用于骨架蛋白的蛋白质一一作测试，不同批的经检测的蛋白显示本发明包括符合本文所述标准的所有蛋白。可以预见本领域普通技术人员可以利用普通研究技术和本文所述的标准作为基础来开发并选择合适的骨架蛋白。
使用荧光蛋白的一个优点在于用这种蛋白构建的显像剂是多功能的探针。在本实施方式中，用荧光蛋白构建的显像剂可以利用荧光和MR显像进行筛选。由于这种蛋白给显像剂配备了荧光检测法所需的荧光和用MRI进行深层组织检测所需的灵敏度，因此这是其尤为突出的优点。这种显像剂是一种多功能的显像剂。
其它蛋白也可用作本发明的骨架蛋白。优选地，骨架蛋白能够经受增加金属离子结合位点而基本不会对其结构造成破坏。本领域普通技术人员不用作过多的实验就可以选择出优选的骨架蛋白。
金属离子结合位点
金属离子结合位点的亲和性会改变显像剂对金属离子的亲和性。特别地，由于金属离子结合位点的亲和性和灵敏度可以进行修饰，因此显像剂的弛豫度和金属亲和性也可以进行修饰。优选地，金属结合位点具有最佳的显像性质，包括金属结合亲和性、选择性、弛豫度、核磁弛豫消散(NMRD)图谱、和水交换率。
本领域普通技术人员可以采用本领域已知方法或以后开发出的方法来开发具有最佳性质的金属结合位点。例如，本发明的金属离子结合位点至少可以通过这些方法来构建：
(1)计算机设计方法，其中基于金属离子和其它基团的最佳结合性质，对金属离子具有选择性和亲和性的金属结合位点重头(de novo)进行制备和合理的设计；
(2)接枝方法，其中通过改变确定的结合位点的一级、二级、三级和/或四级结构来制备和构建对金属离子具有选择性和亲和性的金属结合位点；以及
(3)已知或以后开发的其它方法，以及已知或以后开发的方法的组合。
1.计算机设计法
计算机设计法着重于重头设计金属离子结合位点。该设计法注重使用算法来构建和设计最佳的结合位点。优选地，计算机设计法通过例如，改变位点的配位几何构型、配位层中的水分子数目、配基类型以及电荷的方式被用于创造最优选的结合位点。
计算机设计法包括如下步骤：
(1)登录一个或多个包含金属离子结合位点的结构、配位、和/或三维结构或模式的数据库，或者创建基于和其它金属结合位点同源序列的模式结构；
(2)从结构数据部分创建一个或多个初级金属离子结合位点；
(3)基于配位几何构型从所生成的初级结合位点中合理地选择一个或多个合适的金属离子结合位点；以及
(4)通过剪接和调谐所选金属离子结合位点来创建金属离子结合位点。
该金属离子结合位点可以结合到骨架蛋白中，例如荧光或CD2蛋白。进一步地，该方法可以用于改变蛋白的金属离子结合性质并生成具有不同离子结合亲和力的新材料。
更加特别地，该方法包括为了获取金属离子结合位点的优选要素而搜寻和登陆公共和或私有数据库。这些用于搜寻标准或要素的数据库包括公共领域的数据库(例如生物技术信息国家中心(NBCI)或美国国家健康研究所的PubMed)或者诸如蛋白模拟结构数据库(例如剑桥或RCSB蛋白数据库和BioMagResBank数据库)之类的知识库或者其它生物技术数据库。此外，数据库包括金属离子结合蛋白的结构数据，这些蛋白的结构特征已经在之前被确定了。本领域普通技术人员能够确定出适合于本发明的数据库以及数据库的物质来源。采用具有因特网和内联网能力的计算机可明显地大大加快搜索，这也是优选的。
这些数据库可以用于提供对一千到几千个能结合蛋白的不同小分子或金属离子进行结构分析。该分析包括局部配位性质，通常可用于结合期望的金属离子的残基或微粒的类型、化学性质(例如pKa或电荷)、位点中带电残基的数量、以及已知结合位点的范围和偏离。该分析进一步包括环境，例如原子类型、残基、疏水性、可溶性、金属结合位点的形状、电迁移势以及结合位点的动力学性质(例如蛋白的B因子或秩序因子)等。这样的分析也包括该结合位点相对于特定的金属离子而言是连续的结合位点或是不连续的结合位点。
一旦采用结构数据并经分析从而发现了初级金属离子结合位点，就可以基于合理参数而生成一个或多个合适的金属离子结合位点。特别地，基于除了例如构型描述符之外的其它关键特征，可以采用不同搜索算法来生成潜在的金属离子结合位点。这些关键特征包括骨架蛋白中的原始残基的性质、对折叠所必需的配基位置、带电残基的数目以及它们的设置和配位外形中的水分子数。还可估算氢键网和对所设计配体残基的静电作用。而且，还可以根据溶解性、电荷分布、骨干柔性以及骨架蛋白的特性来分析金属离子结合位点的蛋白环境。由此，本领域普通技术人员可以基于期望的参数来合理地选择结合位点。
一旦金属离子结合位点生成，可以采用两种互补的计算机设计和接枝(见下文)方法来对位点进行剪接。首先，按照上面所述，可以采用接枝法来剪接金属离子结合位点，其中一级、二级、三级和/或四级结构是调谐的。其次，采用计算机设计法来剪接金属离子结合位点。可以理解的是这两种方法中的一个或全部是可以用于剪接结合位点。
计算机设计法包括通过修饰骨架中的金属结合位点残基的方法来修饰金属离子结合位点。在一个实施方式中，可以通过计算机，利用围绕金属离子的配体进行的构型或统计性描述、蛋白骨干的三维结构、以及氨基酸(或来自主链的微粒)侧链旋转异构体的文库可以识别一系列潜在的金属结合位点。采用对特定计算离子位点的几何构型和图形的描述，关键配体的残基可以被仔细地按放在氨基酸序列中从而形成金属(金属离子)结合袋。该结合袋可以通过根据配位描述和使用者优选的亲和性而设计的计算机算法而自动得以创建。
可以对所创建的潜在金属离子结合位点进行最优化并调谐至规格。可以根据金属结合位点的需要或灵活性来使用具有不同柔韧程度的金属离子结合位点的骨干结构。所设计的金属离子结合位点可以基于局部因素而进一步的评分、筛选，其中包括金属结合位点的形状、位置、电荷数、动力学性质、所需的突变数、溶解性以及边缘链碰撞。为达到最大的弛豫度，在配位外形中水分子的具有一个或两个氧微粒而又不会减小所需的结合亲和性和选择性是重要的。
可以基于几个对有助于金属离子亲和性的模式因子来开发较强金属结合亲和性的设计位点。例如，配体残基的数目是直接螯合特定金属进行的因素。在某些情况下，为了具备较强的金属离子亲和性Kd，其对测量金属离子浓度来说是必须的，有必要包括来自用于最佳金属离子结合的蛋白框架的残基。在其它情况下，带电残基数能够改变金属离子的亲和性。在又一其它情况下，由于螯合物的结合优选性依赖于特定配体类型，配体类型是一个影响因素。其它因素，例如负电环境，有助于金属离子结合蛋白的结合亲和性并且本领域普通技术人员无需过多的实验就可考虑到的。这些带电残基可以提高水交换率以避免其对所需弛豫度的限制。
该计算机方法阐述性的说法是用所选的关于金属离子结合位点的标准用计算机处理(或其它自动方式)来查询一个或多个包括金属结合蛋白位点的结构数据的数据库，从基于所选标准的兼容性的数据库信息中生成至少一个初步的金属离子结合位点，并从基于所选标准的最佳兼容性的初步的金属离子结合位点中选择一个或更多合适的金属离子结合位点。一旦选择了合适的金属离子结合位点，便能对所选金属离子结合位点的核酸序列进行获取、剪接并可操作地连接到骨架蛋白序列，其中对所选金属离子结合位点的核酸序列进行剪接以便获得对金属离子具有期望特异性的金属离子结合位点。此外，编码初步的结合位点的核酸序列可以从结构或模式数据中生成。计算机方法也可用于产生金属结合位点。
计算机方法可以用包含至少一个数据库的系统来实现，其中所述数据库包含金属离子结合位点的结构数据，从采用了与金属离子结合位点所选的相关标准的部分结构或模式数据中生成初步的金属结合位点以及基于所选金属离子的特异性对初步的金属结合位点进行鉴定的算法，和用于执行算法的计算机以便查询数据库以生成初步的金属离子结合位点。该算法总体上是相对简单的搜索算法，它可以基于所输入的标准来查询数据库。
2.接枝法
接枝法集中于通过对识别结合位点的一级、二级、三级和/或四级结构进行修饰来设计和构建金属结合位点。通过选择性地操作结合位点的结构，从而能够获取可以植入骨架蛋白中的金属离子结合位点，例如CD2或荧光蛋白，而不会明显地造成蛋白变性。采用接枝法，可以获得对某种金属离子比对另一种金属离子具有更强优选性的结合位点。这种修饰可以改良对比能力。
首先，采用了接枝法的经识别的结合位点可以是对金属离子具有一定亲和性的任何连续的序列位点。这样的结合位点既可以是源于诸如单个的EF-手相的已知结合肽也可以源自显示出结合特定金属离子能力的短片段，例如α-乳清蛋白。这种肽在自然界中非常保守，且遍布在自然界中或者可以是非天然的但是已知对特定金属离子具有亲和性。本领域普通技术人员能够确定对金属离子具有亲和性的结合位点而无需过多的实验。一旦确定了结合位点，该金属离子结合位点的一级结构可以经改动并调谐以获取具有较好结合性能的金属结合位点。例如，诸如门冬氨酸和谷氨酸等具有更多带电配体的残基可以经设计成通过插入密码子(多个密码子)到金属离子结合位点中从而调谐该位点或骨架蛋白的响应度。额外的带电配体的包涵物允许显像剂实现对所选顺磁金属离子的亲和性以及具有所需的选择性。此外，也可以通过对配体残基和其环境进行移除或修饰的方法把一个或两个水分子引入配位层。此外，一级结构的其它突变包括去除或增加氨基酸以改变诸如柔性或刚性等位点性质。从结合位点中加入或移除氨基酸可以改变结合位点的一级结构。
金属离子结合位点的二级结构，也就是，在线型序列中相互靠近的氨基酸残基的空间排布，可以经修饰以便对金属离子结合位点的灵敏度和响应度进行调谐。位点本身的残基，诸如螺旋、β链或转角之类的两侧或邻接的结构可以通过修饰以改变诸如疏水性、盐桥、二级结构倾向(例如螺旋，和β片)以及与不同氨基酸的电荷相互作用等性质，其中上述性质本身都可以改变二级结构。
金属离子结合位点的三级结构可以被修饰以便进一步调谐金属结合位点的灵敏度和响应度。金属离子结合位点对金属离子的亲和性可以根据选择性地操纵和加入螺旋、环、桥和/或衔接物以及诸如氢键、静电作用和疏水作用之类的化学性质而改变。实际上，这些三级结构的改变可以通过增加二级机构的倾向性，加入侧链的电荷作用以及通过稳定金属离子结合配位化学性质从而增加稳定性和亲和力。因此，通过调谐金属离子结合位点的三级结构来提高或降低连续结合位点的结合亲和力是可能的。此外，动力学性质可以通过提高蛋白的包装以及用具有更强刚性(例如Pro)或柔性(例如Gly)的氨基酸或其它基团来替换残基，或者添加二硫键来进行修饰。
直接改变金属离子结合位点的一级、二级、和/或三级结构的一种方法是通过改变位点的电荷。由于任何结合位点的电荷在位点结构中具有重要作用，电荷或电荷比率的变化对位点的结构具有重要影响。更重要的是，由于带电的侧链即便不直接用作为配体其也对金属离子结合亲和性展现出较强的影响力，因此这些各种链的变化会导致金属离子结合亲和力和选择性的不同。通过设计或修饰位点，例如改变带电配体残基的数目来形成金属离子结合袋，金属离子结构位点对所需要的金属离子可比竞争性金属离子具备更强的亲和性和更好的选择性。例如，金属结合位点的金属离子结合亲和性可以随金属离子结合位点和/或邻近环境中带电侧链的改变而不同。用例如丙氨酸等残基来替换诸如门冬氨酸或谷氨酸之类的带电残基可以出乎意料地使金属离子结合亲和力降低高达100倍。
就多功能显像剂来说，例如如果显像剂是荧光蛋白时，需要诱导金属结合位点但不能显著改变发色团的环境因为这样会减小荧光/光学信号。这些金属结合位点可以添加到远离发色团的位置或者简单地融合到荧光团中。这种位置可以明显地从序列和蛋白折叠中发现。
在其它实施方式中，接枝方法可以和设计方法一起使用以便创建最佳的金属结合位点。例如，金属结合位点可以通过使用由计算机设计所获得的部分连续结合位点和部分配体残基来创建。蛋白的环或任何序列可以移除或修饰以便获得最佳的所需结合亲和性、金属选择性、弛豫度和稳定性。因此，通过改变金属离子结合位点的一级、二级和/或三级结构，使得金属离子结合位点具有所期望特异性和亲和性以及更多重要显像性能成为可能。
3.其它方法
金属离子的螯合或结合可以采用已知或以后发明的方法来发展。这些方法包括现有技术中容易获得的蛋白质工程法，其包括通过修饰已有的金属结合位点来改变金属结合特异性和动力学性质。这些方法还包括用蛋白质配体残基来修饰已有结合位点或将其融合其它分子至蛋白显像剂中，其包括其它含非天然氨基酸或碳水化合物或磷酸盐的其它分子/人工基团的金属结合位点构象。用于蛋白质工程或设计合适方式的示例性方法在Barondeau D.P和Getzoff E.D.，蛋白-金属离子结合关系的结构探索(Structural Insights into Protein-Metal Ion Partnerships)，Current Opinonin chemical Biology，2004，14：7；和Lu，Y，含非天然氨基酸或非原始的金属辅助因子的蛋白质的设计和制备(Design and Engineering ofMetalloproteins Containing Unnatural Amino Acids or Non-NativeMetal-Containing Cofactors)，Current Opinon in chemical Biology，2005。这两篇文献的全部内容以参考的方式的结合在本文中。
此外，可以对方法进行组合来制备期望的金属离子鳌合位点。
在骨架蛋白中选择金属离子结合位点
金属结合位点可以选择性地引入许多骨架蛋白的位点中而基本不损害其二级结构。现有技术已知有许多用于确定如CD2蛋白、荧光蛋白(例如GFP、YFP、CFP和RFP)等蛋白质上结合位点的方法，包括例如控制位点的定向突变、插入突变以及缺失突变。其它方法，包括下面所举的和实施例中的例子，都是已知的或者是本领域技术人员容易理解的。
能够经受金属结合位点插入的荧光蛋白的位点还可以通过基因操纵和筛选所确定和识别的。通过生成突变蛋白以及操纵DNA序列，可以得到多种不同的插入，随后可以对其进行筛选以确定该蛋白是否保持其固有的活性。优选地，移除或损害荧光蛋白内在荧光性的位点不是最佳的，应当筛除。照这样方式所识别的变异体中暴露出可以经受插入却依旧保持其荧光性的位点。
用于骨架蛋白的优选金属离子结合位点可以通过考虑五项标准来优化金属结合位点、荧光蛋白和蛋白质环境的局部性质，第一，金属离子结合位点的构型相对于所期望的配位构型应当具有相对较小的差异。第二，根据对金属离子所期望的亲和性(Kd)，负电荷残基的变化应当不多于3-5个电荷。第三，金属离子螯合位点的水配位层应当能够和至少1-2水分子发生配位。第四，蛋白折叠和显像剂所需的快速动力学希望获取来自二级结构之间的环的具有良好溶解性的残基。
金属离子结合位点的突变或引入应当基本上不会妨碍蛋白的合成和折叠。更特别地，金属离子结合位点的引入不应当妨碍翻译后的发色团构象或者稳定发色团和蛋白框架折叠所需的分子间作用力。此外，所引入的侧链不应当被第二层包装并且不应当和骨架蛋白(例如，荧光蛋白)的蛋白质框架发生碰撞。虽然直接将发色团残基用作螯合位点并不是优选的，但是其也属于本发明的范围之内。
II导向部分
可用于本发明中的导向部分包括容许显像剂结合到蛋白质或其它靶的序列，其增加了将成像位点的显像剂的浓度。可用于本发明中特殊的导向部分可依赖于靶的特性和结合的特异性需求。有用的导向部分的实施例包括药物、亲脂性的或两性有机分子、卟啉、受体配体、类固醇、脂质、激素、肽、寡聚核苷酸(DNA，RNA或其化学修饰形式)、碳水化合物或其它分子或已知对需要成像的特异性组织中的一个或多个成分具有足够高亲和力的物质。可预期特定的导向部分比其它导向部分对靶具有更高的亲和力。
显像剂的靶或靶蛋白质是广泛存在的。这些靶可以是任何机体区室、细胞、器官、或组织或其构成。更优选的靶是那些具有诊断和治疗相关性的，比如那些与疾病或疾病状态相关的靶。例如，这样的靶可包括那些在体液内的，比如那些在血液、血浆、淋巴和中枢神经系统的液体内的靶物质。进一步的，这些靶可包括存在在高浓度或具有大量对特定配体的结合位点内的聚合肽或蛋白质。
适用于本发明的导向部分已经被或将被本领域普通技术人员发现。例如，血管血液淤积成像中，血清白蛋白可用作靶向部分。成像凝块，血纤维蛋白可作为靶。其它蛋白质靶包括，但是不限于，α-酸糖蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白和胶原质。导向部分优选得是对靶的结合具有特异性和高亲和力的蛋白质或分子。
众所周知，大部分的亲脂性或两性分子的TBMs可有效率得结合到不同的靶上，包括人血清白蛋白(HSA)。这些包括但不限于芳香族，和有4-200个碳原子的饱和脂肪族或不饱和脂肪族基团，其中每个碳原子是可由氧原子、氮原子、卤素、硫原子、或其它可共价结合碳原子的原子替换或取代。为了高特异性得结合其它蛋白质靶，经常需要专用的导向基团。具有足够高亲和力和特异性的定向基团可使用现代技术识别，比如联合化学、高通量筛选、抗菌素展示、通过指数富集的配体的系统性进化和其它所描述的方法，例如，在美国专利号5,475,096，5,595,877，和5,270,163(参见Gold等人Ann.Rev.of Biochem.，64：第763-797页(1995))，以参考方式结合入本文中。
III连接件
某些实施例的显像剂可包括任意的连接件，通过其导向部分连接到骨架蛋白。优选的，连接件可以是任何包括1到30碳原子通过单键或多键共价得连接的小亚基，其中高达10个碳原子可由O，N，P，S，F和Cl替换。连接件有将IEMs连接至骨架蛋白的功能。连接件的实施例包括线性或支链的烷烃，烯烃，或炔，其可选地可由功能基团比如羰基、醚、氨基化合物、胺、尿素、硫醚、芳基、磷酸基、磺胺基等等替换。某些实施方式的优选连接件体现两个或更多的功能化学基团，其一个连接到骨架蛋白上，其它连接到IEMs上。优选的是短到不可折叠的肽片段通常处于C-末端。在比如affibody之类的折叠区域内，连接件处于蛋白显像剂的N-末端。连接能够柔性的有助于确保造影部分和导向部分都回到它们的功能性质。
优选得连接件包括氨基酸，尤其是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、氨基苯基丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸，二氨基丙酸、羟脯氨酸、天门冬氨酸、和谷氨酸、二醇，尤其是乙二醇、二卤化物，尤其是乙烯二氯化合物、2-巯基乙醇、2-氨基乙醇、1，2-二氨基乙醇、二羧酸，尤其是草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸、反丁烯二酸、戊二酸、脂肪酸和其它双功能的、三功能的、多功能的小分子。实施例的连接件包括GGSGG，LGGSGGS，GGSGGS和GSG。
其它连接件没有限制，可以是尿素、乙缩醛、酮缩醇、双酯、羰基、硫脲、砜、硫酯、酯、醚、二硫化物、内酯、亚胺、磷酰基或磷酸二酯连接件；取代的或非取代的饱和或不饱和烷基链；直链的、支链的或环状的单一氨基酸或不同氨基酸(例如，纤维蛋白结合部分的N-或C-末端的延伸)的氨基酸链；丙二酸、丁二酸、戊二酸、已二酸或庚二酸；已酸；单二胺类和二醇类。
优选的连接件的分子量已定义。分子量可从小于100直到大于1000。优选的连接件的分子量小于200，更优选的是小于100。此外，理想的是使用体内生物可降解的连接件，以提供本发明显像剂的有效率的排泄途径。根据连接件内它们的位置，这样生物可降解的功能基可包括酯、双酯、氨化物、磷酸酯、醚、乙缩醛、酮缩醛功能团。
本领域普通技术人员可不需要过多实验就可以选择合适的连接件。
IV金属离子
金属离子是微粒(atoms)和离子，包括能够结合到蛋白质或肽上的各自的同位素和放射性同位素。金属离子可以可逆得或不可逆得结合，这样的键可以是共价键或非共价键。当本发明的优选实施方式中使用Gd3+时，可以理解适用于本发明中的金属离子包括，但不限于包括顺磁性金属离子、过渡金属离子、和镧系元素离子的金属离子。实施例的金属离子包括，但不限于镁、钙、钪、钛、锰、铁、硼、铬、钴、镍、铜、锌、镓、锶、钇、锶、锝、钌、铟、铪、钨、铼、锇、和铋的离子、同位素和/或放射性同位素形式。本发明使用金属的放射性同位素也是可能的。顺磁性金属离子是本发明优选使用的金属离子。
显像剂螯合离子的选择部分取决于离子在诊断中的角色。金属包括镧系元素和其它金属的离子，包括其同位素和其放射性同位素可通过例如螯合作用合并。在MR成像应用中，优选的金属离子是顺磁性金属离子比如钆。基于想要的诊断应用，本领域的普通技术人员不需要过多的实验可选择用作螯合的金属离子。
如上所述，本发明中处于显像剂形成的螯合复合物中的金属离子的选择有赖于采用该试剂的诊断技术。在MRI或MRS或EPR应用中，金属离子应该是顺磁性的(金属离子具有不成对电子)，并且优选得是非放射性的。应该将例如具有至少37个微粒(atoms)，优选得至少50个微粒的重金属离子用于X-射线和超声成像中，同样优选的是非放射活性的种类。对于闪烁扫描法而言，该金属离子应当是放射性同位素离子。对于MR、X射线、EIT或磁力显像而言可使用螯合基团以结合到重金属族(例如多金属氧酸盐以及全部或部分硫似物)或到氧化铁或其它顺磁性多原子种类。
金属离子配位的螯合物和多聚螯合物的方法是本领域普通技术人员已知的。金属可以通过直接结合、模板合成以及转甲基作用而结合到显像剂中，也就是剪接的结合位点内。优选地，金属离子通过直接合并螯合入显像剂内，其包括亚化学剂量水平至全部合并的溶液的滴定。
使用和制备
根据本发明制备的显像剂可以同样的方式用于许多传统的MRI和光学显像剂。按照常规程序配伍的成分可作为适用于人类或动物模型系统中的静脉内的给药的制药成分。
实施例
实施例1
本实施例说明具有胃泌素受体肽受体的显像剂结合癌细胞。在三个细胞株中的ELISA检测显示实施例的具有胃泌素受体肽(GNQWAVGHLM)的导向部分的显像剂CD2.CA1.CD2-Bom(参见以下)靶向定位表达胃泌素受体肽受体(GRPRs)的癌细胞。特别地，在三个细胞株上进行的ELISA检测，即PC-3细胞株、SW620细胞株、和HCT116细胞株。即使PC-3细胞株和SW620细胞株都是表达GRPRs细胞，SW620细胞株表达的GPRPs少于PC-3细胞株的表达。HCT116细胞株表达非常少的GRPRs，被用作对照组。
检测使用细胞结合分析技术实施，由于GST-融合蛋白的N-末端利用抗GST的抗体检测到。细胞在孔中培养过夜。接着将GST-融合蛋白加入到培养基中。细胞进一步孵育45分钟。细胞用3.7％的甲醛溶液固定。蛋白到细胞的结合用ELISA进行分析。
如图3所示，显像剂优选地结合到具有GRPRs的细胞株上。设计的显像剂和PC-3的结合也明显强于其与SW620的结合，与两个细胞株的GRPR的水平相关。如所预期的一样，在缺乏GRPR表达的显著水平的HCT116细胞株上没有观察到结合。
实施例2
该实施例显示和GRP连接的显像剂经历受体介导的细胞内吞作用。可观察到造影蛋白GST-CA1.CD2-Bom的GPRP介导的内化作用(internalization)。显像剂的内化作用很大程度上增加了局部Gd3+的浓度。在45分钟到1小时之后，大部分GST-CA1.CD2-Bom通过受体介导的细胞内吞作用而内化。显示出内在化的GST-CA1.CD2-Bom富集在膜内胞液侧。然而在30分钟之后没有观察到GST-CA1.CD2-Bom的细胞显著水平的内吞作用。
如图4A-4F所示，具有GRP的显像剂经历受体介导的细胞内吞作用。设计的GST-CA1.CD2-Bom到三个细胞株上的结合通过使用抗GST的抗体的免疫印迹法检测。印迹通过Zeiss510的激光扫描共焦显微镜观察。在HCT116细胞上没有观察到明显的结合(数据未示出)。接着，由于在两个小时的额外孵育中没有观察到检测细胞明显的细胞死亡(数据未示出)，因而可观察到Gd3+没有毒性效应。
更特别的是如图4A所示，在SW620和PC-3细胞的清楚的细胞印迹模型中，显像剂在30分钟的时间结合到具有GRP受体的细胞表面。在PC-3细胞中孵育的大部分蛋白质在120分钟进入到细胞内(图4D和4E)。有趣的是，蛋白质在120分钟的内化作用之后是稳定的，显示其显像通过细胞内吞作用抵抗蛋白质降解。
实施例3
该实施例显示具有导向部分的显像剂已表明没有明显的细胞毒性。设计的显像剂的细胞毒性在细胞株SW620、SW480和HEK293中通过本领域已知的实验程序MTT法进行测定。简而言之，检测细胞被设计带有和不带有Gd3+(浓度达到50μM)的显像剂孵育48小时后的情况。然后从孵育过程中除去细胞培养基。细胞的生存能力通过MTT法进行分析。用w.t.CD2和CA1.CD2蛋白处理的HEK293细胞株中观察到存活率的轻微的降低。在所有经设计出的显像剂处理过的检测细胞中观察到没有明显毒性(参见附图5)，显像剂的浓度最高达到50μM。
出版文献建议GRP肽序列对Kd＜10-10的受体具有较强的亲和力。已知其在结合其受体GRPR之后GRP很快经历内在化作用。如上所讨论的，GST-CA1.CD2-Bom在PC-3和SW620中经历的内在化作用。基于这些研究，可预见CD2-GRP(序列)可同样被内在化。时间间隔共焦的和免疫印迹实验可说明内在化作用的时间框架和CD2-GRP的内在化作用之后的细胞定位。更重要的是，这些实验可表明在内在化作用之后CD2-GRP的稳定性和显像剂的稳定性。
如果显像剂缺乏稳定性或容易被细胞降解，靶序列可相应得经过修饰。如图6所示，GRP靶序列可经修饰减少由蛋白酶引起的降解，并通过封闭N-和/或C-末端降低GRP受体的结合亲和力。另外，通过接枝或设计稳定的造影蛋白内的导向部分将通过羧化酶或氨基-肽酶保护蛋白酶的降解。另外，这种接枝的靶肽序列具有良好的柔性连接件可提供一种更好的活性构型。
实施例4
结合到设计蛋白的细胞的MR成像
MR图像分析可通过相同的三个细胞株如PC-3、SW480和HCT116实施。PC-3细胞可在上清液中生长。由于SW480和HCT116细胞不能在上清液中生长，这些细胞可每7ml培养基4×106的密度的皮氏培养皿上接种。几个具有不同浓度的蛋白显像剂的皮氏培养皿可为每个成像实验接种。非造影蛋白，比如野生型CD2，可用于阴性对照，GRP肽标记荧光探针可用于阳性对照。细胞在孵育的不同时间点之后可成球状。细胞用5mlPBS洗涤三次并用200μl PBS收集。细胞在800g下离心5分钟，移去上清液。
图像可使用成像仪获得，比如具有60-mm内径的鸟笼共振器的3T成像仪(Pharmascan 300)。用于获取图像的顺序是具有重复时间/回声时间/激发数为100/8.45/24的旋转回声，3.5em的视野和1mm一张片子。
图6显示CA1.CD2-Bom提供更强的T1加权像的细胞成像的增强。与CA1.CD2-Bom提供给HCT-116(1162ms/mM)和Gd-DTPA提供给PC-3(1555ms/mM)相比，CA1.CD2-Bom提供给的PC-3(814ms/mM)的T1弛豫率显著缩短，其与PC-3细胞株高表达GRPr的事实一致。结果表明在具有更高GRPr表达水平的情况下，CA1.CD2-Bom有选择地增强癌细胞的MR成像。
实施例5
根据本发明，这个实施例显示实施例的显像剂能够被靶向定位。产生的靶向显像剂的实施例通过序列ID Nos.1-13显示。
实施例6
该实施例证明衍生自荧光蛋白的多功能探针可定位于特定的位点。图7显示实施例的探针(EGFP-CA1.CD2-a-Bom 10)可定位于具有靶向标记(蛙皮素(Bombesin))的细胞。参见例如序列Nos.12和13。
在前详细描述的优选实施例和附图的给出仅用于解释性的和描述之用。它们并不意于穷尽也不意在限定本发明的范围和精神。对实施方式的选择和描述是为了最佳地解释本发明的原理及其实际应用。本领域技术人员可以认识到在不脱离本发明范围和实质的情况下对说明书所公开的发明作出多种变型。
序列表
<110>佐治亚州立大学研究基金会(Georgia State University Research Foundation，Inc.)
<120>靶向显像剂及显像剂靶向定位的方法
<130>FP08US557
<140>n/a
<141>2008-05-08
<150>US 60/715,493
<151>2005-09-09
<150>US 11/457,370
<151>2006-07-13
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>121
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This artifcial sequence，derived from CD2，contains 2 linkers
(GGSGGS)flanking at Bombesin GNQWAVGHLM grafted at the position
52.
<400>1
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asp Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asn Gln Trp Ala Val
50 55 60
Gly His Leu Met Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp
65 70 75 80
Ala Asn Gly Asp Leu Asp Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly
85 90 95
Thr Tyr Asn Val Thr Val Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn
100 105 110
Lys Ala Leu Asp Leu Arg Ile Leu Glu
115 120
<210>2
<211>114
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)and 10amino acids from Bombesin (GNQWAVGHLM) at the
terminal end.
<400>2
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His
100 105 110
Leu Met
<210>3
<211>116
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(LGGSGGS) and 10 Amino Acids from Bombesin (GNQWAVGHLM) at the
terminal end.
<400>3
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asn Gln Trp Ala Val
100 105 110
Gly His Leu Met
115
<210>4
<211>120
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，14 Amino Acids from Bombesin (GNQWAVGHLM)，and a portion
GG at the terminal end.
<400>4
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp
100 105 110
Ala Val Gly His Leu Met Gly Gly
115 120
<210>5
<211>117
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(LGGSGGS)，10 Amino Acids from Bombesin (GNQWAVGHLM)，the amino
acid G at the terminal end.
<400>5
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asn Gln Trp Ala Val
100 105 110
Gly His Leu Met Gly
115
<210>6
<211>116
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GSG) and 14 amino acids from Bombesin (EQRLGNQWAVGHLM) at the
terminal end.
<400>6
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Ser Gly Glu Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp Ala Val
100 105 110
Gly His Leu Met
115
<210>7
<211>115
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(LGGSGG)，10 amino acids from Bombesin (GNQWAVGHLM at the
terminal end.This protein contains two metal chelating sites.
<400>7
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asp Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly
100 105 110
His Leu Met
115
<210>8
<211>115
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(LGGSGG)，10 amino acids from Bombesin (GNQWAVGHLM at the
terminal end.This protein contains two metal chelating sites.
<400>8
Arg Asp Ser Gly Thr ValTrp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Asp Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Glu Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly
100 105 110
His Leu Met
115
<210>9
<211>115
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(LGGSGG)，10 amino acids from Bombesin (GNQWAVGHLM)at the
terminal end.This protein contains three metal chelating sites.
<400>9
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asp Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Asp Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Glu Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly
100 105 110
His Leu Met
115
<210>10
<211>219
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains two
linkers (LGGSGG)，10 amino acids from Bombesin (GNQWAVGHLM)at
the terminal end.This contrast agent contains two contrast
proteins and three metal chelating sites.
<400>10
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp
100 105 110
Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met
115 120 125
Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val
130 135 140
Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe
145 150 155 160
Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp
165 170 175
Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg
180 185 190
Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met
210 215
<210>11
<211>148
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGGS)and 10 amino acids from Bombesin(GNQWAVGHLM)at the
terminal end.This contrast agent also contains a tag(HHHHHH)
for Affinity purification.
<400>11
His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln
1 5 10 15
Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg Trp Gly Ser
20 25 30
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
35 40 45
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
50 55 60
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
85 90 95
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
100 105 110
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
115 120 125
Ile Leu Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asn Gln Trp Ala Val
130 135 140
Gly His Leu Met
145
<210>12
<211>303
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from green fluorescent
protein，contains a linker(GGSGGS)and 10 amino acids from
Bombesin(GNQWAVGHLM)at the terminal end.The metal binding
site is derived from the EF-hand III from calmodulin grafted at
<400>12
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
65 70 75 80
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
85 90 95
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
100 105 110
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
130 135 140
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
165 170 175
Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn
180 185 190
Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Lys
195 200 205
Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly
210 215 220
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
245 250 255
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile Val Leu Leu Glu
260 265 270
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met
290 295 300
<210>13
<211>303
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from green fluorescent
protein，contains a linker(GGSGGS)and 10 amino acids from
Bombesin(GNQWAVGHLM)at the terminal end.The metal binding
site is derived from the EF-hand III from calmodulin grafted at
<400>13
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
20 25 30
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly His Lys Phe Ser Val
35 40 45
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
50 55 60
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
65 70 75 80
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
85 90 95
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
100 105 110
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
130 135 140
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
165 170 175
Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Glu
180 185 190
Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
195 200 205
Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Asp Gly
210 215 220
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
245 250 255
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Ile Val Leu Leu Glu
260 265 270
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met
290 295 300
<210>14
<211>163
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains two
linkers(GGSGG)，10 amino acids from Affibody
(VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK)at
the terminal end.This contrast agent also contains a metal
<400>14
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
100 105 110
Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu
115 120 125
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln
130 135 140
Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
145 150 155 160
Pro Lys Pro
<210>15
<211>165
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains two
linkers(LGGSGGS)，10 amino acids from Affibody
(VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK)at
the terminal end.This contrast agent also contains a metal
<400>15
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Val Asp Asn Lys Phe Asn
100 105 110
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
115 120 125
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
145 150 155 160
Gln Ala Pro Lys Pro
165
<210>16
<211>113
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，9 amino acids from Somastostin analogue(ACYDWKVCT)at
the terminal end.This protein contains a metal chelating site.
<400>16
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg GIy Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ala Cys Tyr Asp Trp Lys Val Cys
100 105 110
Thr
<210>17
<211>116
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，12 amino acids from VIP1-12(HSDAVFTDNYTR)at the
terminal end.This protein contains a metal chelating site and
can be targeted to a CD4 receptor.
<400>17
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp
100 105 110
Asn Tyr Thr Arg
115
<210>18
<211>132
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，28 amino acids from VIP28(HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN)
at the terminal end.This protein contains a metal chelating
site.
<400>18
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp
100 105 110
Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn
115 120 125
Ser Ile Leu Asn
130
<210>19
<211>134
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，30 amino acids from Galanin
(GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS)at the terminal end.This
protein contains a metal chelating site.
<400>19
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly
100 105 110
Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val Gly Asn His Arg Ser Phe Ser Asp
115 120 125
Lys Asn Gly Leu Thr Ser
130
<210>20
<211>131
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，27 amino acids from Secretin
(HSDGTFTSELSRLREGARLQRLLQGLV) at the terminal end.This protein
contains a metal chelating site.
<400>20
Arg Asp Ser Gly Thr ValTrp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser
100 105 110
Glu Leu Ser Arg Leu Arg Glu Gly Ala Arg Leu Gln Arg Leu Leu Gln
115 120 125
Gly Leu Val
130
<210>21
<211>113
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，8 amino acids from CCK8(DYMGWMDF)at the terminal end.
This protein contains a metal chelating site.
<400>21
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe
100 105 110
Pro
<210>22
<211>114
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，10 amino acids from human angiotensin I(DRVYIHPFHL)at
the terminal end.This protein contains a metal chelating site.
<400>22
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe
100 105 110
His Leu
<210>23
<211>125
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，21 amino acids from Human Endothelin 3
(CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW)at the terminal end.This protein
contains a metal chelating site.
<400>23
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp
100 105 110
Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His Leu Asp Ile Ile Trp
115 120 125
<210>24
<211>139
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，36 amino acids from Human Neuropeptide Y
(YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY)at the terminal end.This
protein contains a metal chelating site.
<400>24
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu
115 120 125
Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg
130 135
<210>25
<211>120
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，16 amino acids from Human Opioid peptide a-Endorphin
(YGGFMTSEKSQTPLVT)at the terminal end.This protein contains a
metal chelating site.
<400>25
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn ValThr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu
100 105 110
Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr
115 120
<210>26
<211>114
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>This targeted contrast agent，derived from CD2，contains a linker
(GGSGG)，10 amino acids from GH-RH(EHWSYGLRPG)at the terminal
end.This protein contains a metal chelating site.
<400>26
Arg Asp Ser Gly Thr Val Trp Gly Ala Leu Gly His Gly Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp Ile Asp Glu Val Arg Trp
20 25 30
Glu Arg Gly Ser Thr Leu Val Ala Glu Phe Lys Arg Lys Met Lys Pro
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Gly Ala Phe Glu Ile Asp Ala Asn Gly Asp Leu Asp
50 55 60
Ile Lys Asn Leu Thr Arg Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Val Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Asn Gly Thr Arg Ile Leu Asn Lys Ala Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg
100 105 110
Pro Gly
Claims (23)
1.一种显像剂包括：
a)具有造影性质的造影蛋白；和
b)至少一个导向部分，
其中至少一个导向部分可操作地连接到或合并入造影蛋白内。
2.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于造影蛋白和导向部分可操作地连接到末端。
3.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于其中造影蛋白和导向部分可操作地连接到造影蛋白内或合并到造影蛋白内作为一整体。
4.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于多个导向部分可操作地与造影蛋白连接。
5.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于其中造影蛋白适用于磁共振成像。
6.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于导向部分诱导特定细胞的内吞作用。
7.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于导向部分和造影序列可操作地通过共价键或肽键连接。
8.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于造影蛋白螯合顺磁性金属离子。
9.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于导向蛋白是胃泌素释放肽。
10.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于顺磁性金属离子是Gd(III)。
11.根据权利要求1所述的显像剂，进一步包括
c)至少一个导向部分中的一个和造影蛋白之间的连接蛋白。
12.一种制备显像剂的方法包括步骤：
a)选择造影蛋白；
b)选择至少一个能够结合靶蛋白的导向部分；
c)可操作地连接或合并导向部分和造影蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于导向部分优先选择结合胃泌素释放肽受体。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于导向部分优先选择结合癌细胞受体。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于造影蛋白是可操作地连接到导向部分的末端。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于导向部分选择在特定的细胞内诱导靶向内吞作用。
17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于造影蛋白螯合顺磁性金属离子。
18.根据权利要求12所述的方法，其特征在于造影蛋白适用于磁共振成像。
19.一种动物或人为对象的磁共振成像的方法：
a)施加蛋白显像剂到该对象，蛋白显像剂能够结合靶向蛋白；
b)允许显像剂结合造影蛋白；和
c)在该对象的造影蛋白定位的位置成像。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于对象优选在靶蛋白的位置成像。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于对象在肿瘤位置成像。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于对象通过核磁共振成像。
23.制备如本文披露的显像剂的靶向显像剂和方法。
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| US71549305P | 2005-09-09 | 2005-09-09 | |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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Family
ID=40114312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CNA2006800417649A Pending CN101304767A (zh) | 2005-09-09 | 2006-09-08 | 靶向显像剂及显像剂靶向定位的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101304767A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107850590A (zh) * | 2015-05-11 | 2018-03-27 | 佐治亚州立大学研究基金会公司 | 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途 |
| CN112979770A (zh) * | 2019-12-16 | 2021-06-18 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种蛋白a突变体、融合蛋白和应用 |
-
2006
- 2006-09-08 CN CNA2006800417649A patent/CN101304767A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107850590A (zh) * | 2015-05-11 | 2018-03-27 | 佐治亚州立大学研究基金会公司 | 靶向蛋白造影剂、其制备方法及用途 |
| CN112979770A (zh) * | 2019-12-16 | 2021-06-18 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种蛋白a突变体、融合蛋白和应用 |
| CN112979770B (zh) * | 2019-12-16 | 2022-07-26 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种蛋白a突变体、融合蛋白和应用 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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