CN112979770A - 一种蛋白a突变体、融合蛋白和应用 - Google Patents

一种蛋白a突变体、融合蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种蛋白A突变体、融合蛋白和应用，涉及生物技术领域，该蛋白A突变体选自突变体1～2或与突变体1～2具有94％以上序列同一性的序列，突变体1～2的序列依次如SEQ ID No.1～2所示。该蛋白A突变体或其构建的融合蛋白对于不同物种来源的抗体的结合能力没有明显的偏倚，有效扩大了蛋白A或其构建的融合蛋白的应用范围，为更多新技术的开发和应用提供了一种新的途径。

Description

一种蛋白A突变体、融合蛋白和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种蛋白A突变体、融合蛋白和应用。
背景技术
天然的免疫球蛋白结合蛋白有ProteinA(蛋白A)和ProteinG(蛋白G)等。蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42KD，能特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段，而与Fab区或轻链结合很弱。
但蛋白A对于不同种属和不同亚型的抗体结合能力差异大，即对种属有明显的偏好性。
基于免疫球蛋白结合蛋白的应用广泛性，多种免疫球蛋白结合蛋白与具有特殊活性蛋白相结合的方式制备融合蛋白的应用也越来越多，这些方法能够拓展活性蛋白的应用场景，有利于多种新技术的开发和应用。但是由于免疫球蛋白结合蛋白和不同来源的免疫球蛋白结合能力存在差异，且这种差异不具有明显的规律，这导致免疫球蛋白结合蛋白或是由该免疫球蛋白结合蛋白构建的融合蛋白在不同的应用场景中存在差异，如何减小结合蛋白与抗体结合的差异，从而增加融合蛋白的应用范围，是如今需要解决的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供蛋白A突变体、融合蛋白、分离的核酸、载体、宿主细胞、制备蛋白A突变体或融合蛋白的方法、亲和色谱载体和蛋白A突变体在分离、纯化和/或检测免疫球蛋白中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供一种蛋白A突变体，所述蛋白A突变体选自突变体1和突变体2中的任意一种；
其中，所述突变体1选自突变体1a和突变体1b中的任意一种；
所述突变体1a的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述突变体1b与所述突变体1a具有94％以上序列同一性且能够结合免疫球蛋白Fc段；
所述突变体2选自突变体2a和突变体2b中的任意一种；
所述突变体2a的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述突变体2b与所述突变体2a具有94％以上序列同一性且能够结合免疫球蛋白Fc段。
第二方面，实施例提供一种融合蛋白，其包括如前述实施方式所述的蛋白A突变体。
第三方面，实施例提供一种分离的核酸，其编码如前述实施例所述的蛋白A突变体或如前述实施例所述的融合蛋白。
第四方面，实施例提供一种载体，其包括如前述实施例所述的分离的核酸。
第五方面，实施例提供一种宿主细胞，其含有如前述实施例所述的载体。
第六方面，实施例提供一种制备蛋白A突变体或融合蛋白的方法，其包括培养如前述实施方式所述的宿主细胞。
第七方面，实施例提供一种亲和色谱载体，其包括有如前述实施方式所述的蛋白A突变体或融合蛋白。
第八方面，实施例提供如前述实施方式所述的蛋白A突变体或融合蛋白在分离、纯化和/或检测免疫球蛋白中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种蛋白A突变体，所述蛋白A突变体选自上述突变体1和上述突变体2，该蛋白A突变体或其构建的融合蛋白对于不同物种来源的抗体的结合能力偏倚小，有效扩大了蛋白A或其构建的融合蛋白的应用范围，为更多新技术的开发和应用提供了一种新的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明验证例1中不同蛋白A突变体与多种酶标抗体结合的结果；
图2为本发明验证例3中融合蛋白与多种酶标抗体结合的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种蛋白A突变体，所述蛋白A突变体选自突变体1和突变体2中的任意一种。
其中，所述突变体1选自突变体1a和突变体1b中的任意一种。
所述突变体1a的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述突变体1b与所述突变体1a具有94％以上序列同一性且能够结合免疫球蛋白Fc段。
所述突变体2选自突变体2a和突变体2b中的任意一种。
所述突变体2a的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述突变体2b与所述突变体2a具有94％以上序列同一性且能够结合免疫球蛋白Fc段。
在可选实施方式中，所述突变体1b包括相较于所述突变体1a具有I16V、K49Q和K7E中任一突变或突变组合的序列；
需要说明的是，上述I16V为：当突变体1a或突变体2a的第16位的异亮氨酸突变为缬氨酸的情况，K49Q和K7E依此类推。
所述突变体2b包括相较于所述突变体2a具有I16V、K49Q和K7E中任一突变或突变组合的序列。
本发明实施例还提供了一种融合蛋白，其包括至少一个如前述实施方式所述的蛋白A突变体。
在可选实施方式中，融合蛋白包括链接肽和活性蛋白，所述活性蛋白与所述融合蛋白相连。
在可选实施方式中，所述活性蛋白与所述融合蛋白通过连接肽连接。
在可选实施方式中，所述连接肽为刚性连接肽或柔性连接肽。
在可选实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽。
在可选实施方式中，所述连接肽的长度为6～59个氨基酸。
在可选实施方式中，所述连接肽的长度为20～35个氨基酸。在可选实施方式中，所述连接肽的序列如SEQ ID No.3所示。
在可选实施方式中，所述活性蛋白位于所述融合蛋白的氨基酸序列的C端，所述蛋白A突变体位于所述融合蛋白的氨基酸序列的N端。
在可选实施方式中，所述活性蛋白包括内切酶、外切酶、NDA甲基化酶、微球菌核酸酶、转座酶、Dnase I和TET中的任意一种。
本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其编码如前述实施方式所述的蛋白A突变体或如前述实施方式所述的融合蛋白。
本发明实施例还提供了一种载体，其包括如前述实施方式所述的分离的核酸。
在可选实施方式中，所述载体为克隆载体或表达载体。
本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其含有如前述实施方式所述的载体。
本发明实施例还提供了一种制备蛋白A突变体或融合蛋白的方法，其包括培养如前述实施方式所述的宿主细胞。
本发明实施例还提供了一种亲和色谱载体，其包括有如前述实施方式所述的蛋白A突变体。亲和色谱载体包括固相载体和蛋白A突变体，蛋白A突变体为固相载体的配体，应用时，偶联于固相载体上，采用亲和层析柱，用于抗体的分离纯化。
在可选实施方式中，固相载体包括有琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、带羟基的高分子聚合物和硅胶中的一种。
本发明实施例还提供了如前述实施方式所述的蛋白A突变体在分离、纯化和/或检测免疫球蛋白中的应用。
可以根据需要，通过利用蛋白A突变体的物理性质，化学性质等的各种分离操作进行分离纯化。例如，蛋白沉淀剂处理(盐析法)，离心分离，渗透压破碎法，超声波破碎，超滤，凝胶过滤，以及吸附色谱，离子交换色谱，亲和色谱，高速液相色谱等各种液相色谱，透析法及这些方法的组合等。蛋白A突变体结合的免疫球蛋白的活性可以通过ELISA实验测定。
在可选实施方式中，所述分离、纯化和/或检测免疫球蛋白用于分析染色质与蛋白的相互作用。
在可选实施方式中，所述分析染色质与蛋白的相互作用用于分析转录因子结合位点、特异性位点甲基化和/或组蛋白特异性修饰位点。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供蛋白A突变体，其包括突变体1a和突变体2a。
其中，突变体1a的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；突变体2a的氨基酸序列如SEQID No.2所示。
实施例2
本实施例提供蛋白A突变体，其包括突变体1b和突变体2b。
具体的，突变体1b包括突变体1b-1、突变体1b-2、突变体1b-3、突变体1b-4、突变体1b-5、突变体1b-6和突变体1b-7，具体如下。
突变体1b-1为相较于所述突变体1a具有I16V突变的序列；
突变体1b-2为相较于所述突变体1a具有K49Q突变的序列；
突变体1b-3为相较于所述突变体1a具有K7E突变的序列；
突变体1b-4为相较于所述突变体1a具有I16V和K49Q突变组合的序列；
突变体1b-5为相较于所述突变体1a具有K49Q和K7E突变组合的序列；
突变体1b-6为相较于所述突变体1a具有I16V和K7E突变组合的序列；
突变体1b-7为相较于所述突变体1a具有I16V、K49Q和K7E突变的序列。
进一步地，突变体2b包括突变体2b-1、突变体2b-2、突变体2b-3、突变体2b-4、突变体2b-5、突变体2b-6和突变体2b-7，具体如下。
突变体2b-1为相较于所述突变体2a具有I16V突变的序列；
突变体2b-2为相较于所述突变体2a具有K49Q突变的序列；
突变体2b-3为相较于所述突变体2a具有K7E突变的序列；
突变体2b-4为相较于所述突变体2a具有I16V和K49Q突变组合的序列；
突变体2b-5为相较于所述突变体2a具有K49Q和K7E突变组合的序列；
突变体2b-6为相较于所述突变体2a具有I16V和K7E突变组合的序列；
突变体2b-7为相较于所述突变体2a具有I16V、K49Q和K7E突变的序列。
实施例3
采用实施例1或2提供的蛋白A突变体构建融合蛋白，构建方法如下。
该融合蛋白N端到C端依次为蛋白A序列、连接肽序列、微球菌核酸酶(活性蛋白)序列，其中，
连接肽的序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
Asp-Asp-Asp-Lys-Glu-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His；
微球菌核酸酶的序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
Ala-Thr-Ser-Thr-Lys-Lys-Leu-His-Lys-Glu-Pro-Ala-Thr-Leu-Ile-Lys-Ala-Ile-Asp-Gly-Asp-Thr-Val-Lys-Leu-Met-Tyr-Lys-Gly-Gln-Pro-Met-Thr-Phe-Arg-Leu-Leu-Leu-Val-Asp-Thr-Pro-Glu-Thr-Lys-His-Pro-Lys-Lys-Gly-Val-Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Glu-Ala-Ser-Ala-Phe-Thr-Lys-Lys-Met-Val-Glu-Asn-Ala-Lys-Lys-Ile-Glu-Val-Glu-Phe-Asp-Lys-Gly-Gln-Arg-Thr-Asp-Lys-Tyr-Gly-Arg-Gly-Leu-Ala-Tyr-Ile-Tyr-Ala-Asp-Gly-Lys-Met-Val-Asn-Glu-Ala-Leu-Val-Arg-Gln-Gly-Leu-Ala-Lys-Val-Ala-Tyr-Val-Tyr-Lys-Pro-Asn-Asn-Thr-His-Glu-Gln-His-Leu-Arg-Lys-Ser-Glu-Ala-Gln-Ala-Lys-Lys-Glu-Lys-Leu-Asn-Ile-Trp-Ser-Glu-Asp-Asn-Ala-Asp-Ser-Gly-Gln；
蛋白A选自实施例1～2提供的蛋白A突变体以及野生型蛋白A。
野生型蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：
Val-Asp-Asn-Lys-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-His-Leu-Pro-Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe-Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln-Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ala-Glu-Ala-Lys-Lys-Leu-Asn-Asp-Ala-Gln-Ala-Pro-Lys。
将上述融合蛋白对应的核苷酸序列进行人工基因合成，并将合成的序列的片段连接到质粒载体上，用于构建表达载体。
将所构建的表达载体转化到感受态大肠杆菌表达菌株内，添加到1ml LB培养基中，并在37℃培养30min，取200μl菌液涂布于含卡那霉素的LB固体平板上，置于37℃恒温箱中过夜培养16h，并挑选白色菌落的单克隆菌株接种于3ml含有卡那霉素的液体LB培养基中，置于恒温摇床中以37℃过夜培养16h。次日取培养后的菌液，在500ml的三角培养瓶中按照1:100的比例接入到200ml含有卡那霉素的液体LB培养基中，并在37℃恒温摇床中培养，在OD600达到0.6左右时，加入终浓度为0.25mM的IPTG进行诱导，并在18℃过夜培养16h。对于发酵得到的表达目的蛋白的基因工程菌菌液，分别取500ml使用低温高速离心机进行离心(4℃，12000rpm，5min)，弃去上清，对收集到的菌体分别加入50ml裂解缓冲液(50mMHEPES-KOH at PH 7.5，800mM NaCl，1mM EDTA，0.25％Tween-20)重悬菌体，对菌体进行超声破碎(30s超声破碎，10次)，在相同条件下再次离心，收集离心得到的上清。对上清进行纯化以得到纯度高于90％的融合蛋白。
验证例1
使用酶联免疫反应(ELISA)原理检测实施例1中的蛋白A突变体与多种酶标抗体(IgG)结合的能力，具体检测流程如下。
将稀释好的蛋白A突变体1a、突变体2a以及野生型蛋白A(0.8nmol/ml)各100μl加入酶标板的对应孔中，每个样品均设置平行组，同时有3个反应孔对应一种酶标抗体以保证数据准确性，同时设置阴性对照并以ddH2O代替，封板后放置37℃孵育30min；移去孔中液体并用洗液洗涤4次并彻底去除孔中残留的洗液，然后向每个孔中加入250μl封闭液，封板后置于37℃孵育1h，用稀释液将多种酶标抗体(鼠、兔、犬、羊、牛、马、人、猪)稀释至0.4nmol/ml，分别向对应的反应孔中加入250μl，封板后置于37℃孵育30min；移去孔中液体并用洗液洗涤4次并彻底去除孔中残留的洗液，然后向每个孔中加入100μl显色液，封板后置于室温(20～25℃)避光孵育15min，然后向每孔中加入50μl终止液，终止后立即用酶标仪测定OD450数值。检测结果请参照附图1。
图1中，以OD450数值为纵坐标，以多种酶标抗体类型为横坐标，可以看出不同蛋白A或其突变体与多种酶标抗体结合的效果，PA105为突变体1a，PA633为突变2a。
由图1可知，实施例1提供的突变体1a和突变体2a对不同物种来源抗体的结合能力并没有明显的偏倚，而野生型蛋白A对不同物种来源抗体的结合能力偏倚大。
验证例2
使用酶联免疫反应(ELISA)原理检测实施例2中的突变体1b和突变体2b与多种酶标抗体(IgG)结合的能力，具体检测流程同验证例1。
突变体1b-1～7和突变体2b-1～7对不同来源的免疫球蛋白的结合能力请参照表1。
表1突变体
Figure BDA0002320484100000091
Figure BDA0002320484100000101
由表1可知，实施例2提供的突变体1b-1～7和突变体2b-1～7对不同物种来源抗体的结合能力均没有明显的偏倚。
验证例3
验证实施例3提供的融合蛋白对不同物种来源抗体的结合能力。
采用实施例3中的构建融合蛋白的方法，设置7组试验例，蛋白A分别选取：野生型蛋白A、PA105(突变体1a)、PA1053(突变体1b-3)、PA1057(突变体1b-7)、PA633(突变体2a)、PA6332(突变体2b-2)以及PA6335(突变体2b-5)，以构建融合蛋白。
并使用酶联免疫反应(ELISA)原理检测获得的融合蛋白与多种酶标抗体(IgG)结合的能力，具体检测流程同验证例1，检测结果请参照图2。
由图2可知，由实施例1和2提供的蛋白A突变体构建的融合蛋白对不同物种来源抗体的结合能力均没有明显的偏倚，而野生型蛋白A构建的融合蛋白对不同物种来源抗体结合的能力偏倚大。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东菲鹏生物有限公司
<120> 一种蛋白A突变体、融合蛋白和应用
<160> 5
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<212> PRT
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<400> 3
Asp Asp Asp Lys Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His
20 25
<210> 4
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Thr Ser Thr Lys Lys Leu His Lys Glu Pro Ala Thr Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ala Ile Asp Gly Asp Thr Val Lys Leu Met Tyr Lys Gly Gln Pro Met
20 25 30
Thr Phe Arg Leu Leu Leu Val Asp Thr Pro Glu Thr Lys His Pro Lys
35 40 45
Lys Gly Val Glu Lys Tyr Gly Pro Glu Ala Ser Ala Phe Thr Lys Lys
50 55 60
Met Val Glu Asn Ala Lys Lys Ile Glu Val Glu Phe Asp Lys Gly Gln
65 70 75 80
Arg Thr Asp Lys Tyr Gly Arg Gly Leu Ala Tyr Ile Tyr Ala Asp Gly
85 90 95
Lys Met Val Asn Glu Ala Leu Val Arg Gln Gly Leu Ala Lys Val Ala
100 105 110
Tyr Val Tyr Lys Pro Asn Asn Thr His Glu Gln His Leu Arg Lys Ser
115 120 125
Glu Ala Gln Ala Lys Lys Glu Lys Leu Asn Ile Thr Ser Glu Asp Asn
130 135 140
Ala Asp Ser Gly Gln
145
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55

Claims (10)

1.一种蛋白A突变体，其特征在于，所述蛋白A突变体选自突变体1和突变体2中的任意一种；
其中，所述突变体1选自突变体1a和突变体1b中的任意一种；
所述突变体1a的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述突变体1b与所述突变体1具有94％以上序列同一性且能够结合免疫球蛋白Fc段；
所述突变体2选自突变体2a和突变体2b中的任意一种；
所述突变体2a的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述突变体2b与所述突变体2a具有94％以上序列同一性且能够结合免疫球蛋白Fc段。
2.根据权利要求1所述的蛋白A突变体，其特征在于，所述突变体1b包括相较于所述突变体1a具有I16V、K49Q和K7E中任一突变或突变组合的序列；
所述突变体2b包括相较于所述突变体2a具有I16V、K49Q和K7E中任一突变或突变组合的序列。
3.一种融合蛋白，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的蛋白A突变体。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括有活性蛋白，所述活性蛋白与所述融合蛋白相连；
优选地，所述活性蛋白与所述融合蛋白通过连接肽连接；
优选地，所述连接肽为刚性连接肽或柔性连接肽；
优选地，所述连接肽为柔性连接肽；
优选地，所述连接肽的长度为6～59个氨基酸；
优选地，所述连接肽的长度为20～35个氨基酸；
优选地，所述连接肽的序列如SEQ ID No.3所示；
优选地，所述活性蛋白包括内切酶、外切酶、NDA甲基化酶、微球菌核酸酶、转座酶、Dnase I和TET中的任意一种；
优选地，所述活性蛋白位于所述融合蛋白的氨基酸序列的C端，所述蛋白A突变体位于所述融合蛋白的氨基酸序列的N端。
5.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的蛋白A突变体或如权利要求3或4所述的融合蛋白。
6.一种载体，其特征在于，其包括如权利要求5所述的分离的核酸；
优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求6所述的载体。
8.一种制备如权利要求1或2所述的蛋白A突变体或如权利要求3或4所述的融合蛋白的方法，其包括培养如权利要求7所述的宿主细胞。
9.一种亲和色谱载体，其特征在于，其包括有如权利要求1或2所述的蛋白A突变体或如权利要求3或4所述的融合蛋白。
10.如权利要求1或2所述的蛋白A突变体或如权利要求3或4所述的融合蛋白在分离、纯化和/或检测免疫球蛋白中的应用；
优选地，所述分离、纯化和/或检测免疫球蛋白用于分析染色质与蛋白的相互作用；
优选地，所述分析染色质与蛋白的相互作用用于分析转录因子结合位点、甲基化的位点和/或组蛋白修饰位点。
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