CN109535263A

CN109535263A - SIRPα突变体及其融合蛋白

Info

Publication number: CN109535263A
Application number: CN201811474391.5A
Authority: CN
Inventors: 魏化伟; 黄亚杰; 陈春巧
Original assignee: Jiangsu East Against Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu East Against Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN109535263B

Abstract

本发明公开了SIRPα突变体及其融合蛋白，所述SIRPα突变体具有如SEQ ID NO.2～3所示的氨基酸序列。本发明的SIRPα突变体及其融合蛋白增强了SIRPα与CD47的亲和力以及ADCP作用。

Description

SIRPα突变体及其融合蛋白

技术领域

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种高亲和力的SIRPα突变体及其融合蛋白，以及该突变体和其融合蛋白的应用。

背景技术

CD47也被称为整合素相关蛋白(integrin associated protein，IAP)，表达于细胞表面，属于免疫球蛋白超家族成员(immunoglobulin superfamily，IgSF)，在19 世纪80年代首次被确认为人类卵巢癌的肿瘤抗原，继而CD47被发现在多种人类肿瘤类型中表达，包括急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其他实体瘤，迄今为止，人们已证实CD47在几乎所有的肿瘤细胞上高表达，并在肿瘤的生长、转移和复发中作用。

CD47可与信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα,SIRPα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1，TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，介导细胞凋亡、增殖、免疫等一系列反应。SIRPα是一种细胞表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，SIRPα胞外具有3个免疫球蛋白样结构域，最远端为1个IgV结构域，近膜端为2个IgC结构域；在胞内的尾部，具有2个免疫受体酪氨酸抑制基序 (immunoreceptor tyrosine-based inhibitorymotif，ITIM)。SIRPα特异性的表达于神经细胞表面以及髓系造血细胞表面如巨噬细胞、树突状细胞(DCs)，以单体存在。巨噬细胞表面的SIRPα与CD47相互作用结合，进而导致SIRPα的胞质内侧免疫受体酪氨酸抑制性基序ITIMs被磷酸化，并可结合含有SH2结构域的酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，两者均可抑制肌球蛋白II A在吞噬细胞突触中的集聚，进而传递抑制性信号，传递“别吃我(Don’t eat me)”的信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用，减少肿瘤坏死因子(TNF)分泌等。

免疫逃逸是肿瘤细胞的一个重要特征，其通过高表达免疫抑制信号，如 PD-L1、CD47等，从天然免疫和适应性免疫等方面诱导免疫逃逸。目前已有针对T细胞免疫抑制信号如PD1等靶点的药物上市，抑制PD1～PD-L1/L2信号通路，重新激活被抑制的免疫系统成为最近免疫治疗的热点，临床中也取得了显著的治疗效果。而CD47-SIRPα信号通路在生理状态下是一种“别吃我”信号，可维持机体自身细胞的免疫耐受，而在病理状态下CD47在多种类型的肿瘤中过度表达，肿瘤表面的CD47与巨噬细胞表面SIRPα结合，磷酸化其ITIM，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用，并抑制吞噬细胞对肿瘤抗原的提呈，从天然免疫和适应性免疫两方面同时诱导免疫逃逸。因此，将CD47作为抗肿瘤靶点，抑制CD47-SIRPα信号通路，重新激活被抑制的免疫系统成为免疫治疗的热点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有更高靶点结合活性的SIRPα变体及其融合蛋白，用于检测CD47的存在或水平，阻断SIRPα与 CD47的结合，实现肿瘤的免疫治疗。

本发明的第一方面提供了一种高亲和力的SIRPα突变体，所述SIRPα突变体包括与SEQ ID NO.1具有至少80％一致性的氨基酸序列。

进一步，所述SIRPα突变体包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第29、 31、45、51、52、61、63、64、66、68、75或77的一个或多个位点上的修饰。

进一步，所述修饰是选自下组的取代：I29L；I29F；V31L；V31I、E45S； K51R；E52S；E52D；V61L；D63N；L64S；L64T；K66R；N68S；R75S；R75Q； G77Q。

作为一种实施方式，所述修饰选自下组的取代：I29L；V31L；E45S；K51R； E52S；V61L；D63N；L64S；K66R；R75S；G77Q，序列如SEQ ID NO.2所示。

作为另外一种实施方式，所述修饰是选自下组的取代：I29F；V31I、E45S； E52D；L64T；N68S；R75Q；序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括本发明第一方面所述的SIRPα突变体。

作为一种可选择的实施方式，所述融合蛋白还包括免疫球蛋白或其片段。

进一步，所述免疫球蛋白或其片段包括IgG。

进一步，所述IgG选自亚型IgG1或IgG4；

进一步，所述免疫球蛋白或其片段选自IgG1或IgG4的Fc片段及其突变型；

进一步，IgG1的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID.6所示，IgG4的Fc片段的S228P突变体的氨基酸序列如SEQ ID.7所示。

进一步，SIRPα突变体通过连接子与免疫球蛋白或其片段相连。

进一步，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为另外一种可选择的实施方式，所述融合蛋白还包括6×His，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步，SIRPα突变体通过连接子与6×His相连。

进一步，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码本发明第一方面所述的SIRPα突变体或本发明第二方面所述的的融合蛋白的DNA序列。

本发明的第四方面提供了一种表达载体，包含本发明第三方面所述的核酸分子。

进一步，所述SIRPα突变体的N端连接有信号肽。

进一步，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第五方面提供了一种宿主细胞，包含本发明第三方面所述的核酸分子，或本发明第四方面所述的表达载体。

本发明的第六方面提供了一种试剂盒，包含本发明第一方面所述的SIRPα 突变体，本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第三方面所述的核酸分子。

本发明的第七方面提供了一种药物组合物，包含本发明第一方面所述的 SIRPα突变体或本发明第二方面所述的融合蛋白。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明的第八方面提供了如下任一项所述的应用：

1)本发明第一方面所述的SIRPα突变体、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述的试剂盒在制备检测CD47的产品中的应用；

2)本发明第一方面所述的SIRPα突变体、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的药物组合物在制备阻断SIRPα与 CD47结合的产品中的应用；

3)本发明第一方面所述的SIRPα突变体、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步，所述肿瘤选自急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。

本发明第九方面提供了一种阻断SIRPα与CD47结合的方法，包括施用有效量的本发明第一方面所述的SIRPα突变体或本发明第二方面所述的融合蛋白。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了高亲和力的SIRPα突变体及其融合蛋白，所述SIRPα突变体及其融合蛋白能有效的与CD47结合，抑制CD47-SIRPα信号通路，重新激活被抑制的免疫系统，进行肿瘤的治疗。

附图说明

图1是SIRPα及其变体融合蛋白结构示意图；

图2是SIRPα及其变体融合蛋白编码DNA结构示意图；

图3是PTT5载体图谱；

图4是SIRPα及其变体融合蛋白与CD47的ELISA结合活性图，其中图A是变体 A2G5融合蛋白与CD47的ELISA结合活性图；图B是变体A1C6融合蛋白与CD47 的ELISA结合活性图。

具体的实施方式

本发明通过将SIRPα膜外端第一个区域与人免疫球蛋白的Fc片段连接而成融合蛋白，与SIRPα的整个膜外端与人免疫球蛋白的Fc片段连接而成的融合蛋白相比，具有更高的靶点结合活性。

本发明的SIRPα突变体及其融合蛋白具有对肿瘤细胞上的肿瘤特异性抗原 CD47的高结合亲和力；通过阻断CD47“别吃我”信号和免疫效应细胞的Fc依赖性激活的组合引起有效的抗体依赖的细胞吞噬(ADCP)作用。

“SIRPα”是指野生型信号调节蛋白α、或具有野生型信号调节蛋白α的氨基酸序列的重组或非重组多肽的氨基酸序列、或天然或天然存在的信号调节蛋白α的突变体。

SIRPα的“突变体”定义为与野生型SIRPα相比具有一个或多个氨基酸修饰的SIRPα氨基酸序列。变体可以具有“保守”修饰，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。较为罕见地，变体可以具有“非保守”修饰，例如，用色氨酸替换甘氨酸。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入，或同时包括这两者。

在一个实施方案中，SIRPα变体包括与野生型SIRPα具有至少80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性的多肽。

在一些实施方案中，与野生型SIRPα相比，SIRPα变体在胞外结构域的可变结构域中包含一个或多个突变。

作为优选的实施方案中，本发明的SIRPα突变体包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第29、31、45、51、52、61、63、64、66、68、75或77的一个或多个位点上的修饰。所述修饰可以是删除、取代或插入；优选的，所述修饰是取代。

作为优选的实施方案，本发明的SIRPα突变体具有一个或多个如下的取代： I29L；I29F；V31L；V31I、E45S；K51R；E52S；E52D；V61L；D63N；L64S； L64T；K66R；N68S；R75S；R75Q；G77Q。

作为一种优选的实施方案，本发明的SIRPα突变体具有如下的取代：I29L； V31L；E45S；K51R；E52S；V61L；D63N；L64S；K66R；R75S；G77Q，序列如SEQ ID NO.2所示。

作为一种优选的实施方案，本发明的SIRPα突变体具有如下的取代：I29F； V31I、E45S；E52D；L64T；N68S；R75Q；序列如SEQ ID NO.3所示。

免疫球蛋白

“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白分子”是指如本文定义的抗体或抗体的抗原结合片段，但也包括抗体的部分，例如重链或轻链可变或恒定区。免疫球蛋白的部分例如CH1，CH2，CH3，铰链(hinge)，VH1，CL和VL结构域以及Fc片段。此外，“免疫球蛋白”包括已经改造以包括抗原结合位点(“Fcab”)的Fc片段或区域。在一些实施方案中，“免疫球蛋白”可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4， IgM，IgE，IgD或IgA，优选的免疫球蛋白是IgG1，IgG4。

连接子

本发明的融合蛋白可包括将融合蛋白的CD47结合剂部分与融合蛋白的免疫球蛋白部分或其他多肽连接的连接子。所述连接子可以是本领域常用的多肽，如(G4S)n(n＝1～4)、G4SG3、GSTSGGGSGGGSGGGGSS、 GSTSGSGKPGSSEGSTKG、VEGGSGGSGGSGGSGGVD、Gn(n＝6～8)、 (EAAAK)n(n＝1～3)、G5S等。作为一种优选的实施方案，所述连接子为G5S。

在本发明的一个实施方案中，CD47结合剂(在本发明的实施方案中可以是 SIRPα或SIRPα变体)通过连接子连接到免疫球蛋白部分。

在本发明的一个实施方案中，CD47结合剂(在本发明的实施方案中可以是SIRPα或SIRPα变体)通过连接子连接到多肽6×His。

表达载体

本发明对表达载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。

宿主细胞

本发明中的用于导入载体的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，上述细胞包含(但并不限于)细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；酵母细胞；真菌细胞如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇或夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞，SP2/0，人淋巴样母细胞，COS，NSO，293T，Bowes黑素瘤细胞， HT-1080，BHK(幼仓鼠肾细胞)，HEK(人胚肾细胞)，PERC.6(人视网膜细胞)等；和植物细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

术语“导入”是指将包括编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。此导入可以通过本领域中已知的各种方法，包括磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，脂质体融合，脂转染和原生质体融合进行。此外，转染是指用病毒颗粒通过感染将期望材料递送入细胞。此外，该载体可以通过基因轰击导入宿主细胞。在本发明中，导入与转染可以互换使用。

本发明的重组细胞接着可以用于表达以及培养目的，用于大量药物生产的抗体表达。还可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。

试剂盒

作为一种可选择的实施方式，本发明中的试剂盒包括本发明所制备的SIRPα 突变体或融合蛋白。作为另外一种可选择的实施方式，本发明的试剂盒包括诊断组合物，所述诊断组合物包括至少一种可检测的标签，诸如可检测的部分/试剂。标签可非共价地缀合至本发明的SIRPα突变体或其融合蛋白。标签还可通过共价键直接缀合至SIRPα突变体或其融合蛋白。可选择地，标签可利用一种或多种连接化合物缀合至上述SIRPα突变体或其融合蛋白。缀合标签的技术对本领域的技术人员是公知的。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自(但并不限于)由酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。

药物组合物

本发明中的药物组合物包括本发明的SIRPα变体及其融合蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

药学上可接受的载体本身不应该诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，且不应该是毒性的。适当的载体可以是大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。也可以是药学上可接受的盐，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。

药学上可接受的载体可以还包含液体，例如水、生理盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质(例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲液物质)可以出现在此组合物中。这些载体使药物组合物能被制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆料和悬浮液，用于患者摄取。

本发明的药物组合物可以制备成不同的类型。例如，组合物可以制备成可注射的溶液溶液或悬浮液。也可以制备成适于溶于液体载体中的溶液或悬浮液的注射前固体形式(例如冻干组合物，用于重配含防腐剂的无菌水)。组合物可以制备用于局部给药，例如作为软膏、乳膏或粉末。组合物可以制备用于口服给药，例如作为片剂或胶囊，作为喷雾，或作为糖浆(可选有味道的)。组合物可以制备用于经肺给药，例如作为吸入物，采用精细粉末或喷雾。组合物可以制备作为栓剂或子宫托。组合物可以制备用于经鼻、耳或眼给药，例如作为滴液。组合物可以是试剂盒的形式，设计成在向患者给药前重配混合的组合物。例如，可以提供试剂盒形式的冻干抗体，以及无菌水或无菌缓冲液。

本发明的药物组合物可以通过任意多种途径给药，其包括但不局限于：口服、静脉注射、肌肉内注射、动脉内注射、髓内注射、腹腔内注射、鞘内注射、心脑内、透皮、经皮肤、外用、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途经。无针注射器(Hypospray)也可以用于施用本发明药物组分。典型地，治疗组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以制备成适于溶于液体载体中的溶液或悬浮液的注射前固体形式。

组合物的直接输送通常是通过注射、皮下注射、腹膜内注射、静脉注射或肌肉内注射完成。治疗剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。已知的基于融合蛋白的药物提供关于给药频率的说明，例如药物是否需要每天、每周、每月等给药。频率和剂量也同样视症状的严重程度而定。

本发明的药物组合物可以药学有效量施用。“药学有效量”是指其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素，在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要，该最小量可由本领域技术人员容易地确定。

本发明中的“治疗”是指治疗哺乳动物，例如人的疾病。这包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)缓解疾病，即引起疾病状态的消退。

本发明的药物组合物可用于治疗各种形式的癌症，包括但不限于急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。

融合蛋白的生产

一般来说，本发明的融合蛋白使用含有经改造以表达所述融合蛋白的核酸的哺乳动物细胞重组产生。如果本发明的免疫球蛋白融合蛋白需要表达两条或多条多肽链以装配所述融合蛋白，则本发明考虑编码每条多肽链的核酸包含在一个或多个细胞内，以重组生产所述融合蛋白。例如，在一个实施方案中，一个核酸编码本发明的融合蛋白的重链或其部分，而另一个核酸编码本发明的融合蛋白的轻链或其部分。编码重链或其部分的核酸或编码轻链或其部分的核酸也包括编码CD47结合部分的核酸序列，例如本文所述的SIRPα部分。在另一个实施方案中，细胞含有编码本发明的融合蛋白的重链或其部分的核酸，并且含有编码本发明的融合蛋白的轻链或其部分的核酸。编码本发明的免疫球蛋白融合蛋白的重链或其部分的核酸或编码轻链或其部分的核酸也含有编码CD47结合部分的核酸，例如本文所述的SIRPα部分。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 SIRPα变体-Fc融合蛋白的表达载体构建

本发明制备的野生型SIRPα及其突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，其中野生型SIRPα即SIRPα母本的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；变体A2G5的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；变体A1C6氨基酸的序列为SEQ ID NO.3。

SIRPα及其变体通过连接子(linker)(氨基酸序列：SEQ ID NO.4)与IgG1 Fc(氨基酸序列：SEQ ID NO.6)、IgG4Fc(氨基酸序列：SEQ ID NO.7)或6 ×His(氨基酸序列：SEQ IDNO.8)等连接形成融合蛋白，其蛋白结构示意图如图1所示。

为在哺乳动物细胞中分泌表达SIRPα及其变体，在构建表达载体时需在其N 段加上分泌表达的信号肽(氨基酸序列：SEQ ID NO.5)，其编码DNA结构如图2所示。

采用pTT5作为表达载体(图3)，分别合成编码的DNA序列(SEQ ID NO.9～ SEQ IDNO.15)，通过常规PCR在5’端引入EcoRI酶切位点，在3’端引入NotI酶切位点，插入到PTT5载体的EcoRI和NotI之间，构建获得真核表达载体。本发明中的SIRPα及其变体融合蛋白的氨基酸和DNA序列如表1所示。

表1 SIRPα及其变体融合蛋白的氨基酸和DNA序列

实施例2 SIRPα变体-Fc融合蛋白的表达和纯化

通过293E细胞的瞬时转染来表达重组免疫球蛋白变体。将处于对数生长期的293E细胞以4×10⁵/ml密度接种于摇瓶中，置于37℃、5％CO₂摇床，125r/min 培养24小时后进行转染。

每100ml的293E细胞，取5mL的OPTI-MEM加入200μg的质粒，震荡混匀室温孵育5min，得到质粒溶液；另取5mL的OPTI-MEM加入600μg的PEI，震荡混匀室温孵育5min，得到PEI溶液；将质粒和PEI溶液混合，震荡混匀室温孵育20min，将反应混合物滴加入细胞中，置37℃、5％CO₂的摇床，125r/min 培养，第4、6天流加补料，第8天收获上清。以14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤收获包含抗体的细胞培养物上清液。采用AKTA(GE公司) 进行分离纯化，表达的Fc融合蛋白过Protein A亲和层析柱(MabSelect SuRe)， pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调pH值至6.0，超滤浓缩后获得SIRPα及其变体的融合蛋白；表达的6×His融合蛋白过镍柱(HisTrap HP)，通过200mM咪唑洗脱，超滤置换缓冲液并浓缩后获得的6×His融合蛋白。

实施例3 SIRPα变体-Fc融合蛋白与CD47结合活性分析

包被液稀释CD47抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃ 过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭 1h。用1×PBS稀释SIRPα及其变体的融合蛋白至5μg/mL，并以4倍梯度稀释后，以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人Fc-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。使用Graphpad分析软件拟合四参数方程曲线，方程为y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中B代表斜率， C代表EC₅₀。

SIRPα及其变体与IgG1-Fc的融合蛋白与CD47的ELISA结合活性如图4和表2所示，SIRPα变体(A2G5、A1C6)与CD47结合活性高于野生型的SIRPα；同时，与IgG1-Fc的融合蛋白相比，与IgG4-Fc和6×His形成融合蛋白与CD47 的结合活性基本一致。

表2 SIRPα及其变体与IgG1-Fc、IgG4-Fc的融合蛋白与CD47的结合活性

融合蛋白	EC<sub>50</sub>(ng/mL)
		野生型SIRPα-IgG1Fc	8.971
A2G5-IgG1Fc	6.220
		A1C6-IgG1Fc	2.440
野生型SIRPα-IgG4Fc	10.538
		A2G5-IgG4Fc	5.835
A1C6-IgG4Fc	2.750

实施例4 SIRPα变体-Fc融合蛋白与CD47亲和力检测

使用Fortebio生物膜层干涉技术测量样品与CD47抗原的结合动力学和亲合力。用Anti-Human IgG Fc Capture(AHC)芯片捕获待测样品，将待测抗体的浓度用运行缓冲液(PBS+0.1％吐温20+0.02％BSA)稀释至10μg/mL，上样时间为 90s；分析物CD47同样用运行缓冲液梯度稀释至相应的浓度(10nM、5nM、2.5nM、 1.25nM、0.625nM、0.3125nM、0.15625nM和0nM)，待测抗体与分析物结合时间300s，解离时间600s；芯片用10mM甘氨酸-HCl、pH 1.7溶液5s脉冲重复3 次进行再生。测定数据拟合成1:1结合模型，来测定平衡解离常数KD。

SIRPα变体(A2G5和A1C6)的平衡解离常数KD测定结果如表3所示， SIRPα变体与CD47的亲和力都高于野生型的SIRPα。

表3 SIRPα及其变体与IgG1-Fc、IgG4-Fc的融合蛋白与CD47的亲和力

融合蛋白	KD(M)
		野生型SIRPα-IgG1Fc	4.88×10<sup>-10</sup>
A2G5-IgG1Fc	8.75×10<sup>-11</sup>
		A1C6-IgG1Fc	4.18×10<sup>-11</sup>
野生型SIRPα-IgG4Fc	5.53×10<sup>-10</sup>
		A2G5-IgG4Fc	6.79×10<sup>-11</sup>
A1C6-IgG4Fc	4.35×10<sup>-11</sup>

实施例5 SIRPα变体-Fc融合蛋白竞争活性分析

包被液稀释CD47抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中 4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。用1×PBS稀释的SIRP-Fc-Biotin至3μg/mL，以上述溶液作为稀释液，以 3倍浓度梯度稀释SIRPα变体-Fc融合蛋白，共获得12个浓度梯度。100μL每孔加入酶联板中湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μLTMB底物显色，反应5min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数并计算IC₅₀值。

SIRPα变体(A2G5和A1C6)的IC₅₀值测定结果如表4所示，SIRPα变体的竞争活性高于野生型的SIRPα。

表4 SIRPα及其变体与IgG1-Fc的融合蛋白的竞争活性

融合蛋白	IC<sub>50</sub>(μg/mL)
		野生型SIRPα-IgG1Fc	2.81
A2G5-IgG1Fc	0.79
		A1C6-IgG1Fc	0.26

实施例6 SIRPα变体-Fc融合蛋白增强ADCP的作用

复苏冻存的PBMC细胞用无血清RPIM-1640重悬，37℃，5％CO₂贴壁2h。洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入重组人M-CSF(50ng/ml)。RPIM-1640完全培养基，置于培养箱诱导单核细胞向巨噬细胞分化。每2-3天半换液，第10天将诱导分化的巨噬细胞用无胰酶消化液消化，无血清1640洗两遍，计数调整细胞密度为4×10⁵个/ml。5mM CSFE标记Raji细胞，37℃标记15min，并加入40％血清终止反应。离心计数，将巨噬细胞和标记的Raji按照1:10比例混合，同时加入10μg/mL待测样品，37℃反应3h，加入FACS清洗一遍。加入APC-Anti-human CD14抗体，4℃标记30min。FACS洗液清洗细胞两次最终用1％多聚甲醛固定细胞，流式细胞仪上样检测。

SIRPα变体(A2G5和A1C6)的吞噬活性测定结果如表5所示，SIRPα变体的吞噬活性高于野生型的SIRPα。

表5 SIRPα及其变体与IgG1-Fc的融合蛋白的吞噬活性

融合蛋白	吞噬活性(％)
		野生型SIRPα-IgG1Fc	55.5％
A2G5-IgG1Fc	80.2％
		A1C6-IgG1Fc	87.5％

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 江苏东抗生物医药科技有限公司

<120> SIRPα突变体及其融合蛋白

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

20 25 30

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

50 55 60

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

85 90 95

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Pro Leu Gly

20 25 30

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Asn Gln Arg Ser Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Leu Ser Asn Ser

50 55 60

Thr Arg Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Gln Asn Ile Thr

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

85 90 95

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Phe Pro Ile Gly

20 25 30

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Asn Gln Lys Asp Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Thr

50 55 60

Thr Lys Arg Ser Asn Met Asp Phe Ser Ile Gln Ile Gly Asn Ile Thr

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

85 90 95

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 6

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 7

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

His His His His His His

1 5

<210> 9

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgatcccc gtgggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc gggagctgat ctacaaccag aaggagggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgacc tgaccaagcg gaacaacatg gacttcagca tccggatcgg caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 420

cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 480

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacgcc 600

agcacctacc gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 720

aaggccaagg gccagccccg ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 780

atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 900

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 960

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1020

cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 1050

<210> 10

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgctgccc ctgggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc ggagcctgat ctacaaccag cggagcggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

ctgagcaaca gcacccggcg gaacaacatg gacttcagca tcagcatcca gaacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 420

cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 480

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacgcc 600

agcacctacc gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 720

aaggccaagg gccagccccg ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 780

atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 900

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 960

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1020

cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 1050

<210> 11

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgttcccc atcggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc ggagcctgat ctacaaccag aaggacggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgaca ccaccaagcg gagcaacatg gacttcagca tccagatcgg caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 420

cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 480

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacgcc 600

agcacctacc gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 720

aaggccaagg gccagccccg ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 780

atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 900

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 960

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1020

cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 1050

<210> 12

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgatcccc gtgggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc gggagctgat ctacaaccag aaggagggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgacc tgaccaagcg gaacaacatg gacttcagca tccggatcgg caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 420

ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 480

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 540

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag 600

ttcaacagca cctaccgggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 660

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 720

atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 780

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 840

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 900

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagcc ggctgaccgt ggacaagagc 960

cggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1020

tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggcaag 1056

<210> 13

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgctgccc ctgggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc ggagcctgat ctacaaccag cggagcggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

ctgagcaaca gcacccggcg gaacaacatg gacttcagca tcagcatcca gaacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 420

ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 480

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 540

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag 600

ttcaacagca cctaccgggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 660

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 720

atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 780

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 840

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 900

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagcc ggctgaccgt ggacaagagc 960

cggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1020

tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggcaag 1056

<210> 14

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgttcccc atcggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc ggagcctgat ctacaaccag aaggacggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgaca ccaccaagcg gagcaacatg gacttcagca tccagatcgg caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 420

ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 480

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 540

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag 600

ttcaacagca cctaccgggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 660

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 720

atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 780

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 840

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 900

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagcc ggctgaccgt ggacaagagc 960

cggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1020

tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggcaag 1056

<210> 15

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgttcccc atcggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc ggagcctgat ctacaaccag aaggacggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgaca ccaccaagcg gagcaacatg gacttcagca tccagatcgg caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcc accaccacca ccaccac 387

Claims

1.一种高亲和力的SIRPα突变体，其特征在于，所述SIRPα突变体包括与SEQ ID NO.1具有至少80％一致性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述SIRPα突变体包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第29、31、45、51、52、61、63、64、66、68、75或77的一个或多个位点上的修饰。

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述修饰是选自下组的取代：I29L；I29F；V31L；V31I、E45S；K51R；E52S；E52D；V61L；D63N；L64S；L64T；K66R；N68S；R75S；R75Q；G77Q。

4.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述修饰选自下组的取代：I29L；V31L；E45S；K51R；E52S；V61L；D63N；L64S；K66R；R75S；G77Q，序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述修饰是选自下组的取代：I29F；V31I、E45S；E52D；L64T；N68S；R75Q；序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1-5任一项所述的SIRPα突变体。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括免疫球蛋白或其片段。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白或其片段包括IgG；优选的所述IgG选自亚型IgG1或IgG4。

9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白或其片段选自IgG1或IgG4的Fc片段及其突变型；优选的，IgG1的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID.6所示，IgG4的Fc片段的S228P突变体的氨基酸序列如SEQ ID.7所示。

10.根据权利要求7-9任一项所述的融合蛋白，其特征在于，SIRPα突变体通过连接子与免疫球蛋白或其片段相连；优选的，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

11.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括6×His，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其特征在于，SIRPα突变体通过连接子与6×His相连；优选的，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

13.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为编码权利要求1-5任一项所述的SIRPα突变体或权利要求6-12任一项所述的融合蛋白的DNA序列。

14.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求13所述的核酸分子。

15.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述SIRPα突变体的N端连接有信号肽；优选的，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

16.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求13所述的核酸分子，或包含权利要求14或15所述的表达载体。

17.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的SIRPα突变体，权利要求6-12任一项所述的融合蛋白或权利要求13所述的核酸分子。

18.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的SIRPα突变体，或权利要求6-12任一项所述的融合蛋白，优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

19.如下任一项所述的应用：

1)权利要求1-5任一项所述的SIRPα突变体、权利要求6-12任一项所述的融合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14或15所述的表达载体、权利要求16所述的宿主细胞或权利要求17所述的试剂盒在制备检测CD47的产品中的应用；

2)权利要求1-5任一项所述的SIRPα突变体、权利要求6-12任一项所述的融合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14或15所述的表达载体、权利要求16所述的宿主细胞或权利要求18所述的药物组合物在制备阻断SIRPα与CD47结合的产品中的应用；

3)权利要求1-5任一项所述的SIRPα突变体、权利要求6-12任一项所述的融合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14或15所述的表达载体、权利要求16所述的宿主细胞或权利要求18所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；优选的，所述肿瘤选自急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。

20.一种阻断SIRPα与CD47结合的方法，其特征在于，施用有效量的权利要求1-5任一项所述的SIRPα突变体或权利要求6-12任一项所述的融合蛋白。