CN106536553A - 生长和分化因子15(gdf‑15)的单克隆抗体及其治疗癌性恶病质和癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及单克隆抗‑人‑GDF‑15抗体。所述抗体包括嵌合抗体和人源化抗体。本发明还涉及包括鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体的单克隆抗‑人‑GDF‑15抗体，其用于治疗癌性恶病质以及用于治疗癌症的方法。本发明还提供药物组合物、试剂盒、方法和用途以及能够生产本发明的单克隆抗体的细胞系。

Description

生长和分化因子15(GDF-15)的单克隆抗体及其治疗癌性恶病 质和癌症的用途
发明领域
本发明涉及单克隆抗-人-GDF-15抗体、药物组合物、试剂盒、方法和用途以及能够生产本文所述单克隆抗体的细胞系。本发明还涉及能够抑制癌生长，治疗癌症引起的体重减轻和癌性恶病质(cancer cachexia)的针对人GDF-15的抗体。
背景技术
至今，很多癌症仍然是未满足的医疗需求的领域，并且因此，意味着需要更有效地治疗癌症，并且在更宽的癌症范围内治疗癌症。
除了癌症本身造成的痛苦，很多患者患有癌性恶病质，一种由癌症引起的医学状况，通常涉及体重减轻和骨骼肌质量的损失。癌性恶病质占所有癌症引起的死亡的大于20％(Murphy KT和Lynch GS：Update on emerging drugs for cancer cachexis.ExpertOpin Emerg Drugs.2009 Dec；14(4)：619-32.)。
因此，为了改善导致癌性恶病质的癌症的治疗和预后，需要靶向这两种医学病况的治疗方案。至今，大多数出现的用于治疗癌性恶病质的药物是靶向恶病质但不靶向癌症本身的药物(参见Murphy KT和Lynch GS：Update on emerging drugs for cancercachexis.Expert Opin Emerg Drugs.2009 Dec；14(4)：619-32.)。仅很少的药物对癌症和癌性恶病质二者都有效，并且因此，常常需要组合抗-癌药物和抗-癌性恶病质药物的复杂治疗方案。因此，仍然存在对于可以在更宽的癌症范围中用于有效治疗癌症和癌性恶病质二者的药物的需要。
已知很多类型的癌症表达生长因子，包括因子比如VEGF、PDGF、TGF-β和GDF-15。
GDF-15，生长和分化因子-15，是TGF-β超家族的不同成员。其是在细胞内表达为前体，随后加工并最终从细胞分泌到环境中的蛋白。活性的、完全加工(成熟)形式的和前体的GDF-15可以在细胞外部找到。前体通过其COOH-末端氨基酸序列共价结合于细胞外基质(Bauskin AR等人，Cancer Research 2005)并且因此存在于细胞外部。活性的、完全加工(成熟)形式的GDF-15是可溶的并在血清中发现。因此，如果潜在的靶细胞表达可溶GDF-15配体的受体，则加工形式的GDF-15可能潜在地作用于与血液循环连接的体内任何靶细胞上。
在妊娠过程中，在生理条件下在胎盘中发现GDF-15。然而，很多恶性癌症(特别是侵袭性脑癌、黑素瘤、肺癌、胃肠道肿瘤、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌(Mimeault M和Batra SK，J.Cell Physiol 2010))在肿瘤以及在血清中呈现增加的GDF-15水平。同样已经分别描述了在高GDF-15表达和化学抗性之间(Huang CY等人，Clin.Cancer Res.2009)以及在高GDF-15表达和不良预后之间(Brown DA等人，Clin.Cancer Res.2009)的关联。
GDF-15表达在通过免疫组化评定的不同WHO分级的神经胶质瘤中(Roth等人，Clin.Cancer Res.2010)。此外，Roth等人稳定表达了表达短发夹RNA的DNA构建体，所述构建体靶向SMA560神经胶质瘤细胞中的内源性GDF-15或对照构建体。当使用这些预先建立的稳定细胞系时，他们观察到，与荷有对照构建体的小鼠相比，在荷有GDF-15敲减SMA560细胞的小鼠中的肿瘤形成延迟。
专利申请PCT/EP2013/070127涉及单克隆抗-GDF-15抗体，尤其是由根据布达佩斯条约以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)的杂交瘤细胞系B1-23产生的抗体。PCT/EP2013/070127还涉及抗-GDF-15抗体的用途。
专利申请WO 2005/099746和WO 2009/021293涉及抗-人-GDF-15抗体(Mab26)，所述抗体能够在小鼠中体内对抗人GDF-15在肿瘤诱导的体重减轻方面的效应：在这些文献中，给免疫缺陷小鼠施用转染有过表达人GDF-15的质粒的人肿瘤细胞(前列腺癌细胞DU145)。携带缺少GDF-15序列的质粒的肿瘤细胞用作阴性对照。表达异种移植物GDF-15的那些小鼠呈现肿瘤-诱导的体重减轻(临床术语：恶病质)和厌食。单次腹膜内施用 1mg来自WO 2005/099746的Mab26导致肿瘤-诱导的体重减轻的完全逆转。WO 2005/099746和WO2009/021293未公开抗-人-GDF-15抗体对肿瘤生长的影响。此外，关于抗-人-GDF-15抗体是否能够导致与它们在恶病质发病前的体重相比，处理的小鼠的体重增加，这些文献没有提及。
类似地，Johnen H等人(Nature Medicine，2007)报道了抗-人-GDF-15单克隆抗体对癌症-引起的厌食和体重减轻的影响，但即使当以1mg的高剂量施用抗体时，也未观察到抗-人-GDF-15抗体对由于癌症而形成的肿瘤的尺寸的任何影响，并且因此所述抗体不抑制癌生长。
因此，至今，在本领域中仍然存在对有效治疗癌症和癌性恶病质的方法，和对在更宽的癌症范围内治疗癌症和癌性恶病质的方法的需求。
因此本发明的目的是获得可以用于有效治疗癌性恶病质，并还用于有效治疗癌症的方法，以及可以用于治疗癌性恶病质，以及此外有效治疗更宽的癌症范围内的癌症的方法。
在发现实现这些目的的尝试中，本发明人出人意料地发现，针对人GDF-15的单克隆抗体可以用于在小鼠中治疗癌性恶病质，并且也用于治疗人异种移植物肿瘤的癌症。
此外，即使在没有另外的亲和力成熟的情况下，根据本发明的针对人GDF-15的抗体对重组GDF-15也具有约790pM的平衡解离常数，与大多数治疗性抗体相比，其是更高的亲和力。
因此，与本领域已知的抗体相比，根据本发明的针对人GDF-15的抗体具有优越的性质，并且尤其用于抑制癌生长和癌性恶病质。本发明的抗体因此可用于治疗癌症和用于治疗癌性恶病质。因此，完成本发明。
发明概述
本发明通过提供单克隆抗体、药物组合物、试剂盒、用途和能够产生本文所述单克隆抗体的细胞系来解决上文提及的目的。
尤其是，本发明人出人意料地表明，根据本发明的针对人GDF-15的单克隆抗体及其抗原结合部分能够抑制癌性恶病质和/或癌生长。这是出人意料的，因为本领域之前已知的那些针对GDF-15的单克隆抗体(WO 2005/099746，WO 2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007) 仅已知引起癌症-引起的体重减轻的逆转(即由癌症表达的GDF-15引起的继发性症状的逆转)，但显示未能抑制癌生长。
通过显示根据本发明的针对人GDF-15的单克隆抗体可以用于治疗癌症引起的体重减轻(weight loss)和/或癌性恶病质以及治疗癌症，本发明人还出人意料地表明，人GDF-15蛋白可以被本发明的抗体以癌生长被抑制并且癌症诱导的体重减轻和癌性恶病质得到治疗的方式靶向。预期癌生长抑制以及癌症引起的体重减轻和癌性恶病质的治疗的相同机制可应用于过表达人GDF-15的大量的癌症，包括下文列出的癌症。
根据本发明的单克隆抗体及其抗原结合部分源自鼠抗-GDF-15抗体，mAb-B1-23，其在PCT/EP2013/070127中描述，并且根据布达佩斯条约以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)。根据本发明的抗-人GDF-15 mAb-B1-23抗体可以通过用人IgG1抗体的恒定结构域替代鼠抗体mAb-B1-23的恒定结构域产生。
出人意料地，观察到，根据本发明的嵌合的和人源化的B1-23抗体不表现聚集的倾向性。预期根据本发明这些抗体性质增加这些抗体的生物利用度，并且对于这些抗体的临床制剂有利。
因此，本发明涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列。
本发明还涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区，其在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。所述方法包括向所述哺乳动物施用抗体或其抗原结合部分。此外，本发明涉及用于治疗的相应方法。
此外，本发明还涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象的或不连续的表位，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ IDNo：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列。
此外，本发明还涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的在人GDF-15上的构象的或不连续的表位，所述单克隆抗体或其抗原结合部分在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。所述方法包括向所述哺乳动物施用抗体或其抗原结合部分。此外，本发明涉及用于治疗的相应方法。
本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
本发明还涉及根据本发明的抗体或其抗原结合部分，其用于医疗。
此外，本发明涉及根据本发明的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于治疗哺乳动物中癌症的方法。所述方法包括向所述哺乳动物施用所述抗体或其抗原结合部分或所述药物组合物。
此外，本发明涉及根据本发明的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。所述方法包括向所述哺乳动物施用所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
此外，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒含有根据本发明的药物组合物。
本发明还涉及表达载体，所述表达载体包含编码根据本发明的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。
此外，本发明涉及细胞系，所述细胞系能够产生根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
因此，通过提供针对人GDF-15的单克隆抗体，本发明提供用于治疗癌性恶病质的方法和癌生长抑制剂，所述抑制剂满足本领域中的上述需求。
附图简述
图1：用或不用GDF-15处理之后，NK细胞上的NKG2D表达。在抗-GDF-15抗体mAb B1-23存在或缺失下用指定细胞因子处理后，确定在NK细胞上NKG2D的细胞表面表达。该图显示通过流式细胞术确定的特异荧光强度，相对于非特异对照抗体来定量。
图2：卵巢癌细胞系SK-OV-3中的Akt磷酸化。为了定量对于卵巢癌细胞系SK-OV-3的蛋白质印迹，计算磷酸化的Akt与Akt总量的比率并相对于未处理对照标准化。
图3：免疫细胞中的JNK1/2磷酸化。为了定量蛋白质印迹，计算磷酸化的JNK1/2与JNK总量的比率，并相对于未处理对照标准化。
图4：鼠B1-23在体内的抗-肿瘤效果。Balb/cnu/nu裸鼠用于使用黑素瘤细胞系UACC-257的异种移植物设置中。与PBS对照组(填充的实心圆)相比，用B1-23处理的动物群体(空心正方形)的肿瘤尺寸显著减小。显著性定义为通过Wilcoxon′s对数秩检验评价，p＜0.05。
图5：用抗-GDF-15抗体治疗癌性恶病质。该图显示所有处理的Balb/cnu/nu裸鼠(其接种有UACC-257细胞)的平均体重的比较。以与第0天的起始体重相比的百分数描述体重的变化，达38天的时期。
图6：用于研究编号140123的抗体的考马斯染色。
图7：嵌合的和人源化的抗体在生理pH下改善的溶解度。
发明详述
定义
除非下文另有定义，本发明中使用的术语应该根据本领域技术人员已知的其通常意义来理解。
本文使用的术语“抗体”是指能够特异结合研究的抗原的任何功能抗体，如Paul，W.E.(编辑).：Fundamental Immunology第2版.Raven Press，Ltd.，New York 1989的第7章一般性概述的，其通过引用并入本文。无特别限制，术语“抗体”包括来自任何适当的来源物种的抗体，所述物种包括鸡和哺乳动物，比如小鼠、山羊、非人灵长类和人。优选地，所述抗体是人源化抗体。所述抗体优选为单克隆抗体，其可以通过本领域公知的方法制备。术语“抗体”包括IgG-1，-2，-3，或-4，IgE，IgA，IgM，或IgD同种型抗体。术语“抗体”包括单体抗体(比如IgD，IgE，IgG)或低聚抗体(比如IgA或IgM)。术语“抗体”还包括-无特别限制-分离的抗体和改造的抗体比如遗传改造的抗体，例如嵌合抗体。
抗体结构域的命名按照本领域已知的术语。如本领域通常已知的，抗体的每个单体包含两条重链和两条轻链。这些中，各个重链和轻链包含可变结构域(对于重链称为VH并且对于轻链称为VL)，其对于抗原结合是重要的。这些重链和轻链可变结构域包含(以N-末端到C-末端的顺序)区域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4(FR，框架区；CDR，互补决定区，也称为高变区)。抗体序列内的上述抗体区域的鉴定和分配通常根据Kabat等人(Sequences of proteins of immunological interest，美国卫生和人类服务部，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.1983)，或Chothia等人(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.Nature.1989 Dec 21-28；342(6252)：877-83.)，或可以通过使用Giudicelli等人(IMGT/V-QUEST，an integratedsoftware program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-Jrearrangement analysis.Nucleic Acids Res.2004 Jul 1；32(Web Server issue)：W435-40.)中描述的软件IMGT/V-QUEST软件进行，其通过引用并入本文。优选地，通过使用IMGT/V-QUEST软件鉴定和分配上文指出的抗体区域。
“单克隆抗体”是来自抗体的基本同源群体的抗体，其中所述抗体在序列上基本相同(例如相同，除了含有天然存在的序列修饰比如在其N-和C-末端的氨基酸修饰的小部分抗体)。不同于多克隆抗体(其含有针对许多表位的不同抗体的混合物)，单克隆抗体针对相同表位并且因此高度特异。术语“单克隆抗体”包括(但不限于)从源自单个细胞克隆的单克隆细胞群体获得的抗体，如例如通过和Milstein(Nature，1975 Aug 7；256(5517)：495-7)或Harlow和Lane(“Antibodies：A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York 1988)中描述的杂交瘤方法产生的抗体。单克隆抗体还可以从其它合适的方法获得，包括噬菌体展示技术比如在Clackson等人(Nature.1991 Aug 15；352(6336)：624-8)或Marks等人(J Mol Biol.1991 Dec 5；222(3)：581-97)中描述的那些。单克隆抗体可以是已经通过本领域已知方法优化了抗原结合性质比如减小的Kd值、优化的缔合和解离动力学的抗体。例如，Kd值可以通过展示方法包括噬菌体展示来优化，产生亲和力成熟的单克隆抗体。术语“单克隆抗体”不限于来自特别物种来源或来自一个单一物种来源的抗体序列。因此，术语“单克隆抗体”的意思包括嵌合单克隆抗体比如人源化单克隆抗体。
“人源化抗体”是含有人序列和小部分非-人序列的抗体，所述非-人序列赋予对研究的抗原(例如人GDF-15)的结合特异性。典型地，人源化抗体通过由来自结合研究的抗原(例如人GDF-15)的非-人供体抗体(例如小鼠、兔、大鼠供体抗体)的高变区序列替代来自人受体抗体的高变区序列而产生。在一些情况中，受体抗体的框架区序列还可以由供体抗体的相应序列替代。除了源自供体和受体抗体的序列之外，“人源化抗体”也可以含有或不含有其它(另外或替代)残基或序列。这种其它残基或序列可以用于进一步改善抗体性质比如结合性质(例如降低Kd值)和/或免疫原性(例如降低人中抗原性)。产生人源化抗体的方法的非限制性实例是本领域中已知的，例如来自Riechmann等人(Nature.1988 Mar 24；332(6162)：323-7)或Jones等人(Nature.1986 May 29-Jun 4；321(6069)：522-5)。
术语“人抗体”涉及含有人可变和恒定结构域序列的抗体。该定义包括具有携带可能用于进一步改善抗体性质比如结合性质(例如降低Kd值)和/或免疫原性(例如降低人中抗原性)的单个氨基酸取代或修饰的人序列的抗体。术语“人抗体”不包括人源化抗体，所述人源化抗体中，部分非-人序列赋予对于研究的抗原的结合特异性。
本文使用的抗体的“抗原结合部分”是指保留抗体特异结合抗原(例如GDF-15)能力的抗体部分，即“抗原结合部分”能够与抗体竞争特异结合抗原。“抗原结合部分”可以含有抗体的一个或多个片段。无特别限制，其可以通过任何本领域已知的合适方法产生，包括重组DNA方法和通过化学或酶片段化抗体制备。抗原结合部分可以是Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、单链抗体(scFV)、单结构域抗体、双抗体(diabodies)或允许保持结合抗原的任何其它抗体部分。
“抗体”(例如单克隆抗体)或“抗原结合部分”可以衍生或连接于不同分子。例如，可以连接于抗体的分子是其它蛋白(例如其它抗体)、分子标记(例如荧光、发光、有色或放射性分子)、药剂和/或毒剂。抗体或抗原结合部分可以直接连接(例如以两种蛋白中间融合的方式)，或通过接头分子连接(例如本领域中已知的任何适当类型的化学接头)。
如本文使用的，术语“结合(binding)”或“结合(bind)”是指特异结合研究的抗原(例如人GDF-15)。优选地，Kd值小于100nM，更优选小于50nM，还更优选小于10nM，还更优选小于5nM并且最优选小于2nM。
本文使用的术语“表位”是指形成抗体的结合位点的小的抗原部分。
在本发明的情况下，通过使用表面等离子共振测量作为参考标准测定，来测量抗体或其抗原结合部分对研究的抗原(例如人GDF-15)的结合或竞争结合，如下文所述。
术语“KD”或“KD值”涉及本领域中已知的平衡解离常数。在本发明的情况下，这些术语涉及抗体关于研究的特定抗原(例如人GDF-15)的平衡解离常数。所述平衡解离常数是复合体(例如抗原-抗体复合体)可逆解离为其组分(例如抗原和抗体)的倾向的测量值。对于根据本发明的抗体，KD值(比如对于抗原人GDF-15的那些)通常通过使用下文描述的表面等离子共振测量确定。
本文使用的术语“癌生长”是指任何可测量的癌生长。对于形成实体瘤的癌，“癌生长”是指肿瘤体积随时间的可测量的增加。如果癌症仅形成单个肿瘤，则“癌生长”是仅指单个肿瘤的体积的增加。如果癌症形成多个肿瘤比如转移，则“癌生长”是指所有可测量肿瘤体积的增加。对于实体瘤，肿瘤体积可以通过本领域中已知的任意方法测量，包括磁共振成像和计算机断层扫描(CT扫描)。
对于特征为在血液中存在血液系统的癌细胞的白血病，“癌生长”是指每血液体积癌细胞数量的可测量的增加。为了进行这种测量，可以通过使用本领域中已知的任意方法从血液样品鉴定癌细胞，所述方法包括细胞形态学测量，或对肿瘤细胞标志物蛋白比如肿瘤标志物细胞表面蛋白染色，例如通过用特异抗体染色，并且可以计数癌细胞。
本文使用的术语比如“抑制癌生长”是指用抗体治疗的患者中可测量的癌生长抑制。优选地，所述抑制是统计学显著的。癌生长的抑制可以通过将根据本发明治疗的患者组的癌生长与未治疗患者的对照组相比较来评价，或通过将接受本领域的标准癌症治疗加上根据本发明的治疗的患者组与仅接受本领域标准癌症治疗的患者对照组相比较来评价。根据接受的临床研究标准，例如双盲、以足够的统计学强度随机研究，设计这种评价癌生长抑制的研究。术语“抑制癌生长”包括癌生长被部分抑制的癌生长抑制(即与对照组的患者相比，患者中的癌生长延迟)，癌生长被完全抑制的抑制(即患者中的癌生长终止)，和癌生长被反转的抑制(即癌缩小)。
本文使用的“分离的抗体”是从其来源环境的主要组分(以重量计)，例如从杂交瘤培养物或用于其生产的不同细胞培养物(例如重组表达抗体的生产细胞比如CHO细胞)的组分鉴定和分离的抗体。这样进行分离：其充分去除否则可以干扰抗体用于所需应用的适合性(例如根据本发明的抗-人GDF-15抗体的治疗性用途)的组分。制备分离的抗体的方法是本领域已知的并且包括蛋白A层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、病毒保留性过滤和超滤。优选地，如通过使用Lowry蛋白测定测量的，分离的抗体制备物至少70％纯度(w/w)，更优选至少80％纯度(w/w)，还更优选至少90％纯度(w/w)，还更优选至少95％纯度(w/w)，并且最优选至少99％纯度(w/w)。
本文使用的“双抗体”是小的双价抗原-结合抗体部分，其包含在相同多肽链上通过肽接头(其太短从而不允许相同链上的两个结构域配对)连接轻链可变结构域的重链可变结构域。这导致与其它链的互补结构域配对并且导致二聚分子与两个抗原结合位点的组装。双抗体可以是双价并且单特异性的(比如具有两个对人GDF-15的抗原结合位点的双抗体)，或可以是双价并且双特异的(例如具有两个抗原结合位点的双抗体(一个是对人GDF-15的结合位点，并且另一个是对不同抗原的结合位点))。双抗体的详细描述可以在Holliger P等人(“″Diabodies″：small bivalent and bispecific antibodyfragments.”Proc Natl Acad Sci U S A.1993 Jul 15；90(14)：6444-8.)中找到。
本文使用的“单结构域抗体”(也被称为“纳米抗体(Nanobody)TM”)是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的结构和产生单结构域抗体的方法是本领域已知的，例如来自Holt LJ等人(“Domain antibodies：proteins for therapy.”TrendsBiotechnol.2003 Nov；21(11)：484-90.)，Saerens D等人(“Single-domain antibodiesas building blocks for novel therapeutics.”Curr Opin Pharmacol.2008 Oct；8(5)：600-8.Epub 2008 Aug 22.)，和Arbabi Ghahroudi M等人(“Selection andidentification of single domain antibody fragments from camel heavy-chainantibodies.”FEBS Lett.1997 Sep 15；414(3)：521-6.)。
本文使用的术语“更高”意为患者样品中的值(例如GDF-15水平)高于相应对照样品中或对照样品组中的值。优选地，差异是统计学显著的。
本文使用的术语“升高的GDF-15水平”意为当与作为参考的健康人对照个体的血清中的中值GDF-15水平相比时，在施用根据本发明的抗体或其抗原结合部分或药物组合物之前，人患者血清中具有更高的GDF-15水平。
健康人对照个体的血清中GDF-15水平的优选的中值参考值为＜0.8ng/ml。在健康人对照中预期的范围在0.2ng/ml和1.2ng/ml之间(参考文献：Tanno T等人：“Growthdifferentiation factor 15 in erythroid health and disease.”Curr OpinHematol.2010 May；17(3)：184-190.)。
优选地，所述水平是1.2-倍高，更优选1.5-倍高，还更优选2-倍高并且最优选5-倍高。
本文使用的术语“施用之前”意为施用根据本发明的抗体、其片段或药物组合物之前的时期。优选地，术语“施用之前”意为施用之前30天的时期；最优选施用之前一周的时期。
本文使用的术语“显著的”，“显著地”，等是值之间的统计学显著差异。
术语“癌症”和“癌细胞”在本文根据其在本领域中常见意义使用(参见例如Weinberg R.等人：The Biology of Cancer.Garland Science：New York 2006.850p.)。
术语“癌症引起的体重减轻”在本文中根据其在本领域中的通常意义使用。癌症引起的体重减轻常看作是患有癌症的个体中的副作用(参见，例如Fearon K.等人：Definition and classification of cancer cachexia：an internationalconsensus.Lancet Oncol.2011 May；12(5)：489-95.；Tisdale MJ.：Mechanisms ofcancer cachexia.Physiol Rev.2009 Apr；89(2)：381-410.)。术语“癌症引起的体重减轻”涉及癌症引起的体重减轻。除了癌症引起的体重减轻之外的其他体重减轻-例如癌症治疗如手术、化疗和放疗引起的体重减轻-也可能在患有癌症的个体中发生。要理解的是，术语“癌症引起的体重减轻”的意义不包括该其他体重减轻。然而，这不排除本发明的抗体-除了它们对癌症引起的体重减轻和对癌生长的影响之外-可以例如通过逆转或部分逆转这样的其他体重减轻，或通过预防或部分预防这样的其他体重减轻，对这样的其他体重减轻具有有益效果的可能性。
体重可以容易地通过称重测量，并且体重通常以质量单位如kg表达。
术语“癌性恶病质”在本文中根据其在本领域中的通常意义使用。(参见，例如Fearon K.等人：Definition and classification of cancer cachexia：aninternational consensus.Lancet Oncol.2011 May；12(5)：489-95.；Tisdale MJ.：Mechanisms of cancer cachexia.Physiol Rev.2009 Apr；89(2)：381-410.)。癌性恶病质的最常见的症状是癌症引起的体重减轻。因此，根据一个定义，癌性恶病质特征为骨骼肌质量的持续损失(损失或不损失脂肪质量)，其不能由常规营养完全逆转。在人患者中，癌性恶病质可以定义为在过去6个月期间大于5％的体重减轻，或定义为小于20g/m2的体重指数和大于2％的任何程度的持续体重减轻，或肌肉减少症(即肌肉质量的退化性减少)和大于2％的持续体重减轻(参见，Fearon K.等人：Definition and classification of cancercachexia：an international consensus.Lancet Oncol.2011年5月；12(5)：489-95.)。癌性恶病质的进一步症状可以是脂肪组织的消耗。
就癌性恶病质而言，根据本发明的“治疗”可以是用于预防的治疗和/或用于抑制或逆转癌性恶病质的治疗。通常，用于预防癌性恶病质的治疗是在其中癌性恶病质尚未发生的癌症疾病阶段预防性给予的治疗。用于抑制癌性恶病质的治疗通常是在一些癌性恶病质已经发生的癌症疾病阶段给予，以抑制癌性恶病质的进一步进展的治疗。用于逆转癌性恶病质的治疗通常是在一些癌性恶病质已经发生的癌症阶段开始的治疗，其逆转癌性恶病质。治疗的效果可以是部分效果，即部分预防、部分抑制或部分逆转癌性恶病质，或完全效果，即完全预防、完全抑制或完全逆转癌性恶病质。优选地，根据本发明，治疗效果是完全预防、完全抑制或完全逆转癌性恶病质。更优选地，根据本发明的治疗效果是完全预防或完全逆转癌性恶病质。
如本文中使用的，与根据本发明的癌性恶病质的治疗相关的术语“完全的(地)”意为，在用于预防的治疗的情况下，在治疗期间和/或治疗后，在治疗的个体中不发生癌性恶病质。在用于抑制癌性恶病质的治疗的情况下，术语“完全的(地)”意为，在治疗期间和/或治疗后，在治疗的个体中不发生癌性恶病质的进一步发展。在用于逆转癌性恶病质的治疗的情况下，术语“完全的(地)”意为，在治疗期间和/或治疗后，癌性恶病质被完全逆转，从而在治疗的个体中不存在癌性恶病质。
关于根据本发明的治疗的这些效果，术语“无癌性恶病质”意为，通过使用在本领域中已知用于测量和用于诊断的标准方法，检测不到癌性恶病质。同样，术语“没有癌性恶病质的进一步发展”意为，通过使用在本领域中已知用于测量和用于诊断的标准方法，检测不到癌性恶病质的进一步发展。本领域中已知的和本文中引用的方法例如在Fearon KC.：Cancer cachexia：developing multimodal therapy for a multidimensionalproblem.Eur J Cancer.2008 May；44(8)：1124-32；Fearon K.等人：Definition andclassification of cancer cachexia：an international consensus.LancetOncol.2011年5月；12(5)：489-95.；或Tisdale MJ.：Mechanisms of cancercachexia.Physiol Rev.2009 Apr；89(2)：381-410中描述。
除了完全预防或完全逆转癌性恶病质之外，用于根据本发明的这些方法的治疗方法和产品可以增加治疗的哺乳动物的体重(与其在癌性恶病质发病前的体重相比)。如本文中使用的，术语“在癌性恶病质发病前”意为癌症疾病过程期间的时间点，在该时间点之后，癌性恶病质变得可由本领域中已知的方法，如上文提及的方法测量。
优选地，当针对合适的对照组时，根据本发明的癌性恶病质治疗的上文定义的效果是统计学显著的，而治疗的个体患者将不显示显著的恶病质。
根据本发明，术语“包含”的每次出现可以任选地被术语“由...组成”替代。
方法和技术
除非在本文中另有定义，通常，本发明中使用的方法(例如克隆方法或与抗体相关的方法)根据本领域中已知的步骤，例如在Sambrook等人(“Molecular Cloning：ALaboratory Manual.”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York 1989)，Ausubel等人(“Current Protocols in Molecular Biology.”Greene Publishing Associates and Wiley Interscience；New York 1992)，以及Harlow和Lane(“Antibodies：A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York 1988)中描述的步骤进行，其全部通过参考并入本文。
分子量通过本领域中已知的方法诸如质谱法测量。其以道尔顿(Da)或千道尔顿(kDa)表达。
根据本发明的单克隆抗-人-GDF-15抗体的结合通常通过使用ProteOnXPR36TM系统和GLC传感器芯片，应用表面等离子共振测量评价，如在实施例1中关于鼠抗-人GDF-15 mAb-B1-23所述。
根据本发明序列的序列比对通过使用BLAST算法进行(参见Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool.”Journal of Molecular Biology 215.p.403-410.；Altschul等人：(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation ofprotein database search programs.Nucleic Acids Res.25：3389-3402.)。优选地，使用以下参数：最大靶序列10；字长3；BLOSUM 62矩阵；缺口成本(gap costs)：存在性11，延伸1；有条件的组合评分矩阵调整。因此，当与序列连同使用时，术语比如“同一性”或“相同的”是指通过使用BLAST算法获得的同一性值。
根据本发明的单克隆抗体可以通过本领域已知的任意方法生产，包括但不限于Siegel DL(“Recombinant monoclonal antibody technology.”Transfus ClinBiol.2002 Jan；9(1)：15-22.)中涉及的方法。在优选的实施方案中，根据本发明的抗体是由根据布达佩斯条约以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)的杂交瘤细胞系B1-23产生。保藏在2011年9月29日提交。
细胞增殖可以通过本领域已知的适当方法测量，包括(但不限于)目视显微镜、代谢测定比如测量线粒体氧化还原电位的那些(例如MTT(3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑鎓溴化物)测定；刃天青染色，也被称为Alamar测定)，对已知的内源性增殖生物标志物(例如Ki-67)染色、和测量细胞DNA合成的方法(例如BrdU和[3H]-胸苷掺入实验)。
免疫抑制可以通过本领域中已知的适当方法测量，包括(但不限于)免疫细胞增殖、细胞因子分泌、通过流式细胞术的细胞内细胞因子染色、通过qRT-PCR的细胞因子测量、重定向的靶细胞裂解、进一步的细胞毒性或脱颗粒测定、激活的免疫细胞受体(如NKG2D)的下调、抑制剂性免疫细胞受体的上调、免疫突触的形成、免疫细胞浸润。对于要应用的术语免疫抑制，效果应该可以以这些中的至少一个或以任何其他的适当测定测量。在具体测试中缺乏效果不意味着免疫抑制的总体缺乏。
人GDF-15水平可以通过本领域中已知的任何方法测量，包括通过以下方法测量GDF-15 mRNA水平：所述方法包括(但不限于)使用特异于人GDF-15的引物定量实时PCR(qRT-PCR)人GDF-15 mRNA，使用特异于人GDF-15的探针的mRNA原位杂交，mRNA深度测序方法；并且包括通过以下方法测量GDF-15蛋白水平：所述方法包括(但不限于)源自人GDF-15的蛋白或肽的质谱，使用特异于人GDF-15的抗体的蛋白质印迹，使用特异于人GDF-15的抗体的流式细胞术，使用特异于人GDF-15的抗体的试纸检验，或特异于人GDF-15的抗体的免疫细胞化学。对于这种使用特异于人GDF-15的抗体的方法，优选本发明的抗-人GDF-15抗体，并且由以保藏号DSM ACC3142于德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)保藏的杂交瘤细胞系B1-23产生的本发明的抗体是最优选的。
本发明的实施方案
如上文所述，本发明人表明，根据本发明的抗体可以以能够治疗癌性恶病质和癌症引起的体重减轻并且此外抑制癌生长的方式靶向人GDF-15蛋白。
当考虑到本发明时，变得明显的是，已知来自WO 2005/099746，WO 2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007的抗-GDF-15抗体仅抑制人GDF-15的效应之一(即癌症-诱导的体重减轻)，但未能抑制人GDF-15的其它效应比如与癌生长相关的那些。基于本发明，对于该失败的一个可能的解释是，已知来自以上文献的抗体仅可以干涉人GDF-15跨血脑屏障的转运(通过形成不能跨越血脑屏障转运的大的复合体)，但不能够以使其通常不能与其受体(例如位于脑外部的细胞上的受体)相互作用的方式结合人GDF-15。此外，不同于本发明的抗体，从WO 2005/099746，WO 2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007已知的抗-GDF-15抗体不导致哺乳动物的可检测的体重增加(与其在在癌性恶病质发病前的体重相比)。
因此，基于现有技术，根据本发明使用的抗体的效果是预料不到的。
预期本发明抗体的以下性质增进其更完全地抑制人GDF-15的效应的能力，包括治疗恶病质和抑制癌生长：
对人GDF-15形式的广泛的结合特异性
本发明的抗体能够结合成熟的重组人GDF-15(由SEQ ID No：8表示)并且因此能够结合活性的、完全加工的(成熟)人GDF-15。
此外，通过用根据本发明的鼠mAb-B1-23抗体在人细胞上进行染色实验，本发明人表明，根据本发明的mAb-B1-23抗体能够结合人细胞上的人GDF-15前体。
因此，预期的是，根据本发明抗体的结合和效果(特别是抑制癌生长)一般不限于对特定形式的人GDF-15的效应。
关于人GDF-15对癌性恶病质的效应，这些效应可能由人GDF-15的一个亚类(subset)形式，例如可溶形式的人GDF-15(其能够通过血脑屏障)引起。如本发明的实施例中举例说明的，根据本发明的所有测试的抗-GDF-15抗体可以用于治疗癌症引起的恶病质。因此，根据本发明的抗体可以干扰造成癌性恶病质的人GDF-15的形式。
高结合亲和力
如由根据本发明的mAb-B1-23抗体显示的，根据本发明的抗体及其抗原结合部分具有高结合亲和力，其对重组人GDF-15具有约790pM的平衡解离常数。尤其是，这种亲和力值好于大多数已有的治疗性抗体，例如好于具有约8nM的平衡解离常数的治疗性抗体利妥昔单抗(Rituximab)。
高结合亲和力将保证根据本发明的针对人GDF-15的抗体稳定结合人GDF-15，从而人GDF-15的效应(包括对癌生长的影响)被有效抑制。同样，预期根据本发明的抗体的稳定结合确保引起癌性恶病质的人GDF-15的形式不能实施其病理功能。这可能例如由于这些形式的人GDF-15从它们在脑中的可能作用位点的抗体依赖性的隔离(sequestration)导致。这种结合和隔离可以例如在癌症的位点发生，或根据本发明的抗体可以干预人-GDF-15的跨血脑屏障转运。
结合不连续的或构象的表位
如下文对于根据本发明的鼠mAb-B1-23抗体所显示的，根据本发明的抗体及其抗原结合部分结合不连续或构象表位。
根据本发明的抗体及其抗原结合部分对GDF-15的不连续或构象表位的结合可以帮助保持人GDF-15在特定构象。该构象特异性可能对于将GDF-15保持为不能从肿瘤释放，或不能跨血脑屏障和在脑中的可能作用位点引起癌性恶病质的形式有利。此外，这样结合GDF-15的不连续的或构象的表位可以例如通过将GDF-15保持在不能与其受体功能性相互作用的构象，来促进对人GDF-15效应(包括对癌生长的效应)的有效抑制。
因此，本发明涉及以下实施方案：
A)抗体、载体和细胞系
具体地，本发明涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案中，最优选地，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列。
在备选地实施方案中，本发明涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与SEQ ID NO：5的氨基酸序列相差不多于一个氨基酸的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7的氨基酸序列相差不多于一个氨基酸的氨基酸序列的CDR3区，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ IDNo：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含与SEQ ID No：29的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No： 29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。
在该实施方案的另一优选的方面，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，并且最优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含与SEQ ID No：32的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
在该实施方案中，最优选地，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列。
此外，提供能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。优选地，该单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定结构域包含SEQ IDNo：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且该单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列。更优选地，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列。还更优选地，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列。
此外，提供能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与SEQ ID NO：5的氨基酸序列相差不多于1个氨基酸的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7的氨基酸序列相差不多于1个氨基酸的氨基酸序列的CDR3区。优选地，该单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且该单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列。更优选地，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列。还更优选地，重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列，并且轻链恒定结构域包含SEQ IDNo：32的氨基酸序列。
在根据以上实施方案的第二个实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，或轻链可变结构域包含含有SEQID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。
在根据以上实施方案的第三个实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，并且轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。
在根据上述实施方案的的第四个实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区。
在根据上述实施方案的第五个实施方案中，抗体是人源化抗体。优选地，人源化抗体的所有可变结构域是人源化可变结构域。
在根据上述实施方案的进一步实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含SEQ ID No：28的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列。在该实施方案的最优选的方面，重链可变结构域包含SEQ ID No：28的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列。
在根据上述实施方案的进一步优选的实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分的重链包含SEQ ID No：27的氨基酸序列，并且单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链包含SEQ ID No：30的氨基酸序列。
在根据上述实施方案的另一优选的实施方案，单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列或与其至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列或与其至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％相同的氨基酸序列。在根据上述实施方案的该实施方案的最优选的方面，重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQID No：37的氨基酸序列。
在根据上述第一至第三个实施方案的另外的实施方案，重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的区域。
在根据上述第一至第三个实施方案的优选的实施方案中，重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其95％相同的序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其95％相同的序列的区域。
在根据上述第一至第三个实施方案的更优选的实施方案中，重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其98％相同的序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其98％相同的序列的区域。
在根据上述第一至第三个实施方案的还更优选的实施方案中，重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的区域。
此外，提供能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQID NO：7的氨基酸序列的CDR2区。在本实施方案的优选的方面，抗体可以具有上文所述本发明的任意实施方案中限定的CDR3序列。
在另一个实施方案中，提供能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分能够抑制哺乳动物，优选人患者中的癌生长。
在根据上述实施方案的另一个实施方案中，本发明涉及能够结合人GDF-15的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分是单结构域抗体(也称为“纳米抗体TM”)。在该实施方案的一个方面，所述单结构域抗体分别包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2、和CDR3氨基酸序列。在该实施方案的另一个方面，所述单结构域抗体分别包含SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2、和CDR3氨基酸序列。在该实施方案的优选的方面，单结构域抗体是人源化抗体。
优选地，能够结合人GDF-15的本发明的抗体或其抗原结合部分具有等于或小于100nM，小于20nM，优选小于10nM，更优选小于5nM并且最优选在0.1nM和2nM之间的对人GDF-15的平衡解离常数。
在本发明的另一个实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分结合与从以保藏号DSM ACC3142保藏在德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23可获得的针对人GDF-15的抗体相同的人GDF-15表位。如本文所述，根据实施例1中所述步骤，通过作为参考标准方法的表面等离子共振测量评价根据本发明的结合人GDF-15的抗体。通过可从细胞系B1-23获得的针对人GDF-15的抗体和预期结合与可从细胞系B1-23获得的针对人GDF-15的抗体相同的人GDF-15表位的抗体的表面等离子共振竞争性结合实验，可以类似地评价对人GDF-15上相同表位的结合。
在非常优选的实施方案中，所述抗体是可获自以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23的能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分。
在优选的实施方案中，根据本发明的能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是人源化单克隆抗体或其抗原结合部分。对于根据本发明的任何给定的非人抗体序列(即供体抗体序列)，本发明的人源化单克隆抗-人-GDF-15抗体或其抗原结合部分可以根据本领域中已知的技术产生，如上文所述。
在非常优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分是源自可从以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23获得的能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分的人源化抗体。在该实施方案的非限制性方面，人源化抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，并且人源化抗体或其抗原结合部分的轻链可变结构域包含含有SEQID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。在该实施方案的进一步的非限制性方面，所述人源化抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含或还包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且所述人源化抗体或其抗原结合部分的轻链可变结构域包含或还包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2区。
此外，提供能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象或不连续表位。在该实施方案的优选的方面，所述抗体或其抗原结合部分是上述实施方案任一个中限定的抗体或其抗原结合部分。
根据以上实施方案的本发明的另一个实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是双抗体。在该实施方案的一个方面，所述双抗体是双价和单特异的，具有两个相同的对人GDF-15的抗原结合位点。在该实施方案的第二个、备选的方面，所述双抗体是二价和双特异的，其中一个抗原结合位点是针对人GDF-15的结合位点，并且另一个抗原结合位点是针对不同抗原的结合位点。根据该实施方案的该第二个方面的不同抗原的非限制性实例是i)在相同癌症上以高水平(例如以与相同患者的获自癌症来源组织的组织非癌部分的对照样品相比更高的水平)与GDF-15共表达的细胞表面抗原，并且ii)已知用于将免疫系统细胞募集至肿瘤的有用抗原的免疫系统细胞上的细胞表面抗原。
在根据以上实施方案的本发明的另一个实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分连接于药物。在该实施方案的非限制性方面，所述药物可以是已知的抗癌剂和/或免疫刺激分子。已知的抗癌药剂包括烷化剂比如顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)，氮芥(mechlorethamine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，和异环磷酰胺(ifosfamide)；抗-代谢物比如硫唑嘌呤(azathioprine)和巯基嘌呤(mercaptopurine)；生物碱比如长春花生物碱(例如长春新碱(vincristine)，长春花碱(vinblastine)，长春瑞滨(vinorelbine)，和长春地辛(vindesine))，紫杉烷(例如紫杉醇(paclitaxel)，多西他赛(docetaxel))依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；拓扑异构酶抑制剂比如喜树碱(camptothecins)(例如依立替康(irinotecan)和托泊替康(topotecan))；细胞毒性抗生素比如放线菌素(actinomycin)，蒽环类抗生素(anthracyclines)，阿霉素(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，戊柔比星(valrubicin)，伊达比星(idarubicin)，表柔比星(epirubicin)，博来霉素(bleomycin)，光辉霉素(plicamycin)和丝裂霉素(mitomycin)；和放射性同位素。预期本发明的抗体或其抗原结合部分与抗癌剂的连接导致与没有抗癌剂的抗体相比更强的肿瘤生长抑制，因为由于肿瘤中GDF-15的存在，产生的缀合物将积累在肿瘤位点，导致抗癌剂在肿瘤位点的积累并导致抗癌剂对肿瘤的增强的效果。
在根据以上实施方案的进一步实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分被氨基酸标签修饰。此种标签的非限制性实例包括多聚组氨酸(His-)标签，FLAG-标签，血凝素(HA)标签，糖蛋白D(gD)标签，和c-myc标签。标签可以用于不同目的。例如，它们可以用于帮助纯化能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分，或它们可以用于检测抗体或其抗原结合部分(例如当用于诊断测定时)。优选地，这种标签存在于能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分的C-末端或N-末端。
在根据以上实施方案的本发明的优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分能够抑制哺乳动物，优选人患者中癌生长。
在根据以上实施方案的本发明的另一个优选的实施方案中，所述人GDF-15是具有由SEQ ID No：8表示的氨基酸序列的重组人GDF-15。
根据以上实施方案的本发明的另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分的结合是结合人GDF-15上的构象或不连续表位。
优选，本发明的能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分是分离的抗体。
在根据本发明的上述抗体或其抗原结合部分的优选的实施方案中，抗体具有大于100kDa，优选大于110kDa，更优选大于120kDa，还更优选大于130kDa，并且最优选大于140kDa的大小。优选地，所述抗体是全长抗体，更优选全长IgG抗体。
本发明还涉及表达载体，所述表达载体包含编码上文所定义的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。
此外，本发明还提供细胞系，所述细胞系能够产生根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，所述细胞系可以源自本领域中已知的并且适于产生抗体或其抗原结合部分的任何细胞系。
在优选的实施方案中，所述细胞系是以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23。
在另一个优选的实施方案中，所述细胞系含有上文定义的根据本发明的表达载体。
B)药物组合物
在进一步的实施方案中，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含上文定义的任意抗体或其抗原结合部分。
根据已知的用于制备含有抗体及其部分的药物组合物的标准制备根据本发明的药物组合物。
例如，所述组合物以它们可以被适当地储存和施用的方式，例如通过使用药用组分比如载体、赋形剂或稳定剂制备。
这种药用组分以当将药物组合物施用于患者时使用的量是无毒的。加至药物组合物的药用组分可以取决于药物组合物的特定预期用途和给药途径。
通常，根据本领域中可获得的例如从Remington′s Pharmaceutical Sciences，Ed.AR Gennaro，第20版，2000，Williams&Wilkins，PA，USA获得的知识，使用与本发明相关使用的药用组分。
C)治疗方法和用于这些方法的产品
本发明还涉及用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法。所述方法包括施用如上文所定义的抗体或其抗原结合部分，或如上文对于所述哺乳动物所定义的药物组合物。备选地，本发明涉及如上文定义的抗体或其抗原结合部分，或如上文定义的用于这些方法的药物组合物。在这些实施方案的非常优选的方面，哺乳动物是人患者。
本发明还涉及治疗哺乳动物中癌症的方法。所述方法包括将上文所定义的抗体或其抗原结合部分，或上文定义的药物组合物施用于所述哺乳动物。备选地，本发明涉及上文定义的抗体或其抗原结合部分，或上文定义药物组合物，其用于这些方法中。在这些实施方案的非常优选的方面，所述哺乳动物是人患者。
当考虑本发明时，明显的是，从WO 2005/099746，WO 2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007已知的抗-GDF-15抗体仅抑制癌症引起的体重减轻，但不能抑制人GDF-15的其他效应，如与癌生长相关的那些。
本发明涉及与本领域中观察到的效应相比的一些出人意料的益处。
尤其是，本发明的一个主要益处在于，本文中公开的抗-GDF-15抗体可以用于更有效地治疗癌症引起的体重减轻和/或癌性恶病质。
例如，用根据本发明的抗体治疗可以完全预防癌性恶病质(当预防性给予时)或完全逆转癌性恶病质(当在癌性恶病质发病后给予时)。
此外，在用于预防恶病质的预防性治疗期间，根据本发明的抗体可以甚至增加治疗的哺乳动物的体重。同样，预期，在癌性恶病质发病后开始的治疗性处理的过程中，根据本发明的抗体不仅可以逆转体重的损失，而且可以增加治疗的哺乳动物的体重(与其在癌性恶病质发病前的体重相比)。
根据本发明的抗体的该预料不到的效果可以在各种临床情况中是有益的。例如，施用很多针对癌症有药学活性的成分(例如各种化疗药物)可以导致包括人患者在内的哺乳动物的体重减轻。体重的这种另外的损失可以由因为施用根据本发明的抗体导致的体重的增加抵消。因此，根据本发明的抗体的使用对于利用另外的化疗药物的联合方案可以是特别有利和安全的。类似地，根据本发明的抗体的使用对于在癌症发病前和/或在癌性恶病质发病前已经具有低体重的哺乳动物如人患者可以特别有利。具有低体重的患者可以例如是恶病质的患者，例如具有小于18kg/m2的体重指数的患者。
此外，预料之外的，根据本发明，所述抗体不仅对于治疗癌性恶病质有效，而且对于治疗癌症有效。
因此，预期使用根据本发明的抗体的治疗方法和产品对分别遭受癌症引起的体重减轻和/或癌性恶病质的癌症患者亚群特别有利。
然而，还预期根据本发明的效果对于本文中涉及的癌症的整个患者组的治疗都有利：通过使用对癌症本身和对癌症引起的体重减轻和/或癌性恶病质都有效的根据本发明的抗体，癌症和癌性恶病质治疗可以通过对所有癌症患者使用相同治疗简化，不论他们是否遭受癌症引起的体重减轻和/或癌性恶病质。这是因为，由于抗体针对癌症和癌性恶病质的双重效果，预期这些抗体将消除对治疗癌性恶病质的另外的药物的需要。
同样，由于根据本发明的抗体的双重效果，还可以变得不必要的是诊断癌症引起的体重减轻和/或癌性恶病质。因此，预期的是，治疗和诊断的总体成本将降低。
因此，在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，用于治疗癌性恶病质的方法是完全预防或完全逆转癌性恶病质的方法。在该方法，或用于该方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的更优选的实施方案中，用于治疗癌性恶病质的方法是完全预防癌性恶病质的方法。在该方法，或用于该方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的备选的更优选的实施方案中，用于治疗癌性恶病质的方法是完全逆转癌性恶病质的方法。
在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，在该方法中仅治疗患有以下二者的哺乳动物
i)癌症，和
ii)癌性恶病质。
在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，与其在癌性恶病质发病前的体重相比，所述方法增加哺乳动物的体重。优选地，与其在癌性恶病质发病前的体重相比，哺乳动物的体重的增加是至少1.5％，优选至少2.5％，更优选至少5％。
在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，所述方法是在同一哺乳动物中治疗癌症和癌性恶病质的方法。
在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，所述抗体具有大于100kDa，优选大于110kDa，更优选大于120kDa，还更优选大于130kDa，并且最优选大于140kDa的大小。优选地，所述抗体是全长抗体，更优选全长IgG抗体。
在根据本发明的上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的进一步优选的实施方案中，所述抗体具有能够结合Fc受体的Fc部分。
在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，哺乳动物的癌细胞内源表达GDF-15和/或哺乳动物的癌细胞刺激哺乳动物的非癌细胞中GDF-15的内源表达。
在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，哺乳动物的癌细胞特征在于它们内源性表达GDF-15。
在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，所述哺乳动物是人患者。
在上述方法的优选的实施方案，或用于根据本发明的这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物中，所述人GDF-15是具有SEQ ID No：8表示的氨基酸序列的重组人GDF-15。
在上述方法，或用于这些方法中的抗体其抗原结合部分或药物组合物的优选的实施方案中，施用前所述人患者在血清中具有升高的GDF-15水平。在血清中具有升高的GDF-15水平的患者亚组中，预期根据本发明的治疗方法在抑制癌生长方面特别有效。在本实施方案的最优选的方面，GDF-15水平是使用可获自以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)的杂交瘤细胞系B1-23的根据本发明的抗体测量的，优选通过免疫化学测量的GDF-15蛋白水平。
在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是用于所述方法的针对癌症有药物活性的唯一成分。
在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的备选实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分与一种或多种对癌症有药物活性的其它成分联合使用。在该实施方案的一个方面，所述一种或多种对癌症有药物活性的其它成分是如上文定义的已知的抗癌剂和/或免疫刺激分子。因此，抗癌药剂可以例如选自烷化剂比如顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)，氮芥(mechlorethamine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，和异环磷酰胺(ifosfamide)；抗-代谢物比如硫唑嘌呤(azathioprine)和巯基嘌呤(mercaptopurine)；生物碱比如长春花生物碱(例如长春新碱(vincristine)，长春花碱(vinblastine)，长春瑞滨(vinorelbine)，和长春地辛(vindesine))，紫杉烷(例如紫杉醇(paclitaxel)，多西他赛(docetaxel))依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；拓扑异构酶抑制剂比如喜树碱(camptothecins)(例如依立替康(irinotecan)和托泊替康(topotecan))；细胞毒性抗生素比如放线菌素(actinomycin)，蒽环类抗生素(anthracyclines)，阿霉素(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，戊柔比星(valrubicin)，伊达比星(idarubicin)，表柔比星(epirubicin)，博来霉素(bleomycin)，光辉霉素(plicamycin)和丝裂霉素(mitomycin)；和放射性同位素。由于根据本发明的抗体对包括人患者在内的哺乳动物的体重的增加效应，预期抗体或其抗原结合部分与针对癌症的药学活性成分的这些联合使用特别安全，因为它们可以补偿由于施用针对癌症的药学活性成分造成的可能的另外体重减轻。
在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的优选实施方案中，所述癌症选自由以下各项组成的组：脑癌(包括神经胶质瘤)，神经系统癌症，黑素瘤，肺癌，唇和口腔癌，肝癌，白血病，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)，非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)，膀胱癌，子宫颈癌，子宫体癌，睾丸癌，甲状腺癌，肾癌，胆囊癌，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，喉癌，咽癌，食道癌，胃肠道肿瘤(包括胃和结直肠癌)，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌和乳腺癌，优选选自由以下各项组成的组：黑素瘤，前列腺癌，乳腺癌，脑癌(包括神经胶质瘤)，结直肠癌，胃癌，食道癌和卵巢癌，并且最优选为黑素瘤。在一个实施方案中，所述癌症选自上述组，所述组还包含子宫内膜癌(endometrial cancer)(比如子宫内膜癌(endometrial carcinoma))，乳腺癌(包括乳腺癌的亚型，尤其是三阴性乳腺癌)和膀胱癌比如尿路上皮细胞癌。
在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的另一个优选的实施方案中，与相同患者的获自癌症来源组织的组织非癌部分的对照样品相比，由于癌症而形成的肿瘤或多种肿瘤在施用之前具有更高的人GDF-15水平，优选1.2-倍高水平，更优选1.5-倍高水平，还更优选2-倍高水平并且最优选5-倍高水平。与上述对照样品相比，在由于癌症而形成的肿瘤或多种肿瘤中具有更高GDF-15水平的患者亚群中，预期根据本发明的治疗方法在抑制癌生长方面特别有效。
在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的非常优选的实施方案中，所述方法用于治疗癌症，包括抑制癌生长。在该实施方案的优选的方面，癌生长被终止。在更优选的方面，癌缩小。
在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的优选的实施方案中，所述方法用于治疗癌症，包括通过人患者中的NK 细胞和CD8+ T细胞诱导杀伤癌细胞。除了抗体或其抗原结合部分独立于免疫系统的效果之外，由于其阻止GDF-15介导的已知的免疫监视调节剂NKG2D的下调的能力，所以预期根据本发明的抗体或其抗原结合部分修复免疫监视并且通过NK细胞和CD8+ T细胞诱导杀灭癌细胞。
D)试剂盒
本发明还提供试剂盒，所述试剂盒包含上文定义的药物组合物。
在一个实施方案中，所述试剂盒是如上文定义的用于根据本发明的方法的试剂盒。
在进一步的实施方案中，本发明还提供诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含根据本发明的任意抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，所述诊断试剂盒可以用于检测与同一患者的获自组织(其为癌症来源组织)非癌部分的对照样品相比，癌症患者的由于癌症而形成的一种肿瘤或多种肿瘤是否具有更高的人GDF-15水平。
在另一个实施方案中，所述诊断试剂盒可以用于检测人癌症患者是否在血清中具有升高的GDF-15水平。
E)序列
本申请中涉及的氨基酸序列如下(以N-末端到C-末端的顺序；以单字母氨基酸编码表示)：
SEQ ID No：1(包含FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区的重链可变结构域区，来自单克隆抗-人GDF-15 mAb-B1-23的多肽序列)：
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYC
SEQ ID No：2(包含FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区的轻链可变结构域区，来自单克隆抗-人GDF-15 mAb-B1-23的多肽序列)：
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC
SEQ ID No：3(单克隆抗-人GDF-15 mAb-B1-23的重链CDR1区肽序列)：
GFSLSTSGMG
SEQ ID No：4(单克隆抗-人GDF-15 mAb-B1-23的重链CDR2区肽序列)：
IYWDDDK
SEQ ID No：5(单克隆抗-人GDF-15 mAb-B1-23的重链CDR3区肽序列)：
ARSSYGAMDY
SEQ ID No：6(单克隆抗-人GDF-15 mAb-B1-23的轻链CDR1区肽序列)：
QNVGTN
单克隆抗-人GDF-15 mAb-B1-23的轻链CDR2区肽序列：
SAS
SEQ ID No：7(单克隆抗-人GDF-15 mAb-B1-23的轻链CDR3区肽序列)：
QQYNNFPYT
SEQ ID No：8(重组成熟人GDF-15蛋白)：
GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
SEQ ID No：9(人GDF-15前体蛋白)：
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
SEQ ID No：10(人GDF-15前体蛋白+N-末端和C-末端GSGS接头)：
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG
SEQ ID No：11(标志(Flag)肽)：DYKDDDDKGG
SEQ ID No：12(HA肽)：YPYDVPDYAG
SEQ ID No：13(源自人GDF-15的肽)：ELHLRPQAARGRR
SEQ ID No：14(源自人GDF-15的肽)：LHLRPQAARGRRR
SEQ ID No：15(源自人GDF-15的肽)：HLRPQAARGRRRA
SEQ ID No：16(源自人GDF-15的肽)：LRPQAARGRRRAR
SEQ ID No：17(源自人GDF-15的肽)：RPQAARGRRRARA
SEQ ID No：18(源自人GDF-15的肽)：PQAARGRRRARAR
SEQ ID No：19(源自人GDF-15的肽)：QAARGRRRARARN
SEQ ID No：20(源自人GDF-15的肽)：MHAQIKTSLHRLK
SEQ ID No：25(包含结合B1-23的GDF-15表位部分的GDF-15肽)：
EVQVTMCIGACPSQFR
SEQ ID No：26(包含结合B1-23的GDF-15表位部分的GDF-15肽)：
TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
本申请中涉及的核酸序列如下(以5’至3’的顺序；根据标准核酸编码表示)：
SEQ ID No：21(编码SEQ ID No：1中限定的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：
CAAGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGTACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATCCCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGT
SEQ ID No：22(编码SEQ ID No：2中限定的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：
GACATTGTGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTTATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGT
SEQ ID No：23(编码SEQ ID No：5中限定的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：
GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC
SEQ ID No：24(编码SEQ ID No：7中限定的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：
CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG
SEQ ID No：27(H1L5人源化B1-23抗-GDF-15抗体的重链的氨基酸序列)：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTITKDPSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No：28(H1L5人源化B1-23抗-GDF-15抗体的重链可变结构域的氨基酸序列)：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTITKDPSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No：29(H1L5人源化B1-23抗-GDF-15抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No：30(H1L5人源化B1-23抗-GDF-15抗体的轻链的氨基酸序列)：
DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWFQQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No：31(H1L5人源化B1-23抗-GDF-15抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列)：
DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWFQQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID No：32(H1L5人源化B1-23抗-GDF-15抗体的轻链恒定结构域的氨基酸序列)：
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No：33(嵌合B1-23抗-GDF-15抗体的重链的氨基酸序列)：
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No：34(嵌合B1-23抗-GDF-15抗体的重链可变结构域的氨基酸序列)：
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID No：35(嵌合B1-23抗-GDF-15抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No：36(嵌合B1-23抗-GDF-15抗体的轻链的氨基酸序列)：
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No：37(嵌合B1-23抗-GDF-15抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列)：
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVA
SEQ ID No：38(嵌合B1-23抗-GDF-15抗体的轻链恒定结构域的氨基酸序列)：
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
F)实施例
通过以下非限制性实施例说明本发明：
实施例1：鼠GDF-15抗体B1-23的产生和表征，以及嵌合和人源化抗体的产生
在GDF-15敲除小鼠中产生抗体B1-23。使用重组人GDF-15(SEQ ID No：8)作为免疫原。
根据布达佩斯条约，将产生mAb-B1-23的杂交瘤细胞系B1-23以保藏号DSMACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)。
通过可市购试纸系统的方式，鉴定B1-23为IgG2a(κ链)同种型。使用表面等离子共振测量，如下确定解离常数(Kd)：
通过使用表面等离子共振测量，用ProteOnTM XPR36系统和GLC传感器芯片测量单克隆抗-人-GDF-15抗体，抗-人GDF-15 mAb-B1-23的结合：
为了制备生物传感器，将重组成熟人GDF-15蛋白固定在流通池(flow cell)1和2上。在一个流通池上，使用源自杆状病毒感染的昆虫细胞(HighFive昆虫细胞)的重组GDF-15并且在另一个上使用源自大肠杆菌表达的重组蛋白。根据制造商的建议使用磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)和EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)(ProteOnTM胺偶联试剂盒)活化GLC传感器芯片，接着在传感器表面加载蛋白至高达约600RU(1Ru＝1pg mm-2)的密度。然后通过灌注1M乙醇胺pH 8.5猝灭未反应的偶联基团，并且通过用运行缓冲液(10M HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％20，pH 7.4，也称为HBS150)灌注芯片来平衡生物传感器。作为对照，使用两个流通池，一个空的无蛋白偶联并且一个用非生理学蛋白伴侣(人白细胞介素-5)偶联，使用相同的偶联化学和相同的偶联密度将其固定。对于相互作用测量，将抗-人GDF-15 mAb-B1-23溶解在HBS150中并且以六个不同浓度用作被分析物(浓度：0.4，0.8，3，12，49和98nM)。使用一次性动力学(one-shot kinetics)设置将被分析物灌注通过生物传感器，以避免间歇性再生，所有测量在25℃进行并且使用100μl min-1的流速。为了处理大块面效应(bulk face effect)和非特异结合，通过从所有其他SPR数据中减去空的流通池(流通池3)的SPR数据来去除传感器背景。使用软件ProteOn Manager版本3.0分析产生的传感图(sensogram)。为了分析结合动力学，假设1∶1 Langmuir-型相互作用。可以确定结合速率常数值为5.4±0.06x105M-1s-1(kon)和确定解离速率常数值为4.3±0.03x10-4s-1(koff)(值是对于抗-人GDF-15 mAb-B1-23与源自昆虫细胞表达的GDF-15的相互作用)。使用方程式KD＝koff/kon计算平衡解离常数，获得约790pM的值。源自大肠杆菌表达的GDF-15和抗-人GDF-15 mAb-B1-23相互作用的亲和力值差异小于2倍，源自昆虫细胞和大肠杆菌的GDF-15的速率常数偏差约45％并且因此在SPR测量值的精确度内并且可能不反映亲和力的真实差异。在使用的条件下，抗-人GDF-15 mAb-B1-23显示不结合人白细胞介素-5并且因此确认相互作用数据和抗-人GDF-15 mAb-B1-23的特异性。
重组人GDF-15的氨基酸序列(在杆状病毒转染的昆虫细胞中表达)是：
(SEQ ID No：8)
因此，使用表面等离子共振测量，确定解离常数(Kd)为790pM。作为比较：治疗使用的抗体利妥昔单抗具有显著更低的亲和力(Kd＝8nM)。
从鼠抗-人GDF-15 mAb-B1-23，通过用人IgG1抗体(曲妥单抗(trastuzumab)骨架)的恒定结构域替代鼠抗体的恒定结构域产生根据本发明的嵌合抗-人GDF-15 mAb-B1-23抗体。该嵌合抗体的重链的氨基酸序列在SEQ ID No：33中显示，并且该嵌合抗体的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID No：36中。
从嵌合抗-人GDF-15 mAb-B1-23，通过人源化嵌合抗体的可变结构域，即通过用人序列替代嵌合抗体的框架区，开发根据本发明的人源化抗-人 GDF-15 mAb-B1-23抗体。该人源化抗体的重链的氨基酸序列显示在SEQ ID No：27中，并且该人源化抗体的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID No：30中。该抗体称为H1L5抗-GDF-15抗体或人源化B1-23-H1L5抗体或H1L5抗体。
为了如上文所述产生上述嵌合抗-人GDF-15 mAb-B1-23抗体和人源化B1-23-H1L5抗体，优化编码抗体序列的cDNA并且合成基因。然后将基因序列克隆入克隆/表达载体系统。从这些载体，合成具有低的内毒素水平的质粒DNA。
然后将质粒DNA瞬时转染入CHO细胞，接着使用蛋白A生物传感器分析和定量抗体表达。对用于抗体表达的候选培养物的cDNA测序。分析获得的单克隆抗体(参见实施例7至9)。
实施例2：使用mAB B1-23对GDF-15介导的效应的拮抗作用
a)已知表达在NK细胞和CD8+ T细胞上的NKG2D(自然杀伤组(Natural KillerGroup)2D)受体在针对肿瘤的免疫监视中发挥重要作用。转化的以及病毒感染的细胞表达配体(其结合NKG2D受体)，从而激活所描述的免疫细胞的细胞毒效应子功能。以该方式，可以检测转化的细胞并通过免疫系统消除。在用重组人GDF-15或肿瘤细胞分泌的GDF-15在体外处理免疫细胞72小时后，淋巴细胞的细胞表面NKG2D的表达水平下调(图1)。72小时的孵育之后，用以下FACS-抗体将免疫细胞染色：抗CD3，抗CD56，抗-NKG2D。使用该抗体组合，实验集中于NK细胞及其NKG2D表面表达。免疫细胞上低NKG2D水平导致受损的肿瘤/靶细胞裂解。GDF-15介导的NKG2D下调被mAb B1-23阻止。
因此得出结论：人GDF-15下调淋巴细胞细胞表面上的NKG2D表达并且因此下调针对肿瘤的免疫监视。通过结合人GDF-15，本发明的抗体能够阻止GDF-15介导的NKG2D下调，并且应该能够修复免疫监视并通过NK细胞和CD8+ T细胞诱导杀伤癌细胞。鉴于mAb B1-23抗体的CDR区对应于嵌合和人源化抗体的CDR区，预期这些抗体的包括结合性质在内的功能特性相似。
b)用重组GDF-15处理卵巢癌细胞系SK-OV-3导致AKT的磷酸化。 AKT是作为PI3K-通路的一部分的分子并且促进细胞的激活和增殖。在该实验中，在37℃，5％CO2，将SK-OV-3细胞用10ng/ml重组GDF-15处理10min。2μg mAb-B1-23与10ng/ml GDF-15在37℃的5分钟预孵育阻断了GDF-15介导的AKT-磷酸化(图2)。这表明mAb-B1-23的中和效应。
c)用重组GDF-15处理免疫细胞导致JNK(一种激酶，其被细胞因子或被应激激活)的磷酸化。2μg mAb-B1-2310ng/ml对GDF-15的拮抗作用(在37°预孵育5分钟)阻断GDF-15介导的JNK1/2-磷酸化(图3)。
实施例3：使用mAb B1-23抑制癌细胞增殖
使用B1-23产生的数据表明抗体在体外对癌细胞的抗增殖效应。使用前列腺癌细胞系LnCap(其产生许多GDF-15)观察到最强的抗增殖效应。与不使用抗体的对照组相比，当存在mAb-B1-23时，代谢测定(Alamar 测定)显示在72hrs后增殖减少30％。因为在不同测定中抗体的细胞毒效应已经被排除，所以该效应证明GDF-15阻断后显著减少的细胞分裂。
实施例4：mAb B1-23抑制体内肿瘤生长
进行以下体内研究：
为了评估B1-23在体内的抗-肿瘤效果，在黑素瘤细胞系UACC-257的异种移植物设置中使用Balb/cnu/nu裸鼠。将所述小鼠用抗体B1-23或PBS处理。各个处理群组含有10只Balb/cnu/nu裸鼠。
在注射前，将UACC-257黑素瘤细胞在完全培养基中培养，排除任何污染。当在细胞培养瓶中达到70-80％汇合(confluence)时收获细胞。然后将细胞用PBS洗涤并计数。将1x107个活细胞悬浮在PBS中。
在6周龄Balb/cnu/nu裸鼠中进行首次注射/处理。将小鼠接种区域用乙醇清洁。为了避免对肿瘤细胞的负压，将UACC 257细胞混合并吸入无针头的注射器中。将在PBS中含有1x107个细胞的细胞悬浮液皮下(s.c.)注射入小鼠的下侧面(lower flank)。
在肿瘤细胞接种(定义为第1天)之后立即开始B1-23(25mg/kg体重)或相同体积的PBS的腹膜内(i.p.)注射并且一周施用两次。让肿瘤生长48天。用卡尺测量肿瘤直径并且以mm3计的肿瘤体积通过下式计算：
体积＝(宽度)2x长度/2
从该研究获得结果显示在图4中。
如图中所示，与PBS对照组相比，用B1-23处理的动物群组的肿瘤尺寸显著减小。
鉴于mAb B1-23抗体的CDR区对应于嵌合和人源化抗体的CDR区，预期这些抗体的包括抗癌效果的功能特性相似。
实施例5：mAb B1-23识别人GDF-15上的构象或不连续表位
表位制图：针对源自GDF-15的13链节(mer)线性肽的单克隆小鼠抗体GDF-15
抗原：GDF-15：
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(具有接头的322个氨基酸)(SEQ ID No：10)
蛋白序列被翻译为具有一个氨基酸移码的13链节肽。通过中性GSGS接头延长C-和N-末端以避免截短了的肽(粗体字母)。
对照肽：
标记(Flag)：DYKDDDDKGG(SEQ ID No：13)，78个点；HA：YPYDVPDYAG(SEQ ID No：14)，78个点(每个阵列复制)
肽芯片编号：
000264_01(10/90，Ala2Asp接头)
染色条件：
标准缓冲液：PBS，pH 7.4+0.05％20
封闭缓冲液：Rockland封闭缓冲液MB-070
孵育缓冲液：具有10％Rockland封闭缓冲液MB-070的标准缓冲液
初级样品：单克隆小鼠抗体GDF-15(1μg/μl)：在4℃以1∶100的稀释度在孵育缓冲液中染色16h并且以500rpm缓慢震荡
二抗：山羊抗-小鼠IgG(H+L)IRDye680，以1∶5000的稀释度在孵育缓冲液中在室温(RT)染色30min
对照抗体：单克隆抗-HA(12CA5)-LL-Atto 680(1∶1000)，单克隆抗-FLAG(M2)-FluoProbes752(1∶1000)；在RT在孵育缓冲液中染色1h
扫描仪：
成像系统，LI-COR Biosciences
设置：补偿：1mm；分辨率：21μm；强度绿/红：7/7
结果：
在标准缓冲液中30min预膨胀和封闭缓冲液中30min之后，将具有10，12和15链节的B7H3-衍生的线性肽的肽阵列仅与1∶5000的稀释度的第二山羊抗-小鼠IgG(H+L)IRDye680抗体在室温孵育1h，以分析二抗的背景相互作用。用标准缓冲液洗涤2x1min，用蒸馏水冲洗并且在空气流中干燥。用成像系统以21μm的分辨率和7/7的绿/红强度进行读值：由于与带电抗体染料的离子相互作用，我们观察到已知为常见结合物(binder)的富精氨酸肽(ELHLRPQAARGRR(SEQ ID No：15)，LHLRPQAARGRRR(SEQ ID No：16)，HLRPQAARGRRRA(SEQ ID No：17)，LRPQAARGRRRAR(SEQ IDNo：18)，RPQAARGRRRARA(SEQ ID No：19)，PQAARGRRRARAR(SEQ ID No：20)和QAARGRRRARARN(SEQ ID No：21))，和碱性肽MHAQIKTSLHRLK(SEQ ID No：22)的弱相互作用。
在标准缓冲液中预膨胀10min后，将肽微阵列在4℃与1∶100稀释的单克隆小鼠抗体GDF-15孵育过夜。在标准缓冲液中重复洗涤(2x1min)，接着用1∶5000稀释的二抗在室温孵育30min。在标准缓冲液中2x10秒洗涤和用蒸馏水短暂冲洗之后，在空气流中干燥在通过抗-HA和抗-FLAG(M2)抗体将对照肽染色之前和之后，用成像系统以21μm的分辨率和7/7的绿/红强度进行读值。
表明的是，源自GDF-15的线性13链节肽中没有一个与单克隆小鼠抗体GDF-15相互作用(甚至在过调节的强度下)。然而，构成所述阵列的标记和HA对照肽的染色，导致好的和均匀的点强度。
总结：
针对GDF-15的单克隆小鼠GDF-15抗体的表位制图未揭示任何源自所述抗原的13链节肽的线性表位。根据该发现，很可能单克隆小鼠抗体GDF-15识别具有低亲和力的部分表位的构象或不连续表位。由于明显缺少超过仅二抗的背景染色的任何GDF-15信号，所以未进行用分析仪的点强度定量和随后的肽注释。
实施例6：通过质谱表位切除和表位提取的肽配体表位结构鉴定
通过表位切除方法和表位提取方法(Suckau等人Proc Natl Acad Sci U SA.1990年12月；87(24)：9848-9852.；R.Stefanescu等人，Eur.J.Mass Spectrom.13，69-75(2007))的方式鉴定结合抗体B1-23的重组人GDF-15表位。
为了制备抗体柱，将抗体B1-23加至NHS-活化的6-氨基己酸偶联的琼脂糖。然后将琼脂糖偶联的抗体B1-23加载在0,8ml微柱中并用封闭和洗涤缓冲液洗涤。
表位提取实验：
将重组人GDF-15在37℃用胰蛋白酶消化2h(在溶液中)，根据胰蛋白酶在蛋白中的切割位点，产生不同肽。完全消化后，将肽加载在含有固定化的抗体B1-23的亲和柱上。GDF-15的未结合的以及可能结合的肽用于质谱分析。通过质谱的方式鉴定肽是不可能的。这是免疫复合体B1-23中GDF-15的结合区包含不连续的或构象的表位的进一步指征。在连续线性表位的情况中，除非在表位肽中存在胰蛋白酶切割位点，消化的肽应该结合其相互作用伴侣。可以通过以下部分描述的表位切除方法确认不连续或构象表位。
表位切除实验
然后将亲和柱上固定化的抗体B1-23与重组GDF-15孵育2h。亲和柱上形成的免疫复合体随后在37℃与胰蛋白酶孵育2h。切割导致源自重组GDF-15的不同肽。固定化的抗体本身是蛋白水解稳定的。产生的消化的GDF-15蛋白的肽(其被抗体遮蔽并且因此被保护免受蛋白水解切割)在酸性条件下(TFA，pH2)被洗脱，收集并通过质谱鉴定。
使用MS/MS鉴定的表位切除方法产生以下肽：
结合抗体B1-23的人GDF-15的部分，包含不连续或构象表位。质谱鉴定了GDF-15蛋白中的2个肽，其负责免疫复合体的形成。这些肽限制在GDF-15氨基酸序列中的位置40-55(EVQVTMCIGACPSQFR.)和94-114(TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI)。因此，这两个肽包含结合抗体B1-23的GDF-15蛋白的表位。
再次，因为mAb B1-23抗体的CDR区对应于嵌合和人源化抗体的CDR区，预期这些抗体的结合性质相似。
实施例7：用抗-GDF-15抗体治疗癌症引起的体重减轻。在基础的动物研究编号140123中，每个治疗组中的10只Balb/cnu/nu小鼠用10x106个UACC-257细胞/动物以与基质胶1∶1的体积比(100μl细胞+100μl基质胶)皮下接种。如下文所示的，在同一天以各自的抗体治疗动物：
*Detidemac 500mg(有效期：03/2015)
达卡巴嗪组(组1)用作用于肿瘤生长抑制的参照组/阳性对照(用于在人中治疗恶性黑素瘤的细胞抑制性药物)。
PBS组(组2)用作生长对照/媒介物对照组，因为其他组的所有使用的物质在PBS中施用。
鼠B1-23组先导候选抗体(组3)用作参照组，以与嵌合B1-23抗体和与人源化B1-23H1L5(组4和5)相比较。
组4是嵌合的B1-23先导候选抗体的组，其含有鼠可变结构域和人IgG1抗体(曲妥单抗骨架)的恒定结构域。
组5是H1L5人源化B1-23先导候选抗体的组，其含有在鼠可变结构域内的人源化框架和人IgG1抗体(曲妥单抗骨架)的恒定结构域。
组6是B12同种型抗体的组。对于该同种型对照组，抗体B12(批号：ID3195)由Evitria AG生产。B12结合HIV抗原并且因此应该既不结合裸鼠中的抗原，也不结合人肿瘤的抗原。选择B12为高度适合的同种型对照，因为B12的免疫球蛋白骨架也由人IgG1抗体曲妥单抗构成并且因此除了其可变结构域之外，几乎与嵌合B1-23和H1L5人源化B1-23抗体相同。
该研究以双盲的方式进行，用于利用抗体治疗和用于利用PBS治疗。
在未接受抗-GDF-15抗体的组1、2和6中，观察到大于10％体重减轻(即与第0天相比，体重减轻至小于90％的相对体重)。相反，在接受分别用抗-GDF-15抗体B1-23，嵌合B1-23和人源化B1-23-H1L5治疗的组中，观察到体重的增加(图5)。
因此，出人意料地，用所有测试的抗-GDF-15抗体治疗，完全防止了小鼠中癌症引起的体重减轻。对于所有用抗-GDF-15抗体治疗的组，该效果显著(双向ANOVA；p＜0.05)。
还值得注意的是，未接受抗-GDF-15抗体治疗的组的小鼠表现出大于10％的体重减轻。在人中，经6个月的时期低至5％的体重减轻被认为是表示癌性恶病质(Fearon K.等人：Definition and classification of cancer cachexia：an internationalconsensus.Lancet Oncol.2011年5月；12(5)：489-95.)。鉴于在本研究中观察到较大的小鼠体重减轻，甚至超过10％，预期的是，研究中的小鼠(其未接受抗-GDF-15抗体治疗)不仅表现出体重减轻，而且表现出癌性恶病质。该作用完全被测试的抗-GDF-15抗体防止。因此，预期的是，根据本发明的抗-GDF-15抗体既能够治疗癌症引起的体重减轻，也能够治疗癌性恶病质。
值得注意的是，体重减轻的程度与各自的肿瘤尺寸不相关(r2＝10-6)。如果体重减轻的预防仅是癌生长的抑制和较小的肿瘤尺寸造成的次级效应，则将会预期肿瘤尺寸和体重减轻之间的关联。因此，这种关联的缺乏表明，使用根据本发明的抗-GDF-15抗体导致两个独立的治疗效果：
-抑制癌生长，和
-作为额外效果，预防体重减轻，其独立于癌生长的抑制，并且预期其反映癌性恶病质的预防。
尽管它们有机制上的独立性，但是观察到这些效果在同一动物中可以同时发生。
除了评估小鼠的平均体重之外，通过成对比较研究组，评估小鼠的饲料消耗(表1)。值得注意的是，抗-GDF-15抗体组(B1-23、嵌合B1-23和人源化B1-23-H1L5)中的小鼠的饲料消耗显著高于未接受抗-GDF-15抗体的组中的小鼠的饲料消耗。
表1：
(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001，如通过未配对的双侧Student′s t-检验评估的)
表1：不同治疗组之间饲料消耗的比较评价。对于测量的时间间隔(第17-20天，第20-24天，第24-27天，第27-31天，第31-34天)，对于每个各自的组，计算每只小鼠和每天的平均饲料消耗。值与其标准偏差一起表示。
用于研究的人源化抗-GDF-15抗体B1-23-H1L5的质量通过使用抗体的凝胶电泳和考马斯染色检测(参见图6)。值得注意的是，人源化抗-GDF-15抗体B1-23-H1L5的条带明显和清晰，而鼠B1-23抗-GDF-15抗体和B12对照抗体的条带显得不那么明显并且处在较高的分子量。这提示人源化抗-GDF-15抗体B1-23-H1L5不易于聚集，并且一些聚集可能将其他抗体的分子量移动到更高的值。
此外，通过使用比色法测定，确认的是，用于研究的所有抗-GDF-15抗体以浓度依赖性的方式结合GDF-15。为了确定B1-23抗体变体对GDF-15的结合，进行比色ELISA实验。B12抗体用作同种型抗体，其不结合人GDF-15。因此，将Maxisorp 96孔板(Nunc)用hrGDF-15(25ng蛋白/孔，50μl体积)在4℃包被过夜。次日，洗板以去除未结合的蛋白(用150μl的PBS0.05％洗3次)并且在室温用150μl的PBS 1％BSA阻断非特异结合位点2小时。再次，洗板并施加B1-23测试抗体的不同变体(50μl体积)。为了研究抗体结合的特异性，从333ng/ml开始并且以1∶3系列稀释进行终点稀释。作为背景对照，施加PBS 1％BSA。在室温结合1小时后，如上所述洗涤孔。将HRP缀合的抗-人IgG(Life technologies，1∶5000)作为二抗在室温施加1小时。如上所述洗涤孔以去除未结合的二抗。为了检测，加入50μl过氧化物底物(TMB 1∶100于0.1M乙酸钠中，pH6)，并且在10分钟的孵育后，加入50μl终止液(2NH2SO4)。作为阴性对照，包括不包被GDF-15的孔和没有二抗的孔。为了分析，使用ELISA读数器(Tecan Sunrise)和相应的Magellan软件定量450nm处的光密度。观察到，与B12抗体比较，人源化H1L5抗体、嵌合B1-23抗体和鼠B1-23抗体表现出明显浓度依赖性的对GDF-15的结合。
实施例8：确定抗-GDF-15抗体的Kd值。使用Surface Acoustic Wave(SAW)金芯片生物传感器技术(SAW Instruments GmbH，Schwertberger Str.16，D-53177 Bonn，德国)比较不同抗-GDF-15抗体的Kd值：
鼠抗体(B1-23)以及嵌合B1-23抗体以纯化的形式存在。H1L5人源化B1-23抗体是无血清CHO细胞培养上清。鼠B1-23的Kd值源自通过分析(表面等离子共振)以因子35确定的Kd值。
该偏差-除了测量方法的差异之外-可以由游离的鼠B1-23抗体的降低的利用度解释，因为发现作为鼠抗体以形式该抗体可以形成聚集体。因此，通过加入0.2％BSA稳定鼠B1-23抗体的溶液。因此，抗体对白蛋白的结合降低了鼠B1-23抗体的利用度并且可以解释不同测量方法获得的亲和力值的差异。与鼠B1-23抗体相比，H1L5人源化B1-23抗体出人意料地不显示聚集倾向性(还参见下文实施例9)。
在本测定中，嵌合B1-23抗-GDF-15抗体和H1L5人源化B1-23抗体显示出对人GDF-15的亲和力，其分别是鼠B1-23抗-GDF-15抗体的亲和力的约2-倍和5-倍高。因此，嵌合B1-23抗-GDF-15抗体和H1L5人源化B1-23抗体是高亲和力抗体。
实施例9：抗-GDF-15抗体的聚集研究
为了测试抗-GDF-15抗体的聚集性质，在微量离心管中将抗体样品在室温震荡48小时，并且然后肉眼分析管中聚集的抗体沉淀。
观察到，与鼠B1-23抗体相比，H1L5人源化B1-23抗体出人意料地不显示聚集的倾向性，甚至当抗体仅存在于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中时，和当不存在稳定蛋白如BSA时。
此外，在冻/融和稀释实验中，观察到，H1L5人源化B1-23抗体在任何稀释步骤或冻/融循环期间不聚集。
此外，进行以下实验(参见图7)：
将5mg的抗体(B1-23，嵌合B1-23＝“ChimB1-23”，H1L5)加载在ProteusTM蛋白A柱上，在生理pH下，在TRIS缓冲液中洗脱和收集。洗脱后，通过考马斯亮蓝凝胶分析，评估纯化的抗体的质量。通过光度法以及在Bradford测定(Roti-Quant，Carl Roth，Karlsruhe，德国)中测量洗脱的抗体的浓度。所有3种抗体溶液(B1-23，ChimB1-23，H1L5)显示类似的浓度并且被调节至0.5mg/ml。然后将抗体通过旋转柱(Centricon，MWCO 30)浓缩10倍。在该步骤后，浊度表明含有B1-23的样品中存在沉淀，而ChimB1-23和H1L5未显示聚集迹象。然后将所有浓缩的洗脱物在13000rpm离心5min以沉淀抗体聚集体。可溶抗体的剩余量最终通过从上清的Bradford测定确定。
预期抗体的这些性质对抗体的临床制剂有利。
G)工业实用性
根据本发明的抗体、其抗原结合部分、药物组合物和试剂盒可以作为产品根据制造药品的已知标准工业化生产和销售，用于权利要求所要求保护的方法和用途(例如，用于治疗癌性恶病质和癌症)。因此，本发明可在工业上应用。
优选的实施方案
1.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列。
2.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象表位或不连续表位，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列。
3.第1或2项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列。
4.第1至3项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列。
5.第1-4项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是人源化抗体。
6.第5项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的所有可变结构域是人源化的可变结构域。
7.第1-6项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQID No：28的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列。
8.第1-7项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQID No：28的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列。
9.第1-8项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链包含SEQ ID No：27的氨基酸序列，并且其中轻链包含SEQ ID No：30的氨基酸序列。
10.第1-4项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列或与其至少75％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列或与其至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％相同的氨基酸序列。
11.第10项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列。
12.第1-11项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区。
13.第2-12项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。
14.第1和3-12项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象的或不连续的表位。
15.第1-14项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有大于100kDa，优选大于110kDa，更优选大于120kDa，还更优选大于130kDa，并且最优选大于140kDa的大小。
16.第15项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全长抗体。
17.第16项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全长IgG抗体，优选全长IgG1抗体。
18.第1至17项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有能够结合Fc受体的Fc部分。
19.第1至18项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述人GDF-15是具有SEQ ID No：8表示的氨基酸序列的重组人GDF-15。
20.根据第1至19项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其用于医药。
21.根据第1至19项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。
22.根据第1至19项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其在用于治疗哺乳动物中癌症的方法中使用。
23.根据第21至22项中任一项使用的根据第21至22项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述方法是在同一哺乳动物中治疗癌症和治疗癌性恶病质二者的方法。
24.根据第21至23项中任一项使用的第21至23项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述哺乳动物是人患者。
25.根据第21或23-24项使用的第21或23-24项所述的抗体或其抗原结合部分，其中用于治疗癌性恶病质的方法是用于完全预防或完全逆转癌性恶病质的方法。
26.根据第25项使用的第25项所述的抗体或其抗原结合部分，其中用于治疗癌性恶病质的方法是用于完全预防癌性恶病质的方法。
27.根据第25项使用的第25项所述的抗体或其抗原结合部分，其中用于治疗癌性恶病质的方法是用于完全逆转癌性恶病质的方法。
28.根据第21-27项中任一项使用的第21-27项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中在所述方法中，仅治疗患有
i)癌症，和
ii)癌性恶病质
二者的哺乳动物。
29.根据第21或23-28项中任一项使用的第21或23-28项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中与其在癌性恶病质发病前的体重相比，所述方法增加哺乳动物的体重。
30.根据第29项使用的第29项所述的抗体或其抗原结合部分，其中与其在癌性恶病质发病前的体重相比，哺乳动物体重的增加是至少1.5％，优选至少2.5％，更优选至少5％。
31.根据第21至30项中任一项使用的第21至30项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中哺乳动物的癌细胞内源表达GDF-15和/或哺乳动物的癌细胞刺激哺乳动物的非癌细胞中GDF-15的内源表达。
32.根据第21至31项中任一项使用的第21至31项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中哺乳动物的癌细胞内源表达GDF-15。
33.根据第22-32项中任一项使用的第22-32项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗癌症的方法是包括抑制癌生长的方法。
34.根据第22-33项中任一项使用的第22-33项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗癌症的方法包含诱导通过人患者中的NK细胞和CD8+ T细胞杀伤癌细胞。
35.根据第21-34项中任一项使用的第21-34项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述人患者在施用前具有升高的血清中GDF-15水平。
36.根据第21-35项中任一项使用的第21-35项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是
A)用于该方法的唯一的对癌症有药学活性的成分，或
B)与一种以上的对癌症有药学活性的成分联合使用。
37.根据第21-36项中任一项使用的第21-36项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：脑癌(包括神经胶质瘤)，神经系统癌症，黑素瘤，肺癌，唇和口腔癌，肝癌，白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，膀胱癌，子宫颈癌，子宫体癌，睾丸癌，甲状腺癌，肾癌，胆囊癌，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，喉癌，咽癌，食道癌，胃肠道肿瘤(包括胃和结直肠癌)，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌和乳腺癌，优选选自由以下各项组成的组：黑素瘤，前列腺癌，乳腺癌，脑癌(包括神经胶质瘤)，结直肠癌，胃癌，食道癌和卵巢癌，并且最优选为黑素瘤。
38.根据第21-37项中任一项使用的第21-37项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中在施用前，肿瘤或癌症形成的肿瘤具有比同一患者的获自组织(其为癌症来源的组织)的非癌症部分的对照样品更高的人GDF-15水平，优选1.2-倍高水平，更优选1.5-倍高水平，还更优选2-倍高水平，并且最优选5-倍高水平。
39.根据第38项使用的第38项所述的抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分与一种以上其他对癌症有药学活性的成分联合使用，并且其中所述一种以上其他对癌症有药学活性的成分选自由以下各项组成的组：烷化剂；抗-代谢物；生物碱，紫杉烷类；拓扑异构酶抑制剂；细胞毒性抗生素；和放射性同位素。
40.根据第39项使用的第39项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述一种以上其他对癌症有药学活性的成分选自由以下各项组成的组：顺铂，卡铂，奥沙利铂，氮芥，环磷酰胺，苯丁酸氮芥，和异环磷酰胺；硫唑嘌呤和巯基嘌呤；长春新碱，长春花碱，长春瑞滨，和长春地辛，紫杉醇，多西他赛依托泊苷和替尼泊苷；依立替康和托泊替康；放线菌素，蒽环类抗生素，阿霉素，柔红霉素，戊柔比星，伊达比星，表柔比星，博来霉素，光辉霉素和丝裂霉素。
41.试剂盒，其包含第1-19项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
42.第41项所述的试剂盒，其用于根据第21至40项中任一项所述的用途。
43.表达载体，其包含编码根据第1-19项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。
44.细胞系，其能够产生根据第1至19项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
45.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区，其在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。
46.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象的或不连续的表位，其在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。
47.根据第45或46项使用的第45或46项所述的抗体或其抗原结合部分，其中用于治疗癌性恶病质的方法是用于完全预防或完全逆转癌性恶病质的方法。
48.根据第47项使用的第47项所述的抗体或其抗原结合部分，其中用于治疗癌性恶病质的方法是用于完全预防癌性恶病质的方法。
49.根据第47项使用的第47项所述的抗体或其抗原结合部分，其中用于治疗癌性恶病质的方法是用于完全逆转癌性恶病质的方法。
50.根据第45-49项中任一项使用的第45-49项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中在所述方法中，仅治疗患有
i)癌症，和
ii)癌性恶病质
二者的哺乳动物。
51.根据第49-50项中任一项使用的第49-50项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中与其在癌性恶病质发病前的体重相比，所述方法增加哺乳动物的体重。
52.根据第51项使用的第51项所述的抗体或其抗原结合部分，其中与其在癌性恶病质发病前的体重相比，哺乳动物体重的增加是至少1.5％，优选至少2.5％，更优选至少5％。
53.根据第45-52项中任一项使用的第45-52项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述方法是在同一哺乳动物中治疗癌症和治疗癌性恶病质二者的方法。
54.根据第45-53项中任一项使用的第45-53项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有大于100kDa，优选大于110kDa，更优选大于120kDa，还更优选大于130kDa，并且最优选大于140kDa的大小。
55.根据第54项使用的第54项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全长抗体。
56.根据第55项使用的第55项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全长IgG抗体。
57.根据第45至56项中任一项使用的第45至56项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有能够结合Fc受体的Fc部分。
58.根据第45至57项中任一项使用的第45至57项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中哺乳动物的癌细胞内源表达GDF-15和/或哺乳动物的癌细胞刺激哺乳动物的非癌细胞中GDF-15的内源表达。
59.根据第45至58项中任一项使用的第45至58项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中哺乳动物的癌细胞内源表达GDF-15。
60.根据第45至59项中任一项使用的第45至59项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述哺乳动物是人患者。
61.根据第45至60项中任一项使用的第45至60项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述人GDF-15是具有SEQ ID No：8表示的氨基酸序列的重组人GDF-15。
62.根据第46-61项中任一项使用的第46-61项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。
63.根据第45和47-61项中任一项使用的第45和47-61项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象的或不连续的表位。
64.根据第53-63项中任一项使用的第53-63项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗癌症的方法是包括抑制癌生长的方法。
65.根据第53-64项中任一项使用的第53-64项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗癌症的方法包括诱导通过人患者中的NK细胞和CD8+ T细胞杀伤癌细胞。
66.根据第45-65项中任一项使用的第45-65项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ IDNO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区。
67.根据第45-66项中任一项使用的第45-66项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％，优选至少90％，更优选至少95％相同的氨基酸序列。
68.根据第45-67项中任一项使用的第45-67项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列。
69.根据第45-68项中任一项使用的第45-68项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列。
70.根据第45-69项中任一项使用的第45-69项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是人源化抗体，并且其中所述抗体的所有可变结构域是人源化可变结构域。
71.根据第45-70项中任一项使用的第45-70项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：28的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列。
72.根据第45-71项中任一项使用的第45-71项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：28的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列。
73.根据第45-72项中任一项使用的第45-72项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链包含SEQ ID No：27的氨基酸序列，并且其中轻链包含SEQ ID No：30的氨基酸序列。
74.根据第45-69项中任一项使用的第45-69项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列或与其至少75％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列或与其至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％相同的氨基酸序列。
75.根据第74项使用的第74项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列。
76.根据第45-66项中任一项使用的第45-66项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是可获自以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)的细胞系B1-23的针对人GDF-15的抗体或其抗原结合部分。
77.根据第45-75项中任一项使用的第45-75项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，或其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。
78.根据第45-75和77项中任一项使用的第45-75和77项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。
79.根据第45-69和77-78项中任一项使用的第45-69和77-78项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其95％相同的序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其95％相同的序列的区域。
80.根据第45-69和77-79项中任一项使用的第45-69和77-79项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其98％相同的序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其98％相同的序列的区域。
81.根据第45-80项中任一项使用的第45-80项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分具有等于或小于20nM，优选小于10nM，更优选小于5nM和最优选在0.1nM至2 nM之间的对人GDF-15的平衡解离常数。
82.根据第45-75和77-81项中任一项使用的第45-75和77-81项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分结合与可获自以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23的针对人GDF-15的抗体相同的人GDF-15表位。
83.根据第45-82项中任一项使用的第45-82项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中在施用前人患者具有升高的血清GDF-15水平。
84.根据第45-83项中任一项使用的第45-83项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是
A)用于该方法的唯一的对癌症有药学活性的成分，或
B)与一种以上对癌症有药学活性的成分联合使用。
85.根据第45-84项中任一项使用的第45-84项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：脑癌(包括神经胶质瘤)，神经系统癌症，黑素瘤，肺癌，唇和口腔癌，肝癌，白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，膀胱癌，子宫颈癌，子宫体癌，睾丸癌，甲状腺癌，肾癌，胆囊癌，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，喉癌，咽癌，食道癌，胃肠道肿瘤(包括胃和结直肠癌)，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌和乳腺癌，优选选自由以下各项组成的组：黑素瘤，前列腺癌，乳腺癌，脑癌(包括神经胶质瘤)，结直肠癌，胃癌，食道癌和卵巢癌，并且最优选为黑素瘤。
86.根据第45-85项中任一项使用的第45-85项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中在施用前，肿瘤或癌症形成的肿瘤具有比同一患者的获自组织(作为癌症来源的组织)的非癌症部分的对照样品更高的人GDF-15水平，优选1.2-倍高水平，更优选1.5-倍高水平，还更优选2-倍高水平，并且最优选5-倍高水平。
87.根据第84项使用的第84项所述的抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分与一种以上其他对癌症有药学活性的成分联合使用，并且其中所述一种以上其他对癌症有药学活性的成分选自由以下各项组成的组：烷化剂；抗-代谢物；生物碱，紫杉烷类；拓扑异构酶抑制剂；细胞毒性抗生素；和放射性同位素。
88.根据第87项使用的第87项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述一种以上其他对癌症有药学活性的成分选自由以下各项组成的组：顺铂，卡铂，奥沙利铂，氮芥，环磷酰胺，苯丁酸氮芥，和异环磷酰胺；硫唑嘌呤和巯基嘌呤；长春新碱，长春花碱，长春瑞滨，和长春地辛，紫杉醇，多西他赛依托泊苷和替尼泊苷；依立替康和托泊替康；放线菌素，蒽环类抗生素，阿霉素，柔红霉素，戊柔比星，伊达比星，表柔比星，博来霉素，光辉霉素和丝裂霉素。
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WO 2005/099746
WO 2009/021293
序列表
<110> 尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学
<120> 针对生长和分化因子15 (GDF-15)的单克隆抗体及其用于治疗癌症恶病质和癌症的用途
<130> 180484
<150> GB 1405475.3
<151> 2014-03-26
<150> GB 1405477.9
<151> 2014-03-26
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 1
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Pro Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys
<210> 2
<211> 88
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
85
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 3
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Gln Asn Val Gly Thr Asn
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 7
Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 8
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组成熟人GDF-15蛋白
<400> 8
Gly Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys
1 5 10 15
Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala
20 25 30
Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly
35 40 45
Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys
50 55 60
Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr
85 90 95
Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His
100 105 110
Cys Ile
<210> 9
<211> 308
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu
20 25 30
Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser
35 40 45
Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu
50 55 60
Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu
65 70 75 80
Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly
85 90 95
Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu
100 105 110
Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser
115 120 125
Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln
130 135 140
Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala
165 170 175
Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg
180 185 190
Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly
195 200 205
Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly
210 215 220
Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys
225 230 235 240
Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln
245 250 255
Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro
260 265 270
Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr
275 280 285
Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Ile
305
<210> 10
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人GDF-15前体蛋白 + N-末端和C-末端GSGS接头
<400> 10
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val
1 5 10 15
Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro
20 25 30
His Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro
35 40 45
Gly Pro Ser Glu Leu His Ser Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg
50 55 60
Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp
65 70 75 80
Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu
85 90 95
Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile
100 105 110
Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His
115 120 125
Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val
130 135 140
Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro
145 150 155 160
Ala Leu His Leu Arg Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu
165 170 175
Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg
180 185 190
Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp
195 200 205
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
210 215 220
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
245 250 255
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
260 265 270
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
275 280 285
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
290 295 300
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile Gly Ser Gly Ser Gly
305 310 315 320
Ser Gly
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Flag肽
<400> 11
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA肽
<400> 12
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人GDF-15的肽
<400> 13
Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人GDF-15的肽
<400> 14
Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人GDF-15的肽
<400> 15
His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人GDF-15的肽
<400> 16
Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人GDF-15的肽
<400> 17
Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人GDF-15的肽
<400> 18
Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人GDF-15的肽
<400> 19
Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人GDF-15的肽
<400> 20
Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
1 5 10
<210> 21
<211> 291
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 21
caagtgaagc tgcagcagtc aggccctggg atattgcagt cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagt acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120
cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180
tataacccaa ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atccctccag aaaccaggta 240
ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg t 291
<210> 22
<211> 264
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 22
gacattgtgc tcacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtgg cctggtttct acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaagcact tatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgt 264
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 23
gctcgaagtt cctacggggc aatggactac 30
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 24
cagcaatata acaactttcc gtacacg 27
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
1 5 10 15
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
1 5 10 15
Asp Cys His Cys Ile
20
<210> 27
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1L5人源化B1-23抗-GDF-15抗体的重链的氨基酸序列
<400> 27
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Pro Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1L5人源化B1-23 抗-GDF-15抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
<400> 28
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Pro Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1L5人源化B1-23 抗-GDF-15抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1L5人源化B1-23 抗-GDF-15抗体的轻链的氨基酸序列
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1L5人源化B1-23 抗-GDF-15抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列
<400> 31
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 32
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1L5人源化B1-23 抗-GDF-15抗体的轻链恒定结构域的氨基酸序列
<400> 32
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
20 25 30
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
35 40 45
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
65 70 75 80
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
85 90 95
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100
<210> 33
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合B1-23 抗-GDF-15抗体的重链的氨基酸序列
<400> 33
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Pro Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合B1-23 抗-GDF-15抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
<400> 34
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Pro Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合B1-23 抗-GDF-15抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合B1-23 抗-GDF-15抗体的轻链的氨基酸序列
<400> 36
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合B1-23 抗-GDF-15抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列
<400> 37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
<210> 38
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合B1-23 抗-GDF-15抗体的轻链恒定结构域的氨基酸序列
<400> 38
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
20 25 30
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
35 40 45
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
65 70 75 80
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
85 90 95
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100

Claims (60)

1.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
2.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ IDNo：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包括的人GDF-15上的构象的或不连续的表位，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列。
4.权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列。
6.权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是人源化抗体。
7.权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分，其中抗体的所有可变结构域是人源化可变结构域。
8.权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变结构域包含SEQ ID No：28的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列。
9.权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQID No：28的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列。
10.权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链包含SEQ ID No：27的氨基酸序列，并且其中轻链包含SEQ ID No：30的氨基酸序列。
11.权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列或与其至少75％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列或与其至少80％的，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％相同的氨基酸序列。
12.权利要求11所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列。
13.权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区。
14.权利要求2-13中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。
15.权利要求1和3-13中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象的或不连续的表位。
16.权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有大于100kDa，优选大于110kDa，更优选大于120kDa，还更优选大于130kDa，和最优选大于140kDa的大小。
17.权利要求16所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全长抗体。
18.权利要求17所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全长IgG抗体，优选全长IgG1抗体。
19.权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有能够结合Fc受体的Fc部分。
20.权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中人GDF-15是具有SEQID No：8表示的氨基酸序列的重组人GDF-15。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分用于医疗。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。
23.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分在用于治疗哺乳动物中癌症的方法中使用。
24.根据权利要求22至23中任一项使用的根据权利要求22至23中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述方法是在同一哺乳动物中治疗癌症和治疗癌性恶病质二者的方法。
25.根据权利要求22至24中任一项使用的权利要求22至24中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述哺乳动物是人患者。
26.试剂盒，其包含权利要求1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
27.表达载体，其包含编码根据权利要求1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。
28.细胞系，其能够生产根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
29.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区，所述单克隆抗体或其抗原结合部分在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。
30.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ IDNo：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象的或不连续的表位，所述单克隆抗体或其抗原结合部分在用于治疗哺乳动物中的癌性恶病质的方法中使用。
31.根据权利要求29或30使用的权利要求29或30所述的抗体或其抗原结合部分，其中用于治疗癌性恶病质的方法是完全预防或完全逆转癌性恶病质的方法。
32.根据权利要求31使用的权利要求31所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗癌性恶病质的方法是完全预防癌性恶病质的方法。
33.根据权利要求31使用的权利要求31所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗癌性恶病质的方法是完全逆转癌性恶病质的方法。
34.根据权利要求29-33中任一项使用的权利要求29-33中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中在所述方法中，仅治疗患有
i)癌症，和
ii)癌性恶病质
二者的哺乳动物。
35.根据权利要求33-34中任一项使用的权利要求33-34中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中与哺乳动物在癌性恶病质发病前的体重相比，所述方法增加所述哺乳动物的体重。
36.根据权利要求35使用的权利要求35所述的抗体或其抗原结合部分，其中与哺乳动物在癌性恶病质发病前的体重相比，所述哺乳动物体重增加至少1.5％，优选至少2.5％，更优选至少5％。
37.根据权利要求29-36中任一项使用的权利要求29-36中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述方法是在同一哺乳动物中治疗癌症和治疗癌性恶病质二者的方法。
38.根据权利要求29-37中任一项使用的权利要求29-37中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有大于100kDa，优选大于110kDa，更优选大于120kDa，还更优选大于130kDa，并且最优选大于140kDa的大小。
39.根据权利要求38使用的权利要求38所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全长抗体。
40.根据权利要求39使用的权利要求39所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全长IgG抗体。
41.根据权利要求29至40中任一项使用的权利要求29至40中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有能够结合Fc受体的Fc部分。
42.根据权利要求29至41中任一项所述的权利要求29至41中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述哺乳动物的癌细胞内源性表达GDF-15和/或所述哺乳动物的癌细胞刺激所述哺乳动物的非癌细胞中GDF-15的内源表达。
43.根据权利要求29至42中任一项使用的权利要求29至42中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述哺乳动物的癌细胞内源性表达GDF-15。
44.根据权利要求29至43中任一项使用的权利要求29至43中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述哺乳动物是人患者。
45.根据权利要求29至44中任一项使用的权利要求29至44中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述人GDF-15是具有SEQ ID No：8表示的氨基酸序列的重组人GDF-15。
46.根据权利要求30-45中任一项使用的权利要求30-45中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。
47.根据权利要求29和31-45中任一项使用的权利要求29和31-45中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象的或不连续的表位。
48.根据权利要求37-47中任一项使用的权利要求37-47中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗癌症的方法是包括抑制癌生长的方法。
49.根据权利要求37-48中任一项使用的权利要求37-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗癌症的方法包括在人患者中诱导通过NK细胞和CD8+T细胞杀伤癌细胞。
50.根据权利要求29-49中任一项使用的权利要求29-49中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQID NO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区。
51.根据权利要求29-50中任一项使用的权利要求29-50中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列。
52.根据权利要求29-51中任一项使用的权利要求29-51中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列或与其至少98％、优选至少99％相同的氨基酸序列。
53.根据权利要求29-52中任一项使用的权利要求29-52中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定结构域包含SEQ ID No：29的氨基酸序列，并且其中轻链恒定结构域包含SEQ ID No：32的氨基酸序列。
54.根据权利要求29-53中任一项使用的权利要求29-53中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是人源化抗体，并且其中所述抗体的所有可变结构域是人源化可变结构域。
55.根据权利要求29-54中任一项使用的权利要求29-54中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：28的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列或与其至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列。
56.根据权利要求29-55中任一项使用的权利要求29-55中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：28的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：31的氨基酸序列。
57.根据权利要求29-56中任一项使用的权利要求29-56中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链包含SEQ ID No：27的氨基酸序列，并且其中轻链包含SEQ ID No：30的氨基酸序列。
58.根据权利要求29-53中任一项使用的权利要求29-53中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列或与其至少75％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列或与其至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％、还更优选至少99％相同的氨基酸序列。
59.根据权利要求58使用的权利要求58所述的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含SEQ ID No：34的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域包含SEQ ID No：37的氨基酸序列。
60.根据权利要求29-50中任一项使用的权利要求29-50中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是从以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23可获得的针对人GDF-15的抗体或其抗原结合部分。
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