JP7270522B2 - 増殖分化因子15(gdf-15)に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、新規なモノクローナル抗ヒトGDF-15抗体、医薬組成物、キット、方法および使用、および本明細書に記載のモノクローナル抗を産生することができる細胞株に関する。本発明はさらに、癌の増殖を阻害することができる、ヒトGDF-15に対する新規な抗体に関する。
今日まで、多くの癌は医療ニーズがまだ満たされていない領域であり、したがって、より効果的に癌の増殖を阻害しより広範囲の癌の増殖を阻害する手段が、必要とされている。
多くの種類の癌は、VEGF、PDGF、TGF-βおよびGDF-15等の因子を含む増殖因子を発現することが知られている。
GDF-15は、免疫組織化学での評価によれば、異なるWHOグレードの神経膠腫において発現される(Roth et al., Clin. Cancer Res. 2010)。さらに、Rothらは、SMA560神経膠腫細胞において、内因性GDF-15を標的とする短いヘアピンRNAを発現するDNA構築物、または対照構築物を、安定的に発現した。これらの事前に確立された安定な細胞株を使用して、彼らは、GDF-15ノックダウンSMA560細胞を有するマウスにおける腫瘍形成が、対照構築物を有するマウスに比べて遅延されたことを観察した。
したがって今日まで、癌の増殖を効果的に阻害するための手段、およびより広範囲の癌の増殖を阻害するための手段の必要性が、当技術分野において依然として存在した。
本発明の目的はしたがって、癌の増殖を効果的に阻害するための手段、およびより広範囲の癌の増殖を阻害するために使用できる手段を得ることである。
さらに、当技術分野で知られている治療用抗体とは対照的に、本発明によるヒトGDF-15に対する抗体は、組換えGDF-15に対して約790pMという平衡解離定数を、追加の親和性成熟なしで有し、これは、多くの既知の治療抗体よりも高い親和性である。
したがって、本発明によるヒトGDF-15に対する抗体は、当技術分野で知られている抗体と比較して優れた特性を有し、癌の増殖を阻害するために特に有用である。こうして、本発明が完成された。
本発明は、上記の目的を、モノクローナル抗体、医薬組成物、キット、使用および本明細書に記載のモノクローナル抗体を産生することができる細胞株を提供することにより、解決する。
特に、本発明者らは驚くべきことに、本発明によるヒトGDF-15に対する新規なモノクローナル抗体およびその抗原結合部分が、癌の増殖を阻害できることを示している。これは予想外のことであり、何故ならば、当分野で従来から知られていたGDF-15に対するこれらのモノクローナル抗体(WO 2005/099746、WO 2009/021293およびJohnen H et al., Nature Medicine, 2007)は、癌誘発性体重減少の逆転をもたらすこと(すなわち、癌により発現されるGDF-15によって誘発される二次的症状の逆転)が知られているが、しかしこれらは癌の増殖の阻害には失敗したことが示されているからである。
したがって、本発明は、ヒトGDF-15に結合可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで、重鎖可変ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列またはこれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列またはこれと少なくとも85%同一のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む。
さらに本発明は、哺乳動物における癌を処置する方法において使用するための、本発明による抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物に関し、該方法は、該抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物を、前記哺乳動物に投与することを含む。
さらに、本発明は、本発明による医薬組成物を含むキットに関する。
さらに、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合部分を産生可能な細胞株に関する。
したがって、ヒトGDF-15に対する新規なモノクローナル抗体を提供することによって、本発明は、当技術分野における上記に定義された要求を満たす、新規な癌増殖阻害剤を提供する。
図2:卵巣癌細胞株SK-OV-3におけるAktリン酸化。卵巣癌細胞株SK-OV-3に対するウエスタンブロットを定量するために、リン酸化AktのAkt総量に対する比率を算出し、未処理の対照に対して正規化した。
図4:in vivoでのB1-23の抗腫瘍効果。Balb/cNU/NUヌードマウスを、黒色腫細胞株UACC-257を用いた異種移植片の設定で使用した。B1-23(白四角)で処置した動物のコホートの腫瘍サイズは、PBS対照群(黒丸)と比較して、有意に減少した。Wilcoxonのログランク検定での評価のように、有意性はp<0.05として定義した。
以下に特に定義しない限り、本発明において使用される用語は、当業者に知られているそれらの一般的な意味に従って理解されるべきである。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、目的の抗原に特異的に結合可能な任意の機能的抗体を意味し、これはPaul, W.E. (Ed.).: Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989の第7章に一般的に概説されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。特に限定することなく、「抗体」という用語は、ニワトリならびにマウス、ヤギ、非ヒト霊長類およびヒトなどの哺乳動物を含む任意の適切なソースの種からの抗体を包含する。好ましくは、抗体はヒト化抗体である。抗体は、好ましくは、当技術分野でよく知られた方法によって調製することができる、モノクローナル抗体である。「抗体」という用語は、IgG-1、-2、-3、または-4、IgE、IgA、IgM、またはIgDのアイソタイプの抗体を包含する。「抗体」という用語は、単量体抗体(例えばIgD、IgE、IgGなど)、またはオリゴマー抗体(例えばIgAまたはIgMなど)を包含する。「抗体」という用語はまた、特に限定することなく、単離された抗体および改変抗体、例えばキメラ抗体などの遺伝的に操作された抗体も包含する。
本明細書で使用する用語「エピトープ」は、抗体のための結合部位を形成する、抗原の小さな部分を指す。
本発明の文脈において、抗体またはその抗原結合部分の、目的の抗原(例えば、ヒトGDF-15)への結合または競合的結合は、以下に記載するように、表面プラズモン共鳴測定を参照標準アッセイとして用いて測定される。
本明細書で使用する用語「上昇GDF-15レベル」とは、ヒト患者が、本発明の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物の投与前に、参照としての健康なヒト対照個体の血液血清中のGDF-15レベルの中央値と比べて、より高い血清中のGDF-15レベルを有することを意味する。
好ましくは、レベルは1.2倍高く、より好ましくは1.5倍高く、さらに好ましくは2倍高く、最も好ましくは5倍高い。
本明細書で使用される「投与前」という用語は、本発明の抗体、その断片または医薬組成物の投与の直前の時間を意味する。好ましくは、「投与前に」という用語は、投与直前の30日の期間を、最も好ましくは、投与直前の1週間の期間を意味する。
用語「癌」および「癌細胞」は、本明細書において、当技術分野におけるそれらの一般的な意味に従って使用される(例えば、Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: New York 2006. 850pを参照)。
本発明によれば、「含む」という用語の各出現は、任意に、用語「からなる」で置換されてもよい。
一般的に、本明細書において別に定義されない限り、本発明で使用される方法(例えば、クローニング法または抗体に関連する方法)は、当分野で知られている手順に従って、例えばSambrook et al.(“Molecular Cloning: A Laboratory Manual.”, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989)、Ausubel et al.(“Current Protocols in Molecular Biology.” Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992)、および Harlow and Lane(“Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988)に記載の手順などにしたがって行われる;これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明による配列の配列アラインメントは、BLASTアルゴリズムを用いて行われる(Altschul et al.(1990) “Basic local alignment search tool.” Journal of Molecular Biology 215. p. 403-410;Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402を参照)。好ましくは、以下のパラメータが使用される:最大標的配列10;ワードサイズ3; BLOSUM 62マトリクス;ギャップコスト:存在11、延長1;条件付きの組成スコアマトリックス調整。したがって、配列に関連して使用される場合は、例えば、「同一性」または「同一の」などの用語は、BLASTアルゴリズムを用いて得られた識別値を指す。
上述したように、本発明者らは、ヒトGDF-15タンパク質が、癌の増殖が阻害されるような様式で、本発明の抗体によって標的化され得ることを示している。
これは、癌誘発性の体重減少のみが抗GDF-15抗体によって逆転させ得ること、および癌の増殖が阻害できないとの教示(WO 2005/099746、WO 2009/021293およびJohnen H et al., Nature Medicine, 2007)の観点から、驚くべき発見である。
本発明の抗体の以下の特性は、癌増殖阻害を含む、ヒトGDF-15の効果をより完全に阻害するそれらの能力に貢献することが、期待される。
本発明の抗体は、成熟組換えヒトGDF-15(配列番号8によって表される)に結合することができ、したがって活性で完全にプロセシングされた(成熟)ヒトGDF-15に結合することができる。
さらに、ヒト細胞に対する本発明のmAb-B1-23抗体で染色実験を行うことにより、本発明者らは、本発明によるmAb-B1-23抗体が、ヒト細胞上でヒトGDF-15前駆体に結合可能であることを示す。
したがって、本発明の抗体の結合および効果(癌増殖の阻害など)は、ヒトGDF-15の特定の形態への効果に限定されないことが予想される。
本発明による抗体およびその抗原結合部分は高い結合親和性を有し、これは、組換えヒトGDF-15に対して約790pMの平衡解離定数を有する、本発明によるmAb-B1-23抗体によって実証される。特に、かかる親和性の値は、多くの既存の治療用抗体、例えば約8nMの平衡解離定数を有する治療用抗体リツキシマブよりも優れている。
高い結合親和性は、本発明によるヒトGDF-15に対する抗体が、ヒトGDF-15に安定して結合することを確実にして、癌の増殖に対する効果を含むヒトGDF-15の効果が、効果的に阻害されるようにするであろう。
本発明の抗体およびその抗原結合部分は、本発明のmAb-B1-23抗体について以下に実証するように、不連続または立体構造エピトープに結合する。
本発明の抗体およびその抗原結合部分の、不連続または立体構造GDF-15エピトープへの結合は、ヒトGDF-15を特定の構造に維持するのに役立ち得て、それによって、癌増殖に対する効果を含むヒトGDF-15の効果を、効果的に阻害することに貢献する。
A)抗体、ベクターおよび細胞株
具体的には、本発明は、ヒトGDF-15に結合可能なモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって、重鎖可変ドメインが、配列番号5のアミノ酸配列またはこれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号7のアミノ酸配列またはこれと少なくとも85%同一のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、前記抗体またはその抗原結合部分に関する。
上記態様による第3の態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含み、および、軽鎖可変ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む。
上記態様によるさらにより好ましい態様において、重鎖可変ドメインは、FR1、CDR1、FR2、CDR2およびFR3領域を含みかつ配列番号1のアミノ酸配列を含む、領域を含み、および軽鎖可変ドメインは、FR1、CDR1、FR2、CDR2およびFR3領域を含みかつ配列番号2のアミノ酸配列を含む、領域を含む。
別の態様において、本発明は、ヒトGDF-15に結合可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、抗体またはその抗原結合部分が、哺乳動物、好ましくはヒト患者における癌の増殖を阻害することができる、前記抗体またはその抗原結合部分に関する。
本発明の別の態様において、ヒトGDF-15に結合可能な抗体またはその抗原結合部分は、ドイツ微生物細胞培養コレクション(DMSZ)に寄託番号DSM ACC3142として寄託された細胞株B1-23から得られるヒトGDF-15に対する抗体と同一の、ヒトGDF-15エピトープに結合する。本明細書に記載するように、本発明によるヒトGDF-15に結合する抗体は、実施例1に記載した手順に従って、参照標準法として表面プラズモン共鳴測定によって評価される。ヒトGDF-15上の同一エピトープへの結合は、細胞株B1-23から得られるヒトGDF-15に対する抗体と、細胞株B1-23から得られるヒトGDF-15に対する抗体と同一のヒトGDF-15エピトープに結合することが予測される抗体の、表面プラズモン共鳴の競合的結合実験によって、同様に評価することができる。
好ましい態様において、本発明によるヒトGDF-15に結合可能な抗体またはその抗原結合部分は、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。本発明に従った任意の非ヒト抗体配列(すなわち、ドナー抗体配列)に対して、本発明のヒト化モノクローナル抗ヒトGDF-15抗体またはその抗原結合部分は、上記のように当分野で知られた技術に従って生成することができる。
上記態様による別の好ましい態様において、ヒトGDF-15は、配列番号8で表されるアミノ酸配列を有する組換えヒトGDF-15である。
上記態様によるさらに別の好ましい態様において、ヒトGDF-15に結合可能な抗体またはその抗原結合部分の結合は、ヒトGDF-15上の立体構造エピトープまたは不連続エピトープへの結合である。
本発明はまた、上記で定義された抗体またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
さらに、本発明はまた、本発明による抗体またはその抗原結合部分を産生可能な細胞株を提供する。
好ましい態様において、細胞株は、ドイツ微生物細胞培養コレクション(DMSZ)に寄託番号DSM ACC3142として寄託された細胞株B1-23である。
別の好ましい態様において、細胞株は上記で定義された本発明の発現ベクターを含む。
さらなる態様において、本発明は、上記で定義された抗体またはその抗原結合部分のいずれかを含む、医薬組成物に関する。
本発明による医薬組成物は、抗体およびその部分を含む医薬組成物の調製のための既知の標準に従って調製される。
例えば、組成物は、担体、賦形剤または安定剤などの薬学的に許容し得る成分を用いることなどによって、適切に保管および投与できるような方法で、調製される。
一般に、本発明に関連して使用される薬学的に許容し得る成分は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USAからの、当技術分野で利用可能な知識に従って使用される。
本発明はさらに、哺乳動物において癌を処置するための方法であって、上記で定義された抗体もしくはその抗原結合部分、または上記で定義された医薬組成物を、前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法に関する。代替的に、本発明は、これらの方法において用いるための、上記で定義された抗体もしくはその抗原結合部分、または上記で定義された医薬組成物に関する。これらの態様の非常に好ましい側面において、哺乳動物はヒト患者である。
本発明による癌を処置するための全方法では、WO 2005/099746、WO 2009/021293およびJohnen H et al., Nature Medicine, 2007に記載された、癌誘発性の体重減少の処置を除外する。これは、これらの技術の教示によれば抗GDF-15抗体によって癌誘発性の体重減少のみを逆転することができて、癌の増殖を阻害することはできないという事実を反映する。
本発明による癌増殖の阻害は、追加のまたは二次的治療利益が患者に生じることを除外するものではない。例えば、追加のまたは二次的利益は、癌誘発性の体重減少への影響であってよい。しかし、防御が求められているところの一次処置は癌増殖の阻害であることが理解され、任意の二次的または追加的な効果は、癌増殖の処置の、任意の付加的な利点を反映しているだけである。
上記の方法、またはこれらの方法で使用するための抗体、その抗原結合部分もしくは医薬組成物の代替的態様において、抗体またはその抗原結合部分は、癌に対して薬学的に活性な1種または2種以上のさらなる成分と組み合わせて使用される。この態様の一側面において、癌に対して薬学的に活性な1種または2種以上のさらなる成分は、上記で定義されたように、既知の抗癌剤および/または免疫刺激分子である。
上記の方法、またはこれらの方法で使用するための抗体、その抗原結合部分もしくは医薬組成物の好ましい態様において、本方法は、ヒト患者におけるNK細胞およびCD8+T細胞による癌細胞の死滅の誘導を含む。GDF-15媒介性の既知の免疫学的監視レギュレータNKG2Dの下方制御を妨害するそれらの能力により、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、免疫系とは独立した抗体またはその抗原結合部分の効果に加えて、免疫学的監視を回復し、NK細胞およびCD8+T細胞による癌細胞の死滅を誘導することが期待されている、
本発明はまた、上記で定義された医薬組成物を含むキットを提供する。
一態様において、キットは、上記で定義された本発明の方法で使用するためのキットである。
さらなる態様において、本発明はまた、本発明による抗体またはその抗原結合部分のいずれかを含む、診断キットを提供する。
別の態様において、診断キットは、ヒト癌患者が血清中の上昇GDF-15レベルを有するかどうかを検出するために使用することができる。
本出願で言及されるアミノ酸配列は以下である(N末端からC末端への順序;一文字のアミノ酸コードにより表される):
配列番号1(モノクローナル抗ヒトGDF-15 mAb-B1-23のポリペプチド配列からの、FR1、CDR1、FR2、CDR2およびFR3領域を含む重鎖可変ドメインの領域):
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYC
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC
配列番号3(モノクローナル抗ヒトGDF-15 mAb-B1-23の重鎖CDR1領域ペプチド配列):
GFSLSTSGMG
配列番号4(モノクローナル抗ヒトGDF-15 mAb-B1-23の重鎖CDR2領域ペプチド配列):
IYWDDDK
ARSSYGAMDY
配列番号6(モノクローナル抗ヒトGDF-15 mAb-B1-23の軽鎖CDR1領域ペプチド配列):
QNVGTN
SAS
配列番号7(モノクローナル抗ヒトGDF-15 mAb-B1-23の軽鎖CDR3領域ペプチド配列):
QQYNNFPYT
配列番号8(組換え成熟ヒトGDF-15タンパク質):
GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号10(ヒトGDF-15前駆体タンパク質+N末端およびC末端GSGSリンカー):
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG
配列番号12(HAペプチド):YPYDVPDYAG
配列番号13(ヒトGDF-15由来ペプチド):
ELHLRPQAARGRR
配列番号14(ヒトGDF-15由来ペプチド):
LHLRPQAARGRRR
配列番号15(ヒトGDF-15由来ペプチド):
HLRPQAARGRRRA
配列番号16(ヒトGDF-15由来ペプチド):
LRPQAARGRRRAR
RPQAARGRRRARA
配列番号18(ヒトGDF-15由来ペプチド):
PQAARGRRRARAR
配列番号19(ヒトGDF-15由来ペプチド):
QAARGRRRARARN
配列番号20(ヒトGDF-15由来ペプチド):
MHAQIKTSLHRLK
配列番号25(B1-23に結合するGDF-15エピトープの部分を含むGDF-15ペプチド):
EVQVTMCIGACPSQFR
TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
本出願で言及される核酸配列は以下である(5’末端から3’末端への順序;標準の核酸コードにより表される):
配列番号21(配列番号1で定義されたアミノ酸配列をコードするDNAヌクレオチド配列):
CAAGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGTACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATCCCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGT
GACATTGTGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTTATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGT
配列番号23(配列番号5で定義されたアミノ酸配列をコードするDNAヌクレオチド配列):
GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC
配列番号24(配列番号7で定義されたアミノ酸配列をコードするDNAヌクレオチド配列):
CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG
本発明を、以下の非限定的な実施例によって例示する。
例1:GDF-15抗体B1-23の生成および特性評価
抗体B1-23を、GDF-15ノックアウトマウスで生成した。組換えヒトGDF-15(配列番号:8)を免疫原として使用した。
mAb-B1-23を産生するハイブリドーマ細胞株B1-23を、ブダペスト条約に従って、ドイツ微生物細胞培養コレクション(DMSZ)に寄託番号DSM ACC3142として寄託した。
本発明によるモノクローナル抗ヒトGDF-15抗体、抗ヒトGDF-15 mAb-B1-23の結合は、Biorad ProteOn XPR36システムおよびBiorad GLCセンサーチップを用いた表面プラズモン共鳴測定を使用して測定した。
GSARNGDHCP LGPGRCCRLH TVRASLEDLG WADWVLSPRE VQVTMCIGAC PSQFRAANMH AQIKTSLHRL KPDTVPAPCC VPASYNPMVL IQKTDTGVSL QTYDDLLAKD CHCI
(配列番号8)
このように、表面プラズモン共鳴測定を使用して、790pMの解離定数(Kd)を決定した。比較として:治療的に使用する抗体リツキシマブは、有意に低い親和性を有する(Kd=8nM)。
a)NK細胞およびCD8+T細胞上で発現されるNKG2D(ナチュラルキラーグループ2D)受容体は、腫瘍に対する免疫学的監視において重要な役割を果たすことが知られている。形質転換およびウイルス感染細胞はリガンドを発現し、これはNKG2D受容体に結合して、記載された免疫細胞の細胞傷害性エフェクター機能を活性化させる。こうして、形質転換された細胞を検出して、免疫系によって排除することができる。免疫細胞を、組換えヒトGDF-15または腫瘍細胞分泌のGDF-15のいずれかでin vitroで72時間処理した後、リンパ球の細胞表面上のNKG2Dの発現レベルは、下方制御された(図1)。72時間のインキュベーション後、免疫細胞を以下のFACS抗体で染色した:抗CD3、抗CD56、抗NKG2D。この抗体の組合せを使用して、実験は、NK細胞およびそれらのNKG2D表面発現に焦点を当てた。免疫細胞上の低いNKG2Dレベルは、腫瘍/標的細胞の溶解の障害をもたらした。GDF-15媒介性のNKG2Dの下方制御は、mAB B1-23によって防止された。
c)免疫細胞の、組換えGDF-15による処置は、サイトカインまたはストレスのいずれかによって活性化されるところの、キナーゼであるJNKのリン酸化をもたらした。10ng/mlのGDF-15の、2μgのmAb-B1-23による拮抗(37℃での5分間のプレインキュベーション)は、GDF-15媒介性のJNK1/2リン酸化をブロックした(図3)。
B1-23が生成したデータは、抗体の、in vitroでの癌細胞に対する抗増殖効果を示した。最も強力な抗増殖効果は、多くのGDF-15を生成する前立腺癌細胞株LnCaPを用いて観察された。代謝アッセイ(アラマーブルーアッセイ)は、mAb-B1-23が存在する場合に、抗体が適用されない対照群と比べて、72時間後に30%の増殖の減少を示した。抗体の細胞傷害性効果は異なるアッセイで除外されているため、この効果は、GDF-15の遮断後の、細胞分裂速度の顕著な減少を証明する。
1つの実験の試験セットアップでは、腫瘍増殖は、免疫不全NMRIマウスにおけるSK-Mel28ヒト黒色腫細胞モデルで研究されている。7.5×106個の黒色腫細胞を各マウスの皮下に移植する。接種後23日目に(すなわち、悪性新生物(malignoma)の指数増殖期の間)、mAb B1-23抗体を初めて投与する。mAb B1-23を注射した後(30mg/体重kg、i.p.)、mAb B1-23処置マウスにおいてはさらなる腫瘍の増殖は1週間観察されず、一方で陰性対照試料中の腫瘍は増殖を続ける。
この実施例は、本発明のmAb B1-23抗体が、ヒト細胞由来の腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖を阻害することを実証する。
本実施例では、免疫不全マウスを使用している。したがって、本発明の抗体は、無傷の免疫系とは独立した方法で、癌の増殖を阻害することができると結論される。
代替の実験的研究の設定において、以下のin vivo試験を行った。
注射前に、UACC-257黒色腫細胞は、全ての汚染を除去した完全培地中で増殖させた。細胞は、細胞培養フラスコ中で70~80%のコンフルエンスに到達したときに回収した。次いで細胞をPBSで洗浄し、計測した。1×107の生存細胞をPBSに懸濁させた。
B1-23(25mg/体重kg)または同量のPBSのいずれかの腹腔内(i.p.)注射は、腫瘍細胞接種の直後(1日目とする)に開始し、週2回投与した。腫瘍は48日間増殖させた。腫瘍の直径をノギスで測定し、mm3での腫瘍体積は、以下の式によって算出した。
体積=(幅)2×長さ/2
図に示すように、B1-23で処置した動物コホートの腫瘍サイズは、PBS対照群と比較して、有意に減少した。
例5:mAb B1-23はヒトGDF-15の立体構造エピトープまたは不連続エピトープを認識する
エピトープマッピング:GDF-15由来の13量体直鎖ペプチドに対する、モノクローナルマウス抗体GDF-15
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG(リンカー付き322アミノ酸)(配列番号10)
タンパク質配列は、1つのアミノ酸のシフトを有する13量体ペプチドに翻訳された。C末端およびN末端をニュートラルGSGSリンカーにより伸長して、切り詰められたペプチドを回避した(太字)。
Flag:DYKDDDDKGG(配列番号13)、78スポット;HA:YPYDVPDYAG(配列番号14)、78スポット(各アレイコピー)
ペプチドチップ識別子:
000264_01(10/90、Ala2Aspリンカ-)
染色条件:
標準緩衝液:PBS、pH7.4+0.05%Tween 20
ブロッキング緩衝液:Rocklandブロッキング緩衝液MB-070
インキュベーション緩衝液:標準緩衝液と10%のRocklandブロッキング緩衝液MB-070
一次試料:モノクローナルマウス抗体GDF-15(1μg/μl):1:100の希釈で、500rpmでわずかに振盪しつつ、インキュベーション緩衝液中4℃で16時間染色
二次抗体:ヤギ抗マウスIgG(H+L)IRDye680、1:5000の希釈で、インキュベーション緩衝液中室温(RT)で30分間染色
対照抗体:モノクローナル抗HA(12CA5)-LL-Atto 680(1:1000)、モノクローナル抗FLAG(M2)-FluoProbes752(1:1000);インキュベーション緩衝液中RTで1時間染色。
Odyssey Imaging System, LI-COR Biosciences
セッティング:オフセット:1mm;解像度:21μm。赤/緑の強度:7/7
結果:
30分間の標準的な緩衝液および30分間のブロッキング緩衝液における予備膨潤の後、10、12、および15量体B7H3由来の直鎖ペプチドを有するペプチドアレイを、1:5000希釈の二次ヤギ抗マウスIgG(H + L)IRDye680抗体と共に室温で1時間インキュベートして、二次抗体のバックグラウンドの相互作用を分析した。PEPperCHIP(登録商標)は、標準緩衝液で2×1分間洗浄し、蒸留水ですすぎ、空気流中で乾燥させた。Odyssey Imaging Systemを用いて21μmの解像度および7/7の緑/赤の強度でリードアウトを行った:frequent binderとして知られている、アルギニンリッチペプチド(ELHLRPQAARGRR(配列番号15)、LHLRPQAARGRRR(配列番号16)、HLRPQAARGRRRA(配列番号17)、LRPQAARGRRRAR(配列番号18)、RPQAARGRRRARA(配列番号19)、PQAARGRRRARAR(配列番号20)およびQAARGRRRARARN(配列番号21))と、塩基性ペプチドMHAQIKTSLHRLK(配列番号22)との、荷電抗体染料とのイオン相互作用による、弱い相互作用が観察された。
GDF-15由来の直線状の13量体ペプチドのいずれもが、過剰制御された強度であっても、モノクローナルマウス抗体GDF-15と相互作用しないことが示された。しかしアレイをフレームするFlagおよびHA対照ペプチドの染色は、良好かつ均一なスポット強度を生じさせた。
GDF-15に対するモノクローナルマウスGDF-15抗体のエピトープマッピングにより、抗原由来の13量体ペプチドを持ついかなる線形エピトープも明らかにならなかった。この所見によれば、モノクローナルマウス抗体GDF-15は、部分的エピトープの低親和性立体構造エピトープまたは不連続エピトープを認識する可能性が、非常に高い。二次抗体のみによる、背景染色を超える任意のGDF-15シグナルの明らかな欠如のため、PepSlide(登録商標)アナライザによるスポット強度の定量化およびその後のペプチド注釈(annotation)は省略した。
抗体B1-23に結合する組換えヒトGDF-15のエピトープを、エピトープ切除法およびエピトープ抽出法によって同定した(Suckau et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 December; 87(24): 9848-9852.; R.Stefanescu et al., Eur.J.Mass Spectrom. 13, 69-75 (2007))。
抗体カラムの調製のために、抗体B1-23を、セファロースに結合したNHS活性化6-アミノヘキサン酸に添加した。セファロース結合抗体B1-23を次に0.8mlのマイクロカラムに装填し、ブロッキング緩衝液および洗浄緩衝液で洗浄した。
組換えヒトGDF-15を、トリプシンで、37℃で2時間消化し(溶液中)、タンパク質中のトリプシン切断部位に応じて、異なるペプチドを得た。完全消化した後、ペプチドを、固定化抗体B1-23を含むアフィニティカラムにロードした。GDF-15の未結合ペプチドおよび潜在的に結合したペプチドを、質量分析のために使用した。質量分析法によるペプチドの同定は不可能であった。これは、免疫複合体B1-23におけるGDF-15の結合領域が不連続または立体構造エピトープを含むことを、さらに指示した。連続した線形エピトープの場合、消化されたペプチドは、エピトープペプチドにトリプシン切断部位が存在する場合を除いて、その相互作用パートナーに結合するはずである。不連続または立体構造エピトープは、以下に記載のエピトープ切除法により確認することができた。
アフィニティカラム上の固定化抗体B1-23は、その後、組換えGDF-15で2時間インキュベートした。アフィニティカラム上で形成された免疫複合体を次に、トリプシンを用いて37℃で2時間インキュベートした。切断により、組換えGDF-15由来の異なるペプチドがもたらされた。固定化抗体自体は、タンパク質分解的に安定である。抗体によって遮蔽され、したがってタンパク質分解的切断から保護された、消化されたGDF-15タンパク質から得られたペプチドを、酸性条件下(TFA、pH2)で溶出し、回収し、質量分析により同定した。
本発明による抗体、その抗原結合部分、医薬組成物およびキットは、医薬品の製造のための既知の基準に従い、特許請求された方法および使用のための(例えば、癌を処置するための)製品として、産業的に製造し販売することができる。したがって本発明は、産業的に利用可能である。
1.ヒトGDF-15に結合可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、重鎖可変ドメインが、配列番号5のアミノ酸配列またはこれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号7のアミノ酸配列またはこれと少なくとも85%同一のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
2.重鎖可変ドメインが配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含むか、または軽鎖可変ドメインが配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、項目1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
3.重鎖可変ドメインが配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含み、および軽鎖可変ドメインが配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、項目1または2に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
4.重鎖可変ドメインが、FR1、CDR1、FR2、CDR2およびFR3領域を含みかつ配列番号1のアミノ酸配列またはこれと95%同一の配列を含む、領域を含み、および軽鎖可変ドメインが、FR1、CDR1、FR2、CDR2およびFR3領域を含みかつ配列番号2のアミノ酸配列またはこれと95%同一の配列を含む、領域を含む、項目1~3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
5.重鎖可変ドメインが、FR1、CDR1、FR2、CDR2およびFR3領域を含みかつ配列番号1のアミノ酸配列またはこれと98%同一の配列を含む、領域を含み、および軽鎖可変ドメインが、FR1、CDR1、FR2、CDR2およびFR3領域を含みかつ配列番号2のアミノ酸配列またはこれと98%同一の配列を含む、領域を含む、項目1~4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
6.抗体またはその抗原結合部分が、20nM以下、好ましくは10nM未満、より好ましくは5nM未満、および最も好ましくは0.1nM~2nMの間の、ヒトGDF-15に対する平衡解離定数を有する、項目1~5のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
7.抗体またはその抗原結合部分が、ドイツ微生物細胞培養コレクション(DMSZ)に寄託番号DSM ACC3142として寄託された細胞株B1-23から得られるヒトGDF-15に対する抗体と同一のヒトGDF-15エピトープに結合する、項目1~6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
8.抗体が、ドイツ微生物細胞培養コレクション(DMSZ)に寄託番号DSM ACC3142として寄託された細胞株B1-23から得られるヒトGDF-15に対する抗体またはその抗原結合部分である、項目1~7のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
9.抗体が、哺乳動物、好ましくはヒト患者における癌の増殖を阻害することができる、項目1~8のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
10.ヒトGDF-15が、配列番号8で表されるアミノ酸配列を有する組換えヒトGDF-15である、項目1~9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
11.結合が、ヒトGDF-15上の立体構造エピトープまたは不連続エピトープへの結合である、項目1~10のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
12.ヒトGDF-15上の立体構造エピトープまたは不連続エピトープへの結合が、配列番号25および配列番号26のアミノ酸配列で構成される立体構造エピトープまたは不連続エピトープへの結合である、項目11に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
13.ヒトGDF-15に結合可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、結合が、配列番号25および配列番号26のアミノ酸配列で構成される、ヒトGDF-15上の立体構造エピトープまたは不連続エピトープへの結合である、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
14.抗体またはその抗原結合部分が、項目1~10のいずれか一項に定義された抗体またはその抗原結合部分である、項目13に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
15.項目1~14のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、医薬組成物。
16.哺乳動物における癌を処置する方法での使用のための、項目1~14のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、または項目15に記載の医薬組成物であって、方法が、前記哺乳動物に対して、前記抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物を投与することを含む、前記抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
17.哺乳動物がヒト患者である、項目16に記載の使用のための、項目16に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
18.ヒト患者が、投与前に血清中の上昇したGDF-15レベルを有する、項目17に記載の使用のための、項目17に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
19.抗体またはその抗原結合部分が、
A)方法で使用される、癌に対して薬学的に活性な唯一の成分であるか、または
B)癌に対して薬学的に活性な1種または2種以上のさらなる成分と組み合わせて使用される、
項目16~18のいずれか一項に記載の使用のための、項目16~18のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
20.癌が、神経膠腫を含む脳の癌、神経系の癌、黒色腫、肺癌、口唇および口腔癌、肝癌、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、子宮頸癌、子宮体癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、喉頭癌(larynx cancer)、咽頭癌(pharynx cancer)、食道癌、胃癌および結腸直腸癌を含む消化管の腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌および乳癌からなる群から、好ましくは、黒色腫、前立腺癌、乳癌、神経膠腫を含む脳の癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、および卵巣癌からなる群から選択され、および最も好ましくは黒色腫である、項目16~19のいずれか一項に記載の使用のための、項目16~19のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
21.癌によって形成された1または2以上の腫瘍が、同一患者の癌の原発部位組織である組織の非癌部から得た対照試料と比較して、投与の前により高いヒトGDF-15レベルを有し、好ましくは1.2倍高いレベル、より好ましくは1.5倍高いレベル、さらにより好ましくは2倍高いレベル、および最も好ましくは5倍高いレベルを有する、項目17~20のいずれか一項に記載の使用のための、項目17~20のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
22.方法が、癌の増殖を阻害することを含む、項目16~21のいずれか一項に記載の使用のための、項目16~21のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
23.方法が、ヒト患者における、NK細胞およびCD8+T細胞による癌細胞の死滅の誘導を含む、項目17~22のいずれか一項に記載の使用のための、項目17~22のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
24.項目15に記載の医薬組成物を含む、キット。
25.項目16~23のいずれか一項に記載の使用のための、項目24のキット。
26.項目1~14のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
27.項目1~14のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を産生することができる、細胞株。
28.細胞株が、ドイツ微生物細胞培養コレクション(DMSZ)に寄託番号DSM ACC3142として寄託された細胞株B1-23である、項目27に記載の細胞株。
29.細胞株が、項目26に記載の発現ベクターを含む、項目27に記載の細胞株。
Claims (13)
- ヒトGDF-15に結合可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
重鎖可変ドメインが、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号5のアミノ酸配列含むCDR3領域を含み、ならびに
軽鎖可変ドメインが、配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR1、アミノ酸配列SASを含むCDR2、および配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含み、
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、MS/MS同定を用いたエピトープ切除法における配列番号25および配列番号26のペプチドへ結合することを特徴とする、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。 - ヒトGDF-15が、配列番号8で表されるアミノ酸配列を有する組換えヒトGDF-15である、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 結合が、ヒトGDF-15上の立体構造エピトープまたは不連続エピトープへの結合である、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトGDF-15上の立体構造エピトープまたは不連続エピトープへの結合が、配列番号25および配列番号26のアミノ酸配列で構成される立体構造エピトープまたは不連続エピトープへの結合である、請求項3に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、医薬組成物。
- 哺乳動物における癌を処置する方法での使用のための、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項5に記載の医薬組成物であって、
方法が、前記哺乳動物に対して、前記抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物を投与することを含む、前記抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。 - 哺乳動物がヒト患者である、請求項6に記載の使用のための、請求項6に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
- 方法が、癌の増殖を阻害することを含む、請求項6または7に記載の使用のための、請求項6または7に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
- 方法が、ヒト患者における、NK細胞およびCD8+T細胞による癌細胞の死滅の誘導を含む、請求項7または8に記載の使用のための、請求項7または8に記載の抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物。
- 請求項5に記載の医薬組成物を含む、キット。
- 請求項6~9のいずれか一項に記載の使用のための、請求項10に記載のキット。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を産生することができる、細胞株。
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