CN101854947A - 用于调节巨噬细胞抑制因子(mic-1)活性的药剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节对象的食欲和/或体重的方法和新型药剂。此外，本发明还涉及筛选与巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)受体复合物相互作用并调节其活性的药剂的方法。

Description

用于调节巨噬细胞抑制因子(MIC-1)活性的药剂和方法
技术领域
本发明涉及用于调节对象的食欲和/或体重的方法和新型药剂。此外，本发明还涉及筛选与巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)受体复合物相互作用并调节其活性的药剂的方法。
通过引用而并入
本专利申请要求2007年8月16日提交的名称为“Agents andmethods for modulating macrophage inhibitory cytokine-1(MIC-1)activity”的AU2007904412的优先权，该申请的全部内容在此通过引用并入本文中。
此外，在下面的说明书中参考下述专利说明书：
-国际专利申请No.PCT/AU2005/000525(WO 2005/099746)；以及
-美国专利5,225,539。
这两篇专利说明书每一篇的全部内容均在此通过引用并入本文中。
背景技术
体重和食欲控制是复杂的、未完全表征的过程。其失调可导致肥胖，肥胖是一个重要的世界性公共健康问题。在另一个极端，食欲减退/恶病质最常见是由于晚期癌症而引起的，在晚期癌症中，认为肿瘤或基质细胞衍生分子(stromal cell derived molecule)干扰了对食欲和体重的严格控制，导致消瘦、衰弱，并常常导致死亡1-6。已经表明几种细胞因子与食欲减退/恶病质的发病机理相关，但是认为白细胞介素-6(IL-6)是最可能的发病原因。然而，迄今为止还没有抗IL-6单克隆抗体的人临床试验表现出在治疗癌症食欲减退/恶病质中的效力。
MIC-1(又称为GDF-15、PLAB、PDF和NAG-1)是TGF-β超家族的分支成员，其在基础条件下不表达，但是可被炎症、损伤或恶性肿瘤形成所诱导7-13。MIC-1在许多癌症(包括前列腺癌、结肠癌、胰腺癌和乳癌)中过表达14。在晚期癌症患者中，这导致血清MIC-1水平显著升高，可升高10-100倍，从平均450pg/ml升高到5-50ng/ml的水平或更高。由于表达水平的个体差异和通过前转化酶(pro-convertase)加工成熟MIC-1的不同，单个肿瘤分泌的MIC-1的量可不尽相同11。MIC-1前肽强有力地结合细胞外基质(ECM)，导致MIC-1的ECM储备形成，这可在体外和体内证实。仅加工后形式的MIC-1(缺少结合前肽的基质)扩散到循环中。因此，所述前肽调节体内ECM储备和循环血中MIC-1水平之间的平衡11。
本发明人之前在国际专利申请No.PCT/AU2005/000525(WO2005/099746)中描述了调节对象中食欲和/或体重的方法和药剂，所述方法和药剂涉及MIC-1活性的调节。其中所述的具体药剂类型是抗MIC-1抗体，其抑制MIC-1活性并且能增加对象的食欲和/或体重。下文提供了过表达MIC-1的肿瘤诱导食欲减退/恶病质的进一步证据，所述食欲减退/恶病质可通过施用抗MIC-1抗体来逆转，并且可通过注射重组MIC-1来诱导。此外，还研究了MIC-1的作用机制，导致了MIC-1受体复合物以及影响食欲和能量动态平衡调节的潜在中枢调节剂的表征。
因此，本发明人鉴定了用于调节食欲和/或体重的方法和新型药剂等。
发明内容
本发明涉及用于调节巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)活性的新型药剂的鉴定，其中所述药剂调节包含转化生长因子-β(TGF-β)RII受体之MIC-1受体复合物的活性。通过调节MIC-1的活性，所述药剂能够调节对象的食欲和/或体重。
因此，在第一个方面中，本发明提供了调节对象中巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)活性的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的调节包含转化生长因子-β(TGF-β)RII受体之MIC-1受体复合物的活性的药剂，其任选地与药理学上可接受的载体和/或赋形剂相混合。
本发明还提供了筛选调节MIC-1活性之药剂的候选药剂或药剂库的方法。
因此，在第二个方面中，本发明提供了筛选能够调节巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)活性之药剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)使所述药剂与包含转化生长因子-β(TGF-β)RII受体的MIC-1受体复合物或其单体接触，以及
(ii)检测所述MIC-1受体复合物或其单体的任何活性变化。
在第三个方面中，本发明提供了通过所述第二个方面的筛选方法鉴定的新药剂。
附图说明
图1显示：a.对肋腹皮下注射DU145人前列腺癌细胞系的45只裸小鼠的体重和肿瘤大小的影响，所述DU145人前列腺癌细胞系已经用表达hMIC-1的质粒构建体或空质粒载体进行了永久转染。监测所述小鼠的体重和肿瘤大小6周。处死时，通过ELISA测定血清hMIC-1水平，以体重减轻程度的平均值和标准差对血清hMIC-1水平范围作图；b.单次剂量MIC-1-MAb对裸鼠平均体重变化的影响，所述裸鼠利用导致高血清MIC-1水平的构建体永久转染的DU145细胞进行了异种移植。11天后，当带有表达MIC-1之肿瘤的小鼠的体重显著降低时，给小鼠腹膜内注射单次剂量的MIC-1-Mab，每个剂量注射3只小鼠，给5只小鼠注射对照缓冲液(载体)或不作处理。每日监测其体重，监测20天。绘图显示所述小鼠的峰值体重增加相比于对照小鼠在此相同时间段内平均体重变化的平均值和标准差；c.显示根据“1b”的小鼠的反应持续时间(定义为其体重恢复至注射抗体当天的体重的时间)的平均值和标准差对所施用的MIC-1-Mab的剂量作图；d.显示利用导致高血清MIC-1水平的构建体永久转染的DU145细胞进行异种移植的20只裸鼠和利用对照空载体转染的DU145细胞进行异种移植的20只裸鼠的体重变化。注射后第8天，当MIC-1小鼠的平均体重减轻为7％时，监测3个连续的24小时时间段的摄食量。将食物置于料斗内并在0时间点称重。24小时后，从置入所述料斗中的食物中减去未进食和溢失的食物来测定所消耗的食物。结果以每天每克小鼠体重所消耗的食物重量(克)的平均值和标准差来表示。*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001；e.给20只裸鼠植入利用导致高MIC-1水平的构建体永久转染的DU145细胞，给20只小鼠植入对照空载体构建体。当带有MIC-1肿瘤的小鼠体重减轻约18％时，处死小鼠。剥离肩胛骨间棕色脂肪组织、腹股沟、附睾和腹膜后白色脂肪组织以及胫骨肌和腓肠肌，取出并称重。总白色脂肪代表腹股沟、附睾和腹膜后脂肪贮库的总重量。结果以样本重量的平均值和标准差表示，所述样品重量表示为注射肿瘤当天的小鼠体重的比例。*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001；f.剥离之前，对“1.e”中的小鼠进行DXA扫描以测定总的瘦肉质量和脂肪质量。所示结果表示为总重量(以克计)的平均值和标准差。***＝p＜0.001；g.皮下注射10μg高度纯化的重组hMIC-1来处理12只BALB/c小鼠，每日两次。在实验开始时，给一半小鼠腹膜内单次注射10mg MIC-1-PAb或对照-PAb。每日监测小鼠体重，以其初始体重的百分数表示，将结果绘制为平均值和标准差；以及h.显示监测“1g”中所述hMIC-1处理的小鼠的3个连续24小时时间段的每日摄食量。将食物置于料斗中并在0时间点称重。24小时后，从置入所述料斗中的食物中减去未进食和溢失的食物来测定所消耗的食物。结果表示为每天每克小鼠体重所消耗的食物重量(克)的平均值和标准差。*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图2显示：a.(A)用空载体转染的DU145细胞进行异种移植的裸鼠、(B)用过表达MIC-1的DU145细胞进行异种移植后第14天的裸鼠以及(C)按照“B”处理但是预先腹膜内注射1mg MIC-1-Mab 9天的小鼠的代表性照片。箭头表示肿瘤生长部位；b.利用表达hMIC-1的质粒构建体或含有MIC-1的空质粒载体转染的DU145细胞和对照肿瘤进行异种移植的40只裸鼠的体重的平均值和标准差。
图3提供了得自利用导致高血清MIC-1水平的构建体永久转染的DU145细胞进行异种移植的裸鼠的数据。11天后，当带有表达MIC-1的肿瘤的小鼠体重显著减轻时，给小鼠腹膜内注射3种不同剂量的MIC-1-Mab或对照缓冲液(PBS)，每个剂量注射3只小鼠。每日监测其体重，监测20天。就每组而言，以其相对体重变化的平均值和标准差对随实验进程的时间作图。用箭头标出注射MIC-1-Mab的时间。
图4显示MIC-1剂量对体重减轻的影响。给18只9周龄的BALB/c小鼠皮下注射载体对照或指定量的重组MIC-1，每日两次。每日监测其体重，监测3天，计算此期间的体重变化。将结果归一化为载体对照注射第一天的体重并以平均值和标准差对结果绘图。
图5显示：a.MIC-1或载体(对照)处理的自由进食的小鼠以及载体处理的配对进食的动物的体重变化(每组6只)。给小鼠皮下注射10μgMIC-1(或载体)，每日两次，注射10天。将结果归一化为MIC-1注射第一天的体重并以平均值和标准差对结果绘图。与载体处理的对照小鼠相比，MIC-1处理的小鼠(p＜0.05)以及配对进食的小鼠(p＜0.001)的体重显著降低。MIC-1处理的小鼠与配对进食的小鼠之间的差异不显著(两因素重复测量的方差分析ANOVA)。b.10天后，对5a中的小鼠进行DXA扫描以测定全身脂肪质量和两只后腿的瘦肉质量。结果表示为平均值(克)和标准差。*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图6显示MIC-1对小鼠能量消耗的影响。将15只BALB/c小鼠单独饲养在开放回路量热仪(open circuit calorimeter)中并使其在笼中适应24小时。在开始夜晚循环时，给8只小鼠皮下注射(箭头)10μgMIC-1，给7只小鼠皮下注射对照缓冲液。在下一个循环初期给予第二次注射(箭头)，其后立即撤除食物以监测禁食状态下MIC-1诱导的代谢变化。测量每个27分钟周期的能耗(热量)、呼吸交换率(RER)、耗氧量以及运动(x和y总计数)。以横条标出12小时的黑暗和光照循环。数据是2个循环的平均值，并以平均值和平均值的标准误对所述数据绘图。通过两因素重复测量的方差分析ANOVA来比较所述数据。*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图7显示MIC-1对ob/ob小鼠体重变化和摄食量的影响。给瘦素缺陷ob/ob小鼠皮下注射载体对照(5只小鼠)或10μg/20g体重的重组MIC-1(5只小鼠)，每日两次。a.每日测量体重，将结果归一化为MIC-1注射第一天的体重并以平均值和标准差对结果绘图。b.测量最后一天的摄食量并归一化为实验开始时的初始体重。利用双尾t检验分析所述结果。*＝p＜0.05。
图8提供了(a)对照肿瘤小鼠以及(b)MIC-1肿瘤小鼠的下丘脑弓状核中GHRH mRNA表达的原位杂交的乳液自显影图片。Arc：下丘脑弓状核；3V：第三脑室。比例尺＝40μm。
图9显示晚期前列腺癌患者中MIC-1(a)或IL-6(b)的血清水平与体重变化之间的关系。
图10显示：a：检测出生后(0-48小时，N＝76)、3周龄(N＝36)以及8-9周龄(N＝40)的fmsMIC-1转基因小鼠以及其WT同窝小鼠的体重。针对每个时间点和性别将体重归一化。结果以平均值和标准差表示。*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。b.监测8周龄的fmsMIC-1和WT同系对照小鼠的3个连续24小时时间段内的每天摄食量，如图4a所示。结果以平均值和标准差表示。*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。c.在第52-54天龄处死5只雄性和5只雌性fmsMIC-1转基因小鼠以及4只雄性和5只雌性同系对照小鼠。按照图1e剥离脂肪贮积和胫骨肌以及腓肠肌，取出并称重。以样本体重的平均值和标准差分开表示雄性和雌性小鼠的结果，所述样品体重以小鼠体重的比例表示，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图11提供直接AAV介导的下丘脑中MIC-1过表达所引起的体重减轻的结果。给小鼠单侧下丘脑内注射表达MIC-1的AAV或对照AAV。监测12只小鼠的体重，其中一半小鼠单侧下丘脑内注射过表达MIC-1的AAV，另一半小鼠单侧下丘脑内注射对照AAV载体。每日给小鼠称重，以平均值和所述平均值的标准误对结果绘图。
发明详述
之前已经发现许多癌症(尤其是上皮细胞来源的癌症)过表达MIC-1，导致循环中MIC-1水平(即血清水平)升高。还发现这些水平与癌症疾病的时期和程度成比例，在晚期癌症的情形下，这些水平尤其与显著的体重减轻相关。相似地，现在发现患有慢性肾衰竭(通常伴随体重减轻和食欲减退/恶病质的病症)的患者的血清MIC-1水平显著升高，这与体重指数(BMI)降低有关。通过降低MIC-1水平或MIC-1活性，预计与癌症、慢性肾衰竭或其它由血清MIC-1水平升高介导的病因相关的体重减轻可被逆转或减轻。实际上，在上述国际专利申请No PCT/AU2005/000525(WO 2005/099746)中，本申请人证明了抗MIC-1抗体(抑制MIC-1活性)实际上能引起过表达MIC-1的肿瘤小鼠的体重增加。实现体重减轻的逆转或减轻是一个重要的临床结果，因为预计这导致提高患者健康程度，因此认为能成功治疗患者的癌症、慢性肾衰竭或其它病因的疾病或病症，根据具体情况而定。
现在，本发明人研究了MIC-1作用机制，这导致更深入了解通过MIC-1调节食欲的途径和潜在的中枢调节剂。更具体而言，现在将所述MIC-1受体复合物表征为含有TGF-βRII受体。因此，本发明鉴定了用于调节食欲和/或体重的新型药剂，其中所述药剂通过调节MIC-1受体复合物的MIC-1受体活性起作用。此外，本发明人鉴定了筛选与MIC-1受体复合物相互作用并且调节MIC-1受体复合物活性的新型药剂的方法。
因此，在第一个方面中，本发明提供调节对象中巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)活性的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的调节MIC-1受体复合物活性的药剂，其任选地与药理学上可接受的载体和/或赋形剂相混合，所述MIC-1受体复合物含有转化生长因子-β(TGF-β)的RII受体。
优选地，所述药剂与MIC-1受体复合物相互作用并调节MIC-1受体复合物的活性，然而，所述药剂还可通过调节MIC-1受体复合物的量来起作用。
通过调节MIC-1活性，所述药剂能调节对象的食欲和/或体重。
更具体而言，通过抑制(即拮抗)MIC-1活性(例如通过结合和阻断所述MIC-1受体复合物)，所述药剂能增加对象的食欲和/或体重。在此情形下，所述方法适用于治疗与由于癌症、慢性肾衰竭或其它病因疾病、病症或治疗引起的MIC-1过表达相关的食欲减退/恶病质。
另一方面，通过提高(即激动)MIC-1活性(例如通过结合和刺激MIC-1受体复合物活性而模拟MIC-1活性)，所述药剂能降低对象的食欲和/或体重。在此情形下，所述方法可适用于治疗例如肥胖。
TGF-β超家族蛋白(包括MIC-1)受体超家族的受体是四聚体复合物，其含有两个RI受体单体和两个RII受体单体。
所述MIC-1受体是四聚体复合物，其含有两个RI受体单体和两个TGF-βRII受体。存在TGF-βRII受体的许多剪接变体和其它变体(参见例如Konrad，L等38所述的变体)，因此，应当理解的是本文所用的术语“TGF-βRII受体”包括这些变体。
用在所述第一个方面的方法中的药剂可与一个或两个所述TGF-βRII受体单体和/或一个或两个RI受体单体相互作用。然而，优选地，所述药剂与一个或两个TGF-βRII受体单体相互作用。优选地，所述TGF-βII受体单体单体是下丘脑TGF-βRII受体单体。
优选地，所述方法包括抑制MIC-1活性并且是为了增加对象的食欲和/或体重而进行的，所述对象可能患有与以下原因引起的MIC-1过表达相关的食欲减退/恶病质：癌症(尤其是上皮细胞癌症，例如前列腺癌、结肠癌、胰腺癌和乳癌)、慢性肾衰竭或其它病因疾病(例如炎性疾病，比如类风湿性关节炎)、病症(例如损伤、炎症或应激)或治疗(例如放疗或化疗)。为了抑制MIC-1活性，所述药剂优选选自结合和阻断TGF-βRII受体(优选下丘脑TGF-βRII受体)的药剂，但是预计结合和阻断RI受体或其它方式抑制四聚体MIC-1受体复合物的单体之间相互作用的药剂也是合适的。
结合和阻断TGF-βRII受体的合适的药剂的实例包括MIC-1的抑制性肽片段和模拟物。然而，优选地，这样的药剂选自抗TGF-βRII抗体(例如抗TGF-βRII抗体AF532，可得自R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MI，美国)和抗体片段(例如Fab片段和重组scFV片段)。更优选地，所述药剂是人源化抗TGF-βRII单克隆抗体。可根据美国专利No 5,225,539(在此通过引用以整体并入本文)中所述的方法制备人源化抗TGF-βRII单克隆抗体。
结合和阻断RI受体的合适的药剂的实例包括熟知的抑制剂，例如ALK5抑制剂，包括SB-431542(4-(5-苯并(1，3)二噁唑-5-基-4-吡啶-2基-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺)(Sigma Aldrich，St Louis，MO，美国)、SB-505124(2-(5-苯并[1，3]二噁唑-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)35、SD-20836(Scios，Inc.，Freemont，CA，美国)以及GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)37以及MIC-1的抑制性肽片段和模拟物。然而，优选地，这样的药剂选自抗RI抗体和抗体片段(例如抗ALK5细胞外结构域的hAP-0016抗体，可得自Angio-Proteomie，Boston，MA，美国)。更优选地，所述药剂是人源化抗RI单克隆抗体。
当为了抑制MIC-1活性而进行时，适用于利用所述第一个方面的方法治疗的对象可限于表现出MIC-1过表达或至少血清MIC-1水平一直处在200-1200pg/ml的正常人血清水平的高端的那些对象。可利用针对MIC-1的分析(例如MIC-1ELISA33)来测定高血清MIC-1水平(例如来自全血或血清样品)来选择这样的对象。“高”血清MIC-1水平包括＞850pg/ml，更优选＞1000pg/ml，最优选＞1200pg/ml。
或者，所述方法包括提高MIC-1活性，并且是为了降低对象的食欲和/或体重而进行的，所述对象可能患有肥胖或还可能出于健康或虚荣心原因而期望体重减轻。为了提高MIC-1活性，所述药剂优选选自通过结合TGF-βRII受体和刺激TGF-βRII受体活性来模拟MIC-1活性的药剂，但是预计结合RI受体和刺激RI受体活性的药剂也是合适的。结合和刺激TGF-βRII受体的合适的药剂的实例包括MIC-1的刺激性肽片段和模拟物。结合和刺激RI受体的合适的实例包括MIC-1的刺激性肽片段和模拟物。
此外，所述第一个方面的方法可包括通过调节MIC-1受体复合物的量(即对象中内源性MIC-1受体复合物的量)来调节MIC-1活性。就调节MIC-1受体复合物的量而言，所述药剂优选选自降低对象中MIC-1受体复合物的量的药剂，并且可选自靶向抗编码所述MIC-1受体复合物之基因的催化性和抑制性寡核苷酸分子(例如核酶、脱氧核糖核酸酶、反义RNA和小抑制性RNA(siRNA))以及MIC-1受体复合物转录或翻译的抑制剂。优选地，这样的药剂降低内源性TGF-βRII受体(优选内源性下丘脑TGF-βRII受体)的量，但是降低内源性RI受体的量的药剂也是合适的。预计这样的药剂适于治疗与由癌症、慢性肾衰竭或其它病因疾病、病症或治疗引起的MIC-1过表达相关的食欲减退/恶病质。
用在所述第一个方面的方法中的药剂可以被配制成任意合适的药物/兽用组合物或剂型(例如用于口服、口含、鼻内、肌肉内和静脉内施用的组合物)。通常，这样的组合物是以有效调节食欲和/或体重的量施用给所述对象的，因此其可提供约0.01-约100μg/kg体重/天的药剂，更优选提供0.05-25μg/kg体重/天的药剂。合适的组合物可旨在用于每日施用一次、每日施用多次或控制释放或缓慢释放，根据达到的最大有效作用而定。
此外，本发明还提供筛选用于调节MIC-1活性的候选药剂或药剂库的方法。
因此，在第二个方面中，本发明提供用于筛选能调节巨噬细胞抑制因子(MIC-1)活性的药剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)使所述药剂与包含转化生长因子-β(TGF-β)之RII受体的MIC-1受体复合物或其单体接触，以及
(ii)检测所述MIC-1受体复合物或其单体的任何活性改变。
优选地，所述方法是利用例如表达MIC-1受体复合物或其单体的培养细胞(例如CHO细胞)在体外进行。MIC-1受体复合物或其单体活性的改变可通过检测一种或多种信号传导分子例如erk 1/2、P-stat3以及smad信号传导途径的活化与否来检测。或者，MIC-1受体复合物或其单体的活性改变可通过检测akt信号传导途径的一种或多种信号传导分子的活化与否来检测，之前的报道表明所述akt信号传导途径与MIC-1活性有关34。
其中所述方法的步骤(i)是利用所述MIC-1受体复合物的单体进行的，优选地，所述单体是TGF-βRII受体，更优选地，所述单体是下丘脑TGF-βRII受体。
所检测的MIC-1受体复合物或其单体活性的降低可表明所述药剂可能增加对象的食欲和/或体重。另一方面，所检测的MIC-1受体复合物或其单体活性的增加可表明所述药剂可能降低对象的食欲和/或体重。
在第三个方面中，本发明提供通过所述第二个方面的方法鉴定的新药剂。
在下文中，通过参考下述非限定性实施例和附图进一步描述本发明。
实施例
实施例1
材料和方法
肿瘤异种移植模型
在8周龄BALB/c裸鼠的右肋腹皮下注射在200mi PBS中的5-7×106个经转染的DU145细胞。所述DU145细胞已经用含有成熟MIC-1(MIC-1)、全长MIC-1、MIC-1前转化酶位点缺失突变体或空载体的pIRES2-EGFP质粒(Clontech，Mountain View，CA，美国)进行了转染11。一旦肿瘤可见，就测量肿瘤大小，并每1-3天给小鼠称重，称重6周。
通过以下测定瘦肉和脂肪质量：使用双能X射线吸收仪(DXA)(Lunar Piximus II，GE Medical Systems，Madison，WI，美国)并剥离白色和棕色脂肪组织贮积(adipose depot)、胫骨肌以及腓肠肌，然后将其重量表示为占注射肿瘤当天小鼠体重的比例。
过表达MIC-1的转基因小鼠的产生
通过传统方法构建转基因小鼠。简而言之，将含有以巨噬细胞特异性方式驱动啮齿动物MIC-1全长编码序列表达的经修饰c-fms启动子序列的质粒构建体线性化并注射到C57BL6卵母细胞中。然后使所得转基因小鼠与WT C57BL6小鼠交配，基于通过实时RT-PCR评价脾脏(富含巨噬细胞的组织)中MIC-1表达的增加来选择所得的转基因小鼠系(称为fmsMIC-1)。MIC-1被强烈表达至在小鼠血清中可容易检测到的程度。
MIC-1试剂
如之前所述制备和纯化所有MIC-1抗体和重组蛋白11，15，16。在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的条件化培养基中表达重组MIC-1并利用疏水性相互作用色谱、离子交换色谱的组合从中纯化，然后利用反相HPLC纯化。分别通过用重组MIC-1免疫或未免疫的绵羊的血清进行蛋白G亲和色谱来制备MIC-1PAb或对照IgG。对于一些实验而言，通过在偶联纯化重组MIC-1的琼脂糖柱上纯化MIC-1PAb来制备亲和力纯化的抗MIC-1抗体。抗MIC-1单克隆抗体来源于杂交瘤并通过蛋白G亲和色谱纯化。
经改造以表达MIC-1的AAV载体的制备
将人MIC-1的cDNA亚克隆到受控于CBA(鸡β-肌动蛋白)启动子并含有WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件)的AAV表达质粒中，并具有侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)的牛生长激素聚腺苷酸化信号。将不含转基因插入片段的AAV表达质粒装配到AAV中并用作对照载体。然后基本上如所述制备感染性AAV颗粒32。简而言之，通过标准磷酸钙转染法利用AAV和辅助质粒共转染HEK293细胞。转染后60小时收获细胞，通过碘克沙醇密度梯度超离心从细胞裂解液中纯化AAV载体，然后浓缩并用PBS透析。利用实时PCR(ABI Prism7700)滴定载体，将所有载体储备液稀释为1×1013个基因组/ml。
代谢速率、呼吸变换率和物理活动的测定
利用八室开放回路量热仪(Oxymax Series，Columbus Instruments，Columbus，OH，美国)通过间接量热法测量了8-10周龄雄性BALB/c、fmsMIC-1或C57B16小鼠的代谢速率。将小鼠单独饲养在特制的树脂玻璃(Plexiglass)笼(20.1cm×10.1cm×12.7cm)中。温度维持在22℃，空气流量为0.6升/分钟。随意进食和饮水，或者在一些实验中，注射MIC-1后将小鼠禁食12小时。在开始记录之前使小鼠在笼中适应24小时。然后给小鼠皮下注射10μg MIC-1或对照缓冲液，然后监测12小时。每27分钟测量耗氧量(VO2)，呼吸交换率计算为VCO2/VO2(RER)。能量消耗(所产生的千卡热量)计算为热值(CV)×VO2，其中CV是3.815+1.232×RER。通过两因素重复测量的ANOVA分析对产热数据进行统计学分析。
配对饲养实验
利用3组8周龄雌性BALB/c小鼠进行实验。在实验开始前将小鼠单个饲养1周。一组小鼠皮下注射10μg MIC-1，每日两次，并随意进食。第二组对照小鼠仅注射载体，也是随意进食。第三组配对饲养组仅注射载体并且与注射MIC-1的小鼠配对饲养。
通过测量MIC-1处理组每24小时所消耗的食物来进行配对饲养。第二天，给予所述配对饲养小鼠的食物量与MIC-1处理的小鼠在前一天所消耗的食物量相同。为了测量摄食量，将颗粒状食物称重并置于食物料斗中，再次称量24小时后剩余的食物，经溢出和粪便校正后的差异代表每日摄食量。
癌症恶病质患者群组
用于评价MIC-1水平的血清样品得自之前所公开的癌症恶病质研究23中所招募的患者。简而言之，对照组为10名未患有前列腺疾病的患者，一组为19名最近诊断患有器官局限性前列腺癌(CaP)的患者，另一组为38名患有晚期CaP的患者。就进一步的分析而言，此组被分为两个亚组：未患有恶病质和患有恶病质的晚期前列腺癌。晚期前列腺癌患者是根据参加本研究之前由肿瘤科医生确定的临床状态来分类的。当患者体重减轻3-6个月并且失去食欲(食欲减退)时其被确定为恶病质。如果两种症状均不存在，则患者被认为非恶病质。如果存在一个症状，那么仅当存在低能量水平、疲劳或低运动耐受性症状中之一时才诊断为恶病质。未患有恶病质的晚期PCa亚组由14名患者组成。在3/14的患者中发现了体重减轻，其中体重减轻的平均值±SEM为0.87±0.51kg(中值：0kg；范围：0-6.2kg)。尽管一些患者的体重减轻，但是根据肿瘤科主治医生所确定的其临床状态，他们不被认为是恶病质。中值年龄是72.5岁。患有恶病质的亚组由24名患者组成。仅一名患者根据第二标准被置于恶病质组中。此组中所有患者体重均减轻，体重减轻的平均值±SEM为6.89±1.00kg(中值：4.7kg；范围：1.5-21.9kg)。中值年龄是68.5岁。
小鼠下丘脑内注射
利用下述步骤进行所有实验。将小鼠用100mg/kg氯胺酮和20mg/kg赛拉嗪(Parke Davis-Pfizer，Sydney，Australia and Bayer AG，Leverkusen，德国)麻醉并置于Kopf立体定位仪(stereotaxic frame)(David Kopf，CA，美国)上，其中头部处于平坦头骨位置。利用10μl汉密尔顿氏注射器以0.1μl/分钟的速度向小鼠下丘脑内单侧注射相关物质，所述注射器与Micro4微量注射泵控制器(World PrecisionInstruments Inc.，Sarasota，FL，美国)相连。
就细胞因子的直接注射而言，通过相对于前囟后部2.3mm、外侧±0.3mm、腹部5.6mm的坐标(其对应于ARC28)给成年WT小鼠注射1μl MIC-1、1μl瘦蛋白或1μl对照溶液。注射开始后30分钟，处死小鼠。通过灌注固定脑，如下文所述通过免疫组化鉴定P-stat3神经元。
抗TGF-B受体抗体的施用
就涉及注射抗TGF-β受体抗体的实验而言，以0.1μl/分钟的速度将1.5μl抗体(0.1mg/ml)单侧注射到3只成年小鼠的下丘脑后区域中。所注射的抗体是针对TGF-βRII(R&D Systems，Inc.)或BMP RII(GeneTex，Inc.，San Antonio，TX，United States of America)或瘦蛋白受体(Upstate Biotech.，Lake Placid，NY，美国)的抑制性山羊抗体。在此情形下，注射后使针头在原位置放置10分钟以允许扩散。注射坐标为(从前囟开始)：前后-2.3mm；中外侧-0.5mm；背腹-4.5mm，对应于下丘脑后区域29。注射TGF-βRII抗体后24小时，在上午10点至下午12点间给动物腹膜内注射100μg hMIC-1。在注射后恰好30分钟处死小鼠，收集脑，用于检测下丘脑后区域中c-fos和TGF-βRII免疫反应性神经元，如下文所述。
在一个替代性实验中，将6只成龄雄性小鼠分成3个组：将1.5μl抗TGF-βRII抗体(0.1mg/ml)(R&D Systems，Inc.)、1.5μl抗BMP RII抗体(0.1mg/ml)(GeneTex Inc.，San Antonio，TX，美国)或1.5μl抗瘦素抗体(0.1mg/ml)(Upstate Biotech.)单侧注射到所述ARC中。在此情形下，注射后使针头在原位置放置10分钟以允许扩散。所述注射坐标定位(从前囟开始)：前后-1.94mm；中外侧-0.4mm；背腹-5.5mm，即对应于下丘脑弓状核29。注射后24小时，在上午10点至下午12点之间给动物腹膜内注射100μg hMIC-1。注射后30分钟，处死小鼠，收集脑，用于检测下丘脑弓状核区中c-fos免疫反应性，如下文所述。
小鼠脑的免疫组化和免疫荧光
在当天的固定时间(上午10点至下午12点)给BALB/c小鼠腹膜内注射10μg或100μg hMIC-1或对照缓冲液。为确保c-fos免疫反应性可能的最小变化，在腹膜内注射10μg hMIC-1后恰好60±1分钟时处死所有小鼠。就P-stat3而言，用5mg/kg(约100μg)瘦蛋白、100μg hMIC-1或对照缓冲液处理小鼠，并在腹膜内注射后恰好30分钟时处死小鼠。将小鼠深度麻醉，通过用在磷酸盐缓冲液中的25ml 0.9％盐水、以及随后在0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.4)中的冷的4％多聚甲醛灌注来固定脑。立即取出脑并置于4％多聚甲醛中30分钟，然后置于在磷酸盐缓冲液中的30％蔗糖溶液中过夜。将脑切成30μm冠状切片，并用在50％乙醇中的1％H2O2中清洗20分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。按1∶5000将第一抗体即兔抗小鼠c-Fos(sc-52；Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，美国)稀释在含有0.1％曲拉通X-100的PBS中，然后孵育过夜。除分别按1∶500、1∶2000和1∶2000稀释外，类似地处理兔抗小鼠Phospho-Stat3(Cell Signaling Technology Inc.，Danvers，MA，美国)、兔抗phosphoERK 1/2抗体(Cell Signaling)以及山羊抗小鼠TGF-βRII(R&D Systems，Inc.)。在PBS-曲拉通中清洗3次(每次清洗10分钟)后，将切片与在PBS中以1∶250稀释的生物素化抗兔第二抗体(Sigma Aldrich)或生物素化抗山羊第二抗体(Chemicon，Temecula，CA，美国)孵育2小时。在PBS中清洗切片30分钟，然后在室温下与亲和素-生物素-过氧化物酶(Vectastain，Burlingame，CA，美国)孵育30分钟。就一些实验而言，在使用镍增强染色来区分一个切片上两种抗体的反应性的情况下，在PBS中清洗切片，然后在0.04％硫酸镍胺存在下用0.05％二氨基联苯胺四盐酸盐(Sigma)和0.007％过氧化氢处理。然后在PBS中清洗切片并用来自DAKO(Carpinteria，CA，美国)的二氨基联苯胺处理5分钟。在水中清洗载玻片，在封片之前通过二甲苯脱水。通过Zeiss Axioplan光学显微镜的格栅刻线和10×物镜对核Fos阳性神经元进行计数。对所述区域(包括其中差异明显的区域)中的c-fos阳性核进行计数。就每个目的脑核而言，根据Franklin和Paxinos所述的立体定位坐标中的小鼠脑图谱对每隔两个切片进行计数以定量c-fos阳性神经元29。比较同时染色的两组(每组5只小鼠)，测定左侧和右侧的每个核中计数的平均神经元数。合并所有组用于最后的分析，通过ANOVA，然后通过Fisher′s事后检验来评价组与组之间的差异。
就免疫荧光而言，将所述第一抗体即兔抗小鼠P-Stat3(细胞信号传导)和山羊抗小鼠α-MSH(AB5087；Chemicon)按1∶5000和1∶4000在含有0.1％曲拉通X-100的磷酸盐缓冲盐(PBS)中稀释，然后孵育过夜。在PBS-曲拉通中清洗3次(每次清洗10分钟)后，将切片在山羊抗兔和驴抗绵羊第二抗体中孵育3小时，所述第二抗体与Alexa荧光团(Alexa
Figure GPA00001027018500161
594和Alexa
Figure GPA00001027018500162
488；Molecular Probes，Eugene，OR，美国)缀合，按1∶250在PBS中稀释。在PBS中清洗切片3次(每次清洗10分钟)后，在Zeiss Axioplan光学显微镜(Oberkochen，德国)下观察荧光团信号(c-Fos神经元为红色，α-MSH神经元为绿色)。
原位杂交
在所述天的固定时间(上午10点至下午12点)，给小鼠腹膜内注射10μg hMIC-1或对照缓冲液。在腹膜内注射后恰好60分钟时处死所有小鼠，立即取出脑并冷冻在干冰上。在低温恒温器上切冠状切片(20μm)并解冻固定在
Figure GPA00001027018500163
切片(Menzel-Glaser，Braunschweig，德国)上。利用与小鼠NPY(5’-GAGGGTCAGTCCACACAGCCCCATTCGCTTGTTACCTAGCAT-3’)(SEQ ID NO：1)、小鼠POMC(5’-TGGCTGCTCTCCAGGCACCAGCTCCACACATCTATGGAGG-3’)(SEQ ID NO：2)、小鼠GHRH(5’-GCTTGTCCTCTGTCCACATGCTGTCTTCCTGGCGGCTGAGCCTGG-3’)(SEQ ID NO：3)互补的放射性标记的DNA寡核苷酸一起分析来自同一冠状脑水平的MIC-1注射和PBS注射小鼠(n＝5只小鼠/组)的匹配切片，如之前所述28。
为评价分散的神经元中的mRNA水平，利用固定在Zeiss Axiophot显微镜上的ProgRes 3008相机(Zeiss，Jena，德国)对浸渍切片进行数字化处理。利用NIH-Image 1.61软件(由Wayne Rasband编写，可以从zippy.nimh.nih.gov的匿名FTP上获得)评价单一神经元上的银颗粒密度。背景标记相同并且不超过特定信号的5％。
组合免疫组化(原位杂交)
如上所述利用重组hMIC-1处理C57B6小鼠，并且进行相同处理用于P-stat3免疫组化。如上所述加以微小改变来进行P-stat3的免疫组化标记。在含有0.3％曲拉通X-100、0.1％BSA和5mg/ml肝素的PBS中按1∶2000稀释抗P-stat3抗体。在4℃下孵育切片48小时，利用如上所述的相同步骤检测特异性抗体标记。固定切片并如上所述进行NPY原位杂交。
统计学分析
除线性回归、单变量logistic回归以及多变量logistic回归外，还利用Mann-Whitney-U检验分析了前列腺癌患者的数据。利用McNemar检验(GraphPad，San Diego，CA，美国)比较了血清MIC-1和IL-6，作为用于预测癌症相关体重减轻的独立检验。利用PRISM 4通过两因素重复测量的ANOVA比较了代谢数据。除非另外指明，否则利用未配对的双侧T检验进行差异的所有其它统计学评价。除非另外指明，图表上的所有误差线均表示标准差。除非另外指明，利用STATVIEWVERSION 4.5(Abacus Concepts，Berkeley，CA，美国)进行所有分析。
结果
MIC-1诱导可通过抗MIC-1抗体逆转的快速体重减轻
为了了解MIC-1的局部和全身过表达的作用，利用表达人MIC-1(h MIC-1)的质粒构建体永久转染了不组成性产生MIC-1的人前列腺癌细胞系DU145。这些构建体保留了或缺少介导MIC-1基质结合的前肽结构域11。将转染的DU145细胞系皮下注射到裸小鼠的肋腹内以建立异种移植肿瘤11。监测所述小鼠6周，其后利用高度特异性ELISA测定血清hMIC-1水平11，15，16。具有升高的肿瘤来源hMIC-1的小鼠体重进行性减轻，与终点血清MIC-1浓度成比例(图1a、2a和2b)。具有低血清水平肿瘤来源hMIC-1(0-1500pg/ml，与正常人中所观察到的水平相似)的小鼠的体重增加了约19％，与这些小鼠中的幼龄小鼠一致(图1a)。具有中度升高的MIC-1水平(1501-8500pg/ml)的小鼠在实验过程中体重减轻约3％，具有显著升高的MIC-1水平(＞8500pg/ml)的小鼠在实验过程中体重减轻约28％(图1a)。由于具有对照肿瘤的小鼠在实验过程中持续增加体重，所以就对照组而言，MIC-1的净作用是使具有中度和高度血清hMIC-1水平的小鼠的体重分别减轻了22％和47％。
为直接证明MIC-1对体重减轻的作用的特异性，通过给荷瘤小鼠注射多克隆绵羊抗MIC-1IgG(MIC-1-PAb)来逆转其作用。当利用对照IgG(CON-IgG)时未观察到这种对MIC-1的体重减轻作用的逆转(数据未显示)。另外，单次注射hMIC-1特异性单克隆抗体(MIC-1-MAb)而不注射载体对照可快速逆转此MIC-1相关的体重减轻(图1b、1c、2a和3)和对肿瘤大小的作用(数据未显示)。MIC-1诱导的体重减轻的逆转幅度和持续时间与所施用MIC-1-MAb的量成比例。注射1mgMIC-1-MAb导致14％的峰值体重增加，这导致完全逆转肿瘤诱导的体重减轻。将这与施用载体对照的带有MIC-1肿瘤小鼠显著的持续体重减轻相比较(图3)。此MIC-1-MAb的作用持续时间是17天(图1c)。此外，抗体处理对肿瘤大小无影响(数据未显示)。这些数据表明，表达MIC-1的肿瘤所诱导的体重减轻是由MIC-1特异性介导的。
为进一步证明是MIC-1引起此作用，给正常BALB/c小鼠皮下施用剂量递增的纯化重组hMIC-1，每日两次，施用3天，并测量此期间小鼠的体重变化。这证明MIC-1以剂量依赖性方式诱导体重减轻(图4)，其中10μg剂量的纯化重组hMIC-1导致显著而立即的体重减轻，所述体重减轻可被MIC-1-PAb完全逆转，但不能被CON-PAb完全逆转(图1g)。
MIC-1诱导的小鼠体重减轻的表征
为更具体地表征表达MIC-1的肿瘤所诱导的体重减轻的性质，通过以下测定了多个区域中脂肪和瘦肉组织质量的变化：剥离白色和棕色脂肪组织贮积、胫骨肌和腓肠肌，然后将其重量表示为占注射肿瘤当天小鼠体重的比例(图1e)。具有过表达MIC-1之肿瘤的小鼠没有剩余的腹膜后脂肪，腹股沟脂肪贮积和附睾脂肪贮积分别减少了54％和89％。与具有对照肿瘤的小鼠相比，具有MIC-1肿瘤的小鼠的肩胛间棕色脂肪组织贮积(40％)以及胫骨肌和腓肠肌(分别25％和29％)的重量有较小但显著的减少。双能X射线吸收(DXA)扫描数据证明，与对照相比，具有MIC-1肿瘤的小鼠平均减少5.3g瘦肉质量和1.1g脂肪质量(图1f)。
为确定具有过表达MIC-1之肿瘤的小鼠的体重减轻是否是由于进食减少而引起的，测量了连续3日的摄食量。将具有与高血清MIC-1水平相关的DU145细胞肿瘤的小鼠与具有利用空载体转染的DU145细胞肿瘤的小鼠进行了比较。具有过表达MIC-1之肿瘤的小鼠比具有对照肿瘤的小鼠的每日平均摄食量减少了32％(图1d)。还测量了注射重组MIC-1的BALB/c小鼠的食物消耗量，所述BALB/c小鼠被施用MIC-1-PAb或CON-PAb。与所述荷瘤小鼠的数据相似，施用重组MIC-1引起摄食量显著降低(图1h)。重要的是，此食欲低下(hypophagia)被导致体重增加的MIC-1-Pab处理所逆转(图1h)，确定了摄食量降低是MIC-1介导的体重减轻的主要原因。
为查明MIC-1诱导的脂肪质量、瘦肉质量以及体重的降低是完全是由于食欲低下引起，还是代谢性因素也起作用，以接受每日两次注射MIC-1的小鼠所消耗的食物量配对饲养注射载体的小鼠。配对饲养的注射载体的小鼠减轻的体重至少与注射MIC-1的动物一样多，表明注射MIC-1的小鼠在瘦肉或脂肪质量损失方面与注射MIC-1的小鼠没有显著性差异(图5a和5b)。在配对饲养的动物中所观察到的稍微大些的体重减轻很有可能是由于所诱导的应激反应和由食物限制引起的物理活动(例如觅食行为)的增加而造成的17，而注射MIC-1后未出现这样的物理活动增加。总之，这些数据确定了食欲低下是MIC-1减轻体重和相关的脂肪和瘦肉质量降低的方法。
为完全排除增加的代谢速率是MIC-1处理小鼠中体重减轻以及机体组成改变的贡献，在以单次注射对照缓冲液或重组MIC-1处理的正常小鼠中通过间接量热研究了能量消耗。与对照相比，注射10μg MIC-1的小鼠表现出小但显著的能量消耗降低(图6)。当注射MIC-1后将小鼠禁食12小时以上时，这种小的相对能量消耗降低消失(图6)。因此，能量消耗增加不能解释MIC-1处理小鼠中的体重减轻和机体组成的改变，这进一步作为单独原因支持了降低的能量摄取。
为检测MIC-1是否还对肥胖动物起作用，给遗传性肥胖的瘦蛋白缺陷型ob/ob小鼠每20g体重注射10μg MIC-1，每日两次，注射3天。与瘦小鼠中MIC-1的作用相似，ob/ob动物显示出体重显著减轻(图7a)。与注射对照的小鼠相比，注射MIC-1的ob/ob小鼠中的此体重减轻是摄食量显著降低的结果(图7b)。这些数据表明，MIC-1强有力地诱导食欲低下和体重减轻，即使在非常肥胖的动物模型中也是如此。
对激素和代谢物的血清水平的评价表明，具有MIC-1肿瘤的小鼠的游离脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖、胰高血糖素、瘦蛋白和IGF-1的血清水平显著降低(数据未显示)，这与其瘦肉和脂肪质量的减轻是一致的。具有MIC-1肿瘤的小鼠还显示出血清皮质酮水平升高的趋势。循环IGF-1水平的变化提示对下丘脑-垂体-生长激素轴的抑制，并因此检测了下丘脑中生长激素释放激素(GHRH)的mRNA表达。如图8所示，具有MIC-1肿瘤的小鼠的脑中GHRH表达水平显著降低，这证实了这些动物中生长激素轴的中枢性介导的下调。虽然降低的血清IGF-1水平可引起MIC-1的一些作用，特别是瘦肉组织减少18，但是此神经内分泌的变化并不能解释MIC-1处理动物中的脂肪减少。实际上，具有低血清IGF-1水平的同系类小鼠显示出显著增加的身体脂肪19。
对生长激素轴的抑制可能是对MIC-1引起的食欲减退和体重减轻的保护性适应。与此相一致，受限的能量摄取抑制啮齿动物和人的下丘脑-垂体-生长激素轴和/或降低血清IGF-1水平20，21，22。因此，MIC-1处理对生长激素轴的作用可能是MIC-1主要作用(食欲减退和体重减轻)的继发后果，而不是MIC-1作用的主要调节者。
具有MIC-1肿瘤的小鼠还表现出血清瘦蛋白水平的显著降低，尽管伴有食欲低下。这提示MIC-1掩盖了血清瘦蛋白水平降低引起的食欲促进作用，这与瘦蛋白缺陷型ob/ob小鼠(例如瘦动物)还表现出响应于MIC-1的食欲低下和体重减轻这一观察结果相一致。
血清MIC-1水平与晚期前列腺癌患者的体重减轻直接相关
为确定MIC-1与人食欲减退/恶病质的相关性，检测了被招募到良好表征的晚期前列腺癌(PCa)患者群组中的患者的血清MIC-1水平，其中血清IL-6水平与恶病质相关23。与未患有恶病质的晚期癌症患者相比，患有恶病质的晚期癌症患者中血清MIC-1水平显著升高(12416±10235pg/ml与3265±6370pg/ml(平均值±SD)；p＜0.0001；Mann-Whitney-U检验)。类似地，恶病质患者中血清IL-6水平升高(33.8±64.2pg/ml与7.8±3.4pg/ml，p＜0.002；Mann-Whitney-U检验)。血清MIC-1与血清IL-6水平弱但显著地正相关(r＝0.2949，p＜0.04；线性回归)。此外，在单变量logistic回归和多变量logistic回归中，血清MIC-1和IL-6水平均为癌症恶病质存在的独立预测因子(分别为p＝0.0002，p＜0.0001；单变量logistic回归；分别为p＝0.0017，p＜0.0005；多变量logistic回归)。然而，食欲减退/恶病质最客观的可定量衡量标准是体重减轻。血清MIC-1水平与和前列腺癌相关的体重减轻程度显著相关(图4a；p＝0.0002，r＝0.4899；线性回归)，而血清IL-6与和前列腺癌相关的体重减轻程度则没有这样的相关性(p＝0.6303；线性回归)(图9b)。
这些结果还提供了以下可能性：血清MIC-1评价可用作预测前列腺癌相关性恶病质的检验。为评价此可能性，通过接受器工作曲线(ROC)分析比较了癌症诊断时存在的目前最佳的血清标记物(IL-6)和血清MIC-1水平。作为癌症相关性体重减轻的预测因子，血清MIC-1水平显著优于IL-6(曲线下面积(AUC)为0.6829和0.3505；p＝0.0046)。考虑到血清MIC-1水平对癌症恶病质的诊断能力，用于诊断前列腺癌的最广泛应用的血清标志物PSA的ROC的AUC为0.678(95％置信区间，0.666-0.689)24，几乎等同于MIC-1的特征。因此，血清MIC-1测量应证明可用于预测与前列腺癌相关的癌症恶病质，并且还鉴定可能受益于被设计成降低血清MIC-1水平的任何未来疗法的患者。
血清MIC-1水平与慢性肾衰竭患者中BMI相关
如晚期癌症一样，慢性肾衰竭也可能与体重减轻和恶病质相关。此过程的标志例如食欲减退、体重减轻和BMI是晚期肾衰竭死亡的强预测因子30。因为BMI是死亡的强预测因子，并且血清MIC-1水平升高与动物中相似变化相关联，所以研究了晚期肾衰竭中血清MIC-1水平与BMI之间的相关性。为此，检验了来自381名晚期肾衰竭患者群组的血清样品，所述样品没有被集合以研究恶病质或其它代谢过程31。
在研究期间(多达3年)死亡的患者具有显著较低的BMI(26.17±5.63；266(平均值±SD；n)，23.15±4.92；104：p＜0.0001；非配对t检验)。在研究开始时获得透析前血清样品，并测定血清MIC-1水平。血清MIC-1水平与BMI相关，从而血清MIC-1水平升高与BMI降低相关(p＝0.0003；r＝0.189；线性回归)。
过表达MIC-1的转基因小鼠更瘦小并且吃得更少
为确定长期施用MIC-1可能出现的作用，研究了过表达受控于CSF-1启动子的MIC-1的C57BL6转基因小鼠(fmsMIC-1小鼠)。当在出生后最初48小时内测量时，这些小鼠与其WT对照具有相似的体重(图10a)。然而，到21天龄时，雄性和雌性fmsMIC-1小鼠的体重均比其性别匹配的WT同窝小鼠轻18％(图10a)，此差异持续到成年期。从绝对值上讲，fmsMIC-1小鼠吃得比对照小鼠少(图10b)，但在依据小鼠体重校正摄食量时此差异消失。可能出生后摄食量的降低可导致小鼠发育比同类系同窝小鼠瘦小，并因此吃得相应更少。与用MIC-1短期处理的小鼠相似，雄性和雌性fmsMIC-1小鼠的所有测量贮库中的脂肪均减少(图10c)。总的说来，过表达MIC-1的转基因小鼠的数据与利用此细胞因子短期处理的小鼠的数据大体一致。
全身性施用MIC-1活化下丘脑神经元
食欲和体重控制的主要调节中枢位于下丘脑中，尤其是弓状核区域(ARC)中，其被认为具有半通透性的血脑屏障，可能允许血液运载的调节剂与脑的此区域直接相互作用25。为确定MIC-1是否直接对脑发挥其作用，给小鼠腹膜内注射重组hMIC-1，然后1小时后将其处死以检查即早期基因c-fos的脑表达模式。此转录因子由多种刺激快速诱导，是广泛使用的、可靠的神经元活化指示剂26。注射MIC-1后，下丘脑ARC和室旁核(PVN)中c-fos免疫反应活性显著增加，表明这些核中的神经元是MIC-1作用的下游调节剂。有趣的是，脑干最后区(AP)也显示出c-fos阳性神经元数目的显著增加(表1)，提示此核对MIC-1作用做出响应的潜在作用。孤束核(NTS)或下丘脑或脑干的任意其它区域中c-fos阳性神经元数目无变化(数据未显示)。
表1
核   c-fos核％(对照)   c-fos核％(MIC-1)   P值
  ARC   100±6.01   138±7.3   0.0036
  PVN   100±9.9   168±9.3   0.001
  AP   100±22.5   377±22.9   0.0014
对脑的多个区域包括ARC、PVN、AP和NTS中c-fos核染色进行定量并以平均值和标准偏差表示
这些发现提示，MIC-1的核心作用在于ARC，其为食欲控制的主要中心。来自ARC的映射到达其它下丘脑核(例如PVN)，在那里与脑干区域(包括所述AP)形成连接，通过所述连接，它们特异性地调节迷走交感神经系统活性27。然而，不能排除的MIC-1直接活化AP。NTS中c-fos活化不改变，这表明通过迷走神经由外周传入的信号不参与介导MIC-1作用。
下丘脑MIC-1特异性过表达诱导体重减轻
为进一步证实MIC-1诱导的体重减轻是通过下丘脑介导的作用而进行的，将腺相关病毒(AAV)直接单侧注射到下丘脑弓状核内来诱导MIC-1表达。其被改造成表达受控于神经元特异性烯醇酶启动子的全长人MIC-1。使用人MIC-1特异性抗体的免疫组化证明了此蛋白质由细胞在ARC中的表达(图11)。以此方式注射表达MIC-1的AAV的小鼠快速减轻体重，但是注射空对照载体的小鼠以正常方式增加体重。这为MIC-1直接作用于下丘脑细胞提供了进一步有力的证据。
全身性施用的MIC-1通过TGF-βRII受体作用于ARC
TGF-β超家族蛋白(例如MIC-1)结合高度保守的受体超家族并通过其起作用，所述受体超家族由4种不同的II型(RII)受体和7种I型受体(RI)组成，其各自含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。结合配体时，两个RII和两个RI受体组装成四聚体，其中RII使位于细胞质RI结构域中的丝氨酸残基磷酸化。这开始了信号传导级联，其常涉及保守smad家族的转录因子。许多其它信号传导分子也被活化，包括erk 1/2，其之前与MIC-1激发的受体活化相关联14，32。
为确定MIC-1优选的RII受体，利用多种抗不同RII受体的抗体进行了免疫组化。这表明，仅TGF-βRII与c-fos共同定位于处死前30分钟注射MIC-1的小鼠的下丘脑中(数据未显示)。为确定TGF-βRII受体是否形成所述MIC-1结合受体复合物的一部分，将此受体的封闭抗体单侧注射到下丘脑中。24小时后，给这些小鼠腹膜内注射10μgMIC-1。30分钟后处死小鼠，检测下丘脑c-fos表达。
在注射TGF-βRII抗体的一侧将免疫组化核c-fos表达封闭，但是不封闭对侧的c-fos表达。重要的是，针对密切相关的骨形成蛋白(BMP)的RII或瘦蛋白受体注射封闭抗体并不导致抑制MIC-1诱导的c-fos表达(数据未显示)。这清楚地表明，TGF-βRII受体必须形成复合物的一部分，MIC-1通过所述复合物在下丘脑中发挥其作用。
为探究MIC-1诱导下丘脑中下游作用的机制，对处死前15分钟至60分钟之间腹膜内注射100μg MIC-1的小鼠的下丘脑进行进一步的免疫组化。使用对smad信号传导途径成员的磷酸化形式具有特异性的抗体：smad 2、smad 3和smad 1、5、8。在每种情形下，未处理小鼠的ARC还表明用所有抗体染色的核的存在，提示下丘脑中这些途径的组成性活化(数据未显示)。可检测到MIC-1处理小鼠中smad染色无显著性增加，表明这些途径未被利用或者可能这些途径的组成性活化掩盖了smad磷酸化的任何显著增加。然而，已经有几个小组报道了MIC-1直接诱导erk 1/2的磷酸化32。因此，检测了处死前10分钟至60分钟之间注射100μg MIC-1的小鼠下丘脑中此分子的活化。腹膜内注射MIC-1后，检测了ARC中P-erk 1/2染色，最大值出现在注射MIC-1后20分钟。在注射对照缓冲液的小鼠中不存在此途径的活化。总之，这些数据表明，MIC-1通过erk 1/2途径的活化来介导作用。
全身性施用的MIC-1调节ARC的NPY和POMC表达并活化转录因子 stat3
为确定全身性注射MIC-1是否活化已知与食欲调节相关的ARC神经元途径，研究了两种主要的食欲调节剂NPY和POMC的表达。利用原位杂交，观察到注射MIC-1使ARC中NPY mRNA表达水平降低34％，使POMC mRNA水平增加47％，这与减少进食动力相一致(表2)。
表2
 mRNA(ARC)   阳性％(对照)  阳性％(MIC-1)   P值
 NPY   100±13.3  66±6.1   0.0272
 POMC   100±7.6  147±10.5   0.0061
对ARC中的表达细胞进行了定量，结果表示为平均值和标准差。
这种主要POMC食欲减退途径的上调和NPY促进食欲途径的下调在方式上与在瘦蛋白处理小鼠中所观察到的相似(数据未显示)。
由于此相似性，还用抗磷酸化stat3(P-stat3)抗体探测了MIC-1处理小鼠的下丘脑，所述磷酸化stat3是瘦蛋白受体信号传导途径的重要分子(数据未显示)。这清楚地表明，MIC-1处理小鼠的外侧ARC和腹侧正中下丘脑中P-stat3染色神经元显著上调。有趣的是，MIC-1处理小鼠中P-stat3的染色方式与注射瘦蛋白所诱导的不同，与注射瘦蛋白时为背部ARC相比，注射MIC-1的小鼠中大多数P-stat3阳性神经元存在于外侧ARC中。因此，MIC-1和瘦蛋白虽然均活化ARC中的stat3信号传导途径，但却诱导不同的ARC神经元子集上的P-stat3。这些发现提示，MIC-1和瘦蛋白通过不同的途径诱导其作用。与此一致，将MIC-1注射到瘦蛋白受体缺陷型db/db小鼠中，在ARC中产生的P-stat3染色与在注射MIC-1的WT小鼠中所观察的相当，结论表明MIC-1不通过瘦蛋白受体起作用。
为进一步鉴定MIC-1诱导的P-stat3阳性神经元，进行了NPY的原位杂交以及α-黑色素细胞刺激素(α-MSH，POMC的生物活性加工产物)的免疫组化以及P-stat3的免疫组化/免疫荧光(数据未显示)。这证明了α-MSH和NPY神经元为主要的MIC-1靶标种类，并且表明导致此模型体重减轻的摄食量降低是由于NPY和α-MSH产生改变而引起的。此外，与c-fos活化的结果一致，大部分这些P-stat3/NPY和P-stat3/α-MSH阳性神经元代表不同的被瘦蛋白活化的神经元子集，从而代表了MIC-1调节食欲的新途径。
将MIC-1直接注射到ARC内也活化stat3
为提供MIC-1直接作用于ARC的进一步证据，研究了将MIC-1、瘦蛋白或对照缓冲液直接单侧注射到所述ARC内。完成注射后20分钟，处死小鼠，对脑切片染色用于P-stat3。虽然对照注射没有作用，但是瘦蛋白和MIC-1均明显诱导所述ARC中P-stat3的活化(数据未显示)。染色模式与全身性施用调节剂所观察到的相似，其中注射MIC-1诱导ARC外侧部和下丘脑腹侧正中核(VMHDM)背部中神经元中stat3的磷酸化。与之相反，瘦蛋白注射活化ARC背部、VMHDM背部以及下丘脑外侧区(LHA)的神经元中Stat3途径(数据未显示)。这进一步表明这两种调节剂作用于下丘脑中不同的神经元子集。
讨论
动物模型和前列腺癌患者中肿瘤过表达MIC-1以及血清MIC-1水平与体重减轻的强相关表明，MIC-1参与癌症食欲减退/恶病质以及可能的其它恶病质病症(例如与心脏衰竭和肾脏衰竭相关的那些病症)的发病机制。虽然许多研究描述了患有癌症食欲减退/恶病质的人与不具有此并发症的相比细胞因子水平升高，但是还没有任何人证实细胞因子水平与对于MIC-1而言明显的体重减轻程度之间的直接相关性。此相关性以及本文所提供的机制性部分的数据表明，MIC-1作用于下丘脑神经元中的TGF-βRII受体来降低食欲，确定了MIC-1是癌症相关的食欲减退和体重减轻的重要原因。此外，通过抗MIC-1抗体对食欲减退/恶病质的逆转作用表明了利用治疗性抗体(和其它MIC-1拮抗剂)治疗此严重疾病的潜力。最后，本文所示结果表明，MIC-1引起食欲低下并且能直接影响摄食量和能量动态平衡、NPY和POMC源α-MSH的主要下丘脑调节剂。此外，虽然MIC-1诱导食欲减退、体重减轻的瘦蛋白样作用并且减少下丘脑NPY表达以及增加POMC表达，但是由MIC-1活化的NPY和POMC神经元的子集与由瘦蛋白活化的不同。这表明，神经元的更多种功能性网络调节能量动态平衡的不同方面，并且合起来证实MIC-1是食欲和体重的核心调节剂并且与其受体复合物一起提供了作为用于治疗癌症食欲减退/恶病质和肥胖之靶标的相当大的潜力。
在整个说明书中，词语“包含”或者变化形式例如“包括”或“含有”应当理解为意味着涵盖所述元素、整体或步骤，或者元素、整体或步骤的组，但是不排除任意其它元素、整体或步骤，或者元素、整体或步骤的组。
本说明书中所述的所有出版物在此通过引用并入本文。包含在本说明书中的对文献、法案、材料、设备、文章等的任意描述仅用于提供本发明情形的目的。不应当认为，由于任意或所有这些材料在本申请每个权利要求的优先权日前存在于澳大利亚或其它地方而就承认其构成现有技术基础的一部分或是与本发明相关的领域中的一般常识。
本领域技术人员应当理解，可在不背离广泛描述的本发明精神或范围的情形下，如具体实施方案所述对本发明进行多种改动和/或修改。因此，本发明的实施方案应当在所有方面被认为是示例性的而不是限制性的。
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<223>NPY
 
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<223>POMC
 
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<213>小鼠
 
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<223>GHRH
 
<400>3
gcttgtcctc tgtccacatg ctgtcttcct ggcggctgag cctgg      45

Claims (25)

1.一种调节对象中巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)之活性的方法，包括向所述对象施用有效量的与包含转化生长因子-β(TGF-β)RII受体的MIC-1受体复合物相互作用并调节其活性的药剂，其任选地与药理学上可接受的载体和/或赋形剂相混合。
2.权利要求1的方法，其中所述药剂与MIC-1受体复合物相互作用并调节其活性。
3.权利要求2的方法，其中所述药剂抑制MIC-1的活性以增加对象的食欲和/或体重。
4.权利要求3的方法，其用于治疗与MIC-1过表达相关的食欲减退/恶病质。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述药剂与所述TGF-βRII受体相互作用。
6.权利要求5的方法，其中所述TGF-βRII受体是下丘脑TGF-βRII受体。
7.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述药剂选自ALK5抑制剂、MIC-1的抑制性肽片段和模拟物、抗TGF-βRII抗体及其片段、抗RI抗体及其片段。
8.权利要求2的方法，其中所述药剂提高MIC-1的活性以降低对象的食欲和/或体重。
9.权利要求8的方法，其用于治疗肥胖。
10.权利要求8或9的方法，其中所述药剂与所述TGF-βRII受体相互作用。
11.权利要求10的方法，其中所述TGF-βRII受体是下丘脑TGF-βRII受体。
12.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述药剂选自MIC-1的刺激性肽片段和模拟物。
13.权利要求1的方法，其中所述药剂调节所述对象中MIC-1受体复合物的量。
14.权利要求13的方法，其中所述药剂降低所述对象中MIC-1受体复合物的量。
15.权利要求14的方法，其中所述药剂选自靶向编码所述MIC-1受体复合物之基因的催化性和抑制性寡核苷酸分子以及MIC-1受体复合物转录或翻译的抑制剂。
16.权利要求14或15的方法，其中所述药剂通过降低内源性TGF-βRII受体的量来降低MIC-1受体复合物的量。
17.权利要求16的方法，其中所述TGF-βRII受体是下丘脑TGF-βRII受体。
18.权利要求13-17中任一项的方法，其用于治疗与MIC-1过表达相关的食欲减退/恶病质。
19.权利要求4或18的方法，其中所述MIC-1过表达是由癌症引起的。
20.权利要求4或18的方法，其中所述MIC-1过表达是由慢性肾衰竭引起的。
21.一种用于筛选能够调节巨噬细胞抑制因子(MIC-1)活性的药剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)使所述药剂与包含转化生长因子-β(TGF-β)RII受体的MIC-1受体复合物或其单体接触，以及
(ii)检测所述MIC-1受体复合物或其单体的任何活性变化。
22.权利要求21的方法，其中所述MIC-1受体复合物或其单体在培养细胞的表面上提供。
23.权利要求21或22的方法，其中所述MIC-1受体复合物或其单体活性的变化可通过检测erk 1/2、P-stat3信号传导分子或smad和/或akt信号传导途径的活化与否来检测。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述TGF-βRII受体是下丘脑TGF-βRII受体。
25.通过权利要求21-24中任一项的方法鉴定的新药剂。
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