KR100598441B1 - 코르티코트로핀 방출 인자 수용체를 이용하는 근육 질량또는 기능 조절을 위한 화합물의 동정 방법 - Google Patents

Abstract

코르티코트로핀 방출 인자 2 수용체에 결합하거나 이를 활성화시키고, 생체 내에서 골격근 질량 또는 기능을 조절 또는 잠재적으로 조절하는 화합물의 동정을 위한 스크리닝 방법이 제공된다. 또한, CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 활성화를 연장 또는 증강시키고, CRF₂R 을 증가시키거나 CRF 발현을 증가시키는 화합물의 동정을 위한 스크리닝 방법이 개시된다. CRF₂R 작동제, CRF₂R 에 대한 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 골격근 질량 또는 기능을 증가시키거나, 개입을 위한 표적으로서 CRF₂R 을 이용하는 골격근 위축의 처치를 위한 방법, 및 근육 이영양증의 처치 방법이 기재된다.

코르티코트로핀, 근육 이영양증

Description

코르티코트로핀 방출 인자 수용체를 이용하는 근육 질량 또는 기능 조절을 위한 화합물의 동정 방법 {METHODS FOR IDENTIFYING COMPOUNDS FOR REGULATING MUSCLE MASS OR FUNCTION USING CORTICOTROPIN RELEASING FACTOR RECEPTORS}

도 1 은 마우스 좌골 신경 신경 제거 위축 모델에서 비복근 내측건에 대한, CRF₁R/CRF₂R 작동제인 소바진 (피하 투여됨, 1 일 2 회) 의 항위축 효과를 나타낸다.

도 2 는 마우스 좌골 신경 제거 위축 모델에서 전방 경골근에 대한 소바진 (삼투성 미니펌프로 연속 투여됨) 의 항위축 효과를 나타낸다.

도 3a 및 3b 는 전방 경골근 (도 3a) 및 비복근 내측건 (도 3b) 의 글루코코르티코이드-유도 위축에 대한 소바진 (삼투성 미니펌프로 연속 투여됨) 의 항위축 효과를 나타낸다.

도 4a 는 비캐스팅된 (정상) 전방 경골근에 대한 비후-유도 효과 및 전방 경골근의 캐스팅-유도 위축에 대한 소바진 (피하 투여됨, 1 일 2 회) 의 항위축 효과를 나타낸다. 도 4b 는 비복근 내측건의 캐스팅-유도 위축에 대한 소바진의 항위축 효과 및 비캐스팅된 (정상) 비복근 내측건에 대한 소바진의 비후 유도 효과를 나타낸다.

도 5 는 마우스 좌골 신경 제거-유도 위축 모델에서 전방 경골근에 대한 소바진 및 유로코르틴 (삼투성 미니펌프로 연속 투여됨) 의 항위축 및 비후 유도 효과를 나타낸다.

도 6a 및 6b 는 전방 경골근 (도 6a) 및 비복근 내측건 (도 6b) 의 불용성-유도 위축에 대한 유로코르틴 (피하 투여됨, 1 일 2 회) 의 항위축 효과를 나타낸다.

도 7 은 전방 경골근 (도 7a), 장 지신근 (EDL) (도 7b), 가자미근 (도 7c), 비복근 내측건 (도 7d), 및 족저근의 신경제거-유도 위축에 대한, 부신절제 래트 좌골 신경 제거-유도 위축 모델에서 소바진 (피하 투여됨, 1 일 2 회) 의 항위축 효과를 나타낸다. 또한, 비-신경제거 EDL 근육의 소바진 유도 비후를 나타낸다 (도 7b).

도 8 은 마우스 좌골 신경 제거 위축 모델에서, 소바진 (삼투성 미니펌프로 연속 투여됨) 이 야생형 마우스에서는 전방 경골근에 대한 항위축 효과를 갖지만, CRF₂R 녹아웃 마우스에서는 그렇지 않음을 나타낸다.

도 9a 및 b 는 마우스 다리 캐스팅 불용성 위축 모델에서, 소바진이 질량 (도 9a) 또는 근육 기능 (도 9b) 으로 측정되는 바와 같이 EDL 근 및 가자미근에 대한 항위축 효과를 가짐을 나타낸다.

본 발명은 코르티코트로핀 방출 인자-2 수용체 (CRF₂R)의 활성 또는 발현을 조절하거나, 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물의 동정 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개입을 위한 표적으로서 CRF₂R 을 이용하는 골격근 비후를 유도하기 위한 방법 또는 골격근 위축의 처치 방법, 및 표적으로서 CRF₂R 및 코르티코트로핀 방출 인자-1 수용체 (CRF₁R) 를 이용하는 근육 이영양증의 처치 방법에 관한 것이다.

CRFR 및 리간드

G 단백질에 커플링된 단백질 (GPCR) 군에 속하는, 현재까지 동정된 2 종의 코르티코트로핀 방출 인자 수용체 (CRF₁R 및 CRF₂R) 가 존재한다. CRF₁R 또는 CRF₂R 의 작동제 활성화는 아데닐레이트 시클라아제의 활성화를 일으킨다. 아데닐레이트 시클라아제는 cAMP 의 형성을 촉매하며, 이는 다시 단백질 키나아제 A 의 활성화, 세포 내 칼슘 방출 및 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAP kinase) 의 활성화를 포함하는 다중 효과를 갖는다. 다른 연구에서, CRF 수용체의 작동제 활성화 후의 세포 내 이노시톨 트리포스페이트 합성의 증강은 CRFR 이 또한 G_αq 에 커플링되어 있음을 시사한다.

CRF₁R 및 CRF₂R 은 인간, 래트, 마우스, 닭, 소, 메기, 개구리 및 양에서 클 로닝되었다. CRF₁R 및 CRF₂R 각각은 독특한 분포 패턴을 갖는다. 인간에서는, CRF₂R 수용체의 3 개 이성형인 알파, 베타 및 감마가 클로닝되었다. 알파 및 베타 CRF₂R 에 대한 상동체가 래트에서 동정되었다.

CRFR의 일부 리간드/작동제가 공지되어 있다. 코르티코트로핀 방출 인자 (또는 호르몬, CRF 또는 CRH) 는 CRF₁R 및 CRF₂R 에 결합하여 이를 활성화시킨다. CRF 는 스트레스에 대한 신체 반응의 주요 조절자이다. 상기 41 개 아미노산 펩티드는 시상하부-뇌하수체-부신 호르몬 축 (HPA 축) 의 일차 조절자로서, 신경, 내분비 및 면역 과정의 의식을 주재한다. 또한, CRF 와, 양서류 펩티드인 소바진 (sauvagine) 및 텔로스티안 (telostian) 펩티드인 유로텐신 (urotensin) (둘 다 CRF₁R 및 CRF₂R 의 작동제로서 작용함) 사이에는 실질적인 서열 상동성이 존재한다. 상기 3 펩티드는 혈압강하제 및 ACTH 씨크리토고그 (secretogogue) 로서 유사한 생물학적 특성을 갖는다. 또한, 유로텐신의 포유류 동류물인 유로코르틴의 특성이 밝혀져 있다.

CRF 수용체는 선택적인 작동제 및 길항체의 사용을 통해 약리학적으로 비-CRFR 와 구분될 수 있다. 상기 선택적 작동제 및 길항제와 CRFR 녹아웃 마우스는 어느 CRF 수용체가 특정한 생물학적 반응을 매개하는지를 결정하는데 유용하였다.

CRF₁R 의 역할은 매우 잘 밝혀져 있다. CRF₁R 유전자가 제거된 마우스 (CRF₁R 녹아웃) 는 손상된 스트레스 반응 및 감소된 불안유사 행동을 나타낸다. CRF₁R 은 HPA 축의 주요 매개자이다. 구체적으로, 시상하부에서 방출되어 시상하부-하수체 문맥계 (hypothalamic-hypophysial portal system) 를 통해 뇌하수체 전엽으로 수송되는 코르티코트로핀 방출 인자는 뇌하수체 전엽에 위치한 세포에 존재하는 CRF₁R 과 상호작용한다. CRF₁R 의 작동제 활성화는 뇌하수체 전엽의 세포로부터 전신 순환계로 ACTH 를 방출시킨다. 방출된 ACTH 는 부신 피질에 위치하는 세포에 존재하는 ACTH 수용체에 결합하여, 코르티코스테로이드를 포함하는 부신 호르몬을 방출시킨다. 코르티코스테로이드는 흉선 및 비장 위축이 관여되는 기전을 통한 면역계 억제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 여러 효과를 매개한다. 따라서, CRF₁R 의 활성화는 간접적으로 HPA 축의 활성화를 통한 면역계의 하향조절을 일으킨다.

CRF₂R 의 역할은 덜 자세히 밝혀져 있다. CRF₂R 유전자가 제거된 (CRF₂R 녹아웃) 마우스는 유로코르틴의 자극에 따른 손상된 음식 섭취 감소, 혈관확장 소실을 나타내지만 정상적인 스트레스 반응을 나타낸다. CRF₂R 을 이용한 실험에서는 CRF₂R 이 CRFR 작동제의 저혈압성/혈관확장성 효과, 및 CRFR 작동제로의 마우스 처리 후 관찰되는 식품 섭취의 감소에 관여하는 것으로 나타났다.

골격근 위축 및 비후

골격근은 작업 또는 대사적 필요에 따른 생리적 요구의 변화에 쉽게 적응하 는 유연한 조직이다. 비후란 골격근 질량의 증가를 말하며, 골격근 위축이란 골격근 질량의 감소를 말한다. 급성 골격근 위축은 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 여러 원인에 기인할 수 있다: 수술, 장기 요양 또는 골절로 인한 불용성; 척추 손상, 자가면역 질환 또는 감염성 질환으로 인한 신경제거/신경 손상; 비관련 증상에 대한 글루코코르티코이드 사용; 감염 또는 기타 원인으로 인한 패혈증; 질병 또는 기아로 인한 영양 제한; 및 우주 여행. 골격근 위축은 정상적인 생물학적 과정을 통해 일어나지만, 특정 의료 상황에서 상기 정상적인 생물학적 과정은 근육 위축의 쇠약 수준까지 일으킨다. 예를 들어, 급성 골격근 위축은 정형외과적 수술을 동반하지만 이에 제한되는 것은 아닌 고정으로부터 환자의 재활을 심각하게 제한한다. 이런 경우, 골격근 위축을 되돌리기 위해 필요한 재활 기간은 종종 본래 손상을 복구하는데 필요한 시기보다 훨씬 더 길다. 이러한 급성 불용성 위축은 특히, 이미 근육 기능 및 질량에 있어서 상당한 연령 관련 결핍을 겪을 수 있는 노년층에서 상기 위축이 영구적인 장애 및 때이른 사망을 일으킬 수 있으므로 큰 문제가 된다.

골격근 위축은 또한 만성 증상, 예컨대 암 악액질, 만성 염증, AIDS 악액질, 만성 폐색성 폐질환 (COPD), 울혈성 심부전, 유전 장애, 예로, 근육 이영양증, 신경퇴화성 질환 및 사르코페니아 (연령 관련 근육 소실) 에서 일어날 수 있다. 상기 만성 증상에 있어서, 골격근 위축은 운동성의 때이른 소실을 일으켜서, 질환-관련 이환률에 추가될 수 있다.

골격근의 위축 또는 비후를 조절하는 분자적 과정에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 골격근 위축을 개시하는 자극은 다양한 위축 개시 상황에 따라 상이하지만, 단백질 합성의 감소 및 단백질 분해의 증가, 및 느린 것에서 (매우 산화적인 대사/느린 수축성 단백질 이성형) 빠른 것으로의 (매우 해당적인 대사/빠른 수축성 단백질 이성형) 섬유 변경에 특징적인 수축성 및 대사성 효소 단백질 동종효소 (isozyme) 둘 다에서의 변화를 포함하는 일부 공통적인 생화학적 변화가 피해 골격근 섬유에서 일어난다. 일어나는 추가적 골격근 변화에는 맥관 구조의 소실 및 세포외 기질의 재모델링이 포함된다. 빠르고 느린 트위치 근육은 둘 다, 특정 위축 자극 또는 증상에 따른 상대적 근육 소실을 가지며, 적절한 증상 하에서 위축을 나타낸다. 중요하게는, 모든 상기 변화는 통합적으로 조절되며, 생리적 및 대사적 필요에 따른 변화를 기준으로 시작되고 종결된다.

위축 및 비후가 일어나는 과정은 포유류 종에 걸쳐 보존되어 있다. 여러 연구에서, 설치류 및 인간 둘 다에서 위축 동안 동일한 기본적 분자적, 세포적 및 생리적 과정이 일어나는 것으로 나타났다. 따라서, 골격근 위축의 설치류 모델이 인간 위축 반응을 이해 및 예측하는데 성공적으로 이용되어 왔다. 예를 들어, 설치류 및 인간 둘 다에서 다양한 방법에 의해 유도되는 위축은 근육 해부, 단면적, 기능, 섬유형 변경, 수축성 단백질 발현 및 조직학에서 유사한 변화를 일으킨다. 또한, 일부 제제는 설치류 및 인간 둘 다에서 골격근 위축을 조절하는 것으로 나타났다. 이들 제제에는 동화성 (anabolic) 스테로이드, 성장 호르몬, 인슐린 유사 성장 인자 I, 및 베타 아드레날린성 작동제가 포함된다. 이와 함께, 이들 데이타는 설치류 및 인간 둘 다에서 공통 기전으로부터 골격근 위축이 일 어난다는 것을 나타낸다.

일부 제제가 골격근 위축을 조절하는 것으로 나타났고, 상기 적응증에 대해 인간에서의 사용을 허가받았지만, 이들 제제는 바람직하지 않은 부작용, 예컨대 심근 비후, 종양, 다모증, 여성의 남성화, 이환률 및 사망률의 증가, 간 손상, 저혈당, 근골격통, 증가된 조직 팽창압, 빈맥 및 부종을 갖는다. 현재, 급성 또는 만성 골격근 위축에 대한 매우 효과적이고 선택적인 처치는 존재하지 않는다. 따라서, 골격근 위축을 조절하는 다른 치료제를 동정하는 것이 필요하다.

근육 이영양증

근육 이영양증에는 골격근 무력의 선택적 분포에 의해 임상적으로 구별되는, 일군의 유전적 진행성 근육 장애가 포함된다. 근육 이영양증의 가장 일반적인 2 가지 형태는 Duchenne 및 Becker 이영양증으로, 각각은 Xp21 유전자좌에 위치한 디스트로핀 유전자의 돌연변이 유전으로부터 일어난다. 기타 이영양증에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: p94 칼파인, 어드할린, γ-사르코글리칸 및 β-사르코글리칸 유전자좌를 포함하는 다중 유전적 유전자좌의 돌연변이로부터 일어나는 지대 (limb-girdle) 근육 이영양증; 안면견갑상완 (Landouzy-Dejerine) 근육 이영양증, 근긴장성 이영양증, 및 Emery-Dreifuss 근육 이영양증. 거의 남성에서만 발생하는 Duchenne 근육 이영양증의 증상에는 동요성 보행, 경보, 척추전만, 빈번한 넘어짐 및 일어서기와 계단 오르기의 어려움이 포함된다. 대부분의 환자에서 증상은 약 3-7 세 연령에서 시작되어 10-12 년을 휠체어에 의지하다가, 다수는 호흡기 합병증으로 약 20 세 연령시에 사망한다. Duchenne 근육 이영양증에 대한 최근 처치에는 치료약이 아니고, 근육 강도 감소를 느리게하고, 무능을 지연시키는 프레드니손 (코르티코스테로이드 약물) 의 투여가 포함된다. 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손은 질환으로 인해 일어나는 근섬유 손상에 의해 침전되는 침윤 및 면역 세포 활성화를 차단하여 작용한다고 여겨진다. 불행하게도, 코르티코스테로이드 처치는 또한 상기 환자들의 면역 반응을 차단하는 일부 잠재적 이익을 무효화시키는 골격근 위축을 일으킨다. 따라서, 근육 이영양증 환자에서의 근섬유 손상을 느리게하고, 무능의 개시를 지연시키지만, 현재의 요법에 비해 더 적은 정도로 골격근을 위축시키는 치료적 제제를 동정해야할 필요가 있다.

골격근 위축 또는 근육 이영양증의 처치에 사용하기 위한 화합물의 동정과 관련된 한가지 문제점은 상기 화합물의 동정을 위한 우수한 스크리닝 방법이 없다는 것이었다. 이제, 출원인들은 CRF₂R 이 골격근 질량 또는 기능의 조절에 관여하며, CRF₂R 의 작동제가 골격근 위축을 차단하고/하거나 골격근 비후를 유도할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은, 근위축의 처치에 유용한 후보 화합물을 동정하기 위해 사용될 수 있는 CRF₂R 을 이용하는 스크리닝 방법을 제공함으로써, 근위축의 처치를 위한 화합물 동정의 문제점을 해결한다. 본 발명은 또한 CRF₁R 및 CRF₂R 둘 다를 활성화시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공함 으로써, 근육 이영양증의 처치를 위한 화합물 탐색의 문제점을 해결한다.

본 발명의 개요

본 발명은 골격근 위축의 처치에 있어서 잠재적으로 유용하거나 골격근 비후를 유도하기 위한 후보 화합물의 동정을 위한 CRFR 의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 시험 화합물과 CRF₂R 을 발현하는 세포를 접촉시키거나 시험 화합물과 단리된 CRF₂R 을 접촉시키고, 시험 화합물이 CRF₂R 에 결합하거나 이를 활성화시키는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 골격근 질량 또는 기능의 조절을 위해 후보 화합물을 동정하기 위한 시험관 내 방법을 제공한다. 본 발명의 또다른 구현예는 비인간 동물에게 후보 화합물을 투여하고, 처치받은 동물에서 후보 화합물이 골격근 질량 또는 근육 기능을 조절하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, CRF₂R 에 결합하거나 이를 활성화시키는 것으로 결정된 하나 이상의 후보 화합물의 군으로부터, 치료적 후보 화합물을 동정하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 구현예는 임의 순서로 하기를 포함하는, 골격근 질량 또는 기능의 조절을 위한 후보 화합물을 동정하기 위한 방법에 관한 것이다: (i) 시험 화합물과 기능성 CRF₂R 을 발현하는 세포를 접촉시키고, 시험 화합물로부터 유래되는 CRF₂R 의 활성화 수준을 측정; (ii) 시험 화합물과 기능성 CRF₁R 을 발현하는 세포를 접촉시키고, 시험 화합물로부터 유래되는 CRF₁R 의 활성화 수준을 측정; 이어서 (iiii) CRF₂R 활성화 수준 및 CRF₁R 활성화 수준을 비교; 및 (iv) 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물로서 CRF₂R 에 대한 선택성을 나타내거나 CRF₂R 및 CRF₁R 에 대해 유사 활성을 보이는 시험 화합물을 동정.

본 발명은 또한 CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 작동제-유도 활성화를 연장시키거나 증강시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법에는 임의 순서 또는 동시적으로 하기가 포함된다: (i) 시험 화합물을 기능성 CRF₂R 을 발현하는 세포와 접촉시킴, (ii) 세포를 충분한 시간 동안 및 충분한 농도로 CRF₂R 작동제로 처리하여, 대조군 세포에서 CRF₂R 의 탈감작을 일으킴; 이어서 (iii) CRF₂R 의 활성화 수준 측정, 및 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물로서 CRFR 또는 CRFR 신호 전달 기전의 활성화를 연장시키거나 증강시키는 시험 화합물을 동정. 특정 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 활성화를 연장시키거나 증강시키는 것으로 결정된 하나 이상의 후보 화합물의 군으로부터 치료적 후보 화합물의 동정 방법에 관한 것이다: 비인간 동물에게 CRF₂R 작동제와 함께 후보 화합물을 투여, 및 후보 화합물이 처치받은 동물에서 골격근 질량 또는 기능을 조절하는지 여부를 결정.

또한 본 발명은, CRF₂R 유전자 조절 요소와 작동적으로 연합된 리포터 유전자를 함유하는 세포 또는 세포 용해액과 시험 화합물의 접촉 및 리포터 유전자의 발현 검출을 포함하는, CRF₂R 발현을 증가시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 리포터 유전자의 발현을 증가시키는 시험 화합물은 CRF₂R 발현을 증가시키는 후보 화합물로서 동정된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 후보 화합물을 비인간 동물에게 투여하고 처리된 동물에서 후보 화합물이 골격근 질량 또는 기능을 조절할 수 있는지 여부를 결정함으로써 CRF₂R 발현을 증가시키는 상기 후보 화합물이 생체 내에서 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위해 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 CRF 유전자 조절 요소와 작동적으로 연합된 리포터 유전자를 함유하는 세포 또는 세포 용해액과 시험 화합물의 접촉 및 리포터 유전자의 발현 검출을 포함하는, CRF 발현을 증가시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 리포터 유전자의 발현을 증가시키는 시험 화합물은 CRF 발현을 증가시키는 후보 화합물로서 동정된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 후보 화합물을 비인간 동물에게 투여하고 처리된 동물에서 후보 화합물이 골격근 질량 또는 기능을 조절할 수 있는지 여부를 결정함으로써 CRF 발현을 증가시키는 상기 후보 화합물이 생체 내에서 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위해 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 골격근 위축을 처치하기 위한, CRF₂R 작동제, 기능성 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터, 항상적으로 활성인 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터 또는 CRF₂R 또는 CRF 의 발현을 증가시키는 화합물의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상체에게 안전 유효량의 CRF₂R 작동제, 기능성 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터, 항상적으로 활성인 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터, CRF 또는 CRF 유사체를 코딩하는 발현 벡터, 또는 CRF₂R 또는 CRF 의 발현을 증가시키는 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 처치를 필요로 하는 대상체에서 골격근 위축을 처치하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에게 안전 유효량의 CRF₂R 작동제를, CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 작동제 유도 활성화를 연장시키거나 증강시키는 안전 유효량의 화합물과 함께 투여하는 것을 포함하는, 처치를 필요로 하는 대상체에서 골격근 위축을 처치하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 대상체에서 골격근 질량 또는 기능을 증가시키기 위한 CRF₂R 작동제의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 근육 질량 또는 기능의 증가가 바람직한 대상체의 식별 및 대상체에게 안전 유효량의 CRFR 작동제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 골격근 질량 또는 기능을 증가시키는 방법을 제공한다 (여기서, 상기 증가는 바람직하다).

또한 본 발명은 안전 유효량의 CRF₂R 작동제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 CRF₂R 에 대해 특이적인 키메라성 또는 인간 항체를 포함한다. 또다른 특정 구현예에 서, 약학 조성물은 CRF 또는 CRF 유사체, 바람직하게는 유로코르틴 II 를 포함한다.

또한 본 발명은 CRF₂R 에 대한 항체, 특히 CRF₂R 의 작동제인 키메라성 또는 인간 항체를 제공한다.

본 출원을 통해, 다양한 문헌이 참조된다. 본 발명이 포함되는 당 분야의 상태를 보다 자세히 기술하기 위한 상기 문헌들의 개시는 그 전문이 본 출원에 있어서 참조로서 도입된다.

서열 목록 설명

서열 목록에 포함된 각각의 CRFR 뉴클레오티드 및 단백질 서열 또는 CRF 유사체 단백질 서열을 해당 Genbank 또는 Derwent 접근 번호(들) 및 이들이 클로닝된 동물종과 함께, 표 1 에 나타낸다. 또한, 서열 목록에 나타낸 서열과 동일하거나 거의 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 관련 뉴클레오티드 서열에 대한 접근 번호도 나타낸다. 상기 관련 서열은 주로 나타낸 5' 또는 3' 미번역 서열의 양이 상이하다.

본 발명의 상세한 설명

I. 용어 및 정의:

하기는 본원에서 사용되는 용어에 대한 정의 목록이다.

"작동제" 는 항체를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌, 수용체를 활성화시키는 임의의 화합물을 의미한다. 예를 들어, CRFR 작동제에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: CRF 및 CRF 유사체.

"대립유전자 변이형" 은 주어진 유전자 또는 유전자 산물의 변이형을 의미한다. 당업자는 다수의 유전자가 집단 내에서 2 이상의 대립유전자 형태로 존재하며, 일부 유전자는 여러 대립유전자를 가짐을 인지할 것이다.

다양한 문법적 형태로서의 "항체" 는, 이뮤노글로불린 분자 및 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성부, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. "정제 항체" 는 단백질 및 자연적으로 연합된 천연 생성 유기 분자로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 항체를 의미한다. 바람직하게는, 제제는 항체의 건조 중량에 대해 60% 이상 항체, 보다 바람직하게는 75% 이상 항체, 더욱 바람직하게는 90% 이상 항체, 및 가장 바람직하게는 99% 이상이다.

"결합 친화도" 는 수용체와 상호작용하는 리간드의 성향을 의미하며, 특정 CRF 리간드-CRFR 상호작용에 대한 해리 상수에 반비례한다. 해리 상수는 표준 포화, 경쟁, 또는 역학 결합 기술을 통해 직접적으로, 또는 기능성 분석 및 종점 (endpoint) 이 관여되는 약리학 기술을 통해 간접적으로 측정될 수 있다.

"키메라성 항체" 는 2 이상의 상이한 항체 분자로부터, 즉 상이한 동물종으로부터의 구조적 요소를 포함하는 항체를 의미한다. 키메라성 항체에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 상보성 결정 영역 그래프팅으로서 공지된 기술에 의해 생성된 키메라성 항체를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 "인간화 항체" 로서 공지된 항체.

"CRF" 는 코르티코트로핀 방출 호르몬 (CRH) 과 동일한 코르티코트로핀 방출 인자를 의미한다. 전형적인 CRF 펩티드에는 r/h CRF 및 양 CRF (미국 특허 제 4,415,558 호 참고) 등이 포함된다.

"CRF 유사체" 는 CRFR 의 리간드로서 작용하는 물질을 의미한다. 적합한 CRF 유사체는 다양한 척추동물 종으로부터 수득될 수 있고, 하기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다: 예컨대 소바진 (예컨대, 미국 특허 제 4,605,642 호 참고), 유로텐신 (예컨대, 미국 특허 제 4,908,352 호; 및 제 4,533,654 호 참고), 마우스 유로코르틴 II (서열 번호 43), 인간 유로코르틴-관련 펩티드 (서열 번호 44) (Reyes, T. M. 등, Proc. Nat'l Acad Sci 98: 2843-2848 (2001)), 유로코르틴 (예컨대, WO 97/00063 참고) 및 미국 특허 제 4,415,558 호; 제 4,489,163 호; 제 4,594,329 호; 제 4,605,642 호; 제 5,109,111 호; 제 5,235,036 호; 제 5,278,146 호; 제 5,439,885 호; 제 5,493,006 호; 제 5,663,292 호; 제 5,824,771 호; 제 5,844,074 호; 및 제 5,869,450 호에 기재된 CRF 유사체. 그 각각은 본원에 참고문헌으로 삽입된다. 바람직한 CRF 유사체는 소바진, 유로코르틴, 유로코르틴-관련 펩티드, 유로코르틴-II 및 유로텐신이다.

"CRFR 작동제" 는 CRF₁R 또는 CRF₂R, 또는 둘 다를 활성화시킬 수 있는 화합물 또는 분자를 의미한다. CRFR 의 활성화는 후술되는 바와 같이 측정될 수 있다.

"CRFR" 은 CRF₁R 또는 CRF₂R 을 의미한다.

"CRF₁R" 은 임의의 동물종으로부터의 CRF₁R 의 임의의 이성형을 의미한다. CRF₁R 은 이미 CRF-RA, PC-CRF, CRF (Perrin, M. H., 등, Endocrinology 133: 3058-3061 (1993), Chen, R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8967-8971 (1993), Chang, C-P. 등, Neuron 11: 1187-1195 (1993), Kishimoto, T., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1108-1112 (1995) 및 Vita, N. 등, FEBS Lett. 335: 1-5 (1993)) 또는 CRH 수용체로 불려왔다.

CRF₁R 의 정의에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 상기 수용체를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열이 서열 데이타베이스에 기탁된 수용체들. 이들 서열에는 하기 접근 번호가 포함된다: X72304, E11431, L23332, I92584, T37068, T28968, Q81952, L23333, NM_004382, AF180301, T28970, L25438, L24096, I92586, Q81954, AH006791, NM_007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359, AF229361, AB055434 및 L41563. 이들 수용체의 뉴클레오티드 및 단백질 서열은 GenBank 또는 Derwent 에서 얻을 수 있으며, 편리를 위해 대표적 서열을 본원의 서열 목록에 나타낸다.

"CRF₂R" 은 임의의 동물종으로부터의 CRF₂R 의 임의의 이성형을 의미한다. CRF₂R 은 또한 HM-CRF, CRF-RB 로 불려왔다 (Kishimoto, T., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1108-1112 (1995) 및 Perrin, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2969-2973 (1995)).

CRF₂R 수용체의 정의에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 상기 수용체를 코딩하는 DNA 서열이 서열 데이타베이스에 기탁된 수용체. 이들 서열에는 하기 접근 번호가 포함된다: U34587, E12752, NM_001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381, U16253, T12244, T28972, U17858, NM_009953, Y14037 및 AF229360. 이들 수용체의 뉴클레오티드 및 단백질 서열은 GenBank 또는 Derwent 에서 얻을 수 있으며, 편리를 위해 대표적 서열을 본원의 서열 목록에 나타낸다.

용어 "CRFR" 에는 또한 리간드 결합 또는 신호전달에 필요하지 않은 수용체 분자의 영역이 결실 또는 개질된, 절단되고/되거나 돌연변이된 단백질이 포함된다. 예를 들어, 당업자는 일차 아미노산 서열에서 하나 이상의 보존성 변화를 갖는 CRFR 이 본 발명에서 유용할 것임을 인지할 것이다. 유사한 구조 또는 특성을 갖는, 상이한 아미노산으로의 특정 아미노산의 치환 (보존성 치환) 이 무증상 변화, 즉 기능을 유의미하게 변경시키지 않는 변화를 일으킬 수 있음이 당분야에 공지되어 있다. 보존성 치환은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, GPCR 은 지질을 향해 배열된 세포막통과 알파헬릭스 중의 아미노산 잔기의 기타 소수성 아미노산으로의 치환에 관용성일 수 있으며, 기능성으로 남아있음이 공지되어 있다. 절단 및/또는 돌연변이, 예컨대 보존성 아미노산 치환에 의해 천연 생성 서열과 상이한 CRF₁R 도 또한 CRF₁R 의 정의에 포함된다. 절단 및/또는 돌연변이, 예컨대 보존성 아미노산 치환에 의해 천연 생성 서열과 상이한 CRF₂R 도 또한 CRF₂R 의 정의에 포함된다.

당업자는 또한 상기 나열된 것들 이외의 종, 특히 포유류 종으로부터의 CRFR 이 본 발명에서 유용할 것임을 인지할 것이다. 또한 당업자는 공지된 CRFR 종의 서열로부터 탐침을 이용함으로써, 공지된 클로닝 방법에 의해 동일하거나 대안적인 종으로부터 공지된 서열과 상동인 공지된 cDNA 또는 게놈 서열을 수득할 수 있음을 인지할 것이다. 상기 CRF₁R 이 또한 CRF₁R 의 정의에 포함되며, 상기 CRF₂R 이 또한 CRF₂R 의 정의에 포함된다.

또한, CRFR 의 기능성 대립유전자 변이형 또는 기능성 접합 (splice) 변이형이 특정 종에 존재할 수 있고, 이들 변이형이 본 발명에서 유용할 것임을 당업자는 인지할 것이다. CRFR 의 접합 변이형은, 예를 들어 미국 특허 제 5,888,811 호; 제 5,786,203 호; 및 제 5,728,545 호에 공지되어 있으며, 그 각각은 본원에 참고문헌으로 삽입된다. 상기 CRF₁R 이 또한 CRF₁R 의 정의에 포함되며, 상기 CRF₂R 이 또한 CRF₂R 의 정의에 포함된다.

CRF₁R 또는 CRF₂R 폴리펩티드, 또는 CRF₁R 또는 CRF₂R 폴리펩티드 단편과 비-CRFR 폴리펩티드의 융합물이 CRFR 융합 단백질로 불린다. 공지된 방법을 이용하여, 당업자는 천연 CRF₁R 및 CRF₂R 과 상이하지만 본 발명에서 여전히 유용한 CRF₁R 또는 CRF₂R 의 융합 단백질을 제조할 수 있을 것이다. 예를 들어, 비-CRFR 폴리펩티드는 그 합성 부위로부터 또다른 부위로의 단백질 수송을 번역과 동시에 또는 번역 후에 지시하는 신호 (또는 리더) 폴리펩티드 서열 (예컨대, 효모 α-인자 리더) 일 수 있다. 또는 비-CRFR 폴리펩티드는 CRFR 의 정제 또는 동정을 촉진하기 위해 첨가될 수 있다 (예컨대, 폴리-His, 또는 플래그 (Flag) 펩티드). CRF₁R 융합 단백질이 또한 CRF₁R 의 정의에 포함되며, CRF₂R 융합 단백질이 또한 CRF₂R 의 정의에 포함된다.

"CRF₂R 신호 전달 기전" 은 CRF₂R 에 대한 내인성 또는 외인성 리간드의 결합에 의해 조절되는 임의의 신호전달 기전 (예컨대, cAMP, MAP 키나아제) 또는 신호전달 기전의 조합을 의미한다.

"기능성 CRFR" 은 생체 내 또는 시험관 내에서 CRF 또는 CRF 유사체에 결합하고, 리간드 결합의 결과 활성화되는 CRFR 을 말한다.

"융합 유전자" 는 하나의 하이브리드 단백질을 코딩하도록 작동적으로 연합된 2 이상의 DNA 코딩 서열을 의미한다. "융합 단백질" 은 융합 유전자의 단백질 산물이다.

"억제" 는 특정 과정 또는 활성의 부분적 또는 완전한 차단을 의미한다. 예를 들어, 화합물은, 이것이 완전히 또는 부분적으로 근위축을 예방하는 경우 골격근 위축을 억제하는 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 2 개의 DNA 서열 간의 연결의 성질이 하기가 아닌 경우, 2 개의 DNA 서열은 "작동적으로 연합된" 것으로 불린다: (1) 해독틀 (frameshift) 돌연변이를 도입시킴, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해함, 또는 (3) 단백질로 번역될 해당 RNA 전사물의 능력을 방해함. 예를 들어, 코딩 서열 및 조절 서열은, 이들이 코딩 서열의 전사가 조절 서열의 영향 또는 조절 하에 놓이도록 하는 방식으로 공유 연결된 경우, 작동적으로 연합된 것이다. 따라서, 프로모터 영역은, 생성 전사물이 목적 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 프로모터 영역이 상기 DNA 서열의 전사를 일으킬 수 있는 경우, 코딩 서열과 작동적으로 연합된 것이다.

"동일성 백분율" 은 하기와 같이 계산되는, 2 개 서열이 공통으로 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율을 의미한다. 특정 서열에 대한 동일성 백분율을 계산하기 위해 (검색), 검색 서열의 해당 부분을 Genetics Computer Group, Inc. 에서 얻을 수 있는 BestFit 비교 컴퓨터 프로그램 (Wisconsin Package, Version 10.1) 을 이용하여 참조 서열과 비교한다. 상기 프로그램은 Smith 및 Waterman 의 알고리즘 [Advances in Applied Mathematics, Issue 2: 482-489 (1981)] 을 이용한다. 동일성 백분율은 BestFit 프로그램에 대한 하기 기본설정 (default) 파라미터로 계산된다: 스코어링 매트릭스는 blosum62.cmp 이며, 갭 생성 페널티는 8 이고, 갭 연장 페널티는 2 이다. 서열을 참조 서열과 비교할 때, 검색 서열의 해당 부분은 CRFR 서열에서 유래된 것이다. 예를 들어, 검색이 CRFR/정제 태그 융합 단백질인 경우, 서열의 CRFR 폴리펩티드 부분만이 동일성 백분율 스코어의 계산을 위해 배열된다.

"폴리펩티드" 는 길이 또는 번역 후 개질 (예컨대, 인산화 또는 당화) 과는 무관하게, 임의의 아미노산 사슬을 의미한다.

"프로모터" 는 유전자 또는 코딩 영역으로부터의 전사 속도 및 전사의 개시를 조절하는 DNA 서열을 의미한다.

"예방적 처치" 는 골격근 위축의 발생을 완전히 또는 부분적으로 차단하기 위한, 현재는 골격근 위축의 징후를 나타내지 않는 대상체의 예방적 처치를 의미한다. 본원의 배경기술 부분에서 논의된 바와 같이 특정 개인이 골격근 위축에 대한 위험이 높음을 당업자는 인지할 것이다. 또한, 골격근 위축을 일으키는 생화학적 변화가 적절히 조절되는 경우, 고위험 개인에서 위축의 발생이 예방되거나 감소될 것임을 당업자는 인지할 것이다. 예를 들어, 코르티코스테로이드로 처치를 시작하는 근육 이영양증 환자는 골격근 위축 적응증의 발생에 대한 위험도가 높아서, 상기 환자의 예방적 처치가 적절할 것임을 나타낸다.

그 모든 문법적 형태로의 "조절하다" 는 증가, 감소 또는 유지를 의미하며, 예컨대, 골격근 질량 또는 기능의 조절은 골격근 질량 또는 기능 수준의 증가, 감소 또는 유지를 의미한다.

"골격근 질량 또는 기능의 조절" 에는 골격근 질량, 골격근 기능 또는 둘 다의 조절이 포함된다.

"조절 요소" 는 작동적으로 연합된 DNA 서열로부터 전사 수준을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 조절 요소의 상기 정의 내에는 프로모터 및 인핸서가 포함된다. 예컨대, CRFR 유전자 조절 요소는 CRFR 유전자로부터의 전사 수준을 조절할 수 있는 DNA 서열이다.

"리포터 유전자" 는 그 산물이, 바람직하게는 정량적으로 검출될 수 있는 코딩 서열을 의미하며, 여기서 리포터 유전자는 측정될 신호에 반응성인 이종 프로모터 또는 인핸서 요소에 작동적으로 연합된다. 이와 관련된 프로모터 또는 인핸서 요소는 본원에서 "반응성 요소" 로 불린다.

"선택적 작동제" 는 작동제가 기타 수용체와 비교하여 특정 수용체(들)에 대해 유의미하게 더 큰 활성을 가지며, 이것이 기타 수용체들에 대해 완전 불활성인 것은 아님을 의미한다.

"골격근 비후" 는 골격근 질량 또는 골격근 기능 또는 둘 다의 증가를 의미한다.

"골격근 위축" 은 "근육 소모" 와 동일한 의미를 가지며, 골격근 질량 또는 골격근 기능 또는 둘 다의 감소를 의미한다.

"접합 변이형" 은 대체 엑손의 이용으로부터 얻어지는 mRNA 또는 단백질을 의미한다. 당업자는, 세포 유형에 따라, 또는 단일 세포 유형 내에서도, mRNA 가 접합 변이형으로서 상이한 형태로 발현될 수 있고, 따라서 번역된 단백질이 발현되는 mRNA 에 따라 상이할 것임을 인지할 것이다.

물질의 "치료적 유효량" 은 처치된 환자에서 의학적으로 바람직한 결과, 예컨대, 골격근 위축의 감소, 골격근 질량의 증가 또는 골격근 기능의 증가를, 인간 또는 비인간 포유류에서 허용가능한 이익:위험비를 가지면서 일으킬 수 있는 양이다.

"치료적 처치" 는 근육 질량 또는 근육 기능의 증가가 바람직한 대상체의 처치를 의미한다. 예를 들어, 발생한 골격근 위축을 부분적으로 또는 완전히 역전시키거나, 추가적 골격근 위축을 완전히 또는 부분적으로 차단하기 위한, 골격근 위축의 징후를 현재 나타내는 대상체의 처치가 그 대상체의 치료적 처치일 것이다. "치료적 처치" 라는 용어에는 또한, 예를 들어 골격근 비후를 유도하기 위한 골격근 위축의 징후를 나타내지 않는 대상체의 처치, 예컨대 근육 질량의 증가를 위한 가축 동물의 처치가 포함된다.

"처치" 라는 용어는 예방적 또는 치료적 처치를 의미한다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 단백질 화학, 약리학, 또는 분자 생물학 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법, 물질 및 실시예는 제한을 위한 것이 아니다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 기타 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험을 위해 사용될 수 있다.

II. 골격근 질량의 조절에 있어서의 CRFR 의 역할

선행 기술에서의 정보 및 후술되는 교시에 주어진 본 발명의 유용성을 당업자는 인지할 것이다. 본원에 기재된 결과는 CRF₁R 및 CRF₂R 을 둘 다 활성화시키는 CRF 수용체 작동제 (비-선택적 CRFR 작동제) 의 투여가 골격근 위축 모델에서 신경제거, 불용성 또는 덱사메타손 처치의 골격근 위축 유도 효과를 차단하고/하거나 억제함을 나타낸다. 또한, 데이타는 CRFR 작동제가, CRF₂R 이 녹아웃된 마우스에서는 상기 항위축 효과를 나타내지 않음을 나타낸다. 또한, 부신의 제거에 의해 (부신절제술) CRF₁R 매개 HPA 축이 방해된 래트에서, 비-선택적 CRFR 작동제로의 상기 동물의 처치는 항위축 효과를 나타내며, 이는 CRF₂R 이 항위축 효과를 매개함을 시사한다. 또한, 결과는 비-선택적 CRFR 작동제의 투여가 비후 유도 효과를 보임을 나타낸다. 더불어, 상기 데이타는 골격근 위축의 과정에 있어서, CRF₂R 의 조절적 역할을 나타낸다. 생체 내에서의 CRFR 의 특정 역할은, 후술되는 골격근 위축의 다양한 모델에서 CRFR 에 대한 선택적 작동제인 약리학 제제, 소바진 (Bachem Biosciences, Inc. King of Prussia, PA) 및 유로코르틴 (Bachem Biosciences, Inc.) 를 이용하여 조사되었다. 이들 제제는 그 특징이 잘 분석되어 있고, 과학 문헌에 기재되어 있다.

도 1-7 및 9 는 CRFR 의 선택적 작동제의 투여가 골격근 위축의 통계적으로 유의미한 억제를 일으킴을 나타내는 실험 결과를 보여준다. 도 8 은 CRFR 작동제인 소바진의 항위축 효과가 CRF₂R 을 통해 매개됨을 보여준다. 포스포디에스터라아제 억제제인 테오필린과 함께 1 일 2 회 투여되는 CRFR 작동제는 골격근 위축의 동물 모델에서 골격근 위축을 억제시켰다. 테오필린은 CRFR 작동제의 작용 기간 및 크기를 증가시키기 위해 첨가되어, 상기 화합물의 효용성을 증가시켰다. 상기 위축 모델에서 단독 투여된 테오필린은 효과를 나타내지 않았으며, 테오필린와 조합된 CRFR 작동제의 항위축 효과는 CRFR 작동제의 효과로 인한 것임을 시사하였다. 또한, 삼투성 미니펌프를 통한, 테오필린의 부재 하의 CRFR 작동제의 연속 투여도 또한 골격근 위축의 억제 및/또는 골격근 비후를 일으켰다. 결과의 통계적 유의성은 ANCOVA (Douglas C. Montgomery, Design 및 Analysis of Experiments, John Wiley 및 Sons, New York (2 판. 1984)) 를 이용하여 결정되었다. 도 1-9 에 사용된 약어는 하기와 같다: g-그램; SEM-평균의 표준 편차.

구체적으로, 도 1 은 마우스 좌골 신경 제거 위축 모델에서 비복근 내측건의 신경제거-유도 위축을 소바진이 억제함을 보여준다. 주석: A - 생리 식염수 (대조군); B - 소바진 (0.01 mg/kg) + 테오필린; C - 소바진 (0.03 mg/kg) + 테오필린; D - 소바진 (0.1 mg/kg) + 테오필린; E - 소바진 (1.0 mg/kg) + 테오필린; *식염수와 비교하여 - p ≤ 0.05. 우측 좌골 신경의 제거 후, 웅성 마우스의 중앙견갑 영역 내에, 1 일 2 회 소바진을 상기 나타낸 용량으로, 또는 전달체 대조군 (생리 식염수) 을 9 일 동안 피하 주사하였다. 소바진은 30 mg/kg 의 테오필린과 함께 투여하였다. 9 일째 날에, 비복근 내측건을 제거 및 칭량하여, 위축의 정도를 결정하였다.

도 2 는 마우스 좌골 신경 제거 위축 모델에서 전방 경골근의 신경제거-유도 위축을 소바진이 억제함을 보여준다. 주석: A - 물 (대조군); B - 소바진 (0.1 mg/kg/d); C - 소바진 (0.3 mg/kg/d); D - 소바진 (1.0 mg/kg/d); *물과 비교하여 - p ≤0.05. 우측 좌골 신경의 제거 후, 웅성 마우스에 소바진 또는 전달체 대조군 (생리 식염수) 을, Alzet 삼투성 미니펌프를 이용하여 5 ㎕/hr 씩 실험 기간 끝까지 (추가적 테오필린 없이) 연속 주입함으로서 투여하였다. 소바진의 1 일 전달 용량은 상기에 나타낸다. 미니펌프 이식을 좌골 신경의 제거 시에 수행하였다. 9 일째 날에, 전방 경골근을 제거 및 칭량하여, 위축의 정도를 결정하였다.

도 3 은 마우스 글루코코르티코이드-유도 위축 모델에서 전방 경골근 (도 3a) 및 비복근 내측건 (도 3b) 의 글루코코르티코이드-유도 근위축을 소바진이 억제함을 나타낸다. 주석: A - 음료수에 덱사메타손 없이 물만 포함됨 (비-위축된 대조군); B - 물 + 덱사메타손 (위축된 대조군); C - 소바진 (0.1 mg/kg/d) + 덱사메타손; D - 소바진 (0.3 mg/kg/d) + 덱사메타손; E - 소바진 (1.0 mg/kg/d) + 덱사메타손; *물과 비교하여 - p ≤0.05; #물 + 덱사메타손과 비교하여 - p ≤0.05. 음료수로의 글루코코르티코이드인 덱사메타손의 첨가 (1.2 mg/kg/d) 후, 웅성 마우스에 상기 나타낸 제제 또는 전달체 대조군 (생리 식염수) 을 Alzet 삼투성 미니펌프를 이용한 연속 주입에 의해 5㎕/hr 씩 실험 기간 끝까지 (추가적 테오필린 없이) 투여하였다. 소바진의 1 일 전달 용량은 상기에 나타낸 바와 같다. 미니펌프의 이식은 덱사메타손 노출의 개시 시에 수행하였다. 소바진 투여 개시 후 9 일째 날에, 비복근 내측건 및 전방 경골근을 제거 및 칭량하여 위축의 정도를 결정하였다.

도 4 는 전방 경골근 (도 4a) 및 비복근 내측건 (도 4b) 의 불용성-유도 위축을 소바진이 억제함을 나타낸다. 또한, 비캐스팅된 다리의 비복근 내측건 및 전방 경골근의 통계적으로 유의미한 비후가 소바진 처치로 관찰되었다. 주석: A - 생리 식염수 (대조군); B - 테오필린; C - 소바진 (0.03 mg/kg) + 테오필린; D - 소바진 (0.1 mg/kg) + 테오필린; E - 소바진 (0.3 mg/kg) + 테오필린; *식염수와 비교하여 - p ≤0.05. 우측 후각의 캐스팅 후, 웅성 마우스의 중앙견갑 영역에 1 일 2 회, 소바진 또는 전달체 대조군 (생리 식염수) 을 10 일 동안 나타낸 1 일 전달 용량으로 피하 주사하였다. 소바진을 포스포디에스터라아제 억제제인 테오필린 (30 mg/kg) 의 1 일 2 회 복강내 투여와 함께 공동 투여하였다. 10 일째 날에, 비복근 내측건 및 전방 경골근을 제거 및 칭량하여 위축의 정도를 결정하였다.

도 5 는 마우스 좌골 신경 제거 위축 모델에서 전방 경골근의 신경제거유도 위축을 소바진 및 유로코르틴이 둘 다 억제함을 나타낸다. 또한, 유로코르틴 처치로 비-신경제거 다리의 비후가 관찰되었다. 주석: A - 물 (대조군); B - 소바진 (1 mg/kg/d); C - 유로코르틴 (1.0 mg/kg/d); *물과 비교하여 - p ≤0.05. 우측 좌골 신경의 제거 후, 웅성 마우스에 상기 나타낸 제제 또는 전달체 대조군 (생리 식염수) 을 Alzet 삼투성 미니펌프를 이용한 연속 주입에 의해 5 ㎕/hr 씩 실험 기간 끝까지 (추가적 테오필린 없이) 투여하였다. 제제의 1 일 전달 용량을 상기에 나타낸다. 미니펌프 이식은 좌골 신경 제거과 동시에 수행하였다. 9 일째 날에, 전방 경골근을 제거 및 칭량하여 위축의 정도를 결정하였다.

도 6 은 마우스 다리 캐스팅 불용성 위축 모델에서 전방 경골근 (도 6a) 및 비복근 내측건 (도 6b) 의 불용성-유도 위축을 유로코르틴이 억제함을 나타낸다. 주석: A - 생리 식염수 (대조군); B - 유로코르틴 (0.3 mg/kg) + 테오필린; *식염수와 비교하여 - p ≤0.05. 우측 후각의 캐스팅 후, 웅성 마우스의 중앙견갑 영역에 1 일 2 회, 유로코르틴 또는 전달체 대조군 (생리 식염수) 을 10 일 동안 피하 주사하였다. 유로코르틴은 도 6a 및 6b 의 설명에 나타낸 용량으로 투여하였다. 유로코르틴을 포스포디에스터라아제 억제제인 테오필린 (30 mg/kg) 의 1 일 2 회 복강내 투여와 함께 공동 투여하였다. 10 일째 날에, 비복근 내측건 및 전방 경골근을 제거 및 칭량하여 위축의 정도를 결정하였다.

도 7 은 전방 경골근 (도 7a), EDL 근 (도 7b), 가자미근 (도 7c), 비복근 내측건 (도 7d), 및 족저근의 신경제거-유도 위축을 소바진이 억제함을 나타낸다. 또한, 소바진은 비-신경제거 EDL 근육의 통계적으로 유의미한 비후를 유도하였다 (도 7b). 주석: A - 생리 식염수 (대조군); B - 소바진 (0.003 mg/kg) + 테오필린; C - 소바진 (0.01 mg/kg) + 테오필린; D - 소바진 (0.03 mg/kg) + 테오필린; #해당 대조군과 비교하여 - p ≤0.05. 우측 좌골 신경의 제거 후, 웅성 부신절제 래트 (부신절제 래트를 사용하여, CRF₁R 의 아고니즘을 통한 HPA 축 활성화의 골격근 위축-유도 효과를 제거하였다) 의 중앙견갑 영역에 1 일 2 회, 소바진 또는 전달체 대조군 (생리 식염수) 을 9 일 동안 상기 나타낸 용량으로 피하 주사하였다. 소바진을 30 mg/kg 의 테오필린과 함께 공동 투여하였다. 9 일째 날에, 전방 경골근, 장 지신근 (EDL), 가자미근, 비복근 내측건, 및 족저근을 제거 및 칭량하여 위축의 정도를 결정하였다.

도 8 은 마우스 좌골 신경 제거 위축 모델의 야생형에서 (CRF₂R 녹아웃 마우스에서는 아님) 관찰되는 위축을 소바진이 억제함을 나타낸다. 주석: A-C - 야생형 마우스; D-F - CRF₂R 녹아웃 마우스. A 및 D - 물 (대조군); B 및 E - 소바진 (0.3 mg/kg/d); C 및 F - 소바진 (1.0 mg/kg/d); *식염수와 비교하여 - p ≤0.05. 우측 좌골 신경의 제거 후, 자성 야생형 및 CRF₂R 녹아웃 마우스에 소바진 또는 전달체 대조군을 Alzet 삼투성 미니펌프를 이용하여 연속 주입에 의해 5 ㎕/hr 씩 9 일 동안 상기 나타낸 1 일 전달 용량으로 투여하였다. 9 일째 날에, 전방 경골근을 제거 및 칭량하여 위축의 정도를 결정하였다.

도 9 는 소바진이, EDL 근 및 가자미근 질량의 불용성-유도 소실을 억제하고 (도 9a), 마우스 다리 캐스팅 불용성 위축 모델에서 절대력 측정에 의해 평가된 바와 같이 근육 기능의 소실을 억제함을 (도 9b) 나타낸다. 주석: A - 비캐스팅 근육 대조군; B - 캐스팅 근육, 식염수 대조군; C - 캐스팅 근육, 소바진 (0.3 mg/kg) + 테오필린 (30 mg/kg); *식염수와 비교하여 - p ≤0.05. 우측 후각의 캐스팅 후, 웅성 마우스의 중앙견갑 영역에 1 일 2 회, 소바진 또는 전달체 대조군 (생리 식염수) 을 10 일 동안 상기 나타낸 용량으로 피하 주사하였다. 소바진을 30 mg/kg 의 테오필린과 함께 공동 투여하였다. 10 일째 날에, EDL 근 및 가자미근을 제거하고, 절대력 및 질량 측정을 하여 위축의 정도를 결정하였다.

III. CRFR , CRF 또는 CRF 유사체, 또는 CRFR 을 발현하는 세포주의 제조

CRF₁R, CRF₂R, CRF 및 CRF 유사체는 항체의 제조, 본 발명의 스크리닝 분석에 있어서의 시약으로서의 용도 및 골격근 위축의 처치를 위한 약학 시약으로서의 용도를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 용도를 위해 제조될 수 있다. 당업자에게는, 본 발명의 특정 구현예를 위해서는 정제 폴리펩티드가 가장 유용할 것이지만, 기타 구현예를 위해서는 폴리펩티드를 발현하는 세포주가 가장 유용할 것임이 자명할 것이다. 예를 들어, CRFR 의 구조적 및 기능적 특징을 유지하는 것이 중요한 경우, 예컨대 CRFR 을 활성화시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에 있어서, 기능성 CRFR 을 발현하는 세포를 이용하는 것이 바람직하다.

CRF 및 CRF 유사체는 짧은 폴리펩티드이므로, 숙련자는 이들 폴리펩티드가 당분야에 널리 공지된 기술을 이용하여, 재조합 방법보다는 직접적 합성에 의해 가장 편리하게 제공될 것임을 인지할 것이다. 또한, 여러 상기 분자들이 시판되고 있다.

CRFR 원이 폴리펩티드를 발현하는 세포주인 경우, 세포는, 예를 들어 CRFR 을 내인성으로 발현할 수 있고, 내인성 CRFR 발현을 증가시키기 위해 자극되거나 CRFR 을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 세포주가 관심 폴리펩티드를 발현하는지 여부를 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 하기가 있다: 적절한 항체로의 폴리펩티드 검출, 단백질을 코딩하는 mRNA 를 검출하기 위한 DNA 탐침의 이용 (예컨대, 노던 블롯 또는 PCR 기술), 또는 관심 폴리펩티드에 선택적인 제제 (예컨대, 방사선표지된 선택적 작동제) 의 결합 측정.

CRF₁R, CRF₂R, 또는 이들 폴리펩티드를 발현하는 세포주의 제조에 있어서의 재조합 DNA 기술의 이용이 특히 포함된다. 상기 재조합 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 재조합 CRF₁R 또는 CRF₂R 을 발현시키기 위해, 하나 이상의 조절 요소의 조절 하에 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제조된다. 여러 종으로부터 CRF₁R 및 CRF₂R 을 코딩하는 게놈 또는 cDNA 서열이 기술되어 있고, GenBank 데이타베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 에서 입수가능) 또는 Derwent 데이타베이스 (http://www.derwent.co.uk/geneseq/index.html 에서 입수가능) 뿐만 아니라 본 출원의 서열 목록에서 용이하게 입수가 가능하다. CRF₁R 및 CRF₂R 에 대한 접근 번호 및 해당 서열 번호를 표 I 에 나타낸다. 상기 공개적으로 입수가능한 서열 정보를 이용한, CRF₁R 또는 CRF₂R 을 코딩하는 핵산 분자의 하나의 단리 방법은 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여, 예컨대 적절한 라이브러리로부터 서열의 PCR 증폭에 의해, 자연적으로 또는 인공적으로 합성된 DNA 탐침으로 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 또다른 방법은 관심 수용체에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 특정 조직 (예컨대 골격근) 으로부터 단리된 mRNA 로부터 cDNA 를 직접 PCR 증폭하는 것이다. 상기 단리된 mRNA 는 시판되고 있다. 또한 당업자는 공지된 CRFR 수용체 서열의 일부에 해당하는 핵산 탐침을 이용하여, 다른 종으로부터의 상동성 cDNA 또는 게놈 서열을 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있음을 인지할 것이다. 인간, 마우스, 래트, 돼지, 원숭이, 침팬지, 명주원숭이, 개, 소, 양, 고양이, 닭 및 칠면조를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 종으로부터의 CRFR 수용체가 본 발명의 방법에 있어 특히 유용하다. 이어서 당분야에 널리 공지된 방법에 의해, 관심 CRFR 을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 적합한 발현 벡터에 결찰시킨다. 이렇게 제조되는 발현 벡터는 숙주 세포에서 발현되며, 수용체를 발현하는 숙주 세포를 직접 스크리닝 분석에 사용하거나, 수용체를 발현하는 숙주 세포로부터 수용체를 단리하고 단리된 수용체를 스크리닝 분석에 사용한다.

본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있는 숙주-발현 벡터 시스템은 하기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다: CRFR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아 (예컨대, 대장균, 고초균); CRFR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예컨대, 사카로마이세스, 피치아); CRFR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대 배큘로바이러스) 로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스) 로 감염되거나 CRFR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예컨대, Ti 플라스미드) 로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유래한 프로모터 (예컨대, 메탈로티오나인 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유래한 프로모터 (예컨대, 레트로바이러스 LTR) 및 CRFR 뉴클레오티드 서열을 또한 포함하는 재조합 발현 구축물을 갖는 포유류 세포 시스템 (예컨대, COS, CHO, HEK293, NIH3T3).

숙주 세포를 사용하여 관심 폴리펩티드를 제조한다. CRFR 은 막 결합 분자이므로, 숙주 세포 막으로부터 정제하거나, 세포 막에 부착된 상태로 CRFR 을 이용한다, 즉 전체 세포 또는 세포의 막 분획을 이용한다. 상기 발현 시스템으로부터의 CRFR 정제 또는 농축은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 적절한 세제 및 지질 마이셀을 이용하여 수행된다.

박테리아 시스템에서, 발현되는 유전자 산물의 목적 용도에 따라 여러 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 상기 단백질이 CRFR 에 대한 항체 제조를 위해 생성되는 경우, 고수준의 단백질 산물 발현을 지시하는 벡터가 바람직하다. 당분야의 숙련자는 상기 벡터 구축물을 제조하고, 선택적 정제 기술, 예컨대 융합 단백질 선택적 칼럼 및 항체 칼럼, 및 비-선택적 정제 기술을 포함하는 다양한 방법에 의해 단백질을 정제할 수 있다.

곤충 단백질 발현 시스템에서, 배큘로바이러스 A. californica 핵 폴리헤드론형성 바이러스 (AcNPV) 를 S. frugiperda 세포에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용한다. 상기 경우, CRFR 뉴클레오티드 서열을 바이러스의 비필수 영역 내로 클로닝하고, AcNPV 프로모터의 조절 하에 놓는다. 이어서, 재조합 바이러스를 사용하여 삽입 유전자가 발현되는 세포를 감염시키고, 단백질을 당분야의 숙련자에게 공지된 여러 기술 중 하나에 의해 정제한다.

포유류 숙주 세포에서, 여러 바이러스 기재 발현 시스템이 이용될 수 있다. 이들 발현 시스템의 이용은 종종 삽입 뉴클레오티드 서열의 효율적인 번역을 위해, 벡터 내에 특정 개시 신호의 생성을 필요로 한다. 이는, 내인성 개시 신호를 포함하지 않는 CRFR 유전자의 일부가 사용되는 경우 특히 중요하다. 삽입 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 프레임이 맞는 상기 개시 신호의 배치 뿐만 아니라, 전사 및 번역 증강 요소의 부가 및 재조합 단백질의 정제는 당분야의 숙련자에게 공지된 여러 방법 중 하나에 의해 달성된다. 또한, 포유류 숙주 세포에서, 재조합 단백질에 필요한 번역 후 개질시킬 수 있는 적절한 세포 유형의 선택이 중요하다. 상기 개질, 예를 들어 절단, 인산화, 당화 등은 개질 효소를 포함하는 적절한 숙주 세포의 선택을 필요로 한다. 상기 숙주 세포에는 CHO, HEK293, NIH3T3, COS 등이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니며, 당분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

장기적으로, 재조합 단백질의 고발현, 안정적 발현이 바람직하다. 예를 들어, CRFR 을 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 당업자는 공지된 방법, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 트랜스펙션, 또는 리포좀-매개 트랜스펙션에 따라 CRFR 을 안정하게 발현하는 세포주를 제조할 수 있다. 이는 통상적으로, 적절한 발현 조절 요소 (예컨대, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 부위, 번역 시작 부위 등), 선택 마커, 및 관심 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여, 세포를 트랜스펙션시켜 달성된다. 선택 마커는 관심 유전자와 동일한 벡터 내에 포함되거나, CRFR 서열을 포함하는 벡터와 함께 트랜스펙션되는 개별 벡터 상에 포함될 수 있다. 발현 벡터 내의 선택 마커는 선택 내성을 부여할 수 있고, 세포가 이들의 염색체 내로 벡터를 안정적으로 삽입하고 포사이 (foci) 를 형성하도록 성장할 수 있게 하며, 이는 다시 클로닝되어 세포주로 증식할 수 있다. 이와는 달리, 발현 벡터는 마커의 물리적 속성을 이용하는 선택 마커를 발현하는 세포를 선택시킬 수 있다, 즉 녹색 형광 단백질 (GFP) 의 발현은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 이용하여 마커를 발현하는 세포를 선택할 수 있게 한다.

당업자는 관심 유전자가 성공적으로 삽입된 세포의 선택할 수 있도록 하기 위해, 트랜스펙션을 위해 적절한 세포 유형을 선택할 수 있다. 예를 들어, 선택 마커가 단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus) 티미딘 키나아제, 히포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 또는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제인 경우, 적절한 세포 유형은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포일 것이다. 또는 선택 마커가 각각 메토트렉세이트, 미코페놀산, G-418 또는 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 dhfr, gpt, neo 또는 hygro 인 경우, 정상 세포를 사용할 수 있다. 상기 재조합 세포주는 CRFR 활성에 영향을 미치는 후보 화합물의 동정을 위해 유용하다.

IV. CRFR 항체의 제조

CRFR 의 하나 이상의 에피토프를 선택적으로 인지하는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 상기 항체에는, 예컨대, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라성 항체, 인간 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fab 발현 라이브러리를 이용하여 제조된 분자, 트랜스제닉 마우스에서 제조된 인간 항체 (폴리클로날 또는 모노클로날) 및 임의의 상기물의 에피토프 결합 단편이 포함된다. 치료적 이용을 위해, 키메라성 또는 인간 항체가 바람직하며; 인간 항체가 가장 바람직하다.

시험 화합물의 평가를 위해 본원에 기재된 화합물 스크리닝 방식과 함께 항체를 이용할 수 있다, 예컨대 CRFR 의 고정화를 위해, 폴리펩티드 또는 상기 항체를 유전자 치료 기술과 함께 이용하여, 예를 들어 이들 유전자가 도입된 세포 또는 직접적으로 환자 조직에서의 CRFR 발현을 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 골격근 위축의 처치에 유용하다. CRFR 에 선택적인 항체는 CRFR 작동제인 항체의 서브세트를 동정하기 위해 본 발명의 방법에 의해 스크리닝될 수 있다. 또한, CRF 또는 CRF 유사체에 특이적인 항체에 대해 생성되는 항-개별특이형 (idiotype) 항체는 CRFR 작동제 등으로서 유용할 수 있으며, 항-CRFR 항체는 본 발명의 방법에 따라 CRFR 을 활성화시키는 이들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.

항체의 제조를 위해, 당분야에 널리 공지된 방법에 의해 CRFR, CRF 또는 CRF 유사체, 항-CRF 항체, 항-CRF 유사체 항체, 또는 이들의 면역원성 단편을 주사하여 다양한 숙주 동물을 면역화시킬 수 있다. 항개별특이형 항체의 제조를 위해, 면역원은 항-CRF 항체 또는 항-CRF 유사체 항체이다. 항-개별특이형 항체의 제조는, 예를 들어 미국 특허 제 4,699,880 호에 기재되어 있으며, 본원에 참조로서 도입된다. 적합한 숙주 동물에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 토끼, 마우스, 염소, 양 및 말. 면역화 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 면역화 동물의 혈청으로부터 정제될 수 있고, 모노클로날 항체는 당분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 기술에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: Kohler 및 Milstein 의 널리 공지된 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 EBV 하이브리도마 기술. 모노클로날 항체는 카파 또는 람다 경쇄를 포함하는 IgG, IgE, IgM, IgA, 및 IgD 를 포함하는 임의의 이뮤노글로불린 클래스일 수 있다.

인간에서의 비인간 항체의 면역원성으로 인해, 인간 환자의 치료적 처치를 위해 사용되는 경우 키메라성 항체가 비인간 항체보다 바람직하다. 키메라성 항체의 제조 및 이용 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제. 5,807,715 호; 제 4,816,397 호; 제 4,816,567 호; 제 5,530,101 호; 제 5,585,089 호; 제 5,693,761 호; 제 5,693,762 호; 제 6,180,370 호; 및 제 5,824,307 호에 기재되어 있고, 모두 본원에 참조로서 도입된다.

완전 인간 항체는, 이들이 비인간 항체 또는 키메라성 항체에 비해 면역원성이 덜하므로 인간 환자의 치료적 처치를 위해 특히 바람직하다. 상기 항체는 내인성 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 실질적으로 발현할 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 제조될 수 있다. 트랜스제닉 마우스를 선택된 항원, 예컨대 CRF₂R 의 전부 또는 일부로 일반적 방식으로 면역화시킨다. 항원에 대해 만들어진 모노클로날 항체는 이들 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 종래 하이브리도마 기술을 이용하여 수득한다. 상기 기술은 미국 특허 제 5,874,299 호; 제 5,877,397 호; 제 5,569,825 호; 제 5,661,016 호; 제 5,770,429 호; 및 제 6,075,181 호에 상세히 기술되어 있으며, 모두 본원에 참조로서 도입된다. 하이브리도마 세포의 배양물로부터 직접 인간 이뮤노글로불린을 수득하기 위한 대안으로서, 하이브리도마 세포를 후속 발현 또는 유전적 조작을 위한 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 원으로서 사용할 수 있다. 상기 항체 제조 세포로부터의 유전자 단리는, 고수준의 적절한 mRNA 가 이용가능하므로 수월하다. 회수되는 재배열 유전자좌를 필요한 만큼 조작할 수 있다. 예를 들어, 불변 영역을 제거하거나 상이한 이성형의 것과 교환할 수 있고, 또는 가변 영역이 단일쇄 Fv 영역을 코딩하도록 연결시킬 수 있다. 상기 기술은 WO 96/33735 및 WO 96/34096 에 기재되어 있으며, 모두 본원에 참조로서 도입된다.

V. 시험 화합물의 선택

본 발명의 분석에 따라 스크리닝될 수 있는 화합물은 하기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다: 천연 산물, 예컨대 식물 또는 동물 추출물을 포함하는 공지된 화합물의 라이브러리; 합성 화학물질; 단백질, D-또는 L-배치 아미노산으로 제조된 조합 화학 유래 분자 라이브러리 및 랜덤 펩티드 라이브러리의 멤버, 포스포펩티드 (랜덤 또는 부분 변성, 지정 포스포펩티드 라이브러리의 멤버를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아님) 를 포함하는 펩티드, 예컨대 가용성 펩티드, 항체 (폴리클로날, 모노클로날, 키메라성, 인간, 항-개별특이형 또는 단일쇄 항체, 및 Fab, F(ab')₂ 및 Fab 발현 라이브러리 단편, 및 이들의 에피토프-결합 단편을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님) 를 포함하는 생물학적 활성 물질; 유기 및 무기 분자.

또한 보다 전통적인 시험 화합물 원에 덧붙여, 컴퓨터 모델링 및 탐색 기술로 CRFR 의 리간드 결합 부위로부터 또는 이미 동정된 CRFR 의 작동제로부터의 구조적 정보를 이용함으로써, 시험 화합물의 합리적 선택이 가능해졌다. 상기 시험 화합물의 합리적 선택은 치료적 후보 화합물을 동정하기 위해 스크리닝되어야 하는 시험 화합물의 수를 감소시킬 수 있다. CRFR 및 GPCR, 및 CRFR 단백질 서열에 대한 지식으로, 잠재적 리간드를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 그 결합 부위의 모델 제조가 가능해졌다. 상기 과정은 당분야에 널리 공지된 일부 방식에 따라 수행될 수 있다. 간략하게, 가장 거친 접근법은 주형 (박테리오로돕신 또는 로돕신 결정 구조 또는 기타 GPCR 모델에서 유래됨) 에 대한 CRFR 서열의 서열 배열 제조, 아미노산 구조의 전환 및 분자 미케닉 및 시각적 조사에 의한 모델의 정련이 관여된다. 강한 서열 배열이 수득될 수 없는 경우, 모델은 소수성 헬릭스의 모델 확립에 의해 또한 제조될 수 있다. 이어서, 이들은 공지된 로돕신 구조의 일반적 짜임새로부터 시작하여, 각각의 헬릭스를 다른 것으로 회전 및 번역시켜 함께 맞춰진다. 잔기-잔기 접촉을 나타내는 점인 돌연변이적 데이타를 또한 사용하여, 이들 접촉이 달성될 수 있도록 헬릭스를 각각에 대해 배치할 수 있다. 상기 과정 동안, 헬릭스 내에서 결합 부위 공동 내로의 공지된 리간드의 도킹이 또한 이용되어, 리간드의 결합을 안정화시킬 상호작용을 생성시킴으로써, 헬릭스를 배치시키는데 도움이 될 수 있다. 모델은 표준 상동성 모델링 기술을 이용하여 세포 내 및 세포외 루프의 루프 구축 및 분자 미케닉스를 이용한 정련으로 완성될 수 있다. GPCR 구조 및 모델링에 대한 일반 정보는 문헌 [Schoneberg, T. 등, Molecular and Cellular Endocrinology, 151: 181-193 (1999), Flower, D., Biochimica et Biophysica Acta, 1422: 207-234 (1999), 및 Sexton, P. M., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2(5): 440-448 (1999)] 에서 찾아볼 수 있다.

일단 모델이 완성되면, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 스크리닝될 화합물의 수를 감소시키기 위해, 여러 존재하는 컴퓨터 프로그램 중 하나와 함께 사용할 수 있다. 이의 가장 일반적인 것은 DOCK 프로그램 (UCSF Molecular Design Institute, 533 Parnassus Ave, U-64, Box 0446, San Francisco, California 94143-0446) 이다. 그 여러 변이형에 있어서, 결합 부위에 대한 입체적 피트 (fit) 및 대략적인 정전기적 상보성에 대해 시판 및/또는 독점 (proprietary) 화합물의 데이타베이스를 스크리닝할 수 있다. 종종, DOCK 내에서 좋은 점수를 얻은 분자가 리간드일 가능성이 높음이 발견되어 왔다. 사용될 수 있는 또다른 프로그램은 FLEXX 이다 (Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144-2913 (www.tripos.com)). 매우 느린 상기 프로그램은 통상 더 적은 화합물 데이타베이스를 통한 검색을 위해 제한된다. FLEXX 내의 스코어링 방식은 보다 복잡하며, 보통 DOCK 에서보다 결합능에 대해 더 우수한 추정을 제공한다. FLEXX 는 DOCK 에서의 제안을 확인하기 위해, 또는 공지된 리간드 또는 주형으로부터 조합 생성된 화합물의 라이브러리를 시험하기 위해 가장 많이 사용된다.

VI. 골격근 질량 또는 기능의 조절용 후보 화합물의 동정을 위한 스크리닝 분석

CRF₂R 이 골격근 위축의 조절에 관여한다는 발견으로, 골격근 위축의 예방적 또는 치료적 처치를 위해 궁극적으로 사용될 수 있는 후보 화합물의 동정을 위한, 하나 이상의 시험 화합물의 다양한 스크리닝 방법이 가능해졌다. 본 발명은 CRF₂R 에 결합하거나, CRF₂R 을 활성화시키거나, CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 작동제-유도 활성화를 연장 또는 증강시키거나, CRF₂R 또는 CRF 유전자의 발현을 증가시키는 능력에 대한 시험 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.

CRF₂R 및 CRF₁R 은 상동성 단백질이므로, CRF₂R 에 대한 작동제의 일정분은 또한 CRF₁R 의 작동제로서 기능할 것으로 추정된다. 상기에 논의된 바와 같이, CRF₁R 의 활성화는 HPA 축의 활성화 및 코르티코스테로이드의 동시적 생성을 유도한다. 근육 질량 또는 기능의 증가를 목적으로 하는 대부분의 경우, HPA 축을 활성화시키는 것은 바람직하지 않다. 따라서, CRF₂R 을 활성화시키는 능력에 대한 시험 화합물의 스크리닝에 덧붙여, 본 발명은 또한 CRF₂R 의 선택적 작동제를 스크리닝하기 위한 CRF₂R 및 CRF₁R 의 용도를 제공한다. 근육 이영양증에 관련되지 않은 급성 또는 만성 근위축의 처치를 위해 유용한 후보 화합물을 선택하는 경우, 후보 화합물이 CRF₂R 에 대해 선택적인 것이 바람직하다. 후보 화합물은 바람직하게는 CRF₁R 보다, CRF₂R 에 대한 10 배의 선택성을 (즉, CRF₁R 보다, CRF₂R 에 대해 10 배 더 활성임), 보다 바람직하게는 100 배의 선택성을, 가장 바람직하게는 1000 배 이상의 선택성을 나타낸다. 공개된 연구에서 근육 이영양증의 처치에 있어 코르티코스테로이드 치료의 유익성이 나타났으므로, CRF₂R 작동제는 근육 이영양증의 처치를 위해 사용되는 경우 일정 수준의 CRF₁R 아고니즘을 보유하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 근육 이영양증의 처치를 위해, 유사한 농도 범위에 걸쳐 CRF₂R 뿐만 아니라 CRF₁R 도 활성화시키는 낮은 선택성을 갖는 화합물이 바람직하다. 후보 화합물은 바람직하게는 CRF₁R 보다, CRF₂R 에 대해 100 배 선택적이며, 보다 바람직하게는 10 배 선택적이고, 가장 바람직하게는 CRF₁R 보다, CRF₂R 에 대해 선택적이지 않다 (즉, 후보 화합물의 활성이 CRF₂R 및 CRF₁R 에 대해 실질적으로 유사하다). 또한 상기 경우, 화합물이 CRF₂R 에 대한 완전 작동제이지만, CRF₁R 에 대한 부분 작동제인 것이 더 바람직할 수 있다. 따라서, 상기 후보 화합물은 코르티솔 상승 및 근위축에 대한 잠재력의 최대 정도에 대한 고유 한계를 가질 것이지만, CRF₂R 을 통해 매개되는 항위축 효과는 용량을 증가시킴에 따라 증강될 수 있다. 당업자는 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 후보 화합물이 CRF₁R 또는 CRF₂R 의 완전 또는 부분 작동제인지 여부를 결정할 수 있을 것이다.

인간에서 CRF₂R 을 통해 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위해 궁극적으로 사용될 화합물의 스크리닝을 위해, 서열 번호 10 과 80% 초과로 동일한, 보다 바람직하게는 서열 번호 10 과 90% 초과로 동일한 아미노산 서열을 갖는 CRF₂R 을 이용하여 초기 시험관 내 스크리닝을 수행하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 시험 화합물을 인간, 마우스 또는 래트 CRF₂R 에 대해, 가장 바람직하게는 인간에 대해 스크리닝할 것이다. 비인간 종에서 CRF₂R 을 통해 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위해 궁극적으로 사용될 화합물의 스크리닝을 위해, 처치가 수행될 종으로부터의 CRF₂R 을 이용하는 것이 바람직하다.

만약 존재한다면, 어떤 선택성을 후보 화합물이 CRF₁R 보다, CRF₂R 에 대해 나타내는 지를 결정하기 위한, CRF₁R 에 대해 시험 또는 후보 화합물이 갖는 활성 수준의 결정용 스크리닝을 위해, 서열 번호 2 와 80% 초과로 동일한, 보다 바람직하게는 서열 번호 2 와 90% 초과로 동일한 아미노산 서열을 갖는 CRF₁R 을 이용하여 초기 스크리닝을 수행하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 시험 화합물을 인간, 마우스 또는 래트 CRF₁R 에 대해, 가장 바람직하게는 인간에 대해 스크리닝할 것이다. 비인간 종에서 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위해 궁극적으로 사용될 화합물의 스크리닝을 위해, 처치가 수행될 종으로부터의 CRF₁R 을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 고효율 적용에 사용가능하다; 그러나, 상기 방법에서 하나의 시험 화합물 만큼 적은 수의 이용도 "스크리닝" 이라는 용어에 포함된다. 본 발명의 방법에 의해 결정되는 바와 같은, CRF₂R 에 결합하거나, CRF₂R 을 활성화시키거나, CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 작동제-유도 활성화를 연장 또는 증강시키거나, CRF₂R 또는 CRF 유전자의 발현을 증가시키는 시험 화합물이 본원에서 "후보 화합물" 로 불린다. 상기 후보 화합물은 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 보다 전형적으로는, 상기 첫번째 수준의 시험관 내 스크리닝은 더 좁은 범위의 화합물, 즉 후보 화합물을 선택하기 위한 수단을 제공하여, 추가적인 스크리닝 수준에서의 추가 연구에 이득을 제공한다. 당분야의 숙련자는, 본 발명의 유용성이 하나 이상의 시험 화합물 군으로부터, 추가 연구에 이득을 제공하는 화합물의 서브세트를 동정하는 것임을 인지할 것이다. 또한 당업자는 본 발명의 분석이 기타 후보 화합물에 비해 특정 후보 화합물의 가능한 유용성을 평가하는데 유용함을 인지할 것이다. 예를 들어, 1000 nM 에서 (10 nM 에서가 아님) CRF₂R 을 활성화시키는 후보 화합물은, 10 nM 에서 CRF₂R 을 활성화시키는 것에 비해 관심을 덜 받는다. 이러한 정보를 이용하여, 당분야의 숙련자는 추가 연구를 위해, 첫번째 스크리닝 수준에서 동정된 후보 화합물의 서브세트를 선택할 수 있다. 단지 예로서, 200 nM 미만의 농도에서 CRF₂R 을 활성화시키는 화합물을 골격근 위축의 동물 모델에서 추가 시험할 수 있지만, 상기 역치를 초과하는 것은 추가 시험하지 않을 것이다. 또한 당분야의 숙련자는, 시험 화합물 군이 어떻게 선택되고, 양성체들이 어떻게 선택되는지에 따라, 단지 일부의 시험 화합물만이 후보 화합물로서 동정될 것이며, 상기 비율이 매우 작을 수 있음을 인지할 것이다.

후술되는 분석 시스템은 다양한 용기, 예컨대 바이알, 튜브 마이크로타이터 웰 플레이트, 병 등에 포장될 수 있는, CRF₂R 또는 CRF₂R 을 발현하는 세포를 포함하는 키트로 제형화될 수 있다. 기타 시약, 예컨대 양성 대조군 샘플, 음성 대조군 샘플, 완충액 및 세포 배양 배지가 개별 용기에 포함되어 키트와 함께 제공될 수 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 CRF₂R 에 결합하는 후보 화합물을 동정하기 위한 하나 이상의 시험 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 수용체로의 화합물 결합 결정 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 분석에는 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에, 수용체에 결합하는 것으로 공지된 표지 화합물과 CRF₂R 원의 인큐베이션 및 결합된 표지 화합물의 양 결정 단계가 포함된다. CRF₂R 원은 본원에 기재된 바와 같은 CRF₂R 을 발현하는 세포 또는 단리된 CRF₂R 의 일부 형태일 수 있다. 표지 화합물은 바람직하게는 정량적으로 측정될 수 있도록 표지된 (예컨대,¹²⁵I-표지, 유러퓸 표지, 플루오레신 표지, GFP 표지, ³⁵S-메티오닌 표지된) CRF 또는 임의의 CRF 유사체일 수 있다. 상기 표지 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. CRFR 에 결합하는 시험 화합물은 수용체에 결합한 표지 리간드의 양을 감소시켜, 대조군 샘플 (시험 화합물이 없음) 과 비교하여 신호 수준을 감소시킨다. G-단백질 탈커플링 제제의 존재 및 부재 하의 수용체 결합 (예컨대, 구아닌 뉴클레오티드 유사체, 즉 GpppNHp 의 부재 및 존재 하의 결합) 으로 작동제와 길항제를 구별할 수 있는 상기 기술의 변형이 기술되어 있다. 문헌 [Keen, M., Receptor Signal Transduction Protocols 중 Radioligand Binding Methods for Membrane Preparations and Intact cells, R. A. J. Challis 편저, Humana Press Inc., Totoway N. J. (1997)] 참고.

CRF₁R 과 비교하여 CRF₂R 에 특이적으로 결합하는 화합물을 구별하는 것이 바람직하므로, 상술한 분석은 CRF₂R 만을 발현하는 세포 또는 세포막을 이용하여 수행되어야 하고, 또는 상기 분석은 CRF₂R 의 재조합 원과 수행될 수 있다. 두 가지 형태의 CRFR 을 모두 발현하는 세포는 CRF₁R 유전자를 불활성화시키거나 불능하게 하는 상동성 재조합으로 개질될 수 있다. 이와는 달리, CRFR 원이 하나 이상의 CRFR 유형을 포함하는 경우, 관심 대상이 아닌 수용체에 의해 생성되는 배경 신호는 분석에서 수득되는 신호로부터 차감되어야 한다. 배경 반응은, 안티센스, 항체 또는 선택적 길항제의 이용에 의한 관심 대상이 아닌 CRFR 로부터의 신호 제거를 포함하는 여러 방법에 의해 결정될 수 있다. CRFR 의 공지된 길항제에는 안탈라르민 (antalarmin, CRF₁R 선택적), 항소바진-30 (CRF₂R 선택적) 및 아스트레신 (astressin, CRF₁R/CRF₂R 에 대해 비선택적) 이 포함된다.

또다른 구현예에 있어서, 본 발명은 CRF₂R 및/또는 CRF₁R 을 활성화시키는 후보 화합물의 동정을 위한 시험 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 전형적으로, 분석은 세포를 기반으로 한다; 그러나, 상술한 바와 같은 작동제 및 길항제 결합을 구분할 수 있는 무세포 분석이 공지되어 있다. 세포 기반 분석에는 CRF₁R 또는 CRF₂R 을 발현하는 세포와 시험 화합물 또는 대조군을 접촉시키고, CRFR 신호 전달 기전 성분의 발현 또는 활성을 측정하여 CRFR 활성화를 측정하는 단계가 포함된다.

상기 배경기술 분야에서 기재된 바와 같이, CRFR 은 세포 유형에 따라, G_αs, G_αq 또는 G_{α i} 를 포함하는 여러 상이한 기전을 통해 커플링되는 것으로 나타난다. CRFR 의 작동제 활성화로, 필요한 기전 성분이 특정 세포 유형에 존재한다면, 임의의 상기 기전을 통해 수용체가 신호를 전달할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, CRFR 활성화를 스크리닝하기 위해, 생체 내에서 처치를 위한 관련 세포 유형이 상이한 기전을 통해 골격근 위축을 위한 CRFR 에 커플링 되는 경우라도, 분석은 판독된 바와 같은 임의의 신호 전달 기전을 이용할 수 있다. 당업자는 스크리닝 분석이 수용체 활성화가 측정되는 기전과는 무관하게, 유용한 CRFR 작동제를 동정하기 위해 효과적일 것임을 인지할 것이다. 상기 신호전달 기전의 활성화 측정을 위한 분석은 당분야에 공지되어 있다.

예를 들어, 시험 화합물과의 접촉 후, 세포 용해액을 제조하고, cAMP 의 유도에 대해 분석할 수 있다. cAMP 는 G_αs 활성화에 반응하여 유도된다. G_αs 가 CRFR 이외의 수용체에 의해서도 활성화되고, 시험 화합물이 그 효과를 CRFR 또는 또다른 기전에 의해 나타낼 수 있으므로, 시험 화합물이 CRFR 의 활성화를 통해 cAMP 의 수준을 증가시키는지 여부를 결정하기 위한 2 개의 대조군 비교가 적절하다. 하나의 대조군은 시험 화합물과 접촉한 세포의 cAMP 수준과, 대조군 화합물 (즉, 시험 화합물이 용해되는 전달체) 과 접촉한 세포의 cAMP 수준을 비교한다. 시험 화합물이 대조군 화합물에 비해 cAMP 수준을 증가시킨다면, 이는 시험 화합물이 몇몇 기전에 의해 cAMP 를 증가시킴을 시사한다. 다른 대조군은 CRFR 발현 세포주, 및 CRFR 을 발현하지 않는 것을 제외하고는 본질적으로 동일한 세포주의 cAMP 수준을 비교하며, 여기서 두 세포주 모두 시험 화합물로 처리된다. 시험 화합물이 CRFR 을 발현하지 않는 세포주에 비해 CRFR 발현 세포주에서의 cAMP 수준을 상승시킨다면, 이는 시험 화합물이 CRFR 의 활성화를 통해 cAMP 를 상승시킴을 시사한다.

본 발명의 특정 구현예에 있어서, cAMP 유도는 CRFR 발현 세포 내로 도입될 수 있는 임의의 다양한 리포터 유전자에 연결된 cAMP 반응성 요소를 포함하는 DNA 구축물을 이용하여 측정된다. 상기 리포터 유전자에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT), 루시퍼라아제, 글루쿠로니드 신터타아제, 성장 호르몬, 형광 단백질 (예컨대, 녹색 형광 단백질), 또는 알칼린 포스파타아제. 시험 화합물로의 세포 노출 후, 리포터 유전자의 발현 수준을 정량하여, 시험 화합물의 cAMP 수준을 증가시키는 능력을 결정할 수 있고, 따라서 시험 화합물의 CRFR 을 활성화시키는 능력을 결정할 수 있다.

상기 분석에 유용한 세포는, 활성화 분석에 사용되는 세포가 바람직하게는 CRF 또는 하나 이상의 CRF 유사체에 대해 통계적으로 유의미한 반응을 나타내는 기능성 수용체를 발현하는 것을 제외하고는 상술한 CRFR 결합 분석에 대한 것과 동일하다. 또한 전장 CRFR 을 발현하는 세포를 이용하는 것 외에, 신호전달 단백질과 상호작용하거나 리포터 요소를 함유하도록 커플링되거나 물리적으로 개질된 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 CRFR 을 발현하는 세포를 조작할 수 있다. 예를 들어, 야생형 CRFR 또는 CRFR 단편을 G-단백질에 융합시켜, 융합 단백질의 CRFR 부분에 대한 작동제 결합 시 융합 G-단백질의 활성화를 일으킬 수 있다 (Siefert, R. 등, Trends Pharmacol. Sci. 20: 383-389 (1999)). 또한 세포는 판독에 따라, 예를 들어 CRE 리포터 유전자의 강한 유도의 검출을 위한 CRF 또는 CRF 유사체에 의한 유도성 반응을 최대화시키기 위해 바람직하게는 여러 특징을 포함해야 한다; (a) 낮은 천연 수준의 cAMP; (b) CRFR 과 상호작용할 수 있는 G 단백질; (c) 고수준의 아데닐릴 시클라아제; (d) 고수준의 단백질 키나아제 A; (e) 저수준의 포스포디에스터라아제; 및 (f) 고수준의 cAMP 반응 요소 결합 단백질이 유리할 것이다. CRF 또는 CRF 유사체에 대한 반응을 증가시키기 위해, 숙주 세포는 더 많은 양의 바람직한 인자 또는 더 적은 양의 바람직하지 않은 인자를 발현하도록 조작될 수 있다. 또한, CRE 리포터의 유도를 위한 대안적 기전을 제거하여, 기본 수준을 감소시킬 수 있다.

일부 경우에 있어서, G 단백질-커플링된 수용체 반응은 작동제에 대한 연장된 노출 후에 감퇴되거나 탈감작될 수 있다. 본 발명의 또다른 구현예는 CRF₂R 작동제에 대한 반응에서, CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 작동제-유도 활성화를 연장 또는 증강시키는 화합물을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 화합물은, 예를 들어 골격근 위축의 처치를 위한 CRF₂R 작동제와 함께 사용될 수 있다. 전형적으로, 상기 방법은 임의 순서 또는 동시적으로 하기를 포함하는 세포 기반 분석을 이용한다: (i) 세포와 시험 화합물을 접촉시킴; (ii) 기능성 CRF₂R 을 발현하는 세포를 수용체를 탈감작시킬 수 있는 충분한 작동제-수용체 노출 기간 동안 및 작동제의 농도에서 CRF₂R 작동제로 처리함; 이어서 (iii) CRF₂R 의 활성화 수준 결정. 당업자는 수용체 인산화, 수용체 내재화 또는 분해 및 CRFR 신호 전달 기전 하향조절을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 몇몇 기전이 수용체 탈감작에 기여함을 인지할 것이다. 당업자는 표적이 되는 탈감작 기전에 따라 시험 화합물과 세포를 접촉시키기 위해 적절한 시간 (즉, 작동제 처치 전, 도중 또는 후) 을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 작동제 처치 후 세포와 시험 화합물의 접촉으로, 수용체의 인산화 결과 일어나는 수용체 탈감작을 차단하는 시험 화합물을 검출할 수 있다.

또다른 구현예에 있어서, 본 발명은 CRF₂R 유전자로부터의 전사를 조절하거나 CRF₂R 발현을 조절하는 후보 화합물을 동정하기 위한 하나 이상의 시험 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. CRFR 유전자의 전사 활성을 조절하는 후보 화합물은 CRF₂R 조절 영역과 작동적으로 연합된 리포터 유전자 (리포터 유전자 구축물) 를 이용하여 동정될 수 있다. 상기 방법은 당분야에 공지되어 있다. 상기 방법의 하나에서, 리포터 유전자 구축물을 세포성 인자의 원의 존재 하에 시험 화합물과 접촉시키고, 리포터 유전자 발현 수준을 결정한다. 대조군 샘플과 비교하여, 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물이 CRF₂R 유전자의 전사를 증가시키는 후보 화합물임을 시사한다. 시험관 내 또는 생체 내 전사에 필요한 세포성 인자를 제공하기 위해, 적절한 세포 또는 세포 추출물을 CRF₂R 을 일반적으로 발현하는 임의의 세포 유형으로부터 제조한다.

CRF₂R 발현을 조절하는 후보 화합물은 또한 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, CRFR 의 발현을 결정하는 방법으로 동정될 수 있다. 시험 화합물의 존재 하의 CRF₂R 발현 수준을 시험 화합물의 부재 하의 발현 수준과 비교한다. CRF₂R 발현을 증가시키는 시험 화합물을 근육 질량 또는 근육 기능을 증가시키기 위한 후보 화합물로서 동정한다. 상기 방법으로 CRF₂R 의 전사 또는 번역을 증가시키거나, CRF₂R 단백질 또는 mRNA 안정성을 증가시키는 후보 화합물이 검출된다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 CRF 또는 CRF 유사체의 발현을 조절하는 후보 화합물을 동정하기 위한 하나 이상의 시험 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 분석은 하기 개질을 갖는 CRFR 의 발현을 조절하는 후보 화합물을 동정하기 위한 분석에 대해 상술된 바와 본질적으로 동일하게 수행된다. CRF 유전자 또는 CRF 유사체 유전자의 전사를 조절하는 후보 화합물을 동정하기 위해, 리포터 유전자를 관심 CRF 유전자 또는 CRF 유사체 유전자의 조절 영역에 작동적으로 연합시키며, 세포성 인자의 원은 관심 유전자를 발현하는 세포 유형에서 유래되어야 한다.

VII. 골격근 위축 모델을 이용한 후보 화합물의 스크리닝

상술한 바와 같이 시험관 내 분석에 의해 하나 이상의 시험 화합물에서 선택되는 후보 화합물은 골격근 위축 및/또는 비후의 모델 시스템에서 골격근 질량 또는 기능을 조절하는 이들의 능력에 대해 추가로 시험될 수 있다. 골격근 위축 또는 비후의 상기 모델에는 골격근 위축의 시험관 내 세포 배양 모델 및 생체 내 동물 모델이 둘 다 포함된다. 상기 추가적 수준의 스크리닝은 추가적 조사, 예컨대 임상 시험을 이롭게하는 후보 화합물의 범위를 더 좁히는데 유용하다.

근위축의 세포 배양 모델

골격근 위축의 시험관 내 모델은 당분야에 공지되어 있다. 상기 모델은, 예를 들어 [Vandenburgh, H.H., In Vitro 24: 609-619 (1988), Vandenburgh, H.H. 등, J of Biomechanics, 24 Suppl 1: 91-99 (1991), Vandenburgh, H.H 등, In Vitro Cell. Dev. Biol., 24 (3): 166-174 (1988), Chromiak, J.A., 등, In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 34 (9): 694-703 (1998), Shansky, J., 등, In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 33 (9): 659-661 (1997), Perrone, C.E. 등, J. Biol. Chem. 270 (5): 2099-2106 (1995), Chromiac, J.A. 및 Vandenburgh, H.H., J. Cell. Physiol. 159 (3): 407-414 (1994), 및 Vandenburgh, H.H. 및 Karlisch, P., In Vitro Cell. Dev. Biol. 25 (7): 607-616 (1989)] 에 기재되어 있다. 상기 모델은 동물 모델에서의 시험을 이롭게 하는 후보 화합물의 범위를 더 좁히기 위해 상술한 시험관 내 스크리닝 후에 유용하지만, 필요한 것은 아니다. 세포 배양 모델을 후보 화합물로 처리하고, 처리에 대한 모델의 반응을 근육 마커, 예컨대: 근육 단백질 합성 또는 분해, 골격근 질량 또는 수축 기능의 변화 측정에 의해 측정한다. 근육 마커에 있어서 유의미한 변화를 유도하는 화합물을 골격근 위축의 동물 모델에서 전형적으로 추가 스크리닝한다.

골격근 위축의 동물 모델

후보 화합물을 비인간 동물에게 투여하고, 예를 들어 위축 또는 비후의 마커, 예컨대: 골격근 질량, 골격근 기능, 근육 또는 근섬유 단면적, 수축성 단백질 함량, 비수축성 단백질 함량 또는 골격근 질량 또는 기능 변화와 관련되는 생화학적 또는 유전적 마커의 변화 평가에 의해 동물의 반응을 모니터링한다. 골격근 비후를 유도하거나 골격근 위축의 임의 양상을 예방하는 후보 화합물은 인간 골격근 위축의 처치를 위한 기대되는 치료적 후보로서 간주되어야 하며, 본원에서 치료적 후보 화합물로서 불린다. 또한 골격근 위축을 조절하기 위한 후보 화합물의 능력을 평가하기 위해, 바람직하지 못한 부작용, 예컨대 독성도 또한 상기 스크리닝에서 검출될 수 있다. 허용불가능한 고수준의 부작용 부재는, 치료적 후보 화합물의 선택을 위한 추가 기준으로서 사용될 수 있다.

골격근 위축의 다양한 동물 모델은 예컨대 하기 참고문헌에 기재된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다: [Herbison, G.J., 등, Arch. Phys. Med. Rehabil. 60: 401-404 (1979), Appell, H-J., Sports Medicine 10: 42-58 (1990), Hasselgren, P-0. 및 Fischer, J.E., World J. Surg. 22: 203-208 (1998), Agbenyega, E.T. 및 Wareham, A.C., Comp. Biochem. Physiol. 102A: 141-145 (1992), Thomason, D. B. 및 Booth, F. W., J Appl. Physiol. 68: 1-12 (1990), Fitts, R.H., 등, J Appl. Physiol. 60: 1946-1953 (1986), Bramanti, P., 등, Int. J. Anat. Embryol. 103: 45-64 (1998), Cartee, G.D., J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 50: 137-141 (1995), Cork, L.C., 등, Prog. Clin. Biol. Res. 229: 241-269 (1987), Booth, F. W. 및 Gollnick, P.D. Med. Sci. Sports Exerc. 15: 415-420 (1983), Bloomfield, S.A. Med. Sci. Sports Exerc. 29: 197-206 (1997)]. 상기 모델을 위해 바람직한 동물은 마우스 및 래트이다. 이들 모델에는, 예를 들어 불용성-유도 위축 모델, 예컨대 캐스팅 또는 달리 고정화된 사지, 후각 현탁액, 완전 동물 고정 및 감소된 중력 조건이 포함된다. 근육 손상 유도 위축의 모델에는, 예를 들어 신경 좌상, 특정 근육을 자극하는 신경부의 제거, 근육으로의 독소 적용 및 바이러스성, 박테리아성 또는 진핵성 감염 제제로의 신경 감염이 포함된다. 글루코코르티코이드-유도 위축 모델에는 동물로의 외인성 글루코코르티코이드의 위축유도 용량의 적용 및, 예를 들어 시상하부-뇌하수체-부신 (HPA) 축을 활성화시키는 호르몬의 적용에 의한 내인성 코르티코스테로이드 생산의 자극이 포함된다. 패혈증-유도 위축 모델에는, 예를 들어 패혈증-유도 유기체, 예컨대 박테리아의 접종, 면역활성화 화합물, 예컨대 박테리아성 세포벽 추출물 또는 내독소로의 동물 처리, 및 위장관 벽의 상처가 포함된다. 악액질-유도 위축 모델에는, 예를 들어 악액질 형성 가능성을 갖는 종양성 세포로의 동물 접종, 악액질을 일으키는 감염성 제제 (예컨대 AIDS 를 일으키는 바이러스) 로의 동물 감염, 및 악액질을 유도하는 호르몬 또는 시토카인, 예컨대 CNTF, TNF, IL-6, IL-1 등으로의 동물 처리가 포함된다. 심부전-유도 위축 모델에는 골격근 위축과 심부전이 동시에 일어나도록 하는 동물 조작이 포함된다. 신경퇴행성 질환-유도 위축 모델에는 자가면역 동물 모델, 예컨대 신경성 성분으로의 동물 면역화에서 일어나는 것이 포함된다. 위축의 근육 이영양증-유도 모델에는 천연 또는 인공의 근육 이영양증의 유전적 유도 모델, 예컨대 Mdx 마우스에서 일어나는 디스트로핀 유전자의 돌연변이가 포함된다.

골격근 비후의 동물 모델에는, 예를 들어 반대 사지의 불활성화, 불용성 위축 유도 사건으로 인한 재부가 (reweighting), 일시적 신경 손상으로 인해 위축된 근육의 재사용으로 인한 증가된 사지 근육 이용, 상승적 근육의 불활성화로 인한 선택적 근육의 증가된 사용 (예컨대 보상적 비후), 근육 상에 일어나는 증가된 하중으로 인한 증가된 근육 이용 및 글루코코르티코이드-유도 위축 후 글루코코르티코이드 제거로 인한 비후 모델이 포함된다. 바람직한 동물 위축 모델에는 좌골 신경 제거 위축 모델, 글루코코르티코이드-유도 위축 모델, 및 자세히 후술되는 다리 캐스팅 불용성 위축 모델이 포함된다.

좌골 신경 제거 위축 모델에는 동물의 마취 후, 우측 또는 좌측 좌골 신경 단절의 수술적 제거가 관여되며, 예컨대 마우스에서의 좌골 신경은 대략 대퇴골 중앙에서 단리되며, 3-5 mm 절편이 제거된다. 이는 상기 근육의 위축을 일으키는 하부 후각 근조직을 신경제거시킨다. 전형적으로, 대퇴골 이두근에 대한 신경 분포는 실질적으로 정상적인 운동을 위한 무릎의 만족스러운 이동을 제공하기 위해 그대로 놔둔다. 전형적으로, 미처리 동물에서, 신경제거 근육의 근육 질량은 신경제거 10 일 후 30-50% 감소된다. 신경제거 후, 시험 화합물을, 예컨대 주사 또는 예컨대 삼투성 미니펌프 (예컨대, Alzet, Palo Alto, CA) 의 이식을 통한 연속 주입에 의해 투여하여, 신경제거 유도 골격근 위축에 대한 이들의 효과를 결정한다. 신경제거 후 다양한 시점에서, 동물을 안락사시키고, 신경제거 및 비신경제거 다리로부터 하부 다리 근육을 신속히 절개하여, 힘줄 및 연결 조직이 제거된 근육을 칭량한다. 영향받은 근육의 위축 정도를, 예를 들어 근육 질량, 근육 단면적, 근섬유 단면적 또는 수축성 단백질 함량의 측정에 의해 분석한다.

글루코코르티코이드-유도 위축 모델에는 시험 동물로의 글루코코르티코이드, 예컨대, 음료수 중 1.2 mg/kg/day 의 덱사메타손 투여가 관여된다. 전형적으로, 미처리 동물에서, 골격근 질량은 덱사메타손 투여 10 일 후 30-50% 감소된다. 이와 동시에, 또는 글루코코르티코이드 투여 후, 시험 화합물을, 예컨대 주사 또는 연속 주입에 의해 투여하여, 글루코코르티코이드-유도 골격근 위축에 대한 이들의 효과를 결정한다. 글루코코르티코이드 투여 후 다양한 시점에서, 영향받은 근육의 위축 정도를 신경제거 모델에 대해 상술된 바와 같이 분석한다.

다리 캐스팅 불용성 위축 모델에는 무릎 아래부터 발까지의 동물의 한 후각의 캐스팅이 관여된다. 전형적으로, 근육 질량은 캐스팅 10 일 후 20-40% 감소된다. 캐스팅 후, 시험 화합물을 주사 또는 삼투성 미니펌프 (예컨대, Alzet, Palo Alto, CA) 의 이식을 통한 연속 주입에 의해 투여하고, 다리 캐스팅 유도 골격근 위축에 대한 이들의 효과를 결정한다. 다리 캐스팅 후 다양한 시점에서, 영향받은 근육의 위축 정도를 신경제거 모델에 대해 상술된 바와 같이 분석한다.

인간용 화합물을 위한 스크리닝에 있어서, 인간 CRF₂R 및 다른 동물종 유래의 CRF₂R 사이에 차이점이 존재하므로, 비인간 CRF₂R 을 이용하여 스크리닝을 수행할 경우 일부 가양성 또는 가음성 결과가 나타날 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 따라서, 인간 CRF₂R 을 이용하여 초기 시험관 내 스크리닝을 수행하는 것이 바람직하다. 일부 경우에서, 동정된 후보 화합물은 인간 수용체에 대해서만 활성을 가지며, 비인간 수용체에 대해서는 그렇지 아니할 수 있다. 상기 경우, 이들 후보 화합물이 골격근 질량 또는 기능을 2 차 수준의 스크리닝에서 조절할 수 있는지 여부를 결정하는 것이 여전히 바람직할 수 있다. 이들 후보가 비인간 CRF₂R 을 활성화시키는 않기 때문에, 비인간 동물로의 표준 생체 내 스크리닝은 추천되지 않는다. 이런 경우, 이들 후보에 대한 2 차 수준의 스크리닝은 인간 CRFR 을 발현하는 트랜스제닉 동물에서 수행될 수 있다.

임의의 종의 동물, 특히 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 포유류가 CRFR 트랜스제닉 동물의 제조에 사용될 수 있다: 마우스, 래트, 토끼, 기니아픽, 돼지, 염소, 개 및 비인간 영장류. 마우스 및 래트가 바람직하며, 마우스가 가장 바람직하다. 다양한 기술이 당분야에 공지되어 있으며, 트랜스제닉 동물의 창립주 (founder line) 를 제조하기 위해, 인간 CFRF 이식유전자 (transgene) 의 동물 내 도입을 위해 사용될 수 있다. 상기 기술에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 전핵 마이크로주사, 배선 (germ line) 내로의 레트로바이러스-매개 유전자 수송, 배아 줄기 세포로의 유전자 타겟팅, 배아의 전기천공 및 정자-매개 유전자 수송.

VIII. 골격근 위축의 처치용 유전자 치료 방법

CRF₂R 의 전체 활성은 CRF₂R 에 대한 유전자의 과발현 (CRF₂R 의 발현을 증가시키기 위한 것) 또는 적절한 조직 내에서 항상적으로 활성인 CRF₂R 에 의해 증가될 수 있다. CRF 수준은 마찬가지로 CRF 유전자의 과발현에 의해 생체 내에서 증가될 수 있다. 이들 유전자의 과발현은 전체적인 세포성 CRF₂R 활성을 증가시켜서, 골격근 위축을 조절할 것이다. 관심 유전자 또는 유전자들은 대상체 내에서의 발현에 적합한 벡터 내로 삽입된다. 이들 벡터에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 아데노바이러스, 아데노바이러스 관련 바이러스, 레트로바이러스 및 단순 포진 벡터, 및 DNA 를 세포 내로 도입시키는 기타 입자 (예컨대, 리포좀, 금 입자 등) 또는 관심 유전자를 포함하는 DNA 발현 벡터의 인간 조직 (예컨대, 근육) 내로의 직접 주사.

IX. 약학 제형물 및 사용 방법

본원에 기재된 스크리닝 방법에 의해 동정된 후보 화합물 또는 치료적 후보 화합물은 개체에게 투여되어, 골격근 위축을 처치하거나 골격근 비후를 유도할 수 있다. 상기 목적을 위해, 본 발명에는 하기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 골격근 위축의 조절을 위한 방법 및 조성물이 포함된다: 수술, 장기 요양, 골절로 유도된 골격근 위축; 척추 손상으로 인한 신경제거/신경 손상; 자가면역 질환; 감염성 질환; 비관련 증상에 대한 글루코코르티코이드 사용; 감염 또는 기타 원인으로 인한 패혈증; 질병 또는 기아로 인한 영양 제한; 암 악액질; 만성 염증; AIDS 악액질; COPD; 울혈성 심부전; 사르코페니아 (sarcopenia) 및 유전적 장애; 예컨대, 근육 이영양증, 신경퇴행성 질환. CRF₂R 의 작동제를 사용하여 골격근 위축을 억제할 수 있다. 효과적인 화합물이 CRFR 에 대한 절대적 특이성을 나타낼 필요는 없다. 기타 영향받은 수용체의 특정 길항제를 효과적이지만 비특이적인 작동제와 함께 공동 투여할 수 있음을 예상할 수 있다. 이와는 달리, 상기 특이성의 결핍은 용량만의 조절 또는 투여 전략에 의해 해결될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정된 후보 화합물 또는 치료적 후보 화합물을 CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 활성화를 연장시키거나 증강시키는 화합물과 함께 투여할 수 있다. 이들은 공지된 화합물, 예를 들어, 테오필린일 수 있거나, 이들 화합물은 CRF₂R 수용체 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 활성화를 연장시키거나 증강시키기 위해 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정될 수 있다.

용량 결정

CRFR 을 작동시키는 화합물의 안정성 및 치료적 유효성은 시험관 내 또는 생체 내 기술을 이용하는 표준 절차에 의해 결정될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하지만, 부작용 수준이 허용가능하다면 더 낮은 치료 지수를 갖는 화합물이 유용하다. 시험관 내 및 생체 내 독성학 및 약리학 기술에서 수득되는 데이타를 사용하여, 유용할 수 있는 인간 용량 범위를 제형화할 수 있다. 바람직한 용량은 화합물의 순환 농도가 허용가능한 안정성을 가지며 최대로 치료적인 범위 내에 놓인다. 화합물의 순환 농도는 투여형, 투여 후 시간, 투여 경로 등에 따라 다를 수 있다. 상기 범위 밖의 용량도 또한 부작용이 허용가능하다면 유용하다. 환자의 연령 및 체중 등과 같은 문제를 사용하여, 종래 방식으로 상기 문제를 결정할 수 있다. 약물유전학적 접근도 또한 임상 집단에서의 화합물 선택, 용량 및 투여 계획의 최적화에 유용할 수 있다.

제형 및 용도

본 발명에 따라 골격근 위축의 조절에 사용하기 위한 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 이용하는 종래 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 단위 투여형으로 제공된다. 본원에서 사용되는 "단위 투여형" 은 우수한 의약 실시에 따라, 단일 용량으로, 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간 대상체로의 투여에 적합한 양의 CRF₂R 작동제를 포함하는 본 발명의 조성물이다. 약학 조성물은 전달을 위해, 예를 들어 비강내, 경피, 흡입, 비경구, 피하, 경구 또는 직장 투여에 의해 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위해, 약학 조성물은 약리학적 활성 화합물, 및 하기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 첨가제를 함유하는 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다: 결합제, 충전제, 윤활제, 붕해제 또는 습윤제. 정제는 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제에는 하기가 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다: 약리학적 활성 화합물, 및 하기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 시럽, 현탁액 또는 사용 전에 액체 전달체로 재구성되는 건조 제품: 현탁제, 유화제, 비수성 전달체, 방부제, 완충액 염, 향료, 착색제, 감미제 등. 경구 투여용 약학 조성물은 구강, 위 또는 장관에서의 약리학적 활성 성분의 조절되는 방출을 위해 제형화될 수 있다.

흡입 투여를 위해, 본 발명에 따른 사용을 위한 화합물은 하기 형태에 의해 전달될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 액체, 분말, 겔 또는 미리 측정되거나 미리 측정되지 않은 용량으로 가압 또는 비가압 추진제를 이용하는 에어로졸 스프레이의 형태. 약리학적 활성 화합물은 적절한 충전제, 전달체, 방부제, 완충액 등과 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 약리학적 활성 화합물은 허용가능한 생리적 담체, 방부제 등과 제형화될 수 있고, 현탁액, 용액, 에멀젼, 즉시 구성가능한 분말 등으로서 볼루스 주사 또는 주입을 위해 제조될 수 있다. 이들 화합물의 용량은 피하 주사, 고압 장치 등을 포함하는 다양한 기술에 의해 투여될 수 있다. 직장 투여를 위해, 약리학적 활성 화합물은 좌약, 관장제 등으로서의 전달을 위해, 허용가능한 생리적 담체, 방부제 등과 제형화될 수 있다. 피하 투여를 위해, 약리학적 활성 화합물은 로션, 에몰리언트 등을 포함하는 허용가능한 생리적 담체와 함께 제형화되거나, 패치형 장치 내로 도입될 수 있다. 장기 투여를 위해, 약리학적 활성 화합물 및 적절한 첨가제, 예컨대 중합체, 소수성 물질, 수지 등이 (이에 제한되는 것은 아님) 근육내 및 피하 위치를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다중 부위에서의 주사 또는 이식을 위한 데팟 제제로서 제형화될 수 있다. 또한, 약리학적 활성 화합물을 분배 장치에 의해 투여할 수 있다.

임상 시험 중의 효과 모니터링

CRF₂R 의 발현 또는 활성에 대한 화합물 (예컨대 약물) 효과의 모니터링은 기본 약물 스크리닝 뿐만 아니라 임상 시험에서도 사용될 수 있다. 예를 들어, CRF₂R 수용체 활성 또는 CRF₂R 수용체 발현을 증가시키기 위한 스크리닝 분석에 의해 결정된 화합물의 효과는 골격근 위축을 겪거나 이의 위험이 있는 환자의 임상 시험에서 평가될 수 있다. 시험 화합물 또는 위약의 투여 후 다양한 시점에서, 환자에 대한 화합물의 효과는, 예를 들어 골격근 질량, 골격근 기능, 근육 파손의 생화학적 마커 또는 삶의 질 측정에서의 변화를 관찰함으로써 결정할 수 있다. 인간 대상체에서의 골격근 질량의 측정 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 하기를 포함한다: 사지의 치수 측정; 예를 들어 컴퓨터 단층촬영 (tomography), MRI 또는 초음파로 근육 두께 측정; 또는 형태학적 및 생화학적 파라미터 (예컨대, 섬유 단면적, 섬유 직경 또는 효소 활성) 를 검사하기 위한 근육 생검. 또한, 골격근 질량은 골격근 기능과 연관되므로, 근육 기능을 질량의 대리 마커로서 사용할 수 있고, 근육 질량 변화는 기능성 측정, 예컨대, 상승적 근육군의 강도, 힘, 또는 전자근운동 기록에서 나타나는 수축 특징을 이용하여 평가할 수 있다. 또한, 근위축의 결과로서의 근육 단백질 소실은 대상체의 뇨 또는 혈액 중, 아미노산 또는 아미노산 유도체, 즉 3-메틸 히스티딘의 수준 정량에 의해 측정할 수 있다. 상기 방법의 개론에 대해서는 문헌 [Appell, Sports Med. 10: 42-58 (1990)] 을 참고한다. 삶의 질 측정에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 의자로부터의 기립 용이성, 피로하기 전에 취해지는 걸음수 또는 계단을 오르는 능력.

[실시예]

실시예 1. 인간 CRF ₂ R 수용체 발현용 벡터의 구축.

인간 CRF₂R (hCRF₂R) DNA 서열, 접근 번호 E12752 를 검색하고, 개시 코돈에서 시작하는 유전자의 5' 말단을 포함하는 하나 (5' 올리고뉴클레오티드) 및 종결 코돈을 포함하는 유전자의 3' 말단을 포함하는 하나 (3' 올리고뉴클레오티드) 를 포함하는 2 개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 hCRF₂R 유전자에는 존재하지 않고 5' 올리고뉴클레오티드에만 유일한 한개의 제한효소 부위 및 3' 올리고뉴클레오티드에만 유일한 상이한 제한효소 부위를 포함하고, 또한 3' 올리고뉴클레오티드가 폴리아데닐화 부가 신호 서열을 포함하도록 고안되었다. 인간 골격근으로부터의 이중쇄 cDNA 는 Universal QUICK-Clone cDNA collection (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 에서 구매하였다. 상기 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 이용하여, AdvanTaq PCR 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하는 인간 골격근 cDNA 의 PCR 에 의해, hCRF₂R cDNA 를 증폭하였다. hCRF₂R 유전자 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 PCR 인공물로부터 정제하고, hCRF₂R 유전자 DNA 단편을 정제 제품, 예컨대 NucleoTrap (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다.

hCRF₂R PCR 산물의 pIRESneo 벡터 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 내로의 클로닝은 먼저 hCRF₂R PCR 산물 및 pIRESneo 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 5' 및 3' 제한효소 부위가 결찰될 수 있게 수행되었다. pIRESneo 벡터 DNA 를 제조자의 지시에 따라, AdvantAge^TMPCR 클로닝 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 의 DNA 리가아제를 이용하여 hCRF₂R PCR 산물 DNA 에 결찰시켰다. 이어서, 결찰된 벡터 및 삽입 구축물 (pIRESneo/hCRF₂R) 을 사용하여, TOP10F' 콤피턴트 대장균 세포 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 LB/X-gal/IPTG 와 앰피실린을 함유하는 아가 상에 플레이팅하였다. 백색 콜로니 (양성 클론) 를 선택하여, LB 배지 중에서 개별 배양하였다. 플라스미드 DNA 를 NucleoBond DNA 정제 시스템 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 을 이용하여 단리하였다. 하나 이상의 클론으로부터 삽입물을 서열분석하여, hCRF₂R 서열이 맞는지를 확인하였다. 안정적으로 삽입된 Mercury CRE-LUC 플라스미드 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 포함하는 HEK 293 세포를 정확한 서열 삽입물을 가진 정제 pIRESneo/hCRF₂R DNA 로, CalPhos^TM 포유류 트랜스펙션 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하여 트랜스펙션시켰다. pIRESneo/hCRF₂R DNA 로 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 G418 중에서의 세포 배양에 의해 선택하였다. 안정적으로 트랜스펙션된 세포 (HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF₂R 세포) 를 10% 소태아 혈청 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA), 페니실린/스트렙토마이신 용액 (Life Technologies, Rockville, MD), L-글루타민 (Life Technologies, Rockville, MD), 및 비필수 아미노산 (Life Technologies, Rockville, MD) 를 함유하는 DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) 중에서, 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 증식시켰다. 클론들을 실시예 2 및 실시예 3 에 기재된 바와 같이, CRF 로의 노출 후 CRF 결합 및 CRE-LUC 활성화 둘 다에 대해 분석하였다. 이어서, 적절한 수준으로 hCRF₂R 수용체를 발현하고, CRE-LUC 리포터 시스템에 적절히 커플링된 세포를 추가 분석에 이용하였다.

실시예 2. 수용체 결합 분석

화합물의 수용체 결합 분석은 실시예 1 의 HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF₂R 세포를 96 웰 폴리라이신 코팅 플레이트에 플레이팅하여 전체 세포 중에서 수행되었다. 세포를 10% 소태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 용액, L-글루타민, 및 비필수 아미노산을 함유하는 DMEM 배지 중에 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 접종하고, 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지를 제거하고, MEM (Life Technologies, Rockville, MD) + 10% Seablock (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 중의 유러퓸이 공유 표지된 적절한 양의 CRF (Eu-CRF) 를 첨가하였다. 세포를 실온에서 90 분 동안 Eu-CRF 와 인큐베이션 후, 마그네슘 및 칼슘이 없는 인산염 완충식염수 (Life Technologies, Rockville, MD) 로 4 회 세척하였다. 최종 세척 후, 증강 용액 (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) 을 첨가하고, BioWorks 유러퓸 프로그램을 이용하여 Wallac 플레이트 판독기 (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) 상에서 플레이트를 판독하였다. 포화 결합 분석을 위해, 10(-12) 내지 10(-3)M 범위의 Eu-CRF 의 로그 용량을 세포에 첨가하고, 비특이적 결합의 평가를 위해 비표지 CRF 의 포화 농도의 존재 및 부재 하 모두에서 결합을 분석하였다. 경합 결합을 위해, 관심 화합물의 다양한 농도에 첨가하여, 결합에 대해 최대치의 절반인 Eu-CRF 농도를 첨가하였다.

실시예 3. 수용체 활성화 분석

실시예 1 의 HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF₂R 세포를 Packard View Plate-96 (Packard Inc., CA) 에 접종하여 수용체 활성화 분석을 수행하였다. 10% 소태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 비필수 아미노산을 함유하는 DMEM 배지 중에, 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에서 세포를 접종하고, 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 이어서 배지를 제거하고, 관심 화합물을 함유하는 0.01% 소 알부민 분획 V (SIGMA, St. Louis, MO) 를 함유하는 DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) 으로 교체하였다. 이어서, 세포를 4 시간 동안 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 인큐베이션 후 배지를 제거하고, 세포를 Hanks Balanced Salt Solution (Life Technologies, Rockville, MD) 로 2 회 세척하였다. 이어서, 용해 시약 (Promega Inc., Madison, WI) 을 세척 세포에 첨가하고, 세포를 20 분 동안 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 -80℃ 에서 20 분 동안 놓아둔 뒤, 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 20 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후, 루시퍼라아제 분석 완충액 및 루시퍼라아제 분석 기질 (Promega Inc., Madison, WI) 을 세포 용해액에 첨가하고, 발광측정계를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 정량하였다. 화합물의 상대 활성을, hCRF₂R 없이 CRE-LUC 구축물을 포함하는 HEK 세포에서의 루시퍼라아제 수준에 대한 화합물의 노출 후 증가를 비교하여 평가하였다. 반응의 특이성도 또한, 10 배 과량의 hCRF₂R 길항제의 존재 및 부재 하에 화합물에 대한 hCRF₂R/CRE-LUC HEK 세포의 루시퍼라아제 반응을 평가하여 확인하였다.

실시예 4. CRF ₂ R 및/또는 CRF ₂ R 수용체 신호 전달 기전을 연장시키거나 증강 시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 스크리닝.

CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 작동제-유도 활성화를 연장시키거나 증강시키는 화합물의 동정에는 실시예 3 에 기재된 수용체 활성화 분석의 변형이 관여된다. 구체적으로, 상기 분석은 Packard View Plate-96 (Packard Inc., CA) 내로 HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF₂R 수용체 세포의 접종에 의해 수행된다. 10% 소태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 용액, L-글루타민, 비필수 아미노산, 및 포화량의 CRF 를 함유하는 DMEM 배지 중에 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 세포를 접종하고, 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 배지를 제거하고, 관심 화합물에 덧붙여 0.01% 소 알부민 분획 V (SIGMA, St. Louis, MO) 및 CRF 를 함유하는 DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) 로 교체하였다. 이어서, 세포를 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 4 시간 동안 인큐베이션 후 배지를 제거하고, 세포를 Hanks Balanced Salt Solution (Life Technologies, Rockville, MD) 으로 2 회 세척하였다. 이어서, 용해 시약 (Promega Inc., Madison, WI) 을 세척 세포에 첨가하고, 세포를 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 20 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 -80℃ 에서 20 분 동안 놔둔 뒤, 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 20 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후, 루시퍼라아제 분석 완충액 및 루시퍼라아제 분석 기질 (Promega Inc., Madison, WI) 을 세포 용해액에 첨가하고, 발광측정계를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 정량하였다. 세포 밀도의 편차 보정 후, 대조군의 미처리 세포의 수준을 유의미하게 초과하여 형광을 자극하는 시험 화합물을 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물로 간주하였다. 가장 흥미로운 화합물은 비교적 높은 수준의 형광을 유도하는 것들이다.

실시예 5. CRF ₂ R 에 특이적인 후보 화합물의 동정을 위한 스크리닝.

CRF₂R 을 활성화시키는 화합물을 실시예 3 에서와 같이 동정하였다. CRF₁R 에 비해 CRF₂R 에 대한 선택성을 보이는 화합물을 선택하기 위해, 상기 화합물을 또한 CRF₁R 에 대해서도 스크리닝하였다. HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF₁R 세포를, 인간 CRF₁R (hCRF₁R) DNA 서열, 접근 번호 X72304 를 초기 PCR 증폭에 사용한 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1 에 기재된 바에 따라 제조하였다. 화합물이 CRF₁R 에 대해 얼마나 활성인지를 결정하기 위하여, HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF₁R 세포를 이용하여 플레이트를 접종한 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 활성화 분석을 수행하였다. CRF₂R 발현 세포에서 화합물에 의해 자극받는 형광량을 CRF₁R 발현 세포에서 화합물에 의해 자극받는 형광량과 비교하였다. 이어서, CRF₁R 발현 세포에서보다 CRF₂R 발현 세포에서 10 배 더 큰 (몰 기준) 반응을 나타내는 화합물을 클론성 편차로 인한 차이를 제거하기 위해, 반응의 특이성에 대해 추가 검사하였다. HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF₂R 세포를 10 배 과량의 CRF₂R 길항제인 항소바진-30 의 존재 또는 부재 하에 화합물과 함께 분석하였다. CRF₂R 에 대해 10 배의 초과의 선택성을 나타내고, 그 활성이 항소바진-30 에 의해 억제되는 화합물을 후보 화합물로서 선택하였다.

실시예 6. hCRF ₂ R 발현을 증가시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 스크리닝

적절한 조직 내에서의 hCRF₂R 유전자의 생리적 발현에 필요한 모든 조절 요소를 포함하도록 전사 개시 부위에서 충분히 상류에서 시작하는, hCRF₂R 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 서열을 인간 게놈 데이타베이스로부터 검색하였다. 프로모터 영역의 5' 말단을 함유하는 하나 (5' 올리고뉴클레오티드) 및 전사 시작 부위를 포함하는 프로모터 영역의 3' 말단을 함유하는 하나 (3' 올리고뉴클레오티드) 의 2 개 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 또한 hCRF₂R 유전자 조절 영역에는 존재하지 않고 5' 올리고뉴클레오티드에만 유일한 한개의 제한효소 부위 및 3' 올리고뉴클레오티드에만 유일한 상이한 제한효소 부위를 포함한다. PCR 키트인 Advantage

게놈 PCR 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 이용하는 인간 DNA (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 로부터의 hCRF₂R 유전자 조절 영역의 PCR 증폭을 위해 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. hCRF₂R 유전자 조절 영역 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 PCR 인공물로부터 정제하고, hCRF₂R 유전자 조절 영역 DNA 단편을 정제 제품, 예컨대 NucleoTrap (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다. hCRF₂R 유전자 조절 영역 PCR 산물의 pECFP-1 벡터 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 내로의 클로닝은 먼저 hCRF₂R 유전자 조절 영역 PCR 산물 및 pECFP-1 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여, 5' 및 3' 제한효소 부위가 결찰될 수 있게 수행되었다. pECFP-1 벡터 DNA 를 제조자의 지시에 따라, AdvantAge^TMPCR 클로닝 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 의 DNA 리가아제를 이용하여 hCRF₂R 유전자 조절 영역 PCR 산물 DNA 에 결찰시켰다. 이어서, 결찰된 벡터 및 삽입 구축물을 사용하여, TOP10F' 콤피턴트 대장균 세포 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 형질전환시켰다. 세포를 LB 와 카나마이신을 함유하는 아가 상에 플레이팅하고, 카나마이신 내성 콜로니를 추가 분석을 위해 선택하였다. 카나마이신 내성 클론을 카나마이신 함유 LB 배지 중에서 배양하고, 플라스미드 DNA 를 NucleoBond DNA 정제 시스템 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 을 이용하여 단리하고, hVPAC₂ 유전자 조절 영역을 포함하는 구축물을 DNA 서열분석으로 분석하여, 구축물의 정확성 및 보존성을 확인하였다. 이어서, hCRF₂R 유전자 조절 영역을 포함하는 정제 구축물 플라스미드 DNA 를 CalPhos^TM 포유류 트랜스펙션 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하는 인산칼슘-매개 트랜스펙션을 이용하여 HEK293 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포 클론을 G418 을 이용하여 선택하고, 단리하여, 10% 소태아 혈청 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA), 페니실린/스트렙토마이신 용액 (Life Technologies, Rockville, MD), L-글루타민 (Life Technologies, Rockville, MD), 비필수 아미노산 (Life Technologies, Rockville, MD) 및 G418 (Life Technologies, Rockville, MD) 을 함유하는 DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) 중에서, 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 증식시켰다. G418 내성 클론을 써던 블롯팅에 의해 분석하여, 이들이 hCRF₂R 유전자 프로모터 서열을 포함하는 것을 확인하고; 또한 hCRF₂R 유전자 조절 영역의 활성화를 적절한 자극제를 이용하여 분석하였다. 이어서, 적절한 수준으로 hCRF₂R 유전자 조절 영역-ECFP 를 발현하는 세포를 하기와 같이 hCRF₂R 유전자 조절 영역의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 평가하기 위해 고안된 분석에 사용하였다. 조절 영역 활성화 분석은 검은색 투명 바닥의 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내로 적절한 밀도의 hCRF₂R 유전자 조절 영역-ECFP 함유 세포를 접종하고, 하룻밤 동안 성장시켜 수행되었다. 다음날, 배지를 제거하고, 시험 화합물을 신선한 성장 배지에 첨가하였다. 세포를 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 16 시간 동안 인큐베이션 후, 형광측정계 (biolumin^TM 960, Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 를 이용하여 형광도를 측정하였다 (433 (453) nm 에서 여기, 475 (501) nm 에서 관측). 세포 밀도의 편차 보정 후, 대조군인 미처리 세포의 수준을 유의미하게 초과하여 형광을 자극하는 시험 화합물을 골격근 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물로 간주하였다. 가장 흥미로운 화합물은 비교적 높은 수준의 형광을 유도하는 것들이다.

실시예 7. 인간 CRF 발현을 증가시키는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝

인간 CRF (hCRF) 발현을 증가시키는 화합물을 동정하기 위한 방법은 본질적으로 hCRF 유전자에 대한 조절 영역이 사용된다는 것을 제외하고는 hVPAC₂ 수용체 발현을 증가시키는 화합물을 동정하기 위한 방법과 동일하다. 적절한 조직 내에서의 hCRF 유전자의 생리적 발현에 필요한 모든 조절 요소를 포함하도록 전사 개시 부위에서 충분히 상류에서 시작하는, hCRF 유전자의 조절 영역을 포함하는 서열을 인간 게놈 데이타베이스로부터 검색하였다. 조절 영역의 5' 말단을 함유하는 하나 (5' 올리고뉴클레오티드) 및 전사 시작 부위를 포함하는 조절 영역의 3' 말단을 함유하는 하나 (3' 올리고뉴클레오티드) 의 2 개 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 또한 hCRF 유전자 조절 영역에는 존재하지 않고 5' 올리고뉴클레오티드에만 유일한 한개의 제한효소 부위 및 3' 올리고뉴클레오티드에만 유일한 상이한 제한효소 부위를 포함한다. Advantage

게놈 PCR 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 이용하는 인간 DNA (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 로부터의 hCRF 유전자 조절 영역의 PCR 증폭을 위해 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. hCRF 유전자 조절 영역 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 PCR 인공물로부터 정제하고, hCRF 유전자 조절 영역 DNA 단편을 정제 제품인 NucleoTrap (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다. hCRF 유전자 조절 영역 PCR 산물의 pECFP-1 벡터 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 내로의 클로닝은 먼저 hCRF 유전자 조절 영역 PCR 산물 및 pECFP-1 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 5' 및 3' 제한효소 부위가 결찰될 수 있게 수행되었다. pECFP-1 벡터 DNA 를 제조자의 지시에 따라, AdvantAge^TMPCR 클로닝 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 의 DNA 리가아제를 이용하여 hCRF 유전자 조절 영역 PCR 산물 DNA 에 결찰시켰다. 이어서, 결찰된 벡터 및 삽입 구축물을 사용하여, TOP10F' 콤피턴트 대장균 세포 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 형질전환시켰다. 세포를 LB 와 카나마이신을 함유하는 아가 상에 플레이팅하고, 추가 분석을 위해 카나마이신 내성 콜로니를 선택하였다. 카나마이신 내성 클론을 카나마이신 함유 LB 배지 중에서 배양하고, 플라스미드 DNA 를 NucleoBond DNA 정제 시스템 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 을 이용하여 단리하고, hCRF 유전자 조절 영역을 포함하는 구축물을 DNA 서열분석으로 분석하여, 구축물의 정확성 및 보존성을 확인하였다. 이어서, hCRF 유전자 조절 영역을 포함하는 정제 구축물 플라스미드 DNA 를 CalPhos^TM 포유류 트랜스펙션 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하는 인산칼슘-매개 트랜스펙션을 이용하여 HEK293 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포 클론을 G418 을 이용하여 선택하고, 단리하여, 10% 소태아 혈청 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA), 페니실린/스트렙토마이신 용액 (Life Technologies, Rockville, MD), L-글루타민 (Life Technologies, Rockville, MD), 비필수 아미노산 (Life Technologies, Rockville, MD) 및 G418 (Life Technologies, Rockville, MD) 을 함유하는 DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) 중에서, 37℃ 에서 5% 이산화탄소/95% 공기 대기 하에 증식시켰다. G418 내성 클론을 써던 블롯팅에 의해 분석하여, 이들이 hCRF 유전자 조절 영역 서열을 포함하는 것을 확인하고; 또한 hCRF 유전자 조절 영역의 활성화를 적절한 자극제를 이용하여 분석하였다. 이어서, 적절한 수준으로 hCRF 유전자 조절 영역-ECFP 를 발현하는 세포를 하기와 같이 hCRF 유전자 조절 영역의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 평가하기 위해 고안된 분석에 사용하였다. 조절 영역 활성화 분석은 hCRF 유전자 조절 영역 구축물을 포함하는 클론을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5 에서와 같이 수행하였다.

실시예 8. hCRF ₂ R 을 활성화시키는 인간 항체의 제조 방법.

hCRF₂R 을 활성화시키는 완전 인간 모노클로날 항체를 먼저 하기와 같이 재조합 hCRF₂R 단백질을 생성하여 제조하였다. 실시예 1 의 절차를 따라 hCRF₂R PCR 산물을 수득하였다. 이어서, 먼저 hCRF₂R 유전자 PCR 산물 및 pHAT20 벡터를 5' 및 3' 제한효소 부위가 결찰될 수 있게 적절한 제한효소로 절단하여, 상기 hCRF₂R PCR 산물을 pHAT20 벡터 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 내로 클로닝하였다. pHAT20 벡터 DNA 를 제조자의 지시에 따라, AdvantAge^TMPCR 클로닝 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 의 DNA 리가아제를 이용하여 hCRF₂R 유전자 PCR 산물 DNA 에 결찰시켰다. 이어서, 결찰된 벡터/삽입 구축물을 사용하여, TOP10F' 콤피턴트 대장균 세포 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 LB 와 앰피실린을 함유하는 아가 상에 플레이팅하여 앰피실린 내성 콜로니를 추가 분석을 위해 선택하였다. 양성 클론을 앰피실린 함유 LB 배지 중에서 배양하고, 플라스미드 DNA 를 NucleoBond DNA 정제 시스템 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 을 이용하여 단리하고, hCRF₂R 유전자를 포함하는 구축물을 DNA 서열분석하여, 구축물의 정확성 및 보전성을 확인하였다. 이어서 HAT 개시 서열 및 hCRF₂R-pHAT20 구축물에 존재하지 않는 유일한 제한효소 부위를 포함하는 5' 올리고뉴클레오티드 및 앞서 사용된 3' hCRF₂R 올리고뉴클레오티드를 이용하여, hCRF₂R-pHAT20 벡터 DNA 를 추가적 PCR 클로닝에 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, hCRF₂R-pHAT20 구축물로부터 HAT-hCRF₂R 융합 유전자를 PCR 증폭하고, PCR 산물을 상술한 바와 같이 정제하였다. 이어서, Clonetech 의 BacPAK Baculovirus 발현 시스템 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 을 이용하여, HAT-hCRF₂R 융합 유전자 PCR 산물을 pBacPAK8 벡터 내로의 클로닝에 사용하였다. HAT--hCRF₂R 융합 유전자의 pBacPAK8 벡터 내로의 결찰은 본질적으로 상술한 바와 같다. 이어서, hCRF₂R/HAT-pBacPAK8 구축물을 TOP10'F 콤피턴트 대장균 세포 내로 트랜스펙션하고, 앰피실린 내성 세포를 선택하고, 플라스미드 DNA 를 단리하고, 상술한 바와 같이 구축물의 보전성을 확인하였다. 이어서, 상기 구축물을 CalPhos^TM 포유류 트랜스펙션 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하여 Sf21 곤충 숙주 세포 내로, 선형화 BacPAK6 DNA 과 함께 코트랜스펙션하였다. 이어서, 곤충 세포를 2~3 일 인큐베이션 후, 개별의 투명한 플라크로부터 바이러스를 수확하였다. 이어서 바이러스를 Sf21 세포 중에서 증폭시키고, 수확한 바이러스의 역가를 확인하고, 역가확인된 바이러스를 제조자의 지시에 따라 BacPAK 곤충 세포 배지 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하여 Sf21 세포의 대규모 감염에 사용하였다. 이어서, 재조합 HAT-CRF₂R 융합 단백질을 제조자가 지시한 조건을 이용하여 Clonetech 의 TALON

CellThru 정제 키트 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) 를 이용하여 정제하였다. 간단하게, 감염된 Sf21 세포를 감염 48 시간 후에 수확하고, 추출/로딩 완충액 중에 초음파분쇄하였다. 이어서 세포 용해액을 TALON

CellThru 칼럼을 통해 넣었다. 칼럼을 추출/로딩 완충액으로 2 회 세척하고, 결합한 HAT-hCRF₂R 단백질을 용출 완충액으로 용출하였다. 용출된 단백질을 보전성에 대해 SDS-PAGE 로 분석하고, 단백질 농도를 제조자의 지시에 따라 Bio-Rad SDS-PAGE 시스템 및 단백질 정량 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca) 을 이용하여 정량하였다. 이어서, 정제 HAT-hCRF₂R 융합 단백질을 사용하여, 하기와 같이 인간 모노클로날 항체 제조를 위한 제노마우스 (XenoMouse) 동물 (Abgenix Inc., Fremont, CA) 을 면역화시켰다. 10 ㎍ 의 정제 재조합 HAT-hCRF₂R 융합 단백질과 25 ㎍ 의 보강제 모노포스포릴 지질 A (Sigma, St. Louis, MO) 를 함께 사용하여, 8 주 기간 동안에 걸쳐 10 마리의 제노마우스 동물에 다회 백신을 접종하였다. 백신을 접종한 동물로부터 혈청을 수득하고, 정제 HAT-hCRF₂R 융합 단백질을 이용하는 항원 포획 EL1SA 에 이용하여, HAT-hCRF₂R 융합 단백질로 폴리스티렌 ELISA 플레이트 (Corning Glass Works, Corning, NY) 를 코팅하고, PBS-1% BSA 로 블로킹하고, 세척하고, 37℃ 에서 1 시간 동안 1:50 배 희석된 혈청 샘플과 인큐베이션하여, HAT-hCRF₂R 단백질에 대한 항체를 검출하였다. PBS 로 5 회 세척 후, 인간 이뮤노글로불린 G 에 대한 알칼린 포스파타아제가 콘쥬게이션된 염소 항체와 함께 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 5 X PBS 로 세척하고, 완충액 중의 p-니트로페닐 포스페이트 기질 (Sigma, St. Louis, MO) 로 항체를 검출하였다. 405 nm 에서의 광학 밀도를 플레이트 판독기로 측정하고, 신호를 정량하였다. 높은 항체 생산을 나타내는 마우스를 하이브리도마 형성을 위해 사용하였다. 30% 폴리에틸렌 글리콜 PEG1450 의 존재 하에 4:1 비의 비장 세포 대 NSA-bcl2 세포를 이용하여, 비분비성 골수종 세포주 NSA-bcl2 와 제노마우스 동물의 비장 세포 융합에 의해 하이브리도마를 제조하였다. 융합 세포를 96 웰 플레이트 내로 제한 희석에 의해 개별 클로닝하고, 10% 소태아 혈청, 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트, L-글루타민, 100 u/ml 페니실린-스트렙토마이신 및 히포잔틴-아미노프테린-티미딘 (모두 Life Technologies, Rockville, MD 제품) 을 포함하는 RPMI-1640 배지 중에 배양하였다. 히포잔틴-아미노프테린-티미딘 선택 하이브리도마의 상층액을 상술한 바와 같은 ELISA 에 의해 인간 항체 생산에 대해 스크리닝하였다. HAT-hCRF₂R 융합 단백질에 대한 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 대규모 항체 생산을 위해 선택하였다. 모노클로날 항체를 단백질 G-세파로오스 크로마토그래피로 정제하였다. 간단하게, 배양된 하이브리도마 클론의 상층액을 로딩 완충액 중에서 단백질 G-세파로오스 칼럼 (SIGMA, St. Louis, MO) 상에 로딩하고, 3 회 세척하고, IgG 를 용출 완충액으로 용출하였다. 이어서 상기 항체를 hCRF₂R 활성화 (작동성) 가능성을 평가하기 위한 스크리닝에 사용하였다. 이는 실시예 3 에 개략된 방법을 이용하여 수행되었다. hCRF₂R 에 대한 작동제 활성을 나타내는 인간 모노클로날 항체를 후보 화합물로 지정하였다.

실시예 9. 근육의 절대력 측정 결정.

장 지신근 (EDL) 및 가자미근을 캐스팅된 마우스 다리의 힘줄부터 힘줄까지 제거하였다. 단리된 근육의 각 힘줄에 견 봉합사를 묶고, 근육을 25℃ 에서 유지되는 95% 산소/5% 이산화탄소가 연속 버블링되는 링거액 (137 mM 염화나트륨, 24 mM 중탄산나트륨, 11 mM 글루코오스, 5 mM 염화칼륨, 1 mM 황산마그네슘, 1 mM 인산나트륨, 0.025 mM 터보쿠마린, 모두 pH 7.4 이고 95% 산소/5% 이산화탄소로 산소공급됨) 을 채운 플렉시유리 챔버 내에 놓았다. 서보모터 레버 팔 (모델 305B-LR Cambridge Technology Inc., Watertown MA, USA) 및 힘 변환기의 스테인레스 스틸 후크 (모델 BG-50; Kulite Semiconductor Products Inc., Leonia, NJ, USA) 사이에 근육을 수평 배열하고, 2 개의 백금 전극 사이에서 전송되는 펄스에 의해 자극되는 필드를 근육의 양측에 세로로 놓았다. Labview 보드 (모델 PCI-MIO 16E-4, Labview Inc., Austin, TX, USA) 를 갖는 개인용 컴퓨터에서 생성되는 방형파 펄스 (0.2 ms 간격) 를 증폭시켜 (Acurus power amplifier 모델 A25, Dobbs Ferry, NY, USA) 타이타닉 수축을 증가시켰다. 자극 전압 및 근육 길이 (Lo) 를 최대 이소메트릭 트위치력 (isometric twitch force) 을 수득하도록 조절하였다. 최대 타이타닉력 생산 (Po) 을 빈도-힘 상관관계로부터 결정하였다.

실시예 10. hCRF ₂ R 수용체의 작동제인 인간 항체를 이용하는 골격근 위축의 치료적 처치.

체중이 50 kg 이고, 장기간의 요양으로 인해 팔 및 다리에 심각한 근육 위축을 갖는 인간 남성 대상체를 골격근 위축을 되돌리기 위해 처치하였다. 3 달 동안 매주 1 회, CRF₂R 수용체의 활성화 항체를 포함하는 pH 6 의 수용액 15 ml 을 정맥 주사로 대상체에 투여하였다. 용액은 하기를 포함하였다:

성분 농도 (mg/ml)

CRF₂R 수용체 작동제 항체 20

L-히스티딘 HCl 0.47

L-히스티딘 0.3

α,α-트레할로오스 2 수화물 20

폴리소르베이트 20 0.1

정균성 멸균수 적량 (총 1 mL)

처치 기간 말기에, 대상체는 팔 및 다리의 근육 질량, 강도 및 운동성의 측정가능한 증가를 나타내었다.

실시예 11. hCRF ₂ R 수용체의 작동제인 인간 항체를 이용하는 골격근 위축의 예방적 처치.

체중이 55 kg 이고, 1 달 내에 고관절 대체 수술이 예정된 인간 여성 대상체. 수술 전 및 후의 골격근 질량을 증강시켜, 궁극적으로 수술 후 회복 동안 근육 불용성으로 인한 골격근 위축 수준을 감소시키기 위해 대상체를 처치하였다. 구체적으로, 수술 전 1 달 및 수술 후 2 달 동안 매주 1 회, CRF₂R 수용체의 활성화 항체를 포함하는 pH 6 의 수용액 18 ml 을 정맥 주사로 대상체에 투여하였다. 용액은 하기를 포함하였다:

성분 농도 (mg/ml)

CRF₂R 활성화 항체 20

L-히스티딘 HCl 0.47

L-히스티딘 0.3

α,α-트레할로오스 2 수화물 20

폴리소르베이트 20 0.1

정균성 멸균수 적량 (총 1 mL)

처치 기간 말기에, 대상체는 항체 치료를 받지 않은 대상체에서 예상되는 상태와 비교하여, 팔 및 다리의 근육 질량, 강도 및 운동성의 측정가능한 보존을 나타내었다.

실시예 12. CRF ₂ R 수용체의 작동제인 인간 항체를 이용하는 골격근 위축의 예방적 처치.

체중이 45 kg 인 인간 여성 대상체를 캐스팅하여, 낙상 후 상박골의 단순 골절을 처치하였다. 골절 치유 동안 불용성 및 제한된 이용으로 인한 다친 팔 및 어깨의 골격근 위축을 예방하기 위해 대상체를 처치하였다. 구체적으로, 캐스팅한 날로부터 시작하여 매주 1 회, 항-hCRF₂R 수용체를 포함하는 pH 6.0 의 13 ml 을 정맥 주사로 대상체에 투여하였다. 용액은 하기를 포함하였다:

성분 농도 (mg/ml)

CRFR 활성화 항체 20

L-히스티딘 HCl 0.47

L-히스티딘 0.3

α,α-트레할로오스 2 수화물 20

폴리소르베이트 20 0.1

정균성 멸균수 적량 (총 1 mL)

처치 기간 말기에, 대상체는 항체 치료를 받지 않은 대상체에서 예상되는 상태 및 후속 처치와 비교하여, 다친 팔 및 어깨의 근육 질량, 강도 및 운동성의 측정가능한 보존 및 물리 치료의 기간 감소를 나타내었다.

실시예 13. 유로코르틴 - II 를 이용하는 골격근 위축의 예방적 처치.

체중 60 kg 의 인간 여성 대상체가 혼수 상태로 병원에 입원하였다. 대상체를 혼수 상태에서의 불용성으로 인한 전신 골격근의 위축을 예방하기 위해 본 방법으로 처치하였다. 구체적으로, 혼수 중 매일 1 회, 500 ml 의 멸균 식염수의 하기 스톡 용액 5 ml 을 첨가하여 제조된 대략 500 ml 의 수용액을 느리게 정맥 주입하여 대상체에 투여하였다:

성분 농도 (mg/ml)

유로코르틴-II 12

인산나트륨 완충액, pH 7.4 140

처치 결과, 대상체는 약물 치료를 받지 않은 대상체의 상태와 비교하여, 골격근 질량 및 기능의 측정가능한 보존, 및 혼수 도중 및 의식 회복 후 필요한 물리 치료의 기간 감소를 나타내었다.

실시예 14. CRF 를 이용한 Duchenne 근육 이영양증 환자의 치료적 처치

Duchenne's 근육 이영양증의 진단을 나타내는 체중 40 kg 의 남성 대상체를 유사한 용량 범위에 걸쳐 CRF1-R 및 CRF2-R 상승성을 나타내는 화합물로 처치하였다. 대상체를 질환의 진행으로 인한 근육 강도 및 기능의 개선 또는 유지를 위해, 화합물의 서방형 데팟 제형으로 처치하였다. 구체적으로, 매달 1 회, 하기를 포함하는 pH 6.0 의 수용액 3 ml 을 근육내 주사하여 대상체에 투여하였다:

성분 농도 (mg/ml)

CRH (코르티코트로핀-방출 호르몬) 4

D,L 락트산 및 글리콜산 공중합체 5

처치 결과, 대상체는 질환의 자연적 진행 도중 나타나는 것과 비교하여, 시간적 함수의 평가에서 근육 강도 또는 균육 기능의 감소 약화 또는 개선을 나타내었다.

본 발명은 본 발명의 개별 측면을 단지 예로서 나타내는 기재된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되는 것이 아니며, 기능적으로 동등한 방법 및 성분이 본 발명의 범위 내에 속한다. 여기에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 시험 동물의 종, CRFR 작동제의 성질 및 유형, 동물의 성별, 위축 모델, 유전적 방법을 포함하는 CRFR 활성화 방법 등. 본원에 나타내고 설명한 것들에 덧붙여 본 발명의 다양한 변형도 상술한 설명 및 첨부되는 도면의 독서 시 당업자에게 자명할 것이다. 상기 변형은 첨부되는 청구범위에 속할 것이다.

본 발명은 골격근 위축을 처치하기 위한, CRF₂R 작동제, 기능성 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터, 항상적으로 활성인 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터 또는 CRF₂R 또는 CRF 의 발현을 증가시키는 화합물의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상체에게 안전 유효량의 CRF₂R 작동제, 기능성 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터, 항상적으로 활성인 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터, CRF 또는 CRF 유사체를 코딩하는 발현 벡터, 또는 CRF₂R 또는 CRF 의 발현을 증가시키는 화합물을 투여함으로써, 처치를 필요로 하는 대상체에서 골격근 위축을 처치할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에게 안전 유효량의 CRF₂R 작동제를, CRF₂R 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 작동제 유도 활성화를 연장시키거나 증강시키는 안전 유효량의 화합물과 함께 투여함으로써, 처치를 필요로 하는 대상체에서 골격근 위축을 처치할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. 골격근 질량 또는 기능의 증가가 바람직한 대상체에서 골격근 질량 또는 기능을 증가시키기 위한 약제의 제조를 위하여 CRF₂R 작동제의 안전 유효량을 사용하는 방법.
2. 골격근 위축에 대한 처치를 필요로 하는 대상체에서의 골격근 위축 처치용 약제의 제조를 위하여, CRF₂R 작동제, 기능성 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터, 구조적으로 활성인 CRF₂R 을 코딩하는 발현 벡터, CRF 를 코딩하는 발현 벡터, 및 CRF₂R 또는 CRF 의 발현을 증가시키는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 안전 유효량을 사용하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 화합물이 CRF₂R 작동제인 방법.
4. 제 3 항에 있어서, CRF₂R 작동제가 키메라성 또는 인간 항체인 방법.
5. 제 4 항에 있어서, CRF₂R 작동제가 CRF₁R 에 비해 CRF₂R 에 대해 선택적인 방법.
6. 제 5 항에 있어서, CRF₂R 작동제가 CRF₂R 에 대해 100 배 이상의 선택성을 나타내는 방법.
7. 제 3 항에 있어서, 대상체가 근육 이영양증을 가지며, CRF₂R 작동제가 CRF₂R 에 대해 1~100 배의 선택성을 나타내는 방법.
8. 제 3 항에 있어서, 골격근 위축 처치용 약제의 제조를 위하여, CRF₂R 의 활성화 또는 CRF₂R 신호 전달 기전의 활성화를 연장시키거나 증강시키는 화합물의 안전 유효량의 사용을 추가로 포함하는 방법.
9. 제 3 항에 있어서, CRF₂R 작동제가 유로코르틴 Ⅱ인 방법.

Images