SK12132003A3 - Spôsoby identifikácie zlúčenín na reguláciu svalovej hmoty alebo funkcie využitím receptora faktora uvoľňujúceho kortikotropín - Google Patents

Description

Spôsoby identifikácie zlúčenín na reguláciu svalovej hmoty alebo funkcie využitím receptora faktoru uvoľňujúceho kortikotropín

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka spôsobov identifikácie potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva alebo reguláciu aktivity alebo expresie receptora faktoru-2 uvoľňujúceho kortikotropín (CRF₂R). Predložený vynález sa tiež týka spôsobov liečenia atrofie kostrového svalstva alebo spôsobov indukcie hypertrofie kostrového svalstva použitím CRF₂R ako cieľa na intervenciu a spôsobov liečenia svalovej dystrofie použitím CRF₂R a receptora faktoru-1 uvoľňujúceho kortikotropín (CRF^) ako cieľov.

Doterajší stav techniky

CRFR a ligandy

Existujú dva receptory faktora uvoľňujúceho kortikotropín, v súčasnosti označované (CRF1R a CRF₂R), ktoré patria do skupiny s G-proteínom spriahnutých receptorov (GPCR). Agonistom uskutočnená aktivácia CRFíR alebo CRF₂R spôsobuje aktiváciu Gas adenyiátcyklázy. Adenylátcykláza katalyzuje tvorbu cAMP, ktorý následne účinkuje mnohými spôsobmi, zahrnujúci aktiváciu proteínkinázy A, intracelulárne uvoľňovanie vápnika a aktiváciu mitogén-aktivovanej proteínkinázy (MAP kináza). V ďalších štúdiách naznačuje zvýšenie syntézy intracelulárneho inozitol-trifosfátu po agonistom uskutočnenej aktivácii receptora CRF, že CRFR sa tiež spájajú s Go,.

Klonované boli CRF^ a CRF₂R z ľudí, potkanov, myší, sliepok, kráv, sumcov, žiab a oviec. Každá z CRF,R a CRF₂R má unikátne distribučné systémy. Klonované boli tri ľudské izoformy receptora CRF₂R a to: alfa, beta a gama. U krýs bol identifikovaný homológ pre alfa a beta CRF₂R.

-2Známych je niekoľko ligandov/agonistov CRFR. Faktor uvoľňujúci kortikotropín (alebo hormón, CRF alebo CRH) sa viaže na receptor a aktivuje tak CRFíR a CRF₂R. CRF je hlavný modulátor telesných odpovedí na stres. Tento peptid so 41 aminokyselinami dohliada na kompletné neuronálne, endokrinné a imúnne procesy ako primárny regulátor hypotalamickej-pituitárnej-adrenálnej hormonálnej osi (HPA osi). Navyše existuje výrazná sekvenčná homológia medzi CRF a peptidom z obojživelníkov, sauvagínom, ako aj telostianským peptidom, urotenzínom, kde obidvaja pôsobia ako agonisti CRFíR a CRF₂R. Tieto tri peptidy majú podobné biologické vlastnosti ako hypotenzíva a sekrétagogá ACTH. Navyše bola charakterizovaná cicavčia obdoba urotenzínu a to urokortín.

Receptory CRF môžu byť veľmi dôležité, začínajúc non-CRFR a končiac farmakologickým použitím receptor-selektívnych agonistov a antagonistov. Títo selektívni agonisti a antagonisti zároveň s myšou s knockoutovaným CRFR boli použiteľní pri stanovovaní, ktorý receptor CRF sprostredkováva špecifické biologické odpovede.

Funkcia CRFíR bola celkom prijateľne definovaná. Myši bez génu CRFíR (myši s knockoutovaným CRFíR) vykazovali porušenú stresovú odpoveď a znížené anxiózne správanie sa. CRFíR je hlavný mediátor HPA osi. Konkrétne, faktor uvoľňujúci kortikotropín, ktorý je uvoľňovaný z hypotalámu a transportovaný do adenohypofýzy cez hypotalámický-hypofyzárny portálny systém, interaguje s CRFíR prítomnom na bunkách lokalizovaných v adenohypofýze. Agonistom uskutočnená aktivácia CRFíR spôsobuje uvoľnenie ACTH z buniek adenohypofýzy do systémovej cirkulácie. Uvoľnený ACTH sa viaže na receptor ACTH prítomný na bunkách lokalizovaných v kôre nadobličiek, čo spôsobuje uvoľnenie adrenálnych hormónov, vrátane kortikosteroidov. Kortikosteroidy sprostredkovávajú veľké množstvo účinkov, zahrnujúcich, ale nie je to nijako limitované, supresiu imunitného systému mechanizmom, ktorý zahrnuje tymickú a slezinovú atrofiu. Aktivácia CRFíR teda nepriamo smeruje na potlačenie imunitného systému aktiváciou HPA osi.

Funkcia CRF₂R je však menej známa. Myši bez génu CRF₂R (myši s knockoutovaným CRF₂R) mali porušenú redukciu príjmu potravy po stimulácii urokortínom, chýbajúcu vazodilatáciu, ale uchovali si normálnu stresovú odpoveď.

-3Experimenty s CRF₂R ukázali, že CRF₂R je zodpovedný za hypotenzívne/vazodilatačné účinky agonistov CRFR a redukciu príjmu potravy pozorovanú po ošetrení myší agonistami CRFR.

Atrofia a hypertrofia kostrového svalstva

Kostrové svalstvo je ohybné tkanivo, ktoré sa ľahko adaptuje na zmeny podľa fyziologických požiadaviek na prácu alebo podľa metabolickej potreby. Hypertrofia je nárast hmoty kostrového svalstva, zatiaľ čo atrofia kostrového svalstva je jeho úbytok. Akútna atrofia kostrového svalstva vzniká z rôznych príčin, ktoré zahrnujú, ale nie je nijako limitované: nečinnosť v dôsledku chirurgického zákroku, kľudu na lôžku alebo zlomených kostí; denervácia/poškodenie nervov v dôsledku poranenia miechy, autoimúnne choroby alebo infekčných chorôb; použitie glukokortikoidov pre nesúvisiace stavy; sepsu v dôsledku infekcie alebo iných príčin; limitáciu živinami v dôsledku choroby alebo hladovania; a vesmírne lety. Atrofia kostrového svalstva sa vyskytuje pri normálnych biologických procesoch, avšak pri určitých lekárskych stavoch spôsobujú tieto normálne biologické procesy oslabnutie úrovne svalovej atrofie. Napríklad akútna atrofia kostrového svalstva predstavuje výrazné obmedzenie rehabilitácie pacientov z imobilizácie, zahrnujúce, ale nie je to nijako limitované, imobilizácie doprevádzajúce ortopedické procedúry. V takýchto prípadoch je doba rehabilitácie potrebná na inverziu atrofie kostrového svalstva často omnoho dlhšia než čas potrebný na vyliečenie pôvodného poranenia. Takáto akútna atrofia z nečinnosti je veľkým problémom u starších pacientov, ktorí v súvislosti s vekom už môžu trpieť výrazným deficitom funkcie a hmoty svalov, a preto táto atrofia môže spôsobiť trvalú invaliditu a predčasné úmrtie.

Atrofia kostrového svalstva môže byť tiež dôsledkom chronických stavov, napr. rakovinovej kachexie, chronického zápalu, kachexie spojenej s AIDS, chronického obštruktívneho ochorenia pľúc (COPD), mestnavého zlyhania srdca, genetických porúch, napr. svalovej dystrofie, neurodegeneratívnych ochorení a sarkopénie (so starnutím spojený úbytok svalstva). Pri týchto

-4chronických stavoch môže atrofie kostrového svalstva spôsobiť predčasný úbytok mobility, a tým prispievať k morbidite súvisiacej s chorobou.

Málo je známe o molekulárnych procesoch, ktoré riadia atrofiu alebo hypertrofiu kostrového svalstva. Aj keď spúšťací podnet atrofie kostrového svalstva je odlišný od iných prípadov spúšťajúcich atrofiu, vyskytuje sa niekoľko bežných biochemických zmien v postihnutom vlákne kostrového svalstva, zahrnujúcich zníženie syntézy proteínov a zvýšenie degradácie proteínov a zmien v kontraktilných aj metabolických proteínových izozymoch enzýmu, ktoré sú charakteristické pomalým (vysoko oxidatívny metabolizmus/izoformy pomalých kontraktilných proteínov) až rýchlym (vysoko glykolytický metabolizmus/izoformy rýchlych kontraktilných proteínov) prehadzovaním vlákien. Ďalšie zmeny, ktoré sa vyskytujú v kostrovom svalstve, zahrnujú úbytok vaskulatúry a prestavby extracelulárneho matrixu. Pomalý aj rýchly pohyb svalstva demonštruje za príslušných podmienok na atrofiu s relatívnym úbytkom svalstva v závislosti na špecifickej stimulácii alebo stave atrofie. Všetky tieto zmeny sú koordinačne regulované a sú vypínané a spúšťané v závislosti na zmenách vo fyziologických a metabolických zmenách.

Procesy, ktorými sa atrofia a hypertrofia prejavuje, sú u cicavčích druhov konzervatívne. Mnoho štúdií ukázalo, že počas atrofie sa u hlodavcov aj ľudí objavujú rovnaké základné molekulárne, bunkové a fyziologické procesy. Teda modely atrofie kostrového svalstva u hlodavcov boli úspešne používané na pochopenie a predikciu ľudských atrofických odpovedí. Napríklad atrofia indukovaná rôznymi prostriedky u hlodavcov aj ľudí spôsobuje podobné zmeny v anatómii svalstva, cross-sectional oblastiach, funkcii, typu prepínania vlákna, expresiu kontraktilného proteínu a histológiu. Bolo zistené, že niekoľko agensov reguluje atrofiu kostrového svalstva u hlodavcov aj ľudí. Tieto agensy zahrnujú anabolické steroidy, rastový hormón, IGF I (insulin-like growth factor I) a beta adrenergné agonisti. Spolu tieto dáta ukazujú, že atrofia kostrového svalstva je výsledkom bežného mechanizmu u hlodavcov aj ľudí.

Zatiaľ čo sa ukázalo, že niektoré agensy, regulujú atrofiu kostrového svalstva a sú pre tento účel povolené na použitie na ľuďoch, majú tieto agensy nežiadúce vedľajšie účinky, napr. hypertrofia srdcového svalstva, neoplazia, hirzutizmus, androgenizáciu žien, zvýšenú morbiditu a mortalitu,

-5poškodenie pečene, hypoglykémiu, muskuloskeletárnu bolesť, zvýšené napätie v tkanive, tachykardiu a edém. V súčasnej dobe neexistuje vysoko účinné a selektívne ošetrenie či už akútnej alebo chronickej atrofie kostrového svalstva. Preto tu vzniká potreba identifikovať ďalšie terapeutické agensy, ktoré regulujú atrofiu kostrového svalstva.

Svalové dystrofie

Svalové dystrofie zahrnujú skupinu dedičných a progresívnych porúch svalstva, klinicky sa vyznačujúcich selektívnou distribúciou ochablosti kostrového svalstva. Dve najbežnejšie formy svalovej dystrofie sú Duchenneova a Beckerova svalová dystrofia, kde každá vzniká v dôsledku zdedenej mutácie v géne dystrofínu, ktorý je lokalizovaný na lokuse Xp21. Ďalšie dystrofie zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, pletencovou dystrofiou (LGMD), ktorá je výsledkom mutácie niekoľkých genetických lokusov, zahrnujúcich p97 calpaín, adhalín, γ-sarcoglycan a (3-sarcoglykan lokusy; fascioskapulohumerálnu svalovú dystrofiu (Landouzyho-Déjerineova), myotonickú dystrofiu a Emery-Dreifussovu svalovú dystrofiu. Symptómy Duchenneovej svalovej dystrofie, ktoré sa vyskytujú takmer výhradne u mužov, zahrnujú kolísavú chôdzu, chodenie po pätách, lordózu, časté pády a obtiaže pri vstávaní a chôdzu po schodoch. Symptómy začínajú vo veku 37 rokov, kde väčšina pacientov je upútaná na invalidný vozík na 10-12 rokov a mnoho z nich zomrie asi vo veku 20 rokov v dôsledku respiračných komplikácií. Súčasná liečba Duchenneovej svalovej dystrofie spočíva v podávaní prednizonu (kortikosteroidného liečiva), ktoré aj keď nie je kuratívne, spomaľuje znižovanie sily svalstva a odďaľuje invaliditu. Je známe, že kortikosteroidy, napr. prednizon, účinkujú zablokovaním aktivácie imunitných buniek a infiltrácie, ktoré sú precipitované poškodením vlákien svalstva, ktoré neguje niektoré z potenciálnych benefitov blokovania imunitnej odpovede u týchto pacientov. Existuje tu teda potreba identifikovať terapeutické agensy, ktoré spomaľujú poškodenie svalového vlákna a oneskorujú vypuknutie invalidity u pacientov so svalovou dystrofiou, ale spôsobujú menší stupeň atrofie kostrového svalstva ako súčasné terapie.

-6Jeden problém súvisiaci s identifikáciou zlúčenín na použití pri liečbe atrofie kostrového svalstva alebo svalovej dystrofie spočíval v nedostatku dobrých skríningových metód na identifikáciu takýchto zlúčenín. Vynálezcovia teraz prišli na to, že CRF₂R sa podieľajú na regulácii hmoty alebo funkcie kostrového svalstva, a že CRF₂R sú schopné blokovať atrofiu kostrového svalstva a/alebo indukovať hypertrofiu kostrového svalstva. Predložený vynález rieši problém identifikácie zlúčenín na liečbu svalovej atrofie poskytnutím skríningových metód použitím CRF₂R, ktoré sa môžu používať na identifikáciu potencionálnych zlúčenín použiteľných na liečbu svalovej atrofie. Predložený vynález tiež rieši problém nájdenia zlúčenín použiteľných na liečbu svalových dystrofií poskytnutím skríningovej metódy na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré aktivujú CRFíR aj CRF₂R.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka použitia CRFR na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré sú potenciálne použiteľné pri liečení atrofie kostrového svalstva a alebo na indukciu hypertrofie kostrového svalstva. Predovšetkým predložený vynález poskytuje in vitro metódy identifikácie potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva, zahrnujúci uvedenie testovanej zlúčeniny do kontaktu s bunkami exprimujúcimi CRF₂R, alebo uvedenie testovanej zlúčeniny do kontaktu s izolovaným CRF₂R a určenie, či sa testovaná zlúčenina viaže na CRF₂R alebo aktivuje CRF₂R. Ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu sa týka spôsobu identifikácie potencionálnych terapeutických zlúčenín zo skupiny jednej alebo viacerých potencionálnych zlúčenín, ktoré boli určené na väzbu na CRF₂R alebo aktiváciu CRF₂R vyznačujúce sa tým, že zahrnuje podanie potencionálnej zlúčeniny nehumánnemu zvieraťu a stanovenie, či potencionálna zlúčenina reguluje hmotu kostrového svalstva alebo funkciu svalstva u ošetrovaného zvieraťa. Ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu sa týka spôsobu identifikácie možných zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva vyznačujúce sa tým, že zahrnuje v akomkoľvek poradí: (i) uvedenie testovanej zlúčeniny do kontaktu s bunkou exprimujúcou funkčnú CRF₂R a stanovenie miery aktivácie CRF₂R v dôsledku testovanej zlúčeniny;

-7(ii) uvedenie testovanej zlúčeniny do kontaktu s bunkou exprimujúcou funkčnú CRFR a stanovenie miery aktivácie CRF1R v dôsledku testovanej zlúčeniny; nasledované (iii) porovnaním miery aktivácie CRF₂R a miery aktivácie CRF1R; a (iv) identifikáciu tých testovaných zlúčenín, ktoré vykazujú podobnú aktivitu voči CRF₂R a CRFjR alebo vykazujú selektivitu pre CRF₂R ako potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva.

Predložený vynález ďalej poskytuje spôsoby identifikácie potencionálnych zlúčenín, ktoré predlžujú alebo zvyšujú agonistom indukovanú aktiváciu CRF₂R alebo dráhu prenosu signálu CRF₂R.

Tieto metódy zahrnujú v akomkoľvek poradí; (i) uvedenie testovanej zlúčeniny do kontaktu s bunkou, ktorá exprimuje funkčnú CRF₂R (ii) ošetrenie bunky agonistom CRF₂R na dostatočnú dobu a v dostatočnej koncentrácii na vznik desenzitizácie CRF₂R v kontrolných bunkách a následne (iii) stanovenie miery aktivácie CRF₂R a identifikácie testovaných zlúčenín, ktoré predlžujú alebo zvyšujú aktiváciu CRFR alebo dráhy prenosu signálu CRFR ako potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty a funkcie kostrového svalstva. V konkrétnom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu identifikácie potencionálnych terapeutických zlúčenín zo skupiny jednej alebo viacerých potencionálnych zlúčenín určených na predĺženie alebo zvýšenie aktivácie CRF₂R alebo dráhy prenosu signálu CRF₂R vyznačujúceho sa tým, že zahrnuje: podanie potencionálnej zlúčeniny spoločne s agonistom CRF₂R nehumánnemu zvieraťu a stanovenie, či potencionálna zlúčenina reguluje hmotu alebo funkciu kostrového svalstva u ošetrovaného zvieraťa.

Predložený vynález ďalej poskytuje spôsoby identifikácie potencionálnych zlúčenín, ktoré zvyšujú expresiu CRF₂R, vyznačujúcu sa tým, že zahrnujú uvedenie testovanej zlúčeniny do kontaktu s bunkou alebo bunkovým lyzátom obsahujúcim reportérový gén operatívne asociovaný s regulačným elementom génu CRF₂R a detekciu expresie reportérového génu. Testované zlúčeniny, ktoré zvyšujú expresiu reportérového génu, sú identifikované ako potencionálne zlúčeniny na zvýšenie expresie CRF₂R. V konkrétnom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu stanovenia, či tieto potencionálne zlúčeniny, ktoré zvyšujú expresiu CRF₂R, sa môžu používať na reguláciu hmoty alebo funkcie

-8kostrového svalstva in vivo podaním potencionálnej zlúčeniny nehumánnemu zvieraťu, a stanovenie, či potencionálna zlúčenina reguluje hmotu alebo funkciu kostrového svalstva u ošetrovaného zvieraťa.

Predložený vynález ďalej poskytuje spôsoby identifikácie potencionálnych zlúčenín, ktoré zvyšujú expresiu CRFR, vyznačujúcu sa tým, že zahrnujú uvedenie testovanej zlúčeniny do kontaktu s bunkou alebo bunkovým lyzátom obsahujúcom reportérový gén operatívne asociovaný s regulačným elementom génu CRF a detekciu expresie reportérového génu. Testované zlúčeniny, ktoré zvyšujú expresiu reportérového génu, sú identifikované ako potencionálne zlúčeniny zvyšujúce expresiu CRF. V konkrétnom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu stanovenia, či tieto potencionálne zlúčeniny, ktoré zvyšujú expresiu CRF, sa môžu používať na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva in vivo podaním potencionálnej zlúčeniny nehumánnemu zvieraťu, a stanovenie, či potencionálna zlúčenina reguluje hmotu alebo funkciu kostrového svalstva u ošetrovaného zvieraťa.

Predložený vynález sa tiež týka použitia agonistov CRF₂R, expresných vektorov kódujúcich funkčnú CRF₂R, expresných vektorov kódujúcich konštitutívne aktívnu CRF₂R alebo zlúčeniny, ktoré zvyšujú expresiu CRF₂R, alebo CRF na ošetrenie atrofie kostrového svalstva. Predložený vynález konkrétne poskytuje spôsoby liečenia atrofie kostrového svalstva u subjektu s potrebou takéhoto liečenia, vyznačujúce sa tým, že zahrnuje podanie bezpečného a účinného množstva agonistu CRF₂R, expresného vektora kódujúceho funkčnú CRF₂R, expresný vektor kódujúci konštitutívne aktívnu CRF₂R, expresný vektor kódujúci CRF alebo analóg CRF, alebo zlúčeniny, ktoré zvyšujú expresiu CRF₂R alebo CRF subjektu. V konkrétnom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu liečenia atrofie kostrového svalstva u subjektu s potrebou takéhoto liečenia, vyznačujúce sa tým, že zahrnuje podanie bezpečného a účinného množstva agonistu CRF₂R spoločne s bezpečným a účinný množstvom zlúčeniny, ktorá predlžuje alebo zvyšuje agonistom indukovanú aktiváciu CRF₂R alebo dráhy prenosu signálu CRF₂R subjektu.

Predložený vynález sa tiež týka použitia agonistu CRF₂R na zvýšenie hmoty alebo funkcie kostrového svalstva u subjektu. Predložený vynález konkrétne poskytuje spôsoby zvýšenia hmoty a funkcie kostrového svalstva u subjektu,

-9u ktorého je takéto zvýšenie žiadúce, vyznačujúce sa tým, že zahrnuje identifikáciu subjektu, u ktorého zvýšenie svalovej hmoty alebo funkcie je žiadúce, a podanie bezpečného a účinného množstva agonistu CRFR subjektu.

Predložený vynález ďalej poskytuje farmaceutické prípravky obsahujúce bezpečné a účinné množstvo agonistu CRF₂R a farmaceutický prijateľný nosič. V konkrétnom uskutočnení farmaceutický prípravok obsahuje chimérickú alebo humánnu protilátku špecifickú pre CRF₂R. V ďalšom konkrétnom uskutočnení farmaceutický prípravok obsahuje CRF alebo analóg CRF, výhodne urokortín II.

Predložený vynález tiež poskytuje protilátky proti CRF₂R a predovšetkým chimérické alebo ľudské protilátky, ktoré sú agonistami CRF₂R.

V celej prihláške sú odkazy na rôzne publikácie. Obsahy týchto publikácií sú ako celok uvedené v tejto prihláške ako odkaz s cieľom podrobnejšieho popisu stavu techniky, ktorého sa predložený vynález týka.

Sekvenčná analýza

Každý nukleotid CRFR a proteínové sekvencie alebo proteínové sekvencie analógu CRFR obsiahnuté vo výpise zo sekvenčnej analýzy spolu s odpovedajúcimi prístupovými číslami k databázam „Genbank alebo „Derwent“ a zvieracím druhom, z ktorého sú klonované, sú uvedené v tabuľke I. Tu sú tiež uvedené prístupové čísla pre príbuzné nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú rovnaké alebo takmer rovnaké aminokyselinové sekvencie ako je sekvencia uvedená na výpise zo sekvenčnej analýzy. Tieto príbuzné sekvencie sa líšia hlavne v množstve uvedenej 5'- alebo 3'- neprekladanej sekvencie.

-10Tabuľka

Popis sekvencie	IDČ. SEK: nukleotid, aminokyselina	Species	Genbank (GB) alebo Dervent (D) prístupové číslo pre nukleotidovú sekvenciu	Súvisiace Genbank (GB) alebo Dervent (D) prístupové číslo.
CRF,R	1,2	Homo sapiens	X72304 (GB)	El 1431(GB) L23332(GB) 192584(D) T37068(D) T28968(D) Q81952(D)
variant CRF,R	3,4	Homo sapiens	L23333 (GB)
variant CRF,R	5,6	Homo sapiens	NM 004382 (GB)
variant CRF,R	7,8	Homo sapiens	AF 180301 (GB)
CRF?Ralfä	9, 10	Homo sapiens	U34587 (GB) NM 001883 (GB)	E 12752 (GB) TI 2247 (D) T66508(D)
CRF2R beta	11,12	Homo sapiens	AF0U406(GB)
CRF2R gama	13,14	Homo sapiens	AF019381 (GB)
CRF,R	15,16	Rattus norvegicus	T28970(D)	L25438 (GB) L24096 (GB) 192586 (D) Q81954(D) AH006791 (GB)
CRF2RaUa	17,18	Rattus norvegicus	U16253 (GB)	NM 022714 (GB) X01009(D) T12243 (D)
variant CRF2R beta	19,20	Rattus norvegicus	T12244 (D)
CRF,R	21,22	Mus musculus	NM 007762 (GB)	X72305 (D)
CRF2R	23,24	Mus musculus	T28972(D)	U17858(GB)
crf2r	25,26	Mus musculus	NM 009953 (GB)
CRF,R	27,28	Ovis aries	AF054582 (GB)
CRF,R	29,30	Xenopus laevis	Y14036 (GB)
CRF2R	31,32	Xenopus laevis	Y14037 (GB)
CRF,R	33,34	Ameiurus nebulosus	AF229359 (GB)
CRF,R	35,36	Ameiurus nebulosus	AF229361 (GB)
CRF,R	37,38	Ameiurus nebulosus	AF229360 (GB)
CRF,R	39,40	Bos taurus	AB055434 (GB)
CRF,R	41,42	Gallus gallus	L41563 (GB)
Urokortin II	43	Mus musculus	AF331517
Peptid príbuzný s urokortínom	44	Homo sapiens	BC002647

-11Stručný popis obrázkov

Na obrázku 1 je znázornený antiatrofický účinok agonistu CRFfR/CRFsR, sauvagínu (podávaného subkutánne, 2 x denne), na mediálny lýtkový sval na myšom modeli atrofie indukovanej denerváciou sedacieho nervu.

Na obrázku 2 je znázornený antiatrofický účinok sauvagínu (podávaného kontinuálne osmotickou minipumpou) na predný holenný sval na myšom modeli atrofie indukovanej denerváciou sedacieho nervu.

Na obrázku 3A a 3B je znázornený antiatrofický účinok sauvagínu (podávaného kontinuálne osmotickou minipumpou) na glukokortikoidom indukovanú atrofiu predného holenného svalu (Obr. 3A) a mediálneho lýtkového svalu (Obr. 3B)

Na obrázku 4A je znázornený antiatrofický účinok sauvagínu (podávaného subkutánne, 2 x denne) na atrofiu predného holenného svalu indukovanej fixáciou a hypertrofiou indukujúceho účinku na nefixovaný (normálny) predný holenný sval. Na obrázku 4B je znázornený antiatrofický účinok sauvagínu na atrofiu mediálneho lýtkového svalu indukovanej fixáciou a hypertrofiou indukujúceho účinku sauvagínu na nefixovaný (normálny) mediálny lýtkový sval.

Na obrázku 5 sú znázornené antiatrofiou- a hypertrofiou- indukujúce účinky sauvagínu a urokortínu (podávané kontinuálne osmotickou minipumpou) na predný holenný sval na myšom modeli atrofie indukovanej denerváciou sedacieho nervu.

Na obrázku 6A a 6B sú znázornené antiatrofické účinky urokortínu (podávaného subkutánne, 2 x denne) na nečinnosťou indukovanú atrofiu predného holenného svalu a mediálneho lýtkového svalu.

Na obrázku 7 je znázornený antiatrofický účinok sauvagínu (podávaný subkutánne, 2 x denne) v myšom adrenolektomizovanom modeli atrofie

-12indukovanej denerváciou sedacieho nervu, na atrofiu predného holenného svalu indukovanou denerváciou (Obr. 7A), extenzor digitorum longus (EDL) (Obr. 7B), šikmý sval lýtkový (Obr. 7C), mediálny lýtkový sval (Obr. 7D) a lýtkové svaly. Navyše hypertrofia nedenervovaného svalu EDL indukovaná sauvagínom je uvedená na obrázku 7B.

Na obrázku 8 je na myšom modeli atrofie indukovanej denerváciou sedacieho nervu znázornený antiatrofický účinok sauvagínu (podávaného kontinuálne osmotickou minipumpou) na predný holenný sval u normálnej myši, ale nie u myši s knockoutovaným CRF₂R.

Na obrázku 9A a 9B je na myšom modeli atrofie indukovanej nečinnosťou v dôsledku fixácie končatiny znázornený antiatrofický účinok sauvagínu na EDL a šikmý sval lýtkový meraný na hmote (Obr. 9A) alebo funkciu svalu (Obr. 9B).

Detailný popis vynálezu

Termíny a definície

V tejto prihláške majú termíny nasledujúci význam:

Termín „agonista sa vzťahuje na ktorúkoľvek zlúčeninu, zahrnujúcu, ale nie je to nijako limitované, protilátky, ktoré aktivujú receptor. Napríklad agonisti CRFR zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, CRF a analógy CRF.

Termín „alelický variant sa vzťahuje na variantnú formu uvedeného génu alebo génového produktu. Odborník v oboru iste rozozná, že v dvoch alebo viacerých alelických formách v populácii existuje veľké množstvo génov a niektoré gény majú mnoho alel.

Termín „protilátka sa vo svojich rôznych doslovných formách vzťahuje na molekuly imunoglobuiínu a imunologický aktívne časti molekúl imunoglobulínu, tzn. molekuly, ktoré obsahujú väzobné miesto pre antigén, ktoré ho špecificky viažu antigén. Termín „purifikovaná protilátka sa vzťahuje na protilátku, ktorá bola čiastočne alebo úplne separovaná od proteínov a od s ňou prirodzene sa vyskytujúcich organických molekúl. Výhodne je preparát aspoň 60 hmotn. %

-13protilátky, výhodnejšie aspoň 75 hmotn. %, ešte výhodnejšie aspoň 90 hmotn. % protilátky a najvýhodnejšie aspoň 99 hmotn. % suchej hmotnosti protilátky.

Termín „väzobná afinita sa vzťahuje na schopnosť ligandu interagovať s receptorom a je nepriamo úmerná disociačnej konštante pre špecifickú interakciu medzi CRF a ligand-CRFR. Disociačná konštanta môže byť meraná priamo štandardnou saturáciou, kompetíciou alebo kinetický alebo nepriamo farmakologickými technikami zahrnujúcimi funkčné testy a koncové body.

Termín „chimérická protilátka sa vzťahuje na protilátku, ktorá obsahuje štruktúrne elementy z dvoch alebo viacerých rôznych molekúl protilátok, tzn. z rôznych zvieracích druhov. Chimérické protilátky zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, protilátky známe ako „humanizované protilátky, ktoré zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, chimérické protilátky generované technikami známymi ako komplementaritu determinujúcu oblasť nahradenia.

Termín „CRF sa vzťahuje na faktor uvoľňujúci kortikotropín, ktorý je rovnaký ako hormón uvoľňujúci kortikotropín (CRH). Príklady peptidu CRF zahrnujú r/h CRF a ovčí CRF (viď. U.S. Patent č. 4,415,558), atď.

Termín „analóg CRF sa vzťahuje na látky, ktoré účinkujú ako ligandy CRFR. Vhodnú analógy CRF môžu byť získané z rôznych stavovcov a zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, látky, napr. sauvagín (viď. napr. U.S. patent č. 4,605,642), urotenzín (viď. napr. U.S. patenty č. 4,908,352; a 4,533,654), myší urokortín II (id. č. sek.: 43), ľudský peptid urokortínového typu (id. č. sek.:44) (Reyes, T. M. et al., Proc. Naťl Acad Sci 98:2843-2848 (2001)), urokortín (viď. napr. WO 97/00063) a analóga CRF opísaná v U.S. patentoch č. 4,415,558; 4,489,163; 4,594,329; 4,605,642; 5,109,111; 5,235,036; 5,278,146; 5,439,885; 5,493,006; 5,663,292; 5,824,771; 5,844,074; a 5,869,450. Každý z nich je tu uvedený ako odkaz. Výhodnými analógmi CRF sú sauvagín, urokortín, peptid urokortínového typu, urokortín-ll a urotenzín.

Termín „agonista CRFR sa vzťahuje na zlúčeninu alebo molekulu, ktorá má schopnosť aktivovať CRFfR alebo CRF₂R alebo obidve. Aktivácia CRFR môže byť meraná spôsobom opísanom nižšie.

Termín „CRFR sa vzťahuje na CRFtR alebo CRF₂R.

-14Termín „CRFfR sa vzťahuje na ktorúkoľvek z izoforiem CRFíR z ktoréhokoľvek zvieracieho druhu. CRF1R bol predtým označovaný ako CRF-RA, PC-CRF, CRF, (Perrin, M. H., et al. Endocrinology 133: 3058-3061 (1993), Chen, R., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8967-8971 (1993), Chang, C-P. et al., Neurón 11:1187-1195 (1993), Kishimoto, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1108-1112 (1995) and, Víta, N. et al., FEBS Lett. 335: 1-5 (1993)) alebo receptor CRH.

Definícia CRF-|R zahrnuje, ale nie je to nijako limitované, tie receptory, pre ktoré bola cDNA alebo genomická sekvencia kódujúca receptor deponovaná v databáze sekvencii. Tieto sekvencie majú prístupové čísla: X72304, E11431, L23332, I92584, T37068, T28968, Q81952, L23333, NM-004382, AF180301, T28970, L25438, L24096, I92586, Q81954, AH006791, NM-007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359, AF229361, AB055434 a L41563. Nukleotidové a proteínové sekvencie týchto receptorov sú dostupné v GenBank alebo Derwent a na uľahčenie sú reprezentatívne sekvencie uvedené v priloženom výpise zo sekvenčnej analýzy.

Termín „CRF₂R sa vzťahuje na ktorúkoľvek izoformu CRF₂R z ktoréhokoľvek zvieracieho druhu. CRF₂R bol tiež označovaný ako HM-CRF, CRFRB, (Kishimoto, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1108-1112 (1995) a Perrin, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2969-2973 (1995)).

Definícia receptora CRF₂R zahrnuje, ale nie je to nijako limitované, tie receptory, pre ktoré bola DNA-sekvencia kódujúca receptor deponovaná v sekvenčnej databáze. Tieto sekvencie majú prístupové čísla: U34587, E12752, NM-001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381, U16253, T12244, T28972, U17858, NM-009953, Y14037 a AF229360. Nukleotidové a proteínové sekvencie týchto receptorov sú dostupné v GenBank alebo Derwent a na uľahčenie sú reprezentatívne sekvencie uvedené v priloženom výpise zo sekvenčnej analýzy.

Termín „CRFR tiež zahrnuje skrátené a/alebo zmutované proteíny, kde oblasti receptorovej molekuly nepotrebné pre väzbu ligandu alebo signalizáciu boli deletované alebo modifikované. Odborník v odbore určite postrehne, že napríklad CRFR s jednou alebo viacerými konzervatívnymi zmenami v primárnej aminokyselinovej sekvencii byť mohol byť použiteľný v predkladanom vynáleze.

-15Vie sa, že substitúcia niektorých aminokyselín rôznymi aminokyselinami s podobnou štruktúrou alebo vlastnosťami (konzervatívna substitúcia) môže spôsobiť tiché zmeny, tzn. zmeny, ktoré výrazne nemenia funkciu. Konzervatívne substitúcie sú v odbore dobre známe. Vie sa, že napríklad GPCR môže tolerovať substitúcie aminokyselinových zvyškov v transmembránových alfa-helixoch, ktoré sú orientované smerom k lipidu, ďalšími hydrofóbnymi aminokyselinami a ostať naďalej funkčným. CRF-iR sa líši od prirodzene sa vyskytujúcej sekvencie skráteniami a/alebo mutáciami, napr. konzervatívne aminokyselinové substitúcie tak isto patria do definície CRFíR. CRF₂R sa líši od prirodzene sa vyskytujúcej sekvencie skráteniami a/alebo mutáciami, napr. konzervatívne aminokyselinové substitúcie tak isto patria do definície CRF₂R.

Odborník v odbore ďalej rozozná, že CRFR z iných druhov než z tých, ktoré sú uvedené vyššie, najmä potom cicavčie druhy, by mohli byť použiteľné v predloženom vynáleze. Odborník v odbore ďalej rozozná, že použitím sond zo sekvencii CRFR známych druhov by mohla byť cDNA alebo genomické sekvencie získané z rovnakých alebo alternatívnych druhov známymi klonovacími technikami. Tieto CRFíR tiež patria do definície CRFíR. A ďalej tieto CRF₂R tiež patria do definície CRF₂R.

Navyše odborník v odbore ďalej rozozná, že funkčné alelické varianty alebo funkčné zostrihované varianty CRFR môžu byť prítomné u konkrétnych druhov, a že tieto varianty by mohli byť použiteľné v predloženom vynáleze. Známe sú zostrihované varianty CRFR, napr. U.S. patent č. 5,888,811; 5,786,203; a 5,728,545, každá z nich je tu uvedená ako odkaz. Tieto varianty CRFíR tak isto patria do definície CRFíR a tieto varianty CRF₂R tak isto patria do definície CRF₂R.

Fúzia polypeptidu CRFíR alebo CRF₂R alebo polypeptidového fragmentu CRFtR alebo CRF₂R s polypeptidom non-CRFR sú označované ako fúzne proteíny CRFR. Použitím známych metód by odborník v odbore mal byť schopný vytvoriť fúzne proteíny CRFíR alebo CRF₂R, ktoré aj keď sú rozdielne od prirodzených CRFíR a CRF₂R by boli stále použiteľné v predkladanom vynáleze. Napríklad polypeptid non-CRFR môže byť signálna (alebo vedúci) polypeptidová sekvencia, ktorá kotranslačne alebo posttranslačne riadi prenos proteínu z

-16miesta jeho syntézy do iného miesta (napr. α-faktorový leader z kvasiniek). Alebo polypeptid non-CRFR môže byť pridaný pre uľahčenie purifikácie alebo identifikácie CRFR (napr. poly-His alebo FLAG-peptidu). Fúzne proteíny CRFíR tiež patria do definície CRFíR atak isto fúzne proteíny CRF₂R patria do definície CRF₂R.

Termín „dráha prenosu signálu CRF₂R znamená ktorúkoľvek signálnu dráhu (napr. cAMP, MAP kinázu) alebo kombináciu signálnych dráh, ktoré sú modulované väzbou endogénnych alebo exogénnych ligandov na CRF₂R.

Termín „funkčné CRFR sa vzťahuje na CRFR, ktoré viažu CRF alebo analóg CRF in vivo alebo in vitro a sú aktivované v dôsledku väzby ligandov.

Termín „fúzny gén sa vzťahuje na dve alebo viacero DNA kódujúcich sekvencii operatívne asociovaných tak, aby kódovali jeden hybridný protein. Termín „fúzny protein je proteínový produkt fúzneho génu.

Termín „inhibovať sa vzťahuje na čiastočne alebo úplne zastavený konkrétny proces alebo aktivitu. Napríklad zlúčenina inhibuje atrofiu kostrového svalstva, pokiaľ úplne alebo čiastočne zabraňuje svalovej atrofii.

Dve DNA-sekvencie sú „operatívne asociované, ako je používané v predloženom vynáleze, pokiaľ charakter väzby medzi dvomi DNA-sekvenciami (1) nemá za následok zavedenie posunovej mutácie, (2) neinterferuje so schopnosťou oblasti promótora riadiť transkripciu kódujúcich sekvencii, alebo (3) neinterferuje so schopnosťou zodpovedajúceho transkriptu RNA byť preložený na protein. Sú napríklad kódujúce sekvencie a regulačné sekvencie operatívne asociované, pokiaľ sú kovalentne viazané takým spôsobom, že podriadi transkripciu kódujúcej sekvencie pod vplyv alebo kontrolu regulačných sekvencii. Teda oblasť promótora je operatívne asociovaná s kódujúcou sekvenciou, pokiaľ oblasť promótora je schopná ovplyvňovať transkripciu tejto DNA-sekvencie takým spôsobom, aby výsledný transkript bolo možné prepísať na požadovaný protein alebo polypeptid.

Termín „percentuálna zhoda sa vzťahuje na percentuálne množstvo nukleotidov alebo aminokyselín, ktoré majú dve sekvencie spoločné, vyrátané nasledovným spôsobom: na vypočítanie percentuálnej zhody pre špecifickú sekvenciu (požiadavka) je relevantná časť požadovanej sekvencie porovnaná s referenčnou sekvenciou pomocou porovnávacieho počítačového programu

-17BestFit, Wisconsin Package, Version 10.1, dostupného v Genetics Computer Group, Inc. Tento program využíva algoritmus podľa Smitha a Watermana, Advances in Applied Mathematics, Issue 2: 482-489 (1981). Percentuálna zhoda je vypočítaná s nasledovnými defaultnými parametrami pre program BestFit: scoring matrix je blosum62.cmp, gap creation penalty je 8 a gap extension penalty je 2. Pokiaľ sa porovnáva sekvencia s referenčnou sekvenciou, je relevantná časť požadovanej sekvencie odvodená od sekvencie CRFR. Napríklad, pokiaľ existuje požiadavka na CRFR/purifikáciu značeného fúzneho proteínu, potom len polypeptidová časť sekvencie CRFR je zaradená do výpočtu percentuálnej zhody.

Termín „polypeptid sa vzťahuje na ktorýkoľvek reťazec aminokyselín bez ohľadu na dĺžku alebo posttranslačnú modifikáciu (napr. fosforylácia alebo glykosylácia).

Termín „promótor sa vzťahuje na DNA-sekvenciu, ktorá riadi iniciáciu transkripcie a mieru transkripcie z génu alebo kódujúcej oblasti.

Termín „profylaktické ošetrenie sa vzťahuje na preventívne ošetrenie subjektu, ktorý doteraz nevykazuje znaky atrofie kostrového svalstva, s cieľom kompletného alebo čiastočného blokovania výskytu atrofie kostrového svalstva. Odborník v odbore by mohol rozoznať, že niektorí jedinci majú riziko atrofie kostrového svalstva tak, ako je to opísané v týchto podkladoch. Ďalej odborník v odbore určite pozná, že biochemické zmeny, ktoré spôsobujú atrofiu kostrového svalstva, sú vhodne regulované a to tak, aby by sa mohlo zabrániť výskytu atrofie, alebo aby sa mohol redukovať výskyt atrofie u rizikových jedincov. Napríklad pacienti so svalovou dystrofiou a začínajúci liečbou kortikosteroidmi majú riziko vzniku atrofie kostrového svalstva, čo naznačuje, že profylaktické ošetrenie takýchto pacientov by mohlo byť vhodné.

Termín „regulovať“ vo všetkých jeho doslovných formách sa vzťahuje na zvýšenie, zníženie alebo udržanie, napr. regulácia hmoty alebo funkcie kostrového svalstva znamená zvýšenie, zníženie alebo udržanie úrovne hmoty alebo funkcie kostrového svalstva.

Termín „regulácia hmoty alebo funkcie kostrového svalstva sa vzťahuje na reguláciu hmoty kostrového svalstva, funkcie kostrového svalstva alebo obidve.

-18Termín „regulačný prvok sa vzťahuje na DNA-sekvenciu, ktorá je schopná regulácie miery transkripcie z operovateľne asociovanej DNA-sekvencie. Do definície regulačného prvku patria promótory a zosilňovače. Napríklad regulačný prvok génu CRFR je DNA-sekvencia schopná riadiť transkripciu z génu CRFR.

Termín „reportérový gén sa vzťahuje na kódujúcu sekvenciu, ktorej produkt môže byť deletovaný, výhodne kvantitatívne, kde reportérový gén je operatívne asociovaný s heterológnym promótorom alebo zosilňovacím prvkom, ktorý je zodpovedný za prenos, ktorý sa má merať. Promótorový alebo zosilňovací prvok je v tejto spojitosti tu označený ako „responzívny prvok.

Termín „selektívny agonista znamená, že agonista má výrazné väčšiu aktivitu voči niektorému receptoru(om) pri porovnaní s inými receptormi, a nie že je úplne neaktívny voči ďalším receptorom.

Termín „hypertrofia kostrového svalstva sa vzťahuje na prírastok hmoty alebo funkcie kostrového svalstva alebo obidve.

Termín „atrofia kostrového svalstva znamená to isté ako „ochabovanie svalu a znamená úbytok hmoty kostrového svalstva alebo funkcie kostrového svalstva alebo obidve.

Termín „zostrihový variant sa vzťahuje na mRNA alebo protein, ktorý vzniká z alternatívneho použitia exónu. Odborník v odbore rozozná, že v závislosti na type bunky alebo prípade v jednotlivom type bunky môže byť mRNA exprimovaná v rôznej forme ako zostrihový variant, a tým sa prepísaný protein odlíši v závislosti od mRNA, ktorá je exprimovaná.

Termín „terapeuticky účinné množstvo látky je množstvo schopné produkcie lekársky požadovaného výsledku u ošetrovaného pacienta, napr. zníženie atrofie kostrového svalstva, prírastok hmoty kostrového svalstva alebo funkcie kostrového svalstva, s prijateľným pomerom medzi prospechom a rizikom u ľudského alebo humánneho cicavca.

Termín „terapeutické ošetrenie sa vzťahuje na liečbu subjektu, u ktorého je žiadúce zvýšenie svalovej hmoty alebo svalovej funkcie. Napríklad liečba subjektu vykazujúceho znaky atrofie kostrového svalstva s cieľom čiastočného alebo úplného odvrátenia zistenej atrofie kostrového svalstva alebo s cieľom ?? M -JM

-19úplného alebo čiastočného blokovania výskytu ďalšej atrofie kostrového svalstva by mohlo byť terapeutickým ošetrením takého subjektu. Termín „terapeutická liečba tiež zahrnuje napríklad liečbu subjektu nevykazujúceho znaky atrofie kostrového svalstva s cieľom vyvolania hypertrofie kostrového svalstva, napr. liečba hospodársky zvierat kvôli zvýšeniu svalovej hmoty.

Termín „liečba znamená profylaktické alebo terapeutické liečenie.

Pokiaľ to nie je definované inak, majú všetky technické a vedecké termíny používané v tejto prihláške rovnaký význam, ktorý sa bežne chápe odborníkmi v odbore proteínovej chémie, farmakológie alebo molekulárnej biológie. Spôsoby, materiály a príklady opísané v tejto prihláške nemajú limitujúci charakter. Ďalšie spôsoby a materiály podobné alebo ekvivalentné s tými, ktoré boli opísané v tejto prihláške, môžu byť používané pri uskutočňovaní alebo testovaní predloženého vynálezu.

II. Úloha CRFR pri regulácii hmoty kostrového svalstva

Odborník v odbore by mal poznať, že použitie predloženého vynálezu poskytuje jednak informácie o doterajšej technike a ďalej aj poznatky uvedené nižšie. Výsledky popisované v predloženom vynáleze ukazujú, že podanie agonistu receptora CRF, ktorý aktivuje CRF-|R aj CRF₂R (neselektívny agonista CRFR), blokuje a/alebo inhibuje atrofiu kostrového svalstva indukovanú denerváciou, nečinnosťou alebo ošetrením dexametazonom na modeloch atrofie kostrového svalstva. Navyše dáta ukazujú, že agonisti CRFR nemajú tento antiatrofický účinok u myší s knockoutovaným CRF₂R. Aj krysy, u ktorých CRFíR sprostredkovaná HPA osou bola prerušená odstránením nadobličky (chirurgická adrenaloktémia), ošetrované neselektívnymi agonistami CRFR vykazovali antiatrofický účinok, indikujúci, že CRF₂R sprostredkováva antiatrofické účinky. Ďalej výsledky ukazujú, že podanie neselektívneho agonistu CRFR vedie k účinku indikujúceho hypertrofiu. Spolu tieto dáta demonštrujú modulačnú rolu CRF₂R v procese atrofie kostrového svalstva. Špecifická rola CRFR in vivo bola skúmaná pomocou farmakologických agens, sauvagínu (Bachem Biosciences, Inc. King of Prussia, PA) a urokortínu (Bachem Biosciences, Inc.), ktoré sú selektívnymi

-20agonistami CRFR u rôznych modelov atrofie kostrového svalstva popísané ďalej. Tieto agens boli dobre charakterizované a sú popísané vo vedeckej literatúre.

Na obrázkoch 1-7 a 9 sú uvedené výsledky experimentov demonštrujúcich, že podanie selektívnych agonistov CRFR smeruje ku štatisticky výraznej inhibícii atrofie kostrového svalstva. Na obrázku 8 je znázornené, že antiatrofický účinok agonistu CRFR, sauvagínu, ktorý je sprostredkovaný CRF₂R. Vďaka podaniu agonistov CRFR dva razy denne spoločne s inhibítorom fosfodiesterázy, teofylínom, prichádza k inhibícii atrofie kostrového svalstva na zvieracích modeloch atrofie kostrového svalstva. Teofylín sa pridá na predĺženie doby a zosilneniu účinku agonistu CRFR, čo spôsobuje zvýšenú účinnosť týchto zlúčenín. Samotný teofylín podávaný pri týchto modeloch atrofie nemá žiadny účinok, čo demonštruje, že antiatrofický účinok agonistu CRFR pri kombinácii s teofylínom bol dôsledkom účinku agonistu CRFR. Ďalej kontinuálne dávkovanie agonistu CRFR bez teofylínu osmotickou minipumpou tiež spôsobuje inhibíciu atrofie kostrového svalstva a/alebo hypertrofie kostrového svalstva. Štatisticky významné výsledky boli stanovené pomocou ANCOVA (Douglas C. Montgomery, Design and Analysis of Experiments, John Wiley and Sons, New York (2^nd ed. 1984)). Skratky používané v obrázkoch 1-9: g - gram; SEM - smerodajná chyba priemeru.

Konkrétne obrázok 1 (Obr. 1) ukazuje, že sauvagín inhibuje atrofiu mediálneho lýtkového svalu indukovanou denerváciou na myšom modeli atrofie indukované denerváciou sedacieho nervu. Legenda: A - fyziologický roztok (kontrolný); B - sauvagín (0,01 mg/kg) + teofylín; C - sauvagín (0,03 mg/kg) + teofylín; D - sauvagín (0,1 mg/kg) + teofylín; E - sauvagín (1,0 mg/kg) + teofylín;

* - p < 0,05 pri porovnaní s roztokom. Po denervácii pravého sedacieho nervu bol samcovi myši injektovaný subkutánne do strednej skapulárnej oblasti dva razy denne sauvagín v dávkach uvedených vyššie alebo kontrolný nosič (fyziologický roztok) po dobu 9 dní. Sauvagín bol koaplikovaný s 30 mg/kg teofylínu. Deviaty deň bol mediálny lýtkový sval odstránený a odvážený kvôli určeniu stupňa atrofie.

Obrázok 2 (Obr. 2) ukazuje, že sauvagín inhibuje atrofiu predného holenného svalu na myšom modeli atrofie indukovanej denerváciou sedacieho nervu. Legenda: A - voda (kontrolná); B - sauvagín (0,1 mg/kg/d); C sauvagín (0,3 mg/kg/d); D - sauvagín (1,0 mg/kg/d); * - p < 0,05

-21 pri porovnaní s vodou. Po denervácii pravého sedacieho nervu bol samčím myšiam podaný buď sauvagín alebo kontrolný nosič (fyziologický roztok) kontinuálnou infúziou pomocou osmotickej minipumpy Alzet rýchlosťou 5 μΙ/h, pokým neskončil experiment (bez ďalšieho teofylínu). Denná podávaná dávka sauvagínu je uvedená vyššie. Implantácia minipumpy bola vykonaná v čase denervácie sedacieho nervu. Deviaty deň bol predný holenný sval odstránený a odvážený kvôli určeniu stupňa atrofie.

Obrázok 3 (Obr. 3) ukazuje, že sauvagín inhibuje glukokortikoidom indukovanú atrofiu predného holenného svalu (Obr. 3A) a mediálneho lýtkového svalu (Obr. 3B) na myšom modeli atrofie indukovanej glukokortikoidom. Legenda: A - voda len bez dexametanzonu obsiahnutá v pitnej vode (neatrofovaná kontrola); B - voda + dexametazon (atrofovaná kontrola); C - sauvagín (0,1 mg/kg/d) + dexametazon; D - sauvagín (0,3 mg/kg/d) + dexametazon; E sauvagín (1,0 mg/kg/d) + dexametazon; * - p < 0,05 pri porovnaní s vodou; # - p < 0,05 pri porovnaní s vodou + dexametazonom. Po pridaní glukokortikoidu, dexametazonu, do pitnej vody (1,2 mg/kg/d) boli samčím myšiam podávané vyššie uvedené agens alebo kontrolný nosič (fyziologický roztok) kontinuálnou infúziou pomocou osmotickej minipumpy Alzet rýchlosťou 5pl/hod., pokým neskončil experiment (bez ďalšieho teofylínu). Denná podávaná dávka sauvagínu je uvedená vyššie. Na začiatku expozície dexametazonom bola uskutočnená implantácia minipumpy. Deviaty deň po začiatku dávkovania sauvagínu bol mediálny lýtkový sval a predný holenný sval odstránený a odvážený kvôli určeniu stupňa atrofie.

Obrázok 4 (Obr. 4) ukazuje, že sauvagín inhibuje atrofiu predného holenného svalu (Obr. 4A) a mediálneho lýtkového svalu (Obr. 4B) indukovanou nečinnosťou. Navyše štatisticky významná hypertrofia predného holenného svalu a mediálneho lýtkového svalu v nefixovanej končatine bola tiež pozorovaná pri ošetrení sauvagínom. Legenda: A - fyziologický roztok (kontrolný); B - teofylín; C - sauvagín (0,03 mg/kg) + teofylín; D - sauvagín (0,1 mg/kg) + teofylín; E sauvagín (0,3 mg/kg) + teofylín; * - p < 0,05 pri porovnaní s fyziologickým roztokom. Po fixácii pravej zadnej končatiny bol samčím myšiam subkutánne injektovaný v strednej skapulárnej oblasti dva razy denne sauvagín alebo

-22kontrolný nosič (fyziologický roztok) po dobu desiatich dní v indikovaných denných dávkach. Sauvagín bol koaplikovaný dva razy denne intraperitoneálnym dávkovaním inhibítora fosfodiesterázy teofylínu (30 mg/kg). Desiaty deň bol odstránený mediálny lýtkový sval a predný holenný sval a boli odvážené kvôli určeniu stupňa atrofie.

Obrázok 5 (Obr. 5) ukazuje, že sauvagín i urokortín inhibujú atrofiu predného holenného svalu indukovanú denerváciou na myšom modeli atrofie indukovanej denerváciou sedacieho nervu. Navyše bola pozorovaná hypertrofia nedenervovanej končatiny pri ošetrení urokortínom. Legenda: A - voda (kontrolná); B - sauvagín (1 mg/kg/d); C - urokortín (1,0 mg/kg/d); * - p < 0,05 pri porovnaní s vodou. Po denervácii pravého sedacieho nervu boli samčím myšiam podané vyššie uvedené agens alebo kontrolné nosiče (fyziologický roztok) kontinuálnou infúziou Alzetovou osmotickou minipumpou rýchlosťou 5 μΙ/hod, pokým sa experiment neskončil (bez ďalšieho teofylínu). Denná podávaná dávka agens je uvedená vyššie. Implantácia minipumpy bola vykonaná v rovnakom čase ako denervácia sedacieho nervu. Deviaty deň bol odstránený predný holenný sval a bol odvážený kvôli určeniu stupňa atrofie.

Obrázok (Obr. 6) ukazuje, že urokortín inhibuje atrofiu predného holenného svalu (Obr. 6A) a mediálneho lýtkového svalu (Obr. 6B) indukovanou nečinnosťou na myšom modeli atrofie indukovanej nečinnosťou v dôsledku fixácie končatiny. Legenda: A - fyziologický roztok (kontrolný); B - urokortín (0,3 mg/kg) + teofylín; * - p < 0,05 pri porovnaní s fyziologickým roztokom. Po fixácii pravej zadnej končatiny bol samčím myšiam injektovaný subkutánne v strednej skapulárnej oblasti dva razy denne urokortín alebo kontrolný nosič (fyziologický roztok) po dobu desiatich dní. Urokortín bol podávaný v dávkach, ktoré sú uvedené v popise obrázku 6A a 6B. Urokortín bol koaplikovaný dva razy denne intraperitoneálnym dávkovaním inhibítora fosfodiesterázy teofylínu (30 mg/kg). Desiaty deň bol odstránený mediálny lýtkový sval a predný holenný sval a boli odvážené kvôli určeniu stupňa atrofie.

Obrázok 7 (Obr. 7) ukazuje, že sauvagín inhibuje atrofiu predného holenného svalu (Obr. 7A), (EDL) (Obr. 7B), šikmého svalu lýtkového (Obr. 7C), mediálneho lýtkového svalu (Obr. 7D) a lýtkových svalov, kde je atrofia indukovaná denerváciou.

-23Navyše sauvagín spôsoboval štatisticky významnú hypertrofiu nedenervovaného svalu EDL (Obr. 7B). Legenda: A - fyziologický roztok (kontrolný); B - sauvagín (0,003 mg/kg) + teofylín; C - sauvagín (0,01 mg/kg) + teofylín; D -sauvagín (0,03 mg/kg) + teofylín; # - p < 0,05 pri porovnaní so zodpovedajúcimi kontrolami. Po denervácii pravého sedacieho nervu bol samčím adrenalektomizovaným potkanom (adrenalektomizované potkany boli používané na odstránenie účinkov aktivácie HPA osi pomocou agonizmu CRFíR indukujúcich atrofiu kostrového svalstva) podávaný subkutánne v strednej skapulárnej oblasti dva razy denne buď sauvagín alebo kontrolný nosič (fyziologický roztok) po dobu deviatich dní v dávkach uvedených vyššie. Sauvagín bol koaplikovaný s 30 mg/kg teofylínu. Deviaty deň bol odstránený predný holenný sval, extenzor digitorum longus (EDL), šikmý sval lýtkový, mediálny lýtkový sval a lýtkový sval a boli odvážené kvôli určeniu stupňa dystrofie.

Obrázok 8 (Obr. 8) ukazuje, že sauvagín inhibuje atrofiu pozorovanú u normálnej myši, ale nie u myši s knockoutovaným CRF₂R na myšom modeli atrofie indukovanej denerváciou sedacieho nervu. Legenda: A - C normálna myš; D F -myš s knockoutovaným CRF₂R. A a D - voda (kontrolná); B a E - sauvagín (0,3 mg/kg/d); C a F - sauvagín (1,0 mg/kg/d); * - p < 0,05 pri porovnaní s fyziologickým roztokom. Po denervácii sedacieho nervu bol samčím normálnym myšiam a myšiam s knockoutovaným CRF₂R podávaný sauvagín alebo kontrolný nosič kontinuálnou infúziou Alzetovou osmotickou minipumpou rýchlosťou 5 μΙ/hodinu po dobu deviatich dní, pričom množstvo dávky je uvedené vyššie. Deviaty deň bol odstránený predný holenný sval a bol odvážený kvôli určeniu stupňa atrofie.

Obrázok 9 (Obr. 9) ukazuje, že sauvagín inhibuje úbytok EDL spôsobený nečinnosťou a hmotu šikmého svalu lýtkového (Obr. 9A) a inhibuje úbytok funkcie svalu podľa merania absolútnej sily (Obr. 9B) na myšom modeli atrofie indukovanej nečinnosťou v dôsledku fixácie končatiny. Legenda: A - kontrolný nefixovaný sval; B - fixovaný sval, fyziologický roztok; C - fixovaný sval, sauvagín (0,3 mg/kg) + teofylín (30 mg/kg); * - p < 0,05 pri porovnaní s fyziologickým roztokom. Po fixácii pravej zadnej končatiny bol samčím myšiam subkutánne injektovaný do strednej skapulárnej oblasti dva razy denne buď sauvagín alebo

-24kontrolný nosič (fyziologický roztok) po dobu desiatich dní v dávkach uvedených nižšie. Sauvagín bol koaplikovaný s 30 mg/kg teofylínu. Desiaty deň boli odstránené EDL a šikmý sval lýtkový a bolo uskutočnené meranie absolútnej sily a hmoty kvôli určeniu stupňa atrofie.

III. Príprava CRFR, CRF alebo analóg CRF alebo bunkových línií exprimujúcich CRFR

CRFfR, CRF₂R, CRF a analógy CRF môžu byť pripravené na rôzne účely, zahrnujúce, ale nie je to nijako limitované, generáciu protilátok, použitých ako činidiel pri skríningu podľa predloženého vynálezu a použitých ako farmaceutických činidiel na liečbu atrofie kostrového svalstva. Odborníkovi v odbore bude iste zrejmé, že pre niektoré uskutočnenia predloženého vynálezu budú purifikované polypeptidy najpoužiteľnejšie, zatiaľ čo u iných uskutočneniach budú najpoužiteľnejšie bunkové línie exprimujúce polypeptidy. Napríklad v situáciách, pri ktorých je dôležité udržať štruktúrne a funkčné charakteristiky CRFR, napr. pri metóde skríningu na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré aktivujú CRFR, je žiaduce použiť bunky exprimujúce funkčné CRFR.

Pretože CRF a analógy CRF sú krátke polypeptidy, odborník v odbore určite pozná, že tieto polypeptidy sa najvýhodnejšie získajú priamou syntézou, skôr než rekombinantné prostriedky, použitím techník známych v odbore. Navyše veľký počet z týchto molekúl sú komerčne dostupné.

Tam, kde zdrojom CRFR je bunková línia exprimujúca polypeptid, môžu bunky napr. endogénne exprimovaný CRFR, byť stimulované na zvýšenie endogénnej expresie CRFR alebo byť geneticky upravené na exprimáciu CRFR. Metódy určenia, či bunková línia exprimuje požadovaný polypeptid sú známe v odbore, napr. detekcia polypeptidu príslušnou protilátkou, použitie DNAsondy na detekciu mRNA kódujúcu protein (napr. Northern blotting alebo PCR) alebo meranie väzby agens, ktorý je selektívny pre požadovaný polypeptid (napr. izotopicky značený selektívny agonista).

Patrí sem najmä použitie rekombinantnej DNA-technológie pri príprave CRFíR, CRF₂R alebo bunkových línií exprimujúcich tieto polypeptidy. Tieto rekombinantné metódy sú dobre známe v odbore. Na exprimáciu

-25rekombinantných CRFíR alebo CRF₂R je pripravený expresný vektor, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu požadovaný polypeptid pri riadení jedného alebo viacerých regulačných prvkov. Genomické alebo cDNA-sekvencie kódujúce CRFíR a CRF₂R z niekoľkých druhov boli opísané a sú ľahko dostupné v databáze GenBank (adresa http://www.ncbi.nlm.nih.gov) alebo v databáze Derwent (adresa www.derwent.co.uk./geneseq/index.html). ako aj na výpise zo sekvenčnej analýzy v tejto prihláške vynálezu. Prístupové čísla pre sekvencie CRFíR a CRF₂R a zodpovedajúce id. č. sek. sú uvedené v tabuľke I. Použitím týchto voľne prístupných informácií o sekvenciách možno izolovať molekulu nukleovej kyseliny kódujúcej CRFíR alebo CRF₂R na skríning genomickej DNA alebo cDNA-knižnice s prirodzenou alebo umelo syntetizovanou DNA-sondou pomocou metód dobre známych v odbore, napr. PCR amplifikácia sekvencie z príslušnej knižnice. Ďalšou metódou je použitie oligonukleotidových prímerov špecifických pre požadovaný receptor k PCR amplifikácii cDNA priamo z mRNA izolované z konkrétni tkané (napr. kostrového svalstva). Tato izolovaná mRNA je dostupná komerčne. Odborník v odbore s istotou pozná, že použitím sond vo forme nukleových kyselín zodpovedajúcich častiam známej sekvencie receptora CRFR môže byť získaná homológnou cDNA alebo genomické sekvencie z iných druhov použitím známych metód. Konkrétne sú v metódach podľa predloženého vynálezu použiteľné receptory CRFR z druhov zahrnujúcich, ale nie je to nijako limitovane, ľudí, myši, krysy, prasatá, opice, šimpanzy, kosmany, psy, kravy, ovce, mačky, sliepky a moriaky. Metódami známymi v odbore je molekula izolovanej nukleovej kyseliny kódujúcej požadovaný CRFR ligovaná do vhodného expresného vektora. Týmto spôsobom pripravený expresný vektor je exprimovaný v hostiteľskej bunke a hostiteľské bunky exprimujúce receptor sú používané priamo pri skríningu alebo je receptor izolovaný z hostiteľských buniek exprimujúcich receptor a izolovaný receptor je používaný pri skríningu.

Hostiteľské expresné vektorové systémy, ktoré môžu byť používané pre účely vynálezu zahrnujú, ale nie je to nijako limitované: mikroorganizmy, napr. baktérie (napr. E. co/i, B. subtilis), transformované expresnými vektormi rekombinantné bakteriofágové DNA, plazmidové DNA alebo kozmidové DNA,

-26ktoré obsahujú nukleotidové sekvencie CRFR; kvasinky (napr. Saccharomyces, Pichia) transformované expresnými vektormi rekombinantnej kvasinky obsahujúcej nukleotidové sekvencie CRFR; systém buniek hmyzu infikovaných expresnými vektormi rekombinantného vírusu (napr. bakulovirus) obsahujúci nukleotidové sekvencie CRFR; systémy rastlinných buniek infikovaných expresnými vektormi rekombinantného vírusu (napr. vírus karfiolovej mozaiky, vírus tabakovej mozaiky) alebo transformovanej expresnými vektormi rekombinantného plazmidu (napr. Ti plazmid) obsahujúci nukleotidové sekvencie CRFR; alebo systémy cicavčích buniek (napr. COS, CHO, HEK293, NIH3T3) „harboring rekombinantnej expresnej konštrukcie obsahujúci promótory odvodené od genómu cicavčích buniek (napr. metallotioneínový promótor) alebo z cicavčích vírusov (napr. retrovirus LTR) a tiež obsahujúci nukleotidové sekvencie CRFR.

Hostiteľská bunka je používaná na produkciu požadovaného polypeptidu. Pretože CRFR je molekula viazaná k membráne, je purifikovaná od membrán hostiteľských buniek alebo je používaný CRFR, aj keď je zakotvený v bunkovej membráne, tzn. používajú sa celé bunky alebo frakcie membrán buniek. Purifikácia alebo fortifikácia CRFR z takýchto expresných systémov je uskutočňovaná použitím vhodných detergentov a lipidových miciel pomocou metód, o ktorých odborníci v odbore majú dostatočné vedomosti.

V bakteriálnych systémoch môže byť výhodne vybraných veľké množstvo expresných vektorov v závislosti na zamýšľanom použití pre génový produkt, ktorý je exprimovaný. Napríklad, aj je produkované veľké množstvo takéhoto proteínu na generáciu protilátok voči CRFR, sú žiadúce vektory, ktoré riadia expresiu vysokých hladín proteínových produktov. Odborník v odbore je schopný vytvoriť takéto vektorové konštrukcie a purifikovať proteíny rôznymi metódami, zahrnujúcimi selektívne purifikačné technológie, napr. selektívne stĺpce pre fúzne proteíny a stĺpce s protilátkou, a neselektívne purifikačné technológie.

V proteínovom expresnom systéme hmyzu sa používa bakulovirus A. californica vírusu jadrovej polyédrie (AcNPV) ako vektor na exprimáciu cudzích génov v bunkách S. frugiperda. V tomto prípade sú nukleotidové sekvencie CRFR klonované do neesenciálnych oblastí vírusu a umiestnené pod kontrolu promótora AcNPV.

-27Rekombinantné vírusy sa potom používajú na infekciu buniek, v ktorých je inzertovaný gén exprimovaný, a proteín je purifikovaný jednou z mnohých techník, ktoré sú známe odborníkom v odbore.

V cicavčích hostiteľských bunkách sa môže používať veľký počet expresných systémov na báze vírusu. Použitie týchto expresných systémov často vyžaduje vytvorenie špecifických iniciačných signálov vo vektoroch na úspešný prepis inzertovaných nukleotidových sekvencií, čo je dôležité najmä v prípade, kedy je používaná časť génu CRFR, ktorý neobsahuje endogénny iniciačný signál. Umiestnenie tohto iniciačného signálu v rámci kódujúcou oblasťou inzertovanej nukleotidovej sekvencie, ako aj pridanie prvkov zvyšujúcich transkripciu a prepis a purifikácie rekombinantného proteínu, je možné uskutočniť mnohými technológiami, ktoré sú odborníkom v odbore známe. U cicavčích buniek je tiež dôležitý výber vhodného typu bunky, ktorý je schopný nevyhnutných posttranslačných modifikácií rekombinantného proteínu. Tieto modifikácie, napr. štiepenie, fosforylácia, glykosylácia, atd’., vyžadujú výber vhodnej hostiteľskej bunky, ktorá obsahuje modifikačné enzýmy. Tieto hostiteľské bunky zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, CHO, HEK293, NIH3T3, COS, atď. a sú známe odborníkom v odbore.

Pre dlhodobú, vysokú expresiu rekombinantných proteínov je výhodná stabilná expresia. Napríklad geneticky môžu byť upravený bunkové línie, ktoré stabilne exprimujú CRFR. Odborník v odbore môže pomocou známych metód, napr. elektroporácia, transfekcie s fosforečnanom vápenatým alebo transfekcie sprostredkovanej lipozómom, generovať bunkovú líniu, ktorá stabilne exprimuje CRFR, čo sa zvyčajne uskutočňuje transfekčnými bunkami využívajúcimi expresné vektory, ktoré obsahujú vhodné prvky riadiace expresiu (napr. promótorové sekvencie, zosilňovacie sekvencie, sekvencie ukončujúce transkripciu, polyadenylačné miesta, miesta začínajúce transláciu, atď.), voliteľný marker a požadovaný gén. Voliteľný marker môže byť buď obsiahnutý v rovnakom vektore ako požadovaný gén alebo na separátnom vektore, ktorý je kotransfektovaný so sekvenciou CRFR obsahujúcou vektor. Vďaka voliteľnému markeru v expresnom vektore môže vznikať rezistencia voči výberu a umožňovať tak bunkám stabilne integrovať vektor do svojich chromozómov a kultivovať ich na tvorbu lokusu, ktorý sa môže následne klonovať a expandovať

-28do bunkových línií. Alternatívne expresný vektor môže umožňovať výber bunky exprimujúci voliteľný marker využívajúci fyzikálny atribút markeru, napr. expresia zeleného fluoreskujúceho proteínu (GFP) umožňuje výber buniek exprimujúcich marker využívajúci FACS („fluorescence activated celí sorting analysis).

Odborník v odbore je schopný vybrať vhodný typ bunky na transfekciu s cieľom umožnenia výberu buniek, do ktorých bude požadovaný gén úspešné integrovaný. Napríklad tam, kde voliteľný marker je tymidínkináza, hypoxantínguaninfosforibosyltransferáza alebo adeninfosforibosyltransferáza vírusu herpes simplex, by mohol byť vhodný typ bunky tk-, hgprt- alebo aprt-bunky. Alebo tam, kde voliteľný marker je dhfr, gpt, neo alebo hygro, ktorý dodáva rezistenciu metotrexátu, mykofenolovej kyseline, G-418 alebo hygromycínu, môžu sa používať normálne bunky. Tieto rekombinantné bunkové línie sú použiteľné na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré ovplyvňujú aktivitu CRFR.

IV. Príprava protilátok CRFR

Protilátky, ktoré selektívne rozoznávajú jeden alebo viacero epitopov CRFR tiež patria do predloženého vynálezu. Tieto protilátky zahrnujú, napr. polyklonálne protilátky, monoklonálne protilátky, chimérické protilátky, ľudské protilátky, jednoreťazcové protilátky, Fab fragmenty, F(ab')₂ fragmenty, molekuly produkované pomocou knižnice exprimujúce Fab, ľudské protilátky (polyklonálne alebo monoklonálne) produkované v transgénnych myšiach a ktorékoľvek vyššie uvedené fragmenty viažuce epitop. Pre terapeutické použitie sú preferované chimérické alebo ľudské protilátky; ľudské protilátky sú najvýhodnejšie.

Protilátky môžu byť využívané v súlade so schémami skríningu popísanými v predloženom vynáleze na vyhodnotenie testovaných zlúčenín, napr. na imobilizáciu polypeptidov CRFR, lebo také protilátky sa môžu používať v súlade s technikami génovej terapie na vyhodnotenie napr. expresie CRFR buď v bunkách alebo priamo v pacientových tkanivách, do ktorých boli tieto gény zavedené. Navyše protilátky podľa predloženého vynálezu sú použiteľné pri ošetrení atrofie kostrového svalstva. Protilátky selektívne pre CRFR môžu byť skúmané metódami podľa predloženého vynálezu na identifikáciu podskupiny

-29protilátok, ktoré sú agonistami CRFR. Ďalej anti-idiotypické protilátky generované proti protilátkam špecifickým pre CRF alebo analóg CRF môžu byť použiteľné ako agonisti CRFR a ako protilátky anti-CRFR môžu byť skúmané na svoju schopnosť aktivovať CRFR metódami podľa predloženého vynálezu.

Kvôli produkcii protilátok sa môžu imunizovať hostiteľské zvieratá injekciou CRFR, CRF alebo analógu CRF, protilátkou anti-CRF, protilátkou analógu antiCRF alebo ich imunogénnymi fragmentárni pomocou metód, ktoré sú dobre známe v odbore. Na prípravu anti-idiotypickej protilátky je imunogén protilátka anti-CRF alebo protilátka analógu anti-CRF. Produkcia anti-idiotypických protilátok je opísaná napr. v patente US č. 4,699,880, tu je to uvedené ako odkaz. Vhodné hostiteľské zvieratá zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, králiky, myši, kozy, ovce a kone. Imunizačné techniky sú dobre známe v odbore. Polyklonálne protilátky sa môžu purifikovať zo séra imunizovaných zvierat alebo monoklonálne protilátky sa môžu generovať metódami, ktoré sú dobre známe v odbore. Tieto techniky zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, dobre známe hybridómové techniky podľa Kohlera a Milsteina, ľudské B-bunkové hybridómové techniky a EBV hybridómové techniky. Monoklonálne protilátky môžu byť súčasťou ktorejkoľvek imunoglobulínovej triedy, zahrnujúcej IgG, IgE, IgM, IgA a IgD obsahujúcej buď kappa alebo lambda ľahké reťazce.

Pokiaľ sa protilátky používajú na terapeutické ošetrenie ľudských pacientov, sú z dôvodu imunogenicity nehumánnych protilátok u ľudí preferované chimérické protilátky pred neľudskými protilátkami. Techniky produkcie a použitie chimérických protilátok sú známe v odbore a sú opísané napr. v patente US č. 5,807,715; 4,816,397; 4,816,567; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180,370; a 5,824,307, všetko je tu uvedené ako odkaz.

Úplne ľudské protilátky sú žiadúce najmä pre terapeutické ošetrenie ľudských pacientov, pretože sú imunogénnejšie než neľudské protilátky alebo chimérické protilátky. Tieto protilátky môžu byť produkované pomocou transgénnych myší, ktoré sú v podstate neschopné exprimovať gén endogénneho imunoglobulinu s ťažkým a ľahkým reťazcom, ale ktoré môžu exprimovať ľudské gény ťažkého a ľahkého reťazca. Transgénne myši sú imunizované normálnym

-30spôsobom s vybraným antigénom, napr. celá alebo časť CRF₂R. Monoklonálne protilátky zamerané proti antigénu sú získané pomocou konvenčnej hybridómovej technológie z týchto imunizovaných transgénnych myší. Táto technológia je detailne opísaná v patentoch US č. 5,874,299; 5,877,397; 5,569,825; 5,661,016,5,770,429; a 6,075,181, všetky sú tu uvedené ako odkaz.

Ako alternatíva voči získaniu ľudských imunoglobulínov priamo z kultúry hybridómových buniek môže byť používanie hybridómových buniek ako zdroja preorganizovaných lokusov ťažkého a ľahkého reťazca pre následnú expresiu alebo genetickú manipuláciu. Izolácia génu z takých buniek produkujúcich protilátku je zrejmá, pretože sú dostupné vysoké hladiny príslušných mRNA. Regenerované preorganizované lokusy môžu byť manipulované podľa potreby. Napríklad konštantná oblasť môže byť eliminovaná alebo vymenená za oblasť s rozdielnym izotypom alebo rôzne oblasti môžu byť pripojené k oblastiam kódujúcim jednoduchý reťazec Fv. Tieto techniky sú opísané vo WO 96/33735 a WO 96/34096, všetky sú tu uvedené ako odkaz.

V. Výber testovaných zlúčenín

Zlúčeniny, u ktorých sa môže uskutočniť screening v súlade s testami podľa predloženého vynálezu, zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, knižnice známych zlúčenín, zahrnujúce prirodzené produkty, napr. rastlinné alebo zvieracie extrakty, syntetické chemikálie, biologicky aktívne materiály, zahrnujúce proteíny, peptidy, napr. rozpustné peptidy, zahrnujúce, ale nie je to nijako limitované, membrány náhodných peptidových knižníc a molekulárnu knižnicu vytvorenú z D- alebo L-aminokyselín, fosfopeptidov (zahrnujúcu, ale nie je to nijako limitované, členy náhodné alebo čiastočne degenerované, riadené fosfopeptidové knižnice), protilátky (zahrnujúce, ale nie je to nijako limitované, polyklonálne, monoklonálne, chimérické, ľudské, anti-idiotypické alebo protilátky s jednoduchým reťazcom a Fab, F(ab')₂ a expresné knižnice fragmentu Fab a ich fragmenty viažuce epitop), organické a anorganické molekuly.

Okrem tradičných zdrojov testovaných zlúčenín umožňuje počítačové modelovanie a spôsoby vyhľadávania racionálny výber testovaných zlúčenín

-31 využitím štruktúrnej informácie z väzobného miesta CRFR pre ligand alebo z už identifikovaných agonistov CRFR. Takýto racionálny výber testovaných zlúčenín môže znížiť počet testovaných zlúčenín, u ktorých musí byť uskutočnený screening s úmyslom identifikácie potencionálnej terapeutickej zlúčeniny. CRFR sú GPCR, a teda znalosť sekvencie proteínu CRFR umožňuje vytvorenej modelu jeho väzobného miesta, ktoré môže byť používané na screening potenciálnych Iigandov. Tento proces sa môže byť uskutočniť niekoľkými spôsobmi známymi z literatúry. Najmohutnejší prístup zahrnuje vytvorenie sekvenčnej línie sekvencie CRFR kvôli templátu (odvodeného z kryštalických štruktúr bakterio-rodopsínu alebo rodopsínu alebo iný model GPCR), konverzia aminokyselinových štruktúr a upravenie modelu molekulárnou mechanikou a vizuálnym prieskumom. Pokiaľ sa nemôže dosiahnuť silná sekvenčná línia, môže byť model vytvorený stavebnými modelmi hydrofóbnych helixov, ktoré sú potom spolu fitované rotáciou a transláciou každého helixu asociovaného s inými vychádzajúc zo všeobecnej konštrukcie známych rodopsinových štruktúr. Údaje z mutácie, súvisiace kontakty typu zvyšok-zvyšok, môžu byť tiež používané na umiestnenie helixov asociovaných jeden s druhým tak, aby sa dosiahli tieto spoje. Kvôli uľahčeniu pozície helixov vznikom interakcií, ktoré by stabilizovali väzbu Iigandov, Možno počas tohto procesu používať dokovanie známych Iigandov do kavity väzobného miesta vo vnútri helixov. Model môže byť skompletovaný doladením molekulárnou mechanikou a výstavba slučiek intracelulárnych alebo extracelulárnych slučiek pomocou modelovacích techník so štandardnou homológiou. Všeobecné informácie týkajúce sa štruktúry GPCR a modelovania môžu byť nájdené v Schoneberg, T. eŕ a/., Molecular and Callular Endocrinology, 151:181-193 (1999), Flower, D., Biochimica et Biophysica Acta, 1422:207-234 (1999) a Sexton, P. M., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2(5):440-448 (1999).

Akonáhle je model hotový, môže sa používať spolu s jedným z niekoľkých existujúcich počítačových programov na zmenšenie počtu zlúčenín na screening pomocou skríningových metód podľa predloženého vynálezu. Najviac používaný je program DOCK (UCSF Molecular Design Inštitúte, 533 Parnassus Ave, U-64, Box 0446, San Francisco, Calif. 94143-0446).

-32V niekoľkými jeho variantoch môže prehľadávať databázy komerčných a/alebo registrovaných zlúčenín z hľadiska stericity a hrubej elektrostatickej komplementarity voči väzobnému miestu. Mnoho ráz bolo zistené, že molekuly s dobrým skóre z programu DOCK majú väčšiu šancu byť ligandami. Ďalší program, ktorý môže byť používaný je FLEXX ((Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144-2913 (www.tripos.com)). Tento program, ktorý je výrazné pomalší, je zvyčajne obmedzený na prehľadávanie menších databáz zlúčenín. Vyhodnocovacia schéma vo FLEXXe je detailnejšia a obvykle poskytuje lepší odhad väzobnej schopnosti než program DOCK. FLEXX sa najčastejšie používa ako potvrdenie výsledkov dosiahnutých s programom DOCK alebo na preskúmanie knižníc zlúčenín, ktoré sú vytvorené kombinačne zo známych ligandov alebo templátu.

VI. Skríningové metódy identifikácie potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva

Vďaka tomu, že CRF₂R hrá určitú úlohu pri regulácii atrofie kostrového svalstva, možno uskutočniť skríning jednej alebo viacerých testovaných zlúčenín s cieľom identifikácie potencionálnych zlúčenín, ktoré sa môžu reálne používať na profylaktické alebo terapeutické ošetrenie atrofie kostrového svalstva. Tento vynález poskytuje metódy skríningu zlúčenín z hľadiska ich schopnosti viazať sa na CRF₂R, aktivovať CRF₂R, predlžovať alebo zvyšovať CRF₂R alebo aktiváciu dráhy prenosu signálu CRF₂R alebo zvyšovať expresiu génu CRF₂R alebo CRF.

Pretože CRF₂R a CRFfR sú homológové proteíny, očakáva sa, že niektoré časti agonistov CRF₂R majú tiež funkciu agonistov CRFfR. Ako je uvedené vyššie, aktivácia CRFíR indukuje aktiváciu HPA osi a sprievodnú produkciu kortikosteroidov. Vo väčšine prípadov, u ktorých je potrebné zvýšenie hmoty alebo funkcie svalstva, nie je žiadúce aktivovať HPA os. Okrem skríningu zlúčenín na ich schopnosť aktivovať CRF₂R vynález tiež poskytuje použitie CRF₂R a CRFfR na skríning selektívnych agonistov CRF₂R. Pokiaľ je vybraná potencionálna zlúčenina použiteľná na ošetrenie akútnej alebo chronickej svalovej atrofie, ktorá nesúvisí so svalovou dystrofiou, je žiadúce, aby prípustné zlúčeniny boli selektívne pre RF₂R. Výhodne potencionálna zlúčenina vykazuje

-33desaťnásobnú selektivitu pre CRF₂R oproti CRF1R (tzn. desaťnásobne aktívnejšia oproti CRF₂R než oproti CRF-|R), výhodne je stonásobne selektívnejší a najvýhodnejšie tisícnásobná alebo ešte väčšia selektivita. Z publikovaných štúdií, poukazujúcich na úžitok kortikosteroidovej terapie pri ošetrení svalovej dystrofie, môže byť výhodné, aby si agonista CRF₂R uchovával určitú mieru agonizmu voči CRF1R za predpokladu, že je používaný na ošetrenie svalovej dystrofie. Teda na ošetrenie svalovej dystrofie je kvôli podobnému koncentračnému rozpätiu preferovaná zlúčenina s nižšou selektivitou, ktorá aktivuje CRF₂R, ako aj CRF1R. Výhodne je potencionálna zlúčenina stonásobne selektívnejšia pre CRF₂R než CRFfR, výhodnejšie desaťnásobne a najvýhodnejšie neexistuje selektivita medzi CRF₂R a CRFfR (tzn. aktivita potencionálnej zlúčeniny je v podstate podobná pre CRF₂R aj CRF^). Tiež v tomto prípade môže byť výhodnejšie, aby zlúčenina bola kompletným agonistom CRF₂R a zároveň čiastočným agonistom CRFíR. Táto potencionálna zlúčenina by teda mala mať začlenené obmedzenie pre maximálny stupeň elevácie kortizolu a potenciál pre svalovú atrofiu, zatiaľ čo antiatrofický účinok sprostredkovaný CRF₂R by mohol byť so zvyšujúcou sa dávkou zvýšený. Odborník v odbore by mal byť schopný jednoducho určiť, či potencionálna zlúčenina je kompletným alebo parciálnym agonistom CRF-|R alebo CRF₂R metódami, ktoré sú známe v odbore.

Pre skríning zlúčeniny, ktoré budú skutočne využívané na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva vďaka CRF₂R u ľudí, je výhodné, aby in vitro skríning bol uskutočňovaný s CRF₂R s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je viac než 80% zhodná s id. č. sek.:2 a výhodnejšie viac než 90% zhodná s id. č. sek.: 10. Výhodnejšie bude uskutočnený skríning testovaných zlúčenín proti ľudskej, myšej alebo potkanej CRF₂R, najvýhodnejšie ľudskej. Pri skríningu zlúčenín, ktoré budú skutočne používané na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva u nehumánnych species, je výhodné použiť CRF₂R zo species, pre ktoré je zamýšľané ošetrenie.

Pre skríning kvôli určeniu miery aktivity testovanej alebo potencionálnej zlúčeniny voči CRF-iR a tiež kvôli určeniu akú selektivitu, pokiaľ nejaká existuje, vykazuje potencionálna zlúčenina voči CRF₂R než CRFfR, je výhodné, aby bol

-34bol počiatočný skríning uskutočňovaný s CRFíR a aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je viac než 80% zhodná s id. č. sek.:2 a výhodnejšie viac než 90% zhodná s id. č. sek.:2. Výhodnejšie bude uskutočňovaný skríning testovaných zlúčenín proti ľudskej, myšej alebo potkanej CRFíR, najvýhodnejšie ľudskej. Pri skríningu zlúčenín, ktoré budú skutočne používané na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva u nehumánnych species, je výhodné použiť CRFíR zo species, pre ktoré je zamýšľané ošetrenie.

Pre spôsoby podľa predloženého vynálezu existuje veľké množstvo aplikácií, avšak použitie aj jednej zlúčeniny v spôsobe podľa predloženého vynálezu patrí do termínu „skríning. Testované zlúčeniny, ktoré sa viažu na CRF₂R, aktivujú CRF₂R, predlžujú alebo zvyšujú agonistom indukovanú aktiváciu CRF₂R alebo dráhy prenosu signálu CRF₂R alebo zvyšujú expresiu CRF₂R alebo génu CRF, čo je určené spôsobom podľa predloženého vynálezu, sú označované ako potencionálne zlúčeniny. Tieto potencionálne zlúčeniny sa môžu používať na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva. Napokon typickejšie táto prvá úroveň in vitro skríningu poskytuje prostriedky, ktorými možno vybrať užší rozsah zlúčenín, tzn. potencionálnych zlúčenín, ktoré sú vhodné pre ďalší výskum na ďalších úrovniach skríningu. Odborník v odbore tiež pozná, že využitie predloženého vynálezu je tiež v identifikácii zlúčenín zo skupiny jednej alebo viacerých testovaných zlúčenín, podskupiny (výberu) zlúčenín, ktoré sú vhodné na ďalšie skúmanie. Odborník v odbore tiež pozná, že testy podľa predloženého vynálezu sú použiteľné na vytvorenie rebríčka využiteľnosti konkrétnych potencionálnych zlúčenín vo vzťahu k ďalším potencionálnym zlúčeninám. Napríklad potencionálna zlúčenina, ktorá aktivuje CRF₂R pri 1000 nM (ale nie pri 10 nM) má menšiu výhodnosť než zlúčenina, ktorá aktivuje CRF₂R pri 10 nM. Využitím takých informácií môže odborník v odbore vybrať podskupinu potencionálnych zlúčenín identifikovaných na prvej úrovni skríningu pre ďalšie skúmanie. Len ako príklad možno uviesť, že zlúčeniny, ktoré aktivujú CRF₂R pri koncentráciách menších než 200 nM, sa môžu ďalej testovať na zvieracom modeli atrofie kostrového svalstva, pretože vyššie množstvá než 200 nM by sa nemuseli ďalej testovať. Odborník v odbore ďalej pozná, že v závislosti

-35na tom, aká skupina testovaných zlúčenín je vybraná a aké pozitíva sú vybrané, bude len určitá časť testovaných zlúčenín identifikovaná ako potencionálne zlúčeniny, a že táto časť môže byť veľmi malá.

Nižšie opísané testovacie systémy môžu byť formulované do kitov obsahujúcich CRF₂R alebo bunky exprimujúce CRF₂R, ktoré môžu byť zabalené v rôznych kontajneroch, napr. ampulky, rúrkovité mikrotitračné doštičky s jamkami, fľaštičiek, atď. Ďalšie činidlá môžu byť zahrnuté v separátnych kontajneroch a vybavené súborom, napr. pozitívne kontrolné vzorky, negatívne kontrolné vzorky, pufre a média na kultiváciu buniek.

Pri jednom uskutočnení poskytuje vynález spôsob skríningu jednej alebo viacerých testovaných zlúčenín na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré sa viažu na CRF₂R. Spôsoby stanovenia väzby zlúčeniny na receptor sú v odbore dobre známe. Typicky testy zahrnujú kroky inkubácie zdroja CRF₂R značenou zlúčeninou so známou väzbou na receptor za prítomnosti alebo absencii testovanej zlúčeniny a stanovenie množstva naviazanej značenej zlúčeniny. Zdrojom CRF₂R môžu byť buď bunky exprimujúce CRF₂R alebo niektoré formy izolovaného CRF₂R, ako je to opísané v predloženom vynáleze. Značená zlúčenina môže byť CRF alebo ktorýkoľvek analóg CRF značený tak, aby mohol byť meraný, s výhodou kvantitatívne (napr. značený ¹²⁵l, európiom, fluoresceínom, GFP, ³⁵S-mentionínom). Tieto spôsoby značenia sú dobre známe v odbore. Testované zlúčeniny, ktoré sa viažu na CRFR spôsobujú zníženie množstva značeného ligandu viazaného na receptor, čím znižujú hladinu signálu pri porovnaní s kontrolnými vzorkami (absencie testovanej zlúčeniny). Opísané boli obmeny tejto techniky, pri ktorých receptorová väzba za prítomnosti a absencii dekopulačných agensov G-proteínu môže rozlíšiť agonistov od antagonistov (napr. väzba pri absencii alebo za prítomnosti analógu guanínového nukleotidu, tzn. GpppNHp). Viď. Keen, M., Radioligand Binding Methods for Membráne Preparations and Intact celis in Receptor Signál Transduction Protocols, R.A.J. Challis, (ed), Humana Press Inc., Totoway N.J. (1997).

Pretože je žiadúce odlíšiť medzi zlúčeninami ich špecifickú väzbu na CRF₂R pri porovnaní s CRF! R, mali by sa testy opísané vyššie uskutočňovať s bunkou alebo membránou z buniek, ktoré exprimujú len CRF₂R alebo sa testy

-36môžu uskutočňovať s rekombinantným zdrojom CRF₂R. Bunky exprimujúce obidve formy CRFR môžu sa modifikovať pomocou homológovej rekombinácie na inaktiváciu alebo iné deaktiváciu génu CRFíR. Alternatívne, pokiaľ zdroj CRFR obsahuje viac než jeden typ CRFR, pozadie signálu produkovaného receptorom, ktorý nie je požadovaný, musí sa odčítať od signálu získaného pri teste. Pozadie odpovede môže byť určené mnohými metódami, zahrnujúcimi elimináciu signálu z CRFR, o ktorý nie je záujem, použitím antisenzitívnych, protilátkových alebo selektívnych antagonistov. Známi antagonisti CRFR zahrnujú antalarmín (CRFíR selektívny), antisauvagín-30 (CRF₂R selektívny) a astresín (neselektívny pre CRFiR/CRF₂R).

Pri ďalšom uskutočnení poskytuje predložený vynález spôsoby skríningu testovaných zlúčenín na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré aktivujú CRF₂R a/alebo CRFíR. Typicky sú testy na bunkovej báze, napokon sú známe bezbunkové testy, ktoré sú schopné rozlíšiť väzbu agonistu a antagonistu, ako je to opísané vyššie. Testy na báze buniek zahrnujú kroky uvedenie buniek, ktoré exprimujú CRFíR alebo CRF₂R, do kontaktu s testovanou zlúčeninou alebo kontrolou a meraním aktivácie CRFR meraním expresie alebo aktivity komponentov dráh prenosu signálu CRFR.

Ako je uvedené v odstavci vyššie, ukazuje sa, že CRFR sa kuplujú niekoľkými rôznymi dráhami, zahrnujúcimi G_as, G_aq alebo G_qí v závislosti na type bunky. Zámer je, aby aktivácia CRFR agonistom umožňovala receptoru preniesť signál ktoroukoľvek z týchto dráh za predpokladu, že nevyhnutné zložky dráhy sa nachádzajú v konkrétnom type bunky. Teda pre potreby skríningu aktivácia CRFR sa môže v teste používať ktorákoľvek z dráh prenosu signálu ako reálna hodnota, aj keby relevantný typ bunky na ošetrenie in vivo spojoval CRFR s atrofiou kostrového svalstva odlišnou dráhou. Odborník v odbore by mal rozoznať, že skríning by mal byť účinný na identifikáciu použiteľných agonistov CRFR nezávisle na dráhe, ktorou bola meraná aktivácia receptora. Analýzy merania aktivácie týchto signálnych dráh sú v odbore známe.

Napríklad po kontakte s testovanou zlúčeninou sa môžu pripraviť lyzáty buniek a testované z hľadiska indukcie cAMP. cAMP vzniká pri odpovedi na aktiváciu G_as. Pretože G_as je aktivovaný receptormi inými než CRFR, a

-37pretože testovaná zlúčenina môže uplatňovať svoj efekt cez CRFR alebo iným mechanizmom, dôležité sú dve kontrolné porovnania na určenie, či testovaná zlúčenina zvyšuje hladiny cAMP via aktiváciu CRFR. Jedna kontrola porovnáva hladinu cAMP buniek zkontaktovaných testovanou zlúčeninou a hladinu cAMP buniek skontaktovaných kontrolnou zlúčeninou (tzn. nosič, v ktorom je testovaná zlúčenina rozpustená). Pokiaľ testovaná zlúčenina zvyšuje hladiny cAMP pri porovnaní s kontrolnou zlúčeninou, znamená to, že testovaná zlúčenina zvyšuje nejakým mechanizmom cAMP. Ďalšia kontrola porovnáva hladiny cAMP, CRFR exprimujúce bunkovú líniu a bunkovú líniu, ktorá je v podstate rovnaká okrem toho, že neexprimuje CRFR, kde obidve bunkové línie boli ošetrované testovanou zlúčeninou. Pokiaľ testovaná zlúčenina zvyšuje hladiny cAMP v bunkovej línii exprimujúce CRFR pri porovnaní s bunkovou líniou neexprimujúcou CRFR, znamená to, že testovaná zlúčenina zvyšuje cAMP via aktiváciu CRFR.

V špecifickom uskutočnení predloženého vynálezu je meraná indukcia cAMP použitím DNA-konštrukcií obsahujúcich element responzívny na cAMP pripojený ku ktorémukoľvek z reportérových génov, ktoré môžu byť zavedené do buniek exprimujúcich CRFR. Tieto reportérove gény zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, chloramfenikolacetyltransferázu (CAT), luciferázu, glukuronidsyntetázu, rastový hormón, fluorescenčné proteíny (napr. Green Fluorescent Protein) alebo alkalickú fosfatázu. Po expozícii buniek testovanej zlúčeniny môže byť hladina expresie reportérovho génu kvantifikovaná kvôli stanoveniu schopnosti testovanej zlúčeniny zvyšovať hladiny cAMP, a tým určiť schopnosť testovaných zlúčenín aktivovať CRFR.

Bunky použiteľné v tomto teste sú rovnaké ako pre vyššie uvedený test väzby CRFR okrem toho, že bunky využité v testoch aktivácie výhodne exprimujú funkčný receptor, ktorý poskytuje štatisticky signifikantnú odpoveď na CRF alebo jeden alebo viacero analógov CRF. Okrem použitia buniek exprimujúcich úplné CRFR, môžu byť bunky geneticky upravené tak, aby exprimovali CRFR obsahujúcou doménu receptora viažuceho ligand spriahnutou s reportérovými elementárni, alebo fyzicky modifikovanou tak, aby obsahovala reportérove elementy, alebo interagovala so signálnymi proteínmi. Napríklad štandardná

-38CRFR alebo fragment CRFR môže byť fúzovaný s G-proteínom, čo vedie k aktivácii fúzovaného G-proteínu po naviazaní agonistu na časť CRFR fúzneho proteínu. (Seifert, R. et a/., Trends Pharmacol. Sci. 20:383-389 (1999)). Bunky by tiež mali výhodne vykazovať charakteristické znaky v závislosti na snímaní maximalizácie induktívnej odpovede CRF alebo analógu CRF, napr. na detekciu silnej indukcie reportérového génu CRE. Výhodná by mala byť (a) nízka hladina cAMP; (b) G-proteín schopný interakcie s CRFR; (c) vysoká hladina adenylylcyklázy; (d) vysoká hladina proteínkinázy A; (e) nízka hladina fosfodiesteráz; a (f) vysoká hladina proteínu viažuceho element odpovede cAMP. Na zvýšenie odpovede na CRF a analógu CRF by mohli byť hostiteľské bunky geneticky upravené na exprimáciu väčšieho množstva vhodných faktorov alebo menšieho množstva nevhodných faktorov. Navyše by mohli byť alternatívne dráhy na indukciu receptora CRE eliminované na zníženie základných hladín.

V niektorých prípadoch odpovede s G-proteínom spriahnutého receptora sa zmierňujú alebo sa stanú desenzibilizovanými po predĺženej expozícii agonistu. Ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu poskytuje spôsoby identifikácie zlúčenín, ktoré predlžujú alebo zvyšujú aktiváciu CRF₂R indukovanou agonistom alebo dráhu prenosu signálu CRF₂R pri odpovedi na agonistu CRF2R. Tieto zlúčeniny môžu byť používané napr. v spojitosti s agonistom CRF₂R na ošetrenie atrofie kostrového svalstva. Typicky metóda využíva test na bunkovej báze obsahujúca v akomkoľvek poradí alebo súčasne (i) uvedenie buniek do kontaktu s testovanou zlúčeninou; (ii) ošetrenie buniek exprimujúcich funkčnú CRF₂R agonistom CRF₂R pri koncentrácii agonistu a po dobu expozície agonista-receptor, ktorá je postačujúca na desenzibilizáciu receptora; potom (iii) stanovenie hladiny aktivácie CRF₂R. Odborník v odbore rozozná, že na desenzibilizácii receptora sa podieľa niekoľko mechanizmov, zahrnujúcich, ale nie je to nijako limitované, fosforyláciu receptora, internalizáciu alebo degradáciu receptora a potlačenú moduláciu dráhy prenosu signálu CRFR. Odborník v odbore môže určiť potrebný čas (napr. pred, počas alebo po ošetrení agonistom) kontaktu bunky s testovanou zlúčeninou v závislosti na zvolenom mechanizme desenzibilizácie. Napríklad kontaktom buniek s testovanými zlúčeninami po ošetrení agonistom možno detekovať tie testované zlúčeniny, ktoré blokujú

-39desenzibilizáciu receptora, ktorý sa objavuje ako výsledok fosforylácie receptora.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob skríningu jednej alebo viacerých testovaných zlúčenín na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré regulujú transkripciu z génu CRF₂R alebo reguláciu expresie CRF₂R. Potencionálne zlúčeniny, ktoré regulujú transkripčnú aktivitu génu CRFR môžu byť identifikované pomocou reportérového génu operatívne asociovaného s regulačnou oblasťou CRF₂R (konštrukcia reportérového génu). Tieto metódy sú známe v odbore. Pri jednej takejto metóde je konštrukt reportérového génu uvedený do kontaktu s testovanou zlúčeninou za prítomnosti zdroja bunkových faktorov a je určená hladina expresie reportérového génu. Testovaná zlúčenina, ktorá spôsobuje zvýšenie hladiny expresie pri porovnaní s kontrolnou vzorkou je indikáciou potencionálnej zlúčeniny, ktorá zvyšuje transkripciu génu CRF₂R. Na získanie bunkových faktorov potrebných pre in vitro alebo in vivo transkripciu sú pripravené bunky alebo bunkové extrakty z ktoréhokoľvek typu bunky, ktorý normálne exprimuje CRF₂R.

Potencionálne zlúčeniny, ktoré regulujú expresiu CRF₂R môžu byť tiež identifikované metódou, pri ktorej je bunka uvedená do kontaktu s testovanou zlúčeninou a stanovená expresia CRFR. Hladina expresie CRF₂R za prítomnosti testovanej zlúčeniny je porovnaná s hladinou expresie pri absencii testovanej zlúčeniny. Testované zlúčeniny, ktoré zvyšujú expresiu CRF₂R sú identifikované ako potencionálne zlúčeniny zvyšujúce hmotu alebo funkciu svalstva. Táto metóda detekuje potencionálne zlúčeniny, ktoré zvyšujú transkripciu alebo transláciu CRF₂R, alebo ktoré zvyšujú stabilitu mRNA alebo proteínu CRF₂R.

V ďalšom uskutočnení poskytuje predložený vynález spôsoby skríningu jednej alebo viacerých zlúčenín na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré regulujú expresiu CRF alebo analógu CRF. Tieto testy sa uskutočňujú v podstate podľa vyššie uvedeného spôsobu na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré regulujú expresiu CRFR s nasledujúcimi modifikáciami. Na identifikáciu potencionálnej zlúčeniny, ktorá reguluje transkripciu z génu CRF alebo génu analógu CRF je reportérový gén operatívne asociovaný s regulačnou oblasťou požadovaného génu CRF alebo génu analógu CRF a zdroj bunkových

-40faktorov by mal byť z bunky exprimujúci požadovaný gén.

VII. Skríning potencionálnych zlúčenín pomocou modelu atrofie kostrového svalstva

Potencionálne zlúčeniny vybrané z jednej alebo viacerých testovaných zlúčenín in vitro testom podľa vyššie opísaného spôsobu sa môžu ďalej testovať z hľadiska svojej schopnosti regulovať hmotu alebo funkciu kostrového svalstva na modelových systémoch atrofie a/alebo hypertrofie kostrového svalstva. Tieto modely atrofie alebo hypertrofie kostrového svalstva zahrnujú modely in vitro bunkové kultúry i in vivo zvieracie modely atrofie kostrového svalstva. Tieto ďalšie úrovne skríningu sú použiteľné na ďalšie zúženie rozsahu potencionálnych zlúčenín, ktoré napomáhajú k ďalšiemu výskumu, napr. klinickým skúškam.

Modely svalovej atrofie na bunkovej kultúre

V odbore sú známe in vitro modely atrofie kostrového svalstva. Tieto modely sú opísané napr. Vandenburgh, H. H., In Vitro 24:609-619 (1988), Vandenburgh, H. H. et a/., J. of Biomechanics, 24 Suppl 1:91-99 (1991), Vandenburgh, H. H et a/., In Vitro Celí. Dev. B/b/., 24(3):166-174 (1988), Chromiak, J. A., et a/., In Vitro Celí. Dev. e/of. Anim., 34(9):694-703 (1998), Shansky, J., eŕa/., In Vitro Celí Dev. Biol. Anim., 33(9):659-661 (1997), Perrone,

C. E. et a/., J. Biol. Chem. 270(5):2099-2106 (1995), Ohromiac, J. A. and Vandenburgh, H. H., J. Celí. Physiol. 159(3):407-414 (1994) a Vandenburgh, H. H. and Karlisch, P., In Vitro Celí Dev. B/b/. 25(7):607-616 (1989). Takéto modely sú použiteľné, ale nie potrebné, po in vitro skríningu opísanom vyššie kvôli zmenšeniu rozsahu potencionálnych zlúčenín, ktoré je výhodné testovať na zvieracom modeli. Modely bunkovej kultúry sú ošetrené potencionálnymi zlúčeninami a odpoveď modelu na ošetrenie je meraná vyhodnotením zmien vo svalových markeroch, napr. syntéza alebo degradácia svalového proteínu, zmeny v hmote alebo kontraktilnej funkcii kostrového svalstva. U zlúčenín, ktoré

-41 indukujú výrazné zmeny v markeroch kostrového svalstva, je ďalej typicky uskutočnený skríning na zvieracom modeli atrofie kostrového svalstva.

Zvieracie modely atrofie kostrového svalstva

Potencionálne zlúčeniny sa podávajú neľudským zvieracím subjektom a odpoveď zvierat je monitorovaná napr. vyhodnotením zmien v markeroch atrofie alebo hypertrofie, napr. hmoty kostrového svalstva, funkcie kostrového svalstva, svalu alebo plochy priečneho rezu myovláknom, obsah kontraktilného proteínu, obsah nekontraktilného proteínu alebo biochemický alebo genetický marker, ktorý koreluje so zmenou hmoty alebo funkcie kostrového svalstva. Potencionálne zlúčeniny, ktoré indukujú hypertrofiu kostrového svalstva alebo zabraňujú ktorémukoľvek aspektu atrofie kostrového svalstva, by mali byť považované za eventuálnych terapeutických kandidátov na ošetrenie ľudskej atrofie kostrového svalstva a sú tu označované ako potencionálne terapeutické zlúčeniny. Okrem vyhodnotenia schopnosti potencionálnej zlúčeniny regulovať atrofiu kostrového svalstva môžu byť v tomto teste detekované tiež nežiadúce vedľajšie účinky, napr. toxicita. Absencia neprijateľných vysokých hladín vedľajších účinkov sa môže používať ako ďalšie kritérium výberu potencionálnych terapeutických zlúčenín.

V odbore je známy veľký počet zvieracích modelov atrofie kostrového svalstva, napr. modely opísané v nasledujúcich odkazoch: Herbison, G. J., et al. Árch. Phys. Med. Rehabil. 60:401-404 (1979), Appell, H-J. Sporíš Medicíne 10:4258 (1990), Hasselgren, P-O. and Fischer, J. E. World J. Surg. 22:203-208 (1998), Agbenyega, E. T. and Wareham, A. C. Comp. Biochem. Physiol. 102Α.Ί41-145 (1992), Thomason, D. B. and Booth, F. W. J. Appl. Physiol. 68:1-12 (1990), Fitts, R. H., et al. J. Appl. Physiol. 60:1946-1953 (1986), Bramanti, P., et al Int. J. Anat. Embryol. 103:45-64 (1998), Cartee, G. D. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 50:137-141 (1995), Cork, L. C., et al. Prog. Clin. Biol. Res. 229:241-269 (1987), Booth, F. W. and Gollnick, P. D. Med. Sci. Sports Exerc. 15:415-420 (1983), Bloomfield, S. A. Med. Sci. Sports Exerc. 29:197-206 (1997). Vhodnými zvieratami pre tieto modely sú myši a potkany. Tieto modely zahrnujú napr. modely atrofie indukované nečinnosťou, napr. fixácia alebo iným spôsobom

-42imobilizované končatiny, suspenzia zadnej končatiny, kompletná imobilizácia zvieraťa a stavy zníženej gravity. Modely atrofie indukované nervovým poškodením zahrnujú napr. zrútenie nervu, odstránenie častí nervov, ktoré inervujú špecifické svaly, poškodenie nervu toxickými agensmi a infekcie nervu vírusovými, bakteriálnymi alebo eukaryotickými infekčnými agensmi. Modely atrofie indukované glukokortikoidom zahrnujú aplikáciu dávky exogénneho glukokortikoidu indukujúceho atrofiu zvieratám a stimuláciu endogénnej produkcie kortikosteroidu, napr. aplikáciou hormónov, ktoré aktivujú hypotalamickúpituitárnu-adrenálnu (HPA) os. Modely atrofie indukované sepsou zahrnujú napr. inokuláciu organizmu indukujúceho sepsu, napr. baktérie, ošetrenie zvieraťa zlúčeninami aktivujúcimi imunitný systém, napr. extrakt zo steny bakteriálnej bunky alebo endotoxín a punkciu intestinálnych stien. Modely atrofie indukované kachexiou zahrnujú napr. inokuláciu zvieraťa tumorogénnymi bunkami kachexiou formujúcim potenciálom, infekciu zvieraťa infekčnými agensmi (napr. vírusy, ktoré spôsobujú AIDS), čo spôsobuje kachexiu a ošetrenie zvieraťa hormónmi alebo cytokínmi, napr. CNTF, TNF, IL-6, IL-1, atd’., ktoré indukujú kachexiu. Modely atrofie indukované infarktom zahrnujú manipuláciu zvieraťa tak, aby sa infarkt objavil so sprievodnou atrofiou kostrového svalstva. Neurodegeneratívne modely atrofie indukované ochorením zahrnujú autoimúnne zvieracie modely, napr. také modely, ktoré vznikajú imunizáciou zvieraťa neuronálnymi komponentmi. Modely atrofie indukované svalovou dystrofiou zahrnujú prirodzené alebo umelé, geneticky indukované modely svalovej dystrofie, napr. mutácia génu dystrofínu, prítomného v Mdx myši.

Zvieracie modely hypertrofie kostrového svalstva zahrnujú napr. modely zvýšeného používania svalu končatiny v dôsledku inaktivácie opačnej končatiny, prevažovanie po stave atrofie indukovanej nečinnosťou, opätovné využitie svalu, ktorý atrofoval v dôsledku prechodného nervového poškodenia, zvýšené používanie vybraných svalov v dôsledku inaktivácie synergického svalu (napr. kompenzačná hypertrofia), zvýšené využívanie svalu v dôsledku zvýšeného zaťažovania svalu a hypertrofiu zapríčinenú vysadením glukokortikoidu po atrofii indukovanej glukokortikoidom. Vhodné zvieracie modely atrofie zahrnujú

-43model atrofie sedacieho nervu, model atrofie indukovanej glukokortikoidom a model atrofie z nečinnosti v dôsledku fixácie končatiny, ktoré sú detailnejšie opísané nižšie.

Model atrofie indukovanej denerváciou sedacieho nervu zahrnuje anestéziu zvieraťa a následným chirurgickým odstránením krátkeho segmentu buď pravého alebo ľavého sedacieho nervu, napr. u myši je sedací nerv izolovaný približne v strednej línii pozdĺž stehennej kosti a odstráni sa 3-5 mm segment. Týmto spôsobom sa denervuje svalstvo dolnej zadnej končatiny, čo spôsobí atrofiu týchto svalov. Typicky je inervácia dvojhlavého svalu na zadnej strane stehna z ľavej strany intaktná, čím sa získa dostatočný pohyb kolena na prakticky normálnu chôdzu. Typicky je u neošetrovaných zvierat svalová hmota denervovaného svalu znížená o 30-50% po desiatich dňoch od denervácie. Po denervácii sa testované zlúčeniny podávajú napríklad injekciou alebo kontinuálnou infúziou, napr. implantáciou osmotickej minipumpy (napr. Alzet, Palo Alto, CA) na stanovenie ich účinku na atrofiu kostrového svalstva indukovanú denerváciou. V rôznych časoch po denervácii sú zvieratá usmrtené a svalstvo dolnej končatiny z denervovaných i nedenervovaných končatín je rýchlo narezané a svaly zbavené šliach a spojivové tkanivá sa odvážia. Rozsah atrofie v zasiahnutom svalstve sa analyzuje napríklad meraním hmoty svalstva, prierezovej plochy svalu, prierezovej plochy myovlákna alebo obsahu kontraktilného proteínu.

Model atrofie indukovanej glukokortikoidom zahrnuje podanie glukokortikoidu testovanému zvieraťu, napr. 1,2 mg/kg/denne dexametazonu v pitnej vode. Typicky u neošetrovaných zvierat sa hmota kostrového svalstva zníži z 30-50% po desiatich dňoch od podania dexametazonu. Súbežne s podaním glukokortikoidu alebo po podaní glukokortikoidu sú testované zlúčeniny podávané, napr. injekciou alebo kontinuálnou infúziou, na stanovenie ich účinku na atrofiu kostrového svalstva indukovanú glukokortikoidom. V rôznych časoch po podaní glukokortikoidu je rozsah atrofie v postihnutom svalstve analyzovaný spôsobom opísaným pre model denervácie.

Model atrofie z nečinnosti v dôsledku fixácie končatiny zahrnuje fixáciu jednej zadnej končatiny zvieraťa od kolena nadol. Po desiatich dňoch fixácie sa svalová hmota typicky zníži o 20-40%. Po fixácii sa testované zlúčeniny

-44podávajú injekciou alebo kontinuálnou infúziou implantáciou osmotickej minipumpy (napr. Alzet, Palo Alto, CA) s cieľom stanovenia ich účinku na modeli atrofie z nečinnosti v dôsledku fixácie končatiny. V rôznych časoch po fixácii končatiny sa rozsah atrofie v zasiahnutom svalstve analyzuje spôsobom opísaným pre model denervácie.

Odborník v odbore rozozná, že pri skríningu zlúčenín pre použitie na ľuďoch sa kvôli rozdielom medzi ľudskou CRF₂R a CRF₂R z iných zvieracích druhov môžu vyskytnúť určia sa nesprávne pozitívne alebo negatívne výsledky, ktoré vznikajú v prípade, kedy je skríning uskutočňovaný pomocou nehumánnych CRF₂R. Teda je výhodné uskutočniť iniciálny in vitro skríning pomocou ľudskej CRF₂R. V niektorých prípadoch môžu byť identifikované potencionálne zlúčeniny aktívne len voči ľudskému receptoru a nie voči nehumánnemu receptoru. V takých prípadoch môže byť stále potreba určiť, či tieto potencionálne zlúčeniny sú schopné regulovať hmotu alebo funkciu kostrového svalstva v druhej úrovni skríningu. Pretože tieto potencionálne zlúčeniny neaktivujú neľudskú CRF₂R, nie je doporučovaný štandardný in vivo skríning. V takých prípadoch sa môže uskutočniť druhá úroveň skríningu týchto potencionálnych zlúčenín na transgénnych zvieratách, ktoré exprimujú ľudské CRFR.

Zvieratá ktoréhokoľvek druhu, predovšetkým cicavce, zahrnujúce, ale nie je to nijako limitované, myši, potkany, králiky, morčatá, ošípané, kozy, psy a nehumánne primáty, ktoré sa môžu používať na vytvorenie transgénnych zvierat s CRFR. Preferované sú myši a potkany, najvýhodnejšie myši. V odbore sú známe rôzne techniky a môžu sa používať na zavedenie ľudských transgénov CRFR do zvierat kvôli produkcii zakladajúcich línií transgénnych zvierat. Tieto techniky zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, pronukleárnu mikroinjekciu, prenos génu do zárodkových línií sprostredkovaný retrovírusom, génové manipulácie v embryonálnych kmeňových bunkách, elektroporáciu embryí a prenos génu sprostredkovaného spermiou.

VIII. Spôsoby génovej terapie na ošetrenie atrofie kostrového svalstva

Celková aktivita CRF₂R môže byť zvýšená nadexprimáciou génu CRF₂R (pri zvýšení expresie CRF₂R) alebo konštitutívne aktívneho CRF₂R v príslušnom

-45tkanive. Hladiny CRF sa tak isto môžu zvýšiť in vivo nadexprimáciou génu CRF. Nadexprimácia týchto génov bude zvyšovať celkovú bunkovú aktivitu CRF₂R, a tak regulovať atrofiu kostrového svalstva. Požadovaný gén alebo gény sú vložené do vektora vhodného na expresiu v subjekte. Tieto vektory, zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, adenovírus, vírus asociovaný adenovírusom, retrovírus a vektory herpes vírusu okrem ďalších častíc, ktoré zavádzajú DNA do buniek (napr. lipozóm, častice zlata, atď.) alebo priamo injekciou DNAexpresného vektora, ktorý obsahuje požadovaný gén, do ľudského tkaniva (napr. svalu).

IX. Farmaceutické prostriedky a spôsoby použitia

Potencionálne zlúčeniny alebo potencionálne terapeutické zlúčeniny identifikované tu opísanými spôsobmi skríningu sa môžu podávať jednotlivcom na ošetrenie atrofie kostrového svalstva alebo na indukciu hypertrofie kostrového svalstva. Pre tento zámer zahrnuje predložený vynález spôsoby a prípravky na moduláciu atrofie kostrového svalstva, zahrnujúce, ale nie je to nijako limitované, atrofiu kostrového svalstva indukovanú nečinnosťou v dôsledku chirurgického zákroku, kľudu na lôžku, zlomených kostí; denervácii/poškodenia nervov v dôsledku poranenia miechy; autoimúnne ochorenie; infekčné ochorenie; použitie glukokortikoidu na nesúvisiace stavy; sepsu v dôsledku infekcie alebo iných príčin; limitáciu živinami v dôsledku ochorenia alebo hladovania; rakovinová kachexia; chronický zápal; AIDS s kachexiou; COPD; celkové zlyhanie srdca; sarkopénia a genetické poruchy; napr. svalové dystrofie, neurodegeneratívne ochorenia. Agonisty CRF₂R sa môžu používať na inhibiciu atrofie kostrového svalstva. Nie je dôležité, aby účinné zlúčeniny vykazovali absolútnu špecifitu pre CRFR. Je zamýšľané, aby sa špecifický antagonista pre receptory mohol koaplikovať s účinným, ale nešpecifickým agonistom. Alternatívne táto chýbajúca špecifita môže byť adresovaná moduláciou samotnej dávky alebo dávkovacím režimom.

Potencionálne zlúčeniny alebo potencionálne terapeutické zlúčeniny identifikované spôsoby skríningu podľa predloženého vynálezu môžu byť

-46podávané spolu so zlúčeninami, ktoré predlžujú alebo zvyšujú aktiváciu CRF₂R alebo dráhu prenosu signálu CRF₂R, čo môžu byť známe zlúčeniny napr. teofylín, alebo môžu byť tieto zlúčeniny identifikované spôsobmi skríningu podľa predloženého vynálezu ako zlúčeniny, ktoré predlžujú alebo zvyšujú aktiváciu receptora CRF₂R alebo dráhu prenosu signálu CRF₂R.

Určenie dávok

Bezpečná a terapeutická účinnosť zlúčenín, ktoré agonizujú CRFR môže byť určená štandardnými postupmi použitím buď in vitro alebo in vivo technológií. Preferované sú zlúčeniny, ktoré majú vysoké terapeutické indexy, aj keď sú použiteľné aj zlúčeniny s nižšími terapeutickými indexmi za predpokladu, že majú prijateľnú mieru vedľajších účinkov. Dáta získané z in vitro a in vivo toxikologických a farmakologických techník sa môžu používať na formuláciu použiteľných rozpätí dávok u ľudí. Výhodná dávka je v rozsahu, v ktorom je cirkulačná koncentrácia zlúčeniny terapeuticky maximálna s prijateľnou bezpečnosťou. Cirkulačná koncentrácia zlúčeniny sa môže líšiť v závislosti na forme dávky, čase po podaní, spôsobu podania, atď. Dávky mimo tohto rozsahu sú tiež použiteľné za predpokladu prijateľnej miery vedľajších účinkov. Údaje ako je vek a hmotnosť pacienta a podobne sa môžu používať na určenie dávky štandardným spôsobom. Farmakogenetické prístupy môžu byť použiteľné pri optimalizácii výberu zlúčeniny, dávok a dávkovacích režimov v klinických populáciách.

Formulácia a použitie

Farmaceutické prípravky na použitie pri modulácii atrofie kostrového svalstva podľa predloženého vynálezu môžu byť formulované štandardnými technológiami použitím farmaceutický prijateľných nosičov a excipientov. Prípravky podľa predloženého vynálezu sa výhodne produkujú vo forme jednotkovej dávky. Termín „ forma jednotkovej dávky je prípravok podľa predloženého vynálezu obsahujúci množstvo agonistu CRF₂R, ktoré je vhodné na podávanie zvieraťu, výhodne cicavcovi, výhodnejšie ľudskému subjektu, v jednotlivej dávke, podľa náležitej lekárske praxe.

-47Farmaceutické prípravky môžu byť formulované na, napríklad intranazálne podávanie, transdermálne podávanie, inhaláciu, parenterálne, kutánne, perorálne alebo rektálne podávanie. Pre perorálne podávanie môže byť farmaceutický prípravok vo forme tabliet alebo kapsulí obsahujúcich farmakologicky aktívnu zlúčeninu a aditíva zahrnujúce, ale nie je to nijako limitovane, väzobné agensy, plnivá, mastivá, dezintegrátory alebo zmáčacie agensy. Tablety môžu byť potiahnuté filmom. Tekuté preparáty pre perorálne podávanie zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, sirupy, suspenzie alebo suché produkty, ktoré sú rekonštituované pred použitím s tekutým nosičom obsahujúcim farmakologicky aktívnu zlúčeninu a aditíva zahrnujúce, ale nie je to nijako limitované, suspenzačné agensy, emulgátory, bezvodné nosiče, konzervačné látky, pufre, ochucovacie, farbiace látky, sladiace látky, atď. Farmaceutické prípravky pre perorálne podávanie môžu byť formulované na kontrolované uvoľňovanie farmakologicky aktívnych zlúčenín buď na jazyku, v žalúdku alebo intestinálnom trakte.

Na inhalačné podávanie sa môžu zlúčeniny pre použitie podľa predloženého vynálezu podávané, ale nie je to nijako limitované, v nasledovných formách: tekutiny, prášky, gély alebo vo forme aerosólového spreja využívajúceho stlačené alebo nestlačené propelanty buď vo vopred nastavených alebo ľubovolných dávkach. Farmakologicky aktívna zlúčenina môže byť formulovaná s príslušnými plnivami, nosičmi, konzervačnými látkami, puframi, atď. Na parenterálne podávanie môže byť farmakologicky aktívna zlúčenina formulovaná s prijateľnými fyziologickými nosičmi, konzervačnou látkou, atď. a môže byť pripravená ako suspenzia, roztoky, emulzie, prášky pripravené na konštitúciu, atď. buď pre injekciu bolusu alebo infúziu. Dávky týchto zlúčenín sa môžu podávať rôznymi technológiami zahrnujúcimi, hypodermické ihlice, vysokotlakové prístroje, atď. Na rektálne podávanie môže byť farmakologicky aktívna zlúčenina formulovaná s prijateľnými fyziologickými nosičmi, konzervačnými látkami, atď. na podaní vo forme čapíkov, klystírov, atď. Na kutánne podávanie môže byť farmakologicky aktívna zlúčenina formulovaná s prijateľnými fyziologickými nosičmi zahrnujúcimi pleťové vody, látky zmäkčujúce kofu, atď. alebo zabudovaná do náplaste. Na dlhodobé podávanie môžu byť farmakologicky aktívna zlúčenina a príslušné aditíva napríklad, ale nie je to nijako limitované,

-48polyméry, hydrofóbne materiály, živice, atď. formulované ako depotný preparát buď pre injekciu alebo implantáciou na niekoľkých miestach zahrnujúcich, ale nie je to nijako limitované, intramuskulárne a subkutánne lokácie. Navyše sa farmakologicky aktívna zlúčenina môže podávať rozprašovačom.

Monitorovanie účinkov počas klinických skúšok

Monitorovanie vplyvu zlúčenín (napr. liečiv) na expresiu alebo aktivitu CRF₂R sa môže byť používať nielen pri základnom skríningu liečiv, ale tiež pri klinických skúškach. Napríklad účinnosť zlúčeniny určená skríningom so zámerom zvýšenia aktivity receptora CRF₂R alebo expresie receptora CRF₂R môže byť odhadnutá pri klinických skúškach pacientov s atrofiou kostrového svalstva alebo pri riziku atrofie kostrového svalstva. V rôznych časoch po podaní testovanej zlúčeniny alebo placeba môže byť určený účinok zlúčeniny na pacienta napríklad pozorovaním zmeny hmoty kostrového svalstva, funkcie kostrového svalstva, biochemických markerov defektu svalstva alebo kvality života. Spôsoby merania hmoty kostrového svalstva u ľudských subjektov sú v odbore známe a zahrnujú napríklad: meranie obvodu končatiny; meranie sily svalstva napríklad počítačovou tomografiou, MRI alebo ultrazvukovou technikou; alebo svalová biopsia na preskúmanie morfologických a biochemických parametrov (napr. oblasť priečneho rezu vláknom, priemer vlákna alebo aktivity enzýmu). Pretože hmota kostrového svalstva koreluje s funkciou kostrového svalstva môže byť funkcia svalu používaná ako náhradný marker hmoty a zmeny svalovej hmoty sa môžu odhadnúť použitím merania funkcie, napr. pevnosti, sily skupiny synergistických svalov, alebo charakteristík kontrakcie zistených pri elektromyografických záznamoch. Navyše úbytok svalového proteínu v dôsledku svalovej atrofie sa môže odmerať kvantifikáciou hladín aminokyselín alebo derivátov aminokyselín, tzn. 3-metyl-histidínu, v moči alebo krvi subjektu. Ďalšie informácie o týchto metódach viď. Appell, Sports Med. 10:42-58 (1990). Meranie kvality života zahrnuje, ale nie je to nijako limitované, ľahkosť pri vstávaní zo stoličky, počet krokov pred zistením únavy alebo schopnosť zdolávať schody.

-49Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Konštrukcie vektorov na expresiu ľudského receptora CRF₂R

Získaná bola DNA-sekvencia ľudského CRF₂R (hCRF₂R), prístupové číslo E12752, a syntetizované boli dva oligonukleotidy, obsahujúce 5'-koniec génu začínajúceho na iniciačnom kodóne (5'-oligonukleotid) a jeden obsahujúci 3'koniec génu, obsahujúci terminačný kodón (3'-oligonukleotid). Tieto nukleotidy boli navrhnuté tak, aby obsahovali miesta pre reštrikčnú endonukleázu, ktoré sa inak nenachádzajú v géne hCRF₂R s jedným unikátnym miestom na 5'oligonukleotide a odlišným unikátnym miestom pre reštrikčnú endonukleázu v 3'-oligonukleotide. Navyše 3'-oligonukleotid obsahoval ďalšiu polyadenylačnú signálnu sekvenciu. Dvojreťazcová cDNA z ľudského kostrového svalstva bola zakúpená v Universal QUICK-Clone cDNA collection (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Použitím vyššie spomenutých 5'- a 3'-oligonukleotidov bol hCRF₂R amplifikovaný použitím PCR ľudskej cDNA kostrového svalstva pomocou súboru AdvanTaq PCR (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). PCR produkt génu hCRF₂R bol purifikovaný z PCR artefaktov elektroforézou na agarózovom géli a DNAfragment génu hCRF₂R bol purifikovaný z agarózového gélu použitím purifikačného produktu, napr. NueleoTrap (Clonetech I ne., Palo Alto, CA, USA).

Klonovanie PCR produktu hCRF₂R do vektora pIRESneo (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) bolo uskutočnené najprv rozštiepením PCR produktu hCRF₂R a vektoru pIRESneo príslušnými reštrikčnými endonukleázami tak, aby 5'- a 3'-miesta pre reštrikčnú endonukleázu bola pripravená na ligáciu. DNA vektora pIRESneo bola ligovaná do DNA PCR produktu hCRF₂R pomocou DNA-ligázy z AdvantAge™PCR Cloning Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) podľa doporučení výrobcu. Ligovaný vektor a inzertný konštrukt (plRESneo/hCRF₂R) sa potom používal na transformáciu TOP10F' kompetentných E. coli buniek (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Transformované bunky boli umiestnené na LB/X-gal/IPTG plus ampicilín obsahujúci agar. Biele kolónie (pozitívne klony) boli vybrané a individuálne kultivo-50vané v LB médiu. Plazmidová DNA bola izolovaná pomocou purifikačného systému NueleoBond DNA Purification System (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Inzert aspoň z jedného klonu bol sekvenovaný kvôli zaisteniu korektnej sekvencie hCRF₂R. Bunky HEK293 obsahujúce stabilný integrovaný plazmid Mercury CRE-LUC (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) boli transfektované purifikovanou DNA plRESneo/hCRF₂R so správnym sekvenčným inzertom pomocou CalPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Bunky stabilne transfektované plRESneo/hCRF₂R DNA boli vybrané kultiváciou buniek vG418. Stabilné transfektované bunky (bunky HEK293/CRELUC/plRESneo/hCRF₂R) boli propagované v DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA), roztok penicilínu/streptomycínu (Life Technologies, Rockville, MD), L-glutamín (Life Technologies, Rockville, MD) a neesenciálnu aminokyselinu (Life Technologies, Rockville, MD) pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Klony boli charakterizované z hľadiska väzby CRF a aktivácie CRELUC po expozícii CRF podľa spôsobu opísaného v príkladoch 2 a 3. Bunky exprimujúce receptor hCRF₂R v príslušných hladinách, a ktoré boli vhodne spojené s reportérovým systémom CRE-LUC, potom sa využili na ďalšiu analýzu.

Príklad 2

Analýza receptorovej väzby

Analýza väzby zlúčenín na receptor sa uskutočnila na celých bunkách zavedením buniek HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRF₂R z príkladu 1 na doštičku s 96 jamkami potiahnutou polylyzínom. Bunky boli naočkované v DMEM médiu obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum, roztok penicilínu/streptomycínu, Lglutamín a neesenciálnu aminokyselinu pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu a inkubované cez noc. Kultivačné médium bolo odstránené a bolo pridané príslušné množstvo CRF kovalentne značeného Európiom (Eu-CRF) v MEM (Life Technologies, Rockville, MD) + 10% Seablock (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Bunky boli inkubované Eu-CRF po dobu 90 minút pri teplote miestnosti, potom premyté (4x) fyziologickým roztokom

-51 tlmeným fosfátom bez horčíka a vápnika (Life Technologies, Rockville, MD). Po finálnom premytí sa pridal doplňujúci roztok (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) a doštička sa merala na čítacom prístroji Wallac (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) programom BioWorks Europium. Na analýzu saturácie väzby boli logaritmické dávky Eu-CRF v rozsahu od 10(-12) do 10(-3) M pridané do buniek a naviazanie bolo analyzované pri absencii aj prítomnosti saturačnej koncentrácie neznačeného CRF na stanovenie nešpecifickej väzby. Pre kompetitívnu väzbu sa pridalo Eu-CRF, ktorého bola polovina z maxima, z hľadiska naviazania okrem meniacich sa koncentrácií požadovanej zlúčeniny.

Príklad 3

Test aktivácie receptora

Analýza aktivácie receptora bola uskutočnená naočkovaním buniek HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRF₂R z príkladu 1 do Packard View Plate-96 (Packard Inc., CA). Bunky boli naočkované v DMEM médiu obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum, roztok penicilínu/streptomycínu, L-glutamín a neesenciálnu aminokyselinu pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu a inkubovanej cez noc. Médium bolo potom odstránené a nahradené DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujúceho 0,01% frakciu V bovinného albumínu (SIGMA, St. Louis, MO) obsahujúce požadovanú zlúčeninu. Bunky potom boli inkubované po dobu 4 hodín pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu, potom sa médium odstránilo a bunky sa premývali (2x) roztokom Hanks Balanced Sált Solution (Life Technologies, Rockville, MD). Do premytých buniek sa potom pridal Lysis Reagent (Promega Inc., Madison, Wl) a bunky boli inkubované po dobu 20 minút pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Bunky sa umiestnili pri teplote -80°C po dobu 20 minút. Následne sa uskutočnila 20 minútová inkubácia pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Po tejto inkubácii sa pridal Luciferázový testovací pufer a Luciferázový testovací substrát (Promega Inc., Madison, Wl) do bunkového lyzátu a aktivita luciferázy bola kvantifikovaná luminometrom. Relatívna aktivita zlúčeniny bola stanovená porovnaním prírastku

-52po expozícii zlúčeniny na hladine luciferázy v bunkách HEK, ktoré obsahovali konštrukt CRE-LUC bez hCRF₂R po expozícii zlúčeninou. Špecificita odpovede sa tiež vyskúšala stanovením luciferázovej odpovede buniek hCRF₂R/CRE-LUC na zlúčeninu za prítomnosti a absencii desaťnásobného prebytku antagonistu hCRF₂R.

Príklad 4

Skríning na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré predlžujú alebo zvyšujú aktiváciu CRF₂R a/alebo dráhy prenosu signálu receptora CRF₂R

Identifikácia zlúčenín, ktoré predlžujú alebo zvyšujú agonistom indukovanú aktiváciu CRF₂R alebo dráhy prenosu signálu CRF₂R zahrnuje obmenu testu aktivácie receptora podľa príkladu 3. Špecificky je tento test uskutočňovaný naočkovaním buniek HEK293/CRE-LUC/plRESneo/receptora hCRF₂R na doštičku Packard View Plate-96 (Packard Inc., CA). Bunky boli naočkované v DMEM médiu obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum, roztok penicilínu/streptomycínu, L-glutamín, neesenciálnu aminokyselinu a saturačné množstvo CRF pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu a inkubované po dobu 48 hodín. Médium sa potom odstránilo a okrem požadovanej zlúčeniny nahradenej DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujúcom 0,01% frakciu V bovinného albumínu (SIGMA, St. Louis, MO) a CRF. Bunky sa potom inkubovali po dobu 4 hodín pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitom a 95% vzduchu, potom sa médium odstránilo a bunky sa premývali (2x) roztokom Hanks Balanced Sált (Life Technologies, Rockville, MD). Do premytých buniek sa potom pridal Lysis Reagent (Promega Inc., Madison, Wl) a bunky boli inkubované po dobu 20 minút pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Bunky sa umiestnili pri teplote -80°C po dobu 20 minút, potom sa uskutočnila 20 minútová inkubácia pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Po tejto inkubácii sa pridal Luciferázový testovací pufer a Luciferázový testovací substrát (Promega Inc., Madison, Wl) do bunkového lyzátu a aktivita luciferázy bola kvantifikovaná luminometrom. Testované zlúčeniny, ktoré výrazne stimulovali fluorescenciu nad hladinami kontrolných neošetrovaných buniek, boli po korekcii na zmeny v bunkovej hustote

-53považované za potencionálne zlúčeniny na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva. Najlepšie zlúčeniny indukovali relatívne vyššie hladiny fluorescencie.

Príklad 5

Skríning s cieľom identifikácie potencionálnych zlúčenín špecifických pre CRF₂R Zlúčeniny, ktoré aktivujú CRF₂R sú identifikované spôsobom podľa príkladu 3. Na výber zlúčenín selektívnejších pre CRF₂R nad CRFjR, sa tiež uskutočnil skríning na CRF-iR. Bunky HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRFiR boli pripravené v podstate spôsobom podľa príkladu 1 okrem toho, že DNA-sekvencie ľudského CRFíR (hCRFjR), prístupové číslo X72304, bola používaná pre iniciálnu

PCR amplifikáciu. S cieľom určenia aktivity zlúčenín voči CRF-iR bol test aktivácie uskutočňovaný v podstate spôsobom podľa príkladu 3 okrem toho, že bunky HEKžgS/CRE-LUC/pIRESneo/hCRFjR sa používali na naočkovanie doštičiek. Množstvo fluorescencie stimulovanej zlúčeninou v bunkách exprimujúcich CRF₂R bolo porovnávané s množstvom fluorescencie stimulovanej zlúčeninou v bunkách exprimujúcich CRFíR. Zlúčeniny, ktoré vykazovali desaťnásobne väčšiu odpoveď (molárne) v bunkách exprimujúcich CRF₂R než v bunkách exprimujúcich CRFíR sa potom ďalej testovali na špecificitu odpovede na elimináciu rozdielov v dôsledku zmien pri klonovaní. Bunky HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRF₂R boli testované zlúčeninou za prítomnosti alebo pri absencii desaťnásobného prebytku antagonistu CRF₂R, antisauvagínu-30. Zlúčeniny, ktoré mali vyššiu než desaťnásobnú selektivitu pre CRF₂R, a ktorých aktivita bola inhibovaná antisauvagínom-30 boli vybrané ako potencionálne zlúčeniny.

Príklad 6

Skríning na identifikáciu potencionálnych zlúčenín, ktoré zvyšujú expresiu hCRF₂R Sekvencie obsahujúce promótorovu oblasť génu hCRF₂R v príslušnom tkanive, začínajúce dosť ďaleko v smere transkripcie od miesta iniciácie

-54transkripcie tak, aby obsahovala všetky regulačné elementy nevyhnutné na fyziologickú expresiu génu hCRF₂R, sa získala z databázy ľudského genómu. Syntetizovali sa dva oligonukleotidy, jeden obsahujúci 5-koniec promótorovej oblasti (5'-oligonukleotid) a jeden obsahujúci 3'-koniec promótorovej oblasti, zahrnujúce miesto počiatku transkripcie (3'-oligonukleotid). Tieto oligonukleotidy tiež obsahujú miesta pre reštrikčnú endonukleázu, ktoré nie sú v regulačnej oblasti génu hCRF₂R s jedným unikátnym miestom v 5'-oligonukleotide a rozdielnym unikátnym miestom pre reštrikčnú endonukleázu v 3'oligonukleotide. 5'- a 3'-oligonukleotidy sa používali na PCR amplifikáciu regulačnej oblasti génu hCRF₂R z ľudskej DNA (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) pomocou PCR súboru, Advantage®Genomic PCR kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). PCR produkt regulačnej oblasti génu hCRF₂R bol purifikovaný z PCR artefaktov elektroforézou na agarózovom géle a DNA-fragment oblasti regulačného génu hCRF₂R bol purifikovaný z agarózového gélu pomocou purifikačného produktu, napr. NueleoTrap (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Naklonovanie PCR produktu regulačnej oblasti génu hCRF₂R do vektora pECFP-1 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) sa uskutočnilo najprv štiepením PCR produktu regulačnej oblasti génu hCRF₂R a vektoru pECFP-1 príslušnými reštrikčnými endonukleázami tak, aby 5'- a 3'-míesta pre reštrikčné endonukleázy boli pripravené na ligáciu. Ligácia DNA vektora pECFP-1 do DNA PCR produktu regulačnej oblasti génu hCRF₂R bola uskutočnená DNA-ligázou z AdvantAge™PCR Cloning Kitu (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) podľa doporučení výrobcu. Ligovaný vektor a inzertový konštrukt sa potom používali na transformáciu TOP10F' kompetentných buniek E. coli (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Bunky sa naniesli na agar obsahujúci LB plus kanamycín a kolónie rezistentné voči kanamycínu sa vybrali na ďalšiu analýzu. Klony rezistentné voči kanamycínu boli kultivované v kanamycínovom médiu obsahujúcom LB a plazmidová DNA bola izolovaná pomocou purifikačného systému NueleoBond DNA Purification System (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) a konštrukt obsahujúci regulačnú oblasť génu hVPAC₂ sa analyzoval sekvenovaním DNA kvôli zabezpečeniu správnosti a integrity konštruktu. Purifikovaná plazmidová DNA konštruktu obsahujúca regulačnú oblasť génu hCRF₂R potom bola transfektovaná do buniek HEK293 použitím transfekcie sprostredkovanej

-55fosforečnanom vápenatým s CalPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Transfektované bunkové klony boli vybrané pomocou G418, izolované a propagované v DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA), roztok penicilínu/streptomycínu (Life Technologies, Rockville, MD), L-glutamín (Life Technologies, Rockville, MD), neesenciálnu aminokyselinu (Life Technologies, Rockville, MD) a G418 (Life Technologies, Rockville, MD) pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Klony rezistentné voči G418 boli charakterizované Southern blottingom či obsahujú promótorovu sekvenciu génu hCRFsR. Ďalej aktivácia regulačnej oblasti génu hCRF₂R bola analyzovaná použitím príslušného stimulačného agens. Bunky exprimujúce regulačnú oblasť-ECFP génu hCRF₂R v príslušných hladinách sa potom používali pri testoch určených na stanovenie zlúčenín, ktoré môžu modulovať aktivitu regulačnej oblasti génu hCRF₂R nasledovným spôsobom. Analýza aktivácie regulačnej oblasti bola uskutočnená naočkovaním buniek HEK293 obsahujúcich regulačné oblasti-ECFP génu hCRF₂R s príslušnou hustotou do 96 čiernych jamôk s čistým dnom v mikrotitračnej doštičke a bunky sa ponechali kultivovať cez noc. Nasledujúci deň bolo médium odstránené a testovaná zlúčenina bola pridaná v čerstvom rastovom médiu. Bunky boli inkubované po dobu 16 hodín pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu a následne sa uskutočnilo meranie fluorescencie (excitácia pri 433 (453) nm detekciou emisie pri 475 (501) nm použitím fluórometra (biolumin™ 960, Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N J). Testované zlúčeniny, ktoré stimulovali fluorescenciu výrazne nad hladinami kontrolných neošetrovaných buniek, boli po korekcii na zmeny bunkovej hustoty považované za potencionálne zlúčeniny na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva. Najzaujímavejšie boli zlúčeniny, ktoré indukovali relatívne vyššie hladiny fluorescencie.

Príklad 7

Skríning na identifikáciu zlúčenín, ktoré zvyšujú expresiu ľudského CRF

-56Spôsoby identifikácie zlúčenín, ktoré zvyšujú expresiu ľudského CRF (hCRF) boli v podstate rovnaké ako spôsoby identifikácie zlúčenín, ktoré zvyšujú expresiu receptora hVPAC2 okrem toho, že bola používaná regulačná oblasť pre gén hCRF. Sekvencie obsahujúce regulačnú oblasť génu hCRF, začínajúcu dosť ďaleko v smere od miesta iniciácie transkripcie tak, aby obsahovala všetky regulačné elementy nevyhnutné na fyziologickú expresiu génu hCRF₂R, v príslušnom tkanive bola získaná z databázy ľudského genómu. Syntetizované boli dva oligonukleotidy, jeden obsahujúci 5'-koniec regulačnej oblasti (5'oligonukleotid) a jeden obsahujúci 3-koniec regulačnej oblasti, zahrnujúce miesto začiatku transkripcie (3'-oligonukleotid). Tieto oligonukleotidy tiež obsahovali miesta pre reštrikčné endonukleázy, ktoré nie sú v regulačnej oblasti génu hCRF s jedným unikátnym miestom v 5'-oligonukleotide a odlišným unikátnym miestom pre reštrikčnú endonukleázu v 3'-oligonukleotidu. 5'- a 3'-oligonukleotidy sa používali na PCR amplifikáciu regulačnej oblasti génu hCRFR z ľudskej DNA (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) pomocou PCR súboru, Advantage®Genomic PCR kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). PCR produkt regulačnej oblasti génu hCRF sa purifikoval z PCR artefaktov elektroforézou na agarózovom géli a DNA-fragment oblasti regulačného génu hCRF sa purifikoval z agarózového gélu pomocou purifikačného produktu, napr. NucieoTrap (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Naklonovanie PCR produktu regulačnej oblasti génu hCRF do vektora pECFP-1 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) sa uskutočnilo najprv štiepením PCR produktu regulačnej oblasti génu hCRF a vektora pECFP-1 príslušnými reštrikčnými endonukleázami tak, aby 5'- a 3'-miesta pre reštrikčné endonukleázy boli pripravené na ligáciu. Ligácia DNA vektora pECFP-1 do DNA PCR produktu regulačnej oblasti génu hCRF sa uskutočnila DNA-ligázou z AdvantAge™PCR Cloning Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) podľa doporučenia výrobcu. Ligovaný vektor a inzertový konštrukt sa potom používali na transformáciu TOP10F' kompetentných buniek E. coli (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Bunky sa naniesli na agar obsahujúci LB plus kanamycín a kolónie rezistentné voči kanamycínu sa vybrali na ďalšiu analýzu. Klony rezistentné voči kanamycínu sa kultivovali v kanamycínovom médiu obsahujúcom LB a plazmidová DNA bola izolovaná pomocou purifikačného systému

-57NucIeoBond DNA Purification System (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) a konštrukt obsahujúci regulačnú oblasť génu hCRF sa analyzoval sekvenovaním DNA kvôli zaisteniu správnosti a integrity konštruktu. Purifikovaná plazmidová DNA konštruktu obsahujúca regulačnú oblasť génu hCRF potom bola transfektovaná do buniek HEK293 použitím transfekcie sprostredkovanej fosforečnanom vápenatým s CalPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA.USA). Transfektované bunkové klony boli vybrané pomocou G418, izolované a propagované v DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA), roztok penicilínu/streptomycínu(Life Technologies, Rockville, MD), Lglutamín (Life Technologies, Rockville, MD), neesenciálnu aminokyselinu (Life Technologies, Rockville, MD) a G418 (Life Technologies, Rockville, MD) pri teplote 37°C v atmosfére 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Klony rezistentné voči G418 boli charakterizované Southern blottingom či obsahujú sekvenciu regulačnej oblasti génu hCRF. Ďalej aktivácia regulačnej oblasti génu hCRF bola analyzovaná použitím príslušného stimulačného agensu. Bunky exprimujúce regulačnú oblasť-ECFP génu hCRF v príslušných hladinách sa potom používali pri testoch určených na stanovenie zlúčenín, ktoré môžu modulovať aktivitu regulačnej oblasti génu hCRF nasledujúcim spôsobom. Analýza aktivácie regulačnej oblasti sa uskutočnila spôsobom podľa príkladu 5 okrem toho, že boli používané klony obsahujúce konštrukt regulačnej oblasti génu hCRF.

Príklad 8

Spôsob prípravy ľudských protilátok, ktoré aktivujú hCRF

Kompletne ľudské monoklonálne protilátky, ktoré aktivujú hCRF, boli pripravené najprv vytvorením rekombinantného proteínu hCRF₂R nasledovným spôsobom. Na prípravu PCR produktu hCRF₂R sa použil spôsob podľa príkladu

1. Tento PCR produkt hCRF₂R sa potom naklonoval do vektora pHAT20 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) najprv štiepením PCR produktu génu hCRF₂R a vektoru pHAT20 príslušnými reštrikčnými endonukleázami tak, aby 5'- a 3'-miesta pre reštrikčné endonukleázy boli pripravené na ligáciu. Ligácia DNA vektora

-58pHAT20 do DNA PCR produktu génu hCRF₂R sa uskutočnila DNAligázou z AdvantAge™PCR Cloning Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) podľa doporučení výrobcu. Ligovaný vektor/inzertový konštrukt sa potom použil na transformáciu TOP10F' kompetentných buniek E. coli (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Transformované bunky sa naniesli na agar obsahujúci LB plus ampicilín a kolónie rezistentní voči ampicilínu sa vybrali na ďalšiu analýzu. Pozitívne klony boli kultivované v LB médiu obsahujúcom ampicilín a plazmidová DNA bola izolovaná pomocou purifikačného systému NueleoBond DNA Purification System (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA) a konštrukt obsahujúci gén hCRF₂R bol analyzovaný sekvenovaním DNA kvôli zaisteniu správnosti a integrity konštruktu. DNA vektora hCRF₂R-pHAT20 sa potom používala na ďalšie PCR klonovanie využitím 5'-oligonukleotidu obsahujúceho počiatočnú sekvenciu HAT a unikátne miesto reštrikčnej endonukleázy nenachádzajúcu sa v konštrukte hCRF₂R-pHAT20 a 3'-hCRF₂R-oligonukleotide použitého predtým. Oligonukleotidové priméry sa používali na PCR amplifikáciu fúzneho génu HAThCRF₂R z konštruktu HAT-hCRF₂R a PCR produkt sa purifikoval vyššie uvedeným spôsobom. PCR produkt fúzneho génu HAT-hCRF₂R sa potom využíval na klonovanie do vektora pBacPAK8 využitím bakulovírusového expresného systému BacPAK od firmy Clonetech (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Ligácia fúzneho génu HAT-hCRF₂R do vektora pBacPAKS je v podstate rovnaká ako vyššie opísaná ligácia. Konštrukt hCRF₂R/HAT-pBacPAK8 sa potom transfektoval do TOP10T kompetentných buniek E. coli. Boli vybrané bunky rezistentné voči ampicilínu a plazmidová DNA bola izolovaná a skúšaná z hľadiska integrity konštruktu podľa vyššie opísaného spôsobu. Tento konštrukt bol potom kotransfektovaný s linearizovaným BacPAK6 DNA do Sf21 hostiteľských buniek hmyzu využitím CaiPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Hmyzie bunky potom boli inkubované počas 2-3 dní a vírus sa zbieral z jednotlivých čistých plakov. Ďalej sa vírus amplifikoval v bunkách Sf21 využitím BacPAK Insect Celí Média, pričom sa všetko uskutočnilo podľa odporučení výrobcov (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, USA). Rekombinantný fúzny proteín HAT-CRF₂R sa potom purifikoval purifikačnou súpravou TALÓN® CelIThru od firmy Clonetech (Clonetech Inc.,

-59Palo Alto, CA, USA) za podmienok odporučených výrobcom. Infikované bunky Sf21 sa zbierali 48 hodín po infekcii a sonikovali v extrakčnom/nanášacom pufri. Bunkový lyzát sa potom pretiahol cez stĺpec TALÓN® CelIThru. Stĺpec sa premýval (2x) extrakčným/nanášacím pufrom a naviazaný proteín HAT-hCRF₂R sa eluoval eluačným pufrom. Eluovaný proteín sa analyzoval SDS-PAGE z hľadiska integrity a koncentrácia proteínu sa kvantifikovala systémom Bio-Rad SDS-PAGE a proteínovým kvantifikačným systémom podľa doporučení výrobcu (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca). Purifikovaný fúzny proteín HAT-hCRF₂R sa potom používal kvôli imunizácii zvierat XenoMouse (Abgenix Inc., Frernont, CA) so zámerom produkcie ľudskej monoklonálnej protilátky nasledovným spôsobom. Na vakcináciu 10 XenoMouse zvierat sa niekoľkokrát počas ôsmich týždňov použilo 10 pg purifikovaného rekombinantného fúzneho proteínu HAThCRF₂R spolu s 25 pg adjuvancií monofosforylu A (Sigma, St. Louis, MO). Z vakcinovaných zvierat sa získalo sérum a používalo pri ELISA technike s vychytávaním antigénu využívajúci purifikovaný fúzny proteín HAT-hCRF₂R na detekciu protilátok voči proteínu HAT-hCRF₂R potiahnutím ELISA doštičiek polystyrénom (Corning Glass Works, Corning, NY) fúznym proteínom HAT-hCRF₂R a reakcia bola zastavená PBS-1% BSA, premývaná a inkubovaná pri teplote 37°C počas 1 hodiny so zriedením sérových vzoriek 1:50. Po premytí (5x) PBS boli doštičky inkubované pri teplote 37°C počas 1 hodiny kozími protilátkami konjugovanými k alkalickej fosfatáze, kde tieto protilátky sú proti ľudskému imunoglobulínu G. Doštičky boli potom premývané (5x) PBS a protilátky detekované p-nitrofenylovým fosfátovým substrátom (Sigma, St. Louis, MO) v pufre. Merané boli optické hustoty pri 405 nm na počítacom prístroji a signál sa kvantifikoval. Myši s vysokou produkciou protilátky sa používali na hybridómovú technológiu. Hybridómy boli vytvorené fúziou slezinných buniek z XenoMouse zvierat s nesekrétujúcou myelómovou bunkovou líniou NSA-bcI 2 pri pomere slezinnej bunky ku NSA-bcl2 bunky (4:1) v prítomnosti 30% polyetylénglykolu PEG1450. Kondenzované bunky boli individuálne klonované limitným riedením do doštičiek s 96 jamkami a kultivované v RPMI-1640 médiu obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum, neesenciálne aminokyseliny, pyruvát sodný, Lglutamín, 10 u/ml penicilín-streptomycínu a hypoxantín-aminopterín-tymidínu

-60(všetko od Life Technologies, Rockville, MD). Uskutočnil sa skríning supernatantov z hypoxantín-aminopterín-tymidínových vybraných hybridómov na produkciu ľudskej protilátky vyššie opísanou ELISA technikou. Hybridómy, ktoré produkovali ľudské protilátky proti fúznemu proteínu HAT-hCRF₂R boli vybrané na produkciu protilátky vo veľkom rozsahu. Monoklonálne protilátky sa purifikovali chromatografiou na Protein G-Sepharose. Supernatant z kultivovaných hybridómových klonov sa naniesol na stĺpec Protein G-Sepharose (SIGMA, St. Louis, MO) v nanášacom pufre, premývaný (3x) a IgG sa eluoval eluačným pufrom. Tieto protilátky sa potom používali na skríning na stanovenie aktivačného potenciálu (agonizmu) hCRF₂R, čo sa uskutočnilo spôsobom podľa príkladu 3. Tie ľudské monoklonálne protilátky, ktoré vykazovali agonistickú aktivitu voči hCRF₂R boli označené ako potencionálne zlúčeniny.

Príklad 9

Stanovenie absolútnej sily svalstva

Extenzor digitorum longus (EDL) a šikmý lýtkový sval boli odstránené medzi šľachami z fixovanej končatiny myši. Hodvábna sutúra bola priviazaná ku každej tendinis z izolovaného svalstva a svaly boli vložené do komory z plexiskla vyplnené Ringerovým roztokom (137 mM chlorid sodný, 24 mM hydrogénuhličitan sodný, 11 mM glukóza, 5 mM chlorid draselný, 1 mM síran horečnatý, 1 mM fosforečnan sodný, 0,025 mM tubokurarín, všetky s pH 7,4 a oxygenované 95% kyslíkom a 5% oxidom uhličitým) neustále prebublávaným 95% kyslíkom a 5% oxidom uhličitým pri teplote 25°C. Svaly boli orientované horizontálne medzi servomotorické rameno páky (Model 305B-LR Cambridge Technology Inc., Watertown MA, USA) a nerezovou oceľovou platinu snímača sily (Model BG-50; Kulite Semiconductor Products Inc., Leonia, NJ, USA) a pole stimulované pulzmi transmitovanými medzi dvomi platinovými elektródami umiestnenými pozdĺž na ktorejkoľvek strane svalstva. Pravouhlé pulzy (dĺžka 0,2 ms) generované osobným počítačom s Labview board (Model PCI-MIO 16E-4), Labview Inc., Austin, TX, USA) boli amplifikované (Acurus power amplifier model A25, Dobbs Ferry, NY, USA) kvôli zvýšeniu titanickej kontrakcie. Stimulácia napätia a dĺžky svalstva (Lo) bola upravená tak, aby sa získala maximálna izometrická

- 61 sila v zovretí. Maximálna produkcia titánovej sily (Po) bola stanovená z hladiny vzťahu frekvencia-sila.

Príklad 10

Terapeutické ošetrenie atrofie kostrového svalstva ľudskou protilátkou, ktorá je agonistom receptora hCRF₂R.

Ľudský mužský subjekt vážiaci 50 kg s výraznou svalovou atrofiou ramien a nôh v dôsledku dlhého kľudu na lôžku bol liečený z hľadiska reverzie atrofie kostrového svalstva. Raz za každý týždeň počas 3 mesiacov sa subjektu podávalo intravenóznou injekciou 15 ml vodného roztoku s pH 6 obsahujúceho aktivujúcu protilátku receptora CRF2R. Roztok obsahoval nasledovné zložky:

Zložka_Koncentrácia (mg/ml)

Agonistická protilátka receptora CRF₂R 20

L-histidín-hydrochlorid 0,47

L-histidín 0,3

Dihydrát α,α-trehalózy 20

Polysorbát 20 0,1

Bakteriostatická sterilná voda do 1 ml

Na záver ošetrenia subjekt vykazoval merateľné prírastky svalovej hmoty, sily a mobility ramien a nôh.

Príklad 11

Profylaktické ošetrenie atrofie kostrového svalstva ľudskou protilátkou, ktorá je agonistom receptora hCRF₂R

Ľudský samičí subjekt vážiaci 55 kg sa podrobil chirurgickému odstráneniu bedrového kĺbu v prvom mesiaci. Subjekt bol ošetrovaný so zámerom zvýšenia hmoty kostrového svalstva pred a po chirurgickom zákroku na efektívne zníženie hladiny atrofie kostrového svalstva v dôsledku nečinnosti svalstva

-62počas post-chirurgickej normalizácie. Špecificky raz za každý týždeň počas 1 mesiaca pred chirurgickým zákrokom a počas 2 mesiacov po chirurgickom zákroku sa subjektu intravenóznou injekciou podávalo 18 ml vodného roztoku s pH 6,0 obsahujúcom aktivačnú protilátku receptora CRF₂R. Roztok obsahoval nasledovné zložky:

Zložka	Koncentrácia ímq/ml)
Aktivujúca protilátka CRF2R	20
L-histidín-hydrochlorid	0,47
L-histidín	0,3
Dihydrát α,α-trehalózy	20
Polysorbát 20	0,1
Bakteriostatická sterilná voda	do 1 ml

Na záver ošetrenia subjekt vykazoval merateľné zachovanie svalovej hmoty, sily a mobility ramien a nôh pri porovnaní so stavom subjektu, ktorý bol očakávaný bez terapie protilátkou.

Príklad 12

Profylaktické ošetrenie atrofie kostrového svalstva ľudskou protilátkou, ktorá je agonistom receptora CRF₂R

Ľudskému samičiemu subjektu vážiacemu 45 kg bola vykonaná fixácia na ošetrenie jednoduchej zlomeniny ramennej kosti spôsobenej pádom. Subjekt bol ošetrovaný so zámerom prevencie atrofie kostrového svalstva zasiahnutej paže a ramena v dôsledku nečinnosti a obmedzeného používania počas hojenia zlomeniny. Špecificky raz za každý týždeň počnúc dňom fixácie sa subjektu intravenóznou injekciou podávalo 13 ml roztoku s pH 6,0 obsahujúceho receptor anti-hCRF₂R. Roztok obsahoval nasledovné zložky:

Zložka_Koncentrácia (mg/ml)

Aktivačná protilátka CRFR L-histidín-hydrochlorid

0,47

L-histidín	0,3
Dihydrát α,α-trehalózy	20
Polysorbát 20	0,1
Bakteriostatická sterilná voda	do 1 ml

Na záver ošetrenia subjekt vykazoval merateľné zachovanie svalovej hmoty, sily a mobility zasiahnutej paže a ramena a znížený priebeh fyzickej terapie pri porovnaní so stavom subjektu, ktorý sa očakával a to aj bez terapie protilátkou.

Príklad 13

Profylaktické ošetrenie atrofie kostrového svalstva urokortínom-ll

Ľudský samičí subjekt vážiaci 60 kg bol prijatý do nemocnice v komatóznom stave. Subjekt bol ošetrovaný týmto spôsobom kvôli prevencii atrofie kostrového svalstva celého tela v dôsledku nečinnosti v komatóznom stave. Špecificky sa raz za každý deň počas kómy subjektu podávalo pomalou intravenóznou infúziou približne 500 ml vodného roztoku, ktorý bol pripravený pridaním 5 ml nasledovného zásobného roztoku do 500 ml sterilného fyziologického roztoku:

Zložka_Koncentrácia (mg/ml)

Urokortin-ll 12

Pufer fosforečnanu sodného, pH 7,4 140

Po ošetrení subjekt vykazoval merateľné zachovanie hmoty a funkcie kostrového svalstva a zníženú fyzickú terapiu potrebnú počas kómy a po rekuperácii vedomia pri porovnaní so stavom subjektu, ktorý sa očakával bez terapie protilátkou.

Príklad 14

Terapeutické ošetrenie pacienta s Duchenneovou svalovou dystrofiou pomocou CRF

-64Samčí subjekt vážiaci 40 kg s jestvujúcou diagnózou na Duchenneovu svalovú dystrofiu bol ošetrovaný zlúčeninou, ktorá vykazovala agonizmus CRF-1 a CRF-2 v podobnom rozsahu dávok. Subjekt bol ošetrovaný depotnou formou zlúčeniny s trvalým uvoľňovaním kvôli zlepšeniu alebo udržaniu sily a funkcie svalstva počas progresie ochorenia. Špecificky sa raz za každý mesiac subjektu podávalo pomalou intramuskulárnou injekciou 3 ml vodného roztoku s pH 6,0 obsahujúceho nasledovné zložky:

Zložka_Koncentrácia (mg/ml)

CRH (hormón uvoľňujúci kortikotropín) 4

Kopolymér D,L-mliečnej a glykolovej kyseliny 5

Po ošetrení subjekt vykazoval buď zlepšenie alebo atenuáciu poklesu sily alebo funkcie svalstva vo vyhodnoteniach z hľadiska času pri porovnaní s tými znakmi, ktoré vykazoval počas prirodzenej progresie ochorenia.

Predložený vynález nie je obmedzený rozsahom opísaných špecifických uskutočnení, ktoré sú myslené výhradne ako ilustrácia konkrétnych aspektov predloženého vynálezu, a funkčne ekvivalentné spôsoby a komponenty patriace do rozsahu predloženého vynálezu, čo zahrnuje, ale nie je to nijako limitované, druhy testovaných zvierat, povahu a typ agonistov CRFR, pohlavie zvieraťa, model atrofie, spôsob aktivácie CRFR, zahrnujúce genetické metodológie, atď. Rôzne modifikácie predloženého vynálezu okrem tých, ktoré sú uvedené a opísané, budú zrejmé odborníkom v odbore po prečítaní vyššie uvedeného popisu a s tým súvisiacich obrázkov. Tieto modifikácie patria do rozsahu priložených patentových nárokov.

Priemyselná využiteľnosť

Použitím CRFR podľa predloženého vynálezu možno identifikovať zlúčeniny, ktoré je možné využiť pri liečení atrofie kostrového svalstva a alebo na indukciu hypertrofie kostrového svalstva.

Claims (31)

1. Patentové nároky

   1. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva, vyznačujúci sa tým, že:

   (a) sa uvedie testovaná zlúčenina do kontaktu s CRF₂R;

   (b) sa určí, či sa testovaná zlúčenina viaže na CRF₂R; a (c) sa identifikujú tie testované zlúčeniny, ktoré sa viažu na CRF₂R ako potencionálne zlúčeniny na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva.
2. 2. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva, vyznačujúci sa tým, že:

   (a) sa uvedie testovaná zlúčenina do kontaktu s bunkou exprimujúcou funkčný CRF₂R;

   (b) sa určí, či sa testovaná zlúčenina viaže na CRF₂R; a (c) sa identifikujú tie testované zlúčeniny, ktoré aktivujú CRF₂R ako potencionálne zlúčeniny na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva.
3. 3. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že sa vytvorí zoznam potencionálnych zlúčenín.
4. 4. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že sa CRF₂R exprimuje na eukaryotickej bunke.
5. 5. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že CRF₂R má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je viac než z 80% zhodná so sekvenciou id. č. sek.: 10.

   -666. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že CRF₂R má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je viac než z 90% zhodná so sekvenciou id. č. sek.: 10.
6. 7. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že CRF₂R má aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcej aminokyselinovej sekvencii id. č. sek.: 10, id. č. sek.: 12, id. č. sek.: 14, id. č. sek.: 18, id. č. sek.: 20, id. č. sek.: 24, id. č. sek.: 26, id. č. sek.: 32 alebo id. č. sek.: 38.
7. 8. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že CRF₂R je z druhu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z ľudí, myší alebo potkanov.
8. 9. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že CRF₂Rje ľudského pôvodu.
9. 10. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 4 v bunke s bunkovou hladinou cAMP, pri ktorej sa určuje, či testovaná zlúčenina aktivuje CRF₂R, vyznačujúci sa tým, že sa meria hladina bunkového cAMP.
10. 11. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že bunka ďalej zahrnuje reportérový gén operatívne asociovaný s responzívnym elementom cAMP a pri meraní hladiny bunkového cAMP sa meria expresia reportérového génu.
11. 12. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že reportérový gén je alkalická fosfatáza, chloramfenikolacetyltransferáza, luciferáza, glukuronidsyntetáza, rastový hormón, placentárna alkalická fosfatáza alebo Green Fluorescent Proteín.

    -6713. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva, vyznačujúci sa tým, že v akomkoľvek poradí:

    (a) sa uvedie testovaná zlúčenina do kontaktu s bunkou exprimujúcou funkčný CRF₂R a určí sa úroveň aktivácie CRF₂R v dôsledku testovanej zlúčeniny;

    (b) sa uvedie testovaná zlúčenina do kontaktu s bunkou exprimujúcou funkčný CRF₂R a určí sa úroveň aktivácie CRFíR v dôsledku testovanej zlúčeniny; potom (c) sa porovná hladina aktivácie CRF₂R a hladina aktivácie CRFíR;

    (d) sa identifikujú tie testované zlúčeniny, ktoré vykazujú podobnú aktivitu voči CRF₂R a CRFíR alebo vykazujú selektivitu pre CRF₂R ako potencionálne zlúčeniny na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva.
12. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m, že potencionálna zlúčenina vykazuje stonásobnú alebo ešte väčšiu selektivitu pre CRF₂R.
13. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že potencionálna zlúčenina vykazuje tisícnásobnú alebo ešte väčšiu selektivitu pre CRF₂R.
14. 16. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m, že potencionálna zlúčenina vykazuje selektivitu pre CRF₂R v rozsahu jednonásobku až stonásobku.
15. 17. Spôsob identifikácie potencionálnych terapeutických zlúčenín zo skupiny jednej alebo viacerých potencionálnych zlúčenín, u ktorých bola vopred určená ich väzba na CRF₂R alebo aktivácia CRF₂R, vyznačujúci sa tým že:

    (a) sa podá potencionálna zlúčenina nehumánnemu zvieraťu;

    (b) sa určí, či potencionálna zlúčenina reguluje hmotu alebo funkciu kostrového svalstva u ošetrovaného zvieraťa.

    -6818. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín, ktoré predlžujú alebo zvyšujú aktiváciu CRF₂R alebo dráhu prenosu signálu CRF₂R indukovanú agonistom, vyznačujúci sa tým, že v akomkoľvek poradí alebo súčasne:

    (a) sa uvedie testovaná zlúčenina do kontaktu s bunkou exprimujúcou funkčný CRF₂R;

    (b) sa bunky ošetrujú agonistom CRF₂R dostatočný čas a v dostatočnej koncentrácii k desenzibilizáciu CRF₂R v kontrolných bunkách;

    (c) sa určí hladina aktivácie CRF₂R; a (d) sa identifikujú tie testované zlúčeniny, ktoré predlžujú alebo zvyšujú aktiváciu CRF₂R alebo dráhu prenosu signálu CRF₂R ako potencionálne zlúčeniny na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva.
16. 19. Spôsob identifikácie potencionálnych terapeutických zlúčenín zo skupiny jednej alebo viacerých potencionálnych zlúčenín, u ktorých sa vopred určilo, že predlžujú alebo zvyšujú aktiváciu CRF₂R alebo dráhu prenosu signálu CRF₂R, vyznačujúci sa tým, že:

    a) sa podá potencionálna zlúčenina spolu s agonistom CRF₂R nehumánnemu zvieraťu; a

    b) sa stanoví, či potencionálna zlúčenina reguluje hmotu alebo funkciu kostrového svalstva u ošetrovaného zvieraťa.
17. 20. Spôsob identifikácie potencionálnych zlúčenín na zvýšenie expresie CRF₂R alebo CRF, vyznačujúci sa tým, že:

    (a) sa uvedie testovaná zlúčenina do kontaktu s bunkou alebo bunkovým lyzátom obsahujúcim reportérový gén operatívne asociovaný regulačným elementom CRF₂R alebo regulačným elementom CRF;

    (b) sa detekuje expresia reportérového génu; a

    -69(c) sa identifikujú tie testované zlúčeniny, ktoré zvyšujú expresiu reportérového génu ako potencionálne zlúčeniny na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva.
18. 21. Spôsob zvýšenia hmoty alebo funkcie kostrového svalstva subjektu, u ktorého je takéto zvýšenie žiadúce, vyznačujúci sa tým, že:

    (a) sa identifikuje subjekt, u ktorého je zvýšenie hmoty alebo funkcie žiadúce; a (b) sa podá bezpečné a účinné množstvo agonistu CRF₂R subjektu.
19. 22. Spôsob ošetrenia atrofie kostrového svalstva subjektu, pri potrebe takéhoto ošetrenia, vyznačujúci sa tým, že:

    (a) sa identifikuje subjekt pri potrebe ošetrenia atrofie kostrového svalstva;

    (b) sa podá bezpečné a účinné množstvo zlúčeniny vybranej zo skupiny pozostávajúcej z agonistu CRF₂R, expresného vektora kódujúceho funkčný CRF₂R, expresného vektora kódujúceho konštitučné aktívny CRF₂R, expresného vektora kódujúceho CRF a zlúčeniny zvyšujúcej expresiu CRF₂R alebo CRF subjektu.
20. 23. Spôsob ošetrenia atrofie kostrového svalstva podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že zlúčenina je agonista CRF₂R.
21. 24. Spôsob ošetrenia atrofie kostrového svalstva podľa nároku 23, kde agonista CRF₂Rje identifikovaný spôsobom identifikácie potencionálnych zlúčenín na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva, vyznačujúci sa f ý m, že:

    (a) sa uvedie testovaná zlúčenina do kontaktu s CRF₂R, (b) sa určí, či testovaná zlúčenina aktivuje CRF₂R;

    (c) sa identifikujú tie testované zlúčeniny, ktoré aktivujú CRF₂R ako potencionálne zlúčeniny na reguláciu hmoty alebo funkcie kostrového svalstva.

    -70
22. 25. Spôsob ošetrenia atrofie kostrového svalstva podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že agonista CRF₂R je chimérická alebo ľudská protilátka.
23. 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že agonista CRF₂R je selektívnejší pre CRF₂R než pre CRFiR.
24. 27. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že agonista CRF₂R vykazuje selektivitu pre CRF₂R väčšiu alebo rovnú stonásobku.
25. 28. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že subjekt má svalovú dystrofiu a agonista CRF2R vykazuje selektivitu pre CRF2R v rozsahu od jednonásobku po stonásobok.
26. 29. Spôsob ošetrenia atrofie kostrového svalstva podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že sa podá bezpečné a účinné množstvo zlúčeniny, ktorá predlžuje alebo zvyšuje aktiváciu CRF₂R alebo aktiváciu dráhy prenosu signálu CRF₂R subjektu.
27. 30. Purifikovaná protilátka špecifická pre CRF₂R, ktorá je chimérická alebo ľudská protilátka.
28. 31. Protilátka podľa nároku 30, ktorá je agonista CRF₂R.
29. 32. Protilátka podľa nároku 31, ktorá je ľudská protilátka.
30. 33. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (a) bezpečné a účinné množstvo agonistu CRF₂R; a (b) farmaceutický prijateľný nosič.

    -7134. Farmaceutický prípravok podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že agonista CRF₂R je chimérická alebo ľudská protilátka špecifická pre CRF₂R.
31. 35. Farmaceutický prípravok podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že agonista CRF₂R je urokortin II.