CZ20032395A3 - Metoda identifikace sloučenin regulujících svalovou hmotu - Google Patents
Metoda identifikace sloučenin regulujících svalovou hmotu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20032395A3 CZ20032395A3 CZ20032395A CZ20032395A CZ20032395A3 CZ 20032395 A3 CZ20032395 A3 CZ 20032395A3 CZ 20032395 A CZ20032395 A CZ 20032395A CZ 20032395 A CZ20032395 A CZ 20032395A CZ 20032395 A3 CZ20032395 A3 CZ 20032395A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- crf
- skeletal muscle
- compounds
- compound
- potential
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
- G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Description
Předložený vynález se týká způsobů identifikace potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva nebo regulaci aktivity nebo exprese receptorů faktoru-2 uvolňujícího kortikotropin (CRF2R). Předložený vynález se také týká způsobů léčení atrofie kosterního svalstva nebo způsobů indukce hypertrofie kosterního svalstva použitím CRF2R jako cíle pro intervenci a způsobů léčení svalové dystrofie použitím CRF2R a receptorů faktoru-1 uvolňujícího kortikotropin (CRF1R) jako cílů.
Dosavadní stav techniky
CRFR a ligandy
Existují dva receptory faktoru uvolňujícího kortikotropin, v současnosti označované (CRF1R a CRF2R), které patří do skupiny s G-proteinem spřažených receptorů (GPCR). Agonistou provedená aktivace CRF1R nebo CRF2R vede k aktivaci Gas adenylátcyklázy. Adenylátcykláza katalyzuje tvorbu cAMP, který následně účinkuje mnoha způsoby, zahrnující aktivaci proteinkinázy A, intracelulární uvolňování vápníku a aktivaci mitogen-aktivované proteinkinázy (MAP kináza). V dalších studií naznačuje zvýšení syntézy intracelulárního inositoltrifosfátu po agonistou provedené aktivaci receptorů CRF, že CRFR se také spřahují s Gaq.
Byly klonovány CRF^ a CRF2R z lidí, potkanů, myší, slepic, krav, sumců, žab a ovcí. Každá zCRFiR a CRF2R má unikátní distribuční systémy. Byly klonovány tři lidské izoformy receptorů CRF2R a to: alfa, beta a gamma. U krys byla identifikována homologa pro alfa a beta CRF2R.
• ·
-2Je známo několik ligandů/agonistů CRFR. Faktor uvolňující kortikotropin (nebo hormon, CRF nebo CRH) se váže na receptor a aktivuje tak CRFtR a CRF2R. CRF je hlavní modulátor tělesných odpovědí na stres. Tento peptid o 41 aminokyselinách dohlíží na kompletní neuronální, endokrinní a imunní procesy jako primární regulátor hypotalamické-pituitární-adrenální hormonální osy (HPA osy). Navíc existuje výrazná sekvenční homologie mezi CRF a peptidem z obojživelníků, sauvaginem, jakož i telostianským peptidem, urotensinem, kde oba působí jako agonisté CRF^ a CRF2R. Tyto tři peptidy mají podobné biologické vlastnosti jako hypotenziva a sekretagoga ACTH. Navíc byla charakterizována savčí obdoba urotensinu a to urokortin.
Receptory CRF mohou být velmi důležité, počínaje non-CRFR a konče farmakologickým použitím receptor-selektivních agonistů a antagonistů. Tyto selektivní agonisté a antagonisté zároveň s myší s knockoutovaným CRFR byly použitelní při stanovení, který receptor CRF zprostředkovává specifické biologické odpovědi.
Funkce CRF1R byla celkem přijatelně definována. Myši bez genu CRF-iR (myši s knockoutovaným CRF-iR) vykazovaly porušenou stresovou odpověď a snížené anxiózní chování. CRF^ je hlavní mediátor HPA osy. Konkrétně, faktor uvolňující kortikotropin, který je uvolňován z hypothalamu a transportován do adenohypofýzy přes hypothalamický-hypofyzární portální systém, interaguje sCRF^ přítomném na buňkách lokalizovaných v adenohypofýze. Agonistou provedená aktivace CRF1R vede k uvolnění ACTH z buněk adenohypofýzy do systémové cirkulace. Uvolněný ACTH se váže na receptor ACTH přítomný na buňkách lokalizovaných v kůře nadledvin, což vede k uvolnění adrenálních hormonů, včetně kortikosteroidů. Kortikosteroidy zprostředkovávají velké množství účinků, zahrnujících, ale není to nikterak limitováno, supresi imunitního systému mechanizmem, který zahrnuje tymickou a slezinnou atrofii. Aktivace CRF^ tedy nepřímo vede k potlačení imunitního systému aktivací HPA osy.
Avšak funkce CRF2R je známa méně. Myši bez genu CRF2R (myši s knockoutovaným CRF2R) měly porušenou redukci příjmu potravy po stimulaci urokortinem, chybějící vazodilataci, ale uchovaly si normální stresovou odpověď.
• · • « · · · · ··· a ···· ·· · · · · · • · ·····*· ···· ·· ··· ·· ·♦ ··
-3Experimenty s CRF2R ukázaly, že CRF2R je odpovědný za hypotenzivní/vazodilatační účinky agonistů CRFR a redukci příjmu potravy pozorovanou po ošetření myší agonisty CRFR.
Atrofie a hypertrofie kosterního svalstva
Kosterní svalstvo je ohebná tkáň, která se snadno adaptuje na změny podle fyziologických požadavků pro práci nebo podle metabolické potřeby. Hypertrofie je nárůst hmoty kosterního svalstva, zatímco atrofie kosterního svalstva je jeho úbytek. Akutní atrofie kosterního svalstva vzniká v důsledku různých příčin, které zahrnují, ale není to nikterak limitováno: nečinnost v důsledku chirurgického zákroku, klidu na lůžku nebo zlomených kostí; denervace/poškození nervů v důsledku poranění míchy, autoimunní choroby nebo infekčních nemocí; použití glukokortikoidů pro nesouvisející stavy; sepsi v důsledku infekce nebo jiných příčin; limitaci živinami v důsledku nemoci nebo hladovění; a vesmírné lety. Atrofie kosterního svalstva se vyskytuje u normální biologických procesů, nicméně při určitých lékařských stavech vedou tyto normální biologické procesy k zeslabující úrovni svalové atrofie. Například akutní atrofie kosterního svalstva představuje výrazné omezení rehabilitace pacientů z imobilizace, zahrnující, ale není to nikterak limitováno, imobilizace doprovázející ortopedické procedury. V takových případech je doba rehabilitace potřebná k inverzi atrofie kosterního svalstva často mnohem delší než doba potřebná k vyléčení původního poranění. Taková akutní atrofie z nečinnosti je celkem velkým problém u starších pacientů, kteří v souvislosti s věkem již mohou trpět výrazným deficitem funkce a hmoty svalů, a proto tato atrofie může vést k trvalé invaliditě a předčasnému úmrtí.
Atrofie kosterního svalstva může být také důsledkem chronických stavů, např. rakovinné kachexie, chronického zánětu, kachexie spojené sAIDS, chronického obstruktivního onemocnění plic (COPD), městnavého srdečního selhání, genetických poruch, např. svalové dystrofie, neurodegenerativních onemocnění a sarkopenie (se stářím spojený úbytek svalstva). Při těchto
» ··
-4chronických stavech může vést atrofie kosterního svalstva k předčasnému úbytku mobility, a tím přispívat k morbiditě související s nemocí.
Málo je známo o molekulárních procesech, které řídí atrofii nebo hypertrofii kosterního svalstva. I když spouštěcí podnět atrofie kosterního svalstva je odlišný od jiných případů spouštějících atrofii, vyskytuje se několik běžných biochemických změn v postiženém vláknu kosterního svalstva, zahrnujících snížení syntézy proteinů a zvýšení degradace proteinů a změn v kontraktilních i metabolických proteinových isozymech enzymu, které jsou charakteristické pomalým (vysoce oxidativní metabolizmus/izoformy pomalých kontraktilních proteinů) až rychlým (vysoce glykolytický metabolizmus/izoformy rychlých kontraktilních proteinů) přehazováním vláken. Další změny, které se vyskytují v kosterním svalstvu, zahrnují úbytek vaskulatury a přestavby extracelulární matrix. Pomalý i rychlý pohyb svalstva demonstruje za příslušných podmínek na atrofii s relativním úbytkem svalstva v závislosti na specifické stimulaci či stavu atrofie. Všechny tyto změny jsou koordinačně regulovány a jsou vypínány a spouštěny v závislosti na změnách ve fyziologických a metabolických změnách.
Procesy, kterými se atrofie a hypertrofie projevuje, jsou u savčích druhů konzervativní. Mnoho studií ukázalo, že během atrofie se u hlodavců i lidí objevují stejné základní molekulární, buněčné a fyziologické procesy. Tudíž hlodavčí modely atrofie kosterního svalstva byly úspěšně používány k pochopení a predikci lidských atrofických odpovědí. Například atrofie indukovaná různými prostředky u hlodavců i lidí vede k podobným změnám v anatomii svalstva, cross-sectional oblastech, funkci, typu přepínání vlákna, expresi kontraktilního proteinu a histologii. Bylo zjištěno, že několik agens reguluje atrofii kosterního svalstva u hlodavců i lidí. Tyto agens zahrnují anabolické steroidy, růstový hormon, IGF I (insulin-like growth factor I) a beta adrenergní agonisty. Dohromady tato data ukazují, že atrofie kosterního svalstva je výsledkem běžného mechanizmu u hlodavců i lidí.
Zatímco se ukázalo, že některá agens, regulují atrofii kosterního svalstva a jsou pro tento účel povolena pro použití na lidech, mají tato agens nežádoucí vedlejší účinky, např. hypertrofie srdečního svalstva, neoplazie, hirsutizmus,
-5androgenizaci žen, zvýšenou morbiditu a mortalitu, poškození jater, hypoglykemii, muskuloskeletární bolest, zvýšené napětí v tkáni, tachykardii a edém. V současné době neexistuje vysoce účinné a selektivní ošetření buď akutní nebo chronické atrofie kosterního svalstva. Tudíž zde existuje potřeba identifikovat další terapeutická agens, která regulují atrofii kosterního svalstva.
Svalové dystrofie
Svalové dystrofie zahrnují skupinu dědičných a progresivních poruch svalstva, klinicky se vyznačujících selektivní distribucí ochablosti kosterního svalstva. Dvě nejběžnější formy svalové dystrofie jsou Duchenneova a Beckerova svalová dystrofie, kde každá vzniká v důsledku zděděné mutace v genu dystrophinu, který je lokalizován na lokusu Xp21. Další dystrofie zahrnují, ale není to nikterak limitováno, pletencovou dystrofii (LGMD), která je výsledkem mutace několika genetických lokusů, zahrnujících p97 calpain, adhalin, γ-sarcoglycan a β-sarcoglykan lokusy; fascioskapulohumerální svalovou dystrofii (LandouzyhoDéjerineova), myotonickou dystrofii a Emery-Dreifussova svalovou dystrofii. Symptomy Duchenneovy svalové dystrofie, které se vyskytují téměř výhradně u mužů, zahrnují kolíbavou chůzi, chození po patách, lordózu, časté pády a obtíže při vstávání a chůzi po schodech. Symptomy začínají ve věku 3-7 let, kde většina pacientů je upoutána na invalidní vozík na 10-12 let a mnoho z nich zemře asi ve 20 letech v důsledku respiračních komplikací. Současná léčba Duchenneovy svalové dystrofie zahrnuje podání prednisonu (kortikosteroidního léčivo), které i když není kurativní zpomaluje pokles síly svalstva a pooddaluje invaliditu. Ví, se že kortikosteroidy, např. prednison, účinkují zablokováním aktivace imunitních buněk a infiltrace, které jsou precipitovány poškozením vláken svalstva, jenž neguje některé z potenciálních benefitů blokování imunitní odpovědi u těchto pacientů. Tudíž zde existuje potřeba identifikovat terapeutická agens, která zpomalují poškození svalového vlákna a zpožďují vypuknutí invalidity u pacientů se svalovou dystrofii, ale způsobují menší stupeň atrofie kosterního svalstva než současné terapie.
-6Jeden problém související s identifikací sloučenin pro použití při léčení atrofie kosterního svalstva nebo svalové dystrofie spočíval v nedostatku dobrých screningových metod pro identifikaci takových sloučenin. Vynálezci nyní přišli na to, že CRF2R se podílejí na regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva, a že CRF2R jsou schopné blokovat atrofii kosterního svalstva a/nebo indukovat hypertrofii kosterního svalstva. Předložený vynález řeší problém identifikace sloučenin pro léčení svalové atrofie poskytnutím screeningových metod za použití CRF2R, které mohou být používány k identifikaci potencionálních sloučenin použitelných pro léčení svalové atrofie. Předložený vynález také řeší problém nalezení sloučenin použitelných pro léčení svalových dystrofií poskytnutím screeningové metody k identifikaci potencionálních sloučenin, které aktivují CRF^ i CRF2R.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká použití CRFR k identifikaci potencionálních sloučenin, které jsou potenciálně použitelné při léčení atrofie kosterního svalstva a nebo k indukci hypertrofie kosterního svalstva. Zejména předložený vynález poskytuje in vitro metody identifikace potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva, zahrnující uvedení testované sloučeniny v kontakt s buňkami exprimujícími CRF2R, nebo uvedení testované sloučeniny v kontakt s izolovaným CRF2R a stanovení, zda-li se testovaná sloučenina váže na CRF2R nebo aktivuje CRF2R. Další provedení předloženého vynálezu se týká způsobu identifikace potencionálních terapeutických sloučenin ze skupiny jedné nebo více potencionálních sloučenin, které byly určeny k vazbě na CRF2R nebo aktivaci CRF2R vyznačující se tím, že zahrnuje podání potencionální sloučeniny nehumánnímu zvířeti a stanovení, zda-li potencionální sloučenina reguluje hmotu kosterního svalstva nebo funkci svalstva v ošetřovaném zvířeti. Další provedení předloženého vynálezu se týká způsobu identifikace možných sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva vyznačující se tím, že zahrnuje v jakémkoliv pořadí: (i) uvedení testované sloučeniny v kontakt s buňkou exprímující funkční CRF2R a stanovení míry aktivace CRF2R v důsledku testované •· ·· · ·· ······ ···· · · · · ·· · ··· · · · ··· • · · ·· ·· · · · · · • · ······· ···· ·· ··· ·· ·· ··
-7sloučeniny; (ii) uvedení testované sloučeniny v kontakt s buňkou exprimující funkční CRFR a stanovení míry aktivace CRF-|R v důsledku testované sloučeniny; následované (iii) srovnáním míry aktivace CRF2R a míry aktivace CRFtR; a (iv) identifikaci těch testovaných sloučenin, které vykazují podobnou aktivitu vůči CRF2R a CRFiR nebo vykazují selektivitu pro CRF2R jako potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva.
Předložený vynález dále poskytuje způsoby identifikace potencionálních sloučenin, které prodlužují nebo zvyšují agonistou indukovanou aktivaci CRF2R nebo dráhu přenosu signálu CRF2R.
Tyto metody zahrnují v jakémkoliv pořadí: (i) uvedení testované sloučeniny v kontakt s buňkou, která exprimuje funkční CRF2R (ii) ošetření buňky agonistou CRF2R po dostatečnou dobu a v dostatečné koncentraci ke vzniku desenzitizace CRF2R v kontrolních buňkách a následně (iii) stanovení míry aktivace CRF2R a identifikaci testovaných sloučenin, které prodlužují nebo zvyšují aktivaci CRFR nebo dráhy přenosu signálu CRFR jako potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty a funkce kosterního svalstva. V konkrétním provedení se předložený vynález týká způsobu identifikace potencionálních terapeutických sloučenin ze skupiny jedné nebo více potencionálních sloučenin určených k prodloužení nebo zvýšení aktivace CRF2R nebo dráhy přenosu signálu CRF2R vyznačujícího se tím, že zahrnuje: podání potencionální sloučeniny společně s agonistou CRF2R nehumánnímu zvířeti a stanovení, zda-li potencionální sloučenina reguluje hmotu nebo funkci kosterního svalstva u ošetřovaného zvířete.
Předložený vynález dále poskytuje způsoby identifikace potencionálních sloučenin, které zvyšují expresi CRF2R, vyznačující se tím, že zahrnují uvedení testované sloučeniny v kontakt s buňkou nebo buněčným lyzátem obsahujícím reportérový gen operativně asociovaný s regulačním elementem genu CRF2R a detekci exprese reportérového genu. Testované sloučeniny, které zvyšují expresi reportérového genu, jsou identifikovány jako potencionální sloučeniny pro zvýšení exprese CRF2R. V konkrétním provedení se předložený vynález týká způsobu stanovení, zda-li tyto potencionální sloučeniny, které zvyšují expresi CRF2R, mohou být používány k regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva in vivo
-8podáním potencionální sloučeniny nehumánnímu zvířeti, a stanovení, zda-li potencionální sloučenina reguluje hmotu nebo funkci kosterního svalstva v ošetřovaném zvířeti.
Předložený vynález dále poskytuje způsoby identifikace potencionálních sloučenin, které zvyšují expresi CRFR, vyznačující se tím, že zahrnují uvedení testované sloučeniny v kontakt s buňkou nebo buněčným lyzátem obsahujícím reportérový gen operativně asociovaný s regulačním elementem genu CRF a detekci exprese reportérového genu. Testované sloučeniny, které zvyšují expresi reportérového genu, jsou identifikovány jako potencionální sloučeniny zvyšující expresi CRF. V konkrétním provedení se předložený vynález týká způsobu stanovení, zda-li tyto potencionální sloučeniny, které zvyšují expresi CRF, mohou být používány k regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva /7? vivo podáním potencionální sloučeniny nehumánnímu zvířeti, a stanovení, zda-li potencionální sloučenina reguluje hmotu nebo funkci kosterního svalstva v ošetřovaném zvířeti.
Předložený vynález se také týká použití agonistů CRF2R, expresních vektorů kódujících funkční CRF2R, expresních vektorů kódujících konstitutivně aktivní CRF2R nebo sloučeniny, které zvyšují expresi CRF2R, nebo CRF k ošetření atrofie kosterního svalstva. Konkrétně poskytuje předložený vynález způsoby léčení atrofie kosterního svalstva u subjektu s potřebou takového léčení, vyznačující se tím, že zahrnuje podání bezpečného a účinného množství agonisty CRF2R, expresního vektoru kódujícího funkční CRF2R, expresní vektor kódující konstitutivně aktivní CRF2R, expresní vektor kódující CRF nebo analog CRF, nebo sloučeniny, které zvyšují expresi CRF2R nebo CRF subjektu. V konkrétním provedení se předložený vynález týká způsobu léčení atrofie kosterního svalstva u subjektu s potřebou takového léčení, vyznačující se tím, že zahrnuje podání bezpečného a účinného množství agonisty CRF2R společně s bezpečným a účinný množstvím sloučeniny, která prodlužuje nebo zvyšuje agonistou indukovanou aktivaci CRF2R nebo dráhy přenosu signálu CRF2R subjektu.
Předložený vynález se také týká použití agonisty CRF2R ke zvýšení hmoty nebo funkce kosterního svalstva u subjektu. Konkrétně poskytuje předložený vynález způsoby zvýšení hmoty a funkce kosterního svalstva u subjektu, u kterého
-9je takové zvýšené žádoucí, vyznačující se tím, že zahrnuje identifikaci subjektu, u kterého zvýšení svalové hmoty nebo funkce je žádoucí, a podání bezpečného a účinného množství agonisty CRFR subjektu.
Předložený vynález dále poskytuje farmaceutické přípravky obsahující bezpečné a účinné množství agonisty CRF2R a farmaceuticky přijatelný nosič. V konkrétním provedení farmaceutický přípravek obsahuje chimérickou nebo humánní protilátku specifickou pro CRF2R. V dalším konkrétním provedení farmaceutický přípravek obsahuje CRF nebo analog CRF, výhodně urokortin II.
Předložený vynález také poskytuje protilátky proti CRF2R a zejména chimérické nebo lidské protilátky, které jsou agonisté CRF2R.
V celé přihlášce jsou odkazy na různé publikace. Obsahy těchto publikací jsou jako celek uvedeny této přihlášce jako odkaz za účelem podrobnějšího popisu stavu techniky, kterého se předložený vynález týká.
Sekvenční analýza
Každý nukleotid CRFR a proteinové sekvence nebo proteinové sekvence analogu CRFR obsažené ve výpisu ze sekvenční analýzy společně s odpovídajícím přístupovými čísly k databázím „Genbank“ nebo „Derwenť a zvířecím druhem, ze kterého jsou klonovány, jsou uvedeny v tabulce I. Také jsou zde uvedena přístupová čísla pro příbuzné nukleotidové sekvence, které kódují stejné nebo téměř stejné aminokyselinové sekvence jako je sekvence uvedená na výpisu ze sekvenční analýzy. Tyto příbuzné sekvence se liší hlavně v množství uvedené 5'- nebo 3'- nepřekládané sekvence.
• · • * · · · ·
-10Tabulka I
| Popis sekvence | ID Č. SEK: nukleotid, aminokyselina | Species | Genbank (GB) nebo Derwent (D) přístupoví číslo pro nukleotidovoe sekvenci | Související Genbank (GB) nebo í Derwent (D) přístupové číslo. |
| CRFiR | 1,2 | Homo sapiens | X72304 (GB) | El 1431 (GB) L23332(GB) 192584 (D) T37068(D) T28968 (D) Q81952(D) |
| varianta CRFiR | 3,4 | Homo sapiens | L23333 (GB) | |
| varianta CRFiR | 5,6 | Homo sapiens | NM_004382 (GB) | |
| varianta CRF,R | 7, 8 | Homo sapiens | AF180301 (GB) | |
| CRF2Ralfa | 9, 10 | Homo sapiens | U34587 (GB) NM 001883 (GB) | E12752 (GB) T12247 (D) T66508 (D) |
| CRF2R beta | 11, 12 | Homo sapiens | AF011406 (GB) | |
| CRF2R gamma | 13, 14 | Homo sapiens | AF019381 (GB) | |
| CRF|R | 15, 16 | Rattus norvegicus | T28970 (D) | L25438 (GB) L24096 (GB) 192586(D) Q81954(D) ' AH006791 (GB) |
| CRF2R alfa | 17, 18 | Rattus norvegicus | U16253 (GB) | NM_022714 (GB) X01009(D) T12243 (D) |
| varianta CRF2R beta | 19, 20 | Rattus norvegicus | T12244 (D) | |
| CRF,R | 21,22 | Mus musculus | NM 007762 (GB) | X72305(D) |
| CRF2R | 23,24 | Mas musculus | T28972 (D) | U17858 (GB) |
| crf2r | 25, 26 | Mas musculus | NM 009953 (GB) | |
| CRF,R | 27, 28 | Ovis aries | AF054582 (GB) | |
| CRF,R | 29, 30 | Xenopus laevis | Y14036 (GB) | |
| CRF2R | 31,32 | Xenopus laevis | Y14037 (GB) | |
| CRF,R | 33,34 | Ameiurus nebulosus | AF229359 (GB) | |
| CRFiR | 35, 36 | Ameiurus nebulosus | AF229361 (GB) | |
| CRF2R | 37,38 | Ameiurus nebulosus | AF229360 (GB) | |
| CRF,R | 39, 40 | Bos taurus | AB055434 (GB) | |
| CRFiR | 41,42 | Gallus gallus | L41563 (GB) | |
| Urokortin II | 43 | Mus musculus | AF331517 | |
| Peptid příbuzný s urokortinem | 44 | Homo sapiens | BC002647 |
-11 • · • · · • ♦ • · ··♦· ·· • · · ·
Stručný popis obrázků
Na obrázku 1 je znázorněn antiatrofický účinek agonisty CRF^/CRFsR, sauvaginu (podáváného subkutánně, 2 x denně), na mediální lýtkový sval na myším modelu atrofie indukované denervací sedacího nervu.
Na obrázku 2 je znázorněn antiatrofický účinek sauvaginu (podávaného kontinuálně osmotickou minipumpou) na přední holenní sval na myším modelu atrofie indukované denervací sedacího nervu.
Na obrázku 3A a 3B je znázorněn antiatrofický účinek sauvaginu (podávaného kontinuálně osmotickou minipumpou) na glukokortikoidem indukovanou atrofii předního holenního svalu (Obr. 3A) a mediálního lýtkového svalu (Obr. 3B)
Na obrázku 4A je znázorněn antiatrofický účinek sauvaginu (podáváného subkutánně, 2 x denně) na atrofii předního holenního svalu indukované fixací a hypertrofii indukujícího účinku na nefixovaný (normální) přední holenní sval. Na obrázku 4B je znázorněn antiatrofický účinek sauvaginu na atrofii mediálního lýtkového svalu indukované fixací a hypertrofii indukujícího účinku sauvaginu na nefixovaný (normální) mediální lýtkový sval.
Na obrázku 5 jsou znázorněny antiatrofii- a hypertrofii-indukující účinky sauvaginu a urokortinu (podávané kontinuálně osmotickou minipumpou) na přední holenní sval na myším modelu atrofie indukované denervací sedacího nervu.
Na obrázku 6A a 6B jsou znázorněny antiatrofické účinky urokortinu (podávaného subkutánně, 2 x denně) na nečinností indukovanou atrofii předního holenního svalu a mediálního lýtkového svalu.
Na obrázku 7 je znázorněn antiatrofický účinek sauvaginu (podávaný subkutánně, 2 x denně) v myším adrenolektomizovaném modelu atrofie • ·
-12indukované denervací sedacího nervu, na atrofii předního holenního svalu indukovanou denervací (Obr. 7A), extenzor digitorum longus (EDL) (Obr. 7B), šikmý sval lýtkový (Obr. 7C), mediální lýtkový sval (Obr. 7D) a lýtkové svaly. Navíc hypertrofie nedenervovaného svalu EDL indukovaná sauvaginem je uvedena na obrázku 7B.
Na obrázku 8 je na myším modelu atrofie indukované denervací sedacího nervu znázorněn antiatrofický účinek sauvaginu (podávaného kontinuálně osmotickou minipumpou) na přední holenní sval u normální myši, ale ne u myši s knockoutovaným CRF2R.
Na obrázku 9A a 9B je na myší modelu atrofie indukované nečinností v důsledku fixace končetiny znázorněn antiatrofický účinek sauvaginu na EDL a šikmý sval lýtkový měřený na hmotě (Obr. 9A) nebo funkci svalu (Obr. 9B).
Detailní popis vynálezu
Termíny a definice
V této přihlášce mají termíny následující význam:
Termín „agonista“ se vztahuje na kteroukoliv sloučeninu, zahrnující, ale není to nikterak limitováno, protilátky, které aktivují receptor. Například agonisté CRFR zahrnují, ale není to nikterak limitováno, CRF a analoga CRF.
Termín „alelická varianta“ se vztahuje na variantní formu uvedeného genu nebo genového produktu. Odborník v oboru jistě rozpozná, že ve dvou nebo více alelických formách v populaci existuje nespočet genů a některé geny mají mnoho alel.
Termín „protilátka“ se ve svých různých doslovných formách vztahuje na molekuly imunoglobulinu a imunologicky aktivní části molekul imunoglobulinu, tzn. molekuly, které obsahují vazebné místo pro antigen, které ho specificky vážou antigen. Termín „purifikovaná protilátka“ se vztahuje na protilátku, která byla částečně nebo zcela separována od proteinů a od s ní přirozeně se vyskytujících organických molekul. Výhodně je preparát alespoň 60 hmotn. % protilátky,
I
-13·· ·· * « · « · • · · • ··· · • · ···· ·« · ·· · · · · · · • · * · · • · · · · • · · · · · • ♦ · · · · ·· ·· ·· výhodněji alespoň 75 hmotn. %, ještě výhodněji alespoň 90 hmotn. % protilátky a nejvýhodněji alespoň 99 hmotn. % suché hmotnosti protilátky.
Termín „vazebná afinita“ se vztahuje na schopnost ligandu interagovat s receptorem a je nepřímo úměrná disociační konstantě pro specifickou interakci mezi CRF a ligand-CRFR. Disociační konstanta může být měřena přímo standardní saturací, kompeticí nebo kineticky nebo nepřímo farmakologickýcmi technikami zahrnujícími funkční testy a koncové body.
Termín „chimérická protilátka“ se vztahuje na protilátku, která obsahuje strukturní elementy ze dvou nebo více různých molekul protilátek, tzn. z různých zvířecích druhů. Chimérické protilátky zahrnují, ale není to nikterak limitováno, protilátky známé jako „humanizované protilátky“, které zahrnují, ale není to nikterak limitováno, chimérické protilátky generované technikami známými jako komplementaritu determinující oblast nahrazení.
Termín „CRF“ se vztahuje na faktor uvolňující kortikotropin, který je stejný jako hormon uvolňující kortikotropin (CRH). Příklady peptidů CRF zahrnují r/h CRF a ovčí CRF (viz U.S. Patent č. 4,415,558), atd.
Termín „analog CRF“ se vztahuje na látky, které účinkují jako ligandy CRFR. Vhodná analoga CRF mohou být získána z různých obratlovců a zahrnují, ale není to nikterak limitováno, látky, např. sauvagin (viz např. U.S. patent č. 4,605,642), urotensin (viz např. U.S. patenty č. 4,908,352; a 4,533,654), myší urokortin II (id. č. sek.: 43), lidský peptid urokortinového typu (id. č. sek..44) (Reyes, T. M. etal,, Proč. Naťl Acad Sci 98:2843-2848 (2001)), urokortin (viz např. WO 97/00063) a analoga CRF popsaná v U.S. patentech č. 4,415,558; 4,489,163; 4,594,329; 4,605,642; 5,109,111; 5,235,036; 5,278,146; 5,439,885; 5,493,006; 5,663,292; 5,824,771; 5,844,074; a 5,869,450. Každý z nich je zde uveden jako odkaz. Výhodná analoga CRF jsou sauvagin, urokortin, peptid urokortinového typu, urokortin-ll a urotensin.
Termín „agonista CRFR“ se vztahuje na sloučeninu nebo molekulu, která má schopnost aktivovat CRFtR nebo CRF2R nebo obé. Aktivace CRFR může být měřena podle způsobu popsaného níže.
Termín „CRFR“ se vztahuje na CRFtR nebo CRF2R.
• · ··· · ·· ·· · ·· » · · · ·· · · · · · • · · · · · ··· • ··· · ······ · • · ···*··· ···· ·· ··· ·· ·· ··
-14Termín „CRFiR“ se vztahuje na kteroukoliv z izoforem CRFiR z kteréhokoliv zvířecího druhu. CRFiR byl dříve označován jako CRF-RA, PCCRF, CRF, (Perrin, Μ. H., et al. Endocrinology 133: 3058-3061 (1993), Chen, R., etal. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:8967-8971 (1993), Chang, C-P. etal., Neuron 11:1187-1195 (1993), Kishimoto, T., etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92:11081112 (1995) and, Vita, N. etal., FEBS Lett. 335: 1-5 (1993)) nebo receptor CRH.
Definice CRFiR zahrnuje, ale není to nikterak limitováno, ty receptory, pro které byla cDNA nebo genomická sekvence kódující receptor deponována v databázi sekvencí. Tyto sekvence mají přístupová čísla: X72304, E11431, L23332, I92584, T37068, T28968, Q81952, L23333, NM-004382, AF180301, T28970, L25438, L24096, I92586, Q81954, AH006791, NM-007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359, AF229361, AB055434 a L41563. Nukleotidové a proteinové sekvence těchto receptorů jsou dostupné u GenBank nebo Derwent a pro usnadnění jsou reprezentativní sekvence uvedeny ve zde přiloženém výpisu ze sekvenční analýzy.
Termín „CRF2R“ se vztahuje na kteroukoliv izoformu CRF2R z kteréhokoliv zvířecího druhu. CRF2R byl také označován jako HM-CRF, CRF-RB, (Kishimoto, T., etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92:1108-1112 (1995) a Perrin, M. et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:2969-2973 (1995)).
Definice receptorů CRF2R zahrnuje, ale není to nikterak limitováno, ty receptory, pro které byla DNA-sekvence kódující receptor deponována v sekvenční databázi. Tyto sekvence mají přístupová čísla: U34587, E12752, NM001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381, U16253, T12244, T28972, U17858, NM-009953, Y14037 a AF229360. Nukleotidové a proteinové sekvence těchto receptorů jsou dostupné u GenBank nebo Derwent a pro usnadnění jsou reprezentativní sekvence uvedeny ve zde přiloženém výpisu ze sekvenční analýzy.
Termín „CRFR“ také zahrnuje zkrácené a/nebo zmutované proteiny, kde oblasti receptorové molekuly nepotřebné pro vazbu ligandu nebo signalizaci byly deletovány nebo modifikovány. Odborník v oboru jistě pozná, že například CRFR s jednou nebo více konzervativních změn v primární aminokyselinové sekvenci by ·· ·· · ·· ····«· ···· ·· · · · · * • · · · · · · · 9
999 · 9 9 999 9 9 · ······· ···· ·· ··· ·· 99 99
-15mohl být použitelný v předloženém vynálezu. Ví se, že substituce některých aminokyselin různými aminokyselinami s podobnou strukturou nebo vlastnostmi (konzervativní substituce) může vést k tichým změnám, tzn. změny, které výrazně nemění funkci. Konzervativní substituce jsou v oboru dobře známy. Ví se, že například GPCR může tolerovat substituce aminokyselinových zbytků v transmembránových alfa-helixech, které jsou orientovány směrem k lipidu, dalšími hydrofóbními aminokyselinami a zůstat dále funkční. CRF1R se liší od přirozeně se vyskytující sekvence zkráceními a/nebo mutacemi, např. konzervativní aminokyselinové substituce rovněž spadají do definice CRFiR. CRF2R se liší od přirozeně se vyskytující sekvence zkráceními a/nebo mutacemi, např. konzervativní aminokyselinové substituce rovněž spadají do definice CRF2R.
Odborník v oboru dále rozpozná, že CRFR z jiných druhů než ty, které jsou uvedeny výše, zejména pak savčí druhy, by mohly být použitelné v předloženém vynálezu. Odborník v oboru dále rozpozná, že použitím sond ze sekvencí CRFR známých druhů by mohla být cDNA nebo genomické sekvence získány ze stejných nebo alternativních druhů známými klonovacími technikami. Tyto CRFiR také spadají do definice CRFiR. A dále tyto CRF2R rovněž spadají do definice CRF2R.
Navíc odborník v oboru dále rozpozná, že funkční alelické varianty nebo funkční sestřihové varianty CRFR mohou být přítomné u konkrétních druhů, a že tyto varianty by mohly být použitelné v předloženém vynálezu. Jsou známy sestřihové varianty CRFR, např. U.S. patent č. 5,888,811; 5,786,203; a 5,728,545, každá z nich je zde uvedena jako odkaz. Tyto varianty CRFiR spadají rovněž do definice CRFiR a tyto varianty CRF2R taktéž spadají do definice CRF2R.
Fúze polypeptidu CRFiR nebo CRF2R nebo polypeptidového fragmentu CRFiR nebo CRF2R s polypeptidem non-CRFR jsou označovány jako fúzní proteiny CRFR. Použitím známých metod by odborník v oboru měl být schopen vytvořit fúzní proteiny CRFiR nebo CRF2R, které i když jsou rozdílné od přirozených CRFiR a CRF2R by byly stále použitelné v předloženém vynálezu. Například polypeptid non-CRFR může být signální (nebo vedoucí) polypeptidová sekvence, která kotranslačně nebo posttranslačně řídí přenos proteinu z místa • ·
-16jeho syntézy do jiného místa (např. α-faktorový leader z kvasinek). Nebo polypeptid non-CRFR může být přidán k usnadnění purifikace nebo identifikace CRFR (např. poly-His nebo FLAG-peptidu). Fúzní proteiny CRF^ také spadají do definice CRFtR a rovněž fúzní proteiny CRF2R spadají do definice CRF2R.
Termín „dráha přenosu signálu CRF2R“ znamená kteroukoliv signální dráhu (např. cAMP, MAP kinázu) nebo kombinaci signálních drah, které jsou modulovány vazbou endogenních nebo exogenních ligandů na CRF2R.
Termín „funkční CRFR“ se vztahuje na CRFR, které vážou CRF nebo analog CRF in vivo nebo in vitro a jsou aktivovány v důsledku vazby ligandu.
Termín „fúzní gen“ se vztahuje na dvě nebo více DNA kódujících sekvencí operativně asociovaných tak, aby kódovaly jeden hybridní protein. Termín „fúzní protein“ je proteinový produkt fúzního genu.
Termín „inhibovat“ se vztahuje na částečně nebo kompletně zastavený konkrétní proces nebo aktivitu. Například sloučenina inhibuje atrofii kosterního svalstva, pokud zcela nebo částečně zabraňuje svalové atrofii.
Dvě DNA-sekvence jsou „operativně asociovány“, jak je používáno v předloženém vynálezu, pokud charakter vazby mezi dvěma DNA-sekvencemi (1) nemá za následek zavedení posunové mutace, (2) neinterferuje se schopností oblasti promotoru řídit transkripci kódujících sekvencí, nebo (3) neinterferuje se schopností odpovídajícího transkriptu RNA být přeložen na protein. Například jsou kódující sekvence a regulační sekvence operativně asociovány, pokud jsou kovalentně vázány takovým způsobem že, podřídí transkripci kódující sekvence pod vliv nebo kontrolu regulačních sekvencí. Tudíž oblast promotoru je operativně asociována s kódující sekvencí, pokud oblast promotoru je schopná ovlivňovat transkripci této DNA-sekvence takovým způsobem, aby výsledný transkript bylo možno přepsat na požadovaný protein nebo polypeptid.
Termín „procentuální shoda“ se vztahuje na procentuální množství nukleotidů nebo aminokyselin, které mají dvě sekvence společné, vypočtené následujícím způsobem: k vypočtení procentuální shody pro specifickou sekvenci (požadavek) je relevantní část požadované sekvence srovnána s referenční sekvencí pomocí srovnávacího počítačového programu BestFit, Wisconsin • · · · · ·
-17Package, Version 10.1, dostupné u Genetice Computer Group, lne. Tento program využívá algoritmus podle Smithe a Watermana, Advances in Applied Mathematics, Issue 2: 482-489 (1981). Procentuální shoda je vypočtena s následujícími defaultními parametry pro program BestFit: scoring matrix je blosum62.cmp, gap creation penalty je 8 a gap extension penalty je 2. Pokud se srovnává sekvence s referenční sekvencí, je relevantní část požadované sekvence odvozená od sekvence CRFR. Například, pokud existuje požadavek na CRFR/purifikaci značeného fúzního proteinu, pak pouze polypeptidová část sekvence CRFR je zařazena do výpočtu procentuální shody.
Termín „polypeptid“ se vztahuje na kterýkoliv řetězec aminokyselin bez ohledu na délku nebo posttranslační modifikaci (např. fosforylace nebo glykosylace).
Termín „promotor“ se vztahuje na DNA-sekvenci, která řídí iniciaci transkripce a míru transkripce z genu nebo kódující oblasti.
Termín „profýlaktické ošetření“ se vztahuje na preventivní ošetření subjektu, který dosud nevykazuje znaky atrofie kosterního svalstva, za účelem kompletního nebo částečného blokování výskytu atrofie kosterního svalstva. Odborník v oboru by mohl rozpoznat, že někteří jedinci jsou v riziku atrofie kosterního svalstva tak, jak je popsána v podkladech zde. Dále odborník v oboru jistě pozná, že biochemické změny, které vedou katrofii kosterního svalstva, jsou vhodně regulovány a to tak, aby by mohlo být zabráněno výskytu atrofie, nebo aby mohl být redukován výskyt atrofie u rizikových jedinců. Například pacienti se svalovou dystrofií a začínající léčbou kortikosteroídy jsou v riziku vzniku atrofie kosterního svalstva, což ukazuje, že profýlaktické ošetření takových pacientů by mohlo být vhodné.
Termín „regulovat“ ve všech jeho doslovných formách se vztahuje na zvýšení, snížení nebo udržení, např. regulace hmoty nebo funkce kosterního svalstva znamená zvýšení, snížení nebo udržení úrovně hmoty nebo funkce kosterního svalstva.
Termín „regulace hmoty nebo funkce kosterního svalstva“ se vztahuje na regulaci hmoty kosterního svalstva, funkce kosterního svalstva nebo obé.
• · ·· · ·· ······ • · · · ·· · * ·· · • · · *·· · · · » ··· · ······ · • · ······· ···» ·· ··» »· ·· ··
-18Termín „regulační prvek“ se vztahuje na DNA-sekvenci, která je schopná regulace míry transkripce z operovatelně asociované DNA-sekvence. Do definice regulačního prvku spadají promotory a zesilovače. Například regulační prvek genu CRFR je DNA-sekvence schopná řídit transkripci z genu CRFR.
Termín „reportérový gen“ se vztahuje na kódující sekvenci, jejíž produkt může být deletován, výhodně kvantitativně, kde reportérový gen je operativně asociován s heterologním promotorem nebo zesilovacím prvkem, který je odpovědný za přenos, jenž má být měřen. Promotorový nebo zesilovací prvek je v této spojitosti zde označen jako „responzivní prvek“.
Termín „selektivní agonista“ znamená, že agonista má výrazně větší aktivitu vůči některému receptoru(ům) v porovnání s jinými receptory, a ne že je zcela neaktivní vůči dalším receptorům.
Termín „hypertrofie kosterního svalstva“ se vztahuje na přírůstek hmoty nebo funkce kosterního svalstva nebo obé.
Termín „atrofie kosterního svalstva“ znamená to samé jako „ochabování svalů“ a znamená úbytek hmoty kosterního svalstva nebo funkce kosterního svalstva nebo obé.
Termín „sestřihová varianta“ se vztahuje na mRNA nebo protein, který vzniká z alternativního použití exonu. Odborník v oboru rozpozná, že v závislosti na typu buňky nebo případu v jednotlivém typu buňky může být mRNA exprimována v různé formě jako sestřihová varianta, a tím se bude přepsaný protein odlišit v závislosti na mRNA, která je exprimována.
Termín „terapeuticky účinné množství“ látky je množství schopné produkce lékařsky požadovaného výsledku u ošetřovaného pacienta, např. snížení atrofie kosterního svalstva, přírůstek hmoty kosterního svalstva nebo funkce kosterního svalstva, s přijatelným poměrem mezi prospěchem a rizikem u lidského nebo humánního savce.
Termín „terapeutické ošetření“ se vztahuje na léčení subjektu, u kterého je žádoucí zvýšení svalové hmoty nebo svalové funkce. Například léčení subjektu vykazujícího znaky atrofie kosterního svalstva za účelem částečného nebo kompletního odvrácení zjištěné atrofie kosterního svalstva nebo za účelem • · ·· * · · · • · · • ··· · • · ···· ·· » ·· ·· «··· ·· · 9 · · · • · · · · · ······ · • · · · · · · ··· ·· ··
-19kompletního nebo částečného blokování výskytu další atrofie kosterního svalstva by mohlo být terapeutickým ošetřením takové subjektu. Termín „terapeutické léčení“ také zahrnuje například léčení subjektu nevykazujícího znaky atrofie kosterního svalstva za účelem vyvolání hypertrofie kosterního svalstva, např. léčení hospodářský zvířat kvůli zvýšení svalové hmoty.
Termín „léčení“ znamená profylaktické nebo terapeutické léčení.
Pokud není definováno jinak, mají veškeré technické a vědecké termín používané v této přihlášce stejný význam, jenž je běžně chápán odborníky v oboru proteinové chemie, farmakologie nebo molekulární biologie. Způsoby, materiály a příklady popsané v této přihlášce nemají limitující charakter. Další způsoby a materiály podobné nebo ekvivalentní s těmi, které byly popsány této přihlášce, mohou být používány v provádění nebo testování předloženého vynálezu.
II. Úloha CRFR při regulaci hmoty kosterního svalstva
Odborník v oboru by měl rozpoznat, že použití předloženého vynálezu poskytuje jednak informace o dosavadní technice a dále i poznatky uvedené níže. Výsledky popisované v předloženém vynálezu ukazují, že podání agonisty receptoru CRF, který aktivuje CRF1R i CRF2R (neselektivní agonista CRFR), blokuje a/nebo inhibuje atrofii kosterního svalstva indukovanou denervací, nečinností nebo ošetřením dexamethasonem na modelech atrofie kosterního svalstva. Navíc data ukazují, že agonisté CRFR nemají tento antiatrofický účinek u myší s knockoutovaným CRF2R. I krysy, u kterých CRF1R zprostředkovaná HPA osa byla přerušena odstraněním nadledviny (chirurgická adrenaloktémie), ošetřované neselektivními agonisty CRFR vykazovaly antiatrofický účinek, indikující, že CRF2R zprostředkovává antiatrofické účinky. Dále výsledky ukazují, že podání neselektivního agonisty CRFR vede k účinku indikujícím hypetrofii. Dohromady tato data demonstrují modulační roli CRF2R v procesu atrofie kosterního svalstva. Specifická role CRFR in vivo byla zkoumána pomocí farmakologických agens, sauvaginu (Bachem Biosciences, lne. King of Prussia, PA) a urokortinu (Bachem Biosciences, lne.), které jsou selektivními agonisty
-20CRFR u různých modelů atrofie kosterního svalstva popsané dále. Tyto agens byly dobře charakterizovány a jsou popsány ve vědecké literatuře.
Na obrázcích 1-7 a 9 jsou uvedeny výsledky experimentů demonstrujících, že podání selektivních agonistů CRFR vede ke statisticky výrazné inhibici atrofie kosterního svalstva. Na obrázku 8 je znázorněno, že antiatrofický účinek agonisty CRFR, sauvaginu, který je zprostředkován CRF2R. Díky podání agonistů CRFR dvakrát denně společně s inhibitorem fosfodiesterázy, theophyllinem, dochází k inhibici atrofie kosterního svalstva na zvířecích modelech atrofie kosterního svalstva. Theophyllin se přidá k prodloužení doby a zesílení účinku agonisty CRFR, což vede ke zvýšené účinnosti těchto sloučenin. Samotný theophyllin podávaný při těchto modelech atrofie nemá žádný účinek, což demonstruje, že antiatrofický účinek agonisty CRFR v kombinaci s theophyllinem byl důsledkem účinku agonisty CRFR. Dále kontinuální dávkování agonisty CRFR bez theophyllinu osmotickou minipumpou také vede k inhibici atrofie kosterního svalstva a/nebo hypertrofie kosterního svalstva. Statisticky významné výsledky byly stanoveny pomocí ANCOVA (Douglas C. Montgomery, Design and Analysis of Experiments, John Wiley and Sons, New York (2nd ed. 1984)). Zkratky používané v obrázcích 1-9: g - gram; SEM - směrodatná chyba průměru.
Konkrétně obrázek 1 (Obr. 1) ukazuje, že sauvagin inhibuje atrofii mediálního lýtkového svalu indukovanou denervací na myším modelu atrofie indukované denervací sedacího nervu. Legenda: A - fyziologický roztok (kontrolní); B - sauvagin (0,01 mg/kg) + theophyllin; C - sauvagin (0,03 mg/kg) + theophyllin; D - sauvagin (0,1 mg/kg) + theophyllin; E - sauvagin (1,0 mg/kg) + theophyllin; * - p < 0,05 v porovnání s roztokem. Po denervací pravého sedacího nervu byl samčí myši injektován subkutánně do střední skapulární oblasti dvakrát denně sauvagin v dávkách uvedených výše nebo kontrolní nosič (fyziologický roztok) po dobu 9 dnů. Sauvagin byl koaplikován s 30 mg/kg theophyllinu. Devátý den byl mediální lýtkový sval odstraněn a zvážen kvůli určení stupně atrofie.
Obrázek 2 (Obr. 2) ukazuje, že sauvagin inhibuje atrofii předního holenního svalu na myším modelu atrofie indukované denervací sedacího nervu. Legenda: A - voda (kontrolní); B - sauvagin (0,1 mg/kg/d); C - sauvagin (0,3 mg/kg/d);
• · · ·· »····· • · · · · · · · • · · · · · · ···· ·· ··· · · • ··· ···· ···· ·· ··· ·· ·· ··
-21 D - sauvagin (1,0 mg/kg/d); * - p < 0,05 v porovnání s vodou. Po denervaci pravého sedacího nervu byl samčím myším podán buď sauvagin nebo kontrolní nosič (fyziologický roztok) kontinuální infuzí pomocí osmotické minipumpy Alzet rychlostí 5 μΙ/h, dokud neskončil experiment (bez dalšího theopyllinu). Denní podávaná dávka sauvaginu je uvedena výše. Implantace minipumpy byla provedena v době denervace sedacího nervu. Devátý den byl přední holenní sval odstraněn a zvážen kvůli určení stupně atrofie.
Obrázek 3 (Obr. 3) ukazuje, že sauvagin inhibuje glukokortikoidem indukovanou atrofii předního holenního svalu (Obr. 3A) a mediálního lýtkového svalu (Obr. 3B) na myším modelu atrofie indukované glukokortikoidem. Legenda: A - voda pouze bez dexamethansonu obsažená v pitné vodě (neatrofovaná kontrola); B - voda + dexamethason (atrofovaná kontrola); C - sauvagin (0,1 mg/kg/d) + dexamethason; D - sauvagin (0,3 mg/kg/d) + dexamethason; E sauvagin (1,0 mg/kg/d) + dexamethason; * - p < 0,05 v porovnání s vodou; # - p < 0,05 v porovnání s vodou + dexamethasonem. Po přidání glukokortikoidu, dexamethasonu, do pitné vody (1,2 mg/kg/d) byly samčím myším podávány shora uvedená agens nebo kontrolní nosič (fyziologický roztok) kontinuální infuzí pomocí osmotické minipumpy Alzet rychlostí δμΙ/hod., dokud neskončil experiment (bez dalšího theopyllinu). Denní podávaná dávka sauvaginu je uvedena výše. Na začátku expozice dexamethasonem byla provedena implantace minipumpy. Devátý den po začátku dávkování sauvaginu byl mediální lýtkový sval a přední holenní sval odstraněn a zvážen kvůli určení stupně atrofie.
Obrázek 4 (Obr. 4) ukazuje, že sauvagin inhibuje atrofii předního holenního svalu (Obr. 4A) a mediálního lýtkového svalu (Obr. 4B) indukovanou nečinností. Navíc statisticky významná hypertrofie předního holenního svalu a mediálního lýtkového svalu v nefixované končetině byla také pozorována při ošetření sauvaginem. Legenda: A - fyziologický roztok (kontrolní); B - theopyllin; C sauvagin (0,03 mg/kg) + theophyllin; D - sauvagin (0,1 mg/kg) + theophyllin; E sauvagin (0,3 mg/kg) + theophyllin; * - p < 0,05 v porovnání s fyziologickým roztokem. Po fixaci pravé zadní končetiny byl samčím myším injektován subkutánně ve střední skapulární oblasti dvakrát denně sauvagin nebo kontrolní
-22nosič (fyziologický roztok) po dobu deseti dnů v indikovaných denních dávkách. Sauvagin byl koaplikován dvakrát denně intraperitoneálním dávkováním inhibitoru fosfodiesterázy theophyllinu (30 mg/kg). Desátý den byl odstraněn mediální lýtkový sval a přední holenní sval a byly zváženy kvůli stanovení stupně atrofie.
Obrázek 5 (Obr. 5) ukazuje, že sauvagin i urokortin inhibují atrofii předního holenního svalu indukovanou denervací na myším modelu atrofie indukované denervací sedacího nervu. Navíc byla pozorována hypertrofie nedenervované končetiny při ošetření urokortinem. Legenda: A - voda (kontrolní); B - sauvagin (1 mg/kg/d); C - urokortin (1,0 mg/kg/d); * - p < 0,05 v porovnání s vodou. Po denervací pravého sedacího nervu byly samčím myším podány shora uvedené agens nebo kontrolní nosiče (fyziologický roztok) kontinuální infuzí Alzetovou osmotickou minipumpou rychlostí 5 μΙ/hod, dokud neskončil experiment (bez dalšího theophyllinu). Denní podávaná dávka agens je uvedena výše. Implantace minipumpy byla prováděna ve stejnou dobu jako denervace sedacího nervu. Devátý den byl odstraněn a přední holenní sval a byl zvážen kvůli stanovení stupně atrofie.
Obrázek (Obr. 6) ukazuje, že urokortin inhibuje atrofii předního holenního svalu (Obr. 6A) a mediálního lýtkového svalu (Obr. 6B) indukovanou nečinností na myším modelu atrofie indukované nečinností v důsledku fixace končetiny. Legenda: A - fyziologický roztok (kontrolní); B - urokortin (0,3 mg/kg) + theophyllin; * - p < 0,05 v porovnání s fyziologickým roztokem. Po fixaci pravé zadní končetiny byl samčím myším injektován subkutánně ve střední skapulární oblasti dvakrát denně urokortin nebo kontrolní nosič (fyziologický roztok) po dobu deseti dnů. Urokortin byl podáván v dávkách, které jsou uvedeny u popisu obrázků 6A a 6B. Urokortin byl koaplikován dvakrát denně intraperitoneálním dávkováním inhibitoru fosfodiesterázy theophyllinu (30 mg/kg). Desátý den byl odstraněn mediální lýtkový sval a přední holenní sval a byly zváženy kvůli stanovení stupně atrofie.
Obrázek 7 (Obr. 7) ukazuje, že sauvagin inhibuje atrofii předního holenního svalu (Obr. 7A), (EDL) (Obr. 7B), šikmého svalu lýtkového (Obr. 7C), mediálního lýtkového svalu (Obr. 7D) a lýtkových svalů, kde atrofie je indukována denervací.
-23Navíc sauvagin způsoboval statisticky významnou hypertrofii nedenervovaného svalu EDL (Obr. 7B). Legenda: A - fyziologický roztok (kontrolní); B - sauvagin (0,0G3 mg/kg) + theophyllin; C - sauvagin (0,01 mg/kg) + theophyllin; D sauvagin (0,03 mg/kg) + theophyllin; # - p < 0,05 v porovnání s odpovídajícími kontrolami. Po denervací pravého sedacího nervu byl samčím adrenalektomizovaným potkanům (adrenalektomizovaní potkani byly používány k odstranění účinků aktivace HPA osy pomocí agonizmu CRFiR indukujících atrofii kosterního svalstva) podáván subkutánně ve střední skapulární oblasti dvakrát denně buď sauvagin nebo kontrolní nosič (fýziologický roztok) po dobu devíti dnů v dávkách uvedených výše. Sauvagin byl koaplikován s 30 mg/kg theophyllinu. Devátý den byl odstraněn přední holenní sval, extenzor digitorum longus (EDL), šikmý sval lýtkový, mediální lýtkový sval a lýtkový sval a byly zváženy kvůli stanovení stupně dystrofie.
Obrázek 8 (Obr. 8) ukazuje, že sauvagin inhibuje atrofii pozorovanou u normální myši, ale ne u myši s knockoutovaným CRF2R na myším modelu atrofie indukované denervací sedacího nervu. Legenda: A - C normální myš; D - F myš s knockoutovaným CRF2R. A a D - voda (kontrolní); B a E - sauvagin (0,3 mg/kg/d); C a F - sauvagin (1,0 mg/kg/d); * - p < 0,05 v porovnání s fyziologickým roztokem. Po denervací sedacího nervu byl samčím normálním myším a myším s knockoutovaným CRF2R podáván sauvagin nebo kontrolní nosič kontinuální infuzí Alzetovou osmotickou minipumpou rychlostí 5 μΙ/hodinu po dobu devíti dnů, přičemž výše dávky je uvedena výše. Devátý den byl odstraněn přední holenní sval a byl zvážen kvůli stanovení stupně atrofie.
Obrázek 9 (Obr. 9) ukazuje, že sauvagin inhibuje úbytek EDL způsobený nečinností a hmotu šikmého svalu lýtkového (Obr. 9A) a inhibuje úbytek funkce svalu podle měření absolutní síly (Obr. 9B) na myším modelu atrofie indukované nečinností v důsledku fixace končetiny. Legenda: A - kontrolní nefixovaný sval; B - fixovaný sval, fyziologický roztok; C - fixovaný sval, sauvagin (0,3 mg/kg) + theophyllin (30 mg/kg); * - p < 0,05 v porovnání s fyziologickým roztokem. Po fixaci pravé zadní končetiny byl samčím myším injektován subkutánně do střední skapulární oblasti dvakrát denně buď sauvagin nebo kontrolní nosič (fyziologický
-24roztok) po dobu deseti dnů v dávkách uvedených níže. Sauvagin byl koaplikován s 30 mg/kg theophyllinu. Desátý den byly odstraněny EDL a šikmý sval lýtkový a bylo provedeno měření absolutní síly a hmoty kvůli určení stupně atrofie.
III. Příprava CRFR, CRF nebo analog CRF nebo buněčných linií exprimujících CRFR
CRFiR, CRF2R, CRF a analoga CRF mohou být připravena pro různé účely, zahrnující, ale není to nikterak limitováno, generaci protilátek, použití jako činidel při screeningu podle předloženého vynálezu a použití jako farmaceutických činidel pro léčení atrofie kosterního svalstva. Odborníkovi v oboru bude jistě zřejmé, že pro některá provedení předloženého vynálezu budou purifikované polypeptidy nejpoužitelnější, zatímco u jiných provedení budou nejpoužitelnější buněčné linie exprimující polypeptidy. Například v situacích, ve kterých je důležité udržet strukturní a funkční charateristiky CRFR, např. při metodě screeningu k identifikaci potencionálních sloučenin, které aktivují CRFR, je žádoucí použít buňky exprimující funkční CRFR.
Protože CRF a analoga CRF jsou krátkými polypeptidy, odborník v oboru jistě pozná, že tyto polypeptidy budou nejvýhodněji získány přímou syntézou, spíše než rekombinantní prostředky, použitím technik známých v oboru. Navíc velký počet z těchto molekul jsou komerčně dostupné.
Tam, kde zdrojem CRFR je buněčná linie exprimující polypeptid, mohou buňky např. endogenně exprimovaný CRFR, být stimulovány ke zvýšení endogenní exprese CRFR nebo být geneticky upraveny kexprimaci CRFR. Metody stanovení, zda-li buněčná linie exprimuje požadovaný polypeptid jsou známy v oboru, např. detekce polypeptidu příslušnou protilátkou, použití DNAsondy k detekci mRNA kódující protein (např. Northern blotting nebo PCR) nebo měření vazby agens, který je selektivní pro požadovaný polypeptid (např. izotopicky značený selektivní agonista).
Zejména sem patří použití rekombinantní DNA-technologie při přípravě CRF^, CRF2R nebo buněčných linií exprimujících tyto polypeptidy. Tyto rekombinantní metody jsou dobře známy v oboru. K exprimaci rekombinantní
-25CRFtR nebo CRF2R je připraven expresní vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující požadovaný polypeptid za řízení jednoho nebo více regulačních prvků. Genomické nebo cDNA-sekvence kódující CRF1R a CRF2R z několika druhů byly popsány a jsou snadno dostupné v databázi GenBank (adres http://www.ncbi.nlm.nih.gov) nebo v databázi Derwent (adresa www.derwent.co,uk./geneseq/index.html), jakož i na výpisu ze sekvenční analýzy v této přihlášce vynálezu. Přístupová čísla pro sekvence CRFíR a CRF2R a odpovídající id. č. sek. jsou uvedena v tabulce I. Použitím těchto volně přístupných informací o sekvencích lze izolovat molekulu nukleové kyseliny kódující CRF^ nebo CRF2R ke screeningu genomické DNA nebo cDNA-knihovny s přirozenou nebo uměle syntetizovanou DNA-sondou pomocí metod dobře známých v oboru, např. PCR amplifikace sekvence z příslušné knihovny. Další metodou je použití oligonukleotidových primerů specifických pro požadovaný receptor k PCR amplifikaci cDNA přímo z mRNA izolované z konkrétní tkáně (např. kosterního svalstva). Tato izolovaná mRNA je dostupná komerčně. Odborník v oboru jistě rozpozná, že použitím sond ve formě nukleových kyselin odpovídajících částem známé sekvence receptoru CRFR může být získána homologní cDNA nebo genomické sekvence z jiných druhů použitím známých metod. Konkrétně jsou v metodách podle předloženého vynálezu použitelné receptory CRFR z druhů zahrnujících, ale není to nikterak limitováno, lidi, myši, krysy, prasata, opice, šimpanze, kosmany, psy, krávy, ovce, kočky, slepice a krocany. Metodami známými v oboru je molekula izolované nukleové kyseliny kódující požadovaný CRFR ligována do vhodného expresního vektoru. Tímto způsobem připravený expresní vektor je exprimován v hostitelské buňce a hostitelské buňky exprímující receptor jsou používány přímo při screeningu nebo je receptor izolován z hostitelských buněk exprimujících receptor a izolovaný receptor je používán při screeningu.
Hostitelské expresní vektorové systémy, které mohou být používány pro účely vynálezu zahrnují, ale není to nikterak limitováno: mikroorganizmy, např. bakterie (např. E. coli, B. subtilis), transformované expresními vektory rekombinantní bakteriofágové DNA, plasmidové DNA nebo kosmidové DNA, které
-26obsahují nukleotidové sekvence CRFR; kvasinky (např. Saccharomyces, Pichia) transformované expresními vektory rekombinantní kvasinky obsahující nukleotidové sekvence CRFR; systém hmyzích buněk infikovaných expresními vektory rekombinantního viru (např. bakulovirus) obsahující nukleotidové sekvence CRFR; systémy rostlinných buněk infikované expresními vektory rekombinantního viru (např. virus květákové mozaiky, virus tabákové mozaiky) nebo transformované expresními vektory rekombinantního plasmidu (např. Ti plasmid) obsahující nukleotidové sekvence CRFR; nebo systémy savčích buněk (např. COS, CHO, HEK293, NIH3T3) „harboring“ rekombinantní expresní konstrukty obsahující promotory odvozené od genomu savčích buněk (např. metallothioneinový promotor) nebo ze savčích virů (např. retrovirus LTR) a také obsahující nukleotidové sekvence CRFR.
Hostitelská buňka je používána k produkci požadovaného polypeptidu. Protože CRFR je molekula vázaná k membráně, je purifikována od membrán hostitelských buněk nebo je používán CRFR, i když je zakotvený v buněčné membráně, tzn. jsou používány celé buňky nebo frakce membrán buněk. Purifikace nebo fortifikace CRFR z takových expresních systémů je prováděna použitím vhodných detergentů a lipidových micel pomocí metod, které jsou dobře známy odborníkům v oboru.
V bakteriálních systémech může být výhodně vybrán velký počet expresních vektorů v závislosti na zamýšleném použití pro genový produkt, který je exprimován. Například, je-li produkováno velké množství takového proteinu pro generaci protilátek vůči CRFR, jsou žádoucí vektory, které řídí expresi vysokých hladin proteinových produktů. Odborník v oboru je schopný vytvořit takové vektorové konstrukty a purifikovat proteiny různými metodami, zahrnujícími selektivní purifikační technologie, např. selektivní sloupce pro fúzní proteiny a sloupce s protilátkou, a neselektivní purifikační technologie.
V hmyzím proteinovém expresním systému je používán bakulovirus A. californica viru jaderné polyedrie (AcNPV) jako vektor k exprimaci cizích genů v buňkách S. frugiperda. V tomto případě jsou nukleotidové sekvence CRFR klonovány do neesenciálních oblastí viru a umístněny pod kontrolu promotoru
-27AcNPV. Rekombinantní viry jsou pak používány k infekci buněk, ve kterých je inzertovaný gen exprimován, a protein je purifikován jednou z mnoha technik, které jsou známy odborníkům v oboru.
V savčích hostitelských buňkách může být používán velký počet expresních systémů na bázi viru. Použití těchto expresních systémů často vyžaduje vytvoření specifických iniciačních signálů ve vektorech pro úspěšný přepis inzertovaných nukleotidových sekvencí, což je důležité zejména v případě, kdy je používána část genu CRFR, který neobsahuje endogenní iniciační signál. Umístnění tohoto iniciačního signálu v rámci s kódující oblastí inzertované nukleotidové sekvence, jakož i přidání prvků zvyšujících transkripci a přepis a purifikace rekombinantního proteinu, je možno provést mnoha technologiemi, které jsou odborníkům v oboru známy. U savčích buněk je také důležitý výběr vhodného typu buňky, který je schopný nezbytných posttranslačních modifikací rekombinantního proteinu. Tyto modifikace, např. štěpení, fosforylace, glykosylace, atd., vyžadují výběr vhodné hostitelské buňky, která obsahuje modifikační enzymy. Tyto hostitelské buňky zahrnují, ale není to nikterak limitováno, CHO, HEK293, NIH3T3, COS, atd. a jsou známy odborníkům v oboru.
Pro dlouhodobou, vysokou expresi rekombinantních proteinů je výhodná stabilní exprese. Například mohou být geneticky upraveny buněčné linie, které stabilně exprimují CRFR. Odborník v oboru může pomocí známých metod, např. elektroporace, transfekce s fosforečnanem vápenatým nebo transfekce zprostředkované lipozómem, generovat buněčnou linii, která stabilně exprimuje CRFR, což je obvykle provedeno transfekčními buňkami využívajícími expresní vektory, které obsahují vhodné prvky řídící expresi (např. promotorové sekvence, zesilovací sekvence, sekvence ukončující transkripci, polyadenylační místa, místa začínající translaci, atd.), volitelný markér a požadovaný gen. Volitelný markér může být buď obsažen ve stejném vektoru jako požadovaný gen nebo na separátním vektoru, který je kotransfektován se sekvencí CRFR obsahující vektor. Díky volitelnému markéru v expresním vektoru může vznikat rezistence vůči výběru a umožňovat tak buňkám stabilně integrovat vektor do svých chromosomů a kultivovat je k tvorbě lokusu, který může být následně klonován a expandován • · · · · · · • · · · ·· · · • ··· · · · · · · • · · · · · ···· · · ··· ··
-28do buněčných linií. Alternativně expresní vektor může umožňovat výběr buňky exprimující volitelný markér využívající fyzikální atribut markéru, např. exprese zeleného fluoreskujícího proteinu (GFP) umožňuje výběr buněk exprimujících markér využívající FACS („fluorescence activated cell sorting analysis“).
Odborník v oboru bude jistě schopen vybrat vhodný typ buňky pro transfekci za účelem umožnění výběru buněk, do kterých bude požadovaný gen úspěšně integrován. Například tam, kde volitelný markér je thymidinkináza, hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferáza nebo adeninfosforibosyltransferáza viru herpes simplex, by mohl být vhodný typ buňky tk-, hgprt- nebo aprt-buňky. Nebo tam, kde volitelný markér je dhfr, gpt, neo nebo hygro, který dodává rezistenci methotrexátu, mykofenolové kyselině, G-418 nebo hygromycinu, mohou být používány normální buňky. Tyto rekombinantní buněčné linie jsou použitelné pro identifikaci potencionálních sloučenin, které ovlivňují aktivitu CRFR.
IV. Příprava protilátek CRFR
Protilátky, které selektivně rozpoznávají jeden nebo více epitopů CRFR také spadají do předloženého vynálezu. Tyto protilátky zahrnují, např. polyklonální protilátky, monoklonální protilátky, chimérické protilátky, lidské protilátky, jednořetězcové protilátky, Fab fragmenty, F(ab')2 fragmenty, molekuly produkované pomocí knihovny exprimující Fab, lidské protilátky (polyklonální nebo monoklonální) produkované v transgenních myších a kterékoliv výše uvedené fragmenty vázající epitop. Pro terapeutické použití jsou preferovány chimérické nebo lidské protilátky; lidské protilátky jsou nejvýhodnější.
Protilátky mohou být využívány v souladu se schématy screeningu popsanými v předloženém vynálezu pro vyhodnocení testovaných sloučenin, např. pro imobilizaci polypeptidů CRFR, nebo takové protilátky mohou být používány v souladu s technikami genové terapie k vyhodnocení např. exprese CRFR buď v buňkách nebo přímo v pacientově tkáních, do kterých byly tyto geny zavedeny. Navíc protilátky podle předloženého vynálezu jsou použitelné při ošetření atrofie kosterního svalstva. Protilátky selektivní pro CRFR mohou být zkoumány metodami podle předloženého vynálezu k identifikaci podskupiny protilátek, které *· ···· • ··· ·
-29jsou agonisté CRFR. Dále anti-idiotypické protilátky generované proti protilátkám specifickým pro CRF nebo analog CRF mohou být použitelné jako agonisté CRFR a jako protilátky anti-CRFR mohou být zkoumány na svoji schopnost aktivovat CRFR metodami podle předloženého vynálezu.
Kvůli produkci protilátek mohou být imunizována hostitelská zvířata injekcí CRFR, CRF nebo analogu CRF, protilátkou anti-CRF, protilátkou analogu antiCRF nebo jejich imunogenními fragmenty pomocí metod, které jsou dobře známy v oboru. Pro přípravu anti-idiotypické protilátky je imunogen protilátka anti-CRF nebo protilátka analogu anti-CRF. Produkce anti-idiotypických protilátek je popsána např. v patentu US č. 4,699,880, zde je uvedeno jako odkaz. Vhodná hostitelská zvířata zahrnují, ale není to nikterak limitováno, králíky, myši, kozy, ovce a koně. Imunizační techniky jsou dobře známy v oboru. Polyklonální protilátky mohou být purifikovány ze séra imunizovaných zvířat nebo monoklonální protilátky mohou být generovány metodami, které jsou dobře známy v oboru. Tyto techniky zahrnují, ale není to nikterak limitováno, dobře známé hybridomové techniky podle Kohlera a Milsteina, lidské B-buněčné hybridomové techniky a EBV hybridomové techniky. Monoklonální protilátky mohou být kterékoliv imunoglobulinové třídy, zahrnující IgG, IgE, IgM, IgA a IgD obsahující buď kappa nebo lambda lehké řetězce.
Pokud jsou protilátky používány pro terapeutické ošetření lidských pacientů, jsou z důvodu imunogenicity nehumánních protilátek v lidech preferovány chimérické protilátky před nelidskými protilátkami. Techniky produkce a použití chimérických protilátek jsou známy v oboru a jsou popsány např. v patentu US č. 5,807,715; 4,816,397; 4,816,567; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180,370; a 5,824,307, vseje zde uvedeno jako odkaz.
Zcela lidské protilátky jsou žádoucí zejména pro terapeutické ošetření lidských pacientů, protože jsou imunogenější než nelidské protilátky nebo chimérické protilátky. Tyto protilátky mohou být produkovány pomocí transgenních myší, které jsou v podstatě neschopné exprimovat gen endogenního imunoglobulinu s těžkým a lehkým řetězcem, ale které mohou exprimovat lidské geny těžkého a lehkého řetězce. Transgenní myši jsou imunizovány normálním
-30způsobem s vybraným antigenem, např. celá nebo část CRF2R. Monoklonální protilátky zaměřené proti antigenu jsou získány pomocí konvenční hybridomové technologie z těchto imunizovaných transgenních myší. Tato technologie je popsána detailně v patentech US č. 5,874,299; 5,877,397; 5,569,825;
5,661,016;5,770,429; a 6,075,181, všechny jsou zde uvedeny jako odkaz.
Jako alternativa vůči získání lidských imunoglobulinů přímo z kultury hybridomových buněk může být používání hybridomových buněk jako zdroje přeorganizovaných lokusů těžkého a lehkého řetězce pro následnou expresi nebo genetickou manipulaci. Izolace genů z takových buněk produkujících protilátku je zřejmá, jelikož jsou dostupné vysoké hladiny příslušných mRNA. Regenerované přeorganizované lokusy mohou být manipulovány podle potřeby. Například konstantní oblast může být eliminována nebo vyměněna za oblast s rozdílným izotypem nebo různé oblasti mohou být připojeny k oblastem kódujícím jednoduchý řetězec Fv. Tyto techniky jsou popsány ve WO 96/33735 a WO 96/34096, všechny jsou zde uvedeny jako odkaz.
V. Výběr testovaných sloučenin
Sloučeniny, u kterých může být proveden screening v souladu s testy podle předloženého vynálezu, zahrnují, ale není to nikterak limitováno, knihovny známých sloučenin, zahrnující přirozené produkty, např. rostlinné nebo zvířecí extrakty, syntetické chemikálie, biologicky aktivní materiály, zahrnující proteiny, peptidy, např. rozpustné peptidy, zahrnující, ale není to nikterak limitováno, membrány náhodných peptidových knihoven a molekulární knihovnu vytvořenou z D- nebo L-aminokyselin, fosfopeptidů (zahrnující, ale není to nikterak limitováno, Členy náhodné nebo částečně degenerované, řízené fosfopeptidové knihovny), protilátky (zahrnující, ale není to nikterak limitováno, polyklonální, monoklonální, chimérické, lidské, anti-idiotypické nebo protilátky s jednoduchým řetězcem a Fab, F(ab')2 a expresní knihovny fragmentů Fab a jejich fragmenty vázající epitop), organické a anorganické molekuly.
Kromě tradičních zdrojů testovaných sloučenin umožňuje počítačové modelování a způsoby vyhledávání racionální výběr testovaných sloučenin ·· ·* • · · · • · · • ··· · • · ···· ·· ·* ·· ···· • · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ·· ·*
-31 využitím strukturní informace zvazbeného místa CRFR pro ligand nebo z již identifikovaných agonistů CRFR. Takový racionální výběr testovaných sloučenin může snížit počet testovaných sloučenin, u kterých musí být proveden screening za účelem identifikace potencionální terapeutické sloučeniny. CRFR jsou GPCR, a tudíž znalost sekvence proteinu CRFR umožňuje vytvoření modelu jeho vazebného místa, které může být používáno ke screeningu potenciální ligandů. Tento proces může být proveden několika způsoby známými z literatury. Nejrobustnější přístup zahrnuje vytvoření sekvenční linie sekvence CRFR kvůli templátu (odvozeného z krystalických struktur bakterio-rhodopsinu nebo rhodopsinu nebo jiný model GPCR), konverze aminokyselinových struktur a upravení modelu molekulární mechanikou a vizuálním průzkumem. Pokud nemůže být dosaženo silné sekvenční linie, může být model vytvořen stavebními modely hydrofóbních helixů, které jsou pak fitovány dohromady rotací a translací každého helixu asociovaného s jinými vycházeje z obecné konstrukce známých rhodopsinových struktur. Údaje z mutace, související kontakty typu zbytek-zbytek, mohou být také používána k umístnění helixů asociovaných jeden s druhým tak, aby byly dosaženy tyto spoje. Kvůli usnadnění pozice helixů vznikem interakcí, které by stabilizovaly vazbu ligandu, lze během tohoto procesu používat dokování známých ligandů do kavity vazebného místa uvnitř helixů. Model může být zkompletován doladěním molekulární mechanikou a výstavba smyček intracelulárních nebo extracelulárních smyček pomocí modelovacích technik se standardní homologií. Obecné informace týkající se struktury GPCR a modelování mohou být nalezeny vSchoneberg, T. et al., Molecular and Cellular Endocrinology, 151:181-193 (1999), Flower, D., Biochimica et Biophysica Acta, 1422:207-234 (1999) a Sexton, P. M., Current Opinion in Drug Discovery and
Development, 2(5):440-448 (1999).
Jakmile je model hotov, může být používán spolu s jedním z několika existujících počítačových programů ke zmenšení počtu sloučenin ke screeningu pomocí screeningových metod podle předloženého vynálezu. Nejvíce používaný je program DOCK (UCSF Molecular Design Institute, 533 Parnassus Ave, U-64, Box 0446, San Francisco, Calif. 94143-0446). V několika jeho variantách může
• ·
-32prohledávat databáze komerčních a/nebo registrovaných sloučenin z hlediska stericity a hrubé elektrostatické komplementarity vůči vazebnému místu. Často bylo zjištěno, že molekuly s dobrým skórem z programu DOCK mají větší šanci být ligandy. Další program, který může být používán je FLEXX ((Tripos lne., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144-2913 (www.tripos.com)). Tento program, který je výrazně pomalejší, je obvykle omezen na prohledávání menších databází sloučenin. Vyhodnocovací schéma ve FLEXXu je detailnější a obvykle poskytuje lepší odhad vazebné schopnosti než program DOCK. FLEXX je nejlépe používán jako potvrzení výsledků dosažených s programem DOCK nebo k prozkoumání knihoven sloučenin, které jsou vytvořeny kombinatoriálně ze známých ligandů nebo templátu.
VI. Screeningové metody identifikace potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva
Díky tomu, že CRF2R hraje určitou roli při regulaci atrofie kosterního svalstva, lze provést sereening jedné nebo více testovaných sloučenin za účelem identifikace potencionálních sloučenin, které mohou být skutečně používány pro profylaktické nebo terapeutické ošetření atrofie kosterního svalstva. Tento vynález poskytuje metody screeningu sloučenin z hlediska jejich schopnosti vázat se na CRF2R, aktivovat CRF2R, prodlužovat nebo zvyšovat CRF2R nebo aktivaci dráhy přenosu signálu CRF2R nebo zvyšovat expresi genů CRF2R nebo CRF.
Protože jsou CRF2R a CRF1R homologní proteiny, očekává se, že některé části agonistů CRF2R budou také fungovat jako agonisté CRF^. Jak je uvedeno výše, aktivace CRF1R indukuje aktivaci HPA osy a doprovodnou produkci kortikosteroidů. Ve většině případů, u kterých je třeba zvýšení hmoty nebo funkce svalstva, není žádoucí aktivovat HPA osu. Kromě screeningu sloučenin na jejich schopnost aktivovat CRF2R poskytuje také vynález použití CRF2R a CRF1R ke screeningu selektivních agonistů CRF2R. Pokud je vybraná potencionální sloučenina použitelná k ošetření akutní nebo chronické svalové atrofie, která nesouvisí se svalovou dystrofií, je žádoucí, aby možné sloučeniny byly selektivní pro CRF2R. Výhodně potencionální sloučenina vykazuje desetinásobnou
-33selektivitu pro CRF2R oproti CRFiR (tzn. desetinásobně aktivnější proti CRF2R než proti CRFiR), výhodně je stonásobně selektivnější a nejvýhodněji tisícinásobnější nebo ještě větší selektivita. Z publikovaných studií, ukazujících užitek kortikosteroidové terapie při ošetření svalové dystrofie, může být výhodné, aby si agonista CRF2R uchovával určitou míru agonizmu vůči CRFiR za předpokladu, že je používán k ošetření svalové dystrofie. Tudíž pro ošetření svalové dystrofie je kvůli podobnému koncentračnímu rozpětí preferována sloučenina s nižší selektivitou, jenž aktivuje CRF2R, jakož i CRFiR. Výhodně je potencionální sloučenina stonásobně selektivnější pro CRF2R než proti CRFiR, výhodněji desetinásobně a nejvýhodněji neexistuje selektivita mezi CRF2R a CRFiR (tzn. aktivita potencionální sloučeniny je v podstatě podobná pro CRF2R i CRFiR). Také v tomto případě může být výhodnější, aby sloučenina byla kompletním agonistou CRF2R a zároveň částečným agonistou CRFiR. Tato potencionální sloučenina by tudíž měla mít začleněno omezení pro maximální stupeň elevace kortisolu a potenciál pro svalovou atrofii, zatímco antiatrofický účinek zprostředkovaný CRF2R by mohl být se zvyšující se dávkou zvýšen. Odborník v oboru by měl být schopen snadno určit, zda-li potencionální sloučenina je kompletním nebo parciálním agonistou CRFiR nebo CRF2R metodami, které jsou známy v oboru.
Pro screening sloučeniny, které budou skutečně využívány k regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva díky CRF2R u lidí, je výhodné, aby in vitro screening byl prováděn s CRF2R s aminokyselinovou sekvencí, která je více než z 80% shodná s id. č. sek..2 a výhodněji více než z 90% shodná s id. č. sek.: 10. Výhodněji bude proveden screening testovaných sloučenin proti lidské, myší nebo potkaní CRF2R, nejvýhodněji lidské. U screeningu sloučenin, které budou skutečně používány k regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva u nehumánních species, je výhodné použít CRF2R ze species, pro které je zamýšleno ošetření.
Pro screening kvůli stanovení míry aktivity testované nebo potencionální sloučeniny vůči CRFiR a také kvůli stanovení jakou selektivitu, pokud nějaká existuje, vykazuje potencionální sloučenina vůči CRF2R než CRFiR, je výhodné, • · * • ···
-34aby byl počáteční screening prováděn s CRFiR a aminokyselinovou sekvencí, která je více než z 80% shodná s id. č. sek.:2 a výhodněji více než z 90% shodná s id. č. sek.:2. Výhodněji bude proveden screening testovaných sloučenin proti lidské, myší nebo potkaní CRFiR, nejvýhodněji lidské. U screeningu sloučenin, které budou skutečně používány k regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva u nehumánních species, je výhodné použít CRFiR ze species, pro které je zamýšleno ošetření.
Pro způsoby podle předloženého vynálezu existuje velké množství aplikací, nicméně použití i jedné sloučeniny ve způsobu podle předloženého vynálezu spadá do termínu „screening“. Testované sloučeniny, které se vážou na CRF2R, aktivují CRF2R, prodlužují nebo zvyšují agonistou indukovanou aktivaci CRF2R nebo dráhy přenosu signálu CRF2R nebo zvyšují expresi CRF2R nebo genu CRF, což je určeno způsobem podle předloženého vynálezu, jsou označovány jako potencionální sloučeniny. Tyto potencionální sloučeniny mohou být používány k regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva. Nicméně typičtěji tato první úroveň in vitro screeningu poskytuje prostředky, kterými lze vybrat užší rozmezí sloučenin, tzn. potencionálních sloučenin, které jsou vhodné pro další výzkum v dalších úrovních screeningu. Odborník v oboru také rozpozná, že využití předloženého vynálezu je také v identifikaci sloučenin ze skupiny jedné nebo více testovaných sloučenin, podskupiny (výběru) sloučenin, které jsou vhodné pro další zkoumání. Odborník v oboru také rozpozná, že testy podle předloženého vynálezu jsou použitelné k vytvoření žebříčku využitelnosti konkrétních potencionálních sloučenin ve vztahu k dalším potencionálním sloučeninám. Například potencionální sloučenina, která aktivuje CRF2R při 1000 nM (ale ne při 10 nM) má menší výhodnost než sloučenina, která aktivuje CRF2R při 10 nM. Využitím takových informací může odborník v oboru vybrat podskupinu potencionálních sloučenin identifikovaných v první úrovni screeningu pro další zkoumání. Jenom jako příklad lze uvést, že sloučeniny, které aktivují CRF2R v koncentracích menších než 200 nM, mohou být dále testovány na zvířecím modelu atrofie kosterního svalstva, poněvadž vyšší množství než 200 nM by nemusela být dále testována. Odborník v oboru dále rozpozná, že v závislosti na tom, jaká skupina • · • · · ··· · · · • ··· · ······!
• · ♦ ······ ···· ·· ··· ·· ·· ··
-35testovaných sloučenin je vybrána a jaká pozitiva jsou vybrána, bude pouze určitá část testovaných sloučenin identifikována jako potencionální sloučeniny, a že tato část může být velmi malá.
Níže popsané testovací systémy mohou být formulovány do kitů obsahujících CRF2R nebo buňky exprimující CRF2R, které mohou být zabaleny v různých kontainerech, např. vialky, trubkovitých mikrotitračních destiček s jamkami, lahviček, atd. Další činidla mohou být zahrnuta v separátních kontainerech a opatřena kitem, např. pozitivní kontrolní vzorky, negativní kontrolní vzorky, pufry a média pro kultivaci buněk.
V jednom provedení poskytuje vynález způsob screeningu jedné nebo více testovaných sloučenin k identifikaci potencioálních sloučenin, které se vážou na CRF2R. Způsoby stanovení vazby sloučeniny na receptor jsou v oboru dobře známy. Typicky zahrnují testy kroky inkubace zdroje CRF2R se značenou sloučeninou se známou vazbou na receptor v přítomnosti nebo absenci testované sloučeniny a stanovení množství navázané značené sloučeniny. Zdrojem CRF2R mohou být buď buňky exprimující CRF2R nebo některé formy izolovaného CRF2R, jak je popsáno v předloženém vynálezu. Značená sloučenina může být CRF nebo kterýkoliv analog CRF značený tak, aby mohl být měřen, výhodně kvantitativně (např. značený 125l, europiem, fluoresceinem, GFP, 35S-menthioninem). Tyto způsoby značení jsou dobře známy v oboru. Testované sloučeniny, které se vážou na CRFR způsobují snížení množství značeného ligandu vázaného na receptor, čímž snižují hladinu signálu v porovnání s kontrolními vzorky (absence testované sloučeniny). Byly popsány obměny této techniky, u kterých receptorová vazba v přítomnosti a absenci dekopulačních agens G-proteinu může rozlišit agonisty od antagonistů (např. vazba za absence nebo v přítomnosti analogu guaninového nukleotidu, tzn. GpppNHp). Viz Keen, M., Radioligand Binding Methods for Membrane Preparations and Intact celíš in Receptor Signál Transduction Protocols, R.A.J. Challis, (ed), Humana Press lne., Totoway N.J. (1997).
Protože je žádoucí odlišit mezi sloučeninami jejich specifickou vazbu na CRF2R v porovnání s CRFíR, měly by být testy popsané výše prováděny s buňkou nebo membránou z buněk, které exprimují pouze CRF2R nebo mohou být testy
-36prováděny s rekombinantním zdrojem CRF2R. Buňky exprimující obě formy CRFR mohou být modifikovány pomocí homologní rekombinace k inaktivaci nebo jiné deaktivaci genu CRFiR. Alternativně, pokud zdroj CRFR obsahuje více než jeden typ CRFR, pozadí signálu produkované receptorem, který není požadován, musí být odečteno od signálu získaného při testu. Pozadí odpovědi může být určeno mnoha metodami, zahrnujícími eliminaci signálu z CRFR, který není v zájmu, použitím antisensních, protilátkových nebo selektivních antagonistů. Známí antagonisté CRFR zahrnují antalarmin (CRF^ selektivní), antisauvagin-30 (CRF2R selektivní) a astressin (neselektivní pro CRFiR/CRF2R).
V dalším provedení poskytuje předložený vynález způsoby screeningu testovaných sloučenin na identifikaci potencionálních sloučenin, které aktivují CRF2R a/nebo CRF1R. Typicky jsou testy na buněčné bázi, nicméně jsou známy bezbuněčné testy, které jsou schopné rozlišit vazbu agonisty a antagonisty, jak je popsáno výše. Testy na bázi buněk zahrnují kroky uvedení buněk, které exprimují CRFiR nebo CRF2R, v kontakt s testovanou sloučeninou nebo kontrolou a měření aktivace CRFR měřením exprese nebo aktivity komponent drah přenosu signálu CRFR.
Jak je uvedeno v odstavci výše, ukazuje se, že CRFR se kuplují několika různými drahami, zahrnujícími Gas, Gaq nebo Gai v závislosti na typu buňky. Záměr je, aby aktivace CRFR agonistou umožňovala receptoru přenést signál kteroukoliv z těchto drah za předpokladu, že nezbytné složky dráhy se nacházejí v konkrétním typu buňky. Tudíž za účelem screeningu aktivace CRFR může být v testu používána kterákoliv z drah přenosu signálu jako reálná hodnota, i kdyby relevantní typ buňky pro ošetření in vivo spojoval CRFR s atrofii kosterního svalstva rozdílnou drahou. Odborník v oboru by měl rozpoznat, že screening by měl být účinný pro identifikaci použitelných agonistů CRFR nezávisle na dráze, kterou byla měřena aktivace receptoru. Analýzy měření aktivace těchto signálních drah jsou v oboru známy.
Například po kontaktu s testovanou sloučeninou mohou být připraveny lyzáty buněk a testovány z hlediska indukce cAMP. cAMP vzniká při odpovědi na aktivaci G„s. Protože Gas je aktivován receptory jinými než CRFR, a protože
-37testovaná sloučenina může uplatňovat svůj efekt přes CRFR nebo jiným mechanizmem, jsou důležitá dvě kontrolní srovnání pro určení, zda-li testovaná sloučenina zvyšuje hladiny cAMP via aktivaci CRFR. Jedna kontrola srovnává hladinu cAMP buněk zkontaktovaných testovanou sloučeninou a hladinu cAMP buněk zkontaktovaných kontrolní sloučeninou (tzn. nosič, ve kterém je testovaná sloučenina rozpuštěna). Pokud testovaná sloučenina zvyšuje hladiny cAMP v porovnání s kontrolní sloučeninou, znamená to, že testovaná sloučenina zvyšuje nějakým mechanizmem cAMP. Další kontrola srovnává hladiny cAMP, CRFR exprimující buněčnou linii a buněčnou linii, která je v podstatě stejná kromě toho, že neexprimuje CRFR, kde obě buněčné linie byly ošetřovány testovanou sloučeninou. Pokud testovaná sloučenina zvyšuje hladiny cAMP v buněčné linii exprimující CRFR v porovnání s buněčnou linií neexprimující CRFR, znamená to, že testovaná sloučenina zvyšuje cAMP via aktivaci CRFR.
Ve specifickém provedení předloženého vynálezu je měřena indukce cAMP použitím DNA-konstruktů obsahujících element responzivní na cAMP připojený ke kterémukoliv z reportérových genů, jenž mohou být zavedeny do buněk exprimujících CRFR. Tyto reportérové geny zahrnují, ale není to nikterak limitováno, chloramfenikolacetyltransferázu (CAT), luciferázu, glukuronidsyntetázu, růstový hormon, fluorescentní proteiny (např. Green Fluorescent Protein) nebo alkalickou fosfatázu. Po expozici buněk testované sloučeniny může být hladina exprese reportérového genu kvantifikována za kvůli stanovení schopnosti testované sloučeniny zvyšovat hladiny cAMP, a tím určit schopnost testovaných sloučenin aktivovat CRFR.
Buňky použitelné v tomto testu jsou stejné jako pro shora uvedený test vazby CRFR kromě toho, že buňky využité v testech aktivace výhodně exprimují funkční receptor, který poskytuje statisticky signifikantní odpověď na CRF nebo jeden nebo více analog CRF. Kromě použití buněk exprimujících úplné CRFR, mohou být buňky geneticky upraveny tak, aby exprimovaly CRFR obsahující doménu receptoru vázající ligand spřaženou s reportérovými elementy, nebo fyzicky modifikovanou tak, aby obsahovala reportérové elementy, nebo interagovala se signálními proteiny. Například standardní CRFR nebo fragment • · · ·
-38CRFR může být fúzován s G-proteinem, což vede k aktivaci fúzovaného G-proteinu po navázání agonisty na část CRFR fúzního proteinu. (Seifert, R. etal., Trends Pharmacol. Sci. 20:383-389 (1999)). Buňky by také měly výhodně vykazovat charakteristické znaky v závislosti na snímání maximalizace induktivní odpovědi CRF nebo analogu CRF, např. pro detekci silné indukce reportérového genu CRE. Výhodná by měla být (a) nízká hladina cAMP; (b) G-protein schopný interakce s CRFR; (c) vysoká hladina adenylylcyklázy; (d) vysoká hladina proteinkinázy A; (e) nízká hladina fosfodiesteráz; a (f) vysoká hladina proteinu vázajícího element odpovědi cAMP. Ke zvýšení odpovědi na CRF a analoga CRF by mohly být hostitelské buňky geneticky upraveny k exprimaci většího množství vhodných faktorů nebo menších množství nevhodných faktorů. Navíc by mohly být alternativní dráhy pro indukci reptoru CRE eliminovány ke snížení základních hladin.
V některých případech odpovědi s G-proteinem spřaženého receptoru se zmírňují nebo se stanou desenzibilizovanými po prodloužené expozici agonisty. Další provedení předloženého vynálezu poskytuje způsoby identifikace sloučenin, které prodlužují nebo zvyšují aktivaci CRF2R indukovanou agonistou nebo dráhu přenosu signálu CRF2R při odpovědi na agonistů CRF2R. Tyto sloučeniny mohou být používány např. ve spojitosti s agonistou CRF2R pro ošetření atrofie kosterního svalstva. Typicky metoda využívá test na buněčné bázi obsahující v jakémkoliv pořadí nebo současně (i) uvedení buněk v kontakt s testovanou sloučeninou; (ii) ošetření buněk exprimujících funkční CRF2R agonistou CRF2R při koncentraci agonisty a po dobu expozice agonista-receptor, která je dostačující k desenzibilizaci receptoru; pak (iii) stanovení hladiny aktivace CRF2R. Odborník v oboru rozpozná, že na desenzibilizaci receptoru se podílí několik mechanizmů, zahrnujících, ale není to nikterak limitováno, fosforylaci receptoru, internalizaci nebo degradaci receptoru a potlačenou modulaci dráhy přenosu signálu CRFR. Odborník v oboru může určit příslušnou dobu (např. před, během nebo po ošetření agonistou) kontaktu buňky s testovanou sloučeninou v závislosti na zvoleném mechanizmu desenzibilizace. Například kontaktem buněk s testovanými sloučeninami po ošetření agonistou lze detekovat ty testované sloučeniny, které ··· ·
-39blokují desenzibilizaci receptoru, který se objevuje jako výsledek fosforylace receptoru.
V dalším provedení vynález poskytuje způsob screeningu jedné nebo více testovaných sloučenin k identifikaci potencionálních sloučenin, které regulují transkripci z genu CRF2R nebo regulaci exprese CRF2R. Potencionální sloučeniny, které regulují transkripční aktivitu genů CRFR mohou být identifikovány pomocí reportérového genu operativně asociovaného s regulační oblastí CRF2R (konstrukt reportérového genu). Tyto metody jsou známy v oboru. V jedné takové metodě je konstrukt reportérového genu uveden v kontakt s testovanou sloučeninou v přítomnosti zdroje buněčných faktorů a je stanovena hladina exprese reportérového genu. Testovaná sloučenina, která způsobuje zvýšení hladiny exprese v porovnání s kontrolním vzorkem je indikací potencionální sloučeniny, která zvyšuje transkripci genu CRF2R. K získání buněčných faktorů potřebných pro in vitro nebo in vivo transkripci jsou připraveny buňky nebo buněčné extrakty z kteréhokoliv typu buňky, který normálně exprimuje CRF2R.
Potencionální sloučeniny, které regulují expresi CRF2R mohou být také identifikovány metodou, při které je buňka uvedena v kontakt s testovanou sloučeninou a stanovena exprese CRFR. Hladina exprese CRF2R v přítomnosti testované sloučeniny je porovnána s hladinou exprese při absenci testované sloučeniny. Testované sloučeniny, které zvyšují expresi CRF2R jsou identifikovány jako potencionální sloučeniny zvyšující hmotu nebo funkci svalstva. Tato metoda detekuje potencionální sloučeniny, které zvyšují transkripci nebo translaci CRF2R, nebo které zvyšují stabilitu mRNA nebo proteinu CRF2R.
V dalším provedení poskytuje předložený vynález způsoby screeningu jedné nebo více sloučenin k identifikaci potencionálních sloučenin, které regulují expresi CRF nebo analogu CRF. Tyto testy jsou prováděny v podstatě podle výše uvedeného způsobu k identifikaci potencionálních sloučenin, které regulují expresi CRFR s následujícími modifikacemi. K identifikaci potencionální sloučeniny, která reguluje transkripci z genu CRF nebo genu analogu CRF je reportérový gen operativně asociován s regulační oblastí požadovaného genu CRF nebo genu • · ·· ····
-40analogu CRF a zdroj buněčných faktorů by měl být z buňky exprimující požadovaný gen.
VII. Screening potencionálních sloučenin pomocí modelů atrofie kosterního svalstva
Potencionální sloučeniny vybrané z jedné nebo více testovaných sloučenin in vitro testem podle shora popsaného způsobu mohou být dále testovány z hlediska své schopnosti regulovat hmotu nebo funkci kosterního svalstva na modelových systémech atrofie a/nebo hypertrofie kosterního svalstva. Tyto modely atrofie nebo hypertrofie kosterního svalstva zahrnují modely in vitro buněčné kultury i in vivo zvířecí modely atrofie kosterního svalstva. Tyto další úrovně screeningu jsou použitelné k dalšímu zúžení rozmezí potencionálních sloučenin, které slouží k dalšímu výzkumu, např. klinickým zkouškám.
Modely svalové atrofie na buněčné kultuře
V oboru jsou známy in vitro modely atrofie kosterního svalstva. Tyto modely jsou popsány např. Vandenburgh, Η. H., In Vitro 24:609-619 (1988), Vandenburgh, Η. H. et al., J. of Biomechanics, 24 Suppl 1:91-99 (1991), Vandenburgh, Η. H et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 24(3):166-174 (1988), Chromiak, J. A., et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 34(9):694-703 (1998), Shansky, J., et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 33(9):659-661 (1997), Perrone, C. E. et al., J. Biol. Chem. 270(5):2099-2106 (1995), Chromiac, J. A. and Vandenburgh, Η. H., J. Cell. Physiol. 159(3):407-414 (1994) a Vandenburgh, Η. H. and Karlisch, P., In Vitro Cell. Dev. Biol. 25(7):607-616 (1989). Takové modely jsou použitelné, ale ne potřebné, po in vitro screeningu popsaném výše kvůli zmenšení rozmezí potencionálních sloučenin, které je výhodné testovat na zvířecím modelu. Modely buněčné kultury jsou ošetřeny potencionálními sloučeninami a odpověď modelu na ošetření je měřena vyhodnocením změn ve svalových markérech, např. syntéza nebo degradace svalového proteinu, změny v hmotě nebo kontraktilní funkci kosterního svalstva. U sloučenin, které indukují
• · · • · · · · • · ···· ··
-41 výrazné změny v markérech kosterního svalstva, je dále typicky proveden screning na zvířecím modelu atrofie kosterního svalstva.
Zvířecí modely atrofie kosterního svalstva
Potencionální sloučeniny jsou podávány nelidským zvířecím subjektům a odpověď zvířat je monitorována např. vyhodnocením změn v markérech atrofie nebo hypertrofie, např. hmoty kosterního svalstva, funkce kosterního svalstva, svalu nebo plochy příčného řezu myovláknem, obsah kontraktilního proteinu, obsah nekontraktilního proteinu nebo biochemický nebo genetický markér, který koreluje se změnou hmoty nebo funkce kosterního svalstva. Potencionální sloučeniny, které indukují hypertrofii kosterního svalstva nebo zabraňují kterémukoliv aspektu atrofie kosterního svalstva, by měly být povžovány za eventuální terapeutické kandidáty pro ošetření lidské atrofie kosterního svalstva a jsou zde označovány jako potencionální terapeutické sloučeniny. Kromě vyhodnocení schopnosti potencionální sloučeniny regulovat atrofii kosterního svalstva mohou být v tomto testu detekovány také nežádoucí vedlejší účinky, např. toxicita. Absence nepřijatelných vysokých hladin vedlejších účinků může být používána jako další kritérium výběru potencionálních terapeutických sloučenin.
V oboru je znám velký počet zvířecích modelů atrofie kosterního svalstva, např. modely popsané v následujících odkazech: Herbison, G. J., et al. Arch. Phys. Med. Rehabil. 60:401-404 (1979), Appell, H-J. Spoříš Medicine 10:42-58 (1990), Hasselgren, P-O. and Fischer, J. E. World J. Surg. 22:203-208 (1998), Agbenyega, E. T. and Wareham, A. C. Comp. Biochem. Physiol. 102A:141-145 (1992), Thomason, D. B. and Booth, F. W. J. Appl. Physiol. 68:1-12 (1990), Fitts, R. H., etal. J. Appl. Physiol. 60:1946-1953 (1986), Bramanti, P„ et al. Int. J. Anat. Embryol. 103:45-64 (1998), Cartee, G. D. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 50:137-141 (1995), Cork, L. C., et al. Prog. din. Biol. Pes. 229:241-269 (1987), Booth, F. W. and Gollnick, P. D. Med. Sci. Sports Exerc. 15:415-420 (1983), Bloomfield, S. A. Med. Sci. Sports Exerc. 29:197-206 (1997). Výhodná zvířata pro tyto modely jsou myši a potkani. Tyto modely zahrnují např. modely atrofie indukované nečinností, např. fixace nebo jiným způsobem imobilizované
• ··· · • · ···· ··
-42končetiny, suspenze zadní končetiny, kompletní imobilizace zvířete a stavy snížené gravity. Modely atrofie indukované nervovým poškozením zahrnují např. zhroucení nervu, odstranění části nervů, které inervují specifické svaly, poškození nervů toxickými agens a infekce nervů virovými, bakteriálními nebo eukaryotickými infekčními agens. Modely atrofie indukované glukokortikoidem zahrnují aplikaci dávky exogenního glukokortikoidu indukujícího atrofii zvířatům a stimulaci endogenní produkce kortikosteroidu, např. aplikací hormonů, které aktivují hypotalamickou-pituitární-adrenální (HPA) osu. Modely atrofie indukované sepsí zahrnují např. inokulaci organizmu indukujícího sepsi, např. bakterie, ošetření zvířete sloučeninami aktivujícími imunitní systém, např. extrakt ze stěny bakteriální buňky nebo endotoxin a punkci intestinálních stěn. Modely atrofie indukované kachexií zahrnují např. inokulaci zvířete tumorogenními buňkami s kachexii formujícím potenciálem, infekci zvířete infekčními agens (např. viry, které způsobují AIDS), což vede ke kachexii a ošetření zvířete hormony nebo cytokiny, např. CNTF, TNF, IL-6, IL-1, atd., které indukují kachexii. Modely atrofie indukované infarktem zahrnují manipulaci zvířete tak, aby se infarkt objevil s doprovodnou atrofii kosterního svalstva. Neurodegenerativní modely atrofie indukované onemocněním zahrnují autoimunní zvířecí modely, např. takové modely, které vznikají imunizací zvířete neuronálními komponentami. Modely atrofie indukované svalovou dystrofií zahrnují přirozené nebo umělé, geneticky indukované modely svalové dystrofie, např. mutace genu dystrofinu, vyskytujícího se v Mdx myši.
Zvířecí modely hypertrofie kosterního svalstva zahrnují např. modely zvýšeného používání svalu končetiny v důsledku inaktivace opačné končetiny, převažování po stavu atrofie indukované nečinností, opětovné využití svalu, který atrofoval v důsledku přechodného nervového poškození, zvýšené používání vybraných svalů v důsledku inaktivace synergického svalu (např. kompenzační hypertrofie), zvýšené využívání svalu v důsledku zvýšeného loadingu na svalu a hypetrofii vzniklé vysazením glukokortikoidu po atrofii indukované glukokortikoidem. Výhodné zvířecí modely atrofie zahrnují model atrofie sedacího • · ···· ·· ·· «···
-43nervu, model atrofie indukované glukokortikoidem a model atrofie z nečinnosti v důsledku fixace končetiny, které jsou popsány detailněji níže.
Model atrofie indukované denervací sedacího nervu zahrnuje anestezi zvířete následovanou chirurgickým odstraněním krátkého segmentu buď pravého nebo levého sedacího nervu, např. u myši je sedací nerv izolován přibližně ve střední linii podél kosti stehenní a je odstraněn 3-5 mm segment. Tímto způsobem se denervuje svalstvo dolní zadní končetiny, což vede k atrofii těchto svalů. Typicky je inervace dvouhlavého svalu na zadní straně stehna z levé strany intaktní, čímž se získá dostatečný pohyb kolena pro prakticky normální chůzi. Typicky je u neošetřovaných zvířat svalová hmota denervovaného svalu snížena z 30-50% po deseti dnech od denervace. Po denervací jsou testované sloučeniny podávány například injekcí nebo kontinuální infuzí, např. implantací osmotickou minipumpou (např. Alzet, Palo Alto, CA) ke stanovení jejich účinku na atrofii kosterního svalstva indukovanou denervací. V různých časech po denervací jsou zvířata usmrcena a svalstvo dolní končetiny z denervovaných i nedenervovaných končetin je rychle nařezáno a svaly zbavené šlach a pojivové tkáně jsou zváženy. Rozsah atrofie v zasaženém svalstvu je analyzován například měřením hmoty svalstva, cross-sectional oblasti svalu, cross-sectional oblasti myovlákna nebo obsahu kontraktilního proteinu.
Model atrofie indukované glukokortikoidem zahrnuje podání glukokortikoidu testovanému zvířeti, např. 1,2 mg/kg/denně dexamethasonu v pitné vodě. Typicky u neošetřovaných zvířat je hmota kosterního svalstva snížena z 30-50% po deseti dnech od podání dexamethasonu. Souběžně s podáním glukokortikoidu nebo po podání glukokortikoidu jsou testované sloučeniny podávány, např. injekcí nebo kontinuální infuzí, za účelem stanovení jejich účinku na atrofii kosterního svalstva indukovanou glukokortikoidem. V různých časech po podání glukokortikoidem je rozsah atrofie v postiženém svalstvu analyzován způsobem popsaným pro model denervace.
Model atrofie z nečinnosti v důsledku fixace končetiny zahrnuje fixaci jedné zadní končetiny zvířete od kolena dolu. Po deseti dnech fixace je svalová hmota typicky snížena z 20-40%. Po fixaci jsou testované sloučeniny podávány injekcí • · · · · ·· ·· ··
-44nebo kontinuální infuzí přes implantaci osmotické minipumpy (např. Alzet, Palo Alto, CA) za účelem stanovení jejich účinku na modelu atrofie z nečinnosti v důsledku fixace končetiny. V různých časech po fixaci končetiny je rozsah atrofie v zasaženém svalstvu analyzován způsobem popsaným pro model denervace.
Odborník v oboru rozpozná, že při screeningu sloučenin pro použití na lidech se kvůli rozdílům mezi lidskou CRF2R a CRF2R z jiných zvířecích druhů mohou vyskytnout určí se falešné pozitivní nebo negativní výsledky, které vznikají v případě, kdy je screening prováděn pomocí nehumánních CRF2R. Tudíž je výhodné provést iniciální in vitro screening pomocí lidské CRF2R. V některých případech mohou být identifikované potencionální sloučeniny aktivní pouze vůči lidskému receptoru a ne vůči nehumánnímu receptoru. V takových případech může být stále třeba určit, zda-li tyto potencionální sloučeniny jsou schopné regulovat hmotu nebo funkci kosterního svalstva v druhé úrovni screeningu. Protože tyto potencionální sloučeniny neaktivují nelidskou CRF2R, není doporučován standardní in vivo screening. V takových případech může být provedena druhá úroveň screeningu těchto potencionálních sloučenin na transgenních zvířatech, které exprimují lidské CRFR.
Zvířata kteréhokoliv druhu, zejména savci, zahrnující, ale není to nikterak limitováno, myši, potkany, králíky, morčata, prasta, kozy, psy a nehumánní primáty, které mohou být používány k vytvoření transgenních zvířat sCRFR. Preferováni jsou myši a potkani, nejvýhodněji myši. V oboru jsou známy různé techniky a mohou být používány k zavedení lidských transgenů CRFR do zvířat kvůli produkci zakládajících linií transgenních zvířat. Tyto techniky zahrnují, ale není to nikterak limitováno, pronukleární mikroinjekci, přenos genu do zárodečných linií zprostředkovaný retrovirem, genové manipulace v embryonálních kmenových buňkách, elektroporaci embryí a přenos genu zprostředkovaného spermatem.
Vlil. Způsoby genové terapie pro ošetření atrofie kosterního svalstva
Celková aktivita CRF2R může být zvýšena nadexprimací genu CRF2R (za zvýšení exprese CRF2R) nebo konstitutivně aktivního CRF2R v příslušné tkáni.
• · · · « ♦ • · · · · · ·· ·· ··
-45Hladiny CRF mohou být zvýšeny in vivo rovněž nadexprimací genu CRF. Nadexprimace těchto genů bude zvyšovat celkovou buněčnou aktivitu CRF2R, a tak regulovat atrofii kosterního svalstva. Požadovaný gen nebo geny jsou inzertovány do vektoru vhodného pro expresi v subjektu. Tyto vektory, zahrnují, ale není to nikterak limitováno, adenovirus, virus asociovaný s adenovirem, retrovirus a vektory herpes viru kromě dalších částic, které zavádějí DNA do buněk (např. liposom, částice zlata, atd.) nebo přímou injekcí DNA-expresního vektoru, který obsahuje požadovaný gen, do lidské tkáně (např. svalu).
IX. Farmaceutické formulace a způsoby použití
Potencionální sloučeniny nebo potencionální terapeutické sloučeniny identifikované zde popsanými způsoby screeningu mohou být podávány jednotlivcům k ošetření atrofie kosterního svalstva nebo k indukci hypertrofie kosterního svalstva. Pro tento účel zahrnuje předložený vynález způsoby a přípravky pro modulaci atrofie kosterního svalstva, zahrnující, ale není to nikterak limitováno, atrofii kosterního svalstva indukovanou nečinností v důsledku chirurgického zákroku, klidu na lůžku, zlomených kostí; denervaci/poškození nervů v důsledku poranění míchy; autoimunní onemocnění; infekční onemocnění; použití glukokortikoidu pro nesouvisející stavy; sepsi v důsledku infekce nebo jiných příčin; limitaci živinami v důsledku onemocnění nebo hladovění; rakovinová kachexie; chronický zánět; AIDS s kachexií; COPD; městnavé srdeční selhání; sarkopenie a genetické poruchy; např. svalové dystrofie, neurodegenerativní onemocnění. Agonisté CRF2R mohou být používány k inhibici atrofie kosterního svalstva. Není důležité, aby účinné sloučeniny vykazovaly absolutní specifitu pro CRFR. Je zamýšleno, aby specifický antagonista pro receptory mohl být koaplikován s účinným, ale nespecifickým agonistou. Alternativně tato chybějící specifita může být adresována modulací samotné dávky nebo dávkovacím režimem.
Potencionální sloučeniny nebo potencionální terapeutické sloučeniny identifikované způsoby screeningu podle předloženého vynálezu mohou být • · ·· ····
-46podávány spolu se sloučeninami, které prodlužují nebo zvyšují aktivaci CRF2R nebo dráhu přenosu signálu CRF2R, což mohou být známé sloučeniny např. theofyllin, nebo mohou být tyto sloučeniny identifikovány způsoby screeningu podle předloženého vynálezu jako sloučeniny, které prodlužují nebo zvyšují aktivaci receptoru CRF2R nebo dráhu přenosu signálu CRF2R.
Stanovení dávek
Bezpečná a terapeutická účinnost sloučenin, které agonizují CRFR může být stanovena standardními postupy použitím buď in vitro nebo in vivo technologií. Preferovány jsou sloučeniny, které mají vysoké terapeutické indexy, ačkoliv jsou použitelné i sloučeniny s nižšími terapeutickými indexy za předpokladu, že mají přijatelnou míru vedlejších účinků. Data získaná z in vitro a in vivo toxikologických a farmakologických technik mohou být používána k formulaci použitelných rozmezí dávek u lidí. Výhodná dávka leží v rozmezí, ve kterém je cirkulační koncentrace sloučeniny terapeuticky maximální s přijatelnou bezpečností. Cirkulační koncentrace sloučeniny se může lišit v závislosti na formě dávky, čase po podání, způsobu podání, atd. Dávky mimo toto rozmezí jsou také použitelné za předpokladu přijatelné míry vedlejších účinků. Údaje jako je věk a hmotnost pacienta a podobně mohou být používány k určení dávky standardním způsobem. Farmakogenetické přístupy mohou být použitelné při optimalizaci výběru sloučeniny, dávek a dávkovačích režimů v klinických populacích.
Formulace a použití
Farmaceutické přípravky pro použití při modulaci atrofie kosterního svalstva podle předloženého vynálezu mohou být formulovány standardními technologiemi za použití farmaceuticky přijatelných nosičů a excipientů. Přípravky podle předloženého vynálezu jsou výhodně opatřeny ve formě jednotkové dávky. Termín „ forma jednotkové dávky“ je přípravek podle předloženého vynálezu obsahující množství agonisty CRF2R, které je vhodné pro podání zvířeti, výhodně savci, výhodněji lidskému subjektu, v jednotlivé dávce, podle správné lékařské praxe.
9>· ···· ·· ··
I · * » · · • ·*?· · • · »·«· ·«
-47Farmaceutické přípravky mohou být formulovány pro například intranazální podání, transdermální podání, inhalaci, parenterální, kutánní, perorální nebo rektální podání. Pro perorální podání může být farmaceutický přípravek ve formě tablet nebo kapslí obsahujících farmakologicky aktivní sloučeninu a aditiva zahrnující, ale není to nikterak limitováno, vazebné agens, plnidla, lubrikans, dezintegrátory nebo smáčecí agens. Tablety mohou být potaženy. Tekuté preparáty pro perorální podání zahrnují, ale není to nikterak limitováno, sirupy, suspenze nebo suché produkty, které jsou rekonstituovány před použitím s tekutým nosičem obsahujícím farmakologicky aktivní sloučeninu a aditiva zahrnující, ale není to nikterak limitováno, suspendační agens, emulgátory, bezvodé nosiče, konzervační látky, pufry, ochucovadla, barvicí látky, sladící látky, atd. Farmaceutické přípravky pro perorální podání mohou být formulovány pro kontrolované uvolňování farmakologicky aktivních sloučenin buď na jazyku, v žaludku nebo intestinálním traktu.
Pro inhalační podání mohou být sloučeniny pro použití podle předloženého vynálezu podávány, ale není to nikterak limitováno, v následujících formách: tekutiny, prášky, gely nebo ve formě aerosolového spreje využívajícího stlačené nebo nestlačené propellanty buď v předem nastavených nebo libovolných dávkách. Farmakologicky aktivní sloučenina může být formulována s příslušnými plnidiy, nosiči, konzervačními látkami, pufry, atd. Pro parenterální podání může být farmakologicky aktivní sloučenina formulována s přijatelnými fyziologickými nosiči, konzervační látkou, atd. a může být připravena jako suspenze, roztoky, emulze, prášky připravené ke konstituci, atd. buď pro injekci bolusu nebo infuzi. Dávky těchto sloučenin mohou být podávány různými technologiemi zahrnujícími, hypodermické jehlice, vysokotlaké přístroje, atd. Pro rektální podání může být farmakologicky aktivní sloučenina formulována s přijatelnými fyziologickými nosiči, konzervačními látkami, atd. pro podání ve formě čípků, klystýrů, atd. Pro kutánní podání může být farmakologicky aktivní sloučenina formulována s přijatelnými fyziologickými nosiči zahrnujícími lotion, emoliens, atd. nebo zabudována do náplasti. Pro dlouhodobé podání mohou být farmakologicky aktivní sloučenina a příslušná aditiva například, ale není to nikterak limitováno, polymery, hydrofóbní • ·
-48materiály, pryskyřice, atd. formulovány jako depótní preparát buď pro injekci nebo implantaci v několikanásobných místech zahrnujících, ale není to nikterak limitováno, intramuskulární a subkutánní lokace. Navíc farmakologicky aktivní sloučenina může být podávána rozprašovačem.
Monitorování účinků během klinických zkoušek
Monitorování vlivu sloučenin (např. léčiv) na expresi nebo aktivitu CRF2R může být používáno nejenom v základním screeningu léčiv, ale také při klinických zkouškách. Například účinnost sloučeniny stanovená screeningem za účelem zvýšení aktivity receptoru CRF2R nebo exprese receptoru CRF2R může být odhadnuta při klinických zkouškách pacientů s atrofií kosterního svalstva nebo v riziku atrofie kosterního svalstva. V různých časech po podání testované sloučeniny nebo placeba může být stanoven účinek sloučeniny na pacienta například pozorováním změny hmoty kosterního svalstva, funkce kosterního svalstva, biochemických markérů defektu svalstva nebo kvality života. Způsoby měření hmoty kosterního svalstva u lidských subjektů jsou známy v oboru a zahrnují například: měření obvodu končetiny; měření síly svalstva například počítačovou tomografií, MRI nebo ultrazvukovou technikou; nebo svalová biopsie k prozkoumání morfologických a biochemických parametrů (např. oblast příčného řezu vláknem, průměr vlákna nebo aktivity enzymu). Protože hmota kosterního svalstva koreluje s funkcí kosterního svalstva může být funkce svalu používána jako náhradní markér hmoty a změny svalové hmoty mohou být odhadnuty použitím měření funkce, např. pevnosti, síly skupiny synergistických svalů, nebo charakteristik kontrakce zjištěných při elektromyografických záznamech. Navíc úbytek svalového proteinu v důsledku svalové atrofie může být změřen kvantifikací hladin aminokyselin nebo derivátů aminokyselin, tzn. 3-methyl-histidinu, v moči nebo krvi subjektu. Další informace o těchto metodách viz Appell, Sports Med. 10:42-58 (1990). Měření kvality života zahrnuje, ale není to nikterak limitováno, snadnost při zvedání se ze židle, počet kroků před zjištěním únavy nebo schopnost zdolávat schody.
-49Příkladv provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce vektorů pro expresi lidského receptoru CRF2R
Byla získána DNA-sekvence lidského CRF2R (hCRF2R), přístupové číslo E12752, a byly syntetizovány dva oligonukleotidy, obsahující 5'-konec genu začínající na iniciačním kodonu (5'-oligonukleotid) a jeden obsahující 3'-konec genu, obsahující terminační kodon (3'-oligonukleotid). Tyto nukleotidy byly navrženy tak, aby obsahovaly místa pro restrikční endonukleázu, která se jinak nenacházejí v genu hCRF2R s jedním unikátním místem na 5'-oligonukleotidu a odlišným unikátním místem pro restrikční endonukleázu v 3'-oligonukleotidu. Navíc 3'-oligonukleotid obsahoval další polyadenylační signální sekvenci. Dvouřetězcová cDNA z lidského kosterního svalstva byla zakoupena u Universal QUICK-Clone cDNA collection (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Použitím výše zmíněných 5'- a 3'-oligonukleotidů byl hCRF2R amplifikován použitím PCR lidské cDNA kosterního svalstva pomocí kitu AdvanTaq PCR (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). PCR produkt genu hCRF2R byl purifikován z PCR artefaktů elektroforézou na agarózovém gelu a DNA-fragment genu hCRF2R byl purifikován z agarózového gelu použitím purifikačního produktu, např. NucleoTrap (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA).
Klonování PCR produktu hCRF2R do vektoru pIRESneo (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) bylo provedeno nejprve rozštěpením PCR produktu hCRF2R a vektoru pIRESneo příslušnými restrikčními endonukleázami tak, aby 5'- a 3'místa pro restrikční endonukleázu byla připravená pro ligaci. DNA vektoru pIRESneo byla ligována do DNA PCR produktu hCRF2R pomocí DNA-ligázy z AdvantAge™PCR Cloning Kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) podle doporučení výrobce. Ligovaný vektor a inzertní konstrukt (plRESneo/hCRF2R) pak byl používán ke transformaci TOP10F' kompetentních E. coli buněk (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Transformované buňky byly umístněny na LB/Xgal/IPTG plus ampicillin obsahující agar. Bílé kolonie (pozitivní klony) byly vybrány
-50a individuálně kultivovány v LB médiu. Plazmidová DNA byla izolována pomocí purifikačního systému NucleoBond DNA Purification System (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Inzert alespoň z jednoho klonu byl sekvenován kvůli zajištění korektní sekvence hCRF2R. Buňky HEK293 obsahující stabilní integrovaný plazmid Mercury CRE-LUC (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) byly transfektovány s purifikovanou DNA plRESneo/hCRF2R mající správný sekvenční inzert pomocí CalPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Buňky stabilně transfektované plRESneo/hCRF2R DNA byly vybrány kultivací buněk vG418. Stabilně transfektované buňky (buňky HEK293/CRELUC/plRESneo/hCRF2R) byly propagovány v DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA), roztok penicillinu/streptomycinu (Life Technologies, Rockville, MD), L-glutamin (Life Technologies, Rockville, MD) a neesenciální aminokyselinu (Life Technologies, Rockville, MD) při teplotě 37°C při atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Klony byly charakterizovány z hlediska vazby CRF a aktivace CRELUC po expozici CRF podle způsobu popsaného v příkladech 2 a 3. Buňky exprimující receptor hCRF2R v příslušných hladinách, a které byly vhodně spojeny s reportérovým systémem CRE-LUC, pak byly využívány pro další analýzu.
Příklad 2
Analýza receptorové vazby
Analýza vazby sloučenin na receptor byla prováděna na celých buňkách zavedením buněk HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRF2R z příkladu 1 na destičku o 96 jamkách potaženou polylysinem. Buňky byly naočkovány v DMEM médiu obsahujícím 10% fetální bovinní sérum, roztok penicillinu/streptomycinu, L-glutamin a neesenciální aminokyselinu při teplotě 37°C při atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu a inkubovány přes noc. Kultivační médium bylo odstraněno a bylo přidáno příslušné množství CRF kovalentně značeného Europiem (Eu-CRF) v MEM (Life Technologies, Rockville, MD) + 10% Seablock (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Buňky byly inkubovány s Eu-CRF po dobu 90 minut při pokojové teplotě, pak promývány (4x) fyziologickým roztokem
-51 tlumeným fosfátem bez hořčíku a vápníku (Life Technologies, Rockville, MD). Po finálním promytí byl přidán doplňující roztok (Wallac lne., Gaithersburg, MD) a destička byla měřena na čtecím přístroji Wallac (Wallac lne., Gaithersburg, MD) s programem BioWorks Europium. Pro analýzu saturace vazby byly logaritmické dávky Eu-CRF v rozmezí od 10(-12) do 10(-3) M přidány do buněk a navázání bylo analyzováno za absence i přítomnosti saturační koncentrace neznačeného CRF pro stanovení nespecifické vazby. Pro kompetitivní vazbu bylo přidáno EuCRF, kterého byla polovina z maxima, z hlediska navázání kromě měnících se koncentrací požadované sloučeniny.
Příklad 3
Test aktivace receptoru
Analýza aktivace receptoru byla provedena naočkováním buněk HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRF2R z příkladu 1 do Packard View Plate-96 (Packard lne., CA). Buňky byly naočkovány v DMEM médiu obsahujícím 10% fetální bovinní sérum, roztok penicillinu/streptomycinu, L-glutamin a neesenciální aminokyselinu při teplotě 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu a inkubovány přes noc. Médium pak bylo odstraněno a nahrazeno DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujícím 0,01% frakci Vbovinního albuminu (SIGMA, St. Louis, MO) obsahující požadovanou sloučeninu. Buňky pak byly inkubovány po dobu 4 hodin při teplotě 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu, po té bylo médium odstraněno a buňky byly promývány (2x) roztokem Hanks Balanced Salt Solution (Life Technologies, Rockville, MD). Do promytých buněk pak byl přidán Lysis Reagent (Promega lne., Madison, Wl) a buňky byly inkubovány po dobu 20 minut při teplotě 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Buňky byly umístněny při teplotě -80°C po dobu 20 minut. Následně byla provedena 20 minutová inkubace při teplotě 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Po této inkubaci byl přidán Luciferázový testovací pufr a Luciferázový testovací substrát (Promega lne., Madison, Wl) do buněčného lyzátu a aktivita luciferázy byla kvantifikována luminometrem. Relativní aktivita sloučeniny byla stanovena srovnáním přírůstku • · ·· · ·· ······ • · · · · · ··· • · · · · · · · · · « · • · ······· ···· ·· ··· ·· ·· ··
-52po expozici sloučeniny na hladině luciferázy v buňkách HEK, které obsahovaly konstrukt CRE-LUC bez hCRF2R po expozici sloučeninou. Specificita odpovědi byla také vyzkoušena stanovením luciferázové odpovědi buněk hCRF2R/CRELUC na sloučeninu v přítomnosti a absenci desetinásobného přebytku antagonisty hCRF2R.
Příklad 4
Sereening k identifikaci potencionálních sloučenin, které prodlužují nebo zvyšují aktivaci CRF2R a/nebo dráhy přenosu signálu receptoru CRF2R
Identifikace sloučenin, které prodlužují nebo zvyšují agonistou indukovanou aktivaci CRF2R nebo dráhy přenosu signálu CRF2R zahrnuje obměnu testu aktivace receptoru podle příkladu 3. Specificky je tento test prováděn naočkováním buněk HEK293/CRE-LUC/plRESneo/receptoru hCRF2R na destičku Packard View Plate-96 (Packard lne., CA). Buňky byly naočkovány v DMEM médiu obsahujícím 10% fetální bovinní sérum, roztok penicillinu/streptomycinu, L-glutamin, neesenciální aminokyselinu a saturační množství CRF při teplotě 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu a inkubovány po dobu 48 hodin. Médium pak bylo odstraněno a kromě požadované sloučeniny nahrazeno DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujícím 0,01% frakci V bovinního albuminu (SIGMA, St. Louis, MO) a CRF. Buňky pak byly inkubovány po dobu 4 hodin při teplotě 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitém a 95% vzduchu, po té bylo médium odstraněno a buňky byly promývány (2x) roztokem Hanks Balanced Salt (Life Technologies, Rockville, MD). Do promytých buněk pak byl přidán Lysis Reagent (Promega lne., Madison, Wl) a buňky byly inkubovány po dobu 20 minut při teplotě 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Buňky byly umístněny při teplotě -80°C po dobu 20 minut, pak byla provedena 20 minutová inkubace při teplotě 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Po této inkubaci byl přidán Luciferázový testovací pufr a Luciferázový testovací substrát (Promega lne., Madison, Wl) do buněčného lyzátu a aktivita luciferázy byla kvantifikována luminometrem. Testované sloučeniny, které výrazně stimulovaly fluorescenci nad hladinami kontrolních neošetřovaných buněk, byly po korekci na změny v buněčné
-53hustotě považovány za potencionální sloučeniny pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva. Nejlepší sloučeniny indukovaly relativně vyšší hladiny fluorescence.
Příklad 5
Screening za účelem identifikace potencionálních sloučenin specifických pro CRF2R
Sloučeniny, které aktivují CRF2R jsou identifikovány způsobem podle příkladu 3. K vybrání sloučenin selektivnější pro CRF2R nad CRFíR, byl také proveden screening na CRF^. Buňky HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRF1R byly připraveny v podstatě způsobem podle příkladu 1 vyjma toho, že DNA-sekvence lidského CRFiR (hCRFiR), přístupové číslo X72304, byla používána pro iniciální PCR amplifikaci. Za účelem stanovení aktivity sloučenin vůči CRF^ byl test aktivace prováděn v podstatě způsobem podle příkladu 3 kromě toho, že buňky HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRF1R byly používány k naočkování destiček. Množství fluorescence stimulované sloučeninou v buňkách exprimujících CRF2R bylo srovnáváno s množstvím fluorescence stimulované sloučeninou v buňkách exprimujících CRFiR. Sloučeniny, které vykazovaly desetinásobně větší odpověď (molárně) v buňkách exprimujících CRF2R než v buňkách exprimujících CRFiR pak byly dále testovány na specificitu odpovědi k eliminaci rozdílů v důsledku změn při klonování. Buňky HEK293/CRE-LUC/plRESneo/hCRF2R byly testovány se sloučeninou v přítomnosti nebo za absence desetinásobného přebytku antagonisty CRF2R, antisauvaginu-30. Sloučeniny, které měly vyšší než desetinásobnou selektivitu pro CRF2R, a jejichž aktivita byla inhibována antisauvaginem-30 byly vybrány jako potencionální sloučeniny.
Příklad 6
Screening k identifikaci potencionálních sloučenin, které zvyšují expresi hCRF2R
Sekvence obsahující promotorovou oblast genu hCRF2R v příslušné tkáni, začínající dosti daleko po směru transkripce od místa iniciace transkripce tak, aby
-54obsahovala veškeré regulační elementy nezbytné pro fyziologickou expresi genu hCRF2R, byla získána z databáze lidského genomu. Byly syntetizovány dva oligonukleotidy, jeden obsahující 5'-konec promotorové oblasti (5'-oligonukleotid) a jeden obsahující 3'-konec promotorové oblasti, zahrnující místo začátku transkripce (3'-oligonukleotid). Tyto oligonukleotidy také obsahují místa pro restrikční endonukleázu, která nejsou v regulační oblasti genu hCRF2R s jedním unikátním místem v 5'-oligonukleotidu a rozdílným unikátním místem pro restrikční endonukleázu v 3'-oligonukleotidu. 5'- a 3'-oligonukleotidy byly používány pro PCR amplifikaci regulační oblasti genu hCRF2R z lidské DNA (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) pomocí PCR kitu, Advantage®Genomic PCR kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). PCR produkt regulační oblasti genu hCRF2R byl purifikován z PCR artefaktů elektroforézou na agarózovém gelu a DNA-fragment oblasti regulačního genu hCRF2R byl purifikován zagarózového gelu pomocí purifikačního produktu, např. NucleoTrap (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Nakloňování PCR produktu regulační oblasti genu hCRF2R do vektoru pECFP-1 (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) bylo provedeno nejprve štěpením PCR produktu regulační oblasti genu hCRF2R a vektoru pECFP-1 příslušnými restrikčními endonukleázami tak, aby 5'- a 3'-místa pro restrikční endonukleázy byla připravená pro ligaci. Ligace DNA vektoru pECFP-1 do DNA PCR produktu regulační oblasti genu hCRF2R byla provedena DNA-ligázou z AdvantAge™PCR Cloning Kitu (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) podle doporučení výrobce. Ligovaný vektor a inzertový konstrukt pak byly používány k transformaci TOP10F' kompetentních buněk E. coli (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Buňky byly naneseny na agar obsahující LB plus kanamycin a kolonie rezistentní vůči kanamycinu byly vybrány pro další analýzu. Klony rezistentní vůči kanamycinu byly kultivovány v kanamycinovém médiu obsahujícím LB a plazmidová DNA byla izolována pomocí purifikačního systému NucleoBond DNA Purification System (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) a konstrukt obsahující regulační oblast genu hVPAC2 byl analyzován sekvenováním DNA kvůli zajištění správnosti a integrity konstruktu. Purifikovaná plazmidová DNA konstruktu obsahující regulační oblast genu hCRF2R pak byla transfektována do buněk HEK293 použitím transfekce • · · · · · · · · · · • · · · · · · · · • ···· · · · · · · · • · ······· ···· ·· ··· ·· ·· ··
-55zprostředkované fosforečnanem vápenatým s CalPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Transfektované buněčné klony byly vybrány pomocí G418, izolovány a propagovány v DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA), roztok penicillinu/streptomycinu (Life Technologies, Rockville, MD), L-glutamin (Life Technologies, Rockville, MD), neesenciální aminokyselinu (Life Technologies, Rockville, MD) a G418 (Life Technologies, Rockville, MD) při teplotě 37°C při atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Klony rezistentní vůči G418 byly charakterizovány Southern blottingem zda obsahují promotorovou sekvencí genu hCRF2R. Dále aktivace regulační oblasti genu hCRF2R byla analyzována použitím příslušného stimulačního agens. Buňky exprimující regulační oblast-ECFP genu hCRF2R v příslušných hladinách pak byly používány při testech určených ke stanovení sloučenin, které mohou modulovat aktivitu regulační oblasti genu hCRF2R následujícím způsobem. Analýza aktivace regulační oblasti byla provedena naočkováním buněk HEK293 obsahujících regulační oblasti-ECFP genu hCRF2R o příslušné hustotě do 96 černých jamek s čistým dnem v mikrotitrační destičce a buňky se nechaly kultivovat přes noc. Následující den bylo médium odstraněno a testovaná sloučenina byla přidána v čerstvém růstovém médiu. Buňky byly inkubovány po dobu 16 hodin při teplotě 37°C při atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu a následně bylo provedeno měření fluorescence (excitace při 433 (453) nm detekcí emise při 475 (501) nm za použití fluorometru (biolumin™ 960, Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Testované sloučeniny, které stimulovaly fluorescenci výrazně nad hladinami kontrolních neošetřovaných buněk, byly po korekci na změny buněčné hustoty považovány za potencionální sloučeniny pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva. Nejzajímavější byly sloučeniny, které indukovaly relativně vyšší hladiny fluorescence.
Příklad 7
Screening k identifikaci sloučenin, které zvyšují expresi lidského CRF
-56Způsoby identifikace sloučenin, které zvyšují expresi lidského CRF (hCRF) byly v podstatě stejné jako způsoby identifikace sloučenin, které zvyšují expresi receptoru hVPAC2 kromě toho, že byla používána regulační oblast pro gen hCRF. Sekvence obsahující regulační oblast genu hCRF, začínající dosti daleko po směru od místa iniciace transkripce tak, aby obsahovala veškeré regulační elementy nezbytné pro fyziologickou expresi genu hCRF2R, v příslušné tkáni byla získána z databáze lidského genomu. Byly syntetizovány dva oligonukleotidy, jeden obsahující 5'-konec regulační oblasti (5'-oligonukleotid) a jeden obsahující 3'-konec regulační oblasti, zahrnující místo začátku transkripce (3'-oligonukleotid). Tyto oligonukleotidy také obsahovaly místa pro restrikční endonukleázy, která nejsou v regulační oblasti genu hCRF s jedním unikátním místem v 5'-oligonukleotidu a odlišným unikátním místem pro restrikční endonukleázu v 3'-oligonukleotidu. 5'- a 3'-oligonukleotidy byly používány pro PCR amplifikaci regulační oblasti genu hCRFR z lidské DNA (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) pomocí PCR kitu, Advantage®Genomic PCR kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). PCR produkt regulační oblasti genu hCRF byl purifikován z PCR artefaktů elektroforézou na agarózovém gelu a DNA-fragment oblasti regulačního genu hCRF byl purifikován z agarózového gelu pomocí purifikačního produktu, např. NucleoTrap (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Nakloňování PCR produktu regulační oblasti genu hCRF do vektoru pECFP-1 (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) bylo provedeno nejprve štěpením PCR produktu regulační oblasti genu hCRF a vektoru pECFP-1 příslušnými restrikčními endonukleázami tak, aby 5'- a 3'-místa pro restrikční endonukleázy byla připravená pro ligaci. Ligace DNA vektoru pECFP-1 do DNA PCR produktu regulační oblasti genu hCRF byla provedena DNA-ligázou z AdvantAge™PCR Cloning Kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) podle doporučení výrobce. Ligovaný vektor a inzertový konstrukt pak byly používány k transformaci TOP10F' kompetentních buněk E. coli (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Buňky byly naneseny na agar obsahující LB plus kanamycin a kolonie rezistentní vůči kanamycinu byly vybrány pro další analýzu. Klony rezistentní vůči kanamycinu byly kultivovány v kanamycinovém médiu obsahujícím LB a plazmidová DNA byla izolována pomocí purifikačního systému • ··· · » · ► ·· · ·
-57NucleoBond DNA Purification System (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) a konstrukt obsahující regulační oblast genu hCRF byl analyzován sekvenováním DNA kvůli zajištění správnosti a integrity konstruktu. Purifikovaná plazmidová DNA konstruktu obsahující regulační oblast genu hCRF pak byla transfektována do buněk HEK293 použitím transfekce zprostředkované fosforečnanem vápenatým s CalPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Transfektované buněčné klony byly vybrány pomocí G418, izolovány a propagovány v DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA), roztok penicillinu/streptomycinu (Life Technologies, Rockville, MD), L-glutamin (Life Technologies, Rockville, MD), neesenciální aminokyselinu (Life Technologies, Rockville, MD) a G418 (Life Technologies, Rockville, MD) při teplotě 37°C při atmosféře 5% oxidu uhličitého a 95% vzduchu. Klony rezistentní vůči G418 byly charakterizovány Southern blottingem zda obsahují sekvenci regulační oblasti genu hCRF. Dále aktivace regulační oblasti genu hCRF byla analyzována použitím příslušného stimulačního agens. Buňky exprimující regulační oblast-ECFP genu hCRF v příslušných hladinách pak byly používány při testech určených ke stanovení sloučenin, které mohou modulovat aktivitu regulační oblasti genu hCRF následujícím způsobem. Analýza aktivace regulační oblasti byla provedena způsobem podle příkladu 5 kromě toho, že byly používány klony obsahující konstrukt regulační oblasti genu hCRF.
Příklad 8
Způsob přípravy lidských protilátek, které aktivují hCRF
Kompletně lidské monoklonální protilátky, které aktivují hCRF, byly připraveny nejprve vytvořením rekombinantního proteinu hCRF2R následujícím způsobem. K připravení PCR produktu hCRF2R byl použit způsob podle příkladu 1. Tento PCR produkt hCRF2R pak byl nakloňován do vektoru pHAT20 (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) nejprve štěpením PCR produktu genu hCRF2R a vektoru pHAT20 příslušnými restrikčními endonukleázami tak, aby 5'- a 3'-místa pro restrikční endonukleázy byla připravená pro ligaci. Ligace DNA vektoru pHAT20 ·· ·· · ·· ·· ···· • » · · ·· · · ·· · • ··· · · · · a · · · • · ······· ···· ·· ··· ·· ·· ··
-58do DNA PCR produktu genu hCRF2R byla provedena DNA-ligázou z AdvantAge™PCR Cloning Kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) podle doporučení výrobce. Ligovaný vektor/inzertový konstrukt pak byl používán k transformaci TOP10F' kompetentních buněk E. coli (Clonetech lne., Palo Alto,
CA, USA). Transformované buňky byly naneseny na agar obsahující LB plus ampicillin a kolonie rezistentní vůči ampicillinu byly vybrány pro další analýzu. Pozitivní klony byly kultivovány V LB médiu obsahujícím ampicillin a plazmidová DNA byla izolována pomocí purifikačního systému NucleoBond DNA Purification System (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA) a konstrukt obsahující gen hCRF2R byl analyzován sekvenováním DNA kvůli zajištění správnosti a integrity konstruktu. DNA vektoru hCRF2R-pHAT20 pak byla používána pro další PCR klonování využitím 5'-oligonukleotidu obsahujícího počáteční sekvenci HAT a unikátní místo restrikční endonukleázy nenacházející se v konstruktu hCRF2R-pHAT20 a 3'hCRF2R-oligonukleotidu použitého předtím. Oligonukleotidové primery byly používány k PCR amplifikaci fúzního genu HAT-hCRF2R z konstruktu HAThCRF2R a PCR produkt byl purifikován shora uvedeným způsobem. PCR produkt fúzního genu HAT-I-1CRF2R pak byl využíván pro klonování do vektoru pBacPAK8 využitím bakulovirového expresního systému BacPAK od firmy Clonetech (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Ligace fúzního genu HAT-hCRF2R do vektoru pBacPAK8 je v podstatě stejná jako shora popsaná ligace. Konstrukt hCRF2R/HAT-pBacPAK8 pak byl transfektován do ΤΟΡ10Έ kompetentních buněk E. coli. Byly vybrány buňky rezistentní vůči ampicillinu a plazmidová DNA byla izolována a zkoušena z hlediska integrity konstruktu podle shora popsaného způsobu. Tento konstrukt pak byl kotransfektován s linearizovaným BacPAK6 DNA do Sf21 hostitelských hmyzích buněk využitím CalPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clonetech lne., Palo Alto, CA, USA). Hmyzí buňky pak byly inkubovány po dobu 2-3 dnů a virus byl sbírán z jednotlivých čistých plaků. Dále byl virus amplifikován v buňkách Sf21 využitím BacPAK Insect Cell Media, přičemž vše bylo provedeno podle doporučení výrobců (Clonetech lne., Palo Alto,
CA, USA). Rekombinantní fúzní protein HAT-CRF2R pak byl purifikován purifikačním kitem TALON® CelIThru od firmy Clonetech (Clonetech lne., Palo
-59Alto, CA, USA) za podmínek doporučených výrobcem. Infikované buňky Sf21 byly sbírány 48 hodin po infekci a sonikovány v extrakčním/nanášecím pufru. Buněčný lyzát pak byl protažen přes sloupec TALON® CelIThru. Sloupec byl promýván (2x) extrakčním/nanášecím pufrem a navázaný protein HAT-hCRF2R byl eluován elučním pufrem. Eluovaný protein byl analyzován SDS-PAGE z hlediska integrity a koncentrace proteinu byla kvantifikována systémem Bio-Rad SDS-PAGE a proteinovým kvantifikačním systémem podle doporučení výrobců (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca). Purifikovaný fúzní protein HAT-hCRF2R pak byl používán kvůli imunizaci zvířat XenoMouse (Abgenix lne., Fremont, CA) za účelem produkce lidské monoklonální protilátky následujícím způsobem. K vakcinaci 10 XenoMouse zvířat bylo několikrát v průběhu osmi týdnů používáno 10 pg purifikovaného rekombinantního fúzního proteinu HAT-hCRF2R společně s 25 pg adjuvans monofosforylu A (Sigma, St. Louis, MO). Z vakcinovaných zvířat bylo získáno sérum a používáno při ELISA technice s vychytáváním antigenu využívající purifikovaný fúzní protein HAT-hCRF2R k detekci protilátek vůči proteinu HAT-hCRF2R potažením ELISA destiček polystyrenem (Corning Glass Works, Corning, NY) s fúzním proteinem HAT-hCRF2R a reakce byla zastavena PBS-1% BSA, promývána a inkubována při teplotě 37°C po dobu 1 hodiny se zředěním sérových vzorků 1:50. Po promytí (5x) PBS byly destičky inkubovány při teplotě 37°C po dobu 1 hodiny s kozími protilátkami konjugovanými k alkalické fosfatáze, kde tyto protilátky jsou proti lidskému imunoglobulinu G. Destičky pak byly promývány (5x) PBS a protilátky detekované p-nitrofenylovým fosfátovým substrátem (Sigma, St. Louis, MO) v pufru. Byly měřeny optické hustoty při 405 nm na čtecím přístroji a signál byl kvantifikován. Myši s vysokou produkcí protilátky byly používány pro hybridomovou technologii. Hybridomy byly vytvořeny fúzí sleziných buněk z XenoMouse zvířat s nesekretující myelomovou buněčnou linií NSA-bcI 2 v poměru slezinné buňky ku NSA-bcl2 buňky (4:1) v přítomnosti 30% polyethylenglykolu PEG1450. Kondenzované buňky byly individuálně klonovány limitním ředěním do destiček o 96 jamkách a kultivovány v RPMI-1640 médiu obsahujícím 10% fetální bovinní sérum, neesenciální aminokyseliny, pyruvát sodný, L-glutamin, 10 u/ml penicillin-streptomycinu a hypoxanthin• · ···· ♦ · · · ·· · ··· ··· ··· • ···· ·· · · · · · • · ······· ···· ·· ····· ·· ··
-60aminopterin-thymidinu (vše od Life Technologies, Rockville, MD). Byl proveden screening supernatantů z hypoxanthin-aminopterin-thymidinových vybraných hybridomů na produkci lidské protilátky shora popsanou ELISA technikou. Hybridomy, které produkovaly lidské protilátky proti fúznímu proteinu HAT-hCRF2R byly vybrány pro produkci protilátky ve velkém měřítku. Monoklonální protilátky byly purifikovány chromatografií na Protein G-Sepharose. Supernatant z kultivovaných hybridomových klonů byl nanesen na sloupec Protein GSepharose (SIGMA, St. Louis, MO) v nanášecím pufru, promýván (3x) a IgG byl eluován elučním pufrem. Tyto protilátky pak byly používány pro screening ke stanovení aktivačního potenciálu (agonizmu) hCRF2R, což bylo provedeno způsobem podle příkladu 3. Ty lidské monoklonální protilátky, které vykazovaly agonistickou aktivitu vůči hCRF2R byly označeny jako potencionální sloučeniny.
Příklad 9
Stanovení absolutní síly svalstva
Extenzor digitorum longus (EDL) a šikmý sval lýtkový byly odstraněny mezi šlachami z fixované myší končetiny. Hedvábná sutura byla přivázána ke každé tendinis z izolovaného svalstva a svaly byly vloženy do komory z plexiskla vyplněné Ringerovým roztokem (137 mM chlorid sodný, 24 mM hydrogenuhličitan sodný, 11 mM glukóza, 5 mM chlorid draselný, 1 mM síran hořečnatý, 1 mM fosforečnan sodný, 0,025 mM tubokurarin, všechny s pH 7,4 a oxygenovány 95% kyslíkem a 5% oxidem uhličitým) neustále probublávaným 95% kyslíkem a 5% oxidem uhličitým při teplotě 25°C. Svaly byly orientovány horizontálně mezi servomotorické rameno páky (Model 305B-LR Cambridge Technology lne., Watertown MA, USA) a nerezovou ocelovou platinu snímače síly (Model BG-50; Kulíte Semiconductor Products lne., Leonia, NJ, USA) a pole stimulované pulzy transmitovanými mezi dvěma platinovými elektrodami umístněnými podélně na kterékoliv straně svalstva. Pravoúhlé pulzy (délka 0,2 ms) generované osobním počítačem s Labview board (Model PCI-MIO 16E-4), Labview lne., Austin, TX, USA) byly amplifikovány (Acurus power amplifier model A25, Dobbs Ferry, NY, USA) kvůli zvýšení titanické kontrakce. Stimulace napětí a délky svalstva (Lo) byla
-61 upravena tak, aby byla získána maximální izometrická síla v sevření. Maximální produkce titanové síly (Po) byla stanovena z hladiny vztahu frekvence-síla.
Příklad 10
Terapeutické ošetření atrofie kosterního svalstva lidskou protilátkou, která je agonista receptoru hCRF2R.
Lidský mužský subjekt vážící 50 kg a mající výraznou svalovou atrofii ramen a nohou v důsledku dlouhého klidu na lůžku byl léčen z hlediska reverze atrofie kosterního svalstva. Jednou každý týden po dobu 3 měsíců bylo 15 ml vodného roztoku o pH 6 obsahující aktivující protilátku receptoru CRF2R podáváno subjektu intravenózní injekcí. Roztok obsahoval následující složky:
Složka Koncentrace (mg/ml)
Agonistická protilátka receptoru CRF2R 20
L-histidin-hydrochlorid 0,47
L-histidin 0,3
Dihydrát α,α-trehalózy 20
Polysorbát20 0,1
Bakteriostatická sterilní voda do 1 ml
Na konci ošetření subjekt vykazoval měřitelné přírůstky svalové hmoty, síly a mobility ramen a nohou.
Příklad 11
Profylaktické ošetření atrofie kosterního svalstva lidskou protilátkou, která je agonista receptoru hCRF2R
Lidský samičí subjekt vážící 55 kg byl podroben chirurgickému odstranění kyčelního kloubu v prvním měsíci. Subjekt byl ošetřován za účelem zvýšení hmoty kosterního svalstva před a po chirurgickém zákroku ke skutečnému snížení hladiny atrofie kosterního svalstva v důsledku nečinnosti svalstva během post-62chirurgické normalizace. Specificky jednou každý týden po dobu 1 měsíce před chirurgickým zákrokem a po dobu 2 měsíců po chirurgickém zákroku bylo podáno 18 ml vodného roztoku s pH 6,0 obsahujícím aktivační protilátku receptoru CRF2R subjektu intravenózní injekcí. Roztok obsahoval následující složky:
Složka
Aktivující protilátka CRF2R
L-histidin-hydrochlorid
L-histidin
Dihydrát α,α-trehalózy Polysorbát 20
Bakteriostatická sterilní voda
Koncentrace (mg/ml)
0,47
0,3
0,1 do 1 ml
Na konci ošetření subjekt vykazoval měřitelné zachování svalové hmoty, síly a mobility ramen a nohou v porovnání se stavem subjektu, který byl očekáván bez terapie protilátkou.
Příklad 12
Profylaktické ošetření atrofie kosterního svalstva lidskou protilátkou, která je agonista receptoru CRF2R
Lidskému samičímu subjektu vážícímu 45 kg byla provedena fixace k ošetření jednoduché zlomeniny ramenní kosti způsobené pádem. Subjekt byl ošetřován za účelem prevence atrofie kosterního svalstva zasažené paže a ramene v důsledku nečinnosti a omezeného použití během hojení zlomeniny. Specificky jednou každý týden počínaje dnem fixace bylo podáno 13 ml roztoku o pH 6,0 obsahujícího receptor anti-hCRF2R subjektu intravenózní injekcí. Roztok obsahoval následující složky:
Složka
Aktivační protilátka CRFR L-histidin-hydrochlorid
Koncentrace (mg/ml)
0,47
| L-histidin | 0,3 |
| Dihydrát α,α-trehalózy | 20 |
| Polysorbát 20 | 0,1 |
| Bakteriostatická sterilní voda | do 1 ml |
Na konci ošetření subjekt vykazoval měřitelné zachování svalové hmoty, síly a mobility zasažené paže a ramene a snížený průběh fýzické terapie v porovnání se stavem subjektu, který byl očekáván a to i bez terapie protilátkou.
Příklad 13
Profylaktické ošetření atrofie kosterního svalstva urokortinem-ll
Lidský samičí subjekt vážící 60 kg byl přijmut do nemocnice v komatózním stavu. Subjekt byl ošetřován tímto způsobem kvůli prevenci atrofie kosterního svalstva celého těla v důsledku nečinnosti v komatózním stavu. Specificky bylo jednou každý den během komatu subjektu podáváno pomalou intravenózní infuzí přibližně 500 ml vodného roztoku, který byl připraven přidáním 5 ml následujícího zásobního roztoku do 500 ml sterilního fyziologického roztoku:
Složka Koncentrace (mq/ml)
Urokortin-ll 12
Pufr fosforečnanu sodného, pH 7,4 140
Po ošetření subjekt vykazoval měřitelné zachování hmoty a funkce kosterního svalstva a sníženou fyzickou terapii potřebnou během komatu a po rekuperaci vědomí v porovnání se stavem subjektu, který se očekával bez terapie protilátkou.
Příklad 14
Terapeutické ošetření pacienta s Duchenneovou svalovou dystrofií pomocí CRF • ···
-64Samčí subjekt vážící 40 kg s existující diagnózou na Duchenneovu svalovou dystrofii byl ošetřován sloučeninou, která vykazovala agonizmus CRF-1 a CRF-2 v podobném rozpětí dávek. Subjekt byl ošetřován depotní formulací sloučeniny s trvalým uvolňováním kvůli zlepšení nebo udržení síly a funkce svalstva v průběhu progrese onemocnění. Specificky bylo jednou každý měsíc subjektu podáváno pomalou intramuskulární injekcí 3 ml vodného roztoku o pH 6,0 obsahujícího následující složky:
Složka Koncentrace (mq/ml)
CRH (hormon uvolňující kortikotropin) 4
Kopolymer D,L-mléčné a glykolové kyseliny 5
Po ošetření subjekt vykazoval buď zlepšení nebo atenuaci poklesu síly nebo funkce svalstva ve vyhodnoceních z hlediska času v porovnání s těmi znaky, které vykazoval během přirozené progrese onemocnění.
Předložený vynález není omezen rozsahem popsaných specifických provedení, které jsou myšleny výhradně jako ilustrace konkrétních aspektů předloženého vynálezu, a funkčně ekvivalentní způsoby a komponenty spadají do rozsahu předloženého vynálezu, což zahrnuje, ale není to nikterak limitováno, druhy testovaných zvířat, povahu a typ agonistů CRFR, pohlaví zvířete, model atrofie, způsob aktivace CRFR, zahrnující genetické metodologie, atd. Různé modifikace předloženého vynálezu kromě těch, které jsou uvedeny a popsány, budou zřejmé odborníkům v oboru po přečtení shora uvedeného popisu a s tím souvisejících obrázků. Tyto modifikace spadají do rozsahu přiložených patentových nároků.
Průmyslová využitelnost
Použitím CRFR podle předloženého vynálezu lze identifikovat sloučeniny, jenž je možné využít při léčení atrofie kosterního svalstva a nebo k indukci hypertrofie kosterního svalstva.
Claims (31)
1. Způsob identifikace potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva, vyznačující tím, že:
(a) se uvede testovaná sloučenina v kontakt s CRF2R;
(b) se určí, zda-li se testovaná sloučenina váže na CRF2R; a (c) se identifikují ty testované sloučeniny, které se vážou na CRF2R jako potencionální sloučeniny pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva.
2. Způsob identifikace potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva, vyznačující tím, že:
(a) se uvede testovaná sloučenina v kontakt s buňkou exprimující funkční CRF2R;
(b) se určí, zda-li se testovaná sloučenina váže na CRF2R; a (c) se identifikují ty testované sloučeniny, které aktivují CRF2R jako potencionální sloučeniny pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva.
3. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 2, vyznačující tím, že se vytvoří seznam potencionálních sloučenin.
4. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 2, vyznačující tím, že se CRF2Rexprimuje na eukaryotické buňce.
5. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 4, vyznačující se tím, že CRF2R má aminokyselinovou sekvenci, která je více než z 80% shodná se sekvencí id. č. sek.: 10.
• · · · · · ·· ·· · ···
-666. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 4, vyznačující se tím, že CRF2R má aminokyselinovou sekvenci, která je více než z 90% shodná se sekvencí id. č. sek.: 10.
7. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 4, vyznačující se tím, že CRF2R má aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci id. č. sek.: 10, id. č. sek.: 12, id. č. sek.: 14, id. č. sek.: 18, id. č. sek.: 20, id. č. sek.: 24, id. č. sek.: 26, id. č. sek.: 32 nebo id. č. sek.: 38.
8. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 4, vyznačující se tím, že CRF2R je z druhu vybraného ze skupiny sestávající z lidí, myší nebo potkanů.
9. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 8, vyznačující se tím, že CRF2Rje lidského původu.
10. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 4 v buňce mající buněčnou hladinu cAMP, ve které se stanovuje, zda-li testovaná sloučenina aktivuje CRF2R, , vyznačující se tím, že se měří hladina buněčného cAMP.
11. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 10, vyznačující se tím, že buňka dále zahrnuje reportérový gen operativně asociovaný s responzivním elementem cAMP a při měření hladiny buněčného cAMP se měří exprese reportérového genu.
12. Způsob identifikace potencionálních sloučenin podle nároku 11, vyznačující se tím, že reportérový gen je alkalická fosfatáza, chloramfenikolacetyltransferáza, luciferáza, glukuronidsyntetáza, růstový hormon, placentární alkalická fosfatáza nebo Green Fluorescent Protein.
·· ···
-6713. Způsob identifikace potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva, vyznačující tím, že v jakémkoliv pořadí:
(a) se uvede testovaná sloučenina v kontakt s buňkou exprimující funkční CRF2R a stanoví se úroveň aktivace CRF2R v důsledku testované sloučeniny;
(b) se uvede testovaná sloučenina v kontakt s buňkou exprimující funkční CRF2R a stanoví se úroveň aktivace CRF-iR v důsledku testované sloučeniny; následně (c) se srovná hladina aktivace CRF2R a hladina aktivace CRF-iR;
(d) se identifikují ty testované sloučeniny, které vykazují podobnou aktivitu vůči CRF2R a CRF1R nebo vykazují selektivitu pro CRF2R jako potencionální sloučeniny pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že potencionální sloučenina vykazuje stonásobnou nebo ještě větší selektivitu pro CRF2R.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že potencionální sloučenina vykazuje tisícinásobnou nebo ještě větší selektivitu pro CRF2R.
16. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že potencionální sloučenina vykazuje selektivitu pro CRF2R v rozmezí jednonásobku až stonásobku.
17. Způsob identifikace potencionálních terapeutických sloučenin ze skupiny jedné nebo více potencionálních sloučenin, u kterých byla předem stanovena jejich vazba na CRF2R nebo aktivace CRF2R, vyznačující tím, že:
(a) se podá potencionální sloučenina nehumánnímu zvířeti;
(b) se stanoví, zda-li potencionální sloučenina reguluje hmotu nebo funkci kosterního svalstva v ošetřovaném zvířeti.
• · • ··· • · 9· ·
-6818. Způsob identifikace potencionálních sloučenin, které prodlužují nebo zvyšují aktivaci CRF2R nebo dráhu přenosu signálu CRF2R indukovanou agonistou, vyznačující tím, že v jakémkoliv pořadí nebo současně:
(a) se uvede testovaná sloučenina v kontakt s buňkou exprimující funkční CRF2R;
(b) se buňky ošetřují agonistou CRF2R po dostatečnou dobu a v dostatečné koncentraci k desenzibilizaci CRF2R v kontrolních buňkách;
(c) se stanoví hladina aktivace CRF2R; a (d) se identifikují ty testované sloučeniny, které prodlužují nebo zvyšují aktivaci CRF2R nebo dráhu přenosu signálu CRF2R jako potencionální sloučeniny pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva.
19. Způsob identifikace potencionálních terapeutických sloučenin ze skupiny jedné nebo více potencionálních sloučenin, u kterých bylo předem určeno, že prodlužují nebo zvyšují aktivaci CRF2R nebo dráhu přenosu signálu CRF2R, vyznačující tím, že:
a) se podá potencionální sloučenina společně s agonistou CRF2R nehumánnímu zvířeti; a
b) se stanoví, zda-li potencionální sloučenina reguluje hmotu nebo funkci kosterního svalstva v ošetřovaném zvířeti.
20. Způsob identifikace potencionálních sloučenin pro zvýšení exprese CRF2R nebo CRF, vyznačující tím, že:
(a) se uvede testovaná sloučenina v kontakt s buňkou nebo buněčným lyzátem obsahujícím reportérový gen operativně asociovaný s regulačním elementem CRF2R nebo regulačním elementem CRF;
(b) se detekuje exprese reportérového genu; a ····
-69(c) se identifikují ty testované sloučeniny, které zvyšují expresi reportérového genu jako potencionální sloučeniny pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva.
21. Způsob zvýšení hmoty nebo funkce kosterního svalstva subjektu, u kterého je takové zvýšení žádoucí, vyznačující tím, že:
(a) se identifikuje subjekt, u kterého je zvýšení hmoty nebo funkce žádoucí; a (b) se podá bezpečné a účinné množství agonisty CRF2R subjektu.
22. Způsob ošetření atrofie kosterního svalstva subjektu, při potřebě takového ošetření, vyznačující tím, že:
(a) se identifikuje subjekt při potřebě ošetření atrofie kosterního svalstva;
(b) se podá bezpečné a účinné množství sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z agonisty CRF2R, expresního vektoru kódujícího funkční CRF2R, expresního vektoru kódujícího konstitučně aktivní CRF2R, expresního vektoru kódujícího CRF a sloučeniny zvyšující expresi CRF2R nebo CRF subjektu.
23. Způsob ošetření atrofie kosterního svalstva podle nároku 22, vyznačující se tím, že sloučenina je agonista CRF2R.
24. Způsob ošetření atrofie kosterního svalstva podle nároku 23, kde agonista CRF2R je identifikován způsobem identifikace potencionálních sloučenin pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva, vyznačující tím, že:
(a) se uvede testovaná sloučenina v kontakt s CRF2R, (b) se stanoví, zda-li testovaná sloučenina aktivuje CRF2R;
(c) se identifikují ty testované sloučeniny, které aktivují CRF2R jako potencionální sloučeniny pro regulaci hmoty nebo funkce kosterního svalstva.
·· ··
-7025. Způsob ošetření atrofie kosterního svalstva podle nároku 23, vyznačující se tím, že agonista CRF2R je chimérická nebo lidská protilátka.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že agonista CRF2Rje selektivnější pro CRF2R než pro CRFjR.
27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že agonista CRF2R vykazuje selektivitu pro CRF2R větší nebo rovno stonásobku.
28. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že subjekt má svalovou dystrofií a agonista CRF2R vykazuje selektivitu pro CRF2R v rozmezí od jednonásobku po stonásobek.
29. Způsob ošetření atrofie kosterního svalstva podle nároku 23, vyznačující tím, že se podá bezpečné a účinné množství sloučeniny, která prodlužuje nebo zvyšuje aktivaci CRF2R nebo aktivaci dráhy přenosu signálu CRF2R subjektu.
30. Purifikovaná protilátka specifická pro CRF2R, která je chimérická nebo lidská protilátka.
31. Protilátka podle nároku 30, která je agonista CRF2R.
32. Protilátka podle nároku 31, která je lidská protilátka.
33. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje:
(a) bezpečné a účinné množství agonisty CRF2R; a (b) farmaceuticky přijatelný nosič.
·· ♦··· * · * ř · ·«· ·· ··
-71
34. Farmaceutický přípravek podle nároku 33, vyznačující se tím, že agonista CRF2R je chimérická nebo lidská protilátka specifická pro CRF2R.
35. Farmaceutický přípravek podle nároku 33, vyznačující se tím, že agonista CRF2Rje urokortin II.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/799,978 US6670140B2 (en) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using corticotropin releasing factor receptors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20032395A3 true CZ20032395A3 (cs) | 2004-01-14 |
Family
ID=25177205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20032395A CZ20032395A3 (cs) | 2001-03-06 | 2002-03-06 | Metoda identifikace sloučenin regulujících svalovou hmotu |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6670140B2 (cs) |
| EP (1) | EP1379873B1 (cs) |
| JP (2) | JP4331942B2 (cs) |
| KR (2) | KR100596991B1 (cs) |
| CN (1) | CN100520408C (cs) |
| AR (1) | AR032957A1 (cs) |
| AT (1) | ATE429242T1 (cs) |
| AU (1) | AU2002303121B2 (cs) |
| BR (1) | BR0207881A (cs) |
| CA (1) | CA2439170C (cs) |
| CZ (1) | CZ20032395A3 (cs) |
| DE (1) | DE60232063D1 (cs) |
| ES (1) | ES2325485T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0402173A2 (cs) |
| IL (1) | IL157330A0 (cs) |
| MA (1) | MA26990A1 (cs) |
| MX (1) | MXPA03008114A (cs) |
| MY (1) | MY134755A (cs) |
| NO (1) | NO20033936L (cs) |
| NZ (1) | NZ527124A (cs) |
| PE (1) | PE20020993A1 (cs) |
| PL (1) | PL367187A1 (cs) |
| RU (1) | RU2260805C2 (cs) |
| SA (1) | SA02230159B1 (cs) |
| SK (1) | SK12132003A3 (cs) |
| TW (1) | TWI227780B (cs) |
| WO (1) | WO2002069908A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200305642B (cs) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL154102A0 (en) * | 2000-08-04 | 2003-07-31 | Res Dev Foundation | Urocortin proteins and uses thereof |
| AU2001289916A1 (en) * | 2000-09-22 | 2002-04-02 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften | Methods for improving the antagonistic/agonistic properties of peptidic antagonists/agonists of the corticotropin-releasing factor receptor (crfr) |
| US6670140B2 (en) * | 2001-03-06 | 2003-12-30 | The Procter & Gamble Company | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using corticotropin releasing factor receptors |
| US6936585B2 (en) * | 2002-01-16 | 2005-08-30 | The Procter & Gamble Company | Corticotropin releasing factor 2 receptor agonists |
| US7815905B2 (en) * | 2006-01-27 | 2010-10-19 | Research Development Foundation | Methods of increasing insulin sensitivity or decreasing insulin secretion by administering corticotropin releasing factor receptor-2 inhibitors |
| WO2008047241A2 (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Modified corticotropin releasing factor peptides and uses thereof |
| GB0624282D0 (en) * | 2006-12-05 | 2007-01-10 | Cavalla David | Treatment of cachexia |
| US8173378B2 (en) * | 2007-05-23 | 2012-05-08 | Pharmacome Llc | Methods of using an alpha-1-adrenergic receptor having altered ligand affinity |
| WO2010036918A2 (en) * | 2008-09-26 | 2010-04-01 | University Of Massachusetts | Intracellular dna receptor |
| SG10201602286RA (en) * | 2010-12-23 | 2016-04-28 | Amazentis Sa | Compositions and methods for improving mitochondrial function and treating neurodegenerative diseases and cognitive disorders |
| WO2013074557A1 (en) * | 2011-11-14 | 2013-05-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing gdf8 and/or activin a |
| RU2517259C1 (ru) * | 2013-03-06 | 2014-05-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ-ИМБП РАН) | Способ профилактики и снижения деструкции белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой |
| JP2015071549A (ja) * | 2013-10-02 | 2015-04-16 | 株式会社ファンケル | アトロジン−１抑制剤 |
| RU2568903C2 (ru) * | 2014-04-07 | 2015-11-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ оценки анаболического действия лекарственных препаратов |
| JP2019533021A (ja) | 2016-10-20 | 2019-11-14 | コーティーン インコーポレイテッド | 不適応のストレス応答に寄与する疾患を処置する方法 |
| MX2020008991A (es) | 2018-03-01 | 2020-12-10 | Regeneron Pharma | Metodos para alterar la composicion corporal. |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4415558A (en) * | 1981-06-08 | 1983-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | CRF And analogs |
| AU9054582A (en) * | 1982-09-29 | 1984-04-24 | Lederis, K.P., Mac Cannell, K.L.:ichikawa, T:river, J.E. | Urotensin peptides |
| US4489163A (en) * | 1983-04-14 | 1984-12-18 | The Salk Institute For Biological Studies | rCRF and analogs |
| US4605642A (en) * | 1984-02-23 | 1986-08-12 | The Salk Institute For Biological Studies | CRF antagonists |
| US4594329A (en) * | 1984-05-14 | 1986-06-10 | The Salk Institute For Biological Studies | CRF analogs |
| US4801612A (en) * | 1986-07-03 | 1989-01-31 | Regents Of The University Of California | Method of inhibiting inflammatory response |
| DE3703340A1 (de) * | 1987-02-04 | 1988-08-18 | Dirck Dr Med Oppermann | Pharmazeutische zubereitung zur behandlung der herzinsuffizienz |
| US4908352A (en) * | 1987-09-28 | 1990-03-13 | The Salk Institute For Biological Studies | Urotensin peptides |
| US5109111A (en) * | 1988-09-23 | 1992-04-28 | The Salk Institute For Biological Studies | CRF antagonists |
| CA1340964C (en) * | 1988-09-30 | 2000-04-18 | Jean E. F. Rivier | Crf analogs |
| US5278146A (en) * | 1988-09-30 | 1994-01-11 | The Salk Institute For Biological Studies | CRF analogs |
| US5235036A (en) * | 1991-05-31 | 1993-08-10 | The Salk Institute For Biological Studies | Crf analogs |
| US5493006A (en) * | 1993-06-16 | 1996-02-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Cyclic CRF analogs |
| US6495343B1 (en) * | 1993-06-18 | 2002-12-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CRF receptor(s) |
| US5728545A (en) * | 1993-06-18 | 1998-03-17 | The Salk Institute Of Biological Studies | Cloning and recombinant production of CRF receptor (S) |
| EP0724637B2 (en) * | 1994-06-14 | 2002-06-05 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Corticotropin-releasing factor 2 receptors |
| US5786203A (en) * | 1994-06-14 | 1998-07-28 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Isolated nucleic acid encoding corticotropin-releasing factor2 receptors |
| EP0860501A3 (en) | 1994-06-14 | 1999-05-19 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Corticotropin-releasing factor2 receptors |
| US5824771A (en) | 1994-12-12 | 1998-10-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Cyclic CRF agonists |
| US5663292A (en) | 1994-12-12 | 1997-09-02 | The Salk Institute For Biological Studies | Cyclic CRF analogs |
| US5660824A (en) | 1995-05-24 | 1997-08-26 | Grabstein; Kenneth H. | Muscle trophic factor |
| EP0845035A2 (en) | 1995-06-13 | 1998-06-03 | The Salk Institute For Biological Studies | Urocortin peptides |
| US5869450A (en) | 1996-03-06 | 1999-02-09 | The Regents Of The University Of California | Anti-inflammatory compositions and method with corticotropin-releasing factor analogs |
| US5888811A (en) * | 1996-05-23 | 1999-03-30 | Dupont Pharmaceuticals Company | Corticotropin-releasing hormone receptor |
| CA2338561A1 (en) * | 1998-07-24 | 2000-02-03 | Joachim Spiess | Antagonists specific for the corticotropin-releasing factor receptor type 2 (crfr2) |
| IL154102A0 (en) * | 2000-08-04 | 2003-07-31 | Res Dev Foundation | Urocortin proteins and uses thereof |
| US6670140B2 (en) * | 2001-03-06 | 2003-12-30 | The Procter & Gamble Company | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using corticotropin releasing factor receptors |
-
2001
- 2001-03-06 US US09/799,978 patent/US6670140B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-03-05 TW TW091104025A patent/TWI227780B/zh not_active IP Right Cessation
- 2002-03-05 PE PE2002000176A patent/PE20020993A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-03-06 KR KR1020037011659A patent/KR100596991B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-03-06 SK SK1213-2003A patent/SK12132003A3/sk unknown
- 2002-03-06 CZ CZ20032395A patent/CZ20032395A3/cs unknown
- 2002-03-06 CN CNB028059271A patent/CN100520408C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-06 KR KR1020067005678A patent/KR100598441B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-03-06 IL IL15733002A patent/IL157330A0/xx unknown
- 2002-03-06 ES ES02731122T patent/ES2325485T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-06 EP EP02731122A patent/EP1379873B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-06 AU AU2002303121A patent/AU2002303121B2/en not_active Ceased
- 2002-03-06 RU RU2003129500/15A patent/RU2260805C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-03-06 BR BR0207881-3A patent/BR0207881A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-03-06 DE DE60232063T patent/DE60232063D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-06 MY MYPI20020802A patent/MY134755A/en unknown
- 2002-03-06 PL PL02367187A patent/PL367187A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-03-06 AR ARP020100806A patent/AR032957A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-03-06 CA CA2439170A patent/CA2439170C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-06 HU HU0402173A patent/HUP0402173A2/hu unknown
- 2002-03-06 WO PCT/US2002/007476 patent/WO2002069908A2/en active IP Right Grant
- 2002-03-06 MX MXPA03008114A patent/MXPA03008114A/es active IP Right Grant
- 2002-03-06 NZ NZ527124A patent/NZ527124A/en unknown
- 2002-03-06 JP JP2002569086A patent/JP4331942B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-06 AT AT02731122T patent/ATE429242T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-06-19 SA SA02230159A patent/SA02230159B1/ar unknown
-
2003
- 2003-07-22 ZA ZA200305642A patent/ZA200305642B/en unknown
- 2003-08-07 MA MA27267A patent/MA26990A1/fr unknown
- 2003-08-27 US US10/649,852 patent/US7063954B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-05 NO NO20033936A patent/NO20033936L/no not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-04-26 US US11/412,025 patent/US7572768B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-09-01 JP JP2008224143A patent/JP2009029816A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7572768B2 (en) | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using corticotropin releasing factor receptors | |
| US7608409B2 (en) | Screening assay using G-protein coupled receptor protein OT7T175 | |
| AU2002303121A1 (en) | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using corticotropin releasing factor receptors | |
| US6750194B1 (en) | Methods of identifying compounds for regulating muscle mass or function using vasoactive intestinal peptide receptors | |
| AU2002230466A1 (en) | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using vasoactive intestinal peptide receptors | |
| US7067113B2 (en) | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using dopamine receptors | |
| US20060183735A1 (en) | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using dopamine receptors | |
| US20040005997A1 (en) | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass of function using amylin receptors | |
| KR20060059257A (ko) | 도파민 수용체를 사용한 근육 질량 또는 기능의 조절을위한 화합물의 동정 방법 |