JP4331942B2 - 副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体を使用して筋量又は機能を調節する化合物を同定する方法 - Google Patents

副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体を使用して筋量又は機能を調節する化合物を同定する方法 Download PDF

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Description

本発明は、骨格筋量又は機能を調節する、あるいは副腎皮質刺激ホルモン放出因子−２受容体（ＣＲＦ2Ｒ）の活性又は発現を調節する候補化合物を同定する方法に関する。また本発明は、骨格筋萎縮を処置する方法、又は介入の標的としてＣＲＦ2Ｒを使用して骨格筋肥大を誘発する方法、ならびに標的としてＣＲＦ2Ｒ及び副腎皮質刺激ホルモン放出因子−１受容体（ＣＲＦ1Ｒ）を使用して筋ジストロフィーを処置する方法に関する。
（ＣＲＦＲ及びリガンド類）
現在、２つの副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体（ＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒ）が識別されており、これらはＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）分類に属する。ＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒの作動薬活性化は、アデニル酸シクラーゼのＧαs活性化を引き起こす。アデニル酸シクラーゼは、前記ｃＡＭＰの形成に触媒作用を及ぼし、それが次には、タンパク質キナーゼＡの活性化、細胞内カルシウム放出、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）の活性化を含む、多数の効果を有する。他の研究では、ＣＲＦ受容体の作動薬活性化後の細胞内イノシトール３リン酸合成の向上から、ＣＲＦＲもまたＧαqに結合することが示唆される。
ＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒは、ヒト、ラット、マウス、ニワトリ、雌ウシ、ナマズ、カエル、及びヒツジからクローニングされている。ＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒは、それぞれ独特の分散パターンを有する。ヒトでは、ＣＲＦ2Ｒ受容体の３種のイソ型である、α、β、及びγがクローニングされている。α及びβＣＲＦ2Ｒの同族体は、ラットにおいて識別されている。
ＣＲＦＲのリガンド／作動薬がいくつか知られている。副腎皮質刺激ホルモン放出因子（あるいは、ホルモン、ＣＲＦ、又はＣＲＨ）は、ＣＲＦ1ＲならびにＣＲＦ2Ｒに結合し活性化する。ＣＲＦは、ストレスに対する身体の応答の主要な変調機構である。この４１−アミノ酸ペプチドは、視床下部−下垂体−副腎ホルモン軸（ＨＰＡ軸）の主要な調節機構として、ニューロン、内分泌腺、及び免疫プロセスの防御の中心的な役割を果たしている。さらに、ＣＲＦと、共にＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒの作動薬として作用する硬骨類のペプチドウロテンシン、同様に両生類のペプチドソーバジンとの間には、実質的な配列相同性がある。これら３種のペプチドは、血圧降下剤及びＡＣＴＨ分泌促進物質として同様の生物学的特性を有する。さらに、ウロテンシン、ウロコルチンの哺乳類の同族種（congener）が特徴付けられている。
ＣＲＦ受容体は、受容体選択的作動薬及び拮抗薬の使用を介して、ＣＲＦＲでないものと薬理学的に区別することができる。これらの選択的作動薬及び拮抗薬をＣＲＦＲノックアウトマウスと組み合わせると、どのＣＲＦ受容体が特定の生物学的応答を媒介するか判定するのに有用であった。
ＣＲＦ1Ｒの役割は、十分に確立されている。ＣＲＦ1Ｒ遺伝子が除去された（ＣＲＦ1Ｒノックアウト）マウスでは、ストレス応答性の低下及び不安症のような挙動の減少が示される。ＣＲＦ1Ｒは、ＨＰＡ軸の主要な媒介機構である。具体的には、視床下部から放出され、視床下部−下垂体門脈系を介して下垂体前葉に輸送される、副腎皮質刺激ホルモン放出因子は、下垂体前葉内に位置する細胞に存在するＣＲＦ1Ｒと相互作用する。作動薬によってＣＲＦ1Ｒが活性化すると、下垂体前葉の細胞からＡＣＴＨが体循環に放出されることになる。放出されたＡＣＴＨは、副腎皮質内に位置する細胞に存在するＡＣＴＨ受容体に結合し、それが副腎皮質ホルモンを含む副腎ホルモンの放出を引き起こす。副腎皮質ホルモンは、胸腺及び脾臓萎縮に関わるメカニズムを介した免疫系の抑制を含む多くの効果を媒介するが、これだけに限るものではない。したがって、ＣＲＦ1Ｒの活性化は、間接的に、ＨＰＡ軸の活性化を介して免疫系の下方制御を引き起こす。
ＣＲＦ2Ｒの役割については、あまり開発されていない。ＣＲＦ2Ｒ遺伝子が除去された（ＣＲＦ2Ｒノックアウト）マウスは、ウロコルチンによる刺激後の食物摂取減少障害、血管拡張の欠如を示すが、ストレス応答は正常である。ＣＲＦ2Ｒを用いた実験から、ＣＲＦ2Ｒが、ＣＲＦＲ作動薬の血圧降下／血管拡張性効果、ならびにマウスをＣＲＦＲ作動薬で処置した後で観察された食物摂取の減少を担っていることが実証された。
（骨格筋萎縮及び肥大）
骨格筋は、動作に関する生理的要求又は代謝的需要の変化に容易に適合する塑性組織である。肥大とは、骨格筋量の増加を指し、骨格筋萎縮とは、骨格筋量の減少を指す。急性の骨格筋萎縮は、手術、ベッド休養、又は骨折による不使用；脊髄損傷、自己免疫疾患、又は感染病による神経除去／神経損傷；無関係条件に対する糖質コルチコイド使用；感染又は他の原因による敗血症；病気又は飢餓による栄養制限；及び宇宙旅行を含めて、様々な原因を追跡可能であるが、これだけに限るものではない。骨格筋萎縮は、正常な生物学的プロセスを通じて起こるが、ある医療状況では、この正常な生物学的プロセスが衰弱レベルの筋萎縮を引き起こす。例えば、急性の骨格筋萎縮は、これだけに限るものではないが、整形外科的処置に付随するものを含め、患者の運動抑制状態からのリハビリテーションにおける顕著な制限を与える。このような場合、骨格筋萎縮を改善するのに必要なリハビリテーション期間は、しばしば、本来の損傷を修復するのに要する期間よりもはるかに長くなる。既に筋機能及び筋量に加齢性のかなりの欠損を患っている可能性のある高齢者では、このような急性の不使用萎縮は、永久的な障害及び早過ぎる死をまねくことがあるので特に問題である。
また骨格筋萎縮は、癌性悪液質、慢性炎症、ＡＩＤＳ性悪液質、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、遺伝病、例えば筋ジストロフィー、神経変性病、及び筋肉減少症（年齢に関係する筋肉の喪失）のような慢性的な状態にも起因することがある。このような慢性状態では、骨格筋萎縮が可動性の早期喪失をまねき、その結果、疾病関連発症率を増加させる可能性がある。
骨格筋の萎縮又は肥大を制御する分子的プロセスについては、ほとんど知られていない。骨格筋萎縮を開始させる引き金となるものは、多様な萎縮開始事象に関して異なるが、患部の骨格筋線維では、タンパク質合成の減少及びタンパク質分解の増加、ならびに遅筋線維（きわめて酸化的な代謝／遅い収縮性のタンパク質イソ型）から速筋線維（きわめて解糖的な代謝／速い収縮性のタンパク質イソ型）への転換の収縮性及び代謝性酵素タンパク質アイソザイム特徴における変化を含め、いくつかの共通する生化学的変化が生じる。骨格筋において発生する他の変化には、脈管構造の喪失及び細胞外マトリックスの再構築が含まれる。速筋及び遅筋攣縮は、相対的な筋肉喪失が特定の萎縮刺激又は条件に依存する適切な条件下で萎縮を示す。重要なことは、これらの変化すべてが調和して調節され、生理的及び代謝的需要の変化に応じて始動又は停止するということである。
萎縮及び肥大が生じるプロセスは、哺乳類種全体にわたって保存されている。多数の研究により、萎縮時に、げっ歯類とヒトで同一の基本的な分子的、細胞的、及び生理的プロセスが起こることが実証されている。したがって、ヒトの萎縮応答を理解及び予測するために骨格筋萎縮のげっ歯類モデルがうまく利用されてきた。例えば、げっ歯類とヒトの両方で様々な手段によって誘発される萎縮は、筋肉の解剖学的構造、断面積、機能、転換線維の種類、収縮性タンパク質の発現、及び組織学的に同様の変化をまねく。さらに、いくつかの薬剤が、げっ歯類とヒトの両方で骨格筋萎縮を調節することが実証されている。このような薬剤には、タンパク質同化ステロイド、成長ホルモン、インスリン様成長因子Ｉ、及びβアドレナリン作動薬が挙げられる。合わせて、これらのデータから、骨格筋萎縮がげっ歯類とヒトに共通のメカニズムに起因することが明示される。
一部の薬剤は、骨格筋萎縮を調節することがわかっており、この徴候に関してヒトでの使用が承認されているが、これらの薬剤には、心筋の肥大、腫瘍形成、多毛症、女性の男性化、疾病率及び死亡率の増加、肝臓障害、低血糖症、筋骨格系疼痛、組織膨張の増加、頻脈、及び浮腫のような、望ましくない副作用がある。現時点では、急性又は慢性の骨格筋萎縮のためのきわめて有効且つ選択性のある処置は存在しない。したがって、骨格筋萎縮を調節する他の治療用薬剤を同定することが必要とされている。
（筋ジストロフィー）
筋ジストロフィーには、臨床的に骨格筋の衰弱部の選択的分散によって区別される、遺伝性の進行性筋肉疾患群が包含される。筋ジストロフィーの最も一般的な二形態は、デュシェンヌ型（Duchenne）及びベッカー型（Becker）ジストロフィーであり、それぞれ、Ｘｐ２１座に位置するジストロフィン遺伝子における突然変異の遺伝に起因する。他のジストロフィーには、ｐ９４カルパイン、アドハリン、γ−サルコグリカン、及びβ−サルコグリカン座を含む多数の遺伝子座の突然変異に起因する肢帯筋ジストロフィー；顔面肩甲上腕（ランドゥジー・デジュリン（Landouzy-Dejerine））筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、及びエメリー・ドレーフス型（Emery-Dreifuss）筋ジストロフィーが挙げられるが、これらだけに限るものではない。もっぱら男性のみに生じるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状には、アヒル歩行、つま先立ち歩行、脊柱前湾、頻繁な転倒、ならびに立ち上がり及び階段昇降の困難が挙げられる。症状は約３〜７歳で始まり、ほとんどの患者が１０〜１２歳で車椅子に制限され、多くが呼吸器合併症のために約２０歳で死亡する。デュシェンヌ筋ジストロフィーの現在の処置には、プレドニゾン（副腎皮質ホルモン薬）の投与が挙げられ、これは治療するものではないが、筋肉の強度の衰退を緩やかにし、能力喪失を遅らせる。プレドニゾンのような副腎皮質ホルモンは、疾病に起因する筋繊維の損傷によって助長される免疫細胞の活性化及び浸潤を妨害することによって作用すると考えられている。残念なことに、副腎皮質ホルモン処置もまた骨格筋萎縮をまねき、それがこれらの患者の免疫応答を妨害する潜在的な利益の一部を無効化する。したがって、筋ジストロフィー患者において筋繊維の損傷を緩やかにし、能力喪失の開始を遅らせるが、現在の治療ほどの骨格筋萎縮を引き起こさない治療薬を同定することが必要とされている。
骨格筋萎縮又は筋ジストロフィーの処置において使用するための化合物の同定に関する問題の１つは、そのような化合物を同定するための優れたスクリーニング方法がないことであった。本出願人らは、ＣＲＦ2Ｒが骨格筋量又は機能の調節に関与しており、ＣＲＦ2Ｒの作動薬が骨格筋萎縮を妨害し、且つ／又は骨格筋肥大を誘発できることを見出した。本発明は、筋萎縮の処置に有用な候補化合物を同定するために使用できるＣＲＦ2Ｒを用いたスクリーニング方法を提供することによって、筋萎縮を処置するための化合物を同定する問題を解決する。また本発明は、ＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒの両方を活性化する候補化合物を同定するスクリーニング方法を提供することによって、筋萎縮を処置するための化合物を発見する問題も解決する。
本発明は、骨格筋萎縮の処置において有用な可能性のある候補化合物を同定し、且つ／又は骨格筋肥大を誘発するための、ＣＲＦＲの使用に関する。具体的には、本発明は、骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する生体外（in vitro）方法を提供するものであり、この方法は、前記試験化合物をＣＲＦ2Ｒを発現する細胞に接触させる工程、又は試験化合物を単離されたＣＲＦ2Ｒに接触させる工程、ならびに前記試験化合物が前記ＣＲＦ2Ｒに結合する又はそれを活性化するかどうか判定する工程を含む。本発明の他の実施形態は、ＣＲＦ2Ｒに結合する又はそれを活性化するものと判定された１つ以上の候補化合物から治療用候補化合物を同定する方法に関し、この方法は、前記候補化合物をヒト以外の動物に投与する工程、及び、処置した動物において候補化合物が骨格筋量又は筋機能を調節するかどうか判定する工程を含む。
本発明の他の実施形態は、骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法に関し、この方法は次の工程をいずれかの順序で含む：（ｉ）試験化合物を、機能的ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物に起因する前記ＣＲＦ2Ｒの活性化レベルを判定する工程；（ｉｉ）試験化合物を、機能的ＣＲＦ1Ｒを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物に起因する前記ＣＲＦ1Ｒの活性化レベルを判定する工程；それに続いて、（ｉｉｉ）ＣＲＦ2Ｒの活性化レベルとＣＲＦ1Ｒの活性化レベルとを比較する工程；ならびに、（ｉｖ）前記ＣＲＦ2Ｒ及びＣＲＦ1Ｒに対して同様の活性を示す、あるいはＣＲＦ2Ｒに選択性を示す前記試験化合物を、骨格筋量又は機能を調節する候補化合物として同定する工程。
本発明は、さらに、作動薬によって誘発されるＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる候補化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、次の工程をいずれかの順序で又は同時に含む：（ｉ）試験化合物を、機能的ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞に接触させる工程；（ｉｉ）対照細胞においてＣＲＦ2Ｒの脱感作を引き起こす十分な時間且つ十分な濃度で、細胞をＣＲＦ2Ｒ作動薬で処置する工程；それに続いて、（ｉｉｉ）ＣＲＦ2Ｒの活性化レベルを判定し、ＣＲＦＲ又はＣＲＦＲシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる試験化合物を、骨格筋量又は機能を調節する候補化合物として同定する工程。特定の実施形態では、本発明は、ＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させるものと判定された１つ以上の候補化合物から治療用候補化合物を同定する方法に関し、この方法は、候補化合物をＣＲＦ2Ｒ作動薬と併せてヒト以外の動物に投与する工程、及び、前記処置した動物において前記候補化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定する工程を含む。
本発明は、さらに、ＣＲＦ2Ｒの発現を増加させる候補化合物を同定する方法を提供し、この方法は、試験化合物を、ＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節エレメントに操作可能に会合されたレポーター遺伝子を含有する細胞又は細胞溶解物に接触させる工程、及び、前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程を含む。前記レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、ＣＲＦ2Ｒの発現を増加させる候補化合物として同定する。特定の実施形態では、本発明は、候補化合物をヒト以外の動物に投与し、前記処置した動物において前記候補化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定することによって、ＣＲＦ2Ｒの発現を増加させる候補化合物を生体内で骨格筋量又は機能を調節するために使用できるかどうか判定する方法に関する。
本発明は、さらに、ＣＲＦの発現を増加させる候補化合物を同定する方法を提供し、この方法は、試験化合物を、ＣＲＦ遺伝子調節エレメントに操作可能に会合されたレポーター遺伝子を含有する細胞又は細胞溶解物に接触させる工程、及び前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程を含む。前記レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、ＣＲＦの発現を増加させる候補化合物として同定する。特定の実施形態では、本発明は、候補化合物をヒト以外の動物に投与して、前記処置した動物において前記候補化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定することによって、ＣＲＦの発現を増加させる候補化合物を生体内で骨格筋量又は機能を調節するために使用できるかどうか判定する方法に関する。
また本発明は、骨格筋萎縮を処置するための、ＣＲＦ2Ｒ作動薬、機能的ＣＲＦ2Ｒをコード化する発現ベクター、構成的活性型ＣＲＦ2Ｒをコード化する発現ベクター、あるいはＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦの発現を増加させる化合物の使用に関する。具体的には、本発明は、骨格筋萎縮の処置が必要な被験体において骨格筋萎縮を処置する方法を提供するものであり、この方法は、安全且つ有効な量のＣＲＦ2Ｒ作動薬、機能的ＣＲＦ2Ｒをコード化する発現ベクター、構成的活性型ＣＲＦ2Ｒをコード化する発現ベクター、ＣＲＦ又はＣＲＦ類似体をコード化する発現ベクター、あるいはＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦの発現を増加させる化合物を被験体に投与する工程を含む。特定の実施形態では、本発明は、骨格筋萎縮の処置が必要な被験体において骨格筋萎縮を処置する方法に関し、この方法は、安全且つ有効な量のＣＲＦ2Ｒ作動薬を、作動薬によって誘発されるＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる安全且つ有効な量の化合物と併せて被験体に投与する工程を含む。
また本発明は、被験体において骨格筋量又は機能を増加させるためのＣＲＦ2Ｒ作動薬の使用に関する。具体的には、本発明は、骨格筋量又は機能の増加が望ましい被験体において骨格筋量又は機能を増加させる方法を提供するものであり、この方法は、筋量又は機能の増加が望ましい被験体を識別する工程、及び前記被験体に安全且つ有効な量のＣＲＦＲ作動薬を投与する工程を含む。
本発明はさらに、安全且つ有効な量のＣＲＦ2Ｒ作動薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、この医薬組成物はＣＲＦ2Ｒに特異的なキメラ又はヒト抗体を含む。他の特定の実施形態では、この医薬組成物はＣＲＦ又はＣＲＦ類似体、好ましくはウロコルチンＩＩを含む。
また本発明は、ＣＲＦ2Ｒに対する抗体、特にはＣＲＦ2Ｒの作動薬であるキメラ又はヒト抗体に対する抗体を提供する。
本出願全体を通して、多様な刊行物が参照されている。本発明が関連する技術分野についてより詳細に記載するために、本明細書ではこれらの刊行物の開示の全体を参照によりここに援用する。
（配列表の説明）
配列表に含まれるＣＲＦＲヌクレオチド及びタンパク質配列又はＣＲＦ類似体タンパク質配列を、それぞれ、対応する遺伝子バンク（Genbank）又はダウエント（Derwent）受入番号ならびにクローン元である動物種と併せて表Ｉに示す。また、配列表に示す配列と同一又はほぼ同一のアミノ酸配列をコード化する関連ヌクレオチド配列の受入番号も示す。これらの関連配列は、主に示した５’又は３’未翻訳配列の量が異なる。
Figure 0004331942
Figure 0004331942
Ｉ．用語及び定義
以下は、本明細書で使用する用語に関する定義の一覧である。
「作動薬」は、受容体を活性化するいずれかの化合物を意味し、抗体がそれに含まれるが、これだけに限るものではない。例えば、ＣＲＦＲ作動薬には、ＣＲＦ及びＣＲＦ類似体が挙げられるが、これだけに限るものではない。
「対立遺伝子変異型」は、所与の遺伝子又は遺伝子産物の変異型形態を意味する。個体群中では多数の遺伝子が２つ以上の対立形態で存在し、多数の対立遺伝子を有する遺伝子もあることが、当業者には認識されている。
「抗体」とは、その文法的な多様な形態で、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。「精製抗体」とは、それが自然に関係するタンパク質及び自然発生有機分子から、部分的又は完全に分離された抗体を意味する。好ましくは、乾燥重量で少なくとも６０％抗体、より好ましくは少なくとも７５％抗体、さらに好ましくは少なくとも９０％抗体、最も好ましくは少なくとも９９％抗体が調製される。
「結合親和性」とは、リガンドが受容体と相互作用する性向を意味し、特定のＣＲＦリガンド−ＣＲＦＲ相互作用に関する解離定数に反比例する。解離定数は、標準的な飽和、競合、又は動的結合技術を介して直接的に、あるいは機能的アッセイ及び終点に関わる薬理学的技術を介して間接的に測定することができる。
「キメラ抗体」とは、２つ以上の異なる抗体分子由来、すなわち異なる動物種由来の構造エレメントを含有する抗体を意味する。キメラ抗体には、「ヒト化抗体」として知られる抗体が含まれるが、これだけに限るものではなく、これには相補的判定領域グラフトとして知られる技術によって生成されるキメラ抗体が含まれるが、これだけに限るものではない。
「ＣＲＦ」は、副腎皮質刺激ホルモン放出因子を意味し、これは副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）と同じものである。代表的なＣＲＦペプチドには、ｒ／ｈＣＲＦ及びヒツジＣＲＦ（米国特許第４，４１５，５５８号）などが挙げられる。
「ＣＲＦ類似体」は、ＣＲＦＲのリガンドとして働く物質を意味する。好適なＣＲＦ類似体は、様々な脊椎動物種から得ることができ、これには、ソーバジン（例えば、米国特許第４，６０５，６４２号参照）、ウロテンシン（例えば、米国特許第４，９０８，３５２号及び４，５３３，６５４号参照）、マウス由来ウロコルチンＩＩ（配列識別番号４３）、ヒト由来ウロコルチン関連ペプチド（配列識別番号４４）（レイエス（Reyes）Ｔ．Ｍ．他の全国科学学会報（Proc.Nat'l Acad Sci）９８：２８４３〜２８４８（２００１））、ウロコルチン（例えば、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９７／０００６３参照）、ならびに、米国特許第４，４１５，５５８号；４，４８９，１６３号；４，５９４，３２９号；４，６０５，６４２号；５，１０９，１１１号；５，２３５，０３６号；５，２７８，１４６号；５，４３９，８８５号；５，４９３，００６号；５６６３２９２号；５，８２４，７７１号；５，８４４，０７４号；及び５，８６９，４５０号に記載のＣＲＦ類似体のような物質が挙げられるが、これだけに限るものではない。これらの各特許を参照により本明細書に組み込む。好ましいＣＲＦ類似体は、ソーバジン、ウロコルチン、ウロコルチン関連ペプチド、ウロコルチン−ＩＩ、及びウロテンシンである。
「ＣＲＦＲ作動薬」は、ＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒ、あるいはその両方を活性化する能力を有する化合物又は分子を意味する。ＣＲＦＲの活性化は、本明細書で後で説明するように測定することができる。
「ＣＲＦＲ」は、ＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒを意味する。
「ＣＲＦ1Ｒ」は、いずれかの動物種由来のＣＲＦ1Ｒのいずれかのイソ型を意味する。これまで、ＣＲＦ1Ｒは、ＣＲＦ−ＲＡ、ＰＣ−ＣＲＦ、ＣＲＦ（パーリン（Perrin）Ｍ．Ｈ．他の内分泌学（Endocrinology）１３３：３０５８〜３０６１（１９９３）、チェン（Chen）Ｒ．他の米国科学学会報（Proc.Nat'l Acad Sci.USA）９０：８９６７〜８９７１（１９９３）、チャン（Chang）Ｃ−Ｐ．他のニューロン（Neuron）１１：１１８７〜１１９５（１９９３）、岸本（Kishimoto）Ｔ．他の米国科学学会報（Proc.Nat'l Acad Sci.USA）９２：１１０８〜１１１２（１９９５）、及びビータ（Vita）Ｎ．他のＦＥＢＳレターズ（FEBS Lett.）３３５：１〜５（１９９３））、あるいはＣＲＨ受容体と呼ばれている。
ＣＲＦ1Ｒの定義には、受容体をコード化するｃＤＮＡ又は遺伝子配列が配列データベースに蓄積されている受容体が含まれるが、これだけに限るものではない。これらの配列には、受入番号：Ｘ７２３０４、Ｅ１１４３１、Ｌ２３３３２、Ｉ９２５８４、Ｔ３７０６８、Ｔ２８９６８、Ｑ８１９５２、Ｌ２３３３３、ＮＭ＿００４３８２、ＡＦ１８０３０１、Ｔ２８９７０、Ｌ２５４３８、Ｌ２４０９６、Ｉ９２５８６、Ｑ８１９５４、ＡＨ００６７９１、ＮＭ＿００７７６２、Ｘ７２３０５、ＡＦ０５４５８２、Ｙ１４０３６、ＡＦ２２９３５９、ＡＦ２２９３６１、ＡＢ０５５４３４、及びＬ４１５６３が挙げられる。これらの受容体のヌクレオチド及びタンパク質配列は、遺伝子バンク又はダウエントから入手可能であり、便宜上、代表配列を本明細書の配列表に記載している。
「ＣＲＦ2Ｒ」は、いずれかの動物種由来のＣＲＦ2Ｒのいずれかのイソ型を意味する。またＣＲＦ2Ｒも、ＨＭ−ＣＲＦ、ＣＲＦ−ＲＢ（岸本（Kishimoto）Ｔ．他の米国科学学会報（Proc.Nat'l Acad Sci.USA）９２：１１０８〜１１１２（１９９５）及びパーリン（Perrin）Ｍ．他の米国科学学会報（Proc.Nat'l Acad Sci.USA）９２：２９６９〜２９７３（１９９５））と呼ばれている。
ＣＲＦ2Ｒ受容体の定義には、受容体をコード化するＤＮＡ配列が配列データベースに蓄積されている受容体が含まれるが、これだけに限るものではない。これらの配列には、受入番号：Ｕ３４５８７、Ｅ１２７５２、ＮＭ＿００１８８３、Ｔ１２２４７、Ｔ６６５０８、ＡＦ０１１４０６、ＡＦ０１９３８１、Ｕ１６２５３、Ｔ１２２４４、Ｔ２８９７２、Ｕ１７８５８、ＮＭ＿００９９５３、Ｙ１４０３７、及びＡＦ２２９３６０が挙げられる。これらの受容体のヌクレオチド及びタンパク質配列は、遺伝子バンク又はダウエントから入手可能であり、便宜上、代表配列を本明細書の配列表に記載している。
また「ＣＲＦＲ」という用語には、欠損型及び／又は変異型タンパク質も包含され、リガンド結合又は信号伝達に不要な受容体分子の領域が削除又は修飾されている。例えば、主要なアミノ酸配列中に１つ以上の同類変化を有するＣＲＦＲが本発明で有用であることが当業者には認識される。特定のアミノ酸を、同様の構造又は特性を有する異なるアミノ酸によって置換（同類置換）すると、静止変化（silent change）、すなわち機能を顕著に変えない変化をまねき得ることが、当該技術分野において既知である。同類置換は、当該技術分野において周知である。例えば、ＧＰＣＲは、他の疎水性アミノ酸と共に脂肪の方を向き機能性を残す、膜貫通型αヘリックス中のアミノ酸残基の置換を許容できることが知られている。同類アミノ酸置換のような欠損及び／又は突然変異の点で自然発生する配列とは異なるＣＲＦ1Ｒもまた、ＣＲＦ1Ｒの定義に含まれる。同類アミノ酸置換のような欠損及び／又は突然変異の点で自然発生する配列とは異なるＣＲＦ2Ｒもまた、ＣＲＦＲ2の定義に含まれる。
また、前記一覧以外の種、特に哺乳類種由来のＣＲＦＲが本発明で有用であることも当業者に認識され得る。既知のＣＲＦＲ種の配列から得られるプローブを使用することによって、既知の配列に相同なｃＤＮＡ又はゲノム配列を、既知のクローニング方法によって同一又は代替的な種から得ることができることも当業者にはさらに認識され得る。このようなＣＲＦ1ＲもまたＣＲＦ1Ｒの定義に含まれ、このようなＣＲＦ2ＲもまたＣＲＦ2Ｒの定義に含まれる。
さらに、特定の種にはＣＲＦＲの機能的対立遺伝子変異型又は機能的スプライス変異型が存在することがあり、これらの変異型が本発明で有用であることが当業者には認識される。ＣＲＦＲのスプライス変異型は公知であり、例えば、米国特許第５，８８８，８１１号；５，７８６，２０３号；及び５，７２８，５４５号に記載されており、これらの各特許を参照により本明細書に組み込む。このようなＣＲＦ1Ｒ変異型もまたＣＲＦ1Ｒの定義に含まれ、このようなＣＲＦ2Ｒ変異型もまたＣＲＦ2Ｒの定義に含まれる。
ＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒポリペプチド、あるいはＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒポリペプチド断片と、ＣＲＦＲでないポリペプチドとの融合体を、ＣＲＦＲ融合タンパク質と呼ぶ。
当業者は、既知の方法を用いてＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒの融合タンパク質を製造することができ、これは天然のＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒとは異なるが、本発明における有用性は残されている。例えば、ＣＲＦＲでないポリペプチドは、翻訳的に又は翻訳後にタンパク質をその合成位置から他の位置に移動させる信号（又はリーダー）ポリペプチド配列にしてもよい（例えば、酵母α−因子リーダー）。あるいは、ＣＲＦＲの精製又は同定を容易にするためにＣＲＦＲでないポリペプチドを加えてもよい（例えば、ポリ−Ｈｉｓ、又はＦｌａｇペプチド）。ＣＲＦ1Ｒ融合タンパク質もまたＣＲＦ1Ｒの定義に含まれ、ＣＲＦ2Ｒ融合タンパク質もまたＣＲＦ2Ｒの定義に含まれる。
「ＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路」は、内因性又は外因性リガンドのＣＲＦ2Ｒへの結合によって調整される、いずれかの信号伝達経路（例えば、ｃＡＭＰ、ＭＡＰキナーゼ）あるいは信号伝達経路の組み合わせを意味する。
「機能的ＣＲＦＲ」とは、生体内又は生体外でＣＲＦ又はＣＲＦ類似体に結合するＣＲＦＲを指し、リガンド結合の結果として活性化される。
「融合遺伝子」とは、１つのハイブリッドタンパク質をコード化するように動作可能に会合された２つ以上のＤＮＡコード配列を意味する。「融合タンパク質」は、融合遺伝子のタンパク質産物である。
「阻害」とは、特定のプロセス又は活性を部分的又は完全に妨害することを意味する。例えば、化合物が完全又は部分的に筋萎縮を妨げる場合、その化合物は骨格筋萎縮を阻害する。
本明細書で使用するとき、２つのＤＮＡ配列は、それらの間の連鎖の性質が、（１）フレームシフト変異の移入を引き起こさず、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を起こす能力に干渉せず、あるいは（３）対応するＲＮＡ転写産物をタンパク質に翻訳する能力に干渉しない場合に、「動作可能に会合した」といわれる。例えば、コード配列及び調節配列は、それらがコード配列の転写を調節配列の作用下又は制御下におくように共有結合するとき、動作可能に会合している。したがって、プロモーター領域は、得られる転写産物を所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳できるようにそのＤＮＡ配列の転写を実施できるとき、コード配列と動作可能に会合している。
「パーセント同一性」とは、２つの配列が共通に有するヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージを意味し、以下のように計算される。特定の配列（クエリー）についてパーセント同一性を計算するには、ジェネティクス・コンピュータ・グループ社（Genetics Computer Group,Inc.）から入手可能なベストフィット（BestFit）比較コンピュータプログラム、ウィスコンシン・パッケージ（Wisconsin Package）、バージョン１０．１を使用して、クエリー配列の関連部分をリファレンス配列と比較する。このプログラムは、スミス（Smith）及びウォーターマン（Waterman）の、応用数学の進展（Advances in Applied Mathematics）、第２刊：４８２〜４８９（１９８１）のアルゴリズムを使用している。パーセント同一性は、ベストフィット・プログラムの次の初期設定パラメータで計算される：スコアリング・マトリックス（scoring matrix）がｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐ、ギャップ・クリエーション・ペナルティ（gap creation penalty）が８、ギャップ・エクステンション・ペナルティ（Gap extension penalty）が２。配列をリファレンス配列と比較するときには、クエリー配列の関連部分は、ＣＲＦＲ配列由来のものになる。例えば、クエリーがＣＲＦＲ／精製タグ融合タンパク質の場合、パーセント同一性スコアを計算するために、配列のＣＲＦＲポリペプチド部分だけを整列させる。
「ポリペプチド」とは、長さ又は翻訳後修飾（例えば、リン酸化又はグリコシル化）に関わらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。
「プロモーター」とは、遺伝子又はコード領域からの転写の開始ならびに転写の速度を制御するＤＮＡ配列を意味する。
「予防的処置」とは、現時点では骨格筋萎縮の徴候を示していない被験体の、骨格筋萎縮の発生を完全に又は部分的に妨害するための防止的な処置を意味する。本明細書の背景の項で説明したように、骨格筋萎縮の恐れのある人がいることが当業者に認識される。さらに、骨格筋萎縮を引き起こす生化学的変化を適切に調節すれば、その危険のある個体における萎縮の発生が防止又は低減されることが、当業者には認識される。例えば、副腎皮質ホルモンによる処置を開始している筋ジストロフィー患者は、骨格筋萎縮が進行する危険があり、骨格筋萎縮の患者の予防的処置が適切であることが示唆される。
「調節」とは、文法的なすべての形態で、増加、減少、又は維持することを意味し、例えば骨格筋量又は機能のレベルを増加、減少、又は維持するために、骨格筋量又は機能を調節することを意味する。
「骨格筋量又は機能の調節」には、骨格筋量の調節又は骨格筋機能の調節、あるいはその両方が含まれる。
「調節エレメント」とは、動作可能に会合されたＤＮＡ配列からの転写レベルを制御できるＤＮＡ配列を意味する。調節エレメントのこの定義には、プロモーター及びエンハンサーが含まれる。例えば、ＣＲＦＲ遺伝子調節エレメントとは、ＣＲＦＲ遺伝子からの転写レベルを制御できるＤＮＡ配列である。
「レポーター遺伝子」とは、その産物を好ましくは定量的に検出できるコード配列を意味し、レポーター遺伝子が、測定すべき信号に応答性のある異種プロモーター又はエンハンサーエレメントと動作可能に会合している。この状況におけるプロモーター又はエンハンサーエレメントを、本明細書では「応答性エレメント」と呼ぶ。
「選択的作動薬」とは、作動薬が、ある受容体に対して、他の受容体に比べ顕著に大きい活性を有することを意味しており、それが他の受容体に関して完全に不活性であることを意味するものではない。
「骨格筋肥大」とは、骨格筋量の増加又は骨格筋機能の増加、あるいはその両方を意味する。
「骨格筋萎縮」は、「筋消耗」と同じ意味で、骨格筋量の減少又は骨格筋機能の低下、あるいはその両方を意味する。
「スプライス変異型」とは、代替的なエクソン使用の結果得られるｍＲＮＡ又はタンパク質を意味する。細胞の種類に応じて、あるいは単一種類の細胞内でさえ、ｍＲＮＡがスプライス変異型として異なる形態で発現することがあり、したがって、発現するｍＲＮＡに応じて翻訳されるタンパク質が異なることが当業者には認識されている。
物質の「治療的に有効な量」とは、ヒト又はヒト以外の哺乳類における許容可能な利益対危険比で、処置を受ける被験体に医学的に望ましい結果、例えば骨格筋萎縮の軽減、骨格筋量又は骨格筋機能の増加を生み出すことのできる量である。
「治療的処置」とは、筋量又は筋機能の増加が望ましい被験体の処置を意味する。例えば、その時点で骨格筋萎縮の徴候を示している被験体を、既に発生している骨格筋萎縮を部分的又は完全に改善し、あるいはさらなる骨格筋萎縮の発生を完全又は部分的に妨害するために処置することは、その被験体の治療的処置になる。また「治療的処置」という用語には、例えば、骨格筋萎縮の徴候を示していない被験体に骨格筋肥大を誘発させる処置、例えば家畜動物の筋量を増加させる処置が包含される。
「処置」という用語は、予防的又は治療的処置を意味する。
特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、タンパク質化学、薬理学、又は分子生物学の技術者に一般に理解されているのと同一の意味を有する。本明細書で述べる、方法、材料及び実施例は、制限的なものではない。本明細書に記載のものと同様又は等価の他の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができる。
ＩＩ．骨格筋量の調節におけるＣＲＦＲの役割
本発明を利用すると、従来技術における情報及び以下の教示が与えられることが当業者には認識される。本明細書に記載する結果から、骨格筋萎縮モデルにおいて、ＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒ（非選択的ＣＲＦＲ作動薬）の両方を活性化するＣＲＦ受容体作動薬を投与すると、神経除去、不使用、又はデキサメタゾン処置の骨格筋萎縮誘発効果を妨害及び／又は阻害することが実証される。さらに、データから、ＣＲＦ2ＲノックアウトマウスではＣＲＦＲ作動薬がこの抗萎縮効果を示さないことが示される。また、ＣＲＦ1Ｒによって媒介されるＨＰＡ軸が副腎の除去（外科的副腎摘出術）によって遮断されたラットでは、非選択的ＣＲＦＲ作動薬でこれらの動物を処置すると抗萎縮効果が示され、ＣＲＦ2Ｒが抗萎縮効果を媒介することが示唆される。さらに、これらの結果から、非選択的ＣＲＦＲ作動薬を投与すると肥大誘発効果を示すことが実証される。合わせて、これらのデータから、骨格筋萎縮プロセスにおけるＣＲＦ2Ｒの調整的役割が実証される。生体内におけるＣＲＦＲの具体的な役割は、以下に記載する多様な骨格筋萎縮モデルにおいて、ＣＲＦＲの選択的作動薬であるソーバジン（バッケム・バイオサイエンス社（Bachem Biosciences,Inc.）、ペンシルベニア州キングオブプルージア）及びウロコルチン（バッケム・バイオサイエンス社（Bachem Biosciences,Inc.））という薬剤を使用して調査された。これらの薬剤は、十分に特徴付けられており、科学文献に記載されている。
図１〜７及び９は、ＣＲＦＲの選択的作動薬を投与すると骨格筋萎縮が統計的に有意に阻害されることを実証する実験結果を示す。図８は、ＣＲＦＲ作動薬であるソーバジンの抗萎縮効果がＣＲＦ2Ｒを通じて媒介されることを示す。ＣＲＦＲ作動薬を、１日に２度、ホスホジエステラーゼ阻害物質であるテオフィリンと併せて投与すると、骨格筋萎縮の動物モデルにおいて骨格筋萎縮が阻害された。テオフィリンは、ＣＲＦＲ作動薬の作用の期間及び大きさを増強し、したがってこれらの化合物の効き目を高めるために添加されたものである。これらの萎縮モデルにおいてテオフィリンを単独投与すると効果がなく、テオフィリンと組み合わせたＣＲＦＲ作動薬の抗萎縮効果がＣＲＦＲ作動薬の効果によるものであることが実証された。さらに、浸透性ミニポンプを介して、テオフィリンなしでＣＲＦＲ作動薬を連続投与すると、やはり骨格筋萎縮が阻害され、及び／又は骨格筋肥大が引き起こされた。この結果の統計的有意性は、ＡＮＣＯＶＡ（ダグラス・Ｃ・モンゴメリ（Douglas C.Montgomery）、実験の設計及び分析（Design and Analysis of Experiments）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク、第２版、１９８４））を使用して判定した。図１〜９では略語を使用しており、ｇはグラム、ＳＥＭは平均値の標準誤差である。
具体的には、図１は、マウス坐骨神経除去萎縮モデルにおいて、ソーバジンが内側腓腹筋の神経除去誘発萎縮を阻害することを示している。凡例：Ａ−生理食塩水（対照実験）；Ｂ−ソーバジン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；Ｃ−ソーバジン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；Ｄ−ソーバジン（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；Ｅ−ソーバジン（１．０ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；＊−食塩水に比べてｐ≦０．０５。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、１日に２度、上記の用量でソーバジンを又は対照ビヒクル（生理食塩水）を９日間皮下注射した。ソーバジンは、テオフィリン３０ｍｇ／ｋｇと併せて共投与した。９日目に、内側腓腹筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を判定した。
図２は、マウス坐骨神経除去萎縮モデルにおいて、ソーバジンが前脛骨筋の神経除去誘発萎縮を阻害することを示している。凡例：Ａ−水（対照実験）；Ｂ−ソーバジン（０．１ｍｇ／ｋｇ／日）；Ｃ−ソーバジン（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）；Ｄ−ソーバジン（１．０ｍｇ／ｋｇ／日）；＊−水に比べてｐ≦０．０５。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスに、実験期間の終わりまで、アルゼット（Alzet）浸透性ミニポンプを使用した５μｌ／時間の連続注入によってソーバジン又は対照ビヒクル（生理食塩水）のいずれかを投薬した（テオフィリン添加なし）。ソーバジンの１日当りの送達用量は、上記の通りである。ミニポンプの埋め込みは、坐骨神経摘出時に実施した。９日目に、前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を判定した。
図３は、マウスの糖質コルチコイド誘発萎縮モデルにおいて、ソーバジンが前脛骨筋（図３Ａ）及び内側腓腹筋（図３Ｂ）の糖質コルチコイド誘発筋萎縮を阻害することを実証している。凡例：Ａ−水のみ（飲用水にデキサメタゾンは含まれない）（萎縮なし対照実験）；Ｂ−水＋デキサメタゾン（萎縮あり対照実験）；Ｃ−ソーバジン（０．１ｍｇ／ｋｇ／日）＋デキサメタゾン；Ｄ−ソーバジン（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）＋デキサメタゾン；Ｅ−ソーバジン（１．０ｍｇ／ｋｇ／日）＋デキサメタゾン；＊−水に比べてｐ≦０．０５；＃−水＋デキサメタゾンに比べてｐ≦０．０５。糖質コルチコイドであるデキサメタゾンを飲用水に添加後（１．２ｍｇ／ｋｇ／日）、オスのマウスに、実験期間の終わりまで、アルゼット（Alzet）浸透性ミニポンプを使用した５μｌ／時間の連続注入によって上記の薬剤又は対照ビヒクル（生理食塩水）を投薬した（テオフィリン添加なし）。ソーバジンの１日当りの送達用量は、上記の通りである。ミニポンプの埋め込みは、デキサメタゾン曝露開始時に実施した。ソーバジンの投与開始から９日後、内側腓腹筋及び前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を判定した。
図４は、ソーバジンが前脛骨筋（図４Ａ）及び内側腓腹筋（図４Ｂ）の不使用誘発萎縮を阻害することを実証している。さらに、ソーバジン処置による、内側腓腹筋ならびにギプス固定していない肢の前脛骨筋の統計的に有意な肥大も観察された。凡例：Ａ−生理食塩水（対照実験）；Ｂ−テオフィリン；Ｃ−ソーバジン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；Ｄ−ソーバジン（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；Ｅ−ソーバジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；＊−食塩水に比べてｐ≦０．０５。右後肢のギプス固定後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、１日に２度、示した１日当りの送達用量でソーバジン又は対照ビヒクル（生理食塩水）を１０日間皮下注射した。ソーバジンは、１日に２度のホスホジエステラーゼ阻害物質であるテオフィリン（３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与と併せて共投与した。１０日目に、内側腓腹筋及び前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を判定した。
図５は、マウスの坐骨神経除去萎縮モデルにおいて、ソーバジン及びウロコルチンの両方が前脛骨筋の神経除去誘発萎縮を阻害することを実証している。さらに、ウロコルチン処置による、神経除去していない肢の肥大も観察された。凡例：Ａ−水（対照実験）；Ｂ−ソーバジン（１ｍｇ／ｋｇ／日）；Ｃ−ウロコルチン（１．０ｍｇ／ｋｇ／日）；＊−水と比べてｐ≦０．０５。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスに、実験期間の終わりまで、アルゼット（Alzet）浸透性ミニポンプを使用した５μｌ／時間の連続注入によって上記の薬剤又は対照ビヒクル（生理食塩水）を投薬した（テオフィリン添加なし）。薬剤の１日当りの送達用量は、上記の通りである。ミニポンプの埋め込みは、坐骨神経摘出と同時に実施した。９日目に、前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を判定した。
図６は、肢をギプス固定したマウスの不使用萎縮モデルにおいて、ウロコルチンが前脛骨筋（図６Ａ）及び内側腓腹筋（図６Ｂ）の不使用誘発萎縮を阻害することを実証している。凡例：Ａ−生理食塩水（対照実験）；Ｂ−ウロコルチン（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；＊−食塩水に比べてｐ≦０．０５。右後肢のギプス固定後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、１日に２度、ウロコルチン又は対照ビヒクル（生理食塩水）を１０日間皮下注射した。ウロコルチンは、図６Ａ及び６Ｂの記述に示す容量で投与した。ウロコルチンは、１日に２度のホスホジエステラーゼ阻害物質であるテオフィリン（３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与と併せて共投与した。１０日目に、内側腓腹筋及び前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を判定した。
図７は、ソーバジンが、前脛骨筋（図７Ａ）、ＥＤＬ筋（図７Ｂ）、ヒラメ筋（図７Ｃ）、内側腓腹筋（図７Ｄ）、及び足底筋（図７Ｅ）の神経除去誘発萎縮を阻害することを実証している。さらに、ソーバジンは、神経除去していないＥＤＬ筋（図７Ｂ）の統計的に有意な肥大を引き起こした。凡例：Ａ−生理食塩水（対照実験）；Ｂ−ソーバジン（０．００３ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；Ｃ−ソーバジン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；Ｄ−ソーバジン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン；＃−対応する対照実験に比べてｐ≦０．０５。右坐骨神経の神経除去後、副腎摘出したオスのラット（副腎摘出したラットは、ＣＲＦ1Ｒの作動性を介したＨＰＡ軸の活性化の骨格筋萎縮誘発効果を取り除くために使用した）の肩甲骨間領域に、１日に２度、ソーバジン又は対照ビヒクル（生理食塩水）を上記の用量で９日間皮下注射した。ソーバジンは、テオフィリン３０ｍｇ／ｋｇと併せて共投与した。９日目に、前脛骨筋、長指伸筋（ＥＤＬ）、ヒラメ筋、内側腓腹筋、及び足底筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を判定した。
図８は、マウス坐骨神経除去萎縮モデルにおいて、ソーバジンによる萎縮阻害が、野生型では観察されるが、ＣＲＦ2Ｒノックアウトマウスでは観察されないことを実証している。凡例：Ａ〜Ｃ−野生型マウス；Ｄ〜Ｆ−ＣＲＦ2Ｒノックアウトマウス。Ａ及びＤ−水（対照実験）；Ｂ及びＥ−ソーバジン（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）；Ｃ及びＦ−ソーバジン（１．０ｍｇ／ｋｇ／日）；＊−食塩水に比べてｐ≦０．０５。右坐骨神経の神経除去後、オスの野生型マウス及びＣＲＦ2Ｒノックアウトマウスに、アルゼット（Alzet）浸透性ミニポンプを使用した５μｌ／時間の連続注入によってソーバジン又は対照ビヒクルを上記の１日当りの送達用量で９日間投薬した。９日目に、前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を判定した。
図９は、肢をギプス固定したマウスの不使用萎縮モデルにおいて、ソーバジンが、ＥＤＬ及びヒラメ筋量の不使用誘発損失を阻害し（図９Ａ）、絶対力を測定することによって評価した筋機能の損失を阻害する（図９Ｂ）ことを実証している。凡例：Ａ−ギプス固定していない筋肉、対照実験；Ｂ−ギプス固定した筋肉、食塩水対照実験；Ｃ−ギプス固定した筋肉、ソーバジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋テオフィリン（３０ｍｇ／ｋｇ）；＊−食塩水に比べてｐ≦０．０５。右後肢のギプス固定後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、１日に２度、上記の用量でソーバジン又は対照ビヒクル（生理食塩水）のいずれかを１０日間皮下注射した。ソーバジンは、テオフィリン３０ｍｇ／ｋｇと共投与した。１０日目に、ＥＤＬ及びヒラメ筋を摘出し、絶対力及び筋量の測定値を取得して萎縮度を判定した。
ＩＩＩ．ＣＲＦＲ、ＣＲＦ、又はＣＲＦ類似体、あるいはＣＲＦＲを発現する細胞株の調製
ＣＲＦ1Ｒ、ＣＲＦ2Ｒ、ＣＲＦ、及びＣＲＦ類似体は、抗体の生成、本発明のスクリーニング・アッセイでにおける試薬としての使用、及び骨格筋萎縮の処置のための医薬品試薬としての使用を含めて、様々な使用に関して調製することができるが、これに限るものではない。本発明のある種の実施形態には精製ポリペプチドが最も有用であり、他の実施形態にはポリペプチドを発現する細胞株が最も有用であることが、当業者には明白である。例えば、ＣＲＦＲの構造的及び機能的特徴を保持することが重要な状況、例えばＣＲＦＲを活性化する候補化合物を同定するスクリーニング方法においては、機能的ＣＲＦＲを発現する細胞を使用することが望ましい。
ＣＲＦ及びＣＲＦ類似体が短鎖ポリペプチドであるので、これらのポリペプチドが、組換え手段によってではなく、当該技術分野において周知の技術を使用して直接合成によって最も好都合に得られることが当業者には認識される。加えて、これらの分子の多くが市販されている。
ＣＲＦＲ源がポリペプチドを発現する細胞株である場合、細胞は、例えば内生的にＣＲＦＲを発現してもよく、内生ＣＲＦＲの発現を増加させるように刺激してもよく、あるいはＣＲＦＲを発現するように遺伝子操作してもよい。細胞株が関心あるポリペプチドを発現するかどうか判定する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、適切な抗体によるポリペプチドの検出、タンパク質をコード化するｍＲＮＡを検出するためのＤＮＡプローブの使用（例えば、ノーザンブロット又はＰＣＲ技術）、あるいは関心あるポリペプチドに選択性のある薬剤の結合の測定（例えば、放射性同位体標識した選択的作動薬）がある。
ＣＲＦ1Ｒ、ＣＲＦ2Ｒ、又はこれらのポリペプチドを発現する細胞株の調製でＤＮＡ組換え技術を使用することが特に企図されている。このような組換え方法は、当該技術分野においては周知である。組換えＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒを発現するには、１つ以上の調節エレメントの制御下で関心あるポリペプチドをコード化する核酸を含む発現ベクターを調製する。いくつかの種からＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒをコード化するゲノム又はｃＤＮＡ配列については記載されており、遺伝子バンクデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で利用可能）又はダウエントデータベース（http://www.derwent.co.uk/geneseq/index.htmlで利用可能）から、ならびに本出願の配列表で容易に入手可能である。ＣＲＦ1Ｒ及びＣＲＦ2Ｒ配列に関する受入番号ならびに対応する配列識別番号は、表Ｉに示されている。この公的に利用可能な配列情報を使用する場合、ＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒをコード化する核酸分子を単離する手段の１つは、天然のＤＮＡプローブ、あるいは当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば適切なライブラリからの配列のＰＣＲ増幅によって人工的に合成したＤＮＡプローブによる、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリのスクリーニングである。その他の方法は、関心ある受容体に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、特定の組織（骨格筋など）から単離されたｍＲＮＡから直接的にｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することである。このように単離されたｍＲＮＡは、市販されている。また、既知のＣＲＦＲ受容体配列の一部分に一致する核酸プローブを使用することによって、既知の方法を使用して他の種から相同なｃＤＮＡ又はゲノム配列を得ることができることも、当業者には認識される。本発明の方法に特に有用であるのは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サル、チンパンジー、マーモセット、イヌ、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、ニワトリ、及びシチメンチョウを含めた種由来のＣＲＦＲ受容体であるが、これだけに限るものではない。当該技術分野において周知の方法によって、関心あるＣＲＦＲをコード化する単離核酸分子が好適な発現ベクターに連結される。このようにして調製される発現ベクターが宿主細胞中で発現し、受容体を発現する宿主細胞がスクリーニング・アッセイで直接使用され、あるいは、受容体を発現する宿主細胞から受容体が単離され、単離された受容体がスクリーニング・アッセイで使用される。
本発明の目的で使用できる宿主発現ベクター系としては：ＣＲＦＲヌクレオチド配列を含む、バクテリオファージ組換えＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はＤＮＡ発現コスミドベクターによって形質転換させた細菌（例えば、大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis））などの微生物；ＣＲＦＲヌクレオチド配列を含む、酵母発現組換えベクターによって形質転換させた酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピヒア（Pichia））；ＣＲＦＲヌクレオチド配列を含む、ウイルス（例えば、バキュロウイルス（baculovirus））発現組換えベクターで感染させた昆虫細胞系；ＣＲＦＲヌクレオチド配列を含む、ウイルス発現組換えベクター（例えば、カリフラワーモザイク・ウイルス、タバコモザイク・ウイルス）で感染させた、又はプラスミド発現組換えベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換させた植物細胞系；あるいは、やはりＣＲＦＲヌクレオチド配列を含む、哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルスＬＴＲ）を含有する組換え発現構造を有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３）が挙げられるが、これだけに限るものではない。
宿主細胞を使用して、関心のあるポリペプチドが産生される。ＣＲＦＲは膜結合分子であるので、宿主細胞膜から精製され、あるいは、ＣＲＦＲを細胞膜中に固定して使用される、すなわち細胞全体又は細胞の膜断片が使用される。このような発現系からのＣＲＦＲの精製又は濃縮は、当業者に周知の方法によって適切な洗剤又は脂質ミセルを使用して実施される。
細菌系では、多数の発現ベクターを発現する遺伝子産物に意図される用途に応じて有利に選択してよい。例えば、ＣＲＦＲに対する抗体の生成のためにこのようなタンパク質を大量に産生するときには、高レベルのタンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい。当業者は、融合タンパク質選択性カラム及び抗体カラムのような選択的精製技術、ならびに非選択的精製技術を含む様々な方法によって、このようなベクター構成を生成し、タンパク質を精製することができる。
昆虫タンパク質発現系では、バキュロウイルスＡ．カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、ヨトウガ（S．frugiperda）細胞内で異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。この場合、ＣＲＦＲヌクレオチド配列は、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーターの制御下に置かれる。次いで、組換えウイルスを使用して、挿入した遺伝子を発現させる細胞に感染させ、当業者に既知の多くの技術のうちの１つによってタンパク質を精製する。
哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を使用してよい。これらの発現系を使用するには、しばしば、挿入したヌクレオチド配列の効率的な翻訳のためにベクター中で特定の開始信号を形成する必要がある。これは、内生的な開始信号を含まないＣＲＦＲ遺伝子の一部分を使用する場合に、特に重要である。挿入したヌクレオチド配列のコード領域の枠内でのこの開始信号の配置、ならびに転写及び翻訳促進エレメントの添加、及び組換えタンパク質の精製は、当業者に既知の多くの方法の１つによって達成される。また、哺乳類宿主細胞では、組換えタンパク質に必須な翻訳後修飾ができる適切な細胞の種類を選択することも重要である。このような修飾、例えば、卵割、リン酸化、グリコシル化などには、修飾酵素を含有する適切な宿主細胞の選択が必要である。このような宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳなどが挙げられるが、これに限るものではなく、これらは当業者には既知である。
長期的には、組換えタンパク質の高い発現、安定な発現が好ましい。例えば、安定してＣＲＦＲを発現する細胞株を操作してもよい。当業者は、電気穿孔法、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクションなどの公知の方法にしたがって、安定してＣＲＦＲを発現する細胞株を生成することができる。これは、通例は適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写終止端配列、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位など）、選択的マーカ、及び関心ある遺伝子を含む発現ベクターを用いて、細胞をトランスフェクションすることによって実施される。選択可能マーカは、関心ある遺伝子とし同一ベクター内に含めるか、又はＣＲＦＲ配列含有ベクターと併せてトランスフェクションする別個のベクター上に含めてよい。発現ベクター中の選択可能マーカは、選択に対する耐性を与えることができ、細胞がベクターを安定的にその染色体に組み入れるようにし、細胞を成長させて増殖巣を形成させ、次にそれをクローニングして細胞株に拡張させることができる。あるいは、発現ベクターにより、マーカの物理的特質を用いて選択可能マーカを発現する細胞を選択してもよく、すなわち、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現により、蛍光活性細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を使用してマーカを発現する細胞を選択してもよい。
当業者は、関心ある遺伝子をうまく組み入れる細胞を選択できるようにするために、トランスフェクションに適した細胞の種類を選択することができる。例えば、選択可能マーカが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、又はアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの場合、適切な細胞の種類は、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−細胞になる。あるいは、選択可能マーカがそれぞれメトトレキサート、ミコフェノリン酸、Ｇ−４１８、又はハイグロマイシンに対する耐性を与える、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、又はｈｙｇｒｏの場合、正常な細胞を使用することができる。このような組換え細胞株は、ＣＲＦＲの活性に影響を及ぼす候補化合物の同定に有用である。
ＩＶ．ＣＲＦＲ抗体の調製
ＣＲＦＲの１つ以上のエピトープを選択的に認識する抗体も、本発明に包含される。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ発現ライブラリを用いて産生された分子、トランスジェニックマウスで産生されたヒト抗体（ポリクローナル又はモノクローナル抗体）、及び前述のいずれかの断片に結合するエピトープが挙げられる。治療的な使用の場合、キメラ抗体又はヒト抗体が好ましく、ヒト抗体が最も好ましい。
抗体は、試験化合物の評価、例えばＣＲＦＲポリペプチドの不動化のために、本明細書に記載する化合物スクリーニングスキームと併せて使用することができるか、あるいはこのような抗体を、例えばこのような遺伝子が導入された細胞内又は直接に患者の組織内のＣＲＦＲの発現を評価するために、遺伝子治療技術と組み合わせて使用することができる。さらに、本発明の抗体は、骨格筋萎縮の処置において有用である。ＣＲＦＲに選択的な抗体は、ＣＲＦＲ作動薬である抗体の部分集合を同定するために、本発明の方法によってスクリーニングすることができる。さらに、ＣＲＦ又はＣＲＦＲ類似体に特異的な抗体に対して生成される抗イディオタイプ抗体は、ＣＲＦＲ作動薬として有用な可能性があり、抗ＣＲＦＲ抗体と同様に本発明の方法によってＣＲＦＲを活性化する能力に関してスクリーニングすることができる。
抗体の産生では、当該技術分野において周知の方法によって、ＣＲＦＲ、ＣＲＦ又はＣＲＦ類似体、抗ＣＲＦ抗体、抗ＣＲＦ類似体抗体、又はこれらの免疫原性断片で注射することにより、様々な宿主動物を免疫化してよい。抗イディオタイプ抗体の調製では、免疫原は、抗ＣＲＦ抗体又は抗ＣＲＦ類似体抗体である。抗イディオタイプ抗体の生成については、例えば米国特許第４，６９９，８８０号に記載されており、これを参照により本明細書に組み込む。好適な宿主動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、及びウマが挙げられるが、これに限るものではない。免疫化技術は、当該技術分野において周知である。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から精製することができ、あるいは、モノクローナル抗体を当該技術分野において周知の方法によって生成することもできる。これらの技術には、クーラー（Kohler）及びミルスタイン（Milstein）の周知のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれるが、これだけに限るものではない。モノクローナル抗体は、κ又はλ軽鎖を含有する、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤを含め、いずれかの免疫グロブリンのクラスにすることができる。
ヒトでは非ヒト抗体の免疫原性があるので、ヒトの患者の治療的処置に使用するときには非ヒト抗体よりもキメラ抗体が好ましい。キメラ抗体の産生及び使用技術は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，８０７，７１５号；４，８１６，３９７号；４，８１６，５６７号；５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，６９３，７６１号；５，６９３，７６２号；６，１８０，３７０号；及び５，８２４，３０７号に記載されており、これらを参照により本明細書に組み込む。
完全ヒト抗体は、非ヒト抗体又はキメラ抗体よりも免疫原性が低いので、ヒト患者の治療的処置には特に望ましい。このような抗体は、内生免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子は実質的に発現できないが、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子は発現できるトランスジェニックマウスを使用して調製することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えばＣＲＦ2Ｒのすべて又は一部分によって通常の方式で免疫化される。抗原に対して指向性のあるモノクローナル抗体は、このような免疫化したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を使用して得られる。この技術は、米国特許第５，８７４，２９９号；５，８７７，３９７号；５，５６９，８２５号；５，６６１，０１６号；５，７７０，４２９号；６，０７５，１８１号に詳細に記載されており、すべて参照により本明細書に組み込む。ヒト免疫グロブリンをハイブリドーマ細胞の培養から直接得る代替案として、ハイブリドーマ細胞を、その後の発現又は遺伝子操作のための再配列重鎖及び軽鎖部位源として使用することができる。高レベルの適切なｍＲＮＡが利用可能であるので、このような抗体産生細胞からの遺伝子の単離は容易である。再生し、再配置した部位は、所望通りに操作することができる。例えば、一定領域をなくすか、又は異なるイソタイプのもので置き換えることができ、あるいは単鎖Ｆｖ領域をコード化するために様々な領域を連結させることができる。このような技術は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９６／３４０９６に記載されており、すべて参照により本明細書に組み込む。
Ｖ．試験化合物の選択
本発明のアッセイにしたがってスクリーニングできる化合物としては、植物又は動物抽出物のような天然産物、合成化学物質、タンパク質、ランダムペプチドライブラリのメンバ、Ｄ−又はＬ−型アミノ酸からなる順列組み合わせ的化学由来の分子ライブラリ、ホスホペプチドを含むが、これに限定されない（ランダム又は部分的に変性した指向性ホスホペプチドライブラリのメンバを含むが、これには限定されない）可溶性ペプチドのようなペプチド、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、抗イディオタイプ、又は短鎖抗体、及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂ発現ライブラリ断片ならびにこれらのエピトープ結合断片を含むが、これには限定されない）、有機及び無機分子を含む生物学的活性材料を含め、既知の化合物ライブラリを挙げられるが、これに限るものではない。
試験化合物の従来式の供給源に加え、コンピュータモデリング及びサーチ技術により、ＣＲＦＲのリガンド結合部位から、又は既に同定したＣＲＦＲ作動薬からの構造的な情報を用いることによって、試験化合物の合理的な選択が可能になる。試験化合物のこのような合理的選択により、治療用候補化合物を同定するためにスクリーニングしなければならない試験化合物の数を減らすことができる。ＣＲＦＲはＧＰＣＲであり、したがってＣＲＦＲタンパク質配列の知識が、潜在的リガンドのスクリーニングのために使用できる結合部位のモデル形成を可能にする。このプロセスは、当該技術分野において周知のいくつかの方式で達成することができる。簡潔にいえば、最も確固たる手法とは、テンプレート（バクテリオ・ロドプシン又はロドプシン結晶構造又は他のＧＰＣＲモデルから得られる）へのＣＲＦＲ配列の配列整合の形成、アミノ酸構造の変換、ならびに分子力学的及び視覚的検査によるモデルのリファイニングに関わるものである。強い配列整合を得られない場合、疎水性ヘリックスのモデル構築によってモデルを形成してもよい。次いで、既知のロドプシン構造の一般的なレイアウトから開始して他のものに相対的に各ヘリックスを回転させ翻訳することによって、これらを合わせて当てはめる。また、残基間の接触が示される突然変異型データを使用して、このような接触が達成されるように、ヘリックスを互いに対して相対的に位置決めしてもよい。またこのプロセス時には、既知のリガンドの、ヘリックス内の結合空洞部位内へのドッキングを使用して、リガンドの結合を安定化させる相互作用を発達させることによって、ヘリックスの位置決めに役立たせてもよい。モデルは、分子力学を使用した精査、ならびに標準的な相同性モデリング技術を用いた細胞内及び細胞外ループのループ構築によって完成することができる。ＧＰＣＲ構造及びモデリングに関する一般的な情報は、シェーンベルグ（Schoneberg）Ｔ．らの分子及び細胞内分泌学（Molecular and Cellular Endocrinology）、１５１：１８１〜１９３（１９９９）、フラワー（Flower）Ｄ．の生物化学及び生物理学公報（Biochimica et Biophysica Acta）、１４２２：２０７〜２３４（１９９９）、ならびにセクストン（Sexton）Ｐ．Ｍ．の薬物の発見と開発における最新の見解（Current Opinion in Drug Discovery and Development）、２（５）：４４０〜４４８（１９９９）に見出すことができる。
一旦モデルが完成したら、いくつかの既存のコンピュータプログラムの１つと併せて使用して、本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングすべき化合物の数を減らすことができる。これらの最も一般的なものは、ＤＯＣＫプログラム（ＵＣＳＦモルキュラー・デザイン・インスティテュート（UCSF Molecular Design Institute）（米国９４１４３−０４４６カリフォルニア州サンフランシスコ私書箱０４４６、Ｕ−６４、パルナサス・アヴェニュー５３３）である。その変異型のいくつかのものでは、立体的適合及び結合部位への大まかな静電補完のために、市販及び／又は専売化合物のデータベースをスクリーニングすることができる。十分にＤＯＣＫ内にスコアリングされる分子が、リガンドになりやすいことが高い頻度で見出されている。使用できるその他のプログラムは、ＦＬＥＸＸ（トライパス社（Tripos Inc.）、米国６３１４４−２９１３ミズーリ州セントルイス、サウス・ハンリー・ロード１６９９（www.tripos.com））である。このプログラムはかなり遅いので、通例は化合物のより小規模のデータベースを通す検索に制限されている。ＦＬＥＸＸ内のスコアリング・スキームは、より詳細であり、通例はＤＯＣＫよりも結合能力の優れた推測が得られる。ＦＬＥＸＸは、ＤＯＣＫの案を確認するために、又は既知のリガンド又はテンプレートから組み合わせて生成される化合物のライブラリを調査するために使用するのに最適である。
ＶＩ．骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定するためのスクリーニング・アッセイ
ＣＲＦ2Ｒが骨格筋萎縮を調節する役割を果たすことがわかったことで、骨格筋萎縮の予防的又は治療的処置に最終的に使用し得る候補化合物を同定するための１つ以上の試験化合物をスクリーニングする多様な方法が可能になる。本発明は、ＣＲＦ2Ｒに結合し、ＣＲＦ2Ｒを活性化し、作動薬によって誘発されるＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させ、あるいはＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ遺伝子の発現を増加させる能力に関して、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。
ＣＲＦ2Ｒ及びＣＲＦ1Ｒが相同タンパク質であるので、ある割合の、ＣＲＦ2Ｒに関する作動薬もまた、ＣＲＦ1Ｒの作動薬として機能することが予想される。前述のように、ＣＲＦ1Ｒの活性化は、ＨＰＡ軸の活性化、ならびに付随する副腎皮質ホルモンの産生を誘発する。筋量又は機能の増加が望ましいほとんどの場合に、ＨＰＡ軸を活性化することは望ましくない。したがって、ＣＲＦ2Ｒを活性化する能力に関する試験化合物のスクリーニングに加えて、本発明はまた、ＣＲＦ2Ｒの選択的作動薬に関してスクリーニングするためのＣＲＦ2Ｒ及びＣＲＦ1Ｒの使用も提供する。筋ジストロフィーとは関係のない、急性又は慢性の筋萎縮を処置するのに有用な候補化合物を選択するときには、候補化合物がＣＲＦ2Ｒに選択性があることが好ましい。好ましくは、候補化合物が、ＣＲＦ1Ｒに対してＣＲＦ2Ｒに１０倍の選択性を示し（すなわち、ＣＲＦ1Ｒに対するよりもＣＲＦ2Ｒに対する活性が１０倍大きい）、より好ましくは１００倍の選択性、最も好ましくは１０００倍以上の選択性を示す。公開されている研究で筋ジストロフィーの処置における副腎皮質ホルモン治療の利益が実証されているように、筋ジストロフィーを処置するために使用するときにはＣＲＦ2Ｒ作動薬がいくらかのレベルのＣＲＦ1Ｒ作動性を保持していることが有益な可能性がある。したがって、筋ジストロフィーの処置には、同様の濃度範囲にわたってＣＲＦ2ＲならびにＣＲＦ1Ｒを活性化する選択性の低い化合物が好ましい。好ましくは、候補化合物が、ＣＲＦ1Ｒに対してＣＲＦ2Ｒに１００倍の選択性があり、より好ましくは１０倍の選択性、最も好ましくはＣＲＦ1Ｒに対するＣＲＦ2Ｒへの選択性がない（すなわち、候補化合物の活性がＣＲＦ2Ｒ及びＣＲＦ1Ｒについてほぼ同様である）。またこの場合には、化合物が、ＣＲＦ2Ｒには完全作動薬であり、ＣＲＦ1Ｒには部分作動薬であることがより好ましい可能性がある。したがって、このような候補化合物には、最大コルチゾール上昇度及び筋萎縮に関する潜在性に元々備わっている限界があるが、ＣＲＦ2Ｒを通じて媒介される抗萎縮効果は、用量を増加することによって高めることができる。当業者は、当該技術分野において公知の方法を用いて、候補化合物がＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒの完全作動薬であるか又は部分作動薬であるか容易に判定することができる。
ヒトにおいてＣＲＦ2Ｒを通じて骨格筋量又は機能を調節するために最終的に使用される化合物をスクリーニングする場合、アミノ酸配列が配列識別番号１０と８０％より多く同一である、より好ましくは配列識別番号１０と９０％より多く同一であるＣＲＦ2Ｒを使用して、初期の生体外スクリーニングを実施することが好ましい。より好ましくは、試験化合物をヒト、マウス、又はラットのＣＲＦ2Ｒに対してスクリーニングするが、最も好ましくはヒトである。ヒト以外の種においてＣＲＦ2Ｒを通じて骨格筋量又は機能を調節するために最終的に使用される化合物をスクリーニングする場合、処置が企図される種由来のＣＲＦ2Ｒを使用することが好ましい。
試験化合物又は候補化合物がＣＲＦ1Ｒに対して有する活性レベルを判定して、選択性がある場合には候補化合物がＣＲＦ1Ｒに対してＣＲＦ2Ｒにどれほどの選択性を示すか判定するためにスクリーニングする場合、アミノ酸配列が配列識別番号２と８０％より多く同一である、より好ましくは配列識別番号２と９０％より多く同一であるＣＲＦ1Ｒを使用して、初期のスクリーニングを実施することが好ましい。より好ましくは、試験化合物をヒト、マウス、又はラットのＣＲＦ1Ｒに対してスクリーニングするが、最も好ましくはヒトである。ヒト以外の種において骨格筋量又は機能を調節するために最終的に使用される化合物をスクリーニングする場合、処置が企図される種由来のＣＲＦ1Ｒを使用することが好ましい。
本発明の方法は、高スループット用途にも耐えるが、この方法で試験化合物を１つだけ使用することは「スクリーニング」という用語に包含される。本発明の方法によって判定される、ＣＲＦ2Ｒに結合し、ＣＲＦ2Ｒを活性化し、作動薬によって誘発されるＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させ、あるいはＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、本明細書では「候補化合物」と呼ぶ。このような候補化合物は、骨格筋量又は機能を調節するために使用することができる。ただし、より典型的には、生体外スクリーニングのこの第１レベルは、化合物、すなわち追加的なレベルのスクリーニングでさらに調査するに値する候補化合物を、より狭い範囲で選択するための手段を提供するものである。本発明の使用が、１つ以上の試験化合物群からさらなる調査に値する化合物の部分集合を同定するためのものであることが、当業者には認識される。また、本発明のアッセイが、他の候補化合物に対する特定の候補化合物の予想される相対的な有用性をランク付けするのに有用であることも当業者には認識される。例えば、１０００ｎＭでＣＲＦ2Ｒを活性化する（ただし１０ｎＭでは活性化しない）候補化合物は、１０ｎＭでＣＲＦ2Ｒを活性化するものほど関心をもたれない。このような情報を使用して、当業者は、さらなる調査のために、スクリーニングの第１レベルで同定された候補化合物の部分集合を選択することができる。一例にすぎないが、２００ｎＭ未満の濃度でＣＲＦ2Ｒを活性化する化合物には骨格筋萎縮の動物モデルでさらに試験を実施でき、その閾値より高いものにはそれ以上の試験を実施しない。また、試験化合物群の選択方法ならびに陽性のものの選択方法に応じて、試験化合物のある割合だけが候補化合物として同定され、この割合が非常に小さいものであることも、当業者には認識される。
以下で説明するアッセイシステムは、ＣＲＦ2Ｒ、又はＣＲＦ2Ｒを発現する細胞を含むキットに形成してもよく、様々な容器、例えば、バイアル、チューブ、マイクロタイター・ウェルプレート、及びボトルなどの中に包装することができる。その他の試薬は、別個の容器に入れて、キット、例えば陽性対照試料、陰性対照試料、緩衝液、及び細胞培養媒質と共に提供することができる。
一実施形態では、本発明は、ＣＲＦ2Ｒに結合する候補化合物を同定するために、１つ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。受容体への化合物の結合を判定する方法は、当該技術分野において周知である。典型的には、このアッセイには、試験化合物を含む又は含まない環境で受容体に結合することがわかっている標識化合物によってＣＲＦ2Ｒ源をインキュベートする工程と、結合した標識化合物の量を判定する工程とが含まれる。ＣＲＦ2Ｒ源は、本明細書に記載のように、ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞、あるいは単離ＣＲＦ2Ｒの何らかの形態のいずれかでよい。標識化合物は、好ましくは定量的に測定できるように、ＣＲＦ又はいずれかのＣＲＦ類似体標識（例えば、125Ｉ標識、ユーロピウム標識、フルオレセイン標識、ＧＦＰ標識、35Ｓ−メチオニン標識）にすることができる。
このような標識技術は、当該技術分野においては周知である。ＣＲＦＲに結合する試験化合物は、受容体に結合する標識リガンドの量の減少を引き起こすので、対照試料（試験化合物を含まない）からのものに比べて信号レベルが低下する。この技術の変形形態が記載されており、これは、Ｇタンパク質非連結剤を含む又は含まない環境における受容体結合が、作動薬と拮抗薬とを区別できるものである（例えば、グアニンヌクレオチド類似体、すなわちＧｐｐｐＮＨｐを含む又は含まない環境における結合）。キーン（Keen）Ｍ．の受容体シグナルトランスダクションプロトコルにおける膜調製及び完全な状態の細胞のための放射性リガンド結合方法（Radioligand Binding Methods for Membrane Preparations and Intact cells in Receptor Signal Transduction Protocols）、Ｒ．Ａ．Ｊ．チャリス（Challis）（版）、ヒュマナ・プレス社（Humana Press Inc.）、ニュージャージー州トトウェイ（１９９７）を参照のこと。
ＣＲＦ1Ｒに比べてＣＲＦ2Ｒに特異的に結合する化合物を区別することが望ましいので、前述のアッセイはＣＲＦ2Ｒだけを発現する細胞又は細胞膜を使用して実施すべきであるか、あるいはアッセイをＣＲＦ2Ｒの組換え源を用いて実施することもできる。ＣＲＦＲの両方の形態を発現する細胞は、相同的組換えを用いてＣＲＦ1Ｒ遺伝子を不活性化あるいは無効化するように変性させてもよい。あるいは、ＣＲＦＲ源が２つ以上のＣＲＦＲ型を含有する場合、アッセイで得られる信号から、関心のない受容体から発生したバックグラウンド信号を差し引かなければならない。バックグラウンド応答は、アンチセンス、抗体、又は選択的拮抗薬を使用する、関心のないＣＲＦＲからの信号の排除を含め、多数の方法によって判定することができる。ＣＲＦＲの既知の拮抗薬には、アントアラルミン（antalarmin）（ＣＲＦ1Ｒ選択性）、抗ソーバジン（antisauvagine）−３０（ＣＲＦ2Ｒ選択性）、及びアストレッシン（astressin）（ＣＲＦ1Ｒ／ＣＲＦ2Ｒ選択性なし）が挙げられる。
他の実施形態では、本発明は、ＣＲＦ2Ｒ及び／又はＣＲＦ1Ｒを活性化する候補化合物を同定するために、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。典型的には、このアッセイは細胞ベースのものであるが、前述のように作動薬と拮抗薬とを区別できる細胞不使用アッセイも既知である。細胞ベースのアッセイには、ＣＲＦ1Ｒ又はＣＲＦ2Ｒを発現する細胞を試験化合物又は対照物に接触させる工程と、ＣＲＦＲシグナルトランスダクション経路の成分の発現又は活性を測定することによってＣＲＦＲの活性化を測定する工程とが含まれる。
背景の節で前述したように、ＣＲＦＲは、細胞の種類に応じて、Ｇαs、Ｇαq、又はＧαiを含むいくつかの異なる経路を通じて結合すると思われる。必要な経路成分が特定の種類の細胞に存在するのであれば、ＣＲＦＲの作動薬活性化により、受容体がこれらの経路のいずれかを介して信号を発することができると考えられる。したがって、ＣＲＦＲ活性に関してスクリーニングするには、処置に関係のある細胞タイプが生体内で異なる経路を介してＣＲＦＲを骨格筋萎縮に連結させる場合でも、アッセイでは、読出しとして、いずれのシグナルトランスダクション経路を使用することもできる。スクリーニング・アッセイが、受容体活性化を測定する経路とは無関係に有用なＣＲＦＲ作動薬を同定するのに有効であることが、当業者には認識される。このような信号伝達経路の活性化を測定するアッセイは、当該技術分野において既知である。
例えば、試験化合物に接触させた後で、細胞の溶解物を調製し、ｃＡＭＰの誘発について分析することができる。ｃＡＭＰは、Ｇαs活性化に応答して誘発される。ＧαsがＣＲＦＲ以外の受容体によって活性化され、試験化合物がＣＲＦＲを通じて又は他のメカニズムによってその効果を与え得るるので、２つの対照比較は、試験化合物がＣＲＦＲの活性化を介してｃＡＭＰのレベルを増加させるかどうかの判定に関係する。一方の対照実験は、試験化合物に接触させた細胞のｃＡＭＰレベルと、対照化合物（すなわち、試験化合物を溶解させたビヒクル）に接触させた細胞のｃＡＭＰレベルとを比較するものである。試験化合物が対照化合物に対して相対的にｃＡＭＰレベルを増加させる場合、これは、試験化合物が何らかのメカニズムによってｃＡＭＰを増加させることを示している。もう一方の対照実験は、ＣＲＦＲを発現する細胞株のｃＡＭＰレベルと、ＣＲＦＲを発現しないことを除いて本質的に同一の細胞株のｃＡＭＰレベルとを、両方の細胞株を試験化合物で処置して比較するものである。試験化合物が、ＣＲＦＲを発現しない細胞株に対して相対的に、ＣＲＦＲを発現する細胞株におけるｃＡＭＰレベルを高める場合、これは、試験化合物がＣＲＦＲの活性化を介してｃＡＭＰを高めることを示している。
本発明の特定の実施形態では、ｃＡＭＰの誘発は、ＣＲＦＲを発現する細胞に導入することのできる様々なレポーター遺伝子のいずれかに連結されたｃＡＭＰ応答性エレメントを含有するＤＮＡ構造によって測定される。このようなレポーター遺伝子には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、グルクロニドシンセターゼ、成長ホルモン、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、又はアルカリホスファターゼが挙げられるが、これだけに限るものではない。細胞を試験化合物に曝露させた後で、レポーター遺伝子発現レベルを定量化して、試験化合物がｃＡＭＰレベルを増加させる能力を判定し、したがって試験化合物がＣＲＦＲを活性化する能力を判定することができる。
このアッセイで有用な細胞は、活性化アッセイで使用される細胞が好ましくはＣＲＦ又は１つ以上のＣＲＦ類似体に統計的に有意に応答する機能的受容体を発現することを除き、前述のＣＲＦＲ結合アッセイに関するものと同一である。完全長のＣＲＦＲを発現する細胞の使用に加えて、レポーターエレメントに連結された、あるいはレポーターエレメントを含むように又は信号伝達タンパク質と相互作用するように物理的に修飾された、受容体のリガンド結合領域を含有するＣＲＦＲを発現する細胞を操作することができる。例えば、野生型ＣＲＦＲ又はＣＲＦＲ断片をＧタンパク質に融合させて、融合タンパク質のＣＲＦＲ部分に結合する作動薬で融合させたＧタンパク質の活性化を引き起こすことができる。（シーフェルト（Siefert）Ｒ．らの薬理科学の風潮（Trends Pharmacol.Sci.）、２０：３８３〜３８９（１９９９））またこの細胞は、例えばＣＲＥレポーター遺伝子の強い誘発を検出する、ＣＲＦ又はＣＲＦ類似体による誘導応答を最大限にするために、読出しに応じて好ましくは多数の特徴を有するべきであり；（ａ）低い自然レベルのｃＡＭＰ；（ｂ）ＣＲＦＲと相互作用できるＧタンパク質；（ｃ）高レベルのアデニリルシクラーゼ；（ｄ）高レベルのタンパク質キナーゼＡ；（ｅ）低レベルのホスホジエステラーゼ；及び（ｆ）高レベルのｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質が有利である。ＣＲＦ又はＣＲＦ類似体に対する応答性を高めるために、望ましい因子の発現量を多くするか、あるいは望ましくない因子の発現量を少なくするように、宿主細胞を操作することができる。さらに、基礎レベルを減少させるためにＣＲＥレポーターを誘発する代替的な経路を排除することができる。
場合によっては、作動薬への長期曝露後に、Ｇタンパク質連結受容体応答を鎮めるか、又は感度を低下させる。本発明の他の実施形態は、ＣＲＦ2Ｒ作動薬に応答して、作動薬によって誘発されるＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる化合物を同定する方法を提供する。このような化合物は、骨格筋萎縮を処置するために、例えばＣＲＦ2Ｒ作動薬と併せて使用することができる。典型的には、この方法は、次の工程をいずれかの順序で又は同時に含む細胞ベースのアッセイを使用する：（ｉ）細胞を試験化合物に接触させる工程；（ｉｉ）機能的ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞を、受容体を脱感作させるのに十分な作動薬の濃度及び作動薬と受容体との曝露の間に、ＣＲＦ2Ｒ作動薬によって処置する工程；それに続いて（ｉｉｉ）ＣＲＦ2Ｒの活性化レベルを判定する工程。これだけに限るものではないが、受容体リン酸化反応、受容体内在化又は分解、及びＣＲＦＲシグナルトランスダクション経路の下方調節を含む、受容体脱感作に寄与するいくつかのメカニズムがあることが当業者には認識される。当業者は、脱感作のどのメカニズムを標的にするかに応じて、細胞を試験化合物に接触させる適切な時間（すなわち、作動薬処置の前、処置時、又は処置後）を判定することができる。例えば、作動薬処置後に細胞を試験化合物に接触させると、受容体のリン酸化反応の結果として起こる受容体脱感作を阻止する試験化合物を検出することができる。
他の実施形態では、本発明は、ＣＲＦ2Ｒ遺伝子からの転写を調節する、又はＣＲＦ2Ｒの発現を調節する候補化合物を同定するために、１つ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＣＲＦＲ遺伝子の転写活性を調節する候補化合物は、ＣＲＦ2Ｒ調節領域（レポーター遺伝子構成）に動作可能に会合されたレポーター遺伝子を使用して同定してもよい。このような方法は、当該技術分野において既知である。このような方法の１つでは、細胞因子源が存在する環境でレポーター遺伝子構造を試験化合物に接触させ、レポーター遺伝子発現レベルを判定する。対照試料に比べて発現レベルの増加を引き起こす試験化合物が、ＣＲＦ2Ｒ遺伝子の転写を増加させる候補化合物の指標である。生体外又は生体内転写に必要な細胞因子を提供するには、通常ＣＲＦ2Ｒを発現するいずれかの種類の細胞から、適切な細胞又は細胞抽出物を調製する。
またＣＲＦ2Ｒ発現を調節する候補化合物は、細胞を試験化合物に接触させてＣＲＦＲの発現を判定する方法において同定することもできる。試験化合物が存在する環境でのＣＲＦ2Ｒの発現レベルを、試験化合物が存在しない環境での発現レベルと比較する。ＣＲＦ2Ｒの発現を増加させる試験化合物を、筋量又は筋機能を増加させる候補化合物として同定する。このような方法は、ＣＲＦ2Ｒの転写又は翻訳を増加させる、あるいはｍＲＮＡ又はＣＲＦ2Ｒタンパク質の安定性を高める候補化合物を検出する。
他の実施形態では、本発明は、ＣＲＦ又はＣＲＦ類似体の発現を調節する候補化合物を同定するために、１つ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイは、本質的に、後で修飾されるＣＲＦＲの発現を調節する候補化合物を同定するためのアッセイに関して前述したように実施される。ＣＲＦ遺伝子又はＣＲＦ類似体遺伝子からの転写を調節する候補化合物を同定するために、レポーター遺伝子は、関心あるＣＲＦ遺伝子又はＣＲＦ類似体遺伝子の調節領域に作用可能に結合しており、細胞因子源は、関心ある遺伝子を発現する細胞種由来にするべきである。
ＶＩＩ．骨格筋萎縮モデルを使用した候補化合物のスクリーニング
前述のように、生体外アッセイによって、１つ以上の試験化合物から選択される候補化合物を、骨格筋萎縮及び／又は肥大モデル系で骨格筋量又は機能を調節する能力についてさらに試験を実施することができる。このような骨格筋萎縮又は肥大モデルには、骨格筋萎縮の生体外細胞培養モデルと生体内動物モデルの両方が含まれる。このような追加的なレベルのスクリーニングは、追加的な調査、例えば候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用である。
（筋萎縮の細胞培養モデル）
骨格筋萎縮の生体外モデルは、当該技術分野において既知である。このようなモデルについては、例えば、バンデンブルフ（Vandenburgh）Ｈ．Ｈ．の生体外（In Vitro）２４：６０９〜６１９（１９８８）；バンデンブルフ（Vandenburgh）Ｈ．Ｈ．らの生体力学雑誌（J of Biomechanics）、２４Ｓｕｐｐｌ １：９１〜９９（１９９１）；バンデンブルフ（Vandenburgh）Ｈ．Ｈ．らの生体外細胞発展生物学（In Vitro Cell.Dev.Biol.）、２４（３）：１６６〜１７４（１９８８）；クロミアック（Chromiak）Ｊ．Ａ．らの生体外細胞発展生物学・動物学（In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.）、３４（９）：６９４〜７０３（１９９８）；シャンスキー（Shansky）Ｊ．らの生体外細胞発展生物学・動物学（In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.）、３３（９）：６５９〜６６１（１９９７）；ペロン（Perrone）Ｃ．Ｅ．らの生化学雑誌（J.Biol.Chem.）２７０（５）：２０９９〜２１０６（１９９５）；クロミアック（Chromiac）Ｊ．Ａ．及びバンデンブルフ（Vandenburgh）Ｈ．Ｈ．の細胞生理学雑誌（J.Cell.Physiol.）１５９（３）：４０７〜４１４（１９９４）；ならびにバンデンブルフ（Vandenburgh）Ｈ．Ｈ．及びカーリッシュ（Karlisch）Ｐ．の生体外細胞発展生物学（In Vitro Cell.Dev.Biol.）２５（７）：６０７〜６１６（１９８９）に記載されている。このようなモデルは、前述の生体外スクリーニングにしたがって動物モデルでの試験に値する候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用であるが、必ずしも必要ではない。細胞培養モデルを候補化合物によって処置し、処置に対するモデルの応答を、筋肉タンパク質合成又は分解、骨格筋量、又は収縮機能における変化など、筋肉マーカの変化を評価することによって測定する。筋肉マーカで有意な変化を誘発する化合物には、典型的には、骨格筋萎縮の動物モデルでさらにスクリーニングを実施する。
（骨格筋萎縮の動物モデル）
候補化合物をヒト以外の動物に投与し、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉又は筋線維断面積、収縮タンパク質含量、収縮タンパク質含量、非収縮タンパク質含量、あるいは骨格筋量又は機能変化と相関のある生化学又は遺伝子マーカのような、萎縮又は肥大のマーカの変化を評価することによって、動物の応答性を監視する。骨格筋肥大を誘発し、又は骨格筋萎縮のいかなる側面も防止する候補化合物は、ヒトの骨格筋萎縮を処置するための見込み治療用候補と見込むものとして考えるべきであり、本明細書では治療用候補化合物と呼ぶ。候補化合物が骨格筋萎縮を調節する能力の評価に加えて、毒性のような望ましくない副作用もまた、このようなスクリーニングで検出することができる。許容不可能な高レベルの副作用がないことを、治療用候補化合物の選択のためのさらなる基準として使用してよい。
当該技術分野においては骨格筋萎縮に関する様々な動物モデルが知られており、例えば、以下の参照に記載されているものがある：ハービソン（Herbison）Ｇ．Ｊ．らの物理療法医学リハビリ文書（Arch.Phys.Med.Rehabil.）６０：４０１〜４０４（１９７９）、アッペル（Appell）Ｈ−Ｊ．のスポーツ医学（Sports Medicine）１０：４２〜５８（１９９０）、ハッセルグレン（Hasselgren）Ｐ−Ｏ．及びフィッシャー（Fischer）Ｊ．Ｅ．の世界外科雑誌（World J.Surg.）２２：２０３〜２０８（１９９８）、アグベニーガ（Agbenyega）Ｅ．Ｔ．及びウェアハム（Wareham）Ａ．Ｃ．の計算機生化学・生理学（Comp.Biochem.Physiol.）１０２Ａ：１４１〜１４５（１９９２）、トマソン（Thomason）Ｄ．Ｂ．及びブース（Booth）Ｆ．Ｗ．の応用生理学雑誌（J.Appl.Physiol.）６８：１〜１２（１９９０）、フィッツ（Fitts）Ｒ．Ｈ．らの応用生理学雑誌（J.Appl.Physiol.）６０：１９４６〜１９５３（１９８６）、ブラマンティ（Bramanti）Ｐ．らの国際解剖発生学雑誌（Int.J.Anat.Embryol.）１０３：４５〜６４（１９９８）、カーティー（Cartee）Ｇ．Ｄ．のアメリカ老年学会生物科学医用科学雑誌（J.Gerontol.ABiol.Sci.Med.Sci.）５０：１３７〜１４１（１９９５）、コーク（Cork）Ｌ．Ｃ．らの発展臨床生物学研究（Prog.Clin.Biol.Res.）２２９：２４１〜２６９（１９８７）、ブース（Booth）Ｆ．Ｗ．及びゴールニック（Gollnick）Ｐ．Ｄ．の医用科学スポーツ運動（Med.Sci.Sports Exerc.）１５：４１５〜４２０（１９８３）、ブルームフィールド（Bloomfield）Ｓ．Ａ．の医用科学スポーツ運動学（Med.Sci.Sports Exerc.）２９：１９７〜２０６（１９９７）。これらのモデルに好ましい動物は、マウス及びラットである。これらのモデルには、例えば、ギプス固定又は不動化肢、後肢懸架、動物の完全不動化、及び低重力状況のような不使用誘発萎縮モデルが含まれる。神経損傷誘発萎縮モデルには、例えば、神経圧挫、特定の筋肉を刺激する神経部分の除去、神経への毒素適用、ならびにウイルス性、細菌性、又は真核生物感染性剤による神経感染が含まれる。糖質コルチコイド誘発萎縮モデルには、動物への外因性糖質コルチコイドの萎縮誘発用量の適用、例えば視床下−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸を活性化するホルモンの適用による、外因性副腎皮質ホルモン産生刺激が含まれる。敗血症誘発萎縮モデルには、例えば、細菌のような敗血症誘発有機体の接種、細菌細胞壁抽出物又は内毒素のような免疫活性化合物による動物の処置、ならびに腸壁の穿刺が含まれる。悪液質誘発萎縮モデルには、例えば、悪液質形成潜在性を有する腫瘍形成細胞による動物の接種、悪液質をまねく感染性剤（ＡＩＤＳを引き起こすウイルスなど）による動物の感染、悪液質を誘発するホルモン又はＣＮＴＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１などのサイトカインによる動物の処置が含まれる。心機能不全誘発萎縮モデルには、心機能不全が骨格筋萎縮を付随して発生するような動物の操作が含まれる。神経変性病誘発萎縮モデルには、ニューロンの構成成分による動物の免疫化で得られるもののような、自己免疫動物モデルが含まれる。筋ジストロフィー誘発萎縮モデルには、自然又は人工の遺伝的誘発筋ジストロフィーモデル、例えばＭｄｘマウスで発生するジストロフィン遺伝子の変異が含まれる。
骨格筋肥大の動物モデルには、例えば、対向肢の不活性化による肢筋肉使用増加モデル、不使用萎縮誘発事象後の再加重モデル、一時的神経損傷によって萎縮した筋肉の再使用モデル、協力筋の不活性化による選択的な筋肉使用増加（例えば相補的肥大）モデル、筋肉に置かれた高荷重による筋肉使用増加モデル、ならびに糖質コルチコイド誘発萎縮後の糖質コルチコイド除去に起因する肥大モデルが含まれる。好ましい動物萎縮モデルには、坐骨神経除去萎縮モデル、糖質コルチコイド誘発萎縮モデル、肢ギプス固定不使用萎縮モデルが含まれ、これらについては以下で詳細に説明する。
坐骨神経除去萎縮モデルは、例えばマウスにおいて、動物に麻酔し、及びその後に右又は左坐骨神経の小断片を外科的に除去するものであり、坐骨神経は大腿に沿ったほぼ中間点で単離し、３〜５ｍｍの断片を摘出する。この神経除去は、下位後肢筋肉組織で実施し、これらの筋肉の萎縮を生じさせる。典型的には、仮想的正常歩行のために、膝の満足な動きを提供するように、大腿二頭筋に対する神経支配は完全な状態で残される。典型的には、未処置動物では、神経除去１０日後に、神経除去した筋肉の筋量が３０〜５０％減少する。神経除去後、神経除去誘発骨格筋萎縮に対する効果を判定するために、試験化合物を、例えば注射によって、又は例えば浸透性ミニポンプ（例えば、アルゼット（Alzet）、カリフォルニア州パロアルト）の埋め込みを介した連続注入によって投与する。神経除去後の多様な時点で、動物を安楽死させ、神経除去した肢と神経除去していない肢の両方から下肢筋肉を迅速に解剖して、筋肉、洗浄した腱、及び結合組織の重量を測定する。例えば、筋肉量、筋肉断面積、筋線維断面積、又は収縮タンパク質含量を測定することによって、患部筋肉内の萎縮の程度を分析する。
糖質コルチコイド誘発萎縮モデルは、試験動物に糖質コルチコイドを投与するものであり、例えば飲用水中でデキサメタゾン１．２ｍｇ／ｋｇ／日を投与する。典型的には、未処置動物では、１０日間のデキサメタゾン投与後に骨格筋量が３０〜５０％減少する。糖質コルチコイド投与と同時に、又はその後に、糖質コルチコイド誘発骨格筋萎縮に対する効果を判定するために、例えば注射又は連続注入によって試験化合物を投与する。糖質コルチコイド投与後の多様な時点で、神経除去モデルに関して前述したように、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
肢ギプス固定不使用萎縮モデルは、動物の一方の後肢の膝から下の足部までをギプス固定するものである。典型的には、１０日間のギプス固定後に筋量が２０〜４０％減少する。ギプス固定後、肢ギプス固定誘発骨格筋萎縮に及ぼす効果を判定するために、試験化合物を、例えば注射によって、又は例えば浸透性ミニポンプ（例えば、アルゼット（Alzet）米国カリフォルニア州パロアルト）の埋め込みを介した連続注入によって投与する。肢ギプス固定後の多様な時点で、神経除去モデルに関して前述したように、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
ヒトで使用する化合物のスクリーニングでは、ヒトＣＲＦ2Ｒと他の動物種由来のＣＲＦ2Ｒとの間に相違があるので、ヒト以外のＣＲＦ2Ｒを用いてスクリーニングを実施したときに、いくつかの偽陽性又は陰性の結果が現れる可能性があることが当業者には認識される。したがって、初期の生体外スクリーニングを、ヒトＣＲＦ2Ｒを使用して実施することが好ましい。ある環境では、同定される候補化合物が、ヒト受容体にだけ活性があって、ヒト以外の受容体には活性がないことがある。このような環境では、これらの候補化合物がスクリーニングの第２レベルで骨格筋量又は機能を調節できるかどうか判定することがさらに望ましい場合がある。これらの候補物がヒト以外のＣＲＦ2Ｒを活性化しないので、ヒト以外の動物による標準生体内スクリーニングは勧められない。このような環境では、これらの候補物に関するスクリーニングの第２レベルは、ヒトＣＲＦＲを発現するトランスジェニック動物で実施してよい。
ＣＲＦＲトランスジェニック動物を作成するには、いずれの種の動物、とりわけ哺乳類を使用することができ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヤギ、イヌ、及びヒト以外の霊長類が挙げられるが、これだけに限るものではない。好ましくはマウス及びラットであり、マウスが最も好ましい。当該技術分野においては様々な技術が既知であり、トランスジェニック動物の創始株を形成するために、動物にヒトＣＲＦＲ導入遺伝子を導入するのに使用することができる。このような技術には、前核マイクロインジェクション、レトロウイルス媒介遺伝子の生殖細胞系への転移、胚幹細胞での遺伝子標的化、胚の電気穿孔法、及び精子媒介遺伝子転移が挙げられるが、これに限るものではない。
ＶＩＩＩ．骨格筋萎縮の処置のための遺伝子治療方法
ＣＲＦ2Ｒの全体的な活性は、適切な組織中でＣＲＦ2Ｒ（ＣＲＦ2Ｒの発現を増加させるために）又は構成的活性型ＣＲＦ2Ｒについて遺伝子を過剰発現させることによって増加させることができる。ＣＲＦレベルは、同様にＣＲＦ遺伝子を過剰発現させることによって生体内で増加させることができる。これらの遺伝子の過剰発現は、総細胞ＣＲＦ2Ｒ活性を高め、したがって骨格筋萎縮を調節する。関心ある１つ又はそれ以上の遺伝子を、被験体での発現に好適なベクターに挿入する。これらのベクターには、ＤＮＡを細胞内に導入する他の粒子（例えば、リポソーム、金粒子など）、又は関心ある遺伝子を含有するＤＮＡ発現ベクターのヒト組織（例えば筋肉）への直接注射に加えて、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルス及びヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これだけに限るものではない。
ＩＸ．医薬品の配合及び使用方法
本明細書に記載するスクリーニング方法によって同定される候補化合物又は治療用候補化合物は、骨格筋萎縮を処置するために、あるいは骨格筋肥大を誘発させるために、個体に投与することができる。このために、本発明は、手術、ベッド休養、骨折による不使用；神経除去／脊髄損傷による神経損傷；自己免疫疾患；感染病；無関係条件での糖質コルチコイド使用；感染症又は他の原因による敗血症；病気又は飢餓による栄養制限；癌性悪液質；慢性炎症；ＡＩＤＳ性悪液質；ＣＯＰＤ；うっ血性心不全；サルコペニア及び遺伝病；例えば、筋ジストロフィー、神経変性病によって誘発される骨格筋萎縮を含むが、これに限るものではない、骨格筋萎縮を変調させるための方法及び組成物を包含する。ＣＲＦ2Ｒの作動薬は、骨格筋萎縮を阻害するために使用することができる。有効な化合物が必ずしもＣＲＦＲに絶対的特異性を示す必要はない。他の病変受容体の特異的拮抗薬を、有効であるが特異性のない作動薬と併せて共投与できることも企図されている。あるいは、単独投薬又は投薬計画の調節によって、この特異性の欠如に対処してもよい。
本発明のスクリーニング方法によって同定される候補化合物又は治療用候補化合物は、ＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる化合物と組み合わせて投与してもよい。これらは、既知の化合物、例えばテオフィリンにしてもよく、あるいは本発明のスクリーニング方法によって、これらの化合物がＣＲＦ2Ｒ受容体又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させることを同定してもよい。
（用量の判定）
ＣＲＦＲに害を与える化合物の安全性及び治療的有効性は、生体外又は生体内技術を用いる標準的な手順によって判定することができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましいが、副作用のレベルが許容可能であれば、治療指数の低い化合物も有用である。生体外及び生体内の毒性学的及び薬理学的技術から得られるデータを使用して、有用な可能性のあるヒトの用量範囲を配合することができる。好ましい用量は、化合物の循環濃度が許容可能な安全性を備えて治療的に最大限になる範囲内にある。化合物の循環濃度は、投薬形態、投薬後の時間、投与経路などに応じて変更してよい。副作用が許容可能であれば、この範囲から外れる用量も有用である。患者の年齢や体重などの事項を使用して、従来の方式でこのような事項を判定することができる。薬理遺伝学的手法が、臨床群における化合物の選択、用量、及び投薬計画の最適化に有用な可能性がある。
（配合及び使用）
本発明による骨格筋萎縮の調節で使用するための医薬品組成物は、薬学的に許容可能な担体及び賦形剤を使用し、従来の方法を用いて配合することができる。本発明の組成物は、単位剤形で提供することが好ましい。本明細書で使用するとき、「単位剤形」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト被験体への投与に好適な、優良医療基準による１回用量のＣＲＦ2Ｒ作動薬の量を含有する本発明の組成物である。医薬品組成物は、例えば、経鼻投与、経皮投与、吸入投与、非経口投与、皮膚投与、経口投与、又は直腸投与による送達のために配合してよい。経口投与の場合、医薬品組成物は、薬理学的に活性な化合物、ならびに結合剤、充填剤、潤沢剤、崩壊剤、又は湿潤剤を含むが、これに限定されない添加物を含有する錠剤又はカプセル剤形にしてもよい。錠剤は、コーティングしてよい。経口投与のための液体製剤には、薬理学的に活性な化合物、ならびに、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル、防腐剤、緩衝塩、香料、着色剤、甘味剤などを含むが、これに限定されない添加物を含有する、シロップ、懸濁液、又は使用前に液体で再構成する乾燥製品が含まれるが、これだけに限るものではない。経口投与用の医薬品組成物は、口、胃、又は腸管における薬理学的活性化合物の放出を制御するように配合してよい。
吸入投与の場合、本発明にしたがって使用するための化合物は、以下の剤形：液体、粉末、ゲル、又は、事前測定又は非事前測定用量の加圧又は非加圧噴射剤を利用するエアロゾル噴霧の形態などによって送達させてよいが、これに限るものではない。薬理学的に活性な化合物は、適切な充填剤、ビヒクル、防腐剤、緩衝剤などと併せて配合してよい。非経口投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと共に配合でき、ボーラス注射又は注入のための懸濁液、溶液、エマルション、すぐに構成可能な粉末として調製することができる。これらの化合物の投薬は、皮下注射針、高圧用具などを含む様々な技術によって投与してよい。直腸投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、座剤、浣腸などとして送達させるため、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと併せて配合することができる。皮膚投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、ローション、皮膚軟化剤などを含めた許容可能な生理学的担体と併せて配合してよく、あるいはパッチタイプの用具に組み込んでもよい。長期的な投与の場合、薬理学的に活性な化合物、ならびにポリマー、疎水性材料、樹脂などに限定されないが、適切な添加物は、筋肉内又は皮下の位置を含めて、これに限定されないが、多数の部位に注射又は埋め込むための持続性製剤として配合することができる。さらに、薬理学的に活性な化合物を分配用具によって投与してもよい。
（治験時の効果の監視）
ＣＲＦ2Ｒの発現又は活性に対する化合物（例えば薬物）の影響の監視は、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、治験においても実施することができる。例えば、スクリーニング・アッセイによってＣＲＦ2Ｒ受容体活性活性又はＣＲＦ2Ｒ受容体発現を増加させると判定された化合物の効果については、骨格筋萎縮の患者又は骨格筋萎縮の危険性のある患者の治験において評価することができる。試験化合物又は擬薬投与後の多様な時点で、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉破壊の生化学的マーカ、又は生活水準指標の変化を観察することによって、患者に対する化合物の効果を判定することができる。ヒト被験体で骨格筋量を測定する方法は、当該技術分野においては既知であり、例えば、手足の周囲の測定；例えばコンピュータ・断層撮影法、ＭＲＩ、又は超音波による筋肉の厚さの測定；あるいは、形態学的・生化学的パラメータ（例えば、線維面積の断面積、線維直径、又は酵素活性）を検査するための筋肉生検などが挙げられる。さらに、骨格筋量が骨格筋機能と相関があるので、筋機能は、筋量の代替的なマーカとして使用でき、筋量は、機能的測定、例えば、強度、協力筋群の力、又は筋電計記録で見られる収縮特徴を使用して評価することができる。加えて、筋萎縮の結果生じる筋肉タンパク質喪失は、被験体の尿又は血液中のアミノ酸又はアミノ酸誘導体、すなわち３−メチルヒスチジンのレベルの定量化によって測定することができる。このような方法の概観については、アッペル（Appell）のスポーツ医学（Sports Med．）１０：４２−５８（１９９０）を参照のこと。生活水準指標としては、椅子からの立ち上がりの容易さ、疲労前の歩数、又は階段昇降能力が挙げられるが、これだけに限るものではない。
（実施例１）
（ヒトＣＲＦ2Ｒ受容体の発現のためのベクターの構築）
ヒトＣＲＦ2Ｒ（ｈＣＲＦ2Ｒ）ＤＮＡ配列（受入番号Ｅ１２７５２）を取り出し、１つが開始コドンで開始する遺伝子の５’端を含み（５’オリゴヌクレオチド）、１つが停止コドンを含有する遺伝子の３’端を含む（３’オリゴヌクレオチド）、２つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、５’オリゴヌクレオチド内に１つのユニーク部位を有し、３’オリゴヌクレオチドに異なる制限エンドヌクレアーゼのユニーク部位を有する、ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計される。さらに、３’オリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化添加信号配列を含有する。ヒト骨格筋由来の二重鎖ｃＤＮＡは、ユニバーサル・クイック・クローン・ｃＤＮＡコレクション（Universal QUICK−Clone cDNA collection）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）から購入される。前述の５’及び３’オリゴヌクレオチドを使用して、ｈＣＲＦ2Ｒ ｃＤＮＡが、アドバンタックＰＣＲキット（AdvanTaq PCR kit）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を使用したヒト骨格筋ｃＤＮＡのＰＣＲによって増幅される。ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲアーチファクトから精製され、ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子ＤＮＡ断片は、ヌクレオトラップ（NucleoTrap）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）などの精製製品を使用してアガロースゲルから精製される。
ｐＩＲＥＳｎｅｏベクター（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）へのｈＣＲＦ2Ｒ ＰＣＲ産物のクローニングは、５’及び３’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにｈＣＲＦ2Ｒ ＰＣＲ産物とｐＩＲＥＳｎｅｏベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼによって切断することによって達成される。製造業者の推奨にしたがって、アドバンテージ（AdvantAge）（商標）ＰＣＲクローニング・キット（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）から、ＤＮＡリガーゼを使用して、ｐＩＲＥＳｎｅｏベクターＤＮＡをｈＣＲＦ2Ｒ ＰＣＲ産物ＤＮＡにライゲーションする。次いで、ライゲーションしたベクター及び挿入構成（ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ2Ｒ）を使用して、ＴＯＰ１０Ｆ’を適格大腸菌（E.coli）細胞（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）に形質転換させる。形質転換させた細胞を、寒天を含むＬＢ／Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧ及びアンピシリン上に置く。白色コロニー（陽性クローン）を選択し、ＬＢ培地で個々に培養する。ヌクレオボンドＤＮＡ精製システム（NucleoBond DNA Purification System）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を使用して、プラスミドＤＮＡを単離する。少なくとも１つのクローンからの挿入を配列させて、ｈＣＲＦ2Ｒ配列が確実に正しくなるようにする。安定な統合型マーキュリーＣＲＥ−ＬＵＣプラスミド（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を含むＨＥＫ２９３細胞を、カルフォス（CalPhos）（商標）哺乳類トランスフェクションキット（Mammalian Transfection Kit）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、正しい配列挿入を有する精製ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ2Ｒ ＤＮＡによってトランスフェクションする。ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ2Ｒ ＤＮＡによって安定にトランスフェクションした細胞を、Ｇ４１８中での細胞培養によって選択する。安定にトランスフェクションした細胞（ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ2Ｒ細胞）を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で、１０％ウシ胎児血清（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）、Ｌ−グルタミン（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）、非必須アミノ酸（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）を含むＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）中で増殖させる。クローンは、実施例２及び実施例３に記載するように、ＣＲＦへの暴露後にＣＲＦ結合及びＣＲＥ−ＬＵＣ活性化に関して特徴化する。次いで、適切なレベルでｈＣＲＦ2Ｒ受容体を発現し、ＣＲＥ−ＬＵＣレポーター系に適切に連結される細胞を、さらなる分析で用いる。
（実施例２）
（受容体結合アッセイ）
化合物の受容体結合分析は、実施例１のＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ2Ｒ細胞を９６ウェル・ポリリシンコーティングプレートで平板培養することによって細胞全体に実施する。細胞を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭ培地に播種し、一晩インキュベートする。培養培地を取り除き、ＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）中のユーロピウム（Ｅｕ−ＣＲＦ）＋１０％シーブロック（Seablock）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）で共有結合的に標識した適切な量のＣＲＦを添加する。細胞をＥｕ−ＣＲＦと共に室温で９０分インキュベートし、次いでマグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝液（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）で４回洗浄する。最後の洗浄の後、強化溶液（ワラック社（Wallac Inc.）メリーランド州ゲイサーズバーグ）を添加し、バイオワークス・ユーロピウム・プログラム（BioWorks Europium program）を使用してワラック・プレート・リーダ（Wallac plate reader）（ワラック社（Wallac Inc.）メリーランド州ゲイサーズバーグ）でプレートを読み取る。飽和結合分析の場合、１０（−１２）〜１０（−３）Ｍの範囲のＥｕ−ＣＲＦのｌｏｇ用量を細胞に添加し、非特異的結合の評価のために、非標識ＣＲＦの飽和濃度を含まない環境と含む環境の両方で結合を分析する。競合的結合の場合、関心ある化合物の濃度の変更に加えて、結合の間に最大値の半分であるＥｕ−ＣＲＦ濃度を添加する。
（実施例３）
（受容体活性化アッセイ）
受容体活性化分析は、実施例１のＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ2Ｒ細胞をパッカード・ビュー・プレート（Packard View Plate）−９６（パッカード社（Packard Inc.）カリフォルニア州）に播種して実施する。細胞を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭ培地に播種し、一晩インキュベートする。次いで培地を取り除き、関心ある化合物を含有する、０．０１％ウシアルブミン断片Ｖ（シグマ（SIGMA）ミズーリ州セントルイス）を含むＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）で置き換える。次いで、細胞を３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で４時間インキュベートし、その後培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩水溶液（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）で細胞を２回洗浄する。次いで、溶解試薬（Lysis Reagent）（プロメガ社（Promega Inc.）ウィスコンシン州マジソン）を洗浄した細胞に加え、細胞を３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で２０分間インキュベートする。次いで、細胞を−８０℃に２０分間置き、その後３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で２０分間インキュベートする。このインキュベーションの後、ルシフェラーゼ分析緩衝液及びルシフェラーゼ分析基質（プロメガ社（Promega Inc.）ウィスコンシン州マジソン）を細胞溶解物に加え、照度計を使用してルシフェラーゼ活性を定量化する。化合物暴露後の増加を、化合物暴露後の、ｈＣＲＦ2ＲなしでＣＲＥ−ＬＵＣ構成を含有するＨＥＫ細胞中のルシフェラーゼのレベルと比較することによって、化合物の相対的な活性を評価する。１０倍超過のｈＣＲＦ2Ｒ拮抗薬を含む環境及び含まない環境で、ｈＣＲＦ2Ｒ／ＣＲＥ−ＬＵＣ ＨＥＫ細胞の化合物へのルシフェラーゼ応答を評価することによって、応答の特異性についても確認する。
（実施例４）
（ＣＲＦ2Ｒ及び／又はＣＲＦ2受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる候補化合物を同定するためのスクリーニング）
作動薬によって誘発されるＣＲＦ2Ｒ又はＣＲＦ2Ｒシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる化合物の同定は、実施例３で説明した受容体活性化アッセイの変形形態に関する。具体的には、このアッセイは、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ2Ｒ受容体細胞をパッカード・ビュー・プレート（Packard View Plate）−９６（パッカード社（Packard Inc.）カリフォルニア州）に播種することによって実施する。細胞を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、及びＣＲＦの飽和量を含むＤＭＥＭ培地に播種し、４８時間インキュベートする。次いで、培地を取り除き、関心ある化合物に加えて０．０１％ウシアルブミン断片Ｖ（シグマ（SIGMA）ミズーリ州セントルイス）及びＣＲＦを含むＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）で置き換える。次いで、細胞を３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で４時間インキュベートし、その後培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩水溶液（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）で細胞を２回洗浄する。次いで、溶解試薬（Lysis Reagent）（プロメガ社（Promega Inc.）ウィスコンシン州マジソン）を洗浄した細胞に加え、細胞を３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で２０分間インキュベートする。次いで、細胞を−８０℃に２０分間置き、その後３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で２０分間インキュベートする。このインキュベーション後、ルシフェラーゼ分析緩衝液及びルシフェラーゼ分析基質（プロメガ社（Promega Inc.）ウィスコンシン州マジソン）を細胞溶解物に加え、照度計を使用してルシフェラーゼ活性を定量化する。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光発色を刺激する試験化合物を、骨格筋量又は機能を調節する候補化合物とする。最も関心のある化合物は、相対的に高レベルの蛍光を誘発するものである。
（実施例５）
（ＣＲＦ2Ｒに特異的な候補化合物を同定するためのスクリーニング）
ＣＲＦ2Ｒを活性化する化合物を実施例３のように同定する。ＣＲＦ1ＲよりもＣＲＦ2Ｒに選択性を示す化合物を選択するために、これらの化合物もＣＲＦ1Ｒに対してスクリーニングする。ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ1Ｒ細胞は、初期のＰＣＲ増幅にヒトＣＲＦ1Ｒ（ｈＣＲＦ1Ｒ）ＤＮＡ配列、受入番号Ｘ７２３０４が使用されることを除き、本質的には実施例１に記載したように生成される。ＣＲＦ1Ｒに対する化合物の活性がどの程度であるか判定するには、プレートに播種するのにＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ1Ｒ細胞が使用されることを除き、本質的に実施例３に記載したように活性化アッセイを実施する。ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞中の化合物によって刺激される蛍光の量を、ＣＲＦ1Ｒを発現する細胞中の化合物によって刺激される蛍光の量と比較する。次いで、ＣＲＦ1Ｒを発現する細胞よりも、ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞に１０倍高い応答性（モル数を基準にして）を示す化合物を、クローンのばらつきによる差異をなくすために応答性の特異性にについてさらに調査する。ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＣＲＦ2Ｒ細胞に、１０倍を超過するＣＲＦ2Ｒ拮抗薬である抗ソーバジン−３０の存在する環境又は存在しない環境で、化合物によってアッセイを実施する。ＣＲＦ2Ｒに１０倍より高い選択性を示し、その活性が抗ソーバジン−３０によって阻害される化合物を候補化合物として選択する。
（実施例６）
（ｈＣＲＦ2Ｒの発現を増加させる候補化合物を同定するためのスクリーニング）
適切な組織中のｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子の生理的発現に必要なすべての調節エレメントを含むように、転写開始部位の十分に上流で開始するｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子のプロモーター領域を含有する配列をヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方がプロモーター領域の５’端を含有し（５’オリゴヌクレオチド）、他方が転写開始部位を含むプロモーター領域の３’端を含有する（３’オリゴヌクレオチド）、２つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、５’オリゴヌクレオチド内に１つのユニーク部位を有し、３’オリゴヌクレオチド内に異なる制限エンドヌクレアーゼのユニーク部位を有する、ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。５’及び３’オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲキットである、アドバンテージ（Advantage）（登録商標）ゲノムＰＣＲキット（Genomic PCR kit）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を使用してヒトＤＮＡ由来のｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）のＰＣＲ増幅のために使用する。ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲから精製され、ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域ＤＮＡ断片は、ヌクレオトラップ（NucleoTrap）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）などの精製製品を使用してアガロースゲルから精製される。ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域ＰＣＲ産物のｐＥＣＦＰ−１ベクター（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）へのクローニングは、５’及び３’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備が完了するように、ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域ＰＣＲ産物及びｐＥＣＦＰ−１ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼによって初めに切断することによって達成される。ｐＥＣＦＰ−１ベクターＤＮＡのｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域ＰＣＲ産物ＤＮＡへのライゲーションは、製造業者の推奨にしたがって、アドバンテージ（AdvantAge）（商標）ＰＣＲクローニング・キット（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）からのＤＮＡリガーゼを使用して達成される。次いで、ライゲーションしたベクター及び挿入構成を使用して、ＴＯＰ１０Ｆ’を適格大腸菌（E.coli）細胞（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）に形質転換させる。細胞をＬＢ及びカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにカナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有ＬＢ培地で培養し、ヌクレオボンドＤＮＡ精製システム（NucleoBond DNA Purification System）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、ｈＶＰＡＣ2遺伝子調節領域を含有する構成をＤＮＡ配列法によって分析して、構成の正確性及び一体性を確実にする。次いで、ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域を含有する精製された構成プラスミドＤＮＡを、カルフォス（CalPhos）（商標）哺乳類トランスフェクションキット（Mammalian Transfection Kit）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を用い、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを使用して、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、Ｇ４１８を用いて選択し、単離して、３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で、１０％ウシ胎児血清（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）、Ｌ−グルタミン（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）、非必須アミノ酸（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）、及びＧ４１８（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）を含むＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）中で増殖させる。Ｇ４１８耐性クローンは、それがｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子プロモーター配列を確実に含有するように、サザン・ブロッティング（Southern blotting）によって特徴化し、さらにｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域の活性化を適切な刺激剤を用いて分析する。次いで、適切なレベルでｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域−ＥＣＦＰを発現する細胞を、以下のようにｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子調節領域−ＥＣＦＰ含有ＨＥＫ２９３細胞を、適切な密度で、黒・透明底９６ウェル・マイクロタイタープレートに播種し、一晩成長させることによって実施する。翌日、培地を取り除き、試験化合物を新しい成長培地に加える。細胞を、３７℃で５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で１６時間インキュベートし、その後蛍光を測定する（蛍光光度計（バイオルミン（biolumin）（商標）９６０、モルキュラー・ダイナミクス／アマーシャム・ファーマシア・バイオテック（Molecular Dynamics／Amersham Pharmacia Biotech）ニュージャージー州ピスカタウェイ）使用、検出放射４７５（５０１）ｎｍによる励起４３３（４５３）ｎｍ）。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光発色を刺激する試験化合物を、骨格筋量又は機能を調節する候補化合物とする。最も関心のある化合物は、相対的に高レベルの蛍光を誘発するものである。
（実施例７）
（ヒトＣＲＦ発現を増加させる化合物を同定するためのスクリーニング）
ヒトＣＲＦ（ｈＣＲＦ）発現を増加させる化合物を同定するための方法は、調節領域がｈＣＲＦ遺伝子のために使用されるものであることを除き、本質的にはｈＶＰＡＣ2受容体の発現を増加させる化合物を同定するための方法と同一である。適切な組織中のｈＣＲＦ遺伝子の生理学的発現に必要なすべての調節エレメントを含むように、転写開始部位の十分に上流で開始するｈＣＲＦ遺伝子の調節領域を含有する配列をヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方が調節領域の５’端を含有し（５’オリゴヌクレオチド）、他方が転写開始部位を含む調節領域の３’端を含有する（３’オリゴヌクレオチド）、２つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドはまた、５’オリゴヌクレオチド内に１つのユニーク部位を有し、３’オリゴヌクレオチド内に異なる制限エンドヌクレアーゼユニーク部位を有する、ｈＣＲＦ遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。５’及び３’オリゴヌクレオチドは、アドバンテージ（Advantage）（登録商標）ゲノムＰＣＲキットを使用して（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）ヒトＤＮＡ由来のｈＣＲＦ遺伝子調節領域（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）のＰＣＲ増幅のために使用される。ｈＣＲＦ遺伝子調節領域ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲアーチファクトから精製され、ｈＣＲＦ遺伝子調節領域ＤＮＡ断片は、精製製品であるヌクレオトラップ（NucleoTrap）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を使用してアガロースゲルから精製される。ｈＣＲＦ遺伝子調節領域ＰＣＲ産物のｐＥＣＦＰ−１ベクター（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）へのクローニングは、５’及び３’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備が完了するように、ｈＣＲＦ遺伝子調節領域ＰＣＲ産物及びｐＥＣＦＰ−１ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼによって初めに切断することによって達成される。 ｐＥＣＦＰ−１ベクターＤＮＡのｈＣＲＦ遺伝子調節領域ＰＣＲ産物ＤＮＡへのライゲーションは、製造業者の推奨にしたがって、アドバンテージ（AdvantAge）（商標）ＰＣＲクローニング・キット（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）からのＤＮＡリガーゼを使用して達成される。次いで、ライゲーションしたベクター及び挿入構成を使用して、ＴＯＰ１０Ｆ’を適格大腸菌（E.coli）細胞（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）に形質転換させる。細胞をＬＢ及びカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにカナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有ＬＢ培地で培養し、ヌクレオボンドＤＮＡ精製システム（NucleoBond DNA Purification System）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を使用してプラスミドＤＮＡを単離し、ｈＣＲＦ遺伝子調節領域を含有する構成をＤＮＡ配列法によって分析して、構成の正確性及び一体性を確実にする。次いで、ｈＣＲＦ遺伝子調節領域を含有する精製された構成プラスミドＤＮＡを、カルフォス（CalPhos）（商標）哺乳類トランスフェクションキット（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を用いるリン酸カルシウム媒介トランスフェクションを使用して、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、Ｇ４１８を使用して選択し、単離して、３７℃の５％二酸化炭素／９５％周囲空気中で、１０％ウシ胎児血清（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）、Ｌ−グルタミン（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）、非必須アミノ酸（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）、及びＧ４１８（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）を含むＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）メリーランド州ロックビル）中で増殖させる。Ｇ４１８耐性クローンは、それがｈＣＲＦ遺伝子調節領域配列を確実に含有するように、サザン・ブロッティング（Southern blotting）によって特徴化し、さらに、適切な刺激剤を使用してｈＣＲＦ遺伝子調節領域の活性化を分析する。次いで、適切なレベルでｈＣＲＦ遺伝子調節領域−ＥＣＦＰを発現する細胞を、以下のように、ｈＣＲＦ遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、ｈＣＲＦ遺伝子調節領域構成を含有するクローンを使用することを除いて実施例５と同様に実施する。
（実施例８）
（ｈＣＲＦ2Ｒを活性化するヒト抗体の製造方法）
ｈＣＲＦ2Ｒを活性化する完全なヒトモノクローナル抗体は、以下のように最初に組換えｈＣＲＦ2Ｒタンパク質を形成することによって製造する。実施例１からの手順を続けて、ｈＣＲＦ2Ｒ ＰＣＲ産物を得る。次いで、このｈＣＲＦ2Ｒ ＰＣＲ産物を、５’及び３’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように初めにｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子ＰＣＲ産物及びｐＨＡＴ２０ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼによって切断することによって、ｐＨＡＴ２０ベクター（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）にクローニングする。ｐＨＡＴ２０ベクターＤＮＡのｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子ＰＣＲ産物ＤＮＡへのライゲーションは、製造業者の推奨にしたがって、アドバンテージ（AdvantAge）（商標）ＰＣＲクローニング・キット（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）からのＤＮＡリガーゼを使用して達成される。次いで、ライゲーションしたベクター／挿入構成を使用して、ＴＯＰ１０Ｆ’を適格大腸菌（E.coli）細胞（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）に形質転換させる。形質転換させた細胞をＬＢ及びアンピシリン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにアンピシリン耐性コロニーを選択する。陽性のクローンをアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ヌクレオボンドＤＮＡ精製システム（NucleoBond DNA Purification System）（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を使用してプラスミドＤＮＡを単離し、ｈＣＲＦ2Ｒ遺伝子を含有する構成をＤＮＡ配列法によって分析して、構成の正確性及び一体性を確実にする。次いで、ｈＣＲＦ2Ｒ−ｐＨＡＴ２０ベクターＤＮＡを、ＨＡＴ配列の開始部とｈＣＲＦ2Ｒ−ｐＨＡＴ２０構成には存在しない制限エンドヌクレアーゼ単一部位を含む５’オリゴヌクレオチド、ならびに既に使用した３’ｈＣＲＦ2Ｒオリゴヌクレオチドを使用することによって、さらなるＰＣＲクローニングに使用する。オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｈＣＲＦ2Ｒ−ｐＨＡＴ２０構成からのＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒ融合遺伝子をＰＣＲ増幅し、前述のようにＰＣＲ産物を精製する。次いで、ＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒ融合遺伝子ＰＣＲ産物を、クローンテック製ＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現システム（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ｐＢａｃＰＡＫ８ベクターへのクローニングに使用する。ＨＡＴ−−ｈＣＲＦ2Ｒ融合遺伝子のｐＢａｃＰＡＫ８ベクターへのライゲーションは、本質的には前述の通りである。次いで、ｈＣＲＦ2Ｒ／ＨＡＴ−ｐＢａｃＰＡＫ８構成をＴＯＰ１０’Ｆ適格大腸菌（E.coli）細胞にトランスフェクションし、アンピシリン耐性細胞を選択し、プラスミドＤＮＡを単離して前述のように構成の一体性に関して確認する。次いで、カルフォス（CalPhos）（商標）哺乳類トランスフェクションキット（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、この構成を線形化ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡと併せてＳｆ２１昆虫宿主細胞に共トランスフェクションする。次いで、昆虫細胞を２〜３日インキュベートし、その後、個々の明確なプラークからウイルスを採取する。その後、すべて、製造業者（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）の推奨にしたがって、ＢａｃＰＡＫ昆虫細胞培地を使用し、ウイルスをｓｆ２１細胞内で増幅させ、採取したウイルスを力価測定し、力価測定したウイルスをＳｆ２１細胞の大規模感染に使用する。次いで、製造業者が推奨する条件を用いて、ＴＡＬＯＮ（登録商標）クローンテック製ＣｅｌｌＴｈｒｕ精製キット（クローンテック社（Clonetech Inc.）米国カリフォルニア州パロアルト）を使用して、組換えＨＡＴ−ＣＲＦ2Ｒ融合タンパク質を精製する。簡潔には、感染の４８時間後に、感染させたＳｆ２１細胞を採取し、抽出／ローディング緩衝液内で超音波分解する。次いで、細胞溶解物をＴＡＬＯＮ（登録商標）ＣｅｌｌＴｈｒｕカラムの中に押し込む。カラムを抽出／ローディング緩衝液で２度洗浄し、結合したＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒタンパク質を溶出緩衝液で溶出させる。溶出したタンパク質を、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）カリフォルニア州ハーキュレス）の推奨にしたがって、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム及びタンパク質定量化システムを使用し、一体性に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質濃度を定量化する。その後、精製したＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒ融合タンパク質を、以下のようにヒトモノクローナル抗体製造のために異種マウス（XenoMouse）動物の免疫化に使用する。１０μｇの精製した組換えＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒ融合タンパク質を、２５μｇの補助剤モノホスホリル脂質Ａ（シグマ（Sigma）ミズーリ州セントルイス）と組み合わせて使用して、８週を超える期間にわたって何度も１０匹の異種マウス（XenoMouse）動物に接種する。接種した動物から血清を取得し、ＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒ融合タンパク質を含むコーティングポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（コーニング・グラス・ワークス（Corning Glass Works）ニューヨーク州コーニング）によって、精製したＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒ融合タンパク質を用いる抗原回収ＥＬＩＳＡで使用して、ＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒタンパク質に対する抗体を検出し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロッキングし、洗浄して、血清試料の１：５０希釈液と共に３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳで５回洗浄後、ヒト免疫グロブリンＧに対するアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗体と共に、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、緩衝液中のｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（シグマ（Sigma）ミズーリ州セントルイス）によって抗体を検出する。プレート・リーダを使用して４０５ｎｍでの光学密度を測定し、信号を定量化した。高い抗体産生が実証されたマウスを、ハイブリドーマ形成のために使用する。ハイブリドーマは、異種マウス（XenoMouse）動物からの脾臓細胞と非分泌骨髄腫細胞株ＮＳＡ−ｂｃｌ２を、３０％ポリエチレングリコールＰＥＧ４５０の存在下で、比率４：１の脾臓細胞とＮＳＡ−ｂｃｌ２細胞を使用して融合させることによって生成される。融合細胞を、９６ウェルプレートに制限希釈して、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、及びヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地内で培養することによって、個々にクローニングする（すべてライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）（メリーランド州ロックビル）から入手）。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン選択ハイブリドーマからの上清を、前述のようにＥＬＩＳＡによってヒト抗体産生に関してスクリーニングした。ＨＡＴ−ｈＣＲＦ2Ｒ融合タンパク質に対するヒト抗体を産生するハイブリドーマは、大規模な抗体産生のため選択される。モノクローナル抗体を、タンパク質Ｇ−セファロース（Sepharose）クロマトグラフィーによって精製する。簡潔には、培養したハイブリドーマクローンからの上清を、ローディング培養液中でタンパク質Ｇ−セファロースカラム（シグマ（SIGMA）ミズーリ州セントルイス）上に置き、３回洗浄し、ＩｇＧを溶出緩衝液で溶出させる。次いで、これらの抗体を、ｈＣＲＦ2Ｒ活性化（作動性）潜在能力を評価するためのスクリーニングで使用する。これは、実施例３で概略した方法を使用して実施する。ｈＣＲＦ2Ｒに対する作動薬活性を示すヒトモノクローナル抗体は、指定される候補化合物である。
（実施例９）
（筋肉の絶対力の測定値の判定）
ギプス固定したマウスの肢から、長指伸筋（ＥＤＬ）及びヒラメ筋を腱間で摘出する。
単離した筋肉の各腱に絹縫合を結紮し、その筋肉を、リンゲル液（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２４ｍＭ重炭酸ナトリウム、１１ｍＭグルコース、５ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭリン酸ナトリウム、０．０２５ｍＭツボクラリン、すべてｐＨ７．４であり、９５％酸素／５％二酸化炭素によって酸素化されている）で満たされ、２５℃に維持された９５％酸素／５％二酸化炭素で常にバブリングして、プレキシガラスチャンバー内に設置する。サーボモーターのレバーアーム（モデル３０５Ｂ−ＬＲ、ケンブリッジ・テクノロジー社（Cambridge Technology Inc.）、米国マサチューセッツ州ウォータータウン）と、力変換器（モデルＢＧ−５０；クリート・セミコンダクター・プロダクツ社（Kulite Semiconductor Products Inc.）、米国ニュージャージー州レオニア）のステンレス鋼フックとの間に筋肉を水平に合わせ、筋肉の両側に長手方向に設置された２つの白金電極間に送信されるパルスによって広域刺激する。ラボビュー・ボード（Labview board）（モデルＰＣＩ−ＭＩＯ １６Ｅ−４、ラボビュー社（Labview Inc.）米国テキサス州オースティン）を搭載したパソコンによって発生された方形波パルス（持続時間０．２ミリ秒）を増幅して（アキュラス（Acurus）出力増幅器、モデルＡ２５、米国ニューヨーク州ドブズフェリー）、タイタニック収縮（titanic contraction）を増加させる。刺激電圧及び筋肉長（Ｌｏ）を調整して、最大の等尺性単収縮力を得る。周波数−力関係のプラトー域から、最大のタイタニック力（titanic force）の発生（Ｐｏ）を判定する。
（実施例１０）
（ｈＣＲＦ2Ｒ受容体の作動薬であるヒト抗体を使用した骨格筋萎縮の治療的処置）
体重５０ｋｇの、長期のベッド休養による腕及び肢の重度筋萎縮を患うヒト男性被験者に、骨格筋萎縮を改善させるための処置を行った。３ヶ月間、週に１度、ＣＲＦ2Ｒ受容体の活性化抗体を含むｐＨ６の水溶液１５ｍｌを、静脈注射を介して被験者に投与する。
この溶液は、以下を含む：
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 処置期間の終わりに、被験者は、腕と肢の筋量、強度及び可動性の測定可能な増加を示す。
（実施例１１）
（ｈＣＲＦ2Ｒ受容体の作動薬であるヒト抗体を使用した骨格筋萎縮の予防的処置）
体重５５ｋｇのヒト女性被験者に、１ヶ月以内に臀部関節置換手術を計画する。術後回復時の筋肉不使用による骨格筋萎縮のレベルを最終的に低減させるために、手術の前と後に被験者に骨格筋量を増加させるための処置をする。具体的には、手術前の１か月間及び手術後の２ヶ月間、週に１度、ＣＲＦ2Ｒ受容体の活性化抗体を含むｐＨ６の水溶液１８ｍｌを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む：
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 処置期間の終わりに、被験者は、抗体治療を行わない患者で予想される状態に比べて、腕と足の筋量、強度、可動性の測定可能な維持を示す。
（実施例１２）
（ＣＲＦ2Ｒ受容体の作動薬であるヒト抗体を使用した骨格筋萎縮の予防的処置）
体重４５ｋｇのヒト女性被験者に、落下後の上腕の単純骨折を処置するためにギプス固定術を実施する。被験者に、骨折治癒時の不使用及び制限使用による患部の腕と肩の骨格筋萎縮を防止する処置を実施する。具体的には、ギプス固定の日から開始して、週に１度、抗ｈＣＲＦ2Ｒ受容体を含むｐＨ６の水溶液１３ｍｌを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む：
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 処置期間の終わりに、被験者は、抗体治療を行わない被験者で予想される状態及び追跡処置に比べ、腕と肩の患部の筋量、強度及び可動性の測定可能な維持、ならびに物理治療課程の短縮を示す。
（実施例１３）
（ウロコルチン−ＩＩを使用した骨格筋萎縮の予防的処置）
昏睡状態の体重６０ｋｇのヒト女性被験者を病院に収容する。被験者に、この方法によって、昏睡状態における不使用による全身の骨格筋萎縮を防止するための処置を実施する。具体的には、昏睡状態の間、１日に１度、次の原液５ｍｌを滅菌食塩水５００ｍｌに加えることによって調製される水溶液約５００ｍｌを、緩やかな静脈注射を介して被験者に投与する：
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 処置の結果、被験者は、薬物療法なしの被験者の状態に比べ、昏睡時及び意識回復後の、骨格筋量及び機能の測定可能な維持、ならびに物理療法の必要性の低下を示す。
（実施例１４）
（ＣＲＦを使用したデュシェンヌ筋ジストロフィー患者の治療的処置）
デュシェンヌ筋ジストロフィーと診断されている体重４０ｋｇの男性被験者を、同様の用量範囲にわたってＣＲＦ１−Ｒ及びＣＲＦ２−Ｒ作動性を示す化合物で処置する。被験者は、疾病が進行する間の筋強度及び機能を改善又は保持するために、化合物の持続放出性デポー製剤で処置する。具体的には、月に１度、筋肉注射を介して、以下を含むｐＨ６．０の水溶液３ｍｌを被験者に投与する：
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 処置の結果、被験者は、疾病の自然進行時に示されるのに比べ、時間制限された機能評価において筋強度又は筋機能が改善し、あるいはその下降度が減衰する。
本発明は、発明の個々の態様を示すことだけを意図して述べた特定の実施形態の範囲に制限されるものではなく、機能的に等価の方法及び成分は、本発明の範囲内にある。これらには、試験動物の種類、ＣＲＦＲ作動薬の性質及びタイプ、動物の性別、萎縮モデル、遺伝的方法を含むＣＲＦＲ活性化方法などが含まれるが、これだけに限るものではない。本明細書で示し記載するものに加え、前述の説明及び添付の図面を読めば、当業者には本発明の様々な修正形態が明らかである。このような修正形態は、添付の特許請求の範囲内に入るものとする。
マウスの坐骨神経除去萎縮モデルにおける、ＣＲＦ1Ｒ／ＣＲＦ2Ｒ作動薬であるソーバジン（１日２回の皮下投与）の内側腓腹筋に対する抗萎縮効果を示す図である。 マウスの坐骨神経除去萎縮モデルにおける、ソーバジン（浸透性ミニポンプによって連続投与）の前脛骨筋に対する抗萎縮効果を示す図である。 前脛骨筋（図３Ａ）及び内側腓腹筋（図３Ｂ）の糖質コルチコイド誘発萎縮に対するソーバジン（浸透性ミニポンプで連続投与）の抗萎縮効果を示す図である。 前脛骨筋（図３Ａ）及び内側腓腹筋（図３Ｂ）の糖質コルチコイド誘発萎縮に対するソーバジン（浸透性ミニポンプで連続投与）の抗萎縮効果を示す図である。 ソーバジン（１日２回皮下投与）の、前脛骨筋のギプス固定誘発萎縮への抗萎縮効果、ならびにギプス固定していない（正常な）前脛骨筋に対する肥大誘発効果を示す図である。 内側腓腹筋のギプス固定誘発萎縮に対するソーバジンの抗萎縮効果、ならびにギプス固定していない（正常な）内側腓腹筋に対するソーバジンの肥大誘発効果を示す図である。 マウスの坐骨神経除去誘発萎縮モデルにおける前脛骨筋へのソーバジン及びウロコルチン（浸透性ミニポンプで連続投与）の抗萎縮及び肥大誘発効果を示す図である。 前脛骨筋（図６Ａ）及び内側腓腹筋（図６Ｂ）の不使用誘発萎縮に対するウロコルチン（１日２回皮下投与）の抗萎縮効果を示す図である。 前脛骨筋（図６Ａ）及び内側腓腹筋（図６Ｂ）の不使用誘発萎縮に対するウロコルチン（１日２回皮下投与）の抗萎縮効果を示す図である。 副腎摘出ラットの坐骨神経除去誘発萎縮モデルにおける、前脛骨筋の神経除去誘発萎縮に対する、ソーバジン（１日２回皮下投与）の抗萎縮効果を示す図である。 副腎摘出ラットの坐骨神経除去誘発萎縮モデルにおける、長指伸筋（ＥＤＬ）に対する、ソーバジン（１日２回皮下投与）の抗萎縮効果を示す図である。ソーバジンは、神経除去していないＥＤＬ筋の肥大を誘発した。 副腎摘出ラットの坐骨神経除去誘発萎縮モデルにおける、ヒラメ筋の神経除去誘発萎縮に対する、ソーバジン（１日２回皮下投与）の抗萎縮効果を示す図である。 副腎摘出ラットの坐骨神経除去誘発萎縮モデルにおける、内側腓腹筋の神経除去誘発萎縮に対する、ソーバジン（１日２回皮下投与）の抗萎縮効果を示す図である。 マウス坐骨神経除去萎縮モデルにおいて、ソーバジン（浸透性ミニポンプによって連続投与）が野生型マウスでは前脛骨筋の抗萎縮効果を有したが、ＣＲＦ2Ｒノックアウトマウスでは効果がなかったことを示す図である。 マウスの肢ギプス固定不使用萎縮モデルにおいて、ソーバジンが、筋量（図９Ａ）及び筋機能（図９Ｂ）によって測定したときに、ＥＤＬ及びヒラメ筋に対する抗萎縮効果を有したことを示す図である。 マウスの肢ギプス固定不使用萎縮モデルにおいて、ソーバジンが、筋量（図９Ａ）及び筋機能（図９Ｂ）によって測定したときに、ＥＤＬ及びヒラメ筋に対する抗萎縮効果を有したことを示す図である。
配列表
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Claims (20)

  1. 骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法：
    （ａ）試験化合物をＣＲＦ2Ｒに接触させる工程；
    （ｂ）前記試験化合物が前記ＣＲＦ2Ｒに結合するかどうか判定する工程；
    （ｃ）前記ＣＲＦ2Ｒに結合するこれらの化合物を選択し、さらに、骨格筋萎縮のモデル系で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を増加させるかどうか判定する工程；及び、
    （ｄ）骨格筋量又は機能を調節する候補化合物として、骨格筋量又は機能を調節するこれらの試験化合物を同定する工程。
  2. 前記請求項１の（ａ）から（ｄ）の工程で特定される候補化合物の一覧を形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の候補化合物同定方法。
  3. 前記ＣＲＦ2Ｒが、配列識別番号１０の配列と８０％より多く同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の候補化合物同定方法。
  4. 前記ＣＲＦ2Ｒが、配列識別番号１０の配列と９０％より多く同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の候補化合物同定方法。
  5. 前記ＣＲＦ2Ｒが、配列識別番号１０、配列識別番号１２、配列識別番号１４、配列識別番号１８、配列識別番号２０、配列識別番号２４、又は配列識別番号２６のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の候補化合物同定方法。
  6. 骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法：
    （ａ）試験化合物を、機能的ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞に接触させる工程；
    （ｂ）前記試験化合物が前記ＣＲＦ 2 Ｒを活性化させるかどうかを判定する工程；
    （ｃ）前記ＣＲＦ2Ｒを活性化するそれらの化合物を選択し、さらに、骨格筋萎縮のモデル系で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を増加させるかどうか判定する工程；ならびに、
    （ｄ）骨格筋量又は機能を調節する候補化合物として、骨格筋量又は機能を調節するこれらの試験化合物を同定する工程。
  7. 前記請求項６の（ａ）から（ｄ）の工程で特定される候補化合物の一覧を形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の候補化合物同定方法。
  8. 前記ＣＲＦ2Ｒが、配列識別番号１０の配列と８０％より多く同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６に記載の候補化合物同定方法。
  9. 前記ＣＲＦ2Ｒが、配列識別番号１０の配列と９０％より多く同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６に記載の候補化合物同定方法。
  10. 前記ＣＲＦ2Ｒが、配列識別番号１０、配列識別番号１２、配列識別番号１４、配列識別番号１８、配列識別番号２０、配列識別番号２４、又は配列識別番号２６のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６に記載の候補化合物同定方法。
  11. 前記ＣＲＦ2Ｒが、真核生物の細胞中で発現されていることを特徴とする、請求項６に記載の候補化合物同定方法。
  12. ＣＲＦ2Ｒを活性化する前記試験化合物の判定が、細胞性ｃＡＭＰレベルの測定を含む、請求項６に記載の候補化合物同定方法。
  13. 前記細胞がｃＡＭＰ応答性エレメントに操作可能に会合されたレポーター遺伝子をさらに含んでおり、前記細胞性ｃＡＭＰレベルの測定が前記レポーター遺伝子の発現の測定を含むことを特徴とする、請求項６に記載の候補化合物同定方法。
  14. 骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法：
    （ａ）試験化合物を、機能的ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物とＣＲＦ２Ｒとの相互作用から生じるＣＲＦ２Ｒの活性化レベルを判定する工程；
    （ｂ）前記試験化合物を、機能的ＣＲＦ1Ｒを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物とＣＲＦ1Ｒの相互作用から生じるＣＲＦ1Ｒの活性化レベルを判定する工程；
    （ｃ）前記ＣＲＦ2Ｒ活性化レベルと前記ＣＲＦ1Ｒ活性化レベルとを比較する工程；
    （ｄ）ＣＲＦ1ＲよりもＣＲＦ2Ｒを選択的に活性化するこれらの試験化合物を選択する工程；
    （ｅ）さらに、骨格筋萎縮のモデル系で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を増加させるかどうかを判定する工程；および
    （ｆ）骨格筋量又は機能を調節する候補化合物として、骨格筋量又は機能を調節するこれらの試験化合物を同定する工程。
  15. 前記候補化合物がＣＲＦ2Ｒに１００倍以上の選択性を示すことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記候補化合物がＣＲＦ2Ｒに１０００倍以上の選択性を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記候補化合物がＣＲＦ2Ｒに１倍〜１００倍の間の選択性を示すことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  18. 骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法：
    （ａ）試験化合物をＣＲＦ2Ｒ、または機能的ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞と接触させる工程；
    （ｂ）前記試験化合物が前記ＣＲＦ2Ｒに結合するか、または前記ＣＲＦ2Ｒを活性化するかどうか判定する工程；及び、
    （ｃ）前記ＣＲＦ2Ｒに結合するこれらの化合物を選択し、さらに、骨格筋萎縮の細胞培養モデル及び／又はヒト以外の動物で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定する工程。
  19. 請求項１８に記載の方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法：
    （ａ）試験化合物を、機能的ＣＲＦ2Ｒを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物から生じる前記ＣＲＦ2Ｒの活性化レベルを判定する工程；
    （ｂ）前記同じ試験化合物を、機能的ＣＲＦ１Ｒを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物から生じる前記ＣＲＦ１Ｒの活性化レベルを判定する工程；次に、
    （ｃ）細胞培養モデル又はヒト以外の動物で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定するためにＣＲＦ１ＲよりもＣＲＦ2Ｒに対して選択性を示す前記同じ試験化合物を選択する工程。
  20. ヒト以外の動物で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定する工程を含むことを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
JP2002569086A 2001-03-06 2002-03-06 副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体を使用して筋量又は機能を調節する化合物を同定する方法 Expired - Fee Related JP4331942B2 (ja)

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