JP2001206899A - ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途 - Google Patents

ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途

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JP2001206899A
JP2001206899A JP2000340216A JP2000340216A JP2001206899A JP 2001206899 A JP2001206899 A JP 2001206899A JP 2000340216 A JP2000340216 A JP 2000340216A JP 2000340216 A JP2000340216 A JP 2000340216A JP 2001206899 A JP2001206899 A JP 2001206899A
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acid sequence
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信二 坂本
Masashi Kamada
雅史 鎌田
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトTGF-βのシグナルのヒトTGF-βII型受容
体を介する細胞内への伝達を阻害し、ヒトTGF-βの作用
により惹起される種々の臓器での組織線維症、組織線維
症を伴う疾患（腎硬化症、肺線維症、肝硬変など）、関
節リウマチ、血管再狭窄、及び／または皮膚のケロイド
などの種々の疾患の予防及び治療するためのヒトTGF-β
II型受容体に結合するヒトモノクローナル抗体及びその
医薬組成物を提供する。 【解決手段】 遺伝子工学技術を用いて作製したヒト抗
体産生トランスジェニックマウスに可溶性ヒトTGF-βII
型受容体を免疫することにより、ヒトTGF-βII型受容体
に結合し、ヒトTGF-βのシグナルの細胞内への伝達を阻
害する種々のヒトモノクローナル抗体得た。さらに、該
ヒトモノクローナル抗体が、ヒトTGF-βの作用により惹
起される種々の臓器での組織線維症などの種々の疾患の
予防及び治療に有効であることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトトランスフォ
ーミング成長因子-β（Transforming Growth Factor-
β；TGF-β）のII型受容体（以下「TGF-βII型受容体」
または「TβRII」と呼ぶこともある。）に結合するヒト
モノクローナル抗体若しくはその一部、該ヒトモノクロ
ーナル抗体を産生する細胞、該ヒトモノクローナル抗体
を含んでなる医薬組成物、該TGF-βII型受容体に結合し
該受容体を介するシグナル伝達を抑制若しくは阻害する
物質（例えば、該TGF-βII型受容体に結合する抗体ある
いは化学合成低分子化合物など）を含んでなる医薬組成
物に関する。
【０００２】
【従来の技術】正常ラットの線維芽細胞の増殖因子に探
索において、正常細胞の形質転換を促進する分子として
見出された２つの増殖因子は、トランスフォーミング成
長因子-α（Transforming Growth Factor-α；TGF-α）
とトランスフォーミング成長因子-β（Transforming Gr
owth Factor-β；TGF-β）と命名された。その後の研究
により、TGF-αは上皮増殖因子（Epidermal Growth Fac
tor; EGF）ファミリーに属する分子であり、一方、TGF-
βは、ほとんどの種類の細胞で産生され、その受容体も
各臓器及び細胞で広く発現されている（Biol. Signal
s., Vol.5, p,232,1996及びPulmonary Fibrosis, Vol.8
0 of Lung Biology in Health and DiseaseSeries, ed.
by Phan et al, p.627, Dekker, New York, 1995）。T
GF-βは細胞の分化及び増殖を制御する活性を有する。T
GF-βの細胞増殖活性は、細胞の種類によって大きく異
なる（Roberts et al, The transforming growth facto
r-βs, In Peptide Growth Factors and Their Recepto
rs, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Sp
ringer-Verlag, Berlin, 1990, p.419-472）。例えば、
線維芽細胞や血管平滑筋細胞などの間葉系の細胞に対し
ては細胞増殖を促進する活性を有する一方で、上皮細
胞、血管内皮細胞及び血球系細胞などの多種の細胞に対
しては増殖促進よりもむしろ増殖の抑制をする因子とし
て働くことが明らかにされた。さらに、TGF-βは細胞増
殖の制御だけでなく、免疫系の制御やコラーゲン、ファ
イブロネクチン及びテニシンなどの細胞外マトリックス
（ECM；Extracellular Matrix）の蓄積促進などの多彩
な機能を有することが明らかにされた（Adv. Immunol.,
Vol.55, p.181, 1994及びSeminars in Cell Biol., Vo
l.5, p.389, 1994）。
【０００３】最近になって、TGF-βのこの多彩な機能の
メカニズムが、TGF-β受容体の構造とシグナル伝達の特
有性に由来することが明らかにされつつある。TGF-β
は、分子量約25kDの蛋白質で、2本のペプチドでダイマ
ーを構成する。TGF-βには５つのアイソフォーム（isof
orm）が存在し、哺乳動物ではTGF-β1、TGF-β2及びTGF
-β3があり、ニワトリではTGF-β4が、またカエルではT
GF-β5が存在する。これらのアイソフォームは互いに約
70％の相同性を有する。
【０００４】TGF-βのうちTGF-β1については、特にそ
の機能が解析されている。TGF-β1は、生体組織におけ
る創傷の治癒過程において極めて重要な役割をする（Ne
w Engl. J. Med., Vol.331, p.1286, 1994及びJ. Cell.
Biol., Vol.119, p.1017, 1992）。組織の創傷部位で
は、炎症細胞や線維芽細胞の浸潤、ECMの増生と血管新
生、及び組織再生のための細胞増殖などの迅速かつダイ
ナミックな生体反応が起こり傷が修復される。
【０００５】創傷時にはまず出血が起こり、次いで血小
板からTGF-βやPDGF（platelet-derived growth facto
r）が産生されるとともに、創傷部位のECMに結合してい
る不活性型TGF-βを活性化される。遊走してきた細胞や
創傷部位の細胞は、そのように産生された高濃度のTGF-
βに曝させることにより、FGF（fibroblast growth fac
tor）、TNF（Tumor necrosis factor）及びIL-1（Inter
leukin-1）などの増殖因子やサイトカインを分泌し、ま
た線維芽細胞ではECMの合成及び分泌が起こる。さら
に、例えば、線維芽細胞や間葉細胞では、血小板由来増
殖因子（Platelet-derived Growth Factor (PDGF)）や
結合組織成長因子（Connective Tissue Growth Factor
(CTGF)；Hcs24とも呼ぶ。J. Cell Biology, Vol.114, N
o.6, p.1285-1294, 1991；Int. J. Biochem. Cell Bio
l., Vol.29, No.1, p.153-161, 1997；Circulation, Vo
l.95, No.4, p.831-839, 1997；Cell Growth Differ.,
Vol.7, No.4, p.469-480, 1996；J. Invest. Dermato
l., Vol.106, No.4, p.729-733,1996；J. Invest. Derm
atol., Vol.105, No.2, p.280-284, 1995；J. Invest.D
ermatol., Vol.105, No.1, p.128-132, 1995；及び国際
特許出願公開WO96/38172号公報）やファイブロネクチン
（fibronectin）の産生の増加が観察される。TGF-β1は
さらに蛋白質分解酵素の産生を抑える一方で、その酵素
阻害剤を増加させるとともに、ECMの細胞への接着に関
与するインテグリンの合成を促しECMの増生と沈着を助
長し、創傷の修復を行うと考えられている。この他に、
TGF-βは、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の機能を抑制し、
TNFやIL-1の合成を阻害することによる免疫抑制作用も
有する。
【０００６】TGF-βの発現の制御のメカニズムは未だ未
解明な部分もあるが、TGF-βがECMであるプロテオグリ
カンに結合することによりその発現が制御されるものと
考えられている（Nature, Vol.346, p.281, 1990及びNa
ture, Vol.360, p.361, 1992）。即ち、TGF-βが、TGF-
β自身が産生促進したECMにより負の制御を受け、創傷
の治癒とともにTGF-βの過剰な発現が抑制されると考え
られている。従って、この負の制御に異常が起こるとTG
F-βの過剰な発現が起こり組織の線維化（線維症）など
の病的状態が起こるものと考えられている。
【０００７】一方、肺線維症や腎硬化症においては、EC
Mの沈着が十分に起こっているにもかかわらず、TGF-β
は高濃度に保たれており、そのうような線維症等の病的
状態がさらに進行する（Kidney Int., Vol.45, p.916,
1994及びJ.Clin. Invest., Vol.92, p.632, 1993）。肺
線維症や腎硬化症では、組織の傷害が絶えず起こること
によりTGF-βの発現のシグナルが常にオンの状態である
か、上述のようなTGF-β発現の負の制御シグナルが入ら
ないか、あるいはその両者が相乗的に働くものと推察さ
れている。
【０００８】腎硬化症は、慢性糸球体腎炎や糖尿病性腎
症などの多くの腎疾患の最終像であり、メサンギウム細
胞の増殖とECMの増生により特徴付けられる。腎硬化症
の腎臓においては、TGF-βの異常発現が認められてきた
（J. Clin. Invest., Vol.90, p.1, 1992及びProc. Nat
l. Acad. Sci. USA, Vol.86, p.1056, 1989）。また抗T
hy-1抗体により誘発される実験的腎炎モデルにおいて
は、抗TGF-β抗体の投与により腎炎の進行が抑制される
ことが示されTGF-βが腎硬化症の病態形成に関与するこ
とが示唆されてきている（Nature, Vol.346, p.371, 19
90）。
【０００９】一方、肺については、ブレオマイシン投与
により誘導される肺線維症や突発性はい線維症では、TG
F-βが高濃度に発現しており、TGF-βの肺線維症の形成
に関与することが示唆されてきている。また、慢性肝炎
や肝硬変の患者の生検組織においては、コラーゲンの沈
着部位にTGF-βの発現が認められている。このほか、血
管再狭窄、関節リウマチ等の関節炎及び皮膚のケロイド
などにおいてもECMの沈着とTGF-βの発現が報告されて
きている。
【００１０】このような事実から、TGF-βが種々の組織
の線維化（線維症）の病態形成に関与する可能性が示唆
されてきており、アンチセンス医薬や遺伝子治療などに
よりTGF-βの機能の抑制することにより組織線維症の治
療の試みが実験的になされつつある（Kidney Int., Vo
l.50, p.148, 1996）。上述したTGF-βの種々の機能発
現、及びTGF-βによる組織線維症等の種々の病態の形成
は、TGF-βがTGF-β受容体に結合することにより細胞内
にシグナルが伝達することにより開始される。
【００１１】ヒト及びラット等の哺乳動物におけるTGF-
βの受容体としては、これまでにI型受容体（分子量約5
3kD；GenBank Accession No:L11695；Cell, Vol.75, N
o.4,p.681, 1993；以下「TGF-βI型受容体」（TGF-βTy
peI receptor）または「TβRI」と呼ぶこともある。)、
II型受容体（分子量約70kD；GenBank Accession No:M85
079；Cell, Vol.68, No.4, p.775, 1992；以下「TGF-β
II型受容体」（TGF-βTypeII receptor）または「TβRI
I」と呼ぶこともある。）及びIII型受容体（分子量約20
0-300kD；GenBank Accession No:L07594；Cell, Vol.6
7, No.4, p.785, 1991；Cell, Vol.67, No.4, p.797, 1
991；及びBiochem. Biophys. Res. Commun., Vol.189,
No.1, p.356, 1992；以下「TGF-βIII型受容体」（TGF-
βTypeIII receptor）または「TβRIII」と呼ぶことも
ある。）の３つの受容体が同定され構造が明らかにされ
ている（Adv. Imm., Vol.55, p.181, 1994）。
【００１２】それらの受容体の役割については、人為的
に樹立されたTGF-βに抵抗性のミンク肺上皮細胞株Mv1L
uの変異株を用いてそれらの受容体の機能解析により、
それら３つの受容体のうちTGF-βI型受容体とTGF-βII
型受容体がTGF-βのシグナル伝達に重要かつ必須である
ことが明らかにされている（J. Biol. Chem., Vol.265,
p.18518, 1990及びJ. Biol. Chem., Vol.266, p.9108,
1991）。一方、TGF-βIII型受容体は、TGF-βのシグナ
ル伝達には必須ではなく、間接的な役割を演じていると
考えられている。
【００１３】TGF-βIII型受容体は、849個のアミノ酸か
らなる細胞膜貫通蛋白質であり、細胞外領域（761個の
アミノ酸）、細胞膜貫通領域（24個のアミノ酸）及び細
胞内領域（43個のアミノ酸）から構成される。TGF-βII
I型受容体の細胞内領域は、セリン（Ser）／スレオニン
（Thr）残基に富み、40％以上を占める。TGF-βI型受容
体は、503個のアミノ酸からなる細胞膜貫通蛋白質であ
り、細胞外領域（101個のアミノ酸）、細胞膜貫通領域
（22個のアミノ酸）及び細胞内領域（356個のアミノ
酸）から構成される。
【００１４】TGF-βII型受容体は、同様に567個のアミ
ノ酸からなる細胞膜貫通蛋白質であり、シグナル配列
（23個のアミノ酸）、細胞外領域（136個のアミノ
酸）、細胞膜貫通領域（30個のアミノ酸）及び細胞内領
域（378個のアミノ酸）から構成される。TGF-βI型受容
体及びTGF-βII型受容体は、細胞外領域が比較的短く、
２箇所のキナーゼ挿入部位を有するセリン／スレオニン
キナーゼ構造を有する１回膜貫通型蛋白質である。ま
た、細胞内領域にはアスパラギン酸（Asp）結合型糖鎖
が結合し、システイン（Cys）残基がTGF-βI型受容体に
は10個及びTGF-βII型受容体には12個見られ、特徴的な
蛋白三次構造をとっている。
【００１５】TGF-βI型受容体の細胞内領域には、キナ
ーゼ領域に隣接してＧＳ領域を呼ばれるグリシン（Gl
y）、セリン（Ser）及びスレオニン（Thr）に富む領域
が見られる。TGF-βII型受容体もTGF-βI型受容体と似
た構造ではあるが、ＧＳ領域は有しない。TGF-βI型受
容体及びTGF-βII型受容体のキナーゼ領域は、約43％の
相同性を有し、ともにセリン／スレオニンに特異的なプ
ロテインキナーゼであることが示されているが、TGF-β
のシグナルが細胞内に伝達されるためには、両者のセリ
ン／スレオニンキナーゼ領域が作用することが必要であ
ることが明らかとされている（J. Biol. Chem., Vol.26
9, p.30753, 1994）。
【００１６】TGF-βのシグナルの細胞内への伝達には、
TGF-βI型受容体とTGF-βII型受容体の必須である。TGF
-βII型受容体は単独でTGF-βと結合するが、TGF-βI型
受容体単独ではTGF-βに結合しない。TGF-βのシグナル
の細胞内への伝達には、TGF-βI型受容体及びTGF-βII
型受容体の両者が細胞表面で複合体を形成することが重
要である。
【００１７】TGF-βがTGF-βII型受容体に結合すると、
TGF-βII型受容体はTGF-βI型受容体と細胞表面でヘテ
ロ４量体の複合体を形成することが示されている（J. B
iol.Chem., Vol.269, p.20172, 1994）。即ち、TGF-βI
型受容体は、TGF-βII型受容体の基質として働き、TGF-
βの存在下に両者が複合体を形成すると、TGF-βII型受
容体がTGF-βI型受容体のＧＳ領域をリン酸化すること
によってTGF-βI型受容体が活性化され、その結果細胞
内の他の基質をリン酸化することによりTGF-βのシグナ
ルがさらに下流へと伝達されると考えられている（Natu
re, Vol.370, p.341, 1994）。
【００１８】TGF-βのシグナルのTGF-βI型受容体より
下流への伝達の経路の詳細については未だ不明の点も残
っているが、最近になってTGF-βI型受容体より下流に
位置しTGF-βのシグナル伝達を媒介する８つのアイソフ
ォームからなりSmad（S Mothers against Dpp）と総称
されるシグナル伝達分子（Nature, Vol.381, p.620, 19
96; Cell, Vol.86, p.543, p.1996; Nature, 383, p.16
8, 1996;及びNature, Vol.383, p.832, 1996）、及びTA
K1（TGF-β activated kinase-1）と呼ばれるシグナル
伝達分子（Science, Vol.270, p.2008, 1995）が同定さ
れている。Smad2及びSmad3は、TGF-βII型受容体と複合
体を形成することにより活性化されたTGF-βI型受容体
に結合し、TGF-βII型受容体のキナーゼでリン酸化され
た後、TGF-βII型受容体から離れ、Smad4（DPC4）と複
合体を形成した後核内に移行することが明らかにされて
いる（Cell, Vol.87, p.1215, 1996及びEMBO J., Vol.1
6, No.17, 1997）。核内に移行したSmad2/Smad4またはS
mad3/Smad4複合体は、DNA結合蛋白質（転写因子）と結
合し転写活性因子として働き遺伝子の発現を制御すると
考えられている（Nature, Vol.383, p.832, 1996及びNa
ture, Vol.390, p.465, 1997）。TAK1は、MAPキナーゼ
カスケード上でMAPKKKとして働くことによりTGF-βのシ
グナル伝達に関与することが示されている。
【００１９】上述したように、TGF-βは、腎硬化症、肺
線維症や肝硬変等の種々の組織線維症、さらに慢性肝
炎、関節リウマチ、血管再狭窄及び皮膚のケロイド等の
種々病態の形成に深く関与しており、これらの病態の形
成は、TGF-βのシグナルがTGF-β受容体を介して細胞内
に伝達されることにより起こるものと考えられる。従っ
て、TGF-βのシグナルの細胞内への伝達を制御、とりわ
け抑制することにより、それらの病態を治療または予防
できる可能性が示唆される。TGF-βのシグナル伝達の抑
制によるそれらの病態の治療の試みについては、TGF-β
をターゲットとし、TGF-βに対する抗体あるいはTGF-β
遺伝子に対するアンチセンスを用いてTGF-βの機能を抑
制することにより腎炎等の病態を抑制しようとする試み
がなされている。
【００２０】しかしながら、TGF-βの結合の相手方であ
るTGF-β受容体、とりわけTGF-βII型受容体の機能の抑
制、換言すればTGF-βII型受容体をターゲットとし、TG
F-βII型受容体を介したTGF-βの細胞内へのシグナル伝
達を阻害することによる疾患の治療については、未だま
ったく報告されていない。さらに、TGF-βII型受容体に
対する抗体によりTGF-βII型受容体を介したTGF-βのシ
グナル伝達を阻害する疾患治療のアプローチについては
全く報告されていない。
【００２１】ヒトTGF-βII型受容体に対する抗体につい
ては、ウサギやヤギなどの非ヒト哺乳動物由来のポリク
ローナル抗体が報告されているに過ぎず、ヒトTGF-βII
型受容体に対するモノクローナル抗体はおろか、ヒト由
来のモノクローナル抗体の作製、並びに該ヒトモノクロ
ーナル抗体を用いた種々疾患の治療の試みについては、
未だ全く報告されていない。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】TGF-βは、種々の疾患
症状、例えば、腎硬化症、肺線維症や肝硬変等の種々の
組織線維症、さらに慢性肝炎、関節リウマチ、血管再狭
窄及び皮膚のケロイド等などの発症に深く関与する可能
性が示唆されている。TGF-βの機能の発現は、TGF-βが
TGF-βII型受容体に結合することによりTGF-βのシグナ
ルが細胞内に伝達されることにより達成されることか
ら、TGF-βII型受容体に結合する物質、例えばTGF-βII
型受容体に対する抗体等を用いてTGF-βII型受容体を介
したTGF-βのシグナル伝達を抑制することにより、それ
らの病態を治療または予防できるものと考えられる。
【００２３】即ち、本発明は、上述のような組織線維症
等の種々の疾患の治療に極めて有用なヒトTGF-βII型受
容体対するモノクローナル抗体、特にはヒトTGF-βII型
受容体に対するヒトモノクローナル抗体、並びに該TGF-
βII型受容体に結合し該受容体を介する細胞内へのシグ
ナル伝達を抑制または阻害する能力を有する物質（例え
ば、前記のヒトTGF-βII型受容体対するモノクローナル
抗体や化学合成低分子化合物など）を用いる種々疾患
（例えば、種々の腎疾患（例えば、腎炎、腎線維症、腎
硬化症など）、腎線維症や肺線維症等の種々の組織線維
症、肝硬変、関節リウマチ、皮膚ケロイドなど）を治療
するための医薬組成物及びその治療方法を提供すること
を目的とする。
【００２４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の目
的を達成するために、ヒトTGF-βII型受容体に対するヒ
トモノクローナル抗体に関して鋭意研究した結果、遺伝
子組換え技術を用いてヒトの抗体を産生するように作製
したトランスジェニックマウスを可溶性組換えヒトTGF-
βII型受容体で免疫することによって、ヒトTGF-βII型
受容体に結合する種々のヒトモノクローナル抗体、特に
はヒトTGF-βII型受容体に結合し、ヒトTGF-βの細胞内
へのシグナル伝達を阻害する種々のモノクローナル抗体
を作製することに世界に先駆けて初めて成功した。
【００２５】さらに、本発明のヒトTGF-βII型受容体に
結合するヒトモノクローナル抗体に代表されるような該
TGF-βII型受容体に結合る物質（他の例としては、化学
合成低分子化合物やアンチセンス核酸など）が、ヒトTG
F-βII型受容体を介するヒトTGF-βの細胞内へのシグナ
ル伝達を有意に阻害するのみならず、種々疾患（例え
ば、腎疾患（例えば、腎炎、腎線維症、腎硬化症な
ど）、腎線維症及び肺線維症等の種々の組織線維症、肝
硬変、関節リウマチ、皮膚ケロイドなど）の治療効果を
有することを見出し、本発明を完成するに到った。
【００２６】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトに由
来する抗体であることから、マウス由来の抗体等の非ヒ
ト哺乳動物由来の抗体からなる抗体医薬品の治療上の大
きな問題点（副作用）であったヒトに対する抗原性、即
ちHAMA（Human anti-mouse antigenicity）に起因する
宿主の重篤な免疫拒絶反応を全く惹起しないことから、
抗体の医薬品としての価値を劇的に増大させるものであ
る。
【００２７】さらに、本発明のヒトTGF-βII型受容体に
結合するヒトモノクローナル抗体に代表されるような該
TGF-βII型受容体に結合し該受容体を介する細胞内への
シグナル伝達を抑制または阻害する物質（他の例として
は、化学合成低分子化合物や動植物、細菌、微生物など
から単離される化合物など）及び該物質を含んでなる医
薬組成物は、TGF-βの作用に起因する種々の疾患、例え
ば、腎疾患（腎繊維症、腎炎、腎不全、腎硬硬化症な
ど）、肺疾患（例えば、肺線維症、肺炎など）、肝臓疾
患（例えば、肝臓組織繊維症、肝硬変、肝炎など）、皮
膚疾患（例えば、創傷、強皮症、、乾癬、ケロイドな
ど）、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節
症など）、血管疾患（例えば、血管再狭窄、リウマチ性
血管炎など）、種々臓器での組織繊維症（種々の癌で併
発する組織線維症を含む）、及び動脈硬化症（併発する
組織繊維症を含む）などの発症及び／または進行を抑
制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品
として有用である。
【００２８】即ち、本発明の下記(1)乃至(24)に記載さ
れるとおりの発明である。 (1) ヒトTGF-βII型受容体に結合するヒトモノクロー
ナル抗体またはその一部。 (2) 該ヒトモノクローナル抗体が、ヒトTGF-βがヒトT
GF-βII型受容体に結合することにより生ずるシグナル
の細胞内への伝達を阻害する活性を有することを特徴と
する前記(1)に記載のヒトモノクローナル抗体またはそ
の一部。 (3) 該ヒトモノクローナル抗体が、下記の（ａ）乃至
（ｃ）のいずれかに記載の性質を有することを特徴とす
る前記(1)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその
一部： （ａ）ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト骨肉腫
由来細胞株MG-63（ATCCCRL-1427）の細胞増殖を抑制す
る； （ｂ）ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト肺癌細
胞株A549（ATCC CCL-185）の細胞増殖抑制を抑制する；
または （ｃ）ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト骨肉腫
由来細胞株MG-63（ATCCCRL-1427）によるファイブロネ
クチンまたは結合組織成長因子の産生を抑制する。 (4) 該ヒトモノクローナル抗体が、ヒト抗体を産生す
る能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由
来するモノクローナル抗体であることを特徴とする前記
(1)乃至前記(3)のいずれかに記載のヒトモノクローナル
抗体またはその一部。 (5) 該ヒトモノクローナル抗体が、ヒトTGF-βII型受
容体を発現する細胞またはヒトTGF-βII型受容体の全部
若しくは一部を、ヒト抗体を産生する能力を有するトラ
ンスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより得
られるモノクローナル抗体であることを特徴とする前記
(4)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。 (6) 該トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トラン
スジェニックマウスであることを特徴とする前記(4)ま
たは前記(5)に記載のヒトモノクローナル抗体またはそ
の一部。 (7) 該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコー
ドするＶ領域のDNAが、DP-54（3-07）、DP-73（5-51）
及びDP-77（3-21）からなる群から選ばれるいずれかの
Ｖ遺伝子セグメントに由来することを特徴とする前記
(1)乃至前記(6)のいずれかに記載のヒトモノクローナル
抗体またはその一部。 (8) 該ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコー
ドするＶ領域のDNAが、A30、DPK-15（A19）、DPK-24（B
-3）、及びDPK-28（A18）からなる群から選ばれるいず
れかのＶ遺伝子セグメントに由来することを特徴とする
前記(1)乃至前記(6)のいずれかに記載のヒトモノクロー
ナル抗体またはその一部。 (9) 該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコー
ドするＶ領域のDNAが、DP-54（3-07）、DP-73（5-51）
及びDP-77（3-21）からなる群から選ばれるいずれかの
Ｖ遺伝子セグメントに由来し、且つ該ヒトモノクローナ
ル抗体の軽鎖可変領域をコードするＶ領域のDNAが、A3
0、DPK-15（A19）、DPK-24（B-3）、及びDPK-28（A18）
からなる群から選ばれるいずれかのＶ遺伝子セグメント
に由来することを特徴とする前記(1)乃至前記(8)のいず
れかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。 (10) 該ヒトモノクローナルの重鎖可変領域が、下記
（ａ）乃至（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含むアミ
ノ酸を有することを特徴とする前記(1)に記載のヒトモ
ノクローナル抗体またはその一部： （ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号21乃至117番目のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号21乃至117番目のアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列； （ｃ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号２乃至98番目のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号２乃至98番目のアミノ酸配列において、１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された
アミノ酸配列； （ｅ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号21乃至116番目のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号21乃至116番目のアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列； （ｇ）配列番号10に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号21乃至117番目のアミノ酸配列；または （ｈ）配列番号10に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号21乃至117番目のアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列。 (11) 該ヒトモノクローナルの軽鎖可変領域が、下記
（ａ）乃至（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含むアミ
ノ酸を有することを特徴とする前記(1)に記載のヒトモ
ノクローナル抗体またはその一部： （ａ）配列番号12に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号23乃至117番目のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号12に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号23乃至117番目のアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列； （ｃ）配列番号14に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号21乃至116番目のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号14に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号21乃至116番目のアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列； （ｅ）配列番号16に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号22乃至120番目のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号16に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号22乃至120番目のアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列； （ｇ）配列番号18に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号18乃至113番目のアミノ酸配列；または （ｈ）配列番号18に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号18乃至113番目のアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列。 (12) 前記(1)乃至前記(11)のいずれかに記載のヒトモ
ノクローナル抗体を産生する細胞。 (13) 該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体を産生する
能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエロー
マ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴
とする前記(12)に記載の細胞。 (14) 該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体の重鎖をコ
ードするDNA若しくはその軽鎖をコードするDNAのいずれ
か一方のDNA、または両方のDNAが細胞内に導入されるこ
とにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを
特徴とする前記(12)に記載の細胞。 (15) 前記(1)乃至(11)のいずれかに記載のヒトモノク
ローナル抗体若しくはその一部、及び薬学的に許容され
うる担体とを含んでなる医薬組成物。 (16) 該医薬組成物が、ヒトTGF-βがヒトTGF-βII型受
容体に結合することにより生ずるシグナルの細胞内への
伝達を阻害するために用いられることを特徴とする前記
(15)に記載の医薬組成物。 (17) 組織の線維化を抑制するための医薬組成物であっ
て、ヒトTGF-βII型受容体に結合し該受容体を介する細
胞内へのシグナル伝達を抑制または阻害する能力を有す
る物質及び薬学的に許容されうる担体を含んでなること
を特徴とする医薬組成物。 (18) 該物質が、前記(1)乃至(11)のいずれかに記載の
ヒトモノクローナル抗体またはその一部であることを特
徴とする前記(17)に記載の医薬組成物。 (19) 該組織の線維化が、肺、肝臓、腎臓または皮膚に
おける線維化であることを特徴とする前記(17)または前
記(18)に記載の医薬組成物。 (20) 該組織の線維化が、腎臓における線維化であるこ
とを特徴とする前記(19)に記載の医薬組成物。 (21) 腎臓疾患の治療または予防に用いられる医薬組成
物であって、ヒトTGF-βII型受容体に結合し該受容体を
介する細胞内へのシグナル伝達を抑制または阻害する能
力を有する物質及び薬学的に許容されうる担体を含んで
なることを特徴とする医薬組成物。 (22) 該物質が、前記(1)乃至(11)のいずれかに記載の
ヒトモノクローナル抗体またはその一部であることを特
徴とする前記(17)に記載の医薬組成物。 (23) ヒトTGF-βII型受容体に結合し該受容体を介する
細胞内へのシグナル伝達を抑制または阻害する能力を有
する物質及び薬学的に許容されうる担体を含んでなる医
薬組成物であって、該医薬組成物が、腎硬化症、肺線維
症、肝硬変、血管再狭窄、動脈硬化症、乾癬、強皮症、
アトピー、ケロイドまたは関節炎を抑制または治療する
ために用いられることを特徴とする医薬組成物。 (24) 該物質が、前記(1)乃至(11)のいずれかに記載の
ヒトモノクローナル抗体またはその一部であることを特
徴とする前記(17)に記載の医薬組成物。
【００２９】
【発明の実施の形態】以下、本発明で用いる語句の意味
を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ヤギ、
ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット
等を意味し、好ましくは、ヒト、ウサギ、ラット、ハム
スターまたはマウスであり、特に好ましくは、ヒト、ラ
ット、ハムスターまたはマウスである。本発明で用いら
れる「ヒト以外の哺乳動物」及び「非ヒト哺乳動物」な
る用語は各々同義であり、前述に定義した哺乳動物にお
けるヒト以外のあらゆる哺乳動物を意味する。
【００３０】本発明において用いられる「アミノ酸」と
は、自然界に存在するあらゆるアミノ酸を意味し、好ま
しくは、アミノ酸を表記するために用いられるアルファ
ベットの三文字表記法または一文字表記法に従って各々
下記のように表されるアミノ酸を意味する。グリシン
（Gly／G）、アラニン（Ala／A）、バリン（Val／V）、
ロイシン（Leu／L）、イソロイシン（Ile／I）、セリン
（Ser／S）、スレオニン（Thr／T）、アスパラギン酸
（Asp／D）、グルタミン酸（Glu／E）、アスパラギン
（Asn／N）、グルタミン（Glu／Q）、リジン（Lys／
K）、アルギニン（Arg／R）、システイン（Cys／C）、
メチオニン（Met／M）、フェニルアラニン（Phe／F）、
チロシン（Tyr／Y）、トリプトファン（Trp／W）、ヒス
チジン（His／H）、プロリン（Pro／P）。
【００３１】本発明でいう「ヒトTGF-βII型受容体」
（「TβRII」と称する場合もある。）とは、前述に記載
したとおりの既報に報告される構造及び機能を有するヒ
トのTGF-βII型受容体（human TGF-βtypeII recepto
r）を意味する（例えば、Cell, Vol.68, No.4, p.775-7
85, 1992; Adv. Immunol., Vol.55, p.181-220, 1994;
GenBank Accession No.:M85079）。該天然型ヒトTGF-β
II型受容体は、下記のような構造的特徴及び性質を有す
る。ヒトTGF-βII型受容体は、567個のアミノ酸からな
る細胞膜貫通蛋白質であり、細胞外領域（136個のアミ
ノ酸）、細胞膜貫通領域（30個のアミノ酸）及び細胞内
領域（378個のアミノ酸）から構成される。また、TGF-
βII型受容体は、細胞外領域が比較的短く、２箇所のキ
ナーゼ挿入部位を有するセリン／スレオニンキナーゼ構
造を有する１回膜貫通型蛋白質である。また、細胞内領
域にはアスパラギン酸（Asp）結合型糖鎖が結合すると
ともに、システイン（Cys）残基が12個見られ、特徴的
な蛋白三次構造をとっている。
【００３２】TGF-βII型受容体のキナーゼ領域は、セリ
ン／スレオニンに特異的なプロテインキナーゼであり、
TGF-βI型受容体のキナーゼ領域と約43％の相同性を有
する。このキナーゼ領域は、TGF-βのシグナルが細胞内
に伝達されるために必須である（J. Biol. Chem., Vol.
269, p.30753, 1994）。
【００３３】TGF-βII型受容体は、TGF-βI型受容体と
共同してTGF-βのシグナルの細胞内への伝達する極めて
重要な分子である。TGF-βII型受容体は単独でTGF-βと
結合する。TGF-βがTGF-βII型受容体に結合すると、TG
F-βII型受容体はTGF-βI型受容体と細胞表面でヘテロ
４量体の複合体を形成することが示されている（J. Bio
l. Chem., Vol.269, p.20172, 1994）。TGF-βの存在下
に両者が該複合体が形成されると、TGF-βII型受容体
は、TGF-βI型受容体のＧＳ領域（前述）をリン酸化しT
GF-βI型受容体が活性化する。その結果細胞内の他の基
質をリン酸化することによりTGF-βのシグナルがさらに
下流へと伝達されると考えられている（Nature, Vol.37
0, p.341, 1994）。
【００３４】また、本発明で言う「ヒトTGF-βII型受容
体」（「TβRII」とも呼ぶ。）には、上述の既報に記載
される天然型のタンパク一次構造（アミノ酸配列）のア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する天然
型ヒトTGF-βII型受容体の変異体も包含する。
【００３５】ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有
する天然型ヒトTGF-βII型受容体の変異体」とは下記変
異蛋白を意味する。即ち、天然型のヒトTGF-βII型受容
体と実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミ
ノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０
個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が
置換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列を
有する変異蛋白、並びに該天然のヒトTGF-βII型受容体
のアミノ酸配列中にに、複数個のアミノ酸、好ましくは
１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個の
アミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異蛋白。
さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を
有する変異体であってもよい。本発明におけるヒトTGF-
βII型受容体は、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成
法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知
られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いるこ
とにより製造することができる。
【００３６】また、本発明における「ヒトTGF-βII型受
容体」（「TβRII」とも呼ぶ。）には、該ヒトTGF-βII
型受容体の「一部」も包含される。ここで「一部」と
は、前記に定義したヒトTGF-βII型受容体のアミノ酸配
列中の任意の部分配列を含むポリペプチドを意味する。
好ましくは、前記に定義したヒトTGF-βII型受容体の細
胞外領域若しくはその任意の一部を意味する。
【００３７】ヒトTGF-βII型受容体の「一部」（好まし
くはヒトTGF-βII型受容体の細胞外領域若しくはその任
意の一部）は、後述する当該技術的分野において知られ
る公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組
換え技術または化学的合成法により製造することもでき
るし、また細胞培養方法により単離したヒトTGF-βII型
受容体をタンパク分解酵素等を用いて適切に切断するこ
とにより製造することができる。
【００３８】本発明の「ヒトモノクローナル抗体」と
は、前記に定義したヒトTGF-βII型受容体に結合するヒ
トモノクローナル抗体である。さらに詳細には、イムノ
グロブリンを構成する重鎖（Ｈ鎖）の可変領域（Variab
le region）及びＨ鎖の定常領域（Constant Region）並
びに軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む
全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子
に由来するヒトイムノグロブリンである。Ｌ鎖として
は、ヒトκ鎖またはヒトλ鎖が挙げられる。本発明のヒ
トTGF-βII型受容体に結合するヒトモノクローナル抗体
は、前記のとおりの本発明の(1)乃至(11)のいずれかに
記載される特徴を有するモノクローナル抗体である。さ
らに具体的には、後述の実施例並びに図面に記載される
ような様々な特性及び産業上の有用性を有する各種のモ
ノクローナル抗体である。
【００３９】本発明のヒトモノクローナル抗体における
好ましい態様としては、前記本発明の(2)乃至(11)のい
ずれかに記載のヒトTGF-βII型受容体に結合するヒトモ
ノクローナル抗体である。さらに好ましい態様として
は、前記本発明の(7)乃至(11)のいずれかに記載のヒトT
GF-βII型受容体に結合するヒトモノクローナル抗体で
ある。特に好ましい態様としては、前記本発明の(10)ま
たは(11)に記載のヒトTGF-βII型受容体に結合するヒト
モノクローナル抗体である。
【００４０】本発明の「ヒトモノクローナル抗体」は、
下記のいずれかの免疫原（抗原）を以下に述べるヒト抗
体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫するこ
とにより作製することができる。 （イ） 前記に定義したヒトTGF-βII型受容体を細胞表
面に発現する天然の細胞または人工的に樹立した細胞
株； （ロ） 前記に定義したヒトTGF-βII型受容体を細胞表
面に発現するように遺伝子組換え技術を用いて作製され
た遺伝子組換え細胞； （ハ） 前記（イ）または（ロ）の細胞を可溶化して得
た細胞可溶化物（celllysate）、または該cell lysate
から精製したヒトTGF-βII型受容体のポリペプチド断
片； （ニ） 前記に定義したヒトTGF-βII型受容体の一部
（特に好ましくは、その細胞外領域若しくはその任意の
ペプチド）を可溶性ポリペプチドとして発現するように
遺伝子組換え技術を用いて作製された遺伝子組換え細
胞； （ホ） 前記（ニ）の遺伝子組換え細胞を培養して得た
培養上清若しくは該培養上清から精製されたヒトTGF-β
II型受容体の細胞外領域ポリペプチド（可溶性ヒトTGF-
βII型受容体）；または （ヘ） 化学的に合成されたヒトTGF-βII型受容体の一
部（（特に好ましくは、その細胞外領域若しくはその任
意のペプチド）。
【００４１】さらには、本発明のヒトモノクローナル抗
体は、遺伝子組換え技術を用いて、そのような本発明の
ヒトモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコード
するcDNAにより宿主細胞を形質転換して得られる遺伝子
組換え細胞であって、遺伝子組換えヒトモノクローナル
抗体を産生する本発明の「遺伝子組換え細胞」を培養す
ることにより培養上清中から得ることもできる。また、
本発明ヒトモノクローナル抗体は、IgG（IgG1、IgG2、I
gG3、IgG4）、IgM、IgA（IgA1、IgA2）、IgDまたはIgE
のいずれのアイソタイプを有するヒトモノクローナル抗
体であってもよい。好ましくは、IgG（IgG1、IgG2、IgG
3、IgG4）であり、好ましくはIgG1、IgG2またはIgG4で
あり、特に好ましくはIgG4である。
【００４２】本発明のヒトモノクローナル抗体は、後述
するヒト抗体産生トランスジェニックマウスのようなヒ
ト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に前述の
（イ）乃至（ヘ）のいずれかの免疫原（抗原）を免疫
し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従
って製造することができる。即ち、例えば、該抗原を、
必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuv
ant）とともに、該ヒト抗体産生トランスジェニック非
ヒト哺乳動物に免疫する。ポリクローナル抗体は、該免
疫感作動物から得た血清から取得することができる。ま
たモノクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗
体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエ
ローマ細胞）から融合細胞（ハイブリドーマ）を調製
し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫
に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナ
ル抗体を産生するクローンを選択することによって製造
される。
【００４３】さらに具体的には下記のようにして製造す
ることができる。即ち、前述の（イ）乃至（ハ）のいず
れかの免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント
（Freund's Adjuvant）とともに、該ヒト抗体産生トラ
ンスジェニック非ヒト哺乳動物（特に好ましくは後述の
「ヒト抗体産生トランスジェニックマウス」）の皮下
内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に
１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫
感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１
乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に
免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得され
る。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用す
る免疫原の性質などにより、適宜変更することができ
る。
【００４４】ヒトモノクローナル抗体を分泌する融合細
胞（ハイブリドーマ）の調製は、ケーラー及びミルシュ
タインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975）
及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。
即ち、前述の如く免疫感作されたヒト抗体産生トランス
ジェニック非ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ
節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗
体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモッ
ト、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より
好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産
生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることによ
り調製される。
【００４５】細胞融合に用いられるミエローマ細胞とし
ては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（AT
CC No. CRL-1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（ＮＳ−１）、P3/
X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/O,Sp2）、PAI、
F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.
2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-
2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用す
ることができる。モノクローナル抗体を産生する細胞
（例えば、ハイブリドーマ）のスクリーニングは、該細
胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増
殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用い
た免疫抗原に対する反応性を、例えばRIA（radio immun
oassay）やELISA（enzyme-linked immuno-solvent assa
y）等の酵素免疫測定法によって測定することにより行
なうことができる。
【００４６】ハイブリドーマからのモノクローナル抗体
の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウ
ス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、
好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウス
の腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、ま
たは哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが
できる。
【００４７】また、該ハイブリドーマあるいは後述する
遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する本発明
の「遺伝子組換え細胞」からモノクローナル抗体をコー
ドする遺伝子をクローニングし、トランスジェニック動
物作製技術を用いて当該遺伝子が内在性遺伝子に組み込
まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたは
ブタを作製し、当該トランスジェニック動物のミルク中
から当該ヒトモノクローナル抗体遺伝子に由来するモノ
クローナル抗体を大量に取得することも可能である（日
系サイエンス、1997年４月号、第７８頁乃至８４頁）。
該モノクローナル抗体産生細胞をインビトロで培養する
場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び
培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増
殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗
体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あ
るいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養
培地を用いて実施することが可能である。
【００４８】基本培地としては、例えば、Ham'F12培
地、MCDB153培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カ
ルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培地、R
PMI1640培地、ASF104培地あるいはＲＤ培地等の高カル
シウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じ
て、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または
種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あ
るいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン
沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換ク
ロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロ
ブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニ
ティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行
うことができる。
【００４９】本発明のヒトモノクローナル抗体には、該
抗体を構成する重鎖及び／または軽鎖の各々のアミノ酸
配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／また
は軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体も包含される。
【００５０】ここで、「数個のアミノ酸」とは、複数個
のアミノ酸を意味し、具体的には１乃至１０個のアミノ
酸であり、好ましくは１乃至５個のアミノ酸である。本
発明のヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列中に、前
記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、
付加）は、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を部分
的に改変することにより導入することができる。この塩
基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法
（Site specific mutagenesis ）を用いて常法により導
入することができる（Proc. Natl. Acsd. Sci. USA, Vo
l.81, p.5662-5666, 1984）。
【００５１】本発明における「ヒト抗体産生トランスジ
ェニック非ヒト哺乳動物」、特に好ましい態様であるヒ
ト抗体産生トランスジェニックマウスは、既報に従って
作製することができる（Nature Genetics, Vol.7, p.13
-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 199
7；特表平4-504365号公報；特表平7-509137号公報；日
経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５
年；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Natur
e, Vol.368, p.856-859, 1994；及び特表平６−５００
２３３号公報など）。該ヒト抗体産生トランスジェニッ
クマウスは、具体的には、例えば下記の工程からなる手
法を用いることにより作製できる。他のヒト抗体産生ト
ランスジェニック非ヒト哺乳動物も同様にして製造する
ことができる。
【００５２】（１）マウス内在性イムノグロブリン重鎖
遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性
マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換
することにより該マウス内在性イムノグロブリン重鎖遺
伝子が機能的に不活性化されたノックアウトマウスを作
製する工程。 （２）マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子座の少
なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝
子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換することによ
り該マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子（特にκ
鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックアウトマウ
スを作製する工程。 （３）酵母人工染色体（Yeast artificial chromosome,
YAC）ベクター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬
可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝
子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトラ
ンスジェニックマウスを作製する工程。 （４）YAC等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能
なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特にκ
鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込ま
れたトランスジェニックマウスを作製する工程。 （５）前記（１）乃至（４）のノックアウトマウス及び
トランスジェニックマウスを任意の順序で交配すること
により、マウス内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び
マウス内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がともに機能
的に不活性化され、且つヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子
座の所望の領域及ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の所
望の領域がともにマウス染色体上に組み込まれたトラン
スジェニックマウスを作製する工程。
【００５３】前記ノックアウトマウスは、マウス内在性
イムノグロブリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカ
ー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で相同組換え
により置換することにより該遺伝子座が再構成（リアレ
ンジメント）できないように不活性化することにより作
製できる。該相同組換えを用いた不活性化には、例え
ば、ポジティブ・ネガティブ・セレクション（Positive
Negative Selection; PNS）と呼称される方法を用いる
ことができる（日経サイエンス, ５月号, p.52-62, 199
4）。イムノグロブリン重鎖遺伝子座の機能的不活性化
には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）
の一部に障害を導入することにより達成できる。またイ
ムノグロブリン軽鎖（例えばκ鎖）に機能的不活性化
は、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領
域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入す
ることにより達成可能である。
【００５４】トランスジェニックマウスは、トランスジ
ェニック動物の製造において通常使用されるような常法
（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・
シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年
を参照）に従って作製することが可能である。具体的に
は、例えば、正常マウス胚盤胞（blastcyst）に由来す
るHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボ
シルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ＥＳ細胞
（embryonic stem cell）を、該ヒトイムノグロブリン
重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子ま
たはその一部並びにHPRT遺伝子が挿入されたYACベクタ
ーを含む酵母とスフェロプラスト融合法により融合す
る。該外来性遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグ
レートされたＥＳ細胞をHATセレクション法により選別
する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスか
ら取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクショ
ンする（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12,
pp.7380-7384, 1980；米国特許第4,873,191号公報）。
該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植す
る。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニ
ックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマ
ウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトラン
スジェニックマウスを得る。該ヘテロ（heterogeneic）
トランスジェニックマウス同士を交配することにより、
メンデルの法則に従って、ホモ（homogeneic）トランス
ジェニックマウスが得られる。
【００５５】本発明における「モノクローナル抗体の一
部」とは、前述の本発明のヒトモノクローナル抗体の一
部分の領域を意味し、具体的にはF(ab')2、Fab'、Fab、
Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄ
ｓＦｖ（disulphide stabilised Fv）あるいはｄＡｂ
（single domain antibody）等が挙げられる（エキスパ
ート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテン
ツ(Exp. Opin. Ther. Patents)，第６巻，第５号，第44
1〜456頁，1996年）。
【００５６】ここで、「F(ab')2」及び「Fab'」とは、
イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解
酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理すること
により製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在す
るジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体
フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで
処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジ
スルフィド結合の上流で切断されてＶL（Ｌ鎖可変領
域）とＣL（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶ H（Ｈ
鎖可変領域）とＣHγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）と
からなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド
結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製
造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメ
ントを各々Fab'という。またＩｇＧをペプシンで処理す
ると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフ
ィド結合の下流で切断されて前記２つのFab'がヒンジ領
域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを
製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')
2という。
【００５７】本発明の「モノクローナル抗体を産生する
細胞」あるいは遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を
産生する本発明の「遺伝子組換え細胞」とは、前述した
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生する任意の細胞
を意味する。具体的には、例えば、下記（１）乃至
（３）のいずれかに記載される細胞を挙げることができ
るがこの限りではない。 （１）前記で定義した免疫原（抗原）を前述のヒト抗体
産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫すること
により得られ、該被免疫動物から採取され得るヒトモノ
クローナル抗体産生Ｂ細胞。 （２）そのようにして得られたヒトモノクローナル抗体
産生Ｂ細胞を哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合
して得られる前述の融合細胞（ハイブリドーマ）。 （３）該ヒトモノクローナル抗体産生Ｂ細胞またはヒト
モノクローナル抗体産生融合細胞（ハイブリドーマ）か
ら単離される該ヒトモノクローナル抗体をコードする遺
伝子（重鎖をコードする遺伝子若しくは軽鎖をコードす
る遺伝子のいずれか一方、または両方の遺伝子）で、該
Ｂ細胞及びハイブリドーマ以外の細胞（例えば、CHO（C
hinese hamster ovarian）細胞）、BHK（Baby hamster
kydney）細胞など）を形質転換して得られる遺伝子組換
えヒトモノクローナル抗体を産生する遺伝子組換え細
胞。 ここで、前記（３）に記載の遺伝子組換えヒトモノクロ
ーナル抗体を産生する遺伝子組換え細胞は、即ち、前記
（１）のＢ細胞または（２）のハイブリドーマが産生す
るヒトモノクローナル抗体の遺伝子組換え体を産生する
遺伝子組換え細胞を意味する。
【００５８】本発明を構成する「物質」、具体的には
「ヒトTGF-βII型受容体に結合し該受容体を介する細胞
内へのシグナル伝達を抑制または阻害する能力を有する
物質」には、自然界に存在する天然の物質あるいは人工
的に調製される任意の物質を意味する。また、該物質に
は、ヒトTGF-βII型受容体への結合において、該受容体
の生体内リガンドであるTGF-βと競合する任意の物質が
包含される。該物質は、「蛋白性物質」と「非蛋白性物
質」に大別することができる。
【００５９】該「蛋白性物質」としては、ポリペプチ
ド、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または
該モノクローナル抗体の一部が挙げられる。該物質が抗
体である場合には、好ましくはモノクローナル抗体であ
る。該物質がモノクローナル抗体である場合には、非ヒ
ト哺乳動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、組換
えキメラモノクローナル抗体、組換えヒト型モノクロー
ナル抗体、及び前述の「ヒトモノクローナル抗体」が包
含される。
【００６０】該物質が、抗体以外のポリペプチドである
場合には、任意のポリペプチド、該ポリペプチドの断片
（オリゴペプチド）、融合ポリペプチド、及びそれらい
ずれかの化学修飾体が包含される。オリゴペプチドとし
ては、５乃至３０個のアミノ酸、好ましくは５乃至２０
個のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。
該化学修飾は、生体に投与された場合の血中半減期の増
大あるいは経口投与時における消化管での分解に対する
耐性若しくは吸収性の増大の目的等の種々の目的に応じ
て設計することができる。
【００６１】「非蛋白性物質」としては、化学的に合成
された任意の化合物あるいは動植物（例えば、植物、微
生物、細菌、昆虫、魚類、甲殻類など）から単離される
任意の化学物質を挙げることができる。具体的には、分
子量約100乃至約1000以下の化合物、好ましくは分子量
約100乃至約800の化合物であり、より好ましくは分子量
約100乃至約600の化合物を挙げることができる。
【００６２】本発明における「医薬組成物」は、有効成
分としての本発明のヒトTGF-βII型受容体に結合するヒ
トモノクローナル抗体若しくはその一部、あるいは前述
の「ヒトTGF-βII型受容体に結合し該受容体を介する細
胞内へのシグナル伝達を抑制または阻害する能力を有す
る物質」と「薬学的に許容され得る担体」とからなる医
薬品として有用な組成物を意味する。ここで「薬学的に
許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩
壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色
剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその
他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上
を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射
剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁
剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調
製することができる。これらの医薬組成物は、経口ある
いは非経口的に投与することができる。非経口投与のた
めのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性
物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投
与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【００６３】投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症
状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組
成物に含有される活性成分（前記タンパクや抗体など）
の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回
につき10μgから1000mg（あるいは10μgから500mg）の
範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は
種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない
量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量
が必要な場合もある。とりわけ注射剤の場合には、例え
ば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の
薬学的に許容され得る担体中に0.1μg抗体／ml担体〜10
mg抗体／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁する
ことにより製造することができる。
【００６４】このようにして製造された注射剤は、処置
を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋ
ｇ体重あたり、１μg〜100mgの割合で、好ましくは50μ
g〜50mgの割合で、１日あたり１回〜数回投与すること
ができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注
射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような
医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内
注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希
釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブ油のような植物油、エタノールのよう
なアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調
製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バ
クテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合
または照射により行うことができる。注射剤は、用時調
製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥
法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の
注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することが
できる。
【００６５】本発明の医薬組成物は、種々の病態及び疾
患の発症に関与するTGF-βのシグナルのTGF-βII型受容
体を介する細胞内への伝達を阻害するために有用であ
る。さらには、本発明の医薬組成物は、TGF-βの作用に
起因する種々の疾患、例えば、腎疾患（腎繊維症、腎
炎、腎不全、腎硬化症など）、肺疾患（例えば、肺線維
症、肺炎など）、肝臓疾患（例えば、肝臓組織繊維症、
肝硬変、肝炎など）、皮膚疾患（例えば、創傷、強皮
症、、乾癬、ケロイドなど）、関節炎（例えば、慢性関
節リウマチ、変形性関節症など）、血管疾患（例えば、
血管再狭窄、リウマチ性血管炎など）、種々臓器での組
織繊維症（種々の癌で併発する組織線維症を含む）、及
び動脈硬化症（併発する組織繊維症を含む）などの発症
及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を治療または
予防するための医薬品として有用である。とりわけ、本
発明のヒトモノクローナル抗体あるいはその医薬組成物
は、ヒト由来のモノクローナル抗体からなることから、
HAMA（human anti-mouse antibody）に起因する宿主の
免疫拒絶反応を惹起することなく、抗体医薬品として極
めて有用である。
【００６６】また、本発明の医薬組成物の種々疾患症状
の治療効果については、常法に従って、既知の疾患モデ
ル動物に投与することにより試験、検討することができ
る。例えば、組織繊維症の一つであり、また腎臓疾患の
１つでもある腎繊維症の治療効果の検討の場合には、マ
ウスの一方の尿管を結紮し腎臓の血液等のろ過機能を停
止させることにより腎機能不全を惹起させたモデルマウ
ス（UUOモデル、Unilateral ureteral obstruction）
に、本発明の医薬組成物を投与し、該腎機能不全により
惹起される腎炎及び腎繊維症の発症の指標であるヒドロ
キシプロリンの生成の上昇を抑制する程度を測定する方
法を用いることができる。該ヒドロキシプロリンの濃度
の低減は、該医薬組成物が該腎臓疾患の治療に有効であ
ることを示すものである。さらに別の方法としては、ラ
ットに細胞表面マーカーであるThy-1に対する抗体を投
与することにより誘発した腎炎モデルラットに、本発明
の医薬組成物を投与し、該腎機能不全により惹起される
腎炎及び腎繊維症の発症の指標である尿中に排泄される
蛋白量、血清中のクレアチニン量、細胞外マトリックス
（フィブロネクチン、I型コラーゲンなど）の産生の低
減の程度を測定する方法用いることができる（Nephron,
Vol.78, p.453-463, 1998; Kidney Blood Press Res.,
Vol.22, p.5-12, 1999）。該尿蛋白量、血清クレアチ
ニン量、フィブロネクチンあるいはI型コラーゲンの低
減は、該医薬組成物が該腎臓疾患の治療に有効であるこ
とを示すものである。
【００６７】腎疾患、例えば、微小糸球体異常（例え
ば、ネフローゼ型微小変化群（MCNS)）、巣状糸球体硬
化症（FGS）、膜性糸球体腎炎（膜性腎症、MN)、IgA腎
症、メサンギウム増殖性腎炎、溶連菌感染後急性糸球体
腎炎（APSGN）、半月体形成性（管外性）腎炎、間質性
腎炎、あるいは急性腎不全などについては、既報に詳述
されるモデル動物を用いることができる（「疾患別モデ
ル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、p.34
-46、1993、技術情報協会（発行））。皮膚疾患、例え
ば、創傷、ケロイド、アトピー、皮膚炎、強皮症あるい
は乾癬などについては、既報に詳述されるモデル動物を
用いることができる（「疾患別モデル動物の作製と新薬
開発のための試験・実験法」、p.229-235、1993、技術
情報協会（発行））。
【００６８】肝臓疾患、例えば、肝炎（例えば、ウイル
ス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型など）など）、肝硬
変あるいは薬物肝障害などについては、既報に詳述され
るモデル動物を用いることができる（「疾患別モデル動
物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、p.119-12
9及びp.349-358、1993、技術情報協会（発行））。例え
ば、動脈硬化症及び血管再狭窄への効果の検討の場合に
は、ラット大動脈にバルーンカテーテルを挿入しPTCAを
施し疑似的に作成した再狭窄モデルを使用することがで
きる。
【００６９】本発明において用いられるヒトTGF-βII型
受容体をコードするDNAは、常法に従って、該ヒトTGF-
βII型受容体をコードするmRNAからcDNAをクローン化す
る方法、ゲノムDNAを単離してスプライシング処理する
方法、該cDNA配列若しくはmRNA配列を鋳型としてPCRに
より調製する方法、または化学合成する方法等により取
得することができる。本発明のヒトTGF-βII型受容体を
コードするDNAは、そのようにして調製した該ヒトTGF-
βII型受容体をコードする各々のDNAを適切な制限酵素
による切断（消化）し、得られたDNA断片を、必要に応
じてリンカーDNAあるいはタグ（Tag）と共に、適切なDN
Aポリメラーゼ等を用いて連結することにより調製する
ことができる。
【００７０】該ヒトTGF-βII型受容体（以下、目的蛋白
という）をコードするｃDNAをmRNAからクローン化する
方法としては、以下の方法が例示される。まず、目的蛋
白を発現・産生する組織あるいは細胞から目的蛋白をコ
ードするmRNAを調製する。mRNAの調製は、例えばグアニ
ジンチオシアネート法（Biochemistry, Vol.18, p.529
4, 1979）、熱フェノール法もしくはAGPC法等の公知の
方法を用いて調製した全RNAをオリゴ（dT）セルロース
やポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマト
グラフィーにかけることによって行うことができる。次
いで得られたmRNAを鋳型として、例えば逆転写酵素を用
いる等の公知の方法、例えばオカヤマらの方法（Mol. C
ell. Biol., Vol.2, p.161, 1982及び同誌 Vol.3, p.28
0, 1983）やホフマン（Hoffman）らの方法（Gene, Vol.
25, p.263, 1983）等によりｃDNA鎖を合成し、ｃDNAの
二本鎖ｃDNAへの変換を行う。このｃDNAをプラスミドベ
クター、ファージベクターまたはコスミドベクターに組
み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパ
ッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェク
ト）することによりｃDNAライブラリーを作製する。
【００７１】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてpUC19、λgt10、λgt11等
が例示される。ただし、後述の免疫学的スクリーニング
に供する場合は、宿主内で目的蛋白をコードする遺伝子
を発現させうるプロモーターを有したベクターであるこ
とが好ましい。プラスミドにｃDNAを組み込む方法とし
ては、例えばマニアティス（Maniatis）らの方法（Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, second editio
n, ColdSpring Harbor Laboratory, p.1.53, 1989）に
記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクター
にｃDNAを組み込む方法としては、ヒュン（Hyunh）らの
方法（DNA Cloning, a practical approach, Vol.1, p.
49, 1985）などが挙げられる。簡便には、市販のクロー
ニングキット（例えば、宝酒造社製等）を用いることも
できる。このようにして得られる組換えプラスミドやフ
ァージベクターは、原核細胞（例えば、E.coli：HB101,
DH5α, Y1090, DH10BまたはMC1061/P3等）等の適当な
宿主に導入する。
【００７２】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, seco
nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.74,
1989）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウ
ム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が
挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する
方法としてはファージDNAをインビトロパッケージング
した後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示され
る。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパ
ッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製、ア
マシャム社製等）を用いることによって簡便に行うこと
ができる。上記の方法によって作製されたｃDNAライブ
ラリーから、目的蛋白をコードするｃDNAを単離する方
法は、一般的なｃDNAスクリーニング法を組み合わせる
ことによって行うことができる。
【００７３】例えば、別個に目的蛋白のアミノ酸配列に
対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成し
たのち、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知
のコロニーハイブリダイゼーション法（クランシュタイ
ン（Crunstein）ら、Proc. Natl. Acid. Sci. USA, Vo
l.72, p.3961, 1975）またはプラークハイブリダイゼー
ション法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
second edition , Cold Spring Harbor Laboratory、p.
2.108, 1989）により、目的のｃDNAを含有するクローン
をスクリーニングする方法、PCRプライマーを作製し目
的蛋白の特定領域をPCR法により増幅し、該領域をコー
ドするDNA断片を有するクローンを選択する方法等が挙
げられる。
【００７４】また、ｃDNAを発現しうるベクター（例え
ば、λgt11等のファージベクター）を用いて作製したｃ
DNAライブラリーを用いる場合には、目的蛋白に反応性
を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的の
クローンを選択することができる。大量にクローンを処
理する場合には、PCR法を利用したスクリーニング法を
用いることが好ましい。この様にして得られたDNAの塩
基配列はマキサム・ギルバート法（マキサム（Maxam）
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol74, p.560, 197
7）あるいはファージM13を用いたジデオキシヌクレオチ
ド合成鎖停止の方法（サンガー（Sanger）ら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA., Vol.74, p.5463-5467, 1977）に
よって決定することができる。目的蛋白をコードする遺
伝子は、その全部または一部を上記のようにして得られ
るクローンから制限酵素等により切り出すことにより取
得できる。
【００７５】また、前述のような目的蛋白を発現する細
胞に由来するゲノムDNAから目的蛋白をコードするDNAを
単離することによる調製方法としては、例えば以下の方
法が例示される。該細胞を好ましくはSDSまたはプロテ
ナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反
復してDNAの脱蛋白質を行う。RNAを好ましくはリボヌク
レアーゼにより消化する。得られるDNAを適当な制限酵
素により部分消化し、得られるDNA断片を適当なファー
ジまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そ
して目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識
されたDNAプローブを用いる方法等により検出し、該ク
ローンから目的蛋白をコードする遺伝子の全部または一
部を制限酵素等により切り出し取得する。
【００７６】目的蛋白をコードするDNAのPCRによる調製
は、該目的蛋白の既知のmRNAまたはｃDNA等を鋳型とし
て常法により調製することができる（「遺伝子増幅ＰＣ
Ｒ法・基礎と新しい展開」、共立出版株式会社発行、19
92年など）。また、化学的合成による目的蛋白をコード
するDNAの製造は、目的蛋白の塩基配列をもとにして、
常法に従って行うことができる。
【００７７】本発明のヒトTGF-βII型受容体またはその
一部（好ましくは細胞外領域）は、上述に例示した方法
を用いて調製したヒトTGF-βII型受容体をコードするDN
A（ｃDNAあるいはイントロンを含むゲノミックDNA）
を、各々適切な制限酵素で切断することにより、該ヒト
TGF-βII型受容体コードするDNA断片を得、それらの断
片を、必要に応じてリンカーDNAあるいはタグ（Tag）と
共に、適切なDNAポリメラーゼ等を用いて連結させて得
たDNAを用いて、慣用される遺伝子組換え技術を用い
て、常法により組換え蛋白として調製することができ
る。具体的には下記の例示されるとおりである。即ち、
上述のようにして調製したDNAを、下記に詳述するよう
なベクターに挿入して発現ベクターを作成し、該発現ベ
クターで後述するような宿主細胞を形質転換して形質転
換体を得る。該形質転換体を培養することにより、培養
上清中に該目的蛋白を産生させる。培養上清中の該目的
蛋白は、カラムクロマトグラフィー等を用いて容易に精
製することができる。
【００７８】組換えヒトTGF-βII型受容体（またはその
細胞外領域）を製造するために用いられる発現ベクタ
ー、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複
製保持または自己増殖できるものであれば特に制限され
ず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含
される（Cloning Vectors: A Laboratory Manual, エル
スビュ−社、ニューヨーク、1985年）。当該発現ベクタ
ーは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベク
ター（プラスミドDNAおよびバクテリアファージDNA）に
ヒトTGF-βII型受容体（またはその細胞がい領域）をコ
ードするDNAを常法により連結することによって調製す
ることができる。用いられる組換え用ベクターとして具
体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR32
2、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など、酵母由来プラス
ミドとして例えばpSH19、pSH15など、枯草菌由来プラス
ミドとして例えばpUB110、pTP5、pC194などが例示され
る。また、ファージとしては、λファージなどのバクテ
リオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウ
イルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス
（pVL1393、インビトロゲン社製）が例示される。
【００７９】本発明のヒトTGF-βII型受容体またはその
可溶性細胞外領域をコードするDNAを発現させヒトTGF-
βII型受容体を宿主細胞表面に発現させ、またはヒトTG
F-βII型受容体の可溶性細胞外領域を生産させる目的に
おいては、プラスミドベクターが有用である。プラスミ
ドベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞
の各種の宿主細胞中で該ヒトTGF-βII型受容体またはそ
の可溶性細胞外領域をコードする遺伝子を発現し、これ
らのポリペプチドを生産する機能を有するものであれば
特に制限されない。例えば、pMAL C2、pcDNA3.1(-)、pE
F-BOS（NucleicAcid Research, Vol.18, p.5322, 1990
など）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハン
ドブック」、1992年等）等を挙げることができる。
【００８０】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる
場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−
オペレーター領域、開始コドン、本発明のタンパクをコ
ードするDNA、終止コドン、ターミネーター領域および
複製可能単位から構成される。宿主として酵母、動物細
胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なく
ともプロモーター、開始コドン、本発明のヒトTGF-βII
型受容体（またはその細胞外領域）コードするDNA、終
止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペ
プチドをコードするDNA、エンハンサー配列、本発明の
ヒトTGF-βII型受容体をコードする遺伝子の５’側およ
び３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリア
デニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能
単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常
用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいて
もよい。
【００８１】細菌中で本発明のヒトTGF-βII型受容体
（またはその細胞外領域）を発現させるためのプロモー
ター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペレータ
ーおよびShine-Dalgarno(SD)配列（例えば、AAGGなど）
を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場
合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモーター、recA
プロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、t
acプロモーターなどを含むものが例示される。酵母中で
本発明のヒトTGF-βII型受容体（またはその細胞外領
域）を発現させるためのプロモーターとしては、PH05プ
ロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH
プロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合
は、SL01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモ
ーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等
の真核細胞である場合、例えばSV40由来のプロモータ
ー、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプ
ロモーターなどが挙げられる。しかし、特にこれらに限
定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの
利用も効果的な方法である。
【００８２】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ATG）が例示される。終止コドンとしては、常用
の終止コドン（例えば、TAG,TAA,TGA）が例示される。
ターミネーター領域としては、通常用いられる天然また
は合成のターミネーターを用いることができる。複製可
能単位とは、宿主細胞中でその全DNA配列を複製するこ
とができる能力をもつDNAを言い、天然のプラスミド、
人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから
調製されたDNAフラグメント）および合成プラスミド等
が含まれる。好適なプラスミドとしては、E.coliではプ
ラスミドpBR322、もしくはその人工的修飾物（pBR322を
適当な制限酵素で処理して得られるDNAフラグメント）
が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体
DNAが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC
37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpd
BPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 3714
9、プラスミドpSV2bsr等があげられる。エンハンサー配
列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接
合部位については、例えばそれぞれSV40に由来するもの
等、当業者において通常使用されるものを用いることが
できる。
【００８３】選択マーカーとしては、通常使用されるも
のを常法により用いることができる。例えばテトラサイ
クリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物
質耐性遺伝子等が例示される。遺伝子増幅遺伝子として
は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、チミジ
ンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミ
ン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、
オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン
−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラー
トトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することがで
きる。
【００８４】本発明の発現ベクターは、少なくとも、上
述のプロモーター、開始コドン、本発明のタンパクをコ
ードするDNA、終止コドンおよびターミネーター領域を
連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することに
よって調製することができる。またこの際、所望により
制限酵素での消化やＴ４DNAリガーゼを用いるライゲー
ション等の常法により適当なDNAフラグメント（例え
ば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることが
できる。本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベクター
を宿主細胞に導入することにより調製することができ
る。
【００８５】本発明で用いられる宿主細胞としては、前
記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであ
れば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使
用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細
胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、
バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属
など）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には
大腸菌（DH5α、DH10B、TB1、HB101、XL-2Blue等）、マ
ウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、C127、Sp2/0、NS-1またはN
IH3T3等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞（BHK
およびCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1
及びVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、２倍体線維芽
細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびNamalwa
等）などが例示される。発現ベクターの宿主細胞への導
入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて
行うことができる。
【００８６】例えば、細菌（E.coli、Bacillus subtili
s等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1972）、プロトプラ
スト法（Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979）や
コンピテント法（J. Mol. Biol., Vol.56, p.209, 197
1）によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例
えばハイネン（Hinnen）らの方法（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978）やリチウム法（J.
Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983）によって、動物細
胞の場合は、例えばグラハム（Graham）の方法（Virolo
gy, Vol.52, p.456, 1973）、昆虫細胞の場合は、例え
ばサマーズ（Summers）らの方法（Mol. Cell. Biol., V
ol.3, p.2156-2165, 1983）によってそれぞれ形質転換
することができる。
【００８７】本発明のヒトTGF-βII型受容体の細胞外領
域（可溶性ヒトTGF-βII型受容体）は、上記の如く調製
される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移
入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養す
ることによって製造することができる。栄養培地は、宿
主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素
源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素
源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性
デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素
源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミ
ノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、
肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示され
る。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例え
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイ
クリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン
等）など）を含んでいてもよい。培養は当業界において
知られている方法により行われる。培養条件、例えば温
度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明のタンパクが
大量に生産されるように適宜選択される。
【００８８】なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる
具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれら
に限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵
母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液
体培地が適当である。好ましくは、pHが５〜８である培
地である。宿主がE.coliの場合、好ましい培地としてＬ
Ｂ培地、Ｍ９培地（ミラー（Miller）ら、Exp. Mol. Ge
net、Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 197
2）、ＹＴ培地等が例示される。かかる場合、培養は、
必要により通気、撹拌しながら、通常14〜43℃、約３〜
24時間行うことができる。
【００８９】宿主がBacillus属菌の場合、必要により通
気、撹拌をしながら、通常30〜40℃、約16〜96時間行う
ことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例
えばBurkholder最小培（ボスチアン（Bostian）、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980）が挙
げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通
常約20〜35℃で約14〜144時間行なわれ、必要により通
気や撹拌を行うこともできる。宿主が動物細胞の場合、
培地として例えば約５〜20%の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地（Science, Vol.122, p.501, 1952）、DMEM培地（V
irology, Vol.8, p.396, 1959）、RPMI1640培地（J. A
m. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967）、１９９培地
（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 195
0）、HamF12培地等を用いることができる。培地のｐＨ
は約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約30〜40℃
で約15〜72時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行う
こともできる。
【００９０】宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清
を含むGrace's培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo
l.82, p.8404, 1985）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜
８であるのが好ましい。培養は通常約20〜40℃で15〜10
0時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともで
きる。本発明のヒトTGF-βII型受容体の細胞該領域（可
溶性ヒトTGF-βII型受容体）は、上述のような形質転換
細胞（特に動物細胞または大腸菌）を培養することによ
り、培養上清中に分泌させることにより製造することが
できる。即ち、得られた培養物を濾過または遠心分離等
の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然ま
たは合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用い
られる常法に従って目的蛋白を精製、単離する。
【００９１】単離、精製方法としては、例えばアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する
方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利
用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎
水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点
の差を利用する方法などが挙げられる。
【００９２】一方、目的蛋白が培養された形質転換体の
ペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物
を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体あるいは
細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリ
ゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁およ
び／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの
方法で目的蛋白を含有する膜画分を得る。該膜画分をト
ライトン−X100等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶
液を得る。そして、当該粗溶液を先に例示したような常
法を用いることにより、単離、精製することができる。
【００９３】
【実施例】以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限
定されるものではないことは言うまでもない。なお、以
下の実施例においては、「TGF-βII型受容体」を「TβR
II」と称する場合もある。
【００９４】実施例１ サンドイッチELISAによるヒト
可溶性TβRIIの定量法の確立 <1-1> 組換えヒト可溶性TβRII定量のためのサンドイ
ッチELISA系の確立 ヤギ抗ヒトTβRIIポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を
リン酸緩衝液で希釈し、0.1μg／50μl／wellの濃度
で、ELISA用96穴マイクロプレート（Corning社製）の各
ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし該ポリク
ローナル抗体をプレートに吸着させた。
【００９５】プレ−トをリン酸緩衝液で洗浄した後、各
ウェルに3％ウシ血清アルブミン（bovine serum albumi
n、BSA）を含有するリン酸緩衝液（200μl／well）を加
え、室温で２時間インキュベーションすることにより抗
体が結合していない部位をブロックした。次いで、プレ
ートをリン酸緩衝液で３回洗浄した。抗体を固定化した
マイクロプレートの各ウェルに、測定試料（50μl／wel
l）を加え、室温で１時間インキュベートした。次い
で、マイクロプレートを、0.1%Tween20を含有するリン
酸緩衝液で３回洗浄後、各ウェルに、1%BSA、0.1% Twee
n20を含有するリン酸緩衝液で希釈したビオチン標識ヤ
ギ抗ヒトTβRIIポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を0.
025μg／50μl／wellの濃度で加え、室温下で１時間イ
ンキュベートした。
【００９６】次いでマイクロプレートを、0.1% Tween20
を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、0.5MのNaClと20
mMのHEPESからなる溶液（1mg/mlのBSAを含有、pH7.0）
で2000倍に希釈したストレプトアビジン−β−ガラクト
シダーゼ（Streptoavidin-β-galactosidase、50μl、G
IBCO BRL社製）を各ウェルに加え、室温下で３０分間イ
ンキュベートした。
【００９７】マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有
するリン酸緩衝液で３回洗浄後、100mMのNaCl、1mMのMg
Cl2及び10mMのリン酸緩衝液（Na及びKを含有）からなる
溶液（1mg／mlのBSAを含有、pH7.0）で希釈した1%の４
−メチル−ウンベリフェリル−β−D−ガラクトシド（4
-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside、50μl、シグ
マ（Sigma）社製）を各ウェルに加え、室温下で１５分
間インキュベートした。各ウェルに、1MのNa2CO3（100
μl）を加え、反応を止めた。波長460nm（励起：355n
m）での蛍光強度をフルオロスキャンIIマイクロプレー
トフルオロメーター（Fluoroscan II microplate fluor
ometer、ラボシステムズ（Labsystems Inc.）社製）で
測定した。測定試料中の組換えヒト可溶性TβRII量を、
下記実施例で作成した検量線から求めた。
【００９８】<1-2> 検量線の作成 市販の組換えヒト可溶性TβRII（R＆D社製）を標準物質
（スタンダード）として用い、実施例<1-1>で確立した
サンドイッチELISAにより検量線を作成した。結果を図
１に示す。極めて低濃度である0.1ng/ml〜100ng/mlの濃
度範囲で有意差を持った検量線が得られた。
【００９９】実施例２ 組換えヒト可溶性TβRIIの調製 ヒトTβRIIの細胞外領域（第1乃至第159番目のアミノ酸
配列、配列番号２）をコードするcDNA（配列番号１）を
PCR法を用いて常法により調製した。具体的には、ヒト
腎臓から取得したmRNAから調製したcDNAを鋳型とし、ヒ
トTβRIIのcDNA（Cell, Vol.68, p.775-758, 1992；Gen
Bank Accession No.:M85079）を基に設計したプライマ
ーを用いて常法に従ってPCRにより合成した。
【０１００】得られた翻訳領域を含むヒトTβRIIのcDNA
をプラスミドｐEF-BOS（特開平2-242687号公報）に挿入
し発現ベクターを作成した。エレクトロポレ−ションに
より、該ベクターでヒト腎臓由来線維芽細胞株HEK293
（ATCC CRL-1573）を形質転換した。形質転換細胞を、
無血清培地ASF104（味の素社製）中で４日間培養し、組
換えヒト可溶性TβRIIを一過性に発現させた。ヒト可溶
性TβRIIの発現は、抗ヒト可溶性TβRIIポリクローナル
抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を用いたウェスタンブロッティング
により確認した。
【０１０１】培養上清を回収し、濃縮後、抗ヒト可溶性
TβRIIポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を用いたカラ
ムクロマトグラフィーに供した。得られた溶出液をリン
酸緩衝液で洗浄した後、0.1MのGlycine-HCl（pH2.5）で
溶出、2Ｍ Tris-HCl（pH8.83）で中和し、精製ヒト可溶
性TβRII画分を得た。抗ヒト可溶性TβRIIポリクローナ
ル抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を用いたウェスタンブロッティン
グにより、ヒト可溶性TβRIIが精製されたことを確認し
た。結果を図２に示す。この精製ヒト可溶性TβRIIの量
は、実施例１で確立したサンドイッチELISA法により定
量した。
【０１０２】実施例３ 精製ヒトTβRIIのTGF-β1への
結合活性の試験 実施例２で調製した精製ヒト可溶性TβRIIのヒトTGF-β
１との結合活性を以下のように試験した。組換えヒト可
溶性TβRII（0.2μｇ／well）を、ELISA用96穴マイクロ
プレート（Corning社製）の各ウェルに加え、室温で２
時間インキュベートし、組換えヒト可溶性TβRIIをマイ
クロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウ
ェルに、ブロッキング試薬（200μｌ、３％BSA含有リン
酸緩衝液）を加え室温で２時間インキュベートし、TβR
IIが結合していない部位をブロックした。各ウェルを、
0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液（200μl）で３
回洗浄した。このようにして、各ウェルを組換えヒト可
溶性TβRIIでコーティングしたマイクロプレートを作製
した。
【０１０３】各ウェルに、各種濃度（100、50、25、12.
5、6.3及び3.1ng/ml）のヒトTGF-β1（Ｒ＆Ｄ社製）を
添加して、１時間反応させた後、各ウェルを、0.1%のTw
een20を含有するリン酸緩衝液（200μl）で３回洗浄し
た。ビオチンで標識したヤギ抗ヒトTGF-β1抗体（50μ
l、Ｒ＆Ｄ社製）を加え、室温下で１時間インキュベー
トした。
【０１０４】マイクロプレートを、0.1%Tween20を含有
するリン酸緩衝液で洗浄後、1mg/mlのBSAを含有する0.5
MのNaClと20mMのHEPESからなる溶液（pH7.0）で2000倍
に希釈したストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ
（Streptoavidin-β-galactosidase、50μl、GIBCO BRL
社製）を各ウェルに加え、室温下で30分間インキュベー
トした。
【０１０５】次いで、マイクロプレートを、0.1%Tween2
0を含有するリン酸緩衝液で洗浄後、1mg/mlのBSAを含有
する100mMのNaCl、1mMのMgCl2及び10mMのリン酸緩衝液
からなる溶液（pH7.0）で希釈した１％の４−メチル−
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（4-Methyl-u
mbelliferyl-β-D-galactoside、50μl、シグマ（Sigm
a）社製）を各ウェルに加え、室温下で10分間インキュ
ベートした。各ウェルに、1MのNa2CO3（100μl）を加
え、反応を止めた。波長460nm（励起：355nm）での蛍光
強度をフルオロスキャンIIマイクロプレートフルオロメ
ーター（FluoroscanII microplate fluorometer、ラボ
システムズ（Lab Systems Inc.）社製）で測定した。な
お、陽性対照として、市販の組換えヒト可溶性TβRII
（Ｒ＆Ｄ製）を用いて前記と同様に試験した。また、陰
性対照として、いずれのヒト可溶性TβRII（Ｒ＆Ｄ製）
も加えないで上記と同様にして試験した。結果を図３に
示す。精製組換えヒト可溶性TβRIIが、濃度依存的なヒ
トTGF-β1結合活性を保持していることが示された。
【０１０６】実施例４ 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマの調製 本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、実験医
学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、
羊土社発行、第66〜第74頁、1992年）及び単クローン抗
体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、1991
年）等に記載されるような一般的方法に従って調製し
た。
【０１０７】免疫原としてのヒトTβRIIは、実施例２で
調製した精製組換えヒト可溶性TβRIIを用いた。被免疫
動物としては、前述の方法を用いて製造したヒト抗体産
生トランスジェニックマウスを用いた（Nature Genetic
s, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15,
p.146-156, 1997；特表平4-504365号公報；特表平7-509
137号公報；日経サイエンス、６月号、第40〜第50頁、1
995年等）。細胞培養操作は、マルチウェルマイクロプ
レートを用いて行った。
【０１０８】<4-1> 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマの調製 前記のヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、実施
例２で調製した組換えヒト可溶性TβRII（6μg/匹）
を、完全フロインドアジュバント（Freund's Complete
Adjuvant、ICN/CAPPEL社製）と共にフッドパッド内注射
することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から１
週間毎に同組換えヒト可溶性TβRIIを、不完全フロイン
ドアジュバント（Freund's Incomplete Adjuvant、ICN/
CAPPEL社製）と共にフッドパッド内注射により３回以上
追加免疫し、さらに以下に述べるリンパ節細胞の取得の
前々日にも同組換えヒト可溶性TβRIIのみを同様にして
最終免疫した。
【０１０９】各々の動物から採取したリンパ節細胞とマ
ウスミエローマ細胞P3/X63-AG8.653（ATCC No.: CRL-15
80）とを５：１で混合し、融合剤としてポリエチレング
リコール4000またはポリエチレングリコール1500（GIBC
O BRL社製）を用いて細胞融合させることにより多数の
ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、
10%FBSとアミノプテリンを含有するHAT含有ASF104培地
（味の素社製）中で培養することにより行った。
【０１１０】<4-2> モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマのELISAによるスクリーニング 以下に述べるELISAにより、実施例２で調製したハイブ
リドーマから抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマをスクリーニングした。実施例２
で調製した精製組換えヒト可溶性TβRII（0.2μg／wel
l）を、ELISA用９６穴マイクロプレート（Corning社
製）の各ウェルに加え、室温で２時間インキュベート
し、組換えヒト可溶性TβRIIをマイクロプレートに吸着
させた。
【０１１１】次いで、上清を捨て、各ウェルに、ブロッ
キング試薬（200μl、３％BSA含有リン酸緩衝液）を加
え室温で２時間インキュベートし、組換えヒト可溶性T
βRIIが結合していない部位をブロックした。各ウェル
を、0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液（200μl）
で３回洗浄した。このようにして、各ウェルを組換えヒ
ト可溶性TβRIIでコーティングしたマイクロプレートを
作製した。各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上
清（100μl）を加え、２時間反応させた後、各ウェル
を、0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液（200μl）
で３回洗浄した。
【０１１２】次いで、各ウェルにペルオキシダーゼ標識
したヤギ抗ヒトイムノグロブリン（Fc）抗体（50μl、
アメリカンコーレックス社製）を加え、室温下で１時間
インキュベートした。マイクロプレートを、0.1%のTwee
n20を含有するリン酸緩衝液で洗浄後、テトラメチルベ
ンジジン（3,3’,5,5’,-tetramethylbenzidine (TM
B)、100μl、バイオラッド（BIO-RAD）社製）を各ウェ
ルに加え、室温下で15分間インキュベートした。次い
で、2NのH2SO4（25μl）を各ウェルに加え、反応を止め
た。波長450nmでの吸光度をバイオラッド、モデル3550
マイクロプレートリーダー（Model 3550 Microplate Re
ader、バイオラッド（BIO-RAD）社製）で測定した。こ
の結果、抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマが選択された。
【０１１３】実施例５ 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナ
ル抗体の調製 <5-1> 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体の調製
（方法１） 前記の各々のハイブリドーマクローンを、超低濃度ウシ
イムノグロブリン含有ＦＢＳ（Ultra Low Bovine IgG
ＦＢＳ、GIBCO-BRL社製）を10％含有するASF104培地
（味の素社製）中でフラスコ培養した。10乃至20日の培
養後、各々のハイブリドーマの培養上清を回収した。
【０１１４】各々のハイブリドーマの培養上清（100m
l）を遠心（3,000rpm、10分間）して得た遠心上澄に、2
0mMのKH2PO4、180mMのNa2HPO4、及び154mMのNaClからな
る溶液（pH7.6）を1/10量加えた。次いで、各々の遠心
上澄サンプルに、プロテインＡゲル（ProteinA Sepharo
se4 Fast Flow、アマシャムファルマシア社製）を加
え、撹拌しながら一晩反応させた。次いで、遠心分離
（3,000rpm、10分間）して、遠心上澄を除去した後、プ
ロテインＡゲルに100mMのクエン酸と150mMのNaClからな
る溶液（pH2.0〜3.0）を加え抗体を溶出させた。
【０１１５】各々の溶出液を遠心分離（3,000rpm、10分
間）して回収した遠心上澄に、500mMのNa2HPO4と50mMの
KH2PO4からなる溶液（pH8.7）を加え中和した後、フィ
ルター（ミリポア社製）で濾過し、白沈を除いた。得ら
れた濾液をリン酸緩衝液で透析（一晩）し各々の精製ヒ
トTβRIIヒトモノクローナル抗体を得た。
【０１１６】<5-3> 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル
抗体の調製（方法２） 10％のUltra Low Bovine IgG ＦＢＳ（GIBCO-BRL社製）
を含有するASF104培地（味の素社製）に馴化した前記の
各々のハイブリドーマクローン（各々1〜2×10 6個／m
l）を、インテグラセルライン1000（INTEGRA CL1000、
インテグラバイオサイエンス社製）に播種し培養を行っ
た。７乃至10日間の培養後、培養細胞数が約１×108個
／mlに達した時点で、各々のハイブリドーマの培養上清
を回収した。
【０１１７】次いで、各々のハイブリドーマの培養上清
を遠心（3,000rpm、10分間）して得た遠心上澄を、ハイ
トラッププロテインＧカラム（HiTrap affinity column
Protein G、アマシャムファルマシア社製）に供した。
次いで、リン酸緩衝液でカラムを洗浄後、プロテインＧ
カラムに100mMのクエン酸と150mMのNaClからなる溶液
（pH2.0）を加え抗体を溶出させた。溶出液に750mMのTr
is-HClからなる溶液（pH9.0）を加え中和した後、フィ
ルター（ミリポア社製）で濾過し、白沈を除いた。得ら
れた濾液をリン酸緩衝液で透析（一晩）した後、フィル
ター（ミリポア社製）で濾過して各々の精製ヒトTβRII
ヒトモノクローナル抗体を得た。
【０１１８】実施例６ モノクローナル抗体のアイソタ
イプの決定 実施例５で精製した各々の抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体のアイソタイプを、ヒトモノクロ−ナル抗体ア
イソタイプ決定用キット（アメリカン・コーレックス社
製）を用い、該キットに添付の実験操作プロトコールに
従って操作を行い決定した。いずれの抗ヒトTβRIIヒト
モノクローナル抗体もIgG2/κもしくはIgG4／κである
ことが確認された（図４）。
【０１１９】上述のようにして調製した抗ヒトTβRIIヒ
トモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの各々
を下記のとおり記号を用いて命名した。当該記号中のTR
の直後に記載した数字は、そのハイブリドーマが産生す
る抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体のアイソタイプ
を示す。「２」はIgG2/κであることを、「４」はIgG4/
κであることを示す（図４）。 ＜IgG2/κヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマクローン＞TR2B19、TR2B64、TR2B209、TR2B518、
TR2D245、及びTR2D249 ＜IgG4/κヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマクローン＞TR4B16、TR4C175、TR4D204、TR4D45
5、及びTR4D465 なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに
当該実施例における試験結果として示した図面または表
中においては、上記の名称を使用する。
【０１２０】実施例７ ヒトTβRIIに対する反応性及び
ラットTβRIIに対する交叉反応性 前述のようにして調製した種々の抗ヒトTβRIIヒトモノ
クローナル抗体のヒトTβRIIに対する反応性を、ヒトT
βRIIを細胞表面に発現しているヒト肺由来細胞株NHLF
（宝酒造製；カタログ番号：CC-2512）を細胞染色（フ
ローサイトメトリー法による）することにより解析し
た。また、同様にして該各々のヒトモノクローナル抗体
のラットTβRIIに対する反応性を、ラットTβRIIを細胞
表面に発現しているラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49
F（ATCC CRL-1570）を細胞染色（フローサイトメトリー
法による）することにより解析した。
【０１２１】フラスコにて培養した各々の細胞を、10mM
のEDTAと0.1％のBSAを含有するリン酸緩衝液を用いて穏
やかに回収した。各々の細胞（1〜2×104個）に、0.1％
のBSAを含有するリン酸緩衝液を用いて希釈した本発明
の抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体または市販のヤ
ギ抗ヒトTβRIIポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ製）（300
μl、５μg/ml）を加え４℃で１時間インキュベーショ
ンした。次いで、各々を遠心（1,500rpm、３分間）し上
清を捨て、各々の細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄した。
ヒト抗体を加えたサンプルには、ビオチンで標識した抗
ヒトイムノグロブリン（Fc）抗体（200μl、アメリカン
コーレックス社製）を、ヤギ抗体を加えたサンプルに
は、ビオチンで標識した抗ヤギイムノグロブリン抗体
（200μl、アマシャムファルマシア社製）を加え４℃で
１時間インキュベーションした。
【０１２２】次いで、各々を遠心（1,500rpm、３分間）
し上清を捨て、各々の細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し
た。次いで、各々の細胞に0.1％のBSAを含有するリン酸
緩衝液を用いて希釈したフィコエリスリン（phycoeryth
rin、PE）標識したストレプトアビジン（200μl、ベク
トン・ディッキンソン社製）を加え４℃で30分間インキ
ュベーションした。次いで、各々を遠心（1,500rpm、３
分間）し上清を捨て、各々の細胞をリン酸緩衝液で３回
洗浄後、リン酸緩衝液（300μl）を加え、ファクスター
蛍光標示式セルソーター（ベクトン・ディッキンソン
製）を用いて蛍光解析（蛍光波長：DF585/42フィルタ
ー、励起波長：488nm）を行った。
【０１２３】なお、陰性対照試験として、前述したヒト
抗体産生トランスジェニックマウスに、ＫＬＨ(keyhole
limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を免疫し
て調製した抗ＫＬＨヒトモノクローナル抗体を用いて、
上記と同様にして試験した。ヒト肺由来細胞株NHLFに対
する反応性を、図５に示す。また、ラット腎臓由来線維
芽細胞株NRK-49Fに対する反応性を図６に示す。本発明
のモノクローナル抗体は、ヒトTβRIIに有意に反応する
だけでなく、ラットTβRIIへの交叉反応性を有すること
が示された。
【０１２４】実施例８ 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナ
ル抗体のTGF-βの刺激により誘導される細胞増殖の阻害
活性 TGF-βの細胞増殖活性は、細胞の種類によって異なり、
例えば、上皮細胞、血管内皮細胞及び血球系細胞などの
多種の細胞に対しては増殖促進よりもむしろ増殖の抑制
をする因子として働くが、種々組織の線維芽細胞や血管
平滑筋細胞などの間葉系の細胞に対しては細胞増殖を促
進する（Roberts et al, The transforming growth fac
tor-βs, In Peptide Growth Factors and Their Recep
tors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B.,
Springer-Verlag, Berlin, 1990,p.419-472）。本試験
では、本発明の抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体
の、TGF-β刺激による細胞増殖誘導に対する阻害効果を
下記のようにして解析した。
【０１２５】<8-1> TGF-β1の細胞増殖促進活性 96穴マイクロタイタープレートにヒト骨肉腫由来細胞株
MG-63（ATCC CRL-1427、5×103個／well）を播種し、37
℃で１日培養した。次いで、細胞を播種した各ウェルを
0.1％ＦＢＳを含むMEM Earle’s塩 培地（100μl、GIBC
O BRL製)で２回洗浄し、種々の濃度に希釈したヒトTGF-
β1（Ｒ＆Ｄ社製；濃度：0.0001525〜10ng/mlの範囲）
を添加し、37℃で40時間培養した。
【０１２６】次いで、各ウェルに、［3H]-Thymidine（1
μCi／well）を添加してさらに37℃で６時間培養した。
細胞をマイクロメート196セルハーべスター（PACKARD社
製）を用いて回収（ハーベスト）し、細胞内に取り込ま
れた［3H]-Thymidineの量をマトリックス9600M（PACKAR
D社製）にて測定した。なお、陰性対照試験として、TGF
-β1を添加せず上記と同様にして試験を行った。結果を
図７に示す。ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-14
27）がTGF-β1の濃度に依存して増殖することが示され
た。
【０１２７】<8-2> 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル
抗体のTGF-β誘導性細胞増殖の阻害活性 96穴マイクロタイタープレートにヒト骨肉腫由来細胞株
MG-63（ATCC CRL-1427、５×103個／well）を播種し、3
7℃で１日培養した。次いで、細胞を播種したウェルを
0.1％ＦＢＳを含むMEM Earle’s塩 培地（100μl）で２
回洗浄した。次いで、各ウェルに種々の濃度に希釈した
本発明の抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体または市
販の抗ヒトTβRIIポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ製）（濃
度：0.078125〜40μg/mlの範囲）を加え37℃で２時間プ
レインキュベーションした。
【０１２８】次いで、ヒトTGF-β1（最終濃度：0.3ng／
ml、Ｒ＆Ｄ社製）を添加し、37℃で40時間培養した。次
いで、各ウェルに、［3H]-Thymidine（1μCi／well）を
添加してさらに37℃で６時間培養した。細胞をマイクロ
メート196セルハーべスター（PACKARD社製）を用いて回
収（ハーベスト）し、細胞内に取り込まれた［3H]-Thym
idineの量をマトリックス9600M（PACKARD社製）にて測
定した。なお、陽性対照試験として、いずれの抗体も加
えないで上記と同様にして試験を行った。また、陰性対
照試験として、ヒトTGF-β1及びいずれの抗体をも添加
せずに上記と同様にして試験を行った。
【０１２９】結果を図８及び図９に示す。また、図４
に、本試験（複数回）により測定した本発明の抗ヒトT
βRIIヒトモノクローナル抗体のTGF-β1誘導性細胞増殖
の阻害活性の有無を記号を用いて簡略化して示した。本
発明の抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体は、TGF-β
の刺激によるヒト線維芽様細胞の増殖誘導を有意に阻害
することが示された。
【０１３０】実施例９ 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナ
ル抗体のTGF-βの刺激により誘導される細胞増殖抑制の
阻害活性 前述したとおり、TGF-βは、種々組織の線維芽細胞や血
管平滑筋細胞などの間葉系の細胞に対する細胞増殖促進
活性とは逆に、例えば、上皮細胞、血管内皮細胞及び血
球系細胞などの多種の細胞に対しては細胞増殖を抑制す
る活性を有する。本試験では、本発明の抗ヒトTβRIIヒ
トモノクローナル抗体の、TGF-β刺激による細胞増殖の
抑制に対する阻害効果を下記のようにして解析した。
【０１３１】<9-1> TGF-β1の細胞増殖抑制活性 96穴マイクロタイタープレートにヒト肺癌由来細胞株A5
49（ATCC CCL-185、５×103個／well）を播種し、１日
培養した。次いで、細胞を播種したウェルを0.1％ＦＢ
Ｓを含むD-MEM培地（100μl）で２回洗浄した後、種々
の濃度に希釈したヒトTGF-β1（Ｒ＆Ｄ社製；濃度：0.0
001525〜10ng／mlの範囲）を添加し、40時間培養した。
【０１３２】次いで、各ウェルに、［3H]-Thymidine（1
μCi／well）を添加してさらに６時間培養した。細胞を
マイクロメート196セルハーべスター（PACKARD社製）を
用いて回収（ハーベスト）し、細胞内に取り込まれた［
3H]-Thymidineの量をマトリックス9600M（PACKARD社
製）にて測定した。なお、陰性対照試験として、ヒトTG
F-β1を添加せず上記と同様にして試験を行った。結果
を図10に示す。ヒト肺癌由来細胞株A-549（ATCC CCL-18
5）の細胞増殖が、TGF-βの濃度に依存して抑制される
ことが示された。
【０１３３】<9-2> 抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル
抗体のTGF-β誘導性細胞増殖抑制の阻害活性 96穴マイクロタイタープレートにヒト肺癌由来細胞株A-
549（ATCC CCL-185、５×103個／well）を播種し、１日
培養した。次いで、細胞を播種したウェルを0.1％ＦＢ
Ｓを含むD-MEM培地（100μl）で２回洗浄した。各ウェ
ルに種々の濃度に希釈した本発明の抗ヒトTβRIIヒトモ
ノクローナル抗体または市販の抗ヒトTβRIIポリクロー
ナル抗体（Ｒ＆Ｄ製）（濃度：0.625〜40μg／mlの範
囲）を加え37℃で２時間プレインキュベーションした。
【０１３４】次いで、ヒトTGF-β1（最終濃度：0.1ng／
ml、Ｒ＆Ｄ社製）を添加し、40時間培養した。次いで、
各ウェルに、［3H]-Thymidine（1μCi／well）を添加し
てさらに６時間培養した。細胞をマイクロメート196セ
ルハーべスター（PACKARD社製）を用いて回収（ハーベ
スト）し、細胞内に取り込まれた［3H]-Thymidineの量
をマトリックス9600M（PACKARD社製）にて測定した。な
お、陽性対照試験として、いずれの抗体も加えないで上
記と同様にして試験を行った。また、陰性対照試験とし
て、ヒトTGF-β1及びいずれの抗体をも添加せずに上記
と同様にして試験を行った。
【０１３５】結果を図11に示す。また、図４に、本試験
（複数回）により測定した本発明の抗ヒトTβRIIヒトモ
ノクローナル抗体のTGF-β1誘導性細胞増殖抑制の阻害
活性の有無を記号を用いて簡略化して示した。本発明の
抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体は、TGF-βの刺激
によるヒト上皮系細胞の増殖抑制を有意に阻害すること
が示された。
【０１３６】実施例１０ 抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体のTGF-βの刺激による細胞外マトリックス及び
細胞増殖因子の産生促進の阻害活性 TGF-βは細胞増殖の制御だけでなく、コラーゲン（coll
agen）、ファイブロネクチン（fibronectin）及びテニ
シンなどの細胞外マトリックス（ECM；Extracellular M
atrix）の産生を促進する（Adv. Immunol., Vol.55, p.
181, 1994及びSeminars in Cell Biol., Vol.5, p.389,
1994）。
【０１３７】また、TGF-βは、ECMの産生を促進するだ
けでなく、FGF（fibroblast growthfactor）、TNF（Tum
or necrosis factor）、IL-1（Interleukin-1）、血小
板由来増殖因子（Platelet-derived Growth Factor (PD
GF)）、及び結合組織成長因子（Connective Tissue Gro
wth Factor (CTGF)；Hcs24とも呼ぶ。J. Cell Biology,
Vol.114, No.6, p.1285-1294, 1991；Int. J. Bioche
m. Cell Biol., Vol.29, No.1, p.153-161, 1997；Circ
ulation, Vol.95, No.4, p.831-839, 1997；Cell Growt
h Differ., Vol.7, No.4, p.469-480, 1996；J. Inves
t. Dermatol., Vol.106, No.4, p.729-733, 1996；J. I
nvest. Dermatol., Vol.105, No.2, p.280-284, 1995；
J. Invest. Dermatol., Vol.105, No.1, p.128-132, 19
95）などのサイトカインや細胞増殖因子の産生を促す。
本試験では、本発明の抗ヒトTβRIIヒトモノクローナル
抗体の、TGF-β刺激による線維芽様細胞の細胞外マトリ
ックス及び細胞増殖因子の産生に対する阻害効果を下記
のようにして調べた。
【０１３８】96穴マイクロタイタープレートにヒト骨肉
腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427、１×104個／wel
l）を播種し、１日培養した。次いで、細胞を播種した
ウェルを0.1％ＦＢＳを含むMEM Earle’s塩 培地（100
μl）で２回洗浄し、0.1％ＦＢＳを含むMEM Earle’s塩
培地（100μl）を加え、1日スターベーション（Starva
tion）した。次いで、種々の濃度に希釈した本発明の抗
ヒトTβRIIヒトモノクローナル抗体または市販の抗ヒト
TβRIIポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ製）（濃度：50μg
／ml）を、各ウェルに加え２時間プレインキュベーショ
ンした。
【０１３９】次いで、TGF-β1（最終濃度：１〜４ng/m
l、Ｒ＆Ｄ社製）を添加し、65〜72時間培養した。次い
で、各ウェルの培養上清を回収した。各々の培養上清中
のファイブロネクチンの量をファイブロネクチンEIAキ
ット（Fibronectin EIA Kit、宝酒造社製）を用いて測
定した。また、各々の培養上清に含まれる結合組織成長
因子（CTGF）の量を、サンドイッチELISA（Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,Vol.251,p.748-752,1998；国際特許
出願公開公報WO99-33878号）にて測定した。なお、陽性
対照試験として、いずれの抗体も加えないで上記と同様
にして試験を行った。また、陰性対照試験として、TGF-
β1及びいずれの抗体をも添加せずに上記と同様にして
試験を行った。
【０１４０】結果を図12及び図13に示す。また、図４
に、本試験（複数回）により測定した本発明の抗ヒトT
βRIIヒトモノクローナル抗体のTGF-β1により誘導され
るファイブロネクチン及びCTGFの産生促進の阻害活性の
有無を記号を用いて簡略化して示した。本発明の抗ヒト
TβRIIヒトモノクローナル抗体は、TGF-βにより誘導さ
れるヒト線維芽様細胞からの細胞外マトリックス産生及
び細胞増殖因子の産生を有意に阻害することが示され
た。
【０１４１】実施例１１ TGF-βII型受容体阻害剤の腎
臓疾患に対する治療効果 既報と同様の方法に従って、Wistarラット（雌、150g、
各群５匹または１０匹、チャールズリバー製）に、抗Th
y-1モノクローナル抗体を、500μg/匹の濃度で静脈内投
与し腎臓疾患（腎炎及び腎線維症などの症状）を誘導し
た（Nephron, Vol.78, p.453-463, 1998; Kidney Blood
Press Res., Vol.22, p.5-12, 1999）。抗Thy-1抗体投
与日（０日）及び該抗体投与から４日後に、前記で調製
した抗ヒトTGF-βII型受容体ヒトモノクローナル抗体
（クローン：TRC175）を10mg/kgの濃度で腹腔内投与し
た。なお、陰性対照群には、生理食塩水を前記と同様に
して投与した。また、正常ラットを対照とした。
【０１４２】抗ヒトTGF-βII型受容体ヒトモノクローナ
ル抗体による腎疾患の治療の効果（腎機能の低下の抑
制）は、常法に従って尿中に排泄される蛋白量（７日
目）及び血清クレアチニン量（７日目）を測定すること
により解析した。さらに、抗Thy-1抗体の投与から７日
目に各被験動物から採取した腎臓の凍結組織切片標本を
常法に従って免疫染色することにより、腎疾患の症状の
進行に伴い増加する細胞外マトリックスであるフィブロ
ネクチン及びI型コラーゲンの量を解析した。なお、当
該細胞外マトリックスの量は、染色の程度に応じ下記の
とおりにスコア化して求めた。 ０点： 糸球体標本の染色が認められない。 １点： 糸球体標本が3分の1まで染色される。 ２点： 糸球体標本が3分の2まで染色される。 ３点： 糸球体標本が3分の2以上染色される。 結果を図14乃至図17に示す。抗TGF-βII型受容体抗体の
投与群では、陰性対照に比べ尿中蛋白量の増加が有意に
抑制された。また、抗TGF-βII型受容体抗体の投与群で
は、陰性対照に比べ、血清クレアチニンの上昇が有意に
抑制され、その量は正常ラットと同程度であった。さら
に、抗TGF-βII型受容体抗体の投与群では、陰性対照に
比べ、腎糸球体での細胞外マトリックスの産生が有意に
抑制され、腎臓組織における線維化が抑制されることが
示された。
【０１４３】実施例１２ 抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体の遺伝子配列及びアミノ酸配列の決定及び解析 前記実施例で作製された種々のヒトTGFβRIIに対するヒ
トモノクローナル抗体を構成する重鎖（Heavy Chain）
の可変領域をコードするcDNA配列、並びに軽鎖（Light
Chain）の可変領域及び定常領域をコードするcDNA配列
を下記のようにして決定するとともに、該遺伝子の構造
的特徴を解析した。前記実施例で作製したヒトTGFβRII
に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ（クローン：TR4C175, TR4D204, TR4D455及びTR4D4
65；各々約1×106細胞）を培養後、遠心分離し、沈殿物
を回収し、後述するPolyA+RNAの抽出時まで−80℃で保
存した。
【０１４４】各々のハイブリドーマからのPolyA+RNAの
抽出、精製は、市販のpolyA+quickキット(AmershamPhar
macia製）を用いて次のようにしてした。前記各々の凍
結細胞を、細胞溶解緩衝液（Lysis Buffer）に溶解し、
シリンジにより細胞を破壊し、可溶化させた。該可溶化
物にOligo(dT) resinを加え約3分間緩やかに振盪した。
次いで、Oligo(dT) resinを洗浄後、PolyA+RNAをElluti
on Bufferで溶出させた。溶出したPolyA+RNAをエタノー
ル沈殿させ、20μlのTris-EDTA緩衝液に溶解した。得ら
れたPolyA+RNAの濃度を、260nmの波長での吸光度を測定
することにより決定した。
【０１４５】得られたPolyA+RNAを鋳型とし、市販のcDN
A synthesis Kit（GIBCOBRL製）および配列番号19に記
載のプライマーを用いたReversetranscriptase法により
二本鎖cDNAを合成した。即ち、各々のハイブリドーマか
ら精製したPolyA+RNA（1乃至5μg）を鋳型として、1st
strand cDNA及び2nd strand cDNAを順次合成した。該ｃ
DNAを、フェノール／クロロホルム／イソアミノアルコ
ール並びにクロロホルムを用いて各々1回ずつ抽出に供
した。次いで、cDNAをエタノール沈殿させ、アダプター
DNA（配列番号20及び配列番号21）に市販のDNA Ligase
（TOYOBO製）を用いて連結させた。さらに該DNA反応物
をフェノール／クロロホルム／イソアミノアルコール並
びにクロロホルムを用いて各々1回ずつ抽出に供した。
【０１４６】次いで、該DNA反応物をエタノール沈殿さ
せ、市販の制限酵素NotI（TOYOBO製）を用いて消化し、
市販のATP溶液（GIBCO BRL製）とNucleotideKinase（TO
YOBO製）でその5'末端をリン酸化した。次に得られたDN
A反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し約5
00bpから2000bpのDNAを回収した。回収した該DNA各々と
市販のラムダファージベクターλEXcell（AmershamPhar
macia製）を市販のDNA Ligase（TOYOBO製）を用いて連
結させた。次に該DNA反応物を市販のラムダファージパ
ッケージングキットGigapack III Gold（STRATAGENE
製）を用いてラムダファージとし、ベクターλEXcellに
添付の大腸菌NM522を宿主としてcDNAライブラリーとし
た。
【０１４７】各々のcDNAライブラリーを合成オリゴDNA
をプローブとして用いて常法によりスクリーニングし抗
体重鎖及び抗体軽鎖を各々コードするcDNAを調製した。
抗体重鎖に係るプローブには、配列番号22に記載の合成
オリゴDNAを用いた。抗体軽鎖に係るプローブには、配
列番号23に記載の合成オリゴDNAを用いた。得られた各
々のcDNAの塩基配列の決定を、市販のDyeTerminator Cy
cle Sequencing FS Kit（PE-Applied Biosystems製）及
びPRISM377 DNA Sequencer（PE-Applied Biosystems
製）を用いて行った。
【０１４８】なお、本配列決定のためのSequencing Pri
merは、市販のM13-20プライマー（STRATAGENE製）、M13
Reverseプライマー（STRATAGENE製）を用い、さらに抗
体重鎖に係る本配列決定のためには配列番号24の抗体重
鎖定常領域の配列をもつSequencing Primerを、抗体軽
鎖に係る本配列決定のためには配列番号25の抗体軽鎖定
常領域の配列をもつSequencing Primerを用いた。前記
の各々のハイブリドーマが産生するヒトTGFβRIIに対す
るヒトモノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードす
るcDNA配列、軽鎖（Light Chain）の可変領域をコード
するcDNA配列、並びに該各々のcDNA配列から演繹される
アミノ酸配列を下記のとおり配列表に示した。
【０１４９】＜クローンTR4C175＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号３（シグナル配列：塩基番号１
乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至352） アミノ酸配列：配列番号４（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至117を含
む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号11（シグナル配列：塩基番号１
乃至66、Ｖ領域：塩基番号67乃至352） アミノ酸配列：配列番号12（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至22、可変領域：アミノ酸番号23乃至117を含
む）
【０１５０】＜クローンTR4D204＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号５（シグナル配列：塩基番号１
乃至3、Ｖ領域：塩基番号4乃至295） アミノ酸配列：配列番号６（シグナル配列：アミノ酸番
号１、可変領域：アミノ酸番号2乃至98を含む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号13（シグナル配列：塩基番号１
乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至348） アミノ酸配列：配列番号14（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至116を含
む）
【０１５１】＜クローンTR4D455＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号７（シグナル配列：塩基番号１
乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至350） アミノ酸配列：配列番号８（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至116を含
む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号15（シグナル配列：塩基番号１
乃至60、Ｖ領域：塩基番号61乃至362） アミノ酸配列：配列番号16（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至20、可変領域：アミノ酸番号22乃至120を含
む）
【０１５２】＜クローンTR4D465＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号９（シグナル配列：塩基番号１
乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至353） アミノ酸配列：配列番号10（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至117を含
む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号17（シグナル配列：塩基番号１
乃至51を含む、Ｖ領域：塩基番号52乃至340） アミノ酸配列：配列番号18（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至17を含む、可変領域：アミノ酸番号18乃至113
を含む）
【０１５３】決定された各々のＤＮＡ配列を基に、遺伝
子配列解析ソフトウェアーを用いて、Tomlinsonらによ
り作成されたヒトイムノグロブリンの可変領域遺伝子の
ライブラリーV BASE Sequence（Immunol. Today, Vol.1
6, No.5, p.237-242, 1995）を検索した。その結果、上
記ヒトモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々のＶ領
域遺伝子は、各々下記のセグメントから構成されてい
た。
【０１５４】＜重鎖Ｖ領域遺伝子＞ クローンTR4C175： 3-21（DP-77） クローンTR4D204： 3-07（DP-54） クローンTR4D455： 5-51（DP-73） クローンTR4D465： 3-07（DP-54）
【０１５５】＜軽鎖Ｖ領域遺伝子＞ クローンTR4C175： A30 クローンTR4D204： B-3（DPK-24） クローンTR4D455： A19（DPK-15） クローンTR4D465： A18（DPK-28）
【０１５６】実施例１３ 抗ヒトTGF-βII型受容体ヒト
モノクローナル抗体の抗原（ヒトTGF-βII型受容体）に
対する親和性及び中和活性の測定 前記で作製した各種の抗ヒトTGF-βII型受容体ヒトモノ
クローナル抗体のヒトTGF-βII型受容体との結合速度定
数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び解離定数（Ｋ
ｄ）を、市販の測定キットBiacore X（Amersham-Pharma
cia製）を用いて測定した。下記に述べる抗原（精製ヒ
ト可溶性TβRII）のセンサーチップへの固定化以外の操
作は、市販の測定キットBiacore X（Amersham-Pharmaci
a製）に添付の取扱い説明書及び実験操作法に従って行
った。
【０１５７】キットに付随のフローセル１（Flow Cell-
1）に、HBS緩衝液（0.01MのHEPES、0.15MのNaCl、3mMの
EDTA及び0.005%の界面活性剤P20を含有。pH7.0）を５μ
l/分で流し、次いで、0.005M NHS（N-Hydroxysuccinimi
de）と0.2M EDC（N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)ca
rbodiimide）とからなる溶液（35μl）を添加し、セン
サーチップ表面に被覆されているＣＭのカルボキシル基
を活性化させた。次いで、70μlの実施例２で調製した
精製ヒト可溶性TβRII（30μg/ml；10mMの酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH5.0）に溶解させた。）を添加し、該精製
ヒト可溶性TβRIIをセンサーチップに固定化した。次い
で、未反応の活性化されたカルボキシル基は、35μlの1
M Ethanol aminehydrochlorideを添加することによりブ
ロックした。当該固定化操作において、固定化されたヒ
ト可溶性TβRIIの量は、5234RU（resonance unit）であ
った。なお、RUは、面積当たりの質量を示し、１RU＝1p
g/mm2である。
【０１５８】リファレンスとしてのフローセル２（Flow
Cell-2）は、該ヒト可溶性TβRIIを加えないで上記と
同様にして処理することによりキャッピングした。フロ
ーセル（センサーチップ）に、リン酸緩衝液を20μl/分
の流速で流し、前記実施例で作製した各々の精製抗ヒト
TGF-βII型受容体ヒトモノクローナル抗体（40-100μg/
ml、60μl）を添加した。測定は、結合相３分間及び解
離相200秒間を標準条件として行った。抗原に対する抗
体の結合量並びに該抗原からの抗体の解離量を経時的に
測定しセンサーグラムを得た。得られたセンサーグラム
のデータに基づき、キットに付随の解析ソフト（BIAeva
luation3.0）を用いて、結合速度定数（ｋａ）、解離速
度定数（ｋｄ）及び解離定数（Ｋｄ；Kd=kd/ka）を算出
した。各々の値を下記に示す。
【０１５９】 ＜クローン名＞ ＜ｋａ(1/M.Sec)＞ ＜ｋｄ[1/Sec]＞ ＜Ｋｄ(M)＞ TR4C175 3.0×105 1.4×10-2 5.1×10-8 TR4D455 5.2×104 1.2×10-4 3.4×10-9 TR4D204 7.4×103 5.5×10-4 7.5×10-8 TR4D465 1.2×104 2.3×10-4 2.0×10-8 TR2B 19 4.5×105 3.2×10-3 1.0×10-8 TR2B 64 5.2×105 3.6×10-2 8.6×10-8 TR2D245 2.2×105 2.3×10-4 1.1×10-9 この結果からいずれの抗ヒトTGF-βII型受容体ヒトモノ
クローナル抗体も、ヒトTGF-βII型受容体に対して極め
て高い結合親和性及び中和活性を有していることが明ら
かとなった。
【０１６０】
【発明の効果】本発明のヒトTGF-βII型受容体に結合す
るヒトモノクローナル抗体は、ヒトに由来する抗体であ
ることから、マウス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来
の抗体からなる抗体医薬品の治療上の大きな問題点（副
作用）であったヒトに対する抗原性、即ちHAMA（Human
anti-mouse antigenicity）に起因する宿主の重篤な免
疫拒絶反応を全く惹起しないことから、抗体の医薬品と
しての価値を劇的に増大させるものである。
【０１６１】従って、本発明のヒトTGF-βII型受容体に
結合するヒトモノクローナル抗体に代表されるような該
TGF-βII型受容体に結合し該受容体を介する細胞内への
シグナル伝達を抑制または阻害する物質（他の例として
は、化学合成低分子化合物や天然の動植物、細菌、微生
物などからの単離化合物など）及び該物質を含んでなる
医薬組成物は、TGF-βの作用に起因する種々の疾患、例
えば、腎疾患（腎繊維症、腎炎、腎不全、腎硬化症な
ど）、肺疾患（例えば、肺線維症、肺炎など）、肝臓疾
患（例えば、肝臓組織繊維症、肝硬変、肝炎など）、皮
膚疾患（例えば、創傷、強皮症、、乾癬、ケロイドな
ど）、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節
症など）、血管疾患（例えば、血管再狭窄、リウマチ性
血管炎など）、種々臓器での組織繊維症（種々の癌で併
発する組織線維症を含む）、及び動脈硬化症（併発する
組織繊維症を含む）などの発症及び／または進行を抑
制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品
として有用である。
【０１６２】
【配列表】 SEQUENCELISTING <110> Japan Tobacco, Inc. <120> Human Antibody For Human TGF-beta Type II Receptor and Pharmaceutical Use Thereof <130> J00-0159 <140> <141> <150> JP P11-328681 <151> 1999-11-18 <160> 25 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 477 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(477) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(69) <400> 1 atg ggt cgg ggg ctg ctc agg ggc ctg tgg ccg ctg cac atc gtc ctg 48 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 tgg acg cgt atc gcc agc acg atc cca ccg cac gtt cag aag tcg gtt 96 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 20 25 30 aat aac gac atg ata gtc act gac aac aac ggt gca gtc aag ttt cca 144 Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 35 40 45 caa ctg tgt aaa ttt tgt gat gtg aga ttt tcc acc tgt gac aac cag 192 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 50 55 60 aaa tcc tgc atg agc aac tgc agc atc acc tcc atc tgt gag aag cca 240 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 65 70 75 80 cag gaa gtc tgt gtg gct gta tgg aga aag aat gac gag aac ata aca 288 Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 85 90 95 cta gag aca gtt tgc cat gac ccc aag ctc ccc tac cat gac ttt att 336 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 100 105 110 ctg gaa gat gct gct tct cca aag tgc att atg aag gaa aaa aaa aag 384 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 115 120 125 cct ggt gag act ttc ttc atg tgt tcc tgt agc tct gat gag tgc aat 432 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 gac aac atc atc ttc tca gaa gaa tat aac acc agc aat cct gac 477 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 145 150 155 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 20 25 30 Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 50 55 60 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 65 70 75 80 Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 85 90 95 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 145 150 155 <210> 3 <211> 458 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(456) <400> 3 atg gaa ctg ggg ctc cgc tgg gtt ttc ctt gtt gct att tta gaa ggt 48 Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ctg gtc aag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt agc ttt agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg 192 Ser Ser Phe Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtc tca tcc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac aca 240 Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Thr 65 70 75 80 gac tca gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac 288 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 tca ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg 336 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gcg aga ggg tac tgg ggg ttt gac tac tgg ggc cag gga 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc 432 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc ac 458 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 145 150 <210> 4 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Phe Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 145 150 <210> 5 <211> 395 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 5 tgc cga gtg cag tgt gga gtc tgg ggg agc gtc gtc cag cct ggg aag 48 Cys Arg Val Gln Cys Gly Val Trp Gly Ser Val Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tgg tat gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga ggg ggt ata gca gtg gcg tct gga ctc tac tac tac cgt atg 336 Ala Arg Gly Gly Ile Ala Val Ala Ser Gly Leu Tyr Tyr Tyr Arg Met 100 105 110 gac gtc tgg ggc caa gga cca cgg tcc acc ttc tcc tca gct tcc acc 384 Asp Val Trp Gly Gln Gly Pro Arg Ser Thr Phe Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 aag ggc cca tc 395 Lys Gly Pro 130 <210> 6 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Cys Arg Val Gln Cys Gly Val Trp Gly Ser Val Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Ile Ala Val Ala Ser Gly Leu Tyr Tyr Tyr Arg Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Pro Arg Ser Thr Phe Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro 130 <210> 7 <211> 438 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(438) <400> 7 atg ggg tca acc gcc atc ctc gcc ctc ctc ctg gct gtt ctc caa gga 48 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 gtc tgt gcc gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag 96 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 ccc ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt 144 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 acc agc tac tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg 192 Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg atg ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc 240 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 ccg tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc 288 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 85 90 95 acc gcc tac ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg 336 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 tat tac tgt gcg agg gtg ggg ggg tgt agt ggt ggt agc tgc tac ctc 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Leu 115 120 125 tgg ggc cag gga aac ctg gtc acc gtc tcc tca gct tcc acc aag ggc 432 Trp Gly Gln Gly Asn Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 cca tcc 438 Pro Ser 145 <210> 8 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Leu 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Asn Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser 145 <210> 9 <211> 444 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(444) <400> 9 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt tta aga ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag 96 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg 192 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtg gca gtt ata tgg tat gat gga agt aat aaa tac tat gca 240 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac 288 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg 336 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gcg aga gag ggg atg act acg gtg acc cct act act acg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Met Thr Thr Val Thr Pro Thr Thr Thr 115 120 125 gta tgg acg tct ggg gcc aag gac cac ggt cac cgt ctc ctc act tcc 432 Val Trp Thr Ser Gly Ala Lys Asp His Gly His Arg Leu Leu Thr Ser 130 135 140 acc aag ggc ccg 444 Thr Lys Gly Pro 145 <210> 10 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Met Thr Thr Val Thr Pro Thr Thr Thr 115 120 125 Val Trp Thr Ser Gly Ala Lys Asp His Gly His Arg Leu Leu Thr Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro 145 <210> 11 <211> 438 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(438) <400> 11 atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ttc cca ggt gcc agg tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc 96 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 ctg tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 cag ggc att aga aat gat tta ggc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa 192 Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 gcc cct aag cgc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc 240 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 cca tca agg ttc agc ggc agt gca tct ggg aca gaa ttc act ctc aca 288 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 atc agc agc ctg cag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt cta cag 336 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 cat aat agt aac ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc 384 His Asn Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat 432 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 gag cag 438 Glu Gln 145 <210> 12 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His Asn Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln 145 <210> 13 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 13 atg gtg ttg cag acc cag tct tca ttc tct gtt gct ctg gat ctc tgg 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Ser Ser Phe Ser Val Ala Leu Asp Leu Trp 1 5 10 15 tgc cta cgg gac atc gtg atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg 96 Cys Leu Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 20 25 30 tct ctg ggc gag agg cca cca tca act gca agt cca gcc aga gtg tta 144 Ser Leu Gly Glu Arg Pro Pro Ser Thr Ala Ser Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 tac agg tcc aac aat aag aac tac tta gct tgg tac cag cag aaa cag 192 Tyr Arg Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 50 55 60 gac agc ctc cta agc tgc tca tta ctg gca tct acc cgg aag ccg ggt 240 Asp Ser Leu Leu Ser Cys Ser Leu Leu Ala Ser Thr Arg Lys Pro Gly 65 70 75 80 cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat tca ctc tca cca 288 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Leu Ser Pro 85 90 95 tca gcc gcc tgc agg ctg atg atg tgg cag tta tac tgt cag caa tgt 336 Ser Ala Ala Cys Arg Leu Met Met Trp Gln Leu Tyr Cys Gln Gln Cys 100 105 110 tat agt gct cct gtc act tcg gcg gag gac agt gac atc aaa cga act 384 Tyr Ser Ala Pro Val Thr Ser Ala Glu Asp Ser Asp Ile Lys Arg Thr 115 120 125 gtg gct gca 393 Val Ala Ala 130 <210> 14 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Val Leu Gln Thr Gln Ser Ser Phe Ser Val Ala Leu Asp Leu Trp 1 5 10 15 Cys Leu Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 20 25 30 Ser Leu Gly Glu Arg Pro Pro Ser Thr Ala Ser Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Tyr Arg Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 50 55 60 Asp Ser Leu Leu Ser Cys Ser Leu Leu Ala Ser Thr Arg Lys Pro Gly 65 70 75 80 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Leu Ser Pro 85 90 95 Ser Ala Ala Cys Arg Leu Met Met Trp Gln Leu Tyr Cys Gln Gln Cys 100 105 110 Tyr Ser Ala Pro Val Thr Ser Ala Glu Asp Ser Asp Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala 130 <210> 15 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(417) <400> 15 atg agg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct 48 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 gga tcc agt ggg gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc 96 Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctc ctg cat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggg cag tct cca cag ctc ctg atc ttt ttg ggt tct aat cgg gcc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80 tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 aca ctg aaa atc agc aga gtg gaa gct gaa gat gtt ggg gtt tat ttc 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe 100 105 110 tgc atg caa gtt tta cca ctt cct ccg acc ttc ggc caa ggg aca cga 384 Cys Met Gln Val Leu Pro Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg 115 120 125 ctg gag att aaa cga act gtg gct gca cca tct 417 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 <210> 16 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe 100 105 110 Cys Met Gln Val Leu Pro Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 <210> 17 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 17 atg agg ctc tgc tca gct ctg gct gct atg tct gga tac ctg tcc agt 48 Met Arg Leu Cys Ser Ala Leu Ala Ala Met Ser Gly Tyr Leu Ser Ser 1 5 10 15 gca gat att gtg atg acc cag act cac tct ctc tgt cgt cac cct gga 96 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr His Ser Leu Cys Arg His Pro Gly 20 25 30 cag acg gct cca tct cct gca agt cta gtc aga gcc tct tgc ttg gtg 144 Gln Thr Ala Pro Ser Pro Ala Ser Leu Val Arg Ala Ser Cys Leu Val 35 40 45 atg gaa gac tat atg tat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag cct cca 192 Met Glu Asp Tyr Met Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 50 55 60 cac ctc ctg atg tat gca gtt ccc aac cgg ttt ctg gag tgc cag ata 240 His Leu Leu Met Tyr Ala Val Pro Asn Arg Phe Leu Glu Cys Gln Ile 65 70 75 80 ggt tca gtg gca gcg ggt cag gac aga ttc aca ctg aaa atc agc cgg 288 Gly Ser Val Ala Ala Gly Gln Asp Arg Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 85 90 95 gtg gag gct gaa gga tgt tgg cat tat tac tgc atg caa gta tac agc 336 Val Glu Ala Glu Gly Cys Trp His Tyr Tyr Cys Met Gln Val Tyr Ser 100 105 110 tct cgg acg ttc ggc cag ggg tcc agt gga atc aaa cga act gtg gct 384 Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Ser Ser Gly Ile Lys Arg Thr Val Ala 115 120 125 gca cca tct 393 Ala Pro Ser 130 <210> 18 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Arg Leu Cys Ser Ala Leu Ala Ala Met Ser Gly Tyr Leu Ser Ser 1 5 10 15 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr His Ser Leu Cys Arg His Pro Gly 20 25 30 Gln Thr Ala Pro Ser Pro Ala Ser Leu Val Arg Ala Ser Cys Leu Val 35 40 45 Met Glu Asp Tyr Met Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 50 55 60 His Leu Leu Met Tyr Ala Val Pro Asn Arg Phe Leu Glu Cys Gln Ile 65 70 75 80 Gly Ser Val Ala Ala Gly Gln Asp Arg Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Gly Cys Trp His Tyr Tyr Cys Met Gln Val Tyr Ser 100 105 110 Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Ser Ser Gly Ile Lys Arg Thr Val Ala 115 120 125 Ala Pro Ser 130 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 19 aactggaagc ttcagcggcc gcagagattt tttttttttt ttttt 45 <210> 20 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized adaptor sequence <400> 20 aattcgcctc gtgg 14 <210> 21 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized adaptor sequence <400> 21 ccacgaggcg 10 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized probe sequence <400> 22 tcttgtagtt gttctccggc tg 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized probe sequence <400> 23 gtctgctttg ctcagcgtca ggg 23 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 24 caccggttcg gggaagtagt c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 25 gttccagatt tcaactgctc 20
【０１６３】「配列表フリーテキスト」 配列番号：19 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列。 配列番号：20 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
アダプター配列。 配列番号：21 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
アダプター配列。 配列番号：22 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プローブ配列。 配列番号：23 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プローブ配列。 配列番号：24 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列。 配列番号：25 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列。
【０１６４】
【図面の簡単な説明】
【図１】抗ヒトTβRIIポリクローナル抗体を用いたサン
ドイッチELISAにより定量した組換えヒト可溶性TβRII
（標準物質）の検量線を示す図。縦軸は蛍光強度を示
し、横軸は該標準物質の濃度を示す。
【図２】ウェスタンブロッティング試験による精製組換
えヒト可溶性TβRIIのSDSポリアクリルアミドゲルでの
電気泳動の状態を示す図。レーン１乃至３は各々下記の
電気泳動の状態を示す。 レーン１：マーカー分子。 レーン２：市販の組換えヒト可溶性TβRII。 レーン３：本発明において調製した精製組換えヒト可溶
性TβRII。
【図３】組換えヒト可溶性TβRIIのヒトTGF-β1に対す
る結合活性を示す図。縦軸は組換えヒト可溶性TβRIIと
ヒトTGF-β1との結合活性の指標となる蛍光強度を示
し、横軸は加えたヒトTGF-β1の濃度を示す。
【図４】組換えヒト可溶性TβRIIをヒト抗体産生トラン
スジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノ
クローナル抗体の特性を示す図。丸印は、各種の試験に
おいて有意差を持って阻害活性を示したことを示す。
【図５】フローサイトメトリーにより解析した抗ヒトT
βRIIヒトモノクローナル抗体のヒト肺由来細胞株NHLF
に対する反応性（結合性）を示す図。分図(a)乃至(h)は
各々下記の試験結果を示す。 分図(a)：一次抗体及び二次抗体のいずれも加えずスト
レプトアビジン−ＰＥのみ加えた場合の試験結果。 分図(b)：一次抗体として抗KLHヒトモノクローナル抗体
を用いた場合の試験結果。 分図(c):一次抗体として市販の抗ヒトTβRIIポリクロー
ナル抗体を用いた場合の試験結果。 分図(d)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4C175を用いた場合の試験結果。 分図(e)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4D204を用いた場合の試験結果。 分図(f)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4D455を用いた場合の試験結果。 分図(g)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4D465を用いた場合の試験結果。 分図(h)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4B16を用いた場合の試験結果。
【図６】フローサイトメトリーにより解析した抗ヒトT
βRIIヒトモノクローナル抗体のラット腎臓由来線維芽
細胞株NRK-49Fに対する反応性（結合性）を示す図。分
図(a)乃至(h)は各々下記の試験結果を示す。 分図(a)：一次抗体及び二次抗体のいずれも加えずスト
レプトアビジン−ＰＥのみ加えた場合の試験結果。 分図(b)：一次抗体として抗KLHヒトモノクローナル抗体
を用いた場合の試験結果。 分図(c):一次抗体として市販の抗ヒトTβRIIポリクロー
ナル抗体を用いた場合の試験結果。 分図(d)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4C175を用いた場合の試験結果。 分図(e)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4D204を用いた場合の試験結果。 分図(f)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4D455を用いた場合の試験結果。 分図(g)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4D465を用いた場合の試験結果。 分図(h)：一次抗体として抗ヒトTβRIIヒトモノクロー
ナル抗体TR4B16を用いた場合の試験結果。
【図７】ヒトTGF-β1の濃度依存的なヒト骨肉腫由来細
胞株MG-63の細胞増殖活性を示す図。縦軸は細胞増殖促
進活性の強弱の指標としての［3Ｈ］チミジンの細胞内
への取込み量を示し、横軸はヒトTGF-β1の濃度を示
す。
【図８】ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト骨肉
腫由来細胞株MG-63の細胞増殖の抗ヒトTβRIIヒトモノ
クローナル抗体による阻害活性を示す図。縦軸は細胞増
殖阻害率を示し、横軸は抗体の濃度を示す。
【図９】ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト骨肉
腫由来細胞株MG-63の細胞増殖の抗ヒトTβRIIヒトモノ
クローナル抗体による阻害活性を示す図。縦軸は細胞増
殖阻害率を示し、横軸は抗体の濃度を示す。
【図１０】ヒトTGF-β1の濃度依存的なヒト肺癌由来細
胞株A-549の細胞増殖抑制活性を示す図。縦軸は細胞増
殖の強弱の指標としての［3Ｈ］チミジンの細胞内への
取込み量を示し、横軸はヒトTGF-β1の濃度を示す。
【図１１】ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト肺
癌由来細胞株A-549の細胞増殖抑制の抗ヒトTβRIIヒト
モノクローナル抗体による阻害活性を示す図。縦軸は細
胞増殖抑制の阻害率を示し、横軸は抗体の濃度を示す。
【図１２】ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト由
来細胞からのファイブロネクチンの産生の抗ヒトTβRII
ヒトモノクローナル抗体による阻害活性を示す図。縦軸
はファイブロネクチンの産生量を示し、横軸は抗体の種
類を示す。
【図１３】ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト由
来細胞からの結合組織成長因子（CTGF）の産生の抗ヒト
TβRIIヒトモノクローナル抗体による阻害活性を示す
図。縦軸はファイブロネクチンの産生量を示し、横軸は
抗体の種類を示す。
【図１４】腎疾患モデルラットを用いた試験における腎
疾患パラメーターとしての尿中蛋白の増加に対するTGF-
βII型受容体の阻害剤による抑制効果を示す図。
【図１５】腎疾患モデルラットを用いた試験における腎
疾患パラメーターとしての血清クレアチニンの増加に対
するTGF-βII型受容体の阻害剤による抑制効果を示す
図。
【図１６】腎疾患モデルラットを用いた試験における腎
疾患パラメーターとしての腎臓でのフィブロネクチンの
増加に対するTGF-βII型受容体の阻害剤による抑制効果
を示す図。
【図１７】腎疾患モデルラットを用いた試験における腎
疾患パラメーターとしての腎臓でのI型コラーゲンの増
加に対するTGF-βII型受容体の阻害剤による抑制効果を
示す図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 11/00 11/00 13/12 13/12 17/00 17/00 17/02 17/02 17/04 17/04 17/06 17/06 19/02 19/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトTGF-βII型受容体に結合するヒトモ
    ノクローナル抗体またはその一部。
  2. 【請求項２】 該ヒトモノクローナル抗体が、ヒトTGF-
    βがヒトTGF-βII型受容体に結合することにより生ずる
    シグナルの細胞内への伝達を阻害する活性を有すること
    を特徴とする請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体
    またはその一部。
  3. 【請求項３】 該ヒトモノクローナル抗体が、下記の
    （ａ）乃至（ｃ）のいずれかに記載の性質を有すること
    を特徴とする請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体
    またはその一部： （ａ）ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト骨肉腫
    由来細胞株MG-63（ATCCCRL-1427）の細胞増殖を抑制す
    る； （ｂ）ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト肺癌細
    胞株A549（ATCC CCL-185）の細胞増殖抑制を抑制する；
    または （ｃ）ヒトTGF-β1の刺激により誘導されるヒト骨肉腫
    由来細胞株MG-63（ATCCCRL-1427）によるファイブロネ
    クチンまたは結合組織成長因子の産生を抑制する。
  4. 【請求項４】 該ヒトモノクローナル抗体が、ヒト抗体
    を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳
    動物に由来するモノクローナル抗体であることを特徴と
    する請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のヒトモノ
    クローナル抗体またはその一部。
  5. 【請求項５】 該ヒトモノクローナル抗体が、ヒトTGF-
    βII型受容体を発現する細胞またはヒトTGF-βII型受容
    体の全部若しくは一部を、ヒト抗体を産生する能力を有
    するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫すること
    により得られるモノクローナル抗体であることを特徴と
    する請求項４に記載のヒトモノクローナル抗体またはそ
    の一部。
  6. 【請求項６】 該トランスジェニック非ヒト哺乳動物
    が、トランスジェニックマウスであることを特徴とする
    請求項４または請求項５に記載のヒトモノクローナル抗
    体またはその一部。
  7. 【請求項７】 該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領
    域をコードするＶ領域のDNAが、DP-54（3-07）、DP-73
    （5-51）及びDP-77（3-21）からなる群から選ばれるい
    ずれかのＶ遺伝子セグメントに由来することを特徴とす
    る請求項１乃至請求項６のいずれかに記載のヒトモノク
    ローナル抗体またはその一部。
  8. 【請求項８】 該ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領
    域をコードするＶ領域のDNAが、A30、DPK-15（A19）、D
    PK-24（B-3）、及びDPK-28（A18）からなる群から選ば
    れるいずれかのＶ遺伝子セグメントに由来することを特
    徴とする請求項１乃至請求項６のいずれかに記載のヒト
    モノクローナル抗体またはその一部。
  9. 【請求項９】 該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領
    域をコードするＶ領域のDNAが、DP-54（3-07）、DP-73
    （5-51）及びDP-77（3-21）からなる群から選ばれるい
    ずれかのＶ遺伝子セグメントに由来し、且つ該ヒトモノ
    クローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするＶ領域のDN
    Aが、A30、DPK-15（A19）、DPK-24（B-3）、及びDPK-28
    （A18）からなる群から選ばれるいずれかのＶ遺伝子セ
    グメントに由来することを特徴とする請求項１乃至請求
    項８のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体または
    その一部。
  10. 【請求項１０】 該ヒトモノクローナルの重鎖可変領域
    が、下記（ａ）乃至（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を
    含むアミノ酸を有することを特徴とする請求項１に記載
    のヒトモノクローナル抗体またはその一部： （ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号21乃至117番目のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号21乃至117番目のアミノ酸配列において、１若しく
    は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
    たアミノ酸配列； （ｃ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号２乃至98番目のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号２乃至98番目のアミノ酸配列において、１若しくは
    数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された
    アミノ酸配列； （ｅ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号21乃至116番目のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号21乃至116番目のアミノ酸配列において、１若しく
    は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
    たアミノ酸配列； （ｇ）配列番号10に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号21乃至117番目のアミノ酸配列；または （ｈ）配列番号10に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号21乃至117番目のアミノ酸配列において、１若しく
    は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
    たアミノ酸配列。
  11. 【請求項１１】 該ヒトモノクローナルの軽鎖可変領域
    が、下記（ａ）乃至（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を
    含むアミノ酸を有することを特徴とする請求項１に記載
    のヒトモノクローナル抗体またはその一部： （ａ）配列番号12に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号23乃至117番目のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号12に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号23乃至117番目のアミノ酸配列において、１若しく
    は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
    たアミノ酸配列； （ｃ）配列番号14に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号21乃至116番目のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号14に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号21乃至116番目のアミノ酸配列において、１若しく
    は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
    たアミノ酸配列； （ｅ）配列番号16に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号22乃至120番目のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号16に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号22乃至120番目のアミノ酸配列において、１若しく
    は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
    たアミノ酸配列； （ｇ）配列番号18に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号18乃至113番目のアミノ酸配列；または （ｈ）配列番号18に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号18乃至113番目のアミノ酸配列において、１若しく
    は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
    たアミノ酸配列。
  12. 【請求項１２】 請求項１乃至請求項１１のいずれかに
    記載のヒトモノクローナル抗体を産生する細胞。
  13. 【請求項１３】 該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体
    を産生する能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来
    のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞である
    ことを特徴とする請求項１２に記載の細胞。
  14. 【請求項１４】 該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体
    の重鎖をコードするDNA若しくはその軽鎖をコードするD
    NAのいずれか一方のDNA、または両方のDNAが細胞内に導
    入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞で
    あることを特徴とする請求項１２に記載の細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１乃至請求項１１のいずれかに
    記載のヒトモノクローナル抗体若しくはその一部、及び
    薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 該医薬組成物が、ヒトTGF-βがヒトTG
    F-βII型受容体に結合することにより生ずるシグナルの
    細胞内への伝達を阻害するために用いられることを特徴
    とする請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 【請求項１７】 組織の線維化を抑制するための医薬組
    成物であって、ヒトTGF-βII型受容体に結合し該受容体
    を介する細胞内へのシグナル伝達を抑制または阻害する
    能力を有する物質及び薬学的に許容されうる担体を含ん
    でなることを特徴とする医薬組成物。
  18. 【請求項１８】 該物質が、請求項１乃至請求項１１の
    いずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一
    部であることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成
    物。
  19. 【請求項１９】 該組織の線維化が、肺、肝臓、腎臓ま
    たは皮膚における線維化であることを特徴とする請求項
    １７または請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 【請求項２０】 該組織の線維化が、腎臓における線維
    化であることを特徴とする請求項１９に記載の医薬組成
    物。
  21. 【請求項２１】 腎臓疾患の治療または予防に用いられ
    る医薬組成物であって、ヒトTGF-βII型受容体に結合し
    該受容体を介する細胞内へのシグナル伝達を抑制または
    阻害する能力を有する物質及び薬学的に許容されうる担
    体を含んでなることを特徴とする医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 該物質が、請求項１乃至請求項１１の
    いずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一
    部であることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成
    物。
  23. 【請求項２３】 ヒトTGF-βII型受容体に結合し該受容
    体を介する細胞内へのシグナル伝達を抑制または阻害す
    る能力を有する物質及び薬学的に許容されうる担体を含
    んでなる医薬組成物であって、該医薬組成物が、腎硬化
    症、肺線維症、肝硬変、血管再狭窄、動脈硬化症、乾
    癬、強皮症、アトピー、ケロイドまたは関節炎を抑制ま
    たは治療するために用いられることを特徴とする医薬組
    成物。
  24. 【請求項２４】 該物質が、請求項１乃至請求項１１の
    いずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一
    部であることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成
    物。
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