ES2313908T3 - Anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor tgf-beta ii y su uso medicinal. - Google Patents

Anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor tgf-beta ii y su uso medicinal. Download PDF

Info

Publication number
ES2313908T3
ES2313908T3 ES00976330T ES00976330T ES2313908T3 ES 2313908 T3 ES2313908 T3 ES 2313908T3 ES 00976330 T ES00976330 T ES 00976330T ES 00976330 T ES00976330 T ES 00976330T ES 2313908 T3 ES2313908 T3 ES 2313908T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
human
tgf
baselineskip
antibody
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00976330T
Other languages
English (en)
Inventor
Shinji Pharmaceutical Frontier Res. Lab SAKAMOTO
Masafumi Pharmaceutical Frontier Res. Lab KAMADA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Fremont Inc
Original Assignee
Amgen Fremont Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Fremont Inc filed Critical Amgen Fremont Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2313908T3 publication Critical patent/ES2313908T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Un anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab'') 2, Fab'', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb del anticuerpo, en donde el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno suprime el crecimiento celular inducido por TGF-Beta, en donde (a) una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 23 a 117 de SEQ ID NO: 12; (b) una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 4, en donde se han delecionado, sustituido, insertado o añadido 1 a 10 aminoácidos, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 23 a 117 de SEQ ID NO: 12, en donde se han delecionado, sustituido, insertado o añadido 1 a 10 aminoácidos; (c) una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 2 a 98 de SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 14; (d) una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 2 a 98 de SEQ ID NO: 6, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 14, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado o añadido; (e) una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 22 a 120 de SEQ ID NO: 16; (f) una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 8, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 22 a 120 de SEQ ID NO: 16, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido; (g) una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 18 a 113 de SEQ ID NO: 18; o (h) una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 10, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 18 a 113 de SEQ ID NO: 18, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado o añadido.

Description

Anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor TGF-\beta II y su uso medicinal.
Campo técnico
La presente invención se refiere a: anticuerpos humanos monoclonales o una porción de los mismos, que pueden fijarse al receptor tipo II del factor-\beta de crecimiento transformante humano (TGF-\beta) (al que se hace referencia en lo sucesivo como "receptor de TGF-\beta tipo II" o "T\betaRII") y que suprime el crecimiento de las células humanas inducido por TGF-\beta; células que producen los anticuerpos humanos monoclonales; y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos o porciones.
Antecedentes de la técnica
Dos tipos de factores encontrados durante la investigación de factores de crecimiento para fibroblastos de ratas normales como moléculas intensificadoras de la transformación de las células normales recibieron los nombres de factor-\alpha del crecimiento transformante (TGF-\alpha) y factor \beta del crecimiento transformante (TGF-\beta). Estudios subsiguientes han revelado que TGF-\alpha es una molécula perteneciente a la familia de los factores de crecimiento epidérmicos (EGF), mientras que TGF-\beta es producido prácticamente por todos los tipos de células y, adicionalmente, el receptor del mismo se expresa en una gran diversidad de órganos y células (Biol. Signals., vol. 5, p. 232, 1996 y Pulmonary Fibrosis, vol. 80 de Lung Biology in Health and Disease Series, recopilado por Phan et al. p. 627, Dekker, Nueva York, 1995).
TGF-\beta tiene actividad para regular la diferenciación y el crecimiento celulares. La actividad promotora del crecimiento celular de TGF-\beta depende en gran parte del tipo de célula (Roberts et al., The transforming growth factor-\betas, en Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, recopilado por Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlín, 1990, p.419-472). Por ejemplo, se ha esclarecido que el factor exhibe actividad promotora del crecimiento celular para las células mesangiales, tales como lo fibroblastos y las células de la musculatura lisa vascular, en tanto que no sirve como factor promotor del crecimiento sino como factor supresor del crecimiento en una diversidad de células que incluyen células epiteliales, células endoteliales vasculares, y hemocitos. Se ha descubierto ulteriormente que TGF-\beta posee no sólo funciones moduladoras del crecimiento celular, sino también diversas funciones que incluyen regulación del sistema inmunitario; aumento de la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (ECM), tales como colágeno, fibronectina, y tenascina (Adv. Immunol., vol. 55, p. 181, 1994 y Seminars in Cell Biol., vol. 5, p. 389, 1994); etcétera.
Se ha esclarecido recientemente que el mecanismo para las funciones diversificadas de TGF-\beta depende de la estructura distintiva de los receptores de TGF-\beta y la transducción de señales consiguiente.
TGF-\beta es una proteína con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa. Dos cadenas peptídicas forman un dímero. Existen cinco tipos de isoformas para TGF-\beta: a saber, TGF-\beta1, TGF-\beta2, y TGF-\beta3 en mamíferos; TGF-\beta4 en el pollo; y TGF-\beta5 en la rana. Estas isoformas exhiben una homología de aproximadamente 70% unas con otras.
Entre estas especies de TGF-\beta, la función de TGF-B1 ha sido analizada extensamente. TGF-\beta1 juega papeles extremadamente importantes en el proceso de curación de las heridas en los tejidos biológicos (New Engl. J. Med., vol. 331, p. 1286, 1994 y J. Cell Biol., vol. 119, p. 1017, 1992).. En el sitio del tejido lesionado, tienen lugar reacciones biológicas rápidas y dinámicas que incluyen infiltración de células inflamatorias y fibroblastos, producción de ECM y vascularización, y crecimiento celular para la regeneración subsiguiente del tejido, a fin de reparar el tejido
lesionado.
En primer lugar, se inicia una hemorragia en el momento ñeque se inflinge una herida, y a continuación, se producen TGF-\beta y PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas) por las plaquetas junto con la activación de TGF-\beta inactiva unida a ECM en el sitio de la herida. Por exposición a una concentración alta de la TGF-\beta así producida, las células que migran al sitio de la herida y las células que se encuentran en el sitio de la herida secretan factores de crecimiento y citoquinas, tales como FGF (factor del crecimiento de fibroblastos), TNF (factor de necrosis tumoral), e IL-1 (interleuquina-1); y lo fibroblastos sintetizan y secretan también ECM.
Ulteriormente, por ejemplo, la producción incrementada de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), denominado también Hcs24) (J. Cell Biology, vol. 114, No. 6, p. 1285-1294, 1991; Int. J. Biochem. Cell Biol., Vol. 29, No. 1, p. 153-161, 1997; Circulation, Vol. 95, No. 4, p. 831-839, 1997; Cell Growth Differ., Vol. 7, No. 4, p. 469-480, 1996; J. Invest. Dermatol., Vol. 106, No. 4, p. 729-733, 1996; J. Invest. Dermatol., Vol. 105, No. 2, p. 280-284, 1995; J. Invest. Dermatol., Vol. 105, No. 1, p. 128-132, 1995; y la publicación internacional WO 96/38172)), y fibronectina se observan en los fibroblastos y las células mesangiales.
Adicionalmente, se cree que TGF-\beta1 contribuye a la curación de las heridas por supresión de la producción de proteasas y aumento de la producción de inhibidores contra todas las enzimas, y adicionalmente, por mejora de la síntesis de integrinas, que participan en la adhesión de ECM a las células, promoción de la producción y deposición de ECM. Adicionalmente, TGF-\beta exhibe también una actividad inmunosupresora por supresión de las funciones de los linfocitos T y los linfocitos B para inhibir la síntesis de TNF e IL-1.
El mecanismo para la regulación de la expresión de TGF-\beta no ha sido esclarecido totalmente, pero se cree que la expresión esté regulada por la fijación de TGF-\beta propiamente dicho a proteoglicanos, es decir ECM (Nature, vol. 346, p. 281, 1990 y Nature, vol. 360, p. 361, 1992). De modo más específico, se ha creído que la sobreexpresión de TGF-\beta es suprimida por regulación negativa por ECM, cuya producción es intensificada por la TGF-\beta propiamente dicha, mientras que TGF-\beta promueve la curación de las heridas. Por esta razón, las anormalidades en la regulación negativa pueden conducir a la sobreexpresión de TGF-\beta, y pueden dar por tanto como resultado un estado mórbido, tal como la fibrosación tisular (fibrosis).
Por otra parte, en la fibrosis pulmonar y la nefroesclerosis, a pesar del depósito suficiente de ECM, la concentración de TGF-\beta se mantiene alta y conduce al progreso de estados mórbidos, tales como fibrosis (Kidney Int., vol. 45, p. 916, 1994 y J. Clin. Invest., vol. 92, p. 632, 1993). Se supone que el sufrimiento incesante de lesión tisular se ha supuesto que transduce continuamente señales que expresan TGF-\beta, suprimen la señal de regulación negativa arriba mencionada para la expresión TGF-\beta, o causan ambos sucesos sinérgicamente en la fibrosis pulmonar y la nefroesclerosis.
La nefroesclerosis es un estado terminal de muchos tipos de enfermedades renales, tales como glomerulonefritis crónica y nefropatía diabética, que se caracteriza por la proliferación de células mesangiales y la producción de ECM. Patrones de expresión aberrante de TGF-\beta se han encontrado en pacientes renales de nefroesclerosis (J. Clin. Invest., vol. 90, p. 1, 1992 y Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p. 1056, 1989). Adicionalmente, en un modelo experimental de nefritis, que es inducida por un anticuerpo anti-Thy-1, se demostró que la administración de anticuerpo anti-TGF-\beta suprimía el progreso de la nefritis. Esto sugiere que TGF-\beta participa en el comienzo del estado mórbido de la nefroesclerosis (Nature, vol. 346, p. 371, 1990).
Por otra parte, TGF-\beta se expresa a concentración elevada en el pulmón de sujetos con fibrosis pulmonar inducida por administración de bleomicina o fibrosis pulmonar repentina; lo que sugiere la relación de TGF-\beta en el comienzo de la fibrosis pulmonar.
Adicionalmente, se detectó la expresión de TGF-\beta en sitios con depósitos de colágeno en biopsias tisulares obtenidas de pacientes con hepatitis y pacientes de cirrosis crónicas. Adicionalmente, la deposición de ECM y la expresión de TGF-\beta se consignan también en restenosis vascular; artritis, tales como artritis reumática; queloide de piel, etcétera.
Estos descubrimientos han sugerido la posibilidad de que TGF-\beta esté asociada con las apariciones de estados mórbidos de diversos tipos de fibrosación tisular (fibrosis). Así, se llevan a la práctica intentos experimentales de terapia para fibrosis tisular por supresión de la función de TGF-\beta con utilización de productos farmacéuticos antisentido y terapia génica (Kidney Int., vol. 50, p. 148, 1996).
La transducción de señales en células por la fijación de TGF-\beta al receptor de TGF-\beta inicia la expresión arriba mencionada de diversas funciones de TGF-\beta y los comienzos de diversos estados mórbidos de fibrosis tisular debidos a TGF-\beta.
Se han identificado tres tipos de receptores de TGF-\beta a partir de mamíferos, con inclusión de humano y rata, cuyas estructuras han sido ya reveladas. Los tres son: el receptor tipo I (peso molecular = aproximadamente 53 kDa; No. de Acceso a GenBank LM695; Cell, vol. 75, No. 4, p. 681, 1993; al que se hace referencia en lo sucesivo como "receptor de TGF-\beta tipo I" o "T\betaRI"); el receptor tipo II (peso molecular = aproximadamente 70 kDa; No. de Acceso a GenBank: M85079; Cell, vol. 68, No. 4, p. 775, 1992; al que se hace referencia en lo sucesivo como "receptor de TGF-\beta tipo II" o "T\betaRII"); y el receptor tipo III (peso molecular = aproximadamente 200 a 300 kDa; No. de Acceso a GenBank: L07594; Cell, vol. 67, No. 4, p. 785, 1991; Cell, vol. 67, No. 4, p. 797, 1991; y Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 189, No. 1, p. 356, 1992; al que se hace referencia en lo sucesivo como "receptor de TGF-\beta tipo III" o "T\betaRIII") (Adv. Imm., vol. 75, p. 181, 1994).
Los papeles de los receptores han sido revelados por análisis funcional utilizando variantes resistentes a TGF-\beta establecidas artificialmente, derivadas de la línea de células epiteliales de pulmón de visón Mv1Lu. Entre los tres receptores, se demostró que el receptor de TGF-\beta tipo I y el receptor de TGF-\beta tipo II son importantes y esenciales para la transducción de señales de TGF-\beta (J. Biol. Chem., vol. 265, p. 18518, 1990 y J. Biol. Chem., vol. 266, p. 9108, 1991). Por el contrario, el receptor de TGF-\beta tipo III no es esencial para la transducción de señales de TGF-\beta, y juega un papel indirecto en la transducción.
El receptor de TGF-\beta tipo III es una proteína transmembranal constituida por 849 aminoácidos, que incluye un dominio extracelular (761 aminoácidos), dominio transmembranal (24 aminoácidos), y dominio citoplásmico (43 aminoácidos). El dominio citoplásmico del receptor de TGF-\beta tipo III es rico en residuos serina (Ser)/treonina (Thr), que corresponden al 40% o más del total de aminoácidos.
El receptor de TGF-\beta tipo I es una proteína transmembranal constituida por 503 aminoácidos, que incluye un dominio extracelular (101 aminoácidos), dominio transmembranal (22 aminoácidos), y dominio citoplásmico (356 aminoácidos).
Análogamente, el receptor de TGF-\beta tipo II es una proteína transmembranal constituida por 567 aminoácidos, que incluye una secuencia señal (23 aminoácidos), dominio extracelular (136 aminoácidos), dominio transmembranal (30 aminoácidos), y dominio citoplásmico (378 aminoácidos).
Los receptores TGF-\beta tipo I y TGF- \beta tipo II son simples proteínas transmembranales cuyos dominios extracelulares son relativamente cortos y que tienen una estructura de serina-treonina quinasa que contiene dos dominios de quinasa. Adicionalmente, el dominio citoplásmico contiene una cadena de azúcar enlazada a ácido aspártico (Asp), y el dominio del receptor de TGF-\beta tipo I y el receptor de TGF-\beta tipo II tienen 10 residuos cisteína (Cys) y 12 residuos Cys, respectivamente, que proporcionan una estructura terciaria de proteínas característica.
Una región rica en glicina (Gly), serina (Ser), y treonina (Thr), conocida como "dominio GS", se observa adyacentemente al dominio de quinasa en la región citoplásmica de un receptor de TGF-\beta tipo I. El receptor de TGF-\beta tipo II tiene una estructura similar a la del receptor de TGF-\beta de tipo I, pero carece del dominio GS.
Se ha demostrado que los dominios de quinasa del receptor de TGF-\beta tipo I y receptor de TGF-\beta tipo II comparten una homología de aproximadamente 43%, y son ambos proteína-quinasas específicas de serina-treonina. Adicionalmente, la reacción de los dos dominios serina-treonina quinasa se ha revelado esencial para la transducción de señales de TGF-\beta en las células (J. Biol. Chem., vol. 269, p. 30753, 1994).
Tanto el receptor de TGF-\beta tipo I como el receptor de TGF-\beta tipo II son esenciales para la transducción de señales de TGF-\beta en las células. El receptor de TGF-\beta tipo II puede fijarse a TGF-\beta por sí mismo, mientras que el receptor de TGF-\beta tipo I no puede fijarse a TGF-\beta por sí solo. La formación de un complejo de los receptores de TGF-\beta tipo I y tipo II en la superficie celular es importante para la transducción de señales de TGF-\beta a las células.
Se ha informado que la fijación de TGF-\beta a un receptor de TGF-\beta tipo II conduce a la formación de un complejo hetero-tetrámero del receptor de TGF-\beta tipo II y el receptor de TGF-\beta tipo I en la superficie celular (J. Biol. Chem., vol. 269, p. 20172, 1994). Específicamente, cuando el receptor de TGF-\beta tipo I y el receptor de TGF-\beta tipo II forman un complejo en la presencia de TGF-\beta, el receptor de TGF-\beta tipo I sirve como sustrato para el receptor de TGF-\beta tipo II y el dominio GS del mismo es fosforilado por el receptor de TGF-\beta tipo II para activar el receptor de TGF-\beta tipo I. Como resultado, otros sustratos intracelulares se fosforilan y permiten una transducción adicional aguas abajo de la señalización de TGF-\beta (Nature, vol. 370, p. 241, 1994).
El camino de señalización de TGF-\beta aguas abajo del receptor de TGF-\beta tipo I no ha sido completamente esclarecido todavía, pero recientemente se han identificado moléculas de señalización localizadas aguas abajo del receptor de TGF-\beta tipo I: (1) moléculas de señalización constituidas por 8 isoformas, denominadas colectivamente "Smad" (S Mothers against Dpp), que median la transducción de señales de TGF-\beta (Nature, vol. 381, p. 620, 1996; Cell, vol. 86, p. 543, 1996; Nature, 383, p. 168, 1996; y Nature, vol. 383, p. 832, 1996); y (2) una molécula de señalización denominada TAK1 (quinasa-1 activada por TGF-\beta) (Science, vol. 270, p. 2008, 1995). Se ha informado que Smad2 y Smad3 se fijan al receptor de TGF-\beta tipo I, que había sido activado por formación de un complejo con el receptor de TGF-\beta tipo II; son fosforiladas por el dominio de quinasa del receptor de TGF-\beta tipo II; son liberadas por el receptor de TGF-\beta de tipo II para formar un complejo con Smad4 (DPC4); y, a continuación, sufren translocación al núcleo (Cell, vol. 87, p. 1215, 1996 y EMBO J., vol. 16, No. 17, 1997). Se sugiere que el complejo Smad2/Smad4 o Smad3/Smad4 que ha sufrido translocación al núcleo funcionan como un factor activador de la transcripción por fijación a una proteína de fijación de DNA (factor de transcripción), con lo que la expresión génica se regula (Nature, vol. 383, p. 382, 1996 y Nature, vol. 390, p. 465, 1997).
Se ha demostrado que TAK1 está asociada con la transducción de señales de TGF-\beta, funcionando como un MAPKKK en la cascada de las quinasas MAP.
Como se ha descrito arriba, TGF-\beta está estrechamente implicada en los comienzos de la nefroesclerosis; diversos tejidos fibrosos, tales como la fibrosis pulmonar y la cirrosis; así como el comienzo de diversos estados mórbidos, tales como hepatitis crónica, artritis reumatoide, restenosis vascular, y queloide de piel. Los comienzos de estos estados mórbidos pueden ser resultado de la transducción de señales de TGF-\beta a células mediadas por el receptor de TGF-\beta.
De acuerdo con ello, esto genera la posibilidad de que los estados mórbidos puedan tratarse o prevenirse por regulación, en particular supresión, de la transducción de la señal de TGF-\beta a las células.
Un intento para suprimir los estados mórbidos por supresión de la transducción de señales de TGF-\beta está siendo aplicado para tratar la nefritis y enfermedades análogas, por supresión de la función de TGF-\beta utilizando anticuerpos contra TGF-\beta o ácidos nucleicos antisentido del gen de TGF-\beta, en el cual la TGF-\beta es una diana.
Sin embargo, el tratamiento de enfermedades por supresión de funciones de receptores de TGF-\beta, particularmente el receptor de TGF-\beta tipo II, que es el compuesto asociado particular de TGF-\beta, no ha sido consignado; dicho de otro modo, no existe informe alguno acerca de la terapia para las enfermedades por inhibición de la transducción de señales de TGF-\beta a las células mediadas por el receptor de TGF-\beta tipo II, en las cuales el receptor de TGF-\beta tipo II es una diana.
Adicionalmente, no se publicado informe alguno acerca del enfoque terapéutico para enfermedades, enfoque que comprenda la inhibición de la transducción de señales de TGF-\beta mediada por el receptor de TGF-\beta tipo II utilizando anticuerpos contra el receptor de TGF-\beta tipo II.
\newpage
Los anticuerpos policlonales derivados de mamíferos no humanos, tales como conejo y cabra, son los únicos anticuerpos consignados como anticuerpos contra el receptor humano de TGF-\beta tipo II. Hasta ahora, no se han consignado la preparación de anticuerpos monoclonales derivados de humanos e intentos de terapia para diversas enfermedades utilizando anticuerpos humanos monoclonales, para no mencionar anticuerpos monoclonales contra el receptor humano de TGF-\beta tipo II.
Exposición de la invención
Se ha sugerido que TGF-\beta está estrechamente asociado con diversas enfermedades y síntomas, por ejemplo los comienzas de diversas fibrosis tisulares, tales como nefroescleroisis, fibrosis pulmonar, y cirrosis, así como hepatitis crónica, artritis reumatoide, restenosis vascular, queloide de piel, etcétera. Dado que la función de TGF-\beta está expresada por la transducción de la señal de TGF-\beta a células mediadas por la fijación de TGF-\beta al receptor de TGF-\beta tipo II, se espera que los resultados mórbidos puedan tratarse o prevenirse por supresión de la transducción de señales de TGF-\beta mediada por el receptor de TGF-\beta tipo II utilizando una sustancia que se fija al receptor de TGF-\beta tipo II. Por ejemplo, anticuerpos contra el receptor de TGF-\beta tipo II.
Específicamente, un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal como se define más adelante en esta memoria contra el receptor de TGF-\beta humano tipo II, en particular el anticuerpo humano monoclonal contra el receptor humano de TGF-\beta tipo II, que es extremadamente útil para tratar diversas enfermedades arriba descritas, tales como fibrosis tisular; composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo que se fija al receptor de TGF-\beta tipo II para suprimir o inhibir la transducción de señales a las células mediadas por el receptor; y composiciones para uso en métodos terapéuticos a fin de tratar de este modo diversas enfermedades (v.g., diversas enfermedades renales (v.g., nefritis, fibrosis renal, nefroesclerosis, etc.), diversas fibrosis tisulares tales como fibrosis de riñón y fibrosis pulmonar, cirrosis, artritis reumatoide, queloide de piel, etc.).
Los autores de la presente invención estudiaron intensamente los anticuerpos humanos monoclonales contra el receptor de TGF-\beta tipo II a fin de conseguir el objetivo arriba mencionado. Así, los autores de la presente invención tuvieron éxito por primera vez en el mundo, en la preparación de diversos anticuerpos humanos monoclonales que se fijan al receptor tipo II de TGF-\beta humana, en particular diversos anticuerpos monoclonales que se fijan al receptor de TGF-\beta tipo II humano para inhibir la transducción de señales de TGF-\beta humana a las células, por inmunización de ratones transgénicos que se crearon para producir anticuerpos humanos utilizando tecnología recombinante, como el receptor humano tipo II de TGF-\beta soluble recombinante.
Adicionalmente, los autores de la presente invención han encontrado que una sustancia que se fija al receptor de TGF-\beta-II, representada por el presente anticuerpo humano monoclonal que se fija al receptor tipo II humano TGF-\beta, no sólo inhibe específicamente la transducción de señales de TGF-\beta humano a las células mediada por el receptor de TGF-\beta tipo II humano, sino que tiene también un efecto terapéutico sobre diversas enfermedades (v.g., enfermedades renales (por ejemplo, nefritis, fibrositis renal, y nefroesclerositis); diversas fibrosis tisulares, tales como fibrosis de riñón y fibrosis pulmonar; cirrosis; artritis reumatoide; queloide de piel; etc.), y han completado así la presente invención.
Dado que los anticuerpos monoclonales de la presente invención proceden de humanos, los mismos no experimentan antigenicidad alguna para el hospedador humano, que es un problema terapéutico muy importante (efecto secundario) en el tratamiento médico con productos farmacéuticos de anticuerpos que comprenden anticuerpos derivados de mamíferos no humanos, tales como ratones. Esto significa que los anticuerpos de la presente invención no inducen rechazo inmune severo del hospedador causado por HAMA (antigenicidad humano anti-ratón), y, por consiguiente, aumenta espectacularmente el valor del anticuerpo como producto farmacéutico.
Adicionalmente, el anticuerpo humano monoclonal de la presente invención que se fija al receptor de TGF-\beta tipo II para suprimir o inhibir la transducción de señales a las células mediadas por el receptor, y también una composición farmacéutica que comprende la sustancia son útiles como producto farmacéutico para tratar o prevenir diversos tipos de enfermedades causadas por la acción de TGF-\beta por supresión o inhibición del comienzo y/o progreso de las enfermedades. Tales enfermedades se ilustran por enfermedades renales (fibrosis renal, nefritis, insuficiencia renal, nefroesclerosis, etc.); enfermedades pulmonares (v.g., fibrosis pulmonar, neumonía, etc.); enfermedades hepáticas (v.g., fibrosis tisular hepática, cirrosis, hepatitis, etc.); enfermedades de la piel (v.g. heridas, escleroderma, psoriasis, queloide, etc.); artritis (v.g., artritis reumatoide, osteoartritis, etc.); enfermedades vasculares (v.g., restenosis vascular, vasculitis reumática, etc.); fibrosis tisulares en diversos órganos (con inclusión de fibrosis tisular acompañada por diversos cánceres); arterioesclerosis (con inclusión de fibrosis tisular concomitante); etcétera.
Específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente:
Un anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb del anticuerpo, en donde el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno suprime el crecimiento celular inducido por TGF-\beta, en donde
(a)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 23 a 117 de SEQ ID NO: 12;
\global\parskip0.900000\baselineskip
(b)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 4, en donde se han delecionado, sustituido, insertado o añadido 1 a 10 aminoácidos, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 23 a 117 de SEQ ID NO: 12, en donde se han delecionado, sustituido, insertado o añadido 1 a 10 aminoácidos;
(c)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 2 a 98 de SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 14;
(d)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 2 a 98 de SEQ ID NO: 6, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 14, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado o añadido;
(e)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 22 a 120 de SEQ ID NO: 16;
(f)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 8, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 22 a 120 de SEQ ID NO: 16, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido;
(g)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 18 a 113 de SEQ ID NO: 18; o
(h)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 10, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 18 a 113 de SEQ ID NO: 18, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado o añadido.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo puede caracterizarse opcionalmente además por tener el carácter seleccionado del grupo constituido por:
(a)
suprimir el crecimiento celular de la línea de células de osteosarcoma humano MG-63 (ATCC CRL-1227) que es inducido por el estímulo con una TGF-\beta1 humana;
(b)
suprimir la supresión (sic) inducida por el estímulo de TGF-\beta1 humana del crecimiento celular de la línea de células de cáncer de pulmón humano A549 (ATCC CCL-185); y
(c)
suprimir la producción de una fibronectina o factor de crecimiento de tejido conectivo por la línea de células de osteosarcoma humano MG-63 (ATCC-CRL-1427) que es inducida por el estímulo con una TGF-\beta1 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, el anticuerpo humano monoclonal o porción del mismo puede caracterizarse opcionalmente como sigue:
(i)
el anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo procede de un mamífero no humano transgénico o una porción del mismo que produce anticuerpos humanos;
(ii)
el anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo se produce por inmunización de un mamífero no humano transgénico que produce anticuerpos humanos con células que expresan un receptor de TGF-\beta humana de tipo II, o la molécula receptora de TGF-\beta humano tipo II entera o una porción de la misma;
(iii)
el anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de acuerdo con (i) o (ii), en donde el mamífero transgénico no humano es un ratón transgénico;
(iv)
el anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (i) a (iii), en donde un DNA de la región V que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo humano monoclonal se deriva de un segmento de gen V seleccionado del grupo constituido por DP-54 (3-07), DP-73 (5-51) y DP-77 (3-21);
(v)
el anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (i) a (iv), en donde un DNA de la región V que codifica una región variable de cadena ligera del anticuerpo humano monoclonal se deriva de un segmento de gen V seleccionado del grupo constituido por A30, DPK-15 (A19), DPK-24 (B3), y DPK-28 (A18);
\global\parskip1.000000\baselineskip
(vi)
el anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (i) a (v), en donde un DNA de la región V que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo humano monoclonal se deriva de un segmento de gen V seleccionado del grupo constituido por DP-54(3-07), DP-73(5-51) y DP-77(3-21) y en donde un DNA de la región variable que codifica una región variable de la cadena ligera del anticuerpo humano monoclonal se deriva de un segmento de gen seleccionado del grupo constituido por A30, DPK-15(A19), DPK-24(B-3) y DPK-28(A18).
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, la presente invención proporciona:
(a)
una célula que produce el anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de la presente invención;
(b)
la célula de acuerdo con (a), en donde la célula es una célula fusionada producida por fusión de una célula B de un mamífero que produce el anticuerpo humano monoclonal con una célula de mieloma derivada de un mamífero;
(c)
la célula de acuerdo con (a), en donde la célula es una célula recombinante, que ha sido transformada por uno cualquiera o ambos de DNA que codifica la cadena pesada y DNA que codifica la cadena ligera del anticuerpo humano monoclonal;
(d)
una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable;
(e)
la composición farmacéutica de acuerdo con (d), en donde la composición farmacéutica se utiliza para inhibir la transducción de señales en células inducidas por la fijación de un TGF-\beta humano a un receptor de TGF-\beta tipo II;
(f)
una composición farmacéutica para suprimir una fibrosis tisular, que comprende un anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de la presente invención que se fija a un receptor de TGF-\beta tipo II humano de tal modo que la transducción de señales en las células a través del receptor se suprime o se inhibe, y un vehículo farmacéuticamente aceptable;
(g)
la composición farmacéutica de acuerdo con (f), en donde la fibrosis tisular es fibrosis en el pulmón, hígado, riñón, o piel;
(h)
la composición farmacéutica de acuerdo con (g), en donde la fibrosis tisular es fibrosis en el riñón;
(i)
una composición farmacéutica para tratar o prevenir las enfermedades renales, que comprende un anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de la presente invención que se fija a un receptor humano TGF-\beta tipo II de tal modo que la transducción de señales en las células a través del receptor se suprime o se inhibe, y un vehículo farmacéuticamente aceptable;
(j)
una composición farmacéutica utilizada para suprimir o tratar nefroesclerosis, fibrosis pulmonar, cirrosis, restenosis vascular, arterioesclerosis, psoriasis, escleroderma, atopía, queloide, o artritis, que comprende un anticuerpo humano monoclonal o una porción del mismo de la presente invención que se fija a un receptor humano de TGF-\beta tipo II de tal modo que la transducción de señales en las células a través del receptor se suprime o se inhibe, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se describe en detalle más adelante en esta memoria por definición de los términos utilizados en esta memoria.
En esta memoria, "mamífero" incluye humano, bovino, cabra, conejo, ratón, rata, hámster, y cobayo; preferiblemente humano, conejo, rata, hámster y ratón; y de modo particularmente preferible humano, rata, hámster, y
ratón.
El término "mamífero excepto humano" y "mamífero no humano" hacen referencia en esta memoria al mismo significado que indica todos los mamíferos arriba definidos excepto los humanos.
"Aminoácido", utilizado en la presente invención, hace referencia a cualquier aminoácido existente en la naturaleza y preferiblemente los aminoácidos siguientes presentados por tripletes alfabéticos o códigos de una sola letra utilizados para representar aminoácidos:
(Gly/G) glicina, (Ala/A) alanina, (Val/V) valina, (Leu/L) leucina, (Ile/I) isoleucina, (Ser/S) serina, (Thr/T) treonina, (Asp/D) ácido aspártico, (Glu/E) ácido glutámico, (Asn/N) asparagina, (Gln/Q) glutamina, (Lys/K) lisina, (Arg/R) arginina, (Cys/C) cisteína, (Met/M) metionina, (Phe/F) fenilalanina, (Tyr/Y) tirosina, (Trp/W) triptófano, (His/H histidina, y (Pro/P) prolina.
Como se utiliza en esta memoria, el término "receptor humano" de TGF-B tipo II (al que se hace referencia también como "T\betaRII"), hace referencia a un receptor humano de TGF-\beta tipo II con la estructura y función descritas previamente en los informes arriba indicados (por ejemplo Cell, vol. 68, No. 4, p. 775-785, 1992; Adv. Immunol., vol. 55, p. 181-220, 1994; No. de Acceso a GenBank.: M85079).
Un receptor de TGF-\beta tipo II humano nativo tiene las propiedades estructurales y características que se describen más adelante.
El receptor humano de TGF-\beta tipo II es una proteína transmembranal constituida por 567 aminoácidos, que comprende un dominio extracelular (136 aminoácidos), un dominio transmembranal (30 aminoácidos), y un dominio citoplásmico (378 aminoácidos). Adicionalmente, el receptor de TGF-\beta tipo II es una proteína transmembranal simple cuyo dominio extracelular tiene un tamaño relativamente pequeño y que tiene la estructura de serina/treonina quinasa que contiene dos dominios quinasa. Adicionalmente, el dominio citoplásmico contiene una cadena de azúcar enlazada a ácido aspártico (Asp), y este dominio tiene 12 residuos cisteína (Cys) que proporcionan una estructura terciaria característica.
El dominio quinasa del receptor de TGF-\beta tipo II es una proteína quinasa específica para serina/treonina y comparte una homología de aproximadamente 43% con la del receptor de TGF-\beta tipo I. Este dominio de quinasa es esencial para la transducción de señales de TGF-\beta a las células (J. Biol. Chem., vol. 269, p. 30753, 1994).
El receptor de TGF-\beta tipo II es una molécula muy importante que transduce señales de TGF-\beta a la célula en concierto en el receptor de TGF-\beta tipo I. El receptor de TGF-\beta tipo II se fija a TGF-\beta por sí mismo. Se ha demostrado que la fijación de TGF-\beta al receptor de TGF-\beta tipo II causa la formación de un complejo hetero-tetrámero del receptor de TGF-\beta tipo II y el receptor de TGF-\beta tipo I en la superficie celular (J. Biol. Chem., vol. 269, p. 20172, 1994). Una vez que el complejo constituido por los dos receptores se forma en presencia de TGF-\beta, el receptor de TGF-\beta tipo II fosforila el dominio GS (véase arriba) del receptor de TGF-\beta tipo I y activa por consiguiente el receptor de TGF-\beta tipo I. Como resultado, se fosforilan otros sustratos intracelulares para translucir ulteriormente la señal TGF-\beta aguas abajo (Nature, vol. 370, p. 341, 1994).
Adicionalmente, el "receptor humano de TGF-\beta tipo II" de esta invención (al que se hace referencia también como "T\betaRII") incluye mutantes del receptor natural humano TGF-\beta tipo II, que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la de la estructura primaria nativa (secuencia de aminoácidos) descrita en los informes arriba mencionados.
En esta memoria, el término "mutantes del receptor natural humano de TGF-\beta tipo II que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos" hace referencia a las proteínas mutantes siguientes.
Específicamente, tales proteínas incluyen una proteína mutante que tiene una secuencia de aminoácidos en la cual uno o más aminoácidos, preferiblemente 1 a 10 aminoácidos, de modo particularmente preferible 1 a 5 aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos del receptor natural humano de TGF-\beta tipo II, están sustituidos, delecionados y/o modificados, y una proteína mutante que tiene una secuencia de aminoácidos en la cual uno o más aminoácidos, preferiblemente 1 a 10 aminoácidos, de modo particularmente preferible 1 a 5 aminoácidos, se añaden a la secuencia de aminoácidos, con tal que la proteína tenga sustancialmente las mismas propiedades biológicas que el receptor natural humano de TGF-\beta tipo II.
Adicionalmente, se incluye también un mutante que tiene una combinación de dos o más de las alteraciones anteriores que incluyen sustitución, deleción, modificación, y adición.
El receptor humano de TGF-\beta tipo II de la presente invención puede producirse por métodos conocidos en el campo técnico, tales como tecnología recombinante, síntesis química, y cultivo de células, o por métodos modificados de los mismos.
El receptor humano de TGF-\beta tipo II (al que se hace referencia también como "T\betaRII") de la presente invención incluye también "una porción" del receptor humano de TGF-\beta tipo II. El término "una porción" hace referencia en esta memoria a un polipéptido que comprende una secuencia arbitraria parcial de aminoácidos derivada del receptor humano de TGF-\beta tipo II arriba definido.
Preferiblemente, el mismo hace referencia al dominio extracelular del receptor humano de TGF-\beta tipo II arriba definido, o una parte arbitraria del mismo.
"Una porción" del receptor humano de TGF-\beta tipo II (preferiblemente, el dominio extracelular del receptor humano de TGF-\beta tipo II o cualquier porción de la misma) puede producirse de acuerdo con métodos conocidos en el campo técnico, o métodos modificados de los mismos, que incluyen tecnología recombinante y síntesis química. La misma puede producirse también por digestión apropiada del receptor humano de TGF-\beta tipo II aislado por el método de cultivo de células con proteasas y análogos.
El "anticuerpo humano monoclonal" de esta invención es un anticuerpo humano monoclonal que se fija al receptor humano de TGF-\beta tipo II arriba definido.
De modo más específico, un anticuerpo humano monoclonal incluye una inmunoglobulina humana todas cuyas regiones con inclusión de la región variable y la región constante de la cadena pesada (cadena H), y la región variable y la región constante de la cadena ligera (cadena L) que constituyen la inmunoglobulina proceden de genes que codifican una inmunoglobulina humana. La cadena L incluye la cadena humana kappa y la cadena humana lambda.
Un anticuerpo humano monoclonal que se fija al receptor humano de TGF-\beta tipo II de la presente invención es un anticuerpo humano monoclonal que suprime el crecimiento de las células humanas inducidos por TGF-\beta y que tiene opcionalmente las características arriba descritas.
De modo más específico, el término "anticuerpo monoclonal" hace referencia a diversos anticuerpos monoclonales con diversas propiedades y utilidades industriales descritas más adelante en los ejemplos y como se indican en los dibujos.
Un "anticuerpo humano monoclonal" de la presente invención puede prepararse por inmunización de un mamífero no humano transgénico productor de anticuerpos humanos con uno cualquiera de los inmunógenos (antígenos) siguientes:
(i)
células existentes naturalmente o líneas de células establecidas artificialmente que expresan el receptor humano de TGF-\beta tipo II arriba definido en la superficie celular;
(ii)
células recombinantes, que han sido preparadas por tecnología de DNA recombinante para expresar el receptor humano de TGF-\beta tipo II arriba definido en la superficie celular;
(iii)
lisado de células preparado por solubilización de las células de (i) o (ii), o fragmentos polipeptídicos del receptor humano de TGF-B tipo II purificado del lisado de células;
(iv)
células recombinantes, que se han preparado por tecnología de DNA recombinante para expresar una porción del receptor humano de TGF-\beta tipo II arriba definido (se prefieren particularmente el dominio extracelular o un péptido arbitrario del mismo), como un polipéptido soluble;
(v)
sobrenadante de cultivo obtenido por cultivo de las células recombinantes de (iv), o el polipéptido del dominio extracelular del receptor humano de TGF-\beta tipo II purificado a partir del sobrenadante de cultivo (receptor humano soluble de TGF-\beta tipo II); y
(vi)
receptor humano de TGF-B tipo II parcial sintetizado químicamente (se prefieren particularmente, el dominio extracelular o un péptido arbitrario del mismo).
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, puede obtenerse también un anticuerpo humano monoclonal de la presente invención a partir del sobrenadante de cultivo de las "células recombinantes" de la presente invención, células que producen anticuerpos humanos monoclonales recombinantes. Las células recombinantes se preparan utilizando tecnología de DNA recombinante por transformación de células hospedadoras con cDNAs que codifican la cadena pesada y la cadena ligera respectivas del anticuerpo humano monoclonal de la presente invención.
Adicionalmente, un anticuerpo humano monoclonal de la presente invención puede ser uno cualquiera de los isotipos que incluyen IgG (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgM, IgA (IgA1 e IgA2), IgD, o IgE; preferiblemente IgG (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4); y más preferiblemente IgG1, IgG2 o IgG4. Se prefiere particularmente IgG4.
Un anticuerpo humano monoclonal de la presente invención puede producirse por inmunización de mamíferos no humanos transgénicos productores de anticuerpos humanos, tales como los ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos descritos más adelante, con uno cualquiera de los inmunógenos (antígenos) arriba descritos como (i) a (vi). Tales anticuerpos humanos monoclonales se pueden preparar por métodos convencionales para la preparación de anticuerpos monoclonales.
Específicamente, se inmunizan mamíferos no humanos transgénicos productores de anticuerpos humanos, por ejemplo con un antígeno arriba mencionado junto con adyuvante de Freund, en caso necesario. Pueden obtenerse anticuerpos policlonales a partir del suero obtenido del animal inmunizado. Los anticuerpos monoclonales se producen como sigue. Se producen hibridomas (células fusionadas) por fusión de las células productoras de anticuerpos obtenidas a partir del animal inmunizado y células de mieloma incapaces de producir autoanticuerpos. A continuación se clonan los hibridomas, y los clones que producen los anticuerpos monoclonales que exhiben afinidad específica para el antígeno utilizado para la inmunización del mamífero se someten a cribado.
Más específicamente, puede producirse un anticuerpo monoclonal como sigue. Se realizan inmunizaciones por inyección o implantación una o varias veces de un inmunógeno de uno cualquiera de (i) a (iii) anteriores, en caso necesario, con adyuvante de Freund, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, en la planta del pie, o por vía intraperitoneal en el mamífero no humano transgénico productor de anticuerpos humanos (se prefiere particularmente el "ratón transgénico productor de anticuerpos humanos" descrito más adelante). Usualmente, las inmunizaciones se realizan 1 a 4 veces cada 1 a 14 días después de la primera inmunización. Se obtienen células productoras de anticuerpos a partir del mamífero inmunizado en aproximadamente 1 a 5 días después de la última inmunización. El número de veces y el intervalo entre inmunizaciones pueden alterarse adecuadamente de acuerdo con las propiedades del inmunógeno utilizado.
Hibridomas (células fusionadas) que secretan anticuerpos humanos monoclonales pueden prepararse de acuerdo con el método de Köhler y Milstein (Nature, Vol. 256, pp. 495-497 (1975)) y métodos modificados del mismo. A saber, se preparan hibridomas por fusión de células productoras de anticuerpos de bazo, ganglio linfático, médula ósea, o amígdala del mamífero no humano transgénico productor de anticuerpos humanos, inmunizado como se ha mencionado arriba, preferiblemente de bazo, con mielomas sin capacidad de producción de autoanticuerpos, que se derivan preferiblemente de mamífero, tal como ratón, rata, cobayo, hámster, conejo o humano, o más preferiblemente, de ratón, rata, o humano.
Por ejemplo, pueden utilizarse como mieloma para la fusión celular los mielomas derivados de ratón P3/X63-AG8.653 (653, ATCC No. CRL1580), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), PAI, F0, o BW5147; el mieloma derivado de rata 210RCY3-Ag.2.3.; o los mielomas derivados de humano U-266AR1, GM1500-6ETG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11, o CEM-T15.
Las células productoras de anticuerpos monoclonales (v.g., hibridomas) pueden cribarse por cultivo de las células, por ejemplo, en placas de microtitulación y por medida de la reactividad del sobrenadante de cultivo en el pocillo en el que se observa el crecimiento de hibridoma, respecto al inmunógeno utilizado para la inmunización arriba mencionada, por ejemplo, por un inmunoensayo enzimático, tal como un radio-inmunoensayo (RIA) y ensayo de inmunosolvente (sic) unido a enzima (ELISA).
Puede producirse un anticuerpo monoclonal a partir de hibridoma por cultivo del hibridoma in vitro o in vivo, tal como en la ascitis de ratón, rata, cobayo, hámster, o conejo, preferiblemente ratón o rata, más preferiblemente ratón, y aislamiento del anticuerpo a partir del sobrenadante de cultivo resultante o fluido de ascitis de un mamífero.
Adicionalmente, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales en gran cantidad por clonación de genes que codifican un anticuerpo monoclonal a partir de un hibridoma o "célula recombinante" productora de un anticuerpo humano monoclonal recombinante de la represente invención descrito más adelante, generación de un animal transgénico, tal como bovino, cabra, oveja, o cerdo, en el cual se integran los genes que codifican el anticuerpo monoclonal en su genoma endógeno utilizando técnicas de generación de animales transgénicos, y recuperación del anticuerpo monoclonal derivado del gen de anticuerpo humano monoclonal a partir de la leche de los animales transgénicos (Nikkei Science, abril, pp. 78-94 (1997)).
El cultivo de células productoras de anticuerpos monoclonales in vitro puede realizarse dependiendo de la propiedad de las células a cultivar, del objeto de un test/estudio, y de diversos cultivos, utilizando medios nutrientes conocidos o cualquier medio nutriente derivado de medios basales conocidos para crecimiento, mantenimiento y almacenamiento de los hibridomas a fin de producir anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de cultivo.
Ejemplos de medios basales son medios con baja concentración de calcio, tales como medio Ham' F12, medio MCDB153, y medio MEM con baja concentración de calcio; y medios con alta concentración de calcio, tales como medio MCDB104, medio MEM, medio D-MEM, medio RPMI1640, medio ASF104, y medio RD. El medio basal puede contener, por ejemplo, sueros, hormonas, citoquinas, y/o diversas sustancias inorgánicas u orgánicas dependiendo del objetivo.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse del sobrenadante de cultivo o ascitis arriba mencionado por precipitación con sulfato de amonio saturado, método de precipitación con euglobulina, método del ácido caproico, método del ácido caprílico, cromatografía de intercambio iónico (DEAE o DE52), cromatografía de afinidad utilizando columna anti-inmunoglobulina o columna de proteína A.
Los anticuerpos humanos monoclonales de la presente invención incluyen también un anticuerpo monoclonal que comprende la cadena pesada y/o la cadena ligera en donde cualquiera de las dos o ambas cadenas tienen deleciones, sustituciones o adiciones de uno o más aminoácidos en las secuencias de las mismas.
El término "uno o más aminoácidos" significa en esta memoria uno o más residuos de aminoácidos, e indica específicamente 1 a 10 residuos de aminoácido, preferiblemente 1 a 5 residuos de aminoácidos.
La modificación parcial (deleción, sustitución, inserción, y adición) de la secuencia de aminoácidos arriba descrita puede introducirse en los anticuerpos humanos monoclonales de la presente invención por modificación parcial de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos. La modificación parcial de la secuencia de nucleótidos puede realizarse por métodos convencionales tales como mutagénesis orientada (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, p. 5662-5666, 1984).
El "mamífero no humano transgénico productor de anticuerpos humanos" de la presente invención, en particular, la realización preferible, ratón transgénico productor de anticuerpos humanos, puede prepararse de acuerdo con métodos conocidos por la bibliografía (Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Traducción Publicada del Japonés de la Publicación Internacional No. Hei 4-504365; Traducción Publicada del Japonés de la Publicación Internacional No. Hei 7-509137; Nikkei Science, junio, p. 40-50, 1995; Publicación Internacional WO94/25585; Nature, Vol. 368, p. 856-859, 1994; Traducción Publicada del Japonés de la Publicación Internacional No. Hei 6-500233; etc.).
Los ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos pueden producirse, específicamente, por ejemplo, por los procesos siguientes; otros mamíferos transgénicos no humanos productores de anticuerpos humanos pueden producirse de la misma manera.
(1) Un proceso para preparar ratones con un gen silenciado ("knockout"), cuyo locus del gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno ha sido desactivado funcionalmente, desactivación que puede realizarse por sustitución de al menos una porción del locus del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina endógeno del ratón por un gen de resistencia a los fármacos (el gen de resistencia a neomicina, etc.) por recombinación homóloga;
(2) un proceso para preparar ratones knockout cuyo locus del gen de la cadena ligera de inmunoglobulina endógena (en particular un locus del gen de la cadena \kappa) ha sido desactivado funcionalmente, por lo que la desactivación se realiza por sustitución de al menos una porción del locus del gen de la cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógena por un gen resistente a los fármacos (el gen de resistencia a neomicina, etc.) mediante recombinación homóloga;
(3) un proceso para preparar ratones transgénicos en el cual una porción deseada del locus del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina humana se ha integrado en un cromosoma de ratón utilizando un vector, tal como un vector de cromosoma artificial de levadura (YAC), capaz de transportar genes megabase;
(4) un proceso para preparar ratones transgénicos en el cual una porción deseada del locus del gen de la cadena ligera de inmunoglobulina humana (un gen \kappa en particular) ha sido integrado en el cromosoma de un ratón utilizando un vector, tal como vector YAC, capaz de transportar genes megabase;
(5) un proceso para preparación de ratones transgénicos en el cual tanto la cadena pesada endógena de ratón como los loci del gen de la cadena ligera han sido desactivados funcionalmente y ambas porciones deseadas de los loci de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera de inmunoglobulina humana han sido integradas en un cromosoma, cuya preparación se consigue por reproducción cruzada, en orden arbitrario, de los ratones transgénicos silenciados y los ratones transgénicos descritos arriba en (1) a (4).
Los ratones con un gen silenciado arriba mencionados pueden prepararse por sustitución de cualquier región adecuada del locus del gen de inmunoglobulina endógena del ratón por un gen marcador extraño (gen de resistencia a neomicina, etc.) mediante recombinación homóloga de tal modo que el locus del gen de inmunoglobulina puede desactivarse a fin de no causar una transposición del locus del gen. Por ejemplo, puede utilizarse el método designado como selección positivo-negativa (PNS) para la desactivación por recombinación homóloga (Nikkei Science, edición de Mayo, p. 52-62, 1994).
La desactivación funcional del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina puede realizarse, por ejemplo, por introducción de una lesión en una porción de la región J o una porción de la región C (la región C\mu, por ejemplo). La desactivación funcional de la cadena ligera de inmunoglobulina (cadena \kappa, por ejemplo) puede realizarse también, por ejemplo, por introducción de una lesión en una porción de la región J, una porción de la región C, o una región que se extiende desde la región J a la región C.
El ratón transgénico puede prepararse de acuerdo con métodos convencionales utilizados para producir animales transgénicos (por ejemplo, véase "Newest Manual of Animal Cell Experiment", LIC Press, capítulo 7, pp. 361-408, (1990)). Específicamente, por ejemplo, puede producirse un ratón transgénico como sigue. Se fusionan células del tallo embrionario (células ES) negativas en hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HPRT) obtenidas de un blastocisto de ratón normal por el método de fusión de esferoplastos con una célula de levadura que contiene un vector YAC, en donde se han insertado el gen que codifica el locus de la cadena pesada o el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina humana, o su fragmento, y un gen HPRT. Las células ES en las cuales el gen extraño se ha integrado en el genoma endógeno del ratón se criban por el método de selección HAT. A continuación, las células ES cribadas se microinyectan en un huevo fertilizado (blastocisto) obtenido de otro ratón normal (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, no. 12, pp. 7380-7384 (1980); Patente de EE.UU. No. 4.873.191). El blastocisto se transplanta en el útero de otro ratón normal como la madre de acogida. A continuación, se deja que nazcan ratones transgénicos quiméricos a partir del ratón que actúa como madre de acogida. Por apareamiento de los ratones transgénicos quiméricos con ratones normales, se obtienen ratones transgénicos heterocigóticos. Por apareamiento de los ratones transgénicos heterocigóticos entre sí, se obtienen ratones transgénicos homocigóticos de acuerdo con las leyes de Mendel.
El término "porción de un anticuerpo monoclonal" utilizado en esta memoria se refiere a una región parcial del anticuerpo humano monoclonal de la presente invención como se ha mencionado arriba, y específicamente, incluye F(Ab')_{2}, Fab', Fab, Fv (fragmento variable de anticuerpo), sFv, dsFv, (Fv esterilizado con disulfuro), o dAb (anticuerpo de dominio simple), (Exp. Opin. Ther. Patents, No. 6, No. 5, pp. 441-456 (1996)).
"F(ab')_{2}" y "Fab' " pueden producirse por tratamiento de inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) con una proteasa, tal como pepsina y papaína, y se refieren a fragmentos de anticuerpos generados por digestión de inmunoglobulina cerca de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones bisagra en cada una de las dos cadenas H. Por ejemplo, la papaína escinde IgG aguas arriba de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones bisagra en cada una de las dos cadenas H para generar dos fragmentos de anticuerpos homólogas en los cuales una cadena L compuesta de V_{L} (región variable de la cadena L) y C_{L} (región constante de la cadena L), y un fragmento de cadena H compuesto de V_{H} (región variable de la cadena H) y C_{H}\gamma1 (región \gamma1 en la región constante de la cadena H) están conectadas a sus regiones C-terminales a través de un enlace disulfuro. Cada uno de estos dos fragmentos de anticuerpos homólogos se denomina Fab'. La pepsina escinde también IgG aguas abajo de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones bisagra en cada una de las dos cadenas H para generar un fragmento de anticuerpo ligeramente mayor que el fragmento en el cual se conectan los dos Fab' arriba mencionados en la región bisagra. Este fragmento de anticuerpo se denomina F(ab')_{2}.
El término "célula productora de anticuerpos monoclonales" o "célula recombinante" productora del anticuerpo humano monoclonal recombinante de esta invención se refiere a cualquier célula que produzca el anticuerpo humano monoclonal de esta invención arriba descrito.
Ejemplos específicos incluyen las células siguientes:
(1) células B productoras de anticuerpos humanos monoclonales que pueden obtenerse a partir del mamífero transgénico no humano productor de anticuerpos humanos arriba descrito, animal que puede producirse por inmunización del animal con el inmunógeno arriba definido (antígeno).
(2) el hibridoma (célula fusionada) arriba descrito preparado por fusión del anticuerpo humano monoclonal que produce células B arriba descrito con mielomas derivados de mamífero; y
(3) una célula recombinante que produce un anticuerpo monoclonal recombinante humano obtenido por transformación de otra célula distinta de la célula B y el hibridoma (v.g., célula de ovario de hámster chino (CHO), célula de riñón de cría de hámster (BHK), etc.) con genes que (sea el gen codificante de la cadena pesada o el gen codificante de la cadena ligera, o ambos) codifican el anticuerpo humano monoclonal aislado del anticuerpo monoclonal aislado de la célula B o el hibridoma productores del anticuerpo humano monoclonal.
Las células recombinantes productoras de anticuerpo humano monoclonal recombinantes de (3) hacen referencia a las células recombinantes que dan lugar a productos recombinantes del anticuerpo humano monoclonal producido por las células B de (1) o los hibridomas de (2).
La "sustancia" descrita en esta memoria, específicamente "sustancia que se fija a un receptor TGF tipo II-\beta humano de tal manera que la transducción de las señales en las células a través del receptor se suprime o se inhibe", abarca sustancias existentes naturalmente y sustancias arbitrarias preparadas artificialmente.
Adicionalmente, la sustancia incluye una sustancia arbitraria que se fija competitivamente al receptor TGF tipo II-\beta con el ligando in vivo, TGF-\beta, del receptor.
Las sustancias pueden clasificarse en "sustancia proteinácea" y "sustancia no proteinácea".
La "sustancia proteinácea" incluye polipéptidos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, y una porción del anticuerpo monoclonal.
Cuando la sustancia es un anticuerpo, se prefiere un anticuerpo monoclonal. Cuando la sustancia es un anticuerpo monoclonal, la misma incluye no sólo anticuerpos monoclonales derivados de un mamífero no humano, sino también anticuerpos monoclonales quiméricos recombinantes, anticuerpos monoclonales humanizados recombinantes, y el arriba mencionado "anticuerpo humano monoclonal".
Cuando la sustancia es un polipéptido distinto de un anticuerpo, la misma incluye un polipéptido arbitrario, fragmentos del polipéptido (oligopéptidos), polipéptidos fusionados, y modificaciones químicas de los mismos. El oligopéptido incluye un péptido sustituido por 5 a 30 aminoácidos, preferiblemente 5 a 20 aminoácidos. El péptido modificado químicamente puede diseñarse dependiendo de diversos propósitos, tales como el aumento de la semivida en sangre cuando se administra el mismo a un organismo vivo o para mejorar la resistencia a la degradación o absorción en el tracto digestivo cuando el mismo se administra por vía oral.
La "sustancia no proteinácea" incluye compuestos arbitrarios sintetizados químicamente o sustancias químicas arbitrarias aisladas de animales y plantas (por ejemplo, plantas, microorganismos, bacterias, insectos, peces, y crustáceos). Específicamente, una sustancia de este tipo es un compuestos con un peso molecular de aproximadamente 100 a 1.000 Da o menor, preferiblemente un compuesto con un peso molecular de aproximadamente 100 a 800 Da, más preferiblemente un compuesto con un peso molecular de 100 a 600 Da.
El término "composición farmacéutica" tal como se hace referencia al mismo en la presente invención significa una composición útil como compuesto farmacéutico que comprende como ingrediente activo un anticuerpo humano monoclonal que se fija al receptor humano TGF-\beta de tipo II de la presente invención o una porción del mismo, o la "sustancia que se fija a un receptor humano TGF-\beta tipo II de tal modo que la transducción de señales en las células por el receptor se suprime o se inhibe", arriba mencionada, y que comprende un "vehículo farmacéuticamente aceptable".
El "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye excipientes, diluyentes, expansores, agentes desintegrantes, estabilizadores, conservantes, tampón, emulsionantes, aromáticos, colorantes, edulcorantes, agentes aumentadores de la viscosidad, extractos aromatizantes, agentes de disolución, u otros aditivos.
Utilizando uno o más de tales vehículos, una composición farmacéutica puede formularse en tabletas, píldoras, polvos, gránulos, inyecciones, soluciones, cápsulas, trociscos, elixires, suspensiones, emulsiones, o jarabes.
La composición farmacéutica puede administrarse por vía oral o parenteral. Otras formas para administración parenteral incluyen soluciones para aplicación externa, supositorios para administración rectal, y pesarios, prescritos por métodos usuales, que comprenden uno o más ingredientes activos.
La dosificación puede variar dependiendo de la edad, el sexo, el peso, y los síntomas de un paciente, el efecto del tratamiento, la ruta de administración, el periodo de tratamiento, o la clase de ingrediente activo (proteína o anticuerpo arriba mencionado) contenida en la composición farmacéutica. Usualmente, la composición farmacéutica puede administrarse a un adulto una dosis de 10 \mug a 1000 mg (o 10 \mug a 500 mg) por administración. Dependiendo de diversas condiciones, puede ser suficiente en algunos casos una dosificación menor, y puede ser necesaria en otras clases una mayor dosificación.
En particular, puede producirse una inyección por disolución o suspensión del anticuerpo en un vehículo no tóxico farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina fisiológica o agua destilada disponible comercialmente para inyecciones, por ajuste de la concentración a 0,1 \mug anticuerpo/ml de vehículo hasta 10 mg de anticuerpo/ml de vehículo.
La inyección así producida puede administrarse a un paciente humano que se encuentra en necesidad de tratamiento en una dosis de 1 \mug a 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente 50 \mug a 50 mg/kg de peso corporal, una o más veces al día. Ejemplos de rutas de administración son rutas de administración médicamente apropiadas, tales como inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular, o inyección intraperitoneal, preferiblemente inyección intravenosa.
La inyección puede prepararse también en un diluyente no acuoso (por ejemplo, propilenglicol; polietilenglicol; aceite vegetal, tal como aceite de oliva; y alcoholes, tales como etanol), suspensión, o emulsión.
La inyección puede esterilizarse por filtración con un filtro no penetrable por las bacterias, por mezcla de bacteriocida, o por irradiación. La inyección puede prepararse en el momento de su utilización. Es decir, la misma se liofiliza para preparar una composición sólida estéril, y puede disolverse en agua destilada estéril para inyección u otro disolvente antes de su utilización.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son útiles para inhibir la transducción de la señal TGF-\beta a células mediadas por el receptor de TGF-\beta tipo II, señal que está asociada con diversos estados mórbidos y las apariciones de enfermedades.
Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son útiles como productos farmacéuticos para tratar o prevenir enfermedades por supresión o inhibición del comienzo y/o progreso de diversas enfermedades: por ejemplo, enfermedades renales (fibrosis renal, nefritis, insuficiencia renal, nefroesclerosis, etc.); enfermedades pulmonares (v.g., fibrosis pulmonar, neumonía, etc.); enfermedades hepáticas (v.g., fibrosis de tejido hepático, cirrosis, hepatitis, etc.); enfermedades de la piel (v.g., heridas, escleroderma, psoriasis, queloide, etc.); artritis (v.g., artritis reumatoide, osteoartritis, etc.); enfermedades vasculares (v.g., restenosis vascular, vasculitis reumática, etc.); tejidos fibrosos en diversos órganos (con inclusión de fibrosis tisular complicada con diversos cánceres), y arterioesclerosis (con inclusión de fibrosis tisular complicada).
Los anticuerpos humanos monoclonales de la presente invención o composiciones farmacéuticas de los mismos son particularmente útiles como productos farmacéuticos de anticuerpos debido a que algunos no inducen inmunorrechazo del hospedador causado por HAMA (anticuerpo humano anti-ratón) dado que los anticuerpos monoclonales se derivan de humanos.
Los efectos terapéuticos de la composición farmacéutica de la presente invención sobre diversas enfermedades pueden examinarse y evaluarse de acuerdo con métodos convencionales por administración de la composición a animales conocidos como modelos de enfermedad.
Por ejemplo, la evaluación del efecto terapéutico sobre la fibrosis renal, que es una fibrosis tisular y una enfermedad renal, puede realizarse por un método que utiliza un ratón modelo de insuficiencia renal (modelo de obstrucción ureteral unilateral (UUO)), en el cual la ligación ureteral unilateral obstruye la filtración renal de la sangre en el riñón y da como resultado insuficiencia renal en el ratón. Después de administración de la composición farmacéutica de la invención al ratón, el examen se realiza por medida del grado de inhibición de un aumento de producción de hidroxiprolina, que es un índice de la aparición de nefritis y fibrosis renal inducidas por la insuficiencia renal. Una disminución en la concentración de hidroxiprolina indica la eficacia de la composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad renal.
Adicionalmente, un método alternativo comprende administración de una composición farmacéutica de la presente invención a una rata modelo en el cual la nefritis es inducida por administración de un anticuerpo contra Thy-1, un marcador de la superficie celular, y medida de las cantidades de proteína excretadas en la orina, el nivel de creatinina en suero, y los niveles reducidos de producción de matriz extracelular (fibronectina, colágeno tipo I, etc.), que son todos ellos índices de la aparición de nefritis y fibrosis renal que son inducidas por la insuficiencia funcional del riñón (Nephron, vol. 78, p. 453-463, 1998; Kidney Blood Press Res., vol. 22, p. 5-12, 1999). La cantidad reducida de proteína en la orina, el nivel reducido de creatinina en suero, y las cantidades reducidas de fibronectina y colágeno tipo I demuestran el efecto de la composición farmacéutica para tratamiento de enfermedades
renales.
Utilizando los animales modelo descritos en detalle en la bibliografía ("Preparation of animals as disease models: Testing and experimental methods for the development of new drugs", p. 34-46, 1993, Technological Information Society), puede realizarse la evaluación de enfermedades renales que incluyen, por ejemplo, enfermedad glomerular de cambio mínimo (por ejemplo, síndrome nefrótico de cambio mínimo (MCNS)), esclerosis focal glomerular (FGS), glomerulonefritis membranosa (nefropatía membranosa (MN)), nefropatía de IgA, glomerulonefritis mesangial proliferativa, glomerulonefritis aguda post-estreptocócica (APSGN), glomerulonefritis semilunar (extracapilar), nefritis intersticial, e insuficiencia renal aguda.
Utilizando los animales modelo descritos en detalle en la bibliografía ("Preparation of animals as disease models: Testing and experimental methods for the development of new drugs" p. 229-235, 1993, Technological Information Society), puede realizarse la evaluación de enfermedades de la piel que incluyen, por ejemplo, heridas, queloide, atopía, dermatitis, escleroderma, y psoriasis.
Utilizando los animales modelo descritos en detalle en la bibliografía ("Preparation of animals as disease models: Testing and experimental methods for the development of new drugs" p. 349-358, 1993, Technological Information Society), puede realizarse la evaluación de enfermedades hepáticas que incluyen, por ejemplo, hepatitis (por ejemplo, hepatitis viral (tipo A, tipo B, tipo C, tipo E, etc.)), cirrosis, y lesiones hepáticas inducidas por drogas.
Por ejemplo, el efecto sobre la arterioesclerosis y la restenosis puede evaluarse utilizando una rata modelo de restenosis, en el cual se provoca pseudo-restenosis por angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) con catéter-balón insertado en la aorta.
Un DNA que codifica el receptor humano TGF-\beta tipo II utilizado en la presente invención puede prepararse por métodos convencionales: clonación de cDNA a partir de mRNA codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II, aislamiento de DNA genómico y remodelación del mismo, PCR utilizando la secuencia de cDNA o mRNA como molde, síntesis química, etcétera.
Un DNA codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II de esta invención puede prepararse por escisión (digestión) de cada DNA codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II como se ha preparado arriba con una enzima de rescisión apropiada, y ligación de los receptores de DNA obtenidos, en combinación con un DNA enlazador o marcador en caso necesario, utilizando una DNA-polimerasa apropiada y análogos.
El cDNA que codifica el receptor humano TGF-\beta tipo II (al que se hace referencia en lo sucesivo como la proteína deseada) puede clonarse a partir de mRNA mediante, por ejemplo, el método descrito a continuación.
En primer lugar, se prepara el mRNA que codifica la proteína deseada a partir de tejidos o células que expresan y producen la proteína deseada. El mRNA puede prepararse por aislamiento de RNA total por un método conocido, tal como el método del tiocianato de guanidina (Biochemistry, vol. 18, p. 5294, 1979), el método del fenol caliente, o el método AGPC, y sometimiento del mismo a cromatografía de afinidad utilizando oligo-dT-celulosa o poli-U-Sepharosa.
A continuación, utilizando el mRNA obtenido como molde, se sintetizan cDNAs, por ejemplo, por métodos bien conocidos utilizando transcriptasa inversa, tales como el método de Okayama et al (Mol. Cell. Biol. Vol. 2, p. 161 (1982); ibid, vol. 3, p. 280 (1983)) o el método de Hoffman et al. (Gene vol. 25, p. 263 (1983)), y se convierte en cDNAs bicatenarios. Se prepara una genoteca de cDNA por transformación de E. coli con vectores de plásmido, vectores de fago, o vectores de cósmido que tienen dichos cDNAs o por transfección de E. coli después de empaquetamiento in vitro.
Los vectores de plásmido utilizados en esta invención no están limitados con tal que los mismos se repliquen y mantengan en hospedadores. Puede utilizarse también cualquier vector de fago que pueda replicarse en hospedadores. Ejemplos de los vectores de clonación utilizados habitualmente son pUC19, \lambdagt10, \lambdagt11, etcétera. Cuando el vector se aplica a cribado inmunológico como se menciona más adelante, se utiliza preferiblemente un vector que tenga un promotor que permita expresar un gen que codifique la proteína deseada en un hospedador.
Puede insertarse cDNA en un plásmido de acuerdo con, por ejemplo, el método de Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.53, 1989). Puede insertarse cDNA en un vector de fago de acuerdo con, por ejemplo, el método de Hyunh et al. (DNA cloning, a practical approach, vol. 1, p.49 (1985)). Estos métodos pueden realizarse de manera sencilla por medio de un kit de clonación disponible comercialmente (por ejemplo, un producto de TAKARA). El plásmido recombinante o vector de fago así obtenido se introduce en una célula hospedadora apropiada, tal como un procariota (por ejemplo, E. coli: HB101, DH5\alpha, Y1090, DH10B, MC1061/P3, etc.).
Ejemplos de un método para introducir un plásmido en un hospedador son el método del cloruro de calcio, el método del cloruro de calcio/cloruro de rubidio, y el método de electroporación, descritos en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.74, 1989)). Pueden introducirse vectores de fago en células hospedadoras mediante, por ejemplo, un método en el cual los DNAs de fago se introducen en hospedadores de crecimiento después de empaquetamiento in vitro. El empaquetamiento in vitro puede realizarse fácilmente con un kit de empaquetamiento in vitro disponible comercialmente (por ejemplo, un producto de STRATAGENE o AMERSHAM).
El cDNA que codifica la proteína deseada puede aislarse de la genoteca de cDNA así preparada de acuerdo con el método arriba mencionado por combinación de los métodos generales de cribado de cDNA.
Por ejemplo, un clon que comprende el cDNA deseado puede cribarse por un método de hibridación de colonias conocido (Crunstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 72, p. 3961 (1975)) o método de hibridación en placa (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 2.108 (1989)) utilizando como sondas oligonucleótidos marcados con ^{32}T sintetizados químicamente, que corresponden a la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada. Alternativamente, puede cribarse un clon que tiene un fragmento de DNA que codifica una región específica dentro de la proteína deseada por amplificación de la región mediante PCR con iniciadores PCR sintéticos.
Cuando se utiliza una genoteca de cDNA preparada utilizando un vector de expresión de cDNA (por ejemplo, el vector de fago \lambdaGT11), el clon deseado puede cribarse por la reacción antígeno-anticuerpo utilizando un anticuerpo contra la proteína deseada. Se emplea preferiblemente un método de cribado que utiliza el método PCR cuando se someten a cribado muchos clones.
La secuencia de nucleótidos del DNA obtenido puede determinarse por el método de Maxam-Gilbert (Maxam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 74, p. 160 (1977) o el método sintético de terminación de cadenas de didesoxinucleótidos, utilizando el fago M13 (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 74, pp. 5463-5467 (1977)). La totalidad o una parte del gen que codifica la proteína deseada puede obtenerse por escisión del clon obtenido como se ha mencionado arriba con enzimas de restricción, etcétera.
Adicionalmente, el DNA que codifica la proteína deseada puede aislarse del DNA genómico derivado de las células que expresan la proteína deseada como se ha mencionado arriba por los métodos siguientes.
Dichas células se solubilizan preferiblemente por SDS o proteinasa K, y los DNAs se desproteinizan por extracción repetida con fenol. Los RNAs se digieren preferiblemente con ribonucleasa. Los DNAs obtenidos se digieren parcialmente con enzimas de restricción apropiadas, y los fragmentos de DNA obtenidos se amplifican con fago o cósmido apropiados para generar una genoteca. A continuación, los clones que tienen la secuencia deseada se detectan, por ejemplo, por sondas de DNA marcadas radiactivamente, y el todo o una porción del gen que codifica la proteína deseada se obtiene a partir de los clones por escisión con enzimas de restricción, etc.
Un DNA que codifica una proteína deseada puede prepararse por los métodos PCR convencionales utilizando mRNA o cDNA conocidos de la proteína deseada como molde (método Gene Amplification PCR, Basics and Novel Development, Kyoritsu Publishers, 1992, etc.).
Un DNA codificante de una proteína deseada puede producirse también por síntesis química de acuerdo con métodos usuales basados en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína.
El receptor humano de TGR-\beta tipo II de la presente invención o una porción del mismo (preferiblemente, el dominio extracelular) puede prepararse como una proteína recombinante de acuerdo con una tecnología recombinante convencional utilizando DNA obtenido por digestión del DNA codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II (el cDNA o el DNA genómico que comprende intrones) preparado por el método arriba indicado con enzimas de restricción apropiadas; ligación del o de los fragmentos de DNA resultantes que codifican el receptor humano TGF-\beta tipo II, de acuerdo con las necesidades, con un DNA enlazador o marcador que utiliza una DNA-polimerasa apropiada u otras enzimas.
Específicamente, la preparación de la proteína se ilustra como sigue: la construcción de DNA como se ha preparado arriba se inserta en un vector, descrito más adelante en detalle, para obtener un vector de expresión; una célula hospedadora, que se describirá más adelante en esta memoria, se transforma con el vector de expresión para obtener un transformante; las células resultantes deseadas se cultivan para la producción y acumulación de la proteína deseada en el sobrenadante de cultivo; la proteína acumulada en el sobrenadante de cultivo puede purificarse fácilmente por utilización de cromatografía en columna, etc.
Un vector de expresión disponible para la producción del receptor recombinante humano TGF-\beta tipo II (o dominio extracelular del mismo) no está limitado particularmente con tal que el mismo pueda ser retenido por replicación o automultiplicación en diversas células hospedadoras de células procariotas y/o eucariotas, con inclusión de vectores de plásmido y vectores de fago (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985).
El vector de expresión puede prepararse fácilmente por ligación de acuerdo con métodos convencionales de un DNA codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II (o dominio extracelular) con un vector para recombinación disponible en la técnica (DNA plasmídico y DNA de bacteriófago). Ejemplos específicos de los vectores para recombinación son plásmidos derivados de E. coli tales como pBR322, pBR125, pUC12, pUC13, y pUC19; plásmidos derivados de levadura, tales como pSH19 y pSH15; y plásmidos derivados de Bacillus subtilis, tales como pUB110, pTP5, y pC194. Ejemplos de fagos son bacteriófagos, tales como el fago \lambda; y un virus de animal o insecto (pVL1393, Invitrogen), tal como un retrovirus, virus vaccinia, y virus de la polihedrosis nuclear.
Un vector plasmídico es útil para expresar el DNA codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II de esta invención o su dominio extracelular soluble, para la expresión del receptor humano TGF-\beta tipo II en la superficie de las células del hospedador, y para producción del dominio soluble extracelular del receptor humano TGF-\beta tipo II. El vector plasmídico no está limitado con tal que el mismo exprese un gen codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II o su dominio soluble extracelular en diversas células hospedadoras procariotas y/o eucariotas y produzca el polipéptido. Ejemplos de los mismos incluyen pMAL C2, pcDNA3.1 (-), pEF-BOS (Nucleic Acids Res. Vol.18, p.5322 (1990) etcétera), pME18S (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992) etcétera), etc.
Cuando se utilizan bacterias, particularmente E. coli, como células hospedadoras, un vector de expresión comprende generalmente, al menos, una región promotora/operadora, un codón de iniciación, un DNA codificante de la proteína de la presente invención, un codón de terminación, una región terminadora, y un replicón.
Cuando se utilizan células de levadura, células de animales o células de insecto como hospedadoras, un vector de expresión comprende preferiblemente, al menos, un promotor, un codón de iniciación, un DNA codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II (o su dominio extracelular) de la presente invención, y un codón de terminación. El mismo puede comprender también un DNA codificante de un polipéptido señal, secuencia intensificadora, regiones 5' y 3' no traducidas del gen codificante del receptor humano TGF-\beta tipo II de la presente invención, uniones de remodelación, sitio de poliadenilación, región marcadora seleccionable, y replicón. El vector de expresión puede contener también, en caso requerido, un gen para amplificación génica (marcador) que se utiliza usualmente de acuerdo con los propósitos.
Una región promotora/operadora para expresar el receptor humano TGF-\beta tipo II (o su dominio extracelular) de la presente invención en bacterias comprende un promotor, un operador, y una secuencia Shine-Dalgarno (SD) (por ejemplo, AAGG). Por ejemplo, cuando el hospedador pertenece al género Escherichia, el mismo comprende preferiblemente el promotor Trp, el promotor lac, el promotor recA, el promotor \lambdaPL, el promotor lpp, el promotor tac, o análogos.
Ejemplos de un promotor que expresa el receptor humano TGF-\beta tipo II (o su dominio extracelular) de la presente invención en levadura son el promotor PH05, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH, etcétera. Cuando el hospedador pertenece al género Bacillus, ejemplos del mismo son el promotor SL01, el promotor SP02, el promotor penP, etcétera.
Cuando el hospedador es una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, ejemplos de los mismos son promotores derivados de SV40, promotores de retrovirus, promotores del choque térmico, etcétera. Como es obvio, el promotor no está limitado a los ejemplos anteriores. Adicionalmente, el uso de un intensificador es también eficaz para la expresión.
Un codón de iniciación preferible es, por ejemplo, un codón metionina (ATG).
Un codón de terminación utilizado habitualmente (por ejemplo, TAG, TAA, TGA) se ilustra como un codón de terminación.
Usualmente, se utilizan terminadores naturales o sintéticos convencionales como región terminadora.
Un replicón significa un DNA que es capaz de replicar la secuencia completa de DNA en células hospedadoras, e incluye plásmidos naturales, plásmidos modificados artificialmente (fragmentos de DNA preparados a partir de plásmidos naturales), plásmidos sintéticos, etcétera. Ejemplos de plásmidos preferibles son pBR322 o sus derivados artificiales (fragmentos de DNA preparados por tratamiento de pBR322 con enzimas de restricción apropiadas) para E. coli; plásmido de levadura 2 \mu o DNA cromosómico de levadura en el caso de levaduras; y pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149, pSV2bsr, y análogos para células de mamífero.
Pueden utilizarse también una secuencia intensificadora, sitio de poliadenilación, y unión de remodelación, que se utilizan usualmente en la técnica, tales como las derivadas de SV40.
Pueden utilizarse marcadores seleccionables disponibles usualmente de acuerdo con métodos convencionales. Ejemplos de los mismos son genes de resistencia a antibióticos, tales como tetraciclina, ampicilina o kanamicina.
Ejemplos de genes para amplificación génica son el gen de dihidrofolato-reductasa (DHFR), el gen de timidina-quinasa, el gen de resistencia a neomicina, el gen de glutamato-sintasa, el gen adenosina-desaminasa, el gen ornitina-descarboxilasa, el gen higromicina-B-fosfotransferasa, el gen aspartato-transcarbamilasa, etc.
El vector de expresión de la presente invención puede prepararse por ligación contigua y circular de al menos el promotor arriba mencionado, codón de iniciación, DNA codificante de la proteína de la presente invención, codón de terminación, y región terminadora, a un replicón apropiado. Si se desea, fragmentos apropiados de DNA (por ejemplo, enlazadores, otros sitios de restricción) pueden utilizarse por métodos convencionales, tales como digestión con una enzima de restricción o ligación utilizando DNA-ligasa T4.
Los transformantes de la presente invención pueden prepararse por introducción del vector de expresión arriba mencionado en células hospedadoras.
Las células hospedadoras utilizadas en la presente invención no están limitadas con tal que las mismas sean compatibles con el vector de expresión arriba mencionado y puedan transformarse. Ejemplos de las mismas son diversas células, tales como células de tipo salvaje o células recombinantes establecidas artificialmente, disponibles en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacterias Escherichia y Bacillus), levadura (Sacharomyces, Pichia, y análogas), células animales, o células de insecto).
Se utilizan preferiblemente E. coli o células animales. Ejemplos específicos son E. coli (DH5\alpha, DH10\beta, TB1, HB101, XL-2Blue, y análogas); células derivadas de ratón (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH3T3, y análogas); células derivadas de rata, células derivadas de hámster (BHK, CHO, y análogas); células derivadas de mono (COS1, COS3, COS7, CV1, Vero, y análogas); y células derivadas de humano (Hela, células diploides derivadas de fibroblastos, mieloma, Namalwa, y análogas).
Un vector de expresión puede introducirse (transformado (traducido)) en células hospedadoras por métodos conocidos.
La transformación puede realizarse, por ejemplo, de acuerdo con el método de Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 69, p. 2110 (1972)); el método de los protoplastos (Mol. Gen. Genet., vol. 168, p.111 (1979)); o el método de competencia (J. Mol. Biol., vol. 56, p. 209 (1971)) cuando los hospedadores son bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, y análogas) ; el método de Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, p.1927 (1978)); o el método del litio (J. Bacteriol., Vol.153, p.163 (1983)) cuando el hospedador es Saccharomyces cerevisiae; el método de Graham (Virology, Vol.52, p.456 (1973)) cuando los hospedadores son células animales; y el método de Summers et al. (Mol. Cell. Biol., Vol.3, pp.2156-2165 (1983)) cuando los hospedadores son células de insecto.
Un dominio extracelular de los receptores humanos TGF-\beta tipo II (receptores humanos solubles TGF-\beta tipo II) de la presente invención puede producirse por cultivo de transformantes (en lo sucesivo, el término incluye "transductantes"), que comprenden un vector de expresión preparado como se ha mencionado arriba en medios nutrientes.
Los medios nutrientes comprenden preferiblemente fuente de carbono, fuente de nitrógeno inorgánico, fuente de nitrógeno orgánico necesarias para el crecimiento de las células hospedadoras (transformantes). Ejemplos de la fuente de carbono son glucosa, dextrano, almidón soluble, y sacarosa; y ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánico u orgánico son sales de amonio, nitratos, aminoácidos, licor de maceración de maíz, peptona, caseína, extracto de carne, torta de harina de soja, y extracto de patata. Si se desea, los mismos pueden comprender otros nutrientes (por ejemplo, una sal inorgánica (por ejemplo, cloruro de calcio, dihidrogenofosfato de sodio, y cloruro de magnesio), vitaminas, antibióticos (por ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, kanamicina, etcétera)).
El cultivo se realiza por métodos conocidos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH del medio, y tiempo de cultivo, se seleccionan adecuadamente de tal modo que la proteína de la presente invención se produzca en grandes cantidades.
Medios específicos y condiciones de cultivo dependientes de las células hospedadoras se ilustran más adelante, pero sin carácter limitante.
Cuando los hospedadores son bacterias, actinomicetos, levaduras, hongos filamentosos, son apropiados medios líquidos que comprendan la estructura nutriente arriba mencionada. Se utilizan preferiblemente medios con un pH de 5 a 8.
Cuando el hospedador es E. coli, ejemplos de los medios preferibles son medios LB, medios M9 (Miller et al. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, p. 431 (1972)), medio YT, etcétera. Utilizando estos medios, el cultivo puede realizarse usualmente a 14 hasta 43ºC durante aproximadamente 3 a 24 horas con aireación y agitación, en caso necesario.
Cuando el hospedador es Bacillus, el cultivo puede realizarse usualmente a 30 hasta 40ºC durante aproximadamente 16 a 96 horas con aireación y agitación, en caso necesario.
\newpage
Cuando el hospedador es levadura, un ejemplo de medio es medio mínimo Burkholder (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, p. 4505 (1980)). El pH del medio es preferiblemente 5 a 8. El cultivo puede realizarse usualmente a 20 hasta 35ºC durante aproximadamente 14 a 144 horas con aireación y agitación, en caso necesario.
Cuando el hospedador es una célula animal, ejemplos de medio son medio MEM que contiene aproximadamente 5 a 20% de suero de bovino fetal (Science, vol. 122, p. 501 (1952)), medio DMEM (Virology, vol. 8, p. 396 (1959)), medio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., vol. 199, p. 519 (1967)), medio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., vol. 73, p. 1 (1950)), medio HamF12, etcétera. El pH del medio es con preferencia aproximadamente 6 a 8. El cultivo puede realizarse por regla general a aproximadamente 30 hasta 40ºC durante aproximadamente 15 a 72 horas con aireación y agitación, en caso necesario.
Cuando el hospedador es una célula de insecto, un ejemplo de medio es el medio Grace's que contiene suero de bovino fetal (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, p. 8404 (1985)). El pH del mismo es con preferencia aproximadamente 5 a 8. El cultivo puede realizarse de modo habitual a aproximadamente 20 hasta 40ºC durante 15 a 100 horas, con aireación y agitación, en caso necesario.
Un dominio extracelular del receptor humano TGF-\beta tipo II (receptor soluble humano TGF-\beta tipo II) de la presente invención puede producirse cultivando transformantes como se ha mencionado arriba (en particular células animales o E. coli) y dejando que los mismos secreten la proteína en el sobrenadante de cultivo. A saber, se obtiene un filtrado de cultivo (sobrenadante) por métodos, tales como filtración o centrifugación del cultivo obtenido, y la proteína deseada se purifica y se aísla del filtrado de cultivo por métodos utilizados comúnmente a fin de purificar y aislar proteínas naturales o sintéticas.
Ejemplos de los métodos de aislamiento y purificación son métodos que utilizan afinidad, tales como cromatografía de afinidad en columna; métodos que utilizan solubilidad, tales como el método de precipitación por adición de sal y precipitación con disolvente; métodos que utilizan la diferencia de peso molecular, tales como diálisis, ultrafiltración, filtración con gel, y electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida; métodos que utilizan cargas, tales como cromatografía de intercambio iónico y cromatografía con hidroxilapatito; métodos que utilizan la diferencia en carácter hidrófobo, tales como la cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa; y métodos que utilizan la diferencia de punto isoeléctrico, tales como el enfoque isoeléctrico.
Cuando la proteína deseada existe en el periplasma o el citoplasma de los transformantes cultivados, primeramente se cosechan las células por métodos usuales, tales como filtración o centrifugación, y se suspenden en tampón apropiado. Después que la pared celular y/o la membrana celular de las células y análogos se han roto por métodos tales como lisis por sonicación, lisozima, y congelación-descongelación, la fracción de membrana que comprende la proteína deseada se obtiene por métodos tales como centrifugación o filtración. La fracción de membrana se solubiliza con un detergente, tal como Triton-X100, para obtener el extracto bruto. Finalmente, la proteína se aísla y se purifica del extracto bruto por métodos usuales como se ha ilustrado arriba.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa una curva de calibración de la T\betaRII soluble recombinante humana (sustancia estándar) cuantificada por ELISA sándwich utilizando anticuerpos policlonales anti-T\betaII humana. La ordenada indica la intensidad de fluorescencia y la abscisa indica la concentración de la sustancia estándar.
La Figura 2 representa un electroforetograma en gel SDS-poliacrilamida que muestra el resultado de una transferencia Western sobre T\betaRII humana soluble recombinante purificada. Las pistas 1 a 3 contienen muestras respectivas como sigue:
pista 1: molécula marcadora;
pista 2: T\betaRII humana soluble recombinante disponible comercialmente; y
pista 3: T\betaRII humana soluble recombinante purificada, preparada en la presente invención.
La Figura 3 representa un gráfico que demuestra la actividad de fijación de la T\betaRII humana soluble recombinante a TGF-\beta1 humana. La ordenada indica la intensidad de fluorescencia, un índice de la actividad de fijación de la T\betaRII humana soluble recombinante a TGF-\beta1 humana, y la abscisa indica la concentración de la TGF-\beta1 humana añadida.
La Figura 4 representa una tabla que muestra los perfiles de diversos anticuerpos humanos monoclonales preparados por inmunización de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos con la T\betaRII humana soluble recombinante. El círculo indica que el anticuerpo exhibía la actividad inhibidora con diferencia significativa en diversos tests.
La Figura 5 representa gráficos que demuestran la reactividad (actividad de fijación) de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana frente a la línea de células pulmonares humanas NFL, determinada por un análisis de citometría de flujo. Los paneles (a) a (h) muestran los resultados del ensayo con los anticuerpos monoclonales respectivos como sigue:
panel (a): estreptavidina-PE sola sin anticuerpo primario ni anticuerpo secundario alguno;
panel (b): anticuerpo humano monoclonal anti-KLH como el anticuerpo primario;
panel (c): anticuerpo policlonal anti-T\betaRII humana disponible comercialmente como el anticuerpo primario;
panel (d): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4C175 como el anticuerpo primario;
panel (e): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4D204 como anticuerpo primario;
panel (f): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4D455 como el anticuerpo primario;
panel (g): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4D465 como el anticuerpo primario; y
panel (h): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4B16 como el anticuerpo primario.
La Figura 6 representa gráficos que demuestran la reactividad (actividad de fijación) de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana frente a la línea de fibroblastos NRK-49F derivados de riñón de rata determinada por un análisis de citometría de flujo. Los paneles (a) a (h) demuestran los resultados del ensayo con anticuerpos monoclonales respectivos como sigue:
panel (a): estreptavidina-PE sola sin anticuerpo primario ni anticuerpo secundario alguno;
panel (b): anticuerpo humano monoclonal anti-KLH como el anticuerpo primario;
panel (c): anticuerpo policlonal anti-T\betaRII humana disponible comercialmente como el anticuerpo primario;
panel (d): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4C175 como el anticuerpo primario;
panel (e): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4D204 como el anticuerpo primario;
panel (f): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4D455 como el anticuerpo primario;
panel (g): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4D465 como el anticuerpo primario; y
panel (h): anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana TR4B16 como el anticuerpo primario.
La Figura 7 representa un gráfico que demuestra la actividad promotora del crecimiento dependiente de la dosis de TGF-\beta1 humana sobre la línea de células de osteosarcoma humano MG-63. La ordenada indica la cantidad de absorción de [^{3}H]timidina de las células como índice del grado de actividad promotora del crecimiento celular, y la abscisa indica la concentración (dosis) de TGF-\beta1 humana.
La Figura 8 representa un gráfico que demuestra la actividad inhibidora del anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana sobre el crecimiento de las células de la línea de células de osteosarcoma humano MG-63, en donde el crecimiento celular estaba inducido por la estimulación con TGF-\beta1 humana. La ordenada indica la tasa de inhibición del crecimiento celular y la abscisa indica la concentración de anticuerpos.
La Figura 9 representa un gráfico que demuestra la actividad inhibidora del anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana sobre el crecimiento de las células de la línea de células de osteosarcoma humano MG-63, en donde el crecimiento celular estaba inducido por la estimulación con TGF-\beta1 humana. La ordenada indica la tasa de inhibición del crecimiento celular y la abscisa indica la concentración de anticuerpos.
La Figura 10 representa un gráfico que demuestra la actividad supresora del crecimiento celular dependiente de la dosis de TGF-\beta1 humana sobre la línea de células derivadas de cáncer de pulmón humano A-549. La ordenada indica la cantidad de absorción de [^{3}H]-timidina de las células como índice del grado de actividad promotora del crecimiento celular, y la abscisa indica la concentración de TGF-\beta1 humana.
La Figura 11 representa un gráfico que demuestra la actividad inhibidora del anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana sobre la supresión inducida por estimulación con TGF-\beta1 humana del crecimiento celular de la línea de células derivada de cáncer de pulmón humano A-549. La ordenada indica la tasa de inhibición de la supresión del crecimiento celular, y la abscisa indica la concentración de anticuerpos (dosis).
La Figura 12 representa un gráfico que demuestra la actividad inhibidora del anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana sobre la producción de fibronectina por las células humanas, producción que es inducida por la estimulación con TGF-\beta1 humana. La ordenada indica la cantidad de la fibronectina producida y la abscisa indica el tipo del anticuerpo.
\newpage
La Figura 13 representa un gráfico que demuestra la actividad inhibidora del anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana sobre la producción del factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) por las células humanas, producción que es inducida por la estimulación con TFG-\beta1 humana. La ordenada indica la cantidad del CTGF producida, y la abscisa indica el tipo del anticuerpo.
La Figura 14 representa un gráfico que demuestra el efecto supresor del inhibidor del receptor de TGF-\beta tipo II sobre el aumento de la concentración de proteínas en la orina como parámetro para la enfermedad renal en el ensayo que utiliza una rata modelo de enfermedad renal.
La Figura 15 representa un gráfico que demuestra el efecto supresor del inhibidor del receptor de TGF-\beta tipo II sobre el aumento del nivel de creatinina en suero como parámetro para la enfermedad renal en el ensayo que utiliza una rata modelo de ensayo renal.
La Figura 16 representa un gráfico que demuestra el efecto supresor del inhibidor del receptor de TGF-\beta tipo II sobre el aumento de la cantidad de fibronectina en el riñón como parámetro para la enfermedad renal en el ensayo que utiliza una rata modelo de enfermedad renal.
La Figura 17 representa un gráfico que demuestra el efecto supresor del inhibidor del receptor de TGF-\beta tipo II sobre el aumento de la cantidad de colágeno tipo I en el riñón como parámetro para la enfermedad renal en el ensayo que utiliza una rata modelo de enfermedad renal.
\vskip1.000000\baselineskip
Modo óptimo de realización de la invención
La presente invención se ilustra a continuación en detalle con referencia a Ejemplos, pero no debe considerarse que se limita a los mismos.
En algunos casos en los Ejemplos que siguen, se hace referencia también al "receptor de TGF-\beta tipo II" como "T\betaRII".
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Establecimiento de un método cuantitativo con ELISA sándwich para T\betaRII humana soluble <1-1> Establecimiento de un sistema ELISA sándwich para cuantificar la T\betaRII humana soluble recombinante
Se diluyó anticuerpo policlonal de cabra anti-T\betaRII humana (R & D) con tampón de fosfato, y se añadió a cada pocillo de una microplaca ELISA de 96 pocillos (Corning) a una concentración de 0,1 \mug/50 \mul/pocillo. La placa se incubó a la temperatura ambiente durante una hora para permitir la adsorción del anticuerpo policlonal.
La placa se lavó con tampón de fosfato, y se añadió luego a cada pocillo tampón de fosfato que contenía 3% de seroalbúmina bovina (BSA) (200 \mul/pocillo). La placa se incubó a la temperatura ambiente durante 2 horas para bloquear el espacio exento de anticuerpo en la superficie del pocillo de la placa. A continuación, la placa se lavó 3 veces con tampón de fosfato.
Se añadió la muestra de ensayo a cada pocillo de la microplaca inmovilizada con anticuerpo (50 \mul/pocillo), y se incubó la placa a la temperatura ambiente durante una hora. A continuación, se lavó 3 veces la microplaca con tampón de fosfato que contenía 0,1% Tween 20. Se añadió luego a cada pocillo anticuerpo policlonal de cabra anti-T\betaRII humana marcado con biotina (R & D) (diluido con tampón de fosfato que contenía 1% de BSA y 0,1% de Tween 20), a una concentración de 0,025 \mug/50 \mul/pocillo. La placa se incubó a la temperatura ambiente durante una hora.
A continuación, se lavó la microplaca 3 veces con tampón de fosfato que contenía 0,1% de Tween 20. Se diluyeron 50 \mul de estreptavidin-\beta-galactosidasa (GIBCO BRL) (diluida 2000 veces con una solución que contenía NaCl 0,5 M y HEPES 20 mM (que contenía 1 mg/ml de BSA, pH 7,0)). La placa se incubó a la temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de lavado de la microplaca 3 veces con tampón de fosfato que contenía 0,1% de Tween 20, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de 4-metil-umbeliferil-\beta-D-galactosido al 1% (Sigma) (diluido con una solución (que contenía 1 mg/ml de BSA, pH 7,0) constituida por NaCl 100 mM, MgCl_{2} 1 mM, y tampón de fosfato 10 mM (que contenía Na y K)). La placa se incubó a la temperatura ambiente durante 15 minutos.
Se añadió a cada pocillo Na_{2}CO_{3} 1 M (100 \mul) para detener la reacción. Se determinó la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de 460 nm (excitación: a 355 nm) con un fluorómetro de microplacas Fluoroscan II (Labsystems Inc.). La cantidad de T\betaRII humana soluble recombinante en la muestra de ensayo se determinó a partir de la curva de calibración preparada en el ejemplo descrito más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
<1-2> Preparación de la curva de calibración
Se preparó una curva de calibración con el ELISA sándwich establecido en el Ejemplo <1-1> utilizando como estándar T\betaRII humana soluble recombinante disponible comercialmente (R & D). El resultado se muestra en la Figura 1.
La curva de calibración tenía diferencias significativas dentro de un intervalo de concentración muy baja de 0,1-100 ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Preparación de T\betaRII humana soluble recombinante
El cDNA (SEQ ID NO: 1) codificante del dominio extracelular de T\betaRII humana (la secuencia de aminoácidos del residuo 1 al residuo 159; SEQ ID NO: 2) se preparó por PCR de acuerdo con un método convencional.
Específicamente, el cDNA se sintetizó por PCR de acuerdo con un método convencional utilizando cDNA preparado a partir de mRNA obtenido de riñón humano como molde, y los iniciadores diseñados basados en cDNA de T\betaRII humana (Cell, vol. 68, p. 775-758, 1992; No. de acceso a GenBank: M85079).
El cDNA de T\betaRII humana así preparado que contenía la región codificante se insertó en el plásmido pEF-BOS (Solicitud de Patente Japonesa Publicada y No Examinada NO. (JP-A) Hei 2-242687) para preparar un vector de expresión. La línea de fibroblastos derivada de riñón humano HEK293 (ATCC CRL-1573) se transformó con el vector por electroporación. Las células transformadas se cultivaron en el medio exento de suero ASF104 (Ajinomoto) durante 4 días para expresar transitoriamente la T\betaRII humana soluble recombinante en las células. La expresión de T\betaRII humana soluble se verificó por transferencia Western utilizando el anticuerpo policlonal anti-TBRII humana soluble (R & D).
Se recuperó y se concentró el sobrenadante de cultivo, y se sometió luego a cromatografía en columna utilizando el anticuerpo policlonal anti-T\betaRII humana soluble (R & D). Después de lavar el material eluido con tampón de fosfato, se eluyó ulteriormente el mismo con glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5). La fracción eluida se neutralizó con Tris-HCl 2 M (pH 8,83) para obtener la fracción de T\betaRII humana soluble purificada. La pureza de la T\betaRII humana soluble se confirmó por transferencia Western utilizando el anticuerpo policlonal anti-T\betaRII humana soluble (R & D). El resultado se muestra en la Figura 2.
La T\betaRII humana soluble purificada se cuantificó por el ELISA sándwich establecido en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Ensayo de actividad de fijación de la T\betaRII humana purificada frente a TGF-\beta1
La actividad de fijación de la T\betaRII humana soluble preparada en el Ejemplo 2 para TGF\beta1 se ensayó como sigue.
Se añadió la T\betaRII humana soluble recombinante a cada pocillo (0,2 \mug/pocillo) de una microplaca ELISA de 96 pocillos (Corning). Las microplacas se incubaron a la temperatura ambiente durante 2 horas para adsorber la T\betaRII humana soluble recombinante en los pocillos. A continuación, se desechó el sobrenadante, y se añadió a cada pocillo un reactivo de bloqueo (200 \mul; tampón de fosfato que contenía 3% de BSA). La placa se incubó a la temperatura ambiente durante 2 horas para bloquear el espacio exento de T\betaRII en la superficie de los pocillos de la placa. Cada pocillo se lavó 3 veces con tampón de fosfato que contenía 0,1% de Tween 20 (200 \mul). De este modo, se prepararon microplacas cuyos pocillos se habían recubierto con T\betaRII humana soluble recombinante.
Se añadió la TGF\beta1 humana (R & D) a cada pocillo a diversas concentraciones (100, 50, 25, 12,5, 6,3, y 3,1 ng/ml), y se incubó luego la placa durante una hora. Cada pocillo se lavó 3 veces con tampón de fosfato que contenía 0,1% de Tween 20 (200 \mul).
Se añadió a la placa un anticuerpo de cabra anti-TGF-\beta1 humana marcado con biotina (50 \mul; R & D), y la placa se incubó luego a la temperatura ambiente durante una hora.
Después de lavar la microplaca con tampón de fosfato que contenía 0,1% de Tween 20, se añadió a cada pocillo una estreptavidin-\beta-galactosidasa (50 \mul; GIBCO BRL (diluida 2000 veces con una solución que contenía NaCl 0,5 M, HEPES 20 mM, y 1 mg/ml de BSA (pH 7,0))). La placa se incubó a la temperatura ambiente durante 30 minutos.
A continuación, se lavó la microplaca con tampón de fosfato que contenía 0,1% de Tween 20. Se añadieron a cada pocillo 50 \mul de 4-metil-umbeliferil-\beta-D-galactosido (Sigma) al 1% (diluido con una solución (pH 7,0) que contenía NaCl 100 mM, MgCl_{2} 1 mM, tampón de fosfato 10 mM, y BSA de concentración 1 mg/ml). Se incubó la placa a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadió a cada pocillo Na_{2}CO_{3} 1 M (100 \mul) para detener la reacción. Se determinó la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de 460 nm (excitación: a 355 nm) con el fluorómetro de microplacas Fluoroscan II (Labsystems Inc.).
Se realizó un experimento de control positivo por el mismo método que se ha descrito arriba utilizando una T\betaRII humana soluble recombinante disponible comercialmente (R & D). Se realizó un experimento de control negativo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de cualquier T\betaRII humana soluble (R & D).
El resultado se muestra en la Figura 3, demostrando que la T\betaRII humana soluble recombinante purificada exhibe una actividad de fijación para TGF-\beta1 humana dependiente de la concentración.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Preparación de hibridomas productores de anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana
La preparación de los anticuerpos monoclonales en este Ejemplo se realizó por un método convencional descrito en ``Experimental Medicine (supplement): Handbook for Cellular Engineering Technology, compiladores, T. Kuroki et al., Yodosha, páginas 66-74, 1992) y en "Introductory Manual for Monoclonal Antibody Experiment (T. Ando et al., Kodansha, 1991)".
Se utilizó como el inmunógeno de T\betaRII humano la T\betaRII humana soluble recombinante purificada preparada en el Ejemplo 2.
Como el animal a inmunizar se utilizó el ratón transgénico productor de anticuerpos humanos que se había producido por el método arriba mencionado (Nature Genetics, vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; Published Japanese Translation of International Publication No. Hei 4-504365; Published Japanese Translation of International Publication No. Hei 7-509137; NIKKEI SCIENCE, ejemplar de Junio, pp 40-50, 1995).
Las células se cultivaron en microplacas multipocillo.
\vskip1.000000\baselineskip
<4-1> Preparación de hibridomas productores de anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana
Para la inmunización primaria (día 0), se inyectó la T\betaRII humana soluble recombinante preparada en el Ejemplo 2 junto con adyuvante completo de Freund (ICN/CAPPEL) en las plantas de los pies de los ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos arriba mencionados (6 \mug/animal). Se administró a los ratones la T\betaRII humana soluble recombinante junto con adyuvante incompleto de Freund (ICN/CAPPEL) por inyección en la planta del pie cada semana después de la inmunización primaria. La inmunización de refuerzo se realizó 3 veces o más en total. Ulteriormente, se realizó la inmunización final solamente con la T\betaRII humana soluble recombinante por el mismo procedimiento dos días antes de la recogida de células de los ganglios linfáticos descrita más adelante en esta memoria.
Las células de ganglios linfáticos recogidas de cada animal y células de mieloma de ratón P3/X63-AG8.653 (ATCC No: CRL-1580) se mezclaron en una relación de 5:1. Se prepararon muchos hibridomas por fusión celular utilizando polietilenglicol 4000 o polietilenglicol 1500 (GIBCO BRL) como agente de fusión.
Se realizó la selección de hibridomas por cultivo de las células fusionadas en medio ASF104 (Ajinomoto) que contenía HAT suplementada con 10% de FBS y aminopterina.
\vskip1.000000\baselineskip
<4-2> Cribado de los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales por ELISA
Los hibridomas preparados en el Ejemplo 2 se cribaron respecto a hibridomas productores de anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana por ELISA como se describe a continuación.
La T\betaRII humana soluble recombinante purificada preparada en el Ejemplo 2 se añadió a cada pocillo de una microplaca ELISA de 96 pocillos (Corning) (0,2 \mug/pocillo). La placa se incubó a la temperatura ambiente durante 2 horas para adsorber la T\betaRII humana soluble recombinante.
A continuación, se desechó el sobrenadante, y se añadió a cada pocillo un reactivo de bloqueo (200 \mul; tampón de fosfato que contenía 3% de BSA)). Se incubó la placa a la temperatura ambiente durante 2 horas para bloquear los espacios de la superficie de los pocillos de la placa que no se habían recubierto con la T\betaRII humana soluble recombinante. Cada pocillo se lavó 3 veces con tampón de fosfato (200 \mul) que contenía 0,1% de Tween 20. De este modo, se prepararon las microplacas que se había recubierto con T\betaRII humana soluble recombinante.
El sobrenadante de cada cultivo de hibridoma (100 \mul) se añadió a cada pocillo, y a continuación se incubó la placa durante 2 horas. Cada pocillo se lavó 3 veces con tampón de fosfato (200 \mul) que contenía 0,1% de Tween 20.
\newpage
A continuación, se añadió a cada pocillo un anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina (Fc) humana marcado con peroxidasa (50 \mul, American Qualex International Inc.) y se incubó la placa a la temperatura ambiente durante una hora.
Después de lavar la microplaca con tampón de fosfato que contenía 0,1% de Tween 20, se añadió a cada pocillo tetrametilbencidina (3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB); 100 \mul; BioRad). Se incubó la placa a la temperatura ambiente durante 15 minutos.
A continuación, se añadió a cada pocillo H_{2}SO_{4} 2 N (25 \mul) para detener la reacción. Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm con el Lector de Microplacas Modelo 3550 (BioRad).
De este modo se seleccionaron hibridomas que producían anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Preparación de anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana <5-1> Preparación de anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana (Método 1)
Los clones respectivos de los hibridomas arriba descritos se cultivaron en matraces que contenían medio ASF104 (Ajinomoto) suplementado con 10% de IgG FBS Bovina Ultra-Baja (GIBCO-BRL). Después del cultivo durante 10 a 20 días, se recogió el sobrenadante de cada cultivo de hibridoma.
El sobrenadante de cada cultivo de hibridoma (100 ml) se centrifugó (a 3000 rpm durante 10 minutos). Se añadió una solución (pH 7,6) constituida por KH_{2}PO_{4} 20 mM, Na_{2}HPO_{4} 180 mM, y NaCl 154 mM (1/10 volumen respecto el sobrenadante) al sobrenadante obtenido por centrifugación.
A continuación, se añadió gel de Proteína A (Protein A Sepharose 4 Fast Flow; Amersham Pharmacia) a cada muestra de los sobrenadantes obtenidos por centrifugación, y la mezcla se incubó durante una noche con agitación. La mezcla se centrifugó luego (a 3000 rpm durante 10 minutos) y se desechó el sobrenadante. Se añadió al gel de Proteína A una solución (pH 2,0 a 3,0) constituida por ácido cítrico 100 mM y NaCl 150 mM, para eluir el anticuerpo
del gel.
Cada elución se centrifugó (a 3000 rpm durante 10 minutos). El sobrenadante recuperado se neutralizó por adición de una solución (pH 8,7) que contenía Na_{2}HPO_{4} 500 mM, y KH_{2}PO_{4} 50 mM, y se filtró con un filtro Millipore para eliminar el precipitado blanco. El filtrado obtenido se dializó contra tampón de fosfato (durante una noche). De este modo, se purificaron los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana.
\vskip1.000000\baselineskip
<5-2> Preparación de anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana (Método 2)
Cada uno de los clones de hibridoma arriba mencionados (1 a 2 x 10^{6} células/ml cada uno) acondicionados en medio (ASF104 (Ajinomoto) que contenía 10% de IgG FBS Bovina Ultra Baja (GIBCO-BRL) se extendió en placa y se cultivó en la Línea de Células Integra 1000 (INTEGRA CL1000, Integra Bioscience). Después de 7 a 10 días de cultivo, cuando la densidad de las células del cultivo alcanzaba aproximadamente 1 x 10^{8} células/ml, se recuperó el sobrenadante de cada cultivo de hibridoma.
A continuación, se centrifugaron los cultivos de hibridoma (a 3000 rpm durante 10 minutos) y cada uno de los sobrenadantes obtenidos se cargó en una Columna de Proteína G HiTrap (columna de afinidad HiTrap de Proteína G; Amersham Pharmacia). A continuación, se lavó la columna con tampón de fosfato, y se cargó una solución (pH 2,0) constituida por ácido cítrico 100 mM y NaCl 150 mM en la columna de Proteína G para eluir el anticuerpo. La elución se neutralizó por adición de una solución (pH 9,0) que contenía Tris-HCl 750 mM, y se filtró luego con un filtro Millipore para eliminar el precipitado blanco. El filtrado obtenido se dializó contra tampón de fosfato (durante una noche), y se filtró con un filtro Millipore. De este modo se purificaron los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Determinación del isotipo de los anticuerpos monoclonales
La determinación del isotipo de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana respectivos purificados en el Ejemplo 5 se realizó con un kit de isotipificación de anticuerpos humanos monoclonales (American Qualex). El experimento se realizó de acuerdo con el protocolo unido al kit.
Se demostró que los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana son IgG 2/\kappa o IgG 4/\kappa (Figura 4).
Los hibridomas productores de anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana preparados como se ha descrito arriba se designaron con los símbolos que se indican a continuación. El numeral situado inmediatamente después de TR en el símbolo representa el isotipo del anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana producido por el hibridoma. Cuando el numeral es "2", entonces el isotipo es IgG2/\kappa; cuando aquél es "4", el isotipo es IgG4/\kappa (Figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
<Clones de hibridoma productores de anticuerpo humano monoclonal IgG2/\kappa>
TR2B19, TR2B64, TR2B209, TR2B518, TR2D245 y TR2D249
\vskip1.000000\baselineskip
<Clones de hibridoma productores de anticuerpo humano monoclonal IgG4/\kappa>
TR4B16, TR4C175, TR4D204, TR4B455 y TR4D465
\vskip1.000000\baselineskip
Los nombres de los clones arriba enumerados se utilizan en todos los Ejemplos que figuran más adelante en esta memoria con inclusión de este ejemplo, así como en las Figuras y Tablas que muestran los resultados de los ensayos obtenidos en los Ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Reactividad frente a T\betaRII humana y reactividad cruzada frente a T\betaRII de rata
Los diversos anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana preparados como se ha descrito arriba se analizaron por tinción celular (por citometría de flujo) respecto a su reactividad contra T\betaRII humana utilizando la línea de células de pulmón humano NHLF (Takara Shuzo; No. de catálogo CC-2512) que expresaban T\betaRII humana en la superficie celular.
Ulteriormente, de modo similar, se analizó la reactividad contra T\betaRII de rata de cada uno de los diversos anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana por tinción celular (por citometría de flujo) utilizando la línea de fibroblastos derivada de riñón de rata NRK-49F (ATCC CRL-1570) que expresaba T\betaRII de rata en la superficie celular.
Las células respectivas cultivadas en matraces se recogieron cuidadosamente en condiciones moderadas utilizando tampón de fosfato que contenía EDTA 10 mM y 0,1% de BSA.
Cada uno de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención o anticuerpos monoclonales de cabra anti-T\betaRII humana disponibles comercialmente (R & D) (300 \mul, 5 \mug/ml) (diluidos con tampón de fosfato que contenía 0,1% de BSA) se añadió a las células respectivas (1 a 2 x 10^{4} células). Las mezclas se incubaron a 4ºC durante una hora, y se centrifugaron a continuación (a 1500 rpm durante 3 minutos). Se desecharon los sobrenadantes, y las células se lavaron dos veces con tampón de fosfato. Se añadió el anticuerpo anti-inmunoglobulina humana (Fc) marcado con biotina (200 \mul; American Qualex International Inc.) a las muestras que contenían los anticuerpos humanos. El anticuerpo anti-inmunoglobulina de cabra marcado con biotina (200 \mul; Amersham Pharmacia) se añadió a las muestras que contenían el anticuerpo de cabra. Las muestras se incubaron a 4ºC durante 1 hora.
A continuación, se centrifugó cada muestra (a 1500 rpm durante 3 minutos), y se desechó el sobrenadante. Las células se lavaron dos veces con tampón de fosfato. Seguidamente, se añadió a las células estreptavidina marcada con ficoeritrina (PE) (200 \mul; Becton Dickinson) (diluida con tampón de fosfato que contenía 0,1% de BSA), y se incubaron las células a 4ºC durante 30 minutos. Se centrifugaron luego las células (a 1500 rpm durante 3 minutos), y se desechó el sobrenadante. Se lavaron las células 3 veces con tampón de fosfato, y se añadió a las mismas tampón de fosfato (300 \mul). Se analizaron las muestras por fluorescencia con el clasificador de células FACStar activado por fluorescencia (Becton Dickinson) (longitud de onda de fluorescencia: un filtro DF585/42, longitud de onda de excitación: 488 nm).
Se realizó un ensayo de control negativo por el mismo método que se ha descrito arriba utilizando anticuerpo monoclonal anti-KLH humana preparado por inmunización del ratón transgénico productor de anticuerpos humanos arriba descrito con KLH (hemocianina de lapa perforada; PIERCE).
La reactividad contra la línea de células de pulmón humano NHLF se representa en la Figura 5. La reactividad contra la línea de células fibroblastos derivados de riñón de rata NRK-49F se representa en la Figura 6.
Se demostró que los anticuerpos monoclonales de la presente invención reaccionan significativamente con T\betaRII humana y tienen también reactividad cruzada con T\betaRII de rata.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 La actividad inhibidora del anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana sobre el crecimiento celular inducido por estimulación con TGF-\beta
La actividad promotora del crecimiento de las células TGF-\beta depende del tipo de la célula. Por ejemplo, el factor actúa como un factor supresor del crecimiento en lugar de actuar como factor promotor del crecimiento sobre una diversidad de células que incluyen células epiteliales, células endoteliales vasculares, y hemocitos, pero aumenta el crecimiento de células mesangiales de diversos tejidos, tales como los fibroblastos y las células de la musculatura lisa vascular (Roberts et al, The transforming growth factor-\betas, en Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, recopilado por Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlín, 1990, p.419-472).
De acuerdo con el ensayo, los efectos inhibidores de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención sobre el crecimiento celular inducido por la estimulación con TGF-\beta se analizaron como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
<8-1> Actividad promotora del crecimiento celular TGF-\beta1
Células de la línea de células del osteosarcoma humano MG-63 (ATCC CRL-1247; 5 x 10^{3} células/pocillo) se extendieron en placas en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se cultivaron a 37ºC durante un día. A continuación, cada pocillo en el cual se habían extendido las células se lavó dos veces con medio de sal MEM de Earle (100 \mul, GIBCO BRL) que contenía 0,1% de FBS. Se añadió a los pocillos TGF-\beta1 humana, que se había diluido a diversas concentraciones (R & D; conc., 0,0001525 a 10 ng/ml), y la placa se incubó a 37ºC durante 40 horas.
A continuación, se añadió a cada pocillo [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo), y las células se incubaron ulteriormente a 37ºC durante 6 horas. Se recogieron las células utilizando el cosechador de células MicroMate 196 (PACKARD), y se midió la cantidad de absorción de [^{3}H]-timidina de las células con Matrix 9600M (PACKARD).
Se realizó un ensayo de control negativo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de TGF-\beta1.
El resultado se representa en la Figura 7.
Se demostró que las células de la línea de células de osteosarcoma humano MG-63 (ATCC CRL-1427) crecen de una manera dependiente de la concentración de TGF-\beta1.
\vskip1.000000\baselineskip
<8-2> Actividad inhibidora del anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana sobre el crecimiento celular inducido por TGF-\beta
Células de la línea de células de osteosarcoma humano MG-63 (ATCC CRL-1427; 5 x 10^{3} células/pocillo) se extendieron en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se cultivaron a 37ºC durante un día. A continuación, se lavó dos veces cada pocillo en el cual se habían extendido las placas con medio de sal MEM de Earle (100 \mul) que contenía 0,1% de FBS. Se añadió luego a los pocillos el anticuerpo humano monoclonal anti-T\betaRII humana de la presente invención o anticuerpo policlonal anti-T\betaRII humana disponible comercialmente (R & D), que se había diluido a diversas concentraciones (concentración: 0,078125 a 40 \mug/ml), y se preincubaron las placas a 37ºC durante 2 horas.
Se añadió luego a la placa TGF-\beta1 humana (concentración final: 0,3 ng/ml); R & D), y se cultivaron las células a 37ºC durante 40 horas. Se añadió luego [^{3}H]-timidina a cada pocillo (1 \muCi/pocillo), y se cultivó ulteriormente a 37ºC durante 6 horas. Se cosecharon las células utilizando el cosechador de células MicroMate 196 (PACKARD), y se midió la cantidad de absorción de [^{3}H]-timidina de las células con Matrix 9600M (PACKARD).
Se realizó un ensayo de control positivo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de cualquier anticuerpo. Ulteriormente, se realizó un ensayo de control negativo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de TGF-\beta1 humana y cualquier anticuerpo. Los resultados se representan en la Figura 8 y la Figura 9.
La Figura 4 muestra también el resultado obtenido por este ensayo (en experimentos múltiples). En esta memoria, la presencia o ausencia de actividad inhibidora de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención sobre el crecimiento celular inducido por TGF-\beta1 se representa simplemente con símbolos.
Se demostró que los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención inhiben significativamente el crecimiento de las células humanas semejantes a fibroblastos inducido por la estimulación con TGF-\beta.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
Ejemplo 9 Actividad inhibidora de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana sobre la supresión del crecimiento celular estimulado por TGF-\beta
Como se ha descrito arriba, TGF-\beta tiene actividad para promover el crecimiento de células mesangiales, tales como fibroblastos y células de la musculatura lisa vascular, en diversos tejidos, pero por otra parte, suprime también el crecimiento de diversas células, por ejemplo, células epiteliales, células endoteliales vasculares, y hemocitos.
De acuerdo con este ensayo, los efectos inhibidores de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención sobre la supresión inducida por TGF-\beta del crecimiento celular se analizaron como sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
<9-1> Actividad supresora del crecimiento celular de TGF-\beta1
Se extendieron células de la línea de células de cáncer de pulmón humano A549 (ATCC CCL-185, 5 x 10^{3} células/pocillo) en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se cultivaron durante un día. A continuación, cada pocillo en el que se habían extendido las células se lavó dos veces con un medio D-MEM que contenía 0,1% de FBS (100 \mul). Se añadió a los pocillos TGF-\beta1 humana, que se había diluido a diversas concentraciones (R & D; concentración: 0,0001525 a 10 ng/ml), y se incubó la placa durante 40 horas.
A continuación, se añadió a cada pocillo [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo), y las células se incubaron ulteriormente a 37ºC durante 6 horas. Se cosecharon las células utilizando el cosechador de células MicroMate 196 (PACKARD), y se midió la cantidad de absorción de [^{3}H]-timidina de las células con Matrix 9600M (PACKARD).
Se realizó un ensayo de control negativo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de TGF-\beta1. El resultado se representa en la Figura 10.
Se demostró que el crecimiento celular de la línea de células de cáncer de pulmón A-549 (ATCC CCL-185) se suprime dependiendo de la concentración de TGF-\beta1.
\vskip1.000000\baselineskip
<9-2> Actividad inhibidora de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana sobre la supresión del crecimiento celular inducida por TGF-\beta
Células de la línea de células de cáncer de pulmón humano A-549 (ATCC CCL-185, 5 x 10^{3} células/pocillo) se extendieron en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se cultivaron durante un día. A continuación, cada placa en la que se habían extendido las células se lavó dos veces con medio D-MRM que contenía 0,1% de FBS (100 \mul).
Se añadió a cada pocillo cada uno de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención o anticuerpo policlonal anti-T\betaRII humana disponible comercialmente (R & D) (diluido a diversas concentraciones (concentración: 0,625 a 40 \mug/ml)), y se preincubó la placa a 37ºC durante 2 horas.
A continuación, se añadió a la placa TGF-\beta1 humana (concentración final: 0,1 ng/ml; R & D), y se cultivaron las células a 37ºC durante 40 horas. Se añadió luego a cada pocillo [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo), y las células se cultivaron ulteriormente durante 6 horas. Se cosecharon las células utilizando el cosechador de células MicroMate 196 (PACKARD), y se midió la cantidad de absorción de [^{3}H]-timidina de las células con Matrix 9600M (PACKARD).
Se realizó un ensayo de control positivo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de cualquier anticuerpo. Ulteriormente, se realizó un ensayo de control negativo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de TGF-\beta1 humana y cualquier anticuerpo. Los resultados se representan en la Figura 11.
La Figura 4 muestra también el resultado obtenido por este ensayo (en experimentos múltiples), en el cual la presencia o ausencia de actividad inhibidora de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención sobre la supresión del crecimiento celular inducido por TGF-\beta1 se representa simplemente por símbolos.
Se demostró que los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención inhiben significativamente la supresión del crecimiento inducido por estimulación con TGF-\beta de las células epiteliales humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10 Actividad inhibidora de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana sobre la intensificación de la producción de matriz extracelular y factores de crecimiento celular inducido por la estimulación con TGF-\beta
TGF-\beta no sólo regula el crecimiento celular, sino que intensifica también la producción de matriz extracelular (ECM), tal como colágeno, fibronectina, y tenascina (Adv. Immunol., vol. 55, p. 181, 1994 y Seminars in Cell Biol., vol. 5, p. 389, 1994).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, TGF-\beta no sólo intensifica la producción de ECM, sino que intensifica también la producción de citoquinas y factores de crecimiento celular, tales como FGF (factor de crecimiento de los fibroblastos), TNF (factor de necrosis tumoral), IL-1 (interleuquina-1), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), y factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF); denominado también Hcs24; J. Cell Biology, Vol. 114, No. 6, p. 1285-1294, 1991; Int. J. Biochem. Cell Biol., Vol. 29, No.1, p. 153-161, 1997; Circulation, Vol. 95, No. 4, p. 831-839,1997; Cell Growth Differ., Vol. 7, No. 4, p. 469-480, 1996; J. Invest. Dermatol., Vol. 106, No. 4, p. 729-733, 1996; J. Invest. Dermatol., Vol. 105, No. 2, p. 280-284, 1995; J. Invest. Dermatol., Vol. 105, No. 1, p. 128-132, 1995).
Con arreglo a este ensayo, los efectos inhibidores de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención sobre la producción de matriz extracelular y factores de crecimiento celular inducidas por estimulación con TGF-\beta en células semejantes a fibroblastos se analizó como sigue.
Se extendieron células de la línea de células de osteosarcoma humano MG-63 (ATCC CRL-1427, 1 x 10^{4} células/pocillo) en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se cultivaron durante un día. A continuación, cada pocillo en el que se habían extendido las células se lavó dos veces con medio de sal MEM de Earle que contenía 0,1% de FBS (100 \mul). Se añadió a cada pocillo medio de sal MEM de Earle que contenía 0,1% de FBS (100 \mul), y se dejó que las células permanecieran en condiciones de ayuno total durante un día.
A continuación, se añadieron a cada pocillo cada uno de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención o anticuerpo policlonal anti-T\betaRII humana disponible comercialmente (R & D) (concentración: 50 \mug/ml), y la placa se pre-incubó durante 2 horas.
A continuación, se añadió a la placa TGF-\beta1 humana (concentración final: 1 a 4 ng/ml; R & D), y se cultivaron las células durante 65 a 72 horas. El sobrenadante de cultivo se recuperó luego de cada pocillo.
Los sobrenadantes de cultivo respectivos se ensayaron en cuanto a la cantidad de fibronectina utilizando el kit Fibronectin EIA (Takara Shuzo).
Adicionalmente, se determinó también la cantidad de factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) en cada sobrenadante de cultivo por ELISA sándwich (Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 251, p. 748-752, 1998; publicación internacional WO 99-33878).
Se realizó un ensayo de control positivo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de cualquier anticuerpo. Adicionalmente, se realizó un ensayo de control negativo por el mismo método que se ha descrito arriba en ausencia de TGF-\beta1 y cualquier anticuerpo. Los resultados se representan en la Figura 12 y la Figura 13.
La Figura 4 demuestra también el resultado obtenido por este ensayo (en experimentos múltiples) en donde la presencia o ausencia de actividad inhibidora de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención sobre el aumento de la producción de fibronectina y CTGF inducido por TGF-\beta1 se representa simplemente con símbolos.
Se demostró que los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana de la presente invención inhiben significativamente la producción de matriz extracelular y la producción de factor de crecimiento celular inducidas por TGF-\beta en las células humanas semejantes a fibroblastos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11 Efecto terapéutico del inhibidor del receptor de TGF-\beta tipo II sobre las enfermedades renales
De acuerdo con el mismo método que se ha descrito en un informe previo, se indujeron enfermedades renales (síntomas de nefritis y fibrosis renal, etcétera) en ratas Wistar (hembras, 150 g (Charles River Laboratories Inc.); cada grupo contiene 5 ó 10 animales) por administración del anticuerpo monoclonal anti-Thy-1 a las ratas a una dosis de 500 \mug/animal por inyección intravenosa (Nephron, vol. 78, p. 453-463, 1998; Kidney Blood Press Res., vol. 22, p. 5-12, 1999).
El mismo día (día 0) y 4 días después de la inyección del anticuerpo anti-Thy-1, se administró por vía intraperitoneal el anticuerpo monoclonal del receptor humano anti-TGF-\beta humana tipo II preparado anteriormente, a una dosis de 10 mg/kg.
Se administró solución salina fisiológica al grupo de control negativo de acuerdo con el mismo método que se ha descrito arriba. Adicionalmente, se utilizaron para control ratas normales.
Se analizó el efecto terapéutico del anticuerpo monoclonal del receptor humano anti-TGF-\beta humana tipo II sobre la enfermedad renal (inhibición del deterioro de la función renal) por medida de las cantidades de proteína excretadas en la orina (el día séptimo) y los niveles de creatinina en suero (el día séptimo) de acuerdo con métodos convencionales.
\newpage
Adicionalmente, 7 días después de la administración del anticuerpo anti-Thy-1, se determinaron las cantidades de matriz extracelular, fibronectina y colágeno tipo I, que aumentan dependiendo del progreso de los síntomas de las enfermedades renales, por inmunotinción de muestras de secciones tisulares congeladas recogidas de los riñones de los animales sujeto por un método convencional.
Se determinaron las cantidades de matriz extracelular como registros basados en los datos de tinción, como se indica a continuación.
Registro 0: ausencia de tinción detectable en la muestra de glomérulo.
Registro 1: se tiñó menos de un tercio de la muestra de glomérulo.
Registro 2: se tiñeron menos de dos tercios de la muestra de glomérulo.
Registro 3: se tiñeron dos tercios o más de la muestra de glomérulo.
Los resultados se representan en las Figuras 14 a 17.
El aumento de la cantidad de proteína excretada en la orina aparecía inhibido significativamente en el grupo sometido a la administración del anticuerpo anti-receptor de TGF-\beta tipo II, comparado con el grupo de control negativo. Adicionalmente, el aumento en el nivel de creatinina en suero se encontraba también significativamente inhibido en el grupo sometido a la administración del anticuerpo anti-receptor de TGF-\beta tipo II en comparación con el grupo de control negativo, y el nivel era comparable al de las ratas normales.
Adicionalmente, la producción de matriz extracelular en el glomérulo renal estaba significativamente inhibida en el grupo sometido a la administración del anticuerpo anti-receptor de TGF-\beta tipo II en comparación con el grupo de control negativo. Esto indica que la fibrosis del tejido renal se había inhibido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12 Determinación de las secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de los anticuerpos humanos monoclonales anti-T\betaRII humana
La secuencia de cDNA que codifica la región variable de la cadena pesada, y la secuencia de cDNA que codifica la región variable de la cadena ligera y la región constante de los diversos anticuerpos humanos monoclonales contra TGF\betaRII humana preparadas en los ejemplos arriba mencionados se determinaron como se describe a continuación. Se analizaron también las características estructurales de los genes.
Los hibridomas (clon: TR4C175, TR4D204, TR4D455, y TR4D465; aproximadamente 1 x 10^{6} células cada uno) preparados en el Ejemplo anterior, cada uno de los cuales produce los anticuerpos humanos monoclonales contra TGF\betaRII humana, se cultivaron, y se centrifugaron luego. Se recogió el precipitado y se guardó a -80ºC hasta que se extrajeron los poli(A^{+})RNAs de las células como se describe más adelante en esta memoria.
La extracción y purificación de los poli(A^{+})RNAs de los hibridomas respectivos se llevaron a cabo utilizando el kit rápido de poli(A^{+})RNAs disponible comercialmente (Amersham-Pharmacia) de acuerdo con el método siguiente. Todas las células congeladas arriba descritas se disolvieron en un tampón de lisis celular, y se solubilizaron por destrucción con una jeringuilla. Se añadió resina oligo(dT) al material solubilizado, y la mezcla se agitó cuidadosamente durante aproximadamente 3 minutos. A continuación, se lavó la resina oligo(dT), y se eluyeron los poli(A^{+})RNAs con un tampón de elución. Los poli(A^{+})RNAs eluidos se precipitaron con etanol, y se disolvieron luego en 20 \mul de tampón Tris-EDTA. La concentración de los poli(A^{+})RNAs así obtenidos se determinó basándose en la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.
Los poli(A^{+})RNAs se convirtieron en cDNA bicatenario utilizando un kit de síntesis de cDNA disponible comercialmente (GIBCO BRL) y el iniciador de acuerdo con SEQ ID NO: 19 por el método de la transcriptasa inversa. Específicamente, se sintetizaron sucesivamente el cDNA de la primera cadena y el cDNA de la segunda cadena utilizando los poli(A^{+})RNAs (1 a 5 \mug) purificados a partir de cada hibridoma como un molde. El cDNA se extrajo una sola vez con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y luego una vez con cloroformo. A continuación, se precipitó con etanol el cDNA, y se ligó a un DNA adaptador (SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21) con DNA-ligasa disponible comercialmente (TOYOBO). Ulteriormente, se extrajo el DNA reaccionante una sola vez con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y luego una sola vez con cloroformo.
A continuación, se precipitó con etanol el DNA reaccionante, y se digirió con la enzima de restricción disponible comercialmente NotI (TOYOBO). El extremo 5' del DNA se fosforiló con solución de ATP disponible comercialmente (GIBCO BRL) y nucleótido-quinasa (TOYOBO). El DNA reaccionante resultante se fraccionó luego por electroforesis en gel de poliacrilamida, y se recuperó el DNA comprendido entre aproximadamente 500 pb y 2000 pb. Cada uno de los DNAs recuperados se ligó al vector de fago lambda \lambdaEXcell disponible comercialmente (Amersham-Pharmacia) utilizando DNA-ligasa disponible comercialmente (TOYOBO). A continuación, se empaquetó cada DNA reaccionante en partículas de fago lambda utilizando el kit GigapackIII Gold de empaquetamiento de fago lambda disponible comercialmente, (STRATAGENE). Se construyeron genotecas de cDNA a partir del fago utilizando E. coli NM522, unido al vector \lambdaEXcell, como hospedador.
Las genotecas de cDNA respectivas se cribaron utilizando oligo-DNA sintético como sondas por un método convencional. De este modo se prepararon cDNAs que codificaban la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo. La sonda para la cadena pesada del anticuerpo era el oligo-DNA sintético de SEQ ID NO: 22. La sonda para la cadena ligera del anticuerpo era el oligo-DNA sintético de SEQ ID NO: 23.
Las secuencias de nucleótidos del cDNA respectivo así obtenidas se determinaron con el kit de Secuenciación FS Dye Terminator Cycle Sequencing disponible comercialmente (PE-Applied Biosystems) en el Secuenciador de DNA PRISM 377 (PE-Applied Biosystems).
Los iniciadores de secuenciación utilizados para determinar estas secuencias eran los iniciadores M13-20 (STRATAGENE) y el iniciador M13 Inverso (STRATAGENE) disponibles comercialmente. Adicionalmente, se utilizó el iniciador de secuenciación de SEQ ID NO: 24, que corresponde a la secuencia de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, para determinar la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo; y se utilizó el iniciador de secuenciación de SEQ ID NO: 25, que corresponde a la secuencia de la región constante de la cadena ligera del anticuerpo, para determinar la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo.
El listado de secuencias indicado a continuación muestra las secuencias de cDNA que codifican las regiones variables de la cadena pesada y la secuencia de cDNA que codifica las regiones variables de la cadena ligera de los anticuerpos humanos monoclonales contra TGF\betaRII humana producidas por los hibridomas arriba mencionados, y las secuencias de aminoácidos deducidas de la secuencias de cDNA respectivas.
\vskip1.000000\baselineskip
<Clon TR4C175>
\vskip1.000000\baselineskip
(Región variable de la cadena pesada)
Secuencia de DNA: SEQ ID NO: 3 (secuencia señal: nucleótidos número 1 a 57; región V: nucleótidos número 58 a 352)
Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 4 (secuencia señal: aminoácido número 1 a 19; región variable: incluye los aminoácidos número 21 a 117)
\vskip1.000000\baselineskip
(Región variable de la cadena ligera)
Secuencia de DNA: SEQ ID NO: 11 (secuencia señal: nucleótidos número 1 a 66; región V: nucleótidos número 67 a 352)
Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 12 (secuencia señal: aminoácido número 1 a 22; región variable: incluye los aminoácidos número 23 a 117)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<Clon TR4D204>
\vskip1.000000\baselineskip
(Región variable de la cadena pesada)
Secuencia de DNA: SEQ ID NO: 5 (secuencia señal: nucleótidos número 1 a 3; región V: nucleótidos número 4 a 295)
Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 6 (secuencia señal: aminoácido número 1; región variable: incluye los aminoácidos 2 a 98)
\vskip1.000000\baselineskip
(Región variable de la cadena ligera)
Secuencia de DNA: SEQ ID NO: 13 (secuencia señal: nucleótidos número 1 a 57; región V: nucleótidos número 58 a 348)
Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 14 (secuencia señal: aminoácido número 1 a 19; región variable: incluye los aminoácidos número 21 a 116)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
<Clon TR4D455>
\vskip1.000000\baselineskip
(Región variable de la cadena pesada)
Secuencia de DNA: SEQ ID NO: 7 (secuencia señal: nucleótidos número 1 a 57; región V: nucleótidos número 58 a 350)
Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 8 (secuencia señal: aminoácido número 1 a 19; región variable: incluye los aminoácidos número 21 a 116)
\vskip1.000000\baselineskip
(Región variable de la cadena ligera)
Secuencia de DNA: SEQ ID NO: 15 (secuencia señal: nucleótidos número 1 a 60; región V: nucleótidos número 61 a 362)
Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 16 (secuencia señal: aminoácido número 1 a 20; región variable: incluye los aminoácidos número 22 a 120)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<Clon TR4D465>
\vskip1.000000\baselineskip
(Región variable de la cadena pesada)
Secuencia de DNA: SEQ ID NO: 9 (secuencia señal: nucleótidos número 1 a 57; región V: nucleótidos número 58 a 353)
Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 10 (secuencia señal: aminoácido número 1 a 19; región variable: incluye los aminoácidos número 21 a 117)
\vskip1.000000\baselineskip
(Región variable de la cadena ligera)
Secuencia de DNA: SEQ ID NO: 17 (secuencia señal: incluye los nucleótidos número 1 a 51; región V: nucleótidos número 52 a 340)
Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 18 (secuencia señal: incluye los aminoácidos número 1 a 17; región variable: incluye los aminoácidos número 18 a 113)
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en las secuencias de DNA determinadas, se investigó la genoteca V Base Sequence, que contiene las secuencias de los genes de regiones variables de inmunoglobulina humana, producida por Tomlinson et al. (Immunol. Today, vol. 16, no. 5, p. 237-242, 1995) utilizando software de análisis para secuencias de genes.
El resultado demostró que los genes respectivos para la región V de las cadenas pesadas y cadenas ligeras de los anticuerpos humanos monoclonales arriba mencionados estaban constituidos por los segmentos siguientes.
<Gen de la región V de la cadena pesada>
Clon TR4C175: 3-21 (DP-77)
Clon TR4D204 3-07 (DP-54)
Clon TR4D455: 5-51 (DP-73)
Clon TR4D465 3-07 (DP-54)
\vskip1.000000\baselineskip
<Gen de la Región V de la cadena ligera>
Clon TR4C175: A30
Clon TR4D204: B-3 (DPK-24)
Clon TR4D455: A19 (DPK-15)
Clon TR4D465: A18 (DPK-28)
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13 Determinación de la afinidad y actividad de neutralización de los anticuerpos humanos monoclonales del anti-receptor de TGF-\beta humana tipo II para el antígeno (receptor humano de TGF-\beta tipo II)
La constante de velocidad de asociación (ka), la constante de velocidad de disociación (kd) y la constante de disociación (Kd) de la fijación entre los diversos anticuerpos humanos monoclonales anti-receptor de TGF-\beta humana tipo II preparados como se ha descrito arriba y el receptor humano de TGF-\beta tipo II se determinaron con el kit de ensayo Biacore X disponible comercialmente (Amersham-Pharmacia).
Los procedimientos, excepto en lo que respecta a la inmovilización del antígeno (T\betaRII humana soluble purificada) en un chip sensor descrito más adelante, se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones y el protocolo experimental unidos al kit de ensayo BiacoreX disponible comercialmente (Amersham-Pharmacia).
Se inyectó el tampón HBS (que contenía HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, y 0,005% de Detergente P20, pH 7,0) a través de una celda de flujo-1 unida al kit a un caudal de 5 \mul/min. A continuación, se inyectaron 35 \mul de una solución constituida por NHS (N-hidroxisuccinimida) 0,05 M y EDC 0,2 M (N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimida) 0,2 M para activar los grupos carboxilo de CM aplicado como recubrimiento sobre el chip sensor.
A continuación, se inyectaron 70 \mul de T\betaRII humana soluble purificada (30 \mug/ml; disuelta en tampón de acetato de sodio 10 mM (pH 5,0)) preparada en el Ejemplo 2 para inmovilizarlos en el chip sensor.
Se bloquearon luego los grupos carboxilo activados que no habían reaccionado por adición de 35 \mul de hidrocloruro de etanolamina 1 M. La cantidad de T\betaRII humana soluble inmovilizada por este procedimiento era 5234 RU (unidades de resonancia). RU representa masa por unidad de área: 1 RU = 1 pg/mm^{2}.
La encapsulación de la celda de flujo-2 como referencia se realizó por el mismo tratamiento que se ha descrito arriba en ausencia de la T\betaRII humana soluble.
Se inyectó tampón de fosfato en la celda de flujo (chip sensor) a un caudal de 20 \mul/minuto, y se añadió a ella cada uno de los anticuerpos humanos monoclonales anti-receptor de TGF-\beta humana tipo II purificados preparados en el Ejemplo anterior (40 a 100 \mug/ml, 60 \mul).
Las condiciones de ensayo estándar comprendían la fase de asociación durante 3 minutos y la fase de disociación durante 200 segundos. Se obtuvo un sensograma por medida de las cantidades del anticuerpo fijado y la cantidad de anticuerpo disociado del antígeno a lo largo del tiempo.
Basándose en los datos del sensograma así obtenidos, se computaron la constante de velocidad de asociación (ka), la constante de velocidad de disociación (kd), y la constante de disociación (Kd; Kd = kd/ka) utilizando software de análisis (BIAevaluation 3.0) unido al kit. Los valores respectivos se enumeran a continuación.
100
Este resultado demostró que todos los anticuerpos humanos monoclonales anti-receptor de TGF-\beta tipo II exhiben una afinidad de fijación muy alta y una afinidad de neutralización muy alta respecto al receptor humano de TGF-\beta tipo II.
Aplicabilidad industrial
Dado que los anticuerpos monoclonales de la presente invención son de procedencia humana, los mismos no presentan antigenicidad alguna para el hospedador humano, lo cual es un problema terapéutico importante (efectos secundarios) en el tratamiento médico con productos farmacéuticos de anticuerpos que comprenden anticuerpos derivados de mamíferos no humanos, tales como ratones. Estos significa que los anticuerpos de la presente invención no inducen rechazo inmunitario severo del hospedador causado por HAMA (antigenicidad humana anti-ratón) y, por consiguiente, aumenta espectacularmente el valor del anticuerpo como un producto farmacéutico.
Adicionalmente, una sustancia que se fija al receptor de TGF-\beta tipo II para suprimir o inhibir la transducción de señales en las células mediada por el receptor, que se representa por los anticuerpos humanos monoclonales de la presente invención que se fija al receptor humano de TGF tipo II, y una composición farmacéutica que comprende la sustancia, son útiles como producto farmacéutico para el tratamiento o la prevención de diversos tipos de enfermedades causadas por la acción de TGF-\beta por supresión o inhibición de la aparición y/o el progreso de las enfermedades. Tales enfermedades se ilustran por enfermedades renales (fibrosis renal, nefritis, insuficiencia renal, nefroesclerosis, etc.); enfermedades pulmonares (v.g. fibrosis pulmonar, neumonía, etc.); enfermedades hepáticas (v.g., fibrosis del tejido hepático, cirrosis, hepatitis, etc.); enfermedades de la piel (v.g., heridas, escleroderma, psoriasis, queloide, etc.); artritis (v.g., artritis reumatoide, osteoartritis, etc.); y enfermedades vasculares (v.g., restenosis vascular, vasculitis reumática, etc.); fibrosis tisular en diversos órganos (con inclusión de fibrosis tisular acompañada por diversos cánceres); arteriosclerosis (con inclusión de fibrosis tisular concomitante); etcétera.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Japan Tobacco, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANO CONTRA EL RECEPTOR TGF-\beta tipo II Y SU USO MEDICINAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> J1-A005P
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 1999-328681
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 18-11-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000-340216
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 08-11-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 477
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(477)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(69)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 458
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(456)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(393)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 438
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(438)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
12
13 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(444)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
15
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 438
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(438)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(393)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(417)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
25
26 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(393)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
29
30 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de adaptador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de adaptador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de sonda sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de sonda sintetizada artificialmente
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
39

Claims (19)

1. Un anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb del anticuerpo, en donde el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno suprime el crecimiento celular inducido por TGF-\beta, en donde
(a)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 23 a 117 de SEQ ID NO: 12;
(b)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 4, en donde se han delecionado, sustituido, insertado o añadido 1 a 10 aminoácidos, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 23 a 117 de SEQ ID NO: 12, en donde se han delecionado, sustituido, insertado o añadido 1 a 10 aminoácidos;
(c)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 2 a 98 de SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 14;
(d)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 2 a 98 de SEQ ID NO: 6, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 14, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado o añadido;
(e)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 22 a 120 de SEQ ID NO: 16;
(f)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 116 de SEQ ID NO: 8, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 22 a 120 de SEQ ID NO: 16, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido;
(g)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 18 a 113 de SEQ ID NO: 18; o
(h)
una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 117 de SEQ ID NO: 10, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado, o añadido, y una región variable de cadena ligera la secuencia de aminoácidos de los residuos 18 a 113 de SEQ ID NO: 18, en donde 1 a 10 aminoácidos se han delecionado, sustituido, insertado o añadido.
2. Una célula que produce el anticuerpo humano monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1.
3. La célula de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la célula es una célula fusionada producida por fusión de una célula B de un mamífero que produce el anticuerpo humano monoclonal con una célula de mieloma derivada de un mamífero.
4. La célula de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la célula es una célula recombinante, que ha sido transformada por uno cualquiera o ambos de DNA codificante de la cadena pesada y DNA codificante de la cadena ligera del anticuerpo humano monoclonal.
5. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. Uso del anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para tratamiento o prevención de enfermedades del riñón, pulmón, hígado, piel, artritis, enfermedades vasculares, fibrosis tisular y/o arteriosclerosis.
7. El uso de la reivindicación 6, en donde dicha composición farmacéutica inhibe la transducción de señales a las células inducidas por fijación de una TGF-\beta humana a un receptor de TGF-\beta humana tipo II.
8. El uso de la reivindicación 6 ó 7, en donde dicha composición farmacéutica es para tratamiento o prevención de una fibrosis tisular.
9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde dicha fibrosis tisular es fibrosis en el pulmón, hígado, riñón, o piel.
10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde dicha enfermedad es nefroesclerosis, fibrosis pulmonar, cirrosis, restenosis vascular, arterosclerosis, psoriasis, escleroderma, atopía, queloide, o artritis.
11. Un polinucleótido que codifica una cualquiera de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo humano monoclonal de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por:
(a)
una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18; y
(b)
una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17.
12. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 11.
13. Un método para producir una célula hospedadora que comprende modificar genéticamente las células con el polinucleótido de la reivindicación 11 o con el vector de la reivindicación 12.
14. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 12.
15. Un anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para tratamiento o prevención de enfermedades del riñón, pulmón, hígado, piel, artritis, enfermedades vasculares, fibrosis tisular y/o arterosclerosis.
16. El anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb de la reivindicación 15 para inhibición de la transducción de señales en células inducida por la fijación de una TGF-\beta humana a un receptor de TGF-\beta tipo II humano.
17. El anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb de la reivindicación 15 ó 16 para el tratamiento o prevención de la fibrosis tisular.
18. El anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde dicha fibrosis tisular es fibrosis en el pulmón, hígado, riñón, o piel.
19. El anticuerpo humano monoclonal o fragmento de fijación de antígeno F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv o dAb de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde dicha enfermedad es nefroesclerosis, fibrosis pulmonar, cirrosis, restenosis vascular, arterioesclerosis, psoriasis, escleroderma, atopía, queloide, o artritis.
ES00976330T 1999-11-18 2000-11-17 Anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor tgf-beta ii y su uso medicinal. Expired - Lifetime ES2313908T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP32868199 1999-11-18
JP11-328681 1999-11-18
JP2000-340216 2000-11-08
JP2000340216A JP2001206899A (ja) 1999-11-18 2000-11-08 ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2313908T3 true ES2313908T3 (es) 2009-03-16

Family

ID=26572939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00976330T Expired - Lifetime ES2313908T3 (es) 1999-11-18 2000-11-17 Anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor tgf-beta ii y su uso medicinal.

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7579186B1 (es)
EP (1) EP1245676B1 (es)
JP (1) JP2001206899A (es)
KR (1) KR100548761B1 (es)
AT (1) ATE408628T1 (es)
AU (2) AU779871B2 (es)
CA (1) CA2389862A1 (es)
DE (1) DE60040301D1 (es)
ES (1) ES2313908T3 (es)
WO (1) WO2001036642A1 (es)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
JPWO2005105144A1 (ja) * 2004-04-30 2007-09-13 協和醗酵工業株式会社 潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤
CL2007002668A1 (es) * 2006-09-20 2008-05-09 Amgen Inc Proteina de union a antigeno que se une al receptor de glucagon humano; acido nucleico que la codifica; metodo de produccion; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar o prevenir la diabetes tipo 2.
US20100278843A1 (en) * 2007-08-16 2010-11-04 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Agents and methods for modulating macrophage inhibitory cytokine (mic-1) activity
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
AU2009293658A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 James Cardia Reduced size self-delivering RNAi compounds
JO3096B1 (ar) * 2008-11-07 2017-03-15 Imclone Llc الأجسام المضادة لمستقبل ii مضاد tgfb
BR112012001977A2 (pt) * 2009-07-29 2017-01-31 Glaxo Group Ltd domínio variável único de imunoglobulina, polipeptídeo isolado, ligante, proteína de fusão, ácido nucleico isolado, molécula de ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir um polipeptídeo e para tratar e/ou prevenir uma condição, composição farmacêutica, uso de um domínio variável único, e, dispositivo de dispensação pulmonar.
JP2011045339A (ja) * 2009-08-28 2011-03-10 Univ Of Tokyo ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合する核酸およびその使用
EP3560503B1 (en) 2010-03-24 2021-11-17 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in dermal and fibrotic indications
EP2550001B1 (en) 2010-03-24 2019-05-22 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in ocular indications
MA34820B1 (fr) * 2011-01-06 2014-01-02 Glaxo Group Ltd Ligandise se liant au récepteur ii du tgf-bêta
KR102051014B1 (ko) 2011-06-03 2019-12-04 조마 테크놀로지 리미티드 Tgf-베타에 특이적인 항체
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
JP6668241B2 (ja) 2013-09-05 2020-03-18 アムジエン・インコーポレーテツド 予測可能で、一貫性のある、且つ再現可能な糖型特性を示すＦｃ含有分子
AR098827A1 (es) * 2013-12-19 2016-06-15 Consejo Nac De Investig Científicas Y Técnicas (Conicet) ISOFORMA DEL RECEPTOR II DE TGF-b, POLINUCLEÓTIDOS QUE LA CODIFICAN VECTORES, CÉLULAS TRANSFORMADAS, PÉPTIDOS Y DE FUSIÓN, MÉTODO Y USOS
EP3467501B1 (en) 2014-05-16 2020-11-04 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
KR102506169B1 (ko) 2014-09-05 2023-03-08 피오 파마슈티칼스 코프. Tyr 또는 mmp1을 표적화하는 핵산을 사용한 노화 및 피부 장애의 치료 방법
CN108136001B (zh) 2015-04-03 2022-07-29 佐马技术有限公司 使用TGF-β抑制剂和PD-1抑制剂治疗癌症
WO2017141208A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 Novartis Ag Tgfbeta 2 antibodies
EP3596225A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
EA202092286A1 (ru) 2018-03-26 2021-03-18 Эмджен Инк. Общие афукозилированные гликоформы антител, полученные в культуре клеток
BR112020026862A2 (pt) 2018-06-29 2021-04-20 Gensun Biopharma, Inc. antagonistas antitumorais de reguladores de pontos de verificação imunológica
US11672826B2 (en) 2018-08-30 2023-06-13 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CN113365663A (zh) 2018-08-30 2021-09-07 Hcw生物科技公司 单链嵌合多肽和其用途
WO2020047299A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
AU2019240609A1 (en) * 2018-10-29 2020-05-14 Consejo Nacional de Investigaciones Científcas Y Técnicas (Conicet) TGF- ß receptor II isoform, fusion peptide, methods of treatment and methods in vitro
CN109596841B (zh) 2019-01-14 2020-04-14 浙江大学 外泌体TβRII蛋白作为标志物在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用
CN114269903A (zh) 2019-06-21 2022-04-01 Hcw生物科技公司 多链嵌合多肽和其用途
EP3990116A1 (en) 2019-06-28 2022-05-04 Gensun Biopharma Inc. ANTITUMOR ANTAGONIST CONSISTING OF A MUTATED TGFß1 - RII EXTRACELLULAR DOMAIN AND AN IMMUNOGLOBULIN SCAFFOLD
EP4034556A1 (en) 2019-09-26 2022-08-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
EP4081306A1 (en) * 2019-12-24 2022-11-02 Merus N.V. Tgf-beta-rii binding proteins
KR102314157B1 (ko) * 2020-01-10 2021-10-19 주식회사 뉴클릭스바이오 TGF-β 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 이용방법
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CA3184756A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
WO2022081824A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5147798A (en) * 1986-07-11 1992-09-15 Children's Hospital Medical Center Monophenotypic xenograft of megakaryocytic lineage and origin
WO1991010741A1 (en) * 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
EP0610427B1 (en) 1991-10-31 2003-04-02 Whitehead Institute For Biomedical Research Tgf-beta type iii receptor, cdna encoding it and uses therefor
JPH08504763A (ja) * 1992-10-29 1996-05-21 セルトリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 治療薬としてのＴＧＦ−βレセプターフラグメントの使用
CA2162577C (en) 1993-05-10 2005-06-14 Fumihiko Matsuda Human immunoglobulin vh gene segments and dna fragments containing the same
US6096878A (en) 1993-05-10 2000-08-01 Japan Tobacco Inc. Human immunoglobulin VH gene segments and DNA fragments containing the same
US5824655A (en) * 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
US6037139A (en) * 1997-06-03 2000-03-14 Wisconsin Alumni Research Foundation System for assaying modulators of procollagen maturation
CA2400628A1 (en) 2000-03-09 2001-09-13 Genzyme Corporation Use of tgf-beta antagonists to treat or to prevent loss of renal function

Also Published As

Publication number Publication date
US7579186B1 (en) 2009-08-25
JP2001206899A (ja) 2001-07-31
AU1415801A (en) 2001-05-30
EP1245676B1 (en) 2008-09-17
AU2005200044B2 (en) 2007-06-07
EP1245676A1 (en) 2002-10-02
KR20020048426A (ko) 2002-06-22
AU2005200044A1 (en) 2005-02-03
EP1245676A4 (en) 2004-07-21
DE60040301D1 (de) 2008-10-30
ATE408628T1 (de) 2008-10-15
AU779871B2 (en) 2005-02-17
CA2389862A1 (en) 2001-05-25
WO2001036642A1 (fr) 2001-05-25
KR100548761B1 (ko) 2006-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2313908T3 (es) Anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor tgf-beta ii y su uso medicinal.
US11339215B2 (en) Methods of treating cancer with human monoclonal antibodies against interleukin 8 (IL-8)
US6562618B1 (en) Monoclonal antibody against connective tissue growth factor and medicinal uses thereof
TWI395754B (zh) 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
DE69936382T3 (de) Therapeutische verwendungen von il-17 homologe polypeptide
US20210032350A1 (en) Antibodies to galectin-3 and methods of use thereof
ES2264929T3 (es) Acidos nucleicos y polipeptidos del factor 19 de crecimiento fibroblastico (fgf-19) y procedimientos de utilizacion para el tratamiento de la obesidad.
EP0974651A1 (en) Physiologically active protein originating in mammals
JP2004121001A (ja) ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対する高親和性モノクローナル抗体
JP4537507B2 (ja) 結合組織増殖因子に対するモノクローナル抗体及びその医薬用途
US20240026009A1 (en) Antibodies to galectin-3 and methods of use thereof