JP2011045339A

JP2011045339A - ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合する核酸およびその使用

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Publication number: JP2011045339A
Application number: JP2009198813A
Authority: JP
Inventors: Giichi Nakamura; 義一中村; Yasuko Yamamura; 康子山村
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-03-10
Also published as: WO2011024955A1

Abstract

【課題】ＴＧＦ−βならびにＴＧＦ−βＩＩ型受容体の生理機能の解明、およびＴＧＦ−βにより引き起こされる疾患の発症機構の解析、診断および治療に利用可能な物質の提供。
【解決手段】ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とするアプタマー；当該アプタマーを用いることを特徴とするＴＧＦ−βＩＩ型受容体の検出方法；当該アプタマーを含む医薬など。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合する核酸およびその使用方法に関するものである。

ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ−β（以下、「ＴＧＦ−β」と記載）は上皮細胞、血管内皮細胞、血球系細胞など多くの細胞に対し強い増殖抑制作用を示し、癌化初期においては癌細胞の増殖を抑制し癌化抑制因子として機能する。しかし、ＴＧＦ−βは多機能性のサイトカインであり、癌化後期になると癌細胞が産生するＴＧＦ−βが癌組織周辺の正常組織細胞に作用し血管新生、上皮−間葉移行、免疫抑制、細胞外マトリックスの産生などを誘導し、癌の浸潤・転移を引き起こすことが明らかにされている。さらに、ＴＧＦ−βは細胞外マトリックス産生を促進し組織の線維化を強く引き起こし、肺線維症、慢性腎不全、肝硬変に代表される慢性線維性疾患を誘発する重要な因子であることが見出されている。したがって、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β受容体は、癌の浸潤・転移、組織線維化の分子機構の解明、創薬における重要な標的になると考えられる。

ＴＧＦ−β受容体は、ともに細胞内にセリン／スレオニンキナーゼ領域を有するＴＧＦ−βＩ型受容体（以下、「ＴβＲＩ」と記載する場合がある）とＴＧＦ−βＩＩ型受容体（以下、「ＴβＲＩＩ」と記載する場合がある）からなる複合体である。近年、ＴＧＦ−β受容体複合体の下流で機能するシグナル伝達分子であるＳｍａｄ転写因子ファミリー（Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３およびＳｍａｄ４）が同定され、ＴＧＦ−βの主要なシグナル伝達経路が明らかにされつつある。ＴＧＦ−βがＴβＲＩＩに結合すると、ＴβＲＩＩのセリン／スレオニンキナーゼによりＴβＲＩがリン酸化を受け活性化される。細胞質に存在するＳｍａｄ２またはＳｍａｄ３は活性化されたＴβＲＩの細胞内ドメインに結合し、ＴβＲＩのセリン／スレオニンキナーゼによりリン酸化され活性化される。その後、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３はＴβＲＩから遊離し、細胞質内のＳｍａｄ４とヘテロ複合体を形成し核へと移行し転写因子として機能する。

このように、ＴβＲＩＩはＴＧＦ−βとの結合に不可欠な細胞表面分子であり、ＴβＲＩ単独ではＴＧＦ−βに結合できない。したがって、ＴβＲＩＩへのＴＧＦ−βの結合を阻害できればＴＧＦ−βにより誘導される癌の浸潤・転移、組織線維化を抑制することも可能である。これまでＴβＲＩＩを標的とした乳癌転移の阻害剤として、可溶化型ＴβＲＩＩ（以下、「ｓＴβＲＩＩ」と記載する場合がある）、可溶化型ＴβＲＩＩと免疫グロブリンＦｃ領域との融合たんぱく質（ｓＴβＲＩＩ−Ｆｃ）の開発が進められている。ｉｎｖｉｔｒｏ実験系でその阻害効果が確認され、また、ＭＭＴＶ−ｎｅｕトランスジェニックマウスを用いたｉｎｖｉｖｏ実験系でも乳癌の肺、肝臓、脾臓への転移が抑制されることが報告されている。しかし、ｓＴβＲＩＩやｓＴβＲＩＩ−Ｆｃは分子量が大きく、また、たんぱく質の翻訳後に糖鎖修飾が必要なことなどから、その大量精製は容易ではない。

ところで、ｉｎｖｉｔｒｏで標的分子と特異的に結合するＲＮＡを選択かつ濃縮する手法として、ＳＥＬＥＸ法と呼ばれる手法が開発されている（非特許文献１参照）。ＳＥＬＥＸ法は、ＰＣＲプライマー用の配列（一方にはＴ７ポリメラーゼの配列を含む）を両端に含む適当な長さのランダム配列を持つＲＮＡを合成し、これを固相化し標的分子と結合させる。結合しなかったＲＮＡを洗浄後、標的分子と結合したＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅後、次のラウンドで用いるＲＮＡのテンプレートとする。これを繰り返すことにより標的分子と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得する。この方法では、標的分子と特異的に結合するＲＮＡ配列を明らかにできるだけでなく、標的分子の機能を促進、あるいは阻害するような生理活性を持つＲＮＡを取得することが可能である。このことは病因たんぱく質を標的とすることにより、得られたアプタマーが医薬品として応用できることを示唆している。従来の創薬に比べこのＳＥＬＥＸ法を用いた創薬の優れている点として（１）従来の化学物質のスクリーニングより大規模の母集団よりスクリーニングを行える。（２）試験管内で容易に大量合成することができる。（３）免疫原性がない。（４）容易に化学的改良を行える。（５）保存性が高く抗体の作製が困難なたんぱく質を標的にできる。などがあげられる。例えば特許文献１には、ＳＥＬＥＸ法を用いて得られた、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体と特異的に結合するＲＮＡアプタマーが開示されている。

特開２００７−４３９１７号公報

Ｃ．Ｔｕｅｒｋ＆Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：５０５−５１０，１９９０

収束したＲＮＡの一部とヒト可溶化型ＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合解析を示す図である。２ＲＡ５、２ＲＡ１、２ＲＡ６および２ＲＡ８は、それぞれ収束した２０種類のＲＮＡアプタマーの一部を示す。本発明のアプタマーと、ヒト可溶化型ＴＧＦ−βＩＩ型受容体またはＴＧＦ−β／ヒト可溶化型ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の複合体との結合解析を示す図である。「ｓＴβＲＩＩ」はヒト可溶化型ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を示し、「Ｔβ−ｓＴβＲＩＩ」はＴＧＦ−βとヒト可溶化型ＴＧＦ−βＩＩ型受容体との複合体を示す。本発明のアプタマーを短鎖化した欠失変異体の予想される二次構造を示す図である。配列番号１で表されるアプタマー（７３塩基長：２ＲＡ５）、配列番号２で表されるアプタマー（２ＲＡ５を９塩基欠失させた２ＲＡ５Ｓ１）、および配列番号３で表されるアプタマー（２ＲＡ５を１４塩基欠失させた２ＲＡ５Ｓ２）それぞれの二次構造とＴβＲＩＩに対する結合のＫｄ値を示した。本発明のアプタマーがＴＧＦ−βの細胞増殖抑制作用を阻害することを示す図である。

本発明は、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とするアプタマーを得ることによって、ＴＧＦ−βの生理機能の解明、ならびに過剰なＴＧＦ−βにより引き起こされる疾患の発症機構の解析、診断および治療に利用可能な物質を提供することなどを目的とする。

本発明者らは、このような物質の候補としてＴＧＦ−β受容体の１つであるＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ）に対するＲＮＡアプタマーを作製した。すなわち、ＴβＲＩＩを標的としてＳＥＬＥＸを行い、得られたアプタマーと標的との結合活性を調べ、その有用性を示した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。

すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
［１］ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とするアプタマー；
［２］配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の全部または一部を含む、［１］に記載のアプタマー；
［３］ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾ヌクレオチドである、［２］に記載のアプタマー；
［４］以下（ａ）または（ｂ）のいずれかである、［１］に記載のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の全部または一部を含むアプタマーであって、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマー；
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列の全部または一部を含むアプタマーであって、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマー；
［５］［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマーおよび機能性物質を含む複合体；
［６］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体または薬物である、［５］に記載の複合体；
［７］［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［５］または［６］に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を検出および／または定量する方法；
［８］［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［５］または［６］に記載の複合体を含む医薬。

本発明により、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対する結合能を有し、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマーが提供される。このようなアプタマーは、ＴＧＦ−βの機能を阻害するアプタマーである。本発明のアプタマーは、過剰なＴＧＦ−β発現により引き起こされる疾患の治療等に有用である。

本発明は、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対する結合能を有し、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマーを提供する。

ＴＧＦ−βとは、細胞増殖抑制、血管新生、上皮−間葉移行、免疫抑制、細胞外マトリックス産生などを誘導する多機能性のサイトカインである。ＴＧＦ−βが細胞表面のＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合すると、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体によりＴＧＦ−βＩ型受容体がリン酸化され、活性化される。活性化されたＴＧＦ−βＩ型受容体により細胞内シグナル伝達分子がリン酸化され、活性化されると、細胞内へＴＧＦ−βのシグナルが伝えられる。

本発明で示されるＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βＩ型受容体およびＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、動物体内で作られるほか、マウスなどの哺乳細胞、昆虫細胞、大腸菌などの細胞を用いて作製することができ、化学合成によっても製造することができる。また培養細胞や化学合成によって作製する場合であれば、容易に変異体を作製することができる。ここで「変異体」とは、アミノ酸が１〜数個置換されたものや各種タンパク質の一部分のアミノ酸配列を意味し、本来ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βＩ型受容体およびＴＧＦ−βＩＩ型受容体が有している少なくとも一つ以上の活性を有しているタンパク質またはペプチドを意味する。アミノ酸が置換される場合、置換アミノ酸は天然または非天然のいずれのアミノ酸であってもよい。本発明で言うＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βＩ型受容体およびＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、これらの変異体を含む。

アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、好ましくはＲＮＡアプタマー、修飾ＲＮＡアプタマーまたはそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状または環状の形態であり得る。

本発明のアプタマーはＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合能を有し、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とする。具体的には、本発明のアプタマーはＴＧＦ−βＩＩ型受容体のＴＧＦ−β結合領域に結合することで、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を競合的に阻害する。従って本発明のアプタマーはＴＧＦ−βとＴＧＦ−β受容体との結合を阻害することができる。このようなアプタマーとしては、例えば配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーが挙げられる。ここで「ＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合能を有する」とは、ランダム配列のＲＮＡプールより高いＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合活性を有していることを意味する。

また本発明のアプタマーは、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することができる限り特に限定されず、既存のアプタマーを利用しやすくする目的で短鎖化したものであってもよく、そのようなアプタマーとしては、例えば「配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の一部を含むアプタマーであって、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマー」が挙げられる。

本発明のアプタマーは、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することができる限り、ヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたアプタマーも含むものである。置換、欠失、挿入または付加してもよいヌクレオチド数としては特に限定されないが、通常１〜５個、好ましくは１〜３個である。

本明細書中、「配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の一部を含むアプタマーであって、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマー」の例としては、下記式

（式中、
Ｎ１およびＮ２は、互いに３塩基対の相補的塩基対合が可能な核酸塩基を示し、
Ｎ３およびＮ４は、互いに４塩基対の相補的塩基対合が可能な核酸塩基を示し、
Ｎ５は、１個の核酸塩基を示し、
Ｎ６およびＮ７は、互いに５塩基対の相補的塩基対合が可能な核酸塩基を示し、
Ｎ８は、少なくとも４個の核酸塩基を示し、
Ｎ２の３’末端側塩基とＮ３の５’末端側塩基は連続し、
Ｎ４の３’末端側塩基とＮ５は連続し、
Ｎ５とＮ６の５’末端側塩基は連続し、
Ｎ７の３’末端側塩基とＮ８の５’末端側塩基は連続し、
Ｎ１〜Ｎ８のそれぞれをつなぐ直線は、核酸塩基間の水素結合を示し、そして
Ｎ１〜Ｎ８のそれぞれをつなぐ曲線は、ループ部分を示す。）で表される二次構造を採るヌクレオチド配列を含み、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマーが挙げられる。

ここでＮ１およびＮ２で表される「互いに３対の相補的塩基対合が可能な核酸塩基」とは、「ループ部分を挟んで互いに相補的塩基対を形成することができる３個の核酸塩基」を意味し、例えばＮ１がＧＧＧの場合、Ｎ２はＣＣＣである。Ｎ３およびＮ４で表される「互いに４対の相補的塩基対合が可能な核酸塩基」とは、「ループ部分を挟んで互いに相補的塩基対を形成することができる４個の核酸塩基」を意味し、例えばＮ３がＣＧＧＧの場合、Ｎ４はＣＣＣＧである。Ｎ６、Ｎ７で表される「互いに５対の相補的塩基対合が可能な核酸塩基」とは、「ループ部分を挟んで互いに相補的塩基対を形成することができる５個の核酸塩基」を意味し、例えばＮ６がＧＧＣＣＧの場合、Ｎ７はＣＧＧＣＣである。
Ｎ５で表される「１個の核酸塩基」はどのような核酸塩基であってもよく、例えばＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）およびＵ（ウラシル）からなる群から選択される核酸塩基である。好ましくはＡである。
Ｎ８で示される「少なくとも４個の核酸塩基」はどのような核酸塩基であってもよく、例えばＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）およびＵ（ウラシル）からなる群から選択される核酸塩基を４個以上結合させたものである。好ましくは、はじめの４塩基はＧＡＣＡである。
連続する、Ｎ２の３’末端側塩基とＮ３の５’末端側塩基、Ｎ４の３’末端側塩基とＮ５、Ｎ５とＮ６の５’末端側塩基およびＮ７の３’末端側塩基とＮ８の５’末端側塩基のそれぞれの結合態様は特に限定されず、例えば３’−５’ホスホジエステル結合、２’−５’ホスホジエステル結合などのホスホジエステル結合や、ホスホジエステル結合を構成する酸素の一部または全部を硫黄原子で置換したホスホロチオエート結合などが挙げられる。

本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物のＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害する活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。

本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１０〜約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約７５ヌクレオチド以下であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。

本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドは、それぞれリボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシ基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいは同一又は異なって、リボースの２’位において、ヒドロキシ基が、任意の原子又は基で置換（修飾）されているヌクレオチド（本発明において、「置換ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」と記載する場合がある）であり得る。

このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ_２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。本発明のアプタマーはまた、ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾ヌクレオチドであるようなアプタマーであり得る。

本発明のアプタマーはまた、ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つ、好ましくは全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位においてフッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、あるいは同一または異なって、上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されているヌクレオチドであり得る。

本発明のアプタマーはまた、
（ａ）ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とするアプタマーであって、配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の全部または一部を含み、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマー；
（ｂ）ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とするアプタマーであって、配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列において、１〜５個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列の全部または一部を含み、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマー；
（ｃ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ａ）及び（ｂ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物；
であり得る。

上記アプタマーのうち、（ａ）における「ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とするアプタマーであって、配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の一部を含み、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマー」の例としては、前記した「配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の一部を含むアプタマーであって、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマー」の例として記載したアプタマーのうち、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマーが挙げられる。

また上記アプタマーのうち、（ｂ）における「ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とするアプタマーであって、配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列において、１〜５個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列の一部を含み、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマー」の例としては、前記した「配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の一部を含むアプタマーであって、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマー」の例として記載したアプタマーから１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されており、かつ該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマーが挙げられる。

上記（ｂ）のアプタマーは、（ａ）のアプタマーに変異を導入し、後述のＳＥＬＥＸを再度行うことでも得ることができる。このようにして得られるアプタマーは（ａ）のＲＮＡよりも結合活性や生理活性が高い可能性がある。このようにＲＮＡに変異を導入することにより、種々の目的に合ったアプタマーを作製することができる。

上記（ｃ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ_２）_ｎ−リンカー、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ_３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。

本発明のアプタマーは、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ_２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔｅｔａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎｅｔａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓｅｔａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２，５１３８−５１４５参照）。

本発明のアプタマーはまた、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対する結合性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６および／または８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ_２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。

改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ、核酸、ヌクレオシド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチン、カラム担体などを末端に付加することにより行われ得る。核酸を付加する場合、付加される核酸の長さは特に限定されないが、１００ｍｅｒ以下であることが好ましく、３０ｍｅｒ以下であることが更に好ましい。上記カラム担体としては、例えばアガロースやセファロースが挙げられる。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。

本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合および水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換または削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。

アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ａ．Ｄ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎｅｔａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｃ．Ｔｕｅｒｋｅｔａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用することで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。

ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らないことに注意すべきである。このようにして選ばれた活性のあるアプタマーは、最適化ＳＥＬＥＸを行うことで、更に高性能化することが可能である。最適化ＳＥＬＥＸとは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。

ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは７０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする場合がある。このような本発明のアプタマーとしては、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することができる限り特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の一部を含む、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマーが挙げられる。すなわち本発明のアプタマーには、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害するアプタマーであって、配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の全部または一部を含むアプタマーも含まれる。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる場合がある。

アプタマーは化学合成が可能であるので容易に改変することができる。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いてその二次構造を予測することができる。またＸ線解析やＮＭＲ解析により立体構造を予測することも可能である。これらの構造予測により、どのヌクレオチドを置換または欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能か否かを予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうかは、既存のアッセイ系により確認することができる。また、修飾に関しても配列の長さと同様に高度に設計又は改変可能である。

以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。

例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：

〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００、好ましくは１〜約５０、より好ましくは１〜約３０、さらにより好ましくは１〜約２０又は１〜約１０であり得る。〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。

本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、または非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジンなどのリースト剤、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタルプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。

本発明のアプタマーまたは複合体は、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。特に本発明のアプタマーまたは複合体はＴＧＦ−βＩＩ型受容体を介したＴＧＦ−βの細胞内シグナル伝達を阻害するので、例えばＴＧＦ−βの作用に起因する種々の疾患、ＴＧＦ−βの作用により惹起される各種臓器での組織繊維症、または組織繊維症を伴う種々の疾患の医薬、診断薬、検査薬、試薬などとして有用である。

ここで、「ＴＧＦ−βの作用に起因する種々の疾患」としては、腎疾患（例、腎繊維症、腎炎、腎不全、腎硬化症など）、肺疾患（例、肺繊維症、肺炎など）、肝臓疾患（例、肝臓組織繊維症、肝硬変、肝炎など）、皮膚疾患（例、創傷、強皮症、乾癬、ケロイドなど）、関節炎（例、慢性関節リウマチ、変形性関節症など）、血管疾患（例、血管再狭窄、リウマチ性血管炎など）が挙げられる。また「組織繊維症を伴う種々の疾患」としては、種々臓器における癌（特に癌の浸潤、転移）、動脈硬化症などが挙げられる。

本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。

また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡなどが挙げられる。

非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。更に注射液剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来より使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリンまたはその誘導体等を適宜配合することができる。

本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。

本発明はまた、本発明のアプタマーまたは複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えばＴＧＦ−βＩＩ型受容体の精製、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の検出、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の定量などに有用であり得る。

本発明のアプタマーまたは複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマーまたは複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシ基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。

本発明はまた、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の検出及び定量方法を提供する。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を測定することを含み得る。ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法（例、ウエスタンブロット法における二次抗体の代わりとしての使用）、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるＴＧＦ−βＩＩ型受容体量の測定に有用であり得る。

本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

以下、本発明の実験の手法を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

［実施例１］組換えＴＧＦ−βＩＩ型受容体の精製
細胞内ドメインおよび細胞膜貫通ドメインを欠失させ、Ｃ末端をヒスチジン（Ｈｉｓ）標識したヒト可溶化型ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ｓＴβＲＩＩ−８Ｈｉｓ）の発現ベクターを構築した。次いでこの発現ベクターを、２９３ｆｅｃｔｉｎ−トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞へ導入した。次いで培養上清からＴＡＬＯＮＭｅｔａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｓｉｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、組換えｓＴβＲＩＩ−８Ｈｉｓを精製した。

［実施例２］細胞培養
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて培養した。２９３Ｔ細胞株はＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株はＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、ＳＮＵ−１６細胞株はＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１００単位／ｍｌペニシリン−１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加して培養した。

［実施例３］ＲＮＡアプタマーの選択
ＳＥＬＥＸ法によるＲＮＡアプタマーの取得はＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎＡ．Ｄ．ａｎｄＳｚｏｓｔａｋＪ．Ｗ．，ＩｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓｔｈａｔｂｉｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｌｉｇａｎｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８−８２２，１９９０）、およびＴｕｅｒｋらの方法（ＴｕｅｒｋＣ．ａｎｄＧｏｌｄＬ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌｉｇａｎｄｓｂｙｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡｌｉｇａｎｄｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５−５１０，１９９０）を改良した方法、すなわち精製したｓＴβＲＩＩ−８Ｈｉｓを、ＴＡＬＯＮＭｅｔａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｓｉｎｓまたはＮｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅに固相化し、４０塩基のランダム配列を持つＲＮＡプール（Ｎ４０ランダムＲＮＡプール）に対するＳＥＬＥＸ法を行うことで得た。具体的には、以下のとおりである。
まずＳＥＬＥＸ法に用いたＮ４０ランダムＲＮＡプールは、化学合成した下記のＦ１プライマーと４０塩基のランダム配列を持つテンプレート（オペロンバイオテクノロジー社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に合成依頼）より作製した。ランダム配列テンプレートはＥｘＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）をもちいたＰＣＲによって増幅させ、このＤＮＡ断片を転写のテンプレートとして、Ｆ１プライマーに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列により、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴ７ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔｓ（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をもちいてｉｎｖｉｔｒｏで転写し、フェノール抽出とゲルろ過により精製し、Ｎ４０ランダムＲＮＡプールとした。

ＴＡＬＯＮＭｅｔａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｓｉｎｓまたはＮｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）に固相化したｓＴβＲＩＩ−８ＨｉｓとＮ４０ランダムＲＮＡプール内のＲＮＡの結合は、バッファーＡ［２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，８０ｍＭｐｏｔａｓｓｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，２．５ｍＭｍａｇｎｅｓｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ］中で行った。
ＴＡＬＯＮＭｅｔａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｓｉｎｓまたはＮｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅをバッファーＡで洗浄した後、３００ｍＭイミダゾールを用いてｓＴβＲＩＩ−８Ｈｉｓとこれに結合したＲＮＡを遊離させた。このＲＮＡを基にＲＴ−ＰＣＲを行ってＤＮＡテンプレートを増幅した後、ｉｎｖｉｔｒｏで転写を行い、次のラウンドのＲＮＡプールを作製した。

６ラウンドまでこのサイクルを回した後、濃縮されてきたＲＮＡに対応するｃＤＮＡをｐＧＥＭＴ−ＥＡＳＹＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローン化し、大腸菌株ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換して単一クローンを得た。プラスミドＤＮＡを抽出後、以下のシークエンスプライマーを用いてＤＮＡシークエンサーＭｏｄｅｌ３１００（ＡＢＩ社製）により塩基配列を決定した。その結果、２０種類の収束したＲＮＡが得られた。

（配列番号４）Ｆ１プライマー：
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＣＧ−３’（Ｔ７プロモーター配列を下線で示した）
（配列番号５）ランダム配列テンプレート：
５’−ＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＧＧＣＣＧＴＴＡ−Ｎ４０−ＣＧＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’
（配列番号６）シークエンスプライマー：
５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’

得られた塩基配列に対してＭＦＯＬＤプログラムを適用し、ＲＮＡの二次構造予測を行った。

［実施例４］表面プラズモン共鳴による結合反応速度の解析
収束したＲＮＡのＴβＲＩＩへの結合活性を表面プラズモン共鳴解析により検討した。ｐｏｌｙ（ｄＴ）_１６オリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン化し、ストレプトアビジンセンサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）上に固定化した。さらに３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）_１６を付加した、収束ＲＮＡを添加して固定化した。
次いで、ｓＴβＲＩＩ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）、あるいはＴβ−ｓＴβＲＩＩを添加し、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ社製）を用いて表面プラズモン共鳴解析を行うことで、結合反応速度を測定した（図１）。ＲＮＡとｓＴβＲＩＩ、あるいはＴβ−ｓＴβＲＩＩが結合すると光学的な変化が起こり、センサーグラム上でＲｅｓｏｎａｎｃｅＵｎｉｔｓの上昇が観察される。Ｎ４０ランダムＲＮＡプールとｓＴβＲＩＩ、あるいはＴβ−ｓＴβＲＩＩとの非特異的な結合をバックグラウンドとして測定を行った。得られたセンサーグラムをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）ソフトウェアで解析し、解離定数（Ｋｄ値）を算出した。収束したＲＮＡのうち、１３種類がｓＴβＲＩＩに対し結合能を有する抗ＴβＲＩＩＲＮＡアプタマーであった。算出した結合解離定数（Ｋｄ）は、２．９×１０^−９Ｍ〜１０．４×１０^−９Ｍであった。

［実施例５］蛍光標識ＲＮＡ、あるいは蛍光標識抗体による細胞染色
次に、抗ＴβＲＩＩＲＮＡアプタマーが細胞膜上で発現されるＴβＲＩＩに結合できるか検討した。
Ｎ４０ランダムＲＮＡプールおよびＲＮＡアプタマーは、ＵＬＹＳＩＳＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識した。
次いで標識されたアプタマーが、表面プラズモン共鳴解析により非標識ＲＮＡアプタマーと同様にｓＴβＲＩＩに結合することを確認した。
Ｐｏｌｙ−Ｄ−ＬｙｓｉｎｅＢｉｏＣｏａｔｃｕｌｔｕｒｅｓｌｉｄｅｓ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で培養したヒト胎児腎細胞株２９３Ｔに対して、ＦｕＧＥＮＥ６ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてヒトＴβＲＩＩの発現プラスミドを一過性に導入し、ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現させた。４８時間後に細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定した。さらに、１０％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ＲＮＡ、あるいは抗ヒトＴβＲＩＩ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞を染色した。細胞核ＤＮＡはＤＡＰＩＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で染色した。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤＭｏｕｎｔｉｎｇＭｅｄｉｕｍ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて包埋し、倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ７１（オリンパス社）で蛍光を観察した。
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＴβＲＩＩＲＮＡアプタマーを用いてヒトＴβＲＩＩ発現２９３Ｔ細胞を染色すると、抗ヒトＴβＲＩＩ抗体を用いた免疫染色と同様に蛍光が観察されたが、親株である２９３Ｔ細胞を染色しても蛍光は観察されなかった。一方、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識Ｎ４０ランダムＲＮＡを用いてヒトＴβＲＩＩ発現２９３Ｔ細胞、親株２９３Ｔ細胞を染色したが、どちらも蛍光は観察されなかった。これらの結果から、得られた抗ＴβＲＩＩＲＮＡアプタマーが、抗ヒトＴβＲＩＩ抗体と同様に、細胞表面に発現するＴβＲＩＩを特異的に認識し、結合することが示された。

［実施例６］ＴＧＦ−β結合領域を認識する抗ＴβＲＩＩＲＮＡアプタマーの探索
ｓＴβＲＩＩに対し結合能を有する１３種類の抗ＴβＲＩＩＲＮＡアプタマーの中に、ＴβＲＩＩのＴＧＦ−β結合領域を認識するＲＮＡアプタマーがあるか否かを検索した。
上述のようにストレプトアビジンセンサーチップにＲＮＡアプタマーを固定化し、ｓＴβＲＩＩ、あるいは予めＴＧＦ−βを結合させたｓＴβＲＩＩ（Ｔβ−ｓＴβＲＩＩ）を添加し表面プラズモン共鳴解析を行った（図２）。１３種類のアプタマーのうち、２ＲＡ５と名づけられたＲＮＡアプタマーはｓＴβＲＩＩに結合したが、Ｔβ−ｓＴβＲＩＩとは結合しなかった。一方、２ＲＡ１と名づけられたアプタマーを含む他の１２種類のＲＮＡアプタマーは、ｓＴβＲＩＩおよびＴβ−ｓＴβＲＩＩの両方と結合した。
以上の結果、２ＲＡ５のみがＴβＲＩＩのＴＧＦ−β結合領域を認識しこの領域に結合していることがわかった。２ＲＡ５は配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡアプタマーである（以下、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡアプタマーを「２ＲＡ５」と記載する場合がある）。

［実施例７］ＲＮＡアプタマーによるＴβＲＩＩ、Ｔβ−ＴβＲＩＩの沈降
さらに、実施例６で得られたＲＮＡアプタマーである２ＲＡ５が、細胞可溶化物からＴβＲＩＩ、あるいはＴＧＦ−βとＴβＲＩＩの複合体（Ｔβ−ＴβＲＩＩ）を分離できるか否かを検討した。
Ｎ４０ランダムＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー（２ＲＡ１、２ＲＡ５）のそれぞれの３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）_１６を付加し、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_３０を固定化したラテックス粒子、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０Ｓｕｐｅｒ（タカラバイオ社製）に塩基対合を介して固定化した。次いでヘムアグルチニン（ＨＡ）標識ヒトＴβＲＩＩ（ＴβＲＩＩ−ＨＡ）を発現させた２９３Ｔ細胞を、未刺激で、あるいはＴＧＦ−βで刺激した後、２ｍＭＤＳＳ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で処理して結合したＴＧＦ−βとＴβＲＩＩとを架橋し、細胞可溶化物とした。ＲＮＡを固定化したＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０Ｓｕｐｅｒと細胞可溶化物とを混合し、反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ＳｕｐｅｒからＲＮＡとそれに結合するたんぱく質を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＨＡモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。当該ウェスタンブロッティングでは、ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬＰｌｕｓＷｅｓｔｅｒｍＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア社製）とＨＲＰを反応させ、ＬＡＳ−１０００Ｐｌｕｓ（富士フィルム社製）で検出し、ＴβＲＩＩ、Ｔβ−ＴβＲＩＩがＲＮＡアプタマーにより沈降されたか解析した。
その結果、２ＲＡ５はＴβＲＩＩを分離したが、Ｔβ−ＴβＲＩＩは分離できなかった。一方、２ＲＡ１はＴβＲＩＩのみならずＴβ−ＴβＲＩＩも分離し、Ｎ４０ランダムＲＮＡはどちらも分離しなかった。以上の結果から２ＲＡ５がＴβＲＩＩのＴＧＦ−β結合領域に結合していることが明らかとなり、２ＲＡ５がＴＧＦ−βとＴβＲＩＩとの結合を阻害しＴＧＦ−βの生理作用を抑制する可能性が示唆された。

［実施例８］ＲＮＡアプタマーによるＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制
次に、本発明のＲＮＡアプタマーがｉｎｖｉｔｒｏにおいてＴＧＦ−βとＴβＲＩＩとの結合を阻害し、ＴＧＦ−βのシグナル伝達を抑制するか検討した。
ＴＧＦ−βがＴβＲＩＩに結合すると、細胞質内に存在するＴＧＦ−βのシグナル伝達分子であるＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３が活性化される。活性化されたＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３はＳｍａｄ４とヘテロ複合体を形成し、細胞質から核へと移行し転写因子として機能するようになる。ＦＬＡＧ標識Ｓｍａｄ３（ＦＬＡＧ−Ｓｍａｄ３）、Ｓｍａｄ４、ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩの発現プラスミドを２９３Ｔ細胞へ、ＦＬＡＧ−Ｓｍａｄ３の発現プラスミドをヒト肝癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂへ導入、発現させ、ＴＧＦ−βで刺激すると、ＦＬＡＧ−Ｓｍａｄ３の核内移行が観察された。そこで、細胞をｓＴβＲＩＩ、Ｎ４０ランダムＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー（２ＲＡ１、２ＲＡ５）それぞれの存在下でＴＧＦ−βで刺激し、ＦＬＡＧ−Ｓｍａｄ３の核内移行を抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて観察した。
その結果、ｓＴβＲＩＩと同様に、２ＲＡ５存在下においてＦＬＡＧ−Ｓｍａｄ３の核内移行が著明に阻害された。これに対し、Ｎ４０ランダムＲＮＡ、２ＲＡ１存在下ではＦＬＡＧ−Ｓｍａｄ３の核内移行は阻害されなかった。以上の結果から、２ＲＡ５はＴβＲＩＩへのＴＧＦ−βの結合を阻害することで、ＴＧＦ−βを介したシグナル伝達経路を阻害し、ＴＧＦ−β由来の生理作用を抑制できることがわかった。

［実施例９］ＲＮＡアプタマーの短鎖化
標的物質に対する結合能を維持したまま塩基数を減らし、分子量を減少させる目的で、２ＲＡ５の小型化を試みた。
２ＲＡ５のＭＦＯＬＤプログラムによって予想された二次構造をもとに、２ＲＡ５の複数の欠損変異体を作製し、表面プラズモン共鳴解析により各欠損変異体のｓＴβＲＩＩに対する結合能を調べた。７３塩基長の２ＲＡ５から９塩基欠失させた「２ＲＡ５Ｓ１」と名づけられたＲＮＡアプタマー、そして１４塩基欠失させた「２ＲＡ５Ｓ２」と名づけられたＲＮＡアプタマーは、２ＲＡ５とよく似た二次構造と同様の結合活性を有していた（図３）。
２ＲＡ５Ｓ１、２ＲＡ５Ｓ２の塩基配列は、配列番号２、配列番号３にそれぞれ示される。

［実施例１０］ＲＮＡアプタマーによるＴＧＦ−β細胞増殖抑制作用の阻害試験
ヒト胃癌細胞株ＳＮＵ−１６はＴＧＦ−βに対する反応性を維持しており、ＴＧＦ−βで刺激すると強く細胞増殖が抑制される。そこで、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＴβＲＩＩ抗体、Ｎ４０ランダムＲＮＡ、２ＲＡ１、２ＲＡ５、あるいは２ＲＡ５Ｓ１存在下でＳＮＵ−１６細胞をＴＧＦ−βで刺激し、ＴＧＦ−βの細胞増殖抑制作用が阻害されるか検討した（図４）。
細胞を９６穴プレートに播種し、培地、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＴβＲＩＩ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）、Ｎ４０ランダムＲＮＡプール、あるいはＲＮＡアプタマーを加え、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間静置した。その後、培地、あるいは４０ｐＭのＴＧＦ−βを加え、１６時間培養した。ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔＷＳＴ−１（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ社）を加え、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間静置した後、マイクロプレートリーダーを用いてサンプルの吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。リファレンス波長は６５５ｎｍとした。
その結果、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＴβＲＩＩ抗体と同様に、２ＲＡ５または２ＲＡ５Ｓ１存在下で、ＴＧＦ−βにより誘導される細胞増殖抑制が著明に阻害された。一方、Ｎ４０ランダムＲＮＡ、あるいは２ＲＡ１存在下ではこのような細胞増殖抑制の阻害は見られなかった。これらの結果から、２ＲＡ５、２ＲＡ５Ｓ１がｉｎｖｉｔｒｏにおいてＴＧＦ−βの細胞増殖抑制作用を阻害することが明らかとなった。

Claims

ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合し、かつＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合を阻害することを特徴とするアプタマー。
配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の全部または一部を含む、請求項１に記載のアプタマー。
ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾ヌクレオチドである、請求項２に記載のアプタマー。
以下（ａ）または（ｂ）のいずれかである、請求項１に記載のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列の全部または一部を含むアプタマーであって、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマー；
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列の全部または一部を含むアプタマーであって、該アプタマーに含まれるピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一または異なってフッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群から選択される原子または基で置換されている、アプタマー。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマーおよび機能性物質を含む複合体。
機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体または薬物である、請求項５に記載の複合体。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項５または６に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を検出および／または定量する方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項５または６に記載の複合体を含む医薬。