JP4910195B2 - 免疫グロブリンｇに結合する核酸とその利用法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する結合活性を有する核酸に関する。この核酸によって汎用的な抗体の精製、標識、固定化、修飾等が可能になる。

ＩｇＧは血清の主要なタンパク質の一つで、免疫系において異物を認識し排除に導くという重要な役割を担っている。この特性を活かして各種疾患の治療薬や診断薬、また試薬への応用研究が広くおこなわれている。その一つが癌に対する抗体療法で、抗体依存性細胞介在性細胞障害反応（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害反応（ＣＤＣ）を利用したものや、癌細胞に発現する受容体等を抗体によって特異的にブロックして兵糧攻めにする分子標的医薬、あるいは癌細胞特異的な抗体に抗癌剤を結合した抗体を利用するミサイル療法などの開発が進められている。その中で、抗ＨＥＲ２受容体ヒト化単クローン抗体が、乳癌等の悪性腫瘍治療剤として開発され上市された（商品名ハーセプチン）。またＩｇＧは、抗原と特異的に結合する性質を利用して、免疫学的測定をはじめ、細胞やタンパク質の機能解析、遺伝子の発現スクリーニングなど各種生化学実験の必須の道具として使われている。
ＩｇＧは２本のＨ鎖と２本のＬ鎖がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合したＹ字形の構造をしている。ＩｇＧをタンパク質分解酵素であるパパインで分解すると、定常部位からなるＦｃフラグメントと抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントに分けることができる。また、ＩｇＧにはサブクラスが存在し、ヒトＩｇＧの場合はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４種類が存在する。
抗体は血清やハイブリドーマ細胞培養上清液から抗体精製用カラムを用いて精製される。一般に第一段階の精製にはリガンドとしてＰｒｏｔｅｉｎ Ａが使用される。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａとは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が産生する分子量４２ｋＤａのタンパク質で、ＩｇＧのＦｃ領域に強く結合する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａは高価であり、また、動物種やサブクラスによって高純度の抗体を得ることができない場合や、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた精製条件では抗体が変性する場合があり、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの性能を上回る新規の分離剤が求められている。
蛍光物質または酵素により標識された抗体は、免疫組織化学実験、組織染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリーなど各種実験に用いられている。例えば組織染色では、ＦＩＴＣなどの蛍光物質が結合した抗体を用いることで、目的タンパク質の組織局在を調べることができる。また、ＥＬＩＳＡやウエスタンブロッティングなどの測定では、まず検出したい物質に対して一次抗体を反応させ、次にその一次抗体と結合する標識された二次抗体を反応させることでより高感度な測定がおこなえるようになっている。例えば、ＧＥヘルスケアー社のＥＣＬシステムでは、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗体を用い、その触媒作用によってルミノールを酸化・発光させて目的物質を検出する。しかし、化学修飾によって標識物質を抗体に結合させるには手間と時間がかかり、場合によっては抗体が変性する場合があり、新規の抗体標識技術の開発が求められている。また、標識化された二次抗体についてもより安価で高感度なものが望まれている。
各種疾患に対する診断用チップとして抗体チップの開発が進められている。その一つの課題は基板への抗体の固定化方法で、抗体の抗原結合部位を表面に高活性状態で高密度に整列させる方法の開発である。非特異的吸着を利用した固定化法やアミノ基を利用した固定化法では抗体が無秩序に配列してしまい、十分な感度を得ることができていない。
抗体は癌やリウマチなどの疾患に対する分子標的治療薬として急速に開発研究が推進され、これまでに約２０種類の抗体医薬が実用化され、さらに世界的に約３００種類の抗体医薬候補の臨床試験が実施されている。開発当初は抗体医薬としてマウス単クローン抗体が用いられていたが、マウス抗体はヒト免疫系に異物と認識されヒト抗マウス抗体の産生が誘導されたため、十分な治療効果を上げることができなかった。そこで遺伝子組換え技術を用いて、マウス抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置き換えたキメラ抗体やマウス抗体の相補性決定領域以外全てヒト抗体に置き換えたヒト化抗体が開発された。また、ヒト抗体産生マウス（ＫＭマウス）を用いたヒト単クローン抗体の作製法も開発されている。
抗体療法に用いられる単クローン抗体医薬の一つは、癌細胞を特異的に認識する抗体に抗癌剤や毒素を結合させたもので、これを標的細胞にインターナリゼーションさせて標的細胞を死滅させる。抗癌剤または毒素はインターナリゼーションされた後に抗体から切り離されることが必要である。そのため、抗体と抗癌剤または毒素を結合するリンカーにプロテアーゼ認識部位を含めるなどして、インターナリゼーションされた後に抗体から抗癌剤または毒素が切り離されるような細工が施されている。例えば、急性骨髄性白血病の治療薬として開発されたｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）はヒト化抗ＣＤ３３単クローン抗体にカリケアマイシン誘導体を結合させたもので、ＭｙｌｏｔａｒｇがＣＤ３３に結合し細胞内にインターナリゼーションされると、カリケアマイシン誘導体が遊離して細胞を死滅させる。このように、抗体と抗癌剤または毒素を結合するリンカーの設計は重要で、より高い薬効を引き出すために、新規のリンカーの開発が進められている。
近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）。ＳＥＬＥＸ法とは１０^１４程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる。得られたＲＮＡアプタマーが標的物質の機能を促進したり阻害したりする場合、このＲＮＡアプタマーを医薬品などに応用することができる。実際には、ヒト翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａ（特開２００２−３００８８５号公報、Ｏｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，（２００３）ＲＮＡ ９，３９４−４０７）やｅＩＦ４Ｅ（特開２００４−３４４００８号公報、Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）ＲＮＡ １１，７７−８９）、骨代謝に関係する受容体ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２，６１２０−６１２８）などに特異的に結合するＲＮＡアプタマーがＳＥＬＥＸ法を用いて作製されている。抗ＤＮＡ自己抗体の抗原認識部位を介して結合するＲＮＡアプタマーもまた報告されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ３００，５１６−５２３）。

本発明は、ＩｇＧに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ＩｇＧに対して高度に設計された良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである。
［１］ＩｇＧのＦｃ部分に対して結合するアプタマー。
［２］ＩｇＧのＦｃ部分として、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対して特異的に結合する、上記［１］のアプタマー。
［３］アプタマーを構成する総ヌクレオチド数が４０個以下である、上記［１］又は［２］のアプタマー。
［４］アプタマーに含まれる少なくとも１種のヌクレオチドが、リボースの２’位において、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種の基を含むヌクレオチドである、上記［１］〜［３］のいずれかのアプタマー。
［５］ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）で表されるヌクレオチド配列を含む、上記［３］のアプタマー。
［６］ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基がフッ素原子で置換されているヌクレオチドである、上記［５］のアプタマー。
［７］ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド（但し、３番目のＵを除く）がそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドである、上記［６］のアプタマー。
［８］ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）がＧＧＵＧＣＵ又はＧＧＵＧＡＵである、上記［５］のアプタマー。
［９］ＡＮＣ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドである）で表されるヌクレオチド配列をさらに含む、上記［５］のアプタマー。
［１０］ＡＮＣにおける各ヌクレオチドがそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドである、上記［９］のアプタマー。
［１１］以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである、上記［９］のアプタマー：
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）の５’側にＧＧＡを含み、かつＡＮＣの３’側にＵＣＣを含む；
（ｉｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）の５’側にＧＧＮ_Ｘ１Ａを含み、かつＡＮＣの３’側にＵＮ_Ｘ２ＣＣを含む（Ｎ_Ｘ１、Ｎ_Ｘ２はそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドである）；あるいは
（ｉｉｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）の５’側にＧＧＮ_Ｘ３Ｎ_Ｘ４Ａを含み、かつＡＮＣの３’側にＵＮ_Ｘ５Ｎ_Ｘ６ＣＣを含む（Ｎ_Ｘ３、Ｎ_Ｘ４、Ｎ_Ｘ５、Ｎ_Ｘ６はそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドである）。
［１２］ＧＧＡ、ＧＧＮ_Ｘ１Ａ又はＧＧＮ_Ｘ３Ｎ_Ｘ４Ａに含まれるＧＧ、及びＵＣＣ、ＵＮ_Ｘ２ＣＣ又はＵＮ_Ｘ５Ｎ_Ｘ６ＣＣに含まれるＣＣがそれぞれ、リボースの２’位においてヒドロキシル基が水素原子で置換されているヌクレオチドである、上記［１１］のアプタマー。
［１３］以下（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５はそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドであり、
Ｎ^２及びＮ^３は互いに相補的なヌクレオチドであり、
Ｎ^４及びＮ^５は互いに相補的なヌクレオチドであり、
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド（但し、３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ^１Ｃにおける各ヌクレオチド、（ｉｉｉ）Ｎ^２〜Ｎ^５の各ヌクレオチドがそれぞれ、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドである〕で表される潜在的二次構造を有する、上記［６］のアプタマー。
［１４］ループ構造における全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基が水素原子で置換されている、上記［１１］のアプタマー。
［１５］（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで表される潜在的二次構造を有するアプタマーが、以下（Ｉ’）〜（ＩＩＩ’）：
〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５はそれぞれ、上記［１３］と同義である〕のいずれかで表される潜在的二次構造を有する、上記［１３］のアプタマー。
［１６］ＡＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）Ｃで表されるヌクレオチド配列を含み、ＡＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）Ｃにおける４番目のＵが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基がフッ素原子で置換されているヌクレオチドであり、ＡＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）Ｃにおける各ヌクレオチド（但し、４番目のＵを除く）がそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅで置換されているヌクレオチドである、上記［３］のアプタマー。
［１７］ＧＡＮＣＵ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドである）で表されるヌクレオチド配列をさらに含み、ＧＡＮＣＵにおける各ヌクレオチドがそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドである、上記［１６］のアプタマー。
［１８］以下（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）：
〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５、Ｎ^６、Ｎ^７はそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドであり、
Ｎ^２及びＮ^３は互いに相補的なヌクレオチドであり、
Ｎ^４及びＮ^５は互いに相補的なヌクレオチドであり、
Ｎ^６及びＮ^７は互いに相補的なヌクレオチドであり、
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド（但し、３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ^１Ｃにおける各ヌクレオチド、（ｉｉｉ）Ｎ^２〜Ｎ^７の各ヌクレオチドがそれぞれ、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドである〕で表される潜在的二次構造を有する、上記［６］のアプタマー。
［１９］（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）のいずれかで表される潜在的二次構造を有するアプタマーが、以下（Ｉａ’）〜（ＩＩＩａ’）：
〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５はそれぞれ、上記［１８］と同義である〕のいずれかで表される潜在的二次構造を有する、上記［１８］のアプタマー。
［２０］Ｎ^４、Ｎ^６はそれぞれ、２’位においてヒドロキシル基が水素原子で置換されているヌクレオチドであり、Ｎ^５、Ｎ^７はそれぞれ、２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドである、上記［１９］のアプタマー。
［２１］（Ｉａ’）〜（ＩＩＩａ’）のいずれかで表される潜在的二次構造を有するアプタマーが、以下（Ｉａ’’’）〜（ＩＩＩａ’’’）：
のいずれかで表される潜在的二次構造を有する、上記［１９］のアプタマー。
［２２］以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、上記［３］のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜２３のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）からなるアプタマー；
（ｂ）配列番号１〜２３のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）で表されるヌクレオチド配列において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列からなるアプタマー；
（ｃ）該（ａ）の連結物、該（ｂ）の連結物、及び該（ａ）及び（ｂ）の連結物からなる群より選ばれる連結物。
［２３］上記［１］〜［２２］のいずれか記載のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体。
［２４］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物、毒素又は薬物送達媒体である、上記［２３］の複合体。
［２５］上記［１］〜［２２］のいずれか記載のアプタマーあるいは上記［２３］又は［２４］の複合体が固定化された固相担体。
［２６］固相担体が、基板、樹脂、プレート、フィルター、カートリッジ、カラム又は多孔質材である、上記［２５］の固相担体。
［２７］上記［２５］又は［２６］の固相担体を含む医療用機器。
［２８］医療用機器が血液浄化用機器である、上記［２７］の機器。
［２９］上記［１］〜［２２］のいずれか記載のアプタマー、上記［２３］又は［２４］の複合体あるいは上記［２５］又は［２６］の固相担体を含む、診断用又は検査用試薬。
［３０］上記［１］〜［２２］のいずれかのアプタマーあるいは上記［２３］又は［２４］の複合体を含む、医薬。
［３１］上記［２５］又は［２６］の固相担体にＩｇＧ抗体を吸着させ、吸着したＩｇＧ抗体を溶出液により溶出させることを含む、抗体精製又は濃縮方法。
［３２］溶出液が中性溶液である、上記［３１］の方法。
［３３］ＩｇＧ抗体を作製し、作製されたＩｇＧ抗体を上記［２５］又は［２６］の固相担体により精製することを含む、精製抗体の製造方法。
［３４］上記［１］〜［２２］のいずれか記載のアプタマー、上記［２３］又は［２４］の複合体あるいは上記［２５］又は［２６］の固相担体を用いて、試料中のＩｇＧの有無及び／又は量を測定することを含む、ＩｇＧの検出及び／又は定量方法。

図１は、配列番号１で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図２は、配列番号２で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図３は、配列番号３で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図４は、配列番号４で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図５は、配列番号５で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図６は、配列番号６で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図７は、配列番号７で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図８は、配列番号８で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図９は、配列番号９で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１０は、配列番号１０で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１１は、配列番号１１で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１２は、配列番号１２で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１３は、配列番号１３で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１４は、配列番号１４で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１５は、配列番号１５で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１６は、配列番号１６で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１７は、配列番号１７で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１８は、配列番号１８で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図１９は、配列番号１９で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図２０は、配列番号２０で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図２１は、配列番号２１で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図２２は、配列番号２２で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図２３は、配列番号２３で表されるＲＮＡの予測された二次構造を示す。
図２４は、配列番号１で表されるＲＮＡとヒトＩｇＧ−Ｆｃの結合の様子を示す表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、ＩｇＧ−ＦｃをインジェクションしてＲＮＡとの相互作用を観察した。縦軸のＲＵは、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｕｎｉｔを示し、Ｒｅｓｐ．Ｄｉｆｆ．はＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓを示す。横軸は、時間（秒）を示す。縦軸、横軸におけるこれらの表記は、以下の図２５〜３１、４２でも同様である。
図２５は、配列番号３で表されるＲＮＡとヒトＩｇＧ−Ｆｃの結合の様子を示す表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、ＩｇＧ−ＦｃをインジェクションしてＲＮＡとの相互作用を観察した。
図２６は、ランダム配列のＲＮＡプールとヒトＩｇＧ−Ｆｃの結合の様子を示す表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、ＩｇＧ−ＦｃをインジェクションしてＲＮＡとの相互作用を観察した。
図２７は、配列番号１で表されるＲＮＡとヒトＩｇＧ１とヒトＦｃγＲＩの複合体形成の様子を示す表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、ＩｇＧ１をインジェクションしてＲＮＡに結合し、次いでＦｃγＲＩをインジェクションしてＩｇＧ１との相互作用を観察した。
図２８は、ランダム配列を含むＲＮＡプールとヒトＩｇＧ１とヒトＦｃγＲの結合の様子を示す表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、ＩｇＧ１をインジェクションし、次いでＦｃγＲＩをインジェクションした。
図２９は、配列番号１で表されるＲＮＡとヒトＩｇＧ１とＰｒｏｔｅｉｎ Ａの複合体形成の様子を示す表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、ＩｇＧ１をインジェクションしてＲＮＡに結合し、次いでＰｒｏｔｅｉｎ ＡをインジェクションしてＩｇＧ１との相互作用を観察した。
図３０は、配列番号１で表されるＲＮＡアプタマーとＰｒｏｔｅｉｎ Ａの結合の様子を示す表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡをインジェクションしてＲＮＡとの相互作用を観察した。
図３１は、配列番号１７−２で表されるＲＮＡアプタマーとヒトＩｇＧ１の結合の様子を示す表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ ｄＡを付加したＲＮＡをｄＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、ＩｇＧ１をインジェクションしてＲＮＡとの相互作用を観察した。
図３２は、配列番号１５と１７で表されるＲＮＡを抗体精製用分離剤のリガンドとして用いてヒトＩｇＧ１をプルダウンしたときのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。Ｐｏｌｙ（Ａ）が結合したＲＮＡをＰｏｌｙ（ｄＴ）が結合したビーズに固定化してヒトＩｇＧ１のプルダウンをおこなった。レーン１：配列番号１５で表されるＲＮＡをリガンドとして用いた場合。レーン２：配列番号１７で表されるＲＮＡをリガンドとして用いた場合。レーン３：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａをリガンドとして用いた場合。レーン４：ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａをリガンドとして用いた場合。
図３３は、配列番号１５で表されるＲＮＡを抗体精製用分離剤のリガンドとして用いてヒト血清からヒトＩｇＧを精製したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ビオチンが結合したＲＮＡをストレプトアビジンのビーズに固定化して、ヒト血清からＩｇＧをプルダウンした。ＲＮＡに結合したＩｇＧは３種類の中性の溶出液を用いて溶出した。中性の溶出液でＩｇＧが効率よく溶出されるかどうか確認するために、溶出し終わったビーズにサンプルバッファーを加えて加熱しＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。レーン１：分子量マーカータンパク質。レーン２：ＲＮＡをリガンドとして用いたビーズから２００ｍＭ ＫＣｌと１０ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶出液で溶出されるＩｇＧ。レーン３：ＲＮＡをリガンドとして用いたビーズから２００ｍＭ ＫＣｌと１０ｍＭ ＥＤＴＡと１０％グリセロールからなる溶出液で溶出されるＩｇＧ。レーン４：ＲＮＡをリガンドとして用いたビーズから６００ｍＭ ＫＣｌと１０ｍＭ ＥＤＴＡと１０％グリセロールからなる溶出液で溶出されるＩｇＧ。レーン５：ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースビーズを用いてＩｇＧをプルダウンした場合で、ｐＨ３グリシンバッファーで溶出されるＩｇＧ。レーン６：レーン２の溶出液で処理した後のビーズに結合しているＩｇＧ。レーン７：レーン３の溶出液で処理した後のビーズに結合しているＩｇＧ。レーン８：レーン４の溶出液で処理した後のビーズに結合しているＩｇＧ。レーン９：ＲＮＡをリガンドとして用いたビーズに対して溶出処理をしないで直接ビーズにサンプルバッファーを加えて回収したＩｇＧ。レーン１０：レーン５の溶出液で処理した後のビーズに結合しているＩｇＧ。
図３４は、配列番号１５で表されるＲＮＡを繰り返し抗体精製用分離剤のリガンドとして使用できるかどうか試験したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。一度抗体精製に使ったＲＮＡが結合した分離剤を尿素で洗浄し、再度抗体精製をおこなった。これを２度繰り返した。レーン１：分子量マーカータンパク質。レーン２：一回目の精製で得られるＩｇＧ。レーン３：二回目の精製で得られるＩｇＧ。レーン４：三回目の精製で得られるＩｇＧ。
図３５は、配列番号１６および配列番号１７−２で表されるＲＮＡを抗体精製用分離剤のリガンドとして用いてヒト血清からヒトＩｇＧを精製したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１：分子量マーカータンパク質。レーン２：リガンドとして配列番号１５で表されるＲＮＡを用いた場合にプルダウンされるＩｇＧ。レーン３：リガンドとして配列番号１６で表されるＲＮＡを用いた場合にプルダウンされるＩｇＧ。レーン４：リガンドとして配列番号１７−２で表されるＲＮＡを用いた場合にプルダウンされるＩｇＧ。レーン５：ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａをリガンドとして用いた場合にプルダウンされるＩｇＧ。レーン６：ヒト血清。
図３６は、チオールカップリングにより固定化されたＲＮＡアプタマーを用いて抗体精製をおこなった場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１：分子量マーカータンパク質。レーン２：リガンドに配列番号１５で表されるＲＮＡを用い、５μＬのヒト血清を加えた場合にプルダウンされるＩｇＧ。レーン３：リガンドに配列番号１５で表されるＲＮＡを用い、１０μＬのヒト血清を加えた場合にプルダウンされるＩｇＧ。レーン４：ブランク（リガンドが結合していないビーズに５μＬのヒト血清を加えた場合にプルダウンされる血清タンパク質）。レーン５：ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａビーズを用い、５μＬのヒト血清を加えた場合にプルダウンされるＩｇＧ。レーン６：スタンダードヒトＩｇＧ１。レーン７：ヒト血清。
図３７は、アミノカップリングによりにより固定化されたＲＮＡアプタマーを用いて抗体精製をおこなった場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。回収されたサンプルの半量をアプライした。レーン１：分子量マーカータンパク質。レーン２：リガンドとして配列番号１５で表されるＲＮＡ（固定化量２５μｇ）を用いて、１０μｌのヒト血清から回収したＩｇＧ。レーン３：リガンドとして配列番号１５で表されるＲＮＡ（固定化量７５μｇ）を用いて、１０μｌのヒト血清から回収したＩｇＧ。
図３８は、アミノカップリングにより固定化されたＲＮＡアプタマーを用いて抗体精製をおこなった場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。プルダウンには１０μＬのヒト血清を用いた。レーン１：分子量マーカータンパク質。レーン２：リガンドに配列番号１７−７で表されるＲＮＡを用いた場合。レーン３：リガンドに配列番号１７−８で表されるＲＮＡを用いた場合。レーン４：リガンドに配列番号１７−７−１０７で表されるＲＮＡを用いた場合。レーン５：リガンドに配列番号１５で表されるＲＮＡを用いた場合。レーン６：ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いた場合。レーン７：スタンダードヒトＩｇＧ１（６μｇ）。レーン８：ヒト血清（０．２μＬ）。
図３９は、各種溶出液を用いて溶出した場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１：分子量マーカータンパク質。レーン２：２００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ。レーン３：２００ｍＭ ＫＣｌ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ。レーン４：３００ｍＭ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ。 レーン５：１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
図４０は、加熱再生されたアプタマー樹脂の特性評価のために行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。既に３回使用したアプタマー樹脂１０μＬを２つの方法で加熱処理し、再度１０μＬのヒト血清を用いてプルダウン実験をおこなった。中性溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析。レーン１：配列番号１７−１８で表されるアプタマー樹脂、超純水中で８５℃５分加熱。レーン２：配列番号１７−１７で表されるアプタマー樹脂、６Ｍ尿素中で６５℃１５分加熱。
図４１は、樹脂結合型オリゴにより精製されたＩｇＧについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。配列番号１５で表されるＲＮＡが共有結合した樹脂結合型オリゴ１０μＬに１０μＬのヒト血清を加え、中性溶出液で溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
図４２は、配列番号１７−７で表されるＲＮＡと抗体医薬品であるリツキサンの結合の様子を示す、表面プラズモン共鳴解析で得られたセンサーグラムを示す。３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合でセンサーチップに固定化し、リツキサンをインジェクションしてＲＮＡとの相互作用を観察した。

本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対するアプタマーを提供する。
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害する作用もまた有し得る。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。本発明のアプタマーは、ＩｇＧのＦｃ部分に特異的に結合し得る。
本発明のアプタマーが結合し得るＩｇＧとしては、例えば、ヒトＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ハムスターＩｇＧ、ブタＩｇＧが挙げられる。
本発明のアプタマーは、ＩｇＧのＦｃ部分の任意の部分に結合し得るものであり得る。ＩｇＧのＦｃ部分は、マクロファージや好中球等の免疫担当細胞に発現している受容体タンパク質（ＦｃγＲ）に対して結合することが知られているが、本発明のアプタマーは、ＦｃγＲに対する結合を担うＦｃ部分とは異なるＦｃ部分に結合するものであってもよい。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡがＩｇＧのＦｃ部分に結合することが知られているが、本発明のアプタマーは、ＰｒｏｔｅｉｎＡに対する結合を担うＦｃ部分とは異なるＦｃ部分に結合するものであってもよい。
本発明のアプタマーは、ＩｇＧに対して結合し得るものである限り特に限定されないが、例えば、解離定数（Ｋｄ値）に基づき評価する場合、約１×１０^−６Ｍ以下、好ましくは約１×１０^−７Ｍ以下、より好ましくは約１×１０^−８Ｍ以下のＫｄ値を有するものであり得る。Ｋｄ値は、例えば、表面プラズモン共鳴を利用した方法により算出することができる。
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１６〜約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０ヌクレオチド以下であり、さらにより好ましくは約３０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約２５ヌクレオチド以下であり得る。また、本発明のアプタマーの長さは、例えば約１８ヌクレオチド以上、好ましくは約２０ヌクレオチド以上であってもよい。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。
本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ_２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。
本発明のアプタマーは、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）で表されるヌクレオチド配列を含むものであり得る。ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）としては、例えば、ＧＧＵＧＣＵ、ＧＧＵＧＡＵ、ＧＧＵＧＣＴ、ＧＧＵＧＡＴが挙げられるが、ＲＮＡ分子であるという観点からは、ＧＧＵＧＣＵ、ＧＧＵＧＡＵが好ましい。本発明のアプタマーがＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）を含む場合、核酸に含まれるＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）の数は、１又は複数（例、２又は３個）であり得る。本発明のアプタマーは、１つのＩｇＧに対して２個結合し得る。
本発明のアプタマーは、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵのリボースの２位がフルオロ化されたもの（即ち２’−Ｆ修飾）、又はＩｇＧに対する本発明のアプタマーの結合活性を保持し得るように３番目のＵのリボースの２位がフルオロ化以外の修飾を施されたものであり得る。このような修飾としては、例えば、−Ｏ−Ｍｅ化、アミノ化（ＮＨ_２）が挙げられる。
本発明のアプタマーはまた、化学合成したものであり得、５’末端にモノホスフェート基を有し得る点で、転写（例、ＳＥＬＥＸ法）により合成された、５’末端にトリホスフェート基を有するアプタマーと異なり得る。本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーがＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）で表されるヌクレオチド配列を含む場合、その両端において、ステム構造を有し得る。ステム構造は、バルジ構造の十分な安定化をもたらすものであり得る。例えば、ステム構造として、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）の５’末端のＧ（１番目のヌクレオチド）及び５’側でそれに隣接する１以上のヌクレオチド、３’末端のＵ／Ｔ（６番目のヌクレオチド）及び３’側でそれに隣接する１以上のヌクレオチドがそれぞれ、分子内塩基対合を形成し得る。５’側又は３’側で隣接する１以上のヌクレオチドは、１以上である限り特に限定されるものではないが、例えば２以上、好ましくは３以上であり得る。
本発明のアプタマーはまた、上述したＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）で表されるヌクレオチド配列に加え、ＡＮＣで表されるヌクレオチド配列を含み得る。ＡＮＣにおけるＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれる任意のヌクレオチドであり得るが、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵが好ましく、Ａ及びＧがより好ましく、Ａが最も好ましい。本発明のアプタマーがＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）及びＡＮＣで表されるヌクレオチド配列を含む場合、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）が５’側、ＡＮＣが３’側に存在していてもよく、また、ＡＮＣが５’側、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）が３’側に存在していてもよい。本発明のアプタマーは、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における５’末端のＧがＡＮＣにおけるＣと分子内塩基対合を形成し得る構造、及び／又はＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３’末端のＵ／ＴがＡＮＣにおけるＡと分子内塩基対合を形成し得る構造を有する。本発明のアプタマーがＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）及びＡＮＣの双方を含み得る場合、アプタマーに含まれるＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）及びＡＮＣの数はそれぞれ、１又は複数（例、２又は３個）であり得る。
本発明のアプタマーはまた、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかであり得る：
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）の５’側にＧＧＡを含み、かつＡＮＣの３’側にＵＣＣを含む；
（ｉｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）の５’側にＧＧＮ_Ｘ１Ａを含み、かつＡＮＣの３’側にＵＮ_Ｘ２ＣＣを含む（Ｎ_Ｘ１、Ｎ_Ｘ２はそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドである）；あるいは
（ｉｉｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）の５’側にＧＧＮ_Ｘ３Ｎ_Ｘ４Ａ（例、ＧＧＡＣＡＧ）を含み、かつＡＮＣの３’側にＵＮ_Ｘ５Ｎ_Ｘ６ＣＣを含む（Ｎ_Ｘ３、Ｎ_Ｘ４、Ｎ_Ｘ５、Ｎ_Ｘ６はそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドである）。ＧＧＡ、ＧＧＮ_Ｘ１Ａ又はＧＧＮ_Ｘ３Ｎ_Ｘ４Ａ、及びＵＣＣ、ＵＮ_Ｘ２ＣＣ又はＵＮ_Ｘ５Ｎ_Ｘ６ＣＣにおける全てのヌクレオチドは、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドであり得るが、結合活性の観点より、２’位において、ヒドロキシル基が水素原子で置換されているヌクレオチドであることもまた、好ましい。
本発明のアプタマーはまた、ＡＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）Ｃで表されるヌクレオチド配列、及び／又はＧＡＮＣＵ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドである）で表されるヌクレオチド配列を含み得る。ＡＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）Ｃにおける４番目のＵは、２’位において、ヒドロキシル基がフッ素原子で置換されているヌクレオチドであるか、又はＩｇＧに対する本発明のアプタマーの結合活性を保持し得るように４番目のＵのリボースの２’位がフルオロ化以外の修飾を施されたヌクレオチドであり得る。上記Ｕ以外のヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドであり得る。
詳細には、本発明のアプタマーは、バルジ構造、及び当該バルジ構造の両端に存在する２つのステム構造（Ｓ１、Ｓ２）及びループ構造を含む、潜在的二次構造を有する。本明細書中で用いられる場合、「潜在的二次構造」とは、生理条件下で安定に存在し得る二次構造をいい、例えば、潜在的二次構造を有するか否かは、実施例記載の構造予測プログラムによって決定できる。ループ構造における全てのヌクレオチドは、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得るが、結合活性の観点より、リボースの２’位において、ヒドロキシル基が水素原子で置換されているヌクレオチドであることもまた、好ましい。
より詳細には、本発明のアプタマーは、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５はそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドであり、かつＮ^２及びＮ^３は互いに相補的なヌクレオチドであり、Ｎ^４及びＮ^５は互いに相補的なヌクレオチドである〕のいずれかで表される潜在的二次構造を有し得る。上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、実線（太線）は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドが任意の長さで連結していることを示し、実線（細線）は、相補的な結合（塩基対合）能を潜在的に有することを示す。Ｓ１、Ｓ２はそれぞれ、ステム構造を示す。Ｓ１、Ｓ２におけるステム構造において塩基対合し得るヌクレオチド数はそれぞれ１以上であり得るが、２以上、３以上又は４以上であってもよい。曲線部は、ループ構造を示す。ループ構造は、好ましくは３以上のヌクレオチドから構成され得るが４個のヌクレオチドから構成されるものが好ましい。好ましくは、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される構造は、上記（Ｉ’）〜（ＩＩＩ’）、下記（Ｉ’’）〜（ＩＩＩ’’）又は（Ｉ’’’）〜（ＩＩＩ’’’）で表される構造であり得る。
また、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵが、リボースの２’位において、フッ素原子で置換されているヌクレオチドであり得、本発明のアプタマーに含まれる他のヌクレオチド（上記Ｕを除く）がそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基（例、水素原子、フッ素原子、又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーはまた、以下の（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）：
〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５、Ｎ^６、Ｎ^７はそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドであり、かつＮ^２及びＮ^３は互いに相補的なヌクレオチドであり、Ｎ^４及びＮ^５は互いに相補的なヌクレオチドであり、Ｎ^６及びＮ^７は互いに相補的なヌクレオチドである〕のいずれかで表される潜在的二次構造を有し得る。上記（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）中、実線（太線）は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドが任意の長さで連結していることを示し、実線（細線）は、相補的な結合（塩基対合）能を潜在的に有することを示す。Ｓ１、Ｓ２はそれぞれ、ステム構造を示す。Ｓ１、Ｓ２におけるステム構造において塩基対合し得るヌクレオチド数はそれぞれ１以上であり得るが、２以上、３以上又は４以上であってもよい。曲線部は、ループ構造を示す。ループ構造は、好ましくは３以上のヌクレオチドから構成され得るが、４個のヌクレオチドから構成されるものが好ましい。好ましくは、上記（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）で表される構造は、上記（Ｉａ’）〜（ＩＩＩａ’）、下記（Ｉａ’’）〜（ＩＩＩａ’’）又は上記（Ｉａ’’’）〜（ＩＩＩａ’’’）で表される構造であり得る。
また、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵが、リボースの２’位において、フッ素原子で置換されているヌクレオチドであり得、本発明のアプタマーに含まれる他のヌクレオチド（上記Ｕを除く）がそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基（例、水素原子、フッ素原子、又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。結合活性の観点からは、Ｎ^４、Ｎ^６が、それぞれ、リボースの２’位においてヒドロキシル基が水素原子に置換されているヌクレオチドであり、Ｎ^５、Ｎ^７が、それぞれ、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであることもまた、好ましい。
本発明のアプタマーはまた、（ａ）配列番号１〜２３のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）からなるアプタマー、（ｂ）配列番号１〜２３のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）で表されるヌクレオチド配列において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列からなるアプタマー、（ｃ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ａ）及び（ｂ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物であり得る。上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、数個である限り特に限定されないが、例えば約１０個以下、好ましくは約８個以下、より好ましくは約６個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。上記（ｃ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ_２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ_３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２〜４個であり得る。上記（ａ）〜（ｃ）における各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーはまた、加熱処理による再生、滅菌が可能であり得る。このような加熱処理としては、例えば、６５〜８５℃での数分間（例、５〜１５分間）の処理が挙げられる。
本発明のアプタマーは、ＩｇＧに対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ_２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，５１３８−５１４５参照）。
本発明のアプタマーはまた、ＩｇＧに対する結合性等を高めるため、プリン、ピリミジンが改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ_２（ホルムアセタール）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲまたはＲ’は独立して、Ｈであるか、または置換されているか、または置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。連結基は、−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−連結を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。改変はまたキャッピングのような３’および５’の改変を含んでもよい。改変はさらに、ポリエチレングリコールやその他の脂質を末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における技術常識により化学合成することができる。本発明のアプタマーとしてはまた、例えば、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）で表されるヌクレオチド配列（及び必要に応じてＡＮＣで表されるヌクレオチド配列）を含むアプタマーが挙げられるが、このようなアプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで高度に設計可能である。例えば、下記：
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いることにより、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）で表されるヌクレオチド配列を含む本発明のアプタマーが高度に設計可能である。本発明はまた、このような高度な設計を可能とするアプタマー製造方法を提供する。
本発明のアプタマーは、例えば、抗体精製用分離剤としてのリガンド、抗体と標識物質を結合するリンカー、抗体の固定化剤、抗体と修飾物質を結合するリンカーとして有用であり得る。抗体精製用分離剤のリガンドとしての具体的な利用法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた抗体精製方法とほぼ同様であるが、抗体を中性溶液で溶出できることから、抗体を酸性溶液で溶出することを要するＰｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた方法よりも、抗体の変性を防止することができるという利点を有する。本発明のアプタマーを抗体と標識物質を結合するリンカーとして用いる場合は、本発明のアプタマーが抗体から解離しない程度に高い結合活性が必要である。一方、抗体精製用分離剤として用いる場合は、一度吸着した抗体を溶出しなければならないので、必ずしも結合活性が高ければよいというわけではない。本発明では異なる配列および異なる長さ及び異なる修飾方法を用いることでＩｇＧに対して異なる結合力や安定性を有し、安価である等の利点を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーはまた、後述する種々の有用性を有する。
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物、毒素、薬物送達媒体が挙げられる。
親和性物質としては、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジンが挙げられる。
標識用物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、放射性同位体が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＰＲＯ Ｔａｎｇｅｒｉｎｅ、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、ＡｔｔｏＰｈｏｓ、ＳＹＰＲＯ Ｒｅｄ、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ｄｅｅｐ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｐｒｏ−Ｑ Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＮＥＤ、Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、ＲＦＰ、ＨＮＰＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７、Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＤｉＤ、ＴＯＴＯ−３、ＤＤＡＯ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ、ＳＹＰＲＯ Ｒｏｓｅ、Ｃｙ７、フルオレセインが挙げられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニンが挙げられる。放射性同位体としては、例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉが挙げられる。
酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼが挙げられる。
薬物としては、例えば、抗癌剤が挙げられる。抗癌剤としては、例えば、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジンなどのリースト剤、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミドなどの他の抗腫瘍剤が挙げられる。
毒素としては、例えば、リシン毒素、リア毒素が挙げられる。
薬物送達媒体としては、例えば、リポソーム、ミクロスフェア、ポリエチレングリコール、コレステロール、ペプチドが挙げられる。
本発明のアプタマー及び／又は本発明の複合体は、例えば、医薬又は試薬（例、診断薬、検査薬（実験用試薬を含む））として使用され得る。例えば、本発明の医薬又は診断薬は、例えば、異常ＩｇＧ及び／又はＩｇＧの過剰発現が原因の疾患（例、リウマチ、腎炎、キャッスルマン病、ヴェーゲナー肉芽腫症、糸球体硬化症、糸球体疾患、多発性動脈炎、紫斑病、エリテマトーデス、臓器移植における拒絶反応）、ＩｇＧ産生に関連した疾患（例、Ｂ細胞リンパ腫）等の、自己免疫疾患を含むＩｇＧ関連疾患、あるいは癌の治療又は診断（例、病態把握、治療効果のモニタリング）に有用である。また、癌の治療では、本発明の複合体（例、抗癌剤や毒素に結合した本発明のアプタマーを抗体医薬に結合させたもの）を用いることで、癌細胞を死滅させることが可能である。
本発明の試薬は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により使用され得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法（例、ウエスタンブロット法における二次抗体の代わりとしての使用）、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、上述した疾患の診断や後述するＩｇＧの検出・定量を行い得る。本発明の診断用試薬を使用する方法もまた本発明により提供されるが、この場合、本発明の固相担体を用いることもできる。
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約２．０ｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約０．１ｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約０．０５ｇ／ｋｇであり得る。
本発明はまた、本発明のアプタマー及び／又は本発明の複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、抗体精製クロマトグラフィーや抗体をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーなどで使われるカラムに充填する樹脂、および、バッチ法で抗体を精製もしくは固定化するための樹脂が挙げられ、また、種々の濃度のアガロース粒子や高度架橋されたアガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどを含み、更にこれらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂を含む。
本発明のアプタマー及び／又は本発明の複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー及び／又は本発明の複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
本発明の固相担体は、例えば、ＩｇＧの精製、及びＩｇＧの検出、定量に有用であり得る。本発明の固相担体はまた、上述した異常ＩｇＧ又はＩｇＧの過剰発現が原因の疾患の治療に利用することができる。送液ポンプを用いて患者の血管から血液を本発明の固相担体（例、カートリッジ）に流し込み、所定の量のＩｇＧを吸着除去した後、浄化された血液を患者に戻す。この場合、抗血液凝固剤を添加して血液が固まらないようにすることも有益である。ＩｇＧの除去量は透過血液量及び本発明の固相担体の吸着容量によって調節することができる。本発明の固相担体は中性溶出液を用いて洗浄し、加熱または紫外線照射などにより滅菌することで、再生することができる。本発明の固相担体を血液の浄化に利用する場合、使用方法の詳細や治療効果に関しては、透析療法やＰｒｏｔｅｉｎ Ａを用いたＩｇＧ除去剤であるＰｒｏｓｏｒｂａ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社製）及びＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂａ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社製）を用いた血液浄化法を参考に行うことができる。従って、本発明はまた、このような血液の浄化を可能とする、本発明の固相担体を含む医療用機器を提供する。
本発明は、抗体の精製及び／又は濃縮方法を提供する。本発明の精製及び／又は濃縮方法は、本発明の固相担体にＩｇＧ抗体を吸着させ、吸着したＩｇＧ抗体を溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の精製及び／又は濃縮方法はまた、容器（例、フラスコ、試験管、チューブ）に本発明の固相担体を充填して精製又は濃縮を行う静的法、及び本発明の固相担体（例、カラム）にＩｇＧを含む溶液を送液して精製又は濃縮を行う動的法であり得る。
本発明の固相担体へのＩｇＧ抗体の吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＩｇＧを含有する試料（例、血液、血漿、血清、腹水、細胞培養上清、組織抽出液）を、本発明の固相担体又はそれを充填した容器又は支持体に導入する。静的法の場合は攪拌しながら１〜６０分程度室温放置することでＩｇＧは本発明の固相担体に結合する。動的法の場合は流速０．１〜２０ｍＬ／分程度で試料を導入することでＩｇＧは本発明の固相担体に結合する。ＩｇＧを含有する試料は本発明の固相担体に導入される前に希釈してもよい。希釈はＮａＣｌおよびＭｇＣｌ_２を含む溶液を用いることが好ましい。ＩｇＧが本発明の固相担体に結合した後、不純物を取除くために洗浄液で本発明の固相担体を洗浄する。洗浄液は、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ_２を含有する溶液であることが好ましい。
ＩｇＧ抗体の溶出は、中性溶液を用いて行うことができる。ＩｇＧ抗体の精製においてＰｒｏｔｅｉｎ Ａを用いる従来の方法では、溶出を酸性溶液で行う必要があり、従って、抗体が変性し易いという不利益があった。一方、本発明のアプタマーは、溶出を中性溶液で行うことが可能であり、従って、従来法とは異なり、抗体の変性を防止することができるという利点を有する。
中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。また、中性溶液は、カリウム塩（例、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、蟻酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、過塩素酸カリウム、クエン酸カリウム、リンゴ酸カリウム、シュウ酸カリウム、シアン化カリウム）、マグネシウム塩（例、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、蟻酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム）、カルシウム塩（例、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、蟻酸カルシウム、硫酸カルシウム、シュウ酸カルシウム）、アンモニウム塩（例、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、蟻酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、亜硫酸アンモニウム、過塩素酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、シアン化アンモニウム、シュウ酸アンモニウム）、キレート剤（例、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸ナトリウム等のクエン酸塩、リンゴ酸ナトリウム等のリンゴ酸塩、シュウ酸ナトリウム等のシュウ酸塩、エチレンジアミン、アセチルアセトナトリウム、ＥＧＴＡ）、変性剤又は表面活性剤（グアニジン、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を含み得るが、コストの面からはＫＣｌを含むものが好ましい。ＫＣｌ溶液の濃度は１００〜１０００ｍＭ、好ましくは２００〜８００ｍＭ、更に好ましくは３００〜６００ｍＭである。ＥＤＴＡ溶液の濃度は１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭ、更に好ましくは１０〜２０ｍＭである。
本発明の精製方法はさらに、ＩｇＧ抗体の吸着後、固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、強塩基（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、弱塩基（例、アンモニア）、強酸（例、塩酸、硝酸、硫酸、トリフルオロ酢酸）、弱酸（例、酢酸、蟻酸）を含む溶液が挙げられる。尿素は、例えば、１〜１０Ｍであり得る。強塩基及び弱塩基は０．０１〜１０Ｎが好ましいが、０．０１〜１Ｎがより好ましく、０．０１〜０．１Ｎがさらに好ましい。強酸及び弱塩基は０．０１〜１０Ｎが好ましいが、０．０１〜１Ｎがより好ましく、０．０１〜０．１Ｎがさらに好ましい。
本発明の精製方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。このような加熱処理としては、例えば約５０〜約１００℃、好ましくは約６０〜約９０℃、より好ましくは約６５〜約８５℃での、数分間、例えば１〜３０分間、好ましくは１〜２０分間、より好ましくは５〜１５分間の処理が挙げられる。加熱処理は尿素（例、１〜１０Ｍ）中で行うことが可能である。
本発明はまた、精製抗体の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、ＩｇＧ抗体を作製し、作製されたＩｇＧ抗体を本発明のアプタマー及び複合体を利用して（例、本発明の固相担体の使用により）精製することを含み得る。
本発明の製造方法において作製される抗体は、ＩｇＧであり得る。抗体はまた、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、自体公知の方法により作製できる。抗体はさらに、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得るが、ヒト化抗体又はヒト抗体が好ましい。ヒト化抗体は、例えば特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．ｌ５，ｐ．１４６−１５６，１９９７」、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３−２１，１９９４」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ ９４／２５５８５号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
次いで、作製された抗体は、アプタマーを用いて精製され得る。精製の詳細は、本発明の精製方法と同様であり得る。
本発明はまた、ＩｇＧの検出及び／又は定量方法を提供する。本発明の検出及び／又は定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び／又は固相担体の使用により）ＩｇＧを測定することを含み得る。この方法では、本発明の診断用試薬において上述したように、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により、検出及び／又は定量を行うことができる。
本発明はまた、抗体の修飾方法を提供する。本発明の修飾方法は、本発明のアプタマーを介して、機能性物質を抗体に結合させることを含み得る。本発明は、このような修飾方法により作製された修飾抗体もまた提供する。
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。

［実施例１］ ＩｇＧに特異的に結合する核酸の作製
ＩｇＧに特異的に結合する核酸はＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８１８−８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，５０５−５１０，１９９０）を改良しておこなった。標的物質としてヒスチジンタグが付いたヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｐｒｏ１００〜Ｌｙｓ３３０）とＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ）のキメラ体（ＩｇＧ１−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。このキメラ体はマウスミエローマ細胞を用いて発現させたものである。最初のラウンドで用いたＲＮＡは、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られるＲＮＡはピリミジン塩基含有ヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型として４０残基のランダム配列の両側にプライマー配列を持った長さ９０残基のＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作成した（Ｏｐｅｒｏｎ社製）。ＤＮＡ鋳型の配列とプライマー配列を以下に示す。
ＤＮＡ鋳型：５’−ｃｔｃｔｃａｔｇｔｃｇｇｃｃｇｔｔａ−４０Ｎ−ｃｇｔｃｃａｔｔｇｔｇｔｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａ−３’（配列番号２４）
プライマーＡ：５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｃａｃａａｔｇｇａｃｇ−３’（配列番号２５）
プライマーＢ：５’−ｃｔｃｔｃａｔｇｔｃｇｇｃｃｇｔｔａ−３’（配列番号２６）
プライマーＡはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０^１４であった。
標的物質であるＩｇＧ１−ＦｃはＮｉ−ＮＴＡアフィニティー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社製）またはＢＤＴａｌｏｎ^ＴＭアフィニティー樹脂（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させて固定した。これにＲＮＡプールを加え、３０分間室温で保持した後、ＩｇＧ１−Ｆｃに結合しなかったＲＮＡを溶液Ａで洗い流した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、０．８ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ｐＨ７．６トリスの混合溶液である。ＩｇＧ１−Ｆｃに結合したＲＮＡは、溶出液を加えて回収し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した後、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔで転写して次のラウンドに用いた。溶出液として溶液Ａに２５０ｍＭのイミダゾールを加えたものを用いた。７ラウンドおよび１０ラウンド終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）にトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１００、ＡＢＩ社製）でヌクレオチド配列を決定した。配列番号１で表される配列を持つクローンは４８クローン中１０クローンあった。また、配列番号２、３、４、５、６、７、８で表される配列を持つクローンは、４８クローン中それぞれ２、７、１４、２、５、４、４クローン存在した。
配列番号１〜８で表されるＲＮＡの二次構造をＭＦＯＬＤプログラムを使って予測した（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−１５，（２００３））。その構造を図１〜８に示す。図に示すように、これらのＲＮＡはＧＧＵＧＣＵという共通配列を含み、この共通配列がバルジを形成していた。
プライマーセットを変えて、上記と同様の方法で再度ＳＥＬＥＸをおこなった。プライマー配列を下記に記す。
プライマーＣ：５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｃａｃａｇｃｇａｇ−３’（配列番号２７）
プライマーＤ：５’−ｃｃｇａｃｃａｃａｃｇｃｇ−３’（配列番号２８）
８ラウンド終了後、配列番号９で表されるＲＮＡが配列を調べた４８クローン中１クローン存在していた。このＲＮＡは、ヒトＩｇＧ１に特異的に結合し、ＧＧＵＧＣＵの配列が存在した。しかし、このＲＮＡの二次構造をＭＦＯＬＤプログラムを使って予測したところ、ＧＧＵＧＣＵのバルジ構造が存在していなかった。そこで、配列番号９で表されるＲＮＡの二次構造をｖｓｆｏｌｄ４プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎａ．ｉｔ−ｃｈｉｂａ．ａｃ．ｊｐ／ｖｓｆｏｌｄ４／）を用いて予測したところ、ＧＧＵＧＣＵのバルジ構造が現れた（図９）。一方、他の４７クローンは、ＩｇＧ１とは、結合しなかった。
次に、アミノカップリングによりＩｇＧのＦｃフラグメント（ＩｇＧ−Ｆｃ）を固定化したＳＥＬＥＸをおこなった。１００μｇのヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を３０μＬのＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に固定化した。購入したＩｇＧ−Ｆｃ溶液にはＴｒｉｓ緩衝液が含まれていたので、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ社製）に置換してからカップリングをおこなった。カップリングは仕様書にそっておこなった。固定化量は、固定化前のＩｇＧ−Ｆｃ溶液と固定化直後の上清液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べることで確認した。上清液からはＩｇＧ−Ｆｃのバンドは検出されず、使用したＩｇＧ−Ｆｃのほとんど全てがカップリングされたと考えられる。ＲＮＡは上記同様ピリミジン塩基含有ヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものを用いた。ＲＮＡの初期プールを作成するためのＤＮＡ鋳型として、４０残基のランダム配列を以下のプライマー配列で挟み込んだものを用いた。
プライマーＥ：５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｔａｃｇａｇｔｃｔｇｇａｃｔｔｇｃａａ−３’（配列番号２９）
プライマーＦ：５’−ｇｃｃｔｇｔｔｇｔｇａｇｃｃｔｃａ−３’（配列番号３０）
７ラウンド終了後、配列番号１９、２０、２１で表されるＲＮＡが、配列を調べた４８クローン中それぞれ１３、９、６クローン存在していた。これらのＲＮＡはＧＧＵＧＣＵの共通配列を含んでいた。ＭＦＯＬＤプログラムを使って二次構造を予測したところ、配列番号２０と２１のＲＮＡは配列番号１のＲＮＡと同様なバルジ構造を含んでいたが、配列番号１９のＲＮＡは含んでいなかった（図１９〜２１）。次に、４８クローン中１クローンのみ存在したＲＮＡの配列を詳しく調べたところ、配列番号２２と２３で表されるＲＮＡがＧＧＵＧＣＵの共通配列を含んでいた。ＭＦＯＬＤプログラムを使って二次構造を予測したところ、配列番号２２のＲＮＡは共通のバルジ構造を含んでいたが、配列番号２３のＲＮＡは含んでいなかった。この他１クローンのものが１５配列あった。これらは全てＧＧＵＧＣＵは含んでいなかった。これらの配列のうち８配列の結合活性を調べたが、いずれも結合活性がなかった。
リボースの２’位がフルオロ化されたピリミジン塩基含有ヌクレオチドと天然型のプリン塩基含有ヌクレオチドでできたＲＮＡを用いて３回の異なるＳＥＬＥＸをおこなったが、そのいずれからもＧＧＵＧＣＵの共通配列を含むＲＮＡが選択された。この共通配列の両側の配列に特別な特徴はなく、ＩｇＧとの結合にＧＧＵＧＣＵが重要であることが予想された。ＭＦＯＬＤプログラムを使って二次構造を予測したところ、選択されたＲＮＡのほとんどがＧＧＵＧＣＵのバルジ構造を含んでおり、共通配列をもつすべてのＲＮＡでＧＧＵＧＣＵのバルジ構造をとっていると予測される。
［実施例２］ 結合活性の評価
配列番号１〜９で表されるＲＮＡのヒトＩｇＧ−Ｆｃに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により調べた。測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているＳＡチップを用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６残基のＰｏｌｙ ｄＴを１０００ ＲＵ程度結合させた。リガンドとなるＲＮＡは、３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加し、ｄＴとＡの結合によりＳＡチップに固定した。その固定化量は、０．０１μｇ／μＬの濃度のものを６０μＬインジェクションすることで１０００ ＲＵ程度とした。アナライト用のＩｇＧ−Ｆｃ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）は０．６μＭに調整したものを７０μＬインジェクションした。ランニングバッファーはＳＥＬＥＸで用いた溶液Ａと同じ成分のものを用いた。
配列番号１または３で表されるＲＮＡを固定してＩｇＧ−Ｆｃをインジェクションした場合のセンサーグラムをそれぞれ図２４または２５に示す。ＲＮＡとＩｇＧ−Ｆｃが結合している様子が示されている。コントロールとしてランダム配列を含むＲＮＡプールを固定化した測定をおこなったが、ＩｇＧ−Ｆｃは結合しなかった（図２６）。配列番号２〜９で表されるＲＮＡに対して同様の測定をおこなったが、その全てがＩｇＧ−Ｆｃと結合した。
次に、全長のヒトＩｇＧ１との結合活性を同様の方法で調べた。配列番号１〜９で表されるＲＮＡは全てＩｇＧ１と結合した。また、ランダム配列を含むＲＮＡプールは結合活性を示さなかった。
次に、濃度の異なるＩｇＧ（０．６μＭ〜０．０５μＭ）を用いて速度論的解析を行い、各ＲＮＡアプタマーの解離定数（Ｋｄ）を求めた。解離定数は、３’末端に１６残基のＰｏｌｙＡを付加したＲＮＡをＡ−ｄＴ結合を利用してセンサーチップに固相化し、濃度の異なるＩｇＧ（０．６μＭ〜０．０５μＭ）をインジェクトし、表面プラズモン共鳴によって求めた。結果を表１に示す。
配列番号１９〜２３で表されるＲＮＡとヒトＩｇＧ１の結合活性を表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。その結果、その全てのＲＮＡがＩｇＧ１に対して結合活性を有していることがわかった。ＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測される、配列番号１９と２３で表されるＲＮＡの二次構造は共通のバルジ構造を含んでいなかったが、どちらもヒトＩｇＧ１に対して結合活性を有していた。
アプタマーの結合活性はＢｉａｃｏｒｅ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて測定された。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００には速度論的解析ソフトが組み込まれており、得られたセンサーグラムの形状に理論式をフィッティングさせることで解離定数を求めることができる。配列番号１〜９および１９〜２３で表される長いアプタマーは１：１結合モデルの理論式がうまくフィッティングしたが、配列番号１７など短いアプタマーに対しては１：２結合モデルであるＢｉｖａｌｅｎｔモデルの理論式がよりフィットした。抗体は対称的な構造をしているので、一つの抗体に対して二つのアプタマーが結合していることは極普通に受け入れられる考え方である。
以上より、ＳＥＬＥＸ法により作製された配列番号１〜９および１９〜２３で表されるＲＮＡはヒトＩｇＧに対して結合活性を有していることが確認された。これは共通配列であるＧＧＵＧＣＵがＩｇＧとの結合に重要であることを示している。
［実施例３］ ＲＮＡアプタマーの小型化
配列番号１〜９および１９〜２３で表されるＲＮＡの長さは７０残基程度であるが、４０残基程度以下の長さまで短くすることができると、ＲＮＡアプタマーを化学合成により作製することができるようになる。そこで、配列番号１〜９および１９〜２３で表されるＲＮＡの小型化を試みた。ここで、配列番号１〜９および１９〜２３で表されるＲＮＡはピリミジン塩基含有ヌクレオチド（Ｕ、Ｃ）のリボースの２’位がフルオロ化されており、プリン塩基含有ヌクレオチド（Ａ、Ｇ）は天然のＲＮＡタイプのものである。また、本実施例で新たに作製する短いＲＮＡは全てピリミジン塩基のリボースの２’位がフルオロ化されている。
初めに配列番号１で表されるＲＮＡを基本として小型化を試みた。配列番号１０で表されるＲＮＡは配列番号１で表されるＲＮＡの５’末端のＧＧＧＡＣＡＣを、また、３’末端のＧＡＧＡＧを切断したもので、転写用に５’末端にＧＧを付加したものである。配列番号１１で表されるＲＮＡは配列番号１０で表されるＲＮＡの５’末端のＧＧＡＡＵを、また、３’末端のＡＣＡＵを切断したものである。配列番号１２で表されるＲＮＡは配列番号１１で表されるＲＮＡの５’末端のＧＧＡＣＧＡＧＵＵを、また、３’末端のＡＡＣＧＧＣＣＧを切断したもので、５’末端にＧＧを、また、３’末端にＣＣを付加したものである。配列番号１３で表されるＲＮＡは、配列番号１２で表されるＲＮＡのＧＧＵＧＣＵのバルジの後にあるステムループ構造を配列番号２で表されるＲＮＡのステムループ構造に置き換えたものである。配列番号１４で表されるＲＮＡは配列番号１３で表されるＲＮＡのループ部分をＧＡＡＡテトラループに置き換えたものである。配列番号１５で表されるＲＮＡは配列番号１３で表されるＲＮＡの最初のステムから二つの塩基対を取り除いてステムを短くしたものである。配列番号１６で表されるＲＮＡは配列番号１３で表されるＲＮＡの二番目のステムから三つの塩基対を取り除いてステムを短くしたものである。配列番号１７で表されるＲＮＡは配列番号１６で表されるＲＮＡの最初のステムから二つの塩基対を取り除いてステムを短くしたものである。配列番号１８で表されるＲＮＡは配列番号１７で表されるＲＮＡの二番目のステムから一塩基対を取り除いてステムを短くしたものである。
小型化されたＲＮＡの結合活性は表面プラズモン共鳴法を用いて確認した。測定は実施例１と同様に、１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡをＡ−ｐＴ結合を利用して固定化し、そこにＩｇＧをインジェクションすることでおこなわれた。その結果、ＧＧＵＧＣＵのコンセンサス配列を含む配列番号１０〜１８で表されるＲＮＡがヒトＩｇＧ１に対して結合活性を有していることがわかった。この内、配列番号１８で表されるＲＮＡは２１残基からなるものであった。それぞれの解離定数を表１に示す。
配列番号１７で表されるＲＮＡの８番目のヌクレオチドのＣをＵに置換した変異体を作製した。このＣは共通配列ＧＧＵＧＣＵのＣである。表面プラズモン共鳴解析の結果、この変異体はヒトＩｇＧ１に対して結合活性を有していないことがわかった。この事実は、共通配列であるＧＧＵＧＣＵがＩｇＧとの結合に重要であることを示している。
以上より、配列番号１で表されるＲＮＡを小型化することで、化学合成できる長さのＲＮＡアプタマーを作製することができた。また、共通配列であるＧＧＵＧＣＵのバルジ構造が存在すればＩｇＧとの結合活性が保持されることが示された。
［実施例４］ 種特異性の評価
作製されたＲＮＡアプタマーがヒトＩｇＧ１以外のサブクラスのＩｇＧまたはヒト以外の動物種のＩｇＧに対しても結合活性を有しているかどうか表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。測定は実施例１と同様に、１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加した核酸をＡ−ｐＴ結合を利用して固定化し、そこにＩｇＧをインジェクションすることでおこなわれた。ＲＮＡアプタマーには配列番号１と１７で表される核酸を用いた。抗体にはヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、ヒトＩｇＧ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、ヒトＩｇＧ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、ヒトＩｇＧ４（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、マウスＩｇＧ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、マウスＩｇＧ２ａ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、マウスＩｇＧ２ｂ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、マウスＩｇＧ３（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ラットＩｇＧ１（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ラットＩｇＧ２ａ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ラットＩｇＧ２ｂ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ラットＩｇＧ２ｃ（ＵＫ−Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）、ウサギＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ウシＩｇＧ１（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ウシＩｇＧ２（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ニワトリＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）、イヌＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）、ネコＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、モルモットＩｇＧ（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）、ハムスターＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）、ブタＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を用いた。結果を表２に示す。
^＊Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのデータはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のカタログより引用した。＋は結合の強さを表し、＋が多い方が結合が強い。−は結合しないことを意味する。ｎｄは測定していないことを意味する。
表２に示すように、配列番号１と１７で表されるＲＮＡはヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ハムスターＩｇＧ、ブタＩｇＧには対しては結合活性を有しているが、他の動物種のＩｇＧに対しては結合活性を有していないことがわかった。また、配列番号１と１７で表される核酸はヒトＩｇＤ（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）およびヒトＩｇＥ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）に対しても結合活性を有していなかった。更に、配列番号１７で表される核酸はヒトＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に対して結合活性を有していなかったが、ヒトＩｇＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）に対しては非常に弱いが結合活性を示した。
以上より、本発明で提供されるＲＮＡアプタマーはヒト、ハムスター、ブタのＩｇＧに特異的に結合するＲＮＡであることがわかった。また、ヒトＩｇＧに関してはサブクラスに関係なく、ＩｇＧ１〜４の全てに結合することがわかった。これは現在抗体精製用樹脂のリガンドとして使われているＰｒｏｔｅｉｎ Ａと異なる特性である。
［実施例５］ ＲＮＡアプタマーの結合部位の検討１（ＦｃγＲ）
ＩｇＧのＦｃ部分はマクロファージや好中球などの免疫担当細胞に発現している受容体タンパク質（ＦｃγＲ）に結合し、細胞の活性化あるいは抑制を促す。そこで、本発明で提供されるＲＮＡがＩｇＧのＦｃγＲ結合部位に結合しているかどうか表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。まず、１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加したＲＮＡアプタマーを実施例１と同様な方法で固定化し、そこにヒトＩｇＧ１をインジェクションしてＲＮＡアプタマーに結合させた後、ＦｃγＲをインジェクションした。もしＩｇＧのＲＮＡアプタマー結合部位がＦｃγＲの結合部位と全体的にあるいは主要な一部分が重複していたら、ＦｃγＲはＲＮＡアプタマーに結合しているＩｇＧには結合することができないと考えられる。また、ＩｇＧとＦｃγＲの結合力がＩｇＧとＲＮＡアプタマーの結合力より強く、ＲＮＡアプタマーとＦｃγＲの置換反応が起こった場合は、ＩｇＧは固定されているＲＮＡアプタマーから解離し、ＦｃγＲと複合体を形成して流し出されるものと予想される。
ＲＮＡアプタマーとして配列番号１で表されるＲＮＡを、ＩｇＧとしてヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、ＦｃγＲとしてヒトＦｃγＲＩ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定をおこなった。その結果、ＩｇＧ−Ｆｃ結合後にＦｃγＲＩの結合によるシグナルの上昇が観察されたので（図２７）、ＲＮＡアプタマー、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＦｃγＲＩの三者複合体が形成されることがわかった。また、コントロールとしてランダム配列を含むＲＮＡプールを用いた場合、ＩｇＧ−ＦｃとＦｃγＲＩはともに結合しなかった（図２８）。
以上より、ＲＮＡアプタマーはＩｇＧのＦｃγＲＩ結合部位とは異なる部分に結合していることがわかった。
［実施例６］ ＲＮＡアプタマーの結合部位の検討２（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）
ＩｇＧ−Ｆｃに結合する他の物質としてはＰｒｏｔｅｉｎ Ａがよく知られている。Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡはＩｇＧのＦｃ部分に特異的に結合することから、抗体精製用分離剤のリガンドとして使われている。そこで、実施例５と同様の方法で、本発明で提供されるＲＮＡがＩｇＧのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ結合部位に結合しているかどうか調べた。まず、３’末端に１６残基のＰｏｌｙ Ａを付加した配列番号１で表されるＲＮＡアプタマーを実施例１と同様の方法で固定し、そこにヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を流してＲＮＡアプタマーに結合させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）をインジェクションした。その結果、ＩｇＧ１結合後にＰｒｏｔｅｉｎ Ａの結合によるシグナルの上昇が観察されたので（図２９）、ＲＮＡアプタマー、ＩｇＧ１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの三者複合体が形成されることがわかった。また、コントロールとして配列番号１で表されるＲＮＡアプタマーを固定したあとＰｒｏｔａｉｎ Ａをインジェクションするという測定をおこなったが、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの結合は見られなかった（図３０）。
以上より、ＲＮＡアプタマーはＩｇＧ−ＦｃのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ結合部位とは異なる部分に結合していることがわかった。
［実施例７］ ＲＮＡアプタマーの２’修飾方法とＩｇＧに対する結合活性
実施例１で作製されたＲＮＡアプタマーはピリミジン塩基含有ヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものであった。本実施例では、リボースの２’位の修飾方法が異なるＲＮＡを作製し、ＩｇＧに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。
はじめに、配列番号１１と１３で表される天然型のＲＮＡを作製し、ＩｇＧに対する結合活性を調べた。天然型ＲＮＡはテンプレートＤＮＡを化学合成（オペロン社製）し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて転写することで作製した。結合活性は実施例１と同様に、表面プラズモン共鳴法により測定された。ＩｇＧとしてヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いた。その結果、ＩｇＧ１の結合量は低下したが、配列番号１１と１３で表される天然型のＲＮＡはＩｇＧに対して結合活性を有していることがわかった。
次に、配列番号１７をもとにして以下に記すような修飾の異なる配列番号１７−１〜１７−１４で表されるＲＮＡを作製した。
配列番号１７
Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−１（２３Ｆ１）
Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｔ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−２（２３Ｆ２）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−３（２３Ｆ３）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｔ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−４（２３Ｆ１０）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−５（２３Ｆ１１）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−６（２３Ｆ１２）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｈ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−７（２３Ｆ２３）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−８（２３Ｆ２５）
Ｇ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（ＯＭｅ）Ｃ（ＯＭｅ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−９（２３Ｆ３２）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−１０（２３Ｆ３３）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−１１（２３Ｆ４１）
Ｇ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（ＯＭｅ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（ＯＭｅ）Ｃ（ＯＭｅ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−１２（２３Ｆ４２）
Ｇ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（ＯＭｅ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（ＯＭｅ）Ｃ（ＯＭｅ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−１３（２３Ｆ４３）
Ｇ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ａ（ＯＭｅ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（ＯＭｅ）Ｃ（ＯＭｅ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
配列番号１７−１４（２３Ｆ３１）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＭｅ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）
ＲＮＡは化学合成によって作製した（ジーンデザイン社製）。結合活性は実施例１と同様に、表面プラズモン共鳴法により測定された。ＩｇＧとしてヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いた。測定の結果、配列番号１７−１で表されるＲＮＡは配列番号１７で表されるＲＮＡと同程度の結合活性を示した。また、配列番号１７−２、１７−４〜１７−１４で表されるＲＮＡは配列番号１７で表されるＲＮＡより結合活性が高かった。一方、配列番号１７−３で表されるＲＮＡは配列番号１７で表されるＲＮＡより結合活性が低かった。
配列番号１５で表される核酸をもとにして同様に修飾改変体を作製し、そのヒトＩｇＧに対する結合活性を調べた。
配列番号１５
Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号１５−１（３０Ｆ−１）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）
配列番号１５−２（３０Ｆ−２）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）
配列番号１５−３（３０Ｆ−３）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）
配列番号１５−４（３０Ｆ−４）
Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ａ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）
表面プラズモン共鳴法を用いた測定の結果、配列番号１５−１〜１５−３で表される核酸は配列番号１５で表される核酸と同等の結合活性を有していることがわかった。
以上の結果をまとめたものを表３−１および表３−２に示す。表３中、結合活性の高さを＋で表し、＋の数が多いものほど活性が高いことを意味する。また、配列番号１７−２で表されるＲＮＡとＩｇＧの結合の様子を図３１に示す。
［実施例８］ ＧＧＵＧＣＵのバルジ構造
ＧＧＵＧＣＵ以外の配列でＩｇＧと親和性のある配列がないか調べるために最適化ＳＥＬＥＸをおこなった。最初のプールとしてＧＧＵＧＣＵの部分をランダム配列にしたＲＮＡを用いた。このＲＮＡプールは下記に示す化学合成で作製したＤＮＡをテンプレートにして、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写することで作製した。
ＤＮＡテンプレート：５’−ｔｇｔｃｇｇｃｃｇｔｔａｃａｇｔｔｃｃｇｇｔｔｔｃｃｃｇｇ−６Ｎ−ｔｇｔａａｃｔｃｇｔｃｃａｔｔｇｔｃｃｃ−３’（配列番号３１）
プライマーＧ：５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｃａａｔｇｇａｃｇａｇｔｔａｃ−３’（配列番号３２）
プライマーＨ：５’−ｔｇｔｃｇｇｃｃｇｔｔａｃａｇｔｔｃ−３’（配列番号３３）
ＲＮＡプールの理論的なバリエーションは４０９６である。仕様書に基づいて、４０μｇのヒトＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を４０μｌのＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｒｅｓｉｎ（Ａｍａｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に固定化した。ＳＥＬＥＸは実施例１と同様におこなった。
３ラウンド終了後配列を調べたところ、４８配列中３６配列がＧＧＵＧＣＵを含んでいた。ＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を調べたところ、ＧＧＵＧＣＵと異なる配列でＧＧＵＧＣＵと同じバルジ構造を形成するものは存在しなかった。また、表面プラズモン共鳴法を用いて結合活性を調べたところ、ＧＧＵＧＣＵと異なる配列のものでヒトＩｇＧに対して結合活性を有しているものは存在しなかった。
次に、２ラウンド終了後の配列を４８配列調べた。ＧＧＵＧＣＵを含む配列は１配列存在した。ＭＦＯＬＤプログラムを用いて全ての配列の２次構造を予測したところ、ＧＧＵＧＡＵを含む配列がＧＧＵＧＣＵと同じバルジ構造を形成した。そこで、このクローンとＩｇＧの親和性を表面プラズモン共鳴法を用いて調べたところ、このクローンがＩｇＧに対して結合活性を有していることがわかった。また、ＡＣＣＧＡＣという配列が２クローン見つかったが、この配列はＩｇＧに結合しなかった。ＭＦＯＬＤプログラムを用いるとＧＧＵＧＣＵおよびＧＧＵＧＡＵ以外にもＧＧＵＧＣＵと同様なバルジ構造を形成する配列が見つかる。そこで、配列番号１７−７で表される核酸のＧＧＵＧＣＵの代わりにそのような配列を含んだ核酸を化学合成し、ヒトＩｇＧ１との結合活性を表面プラズモン共鳴法を用いて測定した。ＧＧＵＧＣＵの代わりに用いた配列は以下の通りである。
配列番号１７−７のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＨ）
配列番号１７−７−１のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ａ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＨ）
配列番号１７−７−２のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＨ）
配列番号１７−７−３のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＨ）
配列番号１７−７−４のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ａ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＨ）
配列番号１７−７−５のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＨ）
配列番号１７−７−１〜１７−７−５のうちヒトＩｇＧ１に対して結合活性を有するものは存在していなかった。
配列番号１７−７で表される核酸のＧＧＵＧＣＵはＧ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）のようにピリミジン塩基含有ヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されている。他の修飾方法でヒトＩｇＧに対して結合活性を有しているものが存在するかどうか調べた。実験で使用した核酸は下記の通りで、化学合成により作製した。ヒトＩｇＧ１に対する結合活性は表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。
配列番号１７−７のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（Ｆ）
配列番号１７−７−１０１のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（Ｆ）
配列番号１７−７−１０２のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（Ｆ）
配列番号１７−７−１０３のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｈ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（Ｆ）
配列番号１７−７−１０４のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（Ｆ）
配列番号１７−７−１０５のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）
配列番号１７−７−１０６のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＨ）
配列番号１７−７−１０７のバルジ部分の配列： Ｇ（ＯＨ）Ｇ（ＯＨ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（ＯＨ）Ｃ（Ｈ）Ｕ（ＯＭｅ）
結合活性測定の結果、１７−７−１０１、１７−７−１０４〜１０７は１７−７と同等の結合活性を有していることがわかった。また、１７−７−１０２および１７−７−１０３は結合活性を有していなかった。
以上を表４にまとめる。表４中、結合活性の高さを＋で表し、＋の数が多いものほど活性が高いことを意味する。
以上より、ＧＧＵＧＣＵおよびＧＧＵＧＡＵのバルジ構造はＩｇＧとの結合に重要であることがわかった。また、ＧＧＵＧＣＵの３番目のＵが天然のリボヌクレオチド（リボースの２’位がＯＨのもの）またはデオキシリボヌクレオチド（リボースの２’位がＨのもの）の場合は結合活性がなくなることがわかった。
［実施例９］ ＲＮＡアプタマーを用いたＩｇＧ精製法に関する実験
配列番号１５と１７で表されるＲＮＡをビーズに固定化してヒトＩｇＧ１のプルダウン実験をおこなった。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１０μＬずつ２００μＬのチューブ（Ａｘｙｇｅｎ社製）に入れ、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）でコーティングした。そこに３’末端に１６個Ａを付けたＲＮＡを約１０μｇ加えて固定化した。ＲＮＡはＤＮＡ鋳型とプライマーを化学合成し（Ｏｐｅｒｏｎ社製）、これをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写することで作製した。結合しなかったＲＮＡを溶液Ａを用いて洗浄することで取り除いた後、２０μｇのヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加え、３０分間室温で保持した。ＲＮＡに結合しなかったヒトＩｇＧ１は溶液Ａを用いて洗浄除去した。次に、ビーズにサンプルバッファーを加え、６５℃で１５分加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。６ｘサンプルバッファーは１．３ｇドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３ｍＬ ２−メルカプトエタノール、４．２ｍＬグリセリン、１．５ｍｇブロモフェノールブルーを混合して調整した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３２に示す。レーン１はリガンドに配列番号１５のアプタマーを用いた場合、レーン２は配列番号１７のアプタマーを用いた場合である。上のバンドがＩｇＧの重鎖（Ｈ鎖）のバンドで下が軽鎖（Ｌ鎖）のバンドである。配列番号１５または１７で表されるＲＮＡを抗体精製用分離剤のリガンドとして用いることでＩｇＧをプルダウンすることができることがわかる。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが結合したビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と遺伝子組み替えによりアルブミン結合領域を除去したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ）が結合したビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１０μＬ取り、２０μｇのヒトＩｇＧ１を加えて同様にＩｇＧの精製をおこなった。溶出液としてｐＨ３グリシンバッファーを用いた。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を図３２に示す。レーン３がＰｒｏｔｅｉｎ Ａをリガンドにした場合、レーン２がｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａをリガンドにした場合である。アプタマーがＰｒｏｔｅｉｎ Ａと同等の性能でＩｇＧをプルダウンできることがわかる。
配列番号１５で表されるＲＮＡを用いてヒト血清からヒトＩｇＧが精製できるかどうか調べた。また、中性の溶出液でＩｇＧを溶出することができるかどうか検討した。ストレプトアビジンが結合したセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１０μＬずつ２００μＬのチューブ（Ａｘｙｇｅｎ社製）に入れ、ウシ血清アルブミンでコーティングした。そこに５’末端にビオチンを結合したＲＮＡ（ジーンデザイン社製）を約１０μｇ加えて固定化した。結合しなかったＲＮＡを取り除いた後、２０μＬのヒト血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を加え、３０分間室温で保持した。ＲＮＡに結合しなかったヒト血清成分はＮａＣｌ−ＭｇＣｌ_２バッファーを用いて洗浄除去した。ＮａＣｌ−ＭｇＣｌ_２バッファーとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．６ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーである。ＲＮＡに結合したＩｇＧは中性の溶出液を用いて溶出した。中性の溶出液として（１）２００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡの混合溶液、（２）２００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋１０％グリセロールの混合溶液、（３）６００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋１０％グリセロールの混合溶液を用いた。回収されたＩｇＧの量を調べるために、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。また、溶出されずにビーズに結合しているＩｇＧの量を調べるために、溶出液を取り除いた後のビーズにサンプルバッファーを加え、６５℃で１５分加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３３に示す。レーン２〜４より、アプタマー樹脂を用いて血清からヒトＩｇＧを高純度でプルダウンできることがわかる。また、レーン６〜８でＩｇＧがほとんど検出されていないことより、中性の溶出液を用いることでヒトＩｇＧが溶出できることがわかる。
ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａが結合したビーズを１０μＬ取り、２０μＬのヒト血清を加えて同様にＩｇＧの精製をおこなった。溶出液としてｐＨ３グリシンバッファーを用いた。溶出液とビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を図３３に示す。ＩｇＧの吸着容量に差があるが、アプタマー樹脂がｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂と同程度の純度でＩｇＧを精製することができることがわかる。アプタマー樹脂を用いた場合はＩｇＧを中性で溶出することができる点で、アプタマー樹脂はｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂より優れていると言える。
同様の実験をマウス血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いておこなった。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた場合はＩｇＧはプルダウンされてきたが、配列番号１５で表されるＲＮＡを用いた場合はプルダウンされてこなかった。本発明の抗体精製用ＲＮＡリガンドはヒト抗体のみを高純度で精製することができることがわかる。
配列番号１５で表されるＲＮＡが繰り返し抗体精製用分離剤のリガンドとして使用できるかどうか試験した。上記のように、ビオチンが結合した約１０μｇのＲＮＡを１０μＬのストレプトアビジンのビーズに固定化し、ヒト血清を加え、中性溶液でＩｇＧを溶出した。その後、５０μＬ ６Ｍ尿素で３回ビーズを洗浄し、尿素を取り除くためにＮａＣｌ−ＭｇＣｌ_２バッファーで更に３回ビーズを洗浄した後に、再度ヒト血清を２０μＬ加え、中性溶液でＩｇＧを溶出した。これを再度おこない、３回の抗体精製におけるＩｇＧの回収量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図３４）。その結果、プルダウンされたＩｇＧの量は３回の抗体精製において大差ないことがわかった。これは、抗体精製用のＲＮＡリガンドは尿素で洗浄し、再生することができることを示している。同様に０．１ＭのＮａＯＨで洗浄をおこなった。３回繰り返し精製したが、大きくＩｇＧの回収量が減少することはなかった。
次に、配列番号１６で表されるＲＮＡと配列番号１７−２で表されるＲＮＡの５’末端にビオチンを結合し、上述のとおりヒト血清からＩｇＧを精製した。その結果、これらのＲＮＡリガンドを用いることでＩｇＧを高純度に精製できることがわかった（図３５）。
以上より、ＲＮＡアプタマーをリガンドとして用いることで中性条件でヒト血清からヒトＩｇＧを効率よくかつ高純度に精製できることがわかった。
［実施例１０］ チオールカップリングにより固定化されたＲＮＡアプタマーを用いたＩｇＧ精製法に関する実験
配列番号１５で表されＲＮＡをチオールカップリングでビーズに固定化して実施例９同様のプルダウン実験をおこなった。配列番号１５で表されるＲＮＡの５’末端にＣ１８のリンカーを挟んでチオール基を結合させた（ジーンデザイン社製）。このＲＮＡ約２０μｇをＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）１０μＬに固定化した。固定化は仕様書にそっておこなった。固定化量は固定する前のＲＮＡの量と固定化直後の上清中のＲＮＡの量を吸光度計で測定することで見積もった。その結果、カップリングに用いたＲＮＡの９０％以上のＲＮＡが固定化されることがわかった。このＲＮＡアプタマービーズを用いて実施例９同様にプルダウン実験をおこなった。ビーズ１０μｇに対してヒト血清を５μＬおよび１０μＬ加え、洗浄、中性溶出液による溶出をおこない、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図３６）。その結果、ＩｇＧが高純度にプルダウンされることが示された（図３６レーン２、３）。
実施例９同様にｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａビーズを用いたプルダウン実験もおこなった。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａビーズ１０μＬに対してヒト血清を５μＬ加え、洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加えて６５℃１５分加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図３６レーン５）。
本プルダウン実験の結果より、チオールカップリングにより固定化したＲＮＡアプタマービーズを用いることで、中性条件でヒト血清からヒトＩｇＧを効率よくかつ高純度に精製できることがわかった。
［実施例１１］ アミノカップリングにより固定化されたＲＮＡアプタマーを用いたＩｇＧ精製法に関する実験
ＲＮＡの５’末端にＣ１２のリンカーを挟んでアミノ基を結合させ、ＲＮＡをアミノカップリングにより樹脂上に固定化した。アミノ基を結合したＲＮＡは化学合成により作製した（ジーンデザイン社製）。ＲＮＡの固定化にはＴｒｅｓｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ樹脂（東ソー社製）を用いた。樹脂１ｍｌあたり１０ｍｇのＲＮＡを使用することで、約８ｍｇのＲＮＡを固定化した。固定化量はカップリング前後の上清中のＲＮＡの量を吸光度計で測定することにより求めた。このアプタマー樹脂を用いて実施例９と同様にヒト血清からＩｇＧのプルダウン実験をおこなった。リガンドとして、配列番号１５（図３７）、及び配列番号１７−７、１７−８、１７−７−１０７、１５で表されるＲＮＡ（図３８）を用いた。その結果、これらのどのアプタマー樹脂からもｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂と同等の純度でＩｇＧがプルダウンされることが示された（図３７、３８）。
実施例９でアプタマー樹脂を用いた場合、２００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡの中性溶出液でＩｇＧを溶出できることを示した。ここではアミノカップリングにより固定化された配列番号１７−７で表されるアプタマー樹脂を用いて、異なる成分の中性溶出液によるＩｇＧ溶出実験をおこなった。溶出液として（１）２００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ、（２）２００ｍＭ ＫＣｌ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ、（３）３００ｍＭ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ、（４）１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓを用いた。実施例９と同様にヒト血清からＩｇＧをプルダウンし、上記溶出液で溶出したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。その結果、ＫＣｌまたはＥＤＴＡのみでＩｇＧを溶出できることがわかった（図３９）。
１Ｍ ＮａＣｌ溶液でＩｇＧを溶出することができるか検討した。核酸は負電荷を帯びているので、タンパク質との結合にはイオン結合が重要であると一般に考えられている。よって、タンパク質との結合を切るには高塩濃度の溶液を用いればよい。１ＭＮａＣｌ溶液を溶出液として上述と同様な実験をおこなったが、溶出液中にＩｇＧは検出されず、そのほとんどがアプタマー樹脂に吸着したままであった。高濃度のＮａＣｌ存在化でアプタマーとＩｇＧが結合していることを確認するために表面プラズモン共鳴法を用いた実験をおこなった。ランニングバッファーに５００ｍＭＮａＣｌ＋２ｍＭＭｇＣｌ_２＋１０ｍＭ ｐＨ７．６Ｔｒｉｓ混合液を用いた。その結果、５００ｍＭのＮａＣｌ存在下でも全く結合活性が低下していないことがわかった。
以上より、アプタマー樹脂に結合したＩｇＧは２００ｍＭＫＣｌ溶液では溶出できるが、１ＭＮａＣｌ溶液では溶出できないことがわかった。
次に、アプタマー樹脂の加熱による再生および滅菌に関する実験をおこなった。既に３回使用済みの配列番号１７−１７または１７−１８で表されるアプタマー樹脂を（１）超純水を加え８５℃で５分間加熱または（２）６Ｍ尿素を加え６５℃で１５分間加熱し、再度プルダウン実験をおこなった。ヒト血清は１０μＬ使用し、溶出液として２００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋ｐＨ７．６ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液を用いた。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、（１）および（２）による加熱処理によってアプタマー樹脂がほとんど劣化していないことがわかった（図４０）。
ＩｇＧを動的状態で精製できるかどうか調べた。アプタマー樹脂１００μＬを小型カラム（ＭｏＢｉＴｅｃ／ｍｏｂｉｃｏｌｓ）に充填し、ヒト血清１００μＬを加えた。その後すぐに溶液Ａをシリンジを用いて加え、樹脂を洗浄した（溶液Ａ：４ｍＬ、流速約１ｍＬ／ｍｉｎ）。次に、中性溶出液を用いてアプタマーリガンドに結合したＩｇＧを溶出した（中性溶出液：２ｍＬ、流速約１ｍＬ／ｍｉｎ）。溶出された画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて調べたところ、ＩｇＧが溶出されていることが確認された。また、それぞれの画分の吸光度を測定しＩｇＧの動的精製量を求めたところ、一回の精製で樹脂１ｍＬあたり３．５ｍｇのＩｇＧが精製できることがわかった。
［実施例１２］ 樹脂結合型オリゴを用いたＩｇＧのプルダウン実験
上述までは化学合成により作製したアプタマーをｐｏｌｙＡ−ｐｏｌｙｄＴ結合、ビオチンーストレプトアビジン結合、チオールカップリング、アミノカップリングにより樹脂上に固定化して使用していた。しかし、核酸は樹脂に固定化した状態で合成し、合成後に樹脂から切り離して使用している。そこで、樹脂からの切り離しと樹脂への再結合過程を短縮する目的で、合成終了後に核酸を樹脂から切り離さないでそのままプルダウン実験に使用した（樹脂結合型オリゴ）。樹脂結合型オリゴは配列番号１５で表されるＲＮＡをＯｌｉｇｏ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で合成したものを使用した（ジーンデザイン社製）。樹脂１０μＬにヒト血清１０μＬを加えてＩｇＧをプルダウンし、中性溶出液で溶出したところ、ＩｇＧが高純度で精製された（図４１）。
［実施例１３］ キメラ抗体に対する結合活性の評価
遺伝子組換え技術を用いて作製された医薬品用の抗体に対して本アプタマーが結合活性を有しているかどうか、表面プラズモン共鳴法を用いて確認した。抗体には医薬品として使用されているリツキサン（ロッシュ社製）を、リガンドに配列番号１７−７で表される核酸を用いた。測定の結果、配列番号１７−７で表される核酸はリツキサンに対して結合活性を有していることがわかった（図４２）。

本発明によりＩｇＧに対して結合能を有する核酸リガンドが提供される。本発明により提供される核酸リガンドはＩｇＧに対して高い結合活性と特異性を保持している。また、化学合成できることから容易にヌクレオチド配列を変えたり修飾を加えたりすることができる。そのため、抗体を医薬・試薬・診断薬に利用する場合に、各々のニーズに合わせて結合活性や安定性を変化させたり、蛍光物質や抗癌剤などを結合させて新たな機能を加えることが容易である。又、近年ヒト化した単クローン抗体が分子標的医薬として実用化され世界的に抗体製剤の開発が進められている。そのため、現在抗体精製に使用されているＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂分離剤にかわる高機能性分離剤の開発が期待され、その分離剤市場も５００億円程度に達すると予想される。本発明により提供される核酸リガンドは抗体精製用分離剤のリガンドとして使用することが可能で、目的の抗体を中性条件で簡便に高純度に精製することができる。これは、従来のＰｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた酸性条件での精製と大きく異なり、精製中に抗体が失活する可能性が少ない。また、本発明により提供される核酸リガンドは抗体と蛍光物質や酵素を結合するための新規のリンカー、基板や樹脂に抗体を固定するための新規の固定化剤、さらに抗体と抗癌剤や毒素を結合するための新規のリンカーとして汎用的に利用が可能である。本発明は抗体に関する新規な分離剤、試薬、医薬の産業化と研究用ツールとして汎用的な利用が期待でき、その経済効果も大きい。
本出願は、２００５年７月５日に日本で出願された特願２００５−１９５７１７、及び２００５年１２月１２日に米国で出願された米国仮出願ＵＳ６０／７４９，０２６を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
［配列表］

Claims (21)

1. ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対して結合するアプタマーであって、
   以下（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
   〔式中、Ｎ ^１ 、Ｎ ^２ 、Ｎ ^３ 、Ｎ ^４ 、Ｎ ^５ はそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドであり、
   Ｎ ^２ 及びＮ ^３ は互いに相補的なヌクレオチドであり、
   Ｎ ^４ 及びＮ ^５ は互いに相補的なヌクレオチドであり、
   （ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド（但し、３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ ^１ Ｃにおける各ヌクレオチド、（ｉｉｉ）Ｎ ^２ 〜Ｎ ^５ の各ヌクレオチドがそれぞれ、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドであり、
   ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基がフッ素原子で置換されているヌクレオチドである〕のいずれかで表される潜在的二次構造を有する、アプタマー。
2. （Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで表される潜在的二次構造を有するアプタマーが、以下（Ｉ’）〜（ＩＩＩ’）：
   〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５はそれぞれ、請求項１と同義である〕のいずれかで表される潜在的二次構造を有する、請求項１記載のアプタマー。
3. ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対して結合するアプタマーであって、
   以下（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）：
   〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５、Ｎ^６、Ｎ^７はそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選ばれるヌクレオチドであり、
   Ｎ^２及びＮ^３は互いに相補的なヌクレオチドであり、
   Ｎ^４及びＮ^５は互いに相補的なヌクレオチドであり、
   Ｎ^６及びＮ^７は互いに相補的なヌクレオチドであり、
   （ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド（但し、３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ^１Ｃにおける各ヌクレオチド、（ｉｉｉ）Ｎ^２〜Ｎ^７の各ヌクレオチドがそれぞれ、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドであり、
   ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基がフッ素原子で置換されているヌクレオチドである〕のいずれかで表される潜在的二次構造を有する、アプタマー。
4. （Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）のいずれかで表される潜在的二次構造を有するアプタマーが、以下（Ｉａ’）〜（ＩＩＩａ’）：
   〔式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５ 、Ｎ ^６ 、Ｎ ^７ はそれぞれ、請求項３と同義である〕のいずれかで表される潜在的二次構造を有する、請求項３記載のアプタマー。
5. Ｎ^４、Ｎ^６はそれぞれ、２’位においてヒドロキシル基が水素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基で置換されているヌクレオチドであり、Ｎ^５、Ｎ^７はそれぞれ、２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドである、請求項３又は４記載のアプタマー。
6. Ｎ ^２ がＡであり、Ｎ ^３ がＵである、請求項１〜５のいずれか１項記載のアプタマー。
7. Ｎ ^４ がＣであり、Ｎ ^５ がＧである、請求項１〜６のいずれか１項記載のアプタマー。
8. （Ｉａ’）〜（ＩＩＩａ’）のいずれかで表される潜在的二次構造を有するアプタマーが、以下（Ｉａ’’’）〜（ＩＩＩａ’’’）：
   のいずれかで表される潜在的二次構造を有する、請求項４記載のアプタマー。
9. 以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかであり、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対して結合する、請求項１〜８のいずれか１項記載のアプタマー：
   （ａ）配列番号１〜１８および２０〜２２のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）からなるアプタマー；
   （ｂ）配列番号１〜１８および２０〜２２のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、ＧＧＵＧＣＵ及びＡＡＣ（但し、配列番号１４においては２６〜２８番目のＡＡＣ）を除く１〜４個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列からなるアプタマー；
   （ｃ）該（ａ）の連結物、該（ｂ）の連結物、及び該（ａ）及び（ｂ）の連結物からなる群より選ばれる連結物。
10. 以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかであり、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対して結合する、請求項１〜８のいずれか１項記載のアプタマー：
    （ａ）総ヌクレオチド数が４０個以下であって、配列番号１３〜１８のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）からなるアプタマー；
    （ｂ）総ヌクレオチド数が４０個以下であって、配列番号１３〜１８のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、ＧＧＵＧＣＵ及びＡＡＣ（但し、配列番号１４においては２６〜２８番目のＡＡＣ）を除く１〜４個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列からなるアプタマー；
    （ｃ）該（ａ）の連結物、該（ｂ）の連結物、及び該（ａ）及び（ｂ）の連結物からなる群より選ばれる連結物。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項記載のアプタマー及びそれに結合した標識用物質、酵素、薬物、毒素又は薬物送達媒体を含む複合体。
12. 請求項１〜１０のいずれか１項記載のアプタマーあるいは請求項１１記載の複合体が固定化された固相担体。
13. 固相担体が、基板、樹脂、プレート、フィルター、カートリッジ、カラム又は多孔質材である、請求項１２記載の固相担体。
14. 請求項１２又は１３記載の固相担体を含む医療用機器。
15. 医療用機器が血液浄化用機器である、請求項１４記載の機器。
16. 請求項１〜１０のいずれか１項記載のアプタマー、請求項１１記載の複合体あるいは請求項１２又は１３記載の固相担体を含む、診断用又は検査用試薬。
17. 請求項１〜１０のいずれか１項記載のアプタマーあるいは請求項１１記載の複合体を含む、医薬。
18. 請求項１２又は１３記載の固相担体にヒトＩｇＧを吸着させ、吸着したヒトＩｇＧを溶出液により溶出させることを含む、抗体精製又は濃縮方法。
19. 溶出液が中性溶液である、請求項１８記載の方法。
20. ヒトＩｇＧを作製し、作製されたヒトＩｇＧを請求項１２又は１３記載の固相担体により精製することを含む、精製抗体の製造方法。
21. 請求項１〜１０のいずれか１項記載のアプタマー、請求項１１記載の複合体あるいは請求項１２又は１３記載の固相担体を用いて、試料中のヒトＩｇＧの有無及び／又は量を測定することを含む、ヒトＩｇＧの検出及び／又は定量方法。