JP2003506024A - 肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ）又はその受容体ｃ−ｍｅｔ、及びインテグリン類に対する核酸リガンド - Google Patents

肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ）又はその受容体ｃ−ｍｅｔ、及びインテグリン類に対する核酸リガンド

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ）及びその受容体ｃ−ｍｅｔへの核酸リガンドを提供する。本発明はまた、インテグリン類への核酸リガンドも提供する。本発明の核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法を使用して単離される。ＳＥＬＥＸは、Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（指数的濃縮によるリガンドの系統進化法）の頭字語である。本発明の核酸リガンドは診断薬及び治療薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の属する分野 本明細書中では、肝細胞増殖因子／拡散因子（HGF）あるいはその受容体であ
るc-metの高親和性核酸リガンドを同定および調製するための方法を記載する。
そのような核酸リガンドを同定するために本明細書中で利用される方法は、Syst
ematic Evolution of Ligands by EXponential enrichmentの頭文字をとってSEL
EXと呼ばれる。本発明は、高められたHGFおよびc-met活性が原因因子である疾患
の治療的および診断的な試薬にも関する。
【０００２】 本明細書中では、SELEX法を使用してインテグリンの核酸リガンドを同定する
ための方法も記載する。本発明のこの観点は、インテグリンタンパク質、および
インテグリンを含む疾患を治療および診断するための方法および組成物に関する
。
【０００３】 発明の背景 肝細胞増殖因子／拡散因子（本明細書中ではHGFと略す）は、その受容体であ
るc-metとの相互作用を介して、広範な多様な細胞型、優勢には上皮性、の増殖
、形態形成、および遊走を刺激する強力なサイトカインである。HGFおよびc-met
は腫瘍形成、特に新血管形成および運動形成、後者は転移に必要な細胞の遊走に
関係している、に関するいくつかの細胞性過程に関する（JiangおよびHiscox (1
997) Histol Histopathol. 12:537-55; TamagnoneおよびComoglio (1997) Cytok
ine Growth Factor Rev. 8:129-42; Jiangら (1999) Crit Rev Oncol Hematol.
29:209-48においてレビューされる）。興味深いことに、細胞外基質を減ずるプ
ロテアーゼもHGFを活性化して、次々にウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチ
ベーター（uPA）およびその受容体を亢進制御して、活性化ループ（loop）が転
移癌に必要な侵襲および遊走過程を与えるようになる。
【０００４】 HGFおよびc-met受容体は、かなり多様な固形癌において異常に高いレベルで発
現する。腫瘍細胞株のふるまいに対するHGF/c-metの効果のin vitroにおける非
常に多くの証明に加えて、HGFおよび／あるいはc-metのレベルはヒト腫瘍組織で
測定されている（Jiang (1999) Crit Rev Oncol Hematol 29:209-48においてレ
ビューされる）。高レベルのHGFおよび／あるいはc-metは、多くの他の腫瘍に加
えて肝臓、乳房、膵臓、肺、腎臓、膀胱、卵巣、脳、前立腺、胆嚢および骨髄腫
腫瘍で観察されている。
【０００５】 上で列挙したいくつかの癌の型に関して、HGF/c-metレベルを測定する予後値
が評価されており、疾患の予後および重度を決定するために潜在的に有用である
ことが見出されている。相関的なデータは乳癌（Ghoussoub, Dillonら (1998) C
ancer. 82:1513-20; Toi, Taniguchiら (1998) Clin Cancer Res. 4:659-64）、
および非小細胞肺癌（Siegfried, Weissfeldら (1997) Cancer Res. 57:433-9;
Siegfried, Weissfeldら (1998) Ann Thorac Surg. 66:1915-8）の場合に最も顕
著である。
【０００６】 HGFおよびc-metの高められたレベルは、高血圧（Morishita, Aokiら (1997) J
Atheroscler Thromb. 4:12-9; Nakamura, Moriguchiら (1998), Biochem Bioph
ys Res Commun. 242:238-43）、動脈硬化（Nishimura, Ushiyamaら (1997) J Hy
pertens. 15:1137-42; Morishita, Nakamuraら (1998) J Atheroscler Thromb.
4:128-34）、心筋梗塞（Sato, Yoshinouchiら (1998) J Cardiol. 32:77-82）、
および慢性関節リウマチ（Koch, Halloranら (1996) Arthritis Rheum. 39:1566
-75）などの非腫瘍学的な設定においても観察されており、さらなる治療的およ
び診断的な応用の可能性が高められる。
【０００７】 転移におけるHGF/c-metの役割は、HGF/c-metを用いて形質転換した細胞株を使
用してマウスにて解明されている（Jefers, Rongら (1996) J Mol Med. 74:505-
13にレビューされる）。もう一つの転移モデルでは、HGF/c-metを発現するヒト
乳癌細胞をマウスの乳房脂肪パッドに注入することで、初期腫瘍に加えて最終的
な肺転移を引き起こした（Meiners, Brinkmannら (1998) Oncogene. 16:9-20）
。また、HGFを過剰発現するトランスジェニックマウスは多くの部位で腫瘍を持
つようになる（Takayama, LaRochelleら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
. 94:701-6）。
【０００８】 相関的なデータの蓄積量は確信させているにもかかわらず、上で言及したデー
タにはヒトの癌におけるHGF/c-metの直接的な原因としての役割の証明を提供す
るものはない。しかし、自身のチロシンキナーゼドメインを構造的に活性化する
胚系（germ-line）c-met変異、およびヒト乳頭状腎癌の出現の間に因果関係が確
立された（Schmidt, Duhら (1997) Nat Genet. 16:68-73）。
【０００９】 新血管形成の阻害および腫瘍進行の抑制あるいは転帰との間の関係に関する最
近の研究は、癌の治療における大きな見込みを示す（Boehm, Folkmanら (1997)
Nature. 390:404-7）。この報告では、複数の新血管形成阻害剤の使用は単一の
阻害剤の効果と比較するとより優れた腫瘍抑制／退行を与えることが示された。
新血管形成はHGF、ならびに血管内皮増殖因子（VEGF）および基礎的線維芽細胞
増殖因子（bFGF）により顕著に刺激される（Rosen, Lamszusら (1997) Ciba Fou
nd Symp. 212:215-26）。HGFおよびVEGFは、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVECs）の有
糸分裂誘発に対する付加的なあるいは共同的な効果を有していることが最近報告
された（Van Belle, Witzenbichlerら (1998) Circulation. 97:381-90）。同様
な複合効果は新血管形成および転移に寄与しているらしい。
【００１０】 ヒトHGFタンパク質は728のアミノ酸の単一ペプチド鎖として発現する（Mizuno
およびNakamura (1993) Exs. 65:1-29; Rubin, Bottaroら (1993) Biochem Biop
hys Acta. 1155:357-71; Jiang (1999) Crit Rev Oncol Hematol. 29:209-48）
。HGFのアミノ末端31残基のシグナル配列は輸出（export）において開裂する；u
PAおよび／あるいは他のプロテアーゼによるタンパク質分解性開裂が続く。成熟
タンパク質は、463残基のαサブユニットおよび234残基のβサブユニットからな
るヘテロ二量体であり、１つのジスルフィド結合を介して結合する。HGFはプラ
スミノーゲンの相同体である：そのαサブユニットは4つのクリングルドメイン
の先にあるN末端プラスミノーゲンアクチベーターペプチド（PAP）を含有し、β
サブユニットはセリンプロテアーゼ様ドメインであるが、重要な触媒性アミノ酸
を欠いているため非活性である。PAPおよび最初のクリングルドメインを含有す
るHGF断片の最近解明された結晶構造は、受容体の相互作用に加えて、この領域
がヘパリン結合および二量体化の原因となっていることを示す（Chirgadze, Hep
pleら (1999) Nat Struct Biol. 6:72-9）
【００１１】 ヒトc-metタンパク質は、23アミノ酸の単一配列を介して細胞表面に輸出され
る（Comoglio (1993) Exs. 65:131-65; Rubin (1993) Biochem Biophys Acta. 1
155:357-71; Jiang (1999) Crit Rev Oncol Hematol. 29:209-48においてレビュ
ーされる）。c-metの輸出型は、はじめはタンパク質分解性に開裂されるプロペ
プチドである。成熟タンパク質は、ジスルフィド結合を介して140 kDaβサブユ
ニットに結合する細胞外50 kDaαサブユニットからなるヘテロ二量体である。そ
の細胞外ドメインに加えて、βサブユニットは推定される膜架橋（membrane-spa
nnnig）配列および典型的なチロシンキナーゼを含有する435アミノ酸の細胞内ド
メインを有する。
【００１２】 HGFは主に間葉細胞により産生され、一方c-metは主に上皮起源の細胞上で発現
する。HGFは種間においてアミノ酸レベルで非常に高度に保存される。この相同
性は、ヒト、ラット、マウス、ブタおよびイヌを含む種にわたって、HGFによる
培養中の肝細胞の有糸分裂誘発刺激で観察されるように、機能的な領域に広がる
。これは、ヒトHGFは様々なアッセイにおいて交差特異的に（cross-specificall
y）使用できることを示す。
【００１３】 疾患におけるHGFおよびc-metの役割を仮定すると、これらのタンパク質に結合
してその活性を阻害する薬剤を持つことが所望れるであろう。診断的および予後
の情報を集めるために、個々にHGFおよびc-metのレベルを定量できる薬剤を持つ
ことも所望されるであろう。
【００１４】 インテグリンはヘテロ二量体の肝要な膜タンパク質の種類であり、そのうちの
１つあるいはそれ以上は大半の細胞型で発現する（Hynes (1992) Cell 69:11-25
）。ある16の相同体αサブユニットおよび8の相同体βサブユニットは、受容体
の広範なファミリーを生み出すために様々な組合せで結合する。各々のインテグ
リンヘテロ二量体は、特異的なリガンドとの結合を媒介する大きな細胞外ドメイ
ンを有している。これらのリガンドは原形質タンパク質、隣接する細胞の表面上
で発現するタンパク質、あるいは細胞外基質の成分を含みうる。いくつかのイン
テグリンは１つ以上のリガンドに対して親和性を示し、多くは重複する特異性を
有している（Hynes (1992) Cell 69:11-25）。αおよびβサブユニットは、アク
チン細胞骨格の成分と接触する小さな細胞内ドメインに寄与し、従って細胞の外
および内のタンパク質間での物理的な結合を形成する。
【００１５】 インテグリンは細胞接着および遊走において重要な役割をしており、これらの
特性は細胞により、一部はそのリガンドに対するインテグリン親和性のモジュレ
ート（いわゆる“内外”シグナル伝達）により調節される。対して、インテグリ
ンライゲーション（ligation）の存在あるいは非存在により、細胞の微小環境に
ついての特異的な情報が与えられ、多くの例では、インテグリンはシグナル変換
のための導管（conduit）として作用する。インテグリンによるリガンド結合は
、焦点接着（focal adhesions）内への結合、上位分子複合体内への細胞骨格お
よび細胞内シグナル伝達分子の集合、およびタンパク質リン酸化、カルシウム放
出、および細胞内pHの増加を含む下流シグナル伝達事象のカスケードの開始を促
進しうる（Schwartzら (1995) Ann Rev. Cell Dev. Biol. 11:549-99によりレビ
ューされる）。そのような“外内”シグナル伝達は、細胞増殖、遊走およびアポ
トーシスを調節する経路内に結びつく（Strombladら (1996) J. Clin. Invest.
98:426-33; Eliceiriら (1998) J. Cell. Biol. 140:1255-63）。インテグリン
は、胚発生、創傷治癒、新血管形成、クロット形成、白血球の管外遊出、骨吸収
および腫瘍転移などの多様な生理学的な設定において役割をしていることが示さ
れている。
【００１６】 β3含有インテグリンは最も研究されている受容体ファミリーの中に存在する
。β3サブユニットはαV（αVβ3）あるいはαIIb（αIIbβ3）で二量体を形成
する。これらのインテグリンはリガンド特異性において実質的な重複を示すが、
それらは正常生理および疾患において非常に異なる役割をする。
【００１７】 αVβ3は活性化された内皮細胞、平滑筋細胞、破骨細胞、および非常に低レベ
ルで、血小板により発現される。それは様々な腫瘍細胞型によっても発現される
。インテグリンは多くの血漿タンパク質あるいは細胞外基質のタンパク質に結合
し、その多くは炎症あるいは創傷治癒の部位に関連する（Albelda (1991) Am. J
. Resp. Cell Mol. Biol. 4:195-203）。これらはビトロネクチン、フィブロネ
クチン、オステオポンチン、フォンウィレブランド因子、トロンボスポンジン、
フィブリノーゲン、および変性コラーゲンI型を含む（Hynes (1992) Cell 69:11
-25）。これらのタンパク質の各々は、インテグリン結合部位のコアを形成する
共通の配列モチーフであるアルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）を共有
する。
【００１８】 αVβ3は、細胞外基質を介して内皮細胞の接着および遊走を媒介する新たな血
管の形成（新血管形成）の文脈において、最も熱心に研究されている。成人にお
ける新血管形成は通常、黄体および子宮内膜の周期的な発達および創傷修復の間
の肉芽組織の形成に関連する。後者の場合において、微小血管内皮細胞は創傷内
の一時的な基質に浸透する血管芽を形成する。これらの細胞は一過性にαVβ3を
発現し、インテグリンのリガンド結合機能の阻害は一時的に肉芽組織の形成を阻
害する（Clarkら (1996) Am. J. Pathol. 148:1407-21）。ひな鳥の漿尿膜上で
のサイトカイン刺激あるいは非刺激血管形成において、ヘテロ二量体特異的抗体
を用いたαVβ3の阻害は事前に存在する脈管構造に影響を与えずに新たな血管形
成を妨げる（Brooksら (1994) Science 264:569-71）。さらに、新血管形成に関
して活性化された内皮細胞による接着性接触の消失は、アポトーシス細胞の表現
型的特徴を誘導する（Brooksら (1994) Cell 79:1157-64）；すなわち、αVβ3
によるリガンド結合は細胞へ生存的なシグナルを伝達する可能性がある。従って
、αVβ3により媒介される接着および／あるいはシグナル伝達は新たな血管の形
成に不可欠である。
【００１９】 固形癌は独立した血管供給がないと重大な大きさに増殖できない。脈管形成的
な表現型の獲得は、初期腫瘍および派生的な部位での腫瘍の増殖における制限段
階の１つであると現在仮定されている（Folkman (1995) Nat. Med. 1:27-31）。
加えて、腫瘍塊に浸透する脈管構造は酸素および栄養の源を提供する一方で、初
期腫瘍を離れて体中を遊走する転移細胞のための導管としても作用する。従って
、新血管形成の阻害は癌病変の増殖および転移の両方を制限しうる。腫瘍誘導新
血管形成の実験的な設定において、内皮αVβ3によるリガンド結合の阻害は新た
な血管の形成を妨げ（Brooksら (1994) Cell 79:1157-64; Brooksら (1995) J.
Clin. Invest. 96:1815-22）、αVβ3の阻害はin vivoでの実験的な腫瘍の増殖
を減少させることを示した（Brooksら (1995) J. Clin. Invest. 96:1815-22; C
arronら (1998) Canc. Res. 58:1930-5）。
【００２０】 αVβ3は腫瘍内の微小脈管構造により発現されるだけでなく、いくつかの場合
では、腫瘍細胞自身の表面にも見出される。特に、αVβ3インテグリンの発現は
メラノサイトおよびアストログリア起源の腫瘍由来の組織切片中に検出され（Al
beldaら (1990) Canc. Res. 50:6757-64; GladsonおよびCheresh (1991) J. Cli
n. Invest. 88:1924-32）、インテグリン発現のレベルは腫瘍の病期あるいは転
移の潜在性と相関している（Albeldaら (1990) Canc. Res. 50:6757-64; Gladso
n (1996) Am. J. Pathol. 148:1423-34; Hiekenら (1996) J. Surg. Res. 63:16
9-73）。さらに、変性コラーゲンの三次元的な基質においてin vitroで増殖させ
た黒色腫細胞は、αVβ3阻害によるアポトーシスを受ける。
【００２１】 これらなどのデータは、癌の治療のためのαVβ3の阻害剤に対する興味を動か
している。現在、2つのそのような阻害剤が臨床試験の最中あるいは近くにある
：ビタキシンはαVβ3特異的モノクローナル抗体であるLM609由来のキメラFab断
片である（Wuら (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95:6037-42）。後期病期癌患者
における第I相試験は完了しており、重大な治療関連毒性は観察されなかった（G
utheilら (1998) Am. Soc. Clin. Onc.）。EMD121974はαVβ3の環状ペンタペプ
チド阻害剤である。カポジ肉腫、脳腫瘍および固形腫瘍におけるこの化合物の第
I相試験は1999年の初めに予定されている。
【００２２】 新血管形成（およびαVβ3）は、乾癬（Creamerら (1995) Am. J. Pathol. 14
7:1661-7）、慢性関節リウマチ（Walshら (1998) Am. J. Pathol:152-691-702;
Storgardら (1999) J. Clin. Invest. 103:47-54）、子宮内膜症（Healyら (199
8) Hum. Reprod. Update 4:736-40）、およびいくつかの眼の増殖性疾患（Casar
oli Maranoら (1995) Exp. Eye Res. 60:5-17; Friedlanderら (1996) Proc. Na
t. Acad. Sci. 93:9764-9; Hammesら (1996) Nat. Med. 2:529-33）を含む、い
くつかの他の疾患の病理に関係する。これらの文脈の各々におけるインテグリン
リガンド結合の阻害は、重要な治療的利益を提供しうる。
【００２３】 血管形成の後の粥状斑および再狭窄は、動脈壁の最内層である内膜の肥厚によ
り特徴づけられる病理である。線維性細胞外タンパク質の付随的な沈着を伴う新
規内膜（neointima）内への平滑筋細胞の増殖および／あるいは遊走は、血管壁
の肥厚および続く血管閉塞に寄与する。血小板も、内皮細胞への接着を介した再
狭窄病変の発達および下に存在する平滑筋細胞層を刺激する増殖因子およびサイ
トカインの放出に寄与する（Le Bretonら (1996) J. Am. Coll. Cardiol. 28:16
43-51）。αVβ3インテグリンは動脈平滑筋細胞上で発現し（Hoshigaら (1995)
Circ. Res. 77:1129-35）、ビトロネクチンおよびオステオポンチン上でそれら
の遊走を媒介するが（Brownら (1994) Cardiovasc. Res. 28:1815-20; Jonesら
(1996) Proc. Nat. Acad. Sci. 93:2482-7; Liawら (1995) J. Clin. Invest. 9
5:713-24; Pandaら (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. 94:9308-13）、それらはin
vivoでの動脈硬化的な組織に関連する2つの基質タンパク質である（Brownら (19
94) Cardiovasc. Res. 28:1815-20; Giachelliら (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci
. 760:109-26; Pandaら (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. 94:9308-13）。加えて
、内皮細胞、およびかなりより小さな程度での血小板におけるαVβ3発現は、少
なくともこれらの細胞型の間の接着的な相互作用の一部が原因である（Le Breto
nら (1996) J. Am. Coll. Cardiol. 28:1643-51; Gavazら (1997) Circulation
96:1809-18）。RGD含有ペプチドあるいはモノクローナル抗体を用いたαVβ3阻
害により、動脈障害の後の再狭窄のいくつかの動物モデルにおいて新規内膜の過
形成が制限されることが見出された（Choiら (1994) J. Vasc. Surg. 19:125-34
; Srivatsaら (1997) Cardiovasc. Res. 36:408-28; Slepianら (1998) Circula
tion 97:1818-27; Colemanら (1999) Circ. Res. 84:1268-76）。さらに、血小
板フィブリノーゲン受容体であるαIIbβ3およびαVβ3の両方をブロックする抗
β3抗体（Reopro/abciximab/c7E3）を用いた経皮的冠動脈介入（intervention）
をうける患者の治療は、αVβ3ライゲーションの阻害を介して媒介されうる効果
である、死亡あるいは心筋梗塞の割合および動脈の再閉塞の割合の長期的な減少
を提供した（Lefkovitsら (1996) Am. J. Cardiol. 77:1045-51）。αVβ3が実
験的に誘導された焦点大脳虚血の後の微小血管平滑筋細胞により発現されるとい
う観察は（Okadaら (1996) Am. J. Pathol. 149:37-44）、このインテグリンが
発作における虚血／再灌流障害の発達においてもある役割をしうることを示唆す
る。
【００２４】 最後に、αVβ3は骨の表面上で基質タンパク質、特にオステオポンチンへの破
骨細胞の接着を媒介する。破骨細胞は正常の生理学的ならびに骨粗鬆症などの病
理学的状態において骨の吸収の原因となる。αVβ3に特異的なモノクローナル抗
体は、in vitroにおいて破骨細胞による骨粒子の結合および吸収を阻害した（Ro
ssら (1993) J. Biol. Chem. 268:9901-7）。さらに、RGD含有タンパク質である
エキスタチン（echistatin）は、血清カルシウムレベルによりモニターして、動
物モデルにおいて副甲状腺刺激骨吸収をブロックすることが示された（Fisherら
(1993) Endocrin. 132:1411-3）。従って、αVβ3インテグリンの阻害は、骨粗
鬆症などで起こるような骨損失を弱める治療に潜在的に有用であると考えられる
。
【００２５】 αIIbβ3（GPIIbIIIaとしても言及される）は、血漿タンパク質であるフィブ
リノーゲンへの活性化血小板の接着を媒介する血小板表面上の主要なインテグリ
ンである（NachmanおよびLeung (1982) J. Clin. Invest. 69:263-9; Shattilら
(1985) J. Biol. Chem.260:1 1107-14）。クロット形成の間、フィブリノーゲ
ン二量体はインテグリン受容体を介して互いに血小板を架橋する。αIIbβ3はフ
ォンウィレブランド因子、ビトロネクチン、およびフィブロネクチンを含む、い
くつかのその他の血漿および細胞基質タンパク質にも結合する（FaullおよびGin
sberg (1996) J. Am. Soc. Nephrol. 7:1091-7）。
【００２６】 クロット形成は、血管傷害に対する急性反応のための要求と重大な血管の異所
性閉塞の危険とをつり合わせる厳しく制御された過程である。αIIbβ3ヘテロ二
量体は、細胞当たり約80,000コピーで休止している血小板の表面上に構造的に発
現する（Wagnerら (1996) Blood 88:907-14）；しかし、フィブリノーゲンに対
するインテグリンの親和性はこれらの細胞上では非常に低い。ADP、エピネフリ
ン、コラーゲンあるいはトロンビンによる血小板の活性化は、インテグリンリガ
ンド結合活性の劇的な増加を導くが（BennettおよびVilaire (1979) J. Clin. I
nvest. 64:1393-401; Marguerieら (1979) J. Biol. Chem. 254:5357-63）、お
そらく受容体における構造的な変化を介して達せられる（Shattilら (1985) J.
Biol. Chem.260:1 1107-14; O'Tooleら (1990) Cell Reg. 1:883-93; Duら (199
3) J. Biol. Chem. 268:23087-92）。インテグリン機能の“内外”調節のこの基
本的な例では、αIIbβ3-フィブリノーゲン相互作用を介した血小板の架橋は血
小板活性化の局所的な部位に制限される。
【００２７】 αIIbβ3リガンド結合の阻害剤は、心臓血管疾患の文脈において主に探求され
ているが（Chong (1998) Am. J. Health Syst. Pharm. 55:2363-86; Topolら (1
999) Lancet 353:227-31）、多くは血栓形成が疑われるあるいは起こりそうな多
くの徴候のいずれかにおける適用を有している。3つの阻害剤、レオプロ（Reopr
o）、インテグリリン（Integrilin）およびアグラスタト（Aggrastat）、は急性
冠動脈症候群を経験している患者および／あるいは経皮的冠動脈介入を受けてい
る患者における使用が認可されている。レオプロ（Centocor/Eli Lilly）は、α IIb β3のβ3鎖についての特異性を有するヒト化マウスモノクローナル抗体Fab断
片である。インテグリリン（COR Therapeutics）は、ヘビの毒液由来の阻害タン
パク質であるバルボウリン（barbourin）のインテグリン結合部位に基づく環状
ヘプタペプチドである。アグラスタト（Merck & Co.）はインテグリンの非ペプ
チド小分子拮抗剤である。小分子阻害剤と異なり、レオプロはαVβ3と交差反応
して、その使用に関連する死および致死的でない心筋梗塞の長期の割合を大きく
減少させる原因でありうるという事実がある（上記参照）。認可薬物のコホート
では見出されない特徴と血小板インテグリンの新規阻害剤を関連づけるために、
かなりの努力がされ続けている。特に、αIIbβ3の活性化リガンド結合構造につ
いての特異性を有する化合物は、存在する抗凝固療法と関連する出血性の合併症
の危険を減少させうる。経口的に利用可能な化合物は、再発する心筋梗塞あるい
は不安定狭心症の危険を有する患者の長期療法に特に有用であろう。
【００２８】 上記の様々な疾患状態におけるインテグリンの役割を仮定すると、特定のイン
テグリンに高い特異性を示す阻害剤を有することが所望されるであろう。本発明
はそのような薬剤を提供する。
【００２９】 長い間の定説は、核酸は主として情報を提供する役割を有しているというもの
であった。SELEX過程と名付けられた、Systematic Evolution of Ligands by EX
ponential enrichmentとして知られる方法を介して、核酸はタンパク質とは異な
る三次元構造的な多様性を有していることが明らかになっている。SELEX過程は
、標的分子との高い特異的な結合を用いた核酸分子のin vitroでの進化のための
方法であり、“Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment
”と題されて、1990年6月11日に出願された、米国特許出願シリアルNo. 07/536,
428で、今では放棄されて、“Nucleic Acid Ligands”と題する米国特許No. 5,4
75,096および“Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands”と題する米国
特許No. 5,270,163（WO 91/19813も参照）に記載されており、それらの各々は特
にその全体を参考文献により本明細書中に援用される。これらの出願の各々は、
SELEX特許出願として本明細書中でまとめて言及され、所望される標的分子のい
ずれかに対する核酸結合をつくるための基本的に新規な方法を記載する。
【００３０】 SELEX過程は、核酸リガンドあるいはアプタマー（aptamers）として言及され
る産物の種類を提供し、各々は独特な配列を有しており、所望される標的化合物
あるいは分子に対して特異的に結合する特性を有している。各々のSELEX同定核
酸リガンドは、与えられた標的化合物あるいは分子の特異的なリガンドである。
SELEX過程は、核酸が、単量体あるいは多量体に関わらず事実上いかなる化学的
化合物と共にリガンドとして作用する（特異的結合ペアを形成する）ために、様
々な二次元および三次元構造を形成する十分な能力およびそれらの単量体内で利
用可能な十分な化学的融通性を有する、という独特な洞察に基づく。いかなる大
きさあるいは組成物の分子は標的として作用できる。高親和性結合の応用に適用
されるSELEX法は、結合親和性および選択性の所望される基準のいずれかを実質
的に達成するために、同じ一般的な選択的シェーマを使用する、候補オリゴヌク
レオチドの混合物からの選択および結合、分離および増幅の段階的な反復を含む
。SELEX法は核酸の混合物から開始し、好ましくはランダムか配列のセグメント
を含み、結合に好ましい条件の下で標的と混合物を結合させること、標的分子に
特異的に結合しているそれらの核酸から非結合核酸を分離すること、核酸-標的
複合体を解離すること、核酸のリガンド増加混合物（ligand-enriched mixture
）を産生するために核酸-標的複合体から解離された核酸を増幅すること、そし
て標的分子に対する高い特異性を有する高親和性核酸リガンドを産生するために
できるだけ多くの周期を介して結合、分離、解離および増幅の段階を反復するこ
と、の段階を含む。
【００３１】 SELEX法は、化学的化合物としての核酸が形、大きさおよび配置の広いアレイ
を形成できることを証明し、結合およびその他の機能に関して生物学的体系にお
ける核酸により示されるものよりかなり広範なレパートリーが可能であることが
、本発明により認識されている。
【００３２】 基本的なSELEX法は、多くの特異的な対象を遂行するために修飾されている。
例えば、1992年10月14日に出願された米国特許出願シリアルNo. 07/960,093は今
では放棄されており、同じ題“Method for Selecting Nucleic Acids on the Ba
sis of Structure,”である米国特許No. 5,707,796は、湾曲DNA（bent DNA）な
どの特異的な構造的特徴を用いて核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と共に
SELEX過程の使用を記載する。米国特許出願シリアルNo. 08/123,935は1993年9月
17日に出願され、“Photoselection of Necleic Acid Ligands,”と題されたが
、今では放棄され、米国特許No. 5,763,177および米国特許No. 6,001,577は両方
とも“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photose
lection of Necleic Acid Ligands and Solution SELEX,”と題されて、標的分
子を結合および／あるいは光架橋（photocrosslinking）および／あるいは光不
活性化（photoinactivate）できる光反応性基（photoreactive groups）を含有
する核酸リガンドを選択するためのSELEX基本法を記載する。米国特許No. 5,580
,737は“High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between The
ophylline and Caffeine,”と題され、Counter-SELEXと呼ばれる、非ペプチド性
でありうる密接に関係する分子を識別できる高い特異性の核酸リガンドを同定す
るための方法を記載する。米国特許No. 5,567,588は“Systematic Evolution of
Ligands by EXponential Enrichment: Solution SELEX,”と題され、標的分子
に高いおよび低い親和性を有するオリゴヌクレオチドを高度に効率的に分離する
ことを達成するSELEX基本法を記載する。
【００３３】 SELEX法は、改善されたin vivoでの安定性あるいは改善された輸送特性などの
、リガンド上の改善された特性を与える修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核
酸リガンドの同定を含む。そのような修飾の例は、リボースおよび／あるいはリ
ン酸および／あるいは塩基の位置での化学的置換を含む。修飾ヌクレオチドを含
有するSELEX過程同定核酸リガンドは、ピリミジンの5-および2'-位にて化学的に
修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する“High
Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides,”と題さ
れる米国特許No. 5,660,985に記載される。米国特許No. 5,580,737,上記は、2'-
アミノ（2'-NH2）、2'-fluoro（2'-F）、および／あるいは2'-メトキシ（2'-OMe
）を用いて修飾される１つあるいはそれ以上のヌクレオチドを含有する高い特異
性を有する核酸リガンドを記載する。“Novel Method of Preparation of Known
and Novel 2' Modified Nucleotidos by Intramolecular Nucleophilic Displa
cement,”と題され、1994年6月22日に出願された米国特許出願シリアルNo. 08/2
64,029は、様々な2'-修飾ピリミジンを含有するヌクレオチドを記載する。
【００３４】 SELEX法は、それぞれ“Systematic Evolution of Ligands by EXponential En
richment: Chimeric SELEX,”と題される米国特許No. 5,637,459および“System
atic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Blended SELEX,”と
題される米国特許No. 5,683,867に記載されるように、選択されたオリゴヌクレ
オチドとその他に選択されたオリゴヌクレオチドおよび非ヌクレオチドの機能単
位を結合させることを含む。これらの出願は、形およびその他の特性の広範なア
レイの結合、および他の分子の所望される特性を有するオリゴヌクレオチドの効
率的な増幅および複製特性を与える。
【００３５】 さらにSELEX法は、“Nucleic Acid Ligand Complexes”と題される米国特許No
. 6,011,020に記載されるように診断的あるいは治療的な複合体において、脂肪
親和性化合物あるいは非免疫原性、高分子量化合物と選択された核酸リガンドを
結合させることを含む。基本的SELEX手順の修飾を記載する各々の上記の特許出
願は、その全体を参考文献によって本明細書中に特に援用される。
【００３６】 SELEX過程を使用してHGFおよびc-metに対する核酸リガンドを得ることは、本
発明の対象である。
【００３７】 HGFおよびc-metの阻害剤として作用する核酸リガンドを得ることは、本発明の
さらなる対象である。
【００３８】 HGFおよびc-metが関係する腫瘍形成状態のための治療的および診断的薬剤を提
供することは、本発明のさらなる対象である。
【００３９】 高血圧、動脈硬化、心筋梗塞、および慢性関節リウマチを診断および治療する
ためにHGFおよびc-metに対する核酸リガンドを使用することも、本発明のさらな
る対象である。
【００４０】 HGFに対する核酸リガンドを単独で、あるいはVEGFおよび／あるいはbFGF、お
よび／あるいはもしかするとその他の新血管形成因子、を阻害するその他の核酸
リガンドと共に使用することは、本発明のまさにさらなる対象である。
【００４１】 特定のインテグリンに対して高い特異性と親和性を有して結合する核酸リガン
ドを同定するために使用できる方法を提供することも、本発明の対象である。
【００４２】 特定のインテグリンがその同起源のリガンドを結合する能力を阻害するそのイ
ンテグリンに対する核酸リガンドを得ることは、本発明のさらなる対象である。
【００４３】 血栓症、腫瘍新血管形成、腫瘍細胞遊走、増殖性眼疾患、慢性関節リウマチ、
乾癬、骨粗鬆症、および再狭窄を調節するための医薬的組成物を阻害するインテ
グリンを得ることは、本発明のさらなる対象である。
【００４４】 深静脈および動脈血栓の非侵襲性検出のための画像化薬剤を得ることも、本発
明のさらなる対象である。
【００４５】 発明の要約 ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔに対する核酸リガンドを産生する方法が提供される。こ
の方法はリガンド産生にＳＥＬＥＸ法を使用する。本発明により提供されるＨＧ
Ｆ及びｃ−ｍｅｔに対する核酸リガンドは、数多くの疾患の治療薬及び診断薬と
して有用である。
【００４６】 インテグリン類、特にβ3インテグリン類に対する核酸リガンドを産生する方
法も提供される。この方法はリガンド産生にＳＥＬＥＸ法を使用する。特定の態
様は、αVβ3とαIIbβ3の両方の核酸リガンド阻害剤の単離について説明する。
この核酸リガンド阻害剤は２’−フルオロ−ピリミジンＲＮＡ配列から誘導され
、αVβ3に対する高親和性結合について選択された。修飾された核酸リガンドの
１つは、ビトロネクチン又はフィブリノーゲンのいずれか一方の精製インテグリ
ン類の両方への in vitro における結合を阻害することが示される。この核酸リ
ガンドは、静脈血栓症の動物モデルにおいて、安定及び活性化した血小板の両方
の表面へ同等の親和性で結合し、前形成された血塊の部位に蓄積する。
【００４７】 本発明により提供されるインテグリン類に対する核酸リガンドは、血栓症及び
癌を含む数多くの疾患の治療薬として有用である。本発明の核酸リガンドはまた
血栓症の診断薬としても有用である。
【００４８】 好ましい態様の詳細な説明 核酸リガンドを同定するのに本明細書で利用される中心的な方法は、ＳＥＬＥ
Ｘ法［Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment（指数的
濃縮によるリガンドの系統進化法）の頭字語］と呼ばれる。ＨＧＦ及びｃ−ｍｅ
ｔに対するリガンドを同定することへ適用されるものとして、この方法は、ａ）
核酸の候補混合物をＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔ、又はＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔに対応す
る発現されたドメイン又はペプチドと接触させる工程；ｂ）ＨＧＦ又はｃ−ｍｅ
ｔに対する親和性に基づいて、前記候補混合物のメンバーを分画する工程；及び
ｃ）選択された分子を増幅して、ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔに対する結合について相
対的により高い親和性を有する核酸配列について濃縮された核酸の混合物を産生
する工程を含む。インテグリン類を同定することへ適用されるものとして、この
方法は、ａ）核酸の候補混合物をインテグリン類、又はインテグリン類に対応す
る発現されたドメイン又はペプチドと接触させる工程；ｂ）インテグリン類に対
する親和性に基づいて、前記候補混合物のメンバーを分画する工程；及びｃ）選
択された分子を増幅して、インテグリン類に対する結合について相対的により高
い親和性を有する核酸配列について濃縮された核酸の混合物を産生する工程を含
む。
【００４９】 定義 本発明の側面について述べるのに本明細書では様々な用語が使用される。本発
明の構成内容に関する説明の明確化に役立てるために、以下の定義を提供する： 本明細書で使用されるように、「核酸リガンド」は、ターゲットに対して所望
される作用を有する、非天然に存在する核酸である。核酸リガンドはしばしば「
アプタマー」と呼ばれる。アプタマーという用語は、本出願を通して核酸リガン
ドと相互交換可能的に使用される。所望される作用には、限定しないが、ターゲ
ットに結合すること、ターゲットを触媒的に変化させること、ターゲット又はタ
ーゲットの機能活性を修飾／変化させる仕方でターゲットと反応すること、自殺
阻害剤のようにターゲットへ共有結合すること、ターゲットと他の分子との反応
を促進することが含まれる。好ましい態様では、この作用はターゲット分子に特
異的な結合親和性であり、そのようなターゲット分子は、ワトソン／クリック塩
基対合や三重らせん結合に主に依拠する機序を介して核酸リガンドに結合するポ
リヌクレオチド以外の三次元化学構造体であり、ここで核酸リガンドはターゲッ
ト分子により結合される既知の生理学的機能を有する核酸ではない。本発明では
、ターゲットはＨＧＦ、ｃ−ｍｅｔ及びインテグリン類、又はそれらの部分であ
る。核酸リガンドには、以下の工程を含んでなる方法により核酸の候補混合物か
ら同定される核酸が含まれる（前記核酸リガンドはある一定のターゲットのリガ
ンドである）：（ａ）候補混合物をターゲットと接触させる工程（ここで、候補
混合物に比べてターゲットに対して増加した親和性を有する核酸が候補混合物の
残りから分画され得る）；（ｂ）増加した親和性の核酸を候補混合物の残りから
分画する工程；及び（ｃ）増加した親和性の核酸を増幅して、リガンド濃縮され
た核酸の混合物を産生する工程。
【００５０】 本明細書で使用されるように、「候補混合物」は、所望のアプタマーが選択さ
れる、様々な配列をもった核酸の混合物である。候補混合物の供給源は、天然に
存在する核酸又はそのフラグメント、化学合成した核酸、酵素的に合成した核酸
、又は上記技術の組み合わせにより作られる核酸に由来し得る。好ましい態様で
は、それぞれの核酸は、ランダム化領域の周囲に、増幅法を促進する固定配列を
有する。
【００５１】 本明細書で使用されるように、「核酸」は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＲＮ
Ａのいずれか、及びその化学修飾物を意味する。修飾には、限定しないが、追加
の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、及び流動性を核酸リガンドの塩基又
は核酸リガンド全体に取込む他の化学基を提供するものが含まれる。そのような
修飾には、限定しないが、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリ
ン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５
−ヨード−ウラシルの置換；骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジン及び
イソグアニジンのような、稀な塩基対合の組み合わせ、等が含まれる。修飾には
、キャッピングのような３’及び５’修飾も含まれる。
【００５２】 「ＳＥＬＥＸ」法には、所望されるやり方（例えばタンパク質への結合）でタ
ーゲットと相互作用する核酸リガンドを選択することを、この選択された核酸の
増幅と組み合わせることが含まれる。この選択／増幅工程のサイクルを選択的に
繰り返すことにより、ごく多数の核酸を含有するプールから、ターゲットと最も
強く相互作用する１つ又は少数の核酸を選択することが可能になる。選択／増幅
法のサイクルは選択される目標が達成されるまで続けられる。本発明では、ＳＥ
ＬＥＸ法が、ＨＧＦ、ｃ−ｍｅｔ及びインテグリン類、又はそれらの部分に対す
る核酸リガンドを得るために利用される。ＳＥＬＥＸ法については、ＳＥＬＥＸ
特許出願において説明されている。
【００５３】 「ＳＥＬＥＸターゲット」又は「ターゲット」は、それに対するリガンドが所
望される、関心対象の化合物又は分子を意味する。ターゲットは、タンパク質、
ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウ
イルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素
、増殖因子等であり得て、制限がない。本出願では、ＳＥＬＥＸターゲットはＨ
ＧＦ、ｃ−ｍｅｔ及びインテグリン類である。特に、本発明出願のＳＥＬＥＸタ
ーゲットには、精製されたインテグリン類、ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔ、及びそれら
のフラグメント、及びＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔを含んでなる短ペプチド又は発現タ
ンパクのドメインが含まれる。さらにターゲットトして含まれるのは、ＨＧＦ又
はｃ−ｍｅｔの部分と他のタンパク質を含んでなる融合タンパク質である。
【００５４】 本明細書で使用されるように、「固形支持体」は、共有結合か非共有結合のい
ずれかを介して分子が結合され得る任意の表面として定義される。これには、限
定しないが、膜、マイクロタイタープレート、磁性ビーズ、帯電紙、ナイロン、
ラングミュア・ブロジェット膜、機能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴ
ＦＥ、ポリスチレン、ガリウム砒素、金、及び銀が含まれる。アミノ、カルボキ
シル、チオール又はヒドロキシルのような官能基をその表面に取込ませることが
可能である、当技術分野で知られている他の材料も考慮される。これには、限定
しないが、球状の表面及び溝入りの表面を含む、任意のトポロジーを有する表面
が含まれる。
【００５５】 本明細書で使用されるように、「ＨＧＦ」は、肝細胞増殖因子／細胞分散因子
を意味する。これには、精製された肝細胞増殖因子／細胞分散因子、肝細胞増殖
因子／細胞分散因子のフラグメント、肝細胞増殖因子／細胞分散因子の化学合成
フラグメント、肝細胞増殖因子／細胞分散因子の誘導体又は突然変異バージョン
、及び肝細胞増殖因子／細胞分散因子及び他のタンパク質を含んでなる融合タン
パク質が含まれる。本明細書で使用される「ＨＧＦ」には、ヒト以外の種から単
離される肝細胞増殖因子／細胞分散因子も含まれる。
【００５６】 本明細書で使用されるように、「ｃ−ｍｅｔ」は、ＨＧＦの受容体を意味する
。これには、精製された受容体、受容体のフラグメント、受容体の化学合成フラ
グメント、受容体の誘導体又は突然変異バージョン、及びその受容体及び他のタ
ンパク質を含んでなる融合タンパク質が含まれる。本明細書で使用される「ｃ−
ｍｅｔ」には、ヒト以外の種から単離されるＨＧＦ受容体も含まれる。
【００５７】 本明細書で使用されるように、「インテグリン」はあらゆるインテグリンを意
味する。これには、精製されたインテグリン類、インテグリン類のフラグメント
、インテグリン類の化学合成フラグメント、インテグリンの誘導体又は突然変異
バージョン、及びインテグリン及び他のタンパク質を含んでなる融合タンパク質
が含まれる。本明細書で使用される「インテグリン類」には、ヒト以外の種から
単離されるインテグリン類も含まれる。
【００５８】 本出願を通して様々な参考文献が引用されることに留意すること。本明細書に
引用されるどの参考文献もそのまま特別に組込まれる。
【００５９】 ＳＥＬＥＸ 好ましい態様では、本発明の核酸リガンドがＳＥＬＥＸ法から導かれる。ＳＥ
ＬＥＸ法については、「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法」と題して、現
在放棄された、米国特許出願第０７／５３６，４２８号、「核酸リガンド」と題
した米国特許第５，４７５，０９６号、及び「核酸リガンドの同定法」と題した
米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３号も参照のこと）に記
載されている。これらの出願は、いずれも参照により特別に本明細書に組込まれ
、ＳＥＬＥＸ特許出願と総称される。
【００６０】 ＳＥＬＥＸ法は、核酸分子であり、それぞれユニーク配列を有し、及びそのそ
れぞれが所望のターゲット化合物又は分子へ特異的に結合する特性を有する、一
群の産物を提供する。ターゲット分子は、好ましくはタンパク質であるが、特に
、炭水化物、ペプチドグリカン、及び多種多様な低分子も包含し得る。ＳＥＬＥ
Ｘ法はまた、細胞表面又はウイルスのような生物学的構造体を、その生物学的構
造体の必須部分である分子との特異的な相互作用を介してターゲットとするため
にも使用され得る。
【００６１】 その最も基本的な形態では、ＳＥＬＥＸ法は以下の系列の工程により定義され
得る： １）様々な配列の核酸の候補混合物を製造する。一般に、この混合物には、固
定配列の領域（即ち、候補混合物のメンバーのそれぞれが同じ位置に同一の配列
を含有する）とランダム化配列の領域が含まれる。固定配列の領域は、（ａ）以
下に記載の増幅工程を促進する；（ｂ）ターゲットに結合することが知られてい
る配列を模倣する；又は（ｃ）一定の構造配置をした核酸の候補混合物における
濃度を高めることのいずれかのために選択される。ランダム化配列は、全体にラ
ンダム化され得る（即ち、任意の位置にある塩基を見出す確率は１／４である）
か、又は部分的にのみランダム化され得る（即ち、任意の位置にある塩基を見出
す確率を０〜１００％の任意のレベルで選択し得る）。
【００６２】 ２）この候補混合物を、ターゲットと候補混合物のメンバーとが結合するのに
好ましい条件の下で、選択されたターゲットと接触させる。上記の状況下で、タ
ーゲットと候補混合物の核酸との相互作用により、ターゲットとそのターゲット
への最も強い親和性を有する核酸との核酸−ターゲット対が形成されると考えら
れる。
【００６３】 ３）ターゲットに対する最も高い親和性を有する核酸を、ターゲットへより低
い親和性を有する核酸から分画する。最高親和性の核酸に相当する配列はごくわ
ずかな数しか（１分子の核酸しかない可能性もある）候補混合物に存在しないの
で、候補混合物にある有意な量の核酸（約５〜５０％）が分画の間に保持される
ように、分画の判定基準を設定することが概して望ましい。
【００６４】 ４）次いで、ターゲットに対する相対的により高い親和性を有するものとして
分画の間に選択された核酸を増幅し、ターゲットに対する相対的により高い親和
性を有する核酸が濃縮された新たな候補混合物を創出する。
【００６５】 ５）上記の分画及び増幅工程を繰り返すことによって、新たに形成される候補
混合物に含まれるユニーク配列はどんどん少なくなり、ターゲットに対する核酸
の平均親和性強度は概して増加する。極端な場合、ＳＥＬＥＸ法は、元の候補混
合物由来の核酸を代表する、ターゲット分子に対して最高の親和性を有するユニ
ーク核酸を１つ又は少数含有する候補混合物を産生する。
【００６６】 基本のＳＥＬＥＸ法は多数の特別な目的を達成するために変更されている。例
えば、いずれも「構造に基づいた核酸の選択法」と題した米国特許出願第０７／
９６０，０９３号（１９９２年１０月１４日出願、現在放棄された）と米国特許
第５，７０７，７９６号は、ゲル電気泳動と組み合わせて、折れ曲がり（bent）
ＤＮＡのような特定の構造特徴をもった核酸分子を選択するためのＳＥＬＥＸ法
の使用を説明する。「核酸リガンドの光選択」と題した米国特許出願第０８／１
２３，９３５号（１９９３年９月１７日出願、現在放棄された）と、いずれも「
指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥ
Ｘ」と題した米国特許第５，７６３，１７７号及び米国特許第６，０１１，５７
７号は、ターゲット分子に結合する及び／又は光架橋結合する及び／又はそれを
光不活性化することが可能な光反応基を含有する核酸リガンドを選択するための
ＳＥＬＥＸをベースとした方法を説明する。「テオフィリンとカフェインを判別
する高親和性核酸リガンド」と題した米国特許第５，５８０，７３７号は、近縁
の分子を判別し得る、カウンターＳＥＬＥＸと命名された、高度に特異的な核酸
リガンドを同定する方法を説明する。「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法
：溶液ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，５６７，５８８号は、ターゲット分
子に対する高親和性と低親和性を有するオリゴヌクレオチドの高度に効率的な分
画を達成する、ＳＥＬＥＸをベースとした方法を説明する。「ＨＩＶ−ＲＴ及び
ＨＩＶ−１ Ｒｅｖに対する核酸リガンド」と題した米国特許第５，４９６，９
３８号は、ＳＥＬＥＸが実施された後で改善された核酸リガンドを入手する方法
を説明する。「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：ケミ（Ｃｈｅｍｉ）−
ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドをそのター
ゲットへ共有結合させる方法を説明する。
【００６７】 ＳＥＬＥＸ法には、改善された in vivo 安定性又は改善されたデリバリーの
特徴のような、改善された特徴をリガンドに与える修飾されたヌクレオチドを含
有する高親和性核酸リガンドの同定が含まれる。そのような修飾の例には、リボ
ース及び／又はリン酸及び／又は塩基の位置での化学的な置換が含まれる。修飾
されたヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸで同定された核酸リガンドが、「修
飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」と題した、米国特許第５，６
６０，９８５号に説明されている。これは、ピリミジンの５−及び２’位で化学
的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて説明
する。米国特許第５，６３７，４５９号、同上は、２’−アミノ（２’−ＮＨ2
）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ
）で修飾された１つ又はそれ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸
リガンドについて説明する。「分子内求核置換による既知及び新規２’修飾ヌク
レオシドの新規製造法」と題した、米国特許出願第０８／２６４，０２９号（１
９９４年６月２２日出願）は、様々な２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌ
クレオチドについて説明する。
【００６８】 ＳＥＬＥＸ法には、「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：キメラのＳＥ
ＬＥＸ」と題した米国特許第５，６３７，４５９号と「指数的濃縮によるリガン
ドの系統進化法：混合したＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，６８３，８６７
号にそれぞれ記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択され
たオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチドの機能ユニットと複合させるこ
とが含まれる。上記の応用により、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状や他の特
性、並びに効率的な増幅や複製の特性を、他の分子の所望される特性と組み合わ
せることが可能になる。
【００６９】 米国特許第５，４９６，９３８号には、ＳＥＬＥＸが実施された後で改善され
た核酸リガンドを入手する方法が説明されている。「ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−
１ Ｒｅｖに対する核酸リガンド」と題したこの特許は、そのまま参照により特
別に本明細書へ組込まれる。
【００７０】 核酸の診断用の使用において遭遇する１つの潜在的な問題は、オリゴヌクレオ
チドがそのホスホジエステル形態では、所望の効果が発露されないうちに、エン
ドヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外の酵素により
体液中で速やかに分解され得るということである。核酸リガンドの in vivo 安
定性を高めるか、又は核酸リガンドのデリバリーを強めるか又は仲介するために
核酸リガンドのある種の化学修飾をなし得る。例えば、「修飾ヌクレオチドを含
有する高親和性核酸リガンド」といずれも題した、米国特許出願第０８／１１７
，９９１号（１９９３年９月８日出願、現在放棄された）及び米国特許第５，６
６０，９８５号、さらに「転写フリーのＳＥＬＥＸ」と題した米国特許出願第０
９／３６２，５７８号（１９９９年７月２８日出願）を参照のこと。これらはい
ずれも参照により特別に本明細書に組込まれる。本発明において考慮される核酸
リガンドの修飾には、限定しないが、核酸リガンドの塩基又は核酸リガンド全体
に対して、追加の電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電相互作用、及び流動性
を取込む他の化学基を提供するものが含まれる。そのような修飾には、限定しな
いが、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミン
における修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシル
の置換、骨格修飾、ホスホロチオエート又はリン酸アルキルの修飾、メチル化、
イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンのような、稀な塩基対合の組み合わ
せ、等が含まれる。修飾には、キャッピングのような３’及び５’修飾も含まれ
る。本発明の好ましい態様では、核酸リガンドは、ピリミジン残基の糖部分上で
２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾されているＲＮＡ分子である。
【００７１】 修飾はＳＥＬＥＸの前か又は後の修飾であり得る。ＳＥＬＥＸ法の前修飾は、
そのＳＥＬＥＸターゲットに対する特異性と改善された in vivo 安定性の両方
を有する核酸リガンドを産生する。２’−ＯＨ核酸リガンドに対してなされるＳ
ＥＬＥＸ後修飾は、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、改善さ
れた in vivo 安定性をもたらし得る。他の修飾も当業者に知られている。その
ような修飾は、ＳＥＬＥＸ法の後（すでに同定された非修飾リガンドの修飾）で
か、又はＳＥＬＥＸ法への組込みによりなされ得る。
【００７２】 ある態様では、選択された波長を有する光で核酸リガンドに照射すると、核酸
リガンドがそのターゲットと共有結合するようになる。そのような核酸リガンド
を入手するための方法が「核酸リガンドの光選択」と題した米国特許出願第０８
／１２３，９３５号（１９９３年９月１７日出願、現在放棄された）と、いずれ
も「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥ
ＬＥＸ」と題した米国特許第５，７６３，１７７号及び米国特許第６，０１１，
５７７号に詳しく説明されている。それらはいずれもそのまま参照により特別に
本明細書に組込まれる。
【００７３】 本発明の核酸リガンドは、上記に概説され、そのまま参照により本明細書に組
みこまれるＳＥＬＥＸ出願において完全に可能とされるＳＥＬＥＸ法を介して製
造される。
【００７４】 ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔへの核酸リガンド ＳＥＬＥＸ法は、精製されたＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔ、又はそれらのフラグメン
トをターゲットとして使用して実施され得る。他のやり方では、完全長のＨＧＦ
又はｃ−ｍｅｔ、又はＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔの分離したドメインが、好適な発現
系で産生され得る。他のやり方では、ＳＥＬＥＸ法は、ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔに
見出される配列を包含する合成ペプチドをターゲットとして使用して実施され得
る。最適な核酸リガンドに必要とされるアミノ酸の正確な数を決定することは、
当業者にとって定常的な実験である。
【００７５】 好ましい態様では、ＳＥＬＥＸ法が固形支持体に付いたＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔ
を使用して実行される。次いで、一本鎖ＲＮＡ分子の候補混合物をこの固形支持
体と接触させる。特に好ましい態様では、一本鎖ＲＮＡ分子は、Ｃ及びＵ残基上
に、２’−ＯＨではなく２’フルオロ修飾を有する。選択された温度での前決定
された時間のインキュベーション後、固形支持体を洗浄し、非結合性の候補核酸
リガンドを除去する。次いで、ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔタンパク質へ結合する核酸
リガンドを溶液へ放出させた後、逆転写酵素により逆転写して、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅させる。次いで、この増幅された候補混合物を
使用して、ＳＥＬＥＸ法の次ラウンドを開始する。
【００７６】 上記の態様では、固形支持体はニトロセルロースフィルターであり得る。固定
化されたＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔと相互作用しない候補混合物中の核酸は、真空を
かけることによりこのニトロセルロースフィルターから除去し得る。他の態様で
は、ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔターゲットを乾燥ニトロセルロースフィルター上に吸
着させ、緩衝液において洗浄することによって、ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔへ結合し
ない候補混合物中の核酸を除去する。他の態様では、固形支持体は、例えばポリ
スチレンからなる、マイクロタイタープレートである。
【００７７】 さらに他の態様では、ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔが、そのまま参照により本明細書
に組込まれる、「先端切りＳＥＬＥＸ法」と題した、米国特許出願第０９／２７
５，８５０号（１９９９年３月２４日出願）に記載される、トランケートＳＥＬ
ＥＸのターゲットとして使用される。
【００７８】 好ましい態様では、このように得られた核酸リガンドがＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔ相
互作用を阻害するその能力についてアッセイされる。１つの態様では、このこと
は細胞移動アッセイを実施することによって達成される。Ａ５４９肺癌細胞のよ
うなある種の細胞型は、ＨＧＦの存在下で、マトリゲル（Matrigel）コートされ
たフィルターインサート（ベクトンディキンソン）を通過する増加した移動を示
す。このように、ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔ核酸リガンドの存在下でのＨＧＦ活性の
阻害の程度が、ＨＧＦの存在下でフィルターを通過して移動した細胞の数を決定
することによってアッセイされ得る。
【００７９】 ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔへの核酸リガンドを使用して疾患を治療及び診断するため
の方法及び組成物 高血圧、動脈硬化症、心筋梗塞、及び慢性関節リウマチにおいて、ｃ−ｍｅｔ
及びＨＧＦの上昇レベルが観察されることから、核酸リガンドは、これらの疾患
に有用な治療薬及び診断薬として役に立つだろう。ある態様では、上記の疾患の
１つを罹患している個体へ、ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔの阻害性核酸リガンドが製剤
的に許容される賦形剤とともに投与される。ある態様では、体液の存在下で、核
酸リガンドへ増加した安定性を賦与するために、これら核酸リガンドの修飾がな
される。そのような修飾については上記に引用したＳＥＬＥＸ出願において説明
され、可能とされている。
【００８０】 他の態様では、予後及び診断の情報を得る目的で上記タンパク質の個体におけ
るレベルを測定するために、ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔへの核酸リガンドが使用され
る。ｃ−ｍｅｔ及びＨＧＦの上昇したレベルは、肝臓、乳房、膵臓、肺、腎臓、
膀胱、卵巣、脳、前立腺、及び胆嚢における腫瘍に関連している。ＨＧＦ及びｃ
−ｍｅｔの上昇したレベルは、骨髄腫にも関連している。
【００８１】 他の態様では、ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔ相互作用を阻害する核酸リガンドが、例え
ば血管新生及び有糸分裂生起を阻害することによって、腫瘍形成を阻害するため
に使用される。
【００８２】 本発明の１つの態様では、腫瘍の転移及び血管新生を阻害するために、ＨＧＦ
への核酸リガンドがＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）及び／又はｂＦＧＦ（塩
基性繊維芽細胞増殖因子）への核酸リガンドとともに使用される。多数の核酸リ
ガンドの使用は、腫瘍抑制に対して相加又は相乗の効果を及ぼす可能性がある。
ＶＥＧＦを阻害する核酸リガンドは、いずれも「血管内皮細胞増殖因子への高親
和性オリゴヌクレオチド」と題した米国特許第５，８４９，４７９号、米国特許
第５，８１１，５３３号、及び米国特許出願第０９／１５６，８２４号（１９９
８年９月１８日出願）に記載され、これらはいずれもそのまま参照により特別に
本明細書に組込まれる。ＶＥＧＦへの核酸リガンドも、いずれも「血管内皮細胞
増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体」と題した米国特許第５，８５９，２
２８号、米国特許第６，０５１，６９８号、米国特許出願第０８／８７０，９３
０号（１９９７年６月６日出願）、及び米国特許出願第０９／２５４，９６８号
（１９９９年３月１６日出願）に記載され、これらはいずれもそのまま参照によ
り特別に本明細書に組込まれる。ｂＦＧＦへの核酸リガンドは、いずれも「塩基
性繊維芽細胞増殖因子への高親和性ＲＮＡリガンド」と題した米国特許第５，６
３９，８６８号、及び米国特許出願第０８／４４２，４２３号（１９９５年５月
１６日出願）に記載され、これらはいずれもそのまま参照により特別に本明細書
に組込まれる。
【００８３】 インテグリン類への核酸リガンド ＳＥＬＥＸ法は、精製されたインテグリン類、又はそれらのフラグメントをタ
ーゲットとして使用して実施され得る。他のやり方では、完全長のインテグリン
類、又はインテグリン類の分離したドメインが、好適な発現系で産生され得る。
他のやり方では、ＳＥＬＥＸ法は、インテグリンに見出される配列を包含する合
成ペプチドをターゲットとして使用して実施され得る。最適な核酸リガンドに必
要とされるアミノ酸の正確な数を決定することは、当業者にとって定常的な実験
である。
【００８４】 好ましい態様では、ＳＥＬＥＸ法がポリスチレンビーズに付いたインテグリン
類を使用して実行される。次いで、一本鎖ＲＮＡ分子の候補混合物をこのビーズ
と接触させる。特に好ましい態様では、一本鎖ＲＮＡ分子は、Ｃ及びＵ残基上に
、２’−ＯＨではなく２’フルオロ修飾を有する。選択された温度での前決定さ
れた時間のインキュベーション後、ビーズを洗浄し、非結合性の候補核酸リガン
ドを除去する。次いで、インテグリンへ結合する核酸リガンドを溶液へ放出させ
た後、逆転写酵素により逆転写して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し
て増幅させる。次いで、この増幅された候補混合物を使用して、ＳＥＬＥＸ法の
次ラウンドを開始する。実施例５は、インテグリン類をターゲットとして使用し
てＳＥＬＥＸ法を実施する１つの可能な仕方を示す。
【００８５】 好ましい態様では、このように得られた核酸リガンドが、インテグリンのその
コグネイトリガンドとの相互作用を阻害する能力についてアッセイされる。１つ
の態様では、このことは、先ずマイクロタイタープレートを適当なインテグリン
（類）でコートすることによって達成される。次いで、ビトロネクチン又はフィ
ブリノーゲンのようなインテグリンへのリガンドをビオチン化し、アッセイされ
る核酸リガンドの存在下で、コートされたインテグリンと接触させる。好適な時
間のインキュベーションの後で、マイクロタイタープレートを洗浄し、ストレプ
タビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートに続いて、ｐ−ニトロフェニ
ルリン酸のようなアルカリホスファターゼの比色定量基質を加えることによって
、インテグリンへ結合するビトロネクチン又はフィブリノーゲンの量を定量する
。このように、プレートの各ウェルにおけるアルカリホスファターゼのシグナル
は、結合したインテグリンとそのコグネイトリガンドとの相互作用の阻害剤とし
ての核酸リガンドの効力に反比例する。
【００８６】 他の態様では、核酸リガンドが、ヒト血小板へ結合することをアッセイとして
使用して分析される。このことは、例えば、当技術分野で知られている数多くの
技術により核酸リガンドを蛍光標識することによって、なし得る。次いで、蛍光
性の核酸リガンドを血小板と接触させ、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）を使
用して、核酸リガンドの量を定量する。
【００８７】 本発明の核酸リガンドの分布は、in vivo でも試験され得る。ある態様では、
核酸リガンドが、放射造影技術において使用される放射標識で標識される。例え
ば、核酸リガンドは、当技術分野で知られている数多くの技術の１つを使用して
、同位体99mＴｃにコンジュゲートされ得る。次いで、この放射標識された核酸
リガンドが静脈血栓症の動物モデルにおいて試験され得る。例えば、先ず結紮に
より in situ で静脈を単離し、次いでこの静脈へヒト血小板リッチな血漿とヘ
パリンを注入して血塊の形成を誘発することによって、ウサギ静脈においてヒト
の血塊を産生し得る。次いで、この静脈を通る血流を再確立し、放射標識された
核酸リガンドを動物の血液供給へ導入する。次いで、放射標識核酸リガンドの分
布をウサギの組織において試験し、核酸リガンドが他の領域よりも、血塊に蓄積
したかどうかを判定し得る。
【００８８】 インテグリン類への核酸リガンドを使用して疾患を治療及び診断するための方法
及び組成物 本発明により提供される核酸リガンドは、治療薬及び診断薬として数多くの潜
在的な使用を有する。ある態様では、深在性静脈血栓症に罹患しやすい患者にお
いて血塊の形成を予防するために、血小板発現性インテグリン類とそのコグネイ
トリガンドとの相互作用を阻害する核酸リガンドが、製剤的に許容される賦形剤
とともに投与される。他の態様では、経皮的冠血管形成術の間とその後の急性血
栓形成を治療するために核酸リガンドが使用される。さらに他の態様では、不安
定狭心症又は心筋梗塞のような急性冠症候群を有する患者を治療するために本発
明の核酸リガンドが使用される。
【００８９】 他の態様では、血小板発現性インテグリン類への放射標識核酸リガンドが、大
手術を受ける予定であるか、又は重大な外傷を受けた個体へ投与される。そのよ
うな核酸リガンドは、大きな血小板凝集物が存在する体内の部位を示すことによ
って、血栓検出用の造影剤として機能し得る。体内の重要部位での放射標識によ
って血栓が検出されれば、（本発明の阻害性核酸リガンドでの治療を含む）抗凝
固薬及び血栓溶解治療薬を局所的に与え得る。そのような核酸リガンド造影剤を
使用することの利点は、予防的に投与されると、効率的な血塊形成がなければ内
出血が続くという害を引き起こす可能性がある抗凝固薬及び血栓溶解治療薬を、
危険な血栓を明確に有する個体へのみ投与し得ることである。さらに、これらの
治療薬は、あらゆる血栓の潜在部位へ有効成分が運ばれると期待してより高濃度
を血流へ注射するのではなく、核酸リガンドにより血栓が検出された部位に特定
して注射され得る。
【００９０】 αVβ3インテグリンへの核酸リガンドは、腫瘍の増殖及び転移を阻害するため
に使用され得る。それらはまた、限定しないが、糖尿病性網膜症、未熟の網膜症
、及び黄斑変性を含む眼球疾患を治療するために使用され得る。αVβ3核酸リガ
ンドが有用な治療薬となる他の疾患には、限定しないが、子宮内膜症、乾癬、慢
性関節リウマチ、卒中、骨粗鬆症、及び再狭窄が含まれる。
【００９１】 以下の実施例は説明のためだけに示される。それらは、決して本発明の特許請
求範囲を制限するものとして解釈されてはならない。
【００９２】
【実施例】
実施例１．ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔへの核酸リガンドの産生 材料と方法 「結果：ＨＧＦ」及び「結果：ｃ−ｍｅｔ」と題する以下の節では、以下の材
料及び方法を使用した。
【００９３】 タンパク質：ＳＥＬＥＸ法において使用したＨＧＦタンパク質とｃ−ｍｅｔ−
ＩｇＧ1−Ｈｉｓ6融合タンパク質、及びＫＤＲ−ＩｇＧ1−Ｈｉｓ6タンパク質は
、Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミネアポリス、ＭＮ）から購入した。ヒトｃ−ｍｅｔ−
ＩｇＧ1−Ｈｉｓ6融合タンパク質（アミノ末端からカルボキシル末端へ記載され
る）は、ｃ−ｍｅｔのα及びβ鎖の細胞外ドメインに由来する９３２個のアミノ
酸、Ｘａ因子の開裂部位、ヒトＩｇＧ1（Ｆｃドメイン）に由来する２３１個の
アミノ酸、及び（Ｈｉｓ）6タグからなる。このタンパク質は本文及び図面にお
いてｃ−ｍｅｔと呼ばれる。血管内皮細胞増殖因子の受容体であるＫＤＲを含有
する同様の融合タンパク質はＫＤＲと呼ばれる。
【００９４】 抗ＨＧＦモノクローナル抗体のＭＡＢ２９４はＲ＆Ｄシステムズ社から購入し
た。ヒトＩｇＧ1は、チャイニーズハムスター卵巣細胞からの安定した発現によ
り内製した。
【００９５】 ＳＥＬＥＸのテンプレート及びプライマー：Ｎ７又はＮ８系列の固定領域が隣
接する３０又は４０個のランダムヌクレオチドを担う標準ＳＥＬＥＸテンプレー
トと関連プライマー（図１）を（Fitzwater and Polisky (1996) Methods Enzym
ol. 267: 275-301）に記載のように使用した。トランケートＳＥＬＥＸは、「先
端切りＳＥＬＥＸ法」と題する、１９９９年３月２４日出願の米国特許出願第０
９／２７５，８５０号（そのまま参照により本明細書に組込まれる）に記載され
る、ＲＮアーゼＨ開裂プライマーを使用するハイブリダイゼーション法によって
なされた（図２）。
【００９６】 ＳＥＬＥＸ法：最初のＨＧＦ ＳＥＬＥＸ実験は、いずれもニトロセルロース
フィルター上で結合したＲＮＡからフリーのＲＮＡを分離することを含む、２種
の密接に関連した分画法によりなされた。従来のＳＥＬＥＸは、ターゲットタン
パク質とＲＮＡライブラリーをＨＢＳＭＣ緩衝液（ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水
、２５ｍＭ ｈｅｐｅｓ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ＋１ｍＭ Ｃ
ａＣｌ2，１ｍＭ ＭｇＣｌ2，ｐＨ７．４）において混合した後、真空下、ニト
ロセルロース上で濾過することを含む。真空を維持し、フィルターを緩衝液で洗
浄し、後続して真空解除とＲＮＡ抽出をする。スポットフィルターＳＥＬＥＸで
は、タンパク質を乾燥ニトロセルロース１３ｍｍフィルターにかけた後、数分間
吸着させ、次いで緩衝液Ｓ（ＨＢＳＭＣ緩衝液＋フィコール、ポリビニルピロリ
ドン、及びヒト血清アルブミン、各０．０２％）において３７℃で１０分間プレ
インキュベートして、非結合性のタンパク質を除去する。洗浄緩衝液を除去し、
次いで同じ緩衝液にＲＮＡライブラリーを加え、タンパク質が結合したフィルタ
ーとともにインキュベートする。このフィルターを新鮮な緩衝液中での繰り返し
インキュベーションにより洗浄した後、ＲＮＡ抽出をする。
【００９７】 ３０又は４０個、いずれかのヌクレオチドのランダム化領域配列を含有する２
’−フルオロ−ピリミジンＲＮＡ配列ライブラリー（図１）の１〜５ナノモルを
用いてＳＥＬＥＸを開始した。このＲＮＡライブラリーは、Ｋｌｅｎｏｗ伸張（
Sambrook, Fritsch et al. (1989) 3: B. 12）により産生された、対応する合成
ＤＮＡテンプレートから転写された。このＤＮＡテンプレートを、０．２５ｎＭ
テンプレート、０．５８μＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、各１ｍＭのＡＴＰ及
びＧＴＰ，各３ｍＭの２’−Ｆ−ＣＴＰ及び２’−Ｆ−ＵＴＰ，４０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１２ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ スペルミジン、
５ｍＭ ＤＴＴ，０．００２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，及び４（ｗ／ｖ）
％ポリエチレングリコールをそれぞれ含有する１ｍＬの反応液において、３７℃
で少なくとも４時間転写した。この完全長の転写産物を変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により精製した。放射標識ＲＮＡは、０．２ｎＭ ＡＴＰと１００
μＣｉのα−32Ｐ−ＡＴＰを含むこと以外は、上記のような転写反応により入手
した。他のやり方では、放射標識ＲＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニ
ューイングランドバイオラブズ）により触媒される、ＲＮＡの５’末端をα−32 Ｐ−ＡＴＰ（ＮＥＮ−デュポン）で標識することによって得られた。キナーゼ反
応のための５’−ＯＨ基を含有するＲＮＡを製造するには、転写反応液に５ｍＭ
グアノシンを含ませた。
【００９８】 従来のフィルターＳＥＬＥＸでは、放射標識ＲＮＡプールをＨＢＳＭＣ緩衝液
に懸濁し、それにＨＧＦタンパク質を加え、３７℃でラウンドにより３０分〜３
時間インキュベートした。次いで、結合緩衝液で前もって湿した０．４５μｍニ
トロセルロースフィルター（ミリポア）を通して、結合反応液を吸引濾過した。
このフィルターを、少なくとも５ｍＬのＨＢＳＭＣ緩衝液ですぐに洗浄した。そ
れぞれの結合反応につき、フィルターへのバックグラウンド結合の量を決定する
ために、タンパク質（−）の対照反応を併行して実施した。フィルター上に保持
されたＲＮＡの量をチェレンコフ計数により定量し、反応液へのインプット量と
比較した。フィルターに保持されたＲＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出
し、グリコーゲン１〜２μｇの存在下でのエタノール沈澱により単離した。
【００９９】 引き続き、単離したＲＮＡをトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−Ｒ
Ｔ，ライフサイエンス）のテンプレートとして使用して、ｃＤＮＡを得た。１０
０ピコモルの３’−プライマー（図１）をこのＲＮＡに加え、３分間７０℃で加
熱することによってアニールした後、氷上で冷やした。この５０μＬの反応液に
は、５Ｕ ＡＭＶ−ＲＴ，各０．４ｍＭのｄＮＴＰ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３），６０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2，及び１０
ｍＭ ＤＴＴが含まれ、これを４８℃で４５分インキュベートした。５’−及び
３’−プライマー（図１）を用いるＰＣＲによりこのｃＤＮＡを増幅し、生じた
ＤＮＡテンプレートを転写して、次のＳＥＬＥＸラウンドのＲＮＡを得た。
【０１００】 ラウンド３から始まる、所望されないニトロセルロース結合性配列の選択を最
少化するために、ターゲットタンパク質とインキュベートする前に、ニトロセル
ロースフィルターで前もってプールを浸漬した。この処理はバックグラウンド結
合をコントロールするのに奏効し、各ＳＥＬＥＸラウンドがポジティブなシグナ
ル／ノイズ比を有することを保証することに役立った。ＳＥＬＥＸの進展は、濃
縮されたプールのニトロセルロースフィルター結合分析によりモニターした（以
下参照）。
【０１０１】 トランケートＳＥＬＥＸは、「先端切りＳＥＬＥＸ法」と題する、１９９９年
３月２４日出願の米国特許出願第０９／２７５，８５０号（そのまま参照により
本明細書に組込まれる）に記載のハイブリダイゼーション法によって実施された
。簡潔に言うと、転写の間に２’−Ｆ−ＲＮＡプールを全体標識し、特定の開裂
プライマーを使用するＲＮアーゼＨにより開裂し、ＳＥＬＥＸプールから固定配
列を除去した（図２）。次いで、従来のフィルターＳＥＬＥＸ実験のように、こ
のＲＮＡをターゲットタンパク質のＨＧＦへ結合させ、回収した後、分画した。
次いで、回収されたＲＮＡをその３’末端でビオチン化し、ＲＮＡが転写された
、出発のＳＥＬＥＸプールから得られる一本鎖の完全長相補鎖ＤＮＡと、好適な
条件下で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、このＲＮＡ／ＤＮＡ複合体をスト
レプタビジン−コートされた磁気ビーズ上に捕捉し、十分洗浄して、非ハイブリ
ダイズＤＮＡを除去した。次いで、捕捉されたＲＮＡ／ＤＮＡ複合体中の結合し
たＤＮＡを熱変性により溶出させ、従来のＳＥＬＥＸ ＰＣＲプライマーを使用
して増幅させた。このサイクルを完了させるために、生成したＤＮＡを転写テン
プレートして使用し、ＲＮアーゼＨで開裂されるＲＮＡを産生し、これを次のト
ランケートＳＥＬＥＸラウンドに使用した。
【０１０２】 プレートＳＥＬＥＸでは、ポリスチレンウェルを４００μＬのブロッキング剤
において３７℃で６０分プレブロックした。ブロッキング剤を除去し、所望量の
ＲＮＡ／結合緩衝液１００μＬを加え、３７℃で６０分インキュベートした。分
画に使用される白色のポリスチレン分離ウェル（カタログ＃９６０−２９６５）
は、ＶＷＲ（デンバー、ＣＯ）からのものであった。ブロッキング剤のＩ−ブロ
ックとスーパーブロックは、それぞれＴｒｏｐｉｘ（ベドフォード、ＭＡ）とピ
アス（ロックフォード、ＩＬ）から購入した。前吸着を実施して、ウェル又はブ
ロッキング剤へ結合する可能性のある核酸を除去した。ランダムのラウンド１ラ
イブラリーは、ユニーク配列の損失を避けるために、プレートへ前吸着させなか
った。ｃ−ｍｅｔタンパク質をＨＢＳＭＣＫ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．
４，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ2，１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2）に希釈し、ウェルあたり１００μＬの希釈タンパク質を３７℃で６０
分インキュベートすることによって、ポリスチレンウェルに吸着させた。それぞ
れ３ｘ４００μＬのＨＩＴ緩衝液（ＨＢＳＭＣＫ，０．１％ Ｉ−ブロック、０
．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）アリコートでウェルを洗浄し、ブロッキング剤４０
０μＬにおいて、３７℃で６０分ブロックした。タンパク質が結合したウェルに
おいてＲＮＡ １００μＬを３７℃で６０分インキュベートすることによって、
ＳＥＬＥＸを開始した。ＲＮＡを除去し、ＨＩＴ緩衝液の４００μＬアリコート
でウェルを洗浄した。後半のラウンドでは、増加する洗浄回数を使用した。次い
で、４００μＬの水で２回ウェルを洗浄した。水１００μＬを加え、９５℃で５
分加熱することによって、ｃ−ｍｅｔへ結合したＲＮＡを溶出させ、氷上で冷や
した後に、逆転写した。
【０１０３】 ニトロセルロースフィルター結合：結合反応では、ＲＮＡ濃度を可能な限り低
く（１〜２０ｐＭ）保ち、タンパク質過剰の条件での平衡状態を確実にした。オ
リゴヌクレオチドを、結合緩衝液４３μＬにおいて様々な量のタンパク質ととも
に３７℃で１５分インキュベートした。それぞれの結合混合液３２マイクロリッ
トルを、吸引下、前もって湿した０．４５μｍニトロセルロース上に置いた。各
ウェルを結合緩衝液０．５ｍＬですぐに洗浄した。フィルター上に保持された放
射活性の量を造影によって定量した。タンパク質の不在下でフィルターへ結合し
た放射活性をバックグラウンド補正に使用した。各フィルタースポット上に保持
されたインプットオリゴヌクレオチドの比率を、対応するタンパク濃度の対数に
対してプロットした。非線形最小二乗法を使用して解離定数を得た（Ｋd；参考
文献：Jellinek, Lynott et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 112
27-31）。
【０１０４】 タンパク質及びＲＮＡの濃度を一定に保ち、競合剤の濃度を変化させる以外は
、標準結合曲線とほとんど同じようにして、競合剤の滴定曲線を作成した。競合
剤はまた、結合実験において一定濃度で加え、プールの結合アフィニティーを比
較する目的でストリンジェンシーを高めた。上記の実験では、競合剤の滴定曲線
からの結果に基づいて、競合剤の濃度を決定した。
【０１０５】 分子クローニングとＤＮＡの配列決定：濃縮されたプールから個別の配列を得
るために、最終ＳＥＬＥＸラウンド由来のＰＣＲ産物を、２種の平滑末端（blun
t-end）クローニングキット：パーフェクトリィ・ブラント（Perfectly blunt；
ノヴァゲン、マジソン、ＷＩ）又はＰＣＲ−スクリプト（ストラタジーン、ラジ
ョア、ＣＡ）を使用して、クローン化した。ＡＢＩプリズムビッグダイターミネ
ーターサイクル（Prism Big Dye Terminator Cycle）配列決定キット（パーキン
エルマー・アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ）を用いて、
クローンを配列決定した。自動化ＡＢＩシークエンサーから配列を得て、コンピ
ュータの並置と視察により、テキストファイルを整理して、分析した。
【０１０６】 境界の決定：（Jellinek, Green et al. (1994) Biochemistry. 33: 10450-6
）に記載の部分アルカリ加水分解の方法により、ＲＮＡアプタマーの５’及び３
’境界部分を決定した。
【０１０７】 細胞アッセイ：ＨＧＦ活性のアプタマー仲介性阻害を試験する in vitro 実験
を実施する経過では、標準的な細胞培養法を利用した。細胞移動アッセイでは、
単層のＡ５４９（肺癌）細胞を、２４穴プレートにおいて、マトリゲルコートさ
れたフィルターインサート（ベクトン・ディキンソン、フランクリンレイクス、
ＮＪ）の上面で増殖させた。細胞は、ＨＧＦを含有する増殖培地中に置かれたフ
ィルターの上面に付着する。２日後、細胞をフィルターの上面から物理的に除去
した。次いで、このフィルターをインサートから除去し、クリスタルバイオレッ
トで染色した。フィルター上面の細胞はすべてなくなっているので、残存する細
胞は、フィルターの下面へ移動したものだけである。ＨＧＦの存在下では、ＨＧ
Ｆのない対照と比較して、有意により多い細胞がフィルターの下面に見出される
。
【０１０８】 オリゴヌクレオチドの合成及び修飾：ＲＮＡは、変更した標準シアノエチル化
学により定常的に合成した（Green, Jellinek et al. (1995) Chem Biol. 2: 68
3-95）。２’−フルオロ−ピリミジンホスホロアミダイトモノマーはＪＢＬサイ
エンティフィック（サンルイスオビスポ、ＣＡ）から入手し；２’−ＯＭｅプリ
ン、２’−ＯＨプリン、へキシルアミン、及びｄＴポリスチレン固形支持体はグ
レンリサーチ（スターリング、ＶＡ）から入手した。
【０１０９】 ４０Ｋ（４０，０００）−ＰＥＧの追加用に、５’位にアミノリンカーを有す
るオリゴマーを合成した。引き続き、シアウォーターポリマーズ社（ハンツヴィ
ル、ＡＬ）により製造されたＮＨＳ−エステル４０Ｋ−ＰＥＧとこれを反応させ
、逆相調製用カラムでＨＰＬＣにより精製した。
【０１１０】 ２’−Ｏ−メチルプリン置換：どの２’−ＯＨ−プリンが２’−ＯＭｅプリン
により置換され得るかの決定は、（Green (1995) Chem Biol. 2: 683-95）に記
載のようにしてなされた。簡潔に言えば、２’−ＯＭｅアミダイトと２’−ＯＨ
アミダイトの混合物を用いて、規定されるプリン位置でオリゴヌクレオチドのセ
ットを合成した。このセットを、各オリゴヌクレオチドが部分置換されたプリン
のサブセットを含有し、完全なセットですべてのプリンが網羅されるように設計
した。各アプタマーを５’末端標識し、限定したアルカリ加水分解にかけてから
、２種の異なる濃度、５０及び１００ｐＭでＨＧＦタンパク質へ結合させた。結
合後、タンパク質に結合したＲＮＡを標準ニトロセルロース濾過により分離した
。結合したＲＮＡを回収し、高分割ゲル電気泳動により分析した。ＨＧＦに曝露
しなかった断片化アルカリ加水分解アプタマーを泳動し、非選択アプタマーの開
裂パターンを確定させた。加水分解が起こるのは２’−ＯＨ−プリンでだけであ
る。ある一定の位置がＨＧＦへの最適結合に２’−ＯＨを必要とするならば、そ
れは、その位置での非選択アプタマーに比較して、相対的により暗いバンドとし
て現れる。
【０１１１】 実施例２．結果−ＨＧＦ 全体で５回のＨＧＦ ＳＥＬＥＸ実験を実施した。はじめの３回は従来のフィ
ルターＳＥＬＥＸにより行なったが、後の２回は、そのまま参照により本明細書
に組込まれる、「先端切りＳＥＬＥＸ法」と題した、米国特許出願第０９／２７
５，８５０号（１９９９年３月２４日出願）に記載のハイブリダイゼーショント
ランケートＳＥＬＥＸ法により実施した。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１は、１３ラウン
ドの従来型フィルター結合につき３０Ｎ７ ２’−Ｆ−ＲＮＡを用いて実施した
。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ２は、１３ラウンドの従来型フィルター結合につき３０Ｎ
８ ２’−Ｆ−ＲＮＡを用いて実施した。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ３は、スポットフ
ィルター結合による７ラウンドの後での８ラウンドのフィルター結合につき、３
０Ｎ７ ２’−Ｆ−ＲＮＡを用いて実施した。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ４は、ＨＧＦ
ＳＥＬＥＸ１由来のプール８から開始して、３ラウンドのハイブリダイゼーシ
ョンフィルターＳＥＬＥＸにより実施した。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ５は、ＨＧＦ
ＳＥＬＥＸ３由来のプール１１から開始して、３ラウンドのハイブリダイゼーシ
ョンフィルターＳＥＬＥＸにより実施した。従来のＳＥＬＥＸ反応液、及びスポ
ットフィルターＳＥＬＥＸにおいてはＨＢＳＭＣ緩衝液を使用し、「材料と方法
」に記載のようにブロッキング剤を加えた。
【０１１２】 競合剤のヘパリン及びｔＲＮＡを用いる／用いないＲＮＡプールの結合：ＳＥ
ＬＥＸの進展を評価するために、上記実験の経過の間に進化したプールを用いて
、精製ＨＧＦタンパク質を用いた結合曲線を定常的に作成した。代表的な結合曲
線をＨＧＦ ＳＥＬＥＸ実験１及び２について示す（図３）。これらのデータを
使用して、追加のラウンドを実施してもさらなる進歩が起こりそうにない、ＳＥ
ＬＥＸの完了したときを確かめた。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１は、約０．１ｎＭの結
合アフィニティーである、その最大結合にラウンド８までに達した（図３Ａ；よ
り早期のラウンドとラウンド９は他の実験で試験した）。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ２
は、約０．１ｎＭの結合アフィニティーである、その最大結合にラウンド１０ま
でに達した（図３Ｂ）。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ３は、７ラウンドのスポットフィル
ター分画に次いで４ラウンドの従来型フィルターＳＥＬＥＸの後で、その最大結
合にラウンド１１までに達した（図４Ｂ）。完全とみなされたＳＥＬＥＸ実験の
結果をクローニング及び配列決定により特徴づけた（以下参照）。
【０１１３】 ＨＧＦは、陽電荷アミノ酸の大きなクラスターを有する他のタンパク質のよう
に、ポリアニオン化合物への高度な非特異結合を示す。例えば、ランダムＲＮＡ
プールは、ＨＧＦ機能において重要な生物学的役割を有することが知られている
、ポリアニオン硫酸多糖であるヘパリンへのＨＧＦ結合について報告された数値
に類似した、低ナノモルのアフィニティーでＨＧＦへ結合する（Zioncheck, Ric
hardson et al. (1995) J. Biol Chem. 270: 16871-8）。ヘパリン、並びに非特
異的競合剤のｔＲＮＡへの競合結合は、ＳＥＬＥＸ進展を評価する追加の手段を
提供する。このことがなされたのは、ランダム及び進化したＲＮＡのプールのＨ
ＧＦへの結合が高アフィニティーの範囲で起こり、進展をモニターすることを難
しくするからである。言い換えると、ランダムＲＮＡは非常によくＨＧＦへ結合
するので、進化したプールのアフィニティー増強は、競合剤の不在下での従来型
結合実験では十分に評価し得ない場合がある。
【０１１４】 ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ３由来のＲＮＡプールをヘパリンとの競合にかけた（図４
Ａ）。この実験は、ランダムＲＮＡのほうが、進化したプールよりも、ＨＧＦへ
の結合について競合の影響をかなり受けやすいことを示す。これらのデータを、
同じ３種のＲＮＡプールの結合曲線から得られるものと比較する（図４Ｂ）。ヘ
パリン競合の不在下では、ランダムＲＮＡのＨＧＦへの結合が進化したプールの
それとほとんど同じくらい良好であるのに対し、ヘパリン競合があると、進化し
たプールがランダムＲＮＡとは組成において有意に異なることが明らかになる。
さらに、従来の結合曲線ではラウンド８とラウンド１１は区別がつかないが、ヘ
パリン競合への増加した抵抗性に基づけば、ラウンド１１は改善された結合を示
す。上記のデータは、クローン化して配列決定する最大結合プールとしてラウン
ド１１を我々が選択することに貢献した。
【０１１５】 同様の、しかしよりはっきりとした効果が、競合剤としてｔＲＮＡを用いて観
察された（図５Ａ）。上記のデータは、ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ３由来のラウンド１
１プールが、ランダムＲＮＡよりも、ＨＧＦへの結合についての競合に対して少
なくとも４オーダーの強度でより抵抗性であることを示す。これらの曲線から、
進化したＲＮＡの競合結合が存続するｔＲＮＡの最大濃度は８００ｎＭであるこ
とが決定された。従って、このｔＲＮＡ濃度で結合曲線を作成し、様々な進化プ
ールの結合性を比較した（図５Ｂ）。これらの曲線は、ラウンド１１以上のさら
なるＳＥＬＥＸラウンドが結合性を改善しないことを判定することにおいて有用
であった。
【０１１６】 ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１の後半ラウンドについて実施した結合競合実験の同様な
セットからの典型的なデータを表１に要約する。
【０１１７】 ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１、２及び３のクローニング及び配列分析：ＨＧＦへのプ
ール結合アフィニティーの決定後、最適ＳＥＬＥＸプールをクローン化して配列
を決定し、個別アプタマーを単離して、特徴づけた。３０Ｎ７ ＨＧＦ ＳＥＬ
ＥＸ１及び３からのデータを表２に要約する。これには多くのアプタマーについ
ての結合アフィニティーが含まれる。同様のデータセットを３０Ｎ８ ＨＧＦ
ＳＥＬＥＸ２について作成した（表３）。ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１、２及び３由来
の配列を、それぞれ８−ｓｅｑ．（配列）番号、１０−ｓｅｑ．番号、及び１１
−ｓｅｑ．番号（それぞれのクローン化プールが処理されたＳＥＬＥＸラウンド
の全数を意味する）と表示する。配列を分析し、有意な相同性を有する群へまと
めた。モチーフを分析し、予測構造を導いて、ＨＧＦへの結合の原因となる主要
な特徴について分析した。
【０１１８】 ＨＧＦ仲介性細胞増殖刺激の阻害：ＨＧＦは、強力なマイトジェンではないも
のの、実際に多くの細胞系の適度な増殖を刺激し、それは3Ｈ−チミジンの取込
みにより測定され得る。ＨＧＦアプタマーの阻害活性を、ヒト臍静脈内皮細胞（
ＨＵＶＥＣ）、又はサル気管上皮（４ＭＢｒ−５）細胞の増殖に及ぼすその効果
を測定することによってアッセイした。結合データと配列ファミリー分析に基づ
いて、１４種のアプタマーを in vitro 分析に選択したのは、それらが高アフィ
ニティーでＨＧＦへ結合し、異なる配列ファミリーを代表するからである。その
配列を、いくつかのファミリーに共通した塩基を含有する粗いコンセンサスによ
り並置して、表４に示す。すべての配列は、３０Ｎ８である１０−２を除くと、
３０Ｎ７である。
【０１１９】 ＨＧＦは、ＨＵＶＥＣの増殖を約２〜３倍促進する（データ示さず）。初回の
実験は、アプタマーの８−１７、８−１０２、８−１０４、８−１２２、８−１
２６、１０−２及び１１−２０８がＨＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖の有効な阻害剤で
あり、低ナノモルの範囲にＫi値を有することを示した（図６）。アプタマーの
８−１１３及び１１−２２２はさほど有効ではなく、８−１５１は濃度依存性の
阻害をほとんど乃至まったく示さなかった。後の観察事実は、アプタマー８−１
５１が高アフィニティーでＨＧＦへ結合せず、実際はランダムプールよりも不良
に結合するという事実に一致している。
【０１２０】 ＨＧＦの有意な阻害を保持するアプタマーの長さを減らすために、以下のアプ
ローチを採った：１）部分加水分解したアプタマーの生化学的分離による境界の
決定；２）配列モチーフ分析と経験に基づいた推測；及び３）トランケートＳＥ
ＬＥＸ。
【０１２１】 境界部分と先端切り：ＨＧＦ活性の in vitro 阻害を示したアプタマーのサブ
セットについて境界決定を実施した。５’末端標識ＲＮＡを用いた標準加水分解
法を使用して、アプタマー８−１７、８−１０２、８−１０４、８−１２６、１
０−１及び１０−２の３’境界部分を試験した。さらに、３’末端標識ＲＮＡを
、アプタマー８−１７及び８−１０２に関する５’境界実験について使用した。
上記の実験にほとんど情報価値がなかったのは、ＲＮＡフラグメントが、サイズ
にかかわらず高度に非特異結合したために、先端切りした高アフィニティーアプ
タマーのＨＧＦへの結合が不鮮明になったからである。ほとんどすべてのフラグ
メントの非特異結合は境界の情報を与えず、タンパク濃度を減らすことも役に立
たなかった。その代わり、我々はポリアニオン競合剤であるｔＲＮＡ及びヘパリ
ンを使用して、非特異的な結合をなくし、実際の境界部分を明らかにしようとし
た。競合剤により非特異結合は減少したが、ＨＧＦは主に完全長アプタマーに結
合し、完全長アプタマーが強く好ましいという可能性以上の境界情報を明らかに
しなかった。
【０１２２】 唯一の例外は、コンピュータの予測構造と矛盾しない、２つのあり得る終点の
間に可能な３’境界部分を有するアプタマー８−１０２であった（図７Ａ）。境
界データと構造データに基づいて、アプタマー８−１０２の２種のトランケート
を合成し、ＨＧＦへの結合について分析した。完全長アプタマーと２種のトラン
ケートの配列を以下に示す（固定配列に下線を施す）：
【０１２３】
【化１】
【０１２４】 ＨＧＦへの結合では、３６マーが完全長アプタマーとほとんど同等に結合した
のに対し、２８マーはランダム３０Ｎ７と同じくらい不良に結合し、境界データ
が正確であることを示唆した。
【０１２５】 配列構造の予測による先端切り：先端切りをモチーフ分析と予測構造に基礎づ
けるいくつかの試みがなされたが、それではＨＧＦへの結合を保持するトランケ
ートを産生することに成功しなかった。例えば、アプタマー８−１７は、その３
’末端からの２種の明瞭な先端切り点を示唆する、合理的な予測構造である３８
マー又は２８マーへフォールドした（図８Ａ）。しかしながら、結合分析は、こ
れらトランケートのいずれもがＨＧＦへの有意な結合を保持しないことを明らか
にした（図８Ｂ）。上記のデータは、予測された構造が不正確であるか、又は塩
基３８を越えた３’領域がアプタマー８−１７のＨＧＦへの高アフィニティー結
合に必須であるかのいずれかを示唆する。これら２つの仮説は相互に排除するも
のではない。それでも、我々は、境界及び構造の予測により８−１７の有用なト
ランケートを得ることに成功しなかった。
【０１２６】 トランケートＳＥＬＥＸ：追加の短いアプタマーを産生するために、初期ＳＥ
ＬＥＸ実験の後半ラウンドを、そのまま参照により本明細書に組込まれる、「先
端切りＳＥＬＥＸ法」と題した、米国特許出願第０９／２７５，８５０号（１９
９９年３月２４日出願）に記載の先端切りＳＥＬＥＸ法を使用して、トランケー
トＳＥＬＥＸの追加ラウンドにかけた。ＲＮアーゼＨで開裂したプールの結合性
を試験して、トランケートＳＥＬＥＸを開始するのに使用するためにどれが適切
なラウンドであるかを決定した（データ示さず）。ＲＮアーゼＨで開裂したどの
進化プールも、ＨＧＦへの結合において他のものより明確に優ってはいなかった
ので、以前にクローン化したプールを選択して、トランケートＳＥＬＥＸに使用
した。この実験から有望な結果は、ＲＮアーゼＨ処理後に、進化プールがランダ
ムＤＮＡよりもＨＧＦへより良好に結合したことであり、固定領域の不在下でも
、有意な結合アフィニティーが保持されることを示唆した。この観察事実は、固
定領域の不在下でＨＧＦへ結合する配列がトランケートＳＥＬＥＸにより濃縮さ
れ得ることを示唆する十分な証拠であった。
【０１２７】 出発プールとしてＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１ラウンド８とＨＧＦ ＳＥＬＥＸ３ラ
ウンド１１を使用して、３ラウンドのハイブリダイゼーショントランケートＳＥ
ＬＥＸを併行して実施した。このトランケートＳＥＬＥＸラウンドは等モルのＲ
ＮＡ及びタンパク質で実施し、１ｎＭで開始し、０．５及び０．１ｎＭへ減少さ
せた。シグナル／ノイズの比は選択の間非常に高かった。後続の操作は、回収さ
れたＲＮＡの量がピコモル以下でも満足のいくものであった。
【０１２８】 ＳＥＬＥＸの進展を評価するために、トランケートラウンド２及び３の結合ア
フィニティーを決定し、ＲＮアーゼＨで開裂された出発プールのそれと比較した
（図９）。いずれのＳＥＬＥＸでも、第三ラウンドのプールが、前のラウンドと
比較してＨＧＦへの改善されたアフィニティーで結合した。興味深いことに、第
二ラウンドは出発材料ほど良好にはＨＧＦへ結合しなかった。第三ラウンドのト
ランケートＳＥＬＥＸプールの解離定数は１〜２ｎＭで、２〜３倍の改善を表し
た。この改善の度合いはさして大きくないが、ターゲットとしてのＨＧＦが、お
そらくは本来的に高いＲＮＡへのアフィニティーがあるために容易にはアフィニ
ティー濃縮を生じなかったことに照らせば、有意であろう。
【０１２９】 この２種のプールをクローン化して、配列を決定し、結合アフィニティーを決
定した（表５）。最良の結合アフィニティーを有する先端切れアプタマー、Ｔｒ
５１は、新規である配列のなかにある、つまり完全長のＳＥＬＥＸプールからの
クローン化配列には見出されなかったものである。新規配列の出現は、トランケ
ートＳＥＬＥＸが完全長プールには相対的に稀であるアプタマーを増幅すること
に成功したことを示唆する。アプタマーＴｒ５１は他の配列より高頻度に出現し
、それが他のトランケートより良好な結合アフィニティーを有するという観察事
実に一致した。数倍出現した他の配列も１〜２ｎＭのプールＫdに近いか又はよ
り良好である結合アフィニティーを有するものである傾向がある。
【０１３０】 ４０Ｋ−ＰＥＧで修飾した３６マーアプタマーによるＨＧＦ阻害：上記のアプ
タマー８−１０２の３６マー誘導体を、４ＭＢｒ−５細胞増殖アッセイにおいて
in vitro 阻害について試験した（図１０）。この３６マーはＨＧＦへの高アフ
ィニティー結合を保持したが、その親アプタマーの８−１０２とアプタマー８−
１７に匹敵する in vitro 阻害活性を保持しなかった（図１０）。
【０１３１】 この３６マーの活性を改善するために、３’−ｄＴキャップと５’−４０Ｋ
ＰＥＧを有する製剤においてそれを試験した。ＮＸ２２３５４と表示したこの修
飾アプタマーを、ＨＧＦ仲介増殖性の４ＭＢｒ−５細胞の阻害について試験した
（図１１Ａ）。このデータは，３６マー−ＰＥＧアプタマーがＨＧＦを阻害する
こと、及び、試験されたすべてのアプタマーのなかで最も強い阻害をかつて示し
た、完全長アプタマのー８−１７と少なくとも同等にそれが機能することを示す
。予測されるように、非ＰＥＧ化３６マーはＨＧＦを阻害せず、ＰＥＧ及び／又
は３’−キャップの付加がアプタマーの生物活性に貢献することを示唆した。こ
の実験はより低いアプタマー濃度でも実施され、以前の結果を裏付け、３６マー
ＰＥＧアプタマーが８−１７の完全長アプタマーより優れた阻害剤であることを
より明瞭に示した。さらにこのアッセイにより、３’−ｄＴキャップと５’−４
０Ｋ ＰＥＧを含有する非結合性アプタマーである、ＶＥＧＦアプタマーのＮＸ
１８３８も試験されたが、ＨＧＦ刺激に対して効果がなかった（図１２）。この
同じ実験において、ＮＸ１８３８の非ＰＥＧ化バージョンとトランケートＳＥＬ
ＥＸアプタマーＴｒ５１は、ＨＧＦに対する阻害効果を有さなかった（図１２）
。このことは、Ｔｒ５１が、ＮＸ２２３５４の３６マー基本アプタマーと同様に
、ＨＧＦ機能を阻害するのに５’−４０Ｋ−ＰＥＧを必要とする可能性があるこ
とを示唆する。
【０１３２】 ＨＧＦ仲介性の細胞移動刺激の阻害：ＨＧＦは、細胞分散因子という名称から
して、細胞の運動を刺激する。「材料と方法」に記載のように、８．０ミクロン
の空孔を有するマトリゲルコート膜を通過するＡ５４９細胞の移動に対する効果
を測定することによって、ＨＧＦアプタマーの阻害効果をアッセイした（表６）
。ＮＸ２２３５４アプタマーは、１μＭと０．２μＭの両濃度でＨＧＦ仲介性の
移動を完全に阻害したが、０．０４μＭではその効果は無視できた。モノクロー
ナル抗体の対照（サンプル３）は１μｇ／ｍＬの用量でやや有効であったが、こ
れは４ＭＢｒ−５細胞増殖の阻害について公表されているＥＣ50値（０．１〜０
．３μｇ／ｍＬ）より高い。
【０１３３】 ＨＵＶＥＣ増殖に及ぼすＨＧＦ及びＶＥＧＦアプタマーの合わせた阻害効果：
ＶＥＧＦとＨＧＦはＨＵＶＥＣ増殖に対して相加的な阻害効果を及ぼすと報告さ
れた（Van Belle (1998) Circulation. 97: 381-90）。この効果は、ＶＥＧＦと
ＨＧＦを、ＨＵＶＥＣへ単独又は一緒に加えて、3Ｈ−チミジンの取込みを測定
するときに観察された（図１３）。予測されたように、ＨＧＦによる刺激はＶＥ
ＧＦのそれ、及び一緒のそれと比べて相対的に弱く、刺激効果はＶＥＧＦ単独で
誘発されるものより大きかった。
【０１３４】 上記の曲線に基づいて、我々は、アプタマー阻害実験における最適刺激のため
に各サイトカインを１０ｎｇ／ｍＬ加えることを選択した。次いで、両方の増殖
因子の存在下で二重に刺激された細胞へアプタマーの片方又は両方を加えること
の効果を試験した（図１４Ａ）。各アプタマーは刺激を部分的に阻害し、両アプ
タマーで完全な阻害を生じることが観察された。興味深いことに、各アプタマー
の阻害効果の強さは、各サイトカインにより与えられた刺激の強さに対応する。
この観察は、各サイトカインの刺激効果が独立して阻害され得ること、そしてこ
の２種のサイトカインが独立してＨＵＶＥＣを刺激することを示唆する。
【０１３５】 図１４Ｂ及び１４Ｃは、各サイトカインを別々に投与した対照を示し、ＨＧＦ
とＶＥＧＦが交差反応しない、つまり、各アプタマーがそれに対して選択された
サイトカインのみに影響を及ぼすことを明示する。ＨＧＦで刺激された細胞では
、ＨＧＦアプタマーのＮＸ２２３５４による阻害が観察されたが、ＶＥＧＦアプ
タマーのＮＸ１８３８による阻害は観察されたかった（図１４Ｂ）。逆に、ＶＦ
ＧＦによる刺激はＶＥＧＦアプタマーのＮＸ１８３８により阻害されたが、ＨＧ
ＦアプタマーのＮＸ２２３５４には影響を受けなかった（図１４Ｃ）。
【０１３６】 上記のデータは、ＨＧＦがＶＥＧＦのように血管新生因子であるという事実と
ともに、腫瘍を治療するのにＶＥＧＦ及びＨＧＦのアプタマーを二重投与するこ
とを考察することを大変興味深くさせる。さらに、他の増殖因子を阻害するアプ
タマーの利用可能性は、ＶＥＧＦ又はＨＧＦアプタマーの、他のアプタマー、例
えば、ｂＦＧＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖
因子β（ＴＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、及び／又はそれらの受容体を
阻害するアプタマーと一緒のさらなる組み合わせを示唆し、上記阻害剤のあらゆ
る組み合わせが適切であり得るという可能性を考慮させる。この目標は、サイト
カインとその受容体の多数のアプタマー−阻害剤を有し、特定の病態向けの複合
療法を特別に設計することである。
【０１３７】 ＨＧＦアプタマーＮＸ２２３５４の２’−Ｏ−メチルプリン置換：ＮＸ２２３
５４の安定性及び薬物動態を改善するために、我々は１７個の２’−ＯＨプリン
のどれが置換され得るかを決定した。このことは、ＮＸ２２３５４の基本配列を
部分置換した４種の２’−ＯＭｅプリン変異体を合成すること、次いで、上記の
「材料と方法」の節に記載の分析によりなされた。４種の部分置換オリゴヌクレ
オチドは、２’−ＯＭｅアミダイト：２’−ＯＨアミダイトが１：１の比で合成
された（表７）。このデータ分析では、ゲル由来のバンドの定量に基づいて、各
置換プリン位置での選択／非選択ＲＮＡの比を測定する。このデータを位置ごと
にまとめる（図１５）。各位置で、３種の非置換アプタマーは重要な比較を提供
し、それは誤差の棒線で表される標準偏差をもった、３種の非置換アプタマーの
平均として表現される。近傍の位置よりも高い比で出現する点は結合に２’−Ｏ
Ｈを必要とする可能性がある。
【０１３８】 このデータは、２つの位置、Ｇ５及びＡ２５が、２’−ＯＭｅ置換を寛容しな
いことを強く示す。他の２つの位置、Ａ３及びＧ１０は、非選択ＲＮＡの標準偏
差よりわずかに高い選好性を示す。
【０１３９】 ＯＭｅアプタマーのセットもＨＧＦへの結合性について試験した（データ示さ
ず）。結合データは、ＯＭｅ１とＯＭｅ３が親の非置換３６マーと同じくらい良
好に結合するのに対し、ＯＭｅ２とＯＭｅ４はさほどよく結合しないことを示す
。このことは、ＯＭｅ２とＯＭｅ４における置換が溶液中でのＨＧＦ結合に関し
てあまり寛容されないことを示唆し、ＯＭｅ２とＯＭｅ４がそれぞれＡ２５とＧ
５で置換されるという事実に一致している。
【０１４０】 上記の結果を確かめるために、明らかに十分寛容される位置で完全に２’−Ｏ
Ｍｅ置換されている２種のアプタマーを合成した。これらの配列を以下に示す（
２’−ＯＨ−プリンには下線を施す）。他のプリンはすべて２’−ＯＭｅであり
、ピリミジンは２’−フルオロ置換されている。
【０１４１】
【化２】
【０１４２】 ４ｘＳｕｂ２’−ＯＨの配列が問題の２’−ＯＨ−プリンの全４つを含有するの
に対し、２ｘＳｕｂ ２’−ＯＨは最も必要とされる可能性が高い２つの２’−
ＯＨ−プリンを有する。
【０１４３】 これらオリゴマーのＨＧＦへの結合を、非置換の親ＲＮＡと完全に２’−ＯＭ
ｅ置換したＲＮＡに比較して試験した（図１６）。これらの結合曲線に基づけば
、ＮＸ２２３５４は、結合アフィニティーのわずかな損失があるものの、Ｇ５及
びＡ２５を除くすべてのプリンでの２’−ＯＭｅ置換を寛容する。アプタマーの
４ｘＳｕｂ ２’−ＯＨはアプタマーの２ｘＳｕｂ ２’−ＯＨと同じくらい良
好に結合しないので、問題となる他の２つの位置は、２’−ＯＨであることが必
要とされない。
【０１４４】 ５’−４０Ｋ−ＰＥＧと３’−ｄＴを有する２種のアプタマーを合成した：一
方は完全に２’−ＯＭｅ置換され、他方はＧ５及びＡ２５の位置に２’−ＯＨを
含有する。これらの１つは、さらなる in vitro 及び in vivo 試験のリードＨ
ＧＦアプタマーとして、ＮＸ２２３５４の代わりになる可能性がある。
【０１４５】 実施例３．結果−ｃ−ｍｅｔ ｃ−ｍｅｔ ＳＥＬＥＸ：ｃ−ｍｅｔプレートＳＥＬＥＸ実験では、核酸の濃
度をはじめは低くして、次いで後半ラウンドで高め、タンパク質に対する核酸の
比が非常に高くなるようにする。このことは、より高いアフィニティーのアプタ
マーについて選択することを可能にする高ストリンジェンシーの条件を創出する
ためになされた。ストリンジェンシーはまた、洗浄の回数を増加することによっ
てもかけられた。
【０１４６】 ＳＥＬＥＸプールの結合性：ＳＥＬＥＸプールのｃ−ｍｅｔへの結合性をラウ
ンド７により評価した（図１７）。この結合データは、ＳＥＬＥＸにより、（４
０Ｎ７）（図１７Ａ）と（３０Ｎ８）（図１７Ｂ）プールの両方でＫdが約２０
倍、２０ｎＭから１ｎＭへ改善したことを示す。
【０１４７】 ＳＥＬＥＸにおいて使用したｃ−ｍｅｔタンパク質がＩｇＧ融合タンパク質で
あるので、ランダム４０Ｎ７とラウンド７ｃＲＮＡプールを、ヒトＩｇＧ1とｃ
−ｍｅｔへの結合について試験した。この結合解離定数を表８に示す。ラウンド
７ｃＲＮＡのＩｇＧ1及びｃ−ｍｅｔタンパク質の両方へのアフィニティーは約
５０倍改善した。この結果にはいくつかの解釈がある。いずれのタンパク質へも
より良好なアフィニティーで結合するアプタマーが選択されたのかもしれない。
この解釈は、ＩｇＧ1とｃ−ｍｅｔの結合性における差異がｃ−ｍｅｔ特異的ア
プタマーによることを前提にする。しかしながら、この２つのタンパク質は、結
合性に影響を及ぼす可能性がある異なるグリコシル化パターンを有し得る、異な
る細胞系において作られたものである。従って、アフィニティーにおける差異が
フリーのＩｇＧ1とｃ−ｍｅｔ中のＩｇＧ1ドメインとの違いによるとすれば、ラ
ウンド７のプールには、ｃ−ｍｅｔ特異的アプタマーが、あるとしてもごくわず
かしか存在しないかもしれない。
【０１４８】 これらの問題にさらに深く取り組むために、両ライブラリーからのランダム及
びラウンド５のＲＮＡプールをｃ−ｍｅｔ及びＫＤＲタンパク質への結合につい
て試験した（図１８）。これらのタンパク質はいずれも同一の細胞系でつくられ
、同一のＩｇＧ1−Ｈｉｓ6配列を含有する。両ライブラリーからのランダムＲＮ
Ａは、各タンパク質へほとんど同じ（Ｋd＝約５０ｎＭ）に結合する。ｃ−ｍｅ
ｔ ＳＥＬＥＸの両ライブラリーからのラウンド５は、ＫＤＲよりもｃ−ｍｅｔ
へより良好に結合する（３０Ｎ８プールでは約１００倍良好で、４０Ｎ７プール
では３倍良好である）。しかしながら、ラウンド５のＲＮＡプールは、実際はラ
ンダムＲＮＡよりもＫＤＲへよりよく結合する。上記の結果は、ラウンド５のプ
ールには、ヒトＩｇＧ1又は（Ｈｉｓ）6タグへ結合するアプタマーがおそらく存
在するものの、ｃ−ｍｅｔアプタマーも存在し得ることを暗示する。
【０１４９】 ＰＣＲによるＩｇＧアプタマーの検出：ＳＥＬＥＸプールにＩｇＧ1アプタマ
ーが存在するかを決定するもう１つのアプローチは、それらをＰＣＲへかけるこ
とであった。Ｎ７タイプのライブラリーから、既知の配列を有する支配的なＩｇ
Ｇ1アプタマーを単離した（Nikos Pagratis and Chinh Dang, 私信）。このＰＣ
Ｒには、ＤＮＡオリゴヌクレオチド： ＭＬ−１２４；５’−ＡＣＧＡＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＴＧＧ
ＴＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡ−３’（配列番号：１８８）を使用した。これは最
も頻発するＮ７系列のヒトＩｇＧ1アプタマー配列に相補的であり、ほとんどの
他のＩｇＧ1アプタマーから数塩基しか異ならない。このＰＣＲプライマーはミ
スマッチに寛容で、同様の配列へハイブリダイズすることができるように、主要
ＩｇＧ1の選択配列と同じ長さである。
【０１５０】 ＭＬ１２４の３’プライマー：ＭＬ−３４；５’−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡ
ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’（配列番号：１８９）を、すべてのクロ
ーン化アプタマーに存在するＴ７−プロモーター配列を含有する５’−プライマ
ーとともに使用して、４０Ｎ７系列の核酸プール：ランダム、１ａ、２ａ、３ａ
及び４ａを増幅した（データ示さず）。ＩｇＧ1アプタマーはＮ８タイプのライ
ブラリーから単離されなかったので、この分析は３０Ｎ８ ＳＥＬＥＸについて
はしなかった。ランダム及びｃ−ｍｅｔ ＳＥＬＥＸのラウンド１ａプールのＰ
ＣＲは、２０サイクル後でもシグナルを産生しなかった。しかしながら、ラウン
ド２ａ、３ａ、及び４ａは１０ＰＣＲサイクル後も容易に検出され得る、着実に
増加するシグナルを有した。従って、４０Ｎ７ ＳＥＬＥＸ実験では、比較的早
期にＩｇＧ1アプタマーが出現した。陰性対照として、ＩｇＧ1アプタマーを欠く
ことが知られているＳＥＬＥＸからの核酸プールを用いてＰＣＲを実施した。陽
性対照には、Ｎ７ベースのＩｇＧ1か又はＣＴＬＡ４−ＩｇＧ1 ＳＥＬＥＸのい
ずれか由来のプールを用いて、ＰＣＲを実施した。まず、ＩｇＧ1アプタマーを
これらＳＥＬＥＸの両方から単離した。陰性対照では、２０ＰＣＲサイクル後で
も、検出されるＩｇＧ1アプタマーがなかった。陽性対照では、１０ＰＣＲサイ
クル後も検出されるシグナルがあった。
【０１５１】 ｃ−ｍｅｔアプタマー：ラウンド７ｃ−４０Ｎ７に由来する１９個のクローン
の配列は、それぞれ２種の配列を有する５つのファミリー、３種の無関係なメン
バーの群、及び既知のＩｇＧ1アプタマー配列に密接に関連している６種の配列
へ分類される（表９）。このように、１９個のクローンのうち少なくとも６個（
３２％）は、ヒトＩｇＧ1アプタマーである。このことは、このＳＥＬＥＸ実験
においてＩｇＧ1アプタマーの存在を示したかつての分析の結果を裏付ける。
【０１５２】 ラウンド７ｂ−３０Ｎ８から配列決定された１３個のクローンのうち、６個は
ほとんど同一であり、他の５個は密接に関連していて、残る２個は別個である（
表１０）。
【０１５３】 ４０Ｎ系列からの６個、３０Ｎ８系列からの３個、計９個のクローンをｃ−ｍ
ｅｔ又はＫＤＲへの結合性について試験した。これらのクローンを選択したのは
以下の理由からである。クローン７ｂ−４はファミリー１において最も頻発する
クローンであり、７Ｂ−３０Ｎ８ライブラリーから単離された配列のほとんどす
べてを代表する。クローン７ｂ−１０及び７ｂ−１２は、７ｂ−３０Ｎ８ライブ
ラリーからの、異なる配列を有した２つのクローンである。７ｃ−４０Ｎ７プー
ルから選択された代表物は：ファミリー１（クローン７ｃ−１）；ファミリー２
（クローン７ｃ−４）；ファミリー３（クローン７ｃ−２３）；ファミリー４（
クローン７ｃ−２６）；ファミリー５（クローン７ｃ−２５）；及び推定ＩｇＧ 1 ファミリー１（クローン７ｃ−３）であった。
【０１５４】 ＫＤＲよりｃ−ｍｅｔへより良好に結合することが観察された唯一のクローン
である７ｃ−１を含む、２個のクローンについてのみ結果を示す（図１９Ａ）。
クローン７ｃ−１は、４０Ｎ７系列では２倍出現したが、高アフィニティー結合
（Ｋd＝約５０ｐＭ）とより低いアフィニティー結合（Ｋd＝約５ｎＭ）を有する
二相性の結合挙動を示す可能性がある。ｃ−ｍｅｔと同じくらい良好にＫＤＲへ
結合した他の８個のクローンには、ここで代表例として示されている７ｃ−３が
含まれた（図１９Ｂ）。クローン７ｃ−３と、７ｃ−１以外のクローンはすべて
ＩｇＧ1アプタマーであると推定される。
【０１５５】 要約すると、３２個のうち２つのクローン（７ｃ−１に同一）は、明らかにｃ
−ｍｅｔへ特異的かつ高アフィニティーで結合する。残りのクローンはＩｇＧ1
アプタマーであるらしい。
【０１５６】 実施例４．インテグリンおよびインテグリンリガンドの単離 本質的に（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６３：１８７２６−３１）の記載に従って、αVβ3インテグリン
をヒト胎盤から単離し、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製し
た。要約すると、ヒト胎盤をさいの目に切り、１００ｍＭのオクチル−β−Ｄ−
グルコピラノシド界面活性剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンデ
ィエゴ）を含有する緩衝液中にこの組織片を抽出した。抽出液を遠心により澄明
化し、イムノアフィニティーカラム（αVβ3特異的モノクローナル抗体ＬＭ６０
９をＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
社、カリフォルニア州テメキュラ）に固定したもの）に付与した。カラムに結合
したタンパク質を低ｐＨ緩衝液で溶離し、画分を直ちに中和し、インテグリン含
量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。インテグリン含
量画分をプールし、この精製材料のアリコートを−８０℃に保存した。精製ヒト
αVβ3も、ヒトαVβ5インテグリンと同様にＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ社から購入した。αIIbβおよびフィブリノーゲンはＥｎｚｙｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（インディアナ州サウスベン
ド）から購入された。ビトロネクチンは、期限切れのヒト血漿から（Ｙａｔｏｈ
ｇｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃ．，１３
：２８１−９２）の方法でヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより精
製された。
【０１５７】 実施例５．インテグリンに対する核酸リガンドの生成 下記配列のＤＮＡ鋳型ライブラリーを化学合成により調製した：
【０１５８】
【化３】
【０１５９】 イタリック体のヌクレオチドはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに相当す
る。４０Ｎ残基がある（ａ、ｇ、ｔまたはｃ）。短いＤＮＡプライマー”３Ｎ８
”：
【０１６０】
【化４】
【０１６１】 を鋳型にアニールし、クレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチュセッツ州ビバリー）を用いて延長させた。二本鎖ＤＮ
Ａ生成物がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写（酵素はＥｎｚｙｃｏ社より入手、コ
ロラド州デンバー）のための生成物として作用して、ランダム配列ＲＮＡのライ
ブラリーが形成された。２’−フルオロ−ＣＴＰおよび−ＵＴＰを２’−ＯＨ−
ピリミジンの代わりに用いた。
【０１６２】 ＳＥＬＥＸ法をαVβ3インテグリンに適用するために、精製タンパク質を界面
活性剤含有−保存緩衝液から５０ｍＭ ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタン
スルホン酸）、ｐＨ６．１、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2中へ、
最終濃度が約０．２μｇ／ｍＬになるように希釈した。３．２μのポリスチレン
粒子（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、メーン州ウェストブルック）
を希釈タンパク質に添加し、混合物を４℃で一夜回転させた。ビーズを遠心によ
り採集し、ＭＥＳ緩衝液（前記）中の３％ＢＳＡ中において室温で１時間インキ
ュベートすることによりブロックした。ブロックしたビーズを結合緩衝液（５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（３７℃で）、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ
ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１ｍＭ ＭｎＣｌ2、
０．０１％ＢＳＡ）に再懸濁することにより数回洗浄した。１ラウンドの選択に
つき、インテグリンコーティングしたビーズをＲＮＡと混合し、３７℃で４時間
回転させて、ＲＮＡと固定化タンパク質を平衡化させた。次いでビーズを遠心に
より採集し、結合緩衝液中で速やかな再懸濁とペレット化（追加インキュベーシ
ョンなし）により少なくとも５回洗浄した。ビーズに結合保持されたＲＮＡを、
結合緩衝液プラス１００μＭサイクリックＲＧＤペプチド（”ｃＲＧＤ”）（Ｇ
ＰｅｎＧＲＧＤＧＤＳＰＣＡ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ、メリーランド州ガイザースバーグ）中、３７℃で一夜溶離した。溶
離ＲＮＡをフェノール、次いでクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１
）で抽出し、エタノール沈殿させた。トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フロリダ州セントピーターズバーグ）を用いる逆転
写のために、ＲＮＡペレットを再懸濁し、プライマー３Ｎ８にアニールさせた。
３Ｎ８プライマーおよびプライマー”５Ｎ８”：
【０１６３】
【化５】
【０１６４】 ならびにＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ−Ｃｅｔｕｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて、ｃＤＮＡ
プールを増幅させた。ＰＣＲ生成物の転写により、新たなラウンドの選択を開始
するためのＲＮＡプールが得られた。第１ラウンドの選択のために、１ｎｍｏｌ
のＲＮＡ（約６×１０14配列）を２μＭの濃度で、タンパク質５０ｐｍｏｌに相
当する容量のビーズ懸濁液（すべてのインテグリンがビーズに吸着したとして）
と共にインキュベートした。後続ラウンドでは、より高い親和性結合相互作用を
得るためにＲＮＡおよびタンパク質コーティングしたビーズの濃度を両方とも低
下させた。
【０１６５】 ビオチニル化ＲＮＡを少量の固定化インテグリンで滴定することにより、αV
β3に対する個々のＲＮＡおよびＲＮＡプールの親和性を測定した。結合ＲＮＡ
をビオチン部分により検出した。ビオチニル化ＲＮＡは標準転写プロトコルに従
って調製され、ただしＧＴＰより５倍モル過剰の５’−ビオチン修飾ＧＭＰを反
応混合物に含有させた。５’−ビオチン修飾グアノシンヌクレオチドの合成方法
は、”オリゴヌクレオチドのバイオコンジュゲーション”と題するＷＯ９８／３
０７２０に記載されており、これの全体を本明細書に援用する。この修飾ヌクレ
オチドを転写体の５’末端に、グアノシンプール中にある転写体の量に比例して
取り込ませる。９６ウェルミクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２，Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バージニア州シャンティリー）を
、１００μＬの精製αVβ3（濃度０．２５μｇ／ｍＬ：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ
、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．１ｍＭ ＭｎＣｌ2中）により４℃で一夜コーティングした。コーティン
グ濃度はαIIbβ3については０．８μｇ／ｍＬ、αVβ5については０．３μｇ／
ｍＬであった。ウェルを同緩衝液中の３％ＢＳＡ溶液２００μＬでブロックし（
室温で１時間）、次いで２００μＬの結合緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．５、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、
２ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．１％ＢＳＡ）で３回すすいだ
。各ＲＮＡまたはＲＮＡプールを結合緩衝液（二価カチオンまたはＢＳＡを含有
しない）中、９３℃で短時間変性させ、次いで同緩衝液中に系列希釈した。２倍
濃度の二価カチオンおよびＢＳＡを含有する結合緩衝液５０μＬを各ウェルに添
加し、次いで５０μＬのＲＮＡ希釈液を添加した。
【０１６６】 ＲＮＡを、インテグリンコーティングしたウェル内において３７℃で３０〜６
０分間インキュベートした。結合緩衝液中で速やかに３回洗浄することにより、
結合していないＲＮＡを除去した。結合ＲＮＡの検出のために、結合緩衝液中に
１：２５００希釈したストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ結合体（
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）１００μＬを、各ウェル中、室温で３０分間インキュベ
ートし、次いで前記と同様に速やかに３回洗浄した。１００μＬ／ウェルのリン
酸ｐ−ニトロフェニル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ミズーリ州セントル
イス）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。４０５ｎｍにおける吸収
により発色をモニターした。結合したＲＮＡまたはタンパク質の画分をＫDの関
数として表す方程式に結合データを当てはめ、単相および二相結合挙動について
結合反応におけるＲＮＡおよびタンパク質の全濃度を求めた（Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ
ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５：１４４１３−２４）。 配列撹乱形アプタマー７．２４に相当する対照ＲＮＡ：
【０１６７】
【化６】
【０１６８】 を、アッセイ条件下でのＲＮＡの非特異的結合のモニターに用いた。
【０１６９】 ７ラウンドのＳＥＬＥＸプロセス後、インテグリンコーティングしたビーズに
特異的に結合したＲＮＡの量は実質的に増加していた（データは提示されていな
い）。固定化αVβ3はランダム配列ＲＮＡに対する検出可能な親和性を示さなか
ったが、ラウンド７のＲＮＡプールは平衡解離定数（ＫD）約４×１０-7Ｍで結
合していた（図２０）。このラウンド７の親和性富化プールをクローニングし、
混合物中の個々の分子について配列を決定した。得られた９２の配列のうち３５
（３８％）が互いにきわめて相関性が高く、多くの場合、相異は１塩基位置を超
えなかった。これらの配列をまとめて”ファミリー１”と呼ぶ。これらのＲＮＡ
は、大部分ではなくとも多くが単一前駆物質からＲＴおよびＰＣＲ工程で複製の
誤りの結果生じたと思われる。他の２５配列（２７％）は、第２配列ファミリー
（”ファミリー２”）を規定する短いモチーフ（ＣＣＵＧＣＣ）を共有していた
。残り３２配列（３５％）はファミリー１または２の配列と明らかな相関性がな
く、したがって”みなしご”配列と呼ばれる。ラウンド７のＲＮＡプールにおい
てみなしご配列が大きな割合を占めることは、この集団にかなりの配列複雑度が
残されていることを示唆する。したがって、ラウンド７プールでの提示が低かっ
た高親和性をさらに富化することを目的として、ＳＥＬＥＸプロセスを続けた。
実際に、さらに８ラウンドの親和性選択後、ＲＮＡプールの実質的な親和性改善
がみられた（図２０、ラウンド１５）。さらに２ラウンドの選択後もこれ以上の
改善はみられなかった（図２０、ラウンド１７）ので、ラウンド１５とラウンド
１７のＲＮＡプールからクローンを単離し、各分離体の配列をラウンド７で得た
ものと比較した。ラウンド１５プールから得た３９配列のうち２７（６９％）は
保存度の高いファミリーであるファミリー１のメンバーであった。３配列（８％
）はファミリー２に分類され、９配列（２３％）はみなしごであった。ラウンド
１７プールから分離した１８配列はすべて、配列ファミリー１のメンバーであっ
た。したがってこの場合、追加ラウンドのＳＥＬＥＸプロセスは、既にラウンド
７で優勢であった単一の高親和性配列のファミリーにＲＮＡ集団を絞るのに役立
った。
【０１７０】 表１１は、αVβ3に対して高い親和性をもつ主要ファミリー２’−Ｆ−ピリミ
ジンＲＮＡ（ファミリー１）の配列を示す。クローン名は、各配列を得た特定の
ＲＮＡプール（ラウンド７、ラウンド１５またはラウンド１７）に続いて独自の
クローン番号を示す。幾つかの例では異なるＲＮＡプールから同一配列が分離さ
れた点に注目されたい。これらの場合、両クローン名を挙げる。（クローン１７
．１２ＡとＢは単一プラスミド中における末端同志の挿入配列として単離された
。）かっこ内の数値はその配列の単離回数を示す。数値の無い場合、そのクロー
ンはそのＲＮＡプールから１回だけ得られた。全クローンに共通の５’および３
’側の一定配列領域の配列を上に小文字で示す。大部分のクローン間の配列保存
性が強いことを強調するために、多くの配列にギャップを挿入した。各ＲＮＡに
ついてのランダム配列領域の長さを示し、固定化αVβ3への結合に関するＫDを
測定した場合はその推定値も示す（ＮＤ＝測定せず）。提示したＫD値は、一般
に１回の測定値または２回の測定値の平均値に基づく。αVβ3 ＳＥＬＥＸ法で
単離したファミリー２の配列を表１２に示す。すべての配列に共通に保存されて
いる短いモチーフ（ＣＣＵＧＣＣ）を太字で示す。表１３には、ファミリー１ま
たは２に明らかな関係をもたない配列を示す。２つのメンバー（７．４１（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２７９）および７．９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１））、
または３つのメンバー（７．１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）、７．８２（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８）および７．１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９４
））のみの類似配列グループも表１３に含まれる。
【０１７１】 ラウンド７と１５の間での実質的な親和性改善は、一部は親和性の低い種が集
団から失われたことが原因であるにちがいない。しかし、ファミリー１の高親和
性配列変異体の導入と選択がプールの全体的親和性の富化に関与している可能性
もある。親和性を測定したラウンド７プール由来の配列数は比較的少ないが、固
定化αVβ3に対するそれらの親和性はラウンド１５および１７由来のＲＮＡの親
和性より一般に低かった（表１１〜１３）。
【０１７２】 実施例６．インテグリンに対する核酸リガンドの特異性 一般に特定のターゲットタンパク質への高親和性結合により選択したアプタマ
ーは、他の関連タンパク質に対し、相同度がきわめて高い場合以外は比較的弱い
結合を示す（たとえばＧｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，３５：１４４１３−２４；Ｒｕｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２０５５６−６７参照）。インテグリンαおよび
βサブユニットファミリー内には有意の相同性があり、αおよびβ両サブユニッ
トがインテグリンスーパーファミリーのメンバー間で共有されている。したがっ
て、近縁インテグリンに対するαVβ3アプタマーの相対親和性を評価することに
関心があった。これらの親和性を前記方法で測定した。主要配列ファミリーの代
表としてファミリー１アプタマー１７．１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９）を
選んだ。図２１は、９６ウェルプレート結合アッセイにおいて、アプタマー１７
．１６が精製固定化αVβ3と血小板インテグリンαIIbβ3に等しい親和性で結合
したことを示す。これら２つのタンパク質はβ3サブユニットを共有するが、αV とαIIbのアミノ酸配列アラインメントは３６％の全配列同一性を示すにすぎな
い（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６ ：８１５８−６５）。主に各αサブユニットの４つの推定カルシウム結合ドメイ
ン内に、厳密な配列同一性をもつ長さ５〜９アミノ酸の短い配列はある。インテ
グリンαVβ5へのアプタマー１７．１６の結合も調べた。β5サブユニットはβ3 と５６％の配列同一性をもち、β3に対してβサブユニットファミリーの他のメ
ンバーより近縁である（ＭｃＬｅａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２６５：１７１２６−３１；Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９
９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：５３５４−８）。固定化
インテグリンαVβ5へのアプタマーの結合はみられなかった（図２２）が、αV
特異的抗体はウェル表面に吸着したαVβ5タンパク質の存在を検出した（データ
は示されていない）。同時にこれらのデータは、アプタマー１７．１６が（外延
により配列ファミリー１の他のメンバーも）主にαVβ3のβ3サブユニットに結
合することを強く示唆する。さらに、血小板インテグリンαIIbβ3に対するアプ
タマーの高親和性結合により、アプタマーの適用可能な範囲が血小板の検出また
はそれらの機能の阻害を伴う適用にまで拡張される。
【０１７３】 実施例７．アプタマーによる精製インテグリンへのリガンド結合の阻害 ＳＥＬＥＸ法により特定のターゲットに対する高い親和性をもつＲＮＡ配列が
同定されるが、この例に用いた方法は、溶離緩衝液に競合物質ｃＲＧＤペプチド
を含有させることによりリガンド結合部位阻害物質の回収に影響を与えるように
設計された。アプタマー１７．１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９）がαVβ3ま
たはαIIbβ3のリガンド結合部位をブロックするかを調べるために、精製したビ
トロネクチンおよびフィブリノーゲンをビオチニル化し、一方または両方の固定
化インテグリンと共に種々の濃度のアプタマーまたは非結合性対照ＲＮＡの存在
下または不存在下でインキュベートした。これは下記のように行われた：精製イ
ンテグリンリガンドであるビトロネクチンおよびフィブリノーゲンを（Ｓｍｉｔ
ｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１２２６７
−７１）の記載に従ってビオチニル化した。要約すると、タンパク質を０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3および０．１Ｍ ＮａＣｌ中へ透析した。Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を１ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解し
、タンパク質１ｍｇ当たりビオチン０．１ｍｇの比率でタンパク質に添加した。
反応物を室温で２時間回転させた。ビオチニル化タンパク質をリン酸緩衝塩類溶
液中へ透析し、それらの濃度を２８０ｎｍにおける吸収により測定した。９６ウ
ェルミクロタイタープレートを前記に従ってαVβ3またはαIIbβ3でコーティン
グし、ＢＳＡでブロックした。一定濃度のビオチニル化リガンド（フィブリノー
ゲン：最終６ｎＭ；ビトロネクチン：最終１０ｎＭ）を結合緩衝液（前記”アプ
タマー結合親和性の測定”参照）中で、種々の濃度のアプタマー、対照ＲＮＡ、
サイクリックＲＧＤペプチド、抗体または非修飾リガンドと予備混合した。イン
テグリンコーティングしたウェル内において、混合物を室温で６０分間インキュ
ベートした。洗浄後、結合したビオチニル化リガンドを１：５００希釈したスト
レプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ結合体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）１
００μＬ／ウェルの添加（室温で６０分間）、次いで前記リン酸ｐ−ニトロフェ
ニル１００μＬ／ウェルの添加により検出した。４０５ｎｍで吸収を読みとった
。単一ターゲット種への２つのリガンドの相互排除型結合を表した方程式（Ｇｉ
ｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２０：３０７−２
４）にデータを当てはめた。当てはめた曲線からバックグラウンド差引き最大信
号の５０％を阻害する競合物質濃度（ＩＣ50）を判定した。
【０１７４】 既知のリガンド結合阻害薬（ＲＧＤペプチドおよびαVβ3特異性抗体ＬＭ６０
９を含む）をアッセイの陽性対照として含めた。図２３Ａは、固定化αVβ3への
ビオチニル化ビトロネクチン結合の阻害を示す。アプタマー１７．１６は４．７
ｎＭのＩＣ50で結合相互作用を阻害し、一方、対照ＲＮＡは阻害を示さなかった
。比較すると、ＲＧＤペプチド阻害のＩＣ50は１．４ｎＭ、ＬＭ６０９の場合は
２．７ｎＭであった。非修飾ビトロネクチンはビオチニル化物質の結合を５９ｎ
ＭのＩＣ50で阻害した。同様なデータがαVβ3へのフィブリノーゲン結合のアプ
タマー阻害（図２３Ｂ）およびαIIbβ3へのフィブリノーゲン結合のアプタマー
阻害（図２３Ｃ）についても得られた。図２３ＢのデータについてのＩＣ50値は
下記のとおりであった：１７．１６，９．５ｎＭ；対照ＲＮＡ，測定できず；Ｒ
ＧＤペプチド，１．０ｎＭ；ＬＭ６０９，６．３ｎＭ；非修飾フィブリノーゲン
，４３ｎＭ。図２３ＣのデータについてのＩＣ50値は下記のとおりであった：１
７．１６，６．５ｎＭ；対照ＲＮＡ，測定できず；ＲＧＤペプチド，２１ｎＭ；
非修飾フィブリノーゲン，１５ｎＭ。したがってアプタマー１７．１６はβ3イ
ンテグリンリガンド結合の有効な競合物質であり、モル基準で二価抗体のものと
ほぼ等しい阻害力価をもつ。
【０１７５】 実施例８．ヒト血小板への核酸リガンド結合 アプタマー１７．１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９）を、ポリスチレンビー
ズの表面に吸着された精製ヒトαVβ3への結合のために選択した。疎水性吸着タ
ンパク質に関して、精製β3インテグリンに対するアプタマーの親和性を測定す
るためのインビトロアッセイも行った。したがってアプタマー機能についての重
要な試験は、アプタマーが細胞表面の天然タンパク質に結合する能力を判定する
ものであった。この目的のためにヒト血小板を選択した理由は、それらが単離し
やすく、かつインテグリンαIIbβ3の発現レベルが高いからであった。αIIbβ3 は血小板の活性化に際してコンホメーション変化を伴うので、休止血小板とトロ
ンビン活性化血小板の両方へのアプタマー結合を調べた。これは下記のように行
われた：フルオレセイン結合ＲＮＡを（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６：３９１５−２４）に従って調製した。要約
すると、ＲＮＡを５倍モル過剰のイニシエーターヌクレオチド、グアノシン−５
’−Ｏ−（２−チオジホスフェート）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で転写
し、次いでゲル精製ＲＮＡを５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（Ｐｉｅｒ
ｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合させた。採血したばかりのクエン酸化
ヒト血液から卓上型遠心機で１０００ｒｐｍ、１５分間の遠心により、血小板富
化した血漿を調製した。活性化血小板については、血小板凝集を防ぐために、カ
ルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコＰＢＳ中２×１０17／ｍＬで
、２．５Ｕ／ｍＬのトロンビンおよび５ｍＭのＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
（ＧＰＲＰ）と共に、細胞を室温で１５分間インキュベートした。細胞を結合緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１１１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０１％ＢＳＡ、０．０１％
ＮａＮ3）中へ１：１０希釈した。休止細胞をトロンビンまたはＧＰＲＰに暴露
せずに同様に希釈した。発蛍光団結合した抗体、すなわちすべての血小板（β3
インテグリンサブユニット）に結合するＣＤ６１抗体、および血小板活性化のマ
ーカーであるＣＤ６２抗体（Ｐ−セレクチン）で染色することにより、休止状態
またはトロンビン活性化処理した細胞の活性化状態をモニターした。抗体はＢｅ
ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ（カリフォルニア州サンホゼ）から入手された。フルオレセイン結合ＲＮＡ
を水に希釈して４μＭにし、９３℃で短時間変性し、次いで２倍濃縮した結合緩
衝液で希釈して２μＭにした。次いでＲＮＡを結合緩衝液に系列希釈した。各希
釈液を休止または活性化血小板と１：１混合し、暗所において室温で３０分間イ
ンキュベートした。インキュベーション混合物をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターに直接付与して、試料の平
均蛍光を測定した。このような平衡結合条件下で、細胞表面インテグリンへのア
プタマー結合に関する推定ＫDを求めた。
【０１７６】 血小板への非特異的ＲＮＡ結合は、アプタマー１７．１６と同様な長さおよび
塩基組成をもつ対照ＲＮＡを用いて測定された。非特異的結合は約１００ｎＭを
超える濃度で有意となった。アプタマーの特異的結合は、試料に５ｍＭ ＥＤＴ
Ａを添加することにより非特異的結合と区別された。すなわちＥＤＴＡは対照Ｒ
ＮＡの結合に影響を与えないが、アプタマー結合を対照レベルにまで低下させた
。したがって、アプタマーの特異的結合は、ＥＤＴＡ添加前の試料の蛍光強度（
特異的＋非特異的）とＥＤＴＡ添加後の試料の蛍光強度（非特異的）の差として
定められた。
【０１７７】 図２４は、休止およびトロンビン活性化両方のヒト血小板へのアプタマー結合
のＥＤＴＡ感受性成分について、代表的データを示す。最大結合信号は活性化血
小板に約２倍高く、これはそれらの細胞におけるαIIbβ3レベルがわずかに高い
ことと一致する（Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８８：
９０７−１４）。しかし、血小板へのアプタマー結合に関する推定ＫDは両細胞
について約１０ｎＭであり、これは精製αIIbβ3へのインビトロ結合に関して測
定した値と等しい。さらにアプタマー１７．１６は、休止およびトロンビン活性
化両方の血小板に、承認済みαIIbβ3アンタゴニストであるＲｅｏｐｒｏ（ａｂ
ｃｉｘｉｍａｂ、キメラ７Ｅ３ Ｆａｂ）について報告されたもの（Ｍｏｕｓａ
，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８６：１
２７７−８４）について報告されたものと等しい親和性で結合する。
【０１７８】 実施例９．ウサギ静脈凝塊モデルにおける生体内核酸リガンド分布 凝塊造影におけるβ3特異的アプタマーの利用を探索するために、アプタマー
１７．１６の５’末端をテクネチウム−９９ｍ（99mＴｃ）で標識し、静脈血栓
形成ウサギモデルにおいてその生体内分布をモニターした。このモデルにおいて
、隔離したウサギ頸静脈内においてヒト血小板富化血漿から凝塊をｉｎ ｓｉｔ
ｕ形成する。凝塊を通る血流を再確立し、放射性標識アプタマー（または非結合
性対照ＲＮＡ）を同側耳静脈から血流に導入する。種々の組織中への放射性標識
の分布を組織１ｇ当たりの注入量に対する％として報告する。
【０１７９】 実験は下記により行われた：アプタマー１７．１６ならびに同様な長さおよび
塩基組成の対照ＲＮＡを、５倍モル過剰の５’−（Ｏ−ヘキシルアミノ）グアノ
シン一リン酸を用いて転写した。３０％ジメチルホルムアミド中で、１００ｍＭ
ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．３）中に緩衝化した５モル当量のＨｉ15−ＮＨＳ
を用いて、各ＲＮＡをアプタマー５０ｍｇ／ｍＬでＨｉ15に結合させた。結合反
応物を分子量カットオフ３０，０００のフィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ３０、
Ａｍｉｃｏｎ社、マサチュセッツ州ビバリー）上で洗浄して、過剰のＨｉ15ケー
ジを除去した。次いでＲＮＡを下記の方法により99mＴｃで標識した：１ｎｎｏ
ｌのＨｉ15−アプタマーに、使用前１２時間以内に２００μＬの１００ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５、２３ｍｇ／ｍＬの酒石酸ナトリウムおよび５
０μＬの［99mＴｃ］ペルテクネテート（５．０ｍＣｉ）を添加し、99Ｍｏカラ
ム（Ｓｙｎｃｏｒ、デンバー）から溶離した。１０μＬの５ｍｇ／ｍＬ ＳｎＣ
ｌ2の添加により標識反応を開始した。反応混合物を９０℃で１５分間インキュ
ベートした。３００μＬの洗浄液を用い、分子量カットオフ３０，０００のメン
ブラン（Ｃｅｎｔｒｅｘ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を通し
た遠心機透析により、未反応99mＴｃを除去した。この標識プロトコルにより、
添加した99mＴｃの３０〜５０％が比放射能２〜３ｍＣｉ／ＲＮＡ ｎｍｏｌで
取り込まれた。
【０１８０】 生体内分布試験のために、ウサギをイソフルランで麻酔した。２ｃｍの右頸静
脈セクションをｉｎ ｓｉｔｕ隔離し、枝管をすべて結紮した。カテーテルを顔
面静脈に装入した。隔離した静脈セグメントをカテーテルの上下で一時的に結紮
した。静脈セグメントを塩類溶液でフラッシした。１０００ＵＰ単位のヘパリン
を静脈内投与した。カルシウムおよびトロンビンで活性化した新鮮なヒト血小板
富化血漿（クエン酸化）３００〜４００μＬを隔離した静脈セグメントに装入し
、凝塊を形成させた。３０分後、結紮をはずし、血栓を通る血流を再開した（同
側耳静脈への空気の２００μＬの注入により確認）。［99mＴｃ］結合アプタマ
ーまたは対照ＲＮＡを同側耳静脈に注入した。１時間目にウサギを瀉血し、組織
を秤量し、Ｗａｌｌａｃ １４７０ガンマ計数器で計数した。アプタマーおよび
対照ＲＮＡを１ｎｎｏｌ／ｋｇ（約０．０３ｍｇ／ｋｇ）で試験した。
【０１８１】 アプタマー１７．１６については注入の１時間後までに有意の放射能が凝塊に
蓄積したが、対照ＲＮＡについては同様な蓄積はみられなかった（図２５）。ア
プタマーおよび対照ＲＮＡの両方について腎臓の放射能蓄積が中等度であること
から判定して、血液の放射能クリアランスは速やかで、主に腎機序により仲介さ
れるように思われた。したがって、血小板の表面または凝塊マトリックス内に高
レベルで発現するαIIbβ3または他のタンパク質に特異的なアプタマーは、血栓
の迅速造影に有用な物質として役立つであろう。
【０１８２】 表１ 競争的ｔＲＮＡ存在下、および非存在下でのＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１プール
の結合親和性
【０１８３】
【表１】
【０１８４】 表２ ＨＧＦ ３０Ｎ７アプタマ−配列および結合親和性
【０１８５】
【表２】
【０１８６】
【０１８７】a ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１からのクローンシリーズ８；ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ３から
のクローンシリーズ１１。かっこ内の数は、全く同じ配列の繰り返し数を表す。
シリーズ８クローンの２番目の数は、シリーズ１１で分離されたものとの正確な
一致を表す。b Ｎ７固定配列は示していない。（５’―ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＧＧ−Ｎ
−ＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＣＧＡ―３‘）c ND、決定されていない。
【０１８８】 表３ ＨＧＦ ３０Ｎ８アプタマ−配列および結合親和性
【０１８９】
【表３】
【０１９０】a ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ２からのクローンシリーズ１０。かっこ内の数は、全く同
じ配列の繰り返し数を表す。b Ｎ８固定配列は示していない。（５’―ＧＧＧＡＧＡＵＡＡＧＡＡＧＡＡＵＡ
ＡＡＣＧCＵＣＡＡ−Ｎ−ＵＵＣＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＵＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣ
―３’）c ND、決定されていない。
【０１９１】 表４ 阻害活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価したＨＧＦアプタマ−およびそれらの
結合親和性のリスト
【０１９２】
【表４】
【０１９３】 ＊１０−２はＮ８固定配列を含む；他のすべてはＮ７。
【０１９４】 表５ ＨＧＦ切形ＳＥＬＥＸ３０Ｎ配列
【０１９５】
【表５】
【０１９６】a Ｔｒ１−３６およびＴｒ３７−７２クローンは、それぞれ８および１１通常ラ
ウンドで運ばれたシリーズからのものである。b 配列が、シリーズ８または１１から得られた完全長アプタマ−と同一というこ
とを示している；ＮＸ２２３５４は、境界実験に基づく合成切形で、配列８−１
０２から得られたものであり、ここでは比較の目的で示している。c ND、決定されていない。d （４，２）は第一シリーズで４回、第二シリーズで２回を表している。
【０１９７】 表６ ＨＧＦアプタマ−ＮＸ２２３５４による、マトリゲルを通ってのＡ５４９
細胞の浸潤の阻害
【０１９８】
【表６】
【０１９９】a 抗―ＨＧＦ抗体は、Ｒ＆Ｄシステムｉｎｃ．製のＭＡＢ２９４。
【０２００】 表７ ＮＸ２２３５４の２’−Ｏ−メチル置換異形
【０２０１】
【表７】
【０２０２】 ＮＸ２２３５４の親３６ｍｅｒ配列（プリンはアスタリスクでマークしている）
置換位置はアンダーラインで示している。Ome１配列は、他が4つ置換を有するの
に対し5置換を有する。技術的な理由で、Ｇ残基はそれぞれのアプタマーの３’
末端に加えた。
【０２０３】 表８ 結合および解離定数
【０２０４】
【表８】
【０２０５】 表９ ヒトｃ−ｍｅｔでプレートＳＥＬＥＸから分離された４０Ｎ７配列
【０２０６】
【表９】
【０２０７】a Ｎ７固定配列は示していない。（５’―ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＧＧ−Ｎ
−ＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＣＧＡ―３’）
【０２０８】 表１０ ヒトｃ−ｍｅｔでプレートＳＥＬＥＸから分離された４０Ｎ７配列
【０２０９】
【表１０】
【０２１０】a Ｎ８固定配列は示していない。（５’―ＧＧＧＡＧＡＵＡＡＧＡＡＵＡＡＡＣ
ＧＣＵＣＡＡ−Ｎ−ＵＵＣＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＵＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣ―３’
）
【０２１１】 表１１ αvβ3ファミリー１アプタマー配列
【０２１２】
【表１１】
【０２１３】
【０２１４】 表１２ αvβ3ファミリー２アプタマー配列
【０２１５】
【表１２】
【０２１６】 表１３ αvβ3オーファン（orphan）アプタマー配列
【０２１７】
【表１３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、２’−Ｆ−ピリミジンＲＮＡ ＳＥＬＥＸ実験において使
用されるテンプレート及びプライマーのＲＮＡを示す。このテンプレート及びプ
ライマーの５’固定領域は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの転写を促
進するＴ７プロモーターを含有する。
【図２】 図２は、ハイブリダイゼーショントランケートＳＥＬＥＸにおいて
使用されるＲＮアーゼＨ開裂プライマーを示す。太字で示された塩基は２’−Ｏ
ｍｅ修飾され、下線を施した塩基はデオキシリボヌクレオシドである。ランダム
領域は「Ｎ」と表示される。ＲＮアーゼＨでの処理時に、固定領域は脱字記号に
より示される位置で除去される。固定領域の５’末端には２つの可能な開裂部位
があり、１又は２個の固定Ｇ残基を有するＲＮＡを生じることに注目すること。
【図３】 図３は、ＳＥＬＥＸプールのＨＧＦへの結合を示す。図３Ａは、Ｈ
ＧＦ ＳＥＬＥＸ１ ３０Ｎ７プールを示し、図３Ｂは、ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ２
３０Ｎ８プールを示す。
【図４】 図４は、ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１ ３０Ｎ７プールのＨＧＦへの結合
を評価する２種の方法を示す。図４Ａでは、ヘパリンが２．７ｎＭ ＨＧＦへの
結合についてＲＮＡプールと競合し、図４Ｂは、従来のプール結合を示す。
【図５】 図５は、ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ１ ３０Ｎ７プールのＨＧＦへの結合
を評価する２種の方法を示す。図５Ａでは、ｔＲＮＡが２．７ｎＭ ＨＧＦへの
結合についてＲＮＡプールと競合し、図５Ｂは、従来のプール結合を示す。
【図６】 図６は、飢餓ＨＵＶＥＣの１０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ刺激のアプタマ
ーによる阻害を示す。図６Ａは、第一のアプタマーのセットを示し、図６Ｂは、
第二のアプタマーのセットを示す。
【図７】 図７は、アプタマー８−１０２（配列番号：１２）のトランケート
を示す。 図７Ａは完全長配列及び先端切れ（truncated）配列の予測二次元構造を示す
。 図７Ｂは、完全長アプタマー及び先端切れアプタマーのＨＧＦへの結合を示す
。
【図８】 図８は、アプタマー８−１７（配列番号：６８）のトランケートを
示す。 図８Ａは完全長配列及び先端切れ（truncated）配列の予測二次元構造を示す
。 図８Ｂは、完全長アプタマー及び先端切れアプタマーのＨＧＦへの結合を示す
。
【図９】 図９は、ＨＧＦトランケートＳＥＬＥＸプールの結合を示す。図９
Ａは、ＨＧＦ ＳＥＬＥＸ４ ３０Ｎ７系列を示し、図９Ｂは、ＨＧＦ ＳＥＬ
ＥＸ５ ３０Ｎ７系列を示す。
【図１０】 図１０は、４ＭＢｒ−５細胞の１００ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ刺激の
アプタマー阻害を示す。
【図１１】 図１１は、４ＭＢｒ−５細胞の５０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ刺激のア
プタマー阻害を示す。図１１Ａは、３６マーのＰＥＧ化の効果を示し、図１１Ｂ
は、最良の完全長阻害剤８−１７に対するＰＥＧ化３６マーの比較を示す。
【図１２】 図１２は、４ＭＢｒ−５細胞の５０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ刺激のア
プタマー阻害を示す。
【図１３】 図１３は、１０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ
、又はＨＧＦ及びＶＥＧＦの両方によるＨＵＶＥＣの有糸分裂生起を示す。
【図１４】 図１４は、ＨＵＶＥＣ有糸分裂生起のアプタマー仲介性の阻害を
示す。 図１４Ａは、ＨＧＦ及びＶＥＧＦの両方による刺激がＨＧＦ又はＶＥＧＦのア
プタマーの一方、又は両方により阻害されることを示す。 図１４Ｂは、ＨＧＦ単独による刺激がＨＧＦ又はＶＥＧＦのアプタマーの一方
、又は両方により阻害されることを示す。 図１４Ｃは、ＶＥＧＦ単独による刺激がＨＧＦ又はＶＥＧＦのアプタマーの一
方、又は両方により阻害されることを示す。
【図１５】 図１５は、アプタマーＮＸ２２３５４における部分的２’−ＯＭ
ｅ置換プリンの選択／非選択の比率を示す。
【図１６】 図１６は、ＮＸ２２３５４の２’−ＯＭｅ置換誘導体がＨＧＦへ
結合することを示す（２回の実験の平均）。
【図１７】 図１７は、ＳＥＬＥＸプールのｃ−ｍｅｔへの結合を示す。 図１７Ａはｃ−Ｍｅｔ ＳＥＬＥＸ ４０Ｎ７を示し； 図１７Ｂはｃ−Ｍｅｔ ＳＥＬＥＸ ３０Ｎ８を示す。 図１７Ｃは両方のＳＥＬＥＸを示す：ａ、ｃのプールは４０Ｎ７；ｂ、ｄのプ
ールは３０Ｎ８である。
【図１８】 図１８は、ｃ−ｍｅｔ ＳＥＬＥＸプールのｃ−ｍｅｔとＫＤＲ
Ｉｇ融合タンパク質への結合を示す。
【図１９】 図１９は、ｃ−ｍｅｔ ４０Ｎ７クローン化アプタマーのｃ−ｍ
ｅｔ及びＫＤＲ Ｉｇ融合タンパク質への結合を示す。 図１９Ａはクローン７ｃ−１を示し、 図１９Ｂはクローン７ｃ−３を示す。
【図２０】 図２０は、アフィニティー濃縮されたＲＮＡプールの固定化αV
β3への結合を示す。５’−ビオチン化ＲＮＡプールを、インテグリンαVβ3で
コートした９６穴マイクロタイタープレートにおいて様々な濃度でインキュベー
トした。結合したＲＮＡを、色素産生アッセイによりビオチン部分を介して検出
した。データは、インプットＲＮＡ濃度に関する４０５ｎｍでの吸光単位で表示
する。
【図２１】 図２１は、アプタマー１７．１６（配列番号：２４９）の精製イ
ンテグリンαIIbβ3に対する交差反応性を示す。５’−ビオチン化アプタマー１
７．１６を、インテグリンαVβ3又はαIIbβ3のいずれかでコートしたマイクロ
タイターウェルにおいて様々な濃度でインキュベートした。結合したＲＮＡを、
色素産生アッセイを使用してビオチン部分を介して検出した。データは、タンパ
クコーティングの差異について正規化する最大シグナルの百分率で表示する。
【図２２】 図２２は、アプタマー１７．１６（配列番号：２４９）の精製イ
ンテグリンαVβ5に対する交差反応性を示す。５’−ビオチン化アプタマー１７
．１６又は同様の長さ及び塩基組成の対照ＲＮＡを、αVβ3又はαVβ5のいずれ
かでコートしたマイクロタイターウェルにおいて様々な濃度でインキュベートし
た。結合したＲＮＡを、色素産生アッセイを使用してビオチン部分を介して検出
した。データは、インプットＲＮＡ濃度に関する４０５ｎｍでの吸光単位で表示
する。
【図２３】 図２３は、インテグリンリガンド結合のβ３アプタマー阻害を示
す。ビオチン化したフィブリノーゲン又はビトロネクチンを、様々な濃度のリガ
ンド結合性競合剤の存在又は不在下で、インテグリンαVβ3又はαIIbβ3のいず
れかでコートしたマイクロタイターウェルにおいてインキュベートした。競合剤
には、アプタマー１７．１６（配列番号：２４９)、同様の長さ及び塩基組成の
対照ＲＮＡ、サイクリックＲＧＤペプチド（ｃＲＧＤ、「材料と方法」を参照の
こと）、αVβ3−特異モノクローナル抗体（ＬＭ６０９）、又は非修飾フィブリ
ノーゲン又はビトロネクチンが含まれた。結合したリガンドを、色素産生アッセ
イを使用してビオチン部分を介して検出した。データは、インプット競合剤濃度
に関する４０５ｎｍでの吸光単位で表示する。図２３Ａは、固定化αVβ3へ結合
するビトロネクチンの競合を示し；図２３Ｂは、固定化αVβ3へ結合するフィブ
リノーゲンの競合を示し；図２３Ｃは、固定化αIIbβ3へ結合するフィブリノー
ゲンの競合を示す。最大吸光度の推定値を、競合剤の不在下で、各リガンド／イ
ンテグリン対について決定した。５ｍＭ ＥＤＴＡをインキュベーション緩衝液
へ加えることによって、基準吸光度を決定した。このように決定した最大値及び
最小値は、（ａ）０．９１４／０．１１３；（ｂ）１．０４２／０．１２２；及
び（ｃ）０．８８９／０．１２８であった。
【図２４】 図２４は、活性化又は安定したヒト血小板へのアプタマー１７．
１６（配列番号：２４９）の結合を示す。５’−フルオレセイン−コンジュゲー
トしたアプタマー１７．１６又は同様の長さ及び塩基組成の対照ＲＮＡを、安定
しているか又はトロンビンで活性化したヒト血小板（１０6個／ｍＬ）とともに
様々な濃度でインキュベートした。インキュベーションは、二価カチオン、０．
１％ ＢＳＡ、及び０．０１％アジ化ナトリウムを含有する緩衝化生理食塩水に
おいて、室温でなされた。サンプルの平均蛍光強度を、５ｍＭの最終濃度へＥＤ
ＴＡを加えることの前後で、フローサイトメトリーにより決定した。２種のサン
プル間の蛍光強度差（ＥＤＴＡ感受性シグナル）を、アプタマー又は対照ＲＮＡ
の濃度に関して示す。
【図２５】 図２５は、ウサギ静脈血塊モデルにおける、［99mＴｃ］−アプ
タマー１７．１６（配列番号：２４９）又は対照ＲＮＡの生体分布を示す。ヒト
の血小板リッチ血漿から誘導される血塊を、麻酔ウサギの頚静脈の一過性単離に
より in situ で産生した。血塊全体での循環の回復後、［99mＴｃ］−標識アプ
タマー又は対照ＲＮＡを、ウサギの血流へ同側耳静脈を介して注入した。１時間
後、動物を屠殺し、組織の重量を量り、γ−カウンターで計数した。様々な組織
における放射活性の蓄積量を、組織の湿重量１ｇあたりの注入量比率として記録
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 9/10 9/10 15/00 15/00 17/06 17/06 19/10 19/10 27/06 27/06 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スティーブンス，アンドリュー アメリカ合衆国コロラド州80302，ボール ダー，ケリー・ロード・ウエスト 740 (72)発明者 ジャンジック，ネボイサ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボール ダー，カーター・トレイル 6973 (72)発明者 ラビン，ロス アメリカ合衆国コロラド州80026，ラファ イエット，オーバーランド・コート 117 (72)発明者 ロチュリー，マイケル アメリカ合衆国カリフォルニア州94541− 3581，ヘイワード，クリークビュー・コー ト 3374 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB14 BB46 BB50 BB51 DA13 FB02 FB05 FB08 4B024 AA01 AA11 CA01 CA11 HA12 4B063 QA20 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR56 QS25 QS34 QX02 QX07 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 NA14 ZA33 ZA36 ZA81 ZA89 ZA96 ZA97 ZB15 ZB26

Claims (73)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ）に対する核酸リガ
    ンドであって、 ａ）核酸の候補混合物を製造する工程； ｂ）核酸の候補混合物をＨＧＦと接触させる工程（ここで、候補混合物に比べ
    てＨＧＦに対する増加した親和性を有する核酸が候補混合物の残りから分画され
    得る）； ｃ）増加した親和性の核酸を候補混合物の残りから分画する工程；及び、 ｄ）増加した親和性の核酸を増幅して、ＨＧＦへ結合する相対的により高い親
    和性及び特異性を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工程（
    それにより、ＨＧＦの核酸リガンドが同定され得る）を含んでなる方法により同
    定される、前記核酸リガンド。
  2. 【請求項２】 精製及び単離された、非天然に存在する、ＨＧＦに対する核
    酸リガンド。
  3. 【請求項３】 精製された、非天然に存在する、ＨＧＦに対するＲＮＡリガ
    ンドであって、図７の配列番号：１２〜１４、図８の配列番号：１５〜１７、表
    ２の配列番号：１８〜９３、表３の配列番号：９４〜１３１、表５の配列番号：
    １３２〜１５５、及び表７の配列番号：１５６〜１５９からなる群から選択され
    る、前記リガンド。
  4. 【請求項４】 ＨＧＦが固形支持体に会合し、及び工程ｂ）〜ｃ）が前記固
    形支持体の表面上で起こる、請求項１に記載の核酸リガンド。
  5. 【請求項５】 前記固形支持体がニトロセルロースからなる、請求項４に記
    載の核酸リガンド。
  6. 【請求項６】 前記核酸の候補混合物が一本鎖核酸からなる、請求項１に記
    載の核酸リガンド。
  7. 【請求項７】 前記一本鎖核酸がリボ核酸である、請求項６に記載の核酸リ
    ガンド。
  8. 【請求項８】 前記一本鎖核酸がデオキシリボ核酸である、請求項６に記載
    の核酸リガンド。
  9. 【請求項９】 前記核酸の候補混合物が２’-Ｆ（２’-フルオロ）修飾リボ
    核酸を含む、請求項７に記載の核酸リガンド。
  10. 【請求項１０】 前記核酸リガンドが一本鎖である、請求項２に記載の精製
    及び単離された、非天然に存在する核酸リガンド。
  11. 【請求項１１】 前記核酸リガンドがＲＮＡである、請求項１０に記載の精
    製及び単離された、非天然に存在する核酸リガンド。
  12. 【請求項１２】 前記リガンドが２’-フルオロ（２’-Ｆ）修飾ヌクレオチ
    ドからなる、請求項１１に記載の精製及び単離された、非天然に存在するＲＮＡ
    リガンド。
  13. 【請求項１３】 ＨＧＦに対する核酸リガンドの単離の方法であって、 ａ）核酸の候補混合物を製造する工程； ｂ）核酸の候補混合物をＨＧＦと接触させる工程（ここで、候補混合物に比べ
    てＨＧＦに対する増加した親和性を有する核酸が候補混合物の残りから分画され
    得る）； ｃ）増加した親和性の核酸を候補混合物の残りから分画する工程；及び、 ｄ）増加した親和性の核酸を増幅して、ＨＧＦへ結合する相対的により高い親
    和性及び特異性を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工程（
    それにより、ＨＧＦの核酸リガンドが同定され得る）を含んでなる、前記方法。
  14. 【請求項１４】 前記候補混合物が一本鎖核酸を含む、請求項１３に記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】 前記一本鎖核酸がリボ核酸を含む、請求項１４に記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 ＨＧＦに対する核酸リガンドの生物学的有効量を投与する
    ことを含んでなる、腫瘍の治療の方法。
  17. 【請求項１７】 個体におけるＨＧＦのレベルを決定する方法であって、 ａ）ＨＧＦに対する核酸リガンドを提供する工程； ｂ）前記個体からの生物学的体液を前記核酸リガンドと接触させる工程；及び ｃ）前記核酸リガンドに結合したＨＧＦの量を決定する工程を含んでなる、前
    記方法。
  18. 【請求項１８】 血管新生を阻害する方法であって、ＨＧＦに対する核酸リ
    ガンドの生物学的有効量を投与することを含んでなる、前記方法。
  19. 【請求項１９】 ＨＧＦに対する核酸リガンドと製剤的に許容される賦形剤
    を含んでなる、腫瘍の治療用の医薬組成物。
  20. 【請求項２０】 ｃ−ｍｅｔに対する核酸リガンドであって、 ａ）核酸の候補混合物を製造する工程； ｂ）核酸の候補混合物をｃ−ｍｅｔと接触させる工程（ここで、候補混合物に
    比べてｃ−ｍｅｔに対する増加した親和性を有する核酸が候補混合物の残りから
    分画され得る）； ｃ）増加した親和性の核酸を候補混合物の残りから分画する工程；及び、 ｄ）増加した親和性の核酸を増幅して、ｃ−ｍｅｔへ結合する相対的により高
    い親和性及び特異性を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工
    程（それにより、ｃ−ｍｅｔの核酸リガンドが同定され得る）を含んでなる方法
    により同定される、前記核酸リガンド。
  21. 【請求項２１】 精製及び単離された、非天然に存在する、ｃ−ｍｅｔに対
    する核酸リガンド。
  22. 【請求項２２】 精製された、非天然に存在する、ｃ−ｍｅｔに対するＲＮ
    Ａリガンドであって、表９の配列番号：１６０〜１７４と表１０の配列番号：１
    ７５〜１８５からなる群から選択される、前記リガンド。
  23. 【請求項２３】 ｃ−ｍｅｔが固形支持体に会合し、及び工程ｂ）〜ｃ）が
    前記固形支持体の表面上で起こる、請求項２０に記載の核酸リガンド。
  24. 【請求項２４】 前記固形支持体がニトロセルロースからなる、請求項２３
    に記載の核酸リガンド。
  25. 【請求項２５】 前記核酸の候補混合物が一本鎖核酸からなる、請求項２０
    に記載の核酸リガンド。
  26. 【請求項２６】 前記一本鎖核酸がリボ核酸である、請求項２５に記載の核
    酸リガンド。
  27. 【請求項２７】 前記一本鎖核酸がデオキシリボ核酸である、請求項２５に
    記載の核酸リガンド。
  28. 【請求項２８】 前記核酸の候補混合物が２’-Ｆ（２’-フルオロ）修飾リ
    ボ核酸を含む、請求項２６に記載の核酸リガンド。
  29. 【請求項２９】 前記核酸リガンドが一本鎖である、請求項２１に記載の精
    製及び単離された、非天然に存在する核酸リガンド。
  30. 【請求項３０】 前記核酸リガンドがＲＮＡである、請求項２９に記載の精
    製及び単離された、非天然に存在する核酸リガンド。
  31. 【請求項３１】 前記リガンドが２’-フルオロ（２’-Ｆ）修飾ヌクレオチ
    ドからなる、請求項３０に記載の精製及び単離された、非天然に存在するＲＮＡ
    リガンド。
  32. 【請求項３２】 ｃ−ｍｅｔに対する核酸リガンドの単離の方法であって、 ａ）核酸の候補混合物を製造する工程； ｂ）核酸の候補混合物をｃ−ｍｅｔと接触させる工程（ここで、候補混合物に
    比べてｃ−ｍｅｔに対する増加した親和性を有する核酸が候補混合物の残りから
    分画され得る）； ｃ）増加した親和性の核酸を候補混合物の残りから分画する工程；及び、 ｄ）増加した親和性の核酸を増幅して、ｃ−ｍｅｔへ結合する相対的により高
    い親和性及び特異性を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工
    程（それにより、ｃ−ｍｅｔの核酸リガンドが同定され得る）を含んでなる、前
    記方法。
  33. 【請求項３３】 前記候補混合物が一本鎖核酸を含む、請求項３２に記載の
    方法。
  34. 【請求項３４】 前記一本鎖核酸がリボ核酸を含む、請求項３３に記載の方
    法。
  35. 【請求項３５】 ｃ−ｍｅｔに対する核酸リガンドの生物学的有効量を投与
    することを含んでなる、腫瘍の治療の方法。
  36. 【請求項３６】 血管新生を阻害する方法であって、ｃ−ｍｅｔに対する核
    酸リガンドの生物学的有効量を投与することを含んでなる、前記方法。
  37. 【請求項３７】 ｃ−ｍｅｔに対する核酸リガンドと製剤的に許容される賦
    形剤を含んでなる、腫瘍の治療用の医薬組成物。
  38. 【請求項３８】 上昇したＨＧＦが原因の因子である疾患を治療する方法で
    あって、ＨＧＦに対する核酸リガンドの生物学的有効量を投与することを含んで
    なる、前記方法。
  39. 【請求項３９】 腫瘍発達を阻害する方法であって、ＨＧＦに対する核酸リ
    ガンドの生物学的有効量を、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する核酸リ
    ガンドの生物学的有効量とともに投与することを含んでなる、前記方法。
  40. 【請求項４０】 腫瘍発達を阻害する方法であって、ＨＧＦに対する核酸リ
    ガンドの生物学的有効量を、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する核
    酸リガンドの生物学的有効量とともに投与することを含んでなる、前記方法。
  41. 【請求項４１】 腫瘍発達を阻害する方法であって、ＨＧＦに対する核酸リ
    ガンドの生物学的有効量を、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する核酸リ
    ガンドの生物学的有効量と塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する核酸
    リガンドの生物学的有効量とともに投与することを含んでなる、前記方法。
  42. 【請求項４２】 腫瘍発達を阻害する方法であって、少なくとも２種の増殖
    因子に対する核酸リガンドの生物学的有効量を投与することを含んでなる、前記
    方法。
  43. 【請求項４３】 前記増殖因子が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血
    小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）
    、ＨＧＦ、及び角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）からなる群から選択される、請求項
    ４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 腫瘍発達を阻害する方法であって、少なくとも２種の増殖
    因子の受容体に対する核酸リガンドの生物学的有効量を投与することを含んでな
    る、前記方法。
  45. 【請求項４５】 前記増殖因子が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血
    小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）
    、ＨＧＦ、及び角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）からなる群から選択される、請求項
    ４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 腫瘍発達を阻害する方法であって、１種又はそれ以上の増
    殖因子の受容体に対する核酸リガンドの生物学的有効量を、１種又はそれ以上の
    増殖因子に対する核酸リガンドの生物学的有効量とともに投与することを含んで
    なる、前記方法。
  47. 【請求項４７】 前記増殖因子が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血
    小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）
    、ＨＧＦ、及び角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）からなる群から選択される、請求項
    ４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 インテグリンに対する核酸リガンドであって、 ａ）核酸の候補混合物を製造する工程； ｂ）核酸の候補混合物を前記インテグリンと接触させる工程（ここで、候補混
    合物に比べて前記インテグリンに対する増加した親和性を有する核酸が候補混合
    物の残りから分画され得る）； ｃ）増加した親和性の核酸を候補混合物の残りから分画する工程；及び、 ｄ）増加した親和性の核酸を増幅して、前記インテグリンへ結合する相対的に
    より高い親和性及び特異性を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生
    する工程（それにより、前記インテグリンの核酸リガンドが同定され得る）を含
    んでなる方法により同定される、前記核酸リガンド。
  49. 【請求項４９】 前記インテグリンがβ3インテグリンである、請求項４８
    に記載の核酸リガンド。
  50. 【請求項５０】 前記β3インテグリンがαIIbβ3インテグリン及びαVβ3
    インテグリンからなる群から選択される、請求項４９に記載の核酸リガンド。
  51. 【請求項５１】 精製及び単離された、非天然に存在する、インテグリンに
    対する核酸リガンド。
  52. 【請求項５２】 精製された、非天然に存在する、インテグリンに対するＲ
    ＮＡリガンドであって、配列番号：１９４〜３０７からなる群から選択される、
    前記リガンド。
  53. 【請求項５３】 前記インテグリンが固形支持体に会合し、及び工程ｂ）〜
    ｃ）が前記固形支持体の表面上で起こる、請求項４８に記載の核酸リガンド。
  54. 【請求項５４】 前記固形支持体がビーズである、請求項５３に記載の核酸
    リガンド。
  55. 【請求項５５】 前記核酸の候補混合物が一本鎖核酸からなる、請求項４８
    に記載の核酸リガンド。
  56. 【請求項５６】 前記一本鎖核酸がリボ核酸である、請求項５５に記載の核
    酸リガンド。
  57. 【請求項５７】 前記一本鎖核酸がデオキシリボ核酸である、請求項５５に
    記載の核酸リガンド。
  58. 【請求項５８】 前記核酸の候補混合物が２’-Ｆ（２’-フルオロ）修飾リ
    ボ核酸を含む、請求項５６に記載の核酸リガンド。
  59. 【請求項５９】 前記核酸リガンドが一本鎖である、請求項５１に記載の精
    製及び単離された、非天然に存在する核酸リガンド。
  60. 【請求項６０】 前記核酸リガンドがＲＮＡである、請求項５９に記載の精
    製及び単離された、非天然に存在する核酸リガンド。
  61. 【請求項６１】 前記リガンドが２’-フルオロ（２’-Ｆ）修飾ヌクレオチ
    ドからなる、請求項６０に記載の精製及び単離された、非天然に存在するＲＮＡ
    リガンド。
  62. 【請求項６２】 インテグリンに対する核酸リガンドの単離の方法であって
    、 ａ）核酸の候補混合物を製造する工程； ｂ）核酸の候補混合物を前記インテグリンと接触させる工程（ここで、候補混
    合物に比べて前記インテグリンに対する増加した親和性を有する核酸が候補混合
    物の残りから分画され得る）； ｃ）増加した親和性の核酸を候補混合物の残りから分画する工程；及び、 ｄ）増加した親和性の核酸を増幅して、前記インテグリンへ結合する相対的に
    より高い親和性及び特異性を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生
    する工程（それにより、前記インテグリンの核酸リガンドが同定され得る）を含
    んでなる、前記方法。
  63. 【請求項６３】 前記候補混合物が一本鎖核酸を含む、請求項６２に記載の
    方法。
  64. 【請求項６４】 前記一本鎖核酸がリボ核酸を含む、請求項６３に記載の方
    法。
  65. 【請求項６５】 前記インテグリンがβ3インテグリンである、請求項６２
    に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記β3インテグリンがαIIbβ3インテグリンである、請
    求項６５に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 血小板活性化から生じる疾患の治療の方法であって、β3
    インテグリンに対する核酸リガンドの生物学的有効量を投与することを含んでな
    る、前記方法。
  68. 【請求項６８】 β3インテグリンに対する核酸リガンドの生物学的有効量
    を投与することを含んでなる、深在性静脈血栓症を治療する方法。
  69. 【請求項６９】 β3インテグリンに対する核酸リガンドと製剤的に許容さ
    れる賦形剤を含んでなる、深在性静脈血栓症の治療用の医薬組成物。
  70. 【請求項７０】 個体において深在性静脈血栓を検出する方法であって、 ａ）放射活性ラベルにコンジュゲートした、β3インテグリンに対する核酸リ
    ガンドを提供する工程； ｂ）前記核酸リガンドを前記個体へ投与する工程；及び ｃ）放射造影技術を使用して前記核酸リガンドの局在性を分析することによっ
    て前記血栓の部位を検出する工程を含んでなる、前記方法。
  71. 【請求項７１】 急性冠症候群及び経皮的冠血管形成術における使用のため
    の抗凝血組成物であって、β3インテグリンに対する核酸リガンドと製剤的に許
    容される賦形剤を含んでなる、前記組成物。
  72. 【請求項７２】 αVβ3活性化が貢献する病原性の因子である疾患の治療の
    方法であって、αVβ3に対する核酸リガンドの生物学的有効量と製剤的に許容さ
    れる賦形剤を投与することを含んでなる、前記方法。
  73. 【請求項７３】 前記疾患が、癌、糖尿病性網膜症、未熟の網膜症、黄斑変
    性、子宮内膜症、乾癬、慢性関節リウマチ、卒中、骨粗鬆症、及び再狭窄からな
    る群から選択される、請求項７２に記載の方法。
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