JP2009523430A - 試験試料の多重化分析 - Google Patents

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Abstract

本開示は、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出のための方法、デバイス、試薬、およびキットを記載する。１つの態様において、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。次いで、固体支持体を用い、質量分析を用い、そして定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を用いることを含めて、当業者に知られる多様な方法のいずれを用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化してもよい。

Description

発明の詳細な説明
発明の分野
［０００１］本発明は、一般的に、試料中のターゲット分子の検出のための方法、デバイス、試薬、およびキットに、そしてより具体的には、試験試料中に含有されうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化に関する。
背景
［０００２］以下の説明は、本発明に関連する情報の要約を提供し、そして本明細書に提供する情報または引用する刊行物のいずれかが、ここに請求する発明に対する先行技術であることの容認ではない。
［０００３］生物学的試料および他の試料中の生理学的に重要な分子の検出および定量化に向けられるアッセイは、科学的研究において、そして健康管理分野において重要なツールである。こうしたアッセイの１つのクラスは、固体支持体上に固定された１以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を伴う。アプタマーは、各々、非常に特異的な方式でそして非常に高いアフィニティーで、ターゲット分子に結合可能である。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい；また、例えば、米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、および米国特許第６，５０３，７１５号、各々、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」を参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させると、アプタマーが、試料中に存在するそれぞれのターゲット分子に結合し、そしてそれによって、試料中のターゲット分子の非存在、存在、量、および／または濃度の決定が可能になる。
［０００４］このアッセイの変形は、アプタマーが、ターゲット分子と共有結合する、または「光架橋する」のを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを使用する。例えば、米国特許第６，５４４，７７６号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」を参照されたい。これらの光反応性アプタマーはまた、光アプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）とも称される。例えば、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、および米国特許第６，２９１，１８４号、各々、表題「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」を参照されたい；また、例えば、米国特許第６，４５８，５３９号、表題「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」も参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させ、そして光アプタマーがそのターゲット分子と結合する機会を得た後、光アプタマーを光活性化し、そして固体支持体を洗浄して、いかなる非特異的結合分子も除去する。光アプタマーに結合したターゲット分子は、光アプタマー上の光活性化された官能基（単数または複数）によって達成される共有結合のため、一般的に、除去されないため、激しい洗浄条件を用いてもよい。この方式で、該アッセイは、試験試料中のターゲット分子の非存在、存在、量、および／または濃度の決定を可能にする。
［０００５］これらのアッセイ形式のどちらでも、試料と接触させる前に、アプタマーを固体支持体上に固定する。しかし、特定の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーの固定は、最適なアッセイを提供しない可能性もある。例えば、アプタマーをあらかじめ固定した結果、固体支持体表面上で、ターゲット分子とアプタマーが不十分にしか混合されず、これがおそらく長時間の反応時間につながり、そしてしたがって、ターゲット分子に対するアプタマーの十分な結合を可能にするためには、長時間のインキュベーション期間を要することになる可能性もある。さらに、光アプタマーをアッセイ中に使用すると、そして固体支持体として利用する物質に応じて、固体支持体は、光アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合の形成を達成するのに用いられる光を散乱させるかまたは吸収する傾向がありうる。さらに、固体支持体表面もまた、用いるいかなる標識剤にも曝露され、そしてこれらに影響を受ける可能性もあるため、使用する方法に応じて、アプタマーに結合したターゲット分子の検出は、不正確になりやすい可能性もある。最後に、固体支持体上のアプタマーの固定は、一般的に、試料へのアプタマーの曝露前に、アプタマー調製工程（すなわち固定）を伴い、そしてこの調製工程は、アプタマーの活性または官能性に影響を及ぼしうる。
［０００６］したがって、（１）アプタマーの活性、（２）アプタマー−ターゲット分子複合体に関する結合平衡を達成する効率、（３）アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合（単数または複数）の形成、ならびに（４）アプタマー−ターゲット分子複合体の検出に影響を及ぼす条件を最適化することによって、試験試料中のターゲット分子の検出および／または定量化のための高感度アッセイを提供する方法、デバイス、試薬、およびキットに関する必要性が存在する。
要約
［０００７］本開示には、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための方法、デバイス、試薬、およびキットが含まれる。１つの態様において、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体の形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。次いで、限定されるわけではないが、固体支持体を用い、質量分析を用い、そして定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を用いることを含めて、当業者に知られる多様な方法のいずれを用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化してもよい。
［０００８］１つの態様において、固体支持体の使用を通じて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。この態様において、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を固体支持体に付着させる。固体支持体をアプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）に接触させ、そしてアプタマー上に含まれるタグが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、付着を達成する。次いで、固体支持体上のプローブと会合しているアプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして場合によって定量化する。検出および場合による定量化に先立つ任意の時点で、すなわち、固体支持体へのアプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）の付着前または付着後のいずれかいつでも、複合体を標識剤と接触させて、結合したターゲット分子の検出を可能にする。
［０００９］別の態様において、質量分析を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。この態様において、固体支持体を、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）と接触させ、そしてアプタマー上に含まれるタグが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を固体支持体に付着させる。これは、試験試料の残りから、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を分配し、それによって、質量分析前に、ターゲット分子を濃縮し、そしてこの分析ツールを用いた、複合体混合物からの分析物の検出および定量化を改善することを容易にする。次いで、固体支持体上のプローブと会合しているアプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を溶出し、そして質量分析を用いて分析し、質量分析は、ターゲット分子を同定し、そしてしたがって検出するのに使用可能なピークのスペクトルを生じる。ターゲット分子が検出されたならば、場合によって、当業者に知られる標準的技術によって、定量化もまたしてもよい。１つの態様において、ターゲット分子がタンパク質であるならば、質量分析を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を分析する前に、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を、例えばプロテイナーゼＫまたはトリプシンなどのプロテアーゼ酵素で消化して、結合したターゲット分子の断片を生じてもよく、次いで、この断片を用いてターゲット分子を同定し、そしてそれによってターゲット分子の検出および場合によっては定量化を可能にしてもよい。
［００１０］さらなる態様において、Ｑ−ＰＣＲを用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。この態様において、試験試料中の未結合（ｆｒｅｅ）アプタマーを、検出および／または定量化前に、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）から分配する。ＰＣＲを実行し、そして試験試料中のターゲット分子に結合しているアプタマーの量または濃度を、直接または間接的にのいずれかで決定することによって、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を定量化する。試験試料中のターゲット分子の量または濃度は、一般的に、Ｑ−ＰＣＲを用いることによって定量化されたアプタマーの量または濃度と正比例する。この方式で、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を定量化するのに使用可能な、典型的な方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ；米国特許第５，２１０，０１５号もまた参照されたい）である。
詳細な説明
［００２８］本明細書に開示する本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術レベル内の化学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の慣用法を使用する。こうした技術は文献に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（現行版）； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌ． ＩおよびＩＩ（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ監修）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ． Ｇａｉｔ監修、現行版）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｈｉｇｇｉｎｓ監修、現行版）； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｈｉｇｇｉｎｓ監修、現行版）を参照されたい。
［００２９］本明細書に引用するすべての刊行物、公開特許文書、および特許出願は、本発明が属する当該技術分野（単数または複数）の技術のレベルを示す。本明細書に引用するすべての刊行物、公開特許文書、および特許出願は、各々の個々の刊行物、公開特許文書、または特許出願が、具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いまで、本明細書に援用される。
［００３０］付随する請求項を含めて、本明細書で用いる際、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、内容が明らかに別に指示しない限り、複数の言及も含まれ、そして「少なくとも１つ」および「１以上」と交換可能に用いられる。したがって、「単数のアプタマー（ａｎ ａｐｔａｍｅｒ）」への言及には、アプタマーの混合物が含まれ、「単数のプローブ（ａ ｐｒｏｂｅ）」への言及には、プローブの混合物が含まれるなどである。
［００３１］本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、およびそれらの任意の変形は、非包括的包含を含むと意図され、したがって、要素または要素のリストを含むか、該要素が含まれるか、または該要素を含有する、問題のプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物には、これらの要素のみが含まれるのでなく、問題のこうしたプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物に明確に列挙されていないかまたは本質的でない、他の要素もまた、含まれてもよい。
［００３２］本開示には、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための方法、デバイス、試薬、およびキットが含まれる。開示する方法、デバイス、試薬、およびキットは、（１）アプタマーの活性、（２）アプタマー−ターゲット分子複合体に関する結合平衡を達成する効率、（３）アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合（単数または複数）の形成、ならびに（４）アプタマー−ターゲット分子複合体の検出に影響を及ぼす条件を最適化することによって、試験試料中のターゲット分子の検出および／または定量化のための高感度アッセイを提供する。
［００３３］図１Ａおよび１Ｂと関連して、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと試験試料をまず接触させることによって、試験試料中のターゲット分子の存在を検出し、そしてまたは定量化する。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体の形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。次いで、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。
［００３４］１つの態様において、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を固体支持体に付着させることによって、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃと関連して、試験試料中に存在しうるターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な方法において、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体の形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を固体支持体に付着させる。アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）と固体支持体を接触させ、そしてアプタマー上に含まれるタグが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、付着を達成する。次いで、固体支持体上のプローブと会合しているアプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして場合によって定量化する。検出および場合による定量化に先立つ任意の時点で、すなわち、固体支持体へのアプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）の付着前または付着後のいずれかいつでも、複合体を標識剤と接触させて、結合したターゲット分子の検出を可能にする。
［００３５］本明細書において、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、そしてこうしたヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／または類似体、あるいは化学的に修飾されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが含まれてもよい。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」には、二本鎖または一本鎖分子、ならびに三重らせん分子が含まれる。
［００３６］存在する場合、ヌクレオチドの化学的修飾には、単独でまたは任意の組み合わせで、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾（例えば、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３イル）エチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常な塩基対形成の組み合わせ等が含まれてもよい。修飾にはまた、キャッピングなどの３’および５’修飾もまた含まれてもよい。他の修飾には、類似体での１以上の天然存在ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結での修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、および荷電連結での修飾（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレンなど）での修飾、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、および修飾連結での修飾（例えばアルファ・アノマー核酸など）が含まれてもよい。さらに、糖に通常存在する任意のヒドロキシル基を、ホスホン酸基またはリン酸基によって置換するか；標準的保護基によって保護するか；あるいはさらなるヌクレオチドまたは固体支持体へのさらなる連結に備えて活性化してもよい。５’および３’末端ＯＨ基をリン酸化するか、あるいは、アミン、約１〜約２０炭素原子の有機キャッピング基部分、または約１〜約２０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーまたは他の親水性もしくは疎水性生物学的もしくは合成ポリマーの有機キャッピング基部分で置換してもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾を、ポリマーの組み立て前または後に行ってもよい。非ヌクレオチド構成要素によって、ヌクレオチド配列を中断してもよい。標識構成要素とのコンジュゲート化によるなどで、重合後にポリヌクレオチドをさらに修飾してもよい。
［００３７］ポリヌクレオチドはまた、当該技術分野に一般的に知られるリボースまたはデオキシリボース糖の類似体型も含有してもよく、これらには、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、無環類似体および無塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。上に記載するように、１以上のホスホジエステル連結を、別の連結基によって置換してもよい。これらの別の連結基には、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置換されている態様が含まれ、式中、各ＲまたはＲ’は、独立に、Ｈ、あるいはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を場合によって含有する、置換または非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。糖、プリン、およびピリミジンの類似型の置換は、最終産物の設計に好都合である可能性もあり、例えばポリアミン主鎖のような別の主鎖構造も好都合でありうる。
［００３８］本明細書において、「アプタマー」および「核酸リガンド」は、交換可能に用いられ、ターゲット分子に対する特異的結合アフィニティーを有する核酸を指す。アフィニティー相互作用は、程度の問題であることが認識される；が、この文脈では、ターゲットに対するアプタマーの「特異的結合アフィニティー」は、試験試料中の他の構成要素に結合するよりも、一般的に、はるかにより高い度合いのアフィニティーで、アプタマーがターゲットに結合することを意味する。（単数の）「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは種類のコピーのセットである。アプタマーには、いかなる適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。「（複数の）アプタマー」はこうした分子セットの１より多くを指す。異なるアプタマーは、同数かまたは異なる数か、いずれのヌクレオチドを有してもよい。本明細書に開示するいかなる方法にも、１以上のアプタマーの使用が含まれてもよい。本明細書に開示するいかなる方法にも、また、同じターゲット分子に特異的に結合する２以上のアプタマーの使用も含まれてもよい。以下にさらに記載するように、アプタマーにはタグが含まれてもよい。アプタマーにタグが含まれる場合、アプタマーのすべてのコピーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーに、各々、タグが含まれる場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれを有してもよい。
［００３９］ＳＥＬＥＸ法を含む、いかなる既知の方法を用いて、アプタマーを同定してもよい。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい。同定されたならば、化学的合成法および酵素的合成法を含めて、いかなる既知の方法にしたがって、アプタマーを調製するかまたは合成してもよい。
［００４０］用語「ＳＥＬＥＸ」および「ＳＥＬＥＸ法」は、本明細書において交換可能に用いられ、一般的に、（１）望ましい方式でターゲット分子と相互作用する、例えばタンパク質に高いアフィニティーで結合する、核酸の選択と、（２）これらの選択された核酸の増幅の組み合わせを指す。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい。ＳＥＬＥＸ法を用いて、ターゲットと共有結合するアプタマー、ならびにターゲットに非共有的に結合するアプタマーを生成してもよい。例えば、米国特許第５，７０５，３３７号、表題「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」を参照されたい。
［００４１］本明細書に開示するように、アプタマーは、「タグ」をさらに含んでもよく、タグは、固体支持体にアプタマーを（およびそれに結合したいかなるターゲット分子も）付着させるかまたは固定する手段を提供する構成要素を指す。（単数の）「タグ」は、プローブと会合可能な構成要素の１つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「（複数の）タグ」は、構成要素のこうしたセットの１より多くを指す。当該技術分野に知られるいかなる方法によって、タグをアプタマーに付着させてもよいし、またはタグがアプタマーに含まれてもよい。一般的に、タグは、アプタマーが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合することを可能にする。タグは、固体支持体上の空間的に定義されたアドレスに、アプタマー共有複合体を局在させることを可能にしうる。したがって、異なるタグは、固体支持体上の空間的に定義された異なるアドレスに、異なるアプタマー共有複合体を局在させることを可能にしうる。タグは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディー、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいはプローブ（または以下に記載するようなリンカー分子）が、特異性を持って結合するかまたは別の方式で会合するように設計されるかまたは設定されうる任意の他の構造であってもよい。一般的に、タグは、分子内で、それ自体と、あるいはそのタグが付着しているかまたはそのタグが一部となっているアプタマーと相互作用しないように設定される。ＳＥＬＥＸを用いてアプタマーを同定する場合、ＳＥＬＥＸ前またはＳＥＬＥＸ後のいずれかで、タグをアプタマーに付加してもよい。１つの態様において、ＳＥＬＥＸ後、アプタマーの５’端上にタグが含まれる。別の態様において、ＳＥＬＥＸ後、アプタマーの３’端上にタグが含まれる。
［００４２］１つの態様において、タグには、プローブ配列と直接ハイブリダイズすることによって、相補的ポリヌクレオチド配列を含むプローブと直接会合するように設計されたポリヌクレオチドが含まれる。この態様において、タグは、一般的に設定され、そしてタグが完全な相補体を含むプローブ以外のプローブとタグがハイブリダイズしないような条件下で、ハイブリダイゼーション反応が行われる。
［００４３］いくつかの態様において、タグは、アプタマー自体の部分であるヌクレオチドを含む。例えば、ＳＥＬＥＸを用いてアプタマーを同定する場合、アプタマーには、一般的に、アプタマーに応じて多様であるヌクレオチド配列、すなわち可変領域によって３’固定端から分離された５’固定端が含まれる。１つの態様において、タグは、アプタマーの固定端に含まれる任意の適切な数のヌクレオチド、例えば、固定端全体または固定端の任意の一部を含んでもよく、固定端より内部のヌクレオチドを含んでもよい。別の態様において、タグは、アプタマーの可変領域内に含まれる任意の適切な数のヌクレオチドを含んでもよいし、例えば、可変領域全体または可変領域の任意の一部を含んでもよい。さらなる態様において、タグは、可変領域および固定端の１つの両方に重なり合うヌクレオチドの任意の適切な数を含んでもよく、すなわち、タグは、可変領域の任意の一部（すべてを含む）および固定端の任意の一部（すべてを含む）を含んでもよい。
［００４４］別の態様において、タグは直接プローブに会合し、そしてプローブに共有結合して、それによって、固体支持体表面にアプタマーを共有結合させてもよい。この態様において、タグおよびプローブには、プローブとタグとの会合に際して、共有結合を生じる化学反応を経るために、互いに十分に近接している、適切な反応基が含まれてもよい。反応は、自発的に起きてもよいし、あるいは活性化、例えば光活性化または化学的活性化を必要としてもよい。典型的な態様において、タグには、ジエン部分が含まれ、そしてプローブには求ジエン（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ）が含まれて、そして共有結合形成は、ジエンおよび求ジエンの自発的なディールス−アルダー・コンジュゲート化反応から生じる。例えば、Ｎ−マンニッヒ反応、ジスルフィド形成、カーティス反応、アルドール縮重、シッフ塩基形成、およびマイケル付加などの任意の適切な補完的化学反応を用いてもよい。
［００４５］別の態様において、以下にさらに記載するように、タグは、例えばリンカー分子を通じて、プローブと間接的に会合する。この態様において、タグには、リンカー分子の特定の領域または構成要素に相補的なポリヌクレオチド配列が含まれてもよい。タグは、一般的に設定され、そしてリンカー分子中に含まれるポリヌクレオチド配列以外のポリヌクレオチド配列とタグがハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション反応が行われる。
［００４６］タグにポリヌクレオチドが含まれる場合、ポリヌクレオチドには、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。１つの態様において、タグには、少なくとも約１０ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、タグには、約１０〜約４５ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、タグには、少なくとも約３０ヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドが含まれる、異なるタグには、同じ数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドのいずれかが含まれてもよい。
［００４７］本明細書において、用語「約」は、数値が関連する項目の基本的な機能が不変であるような、数値の重要でない修飾または変動を示す。
［００４８］本明細書において、「会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ、ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）」およびそのいかなる変形も、所定の複合体形成または反応条件下で、タグ−プローブ複合体から、試験試料の「非会合」または非結合物質、例えば非結合構成要素を分離することを可能にするように、十分に安定な複合体を生じる、タグおよびプローブ間の相互作用または複合体形成を指す。特異性を持って互いに相互作用して、そして結合することによって、タグおよびプローブは、互いに直接会合しうる。タグおよびプローブはまた、その複合体形成がリンカー分子によって仲介される際などに、互いに間接的に会合しうる。
［００４９］本明細書において、「プローブ」は、タグと直接または間接的にのいずれかで会合するように設定された分子を指す。（単数の）「プローブ」は、タグと直接または間接的にのいずれかで会合することによって、固体支持体にアプタマーを固定することが可能な、分子の１つのタイプまたは多分子構造の１つのタイプのコピーのセットである。「（複数の）プローブ」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。プローブは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいはタグ（またはリンカー分子）が、特異性を持って結合するかまたは別の方式で会合するように設計されるかまたは設定されうる任意の他の構造であってもよい。当該技術分野に知られるいかなる方法によって、プローブを共有的または非共有的のいずれかで、固体支持体に付着させてもよい。
［００５０］１つの態様において、プローブには、ポリヌクレオチド・タグ配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。この態様において、プローブ配列は、一般的に設定され、そしてプローブが相補配列を含むタグ以外のヌクレオチド配列にはプローブがハイブリダイズしないような条件下で、ハイブリダイゼーション反応が行われる（すなわち、プローブは、一般的に設定され、そしてプローブが、異なるタグまたはアプタマーとハイブリダイズしないような条件下で、ハイブリダイゼーション反応が行われる）。
［００５１］別の態様において、プローブは、タグと間接的に、例えばリンカー分子を通じて会合する。この態様において、プローブには、リンカー分子の特定の領域または構成要素に相補的なポリヌクレオチド配列が含まれてもよい。プローブは、一般的に設定され、そしてプローブが、リンカー分子中に含まれるポリヌクレオチド配列以外のポリヌクレオチド配列とはハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション反応が行われる。
［００５２］プローブにポリヌクレオチドが含まれる場合、ポリヌクレオチドには、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。１つの態様において、プローブには、少なくとも約１０ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、プローブには、約１０〜約４５ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、プローブには、少なくとも約３０ヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドが含まれる、異なるプローブには、同じ数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドのいずれかが含まれてもよい。
［００５３］本明細書において、「リンカー分子」は、タグとプローブの会合を仲介するよう設定される１以上の分子を指す。一般的に、リンカー分子は、タグに連結するための官能性およびプローブに連結するための官能性を含む点で、二官能性である。（単数の）「リンカー分子」は、タグとプローブを会合させることが可能な、分子（単数または複数）または多分子構造（単数または複数）の１つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「（複数の）リンカー分子」は、分子または多分子構造のこうしたセットの１より多くを指す。リンカー分子は、任意の適切な設定を有してもよく、そしてポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいは特異性を持ってタグおよびプローブ間の会合を仲介するように設計されるかまたは設定されうる任意の他の構造または化学的構成要素を含む、任意の適切な構成要素を含んでもよい。リンカー分子は、脂肪族または芳香族であってもよい。
［００５４］リンカー分子の組成は、本明細書に開示する方法のいずれにも重要ではない。リンカー分子が親水性であることがしばしば好ましい。一般的な規則として、特定のリンカー分子の長さを選択して、合成の好適性およびプローブとタグの会合を仲介する際の容易さを提供してもよい。リンカー分子は、官能性を含有してはならず、または開示する方法にしたがって望ましい反応に、干渉するであろう長さのものであってはならない。
［００５５］図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに関連して、本明細書開示の任意の方法でリンカー分子を使用する際に、アッセイ実行中の任意の適切な時点で、リンカー分子を導入してもよいし、そしてリンカー分子をまず、タグまたはプローブのいずれかと接触させてもよい。例えば、アプタマー共有複合体が固体支持体上のプローブに接触する前の任意の時点で、アプタマー上に含まれるタグを、リンカー分子と接触させてもよい。別の態様において、プローブを、アプタマー共有複合体上のタグに曝露する前の任意の時点で、固体支持体に付着したプローブを、リンカー分子と接触させてもよい。さらなる態様において、実行する特定のアッセイの複雑さおよび反応条件に応じて、例えば、プローブをリンカー分子、およびアプタマー共有複合体上のタグに同時に接触させてもよい。
［００５６］リンカー分子は、一般的に、タグ会合構成要素およびプローブ会合構成要素を含む。タグ会合構成要素およびプローブ会合構成要素は、特定のアッセイで利用される特定のタグおよびプローブに基づいて、独立に選択される。１つの態様において、タグ会合構成要素は、タグ中に含まれるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドである。別の態様において、プローブ会合構成要素は、プローブ中に含まれるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドである。さらなる態様において、タグ会合構成要素はポリヌクレオチドであり、そしてプローブ会合構成要素もまたポリヌクレオチドである。
［００５７］さらなる態様において、リンカー分子には、第三の構成要素によってプローブ会合構成要素から分離されたタグ会合構成要素が含まれる。この態様において、第三の構成要素には、１以上の分子または下位構成要素（ｓｕｂ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）が含まれてもよく、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、脂肪族炭素分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいは例えば、タグ会合構成要素およびプローブ会合構成要素間の柔軟性を増加させることによるなどで、プローブとタグの会合を補助しうる任意の他の化学的構造または構成要素が含まれてもよい。
［００５８］リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。１つの態様において、リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、少なくとも約１０ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、約１０〜約４５ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、少なくとも約３０ヌクレオチドが含まれる。本明細書に開示する任意の方法で用いられるリンカー分子には、同じ数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドのいずれかを有するポリヌクレオチド構成要素が含まれてもよい。
［００５９］本明細書において、「光アプタマー」、「光反応性核酸リガンド」、および「光反応性アプタマー」は交換可能に用いられ、ターゲット分子に共有結合するかまたは該分子と「架橋する」ことも可能な、１以上の光反応性官能基を含有するアプタマーを指す。例えば、天然存在核酸残基を修飾して、適切な波長の照射供給源に対する曝露に際して核酸残基に光反応性を与える、化学的官能基を含ませてもよい。いかなる既知の方法を用いて、光アプタマーを同定し、そして／または調製してもよい。いくつかの態様において、光ＳＥＬＥＸ法を用いて、光反応性アプタマーを同定する。例えば、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、および米国特許第６，２９１，１８４号、各々、表題「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」を参照されたい；また、例えば、米国特許第６，４５８，５３９号、表題「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」も参照されたい。他の態様において、アプタマーを調製し、そして続いて、１以上の光反応性官能基を取り込むように修飾して、それによって光アプタマーを生成する。これらの態様において、アプタマーにおいて、例えば、１以上のチミジンおよび／またはシジチン・ヌクレオチドなどの１以上の他のヌクレオチドの代わりに、光反応性核酸残基を置換することによるか、あるいは光反応性官能基を含むように１以上の核酸残基を修飾することによるかのいずれかで、１以上の光反応性核酸残基をアプタマーに取り込んでもよい。
［００６０］光アプタマー内に取り込んでもよい典型的な光反応性官能基には、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−ヨードビニルウラシル、５−アジドウラシル、４−チオウラシル、５−チオウラシル、４−チオシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ブロモビニルシトシン、５−ヨードビニルシトシン、５−アジドシトシン、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヨードアデニン、８−アジドグアニン、８−ブロモグアニン、８−ヨードグアニン、８−アジドヒポキサンチン、８−ブロモヒポキサンチン、８−ヨードヒポキサンチン、８−アジドキサンチン、８−ブロモキサンチン、８−ヨードキサンチン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］シトシン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］ウラシル、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−ブロモアデニン、および７−デアザ−７−ブロモグアニンが含まれる。
［００６１］これらのヌクレオシドに基づく典型的な光反応性官能基に加えて、適切なリンカー分子を用いてアプタマーの末端に付加可能な他の光反応性官能基もまた用いてもよい。こうした光反応性官能基には、ベンゾフェノン、アントラキノン、４−アジド−２−ニトロ−アニリン、ソラレン、これらのいずれかの誘導体等が含まれる。
［００６２］いかなる適切な方法によって、光アプタマー内に取り込まれる光反応性官能基を活性化してもよい。１つの態様において、光アプタマー・アフィニティー複合体を、電磁放射線の供給源に曝露することによって、光反応性官能基を含有する光アプタマーを架橋する。適切なタイプの電磁放射線には、紫外光、可視光、Ｘ線、およびガンマ線が含まれる。適切な放射線供給源には、単色光またはフィルター処理した多色光のいずれかを利用する供給源が含まれる。
［００６３］１つの態様において、例えば４−アジド−２−ニトロ−アニリンなどの光反応性ヌクレオチドを光アプタマー内に取り込んで、そして約３２５ｎｍ〜約４７０ｎｍの範囲の波長を有する光を用いて、この光アプタマーを含む光アプタマー・アフィニティー複合体に照射してもよい。例えば、単一の発光ダイオード（ＬＥＤ）または一連のＬＥＤのいずれかを用いて、安価なＬＥＤで、これらの波長での励起を達成してもよく、これは所要電力が適度であるためである。４６５〜４７５ｎｍの範囲の波長、１００度の視角を有し、そして３８ルーメンの光を提供する、ほぼ単色の光を、１以上の高出力ＬＥＤによって供給する。望ましい光反応性官能基が、ＬＥＤによって生じる波長では励起不能である場合、しばしば、電子求引基または電子供与基の適切な置換を用いて、光反応性官能基の励起波長を適度にシフトさせて、ＬＥＤによって生じる波長での光反応性官能基の励起を可能にしてもよい。
［００６４］１つの態様において、光反応性ヌクレオチドを光アプタマー内に取り込んで、そして約３００ｎｍ〜約３５０ｎｍの範囲の波長を有する光を用いて、この光アプタマーを含む光アプタマー・アフィニティー複合体に照射して、光アプタマー・アフィニティー複合体を光アプタマー共有複合体に変換してもよい。
［００６５］１つの態様において、例えば５−ヨードウラシルまたは５−ヨードシトシンなどの光反応性ヌクレオチドを光アプタマー内に取り込んで、そして約３２０ｎｍ〜約３２５ｎｍの範囲の波長を有する光を用いて、この光アプタマーを含む光アプタマー・アフィニティー複合体に照射してもよい。この組み合わせは、他の非特異的光反応を誘導せずに、ターゲット分子への、発色体含有光アプタマーの選択的光架橋を促進する。例えば、ターゲットタンパク質の場合、ターゲットタンパク質中に含まれうるいかなるトリプトファン残基、ならびに光アプタマー中に含まれうるいかなるチミンおよびウラシル塩基もまた、光反応性であってもよい。５−ヨードウラシルまたは５−ヨードシトシンは、約３２５ｎｍの波長を有する光を吸収するが、トリプトファンおよび天然存在核酸塩基は吸収しないため、この波長の光を用いると、光アプタマー・アフィニティー複合体内の５−ヨードウラシル（単数または複数）または５−ヨードシトシン（単数または複数）での選択的光反応が可能になる。例えば、約３２０ｎｍの波長の周波数重複調節可能（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｄｏｕｂｌｅｄ ｔｕｎａｂｌｅ）色素レーザー放出光によって、または約３２５ｎｍの波長のヘリウム・カドミウム・レーザー放出光によって、約３２０ｎｍ〜約３２５ｎｍの範囲の波長を有する単色光を供給してもよい。
［００６６］さらなる態様において、光アプタマー・アフィニティー複合体を、塩化キセノン（ＸｅＣｌ）エキシマー・レーザーセットに曝露して、約３０８ｎｍの波長の光を放出させてもよい。この態様において、光アプタマーには、光反応性官能基（例えば５−ブロモウラシルまたは５−ブロモシトシン）が含まれてもよく、そして光アプタマー・アフィニティー複合体を光源で処理すると、光反応性官能基が光活性化されるように働いて、光アプタマーがターゲット分子と架橋され、そして光アプタマー共有複合体が形成される。
［００６７］さらに別の態様において、約３１３ｎｍの波長の光を放出するようにセットされた高圧水銀ランプに、光アプタマー・アフィニティー複合体を曝露することによって、光アプタマーをターゲットに架橋してもよい。さらなる態様において、波長フィルターを使用して、放出光が約３００ｎｍより大きくなるように制限して、光アプタマー・アフィニティー複合体中に含まれるもの以外の発色体の活性化を最小限にしてもよい。
［００６８］さらなる態様において、約２５４ｎｍの波長の光を放出するようにセットされた低圧水銀ランプに、光アプタマー・アフィニティー複合体を曝露して、この波長が次いで、リンによって吸収され、そして約３００ｎｍ〜約３２５ｎｍの範囲の波長で再放出されることによって、光アプタマーをターゲットに架橋してもよい。この態様において、再放出された光をフィルター処理して、ターゲットタンパク質を損傷しうる、リンに吸収されない約２５４ｎｍのいかなる光も、ならびに約２９０ｎｍ〜約３０５ｎｍの範囲の波長のいかなる光も除去する。
［００６９］さらに別の態様において、例えばヨードウラシルまたはブロモシトシンなどのハロゲン光反応性官能基を光アプタマー内に取り込んでもよく、そしてこの光アプタマーを含む光アプタマー・アフィニティー複合体を、約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の波長を有する光で処理してもよい。例えば、約３５５ｎｍにセットされたＮｅｏｄｙｍｉｕｍ ＹＡＧレーザーの第三高調波由来の単色光または約３５１ｎｍのフッ化キセノン（ＸｅＦ）エキシマーレーザーの第一高調波由来の単色光を用いてもよい。
［００７０］本明細書において、「ターゲット分子」および「ターゲット」は交換可能に用いられ、アプタマーが高いアフィニティーおよび特異性で結合可能であり、そして試験試料中に存在しうる、関心対象のいかなる分子も指す。「関心対象の分子」には、特定の分子のいかなる重要でない変動も含まれ、例えば、タンパク質の場合、例えばアミノ酸配列の重要でない変動、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作または修飾のいずれか、例えば分子の同一性を実質的に改変しない標識構成要素とのコンジュゲート化が含まれる。「ターゲット分子」または「ターゲット」は、アプタマーに結合可能な分子または多分子構造の１つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「ターゲット分子」または「ターゲット」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。典型的なターゲット分子には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子、細胞、組織、および前述の任意のものの任意の断片または部分が含まれる。任意のサイズの実質的に任意の化学的または生物学的分子に関してアプタマーを同定してもよく、そしてしたがって、任意のサイズの実質的に任意の化学的または生物学的分子も適切なターゲットでありうる。また、ターゲットを修飾して、ターゲットおよびアプタマー間の相互作用の可能性または強度を増進してもよい。典型的な態様において、ターゲット分子はタンパク質である。ＳＥＬＥＸターゲットがペプチドである方法に関しては、米国特許第６，３７６，１９０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＥＬＥＸ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ」を参照されたい。
［００７１］「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖でもまたは分枝鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸によって中断されてもよい。該用語はまた、天然にまたは介入によって；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作または修飾のいずれか、例えば標識構成要素とのコンジュゲート化によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。定義内にやはり含まれるのは、例えば、アミノ酸の１以上の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当該技術分野に知られる他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは一本鎖または会合鎖であってもよい。
［００７２］本明細書において、「非ターゲット分子」および「非ターゲット」は、交換可能に用いられ、アプタマーと非特異的複合体を形成しうる、試験試料中に含有される分子を指す。（単数の）「非ターゲット分子」または「非ターゲット」は、アプタマーに結合可能な分子または多分子構造の１つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「（複数の）非ターゲット分子」または「（複数の）非ターゲット」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。第一のアプタマーに関して非ターゲットである分子が、第二のアプタマーに関してターゲットであってもよいことが認識されるであろう。同様に、第一のアプタマーに関してターゲットである分子は、第二のアプタマーに関して非ターゲットであってもよい。
［００７３］本明細書において、用語「アプタマー・アフィニティー複合体」は、ターゲット分子とアプタマーの相互作用によって形成される非共有複合体を指す。（単数の）「アプタマー・アフィニティー複合体」は、対応するターゲット分子に結合したアプタマーによって形成される複合体の１つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「（複数の）アプタマー・アフィニティー複合体」は、複合体のこうしたセットの１より多くを指す。アプタマー・アフィニティー複合体は、一般的に、環境条件における変化、例えば温度の増加、塩濃度の増加、または変性剤の添加によって、逆転するかまたは解離することも可能である。
［００７４］本明細書において、用語「アプタマー共有複合体」は、アプタマーが、ターゲット分子と共有結合を形成するよう誘導されているか、または別の方式でターゲット分子と共有結合を形成する、アプタマー・アフィニティー複合体を指す。（単数の）「アプタマー共有複合体」は、対応するターゲット分子に共有結合したアプタマーによって形成される複合体の１つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「（複数の）アプタマー共有複合体」は、複合体のこうしたセットの１より多くを指す。光アプタマーに関して上述した部分を含めて、アプタマー上の化学部分の光活性化によって、アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合または連結を誘導してもよい。アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合または連結はまた、化学的に誘導されてもよい。アプタマー中に含まれて、そしてターゲットとの共有連結を誘導するのに用いることも可能な化学基には、限定されるわけではないが、アルデヒド、マレイミド、アクリリル誘導体、ジアゾニウム誘導体、チオール等が含まれる。いくつかの態様において、例えばマレイミドまたはジアゾニウム塩などの化学的架橋基は、単に、特異的でそして十分に増進された化学的反応性が起こるために必要な、適切な環境および反応基の並置を提供することによって、アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換可能である。他の態様において、化学的架橋剤、例えばアルデヒド基は、アプタマー・アフィニティー複合体を、安定な不可逆的アプタマー共有複合体に変換するために、別の構成要素、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムの付加を必要としうる。さらに他の態様において、こうした化学的架橋剤はアプタマー中にまったく含まれず；第三の試薬を用いて、アプタマーおよびターゲット間の共有結合を促進することによって、アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換する。例えば、アミン反応性部分（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、アルデヒド、またはイミデート）およびヌクレオシド反応基（例えばヨードアセトアミドまたは活性化アルデヒド）の両方を含有するホモおよびヘテロ二重官能性試薬は、アプタマー・アフィニティー複合体、例えばアプタマーおよびターゲットタンパク質によって形成されるアフィニティー複合体の共有複合体形成を誘導可能である。
［００７５］用語「試験試料」は、本明細書において、複数の分子を含有し、そして少なくとも１つのターゲット分子を含みうる、いかなる物質、溶液、または混合物も指す。用語、試験試料には、以下に定義するような生物学的試料、ならびに例えば汚染されたかまたは潜在的に汚染された水および産業廃水などの、環境または毒性試験に使用可能な試料が含まれる。試験試料はまた、準備プロセス、例えば製造プロセスの最終産物、中間産物、または副産物であってもよい。試験試料には、生物から、またはいくつかの他の供給源（例えば環境または産業供給源）から得られた、物質、溶液、または混合物に添加されている、任意の適切なアッセイ培地、緩衝液、または希釈剤が含まれてもよい。
［００７６］用語「生物学的試料」は、生物から得られた任意の物質、溶液、または混合物を指す。これには、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿、および血清を含む）、痰、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、および脳脊髄液が含まれる。これにはまた、前述のすべての実験的に分離された分画も含まれる。用語「生物学的試料」にはまた、例えば糞便試料、組織試料、または組織生検由来のものなどの、ホモジナイズした固形物質を含有する、物質、溶液、または混合物も含まれる。用語「生物学的試料」にはまた、組織培養、細胞培養、細菌培養、またはウイルス培養由来の物質、溶液、または混合物も含まれる。
［００７７］「固体支持体」は、共有または非共有結合いずれかを通じて、直接または間接的に分子が付着可能な表面を有する、任意の支持体を指す。固体支持体には、表面に付着するプローブのために物理的支持を提供可能ないかなる支持物質も含まれてもよい。物質は、一般的に、表面へのプローブの付着、およびアッセイの実行中に出会う、いかなる続く処理、取り扱い、またはプロセシングに関連する条件にも耐えることが可能である。物質は、天然存在、合成、または天然存在物質の修飾であってもよい。適切な固体支持体物質には、それのみで、または他の物質と組み合わせて用いられるかいずれかの、シリコン、グラファイト、鏡面、ラミネート、セラミックス、プラスチック（例えばポリ（塩化ビニル）、シクロ−オレフィン・コポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはテフロン（登録商標））、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル））、ゲルマニウム、ガリウムヒ素、金、銀等が含まれてもよい。シリカを含み、そしてさらに例えばＢｉｏｇｌａｓｓとして入手可能なガラスを含む、ガラスなどの、さらなる堅い物質を考慮してもよい。使用してもよい他の物質には、例えば、調節孔ガラスビーズなどの多孔物質が含まれる。表面上に取り込まれた、１以上の官能基、例えば任意のアミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基などを有することが可能な、当該技術分野に知られる任意の他の物質もまた、意図される。
［００７８］固体支持体に用いる物質は、単純から複雑の範囲に渡る、多様な設定のいずれをとってもよい。固体支持体は、ストリップ、プレート、ディスク、ロッド、ビーズを含む粒子、試験管、ウェル等を含む、いくつかの形状のいずれか１つであってもよい。物質は、通常、例えばスライドのように、比較的平面であるが、例えばビーズのように球状でも、または筒状（例えばカラム）であってもよい。多くの態様において、物質は、一般的に、長方形の固体として成形される。例えばプローブのアレイなどの、多数のあらかじめ決定された配置をシート上で合成し、次いでさいの目に切り、すなわちスコアの線に沿って、単一アレイ支持体になるまで割ることによって切断してもよい。使用可能な典型的な固体支持体には、マイクロタイターウェル、顕微鏡スライド、膜、常磁性ビーズ、帯電紙、ラングミュア−ブロジェット膜、シリコンウェハーチップ、フロースルーチップ、およびマイクロビーズが含まれる。
［００７９］固体支持体表面は、通常、固体支持体を形成する支持体物質の外部部分である。プローブが結合している固体支持体表面は、平滑であってもまたは実質的に平面であっても、あるいは、くぼみ、溝、上昇、または他の外見などの、不規則性を有してもよい。所望の方式で、表面の特性を修飾するように働く化合物の１以上の異なる層で、表面を修飾してもよい。多様な態様において、一般的に、こうした表面修飾層は、存在するならば、単一分子の厚さから約１ｍｍ、または単一分子の厚さから約０．１ｍｍ、または単一分子の厚さから約０．００１ｍｍの厚さの範囲であってもよい。
［００８０］関心対象の表面修飾層には、無機および有機層、例えば金属、酸化金属、ポリマー、小有機分子等が含まれる。関心対象のポリマー層には、メタクリレート・コポリマー、ポリアクリルアミド、多糖、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート等が含まれ、ここで、ポリマーは、ヘテロまたはホモポリマー性であってもよく、そして付着した別個の官能部分（例えばコンジュゲート化された部分）を持ってもまたは持たなくてもよい。関心対象の他の表面修飾には、例えばヒドロゲルなどの三次元ネットワークが含まれる。当該技術分野に知られる任意の適切なヒドロゲルを用いてもよい。例えば、米国特許出願公報第２００３／０２１８１３０号、表題「Ｂｉｏｃｈｉｐｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ」、米国特許出願公報第２００５０１４７９９４号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｉｎ ａ Ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ−Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ， ａ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、米国特許出願公報第２００５００５９０８号、表題「Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｂｌｅｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｏａｔｉｎｇｓ」、およびこれらの刊行物に引用される参考文献いずれかを参照されたい。
［００８１］１つの態様において、固体支持体の表面には、ヒドロゲルが含まれる。ヒドロゲルは、例えば、ポリマーマトリックスを含んでもよい。ヒドロゲルを固体支持体表面に化学的に付着させてもよく、そしてヒドロゲルには、直接または間接的にのいずれかで、ヒドロゲルにプローブを付着させることが可能な結合官能性が含まれてもよい。典型的な結合官能性には、疎水性基、親水性基、反応基、例えばアルデヒド基、エポキシ基、炭酸基等、カルボキシル基、チオール基、スルホン酸基、硫酸基、アミノ基、置換アミノ基、リン酸基、金属キレート基、チオエーテル基、ビオチン基、ボロン酸基等が含まれる。
［００８２］遺伝子発現またはＳＮＰ分析に適した任意の表面を用いてもよく、これには、支持体および表面として、または他の構成要素をさらに含む製品の構成要素としてのいずれかで、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（例えばＣｏｄｅＬｉｎｋ）、Ａｇｉｌｅｎｔ、およびＳｃｈｏｔｔ Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎによって提供される支持体および表面が含まれる。
［００８３］開示する方法にしたがった、続くインキュベーションおよびプロセシング工程、例えば、表面を洗浄して非特異的複合体を除去する工程などの間に、プローブが未結合にならない限り、いかなる適切な方式で、固体支持体表面にプローブを結合させてもよい。固体支持体表面に非共有連結させる、例えば接着させるか、吸収させるか、吸着させることによって、または共有連結させることによって、プローブを結合させてもよい。固体支持体へのプローブの共有連結の場合、固体支持体表面は、プローブに連結される官能基を含有するであろう。用いる官能基（単数または複数）の性質は、プローブの性質に応じる。表面に分子を共有結合させるための多様な方法が報告されている。典型的には、分子上の活性官能基と表面上の活性化官能基との反応によって、これらの反応を行う。例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体などのカルボン酸の活性化エステルを形成することによって、アミン含有化合物をカルボン酸含有表面に付着させてもよい。アミンは、この活性化されたエステルと容易に反応して、安定なアミド結合を形成する。この反応は、所望のアミンとの反応が、系の中の他の求核試薬との反応より有意により速い条件下で、有用である。
［００８４］当該技術分野に先に記載されている方法の例には、臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボニルジイミダゾール、カルボジイミド、アズラクトン（ａｚｌａｃｔｏｎｅｓ）、塩化シアヌル、有機塩化スルホニル、スルホン酸ジビニル、ニトロフェニルエステル、ヨードアセチル、マレイミド、エポキシ、ヒドラジド、還元的アミノ化、ジアゾニウム塩、およびマンニッヒ縮合での表面の活性化が含まれる。活性化表面と反応する分子には、アミン、アルコール、カルボン酸、チオール、カルボニル、および活性水素を含有する化合物が含まれる。
［００８５］１つの態様において、プローブをあらかじめ決定された空間配置またはパターンで、固体支持体表面に結合させ、これは特定の位置のプローブの同一性が知られる表面上の任意の配置を意味する。１つの態様において、あらかじめ決定された配置は、アレイである。アレイには、一般的に、その領域と会合する特定のプローブを所持するアドレス可能な領域の一次元、二次元、または三次元いずれの配置も含まれる。アレイ上の特定のあらかじめ決定された位置またはアドレスのアレイの領域または特徴またはスポットが、特定のアプタマー共有複合体上のタグと特異的に会合するため、こうしたアプタマー共有複合体、そしてしたがって特定のターゲット分子を検出するように、異なるプローブの多数の領域を有する点で、アレイはアドレス可能である。
［００８６］固体支持体表面上のアレイの組み立ては、個々の固体支持体表面に沿って配置され、そしてアレイ間領域によって分離される１以上のアレイを指す。通常、アレイを含む表面の反対側の固体支持体表面（反対表面）は、いかなるアレイも所持しない。任意のタイプの試験試料に対して試験するために、アレイを設計することも可能である。固体支持体表面は、少なくとも１つ、２つ、４つ、２０、１００、または少なくとも５００のアレイを所持してもよい。意図する使用に応じて、アレイのいずれかまたはすべてが、互いに同じであってもまたは異なってもよく、そして各々、プローブが配置された多数のスポットまたは特徴を含有してもよい。典型的なアレイは、約２０ｃｍ２未満またはさらに約１０ｃｍ２未満の領域中に、１０より多く、１００より多く、１０００より多く、または１万より多く、またはさらに１０万より多い特徴を含有してもよい。例えば、特徴は、約１０μｍ〜約１．０ｃｍの範囲の幅（すなわち、丸い点に関しては直径）を有してもよい。他の態様において、各特徴は、約１．０μｍ〜約１．０ｍｍ、または約５．０μｍ〜約５００μｍ、または約１０μｍ〜約２００μｍの幅を有してもよい。丸くない特徴は、前述の幅（直径）範囲の円形の特徴のものと同等の面積範囲を有しうる。
［００８７］固体支持体上のアレイの多様な配置のいずれを用いてもよい。上述のように、個々の固体支持体は、単一のアレイまたは多数のアレイを含有してもよい。アレイの特徴を直線の行および列に配置してもよい。これは、固体支持体上の単一アレイには特に魅力的である。多数のアレイが存在する場合、こうしたアレイを、例えば、固体支持体表面に渡る、一連の曲線の列（例えば、スポットの一連の同心円または半円）等に、配置してもよい。同様に、特徴のパターンが、例えば、固体支持体表面に渡る、一連の曲線の列（例えば、スポットの一連の同心円または半円）等を含むように、直線の行および列から変形させてもよい。製造、取り扱い、および使用考慮にしたがって、アレイおよびその特徴の配置を選択してもよい。
［００８８］アレイ内の各特徴、または要素は、固体支持体表面の小さく規則的に成形された領域に明示される。特徴をあらかじめ決定された方式で配置する。アレイの各特徴は、通常、あらかじめ決定されたプローブまたはプローブ混合物を所持する。分子アレイ内の各特徴は、異なるプローブを含有してもよく、そして所定の特徴内のプローブは、アレイの残りの特徴内のプローブと異なってもよい。特徴のいくつかまたはすべては、異なる組成であってもよい。各アレイは、多数のスポットまたは特徴を含有してもよく、そして各アレイは、空間または領域によって、別のアレイから分離されていてもよい。アレイを互いに分離するいかなる空間も必要ではないこともまた認識されるであろう。アレイ間領域および特徴間領域は、通常存在するが、必須ではない。いかなる境界領域とも同様に、これらのアレイ間および特徴間領域は、いかなるプローブも所持しない。アレイ間領域および特徴間領域は、存在する場合、多様なサイズおよび設定であってもよいことが認識されるであろう。
［００８９］いくつかの態様において、例えばビーズなどの第一の固体支持体にプローブを付着させ、そして次いで、第一の固体支持体を、例えばマイクロタイタープレートなどの第二の固体支持体上でアレイ形式に配置することによって、アレイを形成してもよい。他の態様において、アドレス可能なビーズにプローブを付着させることによって、アレイを形成してもよい。「アドレス可能ビーズ」には、色素、バーコード、およびトランスポンダーが含まれる。
［００９０］いくつかの態様において、固体支持体の選択した表面に応じて、固体支持体表面への分子の非特異的結合を減少させるかまたは阻害するため、表面を「ブロッキング」するかまたは「不動態化」してもよい。ブロッキング試薬または不動態化試薬には、粉乳、カゼイン、プールした血清、プールした血漿、ＢＳＡ、ＰＥＧ−ＰＬＬ、ＰＥＧ−シラン、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋまたはＳｔａｒｔｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）、および前述の任意のものの任意の組み合わせが含まれる。
［００９１］本明細書において、用語「標識剤」は、アプタマー共有複合体中の、アプタマーに結合したターゲット分子を検出するのに使用可能な、１以上の試薬を指す。
［００９２］ターゲット分子を検出するための１つの態様において、アプタマーに結合したターゲット分子に特異的な結合パートナーを含む標識剤と、アプタマー共有複合体を接触させる。特異的結合パートナーは、抗体、抗体断片、合成抗体模倣体、生物模倣体、アプタマー、分子インプリンティング・リガンド等を含む、任意の適切な部分であってもよい。特異的結合パートナーを、別の標識剤構成要素、通常、検出可能部分または標識にコンジュゲート化するかまたは連結する。プローブを固体支持体表面に連結させるための任意の前述の方法によって、標識への特異的結合パートナーの連結を行ってもよい。多数のターゲット分子を検出する場合、多数のアプタマー共有複合体を、存在すると推測されるターゲット分子に各々特異的な特異的結合パートナーの混合物と接触させてもよいことが認識されるであろう。使用する標識は、多数のターゲット分子の多重化検出のため、当該技術分野に知られるものであってもよい。
［００９３］検出可能部分または標識は、直接または間接的に検出可能である。一般的に、検出可能な任意のレポーター分子が標識であってもよい。標識には、例えば、（ｉ）シグナルを生じることによって直接検出可能なレポーター分子、（ｉｉ）レポーター分子を含有する同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）に、続いて結合することによって、間接的に検出可能な特異的結合対メンバー、（ｉｉｉ）質量分析によって検出可能な質量タグ、（ｉｖ）増幅または連結のテンプレートを提供可能なオリゴヌクレオチド・プライマー、および（ｖ）例えばリプレッサータンパク質などのリガンドとして作用可能な特異的ポリヌクレオチド配列または認識配列が含まれ、ここで、後者の２つの例では、オリゴヌクレオチド・プライマーまたはリプレッサータンパク質は、レポーター分子などを有するか、または有しうるであろう。レポーター分子は、触媒、例えば酵素、触媒をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、色素、蛍光分子、量子ドット、化学発光分子、補酵素、酵素基質、放射性基、小有機分子、増幅可能ポリヌクレオチド配列、ラテックスまたは炭素粒子などの粒子、金属ゾル、晶子、リポソーム、細胞等であってもよく、これらは色素、触媒または他の検出可能基、質量分析目的のために分子にコンジュゲート化される、分子の重量を改変する質量タグ等でさらに標識されていてもまたはいなくてもよい。標識は、電磁または電気化学物質から選択可能である。１つの態様において、検出可能標識は蛍光色素である。本明細書の開示に基づいて、他の標識および標識スキームが、当業者には明らかであろう。
［００９４］ターゲット分子を検出するための別の態様において、ターゲット分子はタンパク質であり、そして普遍的タンパク質染色剤を含む標識剤と、アプタマー共有複合体を接触させる。本明細書において、「普遍的タンパク質染色剤」および「ＵＰＳ」は、交換可能に用いられ、試験試料中に存在するタンパク質の全部でないとしてもほとんどを、検出可能部分で標識するが、核酸、または固体支持体などのアッセイの他の構成要素を標識しないかまたは最小限にしか標識しない傾向がある、いかなる標識剤も指す。タンパク質上に見られるが、核酸または支持体表面上に見られない、いかなる反応性化学基も、共有付着部位として働きうる。典型的な反応性化学基には、一次アミン（例えばリジン残基上）、チオール（例えばシステイン上、ジスルフィド連結の還元によって生じうる）、アルコール（例えばセリン、スレオニン、チロシン、および糖タンパク質上の糖部分上（こうした糖の上のシス−ジオールの酸化産物を含む））、およびカルボキシレート（例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸上）が含まれる。
［００９５］検出可能部分には、上に列挙するいかなるレポーター分子も、そして任意の方式で、検出可能シグナルを生じるのにも使用可能な他のいかなる化学薬品または構成要素も含まれうる。蛍光シグナル、化学発光シグナル、または部分の同一性に応じた、任意の他の検出可能シグナルを介して、検出可能部分を検出してもよい。検出可能部分が酵素（例えばアルカリホスファターゼ）である場合、酵素基質および酵素活性に必要な任意のさらなる因子の存在下で、シグナルを生じさせてもよい。検出可能部分が酵素基質である場合、酵素および酵素活性に必要な任意のさらなる因子の存在下で、シグナルを生じさせてもよい。ターゲットタンパク質に検出可能部分を付着させるのに適した試薬設定には、ターゲットタンパク質への検出可能部分の共有結合、ターゲットタンパク質に共有結合した別の標識剤構成要素と検出可能部分の非共有結合、およびターゲットタンパク質と非共有結合した標識剤構成要素への検出可能部分の共有結合が含まれる。普遍的タンパク質染色剤は、米国特許出願第１０／５０４，６９６号、２００４年８月１２日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」に詳細に記載される。
［００９６］いくつかの態様において、ＵＰＳは、検出可能部分を含み、そしてタンパク質に特徴的であるが、アプタマーにはない官能基と共有的に反応し、そしてこうして反応する際、検出可能部分をターゲットタンパク質に共有結合させる、単一の化学的試薬である。この態様にしたがったＵＰＳには、タンパク質にユニークな官能基と共有的に反応可能な基を持つ色素が含まれる。誘導体化によって、こうした基を色素に付加させてもよいし、またはこうした基が非修飾色素上に存在してもよい。１つの態様において、ＵＰＳは、ＮＨＳ−Ａｌｅｘａ蛍光体（例えばＮＨＳ−Ａｌｅｘａ６４７など）を含む、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化蛍光体などの、アミン基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化色素を含む。使用可能な別のＵＰＳは、ＣＢＱＣＡ（３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボクスアルデヒド）であり、これもまた、シアン化物またはチオールの存在下でアミンと反応して、非常に蛍光が高いイソインドールを形成する。ＵＰＳ試薬で使用するのに適した他のアミン反応基には、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、塩化スルホニル、アルデヒド、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（ＳＴＰ）エステル、ＴＦＰ−Ａｌｅｘａ６４７、ならびにＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）クロリド、ＮＢＤフルオリド、およびジクロロトリアジンなどのアリール化剤が含まれる。
［００９７］他の態様において、ＵＰＳは、複数の試薬を含む。例えば、ＵＰＳは、ターゲットタンパク質と共有的に反応する第一の試薬、および第一の試薬によって導入された化学基または他の官能性を介して、ターゲットタンパク質に、直接または間接的にのいずれかで、そして共有的にまたは非共有的にのいずれかで、検出可能部分を付着させる、１以上のさらなる試薬を含んでもよい。ＵＰＳが多数の試薬を含むならば、いくつかの場合、試薬が連続して添加され、そして他の場合、同時に添加されてもよいことが認識されるであろう。
［００９８］１つの態様において、適切なＵＰＳは、（ａ）ターゲットタンパク質と反応するビオチン誘導体；および（ｂ）例えば、蛍光ストレプトアビジン誘導体またはストレプトアビジン−酵素コンジュゲートなどの、ストレプトアビジン−検出可能部分コンジュゲートを含む。ビオチン誘導体は、アミン基と反応し、それによって、ターゲットタンパク質にビオチンを共有結合させ；ストレプトアビジン−検出可能部分コンジュゲートが、固定されたビオチン基に結合し、それによって、ターゲットタンパク質が結合している固体支持体上の部位（単数または複数）の検出可能部分を位置決定する。この態様において、適切な試薬には、ＰＦＰ−ビオチン、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（スペーサーアーム２９Å）、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（スペーサーアーム２２．４Å）、およびＴＦＰ−ＰＥＯ３−ビオチン（スペーサーアーム３２．６Å）が含まれる。
［００９９］別の態様において、適切なＵＰＳは：（ａ）結合したターゲットタンパク質にビオチンまたはビオチン誘導体を共有結合させることが可能な反応基にコンジュゲート化された、ビオチンまたはビオチン誘導体；（ｂ）アビジンおよび／またはストレプトアビジン；ならびに（ｃ）ビオチン−検出可能部分コンジュゲート、例えば蛍光ビオチン誘導体を含む。上記（ａ）のビオチン誘導体は、例えば、ＮＨＳ−ビオチンなどのアミン反応性ビオチン誘導体であってもよく、ビオチンは、場合によってスペーサーアーム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｉｎｃ．）によって、ＮＨＳから分離されていてもよい。結合したターゲットタンパク質上の一次アミンとＮＨＳ基の反応は、対応するアプタマーに結合したターゲットタンパク質へのビオチンの共有結合を導く。次いで、対応するアプタマーと複合体形成したターゲットタンパク質をストレプトアビジンまたはアビジンで処理してもよい。ストレプトアビジンおよびアビジンは、各々、４つのビオチンに結合可能であるため、これらのタンパク質の付加は、ＮＨＳ−ビオチンによって、結合したターゲットタンパク質に元来カップリングしていた各ビオチンに関して、３つのビオチン結合部位を提供する。次いで、上記（ｃ）のビオチン検出部分誘導体を付加してもよく、この際、この部分が、ストレプトアビジンまたはアビジン上の占有されていないビオチン結合部位に緊密に結合する。この態様において、適切な試薬には、ＰＦＰ−ビオチン、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（スペーサーアーム２９Å）、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（スペーサーアーム２２．４Å）、およびＴＦＰ−ＰＥＯ３−ビオチン（スペーサーアーム３２．６Å）が含まれる。
［００１００］標識剤の性質、ターゲット分子の性質およびそのあらかじめ決定されたカットオフレベル、特定のターゲットレベルの生物学的重要性等などの考慮が、使用可能な特定の試薬の個々の濃度を含めた、標識剤の濃度を、通常、決定する。各試薬の最終濃度は、通常、方法の感度を最適にするように、経験的に決定されるであろう。１つの態様において、標識剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約１％を検出するのに十分である。別の態様において、標識剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約１０％を検出するのに十分である。さらなる態様において、標識剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約９０％を検出するのに十分である。
［００１０１］標識剤の活性化は、用いる試薬の性質に応じる。例えば、光で活性化される試薬に関しては、試薬を適切な波長の光で照射する。本明細書の開示を考慮すると、当業者には、他の活性化法が示唆されるであろう。放射性標識、酵素等を伴う標識剤などの、いくつかの標識剤に関しては、活性化剤はまったく必要ではない。酵素系に関しては、基質および／または補因子の添加が必要でありうる。
［００１０２］標識剤によって生じるシグナルの存在および／または量に関する固体支持体の検査には、一般的には単にシグナルを読み取る工程である、シグナルの検出が含まれる。シグナルは通常、装置を用いて読み取られ、装置の性質は、シグナルの性質に応じる。装置は、分光光度計、蛍光計、吸収分光計、発光計、化学発光計、感光計、写真装置等であってもよい。検出するシグナルの存在および／または量を、あらかじめ決定されたカットオフレベルを超える、試験試料中に存在する任意のターゲット分子の存在および量に関連させる。測定中の温度は、一般的に、約１０℃〜約７０℃、または約２０℃〜約４５℃、または約２０℃〜約２５℃の範囲であってもよい。１つのアプローチにおいて、試験するターゲット分子の既知の濃度を用いて、標準曲線を形成する。標準物質および他の対照もまた用いてもよい。
［００１０３］１つの態様において、例えばアレイを含む固体支持体を、検査デバイスに移動させ、ここでいかなる結合したターゲット分子の存在に関しても、固体支持体表面を調べる。検査デバイスは、光学系を伴うスキャニングデバイスであってもよい。例えば、アレイに照射し、そしてアレイの各特徴での生じたシグナル（例えば蛍光）の位置および強度を読み取ることによって、アレイを調べるかまたは読み取ってもよい。スキャナは、例えばＴｅｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンノゼから入手可能なＴＥＣＡＮ ＬＳ ３００スキャナに類似であってもよい。しかし、他の光学技術（例えば化学発光または電子発光標識の検出）および電気技術を含む、アレイの他の検査法を用い、前述のもの以外の方法または装置を用いることによって、アレイを調べるかまたは読み取ってもよい。
［００１０４］アレイの検査から生じる結果は、生の結果（１以上の色チャネルにおける各特徴に関する蛍光強度読取り値など）であってもよいし、または特徴に関しての、あらかじめ決定された閾値より低い読取り値を拒絶し、そして／またはアレイから読み取ったパターンに基づいて結論を形成する（特定のターゲット分子が試験試料中に存在していたかどうかなど）ことによって得た結果などのプロセシングした結果であってもよい。所望の場合、検査結果（プロセシングしたかまたはしていない）を（コミュニケーションによるなどで）離れた場所に送り、そしてさらなる使用（例えばさらなるプロセシング）のためにそこで受け取ってもよい。
［００１０５］別の態様において、コンピュータの制御下で、すなわちコンピュータの補助で方法を行う。例えば、ＩＢＭ（登録商標）互換パーソナルコンピュータを利用してもよい。コンピュータを、本明細書記載の方法に特異的なソフトウェアによって駆動する。本明細書に開示する方法の実行を補助することが可能なコンピュータハードウェアには、以下の仕様を有するシステムが含まれてもよい：例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＮＴ４．０オペレーティングシステム（またはその後継）のいずれかの元で作動する、少なくとも１００ＭＨｚのクロック速度、少なくとも３２メガバイトのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、および少なくとも８０メガバイトの仮想メモリを持つ、Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサまたはそれより優れているもの。
［００１０６］方法を実行するのに使用可能なソフトウェアは、例えば、使用者が書いた関数およびテンプレートを介して適切に拡張され、そして必要な場合、望ましい可能性もある独立型プログラムにリンクされた、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）であってもよい。本方法を行うのを補助する際に用いるソフトウェアまたはコンピュータプログラムの例は、Ｖｉｓｕａｌ ＢＡＳＩＣ（登録商標）、ＦＯＲＴＲＡＮ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｙｔｈｏｎ、あるいは現在または未来に利用可能な他の任意の適切なプログラミング言語で書かれていてもよい。上記コンピュータ情報および本明細書で用いるソフトウェアは、例示のみであり、そして限定的であることを意図しないことを理解しなければならない。本明細書に開示する方法のいずれも、他のコンピュータ、コンピュータシステム、およびソフトウェアに適応可能である。使用可能な他の言語には、例えば、ＰＡＳＣＡＬ、ＰＥＲＬまたはアセンブリ言語が含まれる。
［００１０７］別の態様において、質量分析を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。図１Ｂを参照すると、試験試料中に存在しうるターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な例において、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を固体支持体に付着させる。アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）と固体支持体を接触させ、そしてアプタマー上に含まれるタグが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、付着を達成する。次いで、固体支持体上のプローブと会合したアプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を、質量分析を用いた検出（および場合によって定量化）のために調製する。
［００１０８］多様な方法のいずれを用いて、質量分析による検出および場合による定量化のため、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を調製してもよい。例えば、１つの態様において、ターゲット分子がタンパク質である場合、固体支持体から複合体を除去する前または後のいずれかに、プロテアーゼ消化することによって、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を調製する。別の態様において、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を固体支持体から放出させ、そして次いで、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、エレクトロスプレー・イオン化、または電子衝撃イオン化を含む、当該技術分野に知られるいくつかの方法の任意のものを用いた、質量分析用に調製する。１つの態様において、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計内に直接溶出させてもよい。他の態様において、溶出させた試験試料を、質量分析前に、例えば酵素消化または化学的修飾などのさらなるプロセシングに供してもよい。例えばエレクトロスプレー・イオン化、マトリックス支援レーザー脱離イオン化、または電子衝撃イオン化によって、マススペクトルを得てもよい。
［００１０９］典型的には、質量分析によるターゲット分子の定量化は、内部標準、すなわち分析しようとする試験試料内に導入される既知の濃度の化合物を必要とする。理想的な内部標準は、ターゲット分子のものと類似の溶出およびイオン化特性を有するであろうが、異なる質量対電荷比のイオンを生じるであろう。一般的な内部標準は、ターゲット分子の安定な同位体標識型である。１つの態様において、ターゲット分子の安定な同位体標識型を、内部標準として、試験試料に添加する。次いで、試験試料中の多様な構成要素に対応するスペクトルピークを、内部標準のピークの高さまたは面積と比較して、そしてそれによって、ターゲット分子の定量化を可能にする。
［００１１０］別の態様において、ターゲット分子の既知の濃度を含む試料セットから生じたスペクトルピークと、ターゲット分子に対応するスペクトルピークのピークの高さまたは面積を比較することによって、ターゲット分子の定量化を達成する。ターゲット分子の既知の濃度を有する試料から得た、スペクトルピークのピークの高さまたは面積は、標準曲線を構成し、ここから、試験試料中のターゲット分子の未知の濃度を計算可能である。
［００１１１］別の態様において、Ｑ−ＰＣＲを用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。本明細書において、「Ｑ−ＰＣＲ」は、アッセイの結果が定量的である、すなわち、アッセイが、試験試料中に存在するアプタマーの量または濃度を定量化可能であるような方式で、そしてそのように調節された条件下で行う、ＰＣＲ反応を指す。図１Ｂを参照すると、試験試料中に存在しうるターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な方法において、タグを含んでもよく、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。次いで、本明細書にさらに記載するように、次いで、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への場合による変換に続いて、試験試料中に存在しうるいかなる未結合アプタマーも、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）から分配する。次いで、ポリヌクレオチドの定量的複製のために知られる技術を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）を定量化する。
［００１１２］１つの態様において、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを用いて、試験試料中のアプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）の量または濃度を決定する。この技術は、一般的に、オリゴヌクレオチド複製酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に頼って、ターゲット配列からのシグナルを生じる。定量化しようとするアプタマーの配列に基づいて、ＴａｑＭａｎプローブを選択し、そしてこれには、一般的には、例えば６−カルボキシフルオレセインなどの５’端蛍光、および例えば６−カルボキシテトラメチルフルオレセインなどの３’端消光剤が含まれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてアプタマー配列が増幅されるにつれて、シグナルが生じる。ポリメラーゼがアプタマー配列をコピーするにつれ、ＰＣＲプライマーより下流にアニーリングするプローブから、エキソヌクレアーゼ活性が蛍光を遊離させ、それによってシグナルを生じる。複製産物が産生されるにつれて、シグナルが増加する。ＰＣＲ産物の量は、行った複製周期の数ならびにアプタマーの出発濃度の両方に応じる。
［００１１３］別の態様において、複製プロセス中に挿入蛍光色素を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）の量または濃度を決定する。例えばＳＹＢＲ（登録商標）グリーンなどの挿入色素は、一本鎖ＤＮＡの存在下で生じる蛍光シグナルに比較した際、二本鎖ＤＮＡの存在下で、大きな蛍光シグナルを生じる。ＰＣＲ中に二本鎖ＤＮＡ産物が形成されるにつれて、色素によって生じるシグナルは増加する。生じるシグナルの度合いは、ＰＣＲ周期の数およびアプタマーの出発濃度の両方に依存する。
［００１１４］別の態様において、複製プロセス中、「分子ビーコン」を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体（または場合によってアプタマー共有複合体）の量または濃度を決定する（例えば、Ｔｙａｇｉら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：４９ ５３， １９９８；米国特許第５，９２５，５１７号を参照されたい）。分子ビーコンは、フォールディングしてヘアピンループを形成し、そしてヘアピンが形成された際には、蛍光によってほとんどまたはまったくシグナルが生じないように、ヘアピン構造の一端に蛍光を、そしてもう一端に消光剤を含有する、特異的核酸プローブである。ループ配列は、ターゲットポリヌクレオチド配列に特異的であり、そしてアプタマー配列にハイブリダイズした際、ヘアピンがアンフォールディングし、そしてそれによって蛍光シグナルが生じる。
［００１１５］コンピュータプログラムを利用して、本明細書に開示する方法のいずれかの１以上の工程を行ってもよい。本発明の別の側面は、コンピュータプログラムが記憶された、コンピュータ読取り可能記憶媒体を含むコンピュータプログラム製品であり、これをコンピュータに読み込むと、このプログラムが、本明細書開示の任意の方法の実行を行うかまたは補助する。
［００１１６］本発明の１つの側面は、本明細書に開示する方法のいずれかの産物、すなわちアッセイ結果であり、これを試験場所で評価してもよいし、または望ましい場合、評価およびコミュニケーションのために、離れた場所の興味を持つ団体に送ってもよい。本明細書において、「離れた場所」は、結果を得た場所と物理的に異なる場所を指す。したがって、結果を、異なる部屋、異なる建物、町の異なる場所、異なる町等に送ってもよい。例えばファクシミリ、郵便、翌日配達便、ｅ−メール、ｆｔｐ、ボイスメール等などの標準的手段によって、データを送ってもよい。
［００１１７］情報の「コミュニケーション」は、適切なコミュニケーションチャネル（例えば民間または公的ネットワーク）を通した、電子シグナルとしての、その情報を表すデータの伝達を指す。項目を「送る」は、その項目の物理的輸送であれ、または別の方式であれ（可能な場合）、その項目を１つの場所から次の場所に移動させる任意の手段を指し、そしてこれには、少なくともデータの場合、データを所持するかまたはデータを通信する媒体を物理的に輸送することが含まれる。
［００１１８］図３を参照すると、試験試料に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための別の典型的な方法において、ターゲット分子および少なくとも１つの非ターゲット分子を含みうる試験試料を、場合によって競合剤分子（図３にオプションＡと示す）と接触させてもよい。１以上の非特異的複合体が形成されうる。次いで、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。試験試料の性質に応じて、アプタマーおよび１以上の非ターゲット分子間で、１以上の非特異的複合体もまた形成されうる。試験試料を競合剤分子と接触させた場合、競合剤を含む多様な非特異的複合体もまた形成され、そして試験試料中に存在しうる。
［００１１９］次いで、場合によって、試験試料の構成要素に動力学的に負荷を与える（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）条件に試験試料を曝露してもよい（図３にオプションＢとして示す）。以下にさらに記載するように、動力学的負荷は、試験試料の希釈、試験試料への競合剤分子の導入、あるいは固体支持体上のアプタマー・アフィニティー複合体の捕捉、その後の、洗浄溶液中に競合剤分子が存在するかまたは存在しないかいずれかの洗浄を含んでもよい。動力学的負荷を導入した場合、アプタマーおよびいかなる非ターゲット分子の間の非特異的複合体も、解離後、再形成される可能性は低い。非特異的複合体は、一般的に、アプタマー・アフィニティー複合体よりも迅速に解離するため、動力学的負荷は、アプタマーが、非ターゲットとの非特異的複合体中に含まれる可能性を減少させる。有効な動力学的負荷は、最初のアプタマー結合事象およびそれに続く共有相互作用のものを超えて、さらなる特異性を持つアッセイを提供しうる。
［００１２０］動力学的負荷を使用するかどうかに関わらず、次いで、使用中のアプタマーに適した方法を用いて、形成されたアプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。アプタマー共有複合体形成後、場合によって、試験試料中に存在しうるいかなる未結合のまたは複合体形成していないアプタマーも試験試料から分配してもよい（図３にオプションＣとして示す）。場合によって、試験試料中に存在しうるいかなる未結合のまたは複合体形成していない非ターゲットおよびターゲット分子も試験試料から分配してもよい（図３にオプションＤとして示す）。場合によって、未結合アプタマー、ならびに未結合非ターゲットおよびターゲット分子を、アプタマー共有複合体形成後、どちらかの順序で、除去してもよい。
［００１２１］動力学的負荷を導入するために希釈を用いる場合、アプタマー共有複合体を含有する、続く試験試料を、好ましくは濃縮する。適用可能である場合、場合によって試験試料からいかなる未結合のアプタマーも分配し、そして／または場合によって標識剤と反応しうる試験試料の他の構成要素を除去する工程に関して以下に記載する方法を用いて、この濃縮を達成してもよい。
［００１２２］次いで、本明細書記載の任意の方法または一般の当業者に知られる他の適切な任意の方法を用いて、試験試料中のアプタマー共有複合体を検出し、そして／または定量化する。例えば、試験試料と固体支持体を接触させ、そしてアプタマー上のタグが、固体支持体表面上に固定されたプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、アプタマー共有複合体を固体支持体表面に付着させてもよい。次いで、固体支持体上のプローブと会合したアプタマー共有複合体を検出し、そして場合によって定量化する。検出および場合による定量化に先立つ任意の時点で、すなわち、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または付着後のいずれかいつでも、アプタマー共有複合体を標識剤と接触させて、結合したターゲット分子の検出を可能にする。当業者が認識するであろうように、質量分析、Ｑ−ＰＣＲ、または当該技術分野に知られる他の任意の適切な方法を用いて、アプタマー共有複合体を検出し、そして／または定量化してもよい。
［００１２３］本明細書において、「競合剤分子」および「競合剤」は、交換可能に用いられ、非特異的複合体と非ターゲット分子を形成可能ないかなる分子も指す。（単数の）「競合剤分子」または「競合剤」は、分子の１つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「（複数の）競合剤分子」または「（複数の）競合剤」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。競合剤分子には、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（例えば、ヘパリン、一本鎖サケ精子ＤＮＡ、およびポリデキストラン（例えば硫酸デキストラン））、無塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロリン酸が含まれる。競合剤を用いる動力学的負荷の場合、競合剤はまた、アプタマーと非特異的複合体を形成しうる任意の分子であってもよい。こうした競合剤分子には、ポリカチオン（例えば、スペルミン、スペルミジン、ポリリジン、およびポリアルギニン）およびアミノ酸（例えばアルギニンおよびリジン）が含まれる。
［００１２４］本明細書において、「非特異的複合体」は、アプタマーおよびそのターゲット分子以外の２以上の分子間の非共有会合を指す。非特異的複合体は、その構成要素分子間のアフィニティー相互作用に基づいては選択されないが、分子のクラス間の相互作用に相当するため、非特異的複合体に関与する分子は、平均して、互いに対して、はるかにより低いアフィニティーを示し、そしてしたがって、アプタマーおよびそのターゲット分子よりも、対応して高い解離速度を有するであろう。非特異的複合体には、アプタマーおよび非ターゲット分子間、競合剤および非ターゲット分子間、競合剤およびターゲット分子間、ならびにターゲット分子および非ターゲット分子間に形成される複合体が含まれる。
［００１２５］本明細書において、用語「動力学的に負荷を与える」および「動力学的負荷」は、動力学的圧を適用し、そして解離速度を含む、複合体のこうしたクラスの構成要素の異なるアフィニティー特性を利用することによって、アプタマー・アフィニティー複合体および非特異的複合体を含む複合体セットから、アプタマー・アフィニティー複合体を濃縮するプロセスを指す。アプタマー−非ターゲット複合体は、典型的には、アプタマー−ターゲット複合体に比較して減少するため、動力学的負荷は、一般的に、特異性の増加を生じる。本明細書において、用語「動力学的圧」は、複合体が自然に解離する機会を提供し、そして／または複合体から天然に解離する分子の再結合を阻害するための手段を指す。競合剤分子の添加によって、または試料の希釈によって、または複合体が固体支持体に結合している場合は徹底的な洗浄によって、または当業者に知られる他の任意の手段によって、動力学的圧を適用してもよい。一般の当業者が認識するであろうように、動力学的負荷は、一般的に、アプタマー・アフィニティー複合体およびアプタマー−非ターゲット複合体の異なる解離速度に応じるため、実質的にアプタマー−非ターゲット複合体の数を減少させつつ、アプタマー・アフィニティー複合体の高い比率を維持するように、動力学的負荷の期間を選択する。動力学的負荷が有効になるために、アプタマー・アフィニティー複合体の解離速度は、好ましくは、アプタマー−非ターゲット複合体のものよりも有意に低い。アプタマーが特定の特性を含むように選択可能であるため、比較的低い解離速度を有するように、アプタマー・アフィニティー複合体の構成要素を設計してもよい。
［００１２６］本明細書において、用語「分配」は、試験試料からの１以上の分子種の分離または除去を指す。分配を用いて、感度を増加させ、そして／またはバックグラウンドを減少させてもよい。分配は、アプタマー・アフィニティー複合体が、共有結合のために不可逆的になる際、アプタマー共有複合体形成後に最も有効である。
［００１２７］例えば、未結合アプタマーは、固体支持体表面上のプローブへのアプタマー共有複合体の付着中に、アプタマー共有複合体と競合しうるため、試験試料から未結合アプタマーを除去すると、アッセイ感度が増加しうる。検出および場合による定量化にＱＰＣＲを用いた際、未結合アプタマーの除去は、ターゲット分子の検出および定量化を促進する。１つの態様において、ターゲット分子はタンパク質であり、そして試験試料において、アプタマー共有複合体などのタンパク質を含む複合体を沈殿させ、そして遊離核酸を沈殿させない試薬を用いることによって、未結合アプタマーをアプタマー共有複合体（および試験試料の残り）から分配する。こうした試薬には、Ｋ＋／ＳＤＳ、アセトン、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＰｒｏＣｉｐｉｔａｔｅ、および当該技術分野に知られる他の荷電ポリマーが含まれてもよい。
［００１２８］１つの態様において、ターゲット分子、この場合はターゲットタンパク質に対する特異的アフィニティーを持つ、例えばタグ化光アプタマーなどのアプタマーを、試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、上に列挙する任意の試薬または他の任意の適切な試薬などの適切な試薬を用いて、試験試料からアプタマー−タンパク質共有複合体および複合体形成していないタンパク質を沈殿させる。試験試料の沈殿した構成要素を、遠心分離によってペレットにして、そして未結合アプタマーを含有する上清を廃棄する。次いで、未結合タンパク質およびアプタマー−タンパク質共有複合体を含有するペレットを、例えばアッセイ結合希釈剤などの適切な溶液中に懸濁し、そして次いで、アプタマー共有複合体を、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、ターゲット分子を検出し、そして／または定量化する。
［００１２９］アッセイ・バックグラウンドを減少させるため、標識剤と反応可能であり、そしてアプタマーに共有結合していない分子を、試験試料から除去してもよい。１つの態様において、未結合アプタマーおよび複合体形成したアプタマーの両方を、試験試料から沈殿させ、標識剤と反応しうる他の分子を、廃棄される上清中に残すことによって、これを達成する。セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、および例えばエタノールなどの有機溶媒を含む試薬で、こうした核酸沈殿を達成してもよい。別の態様において、固体支持体にアプタマーをハイブリダイズさせることによって、試料から未結合アプタマーおよび複合体形成したアプタマーの両方のアプタマーを分配する。この場合の固体支持体には、マイクロビーズ（例えば常磁性ビーズ）、本明細書記載の他の適切な固体支持体のいずれか等が含まれてもよい。アプタマーが適切な固体支持体表面にハイブリダイズするのを可能にした後、標識剤と反応しうる分子を含有する溶液を容易に除去し、アプタマー共有複合体の濃縮を生じる。一般の当業者が認識するであろうように、この方式でのアプタマーの分配は、アプタマー上に含まれるタグ、またはアプタマー上の何らかの他の核酸配列のいずれかを用いて、固体支持体に付着した適切な相補性ヌクレオチド配列にアプタマーをハイブリダイズさせてもよい。
［００１３０］１つの態様において、ターゲットタンパク質に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、上に列挙する任意の試薬または他の任意の適切な試薬などの適切な試薬を用いて、試験試料からアプタマー−タンパク質共有複合体および未結合アプタマーを沈殿させる。試験試料の沈殿した構成要素を、遠心分離によってペレットにして、そして複合体形成していないターゲットおよび試験試料の残りを含有する上清を廃棄する。次いで、未結合アプタマーおよびアプタマー共有複合体を含有するペレットを、例えばアッセイ結合希釈剤などの適切な溶液中に懸濁し、そして次いで、アプタマー共有複合体および未結合アプタマーを、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、ターゲット分子を検出し、そして／または定量化する。
［００１３１］別の態様において、ターゲットタンパク質に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを、試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、例えばアプタマータグに相補的なプローブを含有するビーズを用いて、固体支持体上にアプタマー−タンパク質共有複合体および未結合アプタマーを捕捉する。常磁性ビーズの場合、磁力によるか、または非常磁性ビーズでは遠心分離によるかのいずれかで、ビーズをペレットにし、そして複合体形成していないターゲットおよび試験試料を含有する上清を廃棄する。次いで、ペレットを、例えばアッセイ結合希釈剤などの適切な溶液中に懸濁し、そして例えば、熱、高ｐＨ、蒸留水、これらの何らかの組み合わせ、または他の任意の既知の方法を含めて、ハイブリダイゼーション相互作用を破壊するための任意の適切な手段を用いて、未結合アプタマーを溶出させる。ビーズを再びペレットにし、そして未結合アプタマーおよびアプタマー共有複合体を含有する上清を、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、ターゲット分子を検出し、そして／または定量化する。
［００１３２］別の態様において、複合体形成していないターゲットおよび試験試料を含有する上清を廃棄した後にビーズを懸濁する工程まで、そしてこの工程を含めて、上に概略するように、アッセイを行う。次いで、未結合アプタマーおよびアプタマー共有複合体をビーズから溶出させる前に、アプタマー共有複合体を標識剤と接触させて、その後、ペレットにする工程および洗浄する工程を反復して、ターゲット分子の検出および／または定量化のためにアプタマー共有複合体と固体支持体を接触させる前に、未反応標識剤を除去してもよい。
［００１３３］本明細書に開示する任意の方法において、試験試料の２以上の希釈として、試験試料を調製してもよく、これは、ターゲット分子が試験試料中に存在可能であり、そして本明細書に開示する方法による検出に供されうる濃度のダイナミックレンジを増加させうる。個々の希釈試験試料を、アプタマー共有複合体形成工程まで、そしてこの工程を含めて、別個にアッセイし、その後、残りのアッセイのため、希釈試験試料をプールし、そして単一固体支持体上で同時に検出してもよい。１つの態様において、各希釈試験試料には、ユニークなアプタマーが含まれ、それによって、対応するターゲットの単一の測定が可能になる。別の態様において、２以上の希釈にアプタマーを添加して、各々の希釈を、特定のターゲットに対する別個にタグ化されたアプタマーと接触させ、単一の固体支持体上の異なる希釈試料各々に関する特異的アプタマーシグナルの検出を可能にしてもよい。この方式で、希釈試料を一緒につなぎ合わせて、単一のターゲット分子に関するダイナミックレンジを何桁にも渡って拡張することも可能であるし、そして定量化の領域が重複していて、単一のターゲット濃度の多数回の決定につながる場合は、正確さを加えることも可能である。
［００１３４］１つの態様において、連続希釈として、試験試料セットを調製し、これに、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを導入する。異なるタグを持つ同じアプタマーを、各試験試料希釈に添加してもよい。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、個々の試験試料をプールし、そして固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、ターゲット分子を検出し、そして／または定量化する。異なるタグを有する各アプタマーに関して検出される生じたシグナルを組み合わせて、元来の試験試料における、ターゲット分子の量または濃度を正確に定量化してもよい。例えば、第一の希釈は、ターゲットに関する最大シグナルを生じ、半定量的情報しか生じない可能性もあるが、第二の希釈は、飽和未満のシグナルを生じ、元来の試験試料におけるターゲットの正確な定量を可能にすることも可能である。
［００１３５］別の態様において、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを導入する連続希釈として、試験試料セットを調製する。ユニークなタグを有する、異なるアプタマーを、各試料希釈に添加してもよい。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、個々の試験試料をプールし、そして固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、試験試料中に存在するターゲット分子を検出し、そして／または定量化する。元来の試料の異なる連続希釈に応じて、何桁にも渡るターゲット範囲に関して、生じたシグナルを定量化することも可能である。
［００１３６］本明細書に開示する任意の方法において、試験試料を参照試料に比較してもよい。「参照試料」は、本明細書において、複数の分子を含有し、そして少なくとも１つのターゲット分子を含むことが知られる、任意の物質、溶液、または混合物を指す。参照試料に存在する任意のターゲット分子の正確な量または濃度もまた知ることも可能である。用語、参照試料には、本明細書に定義するような、生物学的試料、ならびに、例えば汚染されたかまたは潜在的に汚染されている水および産業廃水などの、環境または毒性試験に使用可能な試料が含まれる。参照試料はまた、準備プロセス、例えば製造プロセスの最終産物、中間産物、または副産物であってもよい。参照試料には、生物から、またはいくつかの他の供給源（例えば環境または産業供給源）から得られた、物質、溶液、または混合物に添加されている、任意の適切なアッセイ培地、緩衝液、または希釈剤が含まれてもよい。
［００１３７］１つの態様において、標識剤への曝露工程までであるが、この工程を含まずに、同一の方式で、参照試料を試験試料と別個に処理し、ここで、標識剤への曝露工程は、この態様においてのみ、固体支持体にアプタマー共有複合体を付着させる前に起こる必要がある。２つの異なる標識剤を用いて、参照試料中のターゲットレベルを試験試料中のターゲットレベルと区別する。試料を標識剤と接触させた後、これらを等しく混合し、そして固体支持体と同時に接触させてもよい。次いで、各標識剤からのシグナルを別個に測定することによって、参照試料および試験試料間の任意の異なる発現（すなわち試料中のターゲットの異なる量または濃度）の直接比較が可能である。２つの標識剤には、Ｃｙ３およびＣｙ５対、ならびにＡｌｅｘａ５５５およびＡｌｅｘａ６４７対が含まれてもよい。１つの態様において、参照試料は、対照群に相当するプールした生物学的試料であってもよい。別の態様において、参照試料は、個体から得た、最初に収集した生物学的試料であってもよく、そして試験試料を同じ個体から、しかし二回目に収集して得てもよく、それによって、長期に渡り、個体によって提供される多数の生物学的試料における１以上のターゲット分子の量または濃度のいかなる変化も測定し、そして評価することによって、個体の長期的な研究を容易にしてもよい。
［００１３８］１つの態様において、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを、参照試料および試験試料の両方に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、２つの異なる検出分子を含有する２つの別個の標識剤と、２つの試料を接触させてもよい。次いで、アプタマー共有複合体を含有する２つの別個に標識された試料を、固体支持体に付着させてもよい。次いで、ターゲット分子がいずれかまたは両方の試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の２つの標識剤を検出することによって、例えば検出標識が蛍光分子である場合、典型的には、異なる励起および発光波長で多数回のスキャンを行うことによって、ターゲット分子を検出し、そして／または定量化する。こうした定量化は、参照試料中の異なるターゲット量または濃度のより正確な評価につながる可能性もあり、そして使用する参照試料が同じである場合、異なる試験試料間での比較を容易にしうる。
［００１３９］本明細書に開示する任意の方法において、多数の標識剤を用いて、単一の試験試料を分析してもよい。１つの態様において、各々、異なるターゲット分子部分を標識するための別個の化学反応および場合によって異なる検出基を持つ、２以上の標識剤を、単一の試験試料とともに用いてもよい。異なる化学反応は、ターゲット分子上の異なる官能基を標識し、そこから、さらなる情報が得られうるであろう。例えば、ターゲットタンパク質の場合、一次アミン（例えばリジン）と反応する化学反応を用いて、１つの標識をターゲットに付着させてもよく、一方、例えば、典型的にはグリコシル化したタンパク質と会合する炭水化物基と反応する化学反応を通じて、第二の標識をターゲットに付着させる。共通のアプタマーによって認識される、同じターゲット分子上のこれらの２つの部分の相対的定量化は、試験試料内のそのターゲットのグリコシル化の度合いに関する有用な情報を提供しうる。
［００１４０］１つの態様において、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、アプタマー複合体を固体支持体と接触させる前または後のいずれかで、２つの異なる検出分子を含有する２つの別個の標識剤と、試験試料を接触させてもよい。１つの態様において、検出標識および化学反応はユニークであり、アプタマー共有複合体を含有する同じ試験試料の連続標識が可能である。別の態様において、１つの反応中で同時に化学反応を行ってもよい。次いで、アプタマー共有複合体上の２つの標識剤を検出することによって、例えば検出標識が蛍光分子である場合、典型的には、異なる励起および発光波長で多数回のスキャンを行うことによって、多重標識されたアプタマー共有複合体を検出し、そして／または定量化してもよい。
［００１４１］別の態様において、２以上の別個の標識剤が同じ検出標識を使用する。アッセイは、アプタマー共有複合体への変換工程まで、そして該工程を含めて、上述のように進行し、その後、試験試料を別個の標識剤が存在するのと同じ数のアリコットに分け、そして試験試料の各アリコットを、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または付着後のいずれかに、標識剤と別個に接触させる。アプタマー共有複合体を含有する試験試料の別個に標識されたアリコットを、別個に検出し、そして／または定量化してもよい。
［００１４２］本明細書記載の任意の方法を用いて、試験試料の多重化分析を行ってもよい。こうした任意の多重化分析には、例えば生物学的試料などの試験試料中の同数のターゲット分子を同時にアッセイするための、少なくとも２つ、少なくとも数十、少なくとも数百または少なくとも数千のアプタマーの使用も含まれてもよい。これらの態様において、各々、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有する、タグ化光アプタマーなどの複数のタグ化アプタマーを、試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、固体支持体上に固定された複数の対応するプローブを通じて、アプタマー共有複合体を固体支持体に付着させる。固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または付着後のいずれかに、アプタマー共有複合体と標識剤を接触させてもよい。次いで、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、試験試料中に存在するターゲット分子を検出し、そして／または定量化する。
［００１４３］本発明の別の側面は、試験試料を分析するために、本明細書に開示する任意の方法を好適に実行するのに有用なキットに関する。本発明の多用途性を増進するため、試薬の比が、方法およびアッセイの実質的な最適化を提供するように、同じまたは別個の容器中、パッケージングされた組み合わせで、試薬を提供してもよい。試薬の交差反応性および安定性に応じて、試薬は各々、別個の容器中にあってもよいし、または多様な試薬が１以上の容器中で組み合わされてもよい。
［００１４４］キットは、パッケージングされた組み合わせ中、少なくとも１つのタグ化アプタマー、少なくとも１つのプローブを含む固体支持体、および適切な標識剤を含む。キットはまた、試料希釈のための緩衝水性媒体などの洗浄溶液、ならびにアレイ洗浄、試料調製試薬等も含んでもよい。キット中の多様な試薬の相対量を広く変化させて、アッセイ中に起こる必要がある反応を実質的に最適化し、そしてさらにアッセイ感度を実質的に最適化する、試薬濃度を提供してもよい。適切な状況下で、キット中の１以上の試薬を、賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供してもよく、この粉末は溶解に際して、本発明にしたがった方法またはアッセイを実行するのに適した濃度を有する試薬溶液を提供するであろう。キットにはさらに、本明細書に記載するような、本発明にしたがった方法の書面の説明が含まれてもよい。
［００１４５］典型的な態様において、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のためのキットには、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有し、そしてタグを含む、少なくとも１つのアプタマー；標識剤；および固体支持体が含まれ、固体支持体には配置された少なくとも１つのプローブが含まれ、そしてプローブは、アプタマー上のタグと会合可能である。
実施例
［００１４６］以下の実施例は、例示目的のみのために提供され、そして付随する請求項中に定義するような本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１． 検出および定量化のため、表面上に固定されたプローブによるハイブリダイゼーション捕捉を用いた、緩衝液および血漿内に連続希釈したＶＥＧＦを測定する光アプタマーアッセイ
［００１４７］本実施例は、単一の光アプタマーおよびそのターゲットタンパク質に関する、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに例示するようなアッセイの工程を例示する。２つの異なる試験試料、緩衝液および血漿を用いて、アッセイを行った。
［０１４８］Ａ．オリゴヌクレオチドの調製。ここでは、光アプタマーの３’端上に含まれるＤＮＡオリゴヌクレオチドタグを用いた。この場合、タグは、ＳＥＬＥＸプロトコル中に用いる、３’固定領域であった。慣用的合成装置を用い、固相上で、ホスホロアミダイトＤＮＡ合成のため、標準的プロトコルを用いて、ＶＥＧＦ光アプタマー５０９−８０を合成した。１：１：２の比のｔ−ブチルアミン：メタノール：水を７０℃で５時間用いて、ＤＮＡ合成において標準的である条件よりは穏やかな条件下で、５−ＢｒｄＵを含有する光アプタマーを切断し、そして脱保護し、ろ過し、そして蒸発乾固した。エタノール沈殿後、逆相ＨＰＬＣを用いて、アプタマーを精製した。光アプタマー上のタグに相補的であり、そしてアミン反応基を含むＤＮＡプローブを上述のように合成し、そしてＤＮＡに関する標準的プロトコルを用いて、切断し、そして脱保護した。エタノール沈殿のみを用いて、プローブを精製した。
［００１４９］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。５’アミンを用いて、捕捉タグの逆相補体を上述のように合成し、そして国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８８７７号（ＷＯ ２００６／１０１７９８）、２００６年３月１４日出願、表題「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｃｈ ａ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ」にさらに記載されるような、そして本明細書において、「メタクリレート・コポリマー表面」と称される、メタクリレート・コポリマーでコーティングされた、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）支持体で構成されるアミン反応性スライド表面にカップリングした。捕捉プローブのマイクロアレイを表面上にプリントした。簡潔には、アミン含有捕捉プローブを、表面中に包埋された活性エステル基と反応させた。３００ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭホウ酸ナトリウム（２１℃でｐＨ９．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および１ｍＭ ４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）からなる緩衝液中で、捕捉プローブを２０μＭに希釈した。ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ ＯｍｎｉＧｒｉｄ Ａｃｃｅｎｔマイクロアレイ作製装置を用いて、アレイ中、スライド表面上に、３つ組で、２５０ｐｌのスポットに捕捉プローブを沈着させた。アレイ化したスライドを、６５％の湿度で、室温で１時間インキュベーションし、その後、６５℃で１時間インキュベーションし、そして最後に、室温で一晩インキュベーションした。残ったアミン反応基を２０ｍＭ ＮａＯＨ中で５分間加水分解し、その後、１０回、Ｈ２Ｏリンスし、そして次いで、Ｎ２流下で乾燥させた。使用前に、室温、暗所で、乾燥チャンバー中、スライドを保存した。
［００１５０］ＶＥＧＦアプタマー５０９−８０を、１ｎＭ濃度で、１００μｌのアッセイ希釈剤（１ｘＳＢ１７（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．０５％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ）中、または１０％血漿（１ｘＳＢ１８（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中、１０％血漿）中で、５ｎＭ〜１．６ｐＭまで連続希釈したターゲットタンパク質ＶＥＧＦとインキュベーションした。試料を穏やかに混合し、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。エキシマーレーザー（Ｔｕｉ Ｌａｓｅｒ ＥｘｃｉＳｔａｒ Ｓ２００、１０ｎｓパルス長、２００Ｈｚ、パルスあたり０．８ｍＪ）によって送達される１ジュールの３０８ｎｍの光を試料に照射した。ＤＭＳＯ中、１０ｍｇ／ｍｌのスクシンイミジル−Ａｌｅｘａ６４７ １μｌを各試料に添加することによって、染色を開始した。溶液を混合し、そして４℃で一晩反応させた。５μｌの１０％ＢＳＡを添加し、そして２時間インキュベーションすることによって、染色反応を停止した。最後に、１８μｌの５Ｍ ＮａＣｌおよび４．５μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎを９０μｌの１０％血漿試料に添加して、そして１８μｌの５Ｍ ＮａＣｌおよび０．９μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎを９０μｌの緩衝液試料に添加した。Ｇｒａｃｅ Ｐｒｏｐｌａｔｅガスケットを、固定されたプローブを含有するスライドに取り付け、１６ウェルを生成した。６００μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、３０μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎおよび３ｍｌのアッセイ希釈剤で構成される溶液８０μｌと、各ウェルを４２℃で１５分間インキュベーションした。次いで、この溶液を除去し、そして８０μｌの試料と交換した。ウェルをＭｉｃｒｏｓｅａｌ「Ｆ」フィルムで密封し、そしてスライドをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ上、６００ｒｐｍ、３７℃で３時間混合した。ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そしてＳＢ１７、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡおよび１Ｍ ＮａＣｌで構成される溶液でウェルを３回リンスした。次いで、ガスケットを除去し、そしてスライド全体を、ＳＢ１７、０．５％Ｔｒｉｔｏｎおよび１Ｍ ＮａＣｌで構成される溶液３０ｍｌ中で、パップジャー（ｐａｐ ｊａｒ）中に３０分間入れ、その後、１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で２分間リンスし、その後、０．５ｘＳＢ１７中、３０秒間リンスした。Ｎ２流下でスライドを乾燥させ、そしてＴＥＣＡＮ ＬＳ３００蛍光スキャナ（励起６３３ｎｍ／発光６７０ｎｍ）でスキャンした。Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．のＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅで、生じたＴＩＦ画像を分析して、特徴を単離し、そしてマイクロアレイ画像をプロセシングする標準的技術を用いて、平均強度を計算した。
［００１５１］結果を図４に示し、ここで、ＶＥＧＦアプタマー捕捉プローブに関して、上述するように、緩衝液（図４Ａ）および血漿（図４Ｂ）の結果を定量化した。各反応からタンパク質不含緩衝液対照を減じて得た、両方の培地中の連続希釈に関する線形反応は、ＶＥＧＦ濃度２ｐＭ〜５ｎＭの範囲を含む。
実施例２． 緩衝液中の多数のターゲットタンパク質の検出および定量化のための、表面上に固定されたプローブによるハイブリダイゼーション捕捉を用いた光アプタマーアッセイ
［００１５２］本実施例は、緩衝液中、１０の光アプタマーおよびそのターゲットタンパク質を用いた、多重化形式の、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに例示するようなアッセイの工程を例示する。
［０１５３］Ａ．タグ化光アプタマーの調製。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイから得た遺伝子発現プローブセットの逆相補体由来のユニークなオリゴヌクレオチドタグを、各光アプタマーに割り当てた。アミン基を光アプタマーの５’端に添加することを除いて、実施例１に記載するように、タグ化光アプタマーを調製した。使用前に、アプタマー溶液を９５℃に３分間加熱し、その後、１秒あたり０．１℃の速度で、３７℃に制御冷却した。
［００１５４］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。ここでは、プローブ用に３’アミンを用い、そして０．００２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用い、一方、プリント緩衝液からＤＭＡＰを除去したことを除いて、実施例１に記載するように、捕捉タグの逆相補体を固定した。プリントしたスライドを６５℃で２時間インキュベーションし、その後、乾燥装置中で一晩保存した。次いで、スライドをメトキシエチルアミン（３７℃でｐＨ９．５）の溶液で処理して、未結合プローブを除去し、そして表面上の過剰な活性エステル基を消費した。
［００１５５］アッセイは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに概略するスキームにしたがう。実施例１に記載する基本的なプロトコルを用いた。しかし、４１の光アプタマーを多重化して、そしてこれらのアプタマーのサブセットに対する１０のターゲットタンパク質を試料中で連続希釈した。この実施例で定量化されるタンパク質：光アプタマー対には、ｂＦＧＦ：６−７、ＥＲＢＢ４：１７９７−３８、ＩＬ−Ｉ Ｒ４：１４７２−３、ＭＣＰ−３：８５１−９０、ＰＡＩ−１：１９２１−５２、ＴＩＭＰ−ｌ：９０５３６、ｔＰＡ：９８７−５１、ｕＰＡ：ｌ１６２−７０、ＶＥＧＦ：５０９−８０、ＶＥＧＦ ｓＲ２：１５４６−２３が含まれる。
［００１５６］１００μｌのアッセイ緩衝液（ＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）中、各々、２ｎＭの濃度の４１の光アプタマーを、１０のターゲットタンパク質の６つの連続希釈および１つのタンパク質不含対照と、３７℃で３０分間インキュベーションした。２．１μｌのスクシンイミジル−Ａｌｅｘａ６４７を用い、そして反応を暗所中、室温で２時間インキュベーションしたことを除いて、実施例１に記載するように、試料に照射し、そして染色した。２５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、５μｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１３．５μｌの１００ｍＭグリシン、および１．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを添加することによって、染色反応を停止し、そして暗所中、室温で４０分間インキュベーションした後、７０℃で２分間インキュベーションした。ハイブリダイゼーション前に、ハイブリダイゼーションプローブでアレイ化した、ガスケットを取り付けたスライドを、実施例１に記載するように調製した。プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、そしてウェルにハイブリダイゼーション試料を添加して、そして加湿チャンバー中、４５℃で２時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして１ｘＳＢ１７、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１Ｍグアニジニウム塩酸で構成される４５℃の洗浄溶液で、ウェルを３回リンスした。次いで、ガスケットを除去し、そして各スライド全体を、洗浄緩衝液を含むパップジャー中に４５℃で２０分間入れ、その後、１ｘＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中で２分間リンスし、そして最後に０．２５ｘＳＢ１７でリンスした。実施例１に記載するように、スライドを乾燥させ、スキャンし、そして定量化した。結果を図５に示し、この図は、１０のターゲットタンパク質に関して、緩衝液中、１０ｐＭ〜１ｎＭのタンパク質濃度範囲に関して、多重化アッセイから生成されるシグナルを例示する。
実施例３． 血清中の多数のターゲットタンパク質の検出および定量化のための、表面上に固定されたプローブによるハイブリダイゼーション捕捉を用いた光アプタマーアッセイ
［００１５７］本実施例は、血清試料中の測定のため、５７の光アプタマーを用いた、多重化形式の、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに例示するようなアッセイの有用性を示す。
［０１５８］Ａ．タグ化光アプタマーの調製。実施例２に記載するように、タグ化光アプタマーを調製した。
［００１５９］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。実施例２に記載するように、捕捉タグの逆相補体を固定した。
［００１６０］多重化のため、５７の光アプタマーを２つのセットに分け、２７のアプタマーの１つのセットは、ヒト血清または血漿中で存在量が少ないターゲットに対し、そして３０のアプタマーの１つのセットは、存在量が多いターゲットに対する。２回の希釈で、１４の血清試料を調製し、そして２つのアプタマーセットと混合して、各アプタマーに関して１ｎＭ、そして２７のアプタマーのセットに関しては、１０％血清、０．９ｘＳＢ１、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、５０ｍｇ／ｍｌ ｌｇｈｓＤＮＡ、１０ｍｇ／ｍｌ（ＢｒｄＵ）３０、そして３０のアプタマーのセットに関しては、１％血清、０．９９ｘＳＢ１、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、５ｍｇ／ｍｌ ｌｇｈｓＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ（ＢｒｄＵ）３０の最終濃度を生じた。ＳＢ１は、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ ＣａＣｌ２で構成される。実施例２に記載するように、試料を平衡化し、架橋し、そして染色する。１０μｌの１０％低脂肪酸（ＦＡ）ＢＳＡ、２５μｌの５ｎＭ ＮａＣｌ、５μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および７μｌの１００ｍＭグリシンを添加することによって、染色反応を停止し、そして室温で４０分間インキュベーションした。反応停止後、１．５μｌの１０％ＳＤＳを添加し、そして試料を４２℃に２時間加熱した。
［００１６１］実施例１に記載するように、ガスケットを取り付けたスライドを調製し、そして１ｘＳＢ１、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．６６％低ＦＡ ＢＳＡ、８３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１％ＳＤＳ、５０ｍｇ／ｍｌ巨大ニシン精子ＤＮＡおよび１０ｍｇ／ｍｌ（ＢｒｄＵ）３０と１５分間インキュベーションした。プレハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、染色した試料を添加し、そして加湿チャンバー中、６０℃で２時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーション後、実施例２に記載するように、スライドを洗浄し、乾燥させ、スキャンし、そして定量化した。
［００１６２］図６は、２人の個体由来の血清試料に関する５７の光アプタマーの反復測定のスキャンした画像から定量化したシグナルを示す。測定は非常に再現性が高いことが立証され、反復試料間のアプタマー測定に関して、ピアソン相関は０．９９より優れていた。
実施例４． 表面上に固定されたプローブによるハイブリダイゼーション捕捉を用いた光アプタマーアッセイにおける希釈での動力学的負荷
［００１６３］この実施例は、図３に示すアッセイにおける、場合による２つの工程、動力学的負荷後の未結合タンパク質の除去の使用を例示する。希釈によって達成される動力学的負荷は、血漿中のアプタマー−ターゲット・アフィニティー複合体の保持を伴う、アプタマー−タンパク質非特異的複合体の喪失を例示する。この実施例はまた、希釈後に試料を濃縮し、そして染色前に未結合タンパク質の除去を可能にする、ビーズ捕捉の使用も例示する。
［００１６４］Ａ．タグ化光アプタマー９８７−５１の調製。実施例２に記載するように、タグ化光アプタマーを調製した。
［００１６５］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。実施例２に記載するように、捕捉タグの逆相補体を固定した。
［００１６６］アッセイ緩衝液（ＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）または血漿（ＳＢ１８、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の１０％血漿）のいずれかにおいて、２０ｎＭ濃度の光アプタマー９８７−５１を２つのタンパク質不含対照および１０の連続希釈濃度のターゲットタンパク質ｔＰＡと混合した。動力学的負荷の非存在下での反応を評価するため、緩衝液および血漿中の両方で、２つのさらなる対照試料を調製し、１つはタンパク質不含であり、そして１つはタンパク質の最高濃度を含んだ。１４が各々緩衝液および血漿である、１０μｌ体積中のこれらの２８の試料を、３７℃で３０分間インキュベーションした。緩衝液および血漿の両方の最初の１２の試料に、ＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加することによって５０倍希釈し、そして５分間インキュベーションし、その後、すべての２８の試料に、１ＪのＵＶ光（ＯＡＩ Ｈｇランプのフィルター処理した光源）を照射した。照射後、緩衝液および血漿中の各々２つの残りの試料を、上述のように５０倍希釈した。
［００１６７］各試料を１Ｍ ＮａＣｌに調整し、そしてアプタマー９８７−５１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチドにカップリングしたＤｙｎａｌ常磁性ビーズ２５μｇと４５℃で９０分間インキュベーションした。試料を１０００ｇで２分間遠心分離し、そして上清を除去した。ビーズを、１００μｌのＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した。ビーズを１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．２ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ６４７−ＮＨＳ色素に懸濁し、そして室温で１時間振盪した。この染色溶液を除去し、そして１００μｌのＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭグリシンと交換して、染色反応を停止した。次に、ビーズを１００μｌ体積のグアニジン洗浄緩衝液（ＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１Ｍグアニジン塩酸）で３回洗浄し、７０μｌの０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌ硫酸デキストランに懸濁し、そして９５℃で５分間加熱して、磁気ビーズからアプタマーを溶出させた。実施例２に記載するように、ガスケットを取り付けたスライドを調製し、そしてプレハイブリダイズさせた。溶出したアプタマーを含有する各上清の６５μｌを、２５μｌの３．６Ｍ ＮａＣｌ、１４４ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するウェルに移した。実施例２に記載するように、加湿チャンバー中でスライドを４５℃で一晩インキュベーションし、次いで、洗浄し、乾燥させ、スキャンし、そして定量化した。
［００１６８］図７は、５０倍希釈後の緩衝液（●）および血漿（▲）中の結果のグラフ提示を示す。希釈なし（○緩衝液、△血漿）の高タンパク質対照試料から得たシグナルは、希釈した値とよく一致し、動力学的負荷中にターゲットシグナルの喪失がほとんどないことが示された。希釈を伴わないおよび伴うタンパク質不含血漿ＲＦＵは、８３８ＲＦＵ（０．１ｐＭの□）および１３１ＲＦＵ（△）であり、おそらく、動力学的負荷中のアプタマー非特異的複合体の除去のため、シグナルの８４％の低下を生じた。
実施例５． 表面上に固定されたプローブによるハイブリダイゼーション捕捉を用いた光アプタマーアッセイにおける競合剤での動力学的負荷
［００１６９］この実施例は、図３に示すアッセイにおいて、動力学的負荷を導入する、場合による工程を例示する。競合剤分子の添加による、この実施例で達成される動力学的負荷は、血漿中のアプタマー−ターゲット・アフィニティー複合体を維持しながら、アプタマー−タンパク質非特異的複合体の喪失を例示する。
［００１７０］Ａ．タグ化光アプタマー９８７−５１の調製。実施例２に記載するように、タグ化光アプタマーを調製した。
［００１７１］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。実施例２に記載するように、捕捉タグの逆相補体を固定した。
［００１７２］２０ｎＭ濃度の光アプタマー９８７−５１を、タンパク質不含対照およびＳＢ１８、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０に希釈した１０％血漿中のターゲットタンパク質ｔＰＡの６つの連続希釈濃度と混合した。２セットの試料を調製して、競合剤添加を含むおよび含まない試料間の比較を容易にした。各溶液を３７℃で３０分間インキュベーションした。３０分間平衡化させた後、１つのセット由来の各試料の半分を、同体積のＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の５５０μＭ ｄＮ１５競合剤に３７℃で添加し、そして９分間インキュベーションして、その後、実施例４に記載するように照射した。照射後、ＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を、試料の競合剤不含セットに添加して、競合剤付加の体積と等しくした。インキュベーション時間が２時間であったことを除いて、実施例４に記載するように、試料を染色した。４５μｌの０．８３Ｍ ＮａＣｌ、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ巨大ニシン精子ＤＮＡ、および９ｍＭグリシンの添加によって、染色反応を停止した。試料を混合し、そして暗所中、室温で４０分間インキュベーションし、その後、７０℃に２時間加熱した。
［００１７３］実施例２に記載するように、ガスケットを取り付けたスライドを調製し、そしてＳＢ１８、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ巨大ニシン精子ＤＮＡの溶液中でインキュベーションした。試料をスライドウェルに添加し、そして加湿チャンバー中、４５℃で一晩インキュベーションし、次いで、実施例２に記載するように洗浄し、乾燥させ、スキャンし、そして定量化した。
［００１７４］結果を図８に示し、ここで、競合剤の添加を伴うおよび伴わない、血漿におけるｔＰＡの用量反応曲線を提示する。タンパク質をまったく添加しない血漿の値は、競合剤の添加のため、７０％減少し、一方、最高のターゲット濃度に対する反応は、競合剤の存在下で不変である。
実施例６． 表面上に固定されたプローブによるハイブリダイゼーション捕捉を用いた光アプタマーアッセイにおけるアプタマー・アフィニティー複合体のビーズ捕捉および洗浄での動力学的負荷
［００１７５］この実施例は、図３に示すアッセイにおいて、動力学的負荷を導入する、場合による工程を例示する。ビーズ上にアプタマー・アフィニティー複合体を捕捉し、そして解離したターゲットタンパク質が架橋前に除去されるように、固定された複合体を洗浄することによって、この実施例において動力学的負荷を達成する。
［００１７６］Ａ．タグ化光アプタマー９８７−５１、１１５２−４６、および１９２０−１の調製。実施例２に記載するように、タグ化光アプタマーを調製した。
［００１７７］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。実施例２に記載するように、捕捉タグの逆相補体を固定した。
［００１７８］４ｎＭ濃度の光アプタマー９８７−５１、１１５２−４６、および１９２０−１を、８ｎＭ濃度の各光アプタマーのユニークなタグ配列に相補的なビオチン化プローブと混合し、そして９５℃で１５秒間インキュベーションして、次いで、１秒あたり０．１℃でゆっくりと３７℃まで冷却した。０．２ｎＭ光アプタマー：０．４ｎＭプローブの濃度の光アプタマー：ビオチン化プローブ複合体を、アッセイ緩衝液（ＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）または血漿（ＳＢ１８、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の１０％血漿）のいずれかにおいて、タンパク質不含対照、ならびにターゲットタンパク質、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、およびＩＬ−６の６つの連続希釈濃度と混合した。７が各々緩衝液および血漿である、１００μｌ体積中のこれらの１４の試料を、３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、５０μｇのＤｙｎａｌ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズを各試料に添加し、そして混合しながら３７℃で２分間インキュベーションして、非共有光アプタマー：ビオチン化プローブ：タンパク質複合体を捕捉した。ビーズを、１００μｌのＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡで３０秒間３回洗浄し、１００μｌの同溶液に再懸濁し、そして混合しながら、４ＪのＵＶ光（ＯＡＩ Ｈｇランプのフィルター処理した光源）を照射した。
［００１７９］１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０でビーズを一度洗浄し、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．２ｍｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ６４７−ＮＨＳ色素中に再懸濁し、そして室温で１時間振盪した。ビーズを次に、１００μｌのＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１Ｍグアニジン塩酸、２５ｍＭグリシンで３回洗浄し、１００μｌのＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１回洗浄し、そして９５μｌの４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に懸濁し、そして、７０℃で５分間加熱して、磁気ビーズからアプタマーを溶出させた。実施例２に記載するように、ガスケットを取り付けたスライドを調製し、そしてプレハイブリダイズさせた。溶出したアプタマーを含有する各上清の９０μｌを、３０μｌの４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３Ｍ ＮａＣｌ、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と合わせて、７０℃で２分間インキュベーションし、そして各々の１１０μｌをスライドウェルに移した。加湿チャンバー中でスライドを４５℃で一晩インキュベーションした。試料を除去し、そして４５℃、１５０μｌのＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１Ｍグアニジン塩酸で３回リンスした。ガスケットを取り付けたスライドを分解し、３０ｍｌのＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１Ｍグアニジン塩酸を含有するパップジャーにスライドを入れ、そして４５℃で２０分間、回転によって混合した。次いで、３０ｍｌのＳＢ１７、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含有するパップジャーにスライドを移し、そして２０℃で２分間、回転によって混合し、混合せずに、３０ｍｌの０．２ｘＳＢ１７、０．０２％ＴＷＥＥＮ２０を含有するパップジャーに１５秒間移し、そして、実施例２に記載するように、乾燥させ、スキャンし、そして定量化した。
［００１８０］図９は、緩衝液（●）および血漿（▲）中の、ｔＰＡアプタマー９８７−５１（図９Ａ）、ＰＡＩ−１アプタマー１１５２−４６（図９Ｂ）、およびＩＬ−６アプタマー１９２０−１（図９Ｃ）の結果のグラフ表示を示す。各アプタマーに関して、タンパク質不含緩衝液ＲＦＵ値を減じることによって、ＲＦＵ値を補正した。これらのアプタマーに関する補正したタンパク質不含血漿ＲＦＵ値（△、１ｐＭ）は、それぞれ、６６、２６、および４９ＲＦＵである。
実施例７． 表面上に固定されたプローブによるハイブリダイゼーション捕捉を用いた光アプタマーアッセイにおける未結合光アプタマーの除去
［００１８１］この実施例は、図３に示すように、表面上でのハイブリダイゼーション捕捉前に、未結合アプタマーを除去する、場合による工程を例示する。未結合アプタマーが溶液中に残りつつ、Ｋ＋／ＳＤＳによるタンパク質およびアプタマー−タンパク質共有複合体の沈殿によって、未結合アプタマーを除去する。未結合アプタマーを含有する上清を廃棄し、そしてペレットを懸濁して、この工程を完了する。
［００１８２］Ａ．タグ化光アプタマーの調製。実施例２に記載するように、タグ化光アプタマーを調製した。
［００１８３］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。実施例２に記載するように、捕捉タグの逆相補体を固定した。
［００１８４］実施例１に記載するように、光アプタマーの２ｎＭ最終濃度、およびタンパク質不含対照に加えて、２ｎＭ〜０．６４ｐＭの連続希釈ターゲットタンパク質を含有するように、ＳＢ１８中で結合反応を調製した。反応を３７℃で３０分間インキュベーションし、そして実施例１に記載するように照射した。試料を１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に移し、そして１０μｌのプールした血漿を添加した。３００μｌの以下のＳＤＳ溶液を各試料に添加した：１．３３％ＳＤＳ、１．３３μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（最終体積４００μｌ）。試料を１０秒間、勢いよくボルテックスし、次いで、３７℃で１０分間インキュベーションした。６μｌの２．５Ｍ ＫＣｌを各反応に添加し、そして試料を１０秒間、勢いよくボルテックスし、次いで、氷上で１０分間保持した。微量遠心分離装置中、４℃、８，０００ｇで５分間遠心分離することによって、沈殿物をペレットにした。生じた上清を廃棄した。冷２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を添加することによって、ペレットを洗浄し、その後、５秒間、穏やかにボルテックス混合した。４℃、８，０００ｇで５分間遠心分離することによって、沈殿物を再びペレットにした。洗浄上清を廃棄した。各ペレットを２００μｌの温（＞３７℃）１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に懸濁した。実施例４に記載する常磁性ビーズを各試料に添加して、そしてビーズ懸濁物を５０℃で３０分間、勢いよく混合した。マイクロウェルプレート磁石を用いて、１００μｌのＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０緩衝液でビーズを３回洗浄した。０．２ｍｇ／ｍｌのアミン反応性ＮＨＳ−Ａｌｅｘａ６４７を含有する炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）中にビーズを懸濁し、そして一定して混合しながら、２５℃で６０分間インキュベーションした。実施例４に記載するように、反応を停止し、ビーズを洗浄し、アプタマーを溶出させ、そしてハイブリダイズさせた。実施例１に記載するように、スライドをスキャンし、そして定量化した。
［００１８５］図１０は、未結合アプタマー除去を伴って、そして伴わず、処理した試料の結果を示す。プローブに試料を導入する前に、複合体形成していないアプタマーを試料から除去すると、シグナルがより高い。
実施例８． アプタマー・アフィニティー複合体からのシグナルに影響を及ぼすが、アプタマー共有複合体からのシグナルには影響を及ぼさない条件下でのＵＰＳアッセイシグナルの生成
［００１８６］この実施例は、固体支持体上のプローブへの光アプタマー複合体のハイブリダイゼーション中に、界面活性剤および高塩濃度を用いた場合の、光アプタマーへのターゲット分子の共有結合の影響を示す。ここでは光活性化によって仲介される共有架橋を伴う場合および伴わない場合両方で行ったアッセイの結果を、血漿試料および緩衝液中にｂＦＧＦを含有する試料に関して比較する。
［００１８７］Ａ．タグ化光アプタマー６−７の調製。ここで用いたオリゴヌクレオチドタグは、ＳＥＬＥＸプロトコル中に用いる３’固定領域であった。実施例１に記載するように、ｂＦＧＦ光アプタマー６−７を合成した。
［００１８８］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。実施例１に記載するように、捕捉タグの逆相補体を固定した。
［００１８９］実施例１に記載するように、緩衝液および血漿結合溶液中で、１ｎＭの６−７を調製した。１０ｎＭ ｂＦＧＦタンパク質を緩衝液試料のみに添加した。試料を穏やかに混合し、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。試料の１セットに実施例１に記載するように照射し、そして試料の複製セットには照射しなかった。次いで、反応時間が室温で３時間であり、その後、１０μｌのＢＳＡ、２５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、および５μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加し、そして２時間インキュベーションしたことを除いて、実施例１に記載するように試料を染色した。実施例１におけるようにスライドを調製し、そして８０μｌのプレハイブリダイゼーション溶液（２ｍｌの試料緩衝液に５００μｌの５Ｍ ＮａＣｌおよび１００μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ）を各ウェルに４２℃で１５分間添加した。プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして８０μｌの試料と交換した。ウェルをＭｉｃｒｏｓｅａｌ「Ｆ」フィルムで密封し、そして次いで、スライドをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ上、６００ｒｐｍ、４０℃で２時間混合し、その後、３５℃で２０分間混合した。ウェルを１ｘＳＢ１７、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ、１Ｍ ＮａＣｌで２回リンスし、そして次いで、第二の洗浄液中で１５分間インキュベーションした。ハイブリダイゼーション後、３回の洗浄時間が１５分間、２分間、および３０秒間であったことを除き、実施例１に記載するように、スライドを処理した。実施例１に記載するように、スライドを乾燥させ、スキャンし、そして定量化した。
［００１９０］ｂＦＧＦ光アプタマー６−７の結果を図１１に示す。緩衝液中および１０％血漿中の１０ｎＭ ｂＦＧＦに関して得たシグナルは、光に依存することがわかる。光アプタマーへのターゲットの共有結合が起こりえない、光がない試料上のシグナルは、ここでは「一般バックグラウンド」と称される、特徴外部で観察されるシグナルに匹敵する。１０％血漿中のｂＦＧＦの内因性濃度は、血漿中で、光なしおよび一般バックグラウンド反応を超えるシグナルが小さいことに反映されるように、非常に低い。
実施例９． 緩衝液中の５−ベンジル−ｄＴおよび５−ブロモ−ｄＣヌクレオチドで構成されるＤＮＡ光アプタマーに架橋されたＣ４ｂの検出
［００１９１］この実施例は、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに例示するアッセイ形式における、修飾ヌクレオチドを含有する光アプタマーの活性を例示する。タンパク質Ｃ４ｂに対するＤＮＡ光アプタマー（１９８７−７４）は、標準的なｄＴおよびｄＣの代わりに、５−ベンジル−ｄＴおよび５−ブロモ−ｄＣヌクレオチドで構成される。
［００１９２］Ａ．タグ化光アプタマー１９８７−７４の調製。アプタマー固定領域に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞からアプタマー配列を含有するベクター挿入物を増幅した。３’プライマーをビオチン化し、ＭｙＯｎｅ−ストレプトアビジンビーズ上にＰＣＲ産物を捕捉することを可能にした。洗浄後、捕捉二重鎖の非ビオチン化鎖を２０ｍＭ ＮａＯＨ洗浄で除去し、そして５’プライマー配列にカップリングしたユニークな捕捉タグを含むオリゴヌクレオチドを用いたプライマー伸長によって、アプタマーを生成した。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ｄＡＴＰ、５−Ｂｒ−ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび５−ベンジル−ｄＵＴＰを含有する混合物中、なおストレプトアビジンビーズにカップリングしているテンプレートＤＮＡを用いてプライマー伸張を行って、修飾ヌクレオチドを取り込んだ。２０ｍＭ ＮａＯＨでビーズからアプタマーを収集し、その後、ＨＣｌで中和した。
［００１９３］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。実施例１に記載するように、捕捉タグの逆相補体を固定した。
［００１９４］２ｎＭ １９８７−７４の最終濃度を、ＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の以下の濃度のＣ４ｂタンパク質の希釈シリーズとインキュベーションした：２５ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．０４ｎＭおよびタンパク質不含対照。実施例１におけるように、試料を平衡化し、そして照射し、その後、２μｌのニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。各試料に、７．５μｌ ＮＨＳ−Ａｌｅｘａ−６４７（ＤＭＳＯ中、１．３３ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、Ｃ４ｂタンパク質を蛍光標識し、そして室温で２時間インキュベーションした。２５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、５μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ−１００および１μｌの１００ｍＭグリシンを添加して、未反応標識を反応停止し、非共有相互作用を破壊し、そして続くハイブリダイゼーションを容易にした。
［００１９５］実施例１に記載するように、ガスケットを取り付けたスライドを調製し、そしてＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．８Ｍ ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡおよび０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶液と４２℃で１５分間インキュベーションした。溶液を除去した後、８０μｌの標識試料を、サブアレイごとに１つ、スライドに添加し、そして回転プラットホーム上、４２℃で３０分間インキュベーションした。試料を除去し、そして支持体をプレハイブリダイゼーション溶液で２回、ニシン精子ＤＮＡもまたＴｗｅｅｎ（登録商標）２０も含まないプレハイブリダイゼーション溶液で１回、１ｘＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で１回、そして０．２５ｘＳＢ１７で１回、洗浄した。次いで、実施例１に記載するように、スライドを乾燥させ、スキャンし、そして定量化した。
［００１９６］図１２は、ターゲット濃度の関数として得られる１９８７−７４の、生じた用量反応曲線を示し、アッセイ中の修飾ヌクレオチドアプタマーの活性を例示する。
実施例１０． ２つの独立の染色法を用いた２つの異なる表面上のＵＰＳハイブリダイゼーション捕捉アッセイ
［００１９７］この実施例は、異なる組成の２つの表面、先の実施例のメタクリレート・コポリマー表面およびガラス支持体上のＳｃｈｏｔｔ Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎアミン反応性表面上のアッセイの機能性を示す。さらに、先の実施例におけるように、ターゲットタンパク質にＡｌｅｘａ−６４７を直接付着させることによって、またはまずターゲットタンパク質をビオチンでタグ化し、その後、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ−６４７で標識することによって、ターゲットタンパク質染色反応を行う。アッセイは、どちらかの表面または染色法を用いた、緩衝液におけるＶＥＧＦタンパク質の定量的検出を可能にする。
［００１９８］Ａ．タグ化光アプタマー５０９−８０の調製。実施例１に記載するように、タグ化光アプタマーを調製した。
［００１９９］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。５’アミンを含む捕捉プローブを実施例１に記載するように合成し、そして両方の表面上に固定した。３００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および０．００１％ザルコシルで構成される緩衝液中、４０または２０μＭのいずれかでプローブを溶解することによって、Ｓｃｈｏｔｔ Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎスライド上の固定を達成した。実施例１に記載するように、捕捉プローブを沈着させた。プローブ沈着後、スライドを乾燥ボックス中で一晩インキュベーションし、そして次いで、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）および０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と室温で８時間インキュベーションした。次いで、スライドを水で１０回リンスし、そしてＮ２流下で乾燥させた。実施例１に記載するプロトコルによって、メタクリレート・コポリマー表面上に捕捉プローブを固定した。
［００２００］ＶＥＧＦアプタマー５０９−８０を、１ｎＭ濃度で、アッセイ希釈剤（ＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．０５％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ）中、５０ｎＭ〜１６ｐＭの６つの連続希釈ＶＥＧＦ濃度、およびタンパク質不含対照と、１００μｌ体積中でインキュベーションした。試料を穏やかに混合し、そして３７℃で１５分間インキュベーションし、その後、実施例１に記載するように照射した。試料を分け、そしてＮＨＳ−Ａｌｅｘａ−６４７で直接染色するか、またはＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンと反応させ、そして続いてストレプトアビジンＡｌｅｘａ−６４７で染色する反応によって、染色した。ＮＨＳ−Ａｌｅｘａ−６４７での染色に関しては、反応が室温で４時間であったことを除いて、実施例１の方法を用いた。ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンでの反応に関しては、１μｌのＤＭＳＯ中に溶解した２０ｍＭ ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンを、１００μｌの試料に添加した。溶液を混合し、そして室温で４時間インキュベーションした。どちらの染色反応も、２３μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、１１．４μｌの１０％ＢＳＡおよび１．１μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加することによって反応停止し、そして２時間のインキュベーションを可能にした。
［００２０１］実施例１に記載するように、２つの異なるスライドにガスケットを取り付け、そして１ｘＳＢ１７、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％ＢＳＡおよび１００μｇ／ｍｌ ｈｓＤＮＡで４２℃で１５分間プレハイブリダイズさせた。次いで、溶液を除去し、そして８０μｌの試料と交換した。ウェルをＭｉｃｒｏｓｅａｌ「Ｆ」フィルムで密封し、そしてスライドをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ上、６００ｒｐｍ、４２℃で３時間混合し、その後、３４℃で１時間混合した。ＮＨＳ−Ａｌｅｘａ−６４７で直接標識した試料に関しては、ウェルを１ｘＳＢ１７、０．５％Ｔｒｉｔｏｎおよび１Ｍ ＮａＣｌで３回リンスした。ガスケットを除去し、そしてスライド全体を、ＳＢ１７、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ、１Ｍ ＮａＣｌの３０ｍｌ中で、パップジャーに３０分間入れ、その後、１ｘＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で２分間リンスし、その後、０．２５ｘＳＢ１７中、２０秒間リンスした。ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンと反応させた試料に関しては、ウェルを１ｘＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、０．５％ＢＳＡ（ストレプトアビジン染色緩衝液）で３回リンスした。４μｇ／ｍｌのストレプトアビジンＡｌｅｘａ−６４７の溶液をストレプトアビジン染色緩衝液中で調製し、そして８０μｌのこの溶液を各ウェルに３７℃で１５分間添加した。次いで、ウェルを１ｘＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回リンスした。ガスケットを除去し、そしてスライド全体を、１ｘＳＢ１７、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）２０中、３０ｍｌのパップジャーに３０分間入れ、その後、０．２５ｘＳＢ１７中、２０秒間リンスした。実施例１に記載するように、スライドを乾燥させ、スキャンし、そして定量化した。
［００２０２］図１３は、タンパク質濃度の関数としての用量反応に関する、Ｓｃｈｏｔｔ Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（図１３Ａ）およびメタクリレート・コポリマー表面（図１３Ｂ）の結果を示す。どちらの表面も類似の定量的結果を生じ、アッセイが表面独立性であることを立証した。２つの染色戦略もまた、同程度に有効であるようである。
実施例１１． コーティングされた石英表面上のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上の光架橋タンパク質のハイブリダイゼーション捕捉による、緩衝液および血清中のターゲットタンパク質ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの検出
［００２０３］この実施例は、アッセイのハイブリダイゼーション捕捉工程に関する、さらに別の表面、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ（石英ガラス表面）の有用性を示す。緩衝液中および血清中の両方で、アッセイを行った。
［００２０４］Ａ．タグ化光アプタマー５０９−８０および６−７の合成。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上の２０１および１１２１と称される２つのプローブの逆相補体を、アプタマー５０９−８０および６−７に割り当て、そして実施例１に記載するように調製した。
［００２０５］Ｂ．アミン反応性表面上への捕捉プローブの固定。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイを、ｉｎ ｓｉｔｕで合成したプローブとともにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから購入した。
［００２０６］各々２ｎＭの濃度の、１００μｌ体積のＶＥＧＦアプタマー５０９−８０およびｂＦＧＦアプタマー６−７を、アッセイ希釈剤（１ｘＳＢ１７、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．０２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ）中、２０ｎＭ ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦタンパク質とともに調製した。試料を穏やかに混合し、そして３７℃で６０分間インキュベーションし、次いで、照射し、そして反応時間が１時間であったことを除いて、実施例９に記載するように、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンで染色した。１０μｌの１０％ＢＳＡ、１μｌの１０ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および２５μｌの５Ｍ ＮａＣｌの添加によって、反応を停止した。１０μｌの血清を１つの試料に添加して、およそ１０％血清試料とした。
［００２０７］ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイを、１００μｌのアッセイ希釈剤、１０μｌの１０％ＢＳＡ、１μｌの１０ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、２５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、５μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および７μｌのＤＭＳＯで構成される溶液１００μｌと、４５℃で１時間インキュベーションし、その後、１００μｌの試料をＴｅｓｔ３アレイチャンバーに添加し、そして４５℃で６０分間インキュベーションし、次いで、１ｘＳＢ１、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１Ｍ ＮａＣｌで構成される緩衝液でリンスした。次いで、標準的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ洗浄および染色法を行う、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）流体工学ステーション上にアレイを置いた。次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘスキャナ上でアレイを読み取り、そして定量化した。結果を図１４に示す。緩衝液中（図１４Ａ）、ＶＥＧＦアプタマーは、３５００ＲＦＵの強度でプローブ２０１（図では１と示す）にハイブリダイズし、そしてｂＦＧＦアプタマーは、２３０００ＲＦＵの強度でプローブ１１２１（図では２と示す）にハイブリダイズする。血清中（図１４Ｂ）、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦアプタマーに関して、相対強度は５０００（１）および１８０００（２）である。
実施例１２． 脱脂乳、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋまたは非染色性血漿でプレブロッキングすることによる、コーティングした石英表面上のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイの表面不動態化
［００２０８］この実施例は、脱脂乳、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ、または非染色性血漿でブロッキングすることによる、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上の血清および血漿吸着に対する表面不動態化を例示する。
［００２０９］Ａ．ビオチン化オリゴヌクレオチドの調製。２０１、１１２１、および１０８と示される、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上に固定された３つの異なるプローブにアニーリングするビオチン化オリゴヌクレオチドを、実施例１に記載するように合成した。
［００２１０］Ｂ．血漿ビオチン化。１６０μｌの２１ｍＭ ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンを、１００ｍｌの１ｘＳＢ１８、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の１０％血漿に添加し、そして溶液が２時間反応するのを可能にし、そして次いで、１ｍｌの１００ｍＭグリシン（ｐＨ７．５）の添加で反応停止した。ビオチン化血漿を−２０℃で保存した。
［００２１１］対照緩衝液は、０．７５ｘＳＢ１７、０．１％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および０．８Ｍ ＮａＣｌで構成される。対照緩衝液およびビオチン化血漿で、１０％ビオチン化血漿を調製した。５０μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０μｌの１０％ＳＤＳおよび１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを、１ｍｌの１０％ビオチン化血漿に添加し、９５℃に１０分間加熱し、そして次いで２００μｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加することによって、血漿を前処理した。１μｌの１０００ｘビオチン化プローブ混合物を１ｍｌの対照緩衝液または１０％血漿のいずれかに添加した。
［００２１２］４つのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｔｅｓｔ３アレイを、１ｘＳＢ１７、１％ＢＳＡ、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌおよび１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡとインキュベーションした。ＰＢＳ、０．１％ＳＤＳおよび０．４％に懸濁した、２％脱脂粉乳（Ｎｅｓｔｌｅ Ｃａｒｎａｔｉｏｎ、ＩＮＳＴＡＮＴ ＮＯＮＦＡＴ ＤＲＹ ＭＩＬＫ）の溶液で、アレイＢをブロッキングした。ＳｔａｒｔｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ）、０．１％ＳＤＳおよび０．４％の溶液でアレイＣをブロッキングした。１０％プール血漿、０．１％ＳＤＳおよび０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の溶液で、アレイＤをブロッキングした。各ブロッキング溶液を９５℃に１０分間加熱し、そしてアレイに添加する前に、室温まで冷却するのを可能にした。各Ｔｅｓｔ３アレイを１００μｌのそれぞれのブロッキング溶液で、４５℃で１．５時間ブロッキングした。次いで、１００μｌの試料を各アレイに添加した。アレイＡには、プローブを含む対照緩衝液を添加し、そしてアレイＢ、Ｃ、およびＤには、プローブを含む１０％血漿を添加した。アレイを４５℃で４５分間インキュベーションした。
［００２１３］次いで、チャンバーに渡って１ｍｌの洗浄液を流し、アレイを５分間インキュベーションすることを可能にし、次いで、さらに１ｍｌをチャンバーに渡って流し、そして最後に洗浄液の最後の１００μｌを新鮮な洗浄液１００μｌと交換することによって、１ｘＳＢ１７、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡで、アレイをリンスした。この方法を３回行った。アレイをおよそ１時間インキュベーションした後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）流体工学ステーション上に置き、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘスキャナで読み取った。
［００２１４］結果を図１５Ａ〜Ｄに示す。４つのアレイの一般バックグラウンドは、４０、３００、４００および５００ＲＦＵであり、一方、３つのビオチン化プローブは、アレイ上、〜１７，０００、〜３４０００および１８０００の測定値である。
実施例１３． 脱脂乳でプレブロッキングしたＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上の光架橋タンパク質のハイブリダイゼーション捕捉によるターゲットタンパク質の検出
［００２１５］この実施例は、脱脂乳でブロッキングしたコーティングガラス表面上のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上の、ターゲットタンパク質ＩＬ−１ Ｒ４およびｂＦＧＦのハイブリダイゼーション捕捉を例示する。
［００２１６］Ａ．タグ化光アプタマー１４７２−３および６−７の合成。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上の１３６４および１１２１と示す２つのプローブの逆相補体を、アプタマー１４７２−３および６−７に割り当て、そして実施例１に記載するように合成した。
［００２１７］各アプタマー１４７２−３および６−７の２ｎＭ濃度を各々含有する、４つの溶液を、１０％血漿中で調製して、タンパク質対に関して、以下の最終濃度を生じた（ＩＬ−１ Ｒ４、ｂＦＧＦ）：（０、０）、（１ｎＭ、３０ｐＭ）、（１００ｐＭ、１ｎＭ）、および（１０ｐＭ、１００ｐＭ）。血漿希釈剤は、０．９ｘＳＢ１８、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５μｇ／ｍｌ（ＢｒｄＵ）３０、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および１０％血漿を含有した。試料を３７℃で３０分間インキュベーションし、そして実施例１に記載するように照射した。１μｌのＤＭＳＯ中の５ｍｇ／ｍｌ ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンを各試料に添加し、そして室温で２時間インキュベーションし、その後、２μｌの１００ｍＭグリシン（ｐＨ７．５）、１μｌの１０％ＳＤＳおよび５μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加した。次いで、試料を９５℃に１０分間加熱し、室温まで冷却するのを可能にし、そして１０μｌの１０％ＢＳＡおよび２５μｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加して反応停止した。次いで、１μｌの１００ｘプローブ−１０８を対照配列として添加した。
［００２１８］４つのＴｅｓｔ３アレイを、アレイＢに関して実施例１１に記載するように、脱脂粉乳を用い、４５℃で３時間ブロッキングした。次いで、アレイを、ＰＢＳ、０．１％ＳＤＳおよび０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でリンスし、そして次いで、１ｘＳＢ１７、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡと４５℃で２０分間インキュベーションした。次いで、１００μｌの各試料を別個のアレイに添加した。アレイを４５℃で４５分間インキュベーションした。次いで、実施例１２に記載するように、アッセイを完了した。結果を図１６に示し、血漿中のどちらのターゲットに関しても、線形用量反応が観察された。
実施例１４． Ｌｕｍｉｎｅｘ ＳｅｒｏＭａｐ ＴＭ 微小球体上の光架橋タンパク質のハイブリダイゼーション捕捉による、ターゲットタンパク質、Ｃ５ｂ，６複合体、ニューロトロピン−３、およびトロポニンＩの検出
［００２１９］この実施例は、試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出し、そして場合によって定量化するための、固体支持体としてのＬｕｍｉｎｅｘ ＳｅｒｏＭａｐＴＭ微小球体の使用を示す。緩衝液中にスパイク処理したターゲットタンパク質を用いて、これらのアッセイを行った。検出装置は、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００ＩＳ装置システムであった。
［００２２０］光アプタマー２１８４−６４（Ｃ５ｂ，６複合体アプタマー）、２２７３−３４（ニューロトロピン−３アプタマー）、および２３３８−１２（トロポニンＩアプタマー）に割り当てたアミン末端プローブを、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸）化学反応を用いて、−ＣＯＯＨ官能化ＳｅｒｏＭａｐＴＭ微小球体にコンジュゲート化した。
［００２２１］各々最終アッセイ濃度が２ｎＭの光アプタマー２１８４−６４、２２７３−３４、および２３３３８−１２を、アプタマー３’端に相補的なビオチン化オリゴヌクレオチドにプレアニーリングし、次いで、緩衝液ＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中のある範囲の濃度（１６９ｆＭ〜３．３３ｎＭ）のタンパク質Ｃ５ｂ，６複合体、ニューロトロピン−３、およびトロポニンＩの混合物と合わせた。複製タンパク質不含対照アッセイ試料もまた調製した。１００μｌ体積中のこれらのアッセイ試料を、３７℃で１５分間インキュベーションし、そして次いで、光架橋した。Ｄｙｎａｌ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズ（４００μｇ）を各アッセイ試料に添加し、そして混合しながら２５℃で１０分間インキュベーションして、光アプタマー：ビオチン化オリゴおよびタンパク質−光アプタマー：ビオチン化オリゴハイブリッドを捕捉した。各々、１００μｌの１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、および１０μＭ Ｄ−ビオチン（ｐＨ８．５）で、ビーズを３０秒間、２回洗浄した。この緩衝液のＤ−ビオチン構成要素の目的は、未結合ストレプトアビジン結合部位を飽和させることであった。光アプタマーコンジュゲート化ターゲットタンパク質をビオチンで標識する目的のため、洗浄したビーズを１００μｌの１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ＰＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、および１５０μＭスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に懸濁した。このビオチン化反応を、一定して混合しながら、２５℃で１時間インキュベーションした。次いで、１００μｌ ＳＢ１７、３．１４Ｍグアニジン塩酸、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄し、その後、１００μｌ ＳＢ１７、０．３３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で２回洗浄した。洗浄したビーズを１００μｌの１０μＭ Ｄ−ビオチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５に懸濁し、次いで、７０℃で５分間加熱して、ビーズ結合相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドから光アプタマーを遊離させた。各アッセイ試料に関して、７５μｌのビーズ溶出物体積を２５μｌの以下の高塩緩衝液と合わせた：４Ｍ ＮａＣｌ、０．４％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０。ＳＤＳ（２０％の１１．２５μｌ）を添加し、そして各アッセイ試料を、３０μｌの適切なプローブコンジュゲート化ＳｅｒｏＭａｐＴＭ微小球体（プローブあたり１５００の色コード微小球体、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１Ｍ ＮａＣｌ、１．２５％ＢＳＡ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０）の混合物に移した。微小球体コンジュゲート化プローブへの光アプタマーのハイブリダイゼーションを促進するため、アッセイ試料を一定して混合しながら６５℃で２時間インキュベーションした。６５℃のまま、アッセイ試料を９６ウェル・マイクロタイター真空ろ過プレートに移し、そして２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で、微小球体を６５℃で４回洗浄した。次いで、微小球体を８０μｌの２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、そして９６ウェル・マイクロタイタープレートに移した。２０μｌの１０μｇ／ｍｌストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＃Ｓ８６６）を添加して、光アプタマー−架橋ビオチン化ターゲットタンパク質の検出を可能にした。３７℃で１５分間インキュベーションした後、アッセイ試料を標準的Ｌｕｍｉｎｅｘ装置シグナル（Ｒ−フィコエリトリン）定量化プロトコルに供した。
［００２２２］図１７は、Ｃ５ｂ，６複合体光アプタマー２１８４−６４（図１７Ａ）、ニューロトロピン−３光アプタマー２２７３−３４（図１７Ｂ）、およびトロポニンＩ光アプタマー２３３８−１２（図１７Ｃ）の結果をグラフで示す。各アプタマーに関して、タンパク質不含対照ＭＦＩ（中央値蛍光強度）値を減じることによって、ＭＦＩ値を補正してある。
［００２２３］前述の説明は、多様な態様および実施例に関して、本発明を説明する。特定の態様、実施例、あるいは特定の態様または実施例の要素は、いずれも、請求項のいずれかの決定的な、必要な、または本質的な要素または特徴とは見なされないものとする。さらに、本明細書記載の要素はいずれも、明らかに「本質的」または「決定的」と記載されない限り、本発明の実施に必要とはされない。
［００２２４］請求項に示すような本発明の範囲から逸脱することなく、開示する態様に多様な修飾および置換を行ってもよいことが認識されるであろう。図および実施例を含む明細書は、制限する方式ではなく、例示の方式で見なされるものとし、そしてすべてのこうした修飾および置換は、本発明の範囲内に含まれると意図される。したがって、本発明の範囲は、上に提供する実施例によるのではなく、付随する請求項およびその法的な同等物によって決定されなければならない。例えば、任意の方法またはプロセス請求項に列挙される工程を、実行可能な任意の順で遂行してもよく、そしてこうした工程は、態様、実施例、または請求項のいずれに提示される順にも限定されない。
［００１１］図１Ａおよび１Ｂは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な方法を例示する。 ［００１１］図１Ａおよび１Ｂは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な方法を例示する。 ［００１２］図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な方法を例示する。 ［００１２］図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な方法を例示する。 ［００１２］図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な方法を例示する。 図３は、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための典型的な方法を例示する。 図４は、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた、緩衝液（図４Ａ）および血漿（図４Ｂ）中のＶＥＧＦの連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、両方のセット中の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線を示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１５］図５Ａ〜５Ｊは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すアッセイを用いた緩衝液中の４１の光アプタマーで多重化された１０のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。 ［００１６］図６Ａおよび６Ｂは、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに概略するアッセイから得られる、２つの個体の血清試料中の５７の光アプタマーの反応に関する、ＲＦＵでの反復測定を示す。どちらの反復測定も、測定した５７のターゲットに関して、非常に優れた再現性を示し、０．９９より高いピアソン相関を生じた。 ［００１７］図７は、場合によって動力学的負荷を伴う、ＵＰＳハイブリダイゼーション捕捉アッセイを用いた、緩衝液（●）および血漿（▲）中のｔＰＡに関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を平均し、そしてどちらの曲線からも減じた。ターゲットタンパク質が添加されない血漿試料に関しては、０．１ｐＭ ｔＰＡで、動力学的負荷を伴わない希釈した血漿反応を（□）によって示し、そして動力学的負荷を伴うものを（△）によって示す。測定される反応は、血漿において動力学的負荷のため、ほぼ１対数減少し、一方、１０ｎＭのｔＰＡを添加すると、（○）（緩衝液）および（△）（血漿）によって明らかであるように、ターゲット−アプタマー反応は不変である。 ［００１８］図８は、競合剤を含み（■）、そして含まず（●）、場合によって動力学的負荷を伴うアッセイを用いた、血漿中のｔＰＡに関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含血漿値を１ｐＭ［ｔＰＡ］でプロットし、そしてこれは、競合剤負荷によって、７０％減少したが、３０ｎＭ ｔＰＡでの反応によって立証されるように、ターゲット−アプタマー反応は不変であり、競合剤の存在下または非存在下で本質的に同じである。 ［００１９］図９は、緩衝液（●）および血漿（▲）中の、３つのターゲットタンパク質（ｔＰＡ（図９Ａ）、ＰＡＩ−１（図９Ｂ）、およびＩＬ−６（図９Ｃ））の用量反応曲線を示す。各アプタマーに関して、タンパク質不含緩衝液ＲＦＵ値を減じることによって、ＲＦＵ値を補正してある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた、緩衝液データに関してプロットする。これらのアプタマーに関する補正したタンパク質不含血漿ＲＦＵ値（△、１ｐＭ）は、それぞれ、６６、２６、および４９ＲＦＵである。 ［００２０］図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｋ＋／ＳＤＳ沈殿を用いた、未結合アプタマーの場合による除去に先立って、緩衝液中で架橋し、そして血漿に添加した４つのターゲットタンパク質に関する用量反応曲線（●）を、未結合アプタマーを除去せずに生成した曲線（■）に比較して示す。シグナルは、未結合アプタマーの除去に際して増加し、そして測定のダイナミックレンジは一般的に増加する。 ［００２１］図１１は、ハイブリダイゼーション中に界面活性剤および高塩濃度を用いた際の、光アプタマーに対するターゲットタンパク質（ｂＦＧＦ）の光誘導性化学的架橋の影響を示す。光の非存在下で、そしてしたがって光アプタマーに対するターゲットの共有結合の非存在下で、緩衝液中、アッセイシグナルは２桁以上減少する。ｂＦＧＦの内因性濃度は非常に低く、これは、光なしの対照および全体のバックグラウンド反応を超えるシグナルが小さいことに反映される。 ［００２２］図１２は、ｄＴの代わりに５−ベンジル−ｄＴの修飾ライブラリーで発展させた光アプタマーを用いた、ターゲットタンパク質（Ｃ４ｂ）の緩衝液中の用量反応を示す。ターゲット濃度の３対数を超えて反応が線形であることによって、アッセイにおける修飾ヌクレオチドアプタマーの活性が立証される。 ［００２３］図１３は、Ｓｃｈｏｔｔ Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ表面（図１３Ａ）またはメタクリレート・コポリマー表面（図１３Ｂ）上のターゲットタンパク質の直接標識（▲）またはビオチン化後の蛍光標識されたストレプトアビジン（■）で生じた用量反応曲線を示す。どちらの表面もよく働き、そして２つの標識戦略は同等である。 ［００２４］図１４は、緩衝液（図１４Ａ）または１０％血清（図１４Ｂ）のいずれか由来であり、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上でＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンで標識されたアプタマー−ターゲット複合体のハイブリダイゼーションを例示する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）流体工学ステーション上で、フィコエリトリン−Ｒでの染色を行う。緩衝液中（図１４Ａ）、ＶＥＧＦアプタマーは、３５００ＲＦＵの強度で、プローブ２０１（１）にハイブリダイズし、そしてｂＦＧＦアプタマーは、２３０００ＲＦＵの強度でプローブ１１２１（２）にハイブリダイズする。血清中（図１４Ｂ）、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦアプタマーに関して、相対強度はそれぞれ、５０００（１）および１８０００（２）である。 ［００２５］図１５は、血漿試料由来のアプタマー−ターゲット複合体のハイブリダイゼーションに先立ち、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイをブロッキングする影響を例示する。ビオチン化プローブを、緩衝液中で（図１５Ａ）、そして血漿試料中で、脱脂乳でブロッキングした表面に（図１５Ｂ）、「スターターブロック」でブロッキングした表面に（図１５Ｃ）、そして非標識血漿でブロッキングした表面に（図１５Ｄ）、ハイブリダイズさせた。これらの４つの表面のバックグラウンド値は、４９、３００、４００および５００ＲＦＵであり、一方、３つのプローブのハイブリダイゼーションシグナルは、図１５Ａおよび図１５Ｂでは１６，０００、３３０００および１８０００であり、図１５Ｃでは１７０００、３５０００、および１８０００であり、そして図１５Ｄでは２００００、３６０００および１８０００である。 ［００２６］図１６は、血漿に添加され、光アプタマーに架橋され、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイ上にハイブリダイズさせたターゲットタンパク質の定量的検出を例示する。血漿中で形成される、ターゲットタンパク質、ＩＬ１−Ｒ４（▲）およびｂＦＧＦ（■）のアプタマー複合体のハイブリダイゼーション反応からは、タンパク質不含反応ＲＦＵ値を減じてある。アレイ表面をブロッキングして、試料マトリックス中の分子の吸着を減少させた後、血漿試料からは、２対数定量化範囲が見られる。 ［００２７］図１７は、緩衝液中の光アプタマーと多重化した３つのターゲットタンパク質の連続希釈に関するターゲットタンパク質用量反応を示す。特異的オリゴヌクレオチドプローブがコンジュゲート化したＬｕｍｉｎｅｘ ＳｅｒｏＭａｐＴＭ微小球体へのハイブリダイゼーションを通じて、光アプタマー架橋ターゲットタンパク質を捕捉した。シグナル定量化には、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００ ＩＳ装置システムを用いた。各アプタマーに関して、タンパク質不含対照ＭＦＩ（中央値蛍光強度）値を減じることによって、ＭＦＩ値を補正してある。

Claims (121)

  1. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー・アフィニティー複合体と接触させ；
    （ｃ）（ｄ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー・アフィニティー複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｄ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  2. 前記アプタマーが一本鎖核酸または二本鎖核酸である、請求項１の方法。
  3. 前記アプタマーがＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項２の方法。
  4. 前記アプタマーが、少なくとも１つの化学的修飾を含む、請求項３の方法。
  5. 前記の少なくとも１つの化学的修飾が、リボース位、デオキシリボース位、リン酸位、および塩基位から独立に選択される１以上の位での化学的置換である、請求項４の方法。
  6. 前記の少なくとも１つの化学的修飾が、２’位糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、５−ブロモウラシルの置換、５−ブロモデオキシウリジンの置換、５−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、３’キャップ、および５’キャップから独立に選択される、請求項４の方法。
  7. 前記の少なくとも１つの化学的修飾が、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３イル）エチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンから独立に選択される、請求項４の方法。
  8. 前記タグが、前記アプタマーの５’端である、請求項２の方法。
  9. 前記タグが、前記アプタマーの３’端である、請求項２の方法。
  10. 前記タグが、前記アプタマーの５’端および３’端の間に位置するヌクレオチド配列である、請求項２の方法。
  11. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの５’固定端または３’固定端のいずれか内に含まれる、請求項１０の方法。
  12. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの可変配列または前記アプタマーの可変配列の任意の部分である、請求項１０の方法。
  13. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの可変配列の少なくとも一部および前記固定端の１つの少なくとも一部を含む、ヌクレオチド配列である、請求項１０の方法。
  14. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの可変配列、および前記固定端の少なくとも１つの一部を含む、ヌクレオチド配列である、請求項１０の方法。
  15. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの可変配列および両方の固定端を含む、ヌクレオチド配列である、請求項１０の方法。
  16. 前記ターゲット分子が、タンパク質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子、組織、および規制物質からなる群より選択される、請求項１の方法。
  17. 前記ターゲット分子がタンパク質である、請求項１６の方法。
  18. 前記試験試料が生物学的試料である、請求項１の方法。
  19. 前記生物学的試料が、全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿、血清、痰、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、糞便、組織、組織抽出物、組織生検、および脳脊髄液から選択される、請求項１８の方法。
  20. 前記生物学的試料が血漿または血清である、請求項１９の方法。
  21. 前記プローブが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、および任意のこれらの構造の任意の一部から独立に選択される、少なくとも１つの構成要素を含む、請求項１の方法。
  22. 前記タグが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、および任意のこれらの構造の任意の一部から独立に選択される、少なくとも１つの構成要素を含む、請求項１の方法。
  23. 前記タグが、ハイブリダイゼーションを通じて前記プローブと会合する、請求項１の方法。
  24. 前記タグが第一のヌクレオチド配列を含み、そして前記プローブが第二のヌクレオチド配列を含み、そして前記の第一のヌクレオチド配列が前記の第二のヌクレオチド配列に相補的である、請求項２３の方法。
  25. 前記タグが、リンカー分子を通じて、前記プローブと会合することが可能になるように、前記タグまたは前記プローブを前記リンカー分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１のいずれかの方法。
  26. 前記リンカー分子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、および任意のこれらの構造の任意の一部から独立に選択される、１以上の分子を含む、請求項２５の方法。
  27. 前記リンカー分子が、少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む、請求項２６の方法。
  28. 前記タグが第一のヌクレオチド配列を含み、そして前記プローブが第二のヌクレオチド配列を含み、前記の少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドが、前記の第一のヌクレオチド配列に相補的なタグ会合構成要素および前記の第二のヌクレオチド配列に相補的なプローブ会合構成要素を含み、そして前記タグ会合構成要素が前記の第一のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そして前記プローブ会合構成要素が前記の第二のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項２７の方法。
  29. 前記固体支持体が、マイクロタイターウェル、顕微鏡スライド、シクロオレフィン・コポリマー支持体、膜、プラスチック支持体、常磁性ビーズ、帯電紙、ナイロン、ラングミュア−ボジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｏｄｇｅｔｔ）膜、ガラス、ゲルマニウム支持体、シリコン支持体、シリコンウェハーチップ、フロースルーチップ、マイクロビーズ、ポリテトラフルオロエチレン支持体、ポリスチレン支持体、ガリウムヒ素支持体、金支持体、および銀支持体から選択される、請求項１の方法。
  30. 前記表面が、金属、酸化金属、ポリマー、小有機分子、メタクリレート・コポリマー、ポリアクリルアミド、多糖、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、および三次元ポリマーマトリックスから独立に選択される、少なくとも１つの表面修飾層を含む、請求項２９の方法。
  31. 前記表面が複数の空間的に定義されたアドレスを含み、そして複数の前記アドレスが各々、その上に配置された少なくとも１つのプローブを含む、請求項１の方法。
  32. 前記ターゲット分子を検出する工程が、前記表面上のアドレスで前記標識剤を検出する工程を含む、請求項３１の方法。
  33. 前記標識剤が、検出可能部分で前記ターゲット分子を標識可能な１以上の試薬を含む、請求項１の方法。
  34. 前記試薬の少なくとも１つが、前記ターゲット分子上の官能基と反応する、請求項３３の方法。
  35. 前記官能基が、一次アミン、チオール、アルコール、およびカルボキシレートからなる群より選択される、請求項３４の方法。
  36. 前記検出可能部分が、色素、放射標識、酵素、および酵素基質からなる群より選択される、請求項３３の方法。
  37. 前記色素が蛍光体である、請求項３６の方法。
  38. 前記酵素がアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼである、請求項３６の方法。
  39. 前記ターゲット分子を定量化する工程をさらに含む、請求項１の方法。
  40. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー・アフィニティー複合体と接触させ；
    （ｃ）前記アプタマー・アフィニティー複合体を検出のために調製し；そして
    （ｄ）質量分析を用いて、前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  41. 前記ターゲット分子を定量化する工程をさらに含む、請求項４０の方法。
  42. 前記ターゲットが、エレクトロスプレー・イオン化、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、または電子衝撃イオン化を用いて検出される、請求項４０の方法。
  43. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記試験試料中に存在するいかなる未結合（ｆｒｅｅ）アプタマーも、アプタマー・アフィニティー複合体から分配し；そして
    （ｃ）定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて前記アプタマー・アフィニティー複合体を検出し、そしてそれによって前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  44. 前記ターゲット分子を定量化する工程をさらに含む、請求項４３の方法。
  45. ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを用いるか、ＰＣＲプロセス中に挿入蛍光色素を用いるか、またはＰＣＲプロセス中に分子ビーコンを用いて、前記Ｑ−ＰＣＲを行う、請求項４３の方法。
  46. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｃ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｄ）（ｅ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｅ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  47. 前記アプタマーが一本鎖核酸または二本鎖核酸である、請求項４６の方法。
  48. 前記アプタマーがＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項４７の方法。
  49. 前記アプタマーが、少なくとも１つの化学的修飾を含む、請求項４８。
  50. 前記の少なくとも１つの化学的修飾が、リボース位、デオキシリボース位、リン酸位、および塩基位から独立に選択される１以上の位での化学的置換である、請求項４９の方法。
  51. 前記の少なくとも１つの化学的修飾が、２’位糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、５−ブロモウラシルの置換、５−ブロモデオキシウリジンの置換、５−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、３’キャップ、および５’キャップから独立に選択される、請求項４９の方法。
  52. 前記の少なくとも１つの化学的修飾が、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３イル）エチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンから独立に選択される、請求項４９の方法。
  53. 前記アプタマーが光アプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）である、請求項４６の方法。
  54. 前記光アプタマーが、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−ヨードビニルウラシル、５−アジドウラシル、４−チオウラシル、５−チオウラシル、４−チオシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ブロモビニルシトシン、５−ヨードビニルシトシン、５−アジドシトシン、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヨードアデニン、８−アジドグアニン、８−ブロモグアニン、８−ヨードグアニン、８−アジドヒポキサンチン、８−ブロモヒポキサンチン、８−ヨードヒポキサンチン、８−アジドキサンチン、８−ブロモキサンチン、８−ヨードキサンチン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］シトシン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］ウラシル、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−ブロモアデニン、７−デアザ−７−ブロモグアニン、ベンゾフェノン、アントラキノン、４−アジド−２−ニトロ−アニリン、ソラレン、および任意のこれらの誘導体から独立に選択される１以上の光反応性官能基を含む、請求項５３の方法。
  55. 前記の光アプタマー・アフィニティー複合体を光アプタマー共有複合体に変換する工程が、前記光アプタマー・アフィニティー複合体を照射供給源に曝露する工程を含む、請求項５４の方法。
  56. 前記タグが、前記アプタマーの５’端である、請求項４７の方法。
  57. 前記タグが、前記アプタマーの３’端である、請求項４７の方法。
  58. 前記タグが、前記アプタマーの５’端および３’端の間に位置するヌクレオチド配列である、請求項４７の方法。
  59. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの５’固定端または３’固定端のいずれか内に含まれる、請求項５８の方法。
  60. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの可変配列または前記アプタマーの可変配列の任意の部分である、請求項５８の方法。
  61. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの可変配列の少なくとも一部および前記固定端の１つの少なくとも一部を含む、ヌクレオチド配列である、請求項５８の方法。
  62. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの可変配列、および前記固定端の少なくとも１つの一部を含む、ヌクレオチド配列である、請求項５８の方法。
  63. 前記アプタマーが、可変配列によって３’固定端から分離された５’固定端を含み、そして前記タグが、前記アプタマーの可変配列および両方の固定端を含む、ヌクレオチド配列である、請求項５８の方法。
  64. 前記ターゲット分子が、タンパク質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子、組織、および規制物質からなる群より選択される、請求項４６の方法。
  65. 前記ターゲット分子がタンパク質である、請求項６４の方法。
  66. 前記試験試料が生物学的試料である、請求項４６の方法。
  67. 前記生物学的試料が、全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿、血清、痰、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、糞便、組織、組織抽出物、組織生検、および脳脊髄液から選択される、請求項６６の方法。
  68. 前記生物学的試料が血漿または血清である、請求項６６の方法。
  69. 前記プローブが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、および任意のこれらの構造の任意の一部から独立に選択される、少なくとも１つの構成要素を含む、請求項４６の方法。
  70. 前記タグが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、および任意のこれらの構造の任意の一部から独立に選択される、少なくとも１つの構成要素を含む、請求項４６の方法。
  71. 前記タグが、ハイブリダイゼーションを通じて前記プローブと会合する、請求項４６の方法。
  72. 前記タグが第一のヌクレオチド配列を含み、そして前記プローブが第二のヌクレオチド配列を含み、そして前記の第一のヌクレオチド配列が前記の第二のヌクレオチド配列に相補的である、請求項７１の方法。
  73. 前記タグが、リンカー分子を通じて、前記プローブと会合することが可能になるように、前記タグまたは前記プローブを前記リンカー分子と接触させる工程をさらに含む、請求項４６の方法。
  74. 前記リンカー分子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、および任意のこれらの構造の任意の一部から独立に選択される、１以上の分子を含む、請求項７３の方法。
  75. 前記リンカー分子が、少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む、請求項７４の方法。
  76. 前記タグが第一のヌクレオチド配列を含み、そして前記プローブが第二のヌクレオチド配列を含み、前記の少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドが、前記の第一のヌクレオチド配列に相補的なタグ会合構成要素および前記の第二のヌクレオチド配列に相補的なプローブ会合構成要素を含み、そして前記タグ会合構成要素が前記の第一のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そして前記プローブ会合構成要素が前記の第二のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項７５の方法。
  77. 前記固体支持体が、マイクロタイターウェル、顕微鏡スライド、シクロオレフィン・コポリマー支持体、膜、プラスチック支持体、常磁性ビーズ、帯電紙、ナイロン、ラングミュア−ボジェット膜、ガラス、ゲルマニウム支持体、シリコン支持体、シリコンウェハーチップ、フロースルーチップ、マイクロビーズ、ポリテトラフルオロエチレン支持体、ポリスチレン支持体、ガリウムヒ素支持体、金支持体、および銀支持体から選択される、請求項４６の方法。
  78. 前記表面が、金属、酸化金属、ポリマー、小有機分子、メタクリレート・コポリマー、ポリアクリルアミド、多糖、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、および三次元ポリマーマトリックスから独立に選択される、少なくとも１つの表面修飾層を含む、請求項７７の方法。
  79. 前記表面が複数の空間的に定義されたアドレスを含み、そして複数の前記アドレスが各々、その上に配置された少なくとも１つのプローブを含む、請求項４６の方法。
  80. 前記ターゲット分子を検出する工程が、前記表面上のアドレスで前記標識剤を検出する工程を含む、請求項７９の方法。
  81. 前記標識剤が、検出可能部分で前記ターゲット分子を標識可能な１以上の試薬を含む、請求項４６の方法。
  82. 前記試薬の少なくとも１つが、前記ターゲット分子上の官能基と反応する、請求項８１の方法。
  83. 前記官能基が、一次アミン、チオール、アルコール、およびカルボキシレートからなる群より選択される、請求項８２の方法。
  84. 前記検出可能部分が、色素、放射標識、酵素、および酵素基質からなる群より選択される、請求項８１の方法。
  85. 前記色素が蛍光体である、請求項８４の方法。
  86. 前記酵素がアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビ・ペルオキシダーゼである、請求項８４の方法。
  87. 前記ターゲット分子を定量化する工程をさらに含む、請求項４６の方法。
  88. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｃ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｄ）前記アプタマー共有複合体を検出のために調製し；そして
    （ｅ）質量分析を用いて、前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  89. 前記ターゲット分子を定量化する工程をさらに含む、請求項８８の方法。
  90. 前記ターゲットが、エレクトロスプレー・イオン化、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、または電子衝撃イオン化を用いて検出される、請求項８８の方法。
  91. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｃ）前記試験試料中に存在するいかなる未結合アプタマーも、アプタマー共有複合体から分配し；そして
    （ｄ）定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて前記アプタマー共有複合体を検出し、そしてそれによって前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  92. 前記ターゲット分子を定量化する工程をさらに含む、請求項９１の方法。
  93. ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを用いるか、ＰＣＲプロセス中に挿入蛍光色素を用いるか、またはＰＣＲプロセス中に分子ビーコンを用いて、前記Ｑ−ＰＣＲを行う、請求項９１の方法。
  94. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）試験試料を少なくとも１つの競合剤分子と接触させ、ここで、前記試験試料が、ターゲット分子、非ターゲット分子、またはターゲット分子および非ターゲット分子の両方を含むならば、少なくとも１つの非特異的複合体が形成され；
    （ｂ）タグを含み、そして前記ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、前記試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｃ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｄ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｅ）（ｆ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｆ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  95. 前記の少なくとも１つの競合剤分子が、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、無塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロリン酸から独立に選択される、請求項９４の方法。
  96. 前記の少なくとも１つの競合剤分子がヘパリンまたはポリデキストランである、請求項９５の方法。
  97. 前記の少なくとも１つの競合剤分子が硫酸デキストランである、請求項９５の方法。
  98. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記試験試料中に存在する前記アプタマー、前記ターゲット分子、およびいかなる非ターゲット分子にも、動力学的に負荷を与える（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）条件または処理に、前記試験試料を曝露し；
    （ｃ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｄ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｅ）（ｆ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｆ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  99. 前記アプタマーに動力学的に負荷を与える前記条件または処理が、少なくとも１つの競合剤分子と前記試験試料を接触させることを含む、請求項９８の方法。
  100. 前記の少なくとも１つの競合剤分子が、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、無塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロリン酸から独立に選択される、請求項９９の方法。
  101. 前記の少なくとも１つの競合剤分子がヘパリンまたはポリデキストランである、請求項１００の方法。
  102. 前記の少なくとも１つの競合剤分子が硫酸デキストランである、請求項１００の方法。
  103. 前記アプタマーに動力学的に負荷を与える前記条件または処理が、前記試験試料を希釈することを含む、請求項９８の方法。
  104. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｃ）前記試験試料中に存在するいかなる未結合アプタマーも、前記試験試料から分配し；
    （ｄ）前記タグ配列がプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｅ）（ｆ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｆ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  105. 前記試験試料中に存在するいかなる未結合アプタマーも前記試験試料から分配する工程が、前記試験試料中の前記アプタマー共有複合体、いかなるタンパク質、およびいかなるタンパク質複合体も沈殿させる工程を含む、請求項１０４の方法。
  106. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｃ）前記アプタマー共有複合体を、前記試験試料から分配し；
    （ｄ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｅ）（ｆ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｆ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  107. 前記アプタマー共有複合体を前記試験試料から分配する工程が、前記試験試料から前記アプタマー共有複合体を沈殿させるか、または前記試験試料から前記アプタマー共有複合体を捕捉する工程を含む、請求項１０６の方法。
  108. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｃ）前記試験試料中に存在するいかなる未結合アプタマーも、前記試験試料から分配し；
    （ｄ）前記試験試料から前記アプタマー共有複合体を分配し；
    （ｅ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｆ）（ｇ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｇ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  109. 前記試験試料中に存在するいかなる未結合アプタマーも前記試験試料から分配する工程が、前記試験試料中の前記アプタマー共有複合体、いかなるタンパク質、およびいかなるタンパク質複合体も沈殿させる工程を含む、請求項１０８の方法。
  110. 前記アプタマー共有複合体を前記試験試料から分配する工程が、前記試験試料から前記アプタマー共有複合体を沈殿させるか、または前記試験試料から前記アプタマー共有複合体を捕捉する工程を含む、請求項１０８の方法。
  111. 試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記試験試料中に存在する前記アプタマー、前記ターゲット分子、およびいかなる非ターゲット分子にも、動力学的に負荷を与える条件または処理に、前記試験試料を曝露し；
    （ｃ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｄ）前記試験試料中に存在するいかなる未結合アプタマーも、前記試験試料から分配し；
    （ｅ）前記試験試料から前記アプタマー共有複合体を分配し；
    （ｆ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｇ）（ｈ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｈ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の前記ターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  112. 前記アプタマーに動力学的に負荷を与える前記条件または処理が、少なくとも１つの競合剤分子と前記試験試料を接触させることを含む、請求項１１１の方法。
  113. 前記の少なくとも１つの競合剤分子が、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、無塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロリン酸から独立に選択される、請求項１１２の方法。
  114. 前記の少なくとも１つの競合剤分子がヘパリンまたはポリデキストランである、請求項１１３の方法。
  115. 前記の少なくとも１つの競合剤分子が硫酸デキストランである、請求項１１３の方法。
  116. 前記アプタマーに動力学的に負荷を与える前記条件または処理が、前記試験試料を希釈することを含む、請求項１１１の方法。
  117. 前記試験試料中に存在するいかなる未結合アプタマーも前記試験試料から分配する工程が、前記試験試料中の前記アプタマー共有複合体、いかなるタンパク質、およびいかなるタンパク質複合体も沈殿させる工程を含む、請求項１１１の方法。
  118. 前記アプタマー共有複合体を前記試験試料から分配する工程が、前記試験試料から前記アプタマー共有複合体を沈殿させるか、または前記試験試料から前記アプタマー共有複合体を捕捉する工程を含む、請求項１１１の方法。
  119. 試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子を検出するための方法であって：
    （ａ）各々がタグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有する、複数のアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記アプタマーのいずれかに対応するターゲット分子が存在するならば、１以上のアプタマー・アフィニティー複合体が形成され；
    （ｂ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｃ）各前記アプタマー上の前記タグが、対応するプローブと会合することが可能になるように、少なくとも１つのプローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｄ）（ｅ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｅ）前記標識剤を検出することによって、前記表面上の１以上のターゲット分子を検出する
    工程を含む、前記方法。
  120. 試験試料中のターゲット分子の量または濃度を決定するための方法であって：
    （ａ）タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、試料；
    （ｂ）前記アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換し；
    （ｃ）前記タグがプローブと会合することが可能になるように、前記プローブを含む固体支持体表面を前記アプタマー共有複合体と接触させ；
    （ｄ）（ｅ）に先立つ任意の時点で、前記アプタマー共有複合体と標識剤を接触させ；そして
    （ｅ）前記標識剤を定量的に検出することによって、前記ターゲット分子の量または濃度を決定する
    工程を含む、前記方法。
  121. 試験試料中に存在しうる少なくとも１つのターゲット分子を検出するためのキットであって：タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有する、少なくとも１つのアプタマー；標識剤；および前記タグと会合可能な少なくとも１つのプローブを含む固体支持体を含む、前記キット。
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