JPH0217000A - Ｄｎａ検出システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＤＮＡの存在を検出するための方法に関する
。その方法は、一本鎖ＤＮＡのために高い親和性の結合
タンパク質を使用する。

〔背　景〕

サンプル中のＤＮＡ１７）ｆｔは、分光光度手段により
又は臭化エチジウムにり螢光光度的に従来測定されて来
た。サンプルが純粋である（汚染物、たとえば他の核酸
、タンパク質、フェノール又はアガロースの有意な量を
含まない）場合、吸収される紫外線（ＵＶ）照射の量の
分光光度測定が単純且つ正確である。しかしながら、タ
ンパク質又はＵＶ中において強い吸収性の化合物、たと
えばフェノールによる汚染が存在する場合、ＤＮＡの量
の正確な定量化は不可能であろう。さらに、この技法は
、ｎ／ｍ！範囲でＤＮＡを含むサンプルのためにのみ適
切である。

サンプル中のＤＮＡの量が少ない場合、又はサンプルが
不純物の有意な量を含む場合、ＤＮＡの星は、ＤＮＡ中
に導入された臭化エヂジウムにより放射されるｕ　ｖ　
−誘発性螢光の強さから評価され得る。螢光の量は、Ｄ
ＮＡの合計に比例する。

従ってサンプル中のＤＮＡの量は、一連の標準の螢光収
量とサンプルの螢光収量とを比較することによって評価
され得る。１〜５硝／−はどのＤＮＡがこの方法により
検出され得る。ミニー螢光計（たとえば１１０（イｅｒ
　５ｃｉｅｎｔｔｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　
５ａｎＰｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡにより製造された）
及びフルオロクロム１ｌｏｅｃｈｓ　ｔ　３３２５Ｂの
使用により、感度は１０ｎｇ／ｍｌに上界され得る。

組換えＤＮＡ技法の出現により、サンプル中のＤＮＡ、
たとえば組換え生成物中に存在することができるｌη染
ＤＮＡの有意に低い濃度を同定することが必要になって
来た。？’ｆ；染ＤＮＡは、非特異的であり、そして未
知の配列のものである。従って、サンプルＤＮへの酵素
増幅（たとえばＤＮＡポリマラーゼ連鎖反応方法を用い
て）は、ＤＮＡ合成のための一般的プライマーの欠乏の
ために困難である。従って、ひじょうに少量のＤＮＡの
存在を急速且つ正確に検出することが実質的な興味の対
象である。

〔関連文献〕

Ｋｒａｕｓｅ至＆、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（
１９８１）２２　：　５３４６〜５３５２は、旦、１丈
からの一本鎖結合タンパク質のオリゴヌクレオチドへの
結合を開示する。

Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＬＩＳＡ　（１９７９）’７６：６１５〜６１９は、ガ
ラスへのＤＮＡの結合を開示する。ＫｕｎｇＸ＆、は、
ＤＮＡ−セファロースカラムからの高い塩熔離によりミ
クロコー左ス　ルテウス（旧ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　’　
Ｉｕｔｅｕｓ）からのトポイソメラーゼの精製を開示す
る；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

（１９７７）　２覆：　５３９８〜５４０２゜次のもの
は、ＤＮＡ結合タンパク質に関する総説文献である。Ｇ
ｅ１ｌｅｒｔ工恒り旦す１μリー、第ＸＩＶ巻（１９８
１）３４５〜３６６　；　Ｈａｎｇ。

Ｔｈｅ　Ｅｎｚ　ｍｅｓ　、第ＸＩＶ巻（１９８１）３
３２〜３４３　；　Ｃｈａｓｅ。

八ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８６）５５　
：　　Ｉ０３〜１３６　；Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋ
ｉ）７＆、　、　υ咀」１ηｍｅｓ　、第ＸｒＶ巻（１
９８１）３７５〜４４４　。

〔発明の要約〕

ＤＮＡ検出システム〔ここでその成分の１つは一本鎖Ｄ
　Ｎ　Ａ　（ｓｓＤＮＡ　）に対して高い親和性を有す
るＤＮＡ結合タンパク質である〕を用いる新規方法が、
サンプル中のＤＮＡの存在を検出するために提供される
。ＤＮＡの存在を検出するために、サンプル（場合によ
っては、これがタンパク質を含む場合、前処理される）
が、変性され、５ｓＤＮ八が得られる。次に、サンプル
は、ｓｓＤＮＡ−’ＢＰ複合体（次にこれはｓｓＤＮＡ
又はＢＰのいずれかに結合されるラベルによって検出さ
れ得る）を形成するために、高い親和性の一本鎖ＤＮＡ
結合タンパク質（ＢＰ）と接触せしめられる。ＢＰ及び
ｓｓＤＮＡ　は、接触の時、両者とも溶液中に存在し、
又はＢＰは接触の前、固体支持体に非拡ｌｉｔ的に結合
され得る。

固体支持体に結合される場合、５ｓＤＮ＾又はＢＰは、
固体支持体に直接結合されるか、又は結合分子によって
結合されるかである。この方法は、たとえば組換えタン
パク質生成物におけるＤＮＡを検出するために、又はサ
ンプル中の汚染生物体を検出するために使用され得る。

〔特定の態様の記載〕

本発明によれば、サンプル、特に培養、たとえば発酵で
生成されたタンパク質生成物中のＤＮＡの存在を検出す
るための方法及び組成物が提供される。ＤＮＡの存在は
、高い親和性の一本ｔｉｔ　Ｄ　ＮＡ結合タンパク質の
使用により検出され得る。

一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＢＰ）は、真核又は原核
生物のいづれかの源からであり、そして−本ＩＹ　Ｄ　
Ｎ　Ａ結合タンパク質、トポイソメラーゼ及びＤＮＡ巻
き戻しタンパク質を含むことができる。Ｅ、コリからの
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、ミクロコーカ
スルテウス及びＥ、コリからのＴ４遺伝子３２タンパク
質及びドパイソメラーゼ■が特に興味の対象である。単
離方法は、Ｌｏｈｍａｎｑ　ｅ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒ　（１９８６ｊ−２５：　２１〜２５に記載の
ようにアフィニティークロマトグラフィーを含む。ＢＰ
はまた、たとえばＵｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓｆｌｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ＋　Ｃ１ｅ
ｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏから市販されている。

ＤＮＡ結合タンパク質は、ｓｓＤＮＡが少なくとも１０
０個のヌクレオチドの長さである場合、少なくとも１０
５Ｍ−’、普通約１０１〜ＩＯＩＯＭ−１の範囲で一本
鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に対する高い親和性を有するも
のとして特徴づけられる。他方、そのタンパク質は、ｓ
ｓＤＮＡ−セルロース又はｓｓＤＮＡ−セファロースか
らの溶離のために約０．４Ｍ以上の濃度の塩化ナトリウ
ム（又は同等のイオン強度を提供する他の一価塩）を必
要とする一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質として特徴づけら
れ得る。−船釣に溶離のための濃度は、塩化すトリウム
約０．６Ｍ以上、及び好ましくは約１．０Ｍ以上である
。親和性を決定する場合、水性緩衝液（ｐＨ６〜９，２
５°Ｃ）が使用されるべきである。界面活性剤、変性剤
（たとえば尿素、塩化グアニジウム）、カオトロピック
剤又は有機溶媒は、その緩衝液中には存在すべきでない
。

ＢＰは他の成分に結合されないで使用され得、そして／
又はそれは、直接的に又はリンカ−分子を通して固体支
持体に非拡散的に共有結合され又は吸着的に結合され、
又はラベルに共有結合され得る。リンカ−分子が使用さ
れる場合、ＢＰは特定の結合対の半分に結合され、他の
半分はリンカ−分子である。特定の結合対の例として、
ビオチン及び抗−ビオチン；アビジン及びストレプトア
ビジンを挙げることができる。

種りの固体支持体物質が使用され得る。従って、固体支
持体としで、フィルター膜、好ましくはＩｍｍｏｂｉｌ
ｏｎ”又はニトロセルロースを挙げることができる。ニ
トロセルロース膜に関しては、その膜の孔の大きさは、
５μ以下、好ましくは１μ以下であり；そして普通０．
０５μよりも大きく、好ましくは０．１μよりも大きい
。固体支持体へのＢＰの非拡散結合のための従来の方法
が使用される。

方法は、カルボニルイミダゾール基又は膜上に存在する
他の活性基への共有結合、又は吸着による膜への非共有
結合を含む。

固体支持体物質としてまた、クロマトグラフィー用ベツ
ド材、単分散ラテックス粒子、たとえばスチレン、化学
的に変性されたスチレン、プロピレン、メタクリレート
、ブタジェン、アクリロニトリル又は他のモノマーに基
づくもの；ポリグルタアルデヒド微小球（たとえば、Ｐ
ｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ、により製造されたもの
）、ナイロンビーズ、化学的に変性されたナイロンビー
ズ、オキシランアクリルビーズ、たとえばＥｕｐｅｒｇ
ｒｔ＠　（Ｒｏｈｍ　Ｐｈａｒｍａ。

Ｄａｒｗ＋５ｔａｄｔ、　Ｗ、Ｇｅｒｍａｎｙ）　；ア
クリル酸エステルとアクリル酸アミドのコポリマーを挙
げることができる。これらの物質へのＢＰの結合の方法
は次の通りである：ＢＰが、タンパク質と共に共有結合
を形成することができる反応基を有する活性化されたク
ロマトグラフィー樹脂、たとえばＣＮＢｒにより活性化
された５ｅｐｈａｒｏｓｅ−４８、ＣＮＢｒにより活性
化された４％Ａｇａｒｏｓｅ又はＣＮＢｒにより活性化
されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ−６ＭＢ（ｒ’ｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ、　ＮＪ）　、又は他の樹脂、たとえばセル
ロースに従来の方法により共有結合され得る。

ＢＰは、非特異的な吸着によりポリスチレンビーズに結
合され得る。ＢＰはまた、従来の方法によって、カルボ
キシル基又はアミノ官能基を含むポリスチレンビーズ（
Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、　；ｋａｒｒｉ
ｎｇｔｏｎ、　ＰＡ）に共有結合され得る。

−船釣に一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｓｓＤＮＡ　）に変性さ
れたＤＮＡは、吸着的又は共有的に、直接的又はリンカ
−分子を通して固体支持体に非拡散的に結合され得る。

固体支持体は、膜、たとえばニトロセルロース膜であり
得る。ｓｓＤＮＡを含むサンプルは、好ましくはその股
上で濾過される。膜への結合を促進するために、サンプ
ルの塩濃度は、−船釣に塩化ナトリウム５０１１１Ｍ以
上、好ましくは１００ｍＭ以上であり、又は他の塩が類
似するイオン強度を提供する。次に、ｓｓＤＮＡは、７
５°ｃ〜１００″Ｃ１好ましくは８０°Ｃで少なくとも
３０分、普通少なくとも１時間〜好ましくは６時間、た
とえば膜を焼付けることによってその膜上に固定される
。股上にｓｓＤＮＡを固定する他の方法は、エタノール
によるその膜の洗浄を含む。

ＤＮＡがリンカ−分子を通して固体支持体に結合される
場合、そのリンカ−分子は、ＤＮＡに対して高い親和性
を有するいづれかの分子、たとえばＤＮＡに対する抗体
、ＢＰ又は同様のものである。好ましい方法においては
、リンカ−分子は、固体支持体に非拡散的に結合される
、ビオチン及び抗−ＤＮＡ又はビオチン及びＢＰの接合
体を含んで成る。

固体支持体はまた、陽性に荷電されたナイロン、たとえ
ばビーズ又は膜〔たとえばＮｙｔｒａｎ＠（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｌｌ、　Ｉｎｃ、；　Ｋ
ｃｅｎｅ、　ＮＨ）ＧｅｎａＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ”
（ｄｕＰｏｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ；　Ｂｏｓｔｏｎ、　
ＭＡ）＋Ｚｅｔａ−ＰｒｏｂａＯ（旧ｏＲａｃｌ　Ｌａ
ｂｓ：　Ｐｉｎｏｌｅ、　ＣＡ）＋　Ｂｉ。

ＴｒａｃｅｌＭ（Ｇｅｌｍａｎ　　５ｃｉｅｎｃｅ＋　
　Ｉｎｃ、；　　八ｎｎ　　Ａｒｂｏｒ、　　Ｍｌ）旧
ｏ−ｄｙｎｅ　３ｏ　（Ｐａｉｌ旧ｏｓｕｐｐｏｒｔ；
　Ｇｌｅｎ　Ｃｏｖｅ、　ＮＹ）及びＧｅｎａｔｒａｎ
”ｗ″（Ｐｌａｓｃｏ、　Ｉｎｃ、；　Ｗｏｂｕｒｎ、
　ＭＡ））であることもできる。ｓｓＤＮＡは、陽性に
荷電されたナイロンに、適切な塩濃度及び／又は非イオ
ン性界面活性剤を含んで成るｐ１１６〜９の緩衝液中で
そのナイロンをインキユヘートすることによって選択的
に非拡散結合され得る。適切な塩濃度は、好ましくは塩
化ナトリウム（又は類似するイオン強度を捉供する他の
塩）１Ｍ以下、及び好ましくは０、６　Ｍ以下である。

使用され得る非イオン性界面活性剤の例として、０．１
〜５．０％（Ｖ／Ｖ）の濃度でのＴｗｅｅｎ−２（１）
又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００９を挙げることができる。

サンプルは、ＤＮＡが低濃度で存在する場合、それを検
出することが所望されるいずれかのサンプルである。サ
ンプルは、固体又は液体、たとえば凍結乾燥されたタン
パク質性組成物又は水性媒体である。サンプルは、組換
えＤＮＡ法により製造されたタンパク質、たとえば組織
プラスミノーゲン活性化因子、インシュリン、成長ホル
モン、インターロイキン２及びインターフェロン；治療
目的のために調製されたモノクローナル抗体；絶対的な
純度を必要とする方法で使用するための水を含むことが
できる。ＤＮＡは、裸のＤＮＡ、すなわち二本鎖又は一
本鎖の形で存在し、又はそれは完全な細胞、ずなわち原
核又は真核細胞の形で存在することができる。

本発明を実施するための方法は、他の変法が本発明の範
囲内で存在するけれども、−ａ的に次の通りである。

ＤＮＡが完全な細胞、たとえば細菌又は酵母細胞に含ま
れる場合、その細胞は、溶解条件への暴露、たとえば水
酸化ナトリウム、カオトロピック剤、たとえばカリウム
チオシアネート、及び同様のものによる処理により分解
され得る。サンプルがタンパク質を含む場合、タンパク
質は、場合によっては除去される。次にＤＮＡは、５ｓ
ＯＮＡに変性され、そしてｓｓＤＮＡは固体支持体に非
拡散的に結合される。固体支持体が非拡散的に結合され
たＢＰを含まない場合、ｓｓＤＮＡは、たとえば焼付け
、エタノールによる処理、又は他の便利な手段により固
体支持体上に固定され得る。次にＢＰがその固体支持体
に添加され、そしてｓｓＤＮＡに特異的に結合する。固
体支持体がＢＰを含んで成る場合、５ＳＤＮ＾は固体支
持体」二でＢＰに特異的に結合し、そしてその固定段階
は排除される。ＤＮＡがサン−プル中に存在するかどう
かは、−船釣にＢＰ又はｓｓＤＮＡのいづれかの上のラ
ベルにより、固体支持上のｓｓＤＮＡ−ＢＰ複合体を検
出することによって決定される。他方、ＢＰは、変性さ
れたサンプルに直接的に添加され、ここでそれは５ｓＤ
Ｎ八に結合し、ＢＰ−ｓｓＤＮＡ複合体を形成する。次
にサンプルが濾過される。

存在するＤＮＡの濃度の決定が所望される場合、ＤＮＡ
を含まない少なくとも１種のバックグラウンド溶液及び
既知の量のＤＮＡを含む少なくとも１種の対照溶液が、
未知の濃度のＤＮＡを含むサンプルに対して同様にして
処理される。バックグラウンド溶液中に検出できるラベ
ルの量が、対照溶液及び未知のサンプル中に検出できる
ラベルの量から引き算される。次に、対照溶液及び未知
のサンプルのための調整された値は、サンプル中に存在
するＤＮＡの量の決定に関係する。

次のことば、上記段階を実施するための一般的な方法で
ある。本発明の方法は、タンパク質の存在又は不在下で
ＤＮＡの検出のために使用され得る。タンパク質が存在
する場合、サンプルを除タンパク質するだめの追加の段
階が所望される。

ＤＮＡの結合性に悪影響を与えない除タンパク質のため
の従来の手段（たとえば、フェノール抽出）が使用され
得る。タンパク質が既知の特徴を有する場合、サンプル
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー（例えばＤＥ
ＡＥ−セルロース、ホスホセルロース、スルホン酸ゲル
）、ヒドロキシアパタイト（−本積及び二本鎖ＤＮＡが
異なった塩濃度による溶離によりタンパク質から分離さ
れ得る）、ゲル濾過及びアフィニティークロマトグラフ
ィーにより除タンパクされ得る。

アフィニティークロマトグラフィーは、除去されるべき
タンパク質に対して引き起こされた固定されたマウス免
疫グロブリンを用いて、サンプルから直接的にタンパク
質を除去するために使用され得、又はサンプルは、サン
プル中のＤＮＡを結合する固定されたＢＰを用いて脱タ
ンパク質され得る。次に、ＤＮＡは、ｇｉｌｌｌ　Ｍ以
上、好ましくば２Ｍ以上の高い塩濃度を用いてＢＰから
溶離され、そしてそのＮｍ剤は、その塩濃度をｍ整した
後、検出アッセイに直接的に使用され得る。最終塩濃度
は、使用される方法に依存して異なる。たとえば、固体
支持体が、陽性に荷電されたナイロン膜又はリンカ−分
子を含んで成る膜である場合、塩濃度は等張に調整され
る。モノクローナル抗体サンプル中のＤＮＡの検出のた
めには、そのモノクローナル抗体が、固体支持体に結合
されたプロティンＡを用いて除去され得る。

サンプルを除タンパク質する他の方法は、高濃度の沃化
ナトリウムの存在下でガラス粒子の懸濁液とサンプルと
を混合することを含む。サンプル中に存在するいづれか
のＤＮＡは、そのガラス粒子により非拡散的に結合され
る。ガラス粒子が単離され、そしてＤＮＡが水又はＰＢ
Ｓによる処理により粒子から回収される。ガラス粒子は
、微粉砕されたビーズ、又は好ましくは、ＢＩＯ１０１
，Ｉｎｃ、。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａにより供給
されているようなＧｌａｓｓｍｉ　ＩｋＴＭを含んで成
る組成物を含むことができる。

サンプルを除タンパク質するために使用され得るもう１
つの方法は、少なくとも１種の酵素、たとえばプロアー
ゼ又はプロテイナーゼＫを含んで成るタンパク質分解酵
素組成物とタンパク質含有サンプルとの混合である。酵
素処理の後、加水分解された生成物は、たとえば低分子
量カットオフ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０，Ｃｅｎｔ
ｒｉｐｒｅｐ−３０；　Ａｓ１ｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒ
ｓ。

ＭＡにより供給されるような約１０，０００又は３０，
０００）を有する膜を通しての遠心分離、低分子量カッ
トオフ（約１０，０００又は３０，０００）を有するミ
リボア低体積限外濾過装置の使用又はゲル濾過により、
−ａ的に除去される。存在するすべてのタンパク質が消
化され、除去され又は消化及び除去された後、ＤＮＡは
ｓｓＤＮＡに変性される。ＤＮＡを変性するために使用
される方法は、約９０〜１００°Ｃでの加熱または水酸
化ナトリウム（ｐ旧３．０）による処理を含む。急速な
冷却（ＤＮＡの再アニーリングを避けるために）又は中
和（たとえば酢酸アンモニウム又はＴｒｉｓ緩衝液を用
いて）の後、ｓｓＤＮＡは、固体支持体に接触される。

固体支持体がニトロセルロース又は陽性に荷電されたナ
イロンのような膜である場合、サンプルは一般的に、マ
ニホールド濾過装置を用いて濾過される。しかしながら
、固体支持体が、たとえば陽性に荷電されたナイロンビ
ーズである場合、そのビーズはサンプルと一緒に直接イ
ンキュベートされ得る。固体支持体がその表面上に固定
されたＢＰを有する場合、ｓｓＤＮＡはＢＰに結合し、
ＢＰ−ｓｓＤＮＡ複合体を形成する。固体支持体がＢＰ
を含まない場合、ＤＮＡは、焼付、又はエターノールに
よる処理により固体支持体上に固定される。この段階は
、陽性に荷電されたナイロン膜が使用される場合、排除
され得る。

ニトロセルロース又は陽性に荷電されたナイロン上の非
特異的結合部位は、高濃度のタンパク質溶液、たとえば
約１〜１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、非脂肪
性ドライミルク溶液及び同様のものと共に膜をインキュ
ベートすることによって阻止され得る。陽性に荷電され
たナイロンに関しては、非特異的結合部位は、さらに非
イオン性界面活性剤溶液、たとえばＴｗｅｅｎ−２００
又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００９（ｉｉ！ｌ常０，１〜５
．０％）による洗浄により阻止され得る。

次に、非拡散的に結合されたｓｓＤＮＡを含んで成る固
体支持体は、ラベルされたＢＰと共にインキュベートさ
れ、ＢＰ−ｓｓｌｌＮＡ複合体を形成する。固体支持体
がニトロセルロース又は陽性に荷電されたナイロン膜で
ある場合、ＢＰ（一般的に０．３ｎ／−）を含む緩衝液
（ｐｌ＋６〜９）がその膜に添加される。緩衝液は一般
的に室温で存在し、そして好ましくはＯ０旧〜０．３Ｍ
の塩化ナトリウムを含み、そしてさらに陽性に荷電され
たナイロンのためには、非イオン性界面活性剤、たとえ
ばＴｗｅｅｎ−２０９又はＴｒｉｔｏｎＸ−１０００（
好ましくは０．１〜５．０％ｖ　／　ｖ　）を含む。

ＢＰ−ｓｓＤＮＡ複合体は、ＢＰ又はＳ！ｌＤＮＡのい
づれかに結合されたラベルにより検出され得、該ラベル
は好ましくはＢＰに結合されている。ＤＮＡが好ましく
は、ラベルされる場合、ＢＰが固体支持体に予備結合さ
れる場合の例外が存在する。ＢＰは、多くの方法により
共有的にラベルされ得る。ラベルは、酵素、たとえばア
ルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ホースラディシュベルオキシダーゼ
、βラクタマーゼ、ウレアーゼ；放射性核種、たとえば
＋ｚｓ■、化学ルミネセント又は螢光化合物、たとえば
フルオレセインイソシアネート；ハプテン、たとえばビ
オチン、及び同様のもの；又は検出可能なシグナルを提
供するいづれか他のラベルであることができる。ラベル
が酵素である場合、それは少なくとも１つの入手しやす
い必須でない遊離システィン残基を含む。ＢＰは、たと
えばＢＩａｋｅｌｙ痰＆、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｃａｔａｌ
　ｓｉｓ　（１９８４）２３：２６３〜２９２により記
載されているように酵素に結合され得る。この方法で結
合され得る他の酵素として、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を挙げることができる。

他方、酵素ラベルはチオール化され得、そして次にＢＰ
に接合され得る。タンパク質にラベルを結合するための
方法は、科学文献に詳細に記載されている。たとえばＨ
ｅａｌｅｙｆｌ　煮、　、　Ｃｌ１ｎｉｃａＣ，ｈｉ；
ｉｃａ　Ａｃｔａ（１９８３）　１３４　：　５１〜５
８　；　ｌ５ｈｉｋａｉｅａ星ｅ、。

、１−Ｌ、１−ｍｐ−ｕ−ｎｐｙ咀鮫−（１９８３）土
：２０９〜３２７；及びＴｉｊｓｓｅｎ。

Ｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄ　Ｔｈｅｏｒ　　ｏｆ　Ｅｎｚ
　ｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ　５（１９８５）２５９
〜２３６．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　）を参照のこ
と。

ＳＳＢ上のラベルが酵素である場合、ＳＳＢ分子当りに
結合される酵素分子の数は通常、約１〜３個のマレイミ
ド分子／ＳＳＢ、好ましくは１．８個のマレイミド／分
子である。一般的にこれは、ＳＳＢ分子当り１個の酵素
分子を含んで成る５ＳＢ−酵素接合体をもたらす。ラベ
ルがヘプテン、たとえばビオチンである場合、ＳＳＢ分
子当りに結合されるハプテン分子の数は、通常１〜５、
好ましくは３〜４である。

検出されるべきＤＮＡ　（ＢＰよりもむしろ）は、ラベ
ルされ得る。ラベルとして放射性核種、発けい先回、又
はハブテン、たとえばジゴキシン又はビオチン及び同様
のものを挙げることができる。

ラベルは、標準の酵素的反応、たとえばニックトランス
レーションにより、又は３）１　、１４Ｃ、３２ｐ、又
はビオチンによりラベルされたデオキシヌクレオチド三
リン酸（ｄＮＴＰ）による末端のラベル化により、ＤＮ
Ａに導入され得る。次にラベルされたＤＮＡは、アルカ
リ又は加熱によりｓｓＤＮＡに変性される。

他方、ＤＮＡは、試薬、たとえば二本鎖ＤＮＡに結合す
るイソプソラレンによりラベルされ得る。

３Ｈ−イソプソラレン又はビオチンーイソプソラレンは
、ＩＩＲＩ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、、　Ｂｅｒ
ｋｅｌｅｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから入手できる。

イソプソラレン試薬は、それとサンプルとを混合するこ
とにより、続いて３４０〜３ＢＯｎ＋＊で光照射するこ
とにより、ＤＮＡに結合される。使用されるラベルがイ
ソプソラレンである場合、イソプソラレンによりラベル
されたＤＮＡが変性段階なしにＢＰにより認識されるよ
うに、そのラベルされたＤＮＡを変性する必要はない。

ＢＰ−ｓｓＤＮ＾複合体を検出する方法は、使用される
ラベルのタイプ及び必要とされる感度に依存するであろ
う。ラベルが酵素である場合、基質の消失又は反応生成
物の出現が、基質の添加後、分光光度的に測定され得る
。酵素が、たとえばウレアーゼである場合、指示色素、
たとえばクレゾールレッドは、酵素基質の添加の後、サ
ンプル中のｐＨの変化をモニターするために使用され得
る。次に、光学密度又は色の変化の可視強度の変化は、
既知の濃度のＤＮＡを含む少なくとも１種の同一に処理
された対照溶液との比較によりサンプルのＤＮＡ含有量
と相互関係を示す。他方、存在するいづれかのＤＮＡは
、たとえばアメリカ特許第４．５９１，５５０号に記載
されている光反応性装置によりρ１１変化の量を測定す
ることによって検出され得る。サンプル中のＢＰ−ｓｓ
ＤＮＡ複合体を検出するための他の方法は、ラベルが放
射性核種である場合、放射能の量を定量化することを含
む。ラベルがヘプテン、たとえばビオチンである場合、
そのラベルは、たとえば酵素によりラベルされたアビジ
ン、ストレプトアビジン又は抗−ビオチンの使用により
検出され得る。

便利上、試薬が時々キットに擢供され、ここでそれらは
、緩衝液、安定剤、賦形剤及び同様のものと一緒に存在
することができる。キットはまた、ラベルされたＢＰ又
はｓｓＤＮＡの調製のために及びアッセイの実施におけ
るラベルされたＢＰ−ｓｓＤＮＡ複合体の検出のために
必要ないづれか追加の試薬も含むことができる。試薬が
ＢＰを含む場合、それはラベルされても又はラベルされ
なくてもよい。

ラベルされない場合、それはまた、固体支持体に非拡散
的に結合され得る。

次の例は、例示的であって、限定するものではない。

Ａｏｍ−マレイミドヘンシイルーＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いての５ＳＢ−ウレア
ーゼ　人　の Ｅ、コリからの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）
を、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏｒｐ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＲから得た
。それは、次のようにしく３１） て架橋剤ＭＢＳに結合された。ジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）中、０．２５％のＭＢＳ　１００．＋１１を、
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ１６，８）中、ＳＳ８２
■を含む溶液２．０−に添加した。その混合物を室温で
３０分間、軽く攪拌し、次に５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２
５上で分離した。溶離緩衝液は、０．１　Ｍのリン酸（
ｐＨ６，８）であった。画分を、２８０ｎｍでＵＶ吸光
度によりモニターした。カラムから溶離された第１のピ
ークは、ＭＢＳに結合されたＳＳＢを含んだ。ピーク画
分（３−）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）中
、ウレアーゼ（２０Ｍ）の溶液４−と混合した。

この混合物を、室温で２０分間攪拌した。次にその反応
を、１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む０
．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＦ１６．８）中、
５００ｍＭの亜硫酸ナトリウム溶液１．７５ａｆの添加
により停止せしめた。形成された接合体を、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより接合されなかった酵素から分離
した。次に、精製された酵素接合体を、クリセロールに
より１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。ＢＳＡを添加し、０
．２５％（ｖ　／　ｖ　）にした。

接合体を２〜８°Ｃで貯蔵した。

Ｂ、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド′エステル（ＭＢＳ）を用いての５ＳＢ−ホー
スラディシュペルオキシダーゼＨＲＰ　　人の ＨＲＰ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｌ
ａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を、０、２　Ｍの塩化ナトリ
ウムを含む０．１　Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，５）中、）ＩＲＰ　１６■とジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）　２５ＩｌＩ中、５ＰＤＰ　４３５硝とを混合
し、そして室温で３０分間結合せしめることによって、
チオール化せしめた。反応しなかった５ＰＤＰを、５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５を充填するクロマトグラフィー
により除去し、０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む０、１
　Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）により溶離
した。

ＨＲＰ上のジチオピリジン基を、２５ｄのＤＴＴを３０
分間添加し、次にそのＤＴＴ及びＰＢＳ中においてＧ−
２５分離により形成された２−チオピリジンを除去する
ことによって阻止解除した。

０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液０．５ｄ中、５Ｓ１
０．５５ｍｇにＤＭＦ中、ＭＢＳの０．２５％溶液２５
ｐ！を添加し、そして室温で３０分間攪拌することによ
って、マレイミド−３ＳＢを形成した。マレイミド−３
ＳＢを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５上で精製し、次に２
種の溶液を混合し、そして室温で２０分間反応せしめる
ことによって、チオール化されたＨＲＰ１５−と縮合せ
しめた。その反応を、Ｉ　００ｍＭの２−メルカプトエ
タノール１２．５ｐｆの添加により停止せしめた。５Ｓ
Ｂ−１１ＲＰ接合体溶液をグリセロール中で１０％（Ｖ
／Ｖ）にし、そして４°Ｃで貯蔵した。

Ｃ，５ＳＢ−ビオチン　人　の ＰＢｓｌｉ（１５０ｍＭ、　５０ｍＭのＮａｃｆｆｉ、
　リン酸ナトリウム、ｐ１１７．０及び１ｍＭのＥ［ｌ
ＴＡ’）中、ＳＳＢＩｍｇを、撹拌しながら、室温で２
時間、ＤＭＦ　２０ｐｌ中、ビオチンアミドカプロエー
ト−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５０泳と共
に混合した。反応しなかったビオチン試薬を、５ｅｐＦ
ａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムを通すことにより除去した。

クローナル抗体、すなわちクローン４Ｈｚ（ＳｅｐυＩ
ｖｅｄａＶｅｔｅｒａｎｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉ
ｏｎ　１（ｏｓｐｉｔａｌ、　　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅ
ｓでＤｒ、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｗｅｉｓｂａｒｔから得ら
れた）を、ＤＭＦ５０ｐ！中、４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロへ牛サンー１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）　１２５ｘと共に
反応せしめた。

反応しなかったＳＭＣＣを、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２
５カラムを通すことにより除去した（ＰＢＳＨにより溶
離された）。

抗体当りのマレイミドの数は４であった。次に、ウレア
ーゼ（２０＋ｎｇ）を、マレイミド−抗体に添加し、そ
して４°Ｃで４時間インキュベートした。

次に、反応しなかったマレイミド基を、２−メルカプト
エタノールの添加により２ｍＭの濃度にすることによっ
て阻止した。

接合体を、５０ｍＭの亜硫酸ナトリウム、２０ｍＭのリ
ン酸二水素ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム、
１ｍＭのＥＤＴ八、２ｍＭのジチオトレイトール及びＯ
，Ｉ％Ｔｕｅｅｎ−２０から成る緩衝液中において５ｅ
ｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００５−４００Ｈ１ｌ（Ｐｈａ
ｒ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）ｃ７）　１．５
ｃｍＸ　７０ｃｍカラム上でのゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより精製した。遊離ウレアーゼピークの前に溶出
する全タンパク質ピークを混合した６０．０５％ＢＳＡ
を添加し、そしてその接合体溶液を、密封された容器中
においてアルゴンガス下で４°Ｃで貯蔵した。

Ｅ、ビオチン−−ＤＮＡ　　人　の ＰＢＳＨ中、Ｒ，Ｗｅｉｓｂａｒｄからの精製された抗
−ＤＮＡ抗体１■を、ＤＭＦ　２０Ｊ中、ビオチンアミ
ドカプロエート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル５０Ｉ１ｇに添加し、そして室温で２時間攪拌した。

反応しなかったビオチン試薬を５ｅｐｈａｒｄｅｘ　Ｇ
−２５カラムを通ずことにより除去した。精製された抗
ＤＮＡ−ビオチンを４　”Ｃで貯蔵した。

１＊ｍｏｂｉ　Ｊｏｎ”膜は、リジン又はアルギニン上
のニブシロンアミノ基に結合するカルボニルイミダゾー
ル基を含む。ＳＳＢを、０．６５μのＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ”ｎり（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　；　Ｂｅｄｆｏｒｄ、
　ＭＡ）上に、０．２ｍｇ／−のＳＳＢを含むリン酸緩
衝溶液中に前記膜を１時間ソータすること番こよって固
定した（１０ｃｃのタンパク質溶液／１００ｃｎｌの膜
）。ＳＳＢ溶液をデカントすることによって除去した。

膜上の残存する活性カルボニルイミダゾール基を、室温
で一晩、０、１　Ｍのエタノールアミン（ｐＨ９，５）
により冷却した。次に、膜を連続的にリン酸緩衝溶液、
蒸留水及びポリビニルアルコールにより洗浄しくそれぞ
れ１５分間）、そして次に６５℃で５分間乾燥せしめた
。次にその乾燥せしめられた膜は、検出システムに使用
するために準備された。１０■／ｄのＢＳＡ水溶液中、
３Ｚｐによりラベルされた一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（１０〜
１０００ｐｑ）を含ムサンプル１００ｔｌを、５ＳＢ−
ｒｍｍｏｂｉ　Ｉｏｎ”膜を通して濾過した（１０分間
の濾過時間）。７０％の３２ｐ計数が、ＳＳＢ濃度が０
．２　ｍｇ　／　ｍｌである場合、膜上に捕獲された。

この固定化法に使用されるＳＳＢの濃度を１■／−に高
めることがＤＮ’Ａ捕獲を８０％改良した。

°Ｃでニトロセルロース膜（０，４５μの孔サイズ、５
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｎｅｌｌ）をソー
クすることによって、ＳＳＢをその膜に吸着せしめた。

膜上の非特異的結合部位を、室温で１時間１０■／−の
ＵＳＡにより阻止した。１０ｍｇ／−のＢＳＡ及び３２
ｐによりラベルされた一本鎖ＤＮＡを含むサンプル４０
０ｐｌをその膜を通して濾過する場合、３６％の３ｚｐ
計数が、ニトロセルロース膜上に捕獲された。

サンプル（１０＋＊Ｍのリン酸ナトリウム、ｐｉ（７，
０゜０．１５Ｍの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥ［］ＴＡ
における）当りＯ〜１ｏｏｐｑの純粋ウシ胸腺（Ｓｉｇ
ｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　ＳＬ、［、ｏｕｉｓ
＋　Ｎｏ）を含むサンプルを、１００°Ｃで１０分間加
熱し、続いて急速に冷却することによって一本鎖ＤＮＡ
に変性した。その変性されたサンプルを、多様濾過装置
を用いて、０．４５μの孔サイズのニトロセルロース膜
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｎｅｌｌ；　Ｋ
ｅｅｎｅ、　Ｎ）ｌ）を通して濾過した。次にその膜を
８０°Ｃで１時間焼付けし、ＤＮＡを固定した。例ＩＡ
におけるようにして調製され、そしてさらに精製を伴わ
ないで使用される５ＳＢ−ウレアーゼ接合体を、２％ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）２％Ｆｉｃｏｌｌ、２％ポ
リビニルピロリドン、１０ｎ＋Ｈのリン酸ナトリウム、
４０Ｉｌ１Ｍの塩化ナトリウム中に希釈し、０．３蛸／
１ｍｌにし、そして２ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ１，５）
を、その膜に添加した。その膜を、十分な体積の接合体
のベトリ皿中において、室温で１時間５ＳＢ−ウレアー
ゼ接合体と共にインキュベートし、その膜を被覆した。

次にその膜を３度０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｌｌ１
１ＭのＥＤＴＡ　（ｐｌ（６）により洗浄し、いづれか
非特異的に結合された接合体を除去した。次に存在する
いづれかのＤＮＡを、酵素基質（１００ｍＭの尿素、０
．１５Ｍの塩化ナトリウム、１ｍＭのリン酸ナトリウム
、ｐＨ６、０，５ｍＭのクレゾールレッド）の添加によ
り検出した。ウレアーゼ反応によるｐＩ（の変化は、オ
レンジから赤紫へのクレゾールレッドの色の変化をもた
らした。

次に、赤紫色のスポットの視覚的強度は、膜上の着色さ
れたスポットの相対的サイズ及びその色の強さを決定す
ることによりサンプルのＤＮＡ含有量に相互関係した。

加した。ウレアーゼによるｐｌ（の変化は、光反応性装
置のシグナルの変化をもたらした。次に、そのシグナル
の変化（μポルト／秒）は、サンプルのＤＮＡ含有量に
相互関係した。

Ｂ、バイオセンサーによる１１の 上記のようにして調製された股上に存在するいずれかの
ＤＮＡをまた、酵素基質の添加の後、光反応性装置（た
とえばアメリカ特許第４，５９１，５５０号を参照のこ
と）を用いてｐｎの変化の大きさを測定することによっ
て検出することができる。１１ＩＩＭのリン酸ナトリう
ム、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０，１００ｍＭの尿素
（ｐＨ６）を含む酵素基質混合物を、膜に添＋ ＋＋ 土＋＋ ＋＋＋十 抗−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）を、０．２５ｍｇ／ｍｌの
濃度でＰＢＳ中に？容解した。ニトロセルロースシート
（０，８μ）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈ
ｎｅｌｌ）を、ＤＮＡを含まない水により湿潤し、次に
、室温で１５分、次に４°Ｃで一晩、その膜を軽く振動
しながら抗ビオヂン混合物（０，２ｍＺ／膜ｃＪ）中に
おいてインキュベートした。次に抗−ビオチン混合物を
注ぎ出し、そしてニトロセルロースを簡単にＰＢＳによ
りずずいだ（０，２ｍｌ　／　ｃｒｌ　）。次に、その
ニトロセルロースを、ＰＢＳ中、０．２％（ｗ／ｖ）の
グルタルアルデヒドと共に１５分間インキュベートした
。次にそのニトロセルロースを、ＰＢＳ、次にＤＮＡを
含まない水により連続的に洗浄した（両汗ともＱ、’ｌ
　ｍｌ　／　ｃＪで）。次に、そのニトロセルロースを
、Ｑ、　２ｍ！　／　ｃＪで１０分間、０．１％（Ｗ／
Ｗ）のポリビニルアルコールにより湿潤した。

次にそのニトロセルロースを、６０°Ｃで１０分間焼付
けた。

２、陀隈ｉ少Ｐ二ノー 抗−ビオチン膜に代わる酢酸セルロース膜（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｎｅｌｌ、　　１．２　Ｉ
ｔの孔サイズ）を、」二記セクション３Ａ、１に記載の
ようにして調製した（但し、グルタルアルデヒド／ＰＢ
Ｓのインキプーベーションの前、ＰＢＳによる洗浄を除
いた）。

何−五 タンパク質を含むサンプル中におけるＤＮＡの沃化ナト
リウム（６Ｍ）４００＃を、サンプル２００Ｉに添加し
た。それぞれのサンプルは、ＢＳＡ　２■及びウシ胸腺
ＯＮへ１００．５０．２５又はｏｐｑを含んだ。

Ｇｌａｓｓｍｉｌｋ”　２　Ｊを添加し、そしてその混
合物を室温で１０分間インキユヘートした。ＧＩａｓｓ
ｍ目ｋＴＭ／ＤＮＡ複合体を、ミクロ遠心分離機中に１
０秒間、遠心分離することによりベレット化した。その
ベレットを、２００ｍＭの塩化ナトリウム、５５％メタ
ノール中２ｍＭのＥＤＴ＾を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ緩
衝液１５０ｐ１により洗浄した。その洗浄方法をもう１
度くり返した。ＤＮＡをリン酸緩衝溶液４００ｐｌによ
り溶離した後、それぞれのサンプルを、１００°Ｃで１
０分間加熱し、ＤＮＡを変性し、次に急速に冷却した。

そのサンプルをニトロセルロース膜上に濾過した。例２
．Ａに記載の視覚決定方法を用いて、ＤＮＡを検出した
。

０　　　　　　　　わずかに陽性 ２５　　　　　　　　　　＋＋ ５０　　　　　　　　　　　＋＋＋ １００　　　　　　　　　　　＋＋＋ Ｂ、タンパク　のプロテイナーゼ プロテイナーゼＫ及びジチオトレイトール（それぞれ最
終濃度１００犀／ｄ及び５０ｍＭ）を、リン酸緩衝液中
、ＢＳ＾　１　ｍｇ及びＤＮＡ　１００．５０．２５．
１２、又は０１）Ｑをそれぞれ含むサンプル１００ｘＺ
に添加した。その混合物を５５°Ｃで２時間インキュベ
ートし、タンパク質を消化した。消化の後、すべてのサ
ンプルを＋００°Ｃで５分間加熱し、プロテイナーゼＫ
を不活性化し、そしてＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性した
。適切な量のＤＮＡを含む対照サンプル（但しタンパク
質を含まない）を、同時に変性した。ＤＮＡの再アニー
リングを防ぐために急速に冷却した後、それぞれのサン
プルを、ニトロセルロース膜を通して濾過した。視覚決
定方法を、例２．Ａに記載のようにして行ない、ＤＮＡ
の存在を検定した。

芽−ｊ■−表 プロテイナーゼにより消化されたタンパク質含有例−」
− 陽性に荷電されたナイロンへのＤＮＡの吸着によるタン
パク　　有サンプル中のＤＮＡの検出Ａ、５ＳＢ−１１
１？Ｐ接合体を用いてのインシュリンサン十 ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ 十 ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ （４Ｇ） 本積ウシ胸腺ＤＮＡ０，５．１０，２０、又は４０ｐｑ
を含む、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ！、及びＩＩＩＩ
ＭのＥＤＴＡの溶液（ｐＨ１８，７）中、１０■／−の
ブタインシュリン（Ｃａｌ　Ｒｉｏｃｈｅｎ＋、　Ｌａ
　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）の溶液１５０
、ｔに添加した。そのサンプルを５５°Ｃで一晩インキ
ユヘートし、１００°Ｃで５分間煮沸し、次に氷」二で
冷却した。消化されたサンプルを、陽性に荷電されたナ
イロン膜（Ｇｅｎａｔｒａｎ０１４．６　ｃｍ　Ｘ　８
　ｃｍ　。

ｒ’１ａｓｃｏ、　Ｉｎｃ、、　Ｗｏｈｕｒｎ、　ＭＡ
から得られる）を通して約１００ｐＺ／分の速度で濾過
した。０．２〜０．５　ｍｌ／　ｃｄの５ＳＢ−＋１Ｒ
Ｐ接合体〔リン酸ナトリウム（ｐ１１７．４）、　１５
０ｎｇ／ｍｆ　；　　１５０ｍＭのＮａＣｆｆ１　；　
２ｍＭのＥＤＴＡ、　０．　１　ｍｇ／ｍｌ　　；　　
０．　１　　ｍｇ／−の　ＢＳＡ、５　％Ｔｒｉ　ｔｏ
ｎ−Ｘ１０００中において１５０ｎｇ／ｍｌ）と共に膜
をペトリ皿巾で室温で４０分間インキュベートするごと
によって、ＤＮＡを検出した。次にその膜を、ＩＭの尿
素及び１％硫酸デキストランを含むＰＢＳ中において３
分間インキュベートすることによって、その膜を３度洗
浄し、非特異的に結合したＳ　Ｓ　Ｂ　−１１Ｒ１１を
除去した。次にその膜を蒸留水により洗浄し、１０ｎ＋
ＭのＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍｌのテトラメチルベンジ
デイン及び０．００１％の過酸化水素水（ｐＨ５）を含
む１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液中で１０分間イ
ンキュベートした。膜上に展開する青色のスポットの視
覚による強度が主観的に決定され、次にそれは元のサン
プルのＤＮＡ含有量に相互関係することがわかった。そ
の結果は第６表に示される。

＋＋＋＋ ＋＋ ＋ わずかに陽性 劃−工 抗−ビオチン膜上べのサンプルＤＮＡの特異的この例に
おいては、５０ｍＭの亜硫酸ナトリウム、２０ＩＩＩＭ
のリン酸二水素ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウ
ム、ＩＩＩＩＭのＥＤＴＡ、２ＩＩＩＭのジチオトレイ
トール、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７，ｏＯ）
を含む緩衝液を含む１ｃ＋ａＸ３Ｑｃ＠の５ｕｐｅｒｏ
ｓｅ　６１（Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

１’ｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）のカラム上で５ＳＢ
−ウレアーゼのゲル濾過クロマトグラフィーにより接合
されなかったウレア−ガを除去するために、ＳＳＢウレ
アーゼをさらに精製した。接合されなかったウレアーゼ
ピークの前に溶離するタンパク質ピークを集め、そして
グリセロールと１：１（ｖ：ｖ）で？Ｉ１合し、そして
−２０℃で貯蔵した。

Ｂ、５ＳＢ−ウレアーゼ接合体による緩衝液中のＤＮＡ
のバイオセンサー検出（試薬の逐次的チンにより被覆さ
れたニトロセルロース膜を、抗ビオチン膜を通して約４
分間にわたって、例Ｉ已におけるようにして調製された
ビオチン−抗ＤＮＡ（１％ＢＳＡ、Ｉｎ＋ＭのＥＤＴＡ
を含む・ｌ０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ！、中において３
００ｎｇ／　ｔｎｌ　）２００　ｐｌを濾過することに
よってビオチン−抗−ＤＮＡにより被覆した。次に、そ
の膜をＰＢＳ　３００Ｉ！Ｉにより洗浄した。

ＤＮＡを含むサンプル（ＰＢＳ中、ＤＮＡ　２００ｔｔ
ｌ当り０　、１２　、２５　、５０ｐｑ）２００ｐ７を
、約４分間にわたって濾過した。そのフィルターを再び
ＰＢＳ　３０（ｈｌにより洗浄した。約４分間にわたっ
て、例７Ａに記載のようにして精製された５ＳＢ−ウレ
アーゼ接合体〔２％ＢＳＡ、２％Ｆｉｃｏｌｌｌｌｅ、
２％ポリビニルピロリドン、１０ＩＩＩＭのリン酸ナト
リウム、４０ｍＭのＮａＣｊ！、２ＩＩＩＭのＥＤＴＡ
　（ｐＨ７，５）により希釈された、１１００ｎ／　ｍ
ｌ　）　　２００ｔｔｌも、前記膜を通して濾過した。

次にその膜を、１ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１ＭのＮ
ａＣ１，０，０５％のＴｗｅｅｎ−２０の溶液（ｐＨ７
５）１−により３度洗浄した。その膜を、基質溶液（１
００ｍＭの尿素を含む酢酢塩洗浄緩衝液）に添加し、そ
して生成物の形成の速度を、例３Ｂに記載のようにして
測定した。生成物の形成の速度は、第７表に示されるよ
うに、サンプル中のＤＮＡの濃度の関数である。

穿−」＝二ｋ ＳＳＢ−ウレアーゼ接合体を用いてのＤＮＡのバ２１Ｂ
３ Ｂ、　同時インキュヘーションアソセイのためのビＡ■
チン−−ＤＮへの 例７Ａに記載のようにして精製されたＳＳＢウレアーゼ
接合体及びビオチン−抗−ＤＮＡのニトロセルロース膜
への同時添加の効果を次のようにして評価した： サンプル（ｓｓｌ）ＮＡ　１００ｐｑを含む又は含まな
い、ＴＩＥ中、１％ＵＳＡ）２００ｐＺを、ビオチン−
抗−ＤＮＡ（１％ＢＳＡ、　ＴＥ中、４０．８１．１６
２．３２５ｎｇ／ａＺ）２００ｐ！及び５ＳＢ−ウレア
ーゼ接合体〔２％ＢＳ＾。

２％Ｆｉｃｏｌｌ’９．２％ポリビニルピロリドン、１
０ｍＭのリン酸ナトリウム、４０ｍＭのＮａＣｌ、２Ｉ
ＩＩＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）中、１５ｎｇ／ｍ）
　　２００ｐｌと共に室温で５０分間インキュベートし
た。次にその混合物を、ニトロセルロース膜を通して約
１０分間にわたってゆっくりと濾過した。次にその膜を
、酢酸塩緩衝液（１ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１Ｍの
ＮａＣ１，，０，０５％の↑ｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５）
により３度洗浄した。基質溶液（１００ｍＭの尿素を含
む酢酸塩緩衝液）を添加し、そして膜上に存在するＤＮ
Ａの量を、例２８に記載のようにしてバイオセンサー法
により決定した。第８表に示される結果は、同時アッセ
イにおいて、ビオチン−抗ＤＮＡ及び５ＳＢ−ウレアー
ゼ接合体の割合がたぶん抗−ＤＮＡ及びＳＳＢの両者の
ＤＮＡに対する競争のために臨界であることを示す。

以下糸白 （５Ｉ） 第一」Ｌ二表 同時インキュヘーションアッセイを通してビオチＣ，５
Ｓ１１−ＨＲＰ接合体による顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（ＧＭＣ３Ｆ　）サンプル中のＤＮＡのバ
イオセンサー　　　　　　な ３．４ｍｇ／ｄのＰＢＳ中、紐換えヒトＧＭＣ３Ｆ　（
Ｂｊｏｇｅｎ。

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）　３００ｐ１を、二本鎖
ウシ胸腺ＤＮＡ　０　。

５．１０．５０又は１００凹によりスパイクした。サン
プルを１００’Ｃで５分間加熱し、ＤＮＡを変性し、次
に室温に冷却した。　Ｉｍｍｏｂｉ　Ｊｏｎ”膜（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ。

ｆｌｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を、例２ＡのＩｍｍｏｂｉ
　Ｉｏｎ”上へのＳＳＢ被覆のために、上記のようにし
てヤギ抗−ビオチ７１ｇＧ（Ｓｔｇｔｍａ、　Ｓｔ　１
．ｏｕｉｓ、　ＭＯ）により被覆した。ビオチンにより
ラベルされた抗−ＤＮＡ　（クローン４　Ｈｚ）２００
ｐ１を、その膜を通して濾過した。

ＧＭＣ３Ｆを含むサンプル３００ｐ７を、その膜を通し
て濾過し、そしてそのＨりをＰＢＳ　２００ｔｌｌ＆こ
より再び洗浄した。５ＳＢ−１（＋ＩＰ接合体（６５０
ｎｇ／　ａｆ　、　０．１　ｍｇｌ　ｍｌのＢＳＡ、２
ＩＩＩＭのＥＤＴＡ、５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含
むＰＢＳにより希釈された）２００ｄを、その膜を通し
て濾過した。次に膜を、５％Ｔｒｉｔｏｎ−ＸＩＯ０、
Ｉ　Ｍの尿素を含むＰＢＳにより１度洗浄し、そして５
％エタノール及び１ｍＭのＥ［１Ｔｌｌ　（ｐＨ５，５
）を含む０、１　Ｍの酢酸ナトリウムにより洗浄した。

次に、ＤＮＡの量を、アメリカ特許第４，５９１，５５
０　（引用により本明細書に組込まれている）に記載の
ようなバイオセンサー法により決定した。基質溶液は、
２５０戸のテトラメチルベンジデイン、５０−のルテニ
ウム、５０Ｍの過酸化水素（ｐＨ５，５）を含む酢酸ナ
トリウム洗浄緩衝液を含有する。ＨＲＰレドックス反応
による電位の変化は、光反応性装置のシグナルの変化を
もたらす。その結果は下の第９表に示された。

男−づＬ−表 ５ＳＢ−１１１１Ｐ接合体を用いてＣＭＣ５Ｆサンプル
中のＤＮグラム陰性及びグラム陽性細菌の培養物を、＋
１ＰＬｃ等級の水１００μｌにより希釈し、８０．４０
０．２，０００１０．０００／１００μｌにした。１セ
ツトのサンプルのために、細菌を溶解し、そして３Ｎの
ＮａＯＨ１０１ＪＩによる処理により変性し、次にＩＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，３）　５０μ！により
中和した。２番目の同一のセットの希釈溶液は、そのよ
うに処理されず、そしてサンプルと５ＳＢ−ＨＲＰ接合
体との間の非特異的相互反応のための対照として作用す
る。

両セットの希釈溶液を、ドツト−プロット装置（Ｓｃｈ
ｌｅｉｋｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｎｅｌｌ）を用いて、陽
性に荷電されたナイロン膜（ＧｅｎａｔｒａｎＴ１４）
上に負荷する。

その装置のそれぞれのウェルを、サンプル１６５ｐｌに
より負荷する。ＩＩＰＬｃ等級の水により希釈された、
変性ウシ胸腺ＤＮＡから成る標準液をまた調製し、そし
て陽性に荷電されたナイロン股上に負荷する。

標準液は０，５．１０又は５ｏｐｑのｓｓＤＮＡを含む
。

ＤＮＡを、５ＳＢ−ＨＲＰ接合体を用いて例３Ａに記載
のような視覚的アッセイを用いて検出する。

本発明の方法及び組成物は、高い親和性の一本１ｉ　Ｄ
　Ｎ　Ａ結合タンパク質の使用によりサンプル中のＤＮ
Ａのピコグラム量を検出するための迅速且つ単純な手段
を提供する。このアッセイは、純粋なりＮＡサンプルに
適用できるのみならず、またタンパク質の有意量を含む
サンプルに関し、又は微生物を含むサンプルの汚染を検
出するためにも使用される。

本明細書に記載されたすべての出版物及び特許出願は、
本発明が関与する当業者のレヘルの表示である。すべて
の出版物及び特許出願は、それぞれ個りの出版物又は特
許出願が引用により組込まれることを特別且つ個々に示
されているかのように、ある程度まで引用により本明細
書に組込まれている。

前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高い親和性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＢＰ）
   （ここで該ＢＰ又は該ＤＮＡは検出できるラベルを含有
   する）を用いてサンプル中のＤＮＡを検出するための方
   法であって： ＤＮＡ−ＢＰ複合体を形成するためにサンプル中のいず
   れかの一本鎖ＤＮＡと前記ＢＰとを接触せしめ；結合さ
   れなかったサンプル及びＢＰの複合体を除去し；そして 前記サンプル中のＤＮＡの存在の表示として前記ラベル
   によって前記複合体を検出することを含んで成る方法。 ２、前記サンプルを、前記接触の前、ＤＮＡ変性条件に
   ゆだねる請求項１記載の方法。 ３、前記ＤＮＡ−ＢＰ複合体が固体支持体上に形成され
   る請求項１記載の方法。 ４、前記固体支持体が抗−ビオチン膜である請求項３記
   載の方法。 ５、前記接触の前、（ａ）前記サンプルがＤＮＡ変性条
   件にゆだねられ；そして（ｂ）前記変性されたＤＮＡが
   固体支持体に非拡散的に結合せしめられる請求項１記載
   の方法。 ６、前記ＢＰが固体支持体に非拡散的に結合される請求
   項１記載の方法。 ７、前記ＢＰがＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一本鎖ＤＮ
   Ａ結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク
   質又はトポイソメラーゼ I である請求項１記載の方法
   。 ８、前記ラベルが前記ＢＰに結合された酵素である請求
   項１記載の方法。 ９、前記酵素がウレアーゼ又はホースラディシュペルオ
   キシダーゼである請求項８記載の方法。 １０、ＤＮＡを含まない少なくとも１種のバックグラウ
   ンド溶液及び既知の量のＤＮＡを含む少なくとも１種の
   対照溶液を請求項１記載の方法に従ってさらに処理し； 前記サンプル中に検出されるラベルから及び前記対照溶
   液に検出されるラベルから前記バックグラウンド溶液中
   に検出されるラベルを引き算し：そして 前記サンプル中に存在するＤＮＡの量を決定するために
   、前期サンプル及び前記対照溶液中に検出される調整さ
   れたラベルを関係づけることをさらに含んで成る請求項
   １記載の方法。 １１、前記接触の前、前記サンプルと光反応性化合物と
   を混合し；そして 前記活性化された化合物と前記サンプル中に存在するい
   ずれかのＤＮＡとを反応せしめるために、前記混合物を
   活性化光により照射することをさらに含んで成る請求項
   １記載の方法。 １２、前記光反応性化合物がイソプソラレンである請求
   項１１記載の方法。 １３、前記サンプルがタンパク質をさらに含んで成る請
   求項１記載の方法。 １４、前記タンパク質含有サンプルが、前記接触の前、
   除タンパク質される請求項１３記載の方法。 １５、前記タンパク質含有サンプルが、前記タンパク質
   含有サンプルと（ａ）ガラス粒子を含む懸濁液及び（ｂ
   ）前記ガラス粒子への前記ＤＮＡの結合を引き起こすの
   に十分な沃化物とを混合し；前記ガラス粒子を単離し；
   そして 前記粒子からすべてのＤＮＡを溶離することを含んで成
   る方法により除タンパク質される請求項１４記載の方法
   。 １６、前記溶離が水又はリン酸緩衝溶液による請求項１
   ５記載の方法。 １７、前記タンパク質含有サンプルが、前記タンパク質
   含有サンプルとタンパク質分解酵素組成物とを存在する
   タンパク質が加水分解される条件下で混合することを含
   んで成る方法により除タンパク質される請求項１３記載
   の方法。 １８、前記混合の後、前記加水分解されたタンパク質の
   生成物とＤＮＡとを分離することをさらに含んで成る請
   求項１７記載の方法。 １９、前記分離が、 前記混合の後、低分子量カットオフを有する膜を通して
   前記サンプル遠心分離し；又は低分子量カットオフを有
   するゲル透過クロマトグラフィーマトリックス又は限外
   濾過装置を通して前記サンプルを通し；そして 存在するすべてのＤＮＡを回収することを含んで成る請
   求項１８記載の方法。 ２０、前記タンパク質分解酵素組成物が少なくとも１種
   のプロアーゼ又はプロテイナーゼＫを含んで成る請求項
   １７記載の方法。 ２１、高い親和性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＢＰ
   ）（ここで該ＤＮＡは検出可能なラベルを含有する）を
   含む固体支持体を用いてサンプル中のＤＮＡを検出する
   ための方法であって： ＤＮＡ−ＢＰ複合体を形成するために前記サンプル中の
   いずれかの一本鎖ＤＮＡと前記固体支持体とを接触せし
   め； 結合されなかったサンプルの前記固体支持体を除去し；
   そして 前記サンプル中のＤＮＡの存在の表示として前記ラベル
   によって前記複合体を検出することを含んで成る方法。 ２２、前記サンプルが、前記接触の前、ＤＮＡ変性条件
   にゆだねられる請求項２１記載の方法。 ２３、高い親和性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＢＰ
   ）（ここで該ＢＰは検出可能なラベルを含有する）を用
   いてサンプル中のＤＮＡを検出するための方法であって
   ： 前記サンプル中に存在するいずれかのＤＮＡを変性せし
   め； 前記変性されたＤＮＡを固体支持体に非拡散的に結合し
   ； ＤＮＡ−ＢＰ複合体を形成するために前記固体支持体と
   ＢＰとを接触せしめ； 結合されなかったサンプル及びＢＰの前記固体支持体を
   除去し；そして 前記サンプル中のＤＮＡの存在の表示として前記ラベル
   によって前記複合体を検出することを含んで成る方法。 ２４、前記固体支持体が陽性に帯電されたナイロン膜又
   はニトロセルロース膜である請求項２３記載の方法。 ２５、高い親和性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＢＰ
   ）を含んで成る固体支持体を用いてサンプル中のＤＮＡ
   を検出するための方法であって：前記サンプルと検出可
   能なラベルを含有する光反応性化合物とを混合し； 前記活性化された化合物と前記サンプル中に存在するす
   べてのＤＮＡとを反応せしめるために前記混合物を活性
   化光により照射し； 前記照射された混合物と前記固体支持体とを接触せしめ
   ； 特異的に結合されていないすべての照射された混合物の
   前記固体支持体を除去し；そして前記サンプル中のＤＮ
   Ａの存在の表示として前記ラベルによって前記固体支持
   体上に存在するすべての光反応性化合物を検出すること
   を含んで成る方法。 ２６、前記光反応性化合物がイソプソラレンである請求
   項２５記載の方法。 ２７、前記検出可能なラベルがビオチンである請求項２
   ６記載の方法。 ２８、前記ビオチンが、酵素、放射性同位体又は螢光体
   に連結されたアビジン、ストレプトアビジン又は抗−ビ
   オチンを含んで成る接合体を用いて検出される請求項２
   ７記載の方法。 ２９、酵素に共有結合された高い親和性の一本鎖ＤＮＡ
   結合タンパク質（ＢＰ）を含んで成る接合体。 ３０、前記ＢＰが一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、Ｔ４遺
   伝子３２タンパク質又はトポイソメラーゼ I である請
   求項２９記載の接合体。 ３１、前記酵素がウレアーゼ又はホースラディシュペル
   オキシターゼである請求項２９記載の接合体。 ３２、第１成分として高い親和性の一本鎖ＤＮＡ結合タ
   ンパク質（ＢＰ）を有するＤＮＡ−検出システム（ここ
   で前記システムの少なくとも１つの成分がラベルを含ん
   で成る）を用いてサンプル中の生物体（ここで前記生物
   体又は前記システムの少なくとも１つの成分から調製さ
   れた一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）が固体支持体に非拡散
   的に結合されている）を検出するための方法であって： ｓｓＤＮＡ−ＢＰ複合体を形成するために前記ｓｓＤＮ
   Ａと前記第１成分とを接触せしめ； 結合されなかったｓｓＤＮＡ及び前記システムの成分の
   複合体を除去し；そして 前記サンプル中の生物体の存在の表示として前記ラベル
   によって前記複合体を検出することを含んで成る方法。 ３３、前記ラベルが前記第１成分に接合される請求項３
   ２記載の方法。 ３４、前記生物体が、細菌、酵母細胞又はウィルスであ
   る請求項３２記載の方法。 ３５、前記細菌が、グラム陰性細菌である請求項３４記
   載の方法。 ３６、前記グラム陰性細菌が、Ｅ．コリである請求項３
   ５記載の方法。 ３７、前記接触の前、前記細胞から前記ＤＮＡを開放す
   るために十分な量で及び時間、細胞崩壊組成物に前記細
   胞を暴露し；そして 前記ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変性するこ
   とをさらに含んで成る請求項３１記載の方法。