JPH0217000A - Dna検出システム - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、DNAの存在を検出するための方法に関する
。その方法は、一本鎖DNAのために高い親和性の結合
タンパク質を使用する。
。その方法は、一本鎖DNAのために高い親和性の結合
タンパク質を使用する。
サンプル中のDNA17)ftは、分光光度手段により
又は臭化エチジウムにり螢光光度的に従来測定されて来
た。サンプルが純粋である(汚染物、たとえば他の核酸
、タンパク質、フェノール又はアガロースの有意な量を
含まない)場合、吸収される紫外線(UV)照射の量の
分光光度測定が単純且つ正確である。しかしながら、タ
ンパク質又はUV中において強い吸収性の化合物、たと
えばフェノールによる汚染が存在する場合、DNAの量
の正確な定量化は不可能であろう。さらに、この技法は
、n/m!範囲でDNAを含むサンプルのためにのみ適
切である。
又は臭化エチジウムにり螢光光度的に従来測定されて来
た。サンプルが純粋である(汚染物、たとえば他の核酸
、タンパク質、フェノール又はアガロースの有意な量を
含まない)場合、吸収される紫外線(UV)照射の量の
分光光度測定が単純且つ正確である。しかしながら、タ
ンパク質又はUV中において強い吸収性の化合物、たと
えばフェノールによる汚染が存在する場合、DNAの量
の正確な定量化は不可能であろう。さらに、この技法は
、n/m!範囲でDNAを含むサンプルのためにのみ適
切である。
サンプル中のDNAの量が少ない場合、又はサンプルが
不純物の有意な量を含む場合、DNAの星は、DNA中
に導入された臭化エヂジウムにより放射されるu v
−誘発性螢光の強さから評価され得る。螢光の量は、D
NAの合計に比例する。
不純物の有意な量を含む場合、DNAの星は、DNA中
に導入された臭化エヂジウムにより放射されるu v
−誘発性螢光の強さから評価され得る。螢光の量は、D
NAの合計に比例する。
従ってサンプル中のDNAの量は、一連の標準の螢光収
量とサンプルの螢光収量とを比較することによって評価
され得る。1〜5硝/−はどのDNAがこの方法により
検出され得る。ミニー螢光計(たとえば110(イer
5cienttfic Instruments、
5anPrancisco、 CAにより製造された)
及びフルオロクロム1loechs t 3325Bの
使用により、感度は10ng/mlに上界され得る。
量とサンプルの螢光収量とを比較することによって評価
され得る。1〜5硝/−はどのDNAがこの方法により
検出され得る。ミニー螢光計(たとえば110(イer
5cienttfic Instruments、
5anPrancisco、 CAにより製造された)
及びフルオロクロム1loechs t 3325Bの
使用により、感度は10ng/mlに上界され得る。
組換えDNA技法の出現により、サンプル中のDNA、
たとえば組換え生成物中に存在することができるlη染
DNAの有意に低い濃度を同定することが必要になって
来た。?’f;染DNAは、非特異的であり、そして未
知の配列のものである。従って、サンプルDNへの酵素
増幅(たとえばDNAポリマラーゼ連鎖反応方法を用い
て)は、DNA合成のための一般的プライマーの欠乏の
ために困難である。従って、ひじょうに少量のDNAの
存在を急速且つ正確に検出することが実質的な興味の対
象である。
たとえば組換え生成物中に存在することができるlη染
DNAの有意に低い濃度を同定することが必要になって
来た。?’f;染DNAは、非特異的であり、そして未
知の配列のものである。従って、サンプルDNへの酵素
増幅(たとえばDNAポリマラーゼ連鎖反応方法を用い
て)は、DNA合成のための一般的プライマーの欠乏の
ために困難である。従って、ひじょうに少量のDNAの
存在を急速且つ正確に検出することが実質的な興味の対
象である。
Krause至&、 、 Biochemistr (
1981)22 : 5346〜5352は、旦、1丈
からの一本鎖結合タンパク質のオリゴヌクレオチドへの
結合を開示する。
1981)22 : 5346〜5352は、旦、1丈
からの一本鎖結合タンパク質のオリゴヌクレオチドへの
結合を開示する。
Vogelstein and G11lespie、
Proc、Natl、Acad、Sci。
Proc、Natl、Acad、Sci。
LISA (1979)’76:615〜619は、ガ
ラスへのDNAの結合を開示する。KungX&、は、
DNA−セファロースカラムからの高い塩熔離によりミ
クロコー左ス ルテウス(旧crococcus ’
Iuteus)からのトポイソメラーゼの精製を開示す
る; J、Biol、Chem。
ラスへのDNAの結合を開示する。KungX&、は、
DNA−セファロースカラムからの高い塩熔離によりミ
クロコー左ス ルテウス(旧crococcus ’
Iuteus)からのトポイソメラーゼの精製を開示す
る; J、Biol、Chem。
(1977) 2覆: 5398〜5402゜次のもの
は、DNA結合タンパク質に関する総説文献である。G
e1lert工恒り旦す1μリー、第XIV巻(198
1)345〜366 ; Hang。
は、DNA結合タンパク質に関する総説文献である。G
e1lert工恒り旦す1μリー、第XIV巻(198
1)345〜366 ; Hang。
The Enz mes 、第XIV巻(1981)3
32〜343 ; Chase。
32〜343 ; Chase。
八nn、Rev、Biochem、(1986)55
: I03〜136 ;Kowalczykowsk
i)7&、 、 υ咀」1ηmes 、第XrV巻(1
981)375〜444 。
: I03〜136 ;Kowalczykowsk
i)7&、 、 υ咀」1ηmes 、第XrV巻(1
981)375〜444 。
DNA検出システム〔ここでその成分の1つは一本鎖D
N A (ssDNA )に対して高い親和性を有す
るDNA結合タンパク質である〕を用いる新規方法が、
サンプル中のDNAの存在を検出するために提供される
。DNAの存在を検出するために、サンプル(場合によ
っては、これがタンパク質を含む場合、前処理される)
が、変性され、5sDN八が得られる。次に、サンプル
は、ssDNA−’BP複合体(次にこれはssDNA
又はBPのいずれかに結合されるラベルによって検出さ
れ得る)を形成するために、高い親和性の一本鎖DNA
結合タンパク質(BP)と接触せしめられる。BP及び
ssDNA は、接触の時、両者とも溶液中に存在し、
又はBPは接触の前、固体支持体に非拡lit的に結合
され得る。
N A (ssDNA )に対して高い親和性を有す
るDNA結合タンパク質である〕を用いる新規方法が、
サンプル中のDNAの存在を検出するために提供される
。DNAの存在を検出するために、サンプル(場合によ
っては、これがタンパク質を含む場合、前処理される)
が、変性され、5sDN八が得られる。次に、サンプル
は、ssDNA−’BP複合体(次にこれはssDNA
又はBPのいずれかに結合されるラベルによって検出さ
れ得る)を形成するために、高い親和性の一本鎖DNA
結合タンパク質(BP)と接触せしめられる。BP及び
ssDNA は、接触の時、両者とも溶液中に存在し、
又はBPは接触の前、固体支持体に非拡lit的に結合
され得る。
固体支持体に結合される場合、5sDN^又はBPは、
固体支持体に直接結合されるか、又は結合分子によって
結合されるかである。この方法は、たとえば組換えタン
パク質生成物におけるDNAを検出するために、又はサ
ンプル中の汚染生物体を検出するために使用され得る。
固体支持体に直接結合されるか、又は結合分子によって
結合されるかである。この方法は、たとえば組換えタン
パク質生成物におけるDNAを検出するために、又はサ
ンプル中の汚染生物体を検出するために使用され得る。
本発明によれば、サンプル、特に培養、たとえば発酵で
生成されたタンパク質生成物中のDNAの存在を検出す
るための方法及び組成物が提供される。DNAの存在は
、高い親和性の一本tit D NA結合タンパク質の
使用により検出され得る。
生成されたタンパク質生成物中のDNAの存在を検出す
るための方法及び組成物が提供される。DNAの存在は
、高い親和性の一本tit D NA結合タンパク質の
使用により検出され得る。
一本鎖DNA結合タンパク質(BP)は、真核又は原核
生物のいづれかの源からであり、そして−本IY D
N A結合タンパク質、トポイソメラーゼ及びDNA巻
き戻しタンパク質を含むことができる。E、コリからの
一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)、ミクロコーカ
スルテウス及びE、コリからのT4遺伝子32タンパク
質及びドパイソメラーゼ■が特に興味の対象である。単
離方法は、Lohmanq e、 、 Biochem
istr (1986j−25: 21〜25に記載の
ようにアフィニティークロマトグラフィーを含む。BP
はまた、たとえばUnited Statesflio
chemical Corporation+ C1e
veland、 0hioから市販されている。
生物のいづれかの源からであり、そして−本IY D
N A結合タンパク質、トポイソメラーゼ及びDNA巻
き戻しタンパク質を含むことができる。E、コリからの
一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)、ミクロコーカ
スルテウス及びE、コリからのT4遺伝子32タンパク
質及びドパイソメラーゼ■が特に興味の対象である。単
離方法は、Lohmanq e、 、 Biochem
istr (1986j−25: 21〜25に記載の
ようにアフィニティークロマトグラフィーを含む。BP
はまた、たとえばUnited Statesflio
chemical Corporation+ C1e
veland、 0hioから市販されている。
DNA結合タンパク質は、ssDNAが少なくとも10
0個のヌクレオチドの長さである場合、少なくとも10
5M−’、普通約101〜IOIOM−1の範囲で一本
鎖DNA(ssDNA)に対する高い親和性を有するも
のとして特徴づけられる。他方、そのタンパク質は、s
sDNA−セルロース又はssDNA−セファロースか
らの溶離のために約0.4M以上の濃度の塩化ナトリウ
ム(又は同等のイオン強度を提供する他の一価塩)を必
要とする一本鎖DNA結合タンパク質として特徴づけら
れ得る。−船釣に溶離のための濃度は、塩化すトリウム
約0.6M以上、及び好ましくは約1.0M以上である
。親和性を決定する場合、水性緩衝液(pH6〜9,2
5°C)が使用されるべきである。界面活性剤、変性剤
(たとえば尿素、塩化グアニジウム)、カオトロピック
剤又は有機溶媒は、その緩衝液中には存在すべきでない
。
0個のヌクレオチドの長さである場合、少なくとも10
5M−’、普通約101〜IOIOM−1の範囲で一本
鎖DNA(ssDNA)に対する高い親和性を有するも
のとして特徴づけられる。他方、そのタンパク質は、s
sDNA−セルロース又はssDNA−セファロースか
らの溶離のために約0.4M以上の濃度の塩化ナトリウ
ム(又は同等のイオン強度を提供する他の一価塩)を必
要とする一本鎖DNA結合タンパク質として特徴づけら
れ得る。−船釣に溶離のための濃度は、塩化すトリウム
約0.6M以上、及び好ましくは約1.0M以上である
。親和性を決定する場合、水性緩衝液(pH6〜9,2
5°C)が使用されるべきである。界面活性剤、変性剤
(たとえば尿素、塩化グアニジウム)、カオトロピック
剤又は有機溶媒は、その緩衝液中には存在すべきでない
。
BPは他の成分に結合されないで使用され得、そして/
又はそれは、直接的に又はリンカ−分子を通して固体支
持体に非拡散的に共有結合され又は吸着的に結合され、
又はラベルに共有結合され得る。リンカ−分子が使用さ
れる場合、BPは特定の結合対の半分に結合され、他の
半分はリンカ−分子である。特定の結合対の例として、
ビオチン及び抗−ビオチン;アビジン及びストレプトア
ビジンを挙げることができる。
又はそれは、直接的に又はリンカ−分子を通して固体支
持体に非拡散的に共有結合され又は吸着的に結合され、
又はラベルに共有結合され得る。リンカ−分子が使用さ
れる場合、BPは特定の結合対の半分に結合され、他の
半分はリンカ−分子である。特定の結合対の例として、
ビオチン及び抗−ビオチン;アビジン及びストレプトア
ビジンを挙げることができる。
種りの固体支持体物質が使用され得る。従って、固体支
持体としで、フィルター膜、好ましくはImmobil
on”又はニトロセルロースを挙げることができる。ニ
トロセルロース膜に関しては、その膜の孔の大きさは、
5μ以下、好ましくは1μ以下であり;そして普通0.
05μよりも大きく、好ましくは0.1μよりも大きい
。固体支持体へのBPの非拡散結合のための従来の方法
が使用される。
持体としで、フィルター膜、好ましくはImmobil
on”又はニトロセルロースを挙げることができる。ニ
トロセルロース膜に関しては、その膜の孔の大きさは、
5μ以下、好ましくは1μ以下であり;そして普通0.
05μよりも大きく、好ましくは0.1μよりも大きい
。固体支持体へのBPの非拡散結合のための従来の方法
が使用される。
方法は、カルボニルイミダゾール基又は膜上に存在する
他の活性基への共有結合、又は吸着による膜への非共有
結合を含む。
他の活性基への共有結合、又は吸着による膜への非共有
結合を含む。
固体支持体物質としてまた、クロマトグラフィー用ベツ
ド材、単分散ラテックス粒子、たとえばスチレン、化学
的に変性されたスチレン、プロピレン、メタクリレート
、ブタジェン、アクリロニトリル又は他のモノマーに基
づくもの;ポリグルタアルデヒド微小球(たとえば、P
o1ysciencesInc、により製造されたもの
)、ナイロンビーズ、化学的に変性されたナイロンビー
ズ、オキシランアクリルビーズ、たとえばEuperg
rt@ (Rohm Pharma。
ド材、単分散ラテックス粒子、たとえばスチレン、化学
的に変性されたスチレン、プロピレン、メタクリレート
、ブタジェン、アクリロニトリル又は他のモノマーに基
づくもの;ポリグルタアルデヒド微小球(たとえば、P
o1ysciencesInc、により製造されたもの
)、ナイロンビーズ、化学的に変性されたナイロンビー
ズ、オキシランアクリルビーズ、たとえばEuperg
rt@ (Rohm Pharma。
Darw+5tadt、 W、Germany) ;ア
クリル酸エステルとアクリル酸アミドのコポリマーを挙
げることができる。これらの物質へのBPの結合の方法
は次の通りである:BPが、タンパク質と共に共有結合
を形成することができる反応基を有する活性化されたク
ロマトグラフィー樹脂、たとえばCNBrにより活性化
された5epharose−48、CNBrにより活性
化された4%Agarose又はCNBrにより活性化
されたSepharose−6MB(r’harmac
ia P−L Biochemicals;Pisca
taway、 NJ) 、又は他の樹脂、たとえばセル
ロースに従来の方法により共有結合され得る。
クリル酸エステルとアクリル酸アミドのコポリマーを挙
げることができる。これらの物質へのBPの結合の方法
は次の通りである:BPが、タンパク質と共に共有結合
を形成することができる反応基を有する活性化されたク
ロマトグラフィー樹脂、たとえばCNBrにより活性化
された5epharose−48、CNBrにより活性
化された4%Agarose又はCNBrにより活性化
されたSepharose−6MB(r’harmac
ia P−L Biochemicals;Pisca
taway、 NJ) 、又は他の樹脂、たとえばセル
ロースに従来の方法により共有結合され得る。
BPは、非特異的な吸着によりポリスチレンビーズに結
合され得る。BPはまた、従来の方法によって、カルボ
キシル基又はアミノ官能基を含むポリスチレンビーズ(
Polysciences、 Inc、 ;karri
ngton、 PA)に共有結合され得る。
合され得る。BPはまた、従来の方法によって、カルボ
キシル基又はアミノ官能基を含むポリスチレンビーズ(
Polysciences、 Inc、 ;karri
ngton、 PA)に共有結合され得る。
−船釣に一本鎖D N A (ssDNA )に変性さ
れたDNAは、吸着的又は共有的に、直接的又はリンカ
−分子を通して固体支持体に非拡散的に結合され得る。
れたDNAは、吸着的又は共有的に、直接的又はリンカ
−分子を通して固体支持体に非拡散的に結合され得る。
固体支持体は、膜、たとえばニトロセルロース膜であり
得る。ssDNAを含むサンプルは、好ましくはその股
上で濾過される。膜への結合を促進するために、サンプ
ルの塩濃度は、−船釣に塩化ナトリウム50111M以
上、好ましくは100mM以上であり、又は他の塩が類
似するイオン強度を提供する。次に、ssDNAは、7
5°c〜100″C1好ましくは80°Cで少なくとも
30分、普通少なくとも1時間〜好ましくは6時間、た
とえば膜を焼付けることによってその膜上に固定される
。股上にssDNAを固定する他の方法は、エタノール
によるその膜の洗浄を含む。
得る。ssDNAを含むサンプルは、好ましくはその股
上で濾過される。膜への結合を促進するために、サンプ
ルの塩濃度は、−船釣に塩化ナトリウム50111M以
上、好ましくは100mM以上であり、又は他の塩が類
似するイオン強度を提供する。次に、ssDNAは、7
5°c〜100″C1好ましくは80°Cで少なくとも
30分、普通少なくとも1時間〜好ましくは6時間、た
とえば膜を焼付けることによってその膜上に固定される
。股上にssDNAを固定する他の方法は、エタノール
によるその膜の洗浄を含む。
DNAがリンカ−分子を通して固体支持体に結合される
場合、そのリンカ−分子は、DNAに対して高い親和性
を有するいづれかの分子、たとえばDNAに対する抗体
、BP又は同様のものである。好ましい方法においては
、リンカ−分子は、固体支持体に非拡散的に結合される
、ビオチン及び抗−DNA又はビオチン及びBPの接合
体を含んで成る。
場合、そのリンカ−分子は、DNAに対して高い親和性
を有するいづれかの分子、たとえばDNAに対する抗体
、BP又は同様のものである。好ましい方法においては
、リンカ−分子は、固体支持体に非拡散的に結合される
、ビオチン及び抗−DNA又はビオチン及びBPの接合
体を含んで成る。
固体支持体はまた、陽性に荷電されたナイロン、たとえ
ばビーズ又は膜〔たとえばNytran@(Schle
icher and 5chull、 Inc、; K
cene、 NH)GenaScreen Plus”
(duPont Company; Boston、
MA)+Zeta−ProbaO(旧oRacl La
bs: Pinole、 CA)+ Bi。
ばビーズ又は膜〔たとえばNytran@(Schle
icher and 5chull、 Inc、; K
cene、 NH)GenaScreen Plus”
(duPont Company; Boston、
MA)+Zeta−ProbaO(旧oRacl La
bs: Pinole、 CA)+ Bi。
TracelM(Gelman 5cience+
Inc、; 八nn Arbor、 Ml)旧
o−dyne 3o (Pail旧osupport;
Glen Cove、 NY)及びGenatran
”w″(Plasco、 Inc、; Woburn、
MA))であることもできる。ssDNAは、陽性に
荷電されたナイロンに、適切な塩濃度及び/又は非イオ
ン性界面活性剤を含んで成るp116〜9の緩衝液中で
そのナイロンをインキユヘートすることによって選択的
に非拡散結合され得る。適切な塩濃度は、好ましくは塩
化ナトリウム(又は類似するイオン強度を捉供する他の
塩)1M以下、及び好ましくは0、6 M以下である。
Inc、; 八nn Arbor、 Ml)旧
o−dyne 3o (Pail旧osupport;
Glen Cove、 NY)及びGenatran
”w″(Plasco、 Inc、; Woburn、
MA))であることもできる。ssDNAは、陽性に
荷電されたナイロンに、適切な塩濃度及び/又は非イオ
ン性界面活性剤を含んで成るp116〜9の緩衝液中で
そのナイロンをインキユヘートすることによって選択的
に非拡散結合され得る。適切な塩濃度は、好ましくは塩
化ナトリウム(又は類似するイオン強度を捉供する他の
塩)1M以下、及び好ましくは0、6 M以下である。
使用され得る非イオン性界面活性剤の例として、0.1
〜5.0%(V/V)の濃度でのTween−2(1)
又はTritonX−1009を挙げることができる。
〜5.0%(V/V)の濃度でのTween−2(1)
又はTritonX−1009を挙げることができる。
サンプルは、DNAが低濃度で存在する場合、それを検
出することが所望されるいずれかのサンプルである。サ
ンプルは、固体又は液体、たとえば凍結乾燥されたタン
パク質性組成物又は水性媒体である。サンプルは、組換
えDNA法により製造されたタンパク質、たとえば組織
プラスミノーゲン活性化因子、インシュリン、成長ホル
モン、インターロイキン2及びインターフェロン;治療
目的のために調製されたモノクローナル抗体;絶対的な
純度を必要とする方法で使用するための水を含むことが
できる。DNAは、裸のDNA、すなわち二本鎖又は一
本鎖の形で存在し、又はそれは完全な細胞、ずなわち原
核又は真核細胞の形で存在することができる。
出することが所望されるいずれかのサンプルである。サ
ンプルは、固体又は液体、たとえば凍結乾燥されたタン
パク質性組成物又は水性媒体である。サンプルは、組換
えDNA法により製造されたタンパク質、たとえば組織
プラスミノーゲン活性化因子、インシュリン、成長ホル
モン、インターロイキン2及びインターフェロン;治療
目的のために調製されたモノクローナル抗体;絶対的な
純度を必要とする方法で使用するための水を含むことが
できる。DNAは、裸のDNA、すなわち二本鎖又は一
本鎖の形で存在し、又はそれは完全な細胞、ずなわち原
核又は真核細胞の形で存在することができる。
本発明を実施するための方法は、他の変法が本発明の範
囲内で存在するけれども、−a的に次の通りである。
囲内で存在するけれども、−a的に次の通りである。
DNAが完全な細胞、たとえば細菌又は酵母細胞に含ま
れる場合、その細胞は、溶解条件への暴露、たとえば水
酸化ナトリウム、カオトロピック剤、たとえばカリウム
チオシアネート、及び同様のものによる処理により分解
され得る。サンプルがタンパク質を含む場合、タンパク
質は、場合によっては除去される。次にDNAは、5s
ONAに変性され、そしてssDNAは固体支持体に非
拡散的に結合される。固体支持体が非拡散的に結合され
たBPを含まない場合、ssDNAは、たとえば焼付け
、エタノールによる処理、又は他の便利な手段により固
体支持体上に固定され得る。次にBPがその固体支持体
に添加され、そしてssDNAに特異的に結合する。固
体支持体がBPを含んで成る場合、5SDN^は固体支
持体」二でBPに特異的に結合し、そしてその固定段階
は排除される。DNAがサン−プル中に存在するかどう
かは、−船釣にBP又はssDNAのいづれかの上のラ
ベルにより、固体支持上のssDNA−BP複合体を検
出することによって決定される。他方、BPは、変性さ
れたサンプルに直接的に添加され、ここでそれは5sD
N八に結合し、BP−ssDNA複合体を形成する。次
にサンプルが濾過される。
れる場合、その細胞は、溶解条件への暴露、たとえば水
酸化ナトリウム、カオトロピック剤、たとえばカリウム
チオシアネート、及び同様のものによる処理により分解
され得る。サンプルがタンパク質を含む場合、タンパク
質は、場合によっては除去される。次にDNAは、5s
ONAに変性され、そしてssDNAは固体支持体に非
拡散的に結合される。固体支持体が非拡散的に結合され
たBPを含まない場合、ssDNAは、たとえば焼付け
、エタノールによる処理、又は他の便利な手段により固
体支持体上に固定され得る。次にBPがその固体支持体
に添加され、そしてssDNAに特異的に結合する。固
体支持体がBPを含んで成る場合、5SDN^は固体支
持体」二でBPに特異的に結合し、そしてその固定段階
は排除される。DNAがサン−プル中に存在するかどう
かは、−船釣にBP又はssDNAのいづれかの上のラ
ベルにより、固体支持上のssDNA−BP複合体を検
出することによって決定される。他方、BPは、変性さ
れたサンプルに直接的に添加され、ここでそれは5sD
N八に結合し、BP−ssDNA複合体を形成する。次
にサンプルが濾過される。
存在するDNAの濃度の決定が所望される場合、DNA
を含まない少なくとも1種のバックグラウンド溶液及び
既知の量のDNAを含む少なくとも1種の対照溶液が、
未知の濃度のDNAを含むサンプルに対して同様にして
処理される。バックグラウンド溶液中に検出できるラベ
ルの量が、対照溶液及び未知のサンプル中に検出できる
ラベルの量から引き算される。次に、対照溶液及び未知
のサンプルのための調整された値は、サンプル中に存在
するDNAの量の決定に関係する。
を含まない少なくとも1種のバックグラウンド溶液及び
既知の量のDNAを含む少なくとも1種の対照溶液が、
未知の濃度のDNAを含むサンプルに対して同様にして
処理される。バックグラウンド溶液中に検出できるラベ
ルの量が、対照溶液及び未知のサンプル中に検出できる
ラベルの量から引き算される。次に、対照溶液及び未知
のサンプルのための調整された値は、サンプル中に存在
するDNAの量の決定に関係する。
次のことば、上記段階を実施するための一般的な方法で
ある。本発明の方法は、タンパク質の存在又は不在下で
DNAの検出のために使用され得る。タンパク質が存在
する場合、サンプルを除タンパク質するだめの追加の段
階が所望される。
ある。本発明の方法は、タンパク質の存在又は不在下で
DNAの検出のために使用され得る。タンパク質が存在
する場合、サンプルを除タンパク質するだめの追加の段
階が所望される。
DNAの結合性に悪影響を与えない除タンパク質のため
の従来の手段(たとえば、フェノール抽出)が使用され
得る。タンパク質が既知の特徴を有する場合、サンプル
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー(例えばDE
AE−セルロース、ホスホセルロース、スルホン酸ゲル
)、ヒドロキシアパタイト(−本積及び二本鎖DNAが
異なった塩濃度による溶離によりタンパク質から分離さ
れ得る)、ゲル濾過及びアフィニティークロマトグラフ
ィーにより除タンパクされ得る。
の従来の手段(たとえば、フェノール抽出)が使用され
得る。タンパク質が既知の特徴を有する場合、サンプル
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー(例えばDE
AE−セルロース、ホスホセルロース、スルホン酸ゲル
)、ヒドロキシアパタイト(−本積及び二本鎖DNAが
異なった塩濃度による溶離によりタンパク質から分離さ
れ得る)、ゲル濾過及びアフィニティークロマトグラフ
ィーにより除タンパクされ得る。
アフィニティークロマトグラフィーは、除去されるべき
タンパク質に対して引き起こされた固定されたマウス免
疫グロブリンを用いて、サンプルから直接的にタンパク
質を除去するために使用され得、又はサンプルは、サン
プル中のDNAを結合する固定されたBPを用いて脱タ
ンパク質され得る。次に、DNAは、gilll M以
上、好ましくば2M以上の高い塩濃度を用いてBPから
溶離され、そしてそのNm剤は、その塩濃度をm整した
後、検出アッセイに直接的に使用され得る。最終塩濃度
は、使用される方法に依存して異なる。たとえば、固体
支持体が、陽性に荷電されたナイロン膜又はリンカ−分
子を含んで成る膜である場合、塩濃度は等張に調整され
る。モノクローナル抗体サンプル中のDNAの検出のた
めには、そのモノクローナル抗体が、固体支持体に結合
されたプロティンAを用いて除去され得る。
タンパク質に対して引き起こされた固定されたマウス免
疫グロブリンを用いて、サンプルから直接的にタンパク
質を除去するために使用され得、又はサンプルは、サン
プル中のDNAを結合する固定されたBPを用いて脱タ
ンパク質され得る。次に、DNAは、gilll M以
上、好ましくば2M以上の高い塩濃度を用いてBPから
溶離され、そしてそのNm剤は、その塩濃度をm整した
後、検出アッセイに直接的に使用され得る。最終塩濃度
は、使用される方法に依存して異なる。たとえば、固体
支持体が、陽性に荷電されたナイロン膜又はリンカ−分
子を含んで成る膜である場合、塩濃度は等張に調整され
る。モノクローナル抗体サンプル中のDNAの検出のた
めには、そのモノクローナル抗体が、固体支持体に結合
されたプロティンAを用いて除去され得る。
サンプルを除タンパク質する他の方法は、高濃度の沃化
ナトリウムの存在下でガラス粒子の懸濁液とサンプルと
を混合することを含む。サンプル中に存在するいづれか
のDNAは、そのガラス粒子により非拡散的に結合され
る。ガラス粒子が単離され、そしてDNAが水又はPB
Sによる処理により粒子から回収される。ガラス粒子は
、微粉砕されたビーズ、又は好ましくは、BIO101
,Inc、。
ナトリウムの存在下でガラス粒子の懸濁液とサンプルと
を混合することを含む。サンプル中に存在するいづれか
のDNAは、そのガラス粒子により非拡散的に結合され
る。ガラス粒子が単離され、そしてDNAが水又はPB
Sによる処理により粒子から回収される。ガラス粒子は
、微粉砕されたビーズ、又は好ましくは、BIO101
,Inc、。
La Jolla、 Ca1iforniaにより供給
されているようなGlassmi IkTMを含んで成
る組成物を含むことができる。
されているようなGlassmi IkTMを含んで成
る組成物を含むことができる。
サンプルを除タンパク質するために使用され得るもう1
つの方法は、少なくとも1種の酵素、たとえばプロアー
ゼ又はプロテイナーゼKを含んで成るタンパク質分解酵
素組成物とタンパク質含有サンプルとの混合である。酵
素処理の後、加水分解された生成物は、たとえば低分子
量カットオフ(Centriprep−10,Cent
riprep−30; As1con、 Danver
s。
つの方法は、少なくとも1種の酵素、たとえばプロアー
ゼ又はプロテイナーゼKを含んで成るタンパク質分解酵
素組成物とタンパク質含有サンプルとの混合である。酵
素処理の後、加水分解された生成物は、たとえば低分子
量カットオフ(Centriprep−10,Cent
riprep−30; As1con、 Danver
s。
MAにより供給されるような約10,000又は30,
000)を有する膜を通しての遠心分離、低分子量カッ
トオフ(約10,000又は30,000)を有するミ
リボア低体積限外濾過装置の使用又はゲル濾過により、
−a的に除去される。存在するすべてのタンパク質が消
化され、除去され又は消化及び除去された後、DNAは
ssDNAに変性される。DNAを変性するために使用
される方法は、約90〜100°Cでの加熱または水酸
化ナトリウム(p旧3.0)による処理を含む。急速な
冷却(DNAの再アニーリングを避けるために)又は中
和(たとえば酢酸アンモニウム又はTris緩衝液を用
いて)の後、ssDNAは、固体支持体に接触される。
000)を有する膜を通しての遠心分離、低分子量カッ
トオフ(約10,000又は30,000)を有するミ
リボア低体積限外濾過装置の使用又はゲル濾過により、
−a的に除去される。存在するすべてのタンパク質が消
化され、除去され又は消化及び除去された後、DNAは
ssDNAに変性される。DNAを変性するために使用
される方法は、約90〜100°Cでの加熱または水酸
化ナトリウム(p旧3.0)による処理を含む。急速な
冷却(DNAの再アニーリングを避けるために)又は中
和(たとえば酢酸アンモニウム又はTris緩衝液を用
いて)の後、ssDNAは、固体支持体に接触される。
固体支持体がニトロセルロース又は陽性に荷電されたナ
イロンのような膜である場合、サンプルは一般的に、マ
ニホールド濾過装置を用いて濾過される。しかしながら
、固体支持体が、たとえば陽性に荷電されたナイロンビ
ーズである場合、そのビーズはサンプルと一緒に直接イ
ンキュベートされ得る。固体支持体がその表面上に固定
されたBPを有する場合、ssDNAはBPに結合し、
BP−ssDNA複合体を形成する。固体支持体がBP
を含まない場合、DNAは、焼付、又はエターノールに
よる処理により固体支持体上に固定される。この段階は
、陽性に荷電されたナイロン膜が使用される場合、排除
され得る。
イロンのような膜である場合、サンプルは一般的に、マ
ニホールド濾過装置を用いて濾過される。しかしながら
、固体支持体が、たとえば陽性に荷電されたナイロンビ
ーズである場合、そのビーズはサンプルと一緒に直接イ
ンキュベートされ得る。固体支持体がその表面上に固定
されたBPを有する場合、ssDNAはBPに結合し、
BP−ssDNA複合体を形成する。固体支持体がBP
を含まない場合、DNAは、焼付、又はエターノールに
よる処理により固体支持体上に固定される。この段階は
、陽性に荷電されたナイロン膜が使用される場合、排除
され得る。
ニトロセルロース又は陽性に荷電されたナイロン上の非
特異的結合部位は、高濃度のタンパク質溶液、たとえば
約1〜10%のウシ血清アルブミン(BSA)、非脂肪
性ドライミルク溶液及び同様のものと共に膜をインキュ
ベートすることによって阻止され得る。陽性に荷電され
たナイロンに関しては、非特異的結合部位は、さらに非
イオン性界面活性剤溶液、たとえばTween−200
又はTritonX−1009(ii!l常0,1〜5
.0%)による洗浄により阻止され得る。
特異的結合部位は、高濃度のタンパク質溶液、たとえば
約1〜10%のウシ血清アルブミン(BSA)、非脂肪
性ドライミルク溶液及び同様のものと共に膜をインキュ
ベートすることによって阻止され得る。陽性に荷電され
たナイロンに関しては、非特異的結合部位は、さらに非
イオン性界面活性剤溶液、たとえばTween−200
又はTritonX−1009(ii!l常0,1〜5
.0%)による洗浄により阻止され得る。
次に、非拡散的に結合されたssDNAを含んで成る固
体支持体は、ラベルされたBPと共にインキュベートさ
れ、BP−ssllNA複合体を形成する。固体支持体
がニトロセルロース又は陽性に荷電されたナイロン膜で
ある場合、BP(一般的に0.3n/−)を含む緩衝液
(pl+6〜9)がその膜に添加される。緩衝液は一般
的に室温で存在し、そして好ましくはO0旧〜0.3M
の塩化ナトリウムを含み、そしてさらに陽性に荷電され
たナイロンのためには、非イオン性界面活性剤、たとえ
ばTween−209又はTritonX−1000(
好ましくは0.1〜5.0%v / v )を含む。
体支持体は、ラベルされたBPと共にインキュベートさ
れ、BP−ssllNA複合体を形成する。固体支持体
がニトロセルロース又は陽性に荷電されたナイロン膜で
ある場合、BP(一般的に0.3n/−)を含む緩衝液
(pl+6〜9)がその膜に添加される。緩衝液は一般
的に室温で存在し、そして好ましくはO0旧〜0.3M
の塩化ナトリウムを含み、そしてさらに陽性に荷電され
たナイロンのためには、非イオン性界面活性剤、たとえ
ばTween−209又はTritonX−1000(
好ましくは0.1〜5.0%v / v )を含む。
BP−ssDNA複合体は、BP又はS!lDNAのい
づれかに結合されたラベルにより検出され得、該ラベル
は好ましくはBPに結合されている。DNAが好ましく
は、ラベルされる場合、BPが固体支持体に予備結合さ
れる場合の例外が存在する。BPは、多くの方法により
共有的にラベルされ得る。ラベルは、酵素、たとえばア
ルカリホスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ホースラディシュベルオキシダーゼ
、βラクタマーゼ、ウレアーゼ;放射性核種、たとえば
+zs■、化学ルミネセント又は螢光化合物、たとえば
フルオレセインイソシアネート;ハプテン、たとえばビ
オチン、及び同様のもの;又は検出可能なシグナルを提
供するいづれか他のラベルであることができる。ラベル
が酵素である場合、それは少なくとも1つの入手しやす
い必須でない遊離システィン残基を含む。BPは、たと
えばBIakely痰&、、 J、Mo1.Catal
sis (1984)23:263〜292により記
載されているように酵素に結合され得る。この方法で結
合され得る他の酵素として、β−D−ガラクトシダーゼ
を挙げることができる。
づれかに結合されたラベルにより検出され得、該ラベル
は好ましくはBPに結合されている。DNAが好ましく
は、ラベルされる場合、BPが固体支持体に予備結合さ
れる場合の例外が存在する。BPは、多くの方法により
共有的にラベルされ得る。ラベルは、酵素、たとえばア
ルカリホスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ホースラディシュベルオキシダーゼ
、βラクタマーゼ、ウレアーゼ;放射性核種、たとえば
+zs■、化学ルミネセント又は螢光化合物、たとえば
フルオレセインイソシアネート;ハプテン、たとえばビ
オチン、及び同様のもの;又は検出可能なシグナルを提
供するいづれか他のラベルであることができる。ラベル
が酵素である場合、それは少なくとも1つの入手しやす
い必須でない遊離システィン残基を含む。BPは、たと
えばBIakely痰&、、 J、Mo1.Catal
sis (1984)23:263〜292により記
載されているように酵素に結合され得る。この方法で結
合され得る他の酵素として、β−D−ガラクトシダーゼ
を挙げることができる。
他方、酵素ラベルはチオール化され得、そして次にBP
に接合され得る。タンパク質にラベルを結合するための
方法は、科学文献に詳細に記載されている。たとえばH
ealeyfl 煮、 、 Cl1nicaC,hi;
ica Acta(1983) 134 : 51〜5
8 ; l5hikaiea星e、。
に接合され得る。タンパク質にラベルを結合するための
方法は、科学文献に詳細に記載されている。たとえばH
ealeyfl 煮、 、 Cl1nicaC,hi;
ica Acta(1983) 134 : 51〜5
8 ; l5hikaiea星e、。
、1−L、1−mp−u−npy咀鮫−(1983)土
:209〜327;及びTijssen。
:209〜327;及びTijssen。
Practiceand Theor of Enz
me Immunoassa 5(1985)259
〜236. Elsevier 5cience Pu
blishers(Amsterdam )を参照のこ
と。
me Immunoassa 5(1985)259
〜236. Elsevier 5cience Pu
blishers(Amsterdam )を参照のこ
と。
SSB上のラベルが酵素である場合、SSB分子当りに
結合される酵素分子の数は通常、約1〜3個のマレイミ
ド分子/SSB、好ましくは1.8個のマレイミド/分
子である。一般的にこれは、SSB分子当り1個の酵素
分子を含んで成る5SB−酵素接合体をもたらす。ラベ
ルがヘプテン、たとえばビオチンである場合、SSB分
子当りに結合されるハプテン分子の数は、通常1〜5、
好ましくは3〜4である。
結合される酵素分子の数は通常、約1〜3個のマレイミ
ド分子/SSB、好ましくは1.8個のマレイミド/分
子である。一般的にこれは、SSB分子当り1個の酵素
分子を含んで成る5SB−酵素接合体をもたらす。ラベ
ルがヘプテン、たとえばビオチンである場合、SSB分
子当りに結合されるハプテン分子の数は、通常1〜5、
好ましくは3〜4である。
検出されるべきDNA (BPよりもむしろ)は、ラベ
ルされ得る。ラベルとして放射性核種、発けい先回、又
はハブテン、たとえばジゴキシン又はビオチン及び同様
のものを挙げることができる。
ルされ得る。ラベルとして放射性核種、発けい先回、又
はハブテン、たとえばジゴキシン又はビオチン及び同様
のものを挙げることができる。
ラベルは、標準の酵素的反応、たとえばニックトランス
レーションにより、又は3)1 、14C、32p、又
はビオチンによりラベルされたデオキシヌクレオチド三
リン酸(dNTP)による末端のラベル化により、DN
Aに導入され得る。次にラベルされたDNAは、アルカ
リ又は加熱によりssDNAに変性される。
レーションにより、又は3)1 、14C、32p、又
はビオチンによりラベルされたデオキシヌクレオチド三
リン酸(dNTP)による末端のラベル化により、DN
Aに導入され得る。次にラベルされたDNAは、アルカ
リ又は加熱によりssDNAに変性される。
他方、DNAは、試薬、たとえば二本鎖DNAに結合す
るイソプソラレンによりラベルされ得る。
るイソプソラレンによりラベルされ得る。
3H−イソプソラレン又はビオチンーイソプソラレンは
、IIRI Re5earch、 Inc、、 Ber
keley、 Ca1iforniaから入手できる。
、IIRI Re5earch、 Inc、、 Ber
keley、 Ca1iforniaから入手できる。
イソプソラレン試薬は、それとサンプルとを混合するこ
とにより、続いて340〜3BOn+*で光照射するこ
とにより、DNAに結合される。使用されるラベルがイ
ソプソラレンである場合、イソプソラレンによりラベル
されたDNAが変性段階なしにBPにより認識されるよ
うに、そのラベルされたDNAを変性する必要はない。
とにより、続いて340〜3BOn+*で光照射するこ
とにより、DNAに結合される。使用されるラベルがイ
ソプソラレンである場合、イソプソラレンによりラベル
されたDNAが変性段階なしにBPにより認識されるよ
うに、そのラベルされたDNAを変性する必要はない。
BP−ssDN^複合体を検出する方法は、使用される
ラベルのタイプ及び必要とされる感度に依存するであろ
う。ラベルが酵素である場合、基質の消失又は反応生成
物の出現が、基質の添加後、分光光度的に測定され得る
。酵素が、たとえばウレアーゼである場合、指示色素、
たとえばクレゾールレッドは、酵素基質の添加の後、サ
ンプル中のpHの変化をモニターするために使用され得
る。次に、光学密度又は色の変化の可視強度の変化は、
既知の濃度のDNAを含む少なくとも1種の同一に処理
された対照溶液との比較によりサンプルのDNA含有量
と相互関係を示す。他方、存在するいづれかのDNAは
、たとえばアメリカ特許第4.591,550号に記載
されている光反応性装置によりρ11変化の量を測定す
ることによって検出され得る。サンプル中のBP−ss
DNA複合体を検出するための他の方法は、ラベルが放
射性核種である場合、放射能の量を定量化することを含
む。ラベルがヘプテン、たとえばビオチンである場合、
そのラベルは、たとえば酵素によりラベルされたアビジ
ン、ストレプトアビジン又は抗−ビオチンの使用により
検出され得る。
ラベルのタイプ及び必要とされる感度に依存するであろ
う。ラベルが酵素である場合、基質の消失又は反応生成
物の出現が、基質の添加後、分光光度的に測定され得る
。酵素が、たとえばウレアーゼである場合、指示色素、
たとえばクレゾールレッドは、酵素基質の添加の後、サ
ンプル中のpHの変化をモニターするために使用され得
る。次に、光学密度又は色の変化の可視強度の変化は、
既知の濃度のDNAを含む少なくとも1種の同一に処理
された対照溶液との比較によりサンプルのDNA含有量
と相互関係を示す。他方、存在するいづれかのDNAは
、たとえばアメリカ特許第4.591,550号に記載
されている光反応性装置によりρ11変化の量を測定す
ることによって検出され得る。サンプル中のBP−ss
DNA複合体を検出するための他の方法は、ラベルが放
射性核種である場合、放射能の量を定量化することを含
む。ラベルがヘプテン、たとえばビオチンである場合、
そのラベルは、たとえば酵素によりラベルされたアビジ
ン、ストレプトアビジン又は抗−ビオチンの使用により
検出され得る。
便利上、試薬が時々キットに擢供され、ここでそれらは
、緩衝液、安定剤、賦形剤及び同様のものと一緒に存在
することができる。キットはまた、ラベルされたBP又
はssDNAの調製のために及びアッセイの実施におけ
るラベルされたBP−ssDNA複合体の検出のために
必要ないづれか追加の試薬も含むことができる。試薬が
BPを含む場合、それはラベルされても又はラベルされ
なくてもよい。
、緩衝液、安定剤、賦形剤及び同様のものと一緒に存在
することができる。キットはまた、ラベルされたBP又
はssDNAの調製のために及びアッセイの実施におけ
るラベルされたBP−ssDNA複合体の検出のために
必要ないづれか追加の試薬も含むことができる。試薬が
BPを含む場合、それはラベルされても又はラベルされ
なくてもよい。
ラベルされない場合、それはまた、固体支持体に非拡散
的に結合され得る。
的に結合され得る。
次の例は、例示的であって、限定するものではない。
Aom−マレイミドヘンシイルーN−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル(MBS)を用いての5SB−ウレア
ーゼ 人 の E、コリからの一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)
を、United 5tates Biochemic
al Corp、C1eveland、 ORから得た
。それは、次のようにしく31) て架橋剤MBSに結合された。ジメチルホルムアミド(
DMF)中、0.25%のMBS 100.+11を、
0.1Mのリン酸緩衝液(pH16,8)中、SS82
■を含む溶液2.0−に添加した。その混合物を室温で
30分間、軽く攪拌し、次に5ephadex G−2
5上で分離した。溶離緩衝液は、0.1 Mのリン酸(
pH6,8)であった。画分を、280nmでUV吸光
度によりモニターした。カラムから溶離された第1のピ
ークは、MBSに結合されたSSBを含んだ。ピーク画
分(3−)を、0.1Mリン酸緩衝液(pH6,8)中
、ウレアーゼ(20M)の溶液4−と混合した。
ンイミドエステル(MBS)を用いての5SB−ウレア
ーゼ 人 の E、コリからの一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)
を、United 5tates Biochemic
al Corp、C1eveland、 ORから得た
。それは、次のようにしく31) て架橋剤MBSに結合された。ジメチルホルムアミド(
DMF)中、0.25%のMBS 100.+11を、
0.1Mのリン酸緩衝液(pH16,8)中、SS82
■を含む溶液2.0−に添加した。その混合物を室温で
30分間、軽く攪拌し、次に5ephadex G−2
5上で分離した。溶離緩衝液は、0.1 Mのリン酸(
pH6,8)であった。画分を、280nmでUV吸光
度によりモニターした。カラムから溶離された第1のピ
ークは、MBSに結合されたSSBを含んだ。ピーク画
分(3−)を、0.1Mリン酸緩衝液(pH6,8)中
、ウレアーゼ(20M)の溶液4−と混合した。
この混合物を、室温で20分間攪拌した。次にその反応
を、10mMのジチオトレイトール(DTT)を含む0
.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pF16.8)中、
500mMの亜硫酸ナトリウム溶液1.75afの添加
により停止せしめた。形成された接合体を、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより接合されなかった酵素から分離
した。次に、精製された酵素接合体を、クリセロールに
より1:1(v/v)に希釈した。BSAを添加し、0
.25%(v / v )にした。
を、10mMのジチオトレイトール(DTT)を含む0
.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pF16.8)中、
500mMの亜硫酸ナトリウム溶液1.75afの添加
により停止せしめた。形成された接合体を、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより接合されなかった酵素から分離
した。次に、精製された酵素接合体を、クリセロールに
より1:1(v/v)に希釈した。BSAを添加し、0
.25%(v / v )にした。
接合体を2〜8°Cで貯蔵した。
B、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシ
ンイミド′エステル(MBS)を用いての5SB−ホー
スラディシュペルオキシダーゼHRP 人の HRP(Boeringer−Mannheim、 L
a Jolla、 CA)を、0、2 Mの塩化ナトリ
ウムを含む0.1 Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7
,5)中、)IRP 16■とジメチルホルムアミド(
DMF) 25IlI中、5PDP 435硝とを混合
し、そして室温で30分間結合せしめることによって、
チオール化せしめた。反応しなかった5PDPを、5e
phadex G−25を充填するクロマトグラフィー
により除去し、0.2Mの塩化ナトリウムを含む0、1
Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7,0)により溶離
した。
ンイミド′エステル(MBS)を用いての5SB−ホー
スラディシュペルオキシダーゼHRP 人の HRP(Boeringer−Mannheim、 L
a Jolla、 CA)を、0、2 Mの塩化ナトリ
ウムを含む0.1 Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7
,5)中、)IRP 16■とジメチルホルムアミド(
DMF) 25IlI中、5PDP 435硝とを混合
し、そして室温で30分間結合せしめることによって、
チオール化せしめた。反応しなかった5PDPを、5e
phadex G−25を充填するクロマトグラフィー
により除去し、0.2Mの塩化ナトリウムを含む0、1
Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7,0)により溶離
した。
HRP上のジチオピリジン基を、25dのDTTを30
分間添加し、次にそのDTT及びPBS中においてG−
25分離により形成された2−チオピリジンを除去する
ことによって阻止解除した。
分間添加し、次にそのDTT及びPBS中においてG−
25分離により形成された2−チオピリジンを除去する
ことによって阻止解除した。
0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液0.5d中、5S1
0.55mgにDMF中、MBSの0.25%溶液25
p!を添加し、そして室温で30分間攪拌することによ
って、マレイミド−3SBを形成した。マレイミド−3
SBを5ephadex G−25上で精製し、次に2
種の溶液を混合し、そして室温で20分間反応せしめる
ことによって、チオール化されたHRP15−と縮合せ
しめた。その反応を、I 00mMの2−メルカプトエ
タノール12.5pfの添加により停止せしめた。5S
B−11RP接合体溶液をグリセロール中で10%(V
/V)にし、そして4°Cで貯蔵した。
0.55mgにDMF中、MBSの0.25%溶液25
p!を添加し、そして室温で30分間攪拌することによ
って、マレイミド−3SBを形成した。マレイミド−3
SBを5ephadex G−25上で精製し、次に2
種の溶液を混合し、そして室温で20分間反応せしめる
ことによって、チオール化されたHRP15−と縮合せ
しめた。その反応を、I 00mMの2−メルカプトエ
タノール12.5pfの添加により停止せしめた。5S
B−11RP接合体溶液をグリセロール中で10%(V
/V)にし、そして4°Cで貯蔵した。
C,5SB−ビオチン 人 の
PBsli(150mM、 50mMのNacffi、
リン酸ナトリウム、p117.0及び1mMのE[l
TA’)中、SSBImgを、撹拌しながら、室温で2
時間、DMF 20pl中、ビオチンアミドカプロエー
ト−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル50泳と共
に混合した。反応しなかったビオチン試薬を、5epF
adex G−25カラムを通すことにより除去した。
リン酸ナトリウム、p117.0及び1mMのE[l
TA’)中、SSBImgを、撹拌しながら、室温で2
時間、DMF 20pl中、ビオチンアミドカプロエー
ト−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル50泳と共
に混合した。反応しなかったビオチン試薬を、5epF
adex G−25カラムを通すことにより除去した。
クローナル抗体、すなわちクローン4Hz(SepυI
vedaVeterans Administrati
on 1(ospital、 Los Angele
sでDr、Richard Weisbartから得ら
れた)を、DMF50p!中、4−(N−マレイミドメ
チル)シクロへ牛サンー1−カルボン酸N−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル(SMCC) 125xと共に
反応せしめた。
vedaVeterans Administrati
on 1(ospital、 Los Angele
sでDr、Richard Weisbartから得ら
れた)を、DMF50p!中、4−(N−マレイミドメ
チル)シクロへ牛サンー1−カルボン酸N−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル(SMCC) 125xと共に
反応せしめた。
反応しなかったSMCCを、5ephadex G−2
5カラムを通すことにより除去した(PBSHにより溶
離された)。
5カラムを通すことにより除去した(PBSHにより溶
離された)。
抗体当りのマレイミドの数は4であった。次に、ウレア
ーゼ(20+ng)を、マレイミド−抗体に添加し、そ
して4°Cで4時間インキュベートした。
ーゼ(20+ng)を、マレイミド−抗体に添加し、そ
して4°Cで4時間インキュベートした。
次に、反応しなかったマレイミド基を、2−メルカプト
エタノールの添加により2mMの濃度にすることによっ
て阻止した。
エタノールの添加により2mMの濃度にすることによっ
て阻止した。
接合体を、50mMの亜硫酸ナトリウム、20mMのリ
ン酸二水素ナトリウム、200mMの塩化ナトリウム、
1mMのEDT八、2mMのジチオトレイトール及びO
,I%Tueen−20から成る緩衝液中において5e
phacryl S−4005−400H1l(Pha
r、 Piscataway、 NJ)c7) 1.5
cmX 70cmカラム上でのゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより精製した。遊離ウレアーゼピークの前に溶出
する全タンパク質ピークを混合した60.05%BSA
を添加し、そしてその接合体溶液を、密封された容器中
においてアルゴンガス下で4°Cで貯蔵した。
ン酸二水素ナトリウム、200mMの塩化ナトリウム、
1mMのEDT八、2mMのジチオトレイトール及びO
,I%Tueen−20から成る緩衝液中において5e
phacryl S−4005−400H1l(Pha
r、 Piscataway、 NJ)c7) 1.5
cmX 70cmカラム上でのゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより精製した。遊離ウレアーゼピークの前に溶出
する全タンパク質ピークを混合した60.05%BSA
を添加し、そしてその接合体溶液を、密封された容器中
においてアルゴンガス下で4°Cで貯蔵した。
E、ビオチン−−DNA 人 の
PBSH中、R,Weisbardからの精製された抗
−DNA抗体1■を、DMF 20J中、ビオチンアミ
ドカプロエート−N−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル50I1gに添加し、そして室温で2時間攪拌した。
−DNA抗体1■を、DMF 20J中、ビオチンアミ
ドカプロエート−N−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル50I1gに添加し、そして室温で2時間攪拌した。
反応しなかったビオチン試薬を5ephardex G
−25カラムを通ずことにより除去した。精製された抗
DNA−ビオチンを4 ”Cで貯蔵した。
−25カラムを通ずことにより除去した。精製された抗
DNA−ビオチンを4 ”Cで貯蔵した。
1*mobi Jon”膜は、リジン又はアルギニン上
のニブシロンアミノ基に結合するカルボニルイミダゾー
ル基を含む。SSBを、0.65μのImmobilo
n”nり(Millipore ; Bedford、
MA)上に、0.2mg/−のSSBを含むリン酸緩
衝溶液中に前記膜を1時間ソータすること番こよって固
定した(10ccのタンパク質溶液/100cnlの膜
)。SSB溶液をデカントすることによって除去した。
のニブシロンアミノ基に結合するカルボニルイミダゾー
ル基を含む。SSBを、0.65μのImmobilo
n”nり(Millipore ; Bedford、
MA)上に、0.2mg/−のSSBを含むリン酸緩
衝溶液中に前記膜を1時間ソータすること番こよって固
定した(10ccのタンパク質溶液/100cnlの膜
)。SSB溶液をデカントすることによって除去した。
膜上の残存する活性カルボニルイミダゾール基を、室温
で一晩、0、1 Mのエタノールアミン(pH9,5)
により冷却した。次に、膜を連続的にリン酸緩衝溶液、
蒸留水及びポリビニルアルコールにより洗浄しくそれぞ
れ15分間)、そして次に65℃で5分間乾燥せしめた
。次にその乾燥せしめられた膜は、検出システムに使用
するために準備された。10■/dのBSA水溶液中、
3Zpによりラベルされた一本鎖D N A (10〜
1000pq)を含ムサンプル100tlを、5SB−
rmmobi Ion”膜を通して濾過した(10分間
の濾過時間)。70%の32p計数が、SSB濃度が0
.2 mg / mlである場合、膜上に捕獲された。
で一晩、0、1 Mのエタノールアミン(pH9,5)
により冷却した。次に、膜を連続的にリン酸緩衝溶液、
蒸留水及びポリビニルアルコールにより洗浄しくそれぞ
れ15分間)、そして次に65℃で5分間乾燥せしめた
。次にその乾燥せしめられた膜は、検出システムに使用
するために準備された。10■/dのBSA水溶液中、
3Zpによりラベルされた一本鎖D N A (10〜
1000pq)を含ムサンプル100tlを、5SB−
rmmobi Ion”膜を通して濾過した(10分間
の濾過時間)。70%の32p計数が、SSB濃度が0
.2 mg / mlである場合、膜上に捕獲された。
この固定化法に使用されるSSBの濃度を1■/−に高
めることがDN’A捕獲を80%改良した。
めることがDN’A捕獲を80%改良した。
°Cでニトロセルロース膜(0,45μの孔サイズ、5
chleicher and 5chnell)をソー
クすることによって、SSBをその膜に吸着せしめた。
chleicher and 5chnell)をソー
クすることによって、SSBをその膜に吸着せしめた。
膜上の非特異的結合部位を、室温で1時間10■/−の
USAにより阻止した。10mg/−のBSA及び32
pによりラベルされた一本鎖DNAを含むサンプル40
0plをその膜を通して濾過する場合、36%の3zp
計数が、ニトロセルロース膜上に捕獲された。
USAにより阻止した。10mg/−のBSA及び32
pによりラベルされた一本鎖DNAを含むサンプル40
0plをその膜を通して濾過する場合、36%の3zp
計数が、ニトロセルロース膜上に捕獲された。
サンプル(10+*Mのリン酸ナトリウム、pi(7,
0゜0.15Mの塩化ナトリウム、1mMのE[]TA
における)当りO〜1oopqの純粋ウシ胸腺(Sig
ma ChemicalCo、、 SL、[、ouis
+ No)を含むサンプルを、100°Cで10分間加
熱し、続いて急速に冷却することによって一本鎖DNA
に変性した。その変性されたサンプルを、多様濾過装置
を用いて、0.45μの孔サイズのニトロセルロース膜
(Schleicher andSchnell; K
eene、 N)l)を通して濾過した。次にその膜を
80°Cで1時間焼付けし、DNAを固定した。例IA
におけるようにして調製され、そしてさらに精製を伴わ
ないで使用される5SB−ウレアーゼ接合体を、2%ウ
シ血清アルブミン(BSA)2%Ficoll、2%ポ
リビニルピロリドン、10n+Hのリン酸ナトリウム、
40Il1Mの塩化ナトリウム中に希釈し、0.3蛸/
1mlにし、そして2mMのEDTA (pH1,5)
を、その膜に添加した。その膜を、十分な体積の接合体
のベトリ皿中において、室温で1時間5SB−ウレアー
ゼ接合体と共にインキュベートし、その膜を被覆した。
0゜0.15Mの塩化ナトリウム、1mMのE[]TA
における)当りO〜1oopqの純粋ウシ胸腺(Sig
ma ChemicalCo、、 SL、[、ouis
+ No)を含むサンプルを、100°Cで10分間加
熱し、続いて急速に冷却することによって一本鎖DNA
に変性した。その変性されたサンプルを、多様濾過装置
を用いて、0.45μの孔サイズのニトロセルロース膜
(Schleicher andSchnell; K
eene、 N)l)を通して濾過した。次にその膜を
80°Cで1時間焼付けし、DNAを固定した。例IA
におけるようにして調製され、そしてさらに精製を伴わ
ないで使用される5SB−ウレアーゼ接合体を、2%ウ
シ血清アルブミン(BSA)2%Ficoll、2%ポ
リビニルピロリドン、10n+Hのリン酸ナトリウム、
40Il1Mの塩化ナトリウム中に希釈し、0.3蛸/
1mlにし、そして2mMのEDTA (pH1,5)
を、その膜に添加した。その膜を、十分な体積の接合体
のベトリ皿中において、室温で1時間5SB−ウレアー
ゼ接合体と共にインキュベートし、その膜を被覆した。
次にその膜を3度0.15Mの塩化ナトリウム、ll1
1MのEDTA (pl(6)により洗浄し、いづれか
非特異的に結合された接合体を除去した。次に存在する
いづれかのDNAを、酵素基質(100mMの尿素、0
.15Mの塩化ナトリウム、1mMのリン酸ナトリウム
、pH6、0,5mMのクレゾールレッド)の添加によ
り検出した。ウレアーゼ反応によるpI(の変化は、オ
レンジから赤紫へのクレゾールレッドの色の変化をもた
らした。
1MのEDTA (pl(6)により洗浄し、いづれか
非特異的に結合された接合体を除去した。次に存在する
いづれかのDNAを、酵素基質(100mMの尿素、0
.15Mの塩化ナトリウム、1mMのリン酸ナトリウム
、pH6、0,5mMのクレゾールレッド)の添加によ
り検出した。ウレアーゼ反応によるpI(の変化は、オ
レンジから赤紫へのクレゾールレッドの色の変化をもた
らした。
次に、赤紫色のスポットの視覚的強度は、膜上の着色さ
れたスポットの相対的サイズ及びその色の強さを決定す
ることによりサンプルのDNA含有量に相互関係した。
れたスポットの相対的サイズ及びその色の強さを決定す
ることによりサンプルのDNA含有量に相互関係した。
加した。ウレアーゼによるpl(の変化は、光反応性装
置のシグナルの変化をもたらした。次に、そのシグナル
の変化(μポルト/秒)は、サンプルのDNA含有量に
相互関係した。
置のシグナルの変化をもたらした。次に、そのシグナル
の変化(μポルト/秒)は、サンプルのDNA含有量に
相互関係した。
B、バイオセンサーによる11の
上記のようにして調製された股上に存在するいずれかの
DNAをまた、酵素基質の添加の後、光反応性装置(た
とえばアメリカ特許第4,591,550号を参照のこ
と)を用いてpnの変化の大きさを測定することによっ
て検出することができる。11IIMのリン酸ナトリう
ム、0.05%のTween−20,100mMの尿素
(pH6)を含む酵素基質混合物を、膜に添+ ++ 土++ +++十 抗−ビオチン(Sigma)を、0.25mg/mlの
濃度でPBS中に?容解した。ニトロセルロースシート
(0,8μ)(Schleicher and 5ch
nell)を、DNAを含まない水により湿潤し、次に
、室温で15分、次に4°Cで一晩、その膜を軽く振動
しながら抗ビオヂン混合物(0,2mZ/膜cJ)中に
おいてインキュベートした。次に抗−ビオチン混合物を
注ぎ出し、そしてニトロセルロースを簡単にPBSによ
りずずいだ(0,2ml / crl )。次に、その
ニトロセルロースを、PBS中、0.2%(w/v)の
グルタルアルデヒドと共に15分間インキュベートした
。次にそのニトロセルロースを、PBS、次にDNAを
含まない水により連続的に洗浄した(両汗ともQ、’l
ml / cJで)。次に、そのニトロセルロースを
、Q、 2m! / cJで10分間、0.1%(W/
W)のポリビニルアルコールにより湿潤した。
DNAをまた、酵素基質の添加の後、光反応性装置(た
とえばアメリカ特許第4,591,550号を参照のこ
と)を用いてpnの変化の大きさを測定することによっ
て検出することができる。11IIMのリン酸ナトリう
ム、0.05%のTween−20,100mMの尿素
(pH6)を含む酵素基質混合物を、膜に添+ ++ 土++ +++十 抗−ビオチン(Sigma)を、0.25mg/mlの
濃度でPBS中に?容解した。ニトロセルロースシート
(0,8μ)(Schleicher and 5ch
nell)を、DNAを含まない水により湿潤し、次に
、室温で15分、次に4°Cで一晩、その膜を軽く振動
しながら抗ビオヂン混合物(0,2mZ/膜cJ)中に
おいてインキュベートした。次に抗−ビオチン混合物を
注ぎ出し、そしてニトロセルロースを簡単にPBSによ
りずずいだ(0,2ml / crl )。次に、その
ニトロセルロースを、PBS中、0.2%(w/v)の
グルタルアルデヒドと共に15分間インキュベートした
。次にそのニトロセルロースを、PBS、次にDNAを
含まない水により連続的に洗浄した(両汗ともQ、’l
ml / cJで)。次に、そのニトロセルロースを
、Q、 2m! / cJで10分間、0.1%(W/
W)のポリビニルアルコールにより湿潤した。
次にそのニトロセルロースを、60°Cで10分間焼付
けた。
けた。
2、陀隈i少P二ノー
抗−ビオチン膜に代わる酢酸セルロース膜(Schle
icher and 5chnell、 1.2 I
tの孔サイズ)を、」二記セクション3A、1に記載の
ようにして調製した(但し、グルタルアルデヒド/PB
Sのインキプーベーションの前、PBSによる洗浄を除
いた)。
icher and 5chnell、 1.2 I
tの孔サイズ)を、」二記セクション3A、1に記載の
ようにして調製した(但し、グルタルアルデヒド/PB
Sのインキプーベーションの前、PBSによる洗浄を除
いた)。
何−五
タンパク質を含むサンプル中におけるDNAの沃化ナト
リウム(6M)400#を、サンプル200Iに添加し
た。それぞれのサンプルは、BSA 2■及びウシ胸腺
ONへ100.50.25又はopqを含んだ。
リウム(6M)400#を、サンプル200Iに添加し
た。それぞれのサンプルは、BSA 2■及びウシ胸腺
ONへ100.50.25又はopqを含んだ。
Glassmilk” 2 Jを添加し、そしてその混
合物を室温で10分間インキユヘートした。GIass
m目kTM/DNA複合体を、ミクロ遠心分離機中に1
0秒間、遠心分離することによりベレット化した。その
ベレットを、200mMの塩化ナトリウム、55%メタ
ノール中2mMのEDT^を含む20mMのTris緩
衝液150p1により洗浄した。その洗浄方法をもう1
度くり返した。DNAをリン酸緩衝溶液400plによ
り溶離した後、それぞれのサンプルを、100°Cで1
0分間加熱し、DNAを変性し、次に急速に冷却した。
合物を室温で10分間インキユヘートした。GIass
m目kTM/DNA複合体を、ミクロ遠心分離機中に1
0秒間、遠心分離することによりベレット化した。その
ベレットを、200mMの塩化ナトリウム、55%メタ
ノール中2mMのEDT^を含む20mMのTris緩
衝液150p1により洗浄した。その洗浄方法をもう1
度くり返した。DNAをリン酸緩衝溶液400plによ
り溶離した後、それぞれのサンプルを、100°Cで1
0分間加熱し、DNAを変性し、次に急速に冷却した。
そのサンプルをニトロセルロース膜上に濾過した。例2
.Aに記載の視覚決定方法を用いて、DNAを検出した
。
.Aに記載の視覚決定方法を用いて、DNAを検出した
。
0 わずかに陽性
25 ++
50 +++
100 +++
B、タンパク のプロテイナーゼ
プロテイナーゼK及びジチオトレイトール(それぞれ最
終濃度100犀/d及び50mM)を、リン酸緩衝液中
、BS^ 1 mg及びDNA 100.50.25.
12、又は01)Qをそれぞれ含むサンプル100xZ
に添加した。その混合物を55°Cで2時間インキュベ
ートし、タンパク質を消化した。消化の後、すべてのサ
ンプルを+00°Cで5分間加熱し、プロテイナーゼK
を不活性化し、そしてDNAを一本鎖DNAに変性した
。適切な量のDNAを含む対照サンプル(但しタンパク
質を含まない)を、同時に変性した。DNAの再アニー
リングを防ぐために急速に冷却した後、それぞれのサン
プルを、ニトロセルロース膜を通して濾過した。視覚決
定方法を、例2.Aに記載のようにして行ない、DNA
の存在を検定した。
終濃度100犀/d及び50mM)を、リン酸緩衝液中
、BS^ 1 mg及びDNA 100.50.25.
12、又は01)Qをそれぞれ含むサンプル100xZ
に添加した。その混合物を55°Cで2時間インキュベ
ートし、タンパク質を消化した。消化の後、すべてのサ
ンプルを+00°Cで5分間加熱し、プロテイナーゼK
を不活性化し、そしてDNAを一本鎖DNAに変性した
。適切な量のDNAを含む対照サンプル(但しタンパク
質を含まない)を、同時に変性した。DNAの再アニー
リングを防ぐために急速に冷却した後、それぞれのサン
プルを、ニトロセルロース膜を通して濾過した。視覚決
定方法を、例2.Aに記載のようにして行ない、DNA
の存在を検定した。
芽−j■−表
プロテイナーゼにより消化されたタンパク質含有例−」
− 陽性に荷電されたナイロンへのDNAの吸着によるタン
パク 有サンプル中のDNAの検出A、5SB−11
1?P接合体を用いてのインシュリンサン十 ++ +++ ++++ 十 ++ +++ ++++ (4G) 本積ウシ胸腺DNA0,5.10,20、又は40pq
を含む、10mMのTris−HCI!、及びIIII
MのEDTAの溶液(pH18,7)中、10■/−の
ブタインシュリン(Cal Riochen+、 La
Jolla、 Ca1ifornia)の溶液150
、tに添加した。そのサンプルを55°Cで一晩インキ
ユヘートし、100°Cで5分間煮沸し、次に氷」二で
冷却した。消化されたサンプルを、陽性に荷電されたナ
イロン膜(Genatran014.6 cm X 8
cm 。
− 陽性に荷電されたナイロンへのDNAの吸着によるタン
パク 有サンプル中のDNAの検出A、5SB−11
1?P接合体を用いてのインシュリンサン十 ++ +++ ++++ 十 ++ +++ ++++ (4G) 本積ウシ胸腺DNA0,5.10,20、又は40pq
を含む、10mMのTris−HCI!、及びIIII
MのEDTAの溶液(pH18,7)中、10■/−の
ブタインシュリン(Cal Riochen+、 La
Jolla、 Ca1ifornia)の溶液150
、tに添加した。そのサンプルを55°Cで一晩インキ
ユヘートし、100°Cで5分間煮沸し、次に氷」二で
冷却した。消化されたサンプルを、陽性に荷電されたナ
イロン膜(Genatran014.6 cm X 8
cm 。
r’1asco、 Inc、、 Wohurn、 MA
から得られる)を通して約100pZ/分の速度で濾過
した。0.2〜0.5 ml/ cdの5SB−+1R
P接合体〔リン酸ナトリウム(p117.4)、 15
0ng/mf ; 150mMのNaCff1 ;
2mMのEDTA、 0. 1 mg/ml ;
0. 1 mg/−の BSA、5 %Tri to
n−X1000中において150ng/ml)と共に膜
をペトリ皿巾で室温で40分間インキュベートするごと
によって、DNAを検出した。次にその膜を、IMの尿
素及び1%硫酸デキストランを含むPBS中において3
分間インキュベートすることによって、その膜を3度洗
浄し、非特異的に結合したS S B −11R11を
除去した。次にその膜を蒸留水により洗浄し、10n+
MのEDTA、0.1mg/mlのテトラメチルベンジ
デイン及び0.001%の過酸化水素水(pH5)を含
む10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液中で10分間イ
ンキュベートした。膜上に展開する青色のスポットの視
覚による強度が主観的に決定され、次にそれは元のサン
プルのDNA含有量に相互関係することがわかった。そ
の結果は第6表に示される。
から得られる)を通して約100pZ/分の速度で濾過
した。0.2〜0.5 ml/ cdの5SB−+1R
P接合体〔リン酸ナトリウム(p117.4)、 15
0ng/mf ; 150mMのNaCff1 ;
2mMのEDTA、 0. 1 mg/ml ;
0. 1 mg/−の BSA、5 %Tri to
n−X1000中において150ng/ml)と共に膜
をペトリ皿巾で室温で40分間インキュベートするごと
によって、DNAを検出した。次にその膜を、IMの尿
素及び1%硫酸デキストランを含むPBS中において3
分間インキュベートすることによって、その膜を3度洗
浄し、非特異的に結合したS S B −11R11を
除去した。次にその膜を蒸留水により洗浄し、10n+
MのEDTA、0.1mg/mlのテトラメチルベンジ
デイン及び0.001%の過酸化水素水(pH5)を含
む10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液中で10分間イ
ンキュベートした。膜上に展開する青色のスポットの視
覚による強度が主観的に決定され、次にそれは元のサン
プルのDNA含有量に相互関係することがわかった。そ
の結果は第6表に示される。
++++
++
+
わずかに陽性
劃−工
抗−ビオチン膜上べのサンプルDNAの特異的この例に
おいては、50mMの亜硫酸ナトリウム、20IIIM
のリン酸二水素ナトリウム、200mMの塩化ナトリウ
ム、IIIIMのEDTA、2IIIMのジチオトレイ
トール、0.1%のTween−20(pH7,oO)
を含む緩衝液を含む1c+aX3Qc@の5upero
se 61(R(Pharmacia。
おいては、50mMの亜硫酸ナトリウム、20IIIM
のリン酸二水素ナトリウム、200mMの塩化ナトリウ
ム、IIIIMのEDTA、2IIIMのジチオトレイ
トール、0.1%のTween−20(pH7,oO)
を含む緩衝液を含む1c+aX3Qc@の5upero
se 61(R(Pharmacia。
1’iscataway、 NJ)のカラム上で5SB
−ウレアーゼのゲル濾過クロマトグラフィーにより接合
されなかったウレア−ガを除去するために、SSBウレ
アーゼをさらに精製した。接合されなかったウレアーゼ
ピークの前に溶離するタンパク質ピークを集め、そして
グリセロールと1:1(v:v)で?I1合し、そして
−20℃で貯蔵した。
−ウレアーゼのゲル濾過クロマトグラフィーにより接合
されなかったウレア−ガを除去するために、SSBウレ
アーゼをさらに精製した。接合されなかったウレアーゼ
ピークの前に溶離するタンパク質ピークを集め、そして
グリセロールと1:1(v:v)で?I1合し、そして
−20℃で貯蔵した。
B、5SB−ウレアーゼ接合体による緩衝液中のDNA
のバイオセンサー検出(試薬の逐次的チンにより被覆さ
れたニトロセルロース膜を、抗ビオチン膜を通して約4
分間にわたって、例I已におけるようにして調製された
ビオチン−抗DNA(1%BSA、In+MのEDTA
を含む・l0mMのTris−HCI!、中において3
00ng/ tnl )200 plを濾過することに
よってビオチン−抗−DNAにより被覆した。次に、そ
の膜をPBS 300I!Iにより洗浄した。
のバイオセンサー検出(試薬の逐次的チンにより被覆さ
れたニトロセルロース膜を、抗ビオチン膜を通して約4
分間にわたって、例I已におけるようにして調製された
ビオチン−抗DNA(1%BSA、In+MのEDTA
を含む・l0mMのTris−HCI!、中において3
00ng/ tnl )200 plを濾過することに
よってビオチン−抗−DNAにより被覆した。次に、そ
の膜をPBS 300I!Iにより洗浄した。
DNAを含むサンプル(PBS中、DNA 200tt
l当り0 、12 、25 、50pq)200p7を
、約4分間にわたって濾過した。そのフィルターを再び
PBS 30(hlにより洗浄した。約4分間にわたっ
て、例7Aに記載のようにして精製された5SB−ウレ
アーゼ接合体〔2%BSA、2%Ficolllle、
2%ポリビニルピロリドン、10IIIMのリン酸ナト
リウム、40mMのNaCj!、2IIIMのEDTA
(pH7,5)により希釈された、1100n/ m
l ) 200ttlも、前記膜を通して濾過した。
l当り0 、12 、25 、50pq)200p7を
、約4分間にわたって濾過した。そのフィルターを再び
PBS 30(hlにより洗浄した。約4分間にわたっ
て、例7Aに記載のようにして精製された5SB−ウレ
アーゼ接合体〔2%BSA、2%Ficolllle、
2%ポリビニルピロリドン、10IIIMのリン酸ナト
リウム、40mMのNaCj!、2IIIMのEDTA
(pH7,5)により希釈された、1100n/ m
l ) 200ttlも、前記膜を通して濾過した。
次にその膜を、1mMの酢酸ナトリウム、0.1MのN
aC1,0,05%のTween−20の溶液(pH7
5)1−により3度洗浄した。その膜を、基質溶液(1
00mMの尿素を含む酢酢塩洗浄緩衝液)に添加し、そ
して生成物の形成の速度を、例3Bに記載のようにして
測定した。生成物の形成の速度は、第7表に示されるよ
うに、サンプル中のDNAの濃度の関数である。
aC1,0,05%のTween−20の溶液(pH7
5)1−により3度洗浄した。その膜を、基質溶液(1
00mMの尿素を含む酢酢塩洗浄緩衝液)に添加し、そ
して生成物の形成の速度を、例3Bに記載のようにして
測定した。生成物の形成の速度は、第7表に示されるよ
うに、サンプル中のDNAの濃度の関数である。
穿−」=二k
SSB−ウレアーゼ接合体を用いてのDNAのバ21B
3 B、 同時インキュヘーションアソセイのためのビA■
チン−−DNへの 例7Aに記載のようにして精製されたSSBウレアーゼ
接合体及びビオチン−抗−DNAのニトロセルロース膜
への同時添加の効果を次のようにして評価した: サンプル(ssl)NA 100pqを含む又は含まな
い、TIE中、1%USA)200pZを、ビオチン−
抗−DNA(1%BSA、 TE中、40.81.16
2.325ng/aZ)200p!及び5SB−ウレア
ーゼ接合体〔2%BS^。
3 B、 同時インキュヘーションアソセイのためのビA■
チン−−DNへの 例7Aに記載のようにして精製されたSSBウレアーゼ
接合体及びビオチン−抗−DNAのニトロセルロース膜
への同時添加の効果を次のようにして評価した: サンプル(ssl)NA 100pqを含む又は含まな
い、TIE中、1%USA)200pZを、ビオチン−
抗−DNA(1%BSA、 TE中、40.81.16
2.325ng/aZ)200p!及び5SB−ウレア
ーゼ接合体〔2%BS^。
2%Ficoll’9.2%ポリビニルピロリドン、1
0mMのリン酸ナトリウム、40mMのNaCl、2I
IIMのEDTA (pH7,5)中、15ng/m)
200plと共に室温で50分間インキュベートし
た。次にその混合物を、ニトロセルロース膜を通して約
10分間にわたってゆっくりと濾過した。次にその膜を
、酢酸塩緩衝液(1mMの酢酸ナトリウム、0.1Mの
NaC1,,0,05%の↑ween−20、pH5)
により3度洗浄した。基質溶液(100mMの尿素を含
む酢酸塩緩衝液)を添加し、そして膜上に存在するDN
Aの量を、例28に記載のようにしてバイオセンサー法
により決定した。第8表に示される結果は、同時アッセ
イにおいて、ビオチン−抗DNA及び5SB−ウレアー
ゼ接合体の割合がたぶん抗−DNA及びSSBの両者の
DNAに対する競争のために臨界であることを示す。
0mMのリン酸ナトリウム、40mMのNaCl、2I
IIMのEDTA (pH7,5)中、15ng/m)
200plと共に室温で50分間インキュベートし
た。次にその混合物を、ニトロセルロース膜を通して約
10分間にわたってゆっくりと濾過した。次にその膜を
、酢酸塩緩衝液(1mMの酢酸ナトリウム、0.1Mの
NaC1,,0,05%の↑ween−20、pH5)
により3度洗浄した。基質溶液(100mMの尿素を含
む酢酸塩緩衝液)を添加し、そして膜上に存在するDN
Aの量を、例28に記載のようにしてバイオセンサー法
により決定した。第8表に示される結果は、同時アッセ
イにおいて、ビオチン−抗DNA及び5SB−ウレアー
ゼ接合体の割合がたぶん抗−DNA及びSSBの両者の
DNAに対する競争のために臨界であることを示す。
以下糸白
(5I)
第一」L二表
同時インキュヘーションアッセイを通してビオチC,5
S11−HRP接合体による顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子(GMC3F )サンプル中のDNAのバ
イオセンサー な 3.4mg/dのPBS中、紐換えヒトGMC3F (
Bjogen。
S11−HRP接合体による顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子(GMC3F )サンプル中のDNAのバ
イオセンサー な 3.4mg/dのPBS中、紐換えヒトGMC3F (
Bjogen。
Cambridge、 MA) 300p1を、二本鎖
ウシ胸腺DNA 0 。
ウシ胸腺DNA 0 。
5.10.50又は100凹によりスパイクした。サン
プルを100’Cで5分間加熱し、DNAを変性し、次
に室温に冷却した。 Immobi Jon”膜(Mi
llipore。
プルを100’Cで5分間加熱し、DNAを変性し、次
に室温に冷却した。 Immobi Jon”膜(Mi
llipore。
fledford、 MA)を、例2AのImmobi
Ion”上へのSSB被覆のために、上記のようにし
てヤギ抗−ビオチ71gG(Stgtma、 St 1
.ouis、 MO)により被覆した。ビオチンにより
ラベルされた抗−DNA (クローン4 Hz)200
p1を、その膜を通して濾過した。
Ion”上へのSSB被覆のために、上記のようにし
てヤギ抗−ビオチ71gG(Stgtma、 St 1
.ouis、 MO)により被覆した。ビオチンにより
ラベルされた抗−DNA (クローン4 Hz)200
p1を、その膜を通して濾過した。
GMC3Fを含むサンプル300p7を、その膜を通し
て濾過し、そしてそのHりをPBS 200tll&こ
より再び洗浄した。5SB−1(+IP接合体(650
ng/ af 、 0.1 mgl mlのBSA、2
IIIMのEDTA、5%Triton−X100を含
むPBSにより希釈された)200dを、その膜を通し
て濾過した。次に膜を、5%Triton−XIO0、
I Mの尿素を含むPBSにより1度洗浄し、そして5
%エタノール及び1mMのE[1Tll (pH5,5
)を含む0、1 Mの酢酸ナトリウムにより洗浄した。
て濾過し、そしてそのHりをPBS 200tll&こ
より再び洗浄した。5SB−1(+IP接合体(650
ng/ af 、 0.1 mgl mlのBSA、2
IIIMのEDTA、5%Triton−X100を含
むPBSにより希釈された)200dを、その膜を通し
て濾過した。次に膜を、5%Triton−XIO0、
I Mの尿素を含むPBSにより1度洗浄し、そして5
%エタノール及び1mMのE[1Tll (pH5,5
)を含む0、1 Mの酢酸ナトリウムにより洗浄した。
次に、DNAの量を、アメリカ特許第4,591,55
0 (引用により本明細書に組込まれている)に記載の
ようなバイオセンサー法により決定した。基質溶液は、
250戸のテトラメチルベンジデイン、50−のルテニ
ウム、50Mの過酸化水素(pH5,5)を含む酢酸ナ
トリウム洗浄緩衝液を含有する。HRPレドックス反応
による電位の変化は、光反応性装置のシグナルの変化を
もたらす。その結果は下の第9表に示された。
0 (引用により本明細書に組込まれている)に記載の
ようなバイオセンサー法により決定した。基質溶液は、
250戸のテトラメチルベンジデイン、50−のルテニ
ウム、50Mの過酸化水素(pH5,5)を含む酢酸ナ
トリウム洗浄緩衝液を含有する。HRPレドックス反応
による電位の変化は、光反応性装置のシグナルの変化を
もたらす。その結果は下の第9表に示された。
男−づL−表
5SB−1111P接合体を用いてCMC5Fサンプル
中のDNグラム陰性及びグラム陽性細菌の培養物を、+
1PLc等級の水100μlにより希釈し、80.40
0.2,00010.000/100μlにした。1セ
ツトのサンプルのために、細菌を溶解し、そして3Nの
NaOH101JIによる処理により変性し、次にIM
のTris−HCl2(pH7,3) 50μ!により
中和した。2番目の同一のセットの希釈溶液は、そのよ
うに処理されず、そしてサンプルと5SB−HRP接合
体との間の非特異的相互反応のための対照として作用す
る。
中のDNグラム陰性及びグラム陽性細菌の培養物を、+
1PLc等級の水100μlにより希釈し、80.40
0.2,00010.000/100μlにした。1セ
ツトのサンプルのために、細菌を溶解し、そして3Nの
NaOH101JIによる処理により変性し、次にIM
のTris−HCl2(pH7,3) 50μ!により
中和した。2番目の同一のセットの希釈溶液は、そのよ
うに処理されず、そしてサンプルと5SB−HRP接合
体との間の非特異的相互反応のための対照として作用す
る。
両セットの希釈溶液を、ドツト−プロット装置(Sch
leiker and 5chnell)を用いて、陽
性に荷電されたナイロン膜(GenatranT14)
上に負荷する。
leiker and 5chnell)を用いて、陽
性に荷電されたナイロン膜(GenatranT14)
上に負荷する。
その装置のそれぞれのウェルを、サンプル165plに
より負荷する。IIPLc等級の水により希釈された、
変性ウシ胸腺DNAから成る標準液をまた調製し、そし
て陽性に荷電されたナイロン股上に負荷する。
より負荷する。IIPLc等級の水により希釈された、
変性ウシ胸腺DNAから成る標準液をまた調製し、そし
て陽性に荷電されたナイロン股上に負荷する。
標準液は0,5.10又は5opqのssDNAを含む
。
。
DNAを、5SB−HRP接合体を用いて例3Aに記載
のような視覚的アッセイを用いて検出する。
のような視覚的アッセイを用いて検出する。
本発明の方法及び組成物は、高い親和性の一本1i D
N A結合タンパク質の使用によりサンプル中のDN
Aのピコグラム量を検出するための迅速且つ単純な手段
を提供する。このアッセイは、純粋なりNAサンプルに
適用できるのみならず、またタンパク質の有意量を含む
サンプルに関し、又は微生物を含むサンプルの汚染を検
出するためにも使用される。
N A結合タンパク質の使用によりサンプル中のDN
Aのピコグラム量を検出するための迅速且つ単純な手段
を提供する。このアッセイは、純粋なりNAサンプルに
適用できるのみならず、またタンパク質の有意量を含む
サンプルに関し、又は微生物を含むサンプルの汚染を検
出するためにも使用される。
本明細書に記載されたすべての出版物及び特許出願は、
本発明が関与する当業者のレヘルの表示である。すべて
の出版物及び特許出願は、それぞれ個りの出版物又は特
許出願が引用により組込まれることを特別且つ個々に示
されているかのように、ある程度まで引用により本明細
書に組込まれている。
本発明が関与する当業者のレヘルの表示である。すべて
の出版物及び特許出願は、それぞれ個りの出版物又は特
許出願が引用により組込まれることを特別且つ個々に示
されているかのように、ある程度まで引用により本明細
書に組込まれている。
前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、高い親和性の一本鎖DNA結合タンパク質(BP)
(ここで該BP又は該DNAは検出できるラベルを含有
する)を用いてサンプル中のDNAを検出するための方
法であって: DNA−BP複合体を形成するためにサンプル中のいず
れかの一本鎖DNAと前記BPとを接触せしめ;結合さ
れなかったサンプル及びBPの複合体を除去し;そして 前記サンプル中のDNAの存在の表示として前記ラベル
によって前記複合体を検出することを含んで成る方法。 2、前記サンプルを、前記接触の前、DNA変性条件に
ゆだねる請求項1記載の方法。 3、前記DNA−BP複合体が固体支持体上に形成され
る請求項1記載の方法。 4、前記固体支持体が抗−ビオチン膜である請求項3記
載の方法。 5、前記接触の前、(a)前記サンプルがDNA変性条
件にゆだねられ;そして(b)前記変性されたDNAが
固体支持体に非拡散的に結合せしめられる請求項1記載
の方法。 6、前記BPが固体支持体に非拡散的に結合される請求
項1記載の方法。 7、前記BPがE.コリ(E.coli)の一本鎖DN
A結合タンパク質(SSB)、T4遺伝子32タンパク
質又はトポイソメラーゼ I である請求項1記載の方法
。 8、前記ラベルが前記BPに結合された酵素である請求
項1記載の方法。 9、前記酵素がウレアーゼ又はホースラディシュペルオ
キシダーゼである請求項8記載の方法。 10、DNAを含まない少なくとも1種のバックグラウ
ンド溶液及び既知の量のDNAを含む少なくとも1種の
対照溶液を請求項1記載の方法に従ってさらに処理し; 前記サンプル中に検出されるラベルから及び前記対照溶
液に検出されるラベルから前記バックグラウンド溶液中
に検出されるラベルを引き算し:そして 前記サンプル中に存在するDNAの量を決定するために
、前期サンプル及び前記対照溶液中に検出される調整さ
れたラベルを関係づけることをさらに含んで成る請求項
1記載の方法。 11、前記接触の前、前記サンプルと光反応性化合物と
を混合し;そして 前記活性化された化合物と前記サンプル中に存在するい
ずれかのDNAとを反応せしめるために、前記混合物を
活性化光により照射することをさらに含んで成る請求項
1記載の方法。 12、前記光反応性化合物がイソプソラレンである請求
項11記載の方法。 13、前記サンプルがタンパク質をさらに含んで成る請
求項1記載の方法。 14、前記タンパク質含有サンプルが、前記接触の前、
除タンパク質される請求項13記載の方法。 15、前記タンパク質含有サンプルが、前記タンパク質
含有サンプルと(a)ガラス粒子を含む懸濁液及び(b
)前記ガラス粒子への前記DNAの結合を引き起こすの
に十分な沃化物とを混合し;前記ガラス粒子を単離し;
そして 前記粒子からすべてのDNAを溶離することを含んで成
る方法により除タンパク質される請求項14記載の方法
。 16、前記溶離が水又はリン酸緩衝溶液による請求項1
5記載の方法。 17、前記タンパク質含有サンプルが、前記タンパク質
含有サンプルとタンパク質分解酵素組成物とを存在する
タンパク質が加水分解される条件下で混合することを含
んで成る方法により除タンパク質される請求項13記載
の方法。 18、前記混合の後、前記加水分解されたタンパク質の
生成物とDNAとを分離することをさらに含んで成る請
求項17記載の方法。 19、前記分離が、 前記混合の後、低分子量カットオフを有する膜を通して
前記サンプル遠心分離し;又は低分子量カットオフを有
するゲル透過クロマトグラフィーマトリックス又は限外
濾過装置を通して前記サンプルを通し;そして 存在するすべてのDNAを回収することを含んで成る請
求項18記載の方法。 20、前記タンパク質分解酵素組成物が少なくとも1種
のプロアーゼ又はプロテイナーゼKを含んで成る請求項
17記載の方法。 21、高い親和性の一本鎖DNA結合タンパク質(BP
)(ここで該DNAは検出可能なラベルを含有する)を
含む固体支持体を用いてサンプル中のDNAを検出する
ための方法であって: DNA−BP複合体を形成するために前記サンプル中の
いずれかの一本鎖DNAと前記固体支持体とを接触せし
め; 結合されなかったサンプルの前記固体支持体を除去し;
そして 前記サンプル中のDNAの存在の表示として前記ラベル
によって前記複合体を検出することを含んで成る方法。 22、前記サンプルが、前記接触の前、DNA変性条件
にゆだねられる請求項21記載の方法。 23、高い親和性の一本鎖DNA結合タンパク質(BP
)(ここで該BPは検出可能なラベルを含有する)を用
いてサンプル中のDNAを検出するための方法であって
: 前記サンプル中に存在するいずれかのDNAを変性せし
め; 前記変性されたDNAを固体支持体に非拡散的に結合し
; DNA−BP複合体を形成するために前記固体支持体と
BPとを接触せしめ; 結合されなかったサンプル及びBPの前記固体支持体を
除去し;そして 前記サンプル中のDNAの存在の表示として前記ラベル
によって前記複合体を検出することを含んで成る方法。 24、前記固体支持体が陽性に帯電されたナイロン膜又
はニトロセルロース膜である請求項23記載の方法。 25、高い親和性の一本鎖DNA結合タンパク質(BP
)を含んで成る固体支持体を用いてサンプル中のDNA
を検出するための方法であって:前記サンプルと検出可
能なラベルを含有する光反応性化合物とを混合し; 前記活性化された化合物と前記サンプル中に存在するす
べてのDNAとを反応せしめるために前記混合物を活性
化光により照射し; 前記照射された混合物と前記固体支持体とを接触せしめ
; 特異的に結合されていないすべての照射された混合物の
前記固体支持体を除去し;そして前記サンプル中のDN
Aの存在の表示として前記ラベルによって前記固体支持
体上に存在するすべての光反応性化合物を検出すること
を含んで成る方法。 26、前記光反応性化合物がイソプソラレンである請求
項25記載の方法。 27、前記検出可能なラベルがビオチンである請求項2
6記載の方法。 28、前記ビオチンが、酵素、放射性同位体又は螢光体
に連結されたアビジン、ストレプトアビジン又は抗−ビ
オチンを含んで成る接合体を用いて検出される請求項2
7記載の方法。 29、酵素に共有結合された高い親和性の一本鎖DNA
結合タンパク質(BP)を含んで成る接合体。 30、前記BPが一本鎖DNA結合タンパク質、T4遺
伝子32タンパク質又はトポイソメラーゼ I である請
求項29記載の接合体。 31、前記酵素がウレアーゼ又はホースラディシュペル
オキシターゼである請求項29記載の接合体。 32、第1成分として高い親和性の一本鎖DNA結合タ
ンパク質(BP)を有するDNA−検出システム(ここ
で前記システムの少なくとも1つの成分がラベルを含ん
で成る)を用いてサンプル中の生物体(ここで前記生物
体又は前記システムの少なくとも1つの成分から調製さ
れた一本鎖DNA(ssDNA)が固体支持体に非拡散
的に結合されている)を検出するための方法であって: ssDNA−BP複合体を形成するために前記ssDN
Aと前記第1成分とを接触せしめ; 結合されなかったssDNA及び前記システムの成分の
複合体を除去し;そして 前記サンプル中の生物体の存在の表示として前記ラベル
によって前記複合体を検出することを含んで成る方法。 33、前記ラベルが前記第1成分に接合される請求項3
2記載の方法。 34、前記生物体が、細菌、酵母細胞又はウィルスであ
る請求項32記載の方法。 35、前記細菌が、グラム陰性細菌である請求項34記
載の方法。 36、前記グラム陰性細菌が、E.コリである請求項3
5記載の方法。 37、前記接触の前、前記細胞から前記DNAを開放す
るために十分な量で及び時間、細胞崩壊組成物に前記細
胞を暴露し;そして 前記DNAを一本鎖DNA(ssDNA)に変性するこ
とをさらに含んで成る請求項31記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/093,361 US4978608A (en) | 1987-09-04 | 1987-09-04 | DNA detection system |
US093361 | 1993-07-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0217000A true JPH0217000A (ja) | 1990-01-19 |
Family
ID=22238496
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63220571A Pending JPH0217000A (ja) | 1987-09-04 | 1988-09-05 | Dna検出システム |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4978608A (ja) |
EP (1) | EP0310251B1 (ja) |
JP (1) | JPH0217000A (ja) |
AT (1) | ATE107965T1 (ja) |
CA (1) | CA1323292C (ja) |
DE (1) | DE3850468T2 (ja) |
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